本發(fā)明涉及獲得新的合成的寡糖-蛋白質(zhì)(oligosaccharide-protein，OS-PR)綴合物的改進的綴合方法。本發(fā)明還涉及用于制備新的綴合物疫苗的新的合成OS-PR綴合物，其中所述寡糖為合成寡糖。

背景技術(shù)：

針對高分子量天然多糖抗原而產(chǎn)生的抗體識別對應(yīng)于天然細菌莢膜多糖中一小部分的寡糖。所述寡糖有希望可能成為先導(dǎo)疫苗候選物，因為其不僅具有免疫原性而且還可作為半抗原在其蛋白質(zhì)綴合物中發(fā)揮功能，所述蛋白質(zhì)綴合物可在動物模型和人中引發(fā)特異性抗體。在生物研究和新一代有機合成疫苗技術(shù)領(lǐng)域中的進展已經(jīng)提供了在有機合成實驗室中進行復(fù)雜寡糖片段的更有效化學(xué)組裝，這一般可在病原菌的表面上獲得并從其純化。

由天然多糖獲得的綴合物已經(jīng)被成功地開發(fā)為人疫苗。然而，其使用與例如以下問題相關(guān)：例如細菌多糖的大小和特性的顯著變化、在與載體蛋白化學(xué)綴合期間重要的免疫顯性特征受到破壞、綴合物中展現(xiàn)出顯著的異質(zhì)性以及存在高度毒性組分及其他可難以除去的宿主細胞雜質(zhì)。有機合成可以以高純度且相對大的量提供碳水化合物表位用于與載體蛋白的受控綴合。在這樣的方法中，合成的糖類裝備有人工間隔區(qū)以有利于與載體蛋白的選擇性綴合。

針對b型流感嗜血桿菌(Haemophilus influenza type b)相關(guān)疾病的綴合物疫苗的出現(xiàn)打開了疫苗學(xué)的新時代。開發(fā)新一代疫苗的主要里程碑之一是在預(yù)防兒童期腦膜炎及其他疾病中開發(fā)了b型流感嗜血桿菌的莢膜寡糖的合成片段的有效蛋白質(zhì)綴合物。關(guān)于開發(fā)合成寡糖及其綴合物的關(guān)鍵問題是多方面的，例如表位的大小、綴合物中每個蛋白質(zhì)的寡糖拷貝數(shù)、間隔區(qū)對免疫應(yīng)答的可能影響以及與動物模型的選擇相組合的載體蛋白的適當(dāng)選擇。

鑒于合成寡糖為生物研究(特別是在疫苗技術(shù)領(lǐng)域中)提供了有效的先導(dǎo)化合物的事實，關(guān)于合成寡糖及其蛋白質(zhì)綴合物的制備正進行大量的研究。然而，不存在用于制備具有生物重要性的寡糖的通用方案。每種先導(dǎo)綴合物分子的化學(xué)合成均是需要進行長時間且系統(tǒng)性的實驗的研究工程?，F(xiàn)有技術(shù)中報道的從原材料到產(chǎn)品的總過程時間需要20至24小時。常規(guī)寡糖及其蛋白質(zhì)綴合物的低產(chǎn)率、低穩(wěn)定性和低純度是主要考慮的問題。因此，迫切需要獲得具有更高穩(wěn)定性且偶聯(lián)有同質(zhì)性的合成的寡糖-蛋白質(zhì)綴合物以及以更佳的產(chǎn)率、穩(wěn)定性和純度獲得這樣的合成的綴合物疫苗的高效的合成OS-PR綴合方法。合成的綴合物疫苗的可負擔(dān)性和可用性是一個顯著問題，其需要以時間有效且有成本效益的方式來實現(xiàn)合成的綴合物疫苗的可用性的方法。

發(fā)明目的

為了消除現(xiàn)有技術(shù)的缺點，本發(fā)明的主要目的是提供獲得新的合成的寡糖-蛋白質(zhì)(OS-PR)綴合物的改進的綴合方法。

本發(fā)明的另一個目的提供改進的合成OS-PR綴合方法，其中所述方法能夠?qū)崿F(xiàn)寡糖-蛋白質(zhì)綴合物的更高產(chǎn)率、更高純度和更高穩(wěn)定性。

本發(fā)明的另一個目的是提供改進的合成OS-PR綴合方法，其中所述方法快速且方便地用于所述寡糖與載體蛋白的綴合。

本發(fā)明的另一個目的是提供有成本效益的改進的合成OS-PR綴合方法以獲得可負擔(dān)的寡糖-蛋白質(zhì)綴合物。

本發(fā)明的另一個目的是提供用于制備新綴合物疫苗的新的合成OS-PR綴合物。

本發(fā)明的另一個目的是提供新的合成OS-PR綴合物，其中所述寡糖為合成寡糖。

本發(fā)明的另一個目的是提供合成OS-PR綴合物，其中所述寡糖-蛋白質(zhì)綴合物引發(fā)特異性且均質(zhì)性的免疫應(yīng)答。

本發(fā)明的另一個目的是提供新的合成OS-PR綴合物，其用于制備用作單價疫苗或用作組合疫苗并且還用作診斷工具的新的基于合成寡糖的綴合物。

發(fā)明概述

因此，本發(fā)明提供了獲得新的合成OS-PR綴合物的改進的綴合方法。本發(fā)明的合成OS-PR綴合方法是提供引發(fā)高、單特異性且均質(zhì)性免疫應(yīng)答的OS-PR綴合物的快速方法。由此產(chǎn)生的綴合物提供可重現(xiàn)的結(jié)果，這增強基于這些綴合物的疫苗和診斷劑的可靠性。

由本發(fā)明方法獲得的新的合成OS-PR綴合物產(chǎn)生新的基于合成寡糖的綴合物疫苗。

所述合成的綴合物是合成的在于合成OS-PR綴合物中的寡糖部分為合成寡糖，而載體蛋白是從革蘭氏陽性菌獲得的。

本發(fā)明涉及選擇被修飾用于與蛋白質(zhì)綴合的合適長度的合成寡糖，優(yōu)選寡糖四聚體和八聚體(在下文中為寡聚體)。所述修飾包括以下步驟：向所述寡聚體添加接頭，使用硫醇化劑來活化所述寡聚體，然后純化所述活化的寡聚體(即硫醇化寡聚體)。在另一方面，通過活化來修飾合適的細菌蛋白，優(yōu)選但不限于破傷風(fēng)類毒素。使所述硫醇化寡聚體與所述活化的細菌蛋白綴合。

內(nèi)置入所述寡聚體中的接頭在所述寡聚體的末端提供氨基(-NH2)。所述末端氨基(-NH2)容易地可用于被硫醇化劑活化。所述硫醇化劑選自例如但不限于以下試劑的組：硫代乙酸和N-琥珀酰亞胺基S-乙?；虼宜狨?N-Succinimidyl S-Acetylthioacetate，SATA)，優(yōu)選SATA。然后，用選自還原劑組的親核體處理所得的巰基化化合物以獲得活化的寡聚體，然后將其純化。進行測定以確定每寡糖單位的硫醇單元。

使用例如N-(β-馬來酰亞胺基丙基氧基)琥珀酰亞胺酯(BMPS)的交聯(lián)劑來活化所述蛋白質(zhì)。將所述活化的寡糖和所述活化的蛋白質(zhì)保持在一定實驗條件下例如在特定溫度下持續(xù)特定時間以進行綴合。本發(fā)明的所述寡糖-蛋白質(zhì)綴合物的綴合化學(xué)是硫醚鍵(thio-ether linkage)。

本發(fā)明提供了其中全過程時間為14至22小時的合成綴合。本發(fā)明不需要氮吹掃(nitrogen purging)并且使用無需特殊操作技能的試劑，從而使所述方法方便且有成本效益。

本發(fā)明提供了親本寡聚體骨架的不經(jīng)任何修飾的綴合物，從而使全部表位保持完整以產(chǎn)生天然免疫應(yīng)答。

寡糖與蛋白質(zhì)比值在產(chǎn)生免疫應(yīng)答方面具有關(guān)鍵作用。本發(fā)明提供在蛋白質(zhì)上得到較高的寡糖負載以得到對于b型流感嗜血桿菌(Hib)和腦膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)血清組A、C、Y、W135或X(分別為MenA、MenC、MenY、MenW或MenX)而言期望的0.2至0.5的OS∶PR比值。對于Hib，寡糖蛋白質(zhì)綴合物的總體綴合產(chǎn)率為約45％至65％，對于MenA/C/Y/W/X血清組，為約21％至48％。本發(fā)明還使用N-琥珀酰亞胺基S-乙?；虼宜狨?SATA)來活化寡聚體。SATA可溶解于二甲基亞砜(dimethyl sulphoxide，DMSO)，并且能夠使得寡糖與硫醇化劑在緩沖液中快速混合，從而使方法變得容易。本發(fā)明還提供了其中進行單步驟純化的合成綴合方法，從而減少方法中的步驟，使得產(chǎn)率更佳且過程時間更短。

本發(fā)明的改進方法可用于制備大量可用于制備疫苗的綴合物。這樣的OS-TT綴合物的一些非限制性實例為Hib-TT綴合物、MenX-TT綴合物、MenC-TT綴合物、MenA-TT綴合物、MenW-TT綴合物、MenY-TT綴合物、Hib-CRM197綴合物、MenX-CRM197綴合物、MenC-CRM197綴合物、MenA-CRM197綴合物、MenW-CRM197綴合物、MenY-CRM197綴合物。所述疫苗可作為單一疫苗或作為組合疫苗制備。

在其中可使用合成OS-PR綴合方法的眾多實例中，在一個非限制性實例中，使所述合成制備的寡聚體與己胺(hexaylamine)接頭連接，并使用N-琥珀酰亞胺基S-乙?；虼宜狨?SATA)來活化，其中所述SATA溶解于二甲基亞砜(DMSO)中。使由此獲得的巰基化寡糖以非常低的流量經(jīng)受預(yù)定條件持續(xù)固定的時間并隨后純化。然后，將所述經(jīng)純化的寡聚體濃縮，并與至少一種親核體(例如鹽酸羥胺)反應(yīng)以獲得硫醇化寡糖。

將N-(β-馬來酰亞胺基丙基氧基)琥珀酰亞胺酯在N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)中的溶液與載體蛋白(例如，破傷風(fēng)類毒素(tetanus toxoid，TT)(從破傷風(fēng)梭菌(Clostridium tetani)獲得)或CRM197(白喉毒素的交叉反應(yīng)性突變體或非毒性突變體并且在本說明書中也稱為CRM))混合，并且在預(yù)定條件下保持固定的時間。然后，純化所述活化的載體蛋白的反應(yīng)混合物并收集。

將酯化或活化的載體蛋白與所述硫醇化寡聚體混合，并在預(yù)定條件下孵育過夜。使用超速離心過濾器或其他尺寸排阻裝置(例如，凝膠過濾色譜)來純化寡聚體-蛋白質(zhì)綴合物原料。

本發(fā)明的改進方法的最顯著成果是由合成OS-PR綴合提供了結(jié)果可重現(xiàn)的寡糖-蛋白質(zhì)綴合物，其例如但不限于：MenA-TT、MenC-TT、MenX-TT、MenY-TT、MenW-TT、Hib-TT綴合物。所述寡糖-蛋白質(zhì)綴合物引發(fā)特異性且均質(zhì)性的免疫應(yīng)答，并且可用于產(chǎn)生單價疫苗或多價組合疫苗且可用作診斷工具。

附圖簡述

圖1集合地示出了不同腦膜炎球菌血清組的合成的寡聚體的結(jié)構(gòu)示意圖。圖1a：MenA，圖1b：MenC，圖1c：MenY，圖1d：MenW₁₃₅和圖1e：MenX，其具有末端含胺接頭。

圖2a示出了產(chǎn)生反應(yīng)性末端硫醇基的寡聚體活化過程的示意圖。

圖2b示出了顯示產(chǎn)生對硫醇具有反應(yīng)性的馬來酰亞胺基團的載體蛋白活化的示意圖。

圖2c示出了顯示通過硫醚鍵使硫醇化的合成的寡聚體與經(jīng)馬來酰亞胺標(biāo)記的載體蛋白綴合的示意圖。

圖3a和3b示出了如在Waters UV/PDA檢測儀上觀察到的與活化蛋白質(zhì)(TT和CRM)相比的綴合的寡聚體(MenC)₄或(MenC)₈的HP-SEC峰譜。

圖3c示出了如在Waters UV/PDA檢測儀上觀察到的與活化蛋白質(zhì)相比的綴合的四聚體Hib的HP-SEC峰譜。

圖3d示出了如在Waters UV/PDA檢測儀上觀察到的與活化蛋白質(zhì)相比的綴合的MenX四聚體的HP-SEC峰譜。

圖4示出了(MenX)₄和(MenX)₄-TT綴合物的體外抗原特性，如根據(jù)針對細菌MenX多糖產(chǎn)生的抗體的百分比抑制所示。

圖5a示出了如通過ELISA評估的在1、2和3次劑量的合成的MenC綴合物之后瑞士白化病小鼠(Swiss albino mice)中相對于抗MenC血清IgG濃度的免疫應(yīng)答。

圖5b示出了在3次劑量之后(MenC)₄-TT綴合物相對于抗MenC血清殺菌測定效價的免疫應(yīng)答。

圖5c描述了在3次劑量之后(MenC)₈-TT綴合物相對于抗MenC血清殺菌測定效價的免疫應(yīng)答。

圖5d示出了瑞士白化病小鼠中在3次劑量的合成的(MenX)₄-TT綴合物之后相對于如通過ELISA評估的抗MenX IgG應(yīng)答和血清殺菌效價的免疫應(yīng)答。

帶有舉例說明和實施例的發(fā)明詳述

因此，本發(fā)明提供了用于制備可用于制備疫苗的合成的寡糖-蛋白質(zhì)綴合物的改進的綴合方法。

這樣的綴合物的一些非限制性實例為Hib-TT綴合物、MenX-TT綴合物、MenC-TT綴合物、MenA-TT綴合物、MenW-TT綴合物、MenY-TT綴合物、Hib-CRM197綴合物、MenX-CRM197綴合物、MenC-CRM197綴合物、MenA-CRM197綴合物、MenW-CRM197綴合物、MenY-CRM197綴合物。所述疫苗可作為單價疫苗或作為組合疫苗制備。

本發(fā)明涉及選擇合適的合成寡糖，優(yōu)選寡糖四聚體和八聚體，所述合成寡糖包含至少一個內(nèi)置的末端氨基接頭，所述合成寡糖模擬從例如腦膜炎奈瑟菌血清組A、C、Y、W135、X(圖1a、1b、1c、1d、1e)和流感嗜血桿菌的革蘭氏陰性菌獲得的具有末端氨基接頭(-NH2)的天然多糖。所述末端氨基(-NH2)容易地可用于被巰基化劑活化。促進末端氨基接頭轉(zhuǎn)化成巰基的巰基化劑選自例如但不限于以下試劑的組：乙酸酐、乙酰氯、N-乙?；甙腚装彼崃虼鷥?nèi)酯、高半胱氨酸硫代內(nèi)酯、硫代乙酸和N-琥珀酰亞胺基S-乙?；虼宜狨?SATA)，優(yōu)選SATA。將SATA溶解于二甲基亞砜(DMSO)中，并與所述合成寡糖的溶液在室溫下攪拌1小時。然后，將反應(yīng)混合物施加至凝膠過濾色譜，用HEPES緩沖液(約pH7.5)平衡以去除任何未反應(yīng)的SATA。然后，將所述經(jīng)SATA修飾的寡聚體與選自還原劑組的親核體(優(yōu)選鹽酸羥胺)在室溫下混合2小時以促進巰基轉(zhuǎn)化成反應(yīng)性硫醇基(圖2a)。進行寡糖含量的確定：MenC、MenY和MenW通過間苯二酚測定來進行，MenX和MenA通過Chen測定來進行，并且Hib通過苔黑酚(orcinol)測定來進行。通過Ellman測定來確定所有類型的寡聚體的硫醇基(-SH)含量。通過用硫醇濃度除以寡聚體的濃度(以摩計)來確定硫醇化程度(％)。

活化合適的細菌載體蛋白以產(chǎn)生反應(yīng)性馬來酰亞胺官能團，所述載體蛋白優(yōu)選但不限于破傷風(fēng)類毒素(TT)和交叉反應(yīng)性突變體(CRM197或簡單地CRM)或者其重組形式。使用脂肪族異雙官能交聯(lián)劑來活化所述載體蛋白，所述交聯(lián)劑優(yōu)選但不限于N-(β-馬來酰亞胺基丙基氧基)琥珀酰亞胺酯(BMPS)。將HEPES緩沖液(約pH7.6)中的所述載體蛋白(例如，TT和CRM197)與BMPS在N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)中的所述溶液在室溫下混合2小時。然后，將所述載體蛋白的反應(yīng)混合物用PBS緩沖液(約pH6.8)通過合適的離心截止過濾器洗滌6至7次(圖2b)。通過Lowry法使用BSA作為標(biāo)準(zhǔn)品來確定所述活化的載體蛋白的蛋白質(zhì)含量。通過Ellman測定來間接評估馬來酰亞胺含量，其中首先使經(jīng)馬來酰亞胺標(biāo)記的載體蛋白與已知量的β-巰基乙醇反應(yīng)并通過DTNB來分析未反應(yīng)的β-巰基乙醇。使用載體蛋白的摩爾濃度和馬來酰亞胺的摩爾濃度來計算每單位載體蛋白的馬來酰亞胺基團數(shù)量。

將HEPES緩沖液(約pH 7.5)中的硫醇化寡糖(選自例如腦膜炎奈瑟菌血清組A、C、Y、W135、X以及b型流感嗜血桿菌的革蘭氏陰性菌的組)和PBS緩沖液(約pH6.8)中的用馬來酰亞胺標(biāo)記的所述活化載體蛋白(選自破傷風(fēng)類毒素(TT)和交叉反應(yīng)性突變體(CRM197))混合在一起以進行綴合。優(yōu)選地在2至8℃下輕輕地攪拌pH為6.5至7.5的反應(yīng)混合物過夜，但是這也可在室溫下進行。通過50kD截止離心過濾器用MES緩沖液(約pH6.5)洗滌6至7次來純化粗制綴合物以除去未綴合的寡聚體和例如未反應(yīng)的鹽酸羥胺的雜質(zhì)。將最后的經(jīng)純化寡糖-蛋白質(zhì)綴合物通過0.2μ過濾器過濾并儲存在2至8℃下直到使用(圖2c)。本發(fā)明的所述寡糖-蛋白質(zhì)綴合物的綴合化學(xué)是硫醚鍵。

通過標(biāo)準(zhǔn)方法針對物理化學(xué)分析來進一步表征由所述改進的綴合方法獲得的寡糖-蛋白質(zhì)綴合物，例如蛋白質(zhì)含量、寡糖含量、寡糖與蛋白質(zhì)比值(oligosaccharide protein ratio)、游離寡糖的含量。通過高效尺寸排阻色譜(high performance size exclusion chromatography，HP-SEC)來分析綴合物以觀察反應(yīng)物向綴合物的轉(zhuǎn)化和分子大小分布(圖3a、3b、3c、3d)。進行測試由此獲得的寡糖-蛋白質(zhì)綴合物的抗原性(圖4)和動物免疫原性的研究(圖5a、5b、5c、5d)。

本發(fā)明提供了其中全過程時間為14至22小時的合成綴合。本發(fā)明不需要氮吹掃，并且使用無需特殊操作技能的試劑，從而使所述方法方便且有成本效益。

本發(fā)明提供了親本寡聚體骨架的不經(jīng)任何修飾的綴合物，從而使全部表位保持完整以產(chǎn)生天然免疫應(yīng)答。本發(fā)明還提供了其中進行單步驟純化的合成綴合方法，從而減少所述方法中的步驟，使得產(chǎn)率更佳且過程時間更短。

本發(fā)明的改進方法的最顯著成果是由合成OS-PR綴合提供了結(jié)果可重現(xiàn)的寡糖-蛋白質(zhì)綴合物，其例如但不限于：Hib-TT綴合物、MenX-TT綴合物、MenC-TT綴合物、MenA-TT綴合物、MenW-TT綴合物、MenY-TT綴合物、Hib-CRM197綴合物、MenX-CRM197綴合物、MenC-CRM197綴合物、MenA-CRM197綴合物、MenW-CRM197綴合物、MenY-CRM197綴合物。所述寡糖-蛋白質(zhì)綴合物引發(fā)特異性且均質(zhì)性的免疫應(yīng)答，并且可用于產(chǎn)生單價疫苗或多價組合疫苗且可用作診斷工具。

實施例1：產(chǎn)生反應(yīng)性硫醇官能團的寡聚體(MenA、MenC、MenY、MenW、MenX和Hib)的活化和分析

將合成寡糖在包含0.15M NaCl、10mM EDTA的0.1M HEPES緩沖液(pH 7.5)中濃度為10mg/ml的溶液與2.5×摩爾過量的S-乙酰基硫代乙醇酸N-羥基琥珀酰亞胺酯(SATA)在二甲基亞砜中的溶液混合。將溶液在室溫下輕輕攪拌1小時。使SATA與合成的寡聚體的接頭鏈中存在的胺反應(yīng)以形成用于在第二反應(yīng)步驟中產(chǎn)生反應(yīng)性硫醇基的乙?；虚g體。將反應(yīng)混合物施加到凝膠過濾色譜的sephadex G-10(GE Healthcare)柱(20至30ml床體積)上，所述柱用包含0.15M NaCl、10mM EDTA的0.1M HEPES緩沖液(pH 7.5)平衡以除去任何未反應(yīng)的SATA。使用平衡緩沖液以等度模式來在4.0ml洗脫劑中收集經(jīng)反應(yīng)的寡聚體，隨后將其濃縮至500μl。使由此獲得的經(jīng)SATA修飾的寡聚體以硫醇化寡聚體的濃度為約35摩爾過量來與鹽酸羥胺在包含0.15M NaCl、10mM EDTA的0.1M HEPES(pH 7.5)中的溶液混合。在室溫下混合2小時之后，將硫醇化的寡聚體儲存在-20℃下直到進一步使用?；罨丫垠w的示意圖示于圖2a中。使用MenX四聚體的兩種不同端基異構(gòu)體(即α端基異構(gòu)體(αXTM)和β端基異構(gòu)體(βXTM))來進行活化和綴合。

然后，將活化的寡聚體純化并分析寡糖含量和硫醇含量。

對于MenC、MenY和MenW，通過間苯二酚測定使用N-乙酰基神經(jīng)氨酸(NANA)作為標(biāo)準(zhǔn)品來確定寡糖含量；對于MenA和MenX，通過Chen測定使用磷作為標(biāo)準(zhǔn)品來確定寡糖含量；對于Hib，通過苔黑酚測定使用核糖作為標(biāo)準(zhǔn)品來確定寡糖含量。通過Ellman測定來確定硫醇基(SH)含量。通過用硫醇基的毫摩濃度除以寡聚體的毫摩濃度來獲得硫醇化％。寡聚體活化實驗的一些代表性結(jié)果在表1、2、3和4中給出。

表1：產(chǎn)生反應(yīng)性硫醇基的MenC合成四聚體(MenC)₄的活化

表2：產(chǎn)生反應(yīng)性硫醇基的MenC合成八聚體(MenC)₈的活化

表3：產(chǎn)生反應(yīng)性硫醇基的MenX合成四聚體(MenX)₄的活化

表4：產(chǎn)生反應(yīng)性硫醇基的Hib合成四聚體(Hib)₄的活化

寡聚體的活化過程產(chǎn)生活化的具有末端胺接頭的合成寡糖。如圖1a、1b、1c、1d、1e，圖1集合體地展示了用于通過硫醚綴合化學(xué)來制備不同寡聚體-蛋白質(zhì)綴合物的具有末端胺接頭的不同合成腦膜炎球菌血清組。

實施例2：產(chǎn)生反應(yīng)性馬來酰亞胺官能團的TT的活化和分析

取0.1M HEPES緩沖液(pH 7.6)中濃度為20mg/ml(0.133毫摩)的破傷風(fēng)類毒素(TT)并使其與1-甲基-2-吡咯烷酮中的7.2mg N-(β-馬來酰亞胺基丙基氧基)琥珀酰亞胺酯(BMPS)(27毫摩)反應(yīng)。在室溫下混合2小時之后，將反應(yīng)混合物用包含0.15M NaCl、5mM EDTA的0.1M PBS緩沖液(pH 6.8)通過50kD截止離心過濾器洗滌6至7次。在包含0.15M NaCl、5mM EDTA的0.1M PBS緩沖液(pH 6.8)中以0.5ml的體積收集活化的TT，并將其進一步用于實施例4中的綴合。TT的活化過程的示意圖示于圖2b中。

分析活化的蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)含量和馬來酰亞胺含量。通過Lowry法使用BSA作為標(biāo)準(zhǔn)品來確定活化的TT的蛋白質(zhì)含量；并且通過Ellman測定來間接評估馬來酰亞胺含量，其中首先使經(jīng)馬來酰亞胺標(biāo)記的TT與已知量的β-巰基乙醇反應(yīng)，并通過DTNB來分析未反應(yīng)的β-巰基乙醇。通過TT和馬來酰亞胺的摩爾濃度來計算每個TT分子的馬來酰亞胺數(shù)量。活化的TT的分析數(shù)據(jù)在表5中給出。

表5：產(chǎn)生反應(yīng)性馬來酰亞胺基團的蛋白質(zhì)(破傷風(fēng)類毒素)的活化

實施例3：產(chǎn)生反應(yīng)性馬來酰亞胺官能團的CRM197的活化

取1.8ml的0.1M HEPES緩沖液(pH 7.6)中濃度為25mg(0.24毫摩)的CRM197，并使其與1-甲基-2-吡咯烷酮中的2.6mg N-(β-馬來酰亞胺基丙基氧基)琥珀酰亞胺酯(BMPS)(3.7毫摩)反應(yīng)。在室溫下混合2小時之后，將反應(yīng)混合物用包含0.15M NaCl、5mM EDTA的0.1M PBS緩沖液(pH 6.8)通過10kD截止離心過濾器洗滌6至7次。在包含0.15M NaCl、5mM EDTA的0.1M PBS緩沖液(pH 6.8)中以0.5ml的體積收集活化的蛋白質(zhì)并將其進一步用于綴合。通過Lowry法測試活化的蛋白質(zhì)的總蛋白質(zhì)含量并通過Ellman測定來測試馬來酰亞胺含量以確定每CRM分子的馬來酰亞胺基團?；罨腃RM197的分析數(shù)據(jù)在表6中給出。

表6：產(chǎn)生反應(yīng)性馬來酰亞胺基團的CRM197的活化

實施例4：活化的寡聚體(Hib、MenA、MenC、MenY、MenW和MenX)與活化的蛋白質(zhì)(TT或CRM)通過硫醚鍵的綴合

使包含0.15M NaCl、10mM EDTA的0.1M HEPES緩沖液(pH 7.5)中濃度為10mg/ml的實施例1的硫醇化寡聚體與0.1M PBS、0.15MNaCl、5mM EDTA(pH 6.8)中新鮮制備的約10mg/ml的經(jīng)馬來酰亞胺標(biāo)記TT或CRM混合。將pH為pH 6.5至7.5(優(yōu)選7.0)的反應(yīng)混合物優(yōu)選地在2至8℃下在輕輕攪拌下保持過夜，攪拌還可在室溫下進行。用包含0.2M NaCl的0.05M MES緩沖液(pH 6.5)通過50kD截止離心過濾器洗滌6至7次來純化粗制綴合物以除去未綴合的寡聚體和例如未反應(yīng)的鹽酸羥胺的雜質(zhì)。將最后的經(jīng)純化綴合物通過0.2μ過濾器過濾并儲存在2至8℃下直到使用。綴合的示意圖示于圖2(2c)中。

實施例5：從實施例4獲得的MenC寡聚體綴合物的物理化學(xué)分析

通過Lowry測定使用0.25mg/ml BSA作為標(biāo)準(zhǔn)品來測試[MenC]₄和[MenC]₈綴合物的蛋白質(zhì)含量，并且通過唾液酸測定使用0.5mg/ml N-乙?；窠?jīng)氨酸(NANA)作為標(biāo)準(zhǔn)品來測試寡聚體含量。基于wt./wt.來在數(shù)學(xué)上計算寡糖與蛋白質(zhì)比值。在用脫氧膽酸鈉沉淀之后評價游離OS的量。向900μl的綴合物樣品(約100μg OS含量)中添加80μl的1％w/v脫氧膽酸鈉水溶液(pH 6.8±0.2)。將反應(yīng)混合物在2至8℃下保持30分鐘，添加50μl的1N HCl，并將樣品在6000×g下離心15分鐘。收集上清液并通過間苯二酚測定來評估游離糖的含量(表7、8、9)。在UV檢測儀上在串聯(lián)有TSKgel PWXL保護柱(6.0×40mm，TOSOH)的TSKgel 4000 PWXL(7.8×300mm，顆粒尺寸7μm，TOSOH)和TSKgel 3000 PWXL(7.8×300mm，顆粒尺寸7μm，TOSOH)上將綴合物的HPSEC峰譜與蛋白質(zhì)峰的HPSEC峰譜進行比較以確認所有的蛋白質(zhì)均轉(zhuǎn)化為綴合物。流動相為0.1M NaNO₃(pH 7.2)，以1.0ml/分鐘的流量以等度模式進行30分鐘。分別用葡聚糖(MW 50,00,000至400,00,000(HI-MEDIA))和氧化氘(D₂O，Merck)來確定空隙和總柱體積。在280nm下檢測蛋白質(zhì)和綴合物的峰，示于圖3a和圖3b中。不同批次的(MenC)₄-TT綴合物、(MenC)₈-TT綴合物、(MenC)_4和8-CRM綴合物的表征數(shù)據(jù)在表7、8和9中給出。

表7.不同批次的(MenC)₄-TT綴合物的表征

表8.不同批次的(MenC)₈-TT綴合物的表征

表9.不同批次的(MenC)_4和8-CRM綴合物的表征

實施例6：從實施例4獲得的Hib綴合物的物理化學(xué)分析

通過Lowry測定使用0.25mg/ml BSA作為標(biāo)準(zhǔn)品來確定經(jīng)純化綴合物的蛋白質(zhì)含量，通過苔黑酚測定使用0.2摩d-核糖作為標(biāo)準(zhǔn)品來確定總Hib含量，并且在數(shù)學(xué)上計算Hib與蛋白質(zhì)比值。在如前述實施例中進行的在1％脫氧膽酸鹽(DOC)沉淀之后在上清液中確定游離寡糖的含量。不同批次的(Hib)₄-TT綴合物的表征數(shù)據(jù)在表10中給出。如前述實施例中進行的，通過HP-SEC來分析(Hib)₄-TT綴合物，與用于綴合的經(jīng)修飾TT進行比較以確認完成蛋白質(zhì)(TT或CRM)向綴合物的轉(zhuǎn)化，示于圖3c中。

表10.不同批次的(Hib)₄-TT綴合物的表征

實施例7：從實施例4獲得的MenX綴合物的物理化學(xué)分析

通過針對磷的Chen測定使用0.2毫摩磷溶液作為標(biāo)準(zhǔn)品來測試[MenX]₄綴合物的寡聚體含量，并通過Lowry測定來測試蛋白質(zhì)含量。基于wt./wt.來在數(shù)學(xué)上計算寡糖與蛋白質(zhì)比值。通過間苯二酚測定來評估游離寡糖的量，并且在表11中給出。通過HPSEC來分析[MenXl₄綴合物以確定完成經(jīng)修飾的載體蛋白向MenX綴合物的轉(zhuǎn)化。綴合物的HPSEC峰譜示于圖3d中。

表11：不同批次的(MenX)₄-TT綴合物的表征

實施例8：從實施例4獲得的MenY綴合物的物理化學(xué)分析

通過唾液酸測定使用0.5mg/ml N-乙?；窠?jīng)氨酸(NANA)作為標(biāo)準(zhǔn)品來測試[MenY]₄綴合物的寡聚體含量，并且通過Lowry測定來測試蛋白質(zhì)含量?；趙t./wt.來在數(shù)學(xué)上計算寡糖與蛋白質(zhì)比值。通過間苯二酚測定來評估游離寡糖的量，并且在表12中給出。通過HPSEC來分析[MenY]₄綴合物以確證完成經(jīng)修飾的載體蛋白向[MenY]₄綴合物的轉(zhuǎn)化。

表12：不同批次的(MenY)₄-TT綴合物的表征

實施例9：從實施例4獲得的MenW135綴合物的物理化學(xué)分析

通過唾液酸測定使用0.5mg/ml N-乙?；窠?jīng)氨酸(NANA)作為標(biāo)準(zhǔn)品來測試[MenW]₄綴合物的寡聚體含量，并且通過Lowry測定來測試蛋白質(zhì)含量?；趙t./wt.來在數(shù)學(xué)上計算寡糖與蛋白質(zhì)比值。通過間苯二酚測定來評估游離寡糖的量，并且在表13中給出。通過HPSEC來分析[MenW]₄綴合物以確證完成經(jīng)修飾的載體蛋白向[MenW]₄綴合物的轉(zhuǎn)化。

表13：不同批次的(MenW)₄-TT綴合物的表征

實施例10：確定合成的MenX-TT綴合物的抗原特性

在競爭性酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)中經(jīng)合成的MenX四聚體-TT綴合物與MenX四聚體和無抗原對照的抗原性進行比較。在該測定中，在96孔微量滴定板(A板)中，將針對腦膜炎奈瑟菌血清組X的經(jīng)8,000倍稀釋的兔抗血清(228801；BD)與不同的抗原(合成的MenX四聚體-TT綴合物和合成的MenX四聚體)在37℃下孵育1小時，所述抗原在包含0.1％v/v Brij 35和5％FBS的磷酸緩沖鹽水中以不同的濃度(10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml、1000μg/ml)進行稀釋。用MenX細菌多糖和甲基化人血清白蛋白(methylated-Human Serum Albumin，m-HAS)的混合物包被單獨的板(B板)，隨后在于2℃至8℃下孵育過夜之后用5％FBS封閉。向該B板中添加來自A板的抗毒素-抗原混合物，并在37℃下孵育1小時且在室溫下孵育1小時。用包含0.1％Brij 35的磷酸緩沖鹽水(pH 7.4)洗滌板。將板用PBS(0.1％Brij 35和5％FBS)中經(jīng)過氧化物酶標(biāo)記的抗兔IgG抗體在室溫下孵育60分鐘。再次洗滌板，并用乙酸鈉緩沖液中的100μl過氧化物酶底物3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺-H₂O₂在室溫下孵育10分鐘。通過添加50μl的2M H₂SO₄來停止反應(yīng)。在ELISA讀數(shù)器(微板讀數(shù)器)上記錄吸光度(A₄₅₀)。將結(jié)果作為抑制率(％)相對于對濃度(μg/ml)繪制，并且示于圖4中。

實施例11：用MenC寡聚體綴合物免疫接種小鼠

在第0、14和28天用1μg寡聚體MenC綴合物免疫接種8只雌性BALB/c小鼠(5至8周齡)的組。所有免疫接種均通過皮下途徑施用200μl的疫苗稀釋物來進行。對于陰性(載劑)對照組，僅使用生理鹽水；對于免疫接種陽性對照組，使用了包含MenC細菌多糖綴合物的多價許可疫苗。在第14、28和35天收集血清。通過間接ELISA來評估特異性抗OS IgG抗體效價。按照表14，用不同的合成的MenC綴合物向動物給藥。表14：在小鼠模型中研究免疫原性的不同(MenC)₄綴合物制劑

實施例12：通過IgG ELISA來確定合成的MenC-TT和合成的MenC-CRM綴合物的抗原特性

通過每孔添加5μg/ml PS和m-HAS在PBS緩沖液(pH 7.4)中的100μl混合物來用MenC PS包被96孔板(Nunc Maxisorp)。將板在4℃下孵育過夜，并隨后用PBS緩沖液(PBS中有0.1％Brij 35，pH 7.4)洗滌三次，并每孔用200μl的在PBS緩沖液(PBS中的0.1％Brij 35，pH 7.4)中的5％FBS溶液在37℃下封閉1小時。在每個孵育步驟之后均進行3次PBS緩沖液洗滌。將參照和受試血清樣品在PBS緩沖液(PBS中的0.1％Brij 35、5％FBS，pH7.4)中稀釋，轉(zhuǎn)移至經(jīng)包被-封閉的板(200μl)，并連續(xù)稀釋兩倍，然后在4℃下孵育過夜。然后，每孔添加100μl的經(jīng)1∶1000稀釋的過氧化物酶綴合的抗鼠IgG，并在25℃下靜置1小時。每孔添加100μl的底物3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺-H₂O₂用于顯色。在25℃下顯色10分鐘之后，通過添加50μl的2M H₂SO₄來停止反應(yīng)，并在微板讀數(shù)器上在450nm下測量OD。使用Combistat軟件來評價每種制劑的抗MenC多糖IgG濃度(根據(jù)ELISA單位/ml)，并將幾何平均濃度(IgGGMC)示于圖5a中。

實施例13：合成(MenC)₄-TT綴合物和(MenC)₈-TT綴合物的血清殺菌測定(Serum Bactericidal Assay，SBA)

在綿羊血瓊脂板上在37℃與5％CO₂下培養(yǎng)腦膜炎奈瑟菌(N.meningitidis)血清組C細菌儲備物(13102^TM)過夜。挑選單獨的菌落，并將其在另一個綿羊血瓊脂板的表面上在37℃與5％CO₂下孵育4小時。將1或2環(huán)量的細菌懸浮于5ml的測定緩沖液(不含鈣和鎂的Hank平衡鹽溶液中的5％牛血清白蛋白)中，并將懸浮液的光密度(OD₆₅₀)調(diào)節(jié)至0.1，使用測定緩沖液進一步稀釋以獲得6至10×10⁴個菌落形成單位/ml的工作稀釋度。將質(zhì)量控制(quality control，QC)血清和受試血清樣品在56℃下熱滅活30分鐘。在微孔板中，將受試血清的20μl的連續(xù)兩倍稀釋物與10μl工作稀釋度的細菌和10μl幼兔補體(Pel-Freez)混合。對于陰性對照，將細菌在單獨的板中用幼兔補體且沒有受試血清以及用受試血清和經(jīng)熱滅活的幼兔補體孵育。通過輕輕地拍打測定板來使孔內(nèi)容物混合，并將板在37℃與5％CO₂下孵育1小時。通過劃線平板法將來自每個孔的10μl樣品平板接種在血瓊脂板上。將血瓊脂板在37℃與5％CO₂下孵育過夜并計數(shù)菌落。與相應(yīng)的活性補體對照相比在將細菌與反應(yīng)混合物孵育之后顯示每ml的菌落形成單位下降≥50％的最高血清稀釋度被認為是SBA效價。

考慮了6項不同的研究以與許可的疫苗相比來評價MenC四聚體的SBA效價，并且結(jié)果示于圖5b中。對于MenC八聚體的SBA效價評價，考慮了3項研究，并且結(jié)果示于圖5c中。

免疫和血清殺菌測定揭示，本發(fā)明的OS-PR綴合物產(chǎn)生更高的總IgG抗體效價。對于腦膜炎C寡糖綴合物，在以1μg劑量3次給藥之后，OS-PR綴合物顯示出為免疫接種前效價的4倍多高并且多達18倍高的IgG效價。對于MenC，總IgG效價與許可疫苗的效價相當(dāng)或或者比其更高。

對于MenC蛋白質(zhì)綴合物，功能性抗體效價(也稱為SBA效價)總是為免疫接種前SBA效價的4倍多高，并且與許可疫苗的效價相當(dāng)或比其更高。

實施例14：用(MenX)₄-TT綴合物免疫接種小鼠并且通過ELISA來確定IgG

在第0、14和28天用在生理鹽水中配制的1μg和0.1μg(200μl)(MenX)₄-TT綴合物通過皮下途徑免疫接種8只雌性BALB/c小鼠(5至8周齡)的組。對于陰性對照組，僅使用生理鹽水。在第14、28和35天收集血清。由于沒有可用于MenX組的商業(yè)疫苗，因此與陰性對照比較效價。研究包括兩個不同的劑量(1μg和0.1μg)以及評價兩個不同批次的αXTM-TT和一個批次的βXTM-TT綴合物。按照圖5d，取不同的(MenX)₄綴合物制劑來在小鼠模型中研究其免疫原性。

通過ELISA來評估特異性抗OS IgG抗體效價。通過每孔添加5μg/ml PS和m-HAS在PBS緩沖液(pH 7.4)中的100μl混合物來用細菌MenX PS包被96孔板(Nunc Maxisorp)。將板在4℃下孵育過夜，并隨后用PBS緩沖液(PBS中有0.1％Brij 35，pH 7.4)洗滌三次，并每孔用200μl的在PBS緩沖液(PBS中有0.1％Brij 35，pH 7.4)中的5％FBS溶液在37℃下封閉1小時。在每個孵育步驟之后均進行3次PBS緩沖液洗滌。將所有的血清樣品在PBS緩沖液(PBS中有0.1％Brij 35、5％FBS，pH 7.4)中稀釋，轉(zhuǎn)移到經(jīng)包被-封閉的板中(200μl)，并連續(xù)稀釋兩倍，然后在4℃下孵育過夜。然后，每孔添加100μl的經(jīng)1∶1000稀釋的過氧化物酶綴合的抗小鼠IgG，并在25℃下靜置1小時。每孔添加100μl的底物3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺-H₂O₂用于顯色。在25℃顯色10分鐘之后，通過添加50μl的2M H₂SO₄來停止反應(yīng)，并在微板讀數(shù)器上在450nm下測量OD。使用Combistat軟件來評價每種制劑的IgG GMC，如圖5d中所示。

實施例15：合成的(MenX)₄-TT綴合物的血清殺菌測定(SBA)

在綿羊血瓊脂板上在37℃與5％CO₂下培養(yǎng)腦膜炎奈瑟菌血清組X細菌儲備物(35560)過夜。挑選單獨的菌落并將其在另一個綿羊血瓊脂板的表面上在37℃與5％CO₂下孵育4小時。將1或2環(huán)量的細菌懸浮于5ml的測定緩沖液(不含鈣和鎂的Hank平衡鹽溶液中的5％牛血清白蛋白)中，并將懸浮液的光密度(OD650)調(diào)節(jié)至0.1，使用測定緩沖液進一步稀釋至6至10×10⁴個菌落形成單位/ml的工作稀釋度。將質(zhì)量控制(QC)血清和受試血清樣品在56℃下熱滅活30分鐘。在微孔板中，將受試血清的20μl的連續(xù)兩倍稀釋液與10μl工作稀釋度的細菌和10μl幼兔補體(Pel-Freez)混合。對于陰性對照，將細菌在單獨的板中用幼兔補體且沒有受試血清以及用受試血清和熱滅活的幼兔補體孵育。通過輕輕地拍打測定板來使孔內(nèi)容物混合，并將板在37℃與5％CO₂下孵育1小時。通過劃線平板法將來自每個孔的10μl樣品平板接種在血瓊脂板上。將血瓊脂板在37℃與5％CO₂下孵育過夜并計數(shù)菌落。與相應(yīng)的活性補體對照相比，在將細菌與反應(yīng)混合物孵育之后顯示每ml的菌落形成單位下降≥50％的最高血清稀釋度被認為是SBA效價。

相對于陰性(載劑)對照血清和未綴合的MenX四聚體來評價三種不同的MenX綴合物，并且結(jié)果如圖5d所示。MenX-TT綴合物的總IgG和SBA效價是陰性(載劑)對照的至少四倍高，并且與陰性(載劑)對照相比，總IgG為多達45倍高，并且SBA效價為多達350倍高。