相關(guān)申請(qǐng)

本申請(qǐng)要求2014年10月27日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)第62/069,067號(hào)和2014年8月18日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)第62/038,604號(hào)的優(yōu)先權(quán)及權(quán)益。每一以上申請(qǐng)的公開內(nèi)容均以其全文引用的方式并入本文中。

本發(fā)明涉及合成具有所需序列的聚核苷酸(從頭)且不需要模板的方法和設(shè)備。由此，本發(fā)明能夠制造具有變化序列和變化長(zhǎng)度的聚核苷酸文庫(kù)以用于研究、基因工程以及基因療法。

背景技術(shù)：

基因工程需要確定基因材料的含量的工具以及構(gòu)筑所需基因材料的工具。確定基因材料的含量的工具使得可以在低于$1,000下在約一天內(nèi)對(duì)整個(gè)人類基因組測(cè)序。(參見生命技術(shù)，新聞稿：benchtopionproton^tm測(cè)序儀，2012年1月10日(lifetechnologies,pressrelease:benchtopionproton^tmsequencer,january10,2012))。相反，構(gòu)筑所需基因材料(例如從頭dna合成)的工具并未同步改進(jìn)。作為參照點(diǎn)，在過去的25年，小核酸從頭合成的成本(每個(gè)堿)下降10倍，同時(shí)核酸測(cè)序的成本(每個(gè)堿)下降10,000,000倍以上。dna合成缺乏進(jìn)展目前限制了轉(zhuǎn)譯基因組學(xué)的步伐，即，由此確定個(gè)別序列變異的作用并且用以改進(jìn)治療性治療。

目前，大多數(shù)新生核酸序列使用30多年前研發(fā)的固相亞磷酰胺技術(shù)合成。所述技術(shù)涉及由與天然(或非天然)核酸堿基對(duì)應(yīng)的亞磷酰胺試劑構(gòu)建的序列的依序去保護(hù)和合成。亞磷酰胺核酸合成長(zhǎng)度受限，然而，這是因?yàn)殚L(zhǎng)度大于200個(gè)堿基對(duì)(bp)的核酸會(huì)歷經(jīng)高斷裂率和副反應(yīng)。另外，亞磷酰胺合成會(huì)產(chǎn)生有毒副產(chǎn)物，并且這一廢棄物的處置限制核酸合成器的可用性，并且增加合同寡核苷酸制造成本。(估計(jì)每年對(duì)寡核苷酸合成的需要會(huì)造成大于300,000加侖的有害化學(xué)廢棄物，包括乙腈、三氯乙酸、甲苯、四氫呋喃以及吡啶。參見勒普羅斯特(leproust)等人，核酸研究，第38(8)卷，第2522-2540頁(yè)，(2010)(nucleicacidsres.,vol.38(8),p.2522-2540,(2010))，其以全文引用的方式并入本文中)。因此，需要更有效并且更具成本效益的寡核苷酸合成方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供改進(jìn)的核酸合成方法。本發(fā)明方法提供更快并且更長(zhǎng)的聚核苷酸從頭合成。由此，本發(fā)明大大降低合成常規(guī)核酸的總成本。本發(fā)明方法是針對(duì)使用核苷酸基轉(zhuǎn)移酶來并入未經(jīng)修飾的3'羥基通過可裂解連接子與抑制因子偶聯(lián)的核苷酸類似物而不依賴模板地合成聚核苷酸。由于存在抑制因子，合成因添加每一新的堿基而停頓，因此連接子發(fā)生裂解，從而分離抑制因子并且離開聚核苷酸，這與天然產(chǎn)生的核苷酸本質(zhì)上相同(即，通過酶識(shí)別為進(jìn)一步核苷酸并入的底物)。

本發(fā)明另外包括利用本發(fā)明方法產(chǎn)生定制聚核苷酸的設(shè)備。本發(fā)明的設(shè)備包括提供水性條件的一個(gè)或多個(gè)生物反應(yīng)器和多個(gè)核苷酸類似物來源。生物反應(yīng)器可以是例如儲(chǔ)槽、流槽或多孔板。以固體支撐物起始，通過經(jīng)由核苷酸基轉(zhuǎn)移酶(例如末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(tdt)或無模板指向使dna或rna鏈伸長(zhǎng)的任何其它酶)的天然活性添加連續(xù)核苷酸使聚核苷酸生長(zhǎng)于反應(yīng)器中。在連接子裂解時(shí)，天然聚核苷酸暴露于固體支撐物上。一旦序列完整，支撐物就會(huì)裂解掉，留下聚核苷酸，其實(shí)質(zhì)上相當(dāng)于自然界中所見的聚核苷酸。在一些實(shí)施例中，將設(shè)備設(shè)計(jì)為通過在核苷酸添加之后回收溶液并且將溶液再用于子序列核苷酸添加來回收核苷酸類似物溶液。因此，產(chǎn)生較少?gòu)U棄物，并且，與目前先進(jìn)技術(shù)方法相比每個(gè)堿基的總成本降低。在某些實(shí)施例中，生物反應(yīng)器可以包括微流體裝置和/或使用噴墨印刷技術(shù)。

封端基團(tuán)可以包括(例如)帶電部分或空間抑制因子。一般來說，防止核苷酸基轉(zhuǎn)移酶達(dá)成功能構(gòu)形的大分子可以用以抑制寡核苷酸合成。此類大分子可以包括聚合物、多肽、類多肽以及納米粒子。大分子應(yīng)該足夠大以從物理上阻止接近核苷酸基轉(zhuǎn)移酶的活性位點(diǎn)，但又不會(huì)大到對(duì)反應(yīng)動(dòng)力產(chǎn)生不利改變。大分子可以使用多個(gè)連接分子連接到核苷酸類似物，如下所述。

在一些實(shí)施例中，寡核苷酸合成可以包括在每一核苷酸類似物添加之后，但在封端基團(tuán)裂解之前將3'核酸外切酶引入到一個(gè)或多個(gè)合成的寡核苷酸中。封端基團(tuán)可以阻止3'核酸外切酶作用于已成功添加未裂解核苷酸類似物的寡核苷酸，但通過3'核酸外切酶將去除尚未成功添加抑制因子的寡核苷酸。以這種方式，本發(fā)明使得能夠進(jìn)行制程質(zhì)量控制并且可以消除對(duì)合成后純化的需要。

本發(fā)明的其它方面將在考慮以下圖式和具體實(shí)施方式后而為所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員所顯而易知。

附圖說明

圖1a展示在n-4位連接有可裂解終止子的一種脫氧胞苷三磷酸(dctp)類似物；

圖1b展示來自圖1a的dctp類似物的可裂解終止子的裂解，以獲得“天然”dctp和環(huán)狀離去分子；

圖2a展示在n-6位連接有可裂解終止子的一種脫氧腺苷三磷酸(datp)類似物；

圖2b展示來自圖2a的datp類似物的可裂解終止子的裂解，以獲得“天然”datp和環(huán)狀離去分子；

圖3a展示在n-2位連接有可裂解終止子的一種脫氧鳥苷三磷酸(dgtp)類似物；

圖3b展示來自圖3a的dgtp類似物的可裂解終止子的裂解，以獲得“天然”dgtp和環(huán)狀離去分子；

圖4a展示在n-3位連接有可裂解終止子的一種脫氧胸苷三磷酸(dttp)類似物；

圖4b展示來自圖4a的dttp類似物的可裂解終止子的裂解，以獲得“天然”dttp和環(huán)狀離去分子；

圖5a展示在n-3位連接有可裂解終止子的一種脫氧尿苷三磷酸(dutp)類似物；

圖5b展示來自圖5a的dutp類似物的可裂解終止子的裂解，以獲得“天然”dutp和環(huán)狀離去分子；

圖6展示例示性脫氧胞苷三磷酸(dctp)類似物，其具有使封阻asp-asp分子連接到脫氧胞苷的n-4位的施陶丁格(staudinger)連接子并且隨后在水性條件下使施陶丁格連接子裂解以獲得dctp和離去基；

圖7a展示在n-4位連接有可裂解終止子的一種胞嘧啶核苷三磷酸(rctp)類似物；

圖7b展示來自圖7a的rctp類似物的可裂解終止子裂解以獲得“天然”rctp和環(huán)狀離去分子；

圖8a展示在n-6位連接有可裂解終止子的一種腺苷三磷酸(ratp)類似物；

圖8b展示來自圖8a的ratp類似物的可裂解終止子裂解以獲得“天然”ratp和環(huán)狀離去分子；

圖9a展示在n-2位連接有可裂解終止子的一種鳥苷三磷酸(rgtp)類似物；

圖9b展示來自圖9a的rgtp類似物的可裂解終止子裂解以獲得“天然”rgtp和環(huán)狀離去分子；

圖10a展示在n-3位連接有可裂解終止子的一種胸苷三磷酸(rttp)類似物；

圖10b展示來自圖10a的rttp類似物的可裂解終止子裂解以獲得“天然”rttp和環(huán)狀離去分子；

圖11a展示在n-3位連接有可裂解終止子的一種尿苷三磷酸(rutp)類似物；

圖11b展示來自圖11a的rutp類似物的可裂解終止子裂解以獲得rutp和環(huán)狀離去分子；

圖12展示例示性胞嘧啶核苷三磷酸(rctp)類似物，其具有使封阻asp-asp分子連接到胞嘧啶核苷的n-4位的施陶丁格連接子并且隨后在水性條件下使施陶丁格連接子裂解以獲得rctp和離去基；

圖13展示例示性末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(tdt)介導(dǎo)的聚核苷酸合成循環(huán)，其包括：(a)并入包含可裂解終止子的核苷三磷酸類似物dn*tp-oh，(b)移除封端封阻基團(tuán)(由*所示)，因此使得下一個(gè)dn*tp-oh并入，其中n＝a、g、c或t；

圖14展示具有包含可變數(shù)目的亞甲基橋的可裂解連接子的例示性核苷酸類似物；

圖15展示具有包含半胱氨酸殘基的可裂解連接子的例示性核苷酸類似物；

圖16a展示具有包含單個(gè)磷酸基的陰離子抑制因子的例示性核苷酸類似物；

圖16b展示具有包含兩個(gè)磷酸酯基的陰離子抑制因子的例示性核苷酸類似物；

圖16c展示具有包含三個(gè)磷酸酯基的陰離子抑制因子的例示性核苷酸類似物；

圖17展示例示性微流體聚核苷酸合成裝置；

圖18展示適用于本發(fā)明中的例示性類多肽抑制因子；

圖19展示描述3'核酸外切酶消化寡核苷酸的用途的流程圖，該等寡核苷酸在寡核苷酸合成循環(huán)之間并未適當(dāng)封端。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明提供改進(jìn)的使用酶和核苷酸類似物合成如dna和rna的聚核苷酸的方法。使用所公開的方法，特定聚核苷酸序列可以在水性環(huán)境中在不使用核酸模板下從頭一個(gè)堿基接一個(gè)堿基地合成。另外，因?yàn)楹塑账犷愃莆锞哂形唇?jīng)修飾的3'羥基，即如“天然”脫氧核糖和核糖分子中所見，所以該等類似物在從堿基去除抑制因子，在本文中也稱為經(jīng)由可裂解連接子連接的終止子或終止基團(tuán)時(shí)產(chǎn)生“天然”核苷酸。還可以使用其它核苷酸類似物，其例如包括自消除連接子或具有經(jīng)修飾磷酸基的核苷酸。在大多數(shù)情況下，封阻基團(tuán)經(jīng)設(shè)計(jì)不會(huì)留下大量其它分子，即經(jīng)設(shè)計(jì)以留下通過酶識(shí)別為“天然”核苷酸的“無瘢痕”核苷酸。因此，在合成結(jié)束時(shí)，在去除最后一個(gè)封阻基團(tuán)時(shí)，合成的聚核苷酸從化學(xué)性和結(jié)構(gòu)上相當(dāng)于具有相同序列的天然產(chǎn)生的聚核苷酸。因此，可以將合成聚核苷酸并入到生命系統(tǒng)中，不用擔(dān)心合成的聚核苷酸會(huì)干擾生物化學(xué)途徑或代謝。

本發(fā)明的方法和類似物可以用于有用寡核苷酸和寡脫氧核苷酸，尤其長(zhǎng)寡核苷酸(<5000nt)的非模板化酶促合成。視所用起始因子而定，產(chǎn)物可以是單鏈或部分雙鏈的。長(zhǎng)寡核苷酸的合成需要高效并入和高效可逆終止子去除。結(jié)合于固體支撐物的起始因子由短單鏈dna序列組成，該短單鏈dna序列是一小段用戶定義的序列或自其去除用戶定義的單鏈產(chǎn)物的通用起始因子。

一方面，所公開的方法采用可商購(gòu)的核苷酸轉(zhuǎn)移酶(如末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(tdt))以逐步方式自核苷酸類似物合成聚核苷酸。核苷酸類似物具有以下形式：

ntp-連接子-抑制因子

其中ntp是核苷三磷酸(即dntp或rntp)，連接子是堿基的吡啶或嘧啶之間的可裂解連接子，并且抑制因子是阻止酶并入隨后核苷酸的基團(tuán)。在每一步，將新的核苷酸類似物并入到生長(zhǎng)聚核苷酸鏈中，因此通過抑制因子基團(tuán)阻止酶添加其它核苷酸。一旦酶停止，可以從生長(zhǎng)鏈去除過量核苷酸類似物，可以從ntp裂解抑制因子，并且可以引入新的核苷酸類似物以將下一個(gè)核苷酸添加到鏈中。通過依序重復(fù)該等步驟，有可能快速構(gòu)造所需長(zhǎng)度和序列的核苷酸序列。聚核苷酸合成使用核苷酸轉(zhuǎn)移酶的優(yōu)勢(shì)包括：1)在不依賴模板的聚合中使用單鏈(ss)引發(fā)引子的3'-延伸活性，2)能以高度有效的方式延伸引子致使添加數(shù)千個(gè)核苷酸，和3)接受多種經(jīng)修飾和經(jīng)取代的ntp作為有效底物。此外，本發(fā)明可以利用作為核苷酸轉(zhuǎn)移酶的底物的起始因子序列。起始因子連接到固體支撐物并且充當(dāng)酶的結(jié)合位點(diǎn)。起始因子優(yōu)選地是酶的通用起始因子，如均聚物序列，并且可在固體支撐物上再循環(huán)，形成的寡核苷酸可從起始因子裂解。

本發(fā)明方法非常適合于目前使用合成核酸，例如亞磷酰胺合成的dna寡核苷酸的多種應(yīng)用。舉例來說，由本發(fā)明方法合成的聚核苷酸可以用作核酸擴(kuò)增的引子、偵測(cè)特定標(biāo)記的雜交探針并且用于并入到質(zhì)粒中進(jìn)行基因工程改造。然而，因?yàn)樗_的方法以更快的速率并且在水性環(huán)境中產(chǎn)生更長(zhǎng)的合成核苷酸串，所以所公開的方法又適于高產(chǎn)量應(yīng)用，如在細(xì)胞分析中針對(duì)遺傳變異的表達(dá)進(jìn)行篩選，以及合成生物學(xué)。此外，本發(fā)明方法將提供下一代應(yīng)用所需的功能性，如使用dna作為合成讀/寫存儲(chǔ)器，或產(chǎn)生完全(或部分)從dna合成的宏觀物質(zhì)。

本發(fā)明和本文所述的系統(tǒng)提供包括脫氧核糖核酸(dna)和核糖核酸(rna)的聚核苷酸的合成。盡管如dna和rna的“天然”核苷酸的合成途徑已描述于例如腺嘌呤(a)、鳥嘌呤(g)、胞嘧啶(c)、胸腺嘧啶(t)以及尿嘧啶(u)的常見核酸堿基的情況下，但應(yīng)了解本發(fā)明方法可以用于所謂的“非天然”核苷酸，包括并入有通用堿基的核苷酸，如3-硝基吡咯2'-deoxynucloside和5-硝基吲哚2'-deoxynucleoside、α硫代磷酸酯、硫代磷酸酯核苷三磷酸，或具有其它所需特性(如螢光)的嘌呤或嘧啶結(jié)合物。嘌呤和嘧啶堿基的其它實(shí)例包括吡唑并[3,4-d]嘧啶、5-甲基胞嘧啶(5-me-c)、5-羥基甲基胞嘧啶、黃嘌呤、次黃嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鳥嘌呤的6-甲基和其它烷基衍生物、腺嘌呤和鳥嘌呤的2-丙基和其它烷基衍生物、2-硫尿嘧啶、2-thiothymine和2-thiocytosine、5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶、6-偶氮基尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫尿嘧啶、8-鹵基(例如8-溴)、8-氨基、8-巰基、8-硫代烷基、8-羥基和其它8-取代腺嘌呤和鳥嘌呤、5-鹵基、尤其5-溴、5-三氟甲基和其它5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶；7-甲基鳥嘌呤和7-甲基腺嘌呤、8-氮雜鳥嘌呤和8-氮雜腺嘌呤、脫氮鳥嘌呤、7-脫氮鳥嘌呤、3-脫氮鳥嘌呤、脫氮腺嘌呤、7-脫氮腺嘌呤、3-脫氮腺嘌呤、吡唑并[3,4-d]嘧啶、咪唑[1,5-a]1,3,5三嗪酮、9-脫氮嘌呤、咪唑并[4,5-d]吡嗪、噻唑并[4,5-d]嘧啶、吡嗪-2-酮、1,2,4-三嗪、噠嗪；和1,3,5三嗪。在一些情況下，可以用于產(chǎn)生具有無反應(yīng)但大致等效堿基的核苷酸序列，即堿基不與其它蛋白質(zhì)(即轉(zhuǎn)錄酶)反應(yīng)，因此使序列信息的影響與堿基的結(jié)構(gòu)效果分離。

類似物

本發(fā)明提供具有式ntp-連接子-抑制因子的核苷酸類似物以在水性環(huán)境中合成聚核苷酸。關(guān)于式ntp-連接子-抑制因子的類似物，ntp可以是任何核苷三磷酸，如腺苷三磷酸(atp)、鳥苷三磷酸(gtp)、胞嘧啶核苷三磷酸(ctp)、胸苷三磷酸(ttp)、尿苷三磷酸(utp)、核苷三磷酸酯、脫氧腺苷三磷酸(datp)、脫氧鳥苷三磷酸(dgtp)、脫氧胞苷三磷酸(dctp)、脫氧胸苷三磷酸(dttp)或脫氧尿苷三磷酸(dutp)。

接子可以是使抑制因子連接到ntp的任何分子部分，并且可以發(fā)生裂解。舉例來說，連接子可以通過調(diào)節(jié)周圍環(huán)境的ph值來裂解。連接子還可以通過在既定溫度下活化但在另一溫度下失活的酶來裂解。在一些實(shí)施例中，連接子包括二硫鍵。

連接子可以例如包括可光裂解、親核或親電子裂解位點(diǎn)。裂解由特定波長(zhǎng)的光激活的可光裂解連接子可以包括以安息香、硝基藜蘆基、苯甲酰甲基、特戊?；?、(三甲基硅烷基)硅烷基(sisyl)、2-羥基-桂皮基、香豆素-4-基甲基或2-硝基苯甲基為主的連接子。

親核裂解位點(diǎn)的實(shí)例包括氟離子可裂解硅氧鍵或酯，其可以在堿性溶液中發(fā)生裂解。親電子裂解連接子可以包括酸誘發(fā)的裂解位點(diǎn)，其可包含三苯甲基、叔丁氧基羰基、縮醛基團(tuán)以及對(duì)烷氧基苯甲基酯和酰胺。在某些方面，可裂解連接子可以包括如圖15中所示的半胱氨酸殘基。

連接子可以例如在下胞嘧啶的n4、胸腺嘧啶的n3或o4、鳥嘌呤的n2或n3以及腺嘌呤的n6、或尿嘧啶的n3或o4處連接，這是因?yàn)樘继幍倪B接導(dǎo)致在去除聚合酶抑制基團(tuán)之后存在殘余瘢痕。連接子典型地是約至少約10埃長(zhǎng)，例如至少約20埃長(zhǎng)，例如至少約25埃長(zhǎng)，因此使抑制因子離吡啶或嘧啶足夠遠(yuǎn)以使酶將ntp經(jīng)由所連接的糖主鏈結(jié)合到聚核苷酸鏈。在一些實(shí)施例中，可裂解連接子自環(huán)化，因?yàn)槠湫纬蓪?duì)生長(zhǎng)核苷酸鏈尤其無反應(yīng)性的環(huán)分子。

在某些方面，可裂解連接子可以在二硫鍵的ntp或抑制因子側(cè)包括可變數(shù)目的亞甲基橋，包含例如1、2、3或4個(gè)如圖14和16a-c中所示的亞甲基橋。這些亞甲基橋可以用于增加ntp與抑制因子之間的空間。如上文所示，可以選擇可裂解連接子的長(zhǎng)度以防止抑制因子干擾ntp與合成的聚核苷酸的偶聯(lián)。在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，帶電基團(tuán)與ntp的距離在抑制后續(xù)核苷酸并入的效力中起重要作用。

舉例來說，在一些實(shí)施例中，使用帶電部分作為抑制因子，該帶電部分可以與ntp相距約5到約60個(gè)鍵。在一些其它實(shí)施例中，抑制因子的帶電部分可以與ntp相距約10到約40個(gè)鍵。在一些其它實(shí)施例中，抑制因子的帶電部分可以與ntp相距約10到約35個(gè)鍵。在一些其它實(shí)施例中，抑制因子的帶電部分可以與ntp相距約10到約30個(gè)鍵。在一些其它實(shí)施例中，抑制因子的帶電部分可以與ntp相距約10到約20個(gè)鍵。帶電部分與ntp之間的鍵的數(shù)目可以通過包括其它亞甲基橋來增加。

核苷酸類似物可以包括抑制通過酶使隨后的核苷酸發(fā)生偶聯(lián)的連接到ntp的任何部分。抑制基團(tuán)可以是帶電基團(tuán)，如帶電荷氨基酸，或抑制基團(tuán)可以是視環(huán)境條件而定帶電的基團(tuán)。在一些實(shí)施例中，抑制因子可以包括帶負(fù)電或能夠帶負(fù)電的部分。舉例來說，抑制因子可以如圖16a-c中所示包括一連串的磷酸酯基(例如1、2或3個(gè)磷酸酯)，其中其它磷酸酯基會(huì)增加抑制因子的總陰離子電荷。在其它實(shí)施例中，抑制因子基團(tuán)帶正電或能夠帶正電。在一些其它實(shí)施例中，抑制因子是氨基酸或氨基酸類似物。抑制因子可以是具有2到20個(gè)氨基酸單元的肽或類似物、具有2到10個(gè)氨基酸單元的肽或類似物、具有3到7個(gè)氨基酸單元的肽或類似物、具有3到5個(gè)氨基酸單元的肽或類似物。在一些實(shí)施例中，抑制因子包括選自由以下組成的群組的基團(tuán)：glu、asp、arg、his和lys以及其組合(例如arg、arg-arg、asp、asp-asp、asp、glu、glu-glu、asp-glu-asp、asp-asp-glu或aspaspaspasp等)。肽或基團(tuán)可以是相同或不同氨基酸或類似物的組合。在某些實(shí)施例中，肽抑制因子可以發(fā)生乙?；宰柚褂坞x氨基錯(cuò)誤鍵結(jié)。抑制基團(tuán)還可以包括與酶活性位點(diǎn)中的殘基反應(yīng)的基團(tuán)，因此干擾通過酶使隨后的核苷酸發(fā)生偶聯(lián)。抑制因子可以具有選自由以下組成的群的帶電基團(tuán)：-coo、-no2、-po4、-po3、-so2或-nr3，其中每一r可以是h或烷基。在其它實(shí)施例中，抑制因子部分并不包含-po4基團(tuán)。

在某些方面，終止子或抑制因子可以包括空間抑制因子基團(tuán)。此類空間抑制因子基團(tuán)可以使得ntp-連接子-抑制因子(即，核苷酸類似物)并入寡核苷酸的未封端3'oh上，該并入通過核苷酸基轉(zhuǎn)移酶催化?？臻g抑制因子基團(tuán)可以從物理上阻止核苷酸或其它核苷酸類似物并入并入的核苷酸類似物的未封端3'oh上?？臻g抑制因子也可以阻止3'核酸內(nèi)切酶作用于核苷酸類似物，并且因此，作用于并入有未裂解核苷酸類似物的寡核苷酸。

空間抑制因子可以包括例如化學(xué)聚合物、納米粒子、經(jīng)多n取代的甘氨酸(類肽)或蛋白。本發(fā)明的空間抑制因子可以是多種尺寸，包括例如大于大于大于大于大于大于大于大于大于大于大于大于大于或大于在優(yōu)選實(shí)施例中，空間抑制因子可以是單分散或?qū)嵸|(zhì)上單分散的?？臻g抑制因子可以是水溶性的并且構(gòu)形受限(即，撐剛性或半剛性形式)。在某些方面，空間抑制因子因抑制因子的尺寸或構(gòu)形而從物理上阻止接近相關(guān)核苷酸基轉(zhuǎn)移酶的活性位點(diǎn)。在優(yōu)選實(shí)施例中，空間抑制因子可以包含非天然仿生聚合物，如類多肽或非天然多肽。

在某些方面，可以使用自組裝類多肽序列作為空間抑制因子。類肽單體通?；诮?jīng)n取代的甘氨酸主鏈。因?yàn)橹麈湶缓瑲滏I供體，所以類多肽容易進(jìn)行處理，同時(shí)仍能夠形成二級(jí)結(jié)構(gòu)，如螺旋。其還提供與肽類似的允許極性和側(cè)鏈的有益特性，同時(shí)是通常化學(xué)和熱穩(wěn)定的。根據(jù)本發(fā)明的自組裝類多肽空間抑制因子可以將單個(gè)類肽螺旋自組裝以形成直徑在微米范圍內(nèi)的微球體，包括0.3μm、0.4pm、0.5pm、0.6pm、0.7pm、0.8pm、0.9pm、1.0μm、1.5μm、2μm、2.5μm、3μm或3.5μm等等。在某些方面，空間抑制因子可以包括具有c-α-分支側(cè)鏈、n-芳基側(cè)鏈、n-1-萘基乙基側(cè)鏈或能夠形成穩(wěn)定螺旋結(jié)構(gòu)的其它形式的類肽。類肽空間抑制因子的實(shí)例示于圖18中。圖18圖示分支聚-n-甲氧基乙基甘氨酸，其可以用作根據(jù)本發(fā)明的空間抑制因子。在某些實(shí)施例中，空間抑制因子可以包括容易連接到連接基團(tuán)，例如如本文所述的可裂解鍵聯(lián)基團(tuán)的反應(yīng)性基團(tuán)。

在其它實(shí)施例中，空間抑制因子可以包含聚合物，如生物兼容性聚合物。聚合物可以包含不同聚合物的嵌段，以使得該等嵌段形成所需宏觀結(jié)構(gòu)，例如當(dāng)暴露于水性環(huán)境時(shí)形成球體。舉例來說，共聚物可以包含親水性和疏水性嵌段的嵌段，以使得聚合物在添加到水中時(shí)自組裝成膠束結(jié)構(gòu)。在一些實(shí)施例中，疏水性嵌段可以選自聚己內(nèi)酯(pcf)、聚二甲基硅氧烷(pdms)、聚甲基丙烯酸甲酯(pmma)或聚乳酸交酯(pfa)。親水性嵌段可以包括聚乙二醇(peg)或其它多元醇。

在其它實(shí)施例中，抑制因子可以包含足夠尺寸的納米粒子以阻斷核苷酸基轉(zhuǎn)移酶的活性。此類納米粒子可以包含例如金、銀、硅、氧化鈰、氧化鐵、二氧化鈦、氮化硅、硼化硅或二氧化硅，例如介孔性二氧化硅。在其它實(shí)施例中，納米粒子可以包含高度有序的分子結(jié)構(gòu)，如富勒烯(fullerene)，例如巴克球和納米管(包含碳)，或半導(dǎo)體。

空間抑制因子可以不帶電或可以帶正電或帶負(fù)電，以提供與其所連接的核苷酸和核苷酸基轉(zhuǎn)移酶的兼容性，以使得抑制因子不干擾ntp類似物5'端上的并入反應(yīng)?？臻g抑制因子可以併入多個(gè)氨基酸殘基以提供所需構(gòu)形、電荷或連接位點(diǎn)。

ntp-連接子-抑制因子型核苷酸類似物的實(shí)例示于圖1a中。圖1a中的類似物包括經(jīng)由二硫(-s-s-)鍵連接到dctp的n4位同時(shí)在糖環(huán)上提供為封阻未經(jīng)修飾的3'-oh的抑制性(-asp-asp-)基團(tuán)。連接子經(jīng)構(gòu)建以使得所有連接子原子(包括第2并入抑制部分)均可以去除，由此使初生dna鏈恢復(fù)到天然核苷酸。如圖1b中所示，還原劑水溶液，如三(2-羧乙基)膦(tcep)或二硫蘇糖醇(dtt)可以用以裂解-s-s-鍵，從而致使抑制因子功能(解封)損失。如圖1b中所示，可以并入自環(huán)化連接子，產(chǎn)生在核苷酸合成結(jié)束時(shí)容易從試劑溶液去除的環(huán)狀氧化四氫噻吩離去基。

下文流程1a和1b中展示合成圖1a的dctp類似物的例示性流程：

流程1a

流程1b

以與流程1a和1b類似的方式，ntp-連接子-抑制因子型核苷酸類似物還可以由將連接子-抑制因子部分連接到腺嘌呤的n6(圖2)、鳥嘌呤的n2(圖3)、胸腺嘧啶的n3(圖4)或尿嘧啶的n3(圖5)來形成，由此提供“天然產(chǎn)生的”dntp的類似物以及脫氧尿嘧啶核苷酸(dutp)。盡管不大可能廣泛使用dutp，但根據(jù)化學(xué)方法合成是簡(jiǎn)單的。

本發(fā)明不限于流程1a和1b的連接化學(xué)，然而，還可以使用胺基甲酸酯、酰胺或其它自消除鍵聯(lián)。舉例來說，如流程2中所示，核苷酸還可以由施陶丁格連接子來制備。

流程2

由asp-asp封阻基團(tuán)的施陶丁格連接子(流程2)產(chǎn)生的脫氧胞苷三磷酸(dctp)類似物示于圖6中。如圖6中所示，施陶丁格dctp類似物在水性條件下由添加疊氮化物和三苯基膦經(jīng)歷裂解。圖6中所示的施陶丁格類似物還適用于如上文所述和圖1-5中所例示的使用核苷酸轉(zhuǎn)移酶(如tdt)進(jìn)行核苷酸延伸。盡管圖中未明確展示，但所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員可以視完整從頭核苷酸合成所需用流程2以及適合的反應(yīng)物產(chǎn)生具有施陶丁格連接子的其它核苷酸類似物。以與圖6類似的方式，流程2的核苷酸類似物可以由將施陶丁格部分連接到腺嘌呤的n6、鳥嘌呤的n2、胸腺嘧啶的n3或尿嘧啶的n3來形成，由此提供“天然產(chǎn)生”dntp的類似物以及脫氧尿嘧啶核苷酸(dutp)。

流程1a的方法可以用以通過以適當(dāng)核糖核苷酸反應(yīng)物為起始物質(zhì)產(chǎn)生例如如圖7-10中所示的對(duì)應(yīng)核糖核苷酸類似物。包含施陶丁格連接子的核糖核苷酸類似物還可以使用流程2產(chǎn)生，以形成所需核糖核苷酸類似物，包括例如如圖12中所示的ctp類似物。此外，所有核糖核苷酸類似物，即c、a、t、g、u均可以使用與流程2類似的反應(yīng)物形成。

酶

本發(fā)明方法采用核苷酸轉(zhuǎn)移酶將核苷酸類似物組合到聚核苷酸中。核苷酸轉(zhuǎn)移酶包括若干相關(guān)轉(zhuǎn)移酶和聚合酶家族。一些核苷酸轉(zhuǎn)移酶會(huì)使脫氧核糖核苷酸比核糖核苷酸更高效地聚合，一些核苷酸轉(zhuǎn)移酶使核糖核苷酸比脫氧核糖核苷酸更高效地聚合，并且一些核苷酸基轉(zhuǎn)移酶使核糖核苷酸和脫氧核糖核苷酸以大致相同的速率聚合。

本發(fā)明特別重要的是，具有聚合酶活性的轉(zhuǎn)移酶，如末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(tdt)能夠催化脫氧核糖核苷酸到核苷酸鏈的3^端的添加，由此使dna核苷酸中的鏈長(zhǎng)逐漸增加。tdt僅催化1-2個(gè)核糖核苷酸向dna鏈的生長(zhǎng)端的添加，其可適用于位點(diǎn)特異性dna-rna嵌合聚核苷酸的構(gòu)筑。具體來說，來源于經(jīng)工程改造大腸桿菌的小牛胸腺tdt適合用于本發(fā)明并且購(gòu)自商業(yè)來源，如賽默科技(thermoscientific)(賓夕法尼亞州匹茲堡(pittsburgh,pa))。與小牛tdt對(duì)應(yīng)的氨基酸序列以seqidno.1列舉于表1中。

表1.牛tdt的氨基酸序列

與小牛tdt對(duì)應(yīng)的核苷酸序列以seqidno.2列舉于表2中。

表2.牛tdt的核酸序列

盡管市售tdt適用于本發(fā)明方法，但本發(fā)明方法可以使用例如氨基酸序列與seqidno.1至少95％一致，例如氨基酸序列與seqidno.1至少98％一致，例如氨基酸序列與seqidno.1至少99％一致的經(jīng)修飾的tdt。表達(dá)適合的核苷酸轉(zhuǎn)移酶的生物體可以包含與seqidno.2至少95％一致，例如與seqidno.2至少98％一致，例如與seqidno.2至少99％一致的核酸序列。在一些情況下，經(jīng)修飾的tdt將更有效地產(chǎn)生聚核苷酸，或更好地控制鏈長(zhǎng)。tdt的其它變體可以改變酶的釋放特征，由此降低對(duì)如tcep或dtt的還原劑水溶液的需要。

對(duì)于rna聚核苷酸的合成，如大腸桿菌聚(a)聚合酶的核苷酸轉(zhuǎn)移酶可以用以催化核糖核苷酸向核糖核苷酸起始因子的3'端的添加。在其它實(shí)施例中，大腸桿菌聚(u)聚合酶可以更適用于本發(fā)明方法。大腸桿菌聚(a)聚合酶與大腸桿菌聚(u)聚合酶皆可購(gòu)自新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室(newenglandbiolabs)(馬薩諸塞州伊普斯威奇(ipswich,ma))。這些酶類可與未經(jīng)3'封阻的可逆終止子核糖核苷酸三磷酸酯(rntps)一起使用以合成rna。在某些實(shí)施例中，rna可以使用3'封阻、2'封阻或2'-3'封阻的rntp和聚(u)聚合酶或聚(a)聚合酶合成。下文再現(xiàn)大腸桿菌聚(a)聚合酶和大腸桿菌聚(u)聚合酶的氨基酸和核苷酸序列。經(jīng)修飾的大腸桿菌聚(a)聚合酶大腸桿菌大腸桿菌聚(u)聚合酶可以適用于本發(fā)明方法。舉例來說，氨基酸序列與seqidno.3至少95％一致，例如氨基酸序列與seqidno.3至少98％一致，例如氨基酸序列與seqidno.3至少99％一致的酶可以用于本發(fā)明方法。表達(dá)適合的酶的生物體可以包含與seqidno.4至少95％一致，例如與seqidno.4至少98％一致，例如與seqidno.4至少99％一致的核酸序列。舉例來說，氨基酸序列與seqidno.5至少95％一致，例如氨基酸序列與seqidno.5至少98％一致，例如氨基酸序列與seqidno.5至少99％一致的酶可以用于本發(fā)明方法。表達(dá)適合的核苷酸轉(zhuǎn)移酶的生物體可以包含與seqidno.6至少95％一致，例如與seqidno.6至少98％一致，例如與seqidno.6至少99％一致的核酸序列。

表3：大腸桿菌聚(a)聚合酶的氨基酸序列

與大腸桿菌聚(a)聚合酶對(duì)應(yīng)的核苷酸序列以seqidno.4列舉于表4中。

表4：大腸桿菌聚(a)聚合酶的核苷酸序列

表5：大腸桿菌聚(u)聚合酶的氨基酸序列

與大腸桿菌聚(u)聚合酶對(duì)應(yīng)的核苷酸序列以seqidno.6列舉于表6中。

表6：大腸桿菌聚(a)聚合酶的核苷酸序列

如上文所論述，與核苷酸類似物偶聯(lián)的抑制因子將使例如tdt的轉(zhuǎn)移酶不從聚核苷酸釋放或防止其它類似物并入到生長(zhǎng)鏈中。帶電部分會(huì)產(chǎn)生較好的抑制作用，然而，研究表明抑制因子的特定化學(xué)性質(zhì)并非尤其重要。舉例來說，可以使用磷酸與酸性肽抑制酶活性。參見例如鮑爾斯等人,性質(zhì)方法,第6卷,(2009)第593-95頁(yè)(bowersetal,naturemethods,vol.6,(2009)p.593-95)和美國(guó)專利第8,071,755號(hào)，兩文獻(xiàn)皆以全文引用的方式并入本文中。在一些實(shí)施例中，抑制因子將包括單一胺基酸或二肽，如-(asp)2，然而部分上的尺寸和電荷可以視需要根據(jù)以實(shí)驗(yàn)方式確定的第一核苷酸并入和第二核苷酸并入的速率來調(diào)節(jié)。也就是說，其它實(shí)施例可以使用更多或不同的帶電氨基酸或其它生物相容性帶電分子。

可以使用其它核苷酸合成方法以不依賴模板的方式使用核苷酸轉(zhuǎn)移酶或經(jīng)修飾的核苷酸轉(zhuǎn)移酶從頭建構(gòu)寡核苷酸。在一個(gè)實(shí)施例中，聚合酶/轉(zhuǎn)移酶可以經(jīng)修飾以使得其在遭遇3'-未經(jīng)修飾的dntp類似物的磷酸修飾時(shí)中止核苷酸添加。這一流程需要修飾核苷酸類似物的磷酸末端的解封試劑/反應(yīng)，由此空出初生鏈以進(jìn)行隨后的核苷酸并入。這一方法的優(yōu)選實(shí)施例將使用僅磷酸(α、β或γ)經(jīng)修飾的核苷酸類似物，但允許對(duì)核苷酸的嘌呤/嘧啶堿基進(jìn)行修飾。

在一些實(shí)施例中，可能有利的是使用3'核酸外切酶以在后續(xù)核苷酸類似物添加之前去并未經(jīng)抑制因子適當(dāng)封端的除寡核苷酸。具體來說，核苷酸類似物的抑制因子可以經(jīng)選擇以抑制核苷酸基轉(zhuǎn)移酶和3'核酸外切酶的活性，以使得建立僅適當(dāng)終止的寡核苷酸。使用這一質(zhì)量控制技術(shù)，將改進(jìn)所得寡核苷酸序列的純度。在一些實(shí)施例中，使用此類質(zhì)量控制措施測(cè)量可以抵消對(duì)合成后純化的需要。這一技術(shù)示意性地表示于圖19中，其中3'核酸外切酶是在洗滌步驟之后引入以去除過量核苷酸類似物并且是在連接子裂解之前引入。如圖19中所示，此類清潔步驟將降低長(zhǎng)度和/或序列不合需要的寡核苷酸的數(shù)目。

使用不依賴模板的聚合酶/轉(zhuǎn)移酶的另一實(shí)施例將使用蛋白質(zhì)工程改造或蛋白質(zhì)進(jìn)化來修飾酶以在每一單核苷酸并入之后保持緊緊地結(jié)合于初生鏈且不與其反應(yīng)，因此防止任何隨后的并入，直到此類通過使用釋放試劑/條件使聚合酶/轉(zhuǎn)移酶從鏈釋放的時(shí)間。將選擇此類修飾以允許使用天然未經(jīng)修飾的dntp代替可逆終止子dntp。釋放試劑可為高鹽緩沖劑、變性劑等。釋放條件可為高溫、攪拌等。舉例來說，tdt的環(huán)1和sd1區(qū)的突變已展示會(huì)使活性由不依賴模板的活性顯著改變?yōu)楦吲c模板相關(guān)的活性。所關(guān)注的特定突變包括(但不限于)δ3384/391/392、del環(huán)1(386→398)、f398a、d339a、f401a以及q402k403c404→e402r403s404。實(shí)現(xiàn)并入后緊密結(jié)合tdt酶的目的的其它方式可以包括引起結(jié)合起始因子鏈的三個(gè)磷酸(包括(但不限于)k261、r432和r454)的殘基的突變。

使用不依賴模板的聚合酶/轉(zhuǎn)移酶的另一實(shí)施例將為使用蛋白質(zhì)工程改造或蛋白質(zhì)進(jìn)化來修飾酶以高效地接受3-封阻可逆終止子。大多數(shù)天然存在的聚合酶/轉(zhuǎn)移酶并不并入有3'-封阻可逆終止子，這是因?yàn)槊傅幕钚晕稽c(diǎn)中的空間限制。在與上述完全類似的方法中，修飾酶活性位點(diǎn)中的單一或若干aa殘基可以極有效地將3'-封阻可逆終止子并入到結(jié)合起始因子的支撐物中。在并入之后，用解封試劑/條件去除3'-可逆終止子，由此產(chǎn)生完全天然(無瘢痕)單鏈分子準(zhǔn)備用于隨后的受控延伸反應(yīng)。有殘基接近輸入dntp的3'-oh，這解釋了tdt并入核糖核苷三磷酸與去氧核糖核苷三磷酸酯一樣容易的傾向；殘基，包括(但不限于)β1與β2之間的那些殘基、尤其r334，環(huán)1以及a13與a14之間的那些殘基、尤其r454，很可能是突變誘發(fā)以容納大量3'-可逆終止子基團(tuán)并且允許其有效并入的標(biāo)靶。在某些實(shí)施例中，可能需要其它氨基酸變化以補(bǔ)償這些適應(yīng)3'可逆終止子的殘基改變。使用與模板有關(guān)的聚合酶的另一實(shí)施例將是使用多個(gè)引子-模板對(duì)連接到固體支撐物的經(jīng)3'封阻或未經(jīng)3'封阻的dntp類似物，其中該模板是支撐由使用者所指定的四個(gè)堿基中的任一者的聚合酶介導(dǎo)的引子延伸的核酸類似物。

使用不依賴模板的聚合酶/轉(zhuǎn)移酶的另一實(shí)施例可以使用蛋白質(zhì)工程改造或蛋白質(zhì)進(jìn)化來修飾酶以按類似特定方式優(yōu)化四種不同核苷酸或甚至不同經(jīng)修飾核苷酸類似物中的每一者的用途。核苷酸特異性或核苷酸類似物特異性酶變體可以經(jīng)過工程改造而具有所需生物化學(xué)屬性，如降低的km或提升的添加速率，由此將進(jìn)一步降低合成所需聚核苷酸的成本。

固體狀態(tài)合成

本發(fā)明方法可以在多種反應(yīng)條件下實(shí)施，然而，在大多數(shù)情況下所需聚核苷酸的有序構(gòu)建和回收需要可以生長(zhǎng)聚核苷酸的固體支撐物。在一些實(shí)施例中，該等方法包括在固體支撐物上酶促介導(dǎo)地合成聚核苷酸。當(dāng)與上文所論述的ntp、連接子以及抑制因子類似物結(jié)合使用時(shí)，有可能通過在水性環(huán)境中使用例如tdt或聚(a)聚合酶構(gòu)筑dna以及rna的特異性多核苷酸序列。如圖13中所示，tdt可以用以通過以逐步方式延伸聚核苷酸序列實(shí)現(xiàn)定制聚核苷酸的逐步構(gòu)筑。如先前所論述，每一ntp類似物的抑制因子基團(tuán)使酶因添加核苷酸而停止。在每一核苷酸延伸步驟之后，從固體支撐物洗掉反應(yīng)物，之后通過使連接子裂解而去除抑制因子，并且接著添加新的反應(yīng)物，從而使循環(huán)重新開始。

在某些實(shí)施例中，可并入其它質(zhì)量控制，其中在核苷酸基轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的核苷酸類似物延伸步驟之后并且在抑制因子裂解之前使寡核苷酸或多核苷酸序列暴露于3'核酸外切酶。3'核酸外切酶可以降解具有未封端3'oh的寡核苷酸或聚核苷酸鏈。在某些方面，未裂解抑制因子(例如空間抑制因子)可以從物理上阻止3'核酸外切酶使已成功地并入有未裂解核苷酸類似物的鏈降解。此類質(zhì)量控制步驟可以僅降解不成功地并入有所需核苷酸類似物的寡核苷酸或聚核苷酸，由此消除成品合成序列中的任何錯(cuò)誤，從而可能去除對(duì)合成后序列校驗(yàn)的需要。在3'核酸外切酶暴露之后，酶可以在繼續(xù)抑制因子裂解步驟之前洗掉。

3'核酸外切酶可以通過縮短或完全降解尚未成功添加所需核苷酸類似物的鏈來起作用。指定環(huán)處未能酶促延伸的鏈在連接子裂解步驟之前將不具有末端大分子-dnmp結(jié)合物。如果在這一階段引入3'-核酸外切酶，那么可以保護(hù)全長(zhǎng)鏈以免降解，“失效”鏈的長(zhǎng)度將縮短或可能完全降解成單核苷酸磷酸。長(zhǎng)(>500個(gè)堿基)合成dna的產(chǎn)量視每個(gè)和各個(gè)循環(huán)處出現(xiàn)的高度有效的反應(yīng)而定；酶促延伸與解封/自消除步驟必須以接近的定量產(chǎn)量出現(xiàn)。如果延伸功效小于定量(即，存在不延伸并且因此具有天然未修飾的末端核苷酸的鏈)，那么在酶促延伸步驟之后但在大分子終止子裂解步驟之前引入3'-核酸外切酶將對(duì)初生鏈純度產(chǎn)生正面影響。

*相反，如果解封/消除步驟小于定量，那么3'-核酸外切酶步驟將對(duì)合成的質(zhì)量無影響，因?yàn)槟切╂溔越?jīng)大分子終止子保護(hù)并且在接下來的延伸步驟期間未能延伸。因此可以僅從實(shí)驗(yàn)上測(cè)定添加3'-核酸外切酶步驟下合成質(zhì)量的實(shí)際改進(jìn)，且接著評(píng)估是否值得額外的成本和循環(huán)時(shí)間。因?yàn)殚L(zhǎng)odn的大部分成本由現(xiàn)有胺基磷酸酯造成，所以方法涉及合成后

在n個(gè)延伸-去除-解封-洗滌周期結(jié)束時(shí)，成品全長(zhǎng)、單股聚核苷酸完整并且可以從固體支撐物裂解并回收，以隨后用于如dna定序或pcr的應(yīng)用中?；蛘?，成品全長(zhǎng)、單股聚核苷酸可以保持連接到固體支撐物，以隨后用于如雜交分析、蛋白質(zhì)或dna親和力捕獲的應(yīng)用中。在其它實(shí)施例中，部分雙鏈的dna可以作用起始因子，致使雙鏈聚核苷酸合成。

適用于本發(fā)明方法的固體支撐物可以包括玻璃和二氧化硅支撐物，包括珠粒、載片、栓釘或孔。在一些實(shí)施例中，支撐物可以系栓到另一結(jié)構(gòu)，如聚合物孔板或移液管尖端。在一些實(shí)施例中，固體支撐物可以具有額外磁特性，因此允許使用磁體操控或從某一位置去除支撐物。在其它實(shí)施例中，固體支撐物可以是涂有二氧化硅的聚合物，由此使得形成適于自動(dòng)加工的多種結(jié)構(gòu)形狀。

合成器

為利用所公開的方法的有效性，可以構(gòu)建水相dna合成器以大量產(chǎn)生所需聚核苷酸。在一個(gè)實(shí)施例中，合成器將包括四個(gè)孔的所述ntp類似物試劑，即dctp、datp、dgtp以及dttp，以及濃度足以實(shí)現(xiàn)聚核苷酸生長(zhǎng)的tdt?？梢詫⒍鄠€(gè)起始序列連接到固體支撐物，所述固體支撐物經(jīng)設(shè)計(jì)以例如使用實(shí)驗(yàn)室機(jī)器人反復(fù)浸漬到四個(gè)孔中的每一者中?？蓪?duì)機(jī)器人另外編程以在核苷酸添加之間用洗滌緩沖劑沖洗固體支撐物，通過使支撐物暴露于解封劑而使鍵聯(lián)基團(tuán)裂解，以及第二次洗滌固體支撐物，之后將固體支撐物移到下一所需核苷酸的孔。經(jīng)簡(jiǎn)單編程，有可能在大約幾小時(shí)內(nèi)產(chǎn)生有用量的所需核苷酸序列，并且充分減少有害廢棄物。在小心控制的條件下進(jìn)行合成將使得合成長(zhǎng)度是數(shù)千堿基對(duì)的聚核苷酸。完成時(shí)，延伸產(chǎn)物從固體支撐物釋放出，由此其可以用作成品核苷酸序列。

高度平行的實(shí)施例可由96或384孔格式中栓釘上的一系列起始因子-固體支撐物組成，該等栓釘可以個(gè)別回縮或降低以使得可以控制方式指引栓釘以接觸孔中的液體。因此，合成器可由可隨機(jī)定址的栓釘裝置、四個(gè)與栓釘裝置(96或384空格)相同格式的酶-dntp類似物儲(chǔ)槽、與栓釘裝置(96或384空格)相同格式的額外試劑儲(chǔ)槽(清洗、解封等)以及以用戶可編程控制但隨機(jī)存取的方式將栓釘裝置從一個(gè)儲(chǔ)槽移動(dòng)到另一個(gè)的輸送機(jī)構(gòu)(例如實(shí)驗(yàn)室機(jī)器人)組成。必須小心以避免四個(gè)酶-dntp儲(chǔ)槽中的每一者受到污染，因?yàn)閮?nèi)含物在整個(gè)合成過程中會(huì)重復(fù)使用以降低每一次聚核苷酸合成的成本。

在替代實(shí)施例中，試劑(例如核苷酸類似物、酶、緩沖劑)將在固體支撐物之間移動(dòng)，從而使得回收試劑。舉例來說，具有儲(chǔ)槽和泵的系統(tǒng)可以使四種不同核苷酸類似物溶液、洗滌緩沖劑和/或還原劑溶液在一個(gè)或多個(gè)將形成寡核苷酸的反應(yīng)器之間移動(dòng)。反應(yīng)器和泵可以是常規(guī)的，或裝置可以使用微流體構(gòu)筑。因?yàn)樵摲椒ǖ姆菬o水(水性)性質(zhì)，所以所用硬件的設(shè)計(jì)中不需要特別小心地消除暴露于水。合成方法可以進(jìn)行，僅采取措施以控制蒸發(fā)損失。高度平行的實(shí)施例可以由96或384孔格式中的栓釘上的單片一系列起始因子-固體支撐物組成，其可以接合相同匹配格式的一系列孔。每一孔實(shí)際上為一通過具有適當(dāng)閥門的四個(gè)酶-dntp類似物儲(chǔ)槽和額外試劑儲(chǔ)槽(清洗、解封等)饋料的反應(yīng)室。流體學(xué)邏輯將限制在每一延伸反應(yīng)之后以原始方式回收酶-dntp反應(yīng)物，這是因?yàn)槠湓谡麄€(gè)合成過程中會(huì)重復(fù)使用以降低每一次聚核苷酸合成的成本。在其它實(shí)施例中，移液尖端的系統(tǒng)可以用以添加和去除試劑。

在某些方面，聚核苷酸可以使用微流體裝置和/或噴墨印刷技術(shù)合成。例示性微流體聚核苷酸合成裝置示于圖17中以達(dá)到說明性目的并且并非按比例。包括調(diào)節(jié)器257的微流體通道255將儲(chǔ)槽253偶聯(lián)到反應(yīng)腔室251，并且包括調(diào)節(jié)器257的出口通道259可以從反應(yīng)腔室251中抽出廢棄物。用于聚核苷酸合成的微流體裝置可以包括(例如)通道255、儲(chǔ)槽253和/或調(diào)節(jié)器257。聚核苷酸合成可以出現(xiàn)在微流體反應(yīng)腔室251中，該微流體反應(yīng)腔室可以包括多種錨定的合成核苷酸起始因子，并且可以包括錨定或結(jié)合到反應(yīng)腔室的內(nèi)表面并且能夠可釋放地結(jié)合ntp類似物或聚核苷酸起始因子的珠粒或其它底物。反應(yīng)腔室251可以包括至少一個(gè)進(jìn)口和一個(gè)出口通道259，以使得可以向反應(yīng)腔室251中添加并且去除試劑。微流體裝置可以包括用于每一相應(yīng)ntp類似物的儲(chǔ)槽253。這些ntp類似物儲(chǔ)槽253中的每一者還可以包括適當(dāng)量的tdt或無模板方指向使dna或rna鏈伸長(zhǎng)的任何其它酶。其它儲(chǔ)槽253可以含有用于連接子/抑制因子裂解和洗滌的試劑。這些儲(chǔ)槽253可以經(jīng)由獨(dú)立通道255偶聯(lián)到反應(yīng)腔室251，并且經(jīng)由每一通道255進(jìn)入反應(yīng)腔室251中的試劑流可以經(jīng)由使用閘極、閥門、壓力調(diào)節(jié)器或其它手段個(gè)別地調(diào)節(jié)?？梢灶愃频卣{(diào)節(jié)經(jīng)由出口通道259從反應(yīng)腔室251中的流出。

在某些例子中，可以回收試劑，尤其ntp類似物酶試劑。試劑可以經(jīng)由同一通道255從反應(yīng)腔室251抽吸回其相應(yīng)儲(chǔ)槽253中，其通過使用閘極、閥門、壓力調(diào)節(jié)器或其它手段誘導(dǎo)反向流而穿過該通道?；蛘?，試劑可以經(jīng)由獨(dú)立回流通道從反應(yīng)腔室251中返回到其相應(yīng)儲(chǔ)槽253。微流體裝置可以包括能夠操作上文所述的閘極、閥門、壓力或其它調(diào)節(jié)器257的控制器。

例示性微流體聚核苷酸合成反應(yīng)可以包括使所需酶-ntp類似物試劑流入反應(yīng)腔室251中；在設(shè)定時(shí)間量之后，經(jīng)由出口通道259或返回通道從反應(yīng)腔室251中去除酶-ntp類似物試劑；使洗滌試劑流回反應(yīng)腔室251中；經(jīng)由出口通道259從反應(yīng)腔室251中去除洗滌試劑；使解封或裂解試劑流入反應(yīng)腔室251中；經(jīng)由出口通道259或返回通道從反應(yīng)腔室251中去除解封或裂解試劑；使洗滌試劑流入反應(yīng)腔室251中；經(jīng)由出口通道259從反應(yīng)腔室251中去除洗滌試劑；使待合成的所需序列中包括下一ntp的酶-ntp類似物試劑流入反應(yīng)腔室251中；并且重復(fù)直到合成所需聚核苷酸。在所需聚核苷酸已合成之后，其可以從反應(yīng)腔室錨定物或底物中釋放并且經(jīng)由出口通道259或其它手段收集。

在某些方面，包括ntp類似物、tdt和/或其它酶類的試劑和化合物和用于連接子/抑制因子裂解和/或洗滌的試劑可以使用噴墨印刷技術(shù)或壓電按需滴墨(dod)噴墨印刷技術(shù)沉積于反應(yīng)腔室中?？梢允褂脟娔∷⒓夹g(shù)形成小液滴，其可以經(jīng)由空氣沉積于反應(yīng)腔室中。試劑小液滴的體積可以為皮升到納升等級(jí)?？梢允褂冒?hz、10hz、100hz、1khz、2khz以及2.5khz的多個(gè)頻率的噴墨印刷技術(shù)引入液滴?？梢詫⒍喾N試劑儲(chǔ)存于噴墨印刷裝置內(nèi)的獨(dú)立儲(chǔ)槽中，并且噴墨印刷裝置可以將多種試劑的小液滴遞送到多個(gè)離散位置，包括例如不同反應(yīng)腔室或晶片內(nèi)的孔。在某些實(shí)施例中，可以將噴墨和微流體技術(shù)組合，其中某些試劑和化合物經(jīng)由噴墨印刷技術(shù)遞送到反應(yīng)腔室中，而其他試劑和化合物經(jīng)由微流體通道或管遞送。噴墨印刷裝置可以通過包含耦接到處理器的至少一非瞬時(shí)性實(shí)體存儲(chǔ)器的計(jì)算裝置來控制。計(jì)算裝置可以經(jīng)操作以接收來自包括例如觸摸屏、鼠標(biāo)或鍵盤的輸入裝置的輸入，并且控制噴墨印刷裝置沉積試劑小液滴的時(shí)間和位置、沉積的試劑和/或沉積的試劑的量。

在某些實(shí)例中，可以經(jīng)由輸入裝置將所需多核苷酸序列輸入到計(jì)算裝置中，其中該計(jì)算裝置經(jīng)操作以進(jìn)行必要反應(yīng)以通過以如上文所述的適當(dāng)次序相繼沉積適當(dāng)ntp類似物、酶、裂解試劑以及洗滌試劑產(chǎn)生所需多核苷酸序列。

在合成之后，釋放的延伸產(chǎn)物可以通過高分辨率page分析以確定與對(duì)照相比起始因子是否已延伸預(yù)期堿基數(shù)。還可以對(duì)一部分回收的合成dna測(cè)序以確定合成的聚核苷酸是否具有預(yù)期序列。

因?yàn)楹铣善飨鄬?duì)簡(jiǎn)單并且不需要亞磷酰胺合成所需的有毒組分，所以本發(fā)明的合成器可廣泛用于研究機(jī)構(gòu)、生物技術(shù)公司和醫(yī)院。另外，能重復(fù)使用/回收試劑將減少?gòu)U棄物產(chǎn)生并且有助于降低消耗品成本。本發(fā)明人預(yù)計(jì)該等方法和系統(tǒng)將適用于許多應(yīng)用，如dna測(cè)序、pcr以及合成生物學(xué)。

以引用的方式并入

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等效物

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