本發(fā)明涉及源于hsp70的肽，更具體而言，涉及通過(guò)與人白血球抗原結(jié)合而向t細(xì)胞呈遞抗原的免疫原性肽、使用所述肽的用于治療或預(yù)防癌癥的醫(yī)藥組合物、免疫誘導(dǎo)劑及抗原呈遞細(xì)胞的制造方法等。

背景技術(shù)：

盡管可認(rèn)為生物體內(nèi)常偶然產(chǎn)生癌細(xì)胞，但推測(cè)認(rèn)為：通常，會(huì)發(fā)生因自然免疫導(dǎo)致的對(duì)源于癌細(xì)胞的特異性癌抗原的排斥反應(yīng)，接著，特異性免疫應(yīng)答被誘導(dǎo)出來(lái)，發(fā)生通過(guò)淋巴細(xì)胞等進(jìn)行的對(duì)癌細(xì)胞的排斥反應(yīng)。

為了使得源于癌細(xì)胞的抗原能被識(shí)別，細(xì)胞表面上存在的人白血球抗原(hla)與淋巴細(xì)胞形成復(fù)合體是必需的。主要組織相容性抗原即hla分子可被大致分類為i類分子(hla-a型、b型、c型)和ii類分子(hla-dp型、dq型、dr型)。細(xì)胞毒性t細(xì)胞(ctl)引起的癌細(xì)胞排斥反應(yīng)是通過(guò)癌細(xì)胞表面的hlai類分子所呈遞的由8～11個(gè)氨基酸組成的癌抗原(ctl表位)被ctl上的t細(xì)胞抗原受體(tcr)特異性識(shí)別而誘導(dǎo)出的。

目前，出于將免疫原性肽應(yīng)用于治療或預(yù)防各種免疫相關(guān)疾病的期望而進(jìn)行了各種研究，例如，日本特開(kāi)平8-151396號(hào)公報(bào)中，記載了由特定氨基酸序列構(gòu)成的寡肽具有hla結(jié)合性。

現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)

專利文獻(xiàn)

專利文獻(xiàn)1：日本特開(kāi)平8-151396號(hào)公報(bào)

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

盡管已知多種具有hla結(jié)合性的肽，但仍有對(duì)可用于對(duì)各種癌癥進(jìn)行治療或預(yù)防的肽的需求。另外，hla是多態(tài)性豐富的基因，因此，對(duì)應(yīng)于多種hla基因型的多型性(multi-type)免疫原性肽也是人們所需要的。

用于解決課題的手段

本發(fā)明是鑒于上述情況而完成的，其目的在于，提供與hlai類分子結(jié)合的免疫原性肽、尤其是能夠誘導(dǎo)ctl的肽、使用所述肽的用于治療或預(yù)防癌癥的醫(yī)藥組合物、免疫誘導(dǎo)劑、及抗原呈遞細(xì)胞的制造方法等。

即，本發(fā)明包含以下的發(fā)明。

(1)一種肽，其含有序列號(hào)1～15中的任一項(xiàng)表示的氨基酸序列中連續(xù)8個(gè)以上的氨基酸殘基，并且，所述肽由11個(gè)以下的氨基酸殘基構(gòu)成。

(2)如(1)所述的肽，其中，所述氨基酸序列中，1個(gè)或多個(gè)氨基酸被取代、插入、缺失或添加，并且，所述肽具有免疫原性。

(3)如(2)所述的肽，其中，所述氨基酸序列中的第2位的氨基酸被酪氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、纈氨酸、亮氨酸或谷氨酰胺取代，以及/或者，c末端的氨基酸被苯丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、色氨酸、甲硫氨酸或纈氨酸取代。

(4)用于治療或預(yù)防癌癥的醫(yī)藥組合物，其含有(1)～(3)中任一項(xiàng)所述的肽。

(5)如(4)所述的醫(yī)藥組合物，所述醫(yī)藥組合物為疫苗的形式。

(6)如(4)或(5)所述的醫(yī)藥組合物，其中，所述肽能夠與1種或多種類型的hla分子結(jié)合。

(7)免疫誘導(dǎo)劑，其含有(1)～(3)中任一項(xiàng)所述的肽。

(8)如(7)所述的免疫誘導(dǎo)劑，用于誘導(dǎo)細(xì)胞毒性t細(xì)胞。

(9)如(7)或(8)所述的免疫誘導(dǎo)劑，其中，所述肽能夠與1種或多種類型的hla分子結(jié)合。

(10)具有ctl誘導(dǎo)活性的抗原呈遞細(xì)胞的制造方法，所述方法包括使(1)～(3)中任一項(xiàng)所述的肽與抗原呈遞細(xì)胞體外(invitro)接觸的工序。

發(fā)明的效果

近年來(lái)，作為癌癥的治療方法，免疫療法備受矚目。本發(fā)明的肽因其hla結(jié)合性高、ctl誘導(dǎo)能力強(qiáng)，因此其作為癌癥疫苗的有用性被高度期待。另外，還預(yù)計(jì)其可應(yīng)用于各種免疫療法、尤其是樹(shù)突細(xì)胞療法中。

熱休克蛋白(hsp，heatshockprotein)家族作為分子伴侶，與蛋白質(zhì)的折疊、運(yùn)輸、修飾、保護(hù)等多種細(xì)胞功能相關(guān)(zugeluandkaufmannsh:roleofheat-shockproteinsinprotectionfromandpathogenesisofinfectiousdiseases.clinmicrobiolrev12:19-39,1999.)。hsp根據(jù)其分子大小而被分類成hsp110、hsp90、hsp70、hsp60、hsp40、hsp28、hsp27及hsp25這8個(gè)家族。進(jìn)一步地，隨著知曉hsp與細(xì)胞死亡(凋亡)相關(guān)，而將其大致上分為抑制凋亡的組和誘導(dǎo)凋亡的組這兩大類。

hsp70是抑制凋亡的熱休克蛋白，已發(fā)現(xiàn)，hsp70的高水平表達(dá)與細(xì)胞在例如細(xì)胞的癌化等各種情況下的生存有關(guān)。實(shí)際上，已有報(bào)道稱作為本發(fā)明的肽的來(lái)源的hsp70蛋白在多種癌癥中表達(dá)。

(例如，

1.yoshidaetal.,anticancerres.2009feb；29(2):539-44

2.cioccadr,clarkgm,tandonak,fuquasa,welchwjandmcguirewl:heat-shockproteinhsp70inpatientswithaxillarylymphnode-negativebreastcancer:prognosticimplications.jnatlcancerinst85:570-574,1993

3.kaurjandralhanr:differentialexpressionof70-kdaheatshockproteininhumanoraltumorigenesis.intjcancer63:774-779,1995

4.parkcs,joois,songsy,kimds,baedsandleejh:animmunohistochemicalanalysisofheat-shockprotein70,p53,andestrogenreceptorstatusincarcinomaoftheuterinecervix.gynecoloncol74:53-60,1999

5.cornfordpa,dodsonar,parsonskf,desmondad,woolfendena,fordhamm,neoptolemosjp,keyandfosterc:heat-shockproteinexpressionindependentlypredictsclinicaloutcomeinprostatecancer.cancerres60:7099-7105,2000

6.maluseckae,zboreka,krzyzowska-grucasandkrawczykz:expressionofheat-shockproteinshsp70andhsp27inprimarynon-smallcelllungcarcinomas.animmunohistochemicalstudy.anticancerres21:1015-1021,2001

7.chumam,sakamotom,yamazakik,ohtat,ohkim,asakamandhirohashis:expressionprofilinginmultistagehepatocarcinogenesis:identificationofhsp70asamolecularmarkerofearlyhepatocellularcarcinoma.hepatology37:198-207,2003

8.castlepe,ashfaqr,ansarifandmullercy:immunohistochemicalevaluationofheat-shockproteinsinnormalandpreinvasivelesionsofthecervix.cancerlett229:245-252,2005

9.kurahashit,miyakeh,haraiandfujisawam:expressionofmajorheat-shockproteinsinprostatecancer:correlationwithclinicopathologicaloutcomesinpatientsundergoingradicalprostatectomy.jurol177:757-761,2007.)

另外，本發(fā)明的肽中，一些特定的肽能夠與多種類型的hla結(jié)合。由此，通過(guò)本發(fā)明的肽，得以提供涵蓋范圍極廣的癌患者群體的癌癥疫苗、樹(shù)突細(xì)胞療法等。

附圖說(shuō)明

圖1示出了用序列號(hào)7、9或15的肽對(duì)來(lái)自接受了hsp70樹(shù)突細(xì)胞療法的肝癌患者(hla基因型：02:01/24:02)的試樣進(jìn)行刺激的情況下的elispot檢驗(yàn)的結(jié)果(ifn-γ產(chǎn)生細(xì)胞數(shù))。

圖2示出了用序列號(hào)7、9或15的肽對(duì)來(lái)自接受了hsp70樹(shù)突細(xì)胞療法的肝癌患者(hla基因型：02:01/33:03)的試樣進(jìn)行刺激的情況下的elispot檢驗(yàn)的結(jié)果(ifn-γ產(chǎn)生細(xì)胞數(shù))。

圖3示出了用序列號(hào)7、9或15的肽對(duì)來(lái)自接受了hsp70樹(shù)突細(xì)胞療法的肝癌患者(hla基因型：02:06/24:02)的試樣進(jìn)行刺激的情況下的elispot檢驗(yàn)的結(jié)果(ifn-γ產(chǎn)生細(xì)胞數(shù))。

圖4示出了用序列號(hào)7、9或15的肽對(duì)來(lái)自接受了hsp70樹(shù)突細(xì)胞療法的肝癌患者(hla基因型：24:02/26:01)的試樣進(jìn)行刺激的情況下的elisa檢驗(yàn)的結(jié)果(ifn-γ產(chǎn)生細(xì)胞數(shù))。

圖5示出了用序列號(hào)5、6、7、9、10或15的肽對(duì)來(lái)自接受了hsp70樹(shù)突細(xì)胞療法的肝癌患者(hla基因型：24:02/26:01)的試樣進(jìn)行刺激的情況下的elisa檢驗(yàn)的結(jié)果(ifn-γ產(chǎn)生細(xì)胞數(shù))。

圖6示出了用序列號(hào)5、6、7、9或10的肽對(duì)來(lái)自接受了hsp70樹(shù)突細(xì)胞療法的肝癌患者(hla基因型：24:02/24:02)的試樣進(jìn)行刺激的情況下的elisa檢驗(yàn)的結(jié)果(ifn-γ產(chǎn)生細(xì)胞數(shù))。

具體實(shí)施方式

1.免疫原性肽

本發(fā)明涉及的肽含有序列號(hào)1～15中的任一項(xiàng)表示的氨基酸序列中連續(xù)8個(gè)以上的氨基酸殘基，并且，由總共11個(gè)以下、優(yōu)選為10個(gè)以下、更優(yōu)選為9個(gè)以下的氨基酸殘基構(gòu)成。本發(fā)明的肽可以是由序列號(hào)1～15中的任一項(xiàng)表示的氨基酸序列構(gòu)成的肽。本發(fā)明的肽源于作為熱休克蛋白(heatshockprotein)之一的hsp70。基于構(gòu)成hsp70的氨基酸序列通過(guò)使用主動(dòng)學(xué)習(xí)實(shí)驗(yàn)法(activelearningexperiment)(日本特開(kāi)平8-151396號(hào))得到的假定理論預(yù)測(cè)的與hla分子的結(jié)合性換算為-logkd值為3以上的氨基酸序列被選出。

構(gòu)成本發(fā)明的肽的氨基酸序列及它們的hla預(yù)測(cè)結(jié)合分值示于下表1。

[表1]

本發(fā)明的肽具有hla結(jié)合性，且具有免疫原性(后文中有時(shí)簡(jiǎn)稱為“hla肽”或“免疫原性肽”)。在本說(shuō)明書(shū)中使用時(shí)，“免疫原性”表示能夠誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的特性，例如，具有ctl誘導(dǎo)活性、從而具有對(duì)癌細(xì)胞的細(xì)胞損傷活性。

在優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的肽是能夠與hla-a基因a的等位基因型中的多種結(jié)合的多型性hla肽。例如，序列號(hào)7的肽能與hla-a＊24:02基因的產(chǎn)物(hla-a＊24:02分子)、hla-a＊0201基因的產(chǎn)物(hla-a＊02:01分子)及hla-a＊02:06基因的產(chǎn)物(hla-a＊02:06分子)牢固地結(jié)合，并且具有高的免疫原性。

本發(fā)明的肽能夠結(jié)合的hla亞型不限于hla-a＊24:02、hla-a＊02:01及hla-a＊02:06。然而，鑒于上述hla亞型已涵蓋了東亞人群(包括日本人)的85％左右、及西方人群的55％左右，因此，可認(rèn)為本發(fā)明的多型性hla肽在免疫療法等中具有廣泛的患者覆蓋率。

對(duì)于本發(fā)明的肽而言，只要保持免疫原性，構(gòu)成序列號(hào)1～15的氨基酸序列的氨基酸殘基或其一部分也可以是經(jīng)修飾的。盡管以序列號(hào)1～15所示的氨基酸序列來(lái)表現(xiàn)在抗原呈遞細(xì)胞上呈遞的狀態(tài)，但在將本發(fā)明的肽直接施予至體內(nèi)的情況下，有可能因施予途徑而導(dǎo)致肽經(jīng)歷在消化器官等中其末端被消化等變化。因此，本發(fā)明的肽在被抗原呈遞細(xì)胞攝入之前也可以以在n末端及/或c末端添加有1個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基等的前體的狀態(tài)存在，從而使得其在抗原呈遞細(xì)胞上與規(guī)定的hlai類分子結(jié)合時(shí)得以保持序列號(hào)1～15表示的氨基酸殘基。

進(jìn)一步地，本發(fā)明的肽只要具有所期望的免疫原性即可，構(gòu)成本發(fā)明的肽的1個(gè)或多個(gè)的氨基酸殘基可被取代、插入、缺失或添加，以及/或者，經(jīng)糖鏈添加、側(cè)鏈氧化、及/或磷酸化等修飾。本說(shuō)明書(shū)中，“氨基酸”取其最為寬泛的含義，除了天然氨基酸以外，也包含人工的氨基酸突變體、衍生物。本說(shuō)明書(shū)中，就氨基酸而言，可舉出天然蛋白質(zhì)性的l-氨基酸；d-氨基酸；氨基酸突變體及衍生物等經(jīng)過(guò)化學(xué)修飾的氨基酸；正亮氨酸、β-丙氨酸、鳥(niǎo)氨酸等的天然非蛋白質(zhì)性氨基酸；及具有本領(lǐng)域中已知的作為氨基酸特征的特性的以化學(xué)方式合成的化合物等。作為非天然氨基酸的例子，可舉出α-甲基氨基酸(α-甲基丙氨酸等)、d-氨基酸、類組氨酸的氨基酸(β-羥基-組氨酸、高組氨酸、α-氟甲基-組氨酸及α-甲基-組氨酸等)、在側(cè)鏈具有額外亞甲基的氨基酸(“高(homo)”氨基酸)及側(cè)鏈中的羧酸官能團(tuán)被磺酸基取代的氨基酸(半胱氨酸等)。

關(guān)于氨基酸殘基的取代等，本領(lǐng)域技術(shù)人員在考慮到對(duì)hla顯示出結(jié)合性的肽序列的規(guī)則性(j.immunol.,152:p3913,1994；immunogenetics,41:p178,1995；j.immunol.,155:p4307,1994)的基礎(chǔ)上，可以以合適的方式對(duì)構(gòu)成本發(fā)明的肽的氨基酸殘基進(jìn)行取代。

更具體而言，對(duì)于與hla-a＊24:02分子結(jié)合的肽而言，構(gòu)成肽的第2位氨基酸可被酪氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸或色氨酸取代，以及/或者，c末端的氨基酸可被苯丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、色氨酸或甲硫氨酸取代。另外，對(duì)于與hla-a＊02:01分子結(jié)合的肽而言，第2位氨基酸可被亮氨酸或甲硫氨酸取代，以及/或者c末端的氨基酸可被纈氨酸或亮氨酸取代。此外，對(duì)于與hla-a＊02:06分子結(jié)合的肽而言，第2位氨基酸可被纈氨酸或谷氨酰胺取代，并且/或者c末端的氨基酸可被纈氨酸或亮氨酸取代。

本發(fā)明的肽均可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法來(lái)制造。例如，可利用fmoc法、tboc法等固相法或液相法進(jìn)行人工合成。另外，也可通過(guò)使編碼本發(fā)明的肽的多核苷酸或含有該多核苷酸的重組載體表達(dá)來(lái)制造所期望的肽。另外，這樣得到的肽均可使用領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法來(lái)鑒定。例如，可使用edman降解法、質(zhì)譜法等進(jìn)行鑒定。

2.醫(yī)藥組合物

本發(fā)明涉及的用于治療或預(yù)防癌癥的醫(yī)藥組合物中，含有例如下述的肽作為有效成分，所述肽含有選自由序列號(hào)1～15組成的組中的1種以上氨基酸序列中連續(xù)8個(gè)以上的氨基酸殘基，并且由總共11個(gè)以下、優(yōu)選為10個(gè)以下、更優(yōu)選為9個(gè)以下的氨基酸殘基構(gòu)成。醫(yī)藥組合物中含有的肽也可以是由序列號(hào)1～15中的任一項(xiàng)表示的氨基酸序列構(gòu)成的。所述肽如上文所定義。

本發(fā)明的肽通過(guò)被呈遞于抗原呈遞細(xì)胞上而誘導(dǎo)ctl，該被誘導(dǎo)的ctl殺傷癌細(xì)胞。因此，本發(fā)明的醫(yī)藥組合物中的有效成分不僅限于本發(fā)明的肽，也可以是能夠直接或間接誘導(dǎo)ctl的成分、例如編碼該肽的多核苷酸或者含有所述多核苷酸的載體、或?qū)⒃撾呐chla分子的復(fù)合體呈遞至表面的抗原呈遞細(xì)胞或由抗原呈遞細(xì)胞分泌的外來(lái)體(exosome)、或它們的組合。作為使用的抗原呈遞細(xì)胞，可舉出巨噬細(xì)胞、樹(shù)突細(xì)胞等，優(yōu)選使用ctl誘導(dǎo)能力高的樹(shù)突細(xì)胞。本發(fā)明的醫(yī)藥組合物中也可含有已知用于癌癥治療的其他成分、例如趨化因子、細(xì)胞因子、腫瘤壞死因子、化療劑等。對(duì)于肽的用量而言，例如，患者為成年人的情況下，可以為每天約1～10mg。但是，鑒于用量可能因患者的年齡、體重、施予方法等而變動(dòng)，因此，其可由本領(lǐng)域技術(shù)人員適當(dāng)決定。

認(rèn)為本發(fā)明的醫(yī)藥組合物通過(guò)下述作用機(jī)理而在癌細(xì)胞的殺傷等方面有用(但這并非意圖對(duì)本發(fā)明進(jìn)行限定)：通過(guò)向特定的癌患者施予本發(fā)明的醫(yī)藥組合物，醫(yī)藥組合物中的肽以與hla分子結(jié)合的狀態(tài)被呈遞至抗原呈遞細(xì)胞表面。這樣的抗原呈遞細(xì)胞上的肽被識(shí)別后，ctl活化、增殖并進(jìn)入全身循環(huán)。肽特異性的ctl侵入癌組織后，會(huì)識(shí)別與位于癌細(xì)胞的表面hla分子本來(lái)自然結(jié)合的源于特異性癌抗原的同樣的肽，從而殺傷該癌細(xì)胞。通過(guò)這樣的機(jī)理而能夠有助于對(duì)癌癥的治療。

除了對(duì)癌癥的治療以外，本發(fā)明的醫(yī)藥組合物也可用于對(duì)癌癥的預(yù)防。例如，通過(guò)將本發(fā)明的醫(yī)藥組合物施予至健康的人體，可誘導(dǎo)出ctl，誘導(dǎo)出的細(xì)胞毒性t細(xì)胞在體內(nèi)蓄積，從而能夠在特定癌細(xì)胞產(chǎn)生時(shí)損傷該癌細(xì)胞。同樣地，通過(guò)施予至癌癥治療后的人體，也可預(yù)防癌癥的復(fù)發(fā)。

作為治療或預(yù)防的癌癥，預(yù)計(jì)為表達(dá)hsp70的任何癌癥?？筛唧w地，胰腺癌、肝細(xì)胞癌、前列腺癌、肺癌、乳癌、大腸癌、血液癌、腦腫瘤、腎癌、皮膚癌等可作為對(duì)象被舉出(但這并非意圖對(duì)本發(fā)明進(jìn)行限定)。例如，作為本發(fā)明的肽的來(lái)源的hsp70在肝細(xì)胞癌中過(guò)量表達(dá)，因此，可認(rèn)為本發(fā)明的肽尤其對(duì)于肝細(xì)胞癌癥的治療或預(yù)防有效。存在有多種需要治療或預(yù)防的癌癥的情況下，可以在本發(fā)明的醫(yī)藥組合物中含有多種免疫原性肽等有效成分。

本發(fā)明的醫(yī)藥組合物可被溶解于水溶性溶劑、以制藥上允許的鹽的形式制劑化之后施予至患者。作為這樣的制藥上允許的鹽的形式，可舉出以生理上可接受的水溶性鹽(例如鈉、鉀、鎂、鈣等鹽)的形式緩沖為生理ph值的形式。另外，除了水溶性溶劑以外，也可使用非水溶性溶劑，作為這樣的非水溶性溶劑，例如，可舉出乙醇、丙二醇等醇。

另外，在包含本實(shí)施方式的醫(yī)藥組合物的制劑中，可包含針對(duì)各種目的的藥物，作為這樣的藥物，可舉出例如防腐劑、緩沖劑等。作為防腐劑，可舉出重亞硫酸鈉、重硫酸鈉、硫代硫酸鈉、苯扎氯銨、氯丁醇、硫柳汞(thimerosal)、乙酸苯汞、硝酸苯汞、對(duì)羥基苯甲酸甲酯、聚乙烯醇、苯乙醇、氨、二硫代蘇糖醇、β-巰基乙醇等。另外，作為緩沖劑，可舉出碳酸鈉、硼酸鈉、磷酸鈉、乙酸鈉、重碳酸鈉等。這些試劑可以以能夠?qū)Ⅲw系ph維持在2～9、優(yōu)選為4～8之間的量存在。

對(duì)本發(fā)明的醫(yī)藥組合物的劑型也沒(méi)有特別限制，在作為疫苗的形式使用的情況下，對(duì)其劑型可例示注射劑(肌肉、皮下、皮內(nèi))、口服制劑、滴鼻制劑等。本發(fā)明的醫(yī)藥組合物為疫苗的形式時(shí)，也可以是含有多種有效成分的混合雞尾酒式疫苗(cocktailvacine)。例如，這樣的疫苗可含有序列號(hào)1～15表示的肽中的任選2種以上，或可與其他有效成分組合而含有多種有效成分。

另外，本發(fā)明的疫苗也可以是含有下述非活性成分的疫苗，所述非活性成分是醫(yī)藥組合物以外的成分，其自身不具有活性，但具有進(jìn)一步提高醫(yī)藥組合物的作為疫苗的效果。作為非活性成分，可舉出佐劑、類毒素等。作為佐劑的例子，可舉出氫氧化鋁、磷酸鋁、磷酸鈣等沉降性類型的佐劑，弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑等的油性類型的佐劑(但這并非意圖對(duì)本發(fā)明進(jìn)行限定)。

本發(fā)明的醫(yī)藥組合物以疫苗的形式存在時(shí)，優(yōu)選地，通過(guò)基于皮內(nèi)、皮下、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)施予等的注射或注入，或通過(guò)自皮膚、或鼻腔、咽喉等的粘膜吸收等而施予至體內(nèi)。其單次施予量可被設(shè)定為從能夠顯著地誘導(dǎo)細(xì)胞毒性t細(xì)胞的量到顯著數(shù)量的非癌細(xì)胞不受到損害的量之間。

本發(fā)明的醫(yī)藥組合物不僅可向人體施予，將其在體外使用也在本發(fā)明的意圖之內(nèi)。更具體而言，本發(fā)明的醫(yī)藥組合物也可用于對(duì)抗原呈遞細(xì)胞進(jìn)行體外或離體(exvivo)刺激來(lái)增強(qiáng)ctl誘導(dǎo)活性。例如，以用于癌癥的樹(shù)突細(xì)胞療法的情況為例進(jìn)行說(shuō)明，可使本發(fā)明的醫(yī)藥組合物與來(lái)自于需要癌癥的治療或預(yù)防的患者的樹(shù)突細(xì)胞等抗原呈遞細(xì)胞預(yù)先進(jìn)行接觸，然后將該抗原呈遞細(xì)胞輸回至患者的體內(nèi)，由此施予至患者?？衫美缰|(zhì)體轉(zhuǎn)染法、注射法等將醫(yī)藥組合物中含有的肽導(dǎo)入至抗原呈遞細(xì)胞內(nèi)。在上述用途中使用編碼本發(fā)明的肽的多核苷酸時(shí)，可利用本領(lǐng)域已知的方法將多核苷酸導(dǎo)入至抗原呈遞細(xì)胞。例如，也可利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法、電穿孔法、顯微注射法、細(xì)胞融合法、deae葡聚糖法、磷酸鈣法等，使用對(duì)象多核苷酸或編碼多核苷酸的載體對(duì)來(lái)自患者的抗原呈遞細(xì)胞進(jìn)行體外轉(zhuǎn)化等。

3.免疫誘導(dǎo)劑

本發(fā)明涉及的免疫誘導(dǎo)劑中，作為有效成分，含有例如下述的肽，所述的肽含有選自由序列號(hào)1～15組成的組中的1種以上氨基酸序列中連續(xù)8個(gè)以上的氨基酸殘基，并且由總共11個(gè)以下、優(yōu)選為10個(gè)以下、更優(yōu)選為9個(gè)以下的氨基酸殘基構(gòu)成。免疫誘導(dǎo)劑中含有的肽也可以是由序列號(hào)1～15中的任一項(xiàng)表示的氨基酸序列構(gòu)成的。所述肽如上文所定義。

可以認(rèn)為，本發(fā)明的肽通過(guò)在抗原呈遞細(xì)胞上被呈遞而誘導(dǎo)免疫。因此，本發(fā)明的免疫誘導(dǎo)劑的有效成分不僅限于本發(fā)明的肽，也可以是能夠直接或間接地進(jìn)行誘導(dǎo)的成分，例如編碼本發(fā)明的肽的多核苷酸或者含有所述多核苷酸的表達(dá)載體、或?qū)⒃撾呐chla分子的復(fù)合體呈遞至表面的抗原呈遞細(xì)胞或由抗原呈遞細(xì)胞分泌的外來(lái)體、或它們的組合。作為使用的抗原呈遞細(xì)胞，可舉出巨噬細(xì)胞、樹(shù)突細(xì)胞等，優(yōu)選使用ctl誘導(dǎo)能力高的樹(shù)突細(xì)胞。

本發(fā)明的免疫誘導(dǎo)劑不僅可向人體施予，將其在體外使用也在本發(fā)明的意圖之內(nèi)。更具體而言，本發(fā)明的醫(yī)藥組合物也可用于對(duì)抗原呈遞細(xì)胞進(jìn)行體外或離體刺激來(lái)增強(qiáng)ctl誘導(dǎo)活性。例如，以用于樹(shù)突細(xì)胞療法的情況為例進(jìn)行說(shuō)明，可使本發(fā)明的免疫誘導(dǎo)劑與來(lái)自于需要癌癥的治療或預(yù)防的患者的樹(shù)突細(xì)胞等抗原呈遞細(xì)胞預(yù)先進(jìn)行接觸，然后將該抗原呈遞細(xì)胞輸回至患者的體內(nèi)，由此施予至患者?？衫美缃橛芍|(zhì)體的轉(zhuǎn)染(脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法)、注射法等將免疫誘導(dǎo)劑中含有的肽導(dǎo)入至抗原呈遞細(xì)胞內(nèi)。在上述用途中使用編碼本發(fā)明的肽的多核苷酸時(shí)，可利用本領(lǐng)域已知的方法將多核苷酸導(dǎo)入至抗原呈遞細(xì)胞。例如，也可利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法、電穿孔法、顯微注射法、細(xì)胞融合法、deae葡聚糖法、磷酸鈣法等，使用對(duì)象多核苷酸或表達(dá)多核苷酸的載體對(duì)來(lái)自患者的抗原呈遞細(xì)胞進(jìn)行體外轉(zhuǎn)化等。

在本說(shuō)明書(shū)中使用時(shí)，“免疫誘導(dǎo)”表示：誘導(dǎo)免疫反應(yīng)，例如增強(qiáng)抗原呈遞細(xì)胞的ctl誘導(dǎo)活性、進(jìn)而使ctl對(duì)癌細(xì)胞的細(xì)胞損傷活性增強(qiáng)。以及，在本說(shuō)明書(shū)中使用時(shí)，“ctl誘導(dǎo)”表示以下過(guò)程：在體外或體內(nèi)，通過(guò)將本發(fā)明的肽呈遞至抗原呈遞細(xì)胞表面上來(lái)誘導(dǎo)特異性識(shí)別某種抗原的ctl或使其增殖，或使幼稚t細(xì)胞分化為具有殺傷癌細(xì)胞等靶細(xì)胞的能力(細(xì)胞損傷活性)的效應(yīng)器細(xì)胞，以及/或者使ctl的細(xì)胞損傷活性增強(qiáng)。ctl誘導(dǎo)活性可通過(guò)對(duì)ctl導(dǎo)致的細(xì)胞因子(例如干擾素(ifn)-γ)的產(chǎn)生進(jìn)行評(píng)價(jià)來(lái)測(cè)定。例如，也可使用elispot(酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)，enzyme-linkedimmunospot)等已知的高感度免疫檢驗(yàn)，對(duì)通過(guò)經(jīng)本發(fā)明的肽刺激的末梢血單核細(xì)胞等抗原呈遞細(xì)胞從前體細(xì)胞誘導(dǎo)出的細(xì)胞因子產(chǎn)生細(xì)胞的增加加以評(píng)價(jià)，來(lái)測(cè)定ctl誘導(dǎo)活性。細(xì)胞損傷活性還可利用⁵¹cr游離法等已知方法進(jìn)行測(cè)定。上述活性與對(duì)照相比顯著地增加、例如增加5％以上、10％以上、20％以上、優(yōu)選為50％以上的情況下，可評(píng)價(jià)為免疫或ctl被誘導(dǎo)。

4.抗原呈遞細(xì)胞的制造方法

本發(fā)明涉及的抗原呈遞細(xì)胞的制造方法包括將例如下述的肽與抗原呈遞細(xì)在體外接觸的工序，所述的肽含有選自由序列號(hào)1～15組成的組中的1種以上氨基酸序列中連續(xù)8個(gè)以上的氨基酸殘基，并且由總共11個(gè)以下、優(yōu)選為10個(gè)以下、更優(yōu)選為9個(gè)以下的氨基酸殘基構(gòu)成的肽。本發(fā)明的制造方法中使用的肽也可以是由序列號(hào)1～15中的任一項(xiàng)表示的氨基酸序列構(gòu)成的。所述的肽如上文所定義。

可以認(rèn)為，本發(fā)明的制造方法中使用的肽與抗原呈遞細(xì)胞表面的hlai類分子結(jié)合，作為抗原肽被呈遞給ctl，由此誘導(dǎo)抗原呈遞細(xì)胞的ctl活性。因此，與抗原呈遞細(xì)胞接觸的不僅限于本發(fā)明的肽，也可以是能夠直接或間接誘導(dǎo)ctl的成分，例如編碼該肽的多核苷酸或者含有所述多核苷酸的載體、或?qū)⒃撾呐chla分子的復(fù)合體呈遞至表面的抗原呈遞細(xì)胞或由抗原呈遞細(xì)胞分泌的外來(lái)體(exosome)、或它們的組合。作為使用的抗原呈遞細(xì)胞，可舉出巨噬細(xì)胞、樹(shù)突細(xì)胞等，優(yōu)選使用ctl誘導(dǎo)能力高的樹(shù)突細(xì)胞。

通過(guò)本發(fā)明的制造方法制造的抗原呈遞細(xì)胞不僅可作為上述醫(yī)藥組合物或免疫誘導(dǎo)劑的有效成分使用，將其用于免疫療法等也在本發(fā)明的意圖之內(nèi)。例如，以用于癌癥的樹(shù)突細(xì)胞療法的情況為例進(jìn)行說(shuō)明，可將制造的抗原呈遞細(xì)胞與來(lái)自于需要免疫誘導(dǎo)的患者的、ctl誘導(dǎo)能力低的樹(shù)突細(xì)胞等抗原呈遞細(xì)胞預(yù)先進(jìn)行接觸，然后將該抗原呈遞細(xì)胞輸回患者的體內(nèi)，由此施予至患者?？衫美缃橛芍|(zhì)體的轉(zhuǎn)染(脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法)、注射法等將本發(fā)明的肽導(dǎo)入至抗原呈遞細(xì)胞內(nèi)。在上述用途中使用編碼本發(fā)明的肽的多核苷酸時(shí)，可利用本領(lǐng)域已知的方法將多核苷酸導(dǎo)入至抗原呈遞細(xì)胞。例如，也可利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法、電穿孔法、顯微注射法、細(xì)胞融合法、deae葡聚糖法、磷酸鈣法等，使用對(duì)象多核苷酸或編碼多核苷酸的載體對(duì)來(lái)自患者的抗原呈遞細(xì)胞進(jìn)行體外轉(zhuǎn)化等。

實(shí)施例1

以下，舉出實(shí)施例更具體地說(shuō)明本發(fā)明，但本發(fā)明不限于這些實(shí)施例。

具體而言，本實(shí)施例中的預(yù)測(cè)·實(shí)驗(yàn)·評(píng)價(jià)的步驟基于國(guó)際公開(kāi)2006/004182號(hào)小冊(cè)子中記載的主動(dòng)學(xué)習(xí)實(shí)驗(yàn)計(jì)劃進(jìn)行，并創(chuàng)建了將以下步驟作為整體重復(fù)的規(guī)則。

(1)試行一次下文所述的低階學(xué)習(xí)算法(lowranklearningalgorithm)。即，從對(duì)累積數(shù)據(jù)的隨機(jī)重復(fù)取樣產(chǎn)生多種假定理論，將隨機(jī)產(chǎn)生的備選查詢點(diǎn)(肽)的預(yù)測(cè)值分散最大的點(diǎn)選用為應(yīng)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的查詢點(diǎn)。

(2)利用后述的合成·純化方法對(duì)作為選用的查詢點(diǎn)的肽加以制造，利用后述的實(shí)驗(yàn)測(cè)定實(shí)際的結(jié)合能力，加入進(jìn)累積數(shù)據(jù)中。

通過(guò)進(jìn)行這樣的主動(dòng)學(xué)習(xí)法，對(duì)于由9個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的肽而言，原本共需要進(jìn)行5000億(＝20⁹)次以上的備選hla結(jié)合性肽的結(jié)合實(shí)驗(yàn)的數(shù)量得以被削減。

通過(guò)上文說(shuō)明的規(guī)則，抽選出了序列號(hào)1～15所示的氨基酸序列。

<肽合成和純化>

使用fmoc氨基酸、通過(guò)merrifield的固相法對(duì)具有序列號(hào)1～15的氨基酸序列的肽進(jìn)行人工合成。在去保護(hù)之后，使用c18色譜柱實(shí)施反相hplc純化，使得純度達(dá)到95％以上。肽的鑒定和純度的確通過(guò)maldi-tof質(zhì)譜法來(lái)進(jìn)行(absciexmaldi-tof/tof5800)。以bsa作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，通過(guò)microbca檢驗(yàn)(thermoscienftific公司)來(lái)確定肽的量。

<肽與hla-a＊24:02分子的結(jié)合實(shí)驗(yàn)>

使用表達(dá)hla-a＊24:02分子的c1r-a24細(xì)胞(所述細(xì)胞是熊本大學(xué)滝口雅文教授制備的，在得到許可后由愛(ài)媛大學(xué)安川正貴助理教授提供)，對(duì)肽結(jié)合至與hla-a＊24:02分子(其為hla-a＊24:02基因的產(chǎn)物)的能力進(jìn)行測(cè)定。

首先，將c1r-a24細(xì)胞在ph3.3的酸性條件下暴露30秒，原本與hla-a＊24:02分子結(jié)合的內(nèi)源性肽以及與hlai類分子共通締合的輕鏈β2m被解離、除去。進(jìn)行中和后，向c1r-a24細(xì)胞添加純化的β2m，并將細(xì)胞添加至肽的稀釋系列中，在冰上孵育4小時(shí)。使用識(shí)別此期間重新締合的hla-a＊24:02分子、肽、β2m這三者的締合物(mhc-pep)的經(jīng)熒光標(biāo)記的單克隆抗體17a12進(jìn)行染色。

然后，使用熒光細(xì)胞分析裝置facscan(becton-dickinson公司)對(duì)相對(duì)每個(gè)c1r-a24細(xì)胞的mhc-pep量(與上述熒光抗體的熒光強(qiáng)度成比例)進(jìn)行定量測(cè)定。使用本申請(qǐng)的發(fā)明人發(fā)表于論文(udakaetal.,immunogenetics,51,816-828,2000)中的方法，從相對(duì)每個(gè)細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度計(jì)算出hla-a＊24:02分子與肽之間的結(jié)合解離常數(shù)kd值。

<肽與hla-a＊02:01分子的結(jié)合實(shí)驗(yàn)>

使用表達(dá)hla-a＊02:01分子的細(xì)胞株t2(購(gòu)自atcc)，對(duì)肽結(jié)合至hla-a＊02:01分子(其為hla-a＊02:01基因的產(chǎn)物)的能力進(jìn)行測(cè)定。

向?qū)⒁獪y(cè)定結(jié)合能力的肽的階段(stepwise)稀釋系列中添加t2細(xì)胞和純化的β2m，然后于37℃孵育4小時(shí)。使用締合型特異性熒光標(biāo)記單克隆抗體bb7.2，對(duì)表達(dá)量在直至該時(shí)間點(diǎn)以肽濃度依賴性方式增加的hla-a＊02:01分子進(jìn)行染色。

然后，使用流式細(xì)胞儀對(duì)相對(duì)每個(gè)細(xì)胞的熒光量進(jìn)行測(cè)定，通過(guò)本申請(qǐng)的發(fā)明人發(fā)表于論文(udakaetal.,immunogenetics,51,816-828,2000)中的方法計(jì)算出解離常數(shù)kd值。

<肽與hla-a＊02：06分子的結(jié)合實(shí)驗(yàn)>

使用向rmas(小鼠tap(抗原加工相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)體，transporterassociatedwithantigenprocessing)缺陷細(xì)胞株)中導(dǎo)入hla-a＊02:06基因的cdna而得到的ra2.6細(xì)胞(高知大學(xué)新制備的細(xì)胞株)，對(duì)肽結(jié)合至hla-a＊02:06分子(其為hla-a＊02:06基因的產(chǎn)物)的結(jié)合能力進(jìn)行測(cè)定。

首先，將ra2.6細(xì)胞于26℃過(guò)夜培養(yǎng)，未與肽結(jié)合的hla-a＊02:06分子在細(xì)胞表面蓄積后，向其中添加肽的稀釋系列，于26℃進(jìn)行60分鐘的結(jié)合。

然后，通過(guò)于35℃培養(yǎng)4小時(shí)，使得未結(jié)合肽的空hla-a＊02:06分子變性，喪失立體結(jié)構(gòu)。向其中添加特異性識(shí)別肽結(jié)合型hla-a＊02:06分子的經(jīng)熒光標(biāo)記的單克隆抗體bb7.2，在冰上孵育20分鐘，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色。

然后，使用流式細(xì)胞儀測(cè)定每個(gè)細(xì)胞的熒光量，通過(guò)本申請(qǐng)的發(fā)明人發(fā)表于論文(udakaetal.,immunogenetics,51,816-828,2000)中的方法計(jì)算出解離常數(shù)kd值。

<結(jié)合實(shí)驗(yàn)的評(píng)價(jià)結(jié)果>

結(jié)果，獲得了下表中所示的本發(fā)明的肽對(duì)各hla分子的結(jié)合實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

[表2]

需要說(shuō)明的是，序列號(hào)1～15的氨基酸序列源于序列號(hào)16所示的hsp70的規(guī)定的基因組蛋白質(zhì)全長(zhǎng)序列。

＜肽免疫誘導(dǎo)試驗(yàn)＞

(1)肽刺激樹(shù)突細(xì)胞的制備

·第0～9天(樹(shù)突細(xì)胞的誘導(dǎo))

通過(guò)白細(xì)胞分離術(shù)(leukapheresismethod)從自肝細(xì)胞癌患者采集的末梢血分離出單核細(xì)胞。將分離的單核細(xì)胞在添加了800u/ml的gm-csf及500u/ml的il-4的條件下培養(yǎng)6天。向培養(yǎng)液中進(jìn)一步添加300u/ml的tnf-α，培養(yǎng)4天，誘導(dǎo)成熟樹(shù)突細(xì)胞。然后，使用電穿孔法導(dǎo)入hsp70mrna，制作呈遞有源于hsp70的抗原肽的樹(shù)突細(xì)胞。

向上述肝細(xì)胞癌患者的大腿部通過(guò)皮內(nèi)注射施予1×10⁷個(gè)或2×10⁷個(gè)或3×10⁷個(gè)的導(dǎo)入了hsp70mrna的樹(shù)突細(xì)胞(hsp70-樹(shù)突細(xì)胞)(hsp70樹(shù)突細(xì)胞療法)。每3周重復(fù)進(jìn)行以相同方法制備的hsp70-樹(shù)突細(xì)胞的皮內(nèi)施予。將通過(guò)分離術(shù)(pheresis)從已接受2次以上hsp70樹(shù)突細(xì)胞療法治療的肝癌患者得到的末梢血單核細(xì)胞中粘附于培養(yǎng)燒瓶的細(xì)胞組分在aim-cm培養(yǎng)基(gibco公司制)中于37℃培養(yǎng)10天。在培養(yǎng)期間，分別在第0天及第3天向培養(yǎng)基中添加15μl的il-4和30μl粒細(xì)胞單核細(xì)胞集落刺激因子(gm-csf)，并在第5天添加15μl的il-4、30μl的gm-csf、75μl腫瘤壞死因子(tnf)-α。

·第10天(肽刺激及樹(shù)突細(xì)胞的回收)

將從單核細(xì)胞誘導(dǎo)的樹(shù)突細(xì)胞重新回收至aim-cm培養(yǎng)基中，添加本發(fā)明的肽(序列號(hào)5、6、7、9、10、15)，使得肽濃度為20μg/ml。然后，將含有樹(shù)突細(xì)胞的培養(yǎng)基于37℃培養(yǎng)2小時(shí)。作為陽(yáng)性對(duì)照及陰性對(duì)照，使用了以下的肽。

hla-a24:02用陽(yáng)性對(duì)照(ebvlmp2,419-427:tygpvfmcl(序列號(hào)17))

hla-a24:02用陰性對(duì)照(hivenvgp160,584-592:rylrdqqll(序列號(hào)18))

hla-a02:01用陽(yáng)性對(duì)照(fluamp,58-66:gilgfvftl(序列號(hào)19))

hla-a02:01用陰性對(duì)照(hivgapp17,77-85:slyntvatl(序列號(hào)20))

hla-a02:06用陽(yáng)性對(duì)照(ebvlmp2453-461:ltagflifl(序列號(hào)21))

hla-a02:06用陰性對(duì)照(hivgapp24341-349:atleemmta(序列號(hào)22))

回收樹(shù)突細(xì)胞，使用足量的aim-cm培養(yǎng)基洗滌3次以上，然后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

(2)cd8t細(xì)胞的制備

·第0～9天

將通過(guò)分離術(shù)從接受2次以上hsp70樹(shù)突細(xì)胞療法的治療后的肝癌患者得到的末梢血單核細(xì)胞中未粘附于培養(yǎng)燒瓶的懸浮細(xì)胞組分(包含淋巴細(xì)胞)在aim-cm培養(yǎng)基(gibco公司制)中于37℃培養(yǎng)10天。在培養(yǎng)期間，分別在第4天及第6天向培養(yǎng)基中添加40μl的il-2。

·第10天

使用cd8陰性選擇試劑盒(negativeselectionkit)(miltenyi公司制)從培養(yǎng)基中分離cd8t細(xì)胞，并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

(3)共培養(yǎng)

在下述條件下，將上述(1)及(2)中得到的樹(shù)突細(xì)胞和cd8t細(xì)胞在aim培養(yǎng)基中于37℃共培養(yǎng)。

·cd8t細(xì)胞：5×10⁵個(gè)細(xì)胞/孔

·樹(shù)突細(xì)胞：2×10⁵個(gè)細(xì)胞/孔

·第12或第13天

向上述培養(yǎng)基中以0.4ml/孔添加含有20u/ml的il-2的aim-cm培養(yǎng)基。

(4)elispot檢驗(yàn)

·第17天

向涂覆有抗ifn-γ單克隆抗體(mabtech公司制)的elispot用96孔培養(yǎng)板(millipore公司制)中以每孔為2×10⁴個(gè)細(xì)胞/孔的方式添加上述cd8t細(xì)胞。對(duì)于各試樣，使用3個(gè)孔以上。向各孔中添加100μl的aim-v(gibco公司制)。于37℃對(duì)elispot用96孔培養(yǎng)板進(jìn)行培養(yǎng)。

·第18天

向各孔中添加抗ifn-γ抗體，再使hrp酶標(biāo)記的二抗與其反應(yīng)，利用呈色反應(yīng)測(cè)定ifn-γ產(chǎn)生細(xì)胞的數(shù)量。作為代表性的elispot檢驗(yàn)結(jié)果，hla基因型為02:01/24:02的患者的結(jié)果示于圖1，hla基因型為02:01/33:03的患者的結(jié)果示于圖2，以及，hla基因型為02:06/24:02的患者的結(jié)果示于圖3。各圖中，示出了5次結(jié)果的平均值。

(5)elisa檢驗(yàn)

·第17天

在對(duì)t細(xì)胞和以上述肽進(jìn)行了沖擊的樹(shù)突細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)的第7天，將培養(yǎng)上清液稀釋為×1、×5、×25、×1254個(gè)階段，使用humanifn-γelisamaxdeluxeset(biolegend公司制)，對(duì)測(cè)定限度內(nèi)的稀釋階段進(jìn)行鑒定。然后，在鑒定出的稀釋階段，針對(duì)各試樣分別進(jìn)行3次測(cè)定。作為代表性的elisa檢驗(yàn)結(jié)果，hla基因型為24:02/26:01的患者的結(jié)果示于圖4及圖5，以及，24:02/24:02的患者的結(jié)果示于圖6。

以上，基于實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了說(shuō)明。上述實(shí)施例僅為例示，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解，各種變形例是可行的，并且這些變形例也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。