發(fā)明背景

血管生成素樣蛋白4(angptl4)是分泌型蛋白的血管生成素樣家族的成員。它是由多個細胞類型(包括巨噬細胞、脂肪細胞、肌肉細胞和肝臟細胞)表達的同型寡聚蛋白，能夠形成二聚體和四聚體。angptl4也稱作肝纖維蛋白原/血管生成素相關蛋白(hfarp)(kim等人,(2000)biochem.j.346:603-610)；pparγ血管生成素相關蛋白(pgar)(yoon等人(2000)mol.cellbiol.,20:5343-5349)和禁食誘導的脂肪因子(fiaf)(kerten等人,(2000)j.biol.chem.,275:28488-28493)。angptl4含有一個n末端卷曲螺旋結(jié)構域和一個c末端纖維蛋白原(fbn)樣結(jié)構域(kim等人(2000)biochem.j.346:603-610)。

脂蛋白脂肪酶(lpl)在脂蛋白代謝中具有核心作用，所述核心作用包括維持血液中的脂蛋白水平和通過組織特異性調(diào)節(jié)其活性。已知angptl4的卷曲螺旋區(qū)抑制脂蛋白脂肪酶(lpl)-介導的甘油三酯(tg)清除。因此，觀察到angptl4功能喪失型突變(例如，如人類受試者中所見)、遺傳缺失(例如，如轉(zhuǎn)基因小鼠中所見)，和抗體抑制作用(例如，如小鼠和食蟹猴中所見)均減少血漿甘油三酯。另外，還已知angptl4抗體激活lpl。相反，向小鼠中注射angptl4導致循環(huán)型甘油三酯快速增加并且這是比注射血管生成素樣蛋白3(angptl3)更高的速率(yoshida等人,(2002)jlipidres43:1770-1772)。

本發(fā)明中所述的抗angptl4抗體和抗原結(jié)合片段啟動、促進或增強lpl激活，例如，通過阻斷angptl4對lpl的抑制，因而減少血漿甘油三酯做到。這些抗體預計防止和改善以甘油三酯水平升高為特征的疾病(例如，原發(fā)性血脂異常、高甘油三酯血癥、代謝綜合征、ii型糖尿病等)的急性和慢性表現(xiàn)。

發(fā)明概述

本發(fā)明涉及與人血管生成素樣蛋白4(下文，有時稱作“angptl4”)結(jié)合的單克隆抗體，和包含所述單克隆抗體的藥物組合物和治療方法。

本文所述的分離的抗angptl4抗體或抗原結(jié)合片段按小于或等于100pm的平衡解離常數(shù)(kd)結(jié)合angptl4。例如，本文所述的分離抗體或抗原結(jié)合片段可以按小于或等于150nm、小于或等于50nm、小于或等于10nm、小于或等于750pm、小于或等于600pm、小于或等于500pm、小于或等于400pm、小于或等于300pm、小于或等于200pm、小于或等于100pm、小于或等于75pm、小于或等于65pm、小于或等于60pm、小于或等于55pm的kd與人angptl4結(jié)合。更具體地，本文所述的分離抗體或抗原結(jié)合片段還可以按小于或等于45pm(如通過fortebio動力學結(jié)合測定法所測量)或小于或等于24pm(如通過溶液平衡滴定測定法(set)所測量)的kd結(jié)合人angptl4；并且還可以按小于或等于87pm(如通過fortebio動力學結(jié)合測定法所測量)或小于或等于22pm(如通過set所測量)的kd結(jié)合食蟹猴angptl4。

本發(fā)明涉及與人angptl4結(jié)合的分離抗體或其抗原結(jié)合片段。本發(fā)明還涉及結(jié)合angptl4并且與如表1中所述的抗體進一步競爭結(jié)合的分離抗體或其抗原結(jié)合片段。本發(fā)明也進一步涉及結(jié)合與表1中所述的抗體相同的表位的分離抗體或其抗原結(jié)合片段。

本文所述的分離抗體和抗原結(jié)合片段的結(jié)合親和力可以通過溶液平衡滴定法(set)測定。用于set的方法是本領域已知的并且在下文進一步詳細描述。備選地，本文所述的分離抗體或片段的結(jié)合親和力可以通過biacore測定法測定。用于biacore動力學測定的方法是本領域已知的并且在下文進一步詳細描述。

本文所述的分離的抗angptl4抗體和抗原結(jié)合片段可以用來以小于或等于100nm、小于或等于50nm、小于或等于35nm、小于或等于25nm、小于或等于10nm或小于或等于3nm的ec50抑制angptl4與脂蛋白脂肪酶(lpl)結(jié)合。

分離的抗angptl4抗體或其抗原結(jié)合片段可以用來降低循環(huán)型甘油三酯(tg)的水平。

如本文所述的分離的抗angptl4抗體或其抗原結(jié)合片段可以是單克隆抗體、人或人源化抗體、嵌合抗體、單鏈抗體、fab片段、fv片段、f(ab’)2片段或scfv片段和/或igg同種型。

如本文所述的分離的抗angptl4抗體或其抗原結(jié)合片段還可以包括這樣的構架，其中的氨基酸已經(jīng)置換為來自相應的人vh或vl種系序列的抗體構架。

本發(fā)明的另一個方面包括具有表1中所述的人源化抗體的完整重鏈序列和完整輕鏈序列的分離抗體或其抗原結(jié)合片段。更具體地，分離的抗體或其抗原結(jié)合片段可以具有neg276、neg276-lala、neg278、neg310、neg313、neg315、neg318、neg319的重鏈序列和輕鏈序列。

本發(fā)明的又一個方面包括具有表1中所述的人源化抗體的重鏈可變結(jié)構域序列和輕鏈可變結(jié)構域序列的分離抗體或其抗原結(jié)合片段。更具體地，分離的抗體或其抗原結(jié)合片段可以具有neg276、neg276-lala、neg278、neg310、neg313、neg315、neg318、neg319的重鏈可變結(jié)構域序列和輕鏈可變結(jié)構域序列。

本發(fā)明還涉及一種分離的抗體或其抗原結(jié)合片段，其包含選自seqidno:7、32、52、72、92、112和132的重鏈cdr1；選自seqidno:8、33、53,73、93、113和133的重鏈cdr2以及選自seqidno:9、34、54、74、94、114和134的重鏈cdr3，其中分離的抗體或其抗原結(jié)合片段與人angptl4結(jié)合。在另一個方面，這種分離的抗體或其抗原結(jié)合片段還包括選自seqidno:17、42、62、82、102、122和142的輕鏈cdr1；選自seqidno:18、43、63、83、103、123和143的輕鏈cdr2；和選自seqidno:19、44、64、84、104、124和144的輕鏈cdr3。

本發(fā)明還涉及一種分離的抗體或其抗原結(jié)合片段，其包含選自seqidno:17、42、62、82、102、122和142的輕鏈cdr1；選自seqidno:18、43、63、83、103、123和143的輕鏈cdr2以及選自seqidno:19、44、64、84、104、124和144的輕鏈cdr3，其中分離的抗體或其抗原結(jié)合片段與人angptl4結(jié)合。

本發(fā)明還涉及具有hcdr1、hcdr2和hcdr3及l(fā)cdr1、lcdr2并且lcdr3的結(jié)合angptl4的分離抗體或其抗原結(jié)合片段，其中hcdr1、hcdr2和hcdr3包含seqidno:7、8和9并且lcdr1、lcdr2、lcdr3包含seqidno:17、18和19；或hcdr1、hcdr2和hcdr3包含seqidno:32、33和34和lcdr1、lcdr2、lcdr3包含seqidno:42、43和44；或hcdr1、hcdr2和hcdr3包含seqidno:52、53和54并且lcdr1、lcdr2、lcdr3包含seqidno:62、63和64；或hcdr1、hcdr2和hcdr3包含seqidno:72、73和74并且lcdr1、lcdr2、lcdr3包含seqidno:82、83和84；或hcdr1、hcdr2和hcdr3包含seqidno:92、93和94并且lcdr1、lcdr2、lcdr3包含seqidno:102、103和104；或hcdr1、hcdr2和hcdr3包含seqidno:112、113和114并且lcdr1、lcdr2、lcdr3包含seqidno:122、123和124；或hcdr1、hcdr2和hcdr3包含seqidno:132、133和134并且lcdr1、lcdr2、lcdr3包含seqidno:142、143和144。

本發(fā)明還涉及抗體或抗原結(jié)合片段，其具有如chothia所定義的seqidno:13、38、58、78、98、118和138的重鏈可變結(jié)構域的hcdr1、hcdr2和hcdr3以及seqidno:23、48、68、88、108、128和148的輕鏈可變結(jié)構域的lcdr1、lcdr2和lcdr3。在本發(fā)明的另一個方面，抗體或抗原結(jié)合片段可以具有如kabat所定義的seqidno:13、38、58、78、98、118和138的重鏈可變結(jié)構域序列的hcdr1、hcdr2和hcdr3以及seqidno:23、48、68、88、108、128和148的輕鏈可變結(jié)構域序列的lcdr1、lcdr2和lcdr3。

在本發(fā)明的一個方面，分離的抗體或其抗原結(jié)合片段包含選自seqidno:13、38、58、78、98、118和138的重鏈可變結(jié)構域序列。分離的抗體或抗原結(jié)合片段還可以包含輕鏈可變結(jié)構域序列，其中重鏈可變結(jié)構域和輕鏈可變結(jié)構域組合以形成angptl4的抗原結(jié)合位點。特別地，輕鏈可變結(jié)構域序列可以選自seqidno:23、48、68、88、108、128和148，其中所述分離的抗體或其抗原結(jié)合片段結(jié)合angptl4。

本發(fā)明還涉及包含選自seqidno:23、48、68、88、108、128和148的輕鏈可變結(jié)構域序列的分離抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述分離的抗體或其抗原結(jié)合片段與人angptl4結(jié)合。分離的抗體或抗原結(jié)合片段還可以包含重鏈可變結(jié)構域序列，其中輕鏈可變結(jié)構域和重鏈可變結(jié)構域組合以形成angptl4的抗原結(jié)合位點。

特別地，結(jié)合angptl4的分離抗體或其抗原結(jié)合片段可以具有分別包含seqidno:13和23；38和48；58和68；78和88；98和108；118和128；或138和148的序列的重鏈可變結(jié)構域和輕鏈可變結(jié)構域。

本發(fā)明還涉及包含下述重鏈可變結(jié)構域的分離抗體或其抗原結(jié)合片段，所述重鏈可變結(jié)構域與選自seqidno:13、38、58、78、98、118和138的序列具有至少90％序列同一性，其中所述抗體與angptl4結(jié)合。在一個方面，分離的抗體或其抗原結(jié)合片段還包含與選自seqidno:23、48、68、88、108、128和148的序列具有至少90％序列同一性的輕鏈可變結(jié)構域。在本發(fā)明的又一個方面，分離的抗體或抗原結(jié)合片段具有如kabat所定義的和如表1中所述的hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3。

本發(fā)明還涉及具有下述輕鏈可變結(jié)構域的分離抗體或其抗原結(jié)合片段，所述輕鏈可變結(jié)構域與選自seqidno:23、48、68、88、108、128和148的序列具有至少90％序列同一性，其中所述抗體結(jié)合angptl4。

在本發(fā)明的另一個方面，與angptl4結(jié)合的分離抗體或其抗原結(jié)合片段可以具有包含seqidno:15、28、40、60、80、100、120和140的序列的重鏈。分離的抗體還可以包含可以與重鏈組合以形成針對人angptl4的抗原結(jié)合位點的輕鏈。特別地，輕鏈可以具有包含seqidno:25、50、70、90、110、130和150的序列。特別地，結(jié)合angptl4的分離抗體或其抗原結(jié)合片段可以具有分別包含seqidno:15和25；28和25；40和50；60和70；80和90；100和110；120和130；或140和150的序列的重鏈和輕鏈。

本發(fā)明還涉及包含下述重鏈的分離抗體或其抗原結(jié)合片段，所述重鏈與選自seqidno:15、28、40、60、80、100、120和140的序列具有至少90％序列同一性，其中所述抗體與angptl4結(jié)合。在一個方面，分離的抗體或其抗原結(jié)合片段還包含與選自seqidno:25、50、70、90、110、130和150的序列具有至少90％序列同一性的輕鏈。

本發(fā)明還涉及包含下述輕鏈的分離抗體或其抗原結(jié)合片段，所述輕鏈與選自seqidno:25、50、70、90、110、130和150的序列具有至少90％序列同一性，其中所述抗體結(jié)合angptl4。

本發(fā)明仍進一步涉及分離的抗體或抗原結(jié)合片段，其競爭與本文所述的抗體或抗原結(jié)合片段結(jié)合，例如，與人源化抗體neg276、neg276-lala、neg278、neg310、neg313、neg315、neg318和neg319結(jié)合。在一個實施方案中，本發(fā)明的分離抗體或抗原結(jié)合片段能夠抑制選自neg276、neg276-lala、neg278、neg310、neg313、neg315、neg318和neg319的人源化抗體與angptl4的結(jié)合作用超過50％，此時兩種抗體或抗原結(jié)合片段以等摩爾濃度存在。

在另一個實施方案中，本發(fā)明的分離抗體或抗原結(jié)合片段能夠抑制選自neg276、neg276-lala、neg278、neg310、neg313、neg315、neg318和neg319的人源化抗體與angptl4的結(jié)合作用超過80％，此時兩種抗體或抗原結(jié)合片段以等摩爾濃度存在。在另外的實施方案中，本發(fā)明的分離抗體或抗原結(jié)合片段能夠抑制選自neg276、neg276-lala、neg278、neg310、neg313、neg315、neg318和neg319的人源化抗體與angptl4的結(jié)合作用超過85％(或90％、95％、98％或99％)，此時兩種抗體或抗原結(jié)合片段以等摩爾濃度存在。

本發(fā)明還涉及包含本文所述的分離抗體或其抗原結(jié)合片段的組合物。以及，與可藥用載體組合的抗體組合物。具體而言，本發(fā)明進一步包括藥物組合物，所述藥物組合物包含表1的抗體或其抗原結(jié)合片段，如，例如人源化抗體neg276、neg276-lala、neg278、neg310、neg313、neg315、neg318、neg319。本發(fā)明還涉及藥物組合物，所述藥物組合物包含表1的兩種或更多種分離的抗體或其抗原結(jié)合片段的組合。

本發(fā)明還涉及編碼下述重鏈可變結(jié)構域的分離的核酸序列，所述重鏈可變結(jié)構域具有選自seqidno:13、38、58、78、98、118和138的序列。特別地，該核酸具有這樣的序列，所述序列與選自seqidno:14、27、39、59、79、99、119和139的序列具有至少90％序列同一性。在本發(fā)明的又一個方面，該序列是seqidno:14、27、39、59、79、99、119或139。

本發(fā)明還涉及編碼下述輕鏈可變結(jié)構域的分離的核酸序列，所述輕鏈可變結(jié)構域具有選自seqidno:23、48、68、88、108、128和148的序列。特別地，該核酸具有這樣的序列，所述序列與選自seqidno:24、31、49、69、89、109、129和149的序列具有至少90％序列同一性。在本發(fā)明的又一個方面，該序列是seqidno:24、31、49、69、89、109、129或149。

本發(fā)明還涉及分離的核酸，所述分離的核酸包含編碼多肽的序列，所述多肽包含與選自seqidno:23、48、68、88、108、128和148的序列具有至少90％序列同一性的輕鏈可變結(jié)構域。

本發(fā)明還涉及包含本文所述的一種或多種核酸分子的載體。

本發(fā)明還涉及包含重組dna序列和第二重組dna序列的分離的宿主細胞，所述重組dna序列編碼上文描述的抗體的重鏈，所述第二重組dna序列編碼上文描述的抗體的輕鏈，其中所述dna序列與啟動子有效連接并且能夠在該宿主細胞中表達。構思了抗體可以是人源化抗體。還構思了宿主細胞是非人類的哺乳動物細胞。

構思了細胞是人細胞。還構思了細胞在受試者中。在一個實施方案中，構思了細胞是內(nèi)皮細胞。在其他實施方案中，細胞可以是脂肪細胞、肌肉細胞和肝臟細胞中的一種或多種細胞。仍然還構思了受試者是人。

本發(fā)明還涉及一種治療、改善或預防患者中angptl4相關病癥的方法，其中所述方法包括步驟：向患者施用有效量的包含本文所述的抗體或其抗原結(jié)合片段的組合物。在一個方面，angptl4相關病癥與高甘油三酯血癥(例如，重度高甘油三酯血癥(例如，血漿甘油三酯濃度>500mg/dl)、與肥胖相關的高甘油三酯血癥和v型高甘油三酯血癥)相關。在其他方面，angptl4相關病癥與原發(fā)性血脂異常、代謝綜合征、ii型糖尿病相關。構思了該患者是人。

前述任一種分離的抗體或其抗原結(jié)合片段可以是單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段。

定義

除非另外定義，否則本文中所用的全部技術與科學術語均具有如本發(fā)明所屬領域的普通技術人員通常理解的相同含義。

術語“angptl4蛋白”或“angptl4抗原”或“angptl4”可互換使用并且指不同物種中的血管生成素樣蛋白4(angptl4)。例如，人angptl4具有如表1中所述的序列(seqidno:1)，并且已經(jīng)在先前的報告和文獻中描述(nature,第386卷,第頁73-77,1997；genomics,第54卷,第2期,第191-199頁,1998；biochem.j.,第339卷,part1,第177-184頁,1999；genbank登錄號np002534)。angptl4含有一個n末端卷曲螺旋結(jié)構域和一個c末端纖維蛋白原(fbn)樣結(jié)構域(kim等人(2000)biochem.j.346:603-610)。它是由多個細胞類型(包括巨噬細胞、脂肪細胞、肌肉細胞和肝臟細胞)表達的同型寡聚蛋白，能夠形成二聚體和四聚體，并且已知其抑制脂蛋白脂肪酶(lpl)-介導的甘油三酯(tg)清除。

此外，在本發(fā)明的上下文中，術語“angptl4”包括天然血管生成素樣蛋白4(angptl4)的突變體，所述突變體具有與上文所提報告中描述的天然一級結(jié)構(氨基酸序列)基本上相同的氨基酸序列。本文中，術語“具有基本上相同氨基酸序列的人天然血管生成素樣蛋白4(angptl4)突變體”指這類突變蛋白。

如本文所用的術語“抗體”意指完整抗體和任何抗原結(jié)合片段(即，“抗原結(jié)合部分”)或其單鏈。完整抗體是包含由二硫鍵相互連接的至少兩條重鏈(h)和兩條輕鏈(l)的糖蛋白。每條重鏈由重鏈可變區(qū)(本文中縮寫為vh)和重鏈恒定區(qū)組成。重鏈恒定區(qū)由3個結(jié)構域ch1、ch2和ch3組成。每條輕鏈由輕鏈可變區(qū)(本文中縮寫為vl)和輕鏈恒定區(qū)組成。輕鏈恒定結(jié)域由一個結(jié)構域cl組成。vh區(qū)和vl區(qū)可以進一步再劃分為超變區(qū)，名為互補決定區(qū)(cdr)，其間插有較保守的區(qū)域，名為構架區(qū)(fr)。每個vh和vl由三個cdr和4個fr組成，從氨基端到羧基端以如下順序排列：fr1,cdr1,fr2,cdr2,fr3,cdr3,fr4。重鏈和輕鏈的可變區(qū)含有與抗原相互作用的結(jié)合結(jié)構域?？贵w的恒定區(qū)可以介導免疫球蛋白與宿主組織或因子(包括免疫系統(tǒng)的各種細胞(例如，效應細胞)和經(jīng)典補系統(tǒng)的第一組分(c1q))結(jié)合。

如本文所用，術語抗體的“抗原結(jié)合部分”或“抗原結(jié)合片段”指完整抗體的保留與給定抗原(例如，人氧化型ldl受體(angptl4))特異性結(jié)合的能力的一種或多種片段。抗體的抗原結(jié)合功能可以通過完整抗體的片段執(zhí)行。在術語“抗體的抗原結(jié)合部分或抗原結(jié)合片段”范圍內(nèi)涵蓋的結(jié)合片段的例子包括fab片段，一種由vl結(jié)構域、vh結(jié)構域、cl結(jié)構域和ch1結(jié)構域組成的單價片段；f(ab)2片段，一種包含由二硫鍵在鉸鏈區(qū)連接的兩個fab片段的雙價片段；由vh結(jié)構域和ch1結(jié)構域組成的fd片段；由抗體單臂的vl結(jié)構域和vh結(jié)構域組成的fv片段；由vh結(jié)構域或vl結(jié)構域組成的單結(jié)構域抗體(dab)片段(ward等人,1989nature341:544-546)；和分離的互補決定區(qū)(cdr)。

另外，雖然fv片段的兩個結(jié)構域vl和vh由獨立基因編碼，但是使用重組方法，可以將它們通過能夠使這兩個結(jié)構域作為單條蛋白鏈產(chǎn)生的人工肽接頭連接，在所述單條蛋白鏈中vl區(qū)和vh區(qū)配對以形成單價分子(稱作單鏈fv(scfv)；見例如bird等人,1988science242:423-426；和huston等人,1988proc.natl.acad.sci.85:5879-5883)。這類單鏈抗體包括抗體的一個或多個抗原結(jié)合部分或片段。使用本領域技術人員已知的常規(guī)技術，獲得這些抗體片段，并且按照與完整抗體相同的方式篩選所述片段的用途。

也可以將抗原結(jié)合片段并入單結(jié)構域抗體、大抗體(maxibody)、微型抗體、胞內(nèi)抗體、雙體抗體、三體抗體、四體抗體、v-nar和雙-scfv(參見，例如，hollinger和hudson,2005,naturebiotechnology,23,9,1126-1136)?？贵w的抗原結(jié)合部分可以移植至基于多肽的支架如纖連蛋白iii型(fn3)中(見美國專利號6,703,199，其描述纖連蛋白多肽單體抗體)。

可以將抗原結(jié)合片段并入單鏈分子中，其中所述單鏈分子包含一對串聯(lián)fv區(qū)段(vh-ch1-vh-ch1)，它們與互補輕鏈多肽一起形成一對抗原結(jié)合區(qū)(zapata等人,1995proteineng.8(10):1057-1062；和美國專利號5,641,870)。

如本文所用，術語“親和力”(affinity)指抗體與抗原在單個抗原部位上相互作用的強度。在每一抗原部位中，抗體“臂”的可變區(qū)與抗原在許多位點上通過弱的非共價力相互作用；相互作用越多，親和力越強。如本文所用，術語抗體或其抗原結(jié)合片段(例如，fab片段)的“高親和力”通常指具有10^-9m或更小kd的抗體或抗原結(jié)合片段。

術語“氨基酸”指天然存在的和合成的氨基酸，以及以類似于天然存在氨基酸的方式發(fā)揮作用的氨基酸類似物和氨基酸模擬物。天然存在的氨基酸是由遺傳密碼編碼的那些，以及稍后經(jīng)修飾的那些氨基酸，例如，羥脯氨酸、γ-羧谷氨酸和o-磷酸絲氨酸。氨基酸類似物指具有與天然存在氨基酸相同的基本化學結(jié)構(即，與氫、羧基、氨基和r基團結(jié)合的α-碳)的化合物，例如，高絲氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亞砜、甲硫氨酸甲基硫鎓。這些類似物具有修飾的r基團(例如，正亮氨酸)或修飾的肽主鏈，但是保留與天然存在氨基酸相同的基本化學結(jié)構。氨基酸模擬物指具有與氨基酸的一般化學結(jié)構不同的結(jié)構，但是以類似于天然存在氨基酸的方式發(fā)揮作用的化學化合物。

如本文所用，術語“結(jié)合特異性”指獨立抗體結(jié)合位點僅與一種抗原決定簇反應的能力。

短語“特異性(或選擇性)結(jié)合”抗體(例如，angptl4結(jié)合抗體)指決定在蛋白質(zhì)和其它生物產(chǎn)品的異質(zhì)群體中存在相關抗原(例如人angptl4或食蟹猴angptl4)的結(jié)合反應。短語“識別抗原的抗體”和“對抗原特異的抗體”在本文中與術語“與抗原特異性結(jié)合的抗體”可互換使用。

術語“angptl4介導的”指以下事實：已知angptl4抑制脂蛋白脂肪酶(lpl)-介導的甘油三酯(tg)清除并因而增加甘油三酯水平。

如本文所用的“angptl4相關的病癥”、“angptl4相關的病狀”或相似術語指任何數(shù)目的其中尋求減少angptl4-介導的lpl抑制作用和脂蛋白調(diào)節(jié)作用的病狀或疾病。這些病狀包括但不限于涉及脂質(zhì)代謝的那些，如高脂血癥、高脂蛋白血癥和血脂異常，包括致粥樣硬化性血脂異常、糖尿病血性脂異常、高甘油三酯血癥(例如，重度高甘油三酯血癥(例如，其中血漿甘油三酯濃度>500mg/dl)、與肥胖相關的高甘油三酯血癥、和v型高甘油三酯血癥)、高膽固醇血癥、乳糜微粒血癥、混合性血脂異常(肥胖癥、代謝綜合征、糖尿病等)、脂肪營養(yǎng)不良(lipodystrophy)、脂肪萎縮和由例如lpl活性降低和/或lpl缺乏、ldl受體活性降低和/或ldl受體缺乏、apoc2改變、apoe缺乏、apob增加、極低密度脂蛋白(vldl)的產(chǎn)生增加和/或其消除減少、某些藥物治療(例如，糖皮質(zhì)激素治療誘導的血脂異常)、任何遺傳素質(zhì)、膳食、生活方式等引起的其他病狀。

與高脂血癥、高脂蛋白血癥和/或血脂異常相關或因其產(chǎn)生的其他angptl4相關疾病或病癥包括但不限于心血管疾病或病癥，如動脈粥樣硬化、血管瘤、高血壓、心絞痛、卒中、腦血管病、充血性心力衰竭、冠狀動脈病、心肌梗死、外周血管疾病等；急性胰腺炎；非酒精性脂肪性肝炎(nash)；血糖紊亂如糖尿??；肥胖癥等。

術語“嵌合抗體”是這樣的抗體分子，其中(a)將恒定區(qū)或其部分改變、替換或交換，從而抗原結(jié)合位點(可變區(qū))與不同的或改變的類別、效應子功能和/或物種的恒定區(qū)或賦予嵌合抗體新性能的完全不同的分子(例如，酶、毒素、激素、生長因子、藥物)等連接；或(b)將可變區(qū)或其部分用具有不同或改變的抗原特異性的可變區(qū)改變、替換或交換。例如，小鼠抗體可以通過將其恒定區(qū)更換為來自人免疫球蛋白的恒定區(qū)進行修飾。由于更換為人類恒定區(qū)，該嵌合抗體可以保留其在識別抗原方面的特異性，同時如與原始小鼠抗體相比，具有在人類中降低的抗原性。

術語“保守性修飾的變體”適用于氨基酸序列和核酸序列。就特定的核酸序列，保守性修飾的變體指編碼相同或基本上相同的氨基酸序列的那些核酸，或在核酸不編碼氨基酸序列的情況下，指基本上相同的序列。因為遺傳密碼的簡并性，大量功能上相同的核酸編碼任何給出的蛋白質(zhì)。例如，密碼子gca、gcc、gcg和gcu均編碼氨基酸丙氨酸。因而，在其中丙氨酸由某個密碼子指定的每個位置，可以將該密碼子變成任一個所述的相應密碼子，而不改變編碼的多肽。這類核酸變異是“沉默性變異”，它們是一個種類的保守性修飾變異。本文中編碼多肽的每個核酸序列也描述了該核酸的每種可能沉默變異。技術人員會認識到，可以修飾核酸中的每個密碼子(例外是aug，它通常是甲硫氨酸的唯一密碼子，和tgg，它通常是色氨酸的唯一密碼子)以產(chǎn)生功能上相同的分子。因此，編碼多肽的核酸的每種沉默性變異隱含于每個描述的序列中。

對于多肽序列，“保守性修飾的變體”包括對多肽序列的各個置換、缺失或添加，它們導致某個氨基酸置換為化學上相似的氨基酸。提供功能上相似氨基酸的保守性置換表是本領域熟知的。這類保守性修飾的變體相對于本發(fā)明的多態(tài)性變體、物種間同源物和等位基因而言是附加的并且不排斥它們。以下8組含有互為保守替換的氨基酸：1)丙氨酸(a)、甘氨酸(g)；2)天冬氨酸(d)、谷氨酸(e)；3)天冬酰胺(n)、谷氨酰胺(q)；4)精氨酸(r)、賴氨酸(k)；5)異亮氨酸(i)、亮氨酸(l)、甲硫氨酸(m)、纈氨酸(v)；6)苯丙氨酸(f)、酪氨酸(y)、色氨酸(w)；7)絲氨酸(s)、蘇氨酸(t)；和8)半胱氨酸(c)、甲硫氨酸(m)(參閱例如，creighton,proteins(1984))。在一些實施方案中，術語“保守序列修飾”用于指不顯著影響或改變含有氨基酸序列的抗體的結(jié)合特征的氨基酸修飾。

術語“表位“意指能夠與抗體特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)決定簇。表位通常由化學活躍的表面成組分子如氨基酸或糖側(cè)鏈組成并且通常具有特定的三維結(jié)構特征以及特定的電荷特征。構象型表位和非構象型表位的區(qū)別在于，對前者的結(jié)合作用在變性溶劑存在的情況下喪失，而對后者的結(jié)合作用不喪失。

如本文所用，術語“人抗體”意在包括具有構架和cdr區(qū)均從人源序列衍生的可變區(qū)的抗體。另外，如果該抗體含有恒定區(qū)，該恒定區(qū)還衍生自這類人序列，例如，人種系序列或突變形式的人種系序列。本發(fā)明的人抗體可以包括不由人序列編碼的氨基酸殘基(例如，通過體外隨機或位點特異性誘變或通過體內(nèi)體細胞突變引入的突變)。

“人源化抗體”是一種保留非人類抗體(例如小鼠單克隆抗體)的抗原特異性反應性，同時作為治療藥在人類中施用時免疫原性較低的抗體。參見，例如，robello等人,transplantation,68:1417-1420。這可以例如通過保留非人類抗原結(jié)合區(qū)并且抗體的剩余部分替換成它們的人類對應物(即，恒定區(qū)以及可變區(qū)中不參與結(jié)合的部分)來實現(xiàn)。參見，例如morrison等人,proc.natl.acad.sci.usa,81:6851-6855,1984；morrison和oi,adv.immunol.,44:65-92,1989；verhoeyen等人,science,239:1534-1536,1988；padlan,molec.immun.,28:489-498,1991；和padlan,molec.immun.,31:169-217,1994。人類工程化技術的其他例子包括但不限于us5,766,886中公開的xoma技術。

在兩個或更多個核酸序列或多肽序列的情境下，術語“同一的”或“同一性百分數(shù)”指相同的兩個或更多個序列或子序列。如果在比較窗口或指定區(qū)域范圍內(nèi)為了最大對應性而比較及比對時，如使用以下序列比較算法之一或通過手工比對和目視檢查所測量那樣，兩個序列具有指定百分數(shù)的相同氨基酸殘基或核苷酸(即，在指定區(qū)域范圍內(nèi)或當未指定時在整個序列范圍內(nèi)60％同一性，任選地65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性)，則這兩個序列是“基本上同一的”。任選地，同一性存在于長度至少約50個核苷酸(或10個氨基酸)的區(qū)域內(nèi)，或更優(yōu)選地在長度100到500或1000或更多個核苷酸(或20、50、200或更多個氨基酸)的區(qū)域內(nèi)。

對于序列比較，一般地一個序列充當與測試序列比較的參考序列。當使用序列比較算法時，將測試序列和參考序列輸入計算機，如果需要，指定子序列坐標，并指定序列算法程序參數(shù)?？梢允褂媚J程序參數(shù)或可以指定備選參數(shù)。基于程序參數(shù)，序列比較算法隨后相對于參考序列計算測試序列的序列同一性百分數(shù)。

如本文所用，“比較窗口”包括針對具有任一連續(xù)位置數(shù)的節(jié)段的參考，所述的連續(xù)位置數(shù)選自20至600、通常約50至約200、更通常約100至約150，其中一個序列可以與具有相同連續(xù)位置數(shù)的參考序列在最佳比對這兩個序列后進行比較。用于比對序列以比較的方法是本領域熟知的。用于比較的最佳序列比對可以按如下方式進行，例如通過smith和waterman,(1970)adv.appl.math.2:482c的局部同源性算法、通過needleman和wunsch,j.mol.biol.48:443,1970的同源性比對算法、通過pearson和lipman,proc.nat'l.acad.sci.usa85:2444,1988的相似性檢索方法、通過這些算法的計算機化執(zhí)行(wisconsingenetics軟件包，geneticscomputergroup,575sciencedr.,madison,wi中的gap、bestfit、fasta和tfasta)或通過手工比對和目視審查(見，例如，brent等人,(2003)currentprotocolsinmolecularbiology,johnwiley&sons,inc.(ringbou編著，2003))。

適用于確定序列同一性和序列相似性百分數(shù)的兩個算法例子是blast算法和blast2.0算法，它們分別在altschul等人,nuc.acidsres.25:3389-3402,1977；和altschul等人,j.mol.biol.215:403-410,1990中描述。用于進行blast分析的軟件是通過國家生物技術信息中心可公開獲得的。這種算法涉及首先通過確定查詢序列中長度為w的短字，鑒定高評分序列對(hsp)，其中與數(shù)據(jù)庫序列中具有相同長度的字比對時，所述短字匹配或滿足某些正值閾評分t。將t稱作相鄰字評分閾值(altschul等人，上文)。這些初始相鄰字命中充當種子，所述種子用于啟動檢索以找到含有這些種子的更長hsp。所述字命中在兩個方向沿每個序列盡可能遠地延伸，只要可以提高累積比對評分。對于核苷酸序列，使用參數(shù)m(一對匹配殘基的報酬評分；總是>0)和n(錯配殘基的懲罰評分；總是<0)計算累積評分。對于氨基酸序列，使用評分矩陣計算累積評分。字命中在每個方向上的延伸在以下情況時停止：累積比對評分從其最大實現(xiàn)值跌落達量x；累積評分因積累一個或更多負評分殘基比對結(jié)果而達到或低于零；或抵達兩個序列中任一序列的末端。blast算法參數(shù)w、t和x決定比對的靈敏度和速度。blastn程序(對于核苷酸序列)使用字長度(w)11、期望(e)10、m＝5、n＝-4和兩條鏈的比較作為默認。對于氨基酸序列，blastp程序使用字長度3和期望(e)10，以及blosum62評分矩陣(見henikoff和henikoff,proc.natl.acad.sci.usa89:10915,1989)、比對(b)50、期望(e)10、m＝5、n＝-4和兩條鏈的比較作為默認。

blast算法也進行兩個序列之間相似性的統(tǒng)計分析(見，例如，karlin和altschul,proc.natl.acad.sci.usa90:5873-5787,1993)。由blast算法提供的相似性的一種度量是最小總和概率(p(n))，其提供兩個核苷酸序列或氨基酸序列之間的匹配會因偶然發(fā)生的概率指示。例如，如果最小總和概率在測試核酸與參考核酸的比較中小于約0.2、更優(yōu)選小于約0.01并且最優(yōu)選小于約0.001，則認為核酸相似于參考序列。

還可以使用pam120權重殘基表、空位長度罰分12，空位罰分4，利用已經(jīng)并入align程序(2.0版)的e.meyers和w.miller算法(comput.appl.biosci.,4:11-17,1988)確定兩個氨基酸序列之間的同一性百分數(shù)。此外，可以使用已經(jīng)集成至gcg軟件包的gap程序中的needlema和wunsch(j.mol,biol.48:444-453(1970))算法(在萬維網(wǎng)上gcg.com處可獲得)，使用blossom62矩陣或pam250矩陣和空位權重16、14、12、10、8、6或4和長度權重1、2、3、4、5或6，確定兩個氨基酸序列之間的同一性百分數(shù)。

除上文所示的序列同一性的百分數(shù)之外，兩個核酸序列或多肽基本上同一的另一個指標是由第一核酸編碼的多肽與針對第二核酸編碼的多肽所產(chǎn)生的抗體發(fā)生免疫雜交反應，如下文描述。因此，在兩種肽僅因保守性置換而不同的情況下，一個多肽一般與第二多肽基本上同一。兩個核酸序列基本上同一的另一個指標是這兩個分子或它們的互補物在嚴格條件下彼此雜交，如下文描述。兩個核酸序列基本上同一的又一個指標是能用相同的引物來擴增該序列。

術語“分離的抗體”指一種抗體，它基本上不含具有不同抗原特異性的其他抗體(例如，與angptl4特異性結(jié)合的分離抗體基本上不含特異性結(jié)合除angptl4之外的抗原的抗體)。然而，特異性結(jié)合angptl4的分離抗體可以對其他抗原具有交叉反應性。另外，分離的抗體可以基本上不含其他細胞物質(zhì)和/或化學品。

術語“同種型”指由重鏈恒定區(qū)基因提供的抗體類別(例如，igm、ige、igg如igg1或igg4)。同種型還包括這些類別之一的修飾形式，其中已經(jīng)作出修飾以改變fc功能，例如，以增強或減少效應子功能或與fc受體結(jié)合。

如本文所用，術語“kassoc”或“ka”意指特定抗體-抗原相互作用的結(jié)合速率，而如本文所用，術語“kdis”或“kd”意指特定抗體-抗原相互作用的解離速率。如本文所用，術語“kd”意指解離常數(shù)，它從kd對ka的比率(即kd/ka)獲得，并且表述為摩爾濃度(m)。可以使用本領域充分建立的方法確定抗體的kd值。用于確定抗體的kd的方法包括使用生物傳感器系統(tǒng)如系統(tǒng)測量表面等離子體共振或通過溶液平衡滴定法(set)測量溶液中的親和力。

如本文所用，術語“單克隆抗體”或“單克隆抗體組合物”指具有單一分子組成的抗體分子的制備物。一種單克隆抗體組合物對特定表位顯示單一結(jié)合特異性和親和力。

術語“核酸”在本文中可與術語“多核苷酸”互換使用并且指脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其單鏈形式或雙鏈形式的聚合物。本術語涵蓋含有已知的核苷酸類似物或已修飾的主鏈殘基或鍵的核酸，所述核酸是合成的、天然存在的和非天然存在的，具有與參考核酸相似的結(jié)合特性，并且以類似參考核苷酸的方式代謝。這類類似物的例子包括但不限于硫代磷酸酯、磷酰胺酯、甲基膦酸酯、手性-甲基膦酸酯、2'-o-甲基核糖核苷酸、肽核酸(pna)。

除非另外說明，特定核酸序列也內(nèi)在包括其保守方式修飾的變體(例如簡并密碼子置換)和互補序列，以及明確指出的序列。具體而言，如下文詳述，可以通過產(chǎn)生其中一個或多個選擇的(或全部)密碼子的第三位置用混合的堿基和/或脫氧肌苷殘基置換的序列，實現(xiàn)簡并密碼子置換(batzer等人,nucleicacidres.19:5081,1991；ohtsuka等人,j.biol.chem.260:2605-2608,1985；和rossolini等人,mol.cell.probes8:91-98,1994)。

術語“有效連接”指兩個或更多個多核苷酸(例如，dna)區(qū)段之間的功能性關系。一般，本術語指轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列與被轉(zhuǎn)錄序列的功能性關系。例如，如果啟動子或增強子序列在適宜的宿主細胞或其他表達系統(tǒng)中刺激或調(diào)節(jié)編碼序列的轉(zhuǎn)錄，則該啟動子或增強子序列與編碼序列有效連接。通常，與被轉(zhuǎn)錄的序列有效連接的啟動子轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列物理地與被轉(zhuǎn)錄的序列連續(xù)，即，它們是順式作用的。然而，一些轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列(如增強子)不需要物理上與它們所增強轉(zhuǎn)錄的編碼序列連續(xù)或與之緊鄰。

如本文所用，術語“優(yōu)化的”意指已經(jīng)改變核苷酸序列以使用在生產(chǎn)性細胞或生物(通常是真核細胞，例如畢赤酵母屬(pichia)細胞、木霉屬(trichoderma)細胞、中國倉鼠卵巢細胞(cho)或人細胞)中為優(yōu)選的密碼子編碼氨基酸序列。優(yōu)化的核苷酸序列經(jīng)工程化以完全或盡可能保留由起始核苷酸序列最初編碼的起始氨基酸序列，也稱作“親本”序列。優(yōu)化的序列在本文中已經(jīng)工程化以具有在哺乳動物細胞中為優(yōu)選的密碼子。但是，本文中還構思這些序列在其他真核細胞或原核細胞中的優(yōu)化表達。由優(yōu)化的核苷酸序列編碼的氨基酸序列也稱作優(yōu)化的。

術語“多肽”和“蛋白質(zhì)”在此互換地使用來指氨基酸殘基的聚合物。這些術語適用于其中一個或多個氨基酸殘基是相應的天然存在氨基酸的人造化學模擬物的氨基酸聚合物，以及天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。除非另有指出，特定的多肽序列也隱含地涵蓋其保守修飾的變體。

如本文所用，術語“重組人抗體”包括通過重組手段制備、表達、產(chǎn)生或分離的全部人抗體，如從就人免疫球蛋白基因而言為轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)染色體的動物(例如，小鼠)或從所述動物中制備的雜交瘤分離的抗體，從經(jīng)轉(zhuǎn)化以表達人抗體的宿主細(例如，從轉(zhuǎn)染瘤)分離的抗體、從重組人抗體組合文庫分離的抗體和通過涉及將全部或一部分人免疫球蛋白基因序列剪接成其他dna序列的任何其他手段制備、表達、產(chǎn)生或分離的抗體。這類重組人抗體具有其中構架區(qū)和cdr區(qū)從人種系免疫球蛋白序列衍生的可變區(qū)。然而，在某些實施方案中，此類重組人抗體可以經(jīng)歷體外誘變(或，使用相對于人ig序列為轉(zhuǎn)基因的動物時，經(jīng)歷體內(nèi)體細胞誘變)并且因此重組抗體的vh和vl區(qū)的氨基酸序列是盡管衍生自人種系vh和vl序列并且與之相關，但可能在體內(nèi)人抗體種系庫內(nèi)部不天然存在的序列。

術語“重組宿主細胞”(或簡稱為“宿主細胞”)指已經(jīng)向其引入重組表達載體的細胞。應當理解這類術語不僅意指特定的主題細胞，還意指這種細胞的子代。因為某些修飾可以因突變或環(huán)境影響而出現(xiàn)于后續(xù)世代中，所以這類子代實際上可以與親代細胞不完全相同，但仍包含于如本文中所用的術語“宿主細胞”的范圍內(nèi)。

術語“受試者”包括人類和非人類動物。非人動物包括全部脊椎動物(例如：哺乳動物和非哺乳動物)如非人靈長類(例如：食蟹猴)、綿羊、犬、奶牛、雞、兩棲類和爬行類。除非指出時，否則術語“患者”或“受試者”在本文中可互換地使用。如本文所用，術語“cyno”或“食蟹猴”指食蟹猴(macacafascicularis)。

如本文所用，術語對任何疾病或病癥(例如，angptl4相關病癥)的“治療著”或“治療”在一個實施方案中指改善該疾病或病癥(即，延緩或停滯或減少疾病或其至少一個臨床癥狀的形成)。在另一個實施方案中，“治療著”或“治療”指緩和或緩解至少一個身體參數(shù)，包括患者可能不可察覺的那些身體參數(shù)。在又一個實施方案中，“治療著”或“治療”指在身體上(例如，穩(wěn)定可察覺癥狀)、生理上(例如，穩(wěn)定身體參數(shù))或在這兩方面調(diào)節(jié)疾病或病癥。在又一個實施方案中，“治療著”或“治療”指防止或延遲疾病或病癥的發(fā)作或形成或進展。

“防止”在涉及本文所述的適應癥(例如包括angptl4相關病癥)時，意指防止或減緩如下文描述的例如angptl4相關疾病參數(shù)在面臨惡化風險的患者中的所述惡化。

術語“載體”意指多核苷酸分子，它能夠運輸已經(jīng)之連接的另一個多核苷酸。一種類型的載體是“質(zhì)?！埃渲缚梢韵蚱渲羞B接額外dna區(qū)段的環(huán)狀雙鏈dna環(huán)。另一類型的載體是病毒載體，如腺相關病毒病毒載體(aav或aav2)，其中額外的dna區(qū)段可以連入病毒基因組中。某些載體能夠在導入了它們的宿主細胞中自主復制(例如，具有細菌復制起點的細菌載體和附加體型哺乳動物載體)。其他載體(例如非附加體型哺乳動物載體)可以在導入宿主細胞時整合到該宿主細胞的基因組中，并因而隨宿主基因組一起復制。另外，某些載體能夠指導與它們有效連接的基因表達。此類載體在本文中稱作“重組表達載體“(或簡單地稱作，“表達載體“)。通常，重組dna技術中使用的表達載體經(jīng)常處于質(zhì)粒形式。在本說明書中，“質(zhì)?！焙汀拜d體”可以互換地使用，因為質(zhì)粒是最常用形式的載體。然而，本發(fā)明意在包括起到同等功能的其他形式的表達載體，如病毒載體(例如，復制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺相關病毒)。

附圖簡述

圖1a-1d描述了通過本發(fā)明的所選angptl4抗體逆轉(zhuǎn)angptl4介導對人脂蛋白脂肪酶(lpl)蛋白的抑制。

圖2描述了本發(fā)明的所選抗體與全長人angptl4和人angptl4n末端卷曲螺旋結(jié)構域的結(jié)合和不存在與人全長angptl3結(jié)合。angptl3ab＝angptl3特異性參考抗體。

圖3a-3b描述了在施用本發(fā)明的所選angptl4抗體后人angptl4轉(zhuǎn)基因小鼠中血漿甘油三酯水平的變化。

圖4描述了在施用本發(fā)明的一種angptl4抗體(neg276-lala)后肥胖的糖尿病食蟹猴中的血漿總?cè)丝贵w濃度。

圖5描述了在施用本發(fā)明的一種angptl4抗體(neg276-lala)后肥胖的糖尿病食蟹猴中血漿甘油三酯(tg)濃度的變化。

圖6描述了在施用本發(fā)明的一種angptl4抗體(neg276-lala)后肥胖的糖尿病食蟹猴中血漿總膽固醇濃度的變化。

圖7描述了在施用本發(fā)明的一種angptl4抗體(neg276-lala)后肥胖的糖尿病食蟹猴中血漿高密度脂蛋白(hdl)濃度的變化。

圖8描述了在施用本發(fā)明的一種angptl4抗體(neg276-lala)后肥胖的糖尿病食蟹猴中血漿總載脂蛋白b(apob)濃度的變化。

圖9描述了在施用本發(fā)明的一種angptl4抗體(neg276-lala)后肥胖的糖尿病食蟹猴中血漿載脂蛋白c-iii(apoc-iii)濃度的變化。

圖10描述了在施用本發(fā)明的一種angptl4抗體后如通過快速蛋白質(zhì)液相色譜(fplc)分離血漿脂蛋白所評估的血漿脂蛋白相關膽固醇水平的變化。顯示來自一只猴的數(shù)據(jù)(neg276-lala，猴#6296)?？s寫：trl，甘油三酯豐富的脂蛋白；ldl，低密度脂蛋白；hdl，高密度脂蛋白。

圖11描述了在施用本發(fā)明的一種angptl4抗體后如通過快速蛋白質(zhì)液相色譜(fplc)分離血漿脂蛋白所評估的血漿脂蛋白相關甘油三酯(tg)水平的變化。顯示了來自一只猴的數(shù)據(jù)(neg276-lala，猴#6296)?？s寫：trl，甘油三酯豐富的脂蛋白；ldl，低密度脂蛋白；hdl，高密度脂蛋白。

詳細描述

本發(fā)明部分地基于發(fā)現(xiàn)與angptl4特異性結(jié)合并抑制其生物學活性的抗體分子。本發(fā)明涉及完整igg樣式抗體(例如，人源化抗體neg276、neg276-lala、neg278、neg310、neg313、neg315、neg318、neg319)以及其抗原結(jié)合片段，如fab片段。

因此，本發(fā)明提供與angptl4(例如，人angptl4)特異性結(jié)合的抗體、藥物組合物、產(chǎn)生方法和使用這類抗體和組合物的方法。

angptl4蛋白

本發(fā)明提供與angptl4特異性結(jié)合并抑制其生物學活性(包括激活脂蛋白脂肪酶(lpl)的能力)的抗體分子。相反，血管生成素樣蛋白4(angptl4)是分泌型蛋白的血管生成素家族的成員。它是由多個細胞類型(包括巨噬細胞、脂肪細胞、肌肉細胞和肝臟細胞)表達的同型寡聚蛋白，能夠形成二聚體和四聚體。angptl4也稱作肝纖維蛋白原/血管生成素相關蛋白(hfarp)(kim等人,(2000)biochem.j.346:603-610)；pparγ血管生成素相關蛋白(pgar)(yoon等人(2000)mol.cellbiol.,20:5343-5349)和禁食誘導的脂肪因子(fiaf)(kerten等人,(2000)j.biol.chem.,275:28488-28493)。angptl4含有一個n末端卷曲螺旋結(jié)構域和一個c末端纖維蛋白原(fbn)樣結(jié)構域(kim等人(2000)biochem.j.346:603-610)。

脂蛋白脂肪酶(lpl)在脂蛋白代謝中具有維持血液中的正常脂蛋白水平和通過其活性的組織特異性調(diào)節(jié)作用而決定何時和在哪種組織中卸載甘油三酯(tg)的核心作用。已知angptl4的卷曲螺旋區(qū)抑制脂蛋白脂肪酶(lpl)-介導的甘油三酯(tg)清除。因此，觀察到angptl4功能喪失型突變(例如，如人類受試者中所見)、遺傳缺失(例如，如轉(zhuǎn)基因小鼠中所見)，和抗體抑制作用(例如，如小鼠和食蟹猴中所見)均減少血漿甘油三酯。另外，還已知angptl4抗體激活lpl。相反，向小鼠中注射angptl4導致循環(huán)型甘油三酯快速增加并且這是比注射血管生成素樣蛋白3(angptl3)更高的速率(yoshida等人,(2002)jlipidres43:1770-1772)。

本發(fā)明中所述的抗angptl4抗體和抗原結(jié)合片段啟動、促進或增強lpl激活，例如，通過阻斷angptl4對lpl的抑制，因而減少血漿甘油三酯做到。這些抗體預計防止和改善以甘油三酯水平升高為特征的疾病(例如，原發(fā)性血脂異常、高甘油三酯血癥、代謝綜合征、ii型糖尿病等)的急性和慢性表現(xiàn)。

本發(fā)明中所述的抗angptl4抗體和抗原結(jié)合片段啟動、促進或增強lpl激活，例如，通過阻斷angptl4對lpl的抑制，因而減少血漿甘油三酯做到。這些抗體預計防止和改善以甘油三酯水平升高為特征的疾病(例如，原發(fā)性血脂異常、高甘油三酯血癥、代謝綜合征、ii型糖尿病等)的急性和慢性表現(xiàn)。

angptl4抗體和抗原結(jié)合片段

本發(fā)明提供與angptl4特異性結(jié)合的抗體。在一些實施方案中，本發(fā)明提供與人angptl4和食蟹猴angptl4特異性結(jié)合的抗體。本發(fā)明的抗體包括但不限于如實施例中所述的分離的人源化抗體和fab。

本發(fā)明提供特異性結(jié)合angptl4蛋白(例如，人angptl4和食蟹猴angptl4)的抗體，其中抗體包含具有seqidno:13、38、58、78、98、118和138的氨基酸序列的vh結(jié)構域。本發(fā)明還提供與angptl4蛋白特異性結(jié)合的抗體，其中抗體包含具有本文下表1中所列出任一個vhcdr的氨基酸序列的vhcdr。特別地，本發(fā)明提供與angptl4蛋白(例如，人angptl4和食蟹猴angptl4)特異性結(jié)合的抗體，其中抗體包含具有本文下表1中所列任意個vhcdr的氨基酸序列的一個、兩個、三個或更多個vhcdr(或備選地，由其組成)。

本發(fā)明提供與angptl4蛋白特異性結(jié)合的抗體，所述抗體包含具有seqidno:23、48、68、88、108、128和148的氨基酸序列的vl結(jié)構域。本發(fā)明還提供與angptl4蛋白(例如，人angptl4和食蟹猴angptl4)特異性結(jié)合的抗體，所述抗體包含具有本文下表2中所列出任一個vlcdr的氨基酸序列的vlcdr。特別地，本發(fā)明提供與angptl4蛋白(例如，人angptl4和食蟹猴angptl4)特異性結(jié)合的抗體，所述抗體包含具有本文下表1中所列任意個vlcdr的氨基酸序列的一個、兩個、三個或更多個vlcdr(或備選地，由其組成)。

本發(fā)明的其他抗體包含已經(jīng)被突變，然而在cdr區(qū)內(nèi)具有與表1中所述序列描述的cdr區(qū)至少60％、70％、80％、85％、90％或95％同一性的氨基酸。在一些實施方案中，它包括這樣的突變氨基酸序列，其中與表1所述序列中描述的cdr區(qū)相比時，已經(jīng)在cdr區(qū)中突變了不多于1、2、3、4或5個氨基酸。

本發(fā)明還提供了編碼與angptl4蛋白(例如，人angptl4和食蟹猴angptl4)特異性結(jié)合的抗體的vh、vl、全長重鏈和全長輕鏈的核酸序列?？梢詢?yōu)化這些核酸序列以在哺乳動物細胞中表達(例如，表1顯示本發(fā)明抗體的重鏈和輕鏈的優(yōu)化核酸序列)。

表1.angptl4抗體、fab和angptl4蛋白的例子

本發(fā)明的其他抗體包括這些抗體，其中所述氨基酸或編碼所述氨基酸的核酸已經(jīng)被突變，但仍與表1中描述的序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％同一性。一些實施方案包括突變的氨基酸序列，其中與表1所述序列所示的可變區(qū)相比時，可變區(qū)中已突變了不多于1、2、3、4或5個氨基酸，但保留基本相同的抗原結(jié)合活性。

由于這些抗體中的每一種抗體可以與angptl4結(jié)合，可以“混合并匹配”vh、vl、全長輕鏈和全長重鏈序列(氨基酸序列和編碼所述氨基酸序列的核苷酸序列)以產(chǎn)生結(jié)合angptl4的本發(fā)明其他抗體?？梢允褂帽绢I域已知的結(jié)合測定法(例如，elisa，和實施例部分中描述的其他測定法)測試這類“混合和匹配的”結(jié)合angptl4的抗體。在混合和匹配這些鏈時，應當將來自特定vh/vl配對的vh序列替換為結(jié)構相似的vh序列。同樣，來自特定全長重鏈/全長輕鏈配對的全長重鏈序列應當替換為結(jié)構上相似的全長重鏈序列。同樣，來自特定vh/vl配對的vl序列應當替換為結(jié)構上相似的vl序列。同樣地，應當將來自特定全長重鏈/全長輕鏈配對的全長輕鏈序列替換為結(jié)構相似的全長輕鏈序列。

因此，在一個方面，本發(fā)明提供分離的抗體或其抗原結(jié)合區(qū)，其具有：包含選自seqidno:13、38、58、78、98、118和138的氨基酸序列的重鏈可變結(jié)構域；和包含選自seqidno:23、48、68、88、108、128和148的氨基酸序列的輕鏈可變結(jié)構域；其中抗體與langptl4(例如，人angptl4)特異性結(jié)合。

更具體地，在某些方面，本發(fā)明提供分離的抗體或其抗原結(jié)合區(qū)，其具有重鏈可變結(jié)構域和輕鏈可變結(jié)構域，所述重鏈可變結(jié)構域和輕鏈可變結(jié)構域包含分別選自seqidno:13和23；38和48；58和68；78和88；98和108、118和128或138和148的序列。

在另一個方面，本發(fā)明提供(i)分離的抗體，其具有：包含已經(jīng)優(yōu)化用于哺乳動物細胞中表達的氨基酸序列的全長重鏈，所述氨基酸序列選自seqidno:15、28、40、60、80、100、120和140；和包含已經(jīng)優(yōu)化用于哺乳動物細胞中表達的氨基酸序列的全長輕鏈，所述氨基酸序列選自seqidno:25、50、70、90、110、130和150；或(ii)包含其抗原結(jié)合部分的有功能的蛋白質(zhì)。更具體地，在某些方面，本發(fā)明提供分離的抗體或其抗原結(jié)合區(qū)，其具有重鏈和輕鏈，所述重鏈和輕鏈包含分別選自seqidno:15和25；28和25；40和50；60和70；80和90；100和110；120和130；或140和150的序列。

如本文所用，術語“互補決定區(qū)”和“cdr”指在抗體可變區(qū)內(nèi)部賦予抗原特異性和結(jié)合親和力的氨基酸序列。通常而言，在每個重鏈可變區(qū)中存在三個cdr(hcdr1、hcdr2、hcdr3)并且在每個輕鏈可變區(qū)中存在三個cdr(lcdr1、lcdr2、lcdr3)。

可以通過使用多種熟知方案的任一者輕易地確定給定cdr的精確氨基酸序列界限，所述熟知方案包括由kabat等人,(1991),“sequencesofproteinsofimmunologicalinterest(目的免疫蛋白質(zhì)的序列)”,第5版,publichealthservice,nationalinstitutesofhealth,bethesda,md(“kabat”編號方案)，al-lazikani等人,(1997)jmb273,927-948(“chothia”編號方案)描述的那些方案。

例如，根據(jù)kabat，將抗體ff1在重鏈可變結(jié)構域(vh)中的cdr氨基酸殘基編號為31-35(hcdr1)、50-66(hcdr2)和99-104(hcdr3)；并且將在輕鏈可變結(jié)構域(vl)中的cdr氨基酸殘基編號為24-34(lcdr1)、50-55(lcdr2)和89-97(lcdr3)。根據(jù)chothia，將vh中的cdr氨基酸編號為26-32(hcdr1)、52-57(hcdr2)和99-104(hcdr3)；和將vl中的氨基酸殘基編號為26-32(lcdr1)、50-52(lcdr2)和91-96(lcdr3)。通過組合kabat和chothia二者的cdr定義，cdr由人vh中的氨基酸殘基26-35(hcdr1)、50-66(hcdr2)和99-104(hcdr3)以及人vl中的氨基酸殘基24-34(lcdr1)、50-55(lcdr2)和89-97(lcdr3)組成。

在另一方面，本發(fā)明提供結(jié)合angptl4的抗體，所述抗體包含表1中所述的重鏈和輕鏈cdr1、cdr2和cdr3或其組合。這些抗體的vhcdr1的氨基酸序列在seqidno:7、32、52、72、92、112和132中顯示。這些抗體的vhcdr2的氨基酸序列在seqidno:8、33、53、73、93、113和133中顯示。這些抗體的vhcdr3的氨基酸序列在seqidno:9、34、54、74、94、114和134中顯示。這些抗體的vlcdr1的氨基酸序列在seqidno:17、42、62、82、102、122和142中顯示。這些抗體的vlcdr2的氨基酸序列在seqidno:18、43、63、83、103、123和143中顯示。這些抗體的vlcdr3的氨基酸序列在seqidno:19、44、64、84、104、124和144中顯示。使用kabat系統(tǒng)描述這些cdr區(qū)。

備選地，如使用chothia系統(tǒng)(al-lazikani等人,(1997)jmb273,927-948)所定義的，所述抗體的vhcdr1的氨基酸序列在seqidno:10、35、55、75、95、115和135中顯示。這些抗體的vhcdr2的氨基酸序列在seqidno:11、36、56、76、96、116和136中顯示。這些抗體的vhcdr3的氨基酸序列在seqidno:12、37、57、77、97、117、117和137中顯示。這些抗體的vlcdr1的氨基酸序列在seqidno:20、45、65、85、105、125和145中顯示。這些抗體的vlcdr2的氨基酸序列在seqidno:21、46、66、86、106、126和146中顯示。這些抗體的vlcdr3的氨基酸序列在seqidno:22、47、67、87、107、127和147中顯示。

鑒于這些抗體的每一者均可以與angptl4結(jié)合以及抗原結(jié)合特異性主要由cdr1、2和3區(qū)提供，可以將vhcdr1、2和3序列和vlcdr1、2和3序列“混合并匹配”(即，可以混合并匹配來自不同抗體的cdr，不過每種抗體優(yōu)選地含有vhcdr1、2和3和vlcdr1、2和3以產(chǎn)生結(jié)合angptl4的本發(fā)明其他分子?？梢允褂帽绢I域已知的結(jié)合測定法和實施例中描述的那些測定法(例如，elisa、set、biacore)測試這類“混合和匹配的”結(jié)合angptl4的抗體。當混合并匹配vhcdr序列時，來自特定vh序列的cdr1、cdr2和/或cdr3序列應當替換為結(jié)構上相似的cdr序列。同樣，當混合并匹配vlcdr序列時，來自特定vl序列的cdr1、cdr2和/或cdr3序列應當替換為結(jié)構上相似的cdr序列。普通技術人員將輕易地明白，可以通過將一個或多個vh和/或vlcdr區(qū)序列置換為結(jié)構上相似的來自本文中對本發(fā)明單克隆抗所顯示的cdr序列中的序列。除前述之外，在一個實施方案中，本文所述抗體的抗原結(jié)合片段可以包含vhcdr1、2和3，或vlcdr1、2和3，其中該片段與作為單一可變結(jié)構域的angptl4結(jié)合。

在本發(fā)明的某些實施方案中，抗體或其抗原結(jié)合片段可以具有表1中描述的人源化抗體的重鏈序列和輕鏈序列。更具體地，抗體或其抗原結(jié)合片段可以具有neg276、neg276-lala、neg278、neg310、neg313、neg315、neg318和neg319的重鏈序列和輕鏈序列。

在本發(fā)明的其他實施方案中，特異性結(jié)合angptl4的抗體或抗原結(jié)合片段包含如kabat所定義和在表1中描述的重鏈可變區(qū)cdr1、重鏈可變區(qū)cdr2、重鏈可變區(qū)cdr3、輕鏈可變區(qū)cdr1、輕鏈可變區(qū)cdr2和輕鏈可變區(qū)cdr3。在本發(fā)明的另外實施方案中，特異性結(jié)合angptl4的抗體或抗原結(jié)合片段包含如chothia所定義和在表1中描述的重鏈可變區(qū)cdr1、重鏈可變區(qū)cdr2、重鏈可變區(qū)cdr3、輕鏈可變區(qū)cdr1、輕鏈可變區(qū)cdr2和輕鏈可變區(qū)cdr3。

在一個具體實施方案中，本發(fā)明包括與angptl4特異性結(jié)合的抗體，所述抗體包含seqidno:7的重鏈可變區(qū)cdr1；seqidno:8的重鏈可變區(qū)cdr2；seqidno:9的重鏈可變區(qū)cdr3；seqidno:17的輕鏈可變區(qū)cdr1；seqidno:18的輕鏈可變區(qū)cdr2；和seqidno:19的輕鏈可變區(qū)cdr3。

在另一個具體實施方案中，本發(fā)明包括與angptl4特異性結(jié)合的抗體，所述抗體包含seqidno:32的重鏈可變區(qū)cdr1；seqidno:33的重鏈可變區(qū)cdr2；seqidno:34的重鏈可變區(qū)cdr3；seqidno:42的輕鏈可變區(qū)cdr1；seqidno:43的輕鏈可變區(qū)cdr2；和seqidno:44的輕鏈可變區(qū)cdr3。

在另一個具體實施方案中，本發(fā)明包括與angptl4特異性結(jié)合的抗體，所述抗體包含seqidno:52的重鏈可變區(qū)cdr1；seqidno:53的重鏈可變區(qū)cdr2；seqidno:54的重鏈可變區(qū)cdr3；seqidno:62的輕鏈可變區(qū)cdr1；seqidno:63的輕鏈可變區(qū)cdr2；和seqidno:64的輕鏈可變區(qū)cdr3。

在另一個具體實施方案中，本發(fā)明包括與angptl4特異性結(jié)合的抗體，所述抗體包含seqidno:72的重鏈可變區(qū)cdr1；seqidno:73的重鏈可變區(qū)cdr2；seqidno:74的重鏈可變區(qū)cdr3；seqidno:82的輕鏈可變區(qū)cdr1；seqidno:83的輕鏈可變區(qū)cdr2；和seqidno:84的輕鏈可變區(qū)cdr3。

在另一個具體實施方案中，本發(fā)明包括與angptl4特異性結(jié)合的抗體，所述抗體包含seqidno:92的重鏈可變區(qū)cdr1；seqidno:93的重鏈可變區(qū)cdr2；seqidno:94的重鏈可變區(qū)cdr3；seqidno:102的輕鏈可變區(qū)cdr1；seqidno:103的輕鏈可變區(qū)cdr2；和seqidno:104的輕鏈可變區(qū)cdr3。

在另一個具體實施方案中，本發(fā)明包括與angptl4特異性結(jié)合的抗體，所述抗體包含seqidno:112的重鏈可變區(qū)cdr1；seqidno:113的重鏈可變區(qū)cdr2；seqidno:114的重鏈可變區(qū)cdr3；seqidno:122的輕鏈可變區(qū)cdr1；seqidno:123的輕鏈可變區(qū)cdr2；和seqidno:124的輕鏈可變區(qū)cdr3。

在另一個具體實施方案中，本發(fā)明包括與angptl4特異性結(jié)合的抗體，所述抗體包含seqidno:132的重鏈可變區(qū)cdr1；seqidno:133的重鏈可變區(qū)cdr2；seqidno:134的重鏈可變區(qū)cdr3；seqidno:142的輕鏈可變區(qū)cdr1；seqidno:143的輕鏈可變區(qū)cdr2；和seqidno:144的輕鏈可變區(qū)cdr3。

在另一個具體實施方案中，本發(fā)明包括與angptl4特異性結(jié)合的抗體，所述抗體包含seqidno:10的重鏈可變區(qū)cdr1；seqidno:11的重鏈可變區(qū)cdr2；seqidno:12的重鏈可變區(qū)cdr3；seqidno:20的輕鏈可變區(qū)cdr1；seqidno:21的輕鏈可變區(qū)cdr2；和seqidno:22的輕鏈可變區(qū)cdr3。

在另一個具體實施方案中，本發(fā)明包括與angptl4特異性結(jié)合的抗體，所述抗體包含seqidno:35的重鏈可變區(qū)cdr1；seqidno:36的重鏈可變區(qū)cdr2；seqidno:37的重鏈可變區(qū)cdr3；seqidno:45的輕鏈可變區(qū)cdr1；seqidno:46的輕鏈可變區(qū)cdr2；和seqidno:47的輕鏈可變區(qū)cdr3。

在另一個具體實施方案中，本發(fā)明包括與angptl4特異性結(jié)合的抗體，所述抗體包含seqidno:55的重鏈可變區(qū)cdr1；seqidno:56的重鏈可變區(qū)cdr2；seqidno:57的重鏈可變區(qū)cdr3；seqidno:65的輕鏈可變區(qū)cdr1；seqidno:66的輕鏈可變區(qū)cdr2；和seqidno:67的輕鏈可變區(qū)cdr3。

在另一個具體實施方案中，本發(fā)明包括與angptl4特異性結(jié)合的抗體，所述抗體包含seqidno:75的重鏈可變區(qū)cdr1；seqidno:76的重鏈可變區(qū)cdr2；seqidno:77的重鏈可變區(qū)cdr3；seqidno:85的輕鏈可變區(qū)cdr1；seqidno:86的輕鏈可變區(qū)cdr2；和seqidno:87的輕鏈可變區(qū)cdr3。

在另一個具體實施方案中，本發(fā)明包括與angptl4特異性結(jié)合的抗體，所述抗體包含seqidno:95的重鏈可變區(qū)cdr1；seqidno:96的重鏈可變區(qū)cdr2；seqidno:97的重鏈可變區(qū)cdr3；seqidno:105的輕鏈可變區(qū)cdr1；seqidno:106的輕鏈可變區(qū)cdr2；和seqidno:107的輕鏈可變區(qū)cdr3。

在另一個具體實施方案中，本發(fā)明包括與angptl4特異性結(jié)合的抗體，所述抗體包含seqidno:115的重鏈可變區(qū)cdr1；seqidno:116的重鏈可變區(qū)cdr2；seqidno:117的重鏈可變區(qū)cdr3；seqidno:125的輕鏈可變區(qū)cdr1；seqidno:126的輕鏈可變區(qū)cdr2；和seqidno:127的輕鏈可變區(qū)cdr3。

在另一個具體實施方案中，本發(fā)明包括與angptl4特異性結(jié)合的抗體，所述抗體包含seqidno:135的重鏈可變區(qū)cdr1；seqidno:136的重鏈可變區(qū)cdr2；seqidno:137的重鏈可變區(qū)cdr3；seqidno:145的輕鏈可變區(qū)cdr1；seqidno:146的輕鏈可變區(qū)cdr2；和seqidno:147的輕鏈可變區(qū)cdr3。

在某些實施方案中，本發(fā)明包括如表1中所述的與angptl4特異性結(jié)合的抗體或抗原結(jié)合片段。在一個優(yōu)選實施方案中，結(jié)合angptl4的抗體或抗原結(jié)合片段是neg276、neg276-lala、neg278、neg310、neg313、neg315、neg318、neg319。

同源抗體

在又一個實施方案中，本發(fā)明提供了包含與表1中所述序列同源的氨基酸序列的抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述抗體與angptl4蛋白(例如，人angptl4和食蟹猴angptl4)結(jié)合并且保留表1中描述的那些抗體的所需功能特征。

例如，本發(fā)明提供一種包含重鏈可變結(jié)構域和輕鏈可變結(jié)構域的分離抗體或其功能性抗原結(jié)合片段，其中所述重鏈可變結(jié)構域包含與選自seqidno:13、38、58、78、98、118和138的氨基酸序列至少80％、至少90％或至少95％同一的氨基酸序列；輕鏈可變結(jié)構域包含與選自seqidno:23、23、48、68、88、108、128、148的氨基酸序列至少80％、至少90％或至少95％同一的氨基酸序列；并且所述抗體與angptl4(例如，人angptl4和食蟹猴angptl4)特異性結(jié)合。在本發(fā)明的某些方面，重鏈序列和輕鏈序列還包含如kabat所定義的hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3序列，例如分別包含seqidno:7、8、9、17、18和19。在本發(fā)明的某些其他方面，重鏈序列和輕鏈序列還包含如chothia所定義的hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3序列，例如分別包含seqidno:10、11、12、20、21和22。

在其他實施方案中，vh和/或vl氨基酸序列可以與表1中所述的序列50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一。在其他實施方案中，vh和/或vl氨基酸序列可以是同一的，除了不多于1、2、3、4或5個氨基酸位置中的氨基酸置換外。可以通過以下方式獲得具有與表1中描述的那些抗體的vh區(qū)和vl區(qū)具備高(即，80％或更大)同一性的vh區(qū)和vl區(qū)的抗體：誘變(例如，位點定向誘變或pcr介導誘變)分別編碼seqidno:13、38、58、78、98、118、118或138和seqidno:23、48、68、88、108、128或148的核酸分子，隨后使用本文所述的功能測定法對編碼的已改變的抗體測試保留的功能。

在其他實施方案中，全長重鏈氨基酸序列和/或全長輕鏈氨基酸序列可以與表1中所述的序列50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一?？梢酝ㄟ^以下方式獲得具有全長重鏈和全長輕鏈的抗體，所述全長重鏈和全長輕鏈與seqidno:15、28、40、60、80、100、120或140中任一者的全長重鏈和seqidno:25、25、50、70、90、110、130或150中任一者的全長輕鏈具備高(即，80％或更高)同一性：誘變(例如，位點定向誘變或pcr介導誘變)編碼這類多肽的核酸分子，隨后使用本文所述的功能測定法對編碼的已改變的抗體測試保留的功能。

在其他實施方案中，全長重鏈核苷酸序列和/或全長輕鏈核苷酸序列可以與表1中所述的序列60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一。

在其他實施方案中，重鏈可變區(qū)核苷酸序列和/或輕鏈可變區(qū)核苷酸序列可以與表1中所述序列60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一。

如本文所用，考慮到需要為最佳比對這兩個序列而導入的空位的數(shù)目和每個空位的長度，兩個序列之間的同一性百分數(shù)是所述序列共有的相同位置的函數(shù)(即，％同一性等于相同位置數(shù)/位置總數(shù)x100)。可以使用如下文非限制性實施例中所述的數(shù)學算法，完成序列的比較和兩個序列之間同一性百分數(shù)的確定。

額外地或備選地，可以進一步使用本發(fā)明的核酸序列和蛋白質(zhì)序列作為“查詢序列”以針對公共數(shù)據(jù)庫執(zhí)行檢索，以例如鑒定相關序列。例如，可以使用altschul等人,1990j.mol.biol.215:403-10的blast程序執(zhí)行此類檢索。

具有保守修飾的抗體

在某些實施方案中，本發(fā)明的抗體具有重鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)包含cdr1、cdr2和cdr3序列，和輕鏈可變區(qū)，所述輕鏈可變區(qū)包含cdr1、cdr2和cdr3序列，其中這些cdr序列的一個或多個序列具有基于本文所述抗體的指定氨基酸序列或其保守修飾物，并且其中所述抗體保留結(jié)合angptl4的本發(fā)明抗體的所需功能特性。

因此，本發(fā)明提供一種分離的抗體或其抗原結(jié)合片段，其由包含cdr1、cdr2和cdr3序列的重鏈可變區(qū)和包含cdr1、cdr2和cdr3序列的輕鏈可變區(qū)組成，其中：重鏈可變區(qū)cdr1的氨基酸序列選自seqidno:7、32、52、72、92、112和132及其保守修飾物；重鏈可變區(qū)cdr2的氨基酸序列選自seqidno:8、33、53、73、93、113和133及其保守修飾物；重鏈可變區(qū)cdr3的氨基酸序列選自seqidno:9、34、54、74、94、114和134及其保守修飾物；輕鏈可變區(qū)cdr1的氨基酸序列選自seqidno:17、42、62、82、102、122和142及其保守修飾物；輕鏈可變區(qū)cdr2的氨基酸序列選自seqidno:18、43、63、83、103、123和143及其保守修飾物；輕鏈可變區(qū)cdr3的氨基酸序列選自seqidno:19、44、64、84、104、124和144及其保守修飾物；并且抗體或其抗原結(jié)合片段與angptl4特異性結(jié)合。

在其他實施方案中，本發(fā)明的抗體為哺乳動物細胞中的表達而優(yōu)化，具有全長重鏈序列和全長輕鏈序列，其中這些序列的一個或多個序列具有基于本文所述的優(yōu)選抗體的指定氨基酸序列或其保守修飾物，并且其中抗體保留本發(fā)明結(jié)合angptl4的抗體的所需功能特性。因此，本發(fā)明提供為哺乳動物細胞中表達而優(yōu)化的分離抗體，所述分離的抗體由全長重鏈和全長輕鏈組成，其中所述全長重鏈具有選自seqidno:15、28、40、60、80、100、120和140的氨基酸序列及其保守修飾物；并且全長輕鏈具有選自seqidno:25、50、70、90、110、130和150的氨基酸序列及其保守修飾物；并且所述抗體與angptl4(例如，人angptl4和食蟹猴angptl4)特異性結(jié)合。

結(jié)合相同表位的抗體

本發(fā)明提供了抗體，所述抗體與表1中描述的結(jié)合angptl4的抗體結(jié)合相同的表位。額外的抗體可以因此基于它們在angptl4結(jié)合測定法(如實施例中描述的那些)中與本發(fā)明的其他抗體競爭(例如，以統(tǒng)計顯著方式競爭性抑制其他抗體的結(jié)合作用)的能力而鑒定。測試抗體抑制本發(fā)明抗體與angptl4蛋白結(jié)合的能力表明，該測試抗體可以這種抗體競爭與angptl4的結(jié)合；根據(jù)非限制性理論，這種抗體可以結(jié)合至與它競爭的抗體在angptl4蛋白上的相同或相關(例如，結(jié)構上相似或空間上靠近的)表位。在某些實施方案中，與本發(fā)明抗體在angptl4蛋白上的相同表位結(jié)合的抗體是人源化抗體?？梢员疚乃鲋苽洳⒎蛛x這類人源化抗體。如本文所用，當競爭性抗體抑制等摩爾濃度的競爭性抗體存在下本發(fā)明抗體或抗原結(jié)合片段的angptl4結(jié)合作用超過50％(例如，80％、85％、90％、95％、98％或99％)時，該抗體“競爭”結(jié)合作用。

在其他實施方案中，本發(fā)明的抗體或抗原結(jié)合片段與angptl4的一個或多個表位結(jié)合。在一些實施方案中，與本發(fā)明的抗體或抗原結(jié)合片段結(jié)合的表位是線性表位。在其他實施方案中，與本發(fā)明的抗體或抗原結(jié)合片段結(jié)合的表位是非線性構象表位。

工程化和修飾的抗體

還可用具有一個或多個本文所示vh和/或vl序列的抗體作為起始材料，工程化出修飾的抗體，以制備本發(fā)明的抗體，所述修飾的抗體可以具有相對于起始抗體改變的性質(zhì)。可通過修飾一個或兩個可變區(qū)(即vh和/或vl)內(nèi)，例如一個或多個cdr區(qū)內(nèi)和/或一個或多個構架區(qū)內(nèi)的一個或多個殘基來改造抗體。額外地或備選地，可以通過修飾恒定區(qū)內(nèi)部的殘基，例如以改變抗體的效應子功能)，將抗體工程化。

可以進行的一種可變區(qū)工程化是cdr移植。抗體優(yōu)勢地通過位于六個重鏈和輕鏈互補決定區(qū)(cdr)內(nèi)的氨基酸殘基與靶抗原相互作用。出于這個原因，各抗體之間cdr內(nèi)部的氨基酸序列比cdr外部更多樣。因為cdr序列負責大部分的抗體-抗原相互作用，所以可以通過構建表達載體表達模擬天然存在的特定抗體的特性的重組抗體，其中所述表達載體包含來自該天然存在的特定抗體的cdr序列，所述cdr序列被移植到來自具有不同特性的不同抗體的構架序列上(參見，例如riechmann等人,1998nature332:323-327；jones,p.等人,1986nature321:522-525；queen,c.等人,1989proc.natl.acad.,u.s.a.86:10029-10033；授予winter的美國專利號5,225,539，和授予queen等人的美國專利號5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370)。

因此，本發(fā)明的另一個實施方案涉及一種包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的分離抗體或其抗原結(jié)合片段，所述重鏈可變區(qū)分別包含了具有選自seqidno:7、32、52、72、92、112和132的氨基酸序列的cdr1序列；具有選自seqidno:8、33、53、73、93、113和133的氨基酸序列的cdr2序列；具有選自seqidno:9、34、54、74、94、114和134的氨基酸序列的cdr3序列，所述輕鏈可變區(qū)分別包含了具有選自seqidno:17、42、62、82、102、122和142的氨基酸序列的cdr1序列；具有選自seqidno:18、43、63、83、103、123和143的氨基酸序列的cdr2序列；具有選自seqidno:19、44、64、84、104、124和144的氨基酸序列的cdr3序列。因而，這類抗體含有單克隆抗體的vh和vlcdr序列，然而可以含有來自這些抗體的不同構架序列。

這類構架序列可以從包含種系抗體基因序列的公共dna數(shù)據(jù)庫或公布的參考文獻中獲得。例如，人重鏈和輕鏈可變區(qū)基因的種系dna序列可以在“vbase”人種系序列數(shù)據(jù)庫(在萬維網(wǎng)上以下網(wǎng)址可獲得：mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase)中以及在kabat,e.a.等人,1991sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,fifthedition,u.s.departmentofhealthandhumanservices,nih出版編號91-3242；tomlinson,i.m.等人,1992j.mol.biol.227:776-798；和cox,j.p.l.等人,1994eur.jimmunol.24:827-836中找到。各文獻的內(nèi)容在此明確引入作為參考。

用于本發(fā)明的抗體的構架序列的實例是與所選本發(fā)明抗體使用的構架序列在結(jié)構上相似的那些構架序列(例如本發(fā)明的單克隆抗體使用的共有序列和/或構架序列)?？梢詫hcdr1、2和3序列和vlcdr1、2和3序列移植到下述構架區(qū)上，所述構架區(qū)的序列與衍生該構架序列的種系免疫球蛋白基因中存在的序列相同，或可以將所述cdr序列移植到與種系序列相比含有一種或多種突變的構架區(qū)上。例如，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在某些情況下，使構架區(qū)內(nèi)部的殘基突變有益于維持或增強抗體的抗原結(jié)合能力(見，例如，授予queen等人的美國專利號5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370)?？梢宰鳛樵谄渖蠘嫿ū疚乃隹贵w和抗原結(jié)合片段的支架利用的構架包括但不限于vh1a、vh1b、vh3、vk1、vl2和vk2。額外的構架是本領域已知的并且可以在例如萬維網(wǎng)上以下網(wǎng)址vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/index.php？&mmn_position＝1:1處的vbase數(shù)據(jù)庫中找到。

因此，本發(fā)明的一個實施方案涉及結(jié)合angptl4的分離抗體或其抗原結(jié)合片段，所述抗體或其抗原結(jié)合片段包含重鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)包含選自seqidno:13、38、58、78、98、118和138的氨基酸序列，或在這類序列的構架區(qū)中具有一個、兩個、三個、四個或五個氨基酸置換、缺失或添加的氨基酸序列，并且還包含輕鏈可變區(qū)，所述輕鏈可變區(qū)具有選自seqidno:23、48、68、88、108、128和148的氨基酸序列，或在這類序列的構架區(qū)中具有一個、兩個、三個、四個或五個氨基酸置換、缺失或添加的氨基酸序列。

另一個類型的可變區(qū)修飾是突變vh和/或vlcdr1區(qū)、cdr2區(qū)和/或cdr3區(qū)內(nèi)部的氨基酸殘基，以便因而改善目的抗體的一種或多種結(jié)合特性(例如親和力)，稱作“親和力成熟”。可以進行位點定向誘變或pcr介導的誘變以引入突變，并且可以在如本文所述和實施例中提供的體外或在體內(nèi)測定法中評價對抗體結(jié)合作用或其他目的功能特性的影響。可以引入(如上文討論的)保守修飾。突變可以是氨基酸置換、添加或缺失。另外，一般改變cdr區(qū)內(nèi)部不多于1個、2個、3個、4個、5個殘基。

因此，在另一個實施方案中，本發(fā)明提供一種結(jié)合angptl4的分離的抗體或其抗原結(jié)合片段，所述抗體或其抗原結(jié)合片段由重鏈可變區(qū)組成，所述重鏈可變區(qū)具有：具有選自seqidno:7、32、52、72、92、112和132的氨基酸序列或如與seqidno:7、32、52、72、92、112和132相比，含有1個、2個、3個、4個、5個氨基酸置換、缺失或添加的氨基酸序列的vhcdr1區(qū)域；具有選自seqidno:8、33、53、73、93、113和133的氨基酸序列或如與seqidno:8、33、53、73、93、113和133相比，含有1個、2個、3個、4個、5個氨基酸置換、缺失或添加的氨基酸序列的vhcdr2區(qū)域；具有選自seqidno:9、34、54、74、94、114、114和134的氨基酸序列或如seqidno:9、34、54、74、94、114和134相比，含有1個、2個、3個、4個、5個氨基酸置換、缺失或添加的氨基酸序列的vhcdr3區(qū)域；具有選自seqidno:17、42、62、82、102、122和142的氨基酸序列或如與seqidno:17、42、62、82、102、122和142相比，含有1個、2個、3個、4個、5個氨基酸置換、缺失或添加的氨基酸序列的vlcdr1區(qū)域；具有選自seqidno:18、43、63、83、103、123和143的氨基酸序列或如與seqidno:18、43、63、83、103、123和143相比，含有1個、2個、3個、4個、5個氨基酸置換、缺失或添加的氨基酸序列的vlcdr2區(qū)域；和具有選自seqidno:19、44、64、84、104、124和144的氨基酸序列或如與seqidno:19、44、64、84、104、124和144相比，含有1個、2個、3個、4個、5個氨基酸置換、缺失或添加的氨基酸序列的vlcdr3區(qū)域。

因此，在另一個實施方案中，本發(fā)明提供一種結(jié)合angptl4的分離的抗體或其抗原結(jié)合片段，所述抗體或其抗原結(jié)合片段由重鏈可變區(qū)組成，所述重鏈可變區(qū)具有：具有選自seqidno:10、35、55、75、95、115和135的氨基酸序列或如與seqidno:10、35、55、75、95、115和135相比，含有1個、2個、3個、4個、5個氨基酸置換、缺失或添加的氨基酸序列的vhcdr1區(qū)域；具有選自seqidno:11、36、56、76、96、116和136的氨基酸序列或如與seqidno:11、36、56、76、96、116和136相比，含有1個、2個、3個、4個、5個氨基酸置換、缺失或添加的氨基酸序列的vhcdr2區(qū)域；具有選自seqidno:12、37、57、77、97、117和137的氨基酸序列或如seqidno:12、37、57、77、97、117和137相比，含有1個、2個、3個、4個、5個氨基酸置換、缺失或添加的氨基酸序列的vhcdr3區(qū)域；具有選自seqidno:20、45、65、85、105、125和145的氨基酸序列或如與seqidno:20、45、65、85、105、125和145相比，含有1個、2個、3個、4個、5個氨基酸置換、缺失或添加的氨基酸序列的vlcdr1區(qū)域；具有選自seqidno:21、46、66、86、106、126和146的氨基酸序列或如與seqidno:21、46、66、86、106、126和146相比，含有1個、2個、3個、4個、5個氨基酸置換、缺失或添加的氨基酸序列的vlcdr2區(qū)域；和具有選自seqidno:22、47、67、87、107、127和147的氨基酸序列或如與seqidno:22、47、67、87、107、127和147相比，含有1個、2個、3個、4個、5個氨基酸置換、缺失或添加的氨基酸序列的vlcdr3區(qū)域。

移植抗原結(jié)合結(jié)構域至備選的構架或支架中

可以使用廣泛類型的抗體/免疫球蛋白構架或支架，只要所產(chǎn)生的多肽包括至少一個與angptl4特異性結(jié)合的結(jié)合區(qū)。這類構架或支架包括5個主要獨特型的人免疫球蛋白或其片段，并且包括其他動物物種的免疫球蛋白，優(yōu)選地具有人源化方面。在這個方面，單個重鏈抗體如在駝類(camelid)中鑒定的那些，是特別有意義的。新的構架、支架和片段繼續(xù)由本領域技術人員發(fā)現(xiàn)并開發(fā)。

在一個方面，本發(fā)明涉及使用可以將本發(fā)明的cdr移植到其上的非免疫球蛋白支架，產(chǎn)生基于非免疫球蛋白的抗體?？梢允褂靡阎幕?qū)淼姆敲庖咔虻鞍讟嫾芎椭Ъ?，只要它們包含對靶angptl4蛋白特異的結(jié)合區(qū)。已知的非免疫球蛋白構架或支架包括但不限于纖連蛋白(compoundtherapeutics,inc.,waltham,ma)、錨蛋白(molecularpartnersag,zurich，瑞士)、結(jié)構域抗體(domantis,ltd.,cambridge,ma和ablynxnv,zwijnaarde，比利時)、脂籠蛋白(pierisproteolabag,freising，德國)、小模塊免疫藥物(trubionpharmaceuticalsinc.,seattle,wa)、maxybodies(avidia,inc.,mountainview,ca)、蛋白a(affibodyag，瑞典)和affilin(γ-晶體蛋白或遍在蛋白)(scilproteinsgmbh,halle，德國)。

纖連蛋白支架基于纖連蛋白iii型結(jié)構域(例如，纖連蛋白iii型的第十模塊(10fn3結(jié)構域))。纖連蛋白iii型結(jié)構域具有7條或8條β鏈，這些β鏈分布在兩個β折疊之間，所述β折疊本身相互疊加以形成蛋白質(zhì)的核芯，并且還含有使β鏈彼此連接并且暴露于溶劑的環(huán)(類似于cdr)。在β折疊夾心的每個邊緣存在至少三個這樣的環(huán)，其中所述邊緣是與β鏈的方向垂直的蛋白質(zhì)邊界(參見us6818418)。這些基于纖連蛋白的支架不是免疫球蛋白，不過總體折疊與包含駱駝和羊駝igg中完整抗原識別單元的最小功能性抗體片段(即重鏈可變區(qū))密切相關。由于這種結(jié)構，非免疫球蛋白抗體模擬在性質(zhì)和親和力方面與抗體相似的抗原結(jié)合特性。這些支架可用于體外環(huán)隨機化和改組策略，該策略與體內(nèi)抗體的親和力成熟過程相似。這些基于纖連蛋白的分子可用作支架，其中使用標準克隆技術用本發(fā)明的cdr替換分子的環(huán)區(qū)。

錨蛋白技術基于將具有錨蛋白來源的重復模塊的蛋白質(zhì)用作攜帶可變區(qū)的支架，該可變區(qū)可用于結(jié)合不同的靶。錨蛋白重復序列模塊是一種由兩個反平行α-螺旋和一個β轉(zhuǎn)角組成的33個氨基酸多肽?？勺儏^(qū)的結(jié)合大多通過使用核糖體展示法優(yōu)化。

avimers衍生自天然的含有a-結(jié)構域的蛋白質(zhì)如lrp-1。這些結(jié)構域由自然界用于蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用并且在人類中超過250種蛋白質(zhì)在結(jié)構上基于a-結(jié)構域。avimers由借助氨基酸接頭連接的多個不同“a-結(jié)構域”單體(2-10個)組成。使用例如在美國專利申請公開號20040175756；20050053973；20050048512；和20060008844中描述的方法，可以產(chǎn)生可以與靶抗原結(jié)合的avimers。

affibody親和配體是由三螺旋束組成的小的簡單蛋白質(zhì)，基于蛋白a的一個igg結(jié)合域的支架。蛋白a是來自細菌金黃色葡萄球菌(staphylococcusaureus)的表面蛋白。這種支架結(jié)構域由58個氨基酸組成，其中13個氨基酸經(jīng)隨機化以產(chǎn)生具有大量配體變體的affibody文庫(參見例如，us5831012)。affibody分子模擬抗體，與150kda的抗體分子量相比，它們具有6kda的分子量。盡管其尺寸小，affibody分子的結(jié)合位點類似于抗體。

抗運載蛋白(anticalin)是由pierisproteolabag公司開發(fā)的產(chǎn)品。它們衍生自脂籠蛋白，一組廣泛分布的小而穩(wěn)健的通常參與生理學運輸或儲存化學敏感性或不溶性化合物的蛋白質(zhì)。幾種天然脂籠蛋白存在于人組織或體液中。該蛋白質(zhì)的構造類似于免疫球蛋白，在剛性構架頂部上具有高變環(huán)。但是，與抗體或其重組片段相反，脂籠蛋白由僅略微大于單個免疫球蛋白結(jié)構域的具有160個至180個氨基酸殘基的單條多肽鏈組成。構成結(jié)合袋的一組四個環(huán)顯示突出的結(jié)構塑性并且承受多種側(cè)鏈。結(jié)合位點因此可以在專有過程中再成型，旨在以高親和力和高特異性識別規(guī)定的不同形狀的靶分子。一種脂籠蛋白家族蛋白，大菜粉蝶(pierisbrassicae)的后膽色素結(jié)合蛋白(bbp)，已經(jīng)用來通過誘變這四個環(huán)集合，開發(fā)抗運載蛋白(anticalin)。描述抗運載蛋白的專利申請的一個例子在pct公開號wo199916873中。

affilin分子是小的非免疫球蛋白，其中就針對蛋白質(zhì)和小分子的特異性親和力設計所述蛋白質(zhì)。新的affilin分子可以非常迅速選自兩個文庫，每個文庫基于人衍生的不同支架蛋白。affilin分子不對免疫球蛋白顯示任何結(jié)構同源性。目前，使用兩種affilin支架，其中之一是γ晶狀體蛋白(人眼晶狀體結(jié)構性蛋白)并且另一種是“遍在蛋白”超家族蛋白。兩種人類支架均非常小，顯示高度的溫度穩(wěn)定性并且?guī)缀蹙挚筽h變化和變性劑。這種高度穩(wěn)定性主要歸因于蛋白質(zhì)的擴展β折疊結(jié)構。γ晶狀體蛋白衍生的蛋白質(zhì)的例子在wo200104144中描述并且“遍在蛋白樣”蛋白質(zhì)的例子在wo2004106368中描述。

蛋白質(zhì)表位模擬物(pem)是模擬蛋白質(zhì)β-發(fā)夾二級結(jié)構(參與蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的主要二級結(jié)構)的中等大小、環(huán)狀肽樣分子(mw1-2kda)。

本發(fā)明提供與angptl4蛋白特異性結(jié)合的全人抗體。與嵌合或人源化抗體相比，施用至人類受試者時，本發(fā)明結(jié)合angptl4的人抗體具有進一步降低的抗原性。

駝類抗體

從駱駝和單峰駝(雙峰駝(camelusbactrianus)和單峰駝(calelusdromaderius))家族成員，包括新世界成員如羊駝屬物種(羊駝(lamapaccos)、大羊駝(lamaglama)和小羊駝(lamavicugna))獲得的抗體蛋白已經(jīng)就大小、結(jié)構復雜性和針對人類受試者的抗原性加以表征。如自然界中所找到的來自這個哺乳動物家族的某些igg抗體缺少輕鏈，并且因此在結(jié)構上區(qū)別于來自其他動物的抗體的具有兩條重鏈和兩條輕鏈的常見四鏈四級結(jié)構。參見pct/ep93/02214(1994年3月3日公布的wo94/04678)。

可以通過基因工程獲得駝類抗體的一個區(qū)域(該區(qū)域是小的單可變區(qū)，確定為vhh)以產(chǎn)生對靶具有高親和力的小蛋白質(zhì)，從而產(chǎn)生稱作“駝類納米體”的低分子量抗體蛋白。參見1998年6月2日授予的美國專利號5,759,808；還參見stijlemans,b.等人,2004jbiolchem279:1256-1261；dumoulin,m.等人,2003nature424:783-788；pleschberger,m.等人2003bioconjugatechem14:440-448；cortez-retamozo,v.等人2002intjcancer89:456-62；和lauwereys,m.等人1998emboj17:3512-3520。駝類抗體和抗體片段的工程化文庫是例如從ablynx,ghent,belgium可商業(yè)獲得的。與其他非人源抗體一樣，駝類抗體的氨基酸序列可以重組地改變以獲得更逼真模仿人序列的序列，即，納米體可以“人源化”。因此可以進一步降低駝類抗體對人類的天然低的抗原性。

駝類納米體的分子量是人igg分子的分子量的十分之一，并且這種蛋白質(zhì)具有僅數(shù)納米的物理直徑。小尺寸的一個結(jié)果是駝類納米體能夠與較大抗體蛋白在功能上不可識別的抗原位點結(jié)合，即，駝類納米體可用作試劑以檢測使用經(jīng)典免疫技術時隱匿的抗原，并且可以用作可能的治療藥。因此小尺寸的又一個結(jié)果是駝類納米體可以因為與靶蛋白的槽或狹縫中的特定位點結(jié)合而發(fā)揮抑制作用，并且因此可以提供比經(jīng)典抗體更逼真模仿經(jīng)典低分子量藥物功能的能力。

低分子量和緊湊大小進一步導致駝類納米體具有極端熱穩(wěn)定性、對極端ph和蛋白酶解消化穩(wěn)定和抗原性低。另一個結(jié)果是駝類納米體輕易地從循環(huán)系統(tǒng)移入組織，并且甚至跨越血-腦屏障并且可以治療累及神經(jīng)組織的病癥。納米體還可以促進跨血腦屏障運輸藥物。參見2004年8月19日公開的美國專利申請20040161738。這些特征與對人的低抗原性組合指示了巨大的治療潛能。另外，這些分子可在原核細胞，如大腸桿菌(e.coli)中充分表達，并可以用噬菌體表達為融合蛋白，且是有功能的。

因此，本發(fā)明的一個特征是一種對angptl4具有高親和力的駝類抗體或納米體。在本文的某些實施方案中，駝類抗體或納米體天然地在駝類動物中產(chǎn)生，即，在使用本文對其他抗體所述的技術用angptl4或其肽片段免疫之后由駝類產(chǎn)生。備選地，如本文實施例中所述，使用以angptl4作為靶的淘洗法，從展示適當誘變的駝類納米體蛋白的噬菌體文庫，將結(jié)合angptl4的駝類納米體工程化(即，例如通過選擇過程產(chǎn)生)。還可以通過基因工程，定制工程化的納米體以在接受受試者中具有45分鐘至2周的半壽期。在一個具體實施方案中，如例如pct/ep93/02214中所述，通過將本發(fā)明人抗體的重鏈或輕鏈的cdr序列移植入納米抗體或單結(jié)構域抗體構架序列中，獲得駝類抗體或納米抗體。

雙特異性分子和多價抗體

在另一個方面，本發(fā)明特征在于包含結(jié)合angptl4的本發(fā)明抗體或其片段的雙特異性或多特異性分子?？梢詫⒈景l(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合區(qū)域衍生化或連接至另一種功能分子，例如另一種肽或蛋白質(zhì)(例如針對受體的另一種抗體或配體)以產(chǎn)生與至少兩個不同結(jié)合位點或靶分子結(jié)合的雙特異性分子。本發(fā)明的抗體可以實際上進行衍生化或連接至多于一種其他功能分子以產(chǎn)生與多于兩個不同結(jié)合位點和/或靶分子結(jié)合的多特異性分子；這類多特異性分子也意在由本文所用的術語“雙特異性分子”包括。為了產(chǎn)生本發(fā)明的雙特異性分子，本發(fā)明的抗體可以功能性連接(例如通過化學偶聯(lián)、遺傳融合、非共價結(jié)合或其他方式)至一種或多種其他結(jié)合分子，如另一種抗體、抗體片段、肽或結(jié)合性模擬物，從而產(chǎn)生雙特異性分子。

因此，本發(fā)明包括雙特異性分子，所述雙特異性分子包含針對angptl4的至少一種第一結(jié)合特異性和針對第二靶表位的第二結(jié)合特異性。例如，第二靶表位是與第一靶表位不同的另一個angptl4表位。

另外，對于其中雙特異性分子具有多特異性的本發(fā)明，該分子還可以包括除第一和第二靶表位之外的第三結(jié)合特異性。

在一個實施方案中，本發(fā)明的雙特異性分子包含至少一種抗體或其抗體片段作為結(jié)合特異性，所述抗體片段包括例如fab、fab'、f(ab')2、fv或單鏈fv?？贵w也可以是輕鏈或重鏈二聚體或其任何最小片段如fv或單鏈構建體，如ladner等人在美國專利號4,946,778中所述的抗體。

雙體抗體(diabody)是雙價的雙特異性分子，其中vh和vl結(jié)構域表達于單一多肽鏈上，由太短以至于不允許這兩個結(jié)構域之間在相同鏈上配對的接頭連接。所述vh和vl結(jié)構域與另一條鏈的互補結(jié)構域配對，因而產(chǎn)生兩個抗原結(jié)合位點(見，例如，holliger等人,1993proc.natl.acad.sci.usa90:6444-6448；poljak等人,1994structure2:1121-1123)。可以通過在相同細胞內(nèi)部表達具有結(jié)構vha-vlb和vhb-vla(vh-vl構型)或vla-vhb和vlb-vha(vl-vh構型)的兩條多肽鏈產(chǎn)生雙體抗體。它們大部分可以在細菌中以可溶性形式表達。通過用大約15個氨基酸殘基的接頭連接兩條形成雙體抗體的多肽鏈，產(chǎn)生單鏈雙體抗體(scdb)(見holliger和winter,1997cancerimmunol.immunother.,45(3-4):128-30；wu等人,1996immunotechnology,2(1):21-36)。scdb可以在細菌中以可溶性活性單體形式表達(參見holliger和winter,1997cancerimmunol.immunother.,45(34):128-30；wu等人,1996immunotechnology,2(1):21-36；pluckthun和pack,1997immunotechnology,3(2):83-105；ridgway等人,1996proteineng.,9(7):617-21。雙體抗體可以與fc融合以產(chǎn)生“雙-雙體抗體”(見lu等人,2004j.biol.chem.,279(4):2856-65)。

可以用于本發(fā)明雙特異性分子中的其他抗體是鼠單克隆抗體、嵌合單克隆抗體和人源化單克隆抗體。

可以通過使用本領域已知的方法綴合組分結(jié)合特異性，制備雙特異性分子。例如，雙特異性分子的每種結(jié)合特異性可以單獨地產(chǎn)生并且隨后彼此綴合。當結(jié)合特異性是蛋白質(zhì)或肽時，多種偶聯(lián)或交聯(lián)劑可以用于共價綴合。交聯(lián)劑的實例包括蛋白a、碳二亞胺、n-琥珀酰亞胺-s-乙酰-硫代乙酸酯(sata)、5,5'-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)(dtnb)、鄰亞苯基雙馬來酰亞胺(opdm)、n-琥珀酰亞胺-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(spdp)和磺基琥珀酰亞胺-4-(n-馬來酰亞胺甲基)環(huán)己烷-1-羧酸酯(磺基-smcc)(見，例如，karpovsky等人,1984j.exp.med.160:1686；liu,ma等人,1985procnatlacadsciusa82:8648)。其他方法包括在paulus,1985behringins.no.78,118-132；brennan等人,1985science229:81-83)和glennie等人,1987j.immunol.139:2367-2375)中描述的那些方法。綴合劑是sata和磺基-smcc，兩者均可從piercechemicalco.(rockford,il)獲得。

在結(jié)合特異性是抗體時，它們可通過兩條重鏈的c端鉸鏈區(qū)的硫氫基成鍵而綴合。在一個特別的實施方案中，在綴合之前修飾鉸鏈區(qū)以含有奇數(shù)個硫氫基殘基，例如1個硫氫基殘基。

備選地，可以在相同的載體中編碼兩種結(jié)合特異性并且在相同的宿主細胞中表達及裝配。這種方法在下列情況特別有用，其中雙特異性分子是mabxmab、mabxfab、fabxf(ab')2或配體xfab融合蛋白。本發(fā)明的雙特異性分子可以是包含一個單鏈抗體和一個結(jié)合決定簇的單鏈分子、或包含兩個結(jié)合決定簇的單鏈雙特異性分子。雙特異性分子可包含至少兩個單鏈分子。用于制備雙特異性分子的方法例如在美國專利號5,260,203；美國專利號5,455,030；美國專利號4,881,175；美國專利號5,132,405；美國專利號5,091,513；美國專利號5,476,786；美國專利號5,013,653；美國專利號5,258,498；和美國專利號5,482,858中描述。

可以通過例如酶聯(lián)免疫吸附測定(elisa)、放射免疫測定(rea)、facs分析、生物測定法(例如生長抑制)或蛋白質(zhì)印跡測定法證實雙特異性分子與其特異性靶的結(jié)合。這些測定法中的每一種方法通常通過使用對目的蛋白質(zhì)-抗體復合物特異的標記試劑(例如抗體)來檢測特定的目的復合物的存在。

在另一個方面，本發(fā)明提供包含與angptl4結(jié)合的本發(fā)明抗體的至少兩個相同或不同抗原結(jié)合部分的多價化合物?？梢越?jīng)蛋白質(zhì)融合或共價連接或非共價連接將抗原結(jié)合部分連接在一起。備選地，已經(jīng)描述了用于雙特異性分子的連接方法。例如，可以通過用結(jié)合本發(fā)明抗體的恒定區(qū)(例如fc或鉸鏈區(qū))的抗體來交聯(lián)本發(fā)明的抗體，獲得四價化合物。

三聚化結(jié)構域例如在borean專利ep1012280b1中描述。五聚化模塊例如在pct/ep97/05897中描述。

半壽期延長的抗體

本發(fā)明提供與angptl4蛋白特異性結(jié)合的抗體，所述抗體具有延長的體內(nèi)半壽期。

許多因素可能影響蛋白質(zhì)的體內(nèi)半壽期。例如，腎過濾、肝臟中代謝、遭蛋白水解酶(蛋白酶)降解和免疫原性反應(例如，抗體的蛋白質(zhì)中和作用和被巨噬細胞和樹狀細胞攝取)。多種策略可用于延長本發(fā)明抗體的半壽期。例如，通過化學連接聚乙二醇(peg)、recodepeg、抗體支架、聚唾液酸(psa)、羥乙基淀粉(hes)、白蛋白結(jié)合配體和糖保護層；通過與血清蛋白質(zhì)如白蛋白、igg、fcrn結(jié)合并轉(zhuǎn)移的蛋白質(zhì)遺傳融合；通過偶聯(lián)(遺傳上或化學上)到其他結(jié)合部分，該其他結(jié)合部分結(jié)合血清蛋白質(zhì)，如納米抗體、fab、darpins、avimer、affibody和抗運載蛋白；通過遺傳融合rpeg、白蛋白、白蛋白的結(jié)構域、白蛋白結(jié)合蛋白質(zhì)和fc；或通過摻入到納米載體、緩釋制劑或醫(yī)療設備中。

為了延長抗體的體內(nèi)血清循環(huán)，惰性聚合物分子如高分子量peg可以在采用或不采用接合接頭的情況下，借助peg與抗體n末端或c末端的位點特異性綴合或借助賴氨酸殘基上存在的ε-氨基，連接至抗體或其片段。為了使抗體聚乙二醇化，一般使該抗體或其片段與聚乙二醇(peg)如peg的活性酯或醛衍生物在其中一個或多個peg基團變得與該抗體或其片段連接的條件下反應?？梢酝ㄟ^與反應性peg分子(或類似的反應性水溶聚合物)的?；磻蛲榛磻獙嵤﹑eg化。如本文所用，術語“聚乙二醇”意圖包括已經(jīng)用來衍生化其他蛋白質(zhì)的任何形式的peg，如單(c1-c10)烷氧基或芳氧基-聚乙二醇或聚乙二醇-馬來酰亞胺。在某些實施方案中，待聚乙二醇化的抗體是無糖基化的抗體。將使用導致生物學活性喪失最少的直鏈或分枝聚合物衍生化。可以通過sds-page和質(zhì)譜法密切監(jiān)測綴合程度以確保peg分子與抗體正確綴合。未反應的peg可以通過大小排阻層析或通過離子交換層析與抗體-peg綴合物分離?？墒褂帽绢I域技術人員熟知的方法，例如通過本文描述的免疫測定試驗，測試peg衍生的抗體的結(jié)合活性以及體內(nèi)效力。聚乙二醇化蛋白質(zhì)的方法為本領域已知，并可應用于本發(fā)明的抗體。見例如，nishimura等人的ep0154316和ishikawa等人的ep0401384。

其他改良的聚乙二醇化技術包括重構化學正交定向工程化技術(recodepeg)，該技術借助包括trna合成酶和trna的重構系統(tǒng)將化學指定的側(cè)鏈摻入生物合成的蛋白質(zhì)。這項技術使得在大腸桿菌(e.coli)、酵母和哺乳動物細胞中將多于30個新氨基酸摻入生物合成的蛋白質(zhì)中成為可能。trna在存在琥珀密碼子的位置摻入非天然氨基酸，使琥珀密碼子從終止密碼子轉(zhuǎn)變成摻入化學指定的氨基酸的一個密碼子信號。

重組聚乙二醇化技術(rpeg)也可以用于血清半壽期延長。這項技術涉及300-600個氨基酸的非結(jié)構化蛋白質(zhì)尾與現(xiàn)有藥用蛋白質(zhì)遺傳融合。因為這種非結(jié)構化蛋白質(zhì)鏈的表觀分子量比其實際分子量大約15倍，所以這種蛋白質(zhì)的血清半壽期將大大增加。與需要化學綴合和再純化的常規(guī)聚乙二醇化相反，生產(chǎn)工藝大為簡化并且產(chǎn)物是均質(zhì)的。

聚唾液酸化是使用天然聚合物聚唾液酸(psa)來延長治療性肽和蛋白質(zhì)的有效壽命并改善其穩(wěn)定性的另一項技術。psa是唾液酸(一種糖)的聚合物。當用于蛋白質(zhì)和治療肽藥物遞送時，聚唾液酸對綴合提供保護性微環(huán)境。這增加治療性蛋白在循環(huán)中的有效壽命并防止它被免疫系統(tǒng)識別。psa聚合物天然存在于人體中。它由某些細菌采納，這些細菌經(jīng)數(shù)百萬年演化用psa覆蓋它們的細胞壁。這些天然聚唾液酸化的細菌則能夠通過分子擬態(tài)挫敗身體的防御系統(tǒng)。psa，自然界的終極隱形術，可以容易地從這類細菌以巨大量和以預定的物理特征產(chǎn)生。細菌psa完全無免疫原性，甚至與蛋白質(zhì)偶聯(lián)時也是如此，因為它在化學上與人體中的psa同一。

另一項技術包括使用與抗體連接的羥乙基淀粉(“hes”)衍生物。hes是源自蠟質(zhì)玉米淀粉的改性天然聚合物并且可以由身體的酶代謝。通常施用hes溶液以替代不足的血液容積并改善血液的流變學特性。通過增加分子的穩(wěn)定性，以及通過降低腎清除率，抗體的hes化使得延長循環(huán)半壽期成為可能，導致增加的生物學活性。通過變動不同參數(shù)，如hes的分子量，可以定制廣泛類型的hes抗體綴合物。

也可以向igg恒定結(jié)構域或其fcrn結(jié)合片段(優(yōu)選地fc或鉸鏈fc結(jié)構域片段)中引入一個或多個氨基酸修飾(即，置換、插入或缺失)，產(chǎn)生具有增加的體內(nèi)半壽期的抗體。參見，例如，國際公開號wo98/23289；國際公開號wo97/34631；和美國專利號6277375。

進一步，抗體可以與白蛋白(例如，人血清白蛋白；hsa)綴合以使抗體或抗體片段在體內(nèi)更穩(wěn)定或具有較長的體內(nèi)半壽期。這些技術是本領域熟知的，參見，例如，國際公開號wo93/15199、wo93/15200和wo01/77137；和歐洲專利號ep413,622。此外，在如上文所述的雙特異性抗體背景下，可以如此設計抗體的特異性，從而抗體的一個結(jié)合結(jié)構域與angptl4結(jié)合，而抗體的第二結(jié)合結(jié)構域與血清白蛋白、優(yōu)選地與hsa結(jié)合。

增加半壽期的策略特別可用于納米體、基于纖連蛋白的結(jié)合物和需要增加體內(nèi)半壽期的其他抗體或蛋白質(zhì)。

抗體綴合物

本公開提供與angptl4蛋白特異性結(jié)合的抗體或其片段，所述抗體或其片段重組融合于或化學綴合(包括共價和非共價綴合)至異源蛋白或多肽(或其片段、優(yōu)選地與至少10個、至少20個、至少30個、至少40個、至少50個、至少60個、至少70個、至少80個、至少90個或至少100個氨基酸的多肽綴合)以產(chǎn)生融合蛋白。特別地，本發(fā)明提供融合蛋白，所述融合蛋白包含本文所述的抗體的抗原結(jié)合片段(例如，fab片段、fd片段、fv片段、f(ab)2片段、vh結(jié)構域、vhcdr、vl結(jié)構域或vlcdr)和異源蛋白、多肽或肽。蛋白質(zhì)、多肽或肽與抗體或抗體片段融合或綴合的方法是本領域已知的。參見，例如，美國專利號5,336,603、5,622,929、5,359,046、5,349,053、5,447,851和5,112,946；歐洲專利號ep307,434和ep367,166；國際公開號wo96/04388和wo91/06570；ashkenazi等人,1991,proc.natl.acad.sci.usa88:10535-10539；zheng等人,1995,j.immunol.154:5590-5600；和vil等人,1992,proc.natl.acad.sci.usa89:11337-11341。

可通過基因改組、基序改組、外顯子改組和/或密碼子改組(統(tǒng)稱為“dna改組”)技術，產(chǎn)生其他融合蛋白?？衫胐na改組來改變本發(fā)明抗體或其片段的活性(例如，具有更高親和力和更低解離速率的抗體或其片段)。通常參見美國專利號5,605,793、5,811,238、5,830,721、5,834,252和5,837,458；patten等人,1997,curr.opinionbiotechnol.8:724-33；harayama,1998,trendsbiotechnol.16(2):76-82；hansson等人,1999,j.mol.biol.287:265-76；和lorenzo和blasco,1998,biotechniques24(2):308-313(這些專利和出版物的每篇因而通過引用方式完整地并入)?？梢酝ㄟ^在重組之前借助易錯pcr、隨機核苷酸插入或其他方法經(jīng)歷隨機誘變，改變抗體或其片段或編碼的抗體或其片段。編碼與angptl4蛋白特異性結(jié)合的抗體或其片段的多核苷酸可以與一種或多種異源分子的一種或多種組分、基序、節(jié)段、部分、結(jié)構域、片段等重組。

另外，抗體或其片段可以與標記序列(如肽)融合以促進純化。在優(yōu)選的實施方案中，標記氨基酸序列是六組氨酸肽，如pqe載體(qiagen,inc.,9259etonavenue,chatsworth,ca,91311)等中提供的標簽，它們中的許多是可商業(yè)獲得的。如gentz等人,1989,proc.natl.acad.sci.usa86:821-824中所述，例如，六組氨酸提供融合蛋白的便利純化。用于純化的其他肽標簽包括但不限于血凝素(“ha”)標簽，其對應于源自流感血凝素蛋白的表位(wilson等人,1984,cell37:767)和“flag”標簽。

在其他實施方案中，本發(fā)明的抗體或其片段與診斷劑或可檢測劑綴合。這類抗體可以作為臨床檢驗方法的部分(如確定特定療法的效力)，用于監(jiān)測或預測疾病或病癥的發(fā)作、形成、進展和/或嚴重性。可以通過將抗體與可檢測物質(zhì)偶聯(lián)實現(xiàn)這類診斷和檢測，所述可檢測物質(zhì)包括但不限于多種酶，如但不限于辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰膽堿酯酶；輔基，如但不限于鏈霉親和素/生物素和抗生物素蛋白/生物素；熒光物質(zhì)，如但不限于傘形酮、熒光素、異硫氰酸熒光素、羅丹明、二氯三嗪胺熒光素、丹磺酰氯或藻紅蛋白；發(fā)光物質(zhì)，如但不限于魯米諾；生物發(fā)光物質(zhì)，如但不限于螢光素酶、螢光素和水母發(fā)光蛋白；放射性物質(zhì)，如但不限于碘(¹³¹i、¹²⁵i、¹²³i和¹²¹i)、碳(¹⁴c)、硫(³⁵s)、氚(³h)、銦(¹¹⁵in、¹¹³in、¹¹²in和¹¹¹in)、锝(⁹⁹tc)、鉈(²⁰¹ti)、鎵(⁶⁸ga、⁶⁷ga)、鈀(¹⁰³pd)、鉬(⁹⁹mo)、氙(¹³³xe)、氟(¹⁸f)、¹⁵³sm、¹⁷⁷lu、¹⁵⁹gd、¹⁴⁹pm、¹⁴⁰la、¹⁷⁵yb、¹⁶⁶ho、⁹⁰y、47sc、¹⁸⁶re、¹⁸⁸re、¹⁴²pr、¹⁰⁵rh、⁹⁷ru、⁶⁸ge、⁵⁷co、⁶⁵zn、⁸⁵sr、³²p、¹⁵³gd、¹⁶⁹yb、⁵¹cr、⁵⁴mn、⁷⁵se、¹¹³sn和¹¹⁷tin；和用于各種正電子發(fā)射成像術中的正電子發(fā)射金屬和非放射性順磁金屬離子。

本發(fā)明還包括與治療性部分綴合的抗體或其片段的用途?？贵w或其片段可綴合到治療性部分，如細胞毒素(例如細胞生長抑制劑或細胞殺傷劑)，治療劑或放射性金屬離子，例如α發(fā)射體。術語“細胞毒素”或“細胞毒性劑”包括有害于細胞的任何物質(zhì)。

另外，抗體或其片段可以與調(diào)節(jié)給定生物學反應的治療性部分或藥物部分綴合。治療性部分或藥物部分不得解釋為限于經(jīng)典的化學治療藥。例如，藥物部分可以是擁有所需生物學活性的蛋白質(zhì)、肽或多肽。這類蛋白質(zhì)可以例如包括毒素如相思豆毒蛋白、蓖麻毒蛋白a、假單胞菌外毒素、霍亂毒素、或白喉毒素；蛋白質(zhì)如腫瘤壞死因子、α-干擾素、β-干擾素、神經(jīng)生長因子、血小板衍生生長因子、組織纖維蛋白溶酶原激活物、凋亡劑、抗血管生成劑或生物學反應調(diào)節(jié)物，例如淋巴因子。

另外，抗體可以綴合至治療性部分如放射性金屬離子，如α-發(fā)射體如²¹³bi或可用于使放射金屬離子(包括但不限于¹³¹in、¹³¹lu、¹³¹y、¹³¹ho、¹³¹sm)綴合至多肽的大環(huán)螯合劑。在某些實施方案中，大環(huán)螯合劑是1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷-n,n’,n”,n”’-四乙酸(dota)，其可通過接頭分子附著到抗體上。這類接頭分子是本領域公知的并且在denardo等人,1998,clincancerres.4(10):2483-90；peterson等人,1999,bioconjug.chem.10(4):553-7；和zimmerman等人,1999,nucl.med.biol.26(8):943-50中描述，所述文獻每篇通過引用的方式完整并入。

用于治療性部分與抗體綴合的技術是熟知的，參見，例如arnon等人,“monoclonalantibodiesforimmunotargetingofdrugsincancertherapy”，引自monoclonalantibodiesandcancertherapy,reisfeld等人(編著)，第243-56頁(alanr.liss,inc.1985)；hellstrom等人,“antibodiesfordrugdelivery”，引自controlleddrugdelivery(第2版),robinson等人(編著)，第623-53頁(marceldekker,inc.1987)；thorpe,“antibodycarriersofcytotoxicagentsincancertherapy:areview”，引自monoclonalantibodies84:biologicalandclinicalapplications,pinchera等人(編著)，第475-506頁(1985)；“analysis,results,andfutureprospectiveofthetherapeuticuseofradiolabeledantibodyincancertherapy”，引自monoclonalantibodiesforcancerdetectionandtherapy,baldwin等人(編著)，第303-16頁(academicpress1985)和thorpe等人,1982,immunol.rev.62:119-58。

抗體也可以連接至固相支持物，所述支持物特別可用于免疫測定法或靶抗原的純化。此類固相支持物包括但不限于玻璃、纖維素、聚丙烯酰胺、尼龍、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。

產(chǎn)生本發(fā)明抗體的方法

編碼抗體的核酸

本發(fā)明提供基本上純化的核酸分子，所述核酸分子編碼包含上述結(jié)合angptl4的抗體鏈的區(qū)段或結(jié)構域的多肽。本發(fā)明的一些核酸包含編碼seqidno:13、38、58、78、98、118或138中所示的重鏈可變區(qū)的核苷酸序列，和/或編碼seqidno:23、48、68、88、108、128或148中所示的輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列。在一個具體實施方案中，核酸分子是表1中鑒定的那些。本發(fā)明的一些其他核酸分子包含與表1中鑒定的那些核酸分子的核苷酸序列基本上同一(例如，至少65％、80％、95％、或99％同一)的核苷酸序列。從適宜的表達載體表達時，由這些多核苷酸編碼的多肽能夠顯示angptl4抗原結(jié)合能力。

本發(fā)明中還提供多核苷酸，所述多核苷酸編碼來自上文所述的結(jié)合angptl4的抗體的重鏈或輕鏈的至少一個cdr區(qū)和通常全部三個cdr區(qū)。一些其他多核苷酸編碼上文所述的結(jié)合angptl4的抗體的重鏈和/或輕鏈的全部或基本上全部的可變區(qū)序列。由于密碼子的簡并性，每一種免疫球蛋白氨基酸序列可以由多種核酸序列編碼。

本發(fā)明的核酸分子能編碼抗體的可變區(qū)和恒定區(qū)兩者。本發(fā)明的一些核酸序列包含編碼重鏈序列的核苷酸，所述重鏈序列與seqidno:15、28、40、60、80、100、120和140中所述的重鏈序列基本上同一(例如，至少80％、90％或99％同一)。一些其他核酸序列包含編碼輕鏈序列的核苷酸，所述輕鏈序列與seqidno:25、50、70、90、110、130和150中所述的輕鏈序列基本上同一(例如，至少80％、90％或99％同一)。

可以通過從頭固相dna合成或通過pcr誘變編碼結(jié)合angptl4的抗體或其結(jié)合片段的現(xiàn)有序列(例如，如下文實施例中所述的序列)，產(chǎn)生多核苷酸序列?？梢酝ㄟ^本領域已知的方法完成核酸的直接化學合成，如narang等人,1979,meth.enzymol.68:90的磷酸三酯法；brown等人,meth.enzymol.68:109,1979的磷酸二酯法；beaucage等人,tetra.lett.,22:1859,1981的二乙基磷酰亞胺法；和美國專利號4,458,066的固相支持法。通過pcr向多核苷酸序列引入突變可以如同例如pcrtechnology:principlesandapplicationsfordnaamplification,h.a.erlich(編著),freemanpress,ny,ny,1992；pcrprotocols:aguidetomethodsandapplications,innis等人(編著),academicpress,sandiego,ca,1990；mattila等人,nucleicacidsres.19:967,1991；和eckert等人,pcrmethodsandapplications1:17,1991中所述那樣進行。

本發(fā)明中還提供用于產(chǎn)生上文描述的結(jié)合angptl4的抗體的表達載體和宿主細胞。多種表達載體可以用來表達編碼結(jié)合angptl4的抗體鏈或結(jié)合片段的多核苷酸?；诓《镜谋磉_載體和非病毒表達載體都可用于在哺乳動物宿主細胞中產(chǎn)生抗體。非病毒載體和系統(tǒng)包含質(zhì)粒、游離型載體，一般含有用于表達蛋白質(zhì)或rna的表達盒，和人類人工染色體(參見，例如，harrington等人,natgenet15:345,1997)。例如，可用于哺乳動物(例如人)細胞中表達結(jié)合angptl4的多核苷酸和多肽的非病毒載體包括pthiohisa、b和c、pcdna3.1/his、pebvhisa、b和c(invitrogen，圣迭戈，ca)、mpsv載體和本領域已知用于表達其他蛋白質(zhì)的許多其他載體。有用的病毒載體包括基于逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺相關病毒、皰疹病毒的載體，基于sv40、乳頭瘤病毒、hbpeb病毒、痘苗病毒載體和semliki森林病毒(sfv)的載體。參見，brent等人，上文；smith,annu.rev.microbiol.49:807,1995；和rosenfeld等人,cell68:143,1992。

表達載體的選擇依賴于待在其中表達該載體的預期宿主細胞。一般，表達載體含有與編碼結(jié)合angptl4的抗體鏈或片段的多核苷酸有效連接的啟動子和其他調(diào)節(jié)序列(例如，增強子)。在一些實施方案中，用誘導型啟動子來防止插入序列在誘導條件之外的條件下表達。誘導型啟動子包括，例如阿拉伯糖、lacz、金屬硫蛋白啟動子或熱休克啟動子?？稍诜钦T導條件下擴大轉(zhuǎn)化的生物培養(yǎng)物，而不偏離表達產(chǎn)物能更好地被宿主細胞耐受的編碼序列群體。除啟動子之外，也可能要求或需要其他調(diào)節(jié)元件用于有效表達結(jié)合angptl4的抗體鏈或片段。這些元件通常包括atg起始密碼子和鄰近核糖體結(jié)合位點或其他序列。此外，可以通過納入適用于所用細胞系統(tǒng)的增強子增強表達的效率(參見，例如，scharf等人,resultsprobl.celldiffer.20:125,1994；和bittner等人,meth.enzymol.,153:516,1987)。例如，sv40增強子或cmv增強子可用于提高哺乳動物宿主細胞中的表達。

表達載體還可以提供分泌信號序列位置以形成含有多肽的融合蛋白，其中所述多肽由插入的結(jié)合angptl4的抗體序列編碼。更經(jīng)常地，插入的結(jié)合angptl4的抗體序列在納入載體之前與信號序列連接。待用來接受編碼結(jié)合angptl4的抗體輕鏈可變結(jié)構域和重鏈可變結(jié)構域的序列的載體有時還編碼恒定區(qū)或其部分。此類載體允許可變區(qū)表達為與恒定區(qū)的融合蛋白，由此導致完整抗體或其片段的產(chǎn)生。通常，此類恒定區(qū)是人的恒定區(qū)。

用于攜帶并表達結(jié)合angptl4的抗體鏈的宿主細胞可以是原核的或真核的宿主細胞。大腸桿菌是可以用于克隆和表達本發(fā)明的多核苷酸的一種原核宿主。適合使用的其他微生物宿主包括桿菌如枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)，和其他腸桿菌屬(enterobacter)如沙門氏菌屬(salmonella)、沙雷菌屬(serratia)和多種假單胞菌屬(pseudomonas)物種。在這些原核宿主中，還可以產(chǎn)生一般含有與宿主細胞相容的表達控制序列(例如，復制起點)的表達載體。此外，將存在任何數(shù)目的多種熟知啟動子，如乳糖啟動子系統(tǒng)、色氨酸(trp)啟動子系統(tǒng)、β-內(nèi)酰胺酶啟動子系統(tǒng)或來自噬菌體λ的啟動子系統(tǒng)。啟動子通?？刂票磉_，任選地與操縱子序列一起控制表達，并具有核糖體結(jié)合位點序列等，用于起始并完成轉(zhuǎn)錄和翻譯。其他微生物，如酵母，也可以用來表達結(jié)合angptl4的本發(fā)明多肽。也可組合使用昆蟲細胞與桿狀病毒載體。

在一些優(yōu)選的實施方案中，哺乳動物宿主細胞用來表達并產(chǎn)生結(jié)合angptl4的本發(fā)明多肽。例如，它們可以是表達內(nèi)源免疫球蛋白基因的雜交瘤細胞系(例如，如實施例中所述的1d6.c9骨髓瘤雜交瘤克隆)或攜帶外源表達載體的哺乳動物細胞系(例如，下文例舉的sp2/0骨髓瘤細胞)。這些包括任何正常的非永生的或正?；蚍钦５挠郎膭游锛毎蛉思毎＠?，已經(jīng)開發(fā)出能夠分泌完整免疫球蛋白的多種合適宿主細胞系，包括cho細胞系、多種cos細胞系、hela細胞、骨髓瘤細胞系、轉(zhuǎn)化的b細胞和雜交瘤。通常例如在winnacker,fromgenestoclones,vchpublishers,n.y.,n.y.,1987中討論了使用哺乳動物組織細胞培養(yǎng)物表達多肽。用于哺乳動物宿主細胞的表達載體可以包括表達控制序列，如復制起點、啟動子和增強子(參見，例如，queen等人,immunol.rev.89:49-68,1986)，和必需的加工信息位點如核糖體結(jié)合位點、rna剪接位點、聚腺苷酸化位點和轉(zhuǎn)錄終止子序列。這些表達載體通常含有衍生自哺乳動物基因或哺乳動物病毒的啟動子。合適的啟動子可以是組成型的、細胞類型特異的、階段特異的和/或可調(diào)節(jié)或可控制的。有用的啟動子包括但不限于金屬硫蛋白啟動子、組成型腺病毒主要晚期啟動子、地塞米松誘導型mmtv啟動子、sv40啟動子、mrppoliii啟動子、組成型mpsv啟動子、四環(huán)素誘導型cmv啟動子(如人cmv立即早期啟動子)、組成型cmv啟動子和本領域已知的啟動子-增強子組合。

用于引入含有目的多核苷酸序列的表達載體的方法根據(jù)細胞宿主的類型變動。例如，氯化鈣轉(zhuǎn)染常用于原核細胞，而磷酸鈣處理法或電穿孔法可以用于其他細胞宿主。(通常見sambrook等人,上文)。其他方法例如包括電穿孔法、磷酸鈣處理法、脂質(zhì)體介導轉(zhuǎn)化法、注射法和微量注射法、拋射體法、病毒體法、免疫脂質(zhì)體法、聚陽離子：核酸綴合物法、裸dna法、人工病毒粒法、皰疹病毒結(jié)構蛋白vp22融合法(elliot和o'hare,cell88:223,1997)、試劑增強的dna攝取法和離體轉(zhuǎn)導法。對于重組蛋白質(zhì)的長期高產(chǎn)率產(chǎn)生，通常期望穩(wěn)定表達。例如，可以使用含有病毒復制起點或內(nèi)源表達元件和選擇標記基因的本發(fā)明表達載體，制備穩(wěn)定表達結(jié)合angptl4的抗體鏈或結(jié)合片段的細胞系。在引入該載體之后，可以允許細胞在加富培養(yǎng)基中生長1-2日，之后將它們轉(zhuǎn)換至選擇性培養(yǎng)基。選擇標記目的是賦予選擇抗性，并且它的存在允許成功表達所引入序列的細胞在選擇性培養(yǎng)基中生長?？剐?、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞可以使用適于該細胞類型的組織培養(yǎng)技術增殖。

本發(fā)明單克隆抗體的產(chǎn)生

可以通過多種技術產(chǎn)生單克隆抗體(mab)，所述技術包括常規(guī)單克隆抗體方法學例如，kohler和milstein,1975nature256:495的標準體細胞雜交技術?？梢允褂卯a(chǎn)生單克隆抗體的許多技術，例如，b淋巴細胞的病毒性或致癌性轉(zhuǎn)化。

用于制備雜交瘤的動物系統(tǒng)包括鼠類、大鼠和兔系統(tǒng)。在小鼠中產(chǎn)生雜交瘤是一項充分建立的方法。用于分離免疫的脾細胞以便融合的免疫操作方案和技術是本領域已知的。融合配偶體(例如，鼠骨髓瘤細胞)和融合方法也是已知的。

可以基于上文所述制備的鼠單克隆抗體的序列，制備本發(fā)明的嵌合抗體或人源化抗體。編碼重鏈和輕鏈免疫球蛋白的dna可以從目的鼠雜交瘤獲得并且使用標準分子生物學技術，經(jīng)工程化以含有非鼠(例如人)免疫球蛋白序列。例如，為產(chǎn)生嵌合抗體，可以使用本領域已知的方法，將鼠可變區(qū)與人恒定區(qū)連接(見例如授予cabilly等人的美國專利號4,816,567)。為了產(chǎn)生人源化抗體，可以使用本領域已知的方法，將鼠cdr區(qū)插入人構架中。參見例如，授予winter的美國專利號5225539，和授予queen等人的美國專利號5530101；5585089；5693762和6180370。

在某個實施方案中，本發(fā)明的抗體是人源化抗體?？梢允褂脭y帶部分人免疫系統(tǒng)而非小鼠系統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因小鼠或轉(zhuǎn)染色體小鼠，產(chǎn)生這類針對angptl4的人源化抗體。這些轉(zhuǎn)基因小鼠和轉(zhuǎn)染色體小鼠包括本文中分別稱作humab小鼠和km小鼠的小鼠，并且在本文中統(tǒng)稱為“人ig小鼠”。

humab(medarex，inc.)含有人免疫球蛋白基因微基因座，所述微基因座編碼未重排的人重鏈免疫球蛋白序列(μ和γ)和k輕鏈免疫球蛋白序列，以及使內(nèi)源μ和k鏈基因座失活的靶向的突變(參見例如，lonberg等人,1994nature368(6474):856-859)。因此，這種小鼠顯示減少的小鼠igm或k表達，并且響應于免疫，引入的人重鏈和輕鏈轉(zhuǎn)基因經(jīng)歷類轉(zhuǎn)換和體細胞突變以產(chǎn)生高親和力人iggk單克隆(lonberg,n.等人,1994上文；綜述于lonberg,n.,1994handbookofexperimentalpharmacology113:49-101；lonberg,n.和huszar,d.,1995intern.rev.immunol.13:65-93，和harding,f.和lonberg,n.，1995,1995ann.n.y.acad.sci.764:536-546)。humab小鼠的制備和使用以及這類小鼠攜帶的基因組修飾進一步在taylor,l.等人,1992nucleicacidsresearch20:6287-6295；chen,j.等人,1993internationalimmunology5:647-656；tuaillon等人,1993proc.natl.acad.sci.usa94:3720-3724；choi等人,1993naturegenetics4:117-123；chen,j.等人,1993emboj.12:821-830；tuaillon等人,1994j.immunol.152:2912-2920；taylor,l.等人,1994internationalimmunology579-591；和fishwild,d.等人,1996naturebiotechnology14:845-851中描述，所述全部文獻的內(nèi)容因而特別通過引用的方式完整并入。還參見全部授予lonberg和kay的美國專利號5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,789,650；5,877,397；5,661,016；5,814,318；5,874,299；和5,770,429；授予surani等人的美國專利號5,545,807；全部授予lonberg和kay的pct公開號wo92103918、wo93/12227、wo94/25585、wo97113852、wo98/24884和wo99/45962；和授予korman等人的pct公開號wo01/14424。

在另一個實施方案中，可以使用在轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)染色體上攜帶人免疫球蛋白序列的小鼠如攜帶人重鏈轉(zhuǎn)基因和人輕鏈轉(zhuǎn)染色體的小鼠，產(chǎn)生本發(fā)明的人抗體。本文中稱作“km小鼠”的這類小鼠在授予ishida等人的pct公開wo02/43478中詳述。

另外，表達人免疫球蛋白基因的替代性轉(zhuǎn)基因動物系統(tǒng)是本領域可獲得的并且可以用來產(chǎn)生本發(fā)明結(jié)合angptl4的抗體。例如，可以使用稱作xenomouse(abgenix,inc.)的替代性轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)。這類小鼠在例如授予kucherlapati等人的美國專利號5,939,598；6,075,181；6,114,598；6,150,584和6,162,963中描述。

另外，表達人免疫球蛋白基因的替代性轉(zhuǎn)染色體動物系統(tǒng)是本領域可獲得的并且可以用來產(chǎn)生本發(fā)明結(jié)合angptl4的抗體。例如，可以使用稱作“tc小鼠”的攜帶人重鏈轉(zhuǎn)染色體和人輕鏈轉(zhuǎn)染色體兩者的小鼠；這類小鼠在tomizuka等人,2000proc.natl.acad.sci.usa97:722-727中描述。另外，攜帶人重鏈和輕鏈轉(zhuǎn)染色體的奶牛已經(jīng)在本領域中描述(kuroiwa等人,2002naturebiotechnology20:889-894)且可以用來產(chǎn)生本發(fā)明結(jié)合angptl4的抗體。

也可以使用篩選人免疫球蛋白基因文庫的噬菌體展示法，制備本發(fā)明的人源化抗體。本領域建立了或以下實施例中描述了分離人抗體的這類噬菌體展示法。參見例如：授予ladner等人的美國專利號5,223,409；5,403,484；和5,571,698；授予dower等人的美國專利號5,427,908和5,580,717；授予mccafferty等人的美國專利號5,969,108和6,172,197；和授予griffiths等人的美國專利號5,885,793；6,521,404；6,544,731；6,555,313；6,582,915和6,593,081。

也可以使用scid小鼠制備本發(fā)明的人源化抗體，其中已經(jīng)向所述scid小鼠內(nèi)重構人免疫細胞，從而一旦免疫就可以產(chǎn)生人抗體反應。這類小鼠在例如授予wilson等人的美國專利號5,476,996和5,698,767中描述。

構架或fc工程化

本發(fā)明的工程化抗體包括其中vh和/或vl內(nèi)的構架殘基已被修飾例如以改善抗體性質(zhì)的那些抗體。一般，進行這種構架修飾以降低抗體的免疫原性。例如，一種方案是將一個或多個構架殘基“回復突變”成相應的種系序列。更具體地，已經(jīng)歷過體細胞突變的抗體可以含有與衍生該抗體的種系序列不同的構架殘基。可以通過將抗體構架序列與衍生該抗體的種系序列比較而鑒定這類殘基。為了使構架區(qū)序列恢復其種系構型，可以例如通過位點定向誘變，將體細胞突變“回復突變”成種系序列。此類“回復突變的”抗體也意在由本發(fā)明涵蓋。

另一個類型的構架修飾涉及使構架區(qū)內(nèi)部、或甚至一個或多個cdr區(qū)內(nèi)部的一個或多個殘基突變，以移除t細胞表位，從而減少抗體的潛在免疫原性。該方法也稱為“去免疫化”，并進一步詳細描述于carr等的美國專利公開號20030153043中。

除在構架或cdr區(qū)內(nèi)進行的修飾外，本發(fā)明的抗體還可以或備選地可以被改造以包括fc區(qū)內(nèi)的修飾，通常用來改變抗體的一種或多種功能性質(zhì)，如血清半壽期、補體固定、fc受體結(jié)合和/或抗原依賴性細胞毒性。此外，可化學修飾(例如，一個或多個化學部分可附著到抗體上)或修飾本發(fā)明的抗體以改變其糖基化，進而改變抗體的一種或多種功能性質(zhì)。下文中進一步詳細描述了這些實施方案中的每一個實施方案。fc區(qū)中殘基的編號是kabat的eu索引。

在一個實施方案中，修飾ch1的鉸鏈區(qū)，使得改變(例如增加或減少)鉸鏈區(qū)中半胱氨酸殘基的數(shù)目。bodmer等的美國專利號5,677,425中進一步描述了該方法。改變ch1的鉸鏈區(qū)中半胱氨酸殘基的數(shù)目，例如用來便于輕鏈和重鏈的裝配、或提高或降低抗體的穩(wěn)定性。

在另一實施方案中，突變抗體的fc鉸鏈區(qū)，以降低抗體的生物半壽期。更特別地，可以向fc鉸鏈片段的ch2-ch3結(jié)構域界面區(qū)引入一個或多個氨基酸突變，使得抗體相對于天然的fc鉸鏈結(jié)構域spa結(jié)合具有受損的葡萄球菌蛋白a(spa)結(jié)合。在ward等人的美國專利號6,165,745中更詳細地描述了這種方法。

在另一實施方案中，修飾抗體以增加其生物半壽期?？墒褂枚喾N方法。例如，可以引入以下一種或多種突變：t252l、t254s、t256f，如ward的美國專利號6,277,375中所述。備選地，為了增加生物學半壽期，可以在ch1或cl區(qū)內(nèi)部改變抗體以含有救援受體(salvagereceptor)結(jié)合表位，所述救援受體結(jié)合表位取自igg的fc區(qū)的ch2結(jié)構域的兩個環(huán)，如presta等人的美國專利號5,869,046和6,121,022中所述。

還在其他實施方案中，通過將至少一個氨基酸殘基替換為不同氨基酸殘基，改變fc區(qū)，以改變抗體的效應子功能。例如，可用不同氨基酸殘基替換一個或多個氨基酸，使得抗體對效應子配體具有改變的親和力，但保留親本抗體的抗原結(jié)合能力。改變親和力的效應子配體可以是例如fc受體或補體的c1組分。這種方法在winter等人的美國專利號5,624,821和5,648,260中進一步詳細描述。

在另一實施方案中，可用不同氨基酸殘基替換選自氨基酸殘基的一個或多個氨基酸，使得抗體具有改變的c1q結(jié)合/或降低的或消除的補體依賴性細胞毒性(cdc)。這種方法在美國專利號6,194,551(idusogie等人)中進一步詳細描述。

在另一實施方案中，改變一個或多個氨基酸殘基，由此改變抗體固定補體的能力。這種方法在bodmer等人的pct公開wo94/29351中進一步描述。

還在另一實施方案中，修飾fc區(qū)以提高抗體介導抗體依賴性細胞毒性(adcc)的能力，和/或通過修飾一個或多個氨基酸來增加抗體對fcγ受體的親和力。這種方法在presta的pct公開wo00/42072中進一步描述。另外，人igg1上fcγrl、fcγrii、fcγriii和fcrn的結(jié)合位點已經(jīng)定位，并且已經(jīng)描述了具有改進的結(jié)合作用的變體(見shields,r.l.等人,2001j.biol.chen.276:6591-6604)。

還在另一實施方案中，修飾抗體的糖基化。例如，可以產(chǎn)生非糖基化的抗體(即，抗體缺少糖基化)?？梢愿淖兲腔员憷缭黾涌贵w對“抗原”的親和力。這類糖修飾也可以通過例如改變抗體序列內(nèi)部的一個或多個糖基化位點來完成。例如，可以產(chǎn)生一個或多個氨基酸置換，所述氨基酸置換導致消除一個或多個可變區(qū)構架糖基化位點，從而消除在這個位點處的糖基化。這種非糖基化可以增加抗體對抗原的親和力。在例如co等人的美國專利號5,714,350和6,350,861中更詳細地描述了這種方法。

額外地或備選地，可以產(chǎn)生一種抗體，所述抗體具有改變的糖基化類型，如巖藻糖殘基數(shù)量減少的過低巖藻糖化的抗體或具有對分glcnac結(jié)構增加的抗體。這類改變的糖基化模式已經(jīng)展示增加抗體的adcc能力。這類糖修飾可以通過例如在具有改變的糖基化裝置的宿主細胞中表達這種抗體而完成。已經(jīng)在本領域中描述了具有改變的糖基化機器的細胞，并且該細胞可用作表達本發(fā)明重組抗體的宿主細胞，由此產(chǎn)生具有改變的糖基化的抗體。例如，hang等人的ep1,176,195描述了編碼巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的fut8基因在功能上遭破壞的細胞系，從而在這種細胞系中表達的抗體顯示過低巖藻糖化。presta的pct公開wo03/035835描述了一種變異cho細胞系(lecl3細胞)，所述細胞系具有降低的將巖藻糖連接至asn(297)聯(lián)糖的能力，這也導致在這種宿主細胞中表達的抗體過低巖藻糖化(還參見shields,r.l.等人,2002j.biol.chem.277:26733-26740)。umana等人的pct公開wo99/54342描述了經(jīng)工程化以表達修飾糖蛋白的糖基轉(zhuǎn)移酶(例如β(1,4)-n-乙酰葡糖胺基轉(zhuǎn)移酶iii(gntiii))的細胞系，從而在這種工程化的細胞系中表達的抗體顯示出增加的對分glcnac結(jié)構物，這導致抗體的增加的adcc活性(還參見umana等人,1999nat.biotech.17:176-180)。

工程化改變的抗體的方法

如上文討論，通過修飾全長重鏈和/或輕鏈序列、vh和/或vl序列或與其連接的恒定區(qū)，具有本文所示的vh和vl序列或全長重鏈和輕鏈序列的結(jié)合angptl4的抗體可以用來產(chǎn)生結(jié)合angptl4的新抗體。因此，在本發(fā)明的另一個方面，結(jié)合angptl4的本發(fā)明抗體的結(jié)構特征用來產(chǎn)生結(jié)構上相關的結(jié)合angptl4的抗體，所述抗體保留本發(fā)明抗體的至少一種功能特性，如與人angptl4的結(jié)合和還抑制angptl4的一個或多個功能特征(例如，抑制angptl4與angptl4受體結(jié)合、抑制angptl4依賴性細胞增殖)。

例如，本發(fā)明的抗體或其突變物的一個或多個cdr區(qū)可以重組地與已知的構架區(qū)和/或其他cdr組合，以產(chǎn)生額外的重組工程化的本發(fā)明結(jié)合angptl4的抗體，如上文討論。其他類型的修飾包括在先前部分中描述的那些修飾。用于工程化方法的初始材料是本文中提供的一個或多個vh序列和/或vl序列或其一個或多個cdr區(qū)。為產(chǎn)生工程化抗體，不需要實際地制備(即表達為蛋白質(zhì))具有本文中提供的一個或多個vh序列和/或vl序列或其一個或多個cdr區(qū)的抗體。相反，使用序列中所含的信息作為初始材料以產(chǎn)生源自原始序列的“第二代”序列并且隨后制備“第二代”序列并且表達為蛋白質(zhì)。

因此，在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種用于制備結(jié)合angptl4的抗體的方法，所述結(jié)合angptl4的抗體由重鏈可變區(qū)抗體序列和輕鏈可變區(qū)抗體序列組成，所述重鏈可變區(qū)抗體序列具有選自seqidno:7、32、52、72、92、112和132的cdr1序列、選自seqidno:8、33、53、73、93、113和133的cdr2序列和/或選自seqidno:9、34、54、74、94、114和134的cdr3序列；所述輕鏈可變區(qū)抗體序列具有選自seqidno:17、42、62、82、102、122和142的cdr1序列、選自seqidno:18、43、63、83、103、123和143的cdr2序列和/或選自seqidno:19、44、64、84、104、124和144的cdr3序列；改變重鏈可變區(qū)抗體序列和/或輕鏈可變區(qū)抗體序列內(nèi)部的至少一個氨基酸殘基以產(chǎn)生至少一個改變的抗體序列；并且將改變的抗體序列表達為蛋白質(zhì)。

因此，在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種用于制備結(jié)合angptl4的抗體的方法，所述結(jié)合angptl4的抗體由重鏈可變區(qū)抗體序列和輕鏈可變區(qū)抗體序列組成，所述重鏈可變區(qū)抗體序列具有選自seqidno:10、35、55、75、95、115和135的cdr1序列、選自seqidno:11、36、56、76、96、116和136的cdr2序列和/或選自seqidno:12、37、57、77、97、117和137的cdr3序列；所述輕鏈可變區(qū)抗體序列包含選自seqidno:20、45、65、85、105、125和145的cdr1序列、選自seqidno:21、46、66、86、106、126和146的cdr2序列和/或選自seqidno:22、47、67、87、107、127和147的cdr3序列；改變重鏈可變區(qū)抗體序列和/或輕鏈可變區(qū)抗體序列內(nèi)部的至少一個氨基酸殘基以產(chǎn)生至少一個改變的抗體序列；并且將改變的抗體序列表達為蛋白質(zhì)。

因此，在另一個實施方案中，本發(fā)明提供一種用于制備為哺乳動物細胞中表達而優(yōu)化的結(jié)合angptl4的抗體的方法，所述結(jié)合angptl4的抗體由全長重鏈抗體序列和全長輕鏈抗體序列組成，所述全長重鏈抗體序列具有選自seqidno:15、28、40、60、80、100、120和140的序列；所述全長輕鏈抗體序列具有選自seqidno:25、50、70、90、110、130和150的序列；改變?nèi)L重鏈抗體序列和/或全長輕鏈抗體序列內(nèi)部的至少一個氨基酸殘基以產(chǎn)生至少一個改變的抗體序列；并且將改變的抗體序列作為蛋白質(zhì)表達。在一個實施方案中，重鏈或輕鏈的改變處于重鏈或輕鏈的構架區(qū)內(nèi)。

也可以通過篩選抗體文庫制備改變的抗體序列，所述抗體文庫具有如us20050255552中所述的固定的cdr3序列或最小必需結(jié)合決定簇并在cdr1和cdr2序列上具有多樣性。可以根據(jù)適于從抗體文庫篩選抗體的任何篩選技術(如噬菌體展示技術)進行篩選。

可以用標準分子生物學技術來制備并表達改變的抗體序列。由改變的抗體序列編碼的抗體是這樣一種抗體，所述抗體保留本文所述的結(jié)合angptl4的抗體的一個、一些或全部功能特征，所述功能特征包括但不限于與人、食蟹猴、大鼠和/或小鼠angptl4特異性結(jié)合；并且所述抗體在f36e和/或ba/f3-angptl4r細胞增殖測定法中抑制angptl4依賴性細胞增殖。

在工程化本發(fā)明抗體的方法的某些實施方案中，可以隨機地或選擇性地沿著全部或部分的結(jié)合angptl4的抗體編碼序列引入突變，并且可以對所得到的結(jié)合angptl4的經(jīng)修飾抗體篩選如本文所述的結(jié)合活性和/或其他功能特征。已經(jīng)在本領域描述了突變方法。例如，short的pct公開wo02/092780描述了用于使用飽和誘變法、合成連接裝配法或其組合產(chǎn)生并篩選抗體突變物的方法。備選地，lazar等人的pct公開wo03/074679描述了使用計算篩選方法優(yōu)化抗體物理化學特性的方法。

在本發(fā)明的某些實施方案中，已經(jīng)將抗體工程化以移除脫酰胺化位點。已知的脫酰胺化在肽或蛋白質(zhì)中造成結(jié)構性和功能性改變。脫酰胺化可以導致降低的生物學活性，以及蛋白質(zhì)藥物藥代動力學和抗原性的改變。(analchem.2005mar1；77(5):1432-9)。

在本發(fā)明的某些實施方案中，已經(jīng)將抗體工程化以增加pi并改善它們的藥物樣特性。蛋白質(zhì)的pi是分子總體生物物理特性的決定因素。已經(jīng)已知具有低pi的抗體更不可溶解，較不穩(wěn)定和易于聚集。另外，具有低pi的抗體的純化困難并且可能棘手，尤其在放大用于臨床使用期間。增加本發(fā)明的抗angptl4抗體或fab的pi改善其溶解度，使得按較高濃度(>100mg/ml)配制抗體成為可能。以高濃度(例如>100mg/ml)配制抗體提供以下優(yōu)點：能夠?qū)⑤^高劑量的抗體借助玻璃體內(nèi)注射施用至患者的眼部中，這轉(zhuǎn)而可以實現(xiàn)給藥頻率減少，這是一個治療慢性疾病(包括心血管病)的明顯優(yōu)點。更高的pi還可能增加fcrn介導的igg形式的抗體再循環(huán)，因此使得藥物在身體內(nèi)續(xù)存較長持續(xù)時間成為可能，需要更少的注射。最后，由于較高的pi導致更長的貨架期和體內(nèi)生物學活性，抗體的總體穩(wěn)定性顯著地改善。優(yōu)選地，pi大于或等于8.2。

可以使用本領域可獲得的和/或本文所述的標準測定法，如實施例中所述的那些(例如，elisa)，評估改變的抗體的功能特性。

預防性用途和治療性用途

例如，如本文所述的結(jié)合angptl4的抗體或可以在治療有用的濃度，通過向有需求的受試者施用有效量的本發(fā)明抗體或抗原結(jié)合片段，用于治療與angptl4水平和/或活性增加相關的疾病或病癥。本發(fā)明還提供一種通過向有需求的受試者施用有效量的本發(fā)明抗體，治療angptl4相關的心血管病的方法。本發(fā)明還提供一種通過向有需求的受試者施用有效量的本發(fā)明抗體，治療angptl4相關的心血管病的方法。

本發(fā)明的抗體可以尤其用來預防治療、防止和改善angptl4相關的病狀或病癥，所述病狀或病癥包括但不限于任何數(shù)目的其中angptl4蛋白水平異常高和/或其中尋求降低angptl4蛋白水平的病狀或疾病。這些病狀包括但不限于涉及脂質(zhì)代謝的那些病狀，如高脂血癥、高脂蛋白血癥和血脂異常，包括致粥樣硬化性血脂異常、糖尿病血性脂異常、高甘油三酯血癥(例如，重度高甘油三酯血癥(例如，tg>1000mg/dl)、與肥胖相關的高甘油三酯血癥、和v型高甘油三酯血癥)、高膽固醇血癥、乳糜微粒血癥、混合性血脂異常(肥胖癥、代謝綜合征、糖尿病等)、脂肪營養(yǎng)不良(lipodystrophy)、脂肪萎縮和由例如lpl活性降低和/或lpl缺乏、ldl受體活性降低和/或ldl受體缺乏、apoc2改變、apoe缺乏、apob增加、極低密度脂蛋白(vldl)的產(chǎn)生增加和/或其消除減少、某些藥物治療(例如，糖皮質(zhì)激素治療所致血脂異常)、任何遺傳素質(zhì)、膳食、生活方式等引起的其他病狀。

與高脂血癥、高脂蛋白血癥和/或血脂異常相關或因其產(chǎn)生的其他angptl4相關疾病或病癥包括但不限于心血管疾病或病癥，如動脈粥樣硬化、血管瘤、高血壓、心絞痛、卒中、腦血管病、充血性心力衰竭、冠狀動脈病、心肌梗死、外周血管疾病等；急性胰腺炎；非酒精性脂肪性肝炎(nash)；血糖紊亂如糖尿?。环逝职Y等。

本發(fā)明的抗體也可以與預防、治療或改善angptl4相關病癥的其他藥物組合使用。例如，他汀治療藥可以與本發(fā)明的angptl4抗體和抗原結(jié)合片段組合用于治療患有甘油三酯相關病癥的患者。

藥物組合物

本發(fā)明提供藥物組合物，所述組合物包含與可藥用載體配制在一起的結(jié)合angptl4的抗體(完整抗體或其結(jié)合片段)。該組合物可以額外地含有適于例如治療或預防心血管病的一種或多種其他治療藥?？伤幱幂d體增強或穩(wěn)定組合物，或可以用來促進組合物的制備?？伤幱幂d體包括生理上相容的溶劑、分散介質(zhì)、包衣、抗細菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等。

可以通過本領域已知的多種方法施用本發(fā)明的藥物組合物。施用途徑和/或模式根據(jù)所需的結(jié)果變動。優(yōu)選玻璃體內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、腹內(nèi)或皮下施用或靠近靶部位施用。可藥用載體應當適于玻璃體內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、腸胃外、脊髓或表皮施用(例如，通過注射或輸注)。取決于施用途徑，可以將活性化合物(即，抗體，雙特異性和多特異性分子)包覆在保護該化合物免遭可能使這種化合物失活的酸和其他天然條件作用的材料中。

組合物應當是無菌和流動的?？梢岳缤ㄟ^使用包衣如卵磷脂、在分散體情況下通過維持要求的粒度和通過使用表面活性劑，維持適宜的流動性。在許多情況下，優(yōu)選在組合物中包含等滲劑，例如糖、多元醇如甘露醇或山梨醇和氯化鈉?？梢酝ㄟ^在組合物中包含延遲吸收的物質(zhì)例如單硬脂酸鋁或明膠，引起可注射組合物的長期吸收。

可以根據(jù)本領域熟知和常規(guī)實施的方法制備本發(fā)明的藥物組合物。參見，例如，remington:thescienceandpracticeofpharmacy,mackpublishingco.,第20版,2000和sustainedandcontrolledreleasedrugdeliverysystems,j.r.robinson編著,marceldekker,inc.,newyork,1978。優(yōu)選地在gmp條件下制造藥物組合物。一般，在本發(fā)明的藥物組合物中使用治療有效劑量的或有效劑量的結(jié)合angptl4的抗體。通過本領域技術人員已知的常規(guī)方法，將結(jié)合angptl4的抗體配制成可藥用的劑型。調(diào)整劑量方案以提供最佳的所需反應(例如，治療反應)。例如，可以施用單次大丸劑，可以隨時間推移施用幾個分開的劑量，或可以如治療情況的危急性所示，按比例減少或增加該劑量。特別有利的是以劑量單位形式配制腸胃外組合物以易于劑量的施用和均勻性。如本文所用的劑量單位形式指適合作為用于待治療受試者的單一劑量的物理分立的單元；每個單元含有預定量的活性化合物，所述的預定量經(jīng)計算與所要求的藥用載體結(jié)合時產(chǎn)生所需的治療效果。

可以變動有效成分在本發(fā)明藥物組合物中的實際劑量水平，從而以獲得有效成分的量，其中對于特定患者、組合物和施用模型，所述的量有效實現(xiàn)想要的治療反應，而對患者無毒。選擇的劑量水平取決于多種藥物代謝動力學因素，包括所用的本發(fā)明特定組合物或其酯、鹽或酰胺的活性、施用途徑、施用時間、正在使用的化合物的排泄速率、治療的持續(xù)期、與所用特定組合物聯(lián)合使用的其他藥物、化合物和/或材料、正在治療的患者的年齡、性別、重量、狀況、總體健康和既往醫(yī)史等因素。

醫(yī)師或獸醫(yī)師可以在低于為實現(xiàn)所需治療作用而要求的水平開始在藥物組合物中使用的結(jié)合angptl4的本發(fā)明抗體的劑量并且逐漸地增加劑量直至所需的作用實現(xiàn)。從總體上看，用于治療本文所述的心血管病的本發(fā)明組合物的有效劑量根據(jù)許多不同因素變動，所述因素包括施用手段、靶部位、患者的生理狀態(tài)、患者是否為人或動物、施用的其他用藥和治療是否為預防治療或治療性治療。治療劑量需要滴定以優(yōu)化安全性和效力。對于全身性施用抗體，劑量是約0.0001至100mg/kg和更常見地0.01至15mg/kg宿主體重。對于玻璃體內(nèi)施用抗體，劑量可以是0.1mg/眼至5mg/眼。例如，0.1mg/ml、0.2mg/ml、0.3mg/ml、0.4mg/ml、0.5mg/ml、0.6mg/ml、0.7mg/ml、0.8mg/ml、0.9mg/ml、1.0mg/ml、1.1mg/ml、1.2mg/ml、1.3mg/ml、1.4mg/ml、1.5mg/ml、1.6mg/ml、1.7mg/ml、1.8mg/ml、1.9mg/ml、2.0mg/ml、2.1mg/ml、2.2mg/ml、2.3mg/ml、2.4mg/ml、2.5mg/ml、2.6mg/ml、2.7mg/ml、2.8mg/ml、2.9mg/ml、3.0mg/ml、3.1mg/ml、3.2mg/ml、3.3mg/ml、3.4mg/ml、3.5mg/ml、3.6mg/ml、3.7mg/ml、3.8mg/ml、3.9mg/ml、4.0mg/ml、4.1mg/ml、4.2mg/ml、4.3mg/ml、4.4mg/ml、4.5mg/ml、4.6mg/ml、4.7mg/ml、4.8mg/ml、4.9mg/ml或5.0mg/ml。一個示例性治療方案能夠進行每兩周一次或每月一次或每3至6個月一次全身性施用。一個示例性治療方案能夠進行每兩周一次或每月一次或每3至6個月一次或根據(jù)需要(prn)全身性施用。

通常在多種情形下施用抗體。單個劑量之間的時間間隔可以是每周一次、每月一次或每年一次。間隔期也可以是不規(guī)則的，如通過測量結(jié)合angptl4的抗體在患者中的血液水平所指示。此外，備選給藥間隔時間可以由醫(yī)師確定并且每月施用一次或如需要的效果施用。在一些全身性施用方法中，調(diào)整劑量以實現(xiàn)1–1000μg/ml的血漿抗體濃度，并且在一些方法中以實現(xiàn)25–500μg/ml的血漿抗體濃度。備選地，抗體可以作為持續(xù)釋放形式施用，在這種情況下需要較少頻率的施用。根據(jù)抗體在患者中的半壽期變動劑量和頻率。通常，人源化抗體顯示比嵌合抗體和非人抗體更長的半壽期?？梢愿鶕?jù)治療是否為預防性或治療性而變動施用的劑量和頻率。在預防性應用中，相對低的劑量以相對地不頻繁的間隔期在長的時間范圍內(nèi)施用。一些患者繼續(xù)接受治療持續(xù)其余生。在治療性應用中，有時需要在相對短的間隔期以相對高的劑量直至疾病的進展減低或終止，并且優(yōu)選地直至患者顯示出部分或完全的疾病癥狀改善。此后，患者可以按預防性方案施用。

實施例

提供以下實施例以進一步說明本發(fā)明，而非限制其范圍。本發(fā)明的其他變型將是本領域普通技術人員輕易明白的并且由所附權利要求涵蓋。

實施例1：制備用作抗原和用于抗體表征實驗中的純化重組人angptl4

將編碼全長人angptl4多肽(氨基酸26-406，匹配ncbi序列nm_139314.2)以及來自人igg-κ的n端信號肽(mktfilllwvlllwvifllpgata)(seqidno:152)和c末端flag表位(dykddddkh)(seqidno:153)、六組氨酸純化標簽(hhhhhh)(seqidno:154)和avi標簽(即，bira生物素?；蛄術gglndifeaqkiewhe)(seqidno:155)的核酸序列亞克隆入哺乳動物細胞表達載體prs5a以產(chǎn)生含有20個氨基酸ikk信號序列，后接人angptl4的氨基酸26-406以及羧基末端flag、6his和avi標簽(表2，seqidno:156)的質(zhì)粒prs-ikk-hangptl4(26-406)-flag-6his-avi。

對于一些制備物，以下程序用來表達、純化和生物素化人angptl4蛋白(方法1)：將適應懸浮培養(yǎng)的hek293t細胞在無血清freestyle293表達培養(yǎng)基(lifetechnologies，目錄編號12338-018)中培養(yǎng)，并且使用聚乙烯亞胺轉(zhuǎn)染試劑(polysciences，目錄編號23966)，用質(zhì)粒prs-ikk-hangptl4(26-406)-flag-his6-avi轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后5小時，將肝素(alfaaesar，目錄編號a16198)添加到培養(yǎng)基至終濃度0.5mg/ml。隨后將細胞培養(yǎng)72-96小時并隨后通過在4℃離心收獲細胞培養(yǎng)上清液并使用0.22μm濾器(thermo，目錄編號567-0010)無菌過濾。隨后通過切線流過濾，將過濾的細胞培養(yǎng)上清液濃縮至約100ml。將濃縮的上清液用tbs-甘油緩沖液(50mmtris-hcl，150mmnacl，和15％甘油，ph7.4)稀釋至1升體積，并且通過切線流過濾，將樣品濃縮至約200ml。隨后添加經(jīng)tbs-甘油緩沖液預平衡的抗-flagm2瓊脂糖樹脂(sigma，目錄編號220102-177)至樣品，并且所得溶液溫和地在4℃混合1小時。隨后將瓊脂糖樹脂用25mltbs-甘油洗滌5次，并將結(jié)合的angptl4蛋白用含有0.2mg/mlflag肽(sigma，目錄編號220176-317)的20mltbs-甘油洗脫。添加無過氧化物的吐溫20(applichem，目錄編號a1284,0025)到洗脫的蛋白質(zhì)溶液至終濃度0.1％，并將所得溶液加載于經(jīng)含有0.1％吐溫20的tbs-甘油(緩沖液a)中預平衡的5mlhitrap肝素柱(gelifesciences，目錄編號17-0407-01)上。將柱用50ml緩沖液a洗滌，隨后用含有300mmnacl的50ml緩沖液a洗滌。隨后用含有600mmnacl的20ml緩沖液a洗脫angptl4蛋白。使用具有30kd分子量截止值的離心濃縮器(amiconultra，目錄編號ufc903024)，濃縮洗脫的蛋白質(zhì)。如通過sds-page所評估，純化的angptl4蛋白的純度是>90％。

對于一些應用，使用10μg純化的生物素-蛋白質(zhì)連接酶(bira)(avidity)/mgangptl4，將angptl4蛋白在c末端avi標簽上進行位點特異性生物素?；＞彌_液以終濃度10mmatp、10mm乙酸鎂和0.5md-生物素補充。將反應混合物在30℃溫育2小時并且隨后在4℃溫育過夜，隨后加載于經(jīng)緩沖液a平衡的hiloadsuperdex200柱(26mmx600mm)(gelifesciences，目錄編號28-9893-36)。使用sds-page分析來自superdex200柱的級分，并且匯集含有angptl4的級分并使用離心濃縮器濃縮。

對于其他制備物，以下程序用來表達、純化和生物素化人angptl4蛋白(方法2)：使用標準聚乙烯亞胺(pei)轉(zhuǎn)染方法，將質(zhì)粒prs-ikk-hangptl4(26-406)c-flag6hisavi瞬時轉(zhuǎn)染入hek293t細胞中。將細胞以懸浮培養(yǎng)方式在freestyle293表達培養(yǎng)基中增殖并且使用多個1升培養(yǎng)瓶，在4升培養(yǎng)基中以1x10⁶個細胞/ml細胞終濃度實施轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后5小時，將肝素以終濃度500μg/ml添加。將細胞在37℃和5％co2培育72小時。隨后通過離心沉淀細胞，并且使上清液穿過0.22μm無菌濾器。使用切線流過濾(tff)，濃縮澄清的上清液并令其緩沖液交換成緩沖液b(50mmtris-hcl，150mmnacl，10％甘油，10mm咪唑，ph7.4)。隨后使?jié)饪s的樣品在經(jīng)緩沖液c(50mmtris.hcl，150mmnacl，10％甘油，10mm咪唑，0.1％正辛基-β-麥芽糖苷，ph7.4)平衡的5mlni-nta親和柱上通過。在裝載樣品后，將柱用相同的緩沖液洗滌直至達到基線280nm處的吸光度。隨后通過使用咪唑梯度(10mm至500mm)洗脫結(jié)合的angptl4蛋白。將含有人angptl4的洗脫級分匯集，使用amicon濃縮器(分子量截止值10kd)濃縮，使用pd-10柱令其緩沖液交換成儲存緩沖液(50mmtris-hcl，150mmnacl，15％甘油，ph7.4)，等分，在液氮中急凍，并貯存在-80℃。如通過sds-page所評估，純化的人angptl4蛋白的純度是>90％。

對于一些應用，將如上述制備的純化angptl4蛋白如下進行位點特異性生物素?；簩?0mmbicineph8.3緩沖液中終濃度大約1mg/ml的純化蛋白質(zhì)在10mmatp、10mm乙酸鎂，0.1mm生物素和bira生物素連接酶(avidity)存在下在30℃溫育1小時并且隨后在4℃過夜。將蛋白質(zhì)隨后使用amicon濃縮器(分子量截值值10kd)濃縮，使用pd-10柱令其緩沖液交換成儲存緩沖液(50mmtris-hcl，150mmnacl，15％甘油，ph7.4)，等分，在液氮中急凍，并貯存在-80℃。

實施例2：制備用于抗體表征實驗中的純化重組人angptl4n末端卷曲螺旋結(jié)構域蛋白

使用實施例1方法2中對人全長人angptl4描述的基本上相同的方法，實施人angptl4的n末端卷曲螺旋結(jié)構域(氨基酸26-161)的表達、純化和生物素酰化。表2中顯示純化的人angptl4n端結(jié)構域蛋白的序列(seqidno:157)。

表2.人angptl4(26-406)-flag-his6-avi的氨基酸序列(加下劃線突出顯示信號肽，并且以斜體突出顯示信號肽后的n末端qp序列和c末端flag-his6-avi序列)

實施例3：單克隆抗體的制備和篩選

如實施例1中所述自行制備重組人angptl4蛋白，并且用作免疫原以產(chǎn)生抗angptl4雜交瘤克隆。用重組人angptl4根據(jù)標準快速免疫方案免疫bcl-2轉(zhuǎn)基因小鼠。通過使用基于電融合的標準方法產(chǎn)生雜交瘤。

使用標準方法，生成了穩(wěn)定表達與跨膜結(jié)構域融合的人angptl4的cho-k1pd細胞。由于存在跨膜結(jié)構域，這些細胞在細胞表面上展示angptl4。因此，可以使用流式細胞術檢測到抗體與這些細胞表面上angptl4的結(jié)合。

通過檢測上清液中存在的抗體與cho-k1pd細胞表面上表達的人angptl4的結(jié)合，篩選雜交瘤上清液。使用熒光標記的抗小鼠第二抗體和流式細胞術檢測抗體與細胞的結(jié)合。使用不表達angptl4的親本cho-k1pd細胞作為陰性對照。對于與angptl4結(jié)合的雜交瘤，使用標準方法，從細胞上清液純化抗體，并且在流式細胞術測定法中用cho-k1pd/angptl4和cho-k1pd-親本細胞測試所產(chǎn)生的富集上清液。

通過使用標準的直接elisa測定法確定雜交瘤上清液中的angptl4抗體滴度，在所述測定法中，重組人angptl4蛋白固定在elisa平板的表面上。將證實陽性的雜交瘤亞克隆，并且使用標準方法測定由這些雜交瘤產(chǎn)生的單克隆抗體的序列。

隨后使用以下實施例7中描述的方法，顯示單克隆抗體14p18、17b1、19c16和37p1抑制人angptl4介導的人脂蛋白脂肪酶抑制作用。使用標準方法測定14p18、17b1、19c16和37p1的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列和氨基酸序列。

實施例4：單克隆抗體的人源化

人源化過程是本領域充分描述的(jones等人,1986；queen等人,1989；riechmann等人,1988；verhoeyen,milstein和winter1988)。將術語人源化描述為轉(zhuǎn)移非人類抗體(例如鼠衍生抗體)的抗原結(jié)合位點至人接納體構架，例如人類種系序列(retter等人,2005)。使抗體人源化的主要原理是在人類中施用抗體作為治療劑時，最小化對抗體形成免疫原性應答的風險(rebello等人,1999)。

抗原結(jié)合位點包含互補決定區(qū)(cdr)(chothi和lesk,1987，kabat等人,1991)和可變結(jié)構域(vl和vh)中直接或間接影響結(jié)合的構架區(qū)中位置?？赡苤苯佑绊懡Y(jié)合的構架殘基可以例如在位于cdr2和cdr3之間的所謂“外”環(huán)區(qū)域存在。間接影響結(jié)合的殘基例如在所謂vernier區(qū)存在(foote和winter,1992)。認為它們支持cdr構象。當選擇合適的接納體構架以使得構架區(qū)中最終人源化抗體相對于人種系接納體序列偏差的數(shù)目最小化時，考慮cdr外部的那些位置。

實施例5：抗體序列優(yōu)化和親和力成熟

已知某些氨基酸序列基序經(jīng)歷翻譯后修飾(ptm)如糖基化(例如nxs/t，其中x是除p之外的任何氨基酸)、游離半胱氨酸的氧化、脫酰胺化(例如ng序列中n的脫酰胺化)或異構化(例如，在dg序列處)。如果存在于cdr區(qū)中，則理想地通過位點定向誘變移除這些基序，以增加產(chǎn)物均勻性。

本領域充分描述了親和力成熟的過程。在許多展示系統(tǒng)當中，噬菌體展示(smith,1985)和真核細胞如酵母上展示(boder和wittrup,1997)是最常用來選擇抗體-抗原相互作用的系統(tǒng)。這些展示系統(tǒng)的優(yōu)點是它們適用于廣泛類型的抗原并且可以容易地調(diào)整選擇嚴格性。在噬菌體展示中，可以展示scfv或fab片段并且在酵母展示中，可以展示scfv、fab或全長igg。這些通常采用的方法允許從多樣性超過1x10⁷的較大文庫選擇所需的抗體變體?？梢酝ㄟ^微量表達和elisa，篩選多樣性較小(例如1,000)的文庫。

非靶向或隨機抗體變體文庫可以例如通過易錯pcr(cadwell和joyce,1994)生成，并且提供了非常簡單的、但有時受限的方案。另一種策略是cdr指導的候選抗體多樣化。可以使用例如簡并寡核苷酸(thompson等人,1996)、三核苷酸誘變法(trim)(kayushin等人,1996)或本領域已知的任何其他方案，特異性靶向一個或多個cdr中的一個或多個位置。

實施例6：人源化抗體的表達和純化

編碼人源化vl和vh結(jié)構域的dna序列在geneart訂購(lifetechnologiesinc.雷根斯堡，德國)，其包括針對智人(homosapiens)優(yōu)化的密碼子。通過切割和連接，將編碼vl結(jié)構域和vh結(jié)構域的序列從geneart衍生的載體亞克隆至適于哺乳動物細胞表達和分泌的表達載體中。將重鏈和輕鏈克隆至分別的表達載體中以允許共轉(zhuǎn)染。表達載體的元件包括啟動子(巨細胞病毒(cmv)增強子-啟動子)、促進分泌的信號序列、聚腺苷酸化信號和轉(zhuǎn)錄終止子(來自牛生長激素(bgh)基因)、允許附加體型復制并且在原核生物中復制的元件(例如sv40復制起點和cole1或本領域已知的其他元件)和允許選擇的元件(氨芐青霉素耐藥基因和博萊霉素(zeocin)標記)。

以組成型方式表達sv40大t抗原的人胚腎細胞(hek293-tatcc11268)是用于瞬時表達人源化和/或優(yōu)化的igg蛋白的優(yōu)選宿主細胞系之一。使用pei(聚乙烯亞胺，分子量25,000線型，polysciences，美國，目錄號23966)作為轉(zhuǎn)染試劑，進行轉(zhuǎn)染。通過在室溫(rt)在900ml細胞培養(yǎng)級水中小心溶解1gpei，制備pei母液。為了促進pei的溶解，通過添加hcl至ph3-5，使溶液酸化，隨后用naoh中和至最終ph7.05。最后，將體積調(diào)節(jié)至1l并且將溶液經(jīng)0.22μm濾器過濾，等分并冷凍在-80℃直至進一步使用。使用用于細胞轉(zhuǎn)染和增殖的諾華專利無血清培養(yǎng)基，并使用excellvpro無血清培養(yǎng)基(safcbiosciences，美國，目錄號24561c)作為生產(chǎn)/進料培養(yǎng)基，培養(yǎng)hek293t細胞。以懸浮培養(yǎng)法培育為瞬時轉(zhuǎn)染所制備的細胞。對于小規(guī)模(<5l)轉(zhuǎn)染，在5％co2的增濕培養(yǎng)箱中回轉(zhuǎn)搖床(100-120轉(zhuǎn)/分鐘)上的corning搖瓶(corning，tewksbury，ma)中培育細胞(種子瓶)。應當維持種子培養(yǎng)物中的細胞處于指數(shù)生長期(細胞密度在5x10⁵/ml和3x10⁶/ml之間)并且對于轉(zhuǎn)染，這些細胞顯示>90％的活力。對于小規(guī)模(<5l)轉(zhuǎn)染，將細胞等分試樣從種子培養(yǎng)物取出并以諾華無血清培養(yǎng)基在36％終體積中調(diào)節(jié)至1.4x10⁶個細胞/ml。通過以7％最終培養(yǎng)物體積稀釋dna至1mg/l(終體積)隨后溫柔混合，制備dna溶液(對于1l轉(zhuǎn)染，溶液1:0.5mg重鏈和0.5mg輕鏈表達質(zhì)粒)。為了防止細菌的污染，使用0.22μm濾器(例如milliporestericup)過濾這種溶液。隨后還將3mg/l(終體積)的pei溶液稀釋于7％的最終培養(yǎng)物體積中并溫和地混合(溶液2)。兩種溶液均在室溫(rt)溫育5-10分鐘。此后將溶液2添加至溶液1，伴以溫和混合，并在室溫溫育另外5-15分鐘。隨后將轉(zhuǎn)染混合物添加至細胞并且細胞的培育繼續(xù)4至6小時。最后，通過添加vpro無血清培養(yǎng)基實現(xiàn)剩余的50％總生產(chǎn)體積。轉(zhuǎn)染后，將細胞培育繼續(xù)11天。

通過在4℃以4500轉(zhuǎn)/分鐘離心20分鐘(multifuge3s-r，thermoscientific，rockford，il)收獲培養(yǎng)物。將回收的細胞上清液經(jīng)stericup濾器(0.22μm)無菌過濾并貯存在4℃直至進一步處理。使用新凈化的(0.25mnaoh)hitrap5ml蛋白asure柱，在4℃在冷卻柜中的“100explorerair”色譜系統(tǒng)上進行純化。將柱用5個柱體積的磷酸鹽緩沖鹽水(pbs,gibco,lifetechnologies,carlsbad,ca)平衡，并且隨后將無菌過濾的上清液以4.0ml/分鐘加載。將柱用13個柱體積的pbs洗滌。隨后將抗體用5個柱體積的50mm檸檬酸鹽，70mmnaclph3.2洗脫。將洗脫物按3ml級分收集并用1mtris-hcl，ph10調(diào)整至ph7。將含有抗體的級分合并并無菌過濾(milliporesteriflip，0.22μm)，使用分光光度計(nanodropnd-1000)測量od280nm值，并且根據(jù)od280nm值和基于蛋白質(zhì)序列計算的摩爾消光系數(shù)，計算蛋白質(zhì)濃度。通過大小排阻色譜聯(lián)合多角度光散射探測器(sec-mals)測試洗脫物的聚集情況，并通過凝膠電泳(sds-page)、內(nèi)毒素測定法(lal)和質(zhì)譜法(ms)評定純度。對于第二純化步驟，如果需要，將來自第一次純化的抗體加載到新凈化(0.5mnaoh)的凝膠過濾柱(hiload16/60superdex200，120ml，ge-helthcare)中。將柱用pbs平衡，并且用pbs緩沖液按流速1ml/分鐘運行。洗脫物按1.2ml級分收集。匯集含有抗體的蛋白質(zhì)，并且如對第一純化步驟所述那樣分析所產(chǎn)生的純化抗體。

使用上文描述的方法，制備、表達和純化以下人源化抗體：neg276、neg276-lala、neg278、neg310、neg318、neg318-lala、neg319、neg313和neg315。表3中顯示這些人源化抗體的構架和親本抗體，并且表1中顯示了核苷酸序列和氨基酸序列。全部人源化抗體均作為人igg1抗體制備，例外是neg276-lala和neg318-lala，它們是使用重鏈中l(wèi)eu234-leu235序列由ala234-ala235替換的修飾的fc區(qū)(人igg1-lala)制備。已知與野生型人igg1抗體相比，人igg1-lala抗體具有減少的抗體效應子功能。

表3.本發(fā)明的人源化angptl4抗體

實施例7：人脂蛋白脂肪酶測定法

使用標準聚乙烯亞胺(pei)轉(zhuǎn)染方法，將freestyle表達培養(yǎng)基(invitrogen)中培養(yǎng)的hek293t細胞用編碼全長人脂蛋白脂肪酶(lpl)多肽(匹配ncbi序列nm_000237.2)的哺乳動物表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。在轉(zhuǎn)染后24小時，將肝素添加到培養(yǎng)基至終濃度3u/ml，以增強分泌的hlpl從細胞表面的釋放。在轉(zhuǎn)染后60小時，收集培養(yǎng)基，使用0.2μm濾器過濾，并且添加甘油至終濃度10％v/v。所得溶液加載于已經(jīng)用緩沖液a(50mmtris-hcl，200mmnacl，10％v/v甘油，ph7.2)預平衡的5ml肝素瓊脂糖凝膠hitrap柱(ge)上。將柱用緩沖液a洗滌，并且隨后用緩沖液a中500mmnacl、1mnacl和2mnacl的階梯梯度洗脫人lpl蛋白質(zhì)。最純和最有催化活性的人lpl在2mnacl處洗脫。將純化的人lpl的等分試樣快速冷凍并貯存在-80℃直至使用。

以下方案用來評估本發(fā)明抗體阻斷angptl4抑制人脂蛋白脂肪酶的能力。將384孔分析平板(corning，目錄編號3573)和樣品平板(greinerbio-one，目錄編號781201)在室溫用1％牛血清白蛋白(bsa)(0.1ml/孔)洗滌30分鐘。隨后將平板用0.05％吐溫20溶液洗滌兩次。

將100mmhepes，ph7.0中的angptl4抗體(20μl/孔，系列稀釋物，分析終濃度范圍是0.02至500nm)添加至樣品平板，隨后添加分析緩沖液(100mmhepes，2mmmgcl2，ph7.0)中的20μl人angptl4蛋白(10nm分析終濃度)，并且將平板在室溫溫育20分鐘伴以溫和振搖。隨后添加稀釋于分析緩沖液中的脂蛋白脂肪酶(20μl)并且將平板在室溫溫育10分鐘伴以溫和振搖。

在分析緩沖液中配制偶聯(lián)酶混合物，所述混合物含有?；?輔酶a氧化酶(sekisuidiagnostics，目錄編號t-17)，?；?輔酶a合成酶(sekisuidiagnostics，目錄編號t-16)，和辣根過氧化物酶(sekisuidiagnostics)，atp(sigma，目錄編號a7699)和輔酶a(mpbiomedicals，目錄編號100493)。添加過氧化氫酶瓊脂糖珠(sigma，目錄編號c9284)至偶聯(lián)酶混合物，并將混合物在4℃溫育30分鐘伴以振搖，并且隨后通過離心移除過氧化氫酶瓊脂糖珠。

將人vldl(millipore，目錄編號lp1)稀釋于分析緩沖液中，用過氧化氫酶瓊脂糖珠處理30分鐘，并且通過離心從溶液移除珠。添加分析緩沖液中的amplexred(invitrogen，目錄編號a12222)至濃度33μm。

向含有l(wèi)pl、angptl4和angptl4抗體的樣品平板中的溶液添加偶聯(lián)酶混合物(20μl)，并將54μl所得溶液轉(zhuǎn)移至分析平板。為了啟動脂蛋白脂肪酶反應，添加vldl/amplexred溶液(18μl)，并且使用envision多孔平板讀數(shù)儀(perkinelmer)連續(xù)監(jiān)測試鹵靈熒光30分鐘。分析終濃度是：9.4nmangptl4，約4nm人脂蛋白脂肪酶，2.3μg/ml人vldl，0.75mmatp，90μm輔酶a，0.5u/mlaco，1.25u/mlacs，1.2u/mlhrp，和10μmamplexred。

所產(chǎn)生的試鹵靈熒光對時間的數(shù)據(jù)用來確定每種樣品的脂蛋白脂肪酶酶活性(初始速率)。無lpl(背景對照)或無angptl4或angptl4抗體(lpl活性對照)的對照樣品用來歸一化酶活性，其表示為lpl對照活性的百分數(shù)。使用graphpadprism軟件，將不同angptl4抗體濃度的酶活性數(shù)據(jù)作圖，并且擬合數(shù)據(jù)以產(chǎn)生angptl4抗體介導的脂蛋白脂肪酶酶活性增加的ec50值。在這個測定法中，10nm濃度的人angptl4一般抑制lpl活性70-95％。本發(fā)明的angptl4抗體以劑量依賴性方式逆轉(zhuǎn)angptl4的lpl抑制作用。表4中顯示來自這個測定法的ec50結(jié)果。圖1中顯示本發(fā)明所選抗體的代表性數(shù)據(jù)。

表4.本發(fā)明的angptl4抗體阻斷脂蛋白脂肪酶(lpl)的人angptl4抑制作用

實施例8：抗體表征中所用食蟹猴、小鼠和大鼠angptl4蛋白和人angptl3蛋白的制備

通過從食蟹猴肝cdna文庫(biochain，目錄編號c1534149-cy，批號b409051)擴增基因序列，測定食蟹猴angptl4的序列?；谌薬ngptl4cdna(ncbi序列nm_139314.2)的5’和3'非翻譯區(qū)，設計引物5-ut-cyno5’-atccccgctcccaggctac-3’(seqidno:158)和3-ut-cyno5’-cagcaaggagtgaag-ctccatgcc-3’(seqidno:159)。將凝膠純化的pcr產(chǎn)物連接入pcr4-blunt-topo(lifetechnologies，目錄編號k2875-40)并測序?？寺〉氖承泛颽ngptl4cdna編碼與人angptl4同源95％的406個氨基酸的蛋白質(zhì)。將編碼食蟹猴angptl4氨基酸26-406的核酸序列亞克隆入哺乳動物表達載體prs5，以產(chǎn)生質(zhì)粒prs-ikk-cynoangptl4(26-406)-flag-6his-avi，所述質(zhì)粒具有20氨基酸的ikk信號序列、食蟹猴angptl4的氨基酸26-406、和羧末端flag、6his及avi標簽(表5中seqidno:160)。

使用實施例1中如對人angptl4(26-406)-flag-6his-avi蛋白所述的相似方法，表達并純化食蟹猴angptl4(26-406)-flag-6his-avi蛋白。對于一些應用，使用實施例1中如對人angptl4蛋白所述的相似方法，對純化的食蟹猴angptl4蛋白進行位點特異性生物素酰化。如通過sds-page所評估，純化的食蟹猴angptl4蛋白的純度是>90％。

使用相似的方法，制備食蟹猴angptl4(26-161)-flag-6his-avi蛋白。表5中顯示由其表達構建體編碼的食蟹猴angptl4(26-161)蛋白的序列(seqidno:161)。

使用實施例1方法2中對人angptl4描述的基本上相同方法，實施小鼠angptl4(氨基酸26-410)和大鼠angptl4(氨基酸24-405)的表達、純化和生物素?；?。表5中顯示由相應表達構建體編碼的小鼠angptl4蛋白和大鼠angptl4蛋白的序列(分別是seqidno:162和163)。如通過sds-page所評估，純化的小鼠angptl4蛋白和大鼠angptl4蛋白的純度是>90％。

angptl3(seqidno:5，表1)是與angptl4密切相關的人蛋白質(zhì)。為了評價本發(fā)明抗體對angptl3的可能結(jié)合，使用實施例1方法2中對人angptl4描述的相似方法，實施人angptl3(14-460)-flag-his-avi蛋白(seqidno:164，表5)的表達、純化和生物素?；?/p>

表5.食蟹猴angptl4(26-406)-flag-his6-avi、小鼠angptl4(26-410)-flag-his6-avi、大鼠angptl4(24-405)-flag-his6-avi和人angptl3(17-460)-flag-his-avi的氨基酸序列(加下劃線突出顯示信號肽，并且以斜體突出顯示信號肽后的n末端qp序列和c末端flag-his6-avi序列)

實施例9：通過直接elisa測定法表征抗體結(jié)合特異性

實施直接elisa測定法以表征本發(fā)明所選抗體的抗體結(jié)合特異性。該測定法如下進行。通過將384孔鏈霉親和素包被的mesoscalediscovery(msd)平板與50μl封閉緩沖液(pbs，ph7.4，5％w/v牛血清白蛋白)/孔在22℃溫育1小時伴以恒定振搖(600轉(zhuǎn)/分鐘)，封閉平板。隨后使用洗板器(biotek)，將封閉的msd平板用洗滌緩沖液(pbs，ph7.4和0.05％v/v吐溫20)洗滌3次。在洗滌后，將稀釋于分析緩沖液(無cacl2或mgcl2的pbs，ph7.4，0.5％w/v無脂肪酸牛血清白蛋白和0.02％v/v吐溫20)中的生物素?；娜薬ngptl4蛋白以1nm濃度(15μl/孔)在22℃溫育1小時固定在表面上：全長人angptl4(hangptl4)、人angptl4卷曲螺旋結(jié)構域(hangptl4-ccd)和全長人angptl3(hangptl3)。隨后將平板如先前所述那樣洗滌3次。隨后將分析緩沖液中稀釋至1nm濃度的抗體施加至msd平板(15μl/孔)，并且將平板在22℃溫育1小時，伴以恒定振搖(600轉(zhuǎn)/分鐘)。通過添加15μl/孔加磺基標簽的山羊抗人igg1:500稀釋物，檢測結(jié)合的抗體。隨后將平板溫育1小時，伴以恒定振搖(600轉(zhuǎn)/分鐘)。將平板洗滌3次，并且隨后添加15μl/孔的1xmsd讀取緩沖液t以及利用sectorimager6000(mesoscalediscovery)，使平板顯色。將數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)移至microsoftexcel用于分析并利用graphpadprismv6作圖。這些實驗顯示，這個測定法中測試的本發(fā)明全部抗體均與全長人angptl4及與人angptl4的n端結(jié)構域結(jié)合，并且不與全長人angptl3結(jié)合。使用angptl3-特異性參考抗體作為angptl3結(jié)合測定法的陽性對照(圖2)。

實施例10：通過溶液平衡滴定(set)測定法確定抗體解離常數(shù)

set測定法如下進行。在96孔聚丙烯平板中，將恒定濃度的angptl4抗體(10pm)與不同濃度的非生物素?；娜?、食蟹猴、小鼠或大鼠全長anpglt4蛋白或人angptl4n端結(jié)構域蛋白(0.01pm至100nm的5倍系列稀釋物)在set緩沖液(無cacl2或mgcl2的pbs，ph7.4，0.5％w/v牛血清白蛋白(無脂肪)和0.02％v/v吐溫20)中混合。最終反應體積是80μl。將平板用粘性膜密封并且在22℃溫育14小時，伴以恒定振搖(300轉(zhuǎn)/分鐘)。在相同的時間期間，通過將384孔鏈霉親和素包被的mesoscalediscovery(msd)平板與50μl封閉緩沖液(pbs，ph7.4，5％w/v牛血清白蛋白)/孔在4℃溫育。使用洗板器(biotek)，將封閉的msd平板用洗滌緩沖液(pbs，ph7.4和0.05％v/v吐溫20)洗滌3次。通過在22℃溫育1小時伴以恒定振搖(600轉(zhuǎn)/分鐘)，將生物素?；腶ngptl4(全長的人、食蟹猴、小鼠或大鼠angptl4，或人angptl4n端結(jié)構域)蛋白(1nm，15μl/孔)固定在鏈霉親和素包被的msd平板的表面上。隨后將平板如先前所述那樣洗滌3次。

應用平衡結(jié)合反應(15μl/孔)至angptl4固定的msd平板并在22℃溫育20分鐘。通過用洗滌緩沖液洗滌平板3次，移除未結(jié)合的材料，并且通過添加15μl/孔加磺基標簽的山羊抗人igg(mesoscalediscovery)1:500稀釋物，檢測捕獲的抗體。隨后將平板溫育1小時，伴以恒定振搖(600轉(zhuǎn)/分鐘)。將平板洗滌3次，并且隨后添加15μl/孔的1xmsd讀取緩沖液t以及利用sectorimager6000(mesoscalediscovery)，使平板顯色。將數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)移至microsoftexcel用于分析并利用graphpadprismv6作圖。通過將數(shù)據(jù)對以下等式擬合確定kd值：y＝(bmax/(cab/2))*((cab/2)-((((((cag+cab)+kd)/2)-((((((cag+cab)+kd)^2)/4)-(cag*cab))^0.5))^2)/(2*cab)))，

其中bmax是溶液中不存在angptl4時的信號，cab是溶液中恒定濃度的angptl4抗體，cag是溶液中angptl4的濃度，并且kd是平衡解離常數(shù)。表6中顯示使用這種方法確定的平衡解離常數(shù)。

表6.通過溶液平衡滴定(set)測定法確定的本發(fā)明抗體與angptl4蛋白結(jié)合的解離常數(shù)(kd)

*以所用的實驗條件未檢測到結(jié)合信號，表明kd值>500pm。測定angptl4參考抗體與大鼠angptl4結(jié)合的kd值為517pm。

實施例11:通過octet動力學結(jié)合測定法確定抗體結(jié)合動力學和解離常數(shù)

通過使用octet(fortebio)動力學結(jié)合測定法確定本發(fā)明所選抗體的解離常數(shù)(kd)。將fortebio10x動力學緩沖液(fortebio，目錄編號18-5032)用dpbs(lifetechnologies，目錄編號14190-136)稀釋10倍，并添加所得溶液(0.2ml/孔)至96孔板(greiner，目錄編號65520)。鏈霉親和素傳感器(fortebio，目錄編號18-5020)浸沒于溶液中并且在室溫平衡至少10分鐘。在第二塊96孔板(greiner，目錄編號65520)中，將傳感器在1x動力學緩沖液中洗滌，并且隨后浸沒于200ul25nm生物素?；娜薬ngptl4或生物素?；膮⒈鹊鞍?用于扣除背景)中在室溫浸沒1000秒。隨后將傳感器在1x動力學緩沖液中洗滌120秒，并浸沒于按多種濃度(2倍系列稀釋；最高濃度是12.5nm或25nm；最低濃度從0.8至3.1nm；對于每種kd測定，使用4-6種不同的抗體濃度)稀釋于1x動力學緩沖液中的200ulangptl4抗體中，并且監(jiān)測抗體締合480秒。隨后將傳感器轉(zhuǎn)移至含有200ul1x動力學緩沖液的孔，并且監(jiān)測抗體解離1200秒。通過octet軟件(fortebio)總體擬合背景校正的締合曲線和解離曲線，以產(chǎn)生締合(ka)和解離(kd)速率常數(shù)，它們隨后用來計算平衡解離常數(shù)(kd)。表7和表8中顯示本發(fā)明所選抗體的所得數(shù)據(jù)。

表7.通過fortebio動力學結(jié)合測定法確定的人angptl4(26-406)抗體解離常數(shù)(kd)

*報告的上限，因為解離速率低于檢測限，所述檢測限為大約5x10^-6s^-1。

表8.通過fortebio動力學結(jié)合測定法確定的neg276-lala解離常數(shù)(kd)

*報告上限，因為解離速率低于檢測限，所述檢測限為大約5x10^-6s^-1。**在所測試抗體的最高濃度25nm未檢測到結(jié)合。

實施例12：通過氫-氘交換/質(zhì)譜法的表位繪圖

氫-氘交換(hd)聯(lián)合質(zhì)譜法(ms)(woods，2001)用來繪圖抗體neg276和neg318對angptl4n端結(jié)構域上的結(jié)合位點。在hdx中，蛋白質(zhì)的可互換酰胺氫由氘替換。這種過程對蛋白質(zhì)結(jié)構/動力學和溶劑可及性敏感，并且因此能夠報道配體結(jié)合。這些實驗的目標是鑒定angptl4上neg276和neg318的表位。

進行自動化hdx/ms實驗，使用與那些文獻中描述相似的方法(chalmers，2006)。在watershdx-ms平臺上進行這些實驗，所述平臺包括leap自動采樣器、nanoacquityuplc系統(tǒng)和synaptg2質(zhì)譜儀。用來以氘標記蛋白質(zhì)主鏈的氘緩沖液是50mmd-tris-hcl(ph7.4)，500mmnacl，15％甘油和0.1％正辛基β-d-麥芽糖苷，溶液中的總氘百分數(shù)是82.5％。對于不存在angptl4抗體情況下的人angptl4(26-161)氘標記實驗，使用冰冷管中的100μl氘緩沖液稀釋300pmol人angplt4(26-161)(1.3μl)并且在搖床上在4℃溫育25分鐘。隨后用100μl冰冷的猝滅緩沖液在冰上猝滅標記反應3分鐘。在三分鐘后，將猝滅的溶液注射到lc-ms系統(tǒng)上以進行自動化胃蛋白酶消化和肽分析。對于存在結(jié)合的angptl4抗體情況下的人angptl4(26-161)氘標記實驗，將300pmolangptl4抗體首先固定在thermo蛋白gplus珠上并且使用辛二酸二琥珀酰亞胺酯(dss)交聯(lián)。為了進行標記實驗，將抗體珠(含有300pmol抗體)與300pmol人angptl4(26-161)在4℃溫育30分鐘。在30分鐘后，用200μltris緩沖液洗滌珠。隨后，添加200μl冰冷的氘緩沖液并且將復合物在4℃溫育25分鐘。在25分鐘后，將標記反應用125μl冰冷的猝滅緩沖液在冰上猝滅2.5分鐘。在離心機中離心樣品30秒后，將猝滅的溶液注射到lc-ms系統(tǒng)上以進行自動化胃蛋白酶消化和肽分析。

使用最少三個分析的一式三份重復，實施全部測量。使用0.5mtcep和3m尿素(ph＝2.5)，猝滅全部氘交換實驗。在猝滅后，使用poroszyme固定化胃蛋白酶柱(2.1x30mm)，使交換的抗原在12℃經(jīng)歷在線胃蛋白酶消化，隨后捕集在watersvanguardhsst3捕集柱上。使用2％至35％b的雙元8分鐘梯度(流動相a是99.9％水和0.1％甲酸；流動相b是99.9％乙腈和0.1％甲酸)，將肽從捕集柱洗脫并在waterscshc181x100mm柱(維持在1℃)上以流速40μl/分鐘分離。

在這些氘交換實驗中，檢測到覆蓋87％的angptl4n端結(jié)構域序列的肽。表9中顯示已檢測的肽和每種肽的氘摻入減少。hdxms繪圖實驗鑒定到angptl4n端結(jié)構域中受neg276和neg318二者明顯保護的三個區(qū)域：氨基酸26-35(g26pvqsksprf35)(seqidno:165)、氨基酸42-68(n42vlahgllqlgqglrehaertrsqlsa68)(seqidno:174)和氨基酸69-95(l69errlsacgsacqtegstdlplapes95)(seqidno:190)。neg276和neg318保護angptl4n端結(jié)構域的多個區(qū)域免于氘摻入的觀察結(jié)果與線性肽表位繪圖結(jié)果一致(參見實施例13)，表明neg276和neg318具有構象表位而非線性表位的。

表9：neg276和neg318結(jié)合對氘摻入人angplt4(26-161)的影響。對于通過質(zhì)譜法檢測的每種肽，顯示相對于僅angptl4的情況，抗體/angptl4復合物的氘摻入(以道爾頓計)減少。

實施例13：通過線性肽結(jié)合的表位繪圖

測試了本發(fā)明所選抗體即neg276和neg318與衍生自人angptl4n末端卷曲螺旋結(jié)構域的線型性15氨基酸肽結(jié)合的能力。使用標準方法合成并純化了總計43種肽；表10中顯示肽的序列。肽固定在玻璃表面上，并且在jptpeptidetechnologies(柏林，德國)，使用為線性肽表位繪圖而優(yōu)化的實驗方法評價neg276和neg318與固定化肽結(jié)合的能力。使用不與angptl4結(jié)合的抗體作為非特異性結(jié)合對照。在這些實驗中未觀察到neg276或neg318與43種15聚肽的任一者特異性結(jié)合。這些結(jié)果有力地提示，neg276和neg318的表位不是線性angptl4肽，而是構象表位。

表10.用于肽結(jié)合實驗的線性angptl4-衍生肽的序列。

實施例14：本發(fā)明的angptl4抗體對人angptl4轉(zhuǎn)基因小鼠中血漿甘油三酯濃度的影響

通過將全長人angptl4cdna序列插入含有人載脂蛋白e基因啟動子和其肝控制區(qū)的plivle6載體的多接頭區(qū)域產(chǎn)生了在小鼠中表達轉(zhuǎn)基因人angptl4的構建體。angptl4轉(zhuǎn)基因小鼠在c57bl/6j背景上產(chǎn)生并且在novartis(easthanover,nj)繁育。轉(zhuǎn)基因小鼠在7日齡剪尾并且使用redextract-n-amp組織pcr試劑盒(sigma-aldrich；st.louis，mo；目錄號xnatr)從尾部提取dna。通過使用靶向plivle6載體和靶向angptl4cdna的引物對，檢測到人angptl4轉(zhuǎn)基因。小鼠在配備自動提供隨意飲水的架上的實底籠中圈養(yǎng)，按12小時光照/黑暗循環(huán)(早6點至晚6點)維持，并且給予標準嚙齒類飼料(harlan-teklad；frederick，md；目錄號8604)。動物飼養(yǎng)室維持在68-76°f之間，濕度30-70％。在研究期間，小鼠與同窩仔鼠一起圈養(yǎng)并且自由接受食物和水，例外是在采集樣品之前禁食4小時。

將動物禁食4小時并且就下頜下采血接受短暫麻醉以測量基線血漿甘油三酯濃度。小鼠隨后用稀釋于pbs中的30mg/kg抗體(10ml/kg注射體積)腹膜內(nèi)注射(i.p.)。在給藥后第1、2和5日4小時禁食后采集血液以測量血漿甘油三酯濃度和人igg總濃度。將血液采集入含edta的bdmicrotainer采集/分離管(becton,dickinson,andcompany；franklinlakes,nj,目錄編號365973)。將樣品在20,817xg離心10分鐘，并將血漿轉(zhuǎn)移至0.2mlthermo排管(thermo-scientific；匹茲堡,pa；目錄號ab0451)并且冷凍并貯存在-80℃。

使用甘油三酯(gpo)液體試劑套裝(pointescientific,canton,mi，目錄編號t7532-500)，測量血漿甘油三酯濃度。簡而言之，將預溫至37℃的300μl分析試劑添加至透明平底96孔板(thermoscientific，目錄編號269620)中的5μl血漿中。將平板在平板搖床上混合30秒并且隨后置于37℃培養(yǎng)箱中5分鐘。在20秒混合后，使用moleculardevicesspectramaxplus讀數(shù)儀測量在500nm的吸光度。通過使用以已知量的甘油三酯標準品(pointescientific，目錄編號t7531-std)生成的標準曲線，計算甘油三酯濃度。

當施用至人angptl4轉(zhuǎn)基因小鼠時，抗體neg276和neg318均降低血漿甘油三酯水平(圖3)。

實施例15：向肥胖、患糖尿病、高甘油三酯血癥食蟹猴施用一種本發(fā)明的angptl4抗體的作用

為了評價neg276-lala的藥代動力學特征和藥理學效應，我們向4個高甘油三酯血癥食蟹猴施用單次皮下3mg/kg劑量。這項研究所用的猴具有207mg/dl至2438mg/dl的基線血漿甘油三酯水平。在neg276-lala給藥后的5周范圍內(nèi)的多個時間點，收集血漿樣品(在清晨飼喂之前從動物抽取血液樣品，但是動物不禁食過夜)。

通過標準方法測定neg276-lala血漿總濃度。neg276-lala在給藥后3天達到平均最大血漿濃度(cmax)15536±2281ng/ml。在給藥后第21天，平均neg276-lala血漿濃度是2663ng/ml(圖4)。

使用市售分析試劑盒測定血漿tg濃度、總膽固醇濃度、高密度脂蛋白(hdl)濃度、膽固醇濃度、總載脂蛋白b(apob)濃度和載脂蛋白ciii(apociii)濃度(tg：甘油三酯(gpo)液體試劑套裝，pointescientific，目錄編號t7532-500；總膽固醇：膽固醇試劑套裝，pointescientific，目錄編號c7510-500；hdl：來自手控hdl試劑盒的膽固醇沉淀試劑，wako，目錄編號431-52501；總apob：k-assayapob，kamiyabiomedicalcompany，目錄編號kai-004；apoc-iii：apoc-iii分析試劑，randox，目錄編號lp-3865)。

neg276-lala施用導致血漿甘油三酯(tg)水平明顯下降。在給藥后第7日觀察到最大血漿tg降低；在這個時間點，血漿tg濃度比基線血漿tg水平低58％。在給藥后第7日出現(xiàn)最大tg降低之后，相對于基線濃度，血漿tg濃度仍受抑制超過40％直至給藥后第21日，隨后返回基線(圖5)。除其對血漿tg的影響之外，相對于基線，neg276-lala施用降低血漿總膽固醇濃度大約30％(圖6)并且在給藥后第7日直至第21日距基線增加hdl膽固醇濃度超過20％(圖7)。此外，在給藥后第7日直至第21日觀察到血漿apob總濃度下降大約30％(圖8)，并且在第7日直至第21日觀察到血漿apoc-iii濃度相對于基線下降大約大約25％(圖9)。我們還通過使用標準大小排阻色譜方法分離脂蛋白組分，評價了neg276-lala施用對脂蛋白相關的甘油三酯水平和膽固醇水平的影響。給藥前(第0日)樣品和給藥后第7日樣品的脂蛋白特征數(shù)據(jù)的比較顯示，neg276-lala施用導致富含甘油三酯的脂蛋白(trl)相關的膽固醇濃度和甘油三酯濃度明顯下降(圖10和圖11中顯示來自一只猴的結(jié)果)。

通過引用方式并入作為參考

本文援引的全部參考文獻，包括專利、專利申請、論文、教材等及其中引用的參考文獻，因而通過引用的方式完整并入本文至它們尚未達到的程度。

等同物

認為前面的書面說明書足以使本領域技術人員實施本發(fā)明成為可能。前面的描述和實施例詳述了本發(fā)明的某些優(yōu)選實施方案并描述了發(fā)明人構思的最佳模式。然而，將理解無論前述內(nèi)容可能在文本上如何詳細出現(xiàn)，本發(fā)明可以按多種方式實施并且本發(fā)明應當根據(jù)所附權利要求書及其任何等同物解釋。