本發(fā)明涉及α-氨基酰胺衍生化合物及包含其的藥物組合物。

背景技術(shù)：

帕金森病是一種進(jìn)行性疾病，其是第二常見的神經(jīng)退行性疾病。據(jù)估計(jì)全球有約630萬帕金森病患者，即約每1000人中便有1人患病。雖然帕金森病通常發(fā)生在老年人中，但也發(fā)生在年輕人身上。由于癥狀發(fā)展緩慢，帕金森病與其他疾病不容易區(qū)別。帕金森病在早期階段不容易發(fā)現(xiàn)，并伴有震顫、僵硬、動(dòng)作減緩、姿勢不穩(wěn)定、姿勢駝背、步態(tài)凍結(jié)、抑郁、睡眠障礙、排尿困難、癡呆等異常臨床癥狀。

雖然帕金森病的起因尚不清楚，但已知其由腦內(nèi)分泌神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺的神經(jīng)元減少引起的多巴胺不足所導(dǎo)致。目前通常使用左旋多巴療法，其中所施用的左旋多巴在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為多巴胺。雖然左旋多巴是帕金森病最有效的治療劑，但在治療期間可能會(huì)發(fā)生藥物效力下降或多種運(yùn)動(dòng)障礙。作為替代藥物，還使用了通過抑制多巴胺代謝來維持腦中多巴胺濃度的COMT抑制劑、MAO-B抑制劑等。

已知MAO-B不僅在腦中的多巴胺代謝中起重要作用，而且還抑制對(duì)顱內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞的損傷。雖然沒有明確的證據(jù)表明MAO-B抑制劑確實(shí)延緩了帕金森病的發(fā)展，但已知對(duì)MAO-B的抑制會(huì)引起對(duì)多巴胺能神經(jīng)元的變性或破壞的抑制，因?yàn)镸AO-B在由MPTP或類似環(huán)境毒物引起的帕金森病發(fā)作中起重要作用。此外，有動(dòng)物和臨床試驗(yàn)的證據(jù)表明，MAO-B抑制劑與其他藥物不同，具有保護(hù)腦的效果。

司來吉蘭被認(rèn)為是最具代表性的MAO-B抑制劑，其被規(guī)定為一種用于帕金森病的治療劑。然而，因?yàn)槠浔淮x成苯丙胺，所以會(huì)引起肝中毒，該不可逆抑制劑伴隨著多種副作用。自從雷沙吉蘭(Azilect)于2005年在以色列首次上市后，就在包括歐洲、美國等的約50個(gè)國家中銷售。Azilect沒有苯丙胺副作用，并且表現(xiàn)出優(yōu)于其他多巴胺能藥物的效力。然而，雖然雷沙吉蘭也表現(xiàn)出與作為不可逆MAO-B抑制劑的司來吉蘭相類似的抑制MAO-B的優(yōu)異效果，但是其也具有安全問題。因此，正在開發(fā)能夠有效且可逆地抑制MAO-B活性并且同時(shí)解決上述缺點(diǎn)的藥物。然而，尚沒有顯著的可逆抑制劑可用。

肥胖是指過剩的身體脂肪累積到可能對(duì)健康有負(fù)面影響的醫(yī)學(xué)病癥。在該病癥中，由于能量攝入和能量消耗的差異導(dǎo)致過剩能量的累積。肥胖會(huì)導(dǎo)致多種疾病的可能性增加。

由于以前對(duì)下丘腦進(jìn)行的關(guān)于食物攝取調(diào)節(jié)的研究集中于作為腦的一部分的神經(jīng)元上，因此這限制了對(duì)腦調(diào)節(jié)的飲食/肥胖的理解。因此，為了全面了解腦的功能，需要研究起到更大部分作用的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞(神經(jīng)膠質(zhì))。最近，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中最豐富的星形膠質(zhì)細(xì)胞作為可以通過分泌多種信號(hào)分子如GABA(γ-氨基丁酸)、谷氨酸、D-絲氨酸、ATP等來激活或抑制附近神經(jīng)元的細(xì)胞受到關(guān)注。下丘腦的星形膠質(zhì)細(xì)胞與POMC(pro-opiomelanocortin，阿黑皮素原)神經(jīng)元密切相互作用并且表達(dá)瘦蛋白受體，其也可以促進(jìn)瘦蛋白信號(hào)傳導(dǎo)。

在下丘腦中，存在兩組POMC神經(jīng)元，一組刺激食欲，另一組刺激能量消耗。在正常情況下，星形膠質(zhì)細(xì)胞有助于激活附近的刺激能量消耗的POMC神經(jīng)元。然而，在肥胖中，由于過度的瘦蛋白信號(hào)，星形膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)變成反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞，并且腐胺被轉(zhuǎn)變?yōu)镚ABA并通過MAO-B(單胺氧化酶B)分泌。此外，刺激能量消耗的POMC神經(jīng)元由于過度的瘦蛋白信號(hào)而在突觸外表達(dá)包括a4、a5和a6亞基的GABAa受體，并且受到反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞所分泌的GABA的影響。結(jié)果POMC神經(jīng)元被抑制，并且能量消耗減少，導(dǎo)致脂肪累積。

如果MAO-B(負(fù)責(zé)產(chǎn)生GABA的酶)被抑制，則當(dāng)POMC神經(jīng)元再次被激活時(shí)會(huì)抑制GABA的產(chǎn)生和分泌并且促進(jìn)能量消耗。然而，抑制食欲的POMC神經(jīng)元不受GABA的影響，因?yàn)檫@種POMC神經(jīng)元不在突觸外表達(dá)GABAa受體。因此，MAO-B抑制劑作用于選擇性激發(fā)能量消耗的POMC神經(jīng)元，從而表現(xiàn)出治療肥胖的作用。然而，大多數(shù)現(xiàn)有的MAO-B抑制劑作為不可逆抑制劑表現(xiàn)出多種副作用。雖然由于這個(gè)原因而研究和開發(fā)了可以可逆地抑制MAO-B的藥物，但還沒有可有效作用于肥胖的顯著可逆MAO-B抑制劑可用。

【公開內(nèi)容】

【技術(shù)問題】

本公開內(nèi)容旨在克服用作MAO-B抑制劑的現(xiàn)有藥物的缺點(diǎn)。旨在開發(fā)通過非共價(jià)鍵可逆地抑制MAO-B的治療劑以減輕或消除通過與MAO-B的共價(jià)鍵不可逆地發(fā)揮作用而表現(xiàn)出治療效果的現(xiàn)有藥物的副作用。還旨在提供與現(xiàn)有的可逆MAO-B抑制劑相比具有優(yōu)異的穩(wěn)定性和效力的化合物、包含所述化合物的組合物以及用于制備所述化合物的方法。

【技術(shù)方案】

在一方面，本公開內(nèi)容提供了由化學(xué)式1表示的α-氨基酰胺衍生物或其可藥用鹽。

[化學(xué)式1]

其中R和X在詳細(xì)描述中限定。

在另一方面，本公開內(nèi)容涉及含有根據(jù)本公開內(nèi)容的多個(gè)示例性實(shí)施方案的α-氨基酰胺衍生物或者其可藥用鹽或溶劑合物作為活性成分的單胺氧化酶B(MAO-B)抑制劑。

在另一方面，本公開內(nèi)容涉及用于治療或預(yù)防神經(jīng)退行性疾病的藥物組合物，所述藥物組合物含有根據(jù)本公開內(nèi)容的多個(gè)示例性實(shí)施方案的α-氨基酰胺衍生物或者其可藥用鹽或溶劑合物作為活性成分。

在另一方面，本公開內(nèi)容涉及根據(jù)本公開內(nèi)容的多個(gè)示例性實(shí)施方案的α-氨基酰胺衍生物或者其可藥用鹽或溶劑合物制備用于治療或預(yù)防神經(jīng)退行性疾病的藥物的用途。

在另一方面，本公開內(nèi)容涉及通過向哺乳動(dòng)物施用含有根據(jù)本公開內(nèi)容的多個(gè)示例性實(shí)施方案的α-氨基酰胺衍生物或者其可藥用鹽或溶劑合物的藥物組合物來治療或預(yù)防神經(jīng)退行性疾病的方法。

在另一方面，本公開內(nèi)容涉及用于治療或預(yù)防肥胖的藥物組合物，所述藥物組合物含有根據(jù)本公開內(nèi)容的多個(gè)示例性實(shí)施方案的α-氨基酰胺衍生物或者其可藥用鹽或溶劑合物作為活性成分。

在另一方面，本公開內(nèi)容涉及制備由化學(xué)式1表示的α-氨基酰胺衍生物的方法。

【有益效果】

根據(jù)本公開內(nèi)容的多個(gè)示例性實(shí)施方案，提供了可以克服用作MAO-B抑制劑的現(xiàn)有藥物的缺點(diǎn)的治療劑，具體而言，提供了通過非共價(jià)鍵可逆地抑制MAO-B的治療劑以減輕或消除通過與MAO-B的共價(jià)鍵不可逆地發(fā)揮作用而表現(xiàn)出治療效果的現(xiàn)有藥物的副作用。特別地，可提供與現(xiàn)有的可逆MAO-B抑制劑相比具有優(yōu)異的穩(wěn)定性和效力的新化合物。

【附圖說明】

圖1示出了測試根據(jù)本公開內(nèi)容的一個(gè)示例性實(shí)施方案的α-氨基酰胺衍生物對(duì)MAO-B(單胺氧化酶B)的可逆性的方法。

圖2a示出了在黑質(zhì)和紋狀體中化合物9的多巴胺能神經(jīng)元保護(hù)效果(預(yù)處理)。

圖2b示出了在黑質(zhì)和紋狀體中化合物9的多巴胺能神經(jīng)元保護(hù)效果(后處理)。

圖2c示出了在黑質(zhì)和紋狀體中化合物9的多巴胺能神經(jīng)元保護(hù)效果(預(yù)處理30天)。

圖3a示出了APP/PS1小鼠中隨刺激強(qiáng)度變化的尖峰概率(Jo等，Nature Medicine，2014)。

圖3b示出了APP/PS1小鼠中的化合物9隨刺激強(qiáng)度變化的尖峰概率。

圖4示出了在DGGC(齒狀回顆粒細(xì)胞)中的化合物9興奮性測試結(jié)果。

圖5示出了預(yù)測沙芬酰胺和化合物9的結(jié)合模式的結(jié)果。

圖6示出了給予正常飲食和高脂飲食的小鼠的體重變化。

圖7示出了給予正常飲食和高脂飲食的小鼠中的反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞的變化。

圖8示出了給予高脂飲食的肥胖模型小鼠隨α-氨基酰胺衍生物施用量的體重變化。

圖9示出了給予正常飲食的小鼠、給予高脂飲食的小鼠以及同時(shí)給予高脂飲食和α-氨基酰胺衍生物的小鼠中的反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞和GABA的變化。

【最佳實(shí)施方式】

下文中，將更詳細(xì)地描述本公開內(nèi)容的多個(gè)方面和多個(gè)示例性實(shí)施方案。

本公開內(nèi)容涉及由[化學(xué)式1]表示的α-氨基酰胺衍生物或其可藥用鹽：

[化學(xué)式1]

其中，R為氫或C_1-7烷基；并且X選自氫、鹵素、烷基、鹵代烷基、烷氧基和鹵代烷氧基。

星號(hào)(＊)表示光學(xué)活性。

在一個(gè)示例性實(shí)施方案中，R選自氫和C₁-C₇烷基；并且X選自氫、鹵素、C₁-C₇烷基、鹵代C₁-C₇烷基、C₁-C₇烷氧基和鹵代C₁-C₇烷氧基。

在另一個(gè)示例性實(shí)施方案中，R選自氫、甲基、乙基、正丙基、異丙基、環(huán)丙基、正丁基、異丁基、仲丁基和叔丁基；并且X選自鹵素、鹵代甲基、鹵代乙基、鹵代甲氧基、鹵代乙氧基、甲氧基和乙氧基。特別地，在這種情況下，可以另外實(shí)現(xiàn)減輕抗體依賴性細(xì)胞毒性的效果。

在另一個(gè)示例性實(shí)施方案中，R選自氫、甲基、異丙基和異丁基；并且X選自氟、氯、三氯甲基、三氯甲氧基和甲氧基。特別地，在這種情況下，幾乎不存在通道抑制作用，其顯著低于作為MAO-B抑制劑為人熟知的沙芬酰胺所具有的通道抑制作用。因此，可以確保作為選擇性MAO-B抑制劑的穩(wěn)定性。

在另一個(gè)示例性實(shí)施方案中，R選自氫、甲基、異丙基和異丁基；并且X選自對(duì)三氯甲基、對(duì)三氯甲氧基、間三氯甲基、間三氯甲氧基、對(duì)氯、間氯、對(duì)甲氧基、間甲氧基、對(duì)氟和間氟。

在另一個(gè)示例性實(shí)施方案中，R選自氫、甲基、異丙基和異丁基；并且X選自對(duì)三氯甲基、對(duì)三氯甲氧基、間三氯甲基、間三氯甲氧基、對(duì)氯、間氯、對(duì)甲氧基和間甲氧基。在另一個(gè)示例性實(shí)施方案中，R為氫或甲基；并且X選自對(duì)三氟甲基、對(duì)三氟甲氧基、間三氟甲基、間三氟甲氧基、對(duì)氯、間氯、對(duì)甲氧基和間甲氧基。

在另一個(gè)示例性實(shí)施方案中，R為氫或甲基；并且X選自對(duì)三氯甲基、對(duì)三氯甲氧基、間三氯甲基和間三氯甲氧基。特別地，在這種情況下，可以另外實(shí)現(xiàn)完全阻斷抗體依賴性細(xì)胞毒性的效果。

在另一個(gè)示例性實(shí)施方案中，R為氫或甲基；并且X為對(duì)三氟甲基或?qū)θ籽趸?/p>

在另一個(gè)示例性實(shí)施方案中，R為甲基；并且X為對(duì)三氟甲基或?qū)θ籽趸?/p>

在另一個(gè)示例性實(shí)施方案中，R為甲基；并且X為對(duì)三氟甲基。

在另一個(gè)示例性實(shí)施方案中，α-氨基酰胺衍生物選自以下化合物：

(S)-2-(((2′-氟聯(lián)苯基-4-基)甲基)氨基)丙酰胺甲磺酸鹽，

(S)-2-(((3′-氟聯(lián)苯基-4-基)甲基)氨基)丙酰胺甲磺酸鹽，

(S)-2-(((4′-氟聯(lián)苯基-4-基)甲基)氨基)丙酰胺甲磺酸鹽，

(S)-2-(((2′-氯聯(lián)苯基-4-基)甲基)氨基)丙酰胺甲磺酸鹽，

(S)-2-(((3′-氯聯(lián)苯基-4-基)甲基)氨基)丙酰胺甲磺酸鹽，

(S)-2-(((4′-氯聯(lián)苯基-4-基)甲基)氨基)丙酰胺甲磺酸鹽，

(S)-2-(((2′-三氟甲基聯(lián)苯基-4-基)甲基)氨基)丙酰胺甲磺酸鹽，

(S)-2-(((3′-三氟甲基聯(lián)苯基-4-基)甲基)氨基)丙酰胺甲磺酸鹽，

(S)-2-(((4′-三氟甲基聯(lián)苯基-4-基)甲基)氨基)丙酰胺甲磺酸鹽，

(S)-2-(((3′-三氟甲氧基聯(lián)苯基-4-基)甲基)氨基)丙酰胺甲磺酸鹽，

(S)-2-(((4′-三氟甲氧基聯(lián)苯基-4-基)甲基)氨基)丙酰胺甲磺酸鹽，

(S)-2-(((3′-甲氧基聯(lián)苯基-4-基)甲基)氨基)丙酰胺甲磺酸鹽，

(S)-2-(((4′-甲氧基聯(lián)苯基-4-基)甲基)氨基)丙酰胺甲磺酸鹽，

(R)-2-(((3′-氟甲氧基聯(lián)苯基-4-基)甲基)氨基)丙酰胺甲磺酸鹽，

(R)-2-(((4′-三氟甲基聯(lián)苯基-4-基)甲基)氨基)丙酰胺甲磺酸鹽，

(R)-2-(((4′-三氟甲基聯(lián)苯基-4-基)甲基)氨基)乙酰胺甲磺酸鹽，

(R)-3-甲基-2-(((4′-三氟甲基聯(lián)苯基-4-基)甲基)氨基)丁酰胺甲磺酸鹽，和

(R)-4-甲基-2-(((4′-三氟甲基聯(lián)苯基-4-基)甲基)氨基)戊酰胺甲磺酸鹽。

在本公開內(nèi)容的另一個(gè)示例性實(shí)施方案中，根據(jù)本公開內(nèi)容的多個(gè)示例性實(shí)施方案的α-氨基酰胺衍生物可為(S)-異構(gòu)體。

在本公開內(nèi)容中，可藥用鹽包括無機(jī)酸鹽如鹽酸鹽、氫溴酸鹽、磷酸鹽或硫酸鹽，以及有機(jī)酸鹽如羧酸鹽或磺酸鹽，然而并不限于此。羧酸鹽包括乙酸鹽、馬來酸鹽、富馬酸鹽、蘋果酸鹽、檸檬酸鹽、酒石酸鹽、乳酸鹽或苯甲酸鹽，然而并不限于此?；撬猁}包括甲磺酸鹽、乙磺酸鹽、苯磺酸鹽、甲苯磺酸鹽或萘二磺酸鹽，然而并不限于此。

本公開內(nèi)容還提供了制備α-氨基酰胺衍生物的方法，其包括以下步驟：

(A)通過使[化學(xué)式1a]的化合物與[化學(xué)式1b]的化合物反應(yīng)來合成[化學(xué)式1c]的化合物的步驟：

[化學(xué)式1a]

[化學(xué)式1b]

[化學(xué)式1c]

(B)使[化學(xué)式1c]的化合物與[化學(xué)式1d]的化合物反應(yīng)來合成[化學(xué)式1e]的化合物的步驟：

[化學(xué)式1d]

[化學(xué)式1e]

以及

(C)將[化學(xué)式1e]的化合物轉(zhuǎn)化成[化學(xué)式1]的α-氨基酰胺衍生物的步驟：

[化學(xué)式1]

在[化學(xué)式1]和[化學(xué)式1b]直至[化學(xué)式1e]中，

R和X與以上限定的相同。

制備方法可由[方案1]表示：

[方案1]

因?yàn)榛衔镉捎谟尚翘?hào)(＊)標(biāo)示的碳而具有光學(xué)活性，所以可以單獨(dú)合成R-化合物和S-化合物。

本公開內(nèi)容還提供了含有α-氨基酰胺衍生物或其可藥用鹽或溶劑合物作為活性成分的MAO-B(單胺氧化酶B)抑制劑。

根據(jù)本公開內(nèi)容的α-氨基酰胺衍生物由于表現(xiàn)出抑制單胺氧化酶B的活性的優(yōu)異效果而可有效地用作MAO-B抑制劑。

本公開內(nèi)容還提供了治療或預(yù)防神經(jīng)退行性疾病的藥物組合物，所述藥物組合物含有α-氨基酰胺衍生物或其可藥用鹽或溶劑合物作為活性成分。

在本公開內(nèi)容中，神經(jīng)退行性疾病包括例如帕金森病、阿爾茨海默病等，然而并不限于此。

在另一方面，本公開內(nèi)容涉及根據(jù)本公開內(nèi)容的多個(gè)示例性實(shí)施方案的α-氨基酰胺衍生物或者其可藥用鹽或溶劑合物制備用于治療或預(yù)防神經(jīng)退行性疾病的藥物的用途。

在另一方面，本公開內(nèi)容涉及通過向哺乳動(dòng)物施用包含根據(jù)本公開內(nèi)容的多個(gè)示例性實(shí)施方案的α-氨基酰胺衍生物或者其可藥用鹽或溶劑合物的藥物組合物來治療或預(yù)防神經(jīng)退行性疾病的方法。

本公開內(nèi)容還提供了含有α-氨基酰胺衍生物或者其可藥用鹽或溶劑合物作為活性成分的γ-氨基丁酸(GABA)產(chǎn)生抑制劑。

根據(jù)本公開內(nèi)容的α-氨基酰胺衍生物由于可以通過抑制MAO-B(產(chǎn)生GABA的酶)來抑制GABA的產(chǎn)生和分泌從而可以有效地用作GABA產(chǎn)生抑制劑。

此外，根據(jù)本公開內(nèi)容的α-氨基酰胺衍生物由于可以通過解除對(duì)選擇性誘導(dǎo)能量消耗的POMC神經(jīng)元的抑制或激活該P(yáng)OMC神經(jīng)元從而促進(jìn)能量消耗，表現(xiàn)出對(duì)肥胖的治療效果，因而可以有效地用作用于治療或預(yù)防肥胖的藥物組合物。

【具體實(shí)施方式】

下文中，將通過實(shí)施例詳細(xì)地描述本公開內(nèi)容。然而，以下實(shí)施例僅用于舉例說明的目的，并且本公開內(nèi)容的范圍和內(nèi)容不應(yīng)解釋為被這些實(shí)施例減少或受其限制。此外，很明顯，即使沒有具體提供實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本領(lǐng)域技術(shù)人員基于包括實(shí)施例的本公開內(nèi)容也可以容易地執(zhí)行本公開內(nèi)容，并且這樣的修改或改變落在所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。

雖然所述化合物的結(jié)構(gòu)和物理特性隨取代基變化，但是實(shí)施例中所描述反應(yīng)的原理和條件也可以用于具有實(shí)施例中未描述的取代基的化合物，因此顯而易見，本領(lǐng)域技術(shù)人員基于實(shí)施例中的公開內(nèi)容和現(xiàn)有技術(shù)的常識(shí)可以容易地得到具有取代基的所述化合物。

實(shí)施例

制備例

(1)步驟(A)

如[方案1a]所示，使用鈀催化劑對(duì)4-溴苯甲醛和硼酸進(jìn)行Suzuki交叉偶聯(lián)反應(yīng)。具體地，將4-溴苯甲醛(3g，16.21mmol)、硼酸(1.28當(dāng)量)、四(三苯基膦)鈀(0)(4-8mol％)和碳酸鈉(4.86當(dāng)量)在脫氣的甲苯/蒸餾水(150mL/21.6mL)中回流18小時(shí)，同時(shí)加熱。將反應(yīng)混合物通過硅藻土(celite)過濾，用乙酸乙酯(200mL)和水(200mL)將濾液洗滌兩次。將有機(jī)層合并，并用硫酸鈉干燥，真空濃縮，然后通過硅膠柱色譜法分離和純化。

[方案1a]

(2)步驟(B)和(C)

通過使用L-丙氨酰胺鹽酸鹽或D-丙氨酰胺鹽酸鹽使步驟(A)的化合物經(jīng)還原胺化來獲得亞胺化合物(步驟(B)，方案1b)。然后，通過用氰基硼氫化鈉還原亞胺化合物來獲得胺化合物(步驟(C)，方案1c)。

向無水甲醇中添加1.2當(dāng)量的甘氨酰胺鹽酸鹽或L-丙氨酰胺鹽酸鹽或D-丙氨酰胺鹽酸鹽或L-纈氨酰胺鹽酸鹽或L-亮氨酰胺鹽酸鹽至0.92M的濃度，接著添加1.5當(dāng)量的三乙胺。當(dāng)溶液變得透明時(shí)，添加1.0當(dāng)量的在步驟(A)中合成的醛。兩小時(shí)后，用乙酸乙酯和蒸餾水洗滌溶液。用硫酸鈉干燥有機(jī)層并在真空中干燥，接著將濃縮的反應(yīng)溶液溶于無水甲醇至1.0M的濃度，然后在0℃下添加4.0當(dāng)量氰基硼氫化鈉。在室溫下反應(yīng)18小時(shí)，接著用乙酸乙酯和蒸餾水洗滌反應(yīng)溶液。用硫酸鈉干燥有機(jī)層，真空濃縮，然后通過硅膠柱色譜法分離和純化。

[方案1b]

[方案1c]

(3)鹽的制備

鹽制備步驟是任選的步驟，其可以在有需要的情況下進(jìn)行或省略。合成鹽形式的化合物會(huì)提高前述步驟中合成的胺化合物的溶解度。鹽形式的化合物可以使用酸合成?？梢允褂玫乃崛缟纤?，但不限于此。

具體而言，使用甲磺酸合成鹽形式的化合物。將乙酸乙酯加熱至50℃至55℃，并完全溶解1.0當(dāng)量的步驟(C)的化合物，接著添加1.25當(dāng)量甲磺酸。1小時(shí)后，將反應(yīng)混合物冷卻至室溫，并使用真空過濾裝置過濾。用乙酸乙酯洗滌濾液，干燥，無純化過程。

[方案1d]

實(shí)施例1：(S)-2-(((2′-氟聯(lián)苯基-4-基)甲基)氨基)丙酰胺甲磺酸鹽的合成

白色固體；產(chǎn)率：90％；

¹H NMR(300MHz，DMSO-d₆)δ 9.17(br s，2H)，7.94(br s，1H)，7.30-7.94(m，9H)，4.16(m，2H)，3.80(q，J＝6.54Hz，1H)，2.30(s，3H)，1.45(d，J＝6.93Hz，3H)；¹³C NMR(75MHz，DMSO-d₆)δ170.9(C(O))，161.2，157.9，136.2，131.7，131，2，131.1，130.8，130.5，130.3，129.5，129.4，128.1，127.9，125.5，125.4，116.8，116.5(ArC)，55.1(C(O)CH⁺NH₂)，48.7(⁺NH₂CH₂Ph)，16.4(CH₃).SCH₃

SCH₃信號(hào)與DMSO信號(hào)重疊。

實(shí)施例2：(S)-2-(((3′-氟聯(lián)苯基-4-基)甲基)氨基)丙酰胺甲磺酸鹽的合成

白色固體；產(chǎn)率：97％；

¹H NMR(300MHz，DMSO-d₆)δ9.15(br s，2H)，7.92(br s，1H)，7.81(d，J＝8.25Hz，2ArH)，7.68(br s，1H)，7.49-7.60(m，5ArH)，7.20-7.27(m，1ArH)，4.15(s，2H)，3.76(q，J＝9.24Hz，1H)，2.30(s，3H)，1.44(d，J＝9.28Hz，3H)；¹³C NMR(75MHz，DMSO-d₆)δ171.0(C(O))，164.9，161.8，161.6，142.4，142.3，139.8，132.0，131.5，131.4，131.2，127.5，123.3，115.2，114.9，114.1，113.8(ArC)，55.0(C(O)CH⁺NH₂)，48.6(⁺NH₂CH₂Ph)，16.4(CH₃)。

SCH₃信號(hào)與DMSO信號(hào)重疊。

實(shí)施例3：(S)-2-(((4′-氟聯(lián)苯基-4-基)甲基)氨基)丙酰胺甲磺酸鹽的合成

白色固體；產(chǎn)率：88％；

¹H NMR(300MHz，DMSO-d₆)δ9.18(br s，2H)，7.95(br s，1H)，7.72-7.77(m，4ArH)，7.65(br s，1H)，7.56(d，J＝8.16Hz，2ArH)，7.28-7.34(m，2ArH)，4.12-4.15(m，2H)，3.78-3.84(m，1H)，2.37(s，3H)，1.45(d，J＝6.93Hz，3H)；¹³C NMR(75MHz，DMSO-d₆)δ171.0(C(O))，164.9，161.8，161.6，142.4，142.3，139.8，132.0，131.5，131.4，131.2，127.5.123.3，115.2，114.9.114.1，113.8(ArC)，55.0(C(O)CH⁺NH₂)，48，6(⁺NH₂CH₂Ph)，16.4(CH₃).

SCH₃信號(hào)與DMSO信號(hào)重疊。

實(shí)施例4：(S)-2-(((2′-氯聯(lián)苯基-4-基)甲基)氨基1丙酰胺甲磺酸鹽的合成

白色固體；產(chǎn)率：62％；

¹H NMR(300MHz，DMSO-d₆)δ9.18(br s，⁺NH₂)，7.96(br s，1C(O)NHH′)，7.67(br s，1C(O)NHH′)，7.59(d，J＝8.1Hz，3ArH)，7.52(d，J＝8.2Hz，2ArH)，7.39-7.47(m，3ArH)，4.09-4.28(m，2H)，3.86-3.90(m，1H)，2.30(s，3H)，1.47(d，J＝6.9Hz，3H)；¹³C NMR(75MHz，DMSO-d₆)δ170.9(C(O))，139.8，139.6，131.9，131.8，131.7，130.4，130.0，128.1，55.2(C(O)CH⁺NH₂)，48.7(⁺NH₂CH₂Ph)，16.4(CH₃)，

SCH₃信號(hào)與DMSO信號(hào)重疊。其他峰未檢測到或者似與其他信號(hào)重疊。

實(shí)施例5：(S)-2-(((3′-氯聯(lián)苯基-4-基)甲基)氨基)丙酰胺甲磺酸鹽的合成

白色固體；產(chǎn)率：90％；

¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)δ9.16(br s，2H)，7.92(br s，1H)，7.81(d，J＝8.14Hz，2ArH)，7.77(br s，1H)，7.67-7.70(m，2ArH)，7.59(d，J＝8.14Hz，1ArH)，7.52(t，J＝7.88Hz，1ArH)，7.46(d，J＝8.1Hz，1ArH)，4.12-4.20(m，2H)，3.78(d，J＝6，7Hz，1H)，2.30(s，3H)，1.45(d，J＝6.7Hz，3H)；¹³C NMR(75MHz，DMSO-d₆)δ170.9(C(O))，141.9，139.5，134.3，132.0，131.3，131.2，128.7，127.5，126.9，125.9(ArC)，55.1(C(O)CH⁺NH₂)，48.6(⁺NH₂CH₂Ph)，16.4(CH₃).

SCH₃信號(hào)與DMSO信號(hào)重疊。

實(shí)施例6：(S)-2-(((4′-氯聯(lián)苯基-4-基）甲基)氨基)丙酰胺甲磺酸鹽的合成

白色固體；產(chǎn)率：84％；

¹H NMR(300MHz，DMSO-d₆)δ9.17(br s，1H)，7.94(br s，1H)，7.73-7.78(m，4ArH)，7.66(br s，1H)，7.53-7.60(m，4ArH)，4.10-4.20(m，2H)，3.76-3.82(m，1H)，2.32(s，3H)，1.45(d，J＝6.93Hz，3H)；¹³C NMR(100MHz，DMSO-d₆)δ170.9(C(O))，139.9，138.6，133.2，131.7，131.2，129.5，129.4，129.0，127.3(A1C)，54.9，(C(O)CH⁺NH₂)，48.5(⁺NH₂CH₂Ph)，16.3(CH₃).

SCH₃信號(hào)與DMSO信號(hào)重疊。

實(shí)施例7：(S)-2-(((2′-三氟甲基聯(lián)苯基-4-基)甲基)氨基)丙酰胺甲磺酸鹽的合成

白色固體；產(chǎn)率：87％；

¹H NMR(300MHz，DMSO-d₆)δ9.20(br s，⁺NH₂)，7.94(br s，1C(O)NHH′)，7.85(d，J＝7.8Hz，1ArH)，7.75(t，J＝7.4Hz，1ArH)，7.61-7.67(m，2ArH)，7.57(d，J＝7.2Hz，1ArH)，7.39-7.41(m，2ArH，1C(O)NHH′)，4.11-4.22(m，2H)，3.86-3.88(m，1H)，2.32(s，3H)，1.47(d，J＝6.7Hz，3H)；¹³C NMR(75MHz，DMSO-d₆)δ170.9(C(O))，140.5，140.4，132.8，132.5，131.9，130.1，129.4，128.7，127.3(q，J_C-F＝29.2Hz)，126.5(q，J_C-F＝5.2Hz)，124.6(q，J_C-F＝270.5Hz)，55.4(C(O)CH⁺NH₂)，48.8(⁺NH₂CH₂Ph)，40.2(SCH₃)，16.4(CH₃).

實(shí)施例8：(S)-2-(((3′-三氟甲基聯(lián)苯基-4-基)甲基)氨基)丙酰胺甲磺酸鹽的合成

白色固體；產(chǎn)率：92％；

¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)δ9.16(br s，2H)，7.988.02(m，2ArH)，7.90(br s，1H)，7.84(d，J＝8.10Hz，2ArH)，7.69-7.76(m，2ArH)，7.65(br s，1H)，7.59(d，J＝8.10Hz，2ArH)，4.14(m，2H)，3.76(d，J＝5.36Hz，1H)，2.27(S，3H)，1.43(d，J＝6.88Hz，3H)；¹³C NMR(100MHz，DMSO-d₆)δ 170.9(C(O))，140.9，139.5，132.2，131.3，131.2，130.7，130.5，130.2，129.9，128.7，127.7，126.0，124.8，123.6，123.3(ArC)，55.0(C(O)CH⁺NH₂)，48.5(⁺NH₂CH₂Ph)，16.4(CH₃).

SCH₃信號(hào)與DMSO信號(hào)重疊。

實(shí)施例9：(S)-2-(((4′-三氟甲基聯(lián)苯基-4-基)甲基)氨基)丙酰胺甲磺酸鹽的合成

白色固體；產(chǎn)率：82％；

¹H NMR(300MHz，DMSO-d₆)δ9.17(br s，2H)，7.93-7.96(m，3H)，7.84(d，J＝7.65Hz，4H)，7.63-7.66(m，3H)，4.12-4.23(m，2H)，3.78-3.83(m，1H)，2.32(s，3H)，1.46(d，J＝6.93Hz，3H)；¹³C NMR(75MHz，DMSO-d₆)δ170.9(C(O))，143.8，139.6，132.4，131.3，128.8，128.4，128.0，127.8，126.6，126.3，126.2，123.0(ArC)，54.9(C(O)CH⁺NH₂)，48.5(⁺NH₂CH₂Ph)，16.4(CH₃).

SCH₃信號(hào)與DMSO信號(hào)重疊。

實(shí)施例10：(S)-2-(((3′-三氟甲氧基聯(lián)苯基-4-基)甲基)氨基)丙酰胺甲磺酸鹽的合成

白色固體；產(chǎn)率：90％；

¹H NMR(300MHz，DMSO-d₆)δ9.16(br s，2H)，7.92(br s，1H)，7.83(d，J＝8.22Hz，2ArH)，7.77(d，J＝8.22Hz，1ArH)，7.59-7.69(m，5H)，7.39-7.42(m，1ArH)，4.16(s，2H)，3.77(q，J＝7.08Hz，1H)，2.30(s，3H)，1.44(d，J＝6.99Hz，3H)；¹³C NMR(100MHz，DMSO-d₆)δ170.9(C(O))，149.5，142.2，139.4，132.2，131.5，131.3，131.2，127.6，126.3，124.4，121.9，120.5，119.8，119.7，119.3(ArC)，55.0，(C(O)CH⁺NH₂)，48.5(⁺NH₂CH₂Ph)，16.4(CH₃).

SCH₃信號(hào)與DMSO信號(hào)重疊。

實(shí)施例11：(S）-2-(((4′-三氟甲氧基聯(lián)苯基-4-基)甲基)氨基)丙酰胺甲磺酸鹽的合成

白色固體；產(chǎn)率：92％；

¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)δ9.17(br s，2H)，7.92(br s，1H)，7.83(d，J＝8.68Hz，2ArH)，7.78(d，J＝8.16Hz，2ArH)，7.67(br s，1H)，7.59(d，J＝8.12Hz，2ArH)，7.48(d，J＝8.20Hz，2ArH)，4.16(s，2H)，3.78(s，1H)，2.30(s，3H)，1.44(d，J＝6.96Hz，3H)；¹³C NMR(100MHz，DMSO-d₆)δ170.9(C(O))，148.5，139.7，139.，131.8，131.3，131.2，129.2，129.1，127.6，127.5，124.4，122.1，121.9，121.8，119.8，116.7(ArC)，55.3，55.1，54.9，54.7(C(O)CH⁺NH₂)，48.6(⁺NH₂CH₂Ph)，16.4(CH₃).

SCH₃信號(hào)與DMSO信號(hào)重疊。

實(shí)施例12：(S)-2-(((3′-甲氧基聯(lián)苯基-4-基)甲基)氨基)丙酰胺甲磺酸鹽的合成

白色固體；產(chǎn)率：91％；

¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)δ9.14(br s，2H)，7.91(br s，1H)，7.76(d，J＝8.16Hz，2ArH)，7.66(br s，1H)，7.66(br s，1H)，7.40(t，J＝7.92Hz，3ArH)，7.26(d，J＝7.76Hz，1ArH)，7.21(m，1ArH)，6.95-6.98(m，1ArH)，4.14(m，2H)，3.83(s，3H)，3，77(q，J＝6.96Hz，1H)，2.30(S，3H)，1.44(d，J＝6.96Hz，3H)；¹³C NMR(75MHz，DMSO-d₆)δ170.9(C(O))，160.3，141.3，141.1，131.4，131.1，130.6，127.4，119.5，113.8，112.7(ArC)，55.6，54.9(C(O)CH⁺NH₂)，48.6(⁺NH₂CH₂Ph)，16.4(CH₃).

SCH₃信號(hào)與DMSO信號(hào)重疊。

實(shí)施例13：(S)-2-(((4′-甲氧基聯(lián)苯基-4-基)甲基)氨基)丙酰胺甲磺酸鹽的合成

白色固體；產(chǎn)率：84％；

¹H NMR(300MHz，DMSO-d₆)δ9.14(br s，2H)，7.92(br s，1H)，7.64-7.72(m，5H)，7.54(d，J＝8.25Hz，2H)，7.04(d，J＝8.79Hz，2ArH)，4.13(s，2H)，3.72-3.89(m，4H)，2.31(s，3H)，1.44(d，J＝6.96Hz，3H)；¹³C NMR(75MHz，DMSO-d₆)δ170.9(C(O))，159.6，140.9，132.1，131.0，128.4，128.2，126.8，115.2，115.0， 114.8，114.6(ArC)，55.8，55.6，54.9，54.8(C(O)CH⁺NH₂)，48.7(⁺NH₂CH₂Ph)，16.4(CH₃).

SCH₃信號(hào)與DMSO信號(hào)重疊。

實(shí)施例14：(R)-2-(((3′-氟甲氧基聯(lián)苯基-4-基)甲基)氨基)丙酰胺甲磺酸鹽的合成

白色固體；產(chǎn)率：87％；

¹H NMR(300MHz，DMSO-d₆)δ9.16(br s，2H)，7.93(br s，1H)，7.81(d，J＝8.07Hz，2H)，7.67(br s，1H)，7.49-7.60(m，5ArH)，7.23(m，1H)，4.15-4.20(m，2H)，3.79(q，J＝6.93Hz，1H)，2.30(s，3H)，1.44(d，J＝6.90Hz，3H)；¹³C NMR(75MHz，DMSO-d₆)δ170.9，(C(O))，164.8，161.6，142.3，142.2，139.7，139.6，132.0，131.5，131.4，131.2，127.5，123.3，123.2，115.1，114.8，114.0，113.7(ArC)，55.0(C(O)CH⁺NH₂)，48.6(⁺NH₂CH₂Ph)，16.4(CH₃).

SCH₃信號(hào)與DMSO信號(hào)重疊。

實(shí)施例15：(R)-2-(((4′-三氟甲基聯(lián)苯基-4-基)甲基)氨基)丙酰胺甲磺酸鹽的合成

白色固體；產(chǎn)率：87％；

¹H NMR(300MHz，DMSO-d₆)δ9.18(br s，2H)，7.93-7.95(m，3H)，7.84(d，J＝7.89Hz，4H)，7.62-7.66(m，3H)，4.12-4.22(m，2H)，3.80(q，J＝6.27Hz，1H)，2.31(s，3H)，1.45(d，J＝6.78Hz，3H)；¹³C NMR(75MHz，DMSO-d₆)δ170.9(C(O))；143.8，139.5，132.4，131.3，130.2，129.2，128.8，128.4，128.0，127.7，126.6，126.3，126.2，123.0，119.4(ArC)，55.1(C(O)CH⁺NH₂)，48.6(⁺NH₂CH₂Ph)，16.4(CH₃).

SCH₃信號(hào)與DMSO信號(hào)重疊。

實(shí)施例16：(R)-2-(((4′-三氟甲基聯(lián)苯基-4-基)甲基)氨基)乙酰胺甲磺酸鹽的合成

白色固體；產(chǎn)率：90％；

¹H NMR(300MHz，DMSO-d₆)δ9.26(br s，⁺NH₂)，7.91-7.93(m，2ArH，1C(O)NHH′)，7.79-7.82(m，4ArH)，7.65(d，J＝7.2Hz，2ArH)，7.58(br s，C(O)NHH′)，4.25(s，2H)，3.71(s，2H)，2.40(s，3H)；¹³C NMR(75MHz，DMSO-d₆)δ167.3(C(O))，143.8，139.6，132.3，131.4，128.6(q，J_C-F＝31.7Hz)，128.0，127.7，126.3(q，J_C-F＝3.7Hz)，124.8(q，J_C-F＝270.2Hz)(ArC)，49.9(C(O)CH⁺NH₂)，47.3(⁺NH₂CH₂Ph)，40.1(SCH₃).

實(shí)施例17：(R)-3-甲基-2-(((4′-三氟甲基聯(lián)苯基-4-基)甲基)氨基)丁酰胺甲磺酸鹽的合成

白色固體；產(chǎn)率：74％；

¹H NMR(300MHz，DMSO-d₆)δ9.20(br s，⁺NHH′)，8.95(br s，⁺NHH′)，7.78-7.96(m，6ArH，C(O)NH₂)，7.60-7.65(m，2ArH)，4.02-4.18(m，2H)，3.47-3.69(m，1H)，2.30(s，3H)，2.16-2.22(m，1H)，0.92-1.00(m，6H)；¹³C NMR(75MHz，DMSO-d₆)δ168.4(C(O))，143.8，139.6，131.8，131.7，128.6(q，J_C-F＝31.8Hz)，126.3(q，J_C-F＝3.7Hz)，124.8(q，J_C-F＝270.2Hz)，64.1(C(O)CH⁺NH₂)，49.7(⁺NH₂CH₂Ph)，40.2(SCH₃)，29.3(CHCH₂)，19.1(CH₃)，18.1(CH₃).

實(shí)施例18：(R)-4-甲基-2-(((4′-三氟甲基聯(lián)苯基-4-基)甲基)氨基)戊酰胺甲磺酸鹽的合成

白色固體；產(chǎn)率：77％；

¹H NMR(300MHz，DMSO-d₆)δ9.30(br s，⁺NHH′)，9.16(br s，⁺NHH′)，8.13(br s，C(O)NHH′)，7.94(d，J＝7.85Hz，2ArH)，7.84(d，J＝7.80Hz，4ArH)，7.79(br s，C(O)NHH′)，7.63(d，J＝7.85Hz，2ArH)，4.05-4.25(m，2H)，3.70-3.83(m，1H)，2.35(s，3H)，1.59-1.79(m，1CH，2CHCH₂)，0.80-1.03(m，6H)；¹³CNMR(75MHz，DMSO-d₆)δ169.9(C(O))，143.8，139.6，132.2，131.4，128.6(q，J_C-F＝31.9Hz)，128.4，127.7，126.3(q，J_C-F＝3.7Hz)，124.8(q，J_C-F＝270.3Hz)，58.4(C(O)CH⁺NH₂)，49.0(⁺NH₂CH₂Ph)，40.2(SCH₃)，24.4，23.5，22.3.

測試?yán)?.抑制單胺氧化酶B活性的效果(MAO-B測定)

(A)通過連續(xù)稀釋10倍將10mM化合物制成1mM、0.1mM、0.01mM、0.001mM和0.0001mM 5種濃度，并制備0.05M磷酸鈉(pH 7.4)緩沖液。

(B)用0.05M磷酸鈉緩沖液將5mg/mL人來源的單胺氧化酶B稀釋至1/200，并通過與5種濃度的2μL化合物溶液混合至100μL的最終體積來制備酶緩沖液。將酶緩沖液添加至96孔板中并進(jìn)行反應(yīng)1小時(shí)。

(C)通過將20mM Amplex Red(200μL)、100mM芐胺底物(200μL)和200U/mL辣根過氧化物酶(100μL)添加到0.05M磷酸鈉(pH7.4)緩沖液(9.5mL)中來制備工作緩沖液，以1∶1將100μL工作緩沖液與(B)的酶緩沖液混合并進(jìn)行孵育2小時(shí)，之后測量吸光度(570nm)。所測定的本公開內(nèi)容的化合物的活性示于表1中。

使用公知為可逆MAO-B抑制劑的沙芬酰胺作為對(duì)照。從[化學(xué)式2]可以看出，沙芬酰胺具有這樣的結(jié)構(gòu)，其中與根據(jù)本公開內(nèi)容的α-氨基酰胺連接的是芐氧基苯基而非聯(lián)苯基。

[化學(xué)式2]

(S)-沙芬酰胺

沙芬酰胺是公知的在動(dòng)物內(nèi)表現(xiàn)出較優(yōu)的MAO-B抑制作用和效力的物質(zhì)。然而，其用作選擇性MAO-B抑制劑時(shí)受到限制，因?yàn)槠溥€具有鈣通道和鈉通道抑制劑的作用。

【表1】

如從表1中可以看出，當(dāng)將多種官能團(tuán)引入聯(lián)苯基的位置X時(shí)，與鄰位或間位相比，當(dāng)將官能團(tuán)引入到對(duì)位時(shí)，獲得更好的活性，并且與引入F或Cl時(shí)相比，當(dāng)引入-CF₃或-OCF₃時(shí)獲得優(yōu)異的抑制效果。特別地，實(shí)施例9的化合物表現(xiàn)出最佳活性，其是沙芬酰胺的2倍或更高。雖然實(shí)施例15的化合物(其是實(shí)施例9的化合物的立體異構(gòu)體)也表現(xiàn)出優(yōu)異的活性，但是其活性比實(shí)施例9的化合物略低。此外，還在位置R處引入例如氫、異丙基和異丁基的烷基來替代甲基。雖然實(shí)施例16的化合物(其中引入氫)表現(xiàn)出僅略微降低的活性，但當(dāng)引入比甲基大的異丙基和異丁基時(shí)，觀察到顯著降低的活性。

此外，研究了根據(jù)本公開內(nèi)容實(shí)施例的化合物的細(xì)胞毒性和通過血腦屏障(blood-brain barrier，BBB)的能力。確認(rèn)了如下結(jié)論。

(1)取代基X位置的優(yōu)選順序?yàn)閷?duì)位、間位和鄰位。特別地，就MAO-B抑制活性而言，對(duì)位是最優(yōu)選的，并且與鄰位和間位相比，可以另外實(shí)現(xiàn)顯著降低抗體依賴性細(xì)胞毒性的效果。

(2)作為取代基X，-OCF₃、-CF₃和-Cl表現(xiàn)出優(yōu)異的MAO-B抑制活性。特別地，-OCF₃或-CF₃表現(xiàn)出比-Cl、-OCH₃或-F更好的MAO-B抑制活性，并且可以另外實(shí)現(xiàn)允許其容易地通過血腦屏障的效果。

(3)與R-異構(gòu)體相比，S-異構(gòu)體表現(xiàn)出更好的MAO-B抑制活性和顯著優(yōu)異的MAO-B活性恢復(fù)。此外，可以另外實(shí)現(xiàn)良好的代謝穩(wěn)定性和顯著較低的細(xì)胞毒性。

(4)作為取代基R，-CH₃和-H表現(xiàn)出較優(yōu)的MAO-B活性。特別地，-CH₃表現(xiàn)出比-H、-CH(CH₃)₂或-CH₂CH(CH₃)₂更好的MAO-B活性，并且可以另外實(shí)現(xiàn)允許其容易地通過血腦屏障的效果。

下文中，對(duì)實(shí)施例9的化合物(作為化合物的代表性實(shí)例)進(jìn)行測試?yán)源_認(rèn)效力。顯然，基于本公開內(nèi)容的描述可以對(duì)另一些化合物進(jìn)行相同的測試。

測試?yán)?：可逆抑制效果的確認(rèn)

根據(jù)圖1中描述的方法研究了可逆抑制效果。

通過周0.05M磷酸鈉(pH 7.4)緩沖液將5mg/mL的人來源的單胺氧化酶B稀釋至1/40來制備酶緩沖液。將441μL酶緩沖液與9μL實(shí)施例9的化合物(0.1mM)混合，接著進(jìn)行反應(yīng)2小時(shí)。

將反應(yīng)溶液分成兩份，各自為200μL。將一份轉(zhuǎn)移到96孔板(A)，并在離心過濾器(Ultra-3K)中在14,000g下將剩余那一份離心20分鐘(B)。向離心過濾器中添加500μL 0.05M磷酸鈉(pH 7.4)緩沖液，接著在14,000g下進(jìn)行離心20分鐘。該步驟重復(fù)2次。

通過向離心過濾器中添加200μL 0.05M磷酸鈉(pH 7.4)緩沖液來將離心過濾器中存留的人來源的單胺氧化酶B稀釋，然后轉(zhuǎn)移到96孔板中。然后，通過將20mM Amplex Red(200μL)、100mM芐胺底物(200μL)和200U/mL辣根過氧化物酶(100μL)添加到0.05M磷酸鈉(pH 7.4)緩沖液(9.5mL)中來制備成工作緩沖液，以1∶1將100μL工作緩沖液與酶緩沖液混合，并在進(jìn)行孵育2小時(shí)后測量吸光度(570nm)。

使用公知為不可逆MAO-B抑制劑的司來吉蘭作為對(duì)照以測試本公開內(nèi)容的化合物的可逆性。結(jié)果示于表2中。

【表2】

如從表2中可以看出，兩種化合物在1μM下均表現(xiàn)出80％或更高的抑制效果。當(dāng)用緩沖液洗滌3次后再次測量MAO-B的活性時(shí)，不可逆抑制劑司來吉蘭保持其抑制效果，但是本公開內(nèi)容的化合物由于在洗滌過程期間被洗掉而沒有表現(xiàn)出抑制效果。實(shí)際上，MAO-B的活性隨著抑制性化合物被洗掉而被恢復(fù)，這一事實(shí)表明本公開內(nèi)容的化合物是一種可逆抑制劑。

測試?yán)?：化合物9在帕金森病的MPTP小鼠模型中的效力

在帕金森病的MPTP小鼠模型中將化合物9的效力與現(xiàn)有的MAO-B抑制劑沙芬酰胺的效力進(jìn)行比較。在腹腔內(nèi)注射20mg/kg MPTP以誘導(dǎo)帕金森病，并經(jīng)口服施用10mg/kg的包含化合物9的MAO-B抑制劑。首先，從注射MPTP的前一天開始施用MAO-B抑制劑3天，并使用TH(酪氨酸羥化酶，tyrosine hydroxylase)作為多巴胺能神經(jīng)元的標(biāo)志物，通過免疫組織化學(xué)方法對(duì)MAO-B抑制劑的效果進(jìn)行定量分析。選擇其中存在多巴胺能神經(jīng)元的黑質(zhì)和紋狀體作為用于分析的腦部分。公知在帕金森病中，這些區(qū)域中TH的表達(dá)顯著降低。在以下實(shí)驗(yàn)中，研究了化合物9是否通過抑制MAO-B來保護(hù)多巴胺能神經(jīng)元免受MPTP的影響。

(1)首先，用化合物9處理一次后，測試其在經(jīng)MPTP處理的小鼠模型中的效力。

如從圖2a中可以看出，在酪氨酸羥化酶染色后，與對(duì)照組(鹽水)相比，僅用MPTP處理的模型中TH的表達(dá)顯著降低，這表明多巴胺能神經(jīng)元的數(shù)量顯著減少。然而，用MAO-B抑制劑沙芬酰胺和化合物9處理的模型則表現(xiàn)出與對(duì)照組相當(dāng)?shù)亩喟桶纺苌窠?jīng)元存活率。

(2)其次，在通過用MPTP處理來建立MPTP小鼠模型之后，從第3天開始對(duì)其用化合物處理，并觀察在帕金森病動(dòng)物模型中多巴胺能神經(jīng)元是否由于抑制MAO-B而得到恢復(fù)。

如從圖2b中可以看出，如同在預(yù)處理實(shí)驗(yàn)中，MPTP處理組的神經(jīng)元遭到破壞。相比之下，用MAO-B抑制劑沙芬酰胺和化合物9處理的模型表現(xiàn)出死亡神經(jīng)元顯著減少。特別地，化合物9將黑質(zhì)中的多巴胺能神經(jīng)元恢復(fù)到與未用MPTP處理的對(duì)照組相當(dāng)?shù)乃健?/p>

(3)再次，考慮到長期用藥的情況，研究了MAO-B抑制劑施用30天是否有效保護(hù)帕金森病MPTP模型中的神經(jīng)元。在紋狀體中，不可逆抑制劑司來吉蘭和化合物9將多巴胺能神經(jīng)元保護(hù)至與未用MPTP處理的對(duì)照組相當(dāng)?shù)乃?。沙芬酰胺表現(xiàn)出略低的效力。在另一方面，在黑質(zhì)中，與MPTP組相比，不可逆抑制劑司來吉蘭的效力降低，并且神經(jīng)元的數(shù)量沒有顯著恢復(fù)。相比之下，可逆抑制劑化合物9保護(hù)神經(jīng)元至類似于對(duì)照組的水平。這表明因?yàn)樗緛砑m不可逆地抑制MAO-B，其MAO-B抑制效果在長期用藥時(shí)由于代償機(jī)制而被抵消。這就是司來吉蘭在長期用藥時(shí)對(duì)治療帕金森病無效的原因。也就是說，如從圖2c中可以看出，化合物9在帕金森病MPTP小鼠模型中的三個(gè)測試中表現(xiàn)出了與司來吉蘭和沙芬酰胺相比較優(yōu)的效力。

測試?yán)?：化合物9在阿爾茨海默病APP/PS1小鼠模型中的效力

本公開內(nèi)容的發(fā)明人最近通過抑制MAO-B揭示了阿爾茨海默病治療的新可能性(Jo等，Nature Medicine 2014)。在該研究中他們發(fā)現(xiàn)，如圖3a至3b中所示，雖然不可逆的MAO-B抑制劑司來吉蘭在阿爾茨海默病模型中初始時(shí)表現(xiàn)出優(yōu)異的效力，但是在2周后效力大大降低，4周后沒有觀察到效力，而可逆的MAO-B抑制劑沙芬酰胺即使在2周之后也保持優(yōu)異的療效。

在測試?yán)?中，如下研究了可逆MAO-B抑制劑化合物9在APP/PS1小鼠中的效力。首先，通過混合在飲用水中，使APP/PS1小鼠自由攝取化合物9，持續(xù)2周。在給藥2周后，制備腦組織切片并使用膜片鉗技術(shù)將電極連接到齒狀回顆粒細(xì)胞處?？梢允褂秒姌O檢測顆粒細(xì)胞的膜電位和尖峰的變化。通過對(duì)齒狀回施加10次電刺激并同時(shí)計(jì)數(shù)顆粒細(xì)胞的尖峰響應(yīng)的數(shù)量來計(jì)算尖峰概率。用化合物9處理2周后，在改變電刺激強(qiáng)度并隨之測量尖峰概率時(shí)，觀察到如圖3b所示的較優(yōu)效力?；衔?的效力高于沙芬酰胺。

測試?yán)?：化合物9與沙芬酰胺相比的差異性和優(yōu)越性

現(xiàn)有的可逆MAO-B抑制劑沙芬酰胺不僅以其MAO-B抑制效果，而且也作為鈉通道和鈣通道抑制劑為人所熟知。選擇性抑制MAO-B并且對(duì)通道的抑制最小化的帕金森病和阿爾茨海默病治療劑可具有作為腦部疾病治療劑的良好穩(wěn)定性。為了研究通道抑制效果，利用海馬的DGGC(齒狀回顆粒細(xì)胞，denate gyrus granule cell)在電生理上研究了對(duì)通道興奮性的抑制。

從圖4中可以看出，雖然沙芬酰胺在10μM下表現(xiàn)出約40％的興奮性抑制效果，但是化合物9幾乎沒有表現(xiàn)出抑制效果。在較高的50μM濃度下化合物9也表現(xiàn)出低于沙芬酰胺的抑制效果。這表明化合物9對(duì)海馬DGGC的興奮性抑制效果遠(yuǎn)低于沙芬酰胺。該結(jié)果表明，由于與沙芬酰胺相比低得多的通道抑制效果，化合物9作為選擇性MAO-B抑制劑是穩(wěn)定的。

測試?yán)?：化合物9和沙芬酰胺針對(duì)MAO-B的分子建模

通過對(duì)接實(shí)驗(yàn)預(yù)測了化合物9對(duì)MAO-B的結(jié)合模式。首先，使用MAO-B X射線晶體結(jié)構(gòu)預(yù)測可逆抑制劑沙芬酰胺的結(jié)合模式。如圖5中所示，在稱為MAO-B的活性位點(diǎn)的袋中觀察到較優(yōu)的結(jié)合親和性(SP分?jǐn)?shù)：-10.862kcal/mol)。當(dāng)對(duì)化合物9進(jìn)行計(jì)算時(shí)，預(yù)測其在與沙芬酰胺相同的活性位點(diǎn)結(jié)合，并且預(yù)計(jì)結(jié)合親和性比沙芬酰胺更強(qiáng)(SP分?jǐn)?shù)：-11.795kcal/mol)。

測試?yán)?：肥胖抑制效果

A.使用高脂飲食建立肥胖模型小鼠

將7周齡的小鼠分為2組，分別給予正常飲食(白色，食物)和高脂肪飲食(藍(lán)色，HFD)8周。結(jié)果示于圖6中。

提供給正常飲食小鼠和高脂飲食小鼠的總卡路里設(shè)定為相等。在8周時(shí)測得正常飲食組的平均體重為3g，比2.5g的初始重量增加約20％。相比之下，高脂飲食的平均體重幾乎翻倍，達(dá)到約4.8克。

B.肥胖模型小鼠中的反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞的出現(xiàn)

在給予高脂飲食8周的小鼠的弓形核中觀察到反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞的變化。如圖7中所示，與正常飲食小鼠相比，在高脂飲食小鼠的弓形核中觀察到GFAP(反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞的生物標(biāo)志物)的顯著增加。除了反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞增加外，還檢測到過量產(chǎn)生的γ-氨基丁酸(GABA)。

C.由實(shí)施例9的化合物導(dǎo)致的肥胖模型小鼠體重的減輕

研究了實(shí)施例9的化合物在肥胖的HFD(高脂飲食)小鼠模型中的體重減輕效果。如圖8中所示，實(shí)施例9的化合物以濃度依賴性方式抑制由于高脂飲食的攝入而引起的體重增加，并且食物攝取量沒有差異。具體而言，與正常小鼠(對(duì)照)相比，高脂飲食小鼠表現(xiàn)出增加20％或更多的體重。施用實(shí)施例9的化合物導(dǎo)致體重減輕。特別地，10mg/kg/天組和100mg/kg/天組也以濃度依賴性方式表現(xiàn)出體重減輕。

D.肥胖模型小鼠弓形核的反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞中的GABA的增加和由實(shí)施例9的化合物導(dǎo)致的GABA的減少

將實(shí)施例9的化合物施用于高脂飲食小鼠的結(jié)果示于圖9中。在弓形核中觀察到GFAP(反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞的生物標(biāo)志物)顯著減少，并且也確認(rèn)了對(duì)GABA過量產(chǎn)生的有效抑制。

通過這些結(jié)果可以看出，包含根據(jù)本公開內(nèi)容的α-氨基酰胺衍生物作為活性成分的組合物可以有效地用作肥胖的治療劑，因?yàn)棣?氨基酰胺衍生物可以表現(xiàn)出通過可逆地抑制MAO-B的抗肥胖效力。

【工業(yè)適用性】

因?yàn)棣?氨基酰胺衍生物可以通過抑制MAO-B來防止下丘腦的反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞中的GABA的過度產(chǎn)生，所以其可以表現(xiàn)出通過作用于選擇性誘導(dǎo)能量消耗的POMC神經(jīng)元而治療肥胖的效果。因此，其可以克服以中樞神經(jīng)系統(tǒng)和糖/脂肪代謝調(diào)節(jié)為中心的現(xiàn)有肥胖治療劑的副作用和效力問題，并且可以有效地用作新的肥胖癥治療劑。此外，因?yàn)槠淇梢砸种茖?duì)多巴胺能神經(jīng)元的變性或破壞，其可以有效地用作神經(jīng)退行性疾病如帕金森病、阿爾茨海默病等的治療劑。