本發(fā)明涉及用于擴增T細胞群體，包括γδT細胞的方法。本發(fā)明還涉及包含擴增的T細胞的藥物組合物，及其用于治療傳染病、自身免疫病和惡性疾病的用途。

發(fā)明背景

盡管科學和醫(yī)學進步，癌癥和傳染病仍然是全世界，并且主要是發(fā)達國家中的主要死因。免疫系統(tǒng)在控制這些疾病中的作用是已知的，且其操作已成為極為可能的治療策略。

基于細胞的免疫療法被證明對某些癌癥有效。發(fā)現(xiàn)對T細胞群體的操作引起疾病退化和腫瘤細胞死亡。例如，自體腫瘤浸潤淋巴細胞用于治療患轉(zhuǎn)移性黑素瘤患者(Rosenberg等人.Science 1986,233:1318–1321)。發(fā)現(xiàn)將識別腫瘤細胞上表達的抗原的αβT細胞輸注到癌癥患者引起白血病腫瘤細胞死亡，導致臨床改善和甚至恢復。然而，僅少部分患者受益于αβT細胞療法，表明需要另外的治療形式。

近來，γδT細胞在治療癌癥和傳染病方面的潛力已被認識到，但是在具有癌癥或慢性感染的患者中，γ9δ2 T細胞的數(shù)量和功能被抑制。已經(jīng)表明，自體離體擴增的γ9δ2T細胞的施用引起抗癌作用，偶爾導致轉(zhuǎn)移性疾病的治愈。

美國專利號8,609,410公開了一種用于活化抗原遞呈細胞的方法，該方法包括在體外用二膦酸鹽和疾病抗原共刺激抗原遞呈細胞。

美國專利申請?zhí)?3/001,581(公布號2012/0107292)公開了一種培養(yǎng)疾病抗原特異性細胞毒性T淋巴細胞(CTL)和γδT細胞的方法，包括向從血液中分離出的外周血單核細胞的培養(yǎng)物中加入氨基二膦酸鹽和疾病抗原，并進行培養(yǎng)程序，直到抗原特異性CTL和γδT細胞增殖并達到對治療有效的數(shù)量。

Itzhaki等人(J Immunothe.34(2):212-220,2011)描述了使用抗CD3抗體和IL-2對腫瘤浸潤淋巴細胞的大規(guī)模擴增。

Lopez等人(Blood,96(12):3827-3837,2000)公開了，γδ-T細胞對由T細胞有絲分裂原OKT3(抗CD3抗體)和IL-2誘導的細胞凋亡異常敏感。

對于有效的離體T細胞，特別是γδT細胞擴增平臺仍然存在未被滿足的需求，所述擴增平臺可提供極大產(chǎn)量的可用于免疫治療的存活且有效的細胞。

發(fā)明概述

本發(fā)明提供了大規(guī)模活化和擴增T細胞群體，包括γδT細胞群體的方法。T細胞可來源于需要用所述細胞免疫治療的受試者或來自另一受試者的外周血單核細胞(PBMC)。擴增方法主要包括兩個階段的擴增，包括第一擴增階段和第二擴增階段，第一擴增階段基于唑來膦酸和任選地白介素-2(IL-2)刺激，第二擴增階段包括用αCD3和被輻照的飼養(yǎng)細胞PBMC(外周血單核細胞，任選地，同種異體的)和IL-2孵育。

本發(fā)明還提供了治療有其需要的受試者的方法，包括在擴增所述細胞后分別自體或同種異體移植來源于所述受試者或另一受試者的PBMC的γδT細胞，從而使得能夠進行實現(xiàn)醫(yī)學改善或治愈所需的眾多移植周期。

因此，如下文所示，順序施用唑來膦酸刺激與IL-2，然后對γδT細胞群進行陰性(或陽性)選擇，且隨后用αCD3和IL-2孵育，提供了非常高產(chǎn)量的存活和有能力的γδT細胞。因此，本發(fā)明的方法適用于過繼性免疫治療，允許有效和長期的治療。

根據(jù)一些實施方案，提供了一種用于快速擴增T細胞的方法，所述方法包括以下步驟：

(i)提供包含T細胞群體的外周血單核細胞；

(ii)在包含至少一種二膦酸鹽的第一培養(yǎng)基中孵育所述外周血單核細胞(PBMC)持續(xù)第一時間段，從而獲得所述T細胞群體的第一階段擴增；和

(iii)在包含α-CD3抗體和IL-2的第二培養(yǎng)基中孵育所述外周血單核細胞持續(xù)第二時間段，從而獲得所述T細胞群體的第二階段擴增，其中所述第二階段擴增為至少100倍擴增。

應當理解，本文公開的擴增的倍數(shù)是指相對于進入某一(第一或第二)擴增階段的細胞數(shù)目，在該特定階段結(jié)束時的細胞數(shù)量的變化倍數(shù)。T細胞群體經(jīng)受步驟(ii)后的擴增也被稱為“第一階段擴增”、“I階段擴增”或“PIE”，其中T細胞群體經(jīng)受步驟(iii)后的擴增也被稱為“第二階段擴張”、“快速擴增程序”或“REP”。

在一些實施方案中，T細胞群體包含γδT細胞。在一些實施方案中，T細胞群體由γδT細胞組成。

在一些實施方案中，外周血單核細胞從罹患惡性疾病、自身免疫病或傳染病的受試者獲得。在一些實施方案中，外周血單核細胞從未罹患惡性疾病、傳染病或自身免疫病的健康供體獲得。

在一些實施方案中，所述第一階段擴增是相對于在第一階段擴增之前所述T細胞群體中的初始細胞數(shù)，這一群體的至少100倍、至少200倍、至少300倍、至少400倍或至少500倍擴增。

在一些實施方案中，所述第一階段擴增是相對于在第一階段擴增之前所述T細胞群體中的初始細胞數(shù)，這一群體的100至1000倍范圍內(nèi)的擴增。

在一些實施方案中，所述T細胞群體由γδT細胞組成，并且所述第一階段擴增是相對于在第一階段擴增之前所述γδT細胞群體中的初始細胞數(shù)，即相對于步驟(i)中提供的初始PBMC中的γδT細胞的數(shù)目，這一群體的100至1000倍范圍內(nèi)的擴增。

在一些實施方案中，所述第二階段擴增是相對于在第一階段擴增之后且在第二階段擴增之前所述T細胞群體中的細胞數(shù)，這一群體的至少100倍、至少200倍、至少300倍、至少400倍或至少500倍擴增。

在一些實施方案中，所述第二階段擴增是相對于在第一階段擴增之后和進入第二階段擴增之前所述T細胞群體中的細胞數(shù)，這一群體的100至1000倍范圍中的擴增。

在一些實施方案中，所述T細胞群體由γδT細胞組成，并且所述第二階段擴增是相對于在第一階段擴增之后和在第二階段擴增之前所述γδT細胞群體中的細胞數(shù)，這一群體的100至1000倍、或500倍至1000倍范圍內(nèi)的擴增。

在一些實施方案中，所述T細胞群體由γδT細胞組成，其中所述γδT細胞在所述第一階段擴增和所述第二階段擴增后經(jīng)歷10⁴倍至10⁶倍范圍內(nèi)的總體擴增。在一些實施方案中，所述方法還包括將步驟(iii)中獲得的T細胞群體或其一部分移植到所述受試者。

在一些實施方案中，所述方法還包括在步驟(iii)之前從所述外周血單核細胞中選擇和分離T細胞，并將分離的T細胞孵育在所述第二培養(yǎng)基中。在一些實施方案中，選擇包括陰性選擇。在一些實施方案中，選擇包括陽性選擇。

在一些實施方案中，所述方法還包括在步驟(iii)之后選擇和分離γδT細胞。

在一些實施方案中，所述方法還包括在步驟(ii)或(iii)中的任一步驟之后另外的選擇步驟，其包括使用免疫磁性柱的陰性選擇。

在一些實施方案中，第一培養(yǎng)基還包含IL-2。

在一些實施方案中，步驟(i)中的所述外周血單核細胞具有約0.5X10⁶至1X10⁶細胞/ml的細胞密度。

在一些實施方案中，第二時間段是至少10天。

在一些實施方案中，所述至少一種二膦酸鹽選自由以下組成的組：唑來膦酸、帕米膦酸、阿侖膦酸、利塞膦酸、伊班膦酸、英卡膦酸、依替膦酸、利塞膦酸、替魯膦酸、其組合、其鹽及其水合物。每種可能性是本發(fā)明的單獨的實施方案。

在一些實施方案中，所述至少一種二膦酸鹽是唑來膦酸。

在一些實施方案中，所述第二培養(yǎng)基還包含被輻照的外周血單核細胞。

根據(jù)一些實施方案，提供了包含通過以下得到的T細胞群體的藥物組合物：

(i)提供包含T細胞群體的外周血單核細胞；

(ii)在包含至少一種二膦酸鹽的第一培養(yǎng)基中孵育所述外周血單核細胞持續(xù)第一時間段，從而獲得所述T細胞群體的第一階段擴增；和

(iii)在包含α-CD3抗體和IL-2的第二培養(yǎng)基中孵育從所述第一培養(yǎng)基收回的外周血單核細胞持續(xù)第二時間段，從而獲得所述T細胞群體的第二階段擴增，其中所述第二階段擴增為至少100倍擴增。

在一些實施方案中，所述藥物組合物還包含至少一種藥學上可接受的載體或稀釋劑。

在一些實施方案中，所述藥物組合物包含治療有效量的T細胞。

在一些實施方案中，T細胞群體包含來源于PBMC的γδT細胞。在一些實施方案中，T細胞群體由來源于PBMC的γ9δ2T細胞組成。在一些實施方案中，γδT細胞包含來源于PBMC的同種異體γδT細胞。在一些實施方案中，γδT細胞包含來源于PBMC的自體γδT細胞。在一些實施方案中，藥物組合物包含來源于需要γδT細胞移植的受試者的PBMC的自體γδT細胞。在一些實施方案中，藥物組合物包含來源于需要γδT細胞移植的受試者的PBMC的同種異體γδT細胞。

在一些實施方案中，藥物組合物包含在所述第一和第二培養(yǎng)基中孵育自體外周血單核細胞之后從所述外周血單核細胞獲得的自體γδT細胞。

在一些實施方案中，藥物組合物包含在所述第一和第二培養(yǎng)基中孵育同種異體外周血單核細胞之后從所述外周血單核細胞獲得的同種異體γδT細胞。

在一些實施方案中，藥物組合物是以細胞懸液形式。

在一些實施方案中，藥物組合物用于在有其需要的受試者中治療傳染病、自身免疫病或惡性疾病。

根據(jù)一些實施方案，提供治療傳染病、自身免疫病或惡性疾病的方法，包括：

(i)從第一受試者獲得包含T細胞群體的外周血單核細胞；

(ii)在包含至少一種二膦酸鹽的第一培養(yǎng)基中孵育所述外周血單核細胞持續(xù)第一時間段，從而獲得所述T細胞群體的第一階段擴增；

(iii)在包含α-CD3抗體和IL-2的第二培養(yǎng)基中孵育所述外周血單核細胞持續(xù)第二時間段，從而獲得所述T細胞群體的第二階段擴增，其中所述第二階段擴增為至少100倍擴增；和

(iv)向第二受試者施用所述細胞或其一部分。

在一些實施方案中，所述第二受試者和所述第一受試者是同一受試者。在一些實施方案中，所述第二受試者不同于所述第一受試者。在一些實施方案中，所述方法還包括在步驟(iii)之前從所述外周血單核細胞中選擇和分離T細胞，并將分離的T細胞孵育在所述第二培養(yǎng)基中。

在一些實施方案中，T細胞群體包含γδT細胞。在一些實施方案中，T細胞群體由γδT細胞組成。

在一些實施方案中，所述方法還包括多重復步驟(iv)至少一次。

在一些實施方案中，所述方法還包括重復步驟(iv)，直到完成所述傳染性、自身免疫性或惡性疾病或病癥的治療。

在一些實施方案中，治療所述傳染性、自身免疫性或惡性疾病或病癥包括抑制所述傳染性、自身免疫性或惡性疾病或病癥，減弱所述傳染性、自身免疫性或惡性疾病或病癥，實現(xiàn)從與所述傳染病、自身免疫病或惡性疾病相關(guān)的癥狀中緩解，以及其組合。

在一些實施方案中，提供了用于擴增T細胞的試劑盒，該試劑盒包含：

(i)至少一個第一容器，其包含含有至少一種二膦酸鹽的第一培養(yǎng)基；

(ii)至少一個第二容器，其包含含有α-CD3抗體和IL-2的第二培養(yǎng)基；和

(iii)使用所述試劑盒擴增T細胞群體的書面說明。

在一些實施方案中，所述試劑盒還包含用于選擇T細胞的裝置。在一些實施方案中，所述試劑盒還包含用于選擇T細胞的一個或更多個柱。在一些實施方案中，T細胞群體包含γδT細胞。在一些實施方案中，T細胞群體由γδT細胞組成。

在一些實施方案中，至少一種容器還包含IL-2。

在一些實施方案中，提供了用于治療傳染病、惡性疾病或自身免疫病的試劑盒，該試劑盒包含：

(i)至少一種第一容器，其在提供長期儲存的條件中包含針對γδT細胞被富集的T細胞群體，其中所述T細胞群體通過以下獲得：

a.提供包含T細胞群體的外周血單核細胞；

b.在包含至少一種二膦酸鹽的第一培養(yǎng)基中孵育所述外周血單核細

胞持續(xù)第一時間段，從而獲得針對γδT細胞被富集的所述T細胞群體

的第一階段擴增；和

c.在包含α-CD3抗體和IL-2的第二培養(yǎng)基中孵育所述外周血單核細

胞持續(xù)第二時間段，從而獲得針對γδT細胞被富集的所述T細胞群體

的至少100倍擴增的第二階段擴增；和

(ii)在有其需要的受試者中使用所述試劑盒移植所述T細胞群體的書面說明。

在一些實施方案中，至少一個第一容器中的T細胞群體包含治療有效量的γδT細胞。

從下文提供的詳述和附圖中，本發(fā)明的另外的實施方案、特征、優(yōu)勢和適用性的全部范圍將變得明顯。然而，應該理解，盡管指出了本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，詳述僅通過示例的方式提供，因為根據(jù)該詳述，在本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)的多種改變和修改對本領(lǐng)域技術(shù)人員將變得明顯。

附圖簡述

示例性實施方案在所述及的附圖中被闡釋。預期本文公開的實施方案和附圖將被認為是說明性的而非限制性的。附圖如下所列。

圖1A顯示在健康供體(HD,n＝6)和癌癥患者(CP,n＝2)中的第一階段擴增(PIE)期間的細胞總數(shù)。

圖1B顯示在HD(健康供體)和CP(癌癥患者)中接種(第0天)和REP(第14天)后的CD3+γ9+T細胞數(shù)(60-99％純度)。

圖1C顯示REP后γδT細胞的擴增倍數(shù)。

圖2A是用針對CD3(Y軸)和γ9(X軸)的單克隆抗體染色的健康供體的PBMC的流式細胞術(shù)點圖，表明2.64％的細胞是CD3+γ9+T細胞。

圖2B是用針對CD3(Y軸)和γ9(X軸)的單克隆抗體染色的用唑來膦酸鹽和IL-2培養(yǎng)14天后的健康供體的PBMC的流式細胞術(shù)點圖，表明79.6％的細胞是CD3+γ9+T細胞。

圖3A是圖2B中的細胞在被剝離CD4和CD8細胞(通過免疫磁性柱)之后的流式細胞術(shù)點圖，導致含有97.7％CD3+γ9+T細胞的細胞群。

圖3B是圖3A中展示的細胞群體內(nèi)的CD4和CD8細胞群的流式細胞術(shù)點圖(在CD4和CD8被剝離后)。

圖4是圖3A中展示的細胞群體在用抗-CD3抗體和IL-2培養(yǎng)后的流式細胞術(shù)點圖，導致87.1％的CD3+γ9+T細胞。

圖5顯示了在REP下用(Zol)或無唑來膦酸鹽(Med)培養(yǎng)的多形性膠質(zhì)母細胞瘤(GBM)細胞系的IFNγ分泌。計算與對照組(Med)相比，唑來膦酸鹽的P值。

圖6A顯示用唑來膦酸鹽培養(yǎng)的效應γδT細胞(圓圈)；用唑來膦酸鹽培養(yǎng)的效應αβT細胞(菱形)；在不存在唑來膦酸鹽下培養(yǎng)的效應γδT細胞(方格)；和在不存在唑來膦酸鹽下培養(yǎng)的效應αβT(三角形)孵育的T98G多形性膠質(zhì)母細胞瘤細胞的比細胞毒性(％)。

圖6B顯示用唑來膦酸鹽培養(yǎng)的效應γδT細胞(圓圈)；用唑來膦酸鹽培養(yǎng)的效應αβT細胞(菱形)；在不存在唑來膦酸鹽下培養(yǎng)的效應γδT細胞(方格)；和在不存在唑來膦酸鹽的下培養(yǎng)的效應αβT(三角形)孵育的U251多形性膠質(zhì)母細胞瘤細胞的比細胞毒性(％)。

圖6C顯示用唑來膦酸鹽培養(yǎng)的效應γδT細胞(圓圈)；用唑來膦酸鹽培養(yǎng)的效應αβT細胞(菱形)；在不存在唑來膦酸鹽下培養(yǎng)的效應γδT細胞(方格)；和在不存在唑來膦酸鹽下培養(yǎng)的效應αβT(三角形)孵育的U87多形性膠質(zhì)母細胞瘤細胞的比細胞毒性(％)。

圖6D顯示用唑來膦酸鹽培養(yǎng)的效應γδT細胞(圓圈)；用唑來膦酸鹽培養(yǎng)的效應αβT細胞(菱形)；在不存在唑來膦酸鹽下培養(yǎng)的效應γδT細胞(方格)；和在不存在唑來膦酸鹽下培養(yǎng)的效應αβT(三角形)孵育的Daudi淋巴瘤細胞的比細胞毒性(％)。

發(fā)明詳述

本發(fā)明提供了用于離體擴增T細胞群體的方法。在培養(yǎng)中擴增存活和功能性免疫細胞的能力提供了潛在的免疫治療工具。本發(fā)明的教導進一步提供了兩個細胞擴增步驟，其被發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生異常高產(chǎn)量的相對罕見的T細胞亞群，γδT細胞。擴增的γδT細胞群可從受試者的PBMC細胞獲得，并且根據(jù)本發(fā)明的方法擴增后，可通過移植用于許多治療。擴增的γδT細胞群體對于許多植入可能是足夠的，每次可將一部分被擴增的群體重新引入受試者用于免疫治療。

Gamma delta T細胞(γδT細胞)代表在其表面上具有獨特T細胞受體(TCR)的T細胞亞群群體。這些細胞在外周血T細胞中相對罕見(1-10％)。大多數(shù)T細胞具有αβTCR，其包括α和β糖蛋白鏈。與之相比，γδT細胞具有由一條γ鏈和一條δ鏈組成的TCR。與αβT細胞相反，γδT細胞的活化不依賴于主要組織相容性復合物分子的抗原呈遞，而是由病原體來源的抗原和在應激如癌癥、自身免疫病和傳染病中被上調(diào)的自身分子介導。在成人外周血中，大多數(shù)γδT細胞表達包括Vδ2和Vγ9基因區(qū)段的TCR。

人類γδTCR，特別是表達γ9和δ2基因的那些，表現(xiàn)為識別非蛋白來源的抗原。這些抗原對于多種致病細菌是常見的，并且也以非常低的水平在人類細胞中表達，逃避被循環(huán)的γ9+δ2+γδT細胞識別。然而，作為甲羥戊酸途徑中的代謝物的這些抗原(最重要的是異戊烯基焦磷酸鹽，IPP)，變得被“病態(tài)”或“應激”的人類細胞過表達，包括各種各樣的癌癥和細菌和病毒感染的細胞。IPP水平的提高使γ9δ2T細胞能夠區(qū)分被感染的或癌性的“應激”的細胞與健康細胞。γ9δ2TCR對這些常見的抗原的識別觸發(fā)細胞毒性響應，導致癌細胞的殺傷和細胞因子，特別是IFNγ的分泌，這些細胞因子對于增加針對癌癥或感染的免疫應答至關(guān)重要。區(qū)分腫瘤細胞與健康細胞的另一種手段是通過上調(diào)自身抗原如熱休克蛋白(HSP)和NKG2D受體的配體。

雖然γ9δ2T細胞固有地存在于人體內(nèi)并且可潛在地殺死癌性細胞，但它們表現(xiàn)為不足以控制已經(jīng)發(fā)展的癌癥和/或擴散的癌癥。此外，在癌癥患者和在患包括結(jié)核病和AIDS的慢性感染患者中，這些細胞的數(shù)量和功能可能被抑制。然而，幸運的是，根據(jù)本發(fā)明的方法，從這些患病個體的血液中收集的γ9δ2T細胞可在實驗室中被活化并顯著擴增。此外，根據(jù)本發(fā)明的方法，從健康供體的血液中收集的γ9δ2 T細胞可在實驗室中被活化并顯著擴增。

本文所用的術(shù)語“健康受試者”、“健康供體”和“健康個體”是指這樣的個體，其捐贈包含T細胞群體的外周血細胞以便按照本發(fā)明的方法擴增γ9δ2T細胞，以及用于同種異體移植。健康供體可以，或可不，罹患需要移植γ9δ2T細胞的疾病或病癥。在這一背景中，需要γ9δ2T細胞移植的受試者是接受者。在自體移植的情形中，供體和接受者是同一個體。

γδT細胞在培養(yǎng)物中是敏感的，顯示出與αCD3和IL-2孵育時的凋亡傾向(Lopez等人，同上)。凋亡通常在培養(yǎng)10-14天后開始。出乎意料的是，本發(fā)明的方法能夠?qū)崿F(xiàn)兩階段擴增，這導致γδT細胞的高產(chǎn)量。因此，本發(fā)明的方法克服了凋亡引起的擴增障礙。

有利地，通過本發(fā)明的方法獲得的γδT細胞群體可用于許多免疫治療周期。

本文使用的術(shù)語“γδT細胞”和“γ9δ2T細胞”是可互換的。不受任何理論或機制的束縛，二膦酸鹽和任選地IL-2刺激的組合，隨后在α-CD3和IL-2以及任選地被輻照的外周血單核細胞(以下也稱為“飼養(yǎng)細胞”)的存在下培養(yǎng)，使得能夠顯著擴增，同時保持細胞的活力和效力。

在一些實施方案中，本發(fā)明提供了一種用于快速擴增T細胞的方法，所述方法包括以下步驟：

(i)提供包含T細胞群體的外周血單核細胞；

(ii)在包含至少一種二膦酸鹽和IL-2的第一培養(yǎng)基中孵育所述外周血單核細胞持續(xù)第一時間段；和

(iii)在包含α-CD3抗體和IL-2以及同種異體的被輻照的單核細胞的第二培養(yǎng)基中孵育所述外周血單核細胞持續(xù)第二時間段，從而獲得所述T細胞群體的至少100倍擴增。

本文所用的術(shù)語“細胞擴增”是指相對于初始群體中的細胞數(shù)目，擴大細胞群體導致更大細胞數(shù)量的過程。通常，并如本文所教導的，細胞擴增離體進行，例如在培養(yǎng)皿中進行。從組織或從外周血系統(tǒng)取出細胞，并暴露于擴增細胞群體的增殖劑。細胞擴增也可指與正常增殖速率相比導致細胞數(shù)量增加更快的操作。在一些實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的擴增階段的擴增速率為每兩周至少100倍。在其他實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的擴增階段的擴增速率為每兩周至少300倍。細胞擴增可以與“富集”互換，是指T細胞群體對γδT細胞的富集。根據(jù)本文公開的方法，γδT細胞的富集可以是至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％和至少90％的富集。每種可能性代表本發(fā)明的單獨的實施方案。

PBMC是獲得免疫細胞諸如淋巴細胞的良好來源。在一些實施方案中，PBMC來源于罹患癌癥、自身免疫病或傳染病的受試者的血液。在一些實施方案中，PBMC來源于健康受試者的血液。感興趣的細胞可被進一步分離并離體擴增，隨后作為免疫治療劑再引入患者系統(tǒng)。

術(shù)語“再引入”、“移植”、“植入”和“注入”是可互換的，并是指將本發(fā)明的擴增的T細胞施用于罹患需要使用所述細胞治療的疾病或病癥的受試者。因此，施用還包括植入根據(jù)本發(fā)明的擴增的細胞。在一些實施方案中，植入是自體植入。

在一些實施方案中，初始PBMC分離程序可包括使用ficoll，ficoll是一種分離血液層的高度支化親水性多糖。Ficoll可用于將PBMC與血漿、多形核細胞和紅細胞分離。

在一些實施方案中，擴增的第一步驟包括使用一種或更多種二膦酸鹽。二膦酸鹽是通常用于防止骨量損失的藥物。這些劑還用于治療與骨損失和/或變形相關(guān)的疾病，諸如骨質(zhì)疏松癥、變形性骨炎，骨轉(zhuǎn)移(伴隨或不伴隨高鈣血癥)和多發(fā)性骨髓瘤。

在一些實施方案中，所述二膦酸鹽選自由以下組成的組：唑來膦酸、帕米膦酸、阿侖膦酸、利塞膦酸、伊班膦酸、英卡膦酸、依替膦酸、利塞膦酸、替魯膦酸、其組合、其鹽及其水合物。每種可能性代表本發(fā)明的單獨的實施方案。在另一個實施方案中，二膦酸鹽是唑來膦酸或唑來膦酸鹽。

在一些實施方案中，二膦酸鹽濃度是從0.1至10μM。在一些實施方案中，二膦酸鹽濃度是從0.5至6μM。在一些實施方案中，二膦酸鹽濃度是從1至3μM。在一些實施方案中，二膦酸鹽濃度是約2μM。

本文所用的術(shù)語“約”是指大約、大致、周圍或在該區(qū)域中。當術(shù)語“約”與數(shù)值范圍結(jié)合使用時，其通過將所述數(shù)值的上方和下方的邊界延伸來修改該范圍。通常，術(shù)語“約”在本文中用于通過向上或向下(更高或更低)20％，任選地10％的變化將數(shù)值修改為高于和低于所述的值。

根據(jù)一些實施方案，可向第一擴增步驟中加入另外的增殖劑。在一些實施方案中，將白介素2(IL-2)加入到第一培養(yǎng)基中。在一些實施方案中，IL-2是重組人IL-2。在一些實施方案中，每3天更換具有IL-2的新鮮培養(yǎng)基。在一些實施方案中，IL-2濃度是從20至400國際單位(IU)/ml。在一些實施方案中，IL-2濃度是從50至200國際單位(IU)/ml。在一些實施方案中，IL-2濃度是約100國際單位(IU)/ml。

第一步驟擴增的時間，也稱為“第一時間段”，是約兩周。在一些實施方案中，第一時間段是從7至20天。在一些實施方案中，第一時間段是從12至16天。在一些實施方案中，第一時間段是約14天。

在一些實施方案中，第二時間段是至少7天、至少10天、或約14天。

在一些實施方案中，第二時間段包括用抗CD3(α-CD3)抗體和IL-2孵育包含γδT細胞的PBMC細胞。

在一些實施方案中，第二時間段還包括用被輻照的PBMC細胞孵育所述細胞。

在一些實施方案中，所述α-CD3抗體是單克隆抗體。在一些實施方案中，所述α-CD3抗體是OKT3。

抗CD3包括OKT3，OKT3是一種靶向T細胞表面的CD3受體的單克隆抗體。OKT3被FDA批準用于減少患者器官移植后的急性排斥反應。

在一些實施方案中，第二培養(yǎng)基包含濃度為從約0.05ng/ml至1μg/ml的α-CD3抗體。在一些實施方案中，所述第二培養(yǎng)基中的α-CD3抗體濃度為約0.1ng/ml至0.5μg/ml。在一些實施方案中，α-CD3抗體濃度為約2ng/ml至100ng/ml。在一些實施方案中，所述第二培養(yǎng)基中的α-CD3抗體濃度為約20ng/ml至40ng/ml。在一些實施方案中，所述第二培養(yǎng)基中的α-CD3抗體濃度為約30ng/ml。

在第一和/或第二步驟的擴增之后，細胞可還經(jīng)歷選擇步驟。選擇步驟旨在提高擴增方法的特異性，即，將方法集中于特定細胞的擴增。在一些實施方案中，選擇步驟是使用免疫磁性柱的陰性選擇。在一些實施方案中，選擇步驟是陽性選擇。例如，陽性選擇可包括用針對Vγ9表位的鼠單克隆抗體染色PBMC，并在免疫磁性抗鼠柱上傳代細胞。與柱結(jié)合的細胞是進一步處理所需的富集細胞。

在一些實施方案中，本發(fā)明的方法還包括在步驟(iii)之前從外周血單核細胞中選擇和分離T細胞，并將分離的T細胞孵育在所述第二培養(yǎng)基中。

在一些實施方案中，本發(fā)明的方法還包括在步驟(iii)之前從外周血單核細胞中選擇和分離γδT細胞，并將分離的γδT細胞孵育在所述第二培養(yǎng)基中。

在一些實施方案中，使用施加特異性單克隆抗體(mAb)免疫剝離CD4和CD8細胞來選擇和分離(純化)γδT細胞。在與mAb結(jié)合后，將細胞與IgG微珠結(jié)合并通過MACS柱。在一些實施方案中，對于γδT細胞的選擇使用抗TCR單克隆抗體。

經(jīng)歷根據(jù)本發(fā)明的擴增的細胞可用于通過自體或同種異體移植治療癌癥、自身免疫病和傳染病的免疫療法。

在一些實施方案中，所述方法還包括在步驟(iii)之后選擇和分離γδT細胞。

在一些實施方案中，第一培養(yǎng)基還包含白介素-2。

在一些實施方案中，外周血單核細胞以約0.5X10⁶至1X10⁶細胞/ml的細胞密度提供。

在一些實施方案中，所述第二培養(yǎng)基還包含被輻照的外周血單核細胞。

本發(fā)明的方法可用作治療惡性疾病、自身免疫病或傳染病的免疫療法。發(fā)現(xiàn)人γδT細胞在體外殺死各種各樣的腫瘤細胞，包括白血病、淋巴瘤、黑素瘤、神經(jīng)母細胞瘤和多種類型的癌。

術(shù)語“惡性”在本文中以其最廣泛的含義使用，并且是指以不受控制的細胞生長為特征的疾病家族。它包括但不限于腎上腺皮質(zhì)癌、肛門癌、膀胱癌、室管膜瘤、成神經(jīng)管細胞瘤、幕上原始神經(jīng)外胚層腫瘤、松果體腫瘤、下丘腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤、乳腺癌、類癌瘤、癌、宮頸癌、結(jié)腸癌、子宮內(nèi)膜癌、食管癌、肝外膽管癌、尤因氏腫瘤家族(pnet)、顱外生殖細胞腫瘤、眼癌、眼內(nèi)黑素瘤、膽囊癌、胃癌、生殖細胞腫瘤、性腺外、妊娠性滋養(yǎng)層細胞瘤、頭頸癌、下咽癌、胰島細胞癌、喉癌、白血病、急性成淋巴細胞白血病、口腔癌、肝癌、肺癌、小細胞淋巴瘤、AIDS相關(guān)淋巴瘤、中樞神經(jīng)系統(tǒng)(原發(fā)性)淋巴瘤、皮膚T細胞淋巴瘤、霍奇金病、非霍奇金病、惡性間皮瘤、黑素瘤、梅克爾細胞癌、轉(zhuǎn)移性鱗狀細胞癌、多發(fā)性骨髓瘤、漿細胞瘤、蕈狀真菌病、骨髓增生異常綜合征、骨髓增生性病癥、鼻咽癌、成神經(jīng)細胞瘤、口咽癌、骨肉瘤、卵巢上皮癌、卵巢生殖細胞瘤、卵巢低惡性潛能腫瘤(ovarian low malignant potential tumor)、胰腺癌、外分泌胰腺癌、鼻旁竇和鼻腔癌、甲狀旁腺癌、嗜鉻細胞瘤癌、垂體癌、漿細胞腫瘤、橫紋肌肉瘤、直腸癌、腎細胞癌、唾液腺癌、塞扎里綜合征、卡波西肉瘤、小腸癌、軟組織肉瘤、胸腺瘤、惡性甲狀腺癌、尿道癌、子宮癌、肉瘤、兒童不常見的癌癥(unusual cancer of childho od)、陰道癌、外陰癌或維爾姆斯腫瘤、與化療治療有關(guān)的良性病況，諸如狼瘡、類風濕關(guān)節(jié)炎和皮膚疾病。每種可能性代表本發(fā)明的另一實施方案。

在一些實施方案中，惡性疾病選自由腎細胞癌、腦癌和肺癌組成的組。每種可能性代表本發(fā)明的另一實施方案。

本文使用的術(shù)語“傳染病”沒有限制，并且可以是任何致病因子的結(jié)果。傳染病可以是例如病毒感染諸如艾滋病、乙型和丙型肝炎，細胞感染，細菌感染，寄生蟲和真菌的結(jié)果。

本文所用的術(shù)語“自身免疫病”是指由身體針對其自身組織的免疫應答引起的疾病和病癥，引起長時間的炎癥和隨后的組織破壞。自身免疫性疾病和病癥的非限制性實例包括尤其是，斑禿、1型糖尿病、吉蘭-巴雷綜合征、多發(fā)性硬化癥、類風濕性關(guān)節(jié)炎、硬皮病、多肌炎、白癜風和系統(tǒng)性紅斑狼瘡。

在一些實施方案中，本發(fā)明提供包含通過本發(fā)明方法獲得的T細胞群體的藥物組合物。在一些實施方案中，T細胞群體包含來源于PBMC的γδT細胞。在一些實施方案中，T細胞群體由來源于PBMC的γ9δ2T細胞組成。

在一些實施方案中，藥物組合物包含在第一培養(yǎng)基中孵育所述外周血單核細胞第一時間段，然后在第二培養(yǎng)基中孵育第二時間段后從外周血單核細胞獲得的γδT細胞，其中所述第一培養(yǎng)基包含至少一種二膦酸鹽，和任選地IL-2，所述第二培養(yǎng)基包含α-CD3抗體和IL-2，以及任選地被輻照的外周血單核細胞。在一些實施方案中，所述外周血單核細胞可來源于同種異體來源。在一些實施方案中，所述外周血單核細胞可來源于自體來源。

如本文所用的，“藥物組合物”是指包含適合施用于患者的根據(jù)本發(fā)明的T細胞的組合物的制劑。

在一些實施方案中，所述藥物組合物還包含至少一種藥學上可接受的載體。在一些實施方案中，藥物組合物可還包含一種或更多種穩(wěn)定劑。

本發(fā)明還提供一種在有其需要的受試者中治療傳染性、自身免疫性或惡性疾病或病癥的方法，包括：

(i)從第一受試者獲得包含T細胞群體的外周血單核細胞(PBMC)；

(ii)在包含至少一種二膦酸鹽和IL-2的第一培養(yǎng)基中孵育所述外周血單核細胞持續(xù)第一時間段，從而獲得刺激的細胞群體；和

(iii)在包含α-CD3抗體和IL-2的第二培養(yǎng)基中孵育所述刺激的細胞群體持續(xù)第二時間段，從而獲得擴增的細胞群體；和

(iv)向第二受試者施用所述擴增的細胞群體或其一部分。

在一些實施方案中，所述第一受試者是具有傳染性、自身免疫性或惡性疾病或病癥的受試者，所述第二受試者是供體，并且步驟(iv)是同種異體移植。在一些實施方案中，所述第一受試者和所述第二受試者是罹患傳染性、自身免疫性疾病或惡性疾病或病癥的受試者，并且步驟(iv)是自體移植。在一些實施方案中，所述第二培養(yǎng)基還包含被輻照的外周血單核細胞。在一些實施方案中，所述外周血單核細胞是同種異體外周血單核細胞。

在一些實施方案中，所述擴增的細胞群體的部分對應于治療有效量的細胞。

在一些實施方案中，所述擴增的細胞群體的部分以藥物組合物的形式提供。

如本文所用，術(shù)語“治療有效量”是指在一段時間內(nèi)被施用藥物組合物的生物體內(nèi)，至少部分地預防或改善特定疾病例如，傳染性、自身免疫性或惡性疾病的癥狀病征的藥物組合物的量。

在一些實施方案中，步驟(iv)被多重復至少一次。在一些實施方案中，步驟(iv)重復多次。在一些實施方案中，步驟(iv)被重復到實現(xiàn)期望的治療效果。

在一些實施方案中，本發(fā)明提供包含通過本發(fā)明的方法獲得的T細胞的藥物組合物，用于在有其需要的受試者中治療傳染性或自身免疫性疾病或惡性疾病或病癥。

本發(fā)明還提供了用于擴增T細胞的試劑盒，該試劑盒包含：

(i)至少一個第一容器，其包含含有至少一種二膦酸鹽的第一培養(yǎng)基；

(ii)至少一個第二容器，其包含含有α-CD3抗體和IL-2的第二培養(yǎng)基；和

(iii)使用所述試劑盒擴增T細胞群體的書面說明。

在一些實施方案中，所述試劑盒還包含用于選擇T細胞的裝置。在一些實施方案中，所述試劑盒還包含用于選擇T細胞的一個或更多個柱。在一些實施方案中，T細胞群體包含γδT細胞。

在一些實施方案中，所述試劑盒還包含用于培養(yǎng)細胞的培養(yǎng)裝置。

在一些實施方案中，所述試劑盒還包含被輻照的PBMC。

在一些實施方案中，第一培養(yǎng)基還包含IL-2。

在一些實施方案中，第二培養(yǎng)基還包含被輻照的PBMC。

在一些實施方案中，試劑盒還包含至少一個第三容器，其包含含有T細胞群體的外周血細胞。在一些實施方案中，T細胞群體包含γδT細胞。在一些實施方案中，T細胞群體由γδT細胞組成。

在一些實施方案中，試劑盒還包括使用所述至少一個第一容器的說明書。根據(jù)一些實施方案，試劑盒還包括使用所述至少一個第二容器的說明書。在一些實施方案中，試劑盒還包括用于調(diào)整使用所述試劑盒擴增的細胞對有其需要的受試者的施用的說明書。

在一些實施方案中，所述至少第一容器內(nèi)的所述第一培養(yǎng)基和所述至少第二容器內(nèi)的所述第二培養(yǎng)基中的每一種在適于保持所述培養(yǎng)基及其中包含的組分的穩(wěn)定性的儲存條件下儲存。

合適的儲存條件是指在儲存時基本上保持培養(yǎng)基和培養(yǎng)基中的生物活性成分的物理穩(wěn)定性和/或化學穩(wěn)定性和/或生物活性所需的條件。在一些實施方案中，所述第一和第二培養(yǎng)基中的每一種在室溫(約25℃)或在30℃至少1個月是穩(wěn)定的，和/或在約2-8℃至少1年或至少2年是穩(wěn)定的。在一些實施方案中，所述第一和第二培養(yǎng)基中的每一種在培養(yǎng)基冷凍(至例如-70℃)和解凍之后是穩(wěn)定的。在一些實施方案中，本發(fā)明的試劑盒還包含用于選擇特定細胞的抗體。在一些實施方案中，所述試劑盒還包含用于陰性選擇γδT細胞的試劑。在一些實施方案中，所述試劑盒還包含用于陽性選擇γδT細胞的試劑。

在一些實施方案中，提供了用于治療傳染病、自身免疫病或惡性疾病的試劑盒，該試劑盒包含：

(i)至少一種第一容器，其包含針對γδT細胞被富集的T細胞群體，其中所述T細胞群體通過以下獲得：

a.提供包含T細胞群體的外周血單核細胞；

b.在包含至少一種二膦酸鹽的第一培養(yǎng)基中孵育所述外周血單核細

胞持續(xù)第一時間段；和

c.在包含α-CD3抗體和IL-2的第二培養(yǎng)基中孵育所述外周血單核細

胞持續(xù)第二時間段，從而獲得針對γδT細胞被富集的所述T細胞群體

的至少100倍擴增；和

(ii)在有其需要的受試者中使用所述試劑盒用于移植所述T細胞群體的書面說明。

在一些實施方案中，至少一個第一容器中的T細胞群體包含治療有效量的γδT細胞。

在一些實施方案中，所述至少一個容器被保持在提供在其所包含的T細胞群體的長期儲存的條件下。在一些實施方案中，所述至少一種第一容器在低溫條件下儲存。

通常，將至少一個容器冷凍并儲存。細胞培養(yǎng)物的這種儲存要求相對較少的時間和精力用于其維護，只要至少一個第一容器被保持在超冷(-130℃或更低)的機械冷凍機或液氮中。低溫保存的培養(yǎng)物一旦儲存在-130℃以下，通常不會發(fā)生任何可檢測的變化。因此，本文公開的試劑盒適用于在儲存時持續(xù)長期培養(yǎng)。因此，本發(fā)明的藥物組合物和試劑盒可保持在不同的儲存條件下，允許這些產(chǎn)品作為現(xiàn)成的產(chǎn)品上市。

在一些實施方案中，試劑盒還包括用于調(diào)整至少一個第一容器中的細胞向有其需要的受試者的施用的說明書。根據(jù)一些實施方案，所述試劑盒還包含以管理藥物或生物制品的生產(chǎn)、使用或銷售的政府機構(gòu)描述的形式的布告，所述布告反映了被該機構(gòu)批準用于人類施用的生產(chǎn)、使用或銷售。

以下實施例被展示以更充分地說明本發(fā)明的一些實施方案。然而，其絕不應以任何方式被解釋為限制本發(fā)明的寬泛的范圍。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地設(shè)想本文公開的原理的許多變化和修改，而不偏離本發(fā)明的范圍。

實施例

實施例1-來源于PBMC細胞的T細胞的擴增

從同意的個體抽取100-500ml單位的外周血，并進行Ficoll hypaqu e密度離心以獲得外周血單核細胞(PBMC)。對細胞進行針對γ9δ2T細胞的以下擴增方案，其相對于初始量在每個階段中導致約500倍的預料不到的細胞擴增：

(a)I階段擴增(PIE)-將細胞以0.5-1X10⁶個細胞/ml的密度接種在培養(yǎng)瓶中的補充有10％胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺和青霉素-鏈霉素溶液(100μg/ml)的RPMI培養(yǎng)基中。用2μM唑來膦酸鹽和100個國際單位(IU)/ml的重組人類IL-2(rhIL-2)刺激培養(yǎng)物并保持14天；每3天用帶有IL-2的新鮮培養(yǎng)基替換培養(yǎng)基。在第一孵育時間后，使用利用特異性mAb免疫剝離CD4和CD8細胞，從總細胞群體純化γδT細胞，隨后在通過MACS柱后結(jié)合抗小鼠IgG微珠。洗脫的γ9δ2T細胞的純度在繼續(xù)第二階段擴增之前通過FACS確認(>90％)，第二階段擴增(PTE)也稱為快速擴增程序(REP)。

(b)如先前對腫瘤浸潤淋巴細胞詳細描述的(Itzhaki等人，同上)，在GMP樣條件下進行PTE，該條件允許在患者中使用擴增的細胞。簡言之，將130,000個純化的γ9δ2T細胞在20ml含有50％AIM-V培養(yǎng)基、50％CM(含10％人血清的RPMI 1640)、25mmol/L HEPES pH 7.2、100U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素、50μg/mL慶大霉素和5.5x10e-5mol/L 2-巰基乙醇、抗CD3抗體(Orthoclone OKT-3,30ng/mL)、3,000IU/mL I L-2和以飼養(yǎng)細胞比γδT細胞為200：1比例的被輻照(5000rad)的同種異體飼養(yǎng)細胞的快速擴增程序(REP)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。將混合物置于垂直放置的T25燒瓶中。在第5天，用含有50％AIM-V培養(yǎng)基、50％CM和3,000IU/mL IL-2的新鮮培養(yǎng)基替代-70％的REP培養(yǎng)基。在第7天，將來自每個T25燒瓶的細胞轉(zhuǎn)移到T75燒瓶中，并添加20mL含有10％人AB血清、100U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素、2mmol L-谷氨酰胺和IL-2的AIM-V培養(yǎng)基。從第9天開始，每2-3天加入帶有青霉素、鏈霉素、L-谷氨酰胺和IL-2的AIM-V培養(yǎng)基，保持細胞密度為大約0.5-2x10⁶個細胞/ml。必要時，將細胞分到兩個燒瓶。

從6個健康供體獲得的γδT細胞(其如上所述最初在PIE中擴增并對γδT細胞選擇)在REP中的擴增倍數(shù)在下表1中展示。結(jié)果表明，第二階段擴增產(chǎn)生的擴增倍數(shù)高于500。具體地，第二階段擴增產(chǎn)生在500至1000的范圍內(nèi)的擴增倍數(shù)。

除了表1以外，圖1A、1B、2A、2B、3A、3B和4展示上述擴增。從第5天開始，每隔一天通過顯微細胞計數(shù)和臺盼藍排除來確定總活細胞數(shù)(圖1A)。在第14天，收集細胞，計數(shù)，通過流式細胞術(shù)分析γδT細胞含量，并測試其抗GBM細胞毒性。在每個起始于從健康供體(HD)和多形性膠質(zhì)母細胞瘤患者(CP；癌癥患者)獲得的130,000個外周血細胞的一組8個P TE實驗中，對于HD和CP產(chǎn)量分別獲得8.5±1.1×10⁷(n＝6)和8.3±0.5×10⁷(n＝2)γδT細胞(圖1A和1B)，對應于約600倍的擴增(圖1C)。HD和CP之間的擴增倍數(shù)沒有顯著差異(n.s)。

表1.

對來自上述研究人群的健康受試者的一個示例性樣品進行流式細胞術(shù)分析(圖2A、2B、3A、3B和4)。最初，獲得了用針對CD3(Y軸)和γ9(X軸)的單克隆抗體染色的PBMC的流式細胞術(shù)點圖(圖2A)。數(shù)據(jù)表明，2.64％的細胞是CD3+Vγ9+。接下來，將細胞在含有唑來膦酸鹽和白介素2的細胞培養(yǎng)物中孵育14天(圖2B)。該第一階段的擴增導致79.6％的細胞被兩種抗體染色，即表達Vγ9的T細胞(圖2B中的右上象限)。通過將細胞傳遞到免疫磁性柱上以剝離CD4和CD8細胞，實現(xiàn)Vγ9+T細胞的進一步富集。這一富集步驟導致97.7％(從79.6％)的Vγ9+T細胞。通過圖3A和3B所示的分析確認了剝離的效率，其中97.7％的細胞是表達Vγ9的T細胞(圖3A中的右上象限)，只有0.08％的細胞表達CD8而0.28％表達CD4(圖3B)。圖4展示的分析給出了圖2B所示的細胞經(jīng)歷第二階段擴增即快速擴增方案(REP)后的CD3+Vγ9+T細胞的百分比。結(jié)果表明，該培養(yǎng)物中87.1％的T細胞是CD3+Vγ9+T細胞，并且相對于該實施例中從初級(第一階段)擴增回收的細胞的擴增倍數(shù)為X540。

實施例2–擴增的T細胞的活性

使用IFNγ分泌測定法測試按實施例1中詳述的培養(yǎng)、擴增和分離的γδT細胞針對GBM細胞系的反應性。使用或不使用唑來膦酸鹽地，將γδT細胞與三種GBM細胞系U251、U87和T98G以5：1的效應物對靶的比例一起孵育48小時。孵育后，分析上清液的IFNγ分泌。PTE來源的γδT細胞在培養(yǎng)基(Med)中建立了一定的自發(fā)性IFNγ分泌，但響應于GBM細胞系的IF Nγ分泌顯著較高(p<0.01；圖5)。

總之，結(jié)果表明，兩階段擴增法提供高產(chǎn)量的存活且有效的γδT細胞。

用于測試擴增的效應γδT細胞的活性的另外的研究如下進行：在室溫將腫瘤細胞系T98G、U87、U251(多形性成膠質(zhì)細胞瘤)和Daudi(淋巴瘤)靶細胞用2.5mM的5,6-羧基熒光素二乙酸琥珀酰亞胺酯(CFSE)(Mo lecular probes)標記10分鐘。此后，用相同體積的FBS(胎牛血清)猝滅CFSE，并用生長培養(yǎng)基洗滌兩次。帶有或不帶有2mM唑來膦酸鹽下，以各種效應物與靶(E：T)比例將標記的靶細胞與通過REP獲得的效應γδT細胞或類似地活化/擴增的γδT細胞(對照)一起接種在圓底96孔板中過夜。第二天早晨收獲細胞并用碘化丙啶(PI)染色。用對CFSE標記的群體中PI陽性細胞的流式細胞術(shù)分析測量特異性裂解。從實驗樣品中減去無效應物的靶細胞對PI的背景吸收。結(jié)果示于圖6A至6D中。結(jié)果表明，用唑來膦酸鹽培養(yǎng)的效應γδT細胞誘導最顯著和有效的治療(細胞毒性)。與效應物γδT細胞相比，對照細胞(γδT細胞)沒有發(fā)揮有效的作用。

以上具體實施方案的描述將如此完全地揭示本發(fā)明的一般性質(zhì)，使得其他人可以通過應用現(xiàn)有的知識，容易地為各種應用修改和/或調(diào)整此類具體實施方案而不需要過度實驗且不背離一般概念，且因此，此類調(diào)整和修改應當并且預期被包含在本公開的實施方案的等效方式的含義和范圍內(nèi)。應理解的是，本文采用的措辭或術(shù)語是為了描述而非限制的目的。用于進行各種本公開的功能的工具、材料和步驟可采取多種替代形式而不背離本發(fā)明。