本發(fā)明涉及用于免疫治療方法的肽、蛋白質、核酸和細胞。特別是，本發(fā)明涉及癌癥的免疫療法。本發(fā)明還涉及單獨使用或與其他腫瘤相關肽(刺激抗腫瘤免疫反應或體外刺激t細胞和轉入患者的疫苗復合體的活性藥物成分)聯(lián)合使用的腫瘤相關t細胞(ctl)肽表位。與主要組織兼容性復合體(mhc)分子結合的肽或與此同類的肽也可能是抗體、可溶性t細胞受體和其他結合分子的靶標。特別是，本發(fā)明涉及數(shù)種新型肽序列及其變體，它們源自人腫瘤細胞的hla-i類和hla-ii類分子，可用于引發(fā)抗腫瘤免疫反應的疫苗組合物中或作為開發(fā)藥物/免疫活性化合物和細胞的目標。發(fā)明背景肝細胞癌(hcc)是世界上最常見的腫瘤之一，占全世界所有確診新發(fā)癌癥病例的大約6％。2012年，全球大約有782,000例hcc新發(fā)病例，使之成為男性中第五位最常見癌癥(554,000例)、女性中第九位常見癌癥(228,000例)(http：//globocan.iarc.fr)。hcc是最常見的原發(fā)性肝惡性腫瘤，占所有成人原發(fā)性肝癌80％以上。hcc的地域分布不同，發(fā)病率取決于性別。男性hcc年齡標準化發(fā)病率(asr)為東亞(31.9)和東南亞(22.2)最高，南歐(9.5)和北美(9.3)中等，北歐(4.6)和中南亞(3.7)最低。女性hcc發(fā)病率比男性asr低。女性最高asr為東亞(10.2)和西部非洲(8.1)，最低為北歐(1.9)和密克羅尼西亞(1.6)。hcc患者的總體預后較差。hcc的5年相對生存率(5y-rsr)約為15％，這取決于診斷時的疾病階段。對于癌癥仍然局限于肝臟的局部hcc，5y-rsr約為28％。對于癌癥已經(jīng)發(fā)展至附近或遠處的器官區(qū)域和遠程hcc，5y-rsr分別為7％和2％。hcc的發(fā)生與多種危險因素相關，肝硬化是最重要的一種危險因素。肝硬化常因酗酒或乙型肝炎病毒(hbv)或丙型肝炎病毒(hcv)感染所致，但也可能由代謝疾病(如ii型糖尿病)引起。因此，健康的肝組織被瘢痕組織取代，這增加了發(fā)生癌癥的風險。疾病管理取決于診斷時腫瘤的階段以及肝臟的整體狀況。如有可能，可透過手術切除部分肝臟(肝部分切除術)或整個器官(肝切除)。特別是腫瘤小或腫瘤可完全切除的患者有資格接受肝臟移植。如果手術不是一種治療選項，可用現(xiàn)有的其他療法。腫瘤消融時，探針被注入肝臟，腫瘤被無線電或微波或冷凍治療破壞。在栓塞程序中，腫瘤的血液供應被機械或化學方式阻斷。在放射療法中，可用高能量無線電波破壞腫瘤。hcc的化療包括用于全身治療的多柔比星、5-氟尿嘧啶和順鉑的組合以及用于肝動脈輸注的多柔比星、氟尿苷和絲裂霉素c。但是，大多數(shù)hcc病例均于對化療藥物表現(xiàn)出很高的耐藥性(enguita-germanandfortes，2014)。晚期不可切除hcc的治療選項僅限于索拉非尼(一種多酪氨酸激酶抑制劑)(changetal.，2007；wilhelmetal.，2004)。索拉非尼是唯一被證實可延長生存期大約3個月的全身性藥物，目前是此類患者的唯一實驗性治療方案(chapiroetal.，2014；llovetetal.，2008)。最近，對于hcc進行了少量的免疫療法試驗。細胞因子已被用于啟動免疫細胞的亞群和/或增加腫瘤免疫原性(reinischetal.，2002；sangroetal.，2004)。其他的試驗主要關注腫瘤浸潤性淋巴細胞或活化外周血淋巴細胞的輸注(shietal.，2004a；takayamaetal.，1991；takayamaetal.，2000)。到目前為止，已經(jīng)進行了少量的治療性疫苗接種試驗。butterfield等人使用源自甲胎蛋白(afp)的肽或載有afp肽的樹突細胞(dc)進行了兩項體外試驗(butterfieldetal.，2003；butterfieldetal.，2006)。在兩項不同的研究中，自體樹突細胞用自體腫瘤裂解物(leeetal.，2005)或肝母細胞瘤細胞系hepg2的裂解物(palmeretal.，2009)進行體外沖擊。到目前為止，疫苗接種試驗僅顯示臨床結果的有限改善。發(fā)明摘要在本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明涉及一種肽，包含選自包括seqidno：1至seqidno：300的組的一個氨基酸序列、或該序列的與seqidno：1至seqidno：300具有至少80％，優(yōu)選至少90％同源(優(yōu)選至少80％或至少90％相同)的一種變體序列(其中所述變體與mhc結合和/或誘導t細胞與所述肽發(fā)生交叉反應)，或其藥用鹽(其中所述肽不是潛在全長多肽)。本發(fā)明進一步涉及本發(fā)明的一種肽，包含選自包括seqidno：1至seqidno：300的組的一個序列、或與seqidno：1至seqidno：300具有至少80％、優(yōu)選至少88％同源性的一種變體，其中所述肽或其變體的總長度為8至100個、優(yōu)選為8至30個、最優(yōu)選為8至14個氨基酸。下表顯示了根據(jù)本發(fā)明的肽、它們各自的序列id號(seqidno)、以及這些肽的可能源(潛在)基因。表1中所有的肽與hla-a＊02等位基因、表2中的肽與hla-a＊24等位基因結合。表3中的肽之前在大型列表中披露，作為高通量篩查結果，錯誤率高，或使用算法計算出，但之前與癌癥毫無關聯(lián)。他們與hla-a＊02結合。表4中的肽是可與本發(fā)明其他肽組合使用的其他肽。肽與a＊02結合或另有說明時與a＊24結合。表5中的肽還可用于診斷和/或治療各種惡性疾病，這些疾病涉及過度表達或過度提呈各潛在多肽。表1：本發(fā)明中的hla-a＊02肽-s＊＝磷酸絲氨酸表2：本發(fā)明中的hla-a＊24肽，含序列id號-s＊＝磷酸絲氨酸表3：本發(fā)明中的其他肽，之前與癌癥無已知的關聯(lián)-s＊＝磷酸絲氨酸表4：用于個性化癌癥療法的肽-s＊＝磷酸絲氨酸本發(fā)明還一般涉及本發(fā)明的肽用于治療增殖性疾病，例如，胰腺癌、結腸癌或直腸癌、腎癌、腦癌和/或白血病。特別優(yōu)選的是本發(fā)明的肽(單獨或組合)，其選自包括seqidno：1至seqidno：300的組。更優(yōu)選的是所述肽(單獨或組合)選自包括seqidno：1至seqidno：124的組(見表1)優(yōu)選為與a＊02結合，以及選自包括seqidno：187至seqidno：218的組(見表2)優(yōu)選為與a＊24結合，并且其用于hcc、腦癌、腎癌、胰腺癌、結腸癌或直腸癌或白血病的免疫治療，優(yōu)選為hcc的免疫治療。如示下面的表5a和5b所示，其中本發(fā)明的許多肽還可用于其他適應癥的免疫治療。該表顯示，對于其他腫瘤類型的選定肽，發(fā)現(xiàn)它們過量提呈(特定提呈)于5％以上測定的腫瘤樣本，或提呈于5％以上測定的腫瘤樣本且?guī)缀螌W平均值腫瘤與正常組織的比值大于3。過度提呈定義為與最高提呈的正常樣本相比，腫瘤樣本中的提呈更高。經(jīng)過度提呈的正常組織有：脂肪組織、腎上腺、血細胞、血管、骨髓、腦、軟骨、食道、眼、膽囊、心臟、腎、大腸、肝、肺、淋巴結、神經(jīng)、胰腺、甲狀旁腺、腹膜、垂體、胸膜、唾液腺、骨骼肌、皮膚、小腸、脾、胃、甲狀腺、氣管、輸尿管、膀胱。表5a：本發(fā)明的肽及其在其他增殖性疾病(特別是其他癌性疾病)中的特定用途-s＊＝磷酸絲氨酸表5b：本發(fā)明的肽及其在其他增殖性疾病(特別是其他癌性疾病)中的特定用途-s＊＝磷酸絲氨酸nsclc＝非小細胞肺癌，sclc＝小細胞肺癌，rcc＝腎癌，crc＝結腸或直腸癌，gc＝胃癌，hcc＝肝癌，pc＝胰腺癌，prc＝前列腺癌，白血病，brca＝乳腺癌，mcc＝merkel細胞癌，oc＝卵巢癌，nhl＝非霍奇金淋巴瘤，aml＝急性骨髓性白血病，cll＝慢性淋巴細胞白血病。因此，本發(fā)明的另一個方面涉及根據(jù)seq序列號1、14、15、41、43、58、59、60、81、121、135、139、144、176、236、248、275、276、283、286、288、289、290、291、300、302、304、308、313、316、317、325、326、329、331、334、342和343中任一項所述的本發(fā)明的至少一種肽與一種優(yōu)選實施方案的肽聯(lián)合用于治療胰腺癌。因此，本發(fā)明的另一個方面涉及根據(jù)seq序列號6、15、16、22、26、30、34、36、47、59、65、69、70、77、80、81、88、121、123、125、127、133、137、139、169、172、176、181、186、221、223、229、230、231、232、233、234、236、237、238、244、247、249、250、251、255、260、261、266、269、271、274、275、282、285、289、290、291、293、297、301、302、304、306、310、313、316、317、319、327、328、329、330、331、332、334和342中任一項所述的本發(fā)明的至少一種肽與一種優(yōu)選實施方案中的肽聯(lián)合用于治療結腸癌或腎癌。因此，本發(fā)明的另一個方面涉及根據(jù)seq序列號10、14、15、22、36、39、54、55、60、72、77、81、90、96、112、116、119、121、133、137、138、148、169、170、172、177、186、187、189、192、197、198、203、206、219、221、229、230、233、234、236、255、260、270、272、275、277、278、279、281、282、285、289、291、292、295、296、297、301、302、305、308、311、313、315、316、319、321、324、328、329、333、334、335、336和346中任一項所述的本發(fā)明的至少一種肽與一種優(yōu)選實施方案中的肽聯(lián)合用于治療腎癌。因此，本發(fā)明的另一個方面涉及根據(jù)seq序列號14、15、16、17、36、39、47、51、54、65、88、101、123、125、133、134、135、137、141、147、161、166、169、176、179、184、186、187、189、191、192、193、194、195、196、197、199、203、206、208、214、220、221、224、229、230、231、234、238、239、244、245、250、251、255、258、259、260、268、269、270、271、272、278、279、282、295、297、302、304、305、306、309、310、311、312、313、316、317、319、321、325、327、328、329、330、331、332、333、334、336、337、338、339、340、342、343、344、345和347中任一項所述的本發(fā)明的至少一種肽與一種優(yōu)選實施方案中的肽聯(lián)合用于治療腦癌。因此，本發(fā)明的另一個方面涉及根據(jù)序列id號172、173、240、250、287、299、302、334和335中任一項所述的本發(fā)明的至少一種肽與一種優(yōu)選實施方案中的肽聯(lián)合用于治療cll。同樣，上面表5b列出的肽可以與一種優(yōu)選實施方案中的肽聯(lián)合形成治療適應疾病的基礎。因此，本發(fā)明的另一個方面涉及本發(fā)明中肽的用途-優(yōu)選聯(lián)合用于治療選自hcc、腦癌、腎癌、胰腺癌、結腸癌或直腸癌和白血病組中的增殖性疾??；本發(fā)明還涉及本發(fā)明的肽，其具有與主要組織兼容性復合體(mhc)i或以拉長形式存在的例如長度變化的-mhc-ii類分子結合的能力。本發(fā)明進一步涉及本發(fā)明中的肽，其中所述肽(每種肽)系由或基本系由根據(jù)seqidno1至seqidno300的一個氨基酸序列組成。本發(fā)明進一步涉及本發(fā)明的肽，其中所述肽被修飾和/或包含非肽鍵。本發(fā)明進一步涉及本發(fā)明的肽，其中所述肽為融合蛋白的一部分，特別是與hla-dr抗原相關不變鏈(ii)的n-端氨基酸融合，或與抗體(例如，樹突狀細胞特定抗體)或抗體的序列融合。本發(fā)明進一步涉及一種核酸，其編碼本發(fā)明的肽。本發(fā)明進一步涉及一種本發(fā)明的核酸，為dna、cdna、pna、rna，也可能為其組合物。本發(fā)明進一步涉及一種能表達和/或表達本發(fā)明核酸的表達載體。本發(fā)明進一步涉及本發(fā)明的一種肽、本發(fā)明的一種核酸或本發(fā)明的一種表達載體，其用于治療疾病和用于藥物，特別用于治療包括癌癥和自身免疫性/炎癥/免疫病理性疾病在內的疾病。本發(fā)明進一步涉及本發(fā)明中肽或本發(fā)明中所述肽復合體(含有mhc)的抗體以及制造這些抗體的方法。本發(fā)明進一步涉及本發(fā)明的t細胞受體(tcr)，特別是可溶性tcr(stcr)和加工為自體或異體t細胞的克隆tcr，以及制造這些tcr的方法和載有所述tcr或所述tcr交叉反應的nk細胞的制造方法?？贵w和tcr是根據(jù)本發(fā)明的肽現(xiàn)有免疫治療用途的另外實施方案。本發(fā)明進一步涉及含本發(fā)明核酸或前述表達載體的一種宿主細胞。本發(fā)明進一步涉及本發(fā)明的宿主細胞，其為抗原提呈細胞，優(yōu)選為樹突細胞。本發(fā)明進一步涉及配制本發(fā)明一種肽的一種方法，所述方法包括培養(yǎng)本發(fā)明的宿主細胞和從所述宿主細胞或其培養(yǎng)基中分離肽。本發(fā)明進一步涉及本發(fā)明中的所述方法，其中抗原透過與足夠量的含抗原提成細胞的抗原結合被載入表達于合適抗原提呈細胞或人工抗原呈遞細胞表面的i或ii類mhc分子。本發(fā)明進一步涉及本發(fā)明的方法，其中抗原提呈細胞由能表達含seqidno.1至seqidno.300、優(yōu)選為含seqidno.1至seqidno.124、以及seqidno.187至seqidno.：218所述肽的一個表達載體、或一個變體氨基酸序列組成。本發(fā)明進一步涉及以本發(fā)明方法制備的啟動t細胞，其中所述t細胞有選擇性地識別一種細胞，該細胞表達含一種本發(fā)明氨基酸序列的多肽。本發(fā)明進一步涉及一種殺傷患者靶細胞的方法，其中患者的靶細胞異常表達含本發(fā)明任何氨基酸序列的多肽，該方法包括給予患者按本發(fā)明方法制造的有效量t細胞。本發(fā)明進一步涉及任何所述肽、本發(fā)明的核酸、本發(fā)明的表達載體、本發(fā)明的細胞、本發(fā)明的作為藥劑或制造藥劑的啟動t淋巴細胞、t細胞受體或抗體或其他肽-和/或肽-mhc結合分子的用途。藥劑優(yōu)選為具有抗癌活性。優(yōu)選情況為，所述藥劑為基于可溶性tcr或抗體的細胞治療藥物、疫苗或蛋白質。本發(fā)明進一步涉及一種本發(fā)明的用途，其中所述癌細胞為hcc、腦癌、腎癌、胰腺癌、結腸癌或直腸癌或白血病，優(yōu)選為hcc細胞。本發(fā)明進一步涉及一種基于本發(fā)明肽的特定標志物蛋白和生物標志物，在此稱為“靶標”，其可用于診斷和/或判斷hcc的預后。本發(fā)明還涉及這些癌癥治療中新靶點的用途。mhc分子有兩類：mhci類和mhcii類。mhc分子分別由一條α重鏈和β-2-微球蛋白(mhc-i類受體)或一條α和一條β鏈(mhc-ii類受體)組成。其三位構造形成一個結合槽，用于與肽進行非共價相互作用。大部分有核細胞上都可發(fā)現(xiàn)mhc-i類分子。它們提呈主要為內源性的蛋白、缺陷核糖體產物(drip)和較大肽裂解生成的肽。mhcii類分子主要發(fā)現(xiàn)于專業(yè)抗原提呈細胞(apc)上，并且主要提呈在內吞作用過程中由apc占據(jù)并且隨后被加工的外源性或跨膜蛋白的肽。肽和mhci類的復合體由負載相應tcr(t細胞受體)的cd8陽性t細胞進行識別，而肽和mhcii類分子的復合體由負載相應tcr的cd4陽性輔助t細胞進行識別。因此，tcr、肽和mhc按照1∶1∶1的化學計量呈現(xiàn)，這一點已是共識。cd4陽性輔助t細胞在誘導和維持cd8陽性細胞毒性t細胞的有效反應中發(fā)揮重要作用。腫瘤相關抗原(taa)衍生的cd4陽性t細胞表位的識別對開發(fā)能引發(fā)抗腫瘤免疫反應的藥物產品可能非常重要(gnjatics，etal.surveyofnaturallyoccurringcd4+tcellresponsesagainstny-eso-1incancerpatients：correlationwithantibodyresponses.procnatlacadsciusa.2003jul22；100(15)：8862-7)。在腫瘤部位，t輔助細胞支持毒性t細胞(ctl)友好型細胞因子環(huán)境(mortaral，etal.ciita-inducedmhcclassiiexpressioninmammaryadenocarcinomaleadstoath1polarizationofthetumormicroenvironment，tumorrejection，andspecificantitumormemory.clincancerres.2006jun1；12(11pt1)：3435-43)并吸引效應細胞，如ctl、nk細胞、巨噬細胞、粒細胞(hwangml，etal.cognatememorycd4+tcellsgeneratedwithdendriticcellpriminginfluencetheexpansion，trafficking，anddifferentiationofsecondarycd8+tcellsandenhancetumorcontrol.jlmmunol.2007nov1；179(9)：5829-38)。在沒有炎癥的情況下，mhcii類分子的表達主要局限于免疫系統(tǒng)細胞，尤其是專業(yè)抗原提呈細胞(apc)，例如，單核細胞、單核細胞源性細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞。在癌癥患者的腫瘤細胞中發(fā)現(xiàn)有mhcii類分子的表達(dengjelj，etal.unexpectedabundanceofhlaclassiipresentedpeptidesinprimaryrenalcellcarcinomas.clincancerres.2006jul15；12(14pt1)：4163-70)。本發(fā)明的拉長(較長)肽可作為mhc-ii類活性表位。mhc-ii類表位活化的輔助t細胞在編排抗腫瘤免疫的ctl效應子功能中發(fā)揮著重要作用。觸發(fā)th1細胞反應的輔助t細胞表位支援cd8陽性殺傷t細胞的效應子功能，其中包括直接作用于腫瘤細胞的細胞毒性功能(該類腫瘤細胞表面顯示有腫瘤相關肽/mhc復合體)。這樣，腫瘤相關t輔助細胞表位單獨使用或與其他腫瘤相關肽結合使用可作為刺激抗腫瘤免疫反應的疫苗化合物的活性藥物成分。哺乳動物(如小鼠)模型顯示，即使沒有cd8陽性t淋巴細胞，cd4陽性t細胞也能透過分泌干擾素-y(ifny)抑制血管生成而足以抑制腫瘤的表現(xiàn)。已有cd4t細胞作為直接抗腫瘤效應因子的證據(jù)(braumulleretal.，2013；tranetal.，2014)。由于hlaii類分子的組成性表達通常僅限于免疫細胞，因此，直接從原發(fā)腫瘤中分離ii類肽被認為是不可能的事。然而，dengjel等人成功地在腫瘤中直接識別了多個mhcii類表位(wo2007/028574，ep1760088b1)。腫瘤特異性細胞毒性t淋巴細胞所識別的抗原，即其表位，可以是源自所有蛋白類型的分子，如酶、受體、轉錄因子等，它們在相應腫瘤的細胞中被表達，并且與同源未變的細胞相比，其表達通常上調。由于cd8依賴型和cd4依賴型這兩種反應共同并協(xié)同地促進抗腫瘤作用，因此，確定和表征由cd8+t細胞(配體：mhci類分子+肽表位)或cd4陽性t輔助細胞(配體：mhcii類分子)識別的腫瘤相關抗原對開發(fā)腫瘤疫苗非常重要。對于mhci類肽觸發(fā)(引發(fā))細胞免疫反應，它也必須與mhc分子結合。這一過程依賴于mhc分子的等位基因以及肽氨基酸序列的特異性多態(tài)性。mhc-i類-結合肽的長度通常為8-12個氨基酸殘基，并且在其與mhc分子相應結合溝槽相互作用的序列中通常包含兩個保守殘基(“錨”)。這樣，每個mhc的等位基因都有“結合基序”，從而確定哪些肽能與結合溝槽特異性結合。在mhc-i類依賴性免疫反應中，肽不僅能與腫瘤細胞表達的某些mhc-i類分子結合，而且它們之后還必須能被t細胞負載的特異性t細胞受體(tcr)識別。目前將腫瘤相關肽分類為以下主要幾組：a)癌-睪丸抗原：t細胞能夠識別的最先確認的taa屬于這一類抗原，由于其成員表達于組織學相異的人腫瘤中、正常組織中、僅在睪丸的精母細胞/精原細胞中、偶爾在胎盤中，因此，它最初被稱為癌-睪丸(ct)抗原。由于睪丸細胞不表達hlai類和ii類分子，所以，在正常組織中，這些抗原不能被t細胞識別，因此在免疫學上可考慮為具有腫瘤特異性。ct抗原大家熟知的例子是mage家族成員或ny-eso-1。b)分化抗原：腫瘤和正常組織(腫瘤源自該組織)都含有taa，大多數(shù)taa發(fā)現(xiàn)于黑色素瘤和正常黑色素細胞中。許多此類黑色素細胞譜系相關蛋白參與黑色素的生物合成，因此這些蛋白不具有腫瘤特異性，但是仍然被廣泛用于癌癥的免疫治療。例子包括，但不僅限于，黑色素瘤的酪氨酸酶和melan-a/mart-1或前列腺癌的psa。c)過度表達的taa：在組織學相異的腫瘤中以及許多正常組織中都檢測到了基因編碼被廣泛表達的taa，一般表達水平較低。有可能許多由正常組織加工和潛在提呈的表位低于t細胞識別的閾值水平，而它們在腫瘤細胞中的過度表達能夠透過打破先前確立的耐受性而引發(fā)抗癌反應。這類taa的典型例子為her-2/neu、生存素、端粒酶或wt1。d)腫瘤特異性抗原：這些獨特的taa產生于正常基因(如β-catenin、cdk4等)的突變。這些分子變化中有一些與致瘤性轉化和/或進展相關。腫瘤特異性抗原一般可在不對正常組織帶來自體免疫反應風險的情況下誘導很強的免疫反應。另一方面，這些taa在多數(shù)情況下只與其上確認了有taa的確切腫瘤相關，并且通常在許多個體腫瘤之間并不都共享taa。在含有腫瘤特定(相關)同種型蛋白的情況下，如果肽源自腫瘤(相關)外顯子也可能出現(xiàn)肽腫瘤特異性(或相關性)。e)由異常翻譯后修飾產生的taa：此類taa可能由腫瘤中既不具有特異性也不過度表達的蛋白產生，但其仍然具有腫瘤相關性(該相關性由主要對腫瘤具有活性的翻譯后加工所致)。此類taa產生于變糖基化模式的改變，導致腫瘤產生針對muc1的新型表位或在降解過程中導致諸如蛋白拼接的事件，這可能具有也可能不具有腫瘤特異性。f)腫瘤病毒蛋白：這些tta是病毒蛋白，可在致癌過程中發(fā)揮關鍵作用，并且由于它們是外源蛋白(非人源蛋白)，所以能夠激發(fā)t細胞反應。這類蛋白的例子有人乳頭狀瘤16型病毒蛋白、e6和e7，它們在宮頸癌中表達。對于被細胞毒性t淋巴細胞識別為腫瘤特異性抗原或相關性抗原以及用于治療的蛋白質，必須具備特殊的條件。該抗原應主要由腫瘤細胞表達，而不由正常健康組織表達，或表達數(shù)量相對較少。在一個優(yōu)選的實施方案中，與正常健康組織相比，所述肽應在腫瘤細胞中過度提呈。更為適宜的情況是，該相應抗原不僅出現(xiàn)于一種腫瘤中，而且濃度(即每個細胞的相應肽拷貝數(shù)目)高。腫瘤特異性抗原和腫瘤相關抗原往往是源自直接參與因細胞周期控制或凋亡抑制中的其功能而發(fā)生的正常細胞向腫瘤細胞轉化的蛋白。另外，這些直接導致轉化事件的蛋白的下游靶標可能會被上調，因此可能與腫瘤間接相關。這些間接腫瘤相關抗原也可能是預防接種方法的靶標(singh-jasujaetal.，2004)。至關重要的是，表位存在于抗原氨基酸序列中，以確保這種肽(“免疫原性肽”)來自腫瘤相關抗原，可導致體外或體內t細胞反應。基本上，任何能與mhc分子結合的肽都可能充當一個t細胞表位。誘導體外或體內t細胞反應的前提是存在具有相應tcr的t細胞，并且不存在對該特定表位的免疫耐受性。因此，taa是基于t細胞療法(包括但不限于腫瘤疫苗)研發(fā)的起點。識別和表征taa的方法基于對患者或健康受試者t細胞的使用情況，或基于腫瘤與正常組織肽之間差別轉錄特性或差別表達模式的產生。然而，對腫瘤組織或人腫瘤細胞株中過度表達或選擇性表達的基因的識別并不提供在免疫療法中使用這些基因所轉錄抗原的準確信息。這是因為，有著相應tcr的t細胞必須要存在而且對這個特定表位的免疫耐受性必須不存在或為最低水平，因此，這些抗原的表位只有一部分適合這種應用。因此，在本發(fā)明的一非常優(yōu)選的實施例中，只選擇那些針對可發(fā)現(xiàn)功能性和/或增殖性t細胞情況的過量提呈或選擇性提呈肽，這一點非常重要。這種功能性t細胞被定義為在以特異性抗原刺激后能夠克隆地擴展并能夠執(zhí)行效應子功能(“效應子t細胞”)的t細胞。在本發(fā)明的tcr和抗體下，潛在肽的免疫原性是次要的。對于本發(fā)明的tcr和抗體，提呈是決定性因素。針對其他癌性疾病的治療和診斷用途在本發(fā)明肽的基礎蛋白(多肽)的以下更詳細描述中進行披露。據(jù)報告，膀胱癌、橫紋肌樣腫瘤及卵巢癌和基因內的特定多態(tài)性的col18a1差異表達被證明能增加散發(fā)性乳房癌的風險(fangetal.，2013；gaddetal.，2010；petersetal.，2005；lourencoetal.，2006)。copa基因表達和rna編輯的變化被證明與肝細胞癌相關，實驗研究顯示了copa在間皮瘤細胞中的抗凋亡作用(sudoetal.，2010；qietal.，2014；wongetal.，2003)。cpb2活性被證明在急性早幼粒細胞白血病中顯著降低(meijersetal.，2000)。crp是肝臟中合成的一種急性期蛋白，被證明是多種癌癥類型以及腎細胞癌和多發(fā)性骨髓瘤的預后標志物(ljungberg，2007；fassasandtricot，2004)。cryz是腫瘤抑制基因p53的靶基因(bansaletal.，2011)。其編碼的蛋白ζ晶體被證明可直接與抗凋亡分子bcl-2的mrna相互作用，并穩(wěn)定bcl-2在t細胞急性淋巴細胞性白血病中的過度表達(lapuccietal.，2010)。csrp2的過度表達與肝細胞癌的去分化有關(midorikawaetal.，2002)。cyb5a編碼一種解毒致癌分子的酶，是胰腺癌的一個預后因素(blankeetal.，2014；giovannettietal.，2014)。cyp27a1的表達水平增加與子宮內膜癌、乳腺癌和結直腸癌相關(bergadaetal.，2014；nelsonetal.，2013；matusiakandbenya，2007)。據(jù)報告，cyp2e1在大腸癌中過度表達，特定多態(tài)性與膀胱癌、肺癌和乳腺癌細胞相關(yeetal.，2014；pateletal.，2014；dengetal.，2014；leungetal.，2013)。cyp2j2是一種酶，其被證明在多種人類癌癥中過度表達，包括食道癌、肺癌、乳腺癌、胃癌、肝癌和結腸癌(jiangetal.，2005；narjozetal.，2014)。cyp4f8被證明在前列腺癌中高度表達(vainioetal.，2011)。cyp4f2和cyp4f3均被證明在胰腺導管腺癌中過度表達，而只有cyp4f2在卵巢癌中過度表達(gandhietal.，2013；alexanianetal.，2012)。cyp4f11的表達被證明被nf-kb和p53調節(jié)(kalsotraetal.，2004；bellandstrobel，2012；goldsteinetal.，2013)。cypaf12的基因變異與胰腺癌患者對吉西他濱響應顯著相關(goldsteinetal.，2013；harrisetal.，2014)。一方面，高水平dap3與胃癌對化療更好的反應和乳腺癌更好的臨床結果相關，但另一方面，據(jù)報告，dap3在甲狀腺嗜酸腫瘤和浸潤性成膠質細胞瘤中過度表達(jiaetal.，2014；waziretal.，2012；jacquesetal.，2009；marianietal.，2001)。pex19是過氧化物酶體生物合成所必需的，但也顯示可直接與p19arf相互作用，最終導致該因子在細胞質中保留并使p53腫瘤抑制功能失活(sugiharaetal.，2001)。ddx11屬于dna解旋酶的deah家族，在晚期黑素瘤中高度表達(bhattacharyaetal.，2012)。nme4是一種核苷二磷酸激酶，在結腸癌和胃癌以及骨髓增生異常征候群中過度表達，在后者的疾病中與不良預后相關(kracmarovaetal.，2008；seifertetal.，2005)。dennd5b充當啟動rab-gtp酶的gdp-gtp交換因子(yoshimuraetal.，2010)。diexf被證明可介導腫瘤抑制基因p53的非蛋白酶體降解(taoetal.，2013)。dock7是一種鳥嘌呤核苷酸交換因子，被證明在膠質母細胞瘤中過度表達并可透過啟動rac-1來增加膠質瘤細胞浸潤以應對hgf(murrayetal.，2014)。在肝細胞癌細胞株中，drg2被證明在化療藥物誘導的細胞凋亡期間下調，而drg2過度表達抑制在這些細胞中阿霉素誘導的細胞凋亡(chenetal.，2012a)。drosha是微小rna生物合成中的兩個關鍵酶之一，在許多癌癥中過度表達，包括胃腸道腫瘤、乳腺癌和宮頸癌，并且似乎增強增殖、集落形成和腫瘤細胞遷移(avery-kiejdaetal.，2014；havensetal.，2014；zhouetal.，2013b)。dusp14基因中的snp與黑素瘤改變風險相關(yangetal.，2014a；liuetal.，2013b)。整個外顯子測序研究發(fā)現(xiàn)胰腺內導管內乳頭狀黏液性腫瘤患者的dync1h1基因內有體細胞突變(furukawaetal.，2011)。eef2蛋白被證明在肺癌、食道癌、胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌、多形性膠質母細胞瘤和非霍奇金淋巴瘤過度表達，并在癌細胞生長中發(fā)揮致癌作用(ojietal.，2014；zhuetal.，2014a)。efr3a基因內的突變在結直腸腺瘤樣本中得到鑒定(bojjireddyetal.，2014；zhouetal.，2013a)。eif2b5編碼翻譯起始因子b的一個亞基。該基因的單核苷酸多態(tài)性被描述與卵巢癌的存活時間相關(goodeetal.，2010)。eif3a(真核翻譯起始因子3亞基a)在乳腺癌、肺癌、宮頸癌、食道癌、胃癌和結腸癌中過度表達，并且顯示出參與細胞周期調控(dongandzhang，2006)。eif4e是在高達30％的人類惡性腫瘤(包括乳腺癌、前列腺癌、肺癌、頭頸部癌)以及在許多白血病和淋巴瘤中升高的有效癌基因(carrollandborden，2013)。elovl2被證明在肝細胞癌中過度表達(jakobssonetal.，2006；zekrietal.，2012)。eprs編碼多功能氨酰trna合成酶，據(jù)報告，是結腸癌中腫瘤相關抗原(lineetal.，2002)。由于dna低甲基化，exosc4啟動子活性在肝細胞癌增加。exosc4有效和特異地抑制癌細胞生長和細胞侵入能力(drazkowskaetal.，2013；stefanskaetal.，2014)。水解酶fuca2被發(fā)現(xiàn)是幽門螺桿菌粘附于人胃癌細胞所必需的(liuetal.，2009a)。gabrq編碼gabaa受體θ亞基。gaba被證明可透過過度表達的gabaa受體θ亞基刺激人肝細胞癌生長(lietal.，2012)。據(jù)報告，在鱗狀細胞癌中，galnt2過度表達可透過修改o-糖基化和egfr的活性來增強腫瘤細胞的侵襲能力(linetal.，2014；huaetal.，2012a；wuetal.，2011)。高水平ggh與抗葉酸細胞抗性相關聯(lián)，特別是甲氨蝶呤，同時與侵襲性乳腺癌和肺內分泌腫瘤的不良預后相關(schneiderandryan，2006；shubbaretal.，2013；heetal.，2004)。glul在人乳腺癌細胞和星形細胞瘤中過度表達(zhuangetal.，2011；collinsetal.，1997；christaetal.，1994；cadoretetal.，2002)。據(jù)報告，gnpat牽涉轉移性黑素瘤中生長抑制和凋亡誘導(ofmanetal.，2001；qinetal.，2013)。據(jù)報告，golga4染色體區(qū)域在宮頸癌中缺失，在骨髓增殖性腫瘤中golga4與pdgfrb結構內mrna融合(senchenkoetal.，2003；hidalgo-curtisetal.，2010)。gpam在人乳腺癌中表達，這與在細胞代謝改變和更好的整體存活相關(brockmolleretal.，2012)。據(jù)報告，gpt高血清水平增加胃腸癌的風險，并且與丙型肝炎病毒誘導的肝細胞癌的發(fā)生和復發(fā)有關(kunutsoretal.，2014；taraoetal.，1997；taraoetal.，1999)。grb14已顯示在乳腺癌中上調，其中高表達與更好的無病生存和總體生存相關(huangetal.，2013；baloghetal.，2012)。據(jù)報告，gtf2h4中單核苷酸多態(tài)性可增加發(fā)生吸煙相關肺癌和乳頭狀瘤病毒誘導的宮頸癌的風險(mydlikovaetal.，2010；buchetal.，2012；wangetal.，2010)。不同的研究表明，hspa2在宮頸癌、腎細胞癌和膀胱癌的疾病進展中起著重要作用?；騼榷鄳B(tài)性與胃癌的發(fā)生有關(singhandsuri，2014；ferrer-ferreretal.，2013；gargetal.，2010a；gargetal.，2010b)。hspa8被證明在食管鱗狀細胞癌中過度表達。此外，hspa8在多發(fā)性骨髓瘤和結腸癌中過度表達，hspa8的bcr-abl1-誘導表達促進慢性髓性白血病細胞的存活(dadkhahetal.，2013；wangetal.，2013a；chatterjeeetal.，2013；kubotaetal.，2010；jose-enerizetal.，2008)。mdn1被描述為一種候選腫瘤抑制基因，在管腔b型乳腺癌中突變(cornenetal.，2014)。mia3，也稱為運輸和高爾基組織蛋白1(tango)，據(jù)報導在結腸和肝細胞癌中下調，在這些實體中發(fā)揮腫瘤抑制作用(arndtandbosserhoff，2007)。相反，口腔鱗狀細胞癌的一項研究表明，mia3表達與腫瘤進展、轉移形成和臨床分期相關，指向mia3的致癌作用(sasahiraetal.，2014)。cpsf6被認定為“靜止基因盒”中的一種基因，其與幾種類型腫瘤的轉移和侵襲可能的顯著差異相關，如乳腺癌、結腸癌、肝癌、肺癌、食道癌、甲狀腺癌(yuetal.，2008)。據(jù)報告，mpdz表達水平低與乳腺癌患者預后不良相關(martinetal.，2004)。naa35(也被稱為mak10)編碼n(α)-乙酰轉移酶35，natc輔助亞基。在食管鱗狀細胞癌患者中，檢測到高度癌癥富集嵌合體golm1-mak10rna，其編碼一種分泌的融合蛋白，可能用作分子標志物(zhangetal.，2013b)。nav2顯示出特異性表達于一組結腸癌中，對含反義寡核苷酸的結腸癌細胞進行nav2治療誘導細胞凋亡(lshiguroetal.，2002)。ncstn過度表達表明雌激素受體陰性乳腺癌患者的總體生存惡化，在內分泌治療抵抗的乳腺癌細胞中檢測到高水平的nicastrin和notch4，它們的啟動最終驅動了侵襲行為(sarajlicetal.，2014；lombardoetal.，2014)。在非小細胞肺癌中nkd1蛋白降低，但nkd1mrna升高，前者與侵襲能力增加和預后不良相關(zhangetal.，2011)。nkd1mrna也被發(fā)現(xiàn)在人結腸腫瘤細胞中升高(yanetal.，2001；zhangetal.，2011)。據(jù)報告，在食管癌中nudc與淋巴結轉移相關，而nudc在前列腺癌細胞中過度表達導致細胞分裂受阻(hatakeyamaetal.，2006；linetal.，2004)。一項在卵巢癌中調查notch信號傳導途徑作用的研究報告，與癌癥相比，rfng在腺瘤中表達頻率較高(guetal.，2012；hopferetal.，2005)。rint1被描述為膠質母細胞瘤的一種癌基因，作為乳腺癌和lynch征候群相關癌癥中所見的一種適度滲透癌癥易感基因(ngeowandeng，2014；quayleetal.，2012)。rorc的高表達被發(fā)現(xiàn)與乳腺癌長期無轉移生存率相關。生長激素腺瘤中rorc表達下降與腫瘤大小增加以及對生長抑素治療臨床反應遲鈍增加相關(cadenasetal.，2014；lekvaetal.，2013)。據(jù)報告，rpl17可透過抑制藥物誘導的凋亡促進多藥耐藥(shietal.，2004b)。據(jù)報告，rps29在胃癌和結直腸癌中表達增加(takemasaetal.，2012；sunetal.，2005)。samm50編碼線粒體外膜的排序和裝配機械(sam)組分，其在β-桶狀蛋白組裝成線粒體外膜中發(fā)揮作用。在乳腺癌和卵巢癌細胞中以及乳腺癌、胃癌、結腸癌、腎癌和子宮癌樣本中檢測到生長促進嵌合體mrna(samm50-parvb)(plebanietal.，2012)。serpinf2編碼纖溶酶的主要抑制劑，這會降低纖維蛋白和各種其他蛋白。纖溶酶-α2-纖溶酶抑制劑復合體的血漿水平被證明是非小細胞肺癌生存的預測因子，在前列腺癌患者的血液中觀察到α2-抗纖溶酶活性低(zieteketal.，1996；taguchietal.，1996)。sf3b3過度表達與雌激素受體陽性乳腺癌中整體存活和內分泌性顯著相關(gokmen-polaretal.，2014)。shc1的蛋白水平在前列腺癌、轉移性乳腺癌、卵巢癌和甲狀腺癌和不同的異構體中升高，并且被認為作為主連接蛋白在非基因組水平介導類固醇類的有絲分裂信號(alametal.，2009；rajendranetal.，2010)。amacr用作前列腺癌的生物標志物，因為它在該實體中高度過表達(wuetal.，2014)。此外，還用作腎細胞癌診斷的免疫標志物(rossetal.，2012)。實驗數(shù)據(jù)表明，c1qtnf3表達可能在骨肉瘤腫瘤生長中發(fā)揮作用，與erk1/2信號途徑活化相關，并且它是一種新型的抗凋亡脂肪因子，可透過pi3k/akt信號途徑保護充質干細胞不會發(fā)生低氧/血清剝奪誘導的凋亡(houetal.，2014；akiyamaetal.，2009)。大多數(shù)肝細胞癌表達gpc3。靶向作用于gpc3的兩種hcc治療方法目前正在ii期臨床試驗中進行測試：人源化gpc3單克隆抗體，以及包括兩個gpc3衍生肽的疫苗。后一項研究中使用的肽與本文件中提出的肽不同。在所有卵黃囊腫瘤、一些肺鱗狀細胞癌和卵巢透明細胞癌中也發(fā)現(xiàn)有gpc3表達(filmusandcapurro，2013；kandilandcooper，2009)。mageb2被歸類為癌癥睪丸抗原，因為它在睪丸和胎盤、很大一部分各種組織學類型腫瘤以及其他多發(fā)性骨髓瘤和頭頸部鱗狀細胞癌中表達(pattanietal.，2012；vanetal.，2011)。mapkapk5編碼絲氨酸/蘇氨酸激酶家族的腫瘤抑制物和成員。mapkapk5被證明在結直腸癌中低表達，導致myc癌蛋白活性增加并透過抑制造血癌癥小鼠模型中致癌ras基因活性而減少癌癥形成(yoshizukaetal.，2012；kressetal.，2011)。usp14過度表達與卵巢上皮癌、非小細胞肺癌和結直腸癌中的腫瘤細胞增殖增加和較差預后有關(wangetal.，2015；wuetal.，2013a；shinjietal.，2006)。c4a被描述為多囊卵巢綜合癥和子宮內膜癌的生物標志物，實驗數(shù)據(jù)表明，c4可介導癌癥生長(galazisetal.，2013；rutkowskietal.，2010)。據(jù)報告，capzb在人乳頭瘤病毒18陽性口腔鱗狀細胞癌中過度表達，被確定為前列腺癌易感基因(loetal.，2007；nwosuetal.，2001)。cfhr5基因內的單核苷酸多態(tài)性與濾泡性淋巴瘤的無事件生存率相關(charbonneauetal.，2012)。clip1編碼含有連接蛋白1的cap-gly結構域，其把內吞囊泡連接至微管。此基因在霍奇金病和里德-斯特恩伯格細胞和乳腺癌中高表達，并似乎涉及乳腺癌和胰腺癌細胞的遷移和侵襲(sunetal.，2013；suzukiandtakahashi，2008；lietal.，2014a；sunetal.，2012)。clu可抑制腫瘤進展，而在晚期瘤變中，其可透過抑制許多治療性應激物和提高轉移而帶來腫瘤的顯著生存優(yōu)勢。clu已經(jīng)顯示出在前列腺癌發(fā)病機制中的關鍵作用，透過調節(jié)erk1/2信號和mmp-9表達來調節(jié)人腎透明細胞癌細胞的侵襲行為，并形成晚期肺癌治療的抗性(trougakos，2013；panicoetal.，2009；takeuchietal.，2014；wangetal.，2014)。融合基因sec16a-notch1報告為乳腺癌的第一復發(fā)融合基因(edwardsandhowarth，2012)。在shq1基因的復發(fā)性缺失已在前列腺癌和宮頸癌中觀察到，提示shq1具有腫瘤抑制作用(krohnetal.，2013；landoetal.，2013)。在透明細胞腎細胞癌和膀胱癌中，slc16a1高表達與預后不良因素相關，并可預測腫瘤的進展。在結直腸癌中，slc16a1基因的單核苷酸多態(tài)性可影響臨床結果，并且可用來預測對輔助化療的反應(kimetal.，2015；feietal.，2014a；feietal.，2014a)。成膠質細胞瘤已經(jīng)顯示可釋放高水平的谷氨酸，這可能會刺激腫瘤細胞增殖、促進腫瘤侵襲性，并下調slc1a2，這與較高的腫瘤分級相關，提示其在神經(jīng)膠質腫瘤進展中發(fā)揮潛在作用。此外，在胃癌中已檢測到slc1a2與cd44的融合基因，并且該基因可能代表了一類基因融合，其建立了一個有利于腫瘤生長和存活的親致癌代謝環(huán)境(taoetal.，2011；degrootetal.，2005)。slc3a2較高表達與膽道癌患者的腫瘤生長、生物攻擊性和生存相關，并且透過pi3k/akt途徑促進細胞增殖顯著導致非小細胞肺癌患者的較差預后。此外，slc3a2與整合素β1、整合素β3和fak過度表達與結直腸癌的進展和肝轉移相關(kairaetal.，2014；feietal.，2014b；sunetal.，2014)。slc9a3r1參與癌癥進展的證據(jù)存在于肝細胞癌、神經(jīng)鞘瘤、成膠質細胞瘤、結直腸癌中，尤其在乳腺癌中(saponaroetal.，2014)。nfyc已經(jīng)被報告可促進胃癌和前列腺癌細胞中癌基因的表達(zhangetal.，2014a；gongetal.，2013)。thy1是鼻咽癌抗侵襲活性的候選抑癌基因(lungetal.，2010)。timm17a在21t乳腺癌細胞中過度表達，乳腺癌組織中的mrna表達與腫瘤進展相關(xuetal.，2010)。tmem209在肺癌中廣泛表達(fujitomoetal.，2012)。tnk2又稱ack1酪氨酸激酶，在多種人類癌癥中被啟動、擴增或突變。去調節(jié)激酶具有致癌性，它的啟動與進展為轉移期相關。ack1抑制劑在臨床前研究中顯示出良好前景(mahajanandmahajan，2013)。trim55編碼ring鋅指蛋白，其在肌肉肌節(jié)組裝過程中與微管、肌球蛋白和肌聯(lián)蛋白瞬時相關，并且還參與肌節(jié)到細胞核信號傳導(pizonetal.，2002)。ufd1蛋白的rna干擾可以使羥基耐結腸癌細胞株sw1116/hcpt對羥基喜樹堿敏感(chenetal.，2011a；chenetal.，2011c)。在結直腸癌中，ugt1a1基因透過甲基化沉寂，因此被認為是伊立替康(cpt-11)藥物抗性和藥物抗性逆轉控制機制的研究目標靶點(xieetal.，2014)。ugt1a10是在胃癌和膽道組織中表達(strassburgetal.，1997)，其過度表達顯著增加了抗腫瘤劑5-二甲基氨基丙基氨基-8-羥基三唑吖啶c-1305的細胞毒性(pawlowskaetal.，2013)。此外，ugt1a10催化外源性化學物質、誘變劑和活性代謝物的葡糖醛酸結合，從而作為間接的抗氧化劑。在ugt1a8、ugt1a9及ugt1a10的啟動子中進行檢測到生物外源性(xre)和抗氧化劑(are)反應元素(kalthoffetal.，2010)。ugt1a8主要在胃腸道中表達(gregoryetal.，2003)，經(jīng)化療預防劑萊菔硫烷(sfn)治療后mrna表達上調(wangetal.，2012)。ugt1a7單倍型與乙肝病毒攜帶者的肝細胞癌風險增加有關(kongetal.，2008)。ugt1a6在對甲氨蝶呤抗藥的乳腺癌細胞中過度表達(dealmagroetal.，2011)并由一種假定的化療預防劑β-萘黃酮誘導(haniokaetal.，2012)。ugt1a9主要在肝和腎中表達(gregoryetal.，2003)。ugt1a9生殖多態(tài)性是前列腺切除術后前列腺癌復發(fā)的潛在預測因素(laverdiereetal.，2014)。ugt1a4啟動子和編碼區(qū)的多態(tài)性導致阿那曲唑(乳腺癌患者的一種芳香酶抑制劑)的葡糖醛酸化的變化(edavanaetal.，2013)。upf1是無義介導mrna降解(nmd)機制的一部分，并且可能在前列腺癌進展和轉移中發(fā)揮著功能性作用(yangetal.，2013)。另外，upf1rna監(jiān)控基因在胰腺癌腺鱗癌中通常突變(liuetal.，2014)。uqcrb是線粒體復合體iii的一個亞基。腫瘤細胞中uqcrb的抑制阻止缺氧誘導的腫瘤血管生成(jungetal.，2013)。uqcrb的3′非翻譯區(qū)的兩個snp作為結直腸癌的候選預后標志物(lascorzetal.，2012)。與結節(jié)性黑素瘤相比，uso1的拷貝數(shù)變化與淺表擴散性黑素瘤差異基因表達相關(roseetal.，2011)。在人結腸癌中檢測到usp10和sirt6蛋白表達顯著減少(linetal.，2013)。utp18也改變翻譯以促進抗逆性和生長，并經(jīng)常在癌癥中獲得并過度表達(yangetal.，2014b)。varsrs2074511多態(tài)性與三陰性型乳腺癌患者的存活相關，因此可被認為是早期乳腺癌患者存活的預后因子(chaeetal.，2011)。vmp1是一種應激誘發(fā)的自噬相關蛋白，也被癌基因kras誘發(fā)(loreetal.，2012)。vmp1在低分化人胰腺癌中過度表達，對化療藥物產生反應(gilabertetal.，2013)。vmp1在人hcc組織中被發(fā)現(xiàn)顯著下調，并與多個腫瘤結節(jié)、無包膜形成、靜脈侵犯和hcc預后不良密切相關(guoetal.，2012)。wdr26保護心肌細胞免受氧化應激的影響(fengetal.，2012)。zc3h7a是稱為巨噬細胞活化的調節(jié)因子ccch鋅指蛋白家族的一部分(liangetal.，2008)。zc3h7a被發(fā)現(xiàn)在胰腺導管腺癌轉移性腫瘤中有更高的功能突變等位基因頻率(zhouetal.，2012)。fasn是一種脂肪酸合酶，參與不同類型癌癥(包括乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、肝癌、卵巢癌、結腸癌和子宮內膜癌)的增強脂質合成(wuetal.，2014；zhaoetal.，2013)。fgg在肝細胞癌以及前列腺癌、肺癌和乳腺癌中上調(vejdaetal.，2002；zhuetal.，2009)。fmo5是一種單加氧酶，是占主導地位的肝特異性fmo，并且在雌激素受體α陽性乳腺腫瘤中上調(biecheetal.，2004；zhangandcashman，2006)。hadhamrna隨著hcc(tanakaetal.，2013)和雌激素受體α陰性乳腺腫瘤(mamtaniandkulkarni，2012)去分化的進展而下降。hal基因的遺傳變異可能在皮膚癌發(fā)生中起作用(welshetal.，2008)。hltf是具有解旋酶和e3泛素連接酶活性的轉錄調節(jié)因子swi/snf家族中的一員，被發(fā)現(xiàn)透過結腸、胃、子宮、膀胱和肺腫瘤的超甲基化而失活(debauveetal.，2008；castroetal.，2010；garcia-baqueroetal.，2014)。hdac10是一種組蛋白脫乙酰和轉錄調節(jié)因子。與相鄰組織相比，hdac10的表達在胃癌組織中顯著降低(jinetal.，2014)。hdac10在宮頸鱗狀細胞癌人類患者中與淋巴結轉移負相關(songetal.，2013)。hdac10在惡性腎上腺皮質腫瘤中超甲基化(fonsecaetal.，2012)。hdac10水平在慢性淋巴細胞性白血病中增加(wangetal.，2011)。hdac10-589c＞t啟動子多態(tài)性與慢性hbv患者的肝癌發(fā)生以及慢性hbv患者的hcc加重顯著相關(parketal.，2007)。ii類組蛋白脫乙?；虻谋磉_降低與肺癌患者的不良預后有關(osadaetal.，2004)。hip1r表達低與彌漫性大b細胞淋巴瘤患者的較差預后密切相關(wongetal.，2014)。hm13是一種信號肽肽酶，影響結直腸腺瘤中的細胞活力(sillars-hardeboletal.，2012)。惡性淋巴瘤患者的血清hpr水平比未患病的對照組明顯更高，hpr表達隨著疾病進展而增加(epelbaumetal.，1998)。hpr表達平行于乳腺癌惡性可能增加，hpr-陽性乳腺癌更有可能在首次切除后復發(fā)并與較短的無病間隔相關(shurbajietal.，1991)。hsd11b1基因中的變體(rs932335)與結腸直腸癌和乳腺癌有關(feigelsonetal.，2008；wangetal.，2013b)。接受雄激素剝奪治療(adt)的前列腺癌患者組織中hsd17b6表達明顯高于未治療患者的組織中表達(ishizakietal.，2013)。hspe1是一種線粒體伴侶蛋白，在蛋白質折迭和細胞信號傳導(nf-kb和wnt信號傳導)中發(fā)揮作用。hsp10水平升高發(fā)現(xiàn)于大腸癌、宮頸外口癌、前列腺癌、套細胞淋巴瘤和漿液性卵巢癌的腫瘤細胞中。在支氣管癌中，報告hsp10水平下降(davidetal.，2013)。移植到裸鼠側腹并用紫杉醇治療的卵巢癌異種移植物與未治療的異種移植物相比，表現(xiàn)出idi1表達下降t(banietal.，2004)。igfbpl1是胰島素生長因子的調節(jié)因子，因異常超甲基化在乳腺癌細胞系下調。igfbpl1甲基化與較差的總生存率和無病生存率明顯相關(smithetal.，2007)。雄激素敏感微粒相關蛋白ikbkap調制前列腺上皮和神經(jīng)元標志物的表達，透過雄激素受體依賴性機制減低增殖，并在lncap前列腺腺癌細胞中共同調節(jié)雄激素受體介導的轉錄(martinezetal.，2011)。ints8是標志物組的一部分，將胃癌與鄰近非癌性組織區(qū)分開來(chengetal.，2013)。irs2衍生肽pirs-21097-1105在hla-a2(+)黑色素瘤和乳腺癌、卵巢癌和結直腸癌中提呈(zarlingetal.，2014)。irs-21057dd基因型和d等位基因與hcc風險顯著相關(rashadetal.，2014)。itga7是層粘連蛋白-1受體二聚體整合素α-7/β-1的α鏈。itga7是一種腫瘤抑制基因，對抑制惡性腫瘤的生長至關重要。突變分析表明，前列腺癌、肝細胞癌、軟組織肉瘤以及膠質母細胞瘤中存在itga7突變。itga7在非轉移性前列腺癌和子宮平滑肌肉瘤中下調(tanetal.，2013)。itih4在幾種腫瘤組織包括結腸、胃、卵巢、肺、腎、直腸和前列腺腫瘤中下調(hammetal.，2008)。itih4低血清水平與hcv相關hcc患者的較短生存期相關(nohetal.，2014)。itih4血清濃度在乳腺癌中觀察到顯著降低，手術后itih4血清水平顯著降低(van，ietal.，2010)。錯義突變在shkbp1中發(fā)現(xiàn)，其作用于flt3的下游，flt3在大約30％的aml病例中(一種受體酪氨酸激酶)突變(greifetal.，2011)。shkbp1是在疾病不同階段對分化良好的小腸神經(jīng)內分泌腫瘤(wd-si-net)進行分類的幾個候選潛在蛋白質生物標志物之一(darmanisetal.，2013)。與對應的非腫瘤組織相比，klb表達在hcc組織中升高(pohetal.，2012)。lbp多態(tài)性rs2232596與中國漢族結直腸癌風險顯著增加相關(chenetal.，2011b)。lbp是卵巢癌中的一種候選血清生物標志物(boylanetal.，2010)。在小細胞肺癌患者中，lbp在化療治療后顯著降低(staal-vandenbrekelajetal.，1997)。lbrmrna表達與乳腺癌的腫瘤分級和諾丁漢預后指數(shù)直接相關(waziretal.，2013)。lbr在乳頭狀甲狀腺癌細胞中大量表達，但該蛋白的異常折迭可解釋其缺乏免疫反應性并與核膜反常折迭有關(recuperoetal.，2010)。lepr失調已在多種惡性細胞(包括結腸癌、肝癌、子宮內膜癌、甲狀腺癌、乳腺癌和肺癌)中進行了報告(ntikoudietal.，2014；surmacz，2013；uddinetal.，2011)。lig1單核苷酸多態(tài)性與肺癌、子宮內膜癌和神經(jīng)膠質瘤的風險相關(dohertyetal.，2011；leeetal.，2008；liuetal.，2009b)。lrpprc在胃癌組織中的表達比相應對照組織中顯著較高(lietal.，2014b)。lrpprc水平作為前列腺腺癌(pca)患者的預后標志物，lrpprc水平高的患者手術后的生存時間短于lrpprc水平低的患者(jiangetal.，2014)。lrpprc在各種腫瘤，如肺腺癌、食道鱗狀細胞癌、胃癌、結腸癌、乳腺癌、子宮內膜腺癌和淋巴瘤中大量表達(tianetal.，2012)。manea在前列腺癌細胞中的表達受雄激素調節(jié)(romanuiketal.，2009)。oplah在肺、乳腺、腎、結腸和卵巢正常和腫瘤組織中表達，oplah在正常標本中的水平比腫瘤患者中明顯較高(srivenugopalandali-osman，1997)。orm2糖型為區(qū)別原發(fā)性和繼發(fā)性肝癌提供了有價值的信息(mackiewiczandmackiewicz，1995)。與對照組相比，orm2血漿水平被證實在結直腸癌患者中顯著升高(zhangetal.，2012)。與對照組相比，巖藻糖形orm2水平在腺癌肺癌病例中顯著較高(ahnetal.，2014)。orm2用于膽管癌早期診斷的一種推定生物標志物(rucksakenetal.，2012)。四氫生物蝶呤水平升高導致人肝癌細胞中的pah活性和pah蛋白質增強(mcguire，1991)。parp14在骨髓瘤漿細胞高表達，與疾病進展和不良生存期相關。parp14與jnk2依賴型生存期極度相關。parp14被發(fā)現(xiàn)可透過結合和抑制jnk1促進骨髓瘤細胞的存活(barbaruloetal.，2013)。pc水平在肝腫瘤和肺癌中升高(changandmorris，1973；fanetal.，2009)。pcnt水平升高和中心體異常已在各種惡性血液病和實體瘤(包括aml、cml、套細胞淋巴瘤、乳腺癌和前列腺癌)中進行了說明(delavalanddoxsey，2010)。pign是一種癌癥染色體不穩(wěn)定(cin)-抑制基因，在cin(+)結直腸癌中發(fā)生頻繁的拷貝數(shù)損失(burrelletal.，2013)。pipox表達根據(jù)乳腺癌亞型變化，her-2型腫瘤顯示表達升高，三陰性乳腺癌亞型顯示表達下降。腫瘤pipox消極性與較短的無病生存期相關(yoonetal.，2014)。pipox在前列腺腫瘤中下降，并透過代謝肌氨酸降低前列腺細胞的致癌潛力(khanetal.，2013)。在結腸癌、骨髓瘤和肝細胞癌中檢測到psmd4水平升高(arltetal.，2009；midorikawaetal.，2002；shaughnessy，jr.etal.，2011)。與對照組相比，plin2在透明細胞和乳頭狀腎細胞癌患者中顯著升高。plin2術前尿濃度反映腫瘤大小和分期(morrisseyetal.，2014)。plin2在肺腺癌標本中的表達顯著高于正常組織和肺鱗狀細胞癌(zhangetal.，2014b)。plk4在人癌癥中經(jīng)常發(fā)生重排或損失，在肝細胞癌中發(fā)生率特別高，同時也在結直腸癌、頭頸部癌中發(fā)生(swallowetal.，2005)。plk4在乳腺癌中過度表達(marinaandsaavedra，2014)。qars是氨?；?trna合成酶(ars)的一員，以谷氨酰胺裝載trna。ars表達和多態(tài)性與乳腺癌和成膠質細胞瘤相關(heetal.，2014b；kimetal.，2012)。甲基化pmf1基因是膀胱癌患者的診斷和預后生物標志物(kandimallaetal.，2013)。幾種人類腫瘤和血液惡性腫瘤上調pon2，包括甲狀腺、前列腺、胰腺、睪丸、子宮內膜/子宮、肝、腎、淋巴組織、膀胱腫瘤、all和cml，這種過度表達對不同化療藥物(伊馬替尼、多柔比星、星形孢菌素或放線菌素)產生耐藥性(witteetal.，2011)。prkar2a是蛋白激酶a的一種調節(jié)亞基。prkar2a顯著增加接受紫杉醇和泰索帝治療的前列腺癌細胞系的生存期(zyndaetal.，2014)。prkar2a在肺腺癌中過度表達(bidkhorietal.，2013)。prpf6是tri-snrnp(小核糖核蛋白)剪接復合體的一員，其透過生長調節(jié)相關基因的優(yōu)先剪接驅動結腸癌增殖(adleretal.，2014)。prpf6在肺腺癌中過度表達(bidkhorietal.，2013)。與相應的鄰近正常前列腺組織相比，psmc4在前列腺癌細胞中顯著和相干上調(hellwinkeletal.，2011)。qprt表達隨著腦膠質瘤的惡性程度增加，并在放化療后復發(fā)性膠質母細胞瘤中表達增加，qprt表達與較差預后相關(sahmetal.，2013)。qprt是濾泡甲狀腺結節(jié)免疫組織化學篩查的潛在標志物(hinschetal.，2009)。rabggtb在化療難治性彌漫性大b細胞淋巴瘤中過度表達(linderothetal.，2008)。rad21在胃腸道腫瘤、結腸直腸癌、晚期子宮內膜癌、前列腺癌和乳腺癌中過度表達(atienzaetal.，2005；debetal.，2014；porkkaetal.，2004；supernatetal.，2012；xuetal.，2014)。rad23b在乳腺癌進展中發(fā)揮著潛在作用(lingeetal.，2014)。單核苷酸多態(tài)性rad23brs1805329與日本hcv患者的hcc發(fā)生和復發(fā)有關(tomodaetal.，2012)。rasal2是一種ras-gtp酶-活化蛋白，在雌激素受體陽性乳腺癌、卵巢癌和肺癌中具有腫瘤抑制功能(liandli，2014；huangetal.，2014)。與此相反，rasal2在三陰乳腺癌中具有致癌性，并促進間質浸潤和轉移(fengetal.，2014a)。rnmt耗竭在不同類型癌癥(包括肝癌)中有效和特異地抑制癌細胞生長和癌癥細胞浸潤能力(stefanskaetal.，2014)。導致激酶活性升高的rock1過度表達或rock1基因突變已經(jīng)在數(shù)種癌癥(包括肺癌、胃癌、cml和aml)中報告(rathandolson，2012)。rpl10a是c-myc靶基因，可能有助于肝細胞轉化(huneckeetal.，2012)。與骨髓性白血病或骨髓增生異常預后特別差相關的inv(3)和t(3；3)斷點在位于rpn1基因著絲粒和下游的區(qū)域簇生(wieser，2002)。rrbp1在肺癌和乳腺癌中過度表達(telikicherlaetal.，2012；tsaietal.，2013)。scfd1表達在糜爛性胃炎中增加，這與胃癌相關(galambetal.，2008)。abcb1編碼在各種器官(如腸、肝、腎、腦和胎盤)正常細胞中表達的p-糖蛋白(p-gp)。p-gp過度表達和基因多態(tài)性在結直腸癌以及腎上腺腫瘤、肺癌和all中檢測到(zhangetal.，2013a；fojoetal.，1987；gervasinietal.，2006；jamroziaketal.，2004)。abcb10編碼亞家族b的abc轉運蛋白(mdr/tap)。abcb10被證明參與kcp-4人表皮樣癌細胞的順鉑抗性(oisoetal.，2014)。abcb11的表達被證明在胰腺導管腺癌(最耐藥的癌癥之一)中上調。因此，這可能歸因于這種癌癥的普遍較差的治療反應(mohelnikova-duchonovaetal.，2013)。abcc2在原發(fā)性輸卵管癌中的上調表達與較差預后相關(halonetal.，2013)。abcc6在對姑息化療無應答的結直腸癌中明顯下調(hlavataetal.，2012)。相反，在耐吉西他濱的人nsclca549細胞中上調(lkedaetal.，2011)。acaca的表達被證明在許多人類癌癥(如乳腺癌、前列腺癌和肝癌)中上調，與癌細胞脂肪生成增強有關。各種acaca抑制劑顯示，透過細胞增殖的抑制對癌細胞系產生治療作用，透過細胞凋亡誘導細胞死亡(zuetal.，2013)。acly在各種腫瘤(如乳腺癌、肝癌、結腸癌、肺癌和前列腺癌)中異常表達，與腫瘤分期和分化負相關(zuetal.，2012)。acsl3在肺癌中過度表達，基于臨床前研究，是肺癌治療的有前景的新治療靶標(peietal.，2013)。acsl3上調表達可以作為雌激素受體特異性乳腺癌風險的潛在生物標志物(wangetal.，2013c)。acsl4在雌激素受體陰性乳腺腫瘤以及在雄激素受體陰性乳腺癌和前列腺腫瘤中過度表達。類固醇激素敏感性損失與acsl4表達的誘導有關(monacoetal.，2010)。研究顯示，acsl4上調在從腺瘤向腺癌轉換期間發(fā)生(caoetal.，2001)。acss3的甲基化發(fā)現(xiàn)與經(jīng)典風險因素(即年齡、階段或神經(jīng)母細胞瘤mycn狀態(tài))中的至少一種相關(decocketal.，2012)。adssl1缺失常在致癌物誘導小鼠原發(fā)性肺腺癌、小鼠和人肺腺癌細胞系中觀察到，并與在原發(fā)性小鼠肺腫瘤更廣泛的染色體不穩(wěn)定性表型相關(milleretal.，2009)。agfg2被確定為識別可能保持無轉移復發(fā)的激素受體陰性或三陰性乳腺癌病例的14種候選預后基因之一(yauetal.，2010)。agt是一種非常有效的抗血管生成因子，其顯示可在體外和體內發(fā)揮抗腫瘤效果(bouquetetal.，2006)。在轉基因小鼠中，人agt的過度表達顯示可減少血管生成，從而推遲肝癌的進展(vincentetal.，2009)。akr1c4編碼人類醛-酮還原酶家族1成員c4并催化視黃醛還原為視黃醇(ruizetal.，2011)。因此，視黃醛耗竭下調視黃酸的生物合成，隨后阻斷類視黃醇信號，這有利于腫瘤進展(tangandgudas，2011；ruizetal.，2012)。研究顯示aldh1l1的表達在hcc和腦膠質瘤中下調。aldh1l1在上述癌癥中的下調與較差的預后和更具侵襲性的表型相關(rodriguezetal.，2008；chenetal.，2012b)。研究顯示alg3的表達在食管鱗狀細胞癌和宮頸癌中增強(shietal.，2014；choietal.，2007)。在食管鱗狀細胞癌中，alg3表達增加與淋巴結轉移有關(shietal.，2014)。anks1a被認定為是src家族激酶的新靶標，已知涉及某些結直腸癌的發(fā)生(emaduddinetal.，2008)。apoa1編碼載脂蛋白a-i，該蛋白是高密度脂蛋白(hdl)的主要蛋白成分。在多種動物腫瘤模型中，apoa1在腫瘤發(fā)生中顯示出強效的免疫調節(jié)作用，并顯示可透過支持先天和適應性免疫過程以抑制腫瘤生長和轉移(zamanian-daryoushetal.，2013)。apoa2被證明在胰腺癌患者中被顯著降低(hondaetal.，2012)。與此相反，apoa2的表達增加與hcc相關(liuetal.，2007)。在甲胎蛋白陰性hbv相關hcc中，apob被發(fā)現(xiàn)是可能與hcc進展相關聯(lián)的14個差異表達蛋白質之一(heetal.，2014a)。在晚期乳腺癌中，apob被發(fā)現(xiàn)是可預測新輔助化療反應和患者無復發(fā)生存期的6種差異表達蛋白之一(hyungetal.，2011)。根據(jù)iii期結腸直腸癌患者以及在人黑色素瘤細胞中，aqp9與化學抗性增加有關(douetal.，2013；gaoetal.，2012)。arg1被證明是區(qū)分hcc和肝臟其他轉移性腫瘤的一種敏感和特異性標志物(sangetal.，2013)。arg1可能有助于nsclc的局部免疫抑制(rotondoetal.，2009)。與健康供體相比，磷酸化以及活性更高形式的arsb蛋白被發(fā)現(xiàn)在慢性髓性白血病患者外周血白細胞中增加(ueharaetal.，1983)。在卵巢癌細胞中，asna1的下調被證明可對化療藥物順鉑、卡鉑、奧沙利鉑和亞砷酸鹽的敏感度(hemmingssonetal.，2009)。研究顯示，asph在各種癌癥和癌細胞系中過度表達(yangetal.，2010)。用asph裝載的樹突狀細胞接種產生對抗體外膽管癌細胞的細胞毒性，并顯著抑制肝內腫瘤生長和轉移(nodaetal.，2012)。atp1a2被發(fā)現(xiàn)是在膠質母細胞瘤中顯著上調的31個蛋白之一(cometal.，2012)。與此相反，atp1a2在骨髓浸潤轉移性成神經(jīng)細胞瘤中下調(morandietal.，2012)。atp1a3被發(fā)現(xiàn)是在膠質母細胞瘤中顯著上調的31個蛋白之一(cometal.，2012)。atp6v1c1可透過溶酶體v-atp酶活性的調控來促進乳腺癌生長和骨轉移。atp6v1c1下降明顯抑制小鼠4t1乳腺腫瘤細胞異種移植物腫瘤的生長、轉移以及體內溶骨性病變(fengetal.，2013)。atp6v1c1被證明在口腔鱗狀細胞癌中過度表達，并與腫瘤細胞的活動性有關(otero-reyetal.，2008)。atp7b與抗順鉑(廣泛使用的抗癌藥物)的癌癥有關(dmitriev，2011)。axin2編碼axin-(軸抑制)相關蛋白2，其可能在wnt信號通路中對β-連環(huán)蛋白的穩(wěn)定性調節(jié)中起著重要作用(salahshorandwoodgett，2005)。此外，axin2被證明壓制癌基因c-myc的表達(rennolletal.，2014)。在hcc中，與baat較高表達的患者相比，baat低表達與較差的生存期相關(furutanietal.，1996)。與正常肝組織相比，bhmt和bhmt2轉錄物顯示在hepg2細胞和hcc樣本中急劇下降(pellandaetal.，2012)。c12orf44被證明是對自噬是必要的，并以atg13依賴的方式與ulk1相互作用(merceretal.，2009)。自噬在癌癥中有雙重角色，透過防止損傷蛋白質和細胞器累積充當腫瘤抑制物，充當能促進已確定腫瘤的生長的細胞存活機制(yangetal.，2011b)。c17orf70是范可尼貧血核心復合體成分，對于復合體的穩(wěn)定性是必不可少的。范可尼貧血核心復合體在dna損傷應答網(wǎng)絡中發(fā)揮著中心作用。范可尼貧血核心復合體介導的dna損傷反應涉及乳腺癌易感基因產物brca1和brca2(lingetal.，2007)。c19orf80編碼肝細胞癌相關基因td26，并被證明是hcc中甲基化水平最高在對照組織中最低的5個位點之一(ammerpohletal.，2012)。cct7被發(fā)現(xiàn)是一種蛋白質子網(wǎng)的一部分，該網(wǎng)絡可明顯判別晚期人結直腸癌(nibbeetal.，2009)。cdk6已顯示可調節(jié)腫瘤抑制rb蛋白的活性。cdk6可透過增強細胞增殖和刺激血管生成發(fā)揮其腫瘤促進功能(kollmannetal.，2013)。cdk6的藥理抑制顯示可抑制異常白血病細胞的生長分化(plackeetal.，2014)。cfh可能在皮膚鱗狀細胞癌的進展中起著一定的作用(riihilaetal.，2014)。cfh可能在各種癌細胞中補體介導的裂解抗性起著關鍵作用，并顯示出在nsclc中過度表達，這與預后較差有關(cuietal.，2011)。clptm1的失活突變在前列腺癌細胞中被發(fā)現(xiàn)(rossietal.，2005)。cmas編碼胞苷酸n-乙酰神經(jīng)氨酸合成酶，其催化唾液酸的活化以及其轉化為單磷酸胞苷二酯?；罨耐僖核嵊糜趎-糖基化，這是細胞分化過程中一種常見的翻譯后修飾。癌細胞表面上唾液酸糖表達增加是已知的腫瘤特征之一(bulletal.，2014)。tf(轉鐵球蛋白)是使用最廣泛的腫瘤靶向配體之一，因為tf受體(tfr)在惡性細胞上過度表達，并透過與tf相互作用在細胞鐵攝取中起著關鍵作用(biswasetal.，2013)。tfr的表達水平已表明與腫瘤分期或癌癥進展相關(tortorellaandkaragiannis，2014)。th1l可能在人乳腺癌細胞增殖和侵襲的調節(jié)中起著重要作用，并且可能是人乳腺癌治療的潛在靶點(zouetal.，2010)。thtpa水解可能負責ndrg-1的抗增殖作用。ndrg-1已經(jīng)顯示可減少乳腺癌、結腸癌、前列腺癌和胰腺癌的侵襲和轉移(kovacevicetal.，2008)。smyd3透過金屬蛋白酶mmp-9的表觀遺傳上調而促進癌浸潤(medjkaneetal.，2012)。smyd3的表達在許多類型的人正常組織中檢測不到或非常弱，而smyd3的過度表達與胃癌、結直腸癌、肝細胞癌、前列腺癌和乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展相關(hamamotoetal.，2006；liuetal.，2014；liuetal.，2013a)。在大腦中缺乏stat2(yueetal.，2015)或組成性表達ifn-α(wangetal.，2003)的轉基因小鼠中觀察到了stat2與腫瘤發(fā)生之間的聯(lián)系。tacc3在許多人類癌癥(包括卵巢癌、乳腺癌、鱗狀細胞癌和淋巴瘤)中過度表達(maetal.，2003；jacquemieretal.，2005；lauffartetal.，2005)。spbp還顯示可壓制雌激素受體α(erα)的轉錄活性。spbp過度表達抑制erα依賴性乳腺癌細胞系的增殖(gburciketal.，2005)。在細胞核中，spbp顯示相對低的活動性，并富集在染色質密集區(qū)域，這清楚地表明它是一種染色質結合蛋白(darvekaretal.，2012)。tcf20對于對抗氧化應激的細胞防御方案中涉及的蛋白質增強誘導很重要(darvekaretal.，2014)。c3是炎性腫瘤微環(huán)境的一種突出元素(rutkowskietal.，2010)，活化可帶來一種腫瘤生長優(yōu)勢(markiewskietal.，2008)。c3的酶裂解導致產生過敏毒素c3a(炎癥介質和化學引誘物)和c3b(sahuetal.，1998)。cln3是nt2神經(jīng)元前體細胞和一些類型癌癥的抗凋亡基因(zhuetal.，2014b)。它參與神經(jīng)元和非神經(jīng)元細胞內的細胞內運輸和調節(jié)(rakhejaetal.，2008；gettyandpearce，2011)，它牽涉幾個重要的信號通路(persaud-sawinetal.，2002)。在許多癌癥細胞系(包括乳腺癌、結腸癌、惡性黑色素瘤、前列腺癌、卵巢癌、神經(jīng)母細胞瘤以及膠質母細胞瘤，但不包括肺癌或胰腺癌細胞系)中cln3mrna和蛋白過度表達(rylovaetal.，2002)。slc13a5是7個cimp-標記基因之一。腎透明細胞癌(ccrcc)的cimp(cpg島甲基劑表型)的特點是在cpg島dna甲基化累積且患者預后較差(tianetal.，2014；araietal.，2012)。slc35b2在急性炎癥期間唾液酸磺基lex聚糖生物合成誘導時參與協(xié)調轉錄調控(huopaniemietal.，2004)，并在人結直腸癌細胞系中參與6個磺基乳糖胺表位的硫酸化(kamiyamaetal.，2006)。結直腸癌細胞以及人類結直腸組織表達slc35b2(kamiyamaetal.，2011)。plod1表達與人類乳腺癌進展相關(gilkesetal.，2013)。prdx5在許多惡性腫瘤中上調(urigandbecker，2006)，抑制prdx5能阻止腫瘤的發(fā)生和進展，表明prdx5為癌癥治療有前景的靶標。其高度親核和易于接近的硒半胱氨酸活性位點可能是藥物設計的主要靶標(liuetal.，2012)。psmd8在周圍肺細胞中表達增加可能對哪些臨界細胞群體參與侵入性癌癥發(fā)生提供潛在的信息(zhouetal.，1996)。snrpd1是一個核心剪接蛋白，其在惡性腫瘤中上調。sptbn1表達下降與胰腺癌預后惡化有關(jiangetal.，2010)。sqstm1作為各種信號轉導途徑的信號傳導中心，如nf-kb信號傳導、細胞凋亡和nrf2活化，其失調與骨佩吉特病和腫瘤發(fā)生相關(komatsuetal.，2012)。pcna表達可預測肛腸惡性黑色素瘤的生存期(ben-izhaketal.，2002)。pcna(capcna)的癌癥相關的同種型被確定其在pcna內的眾多谷氨酸和天冬氨酸殘基上含有異常模式的甲酯基(hoelzetal.，2006)。在一些腫瘤細胞系中消耗srp54不產生明顯的細胞表型，如生長停滯或死亡，即使在srp組分穩(wěn)定還原的選定細胞中也是如此(renetal.，2004)。在分子水平上，stat1透過其能力增加細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑p21cip1的表達或降低c-myc的表達來抑制接受ifn-y治療的小鼠和人腫瘤細胞的增殖(ramanaetal.，2000)。stat1的抗腫瘤活性透過其抑制小鼠模型中的血管生成和腫瘤轉移的能力進一步得到支持(huangetal.，2002)。stat1mrna水平增加被證明是分子信號的一部分，與激素受體陰性和三陰性乳腺癌患者的轉移結果預后較好有關(yauetal.，2010)。濾泡狀腫瘤的細針穿刺樣本表明，與良性疾病相比，惡性結節(jié)過度表達stt3a(pateletal.，2011)。一項薈萃分析表明，stxbp4/cox11rs6504950多態(tài)性與乳腺癌風險顯著相關(tangetal.，2012)。由或基本上由本文所指氨基酸序列組成的一種肽可能有一個或兩個非錨定氨基酸(見下面錨基序相關內容)被交換，而不存在這種情況，即相比于未修飾的肽，與人類主要組織兼容性復合體(mhc)-i或-ii類分子的能力基本上被改變或受到不利影響。在另一實施方案中，在基本上由本文所述氨基酸序列組成的肽中，一個或兩個氨基酸可與其保守交換伙伴交換(見下文)，而不存在這種情況，即相比于未修飾的肽，與人類主要組織兼容性復合體(mhc)-i或-ii類分子的能力基本上被改變或受到不利影響。本發(fā)明進一步涉及本發(fā)明的一種肽，其中所述肽按下文所述被修飾和/或包含非肽鍵。本發(fā)明進一步涉及本發(fā)明的一種肽，其中所述肽為融合蛋白的一部分，特別是與hla-dr抗原相關不變鏈(li)的n-端氨基酸融合，或與抗體(例如，樹突狀細胞特定抗體，即與樹突狀細胞結合)或抗體的序列融合。本發(fā)明進一步涉及一種核酸，其編碼本發(fā)明的一種肽。本發(fā)明進一步涉及一種本發(fā)明的核酸，為dna、cdna、pna、rna，也可能為其組合物。本發(fā)明進一步涉及一種能表達、表達和/或表達本發(fā)明核酸的表達載體。本發(fā)明進一步涉及本發(fā)明的一種肽、本發(fā)明的一種核酸或本發(fā)明的一種藥用表達載體。本發(fā)明進一步涉及下文進一步說明的抗體以及制造抗體的方法。優(yōu)選為抗體特定于本發(fā)明的肽和/或與mhc結合時特定于本發(fā)明的肽。優(yōu)選的抗體可以是單克隆的。本發(fā)明進一步涉及t細胞受體(tcr)，特別是靶向作用于本發(fā)明肽的可溶性tcr(stcr)和/或肽-其mhc復合體，以及制造它們的方法。本發(fā)明進一步涉及靶向作用于本發(fā)明肽的抗體或其他結合分子和/或肽-其mhc復合體，以及制造它們的方法。本發(fā)明進一步涉及含本發(fā)明核酸或前述表達載體的一種宿主細胞。本發(fā)明進一步涉及為一種抗原提呈細胞的本發(fā)明宿主細胞。本發(fā)明進一步涉及本發(fā)明的宿主細胞，其中抗原提呈細胞為樹突細胞。本發(fā)明還涉及適體。適體(例如，參見wo2014/191359及其中引用的文獻)是短的單鏈核酸或肽分子，其可以折迭為所定義的三維結構并識別特定的靶標結構。它們似乎是開發(fā)靶向治療的合適替代方法。適體已顯示可選擇性與具有高親和力和特異性的復合體靶標相結合。識別細胞表面分子的適體在過去十年內已經(jīng)確定，并為開發(fā)診斷和治療方法提供了手段。由于適體已顯示幾乎無毒性和免疫原性，因此，它們是生物醫(yī)學應用中有前景的候選物質。事實上適體，例如前列腺特異性膜抗原識別適體，已被成功地用于靶向治療并在體內模型的異種移植物中顯示出功能。此外，識別特定腫瘤細胞系的適體也已確定?？蛇x擇dna適體來揭示各種癌細胞的廣譜標識屬性，特別是那些來自于實體瘤的細胞，而非致瘤和主要健康細胞不被識別。如果所識別的適體不僅識別腫瘤特異性子類型，而且與一系列腫瘤相互作用，這使適體適用于作為所謂的廣譜診斷和治療手段。此外，用流式細胞儀對細胞結合行為的研究顯示，適體在納摩爾范圍內顯示出很好的親和力。適體用于診斷和治療目的。此外，也可能顯示，一些適體被腫瘤細胞吸取，因而可作為抗癌劑靶向遞送的分子賦形劑，例如sirna進入腫瘤細胞?？蛇x擇適體針對復合體的靶標，如細胞和組織以及包含、優(yōu)選包括根據(jù)任何seqidno1至seqidno300的一個序列、根據(jù)本發(fā)明的肽復合體與mhc分子，使用細胞selex(透過指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進化)技術。本文所用的″支架″一詞是指與(如抗原)決定因子特異性結合的分子。在一項實施方案中，支架是能夠引導其所連接的實體(例如，(第二)抗原結合部分)至目標靶點，例如，至特定類型的腫瘤細胞或承載抗原決定簇的腫瘤基質(如根據(jù)目前應用的肽的復合體)。在另一項實施例中，支架能夠透過其靶抗原(例如t細胞受體復合體抗原)啟動信號通路。支架包括但不限于抗體及其片段，抗體的抗原結合區(qū)，其包含抗體重鏈可變區(qū)和抗體輕鏈可變區(qū)，結合的蛋白包括至少一個錨蛋白重復序列基元和單域抗原結合(sdab)分子、適體、(可溶)tcr和(經(jīng)修飾的)細胞，例如同種異體或自體t細胞。各支架可包括一個標記，其透過確定是否存在或不存在卷標所提供的信號可檢測到結合支架。例如，該支架可用熒光染料或任何其他適用的細胞標記分子進行標記。此類標記分子是本領域中公知的。例如，透過熒光染料進行的熒光標記可透過熒光或激光掃描顯微術或流式細胞術提供結合適體的可視化。各支架可與第二個活性分子(例如il-21、抗cd3、抗cd28)共軛。例如，在wo2014/071978a1
背景技術：
：：部分對多肽支架進行了描述，并作為參考文獻引用。本發(fā)明進一步涉及制備本發(fā)明一種肽的一種方法，所述方法包括培養(yǎng)本發(fā)明的宿主細胞和從宿主細胞和/或其培養(yǎng)基中分離肽。本發(fā)明進一步涉及一種體外制備啟動的t細胞的方法，該方法包括將t細胞與載有抗原的人i或ii類mhc分子進行體外連接，這些分子在合適的抗原提呈細胞表面表達足夠的一段時間從而以抗原特異性方式啟動t細胞，其中所述抗原為本發(fā)明的至少一種肽。本發(fā)明進一步涉及一種方法，其中抗原透過與足夠量的含抗原提成細胞的抗原結合被載入表達于合適抗原提呈細胞表面的i或ii類mhc分子。本發(fā)明進一步涉及本發(fā)明的方法，其中該抗原提呈細胞包括一個表達載體，該載體有能力表達含seqidno：1至seqidno：300的肽或其變體氨基酸序列。本發(fā)明進一步涉及以本發(fā)明方法制備的啟動t細胞，該方法有選擇性地識別一種細胞，該細胞異常表達含一種本發(fā)明氨基酸序列的多肽。本發(fā)明進一步涉及一種殺傷患者靶細胞的方法，其中患者的靶細胞異常表達含本發(fā)明任何氨基酸序列的多肽，該方法包括給予患者本發(fā)明的有效量t細胞。本發(fā)明進一步涉及任何所述肽、本發(fā)明的一種核酸、本發(fā)明的一種表達載體、本發(fā)明的一種細胞、本發(fā)明一種作為藥劑或制造藥劑的啟動t細胞的用途。本發(fā)明進一步涉及一種本發(fā)明的用途，其中所述藥劑為一種疫苗，一種細胞，一種細胞群，例如，一個細胞系，stcr和單克隆抗體。本發(fā)明進一步涉及一種本發(fā)明的用途，其中藥劑可有效抗癌。本發(fā)明進一步涉及一種本發(fā)明的用途，其中所述癌細胞為hcc細胞。本發(fā)明進一步涉及一種基于本發(fā)明肽的特定標志物蛋白和生物標志物，其可用于診斷和/或判斷hcc的預后。此外，本發(fā)明涉及這些供癌癥治療使用的新靶點。此外，本發(fā)明涉及一種使用預篩選腫瘤相關肽的數(shù)據(jù)庫(本文中也稱為「存儲庫」)制備個性化抗癌疫苗用于單個患者的方法。是否能刺激免疫反應取決于是否存在被宿主免疫系統(tǒng)視為異物的抗原。發(fā)現(xiàn)腫瘤相關抗原的存在增加了運用宿主免疫系統(tǒng)干預腫瘤生長的可能性。目前，針對癌癥免疫治療，正在探索利用免疫系統(tǒng)的體液和細胞進行免疫的各種機制。細胞免疫反應的特定元素能特異性地識別和破壞腫瘤細胞。從腫瘤浸潤細胞群或外周血中分離出的t-細胞表明，這些細胞在癌癥的天然免疫防御中發(fā)揮了重要作用。特別是cd8陽性t細胞在這種反應中發(fā)揮重要作用，tcd8+能識別通常8至10個源自蛋白或位于細胞質的缺損核糖體產物(drip)的氨基酸殘基的主要組織兼容性復合體(mhc)所載的肽中所含的i類分子。人mhc分子也稱為人白細胞-抗原(hla)。本文所用″肽″這一術語，系指一系列氨基酸殘基，通常透過相鄰氨基酸的α-氨基和羰基之間的肽鍵來連接。這些肽的長度優(yōu)選為9個氨基酸，但至短可為8個氨基酸長度，至長可為10、11、12或13個氨基酸長度，如果為mhc-ii類肽時(本發(fā)明肽的拉長變體)，至長可為14、15、16、17、18、19或20個氨基酸長度。因此，″肽″這一術語應包括一系列氨基酸殘基的鹽，通常透過相鄰氨基酸的α-氨基和羰基之間的肽鍵來連接。優(yōu)選的情況是，鹽為肽的藥用鹽，例如：氯化物或乙酸(三氟乙酸)鹽。必須注意的是，本發(fā)明肽的鹽與其體內狀態(tài)的肽基本上不同，因為該不是體內的鹽。術語″肽″應也包括″寡肽″。本文使用的術語″寡肽″是指一系列氨基酸殘基，通常透過相鄰氨基酸的α-氨基和羰基之間的肽鍵來連接。寡肽的長度對于本發(fā)明來說并不十分關鍵，只要在寡肽中保持正確的表位即可。通常，寡肽長度約小于30個氨基酸殘基，約長于15個氨基酸?！灞景l(fā)明的肽″這一術語應也包括根據(jù)seqidno：1至seqidno：300的上述肽組成的肽或包含該肽的肽?！宥嚯摹暹@一術語是指一系列氨基酸殘基，通常透過相鄰氨基酸的α-氨基和羰基之間的肽鍵來連接。多肽的長度對于本發(fā)明來說并不十分關鍵，只要保持正確的表位即可。與術語肽或寡肽相對，多肽摂這一術語是指包含多于約30個氨基酸殘基的分子。一種肽、寡肽、蛋白質或編碼該分子的核苷酸如果能誘導免疫反應，則具有「免疫原性」(因此是本發(fā)明中的一種″免疫原″)。在本發(fā)明的情況下，免疫原性的更具體定義是誘導t細胞反應的能力。因此，″免疫原″是一種能夠誘導免疫反應的分子，并且在本發(fā)明的情況下，是一種能誘導t細胞反應的分子。在另一方面，所述免疫原可以是肽，肽與mhc的復合體、和/或用于提高特異性抗體或tcr抗性的蛋白。i類t細胞″表位″要求的是一種結合至mhci類受體上的短肽，從而形成一種三元復合體(mhci類α鏈、β-2-微球蛋白和肽)，其可以透過t細胞負載匹配t細胞受體與具有適當親和力的mhc/肽復合體結合來識別。結合至mhci類分子的肽的典型長度為8-14個氨基酸，最典型為9個氨基酸長度。在人類中，有三種編碼mhci類分子的不同基因位點(人mhc分子也是指定的人白細胞抗原(hla))：hla-a、hla-b和hla-c。hla-a＊01、hla-a＊02和hla-b＊07是可從這些基因位點表達的不同mhci類等位基因的實例。表6：hla-a＊02和hla-a＊24和最常見hla-dr血清類型的表達頻率f。頻率根據(jù)mori等人(morim，etal.hlageneandhaplotypefrequenciesinthenorthamericanpopulation：thenationalmarrowdonorprogramdonorregistry.transplantation.1997oct15；64(7)：1017-27)使用的hardy-weinberg公式f＝1-(1-gf)2改編，從美國人群范圍內的單體型頻率中推導出。由于連鎖不平衡，某些hla-dr等位基因內的a＊02或a＊24組合與其預期單一頻率相比，可能是濃縮的或頻率較低。有關詳細信息，請參閱chanock等人的文獻(s.j.chanock，etal(2004)hla-a，-b，-cw，-dqa1anddrb1inanafricanamericanpopulationfrombethesda，usahumanimmunology，65：1223-1235)。本發(fā)明的肽，優(yōu)選當如本文描述納入本發(fā)明的疫苗時與a＊02或a＊24結合。疫苗還可能包括泛結合mhcii類肽。因此，本發(fā)明的疫苗可用于治療a＊02陽性、a＊24陽性或a＊02和a＊24均呈陽性患者中的癌癥，但不因為這些肽的廣泛結核性而必須選擇ii類mhc同種異型。一種疫苗中a＊02和a＊24肽組合具有優(yōu)勢，即與單獨的mhci類等位基因相比，可治療更高比例的患者群體。雖然在大多數(shù)人群中，低于50％的患者可由單獨的等位基因來解決問題，但是本發(fā)明的疫苗可以治療任何相關人群中至少60％的患者。具體來說，各區(qū)域中，以下比例的患者這些等位基因中的至少一個有肯定效果：美國61％、西歐62％、中國75％、韓國77％、日本86％(根據(jù)www.allelefrequencies.net計算)。本文提到的dna序列既包括單鏈dna也包括雙鏈dna。因此，除非本文另有所指，否則具體的序列是該序列的單鏈dna、該序列與其互補序列的雙工(雙鏈dna)以及該序列的互補序列?！寰幋a區(qū)″這一術語是指在基因的天然基因組環(huán)境中天然或正常編碼該基因的表達產物的那部分基因，即，體內編碼該基因的天然表達產物的區(qū)域。編碼區(qū)可來自非突變(″正常″)基因、突變基因或異?；?，甚至還可以來自dna序列，完全可在實驗室中使用本領域熟知的dna合成方法合成。在一項優(yōu)選的實施方案中，術語″核苷酸序列″系指脫氧核苷酸的雜聚物。編碼特定肽、寡肽或多肽的核苷酸序列可為天然核苷酸序列，也可為合成核苷酸序列。一般來說，編碼肽、多肽以及本發(fā)明蛋白的dna片段由cdna片段和短寡核苷酸銜接物，或一系列寡核苷酸組成，以提供一種合成基因，該基因能夠在包含源自微生物或病毒操縱子的調節(jié)元素的重組轉錄單元中被表達。如本文所用的術語″肽的核苷酸編碼″系指對肽進行核苷酸序列編碼，其中該肽包括與將由用于產生tcr的樹突細胞或另一細胞系統(tǒng)所表達該序列的生物系統(tǒng)兼容的人工(人造)啟動和停止密碼子?！灞磉_產物″這一術語是指多肽或蛋白，它是基因和遺傳碼退化并因而編碼同樣的氨基酸所造成的任何核酸序列編碼同等物的翻譯產物?！迤瑪唷暹@一術語，當指的是一種編碼序列時，表示包含非完整編碼區(qū)的dna的一部分，其表達產物與完整編碼區(qū)表達產物基本上具有相同的生物學功能或活性?！錮na片段″這一術語是指一種dna聚合物，以單獨的片段形式或一種較大dna結構的組分形式存在，它們從至少分離過一次的dna中以基本純凈的形式獲得，即不含污染性內源性材料，并且獲得的數(shù)量或濃度能夠使用標準生化方法，例如使用克隆載體，進行識別、操縱和回收該片段及其組分核苷酸序列。此類片段以開放閱讀框架(未被內部未翻譯序列打斷)或內含子(通常提呈于真核基因中)的形式存在。未翻譯dna序列可能存在于開放閱讀框架的下游，在那里其不會干預編碼區(qū)的操縱或表達?！逡铩暹@一術語表示一種短核酸序列，其可與一個dna鏈配對，并在dna聚合酶開始合成脫氧核糖核酸鏈之處提供一個游離的3′-oh末端?！鍐幼印暹@一術語表示參與rna聚合酶的結合從而啟動轉錄的dna區(qū)域。術語″分離″表示一種物質從其原來的環(huán)境(例如，如果是天然發(fā)生的則是天然環(huán)境)中被移走。例如，活體動物中的天然核苷酸或多肽不是分離的，但是，從天然系統(tǒng)中一些或所有共存物質中分離出來的核苷酸或多肽是分離的。此類多核苷酸可能是載體的一部分和/或此類多核苷酸和多肽可能是一種組合物的一部分，并且由于該載體或組合物不是其天然環(huán)境的一部分，因此它仍然是分離的。本發(fā)明中披露的多核苷酸和重組或免疫原性多肽也可能以″純化″的形式存在。術語″純化″并非要求絕對的純度；它只是一個相對的定義，可以包括高度純化或部分純化的制劑，相關領域技術人員能理解這些術語。例如，各個從已用傳統(tǒng)方法純化為具有電泳同構型的cdna庫中分離出的各種克隆物。明確考慮到將起始材料或天然物質純化至少一個數(shù)量級，優(yōu)選為兩或三個數(shù)量級，更優(yōu)選為四或五個數(shù)量級。此外，明確考慮到所述多肽的純度優(yōu)選為99.999％，或至少為99.99％或99.9％；甚而適宜為以重量計99％或更高。根據(jù)本發(fā)明公開的核酸和多肽表達產物，以及包含此類核酸和/或多肽的表達載體可能以″濃縮的形式″存在。本文使用的術語″濃縮″是指材料的濃度至少是其自然濃度的大約2、5、10、100或1000倍，有優(yōu)勢的是，按重量計為0.01％，優(yōu)選為至少0.1％。也明確考慮到，按重量計約為0.5％、1％、5％、10％和20％的濃縮制劑。序列、構型、載體、克隆物以及包含本發(fā)明的其他材料可有優(yōu)勢地以濃縮或分離的形式存在?！寤钚云巍暹@一術語是指產生免疫反應的片段(即具有免疫原性活性)，通常是一種肽、多肽或核酸序列的片段，不論是單獨或可選地與合適的佐劑一起或在載體中給予一種動物，比如哺乳動物，例如兔子或小鼠，也包括人；這種免疫反應采用的形式是在接受動物(如：人)體內刺激t細胞反應?；蛘撸寤钚云巍逡部捎糜谡T導體外t細胞反應。本文使用的″部分″(portion)、″節(jié)″(segment)、″片段″(fragment)這幾個術語，當與多肽相關地使用時是指殘基的連續(xù)序列，比如氨基酸殘基，其序列形成一個較大序列的子集。例如，如果一個多肽以任一種肽鏈內切肽酶(如胰蛋白酶或糜蛋白酶)進行處理，則該處理獲得的寡肽會代表起始多肽的部分、節(jié)段或片段。當與多核苷酸相關地使用時，這些術語系指用任何核酸內切酶處理所述多核苷酸產生的產物。根據(jù)本發(fā)明，術語″相同百分比″、″等同度百分比″或″等同百分比″，如果指的是序列，則表示在待對比序列(「被對比序列」)與所述序列或權利要求的序列(″參考序列″)對準之后將被對比序列與所述序列或權利要求的序列進行比較。然后根據(jù)下列公式計算等同度百分比：等同度百分比＝100[1-(c/r)]其中c是參考序列與被對比序列之間對準長度上參考序列與被對比序列之間的差異數(shù)量，其中(i)參考序列中每個堿基或氨基酸序列在被對比序列中沒有對應的對準堿基或氨基酸；(ii)參考序列中每個空隙，以及(iii)參考序列中每個對準堿基或氨基酸與被比對比序列中對準堿基或氨基酸不同，即構成一個差異以及(iiii)必須在對準序列的第1位置開始對準；并且r是參考序列與被對比序列對準長度上在參考序列中產生任何空隙也計算為一個堿基或氨基酸的參考序列中的堿基或氨基酸數(shù)目。如果″被對比序列″和″參考序列″之間存在的一個對準按上述計算的等同度百分比大致等于或大于指定的最低等同度百分比，則被對比序列與參考序列具有指定的最低等同度百分比，雖然可能存在按本文上述計算的等同度百分比低于指定等同度百分比的對準。如果無另有說明，那么本文公開的原始(未修飾)肽可以透過在肽鏈內的不同(可能為選擇性)位點上取代一個或多個殘基而被修飾。優(yōu)選情況時，這些取代位于氨基酸鏈的末端。此取代可能是保守性的，例如，其中一個氨基酸被具有類似結構和特點的另一個氨基酸所取代，比如其中一個疏水性氨基酸被另一個疏水性氨基酸取代。更保守的取代是具有相同或類似的大小和化學性質的氨基酸間的取代，例如，亮氨酸被異亮氨酸取代。在天然同源蛋白質家族序列變異的研究中，某些氨基酸的取代往往比其他氨基酸更具有耐受性，這些氨基酸往往表現(xiàn)出與原氨基酸的大小、電荷、極性和疏水性之間的相似性相關，這是確定″保守取代″的基礎。在本文中，保守取代定義為在以下五種基團之一的內部進行交換：基團1-小脂肪族、非極性或略具極性的殘基(ala，ser，thr，pro，gly)；基團2-極性、帶負電荷的殘基及其酰胺(asp，asn，glu，gln)；基團3-極性、帶正電荷的殘基(his，arg，lys)；基團4-大脂肪族非極性殘基(met，leu，lle，val，cys)以及基團5-大芳香殘基(phe，tyr，trp)。較不保守的取代可能涉及一個氨基酸被另一個具有類似特點但在大小上有所不同的氨基酸所取代，如：丙氨酸被異亮氨酸殘基取代。高度不保守的取代可能涉及一個酸性氨基酸被另一個具有極性或甚至具有堿性性質的氨基酸所取代。然而，這種″激進″取代不能認為是無效的而不予考慮，因為化學作用是不完全可預測的，激進的取代可能會帶來其簡單化學原理中無法預見的偶然效果。當然，這種取代可能涉及普通l-氨基酸之外的其他結構。因此，d-氨基酸可能被本發(fā)明的抗原肽中常見的l-氨基酸取代，也仍在本公開的范圍之內。此外，具有非標準r基團的氨基酸(即，除了天然蛋白的20個常見氨基酸之外的r基團)也可以用于取代之目的，以生產根據(jù)本發(fā)明的免疫原和免疫原性多肽。如果在一個以上位置上的取代發(fā)現(xiàn)導致肽的抗原活性基本上等于或大于以下定義值，則對這些取代的組合進行測試，以確定組合的取代是否產生對肽抗原性的迭加或協(xié)同效應。肽內被同時取代的位置最多不能超過4個。本發(fā)明的肽可被拉長多達四個氨基酸，即1、2、3或4個氨基酸，可按照4∶0與0∶4之間的任何組合添加至任意一端。本發(fā)明的拉長組合情況如表7所示：拉伸/延長的氨基酸可以是所述蛋白或任何其他氨基酸的原序列肽。拉長可用于增強所述肽的穩(wěn)定性或溶解性。術語″t細胞反應″是指由一種肽在體外或體內誘導的效應子功能的特異性擴散和啟動。對于mhci類限制性ctl，效應子功能可能為溶解肽脈沖的、肽前體脈沖的或天然肽提呈的靶細胞、分泌細胞因子，優(yōu)選為肽誘導的干擾素-γ，tnf-α或il-2，分泌效應分子，優(yōu)選為肽誘導的顆粒酶或穿孔素，或脫顆粒。優(yōu)選情況是，當本發(fā)明的肽特異性t細胞相比于取代肽受到檢測時，如果取代肽在相對于背景肽溶解度增加達到最大值的一半，則該肽濃度不超過約1mm，優(yōu)選為不超過約1μm，更優(yōu)選為不超過約1nm，再優(yōu)選為不超過約100pm，最優(yōu)選為不超過約10pm。也優(yōu)選為，取代肽被一個以上的t細胞識別，最少為2個，更優(yōu)選為3個。因此，本發(fā)明所述的表位可能與天然腫瘤相關表位或腫瘤特異性表位相同，也可能包括來自參考肽的不超過四個殘基的不同肽，只要它們有基本相同的抗原活性即可。mhc-i類分子，在細胞核提呈因主要內源性、細胞質或細胞核蛋白質、drips和較大肽蛋白裂解產生的肽的細胞上都能發(fā)現(xiàn)此類分子。然而，源自內體結構或外源性來源的肽也經(jīng)常在mhc-i類分子上發(fā)現(xiàn)。這種i-類分子非經(jīng)典提呈方式在文獻中被稱為交叉提呈。由于cd8及cd4依賴型反應共同和協(xié)同促進抗腫瘤作用，因此，cd8陽性t細胞(mhc-i分子)或cd4陽性t細胞(mhc-ii類分子)對腫瘤相關抗原的識別和鑒定對開發(fā)腫瘤疫苗非常重要。因此，提出含有與任一類mhc復合體結合的肽組合物是本發(fā)明的一個目標?？紤]到治療癌癥相關的嚴重副作用和費用，迫切需要更好的預后和診斷方法。因此，有必要確定代表癌癥生物標志物的其他因子，尤其是hcc。此外，有必要確定可用于治療癌癥的因子，尤其是hcc。本發(fā)明提出了有利于治療癌腫/腫瘤，優(yōu)選為治療過量提呈或只提呈本發(fā)明肽的hcc。這些肽由質譜分析法直接顯示出，而由hla分子自然提呈于人原發(fā)性人hcc樣本中。與正常組織相比，癌癥中高度過度表達肽來源的源基因/蛋白質(也指定為″全長蛋白質″或″潛在蛋白質″)-本發(fā)明相關的″正常組織″是健康肝細胞或其他正常組織細胞，這表明腫瘤與這些源基因的高度關聯(lián)性(見實施例2)。此外，這些肽本身也在腫瘤組織中過度提呈(本發(fā)明相關的″腫瘤組織″是指來自hcc患者的樣本)，但不在正常組織中過度提呈(見實施例1)。hla結合肽能夠被免疫系統(tǒng)識別，特別是t淋巴細胞。t細胞可破壞提呈被識別hla/肽復合體的細胞(如：提呈衍生肽的hcc細胞)。本發(fā)明的所有肽已被證明具有刺激t細胞反應的能力，并過量提呈，因而可用于制備本發(fā)明的抗體和/或tcr，特別是stcr(參見實施例3)。此外，肽與相應的mhc組合時，也可用于制備本發(fā)明的抗體和/或tcr，特別是stcr。各個方法均為技術人員所熟知，并在各個文獻中可找到。因此，本發(fā)明的肽可用于在患者中產生免疫反應，從而能夠毀滅腫瘤細胞?；颊叩拿庖叻磻軌蛲高^直接給予患者所述肽或前體物質(如，加長肽、蛋白或編碼這些肽的核酸)，較理想是與加強免疫原性的制劑相結合，而進行誘導。源自該治療性疫苗的免疫反應預期能夠高度特異性地對抗腫瘤細胞，因為本發(fā)明的目標肽在正常組織上提呈的復制數(shù)目較少，防止患者發(fā)生對抗正常細胞的不良自體免疫反應的風險。優(yōu)選的″藥物組合物″是指優(yōu)選適合在醫(yī)療機構用于人體的組合物。優(yōu)選地，藥物組合物為無菌狀態(tài)，并根據(jù)gmp指南生產。藥物組合物包括游離形式或以一種藥用鹽形式存在的肽(也參見上文)。此處使用的″藥用鹽″系指所公開的肽的一種衍生物，其中該肽由制酸或藥劑的堿鹽進行改性。例如，用與適合的酸反應的游離堿(通常其中的中性藥物有一個中性-nh2基團)制備酸式鹽。適合制備酸鹽的酸包括有機酸，如：乙酸、丙酸、羥基酸、丙酮酸、草酸、蘋果酸、丙二酸、丁二酸、馬來酸、富馬酸、酒石酸、檸檬酸、苯甲酸酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、甲磺酸、苯磺酸、水楊酸等等、以及無機酸，如：鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸和磷酸等。相反，可在一種肽上提呈的酸性基團的堿鹽制劑使用藥用堿基進行制備，如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、氫氧化鈣、三甲胺等等。在特別優(yōu)選的實施例中，藥物組合物包括乙酸(醋酸鹽)，三氟乙酸鹽或鹽酸(氯化物)形式的肽。特別優(yōu)選的是一種組合物和/或所述組合物例如以疫苗形式使用，其包括具有seqidno1、2、7、225、228、301、303和312的肽或具有seqidno1、2、7、225、228、301、303和312序列的肽反應性支架，及其mhc分子復合體。本發(fā)明的肽除了用于治療癌癥，也可用于診斷。由于肽由hcc細胞產生，并且已確定這些肽在正常組織中不存在或水平較低，因此這些肽可用于診斷癌癥是否存在。血液樣本中組織活檢物含權利要求的肽，可有助于病理師診斷癌癥。用抗體、質譜或其他本領域內已知的方法檢測某些肽可使病理師判斷該組織樣本為惡性的還是炎癥或一般病變，也可用作hcc的生物標志物。肽基團的提呈使得能對病變組織進行分類或進一步分成子類。對病變標本中肽的檢測使得能對免疫系統(tǒng)治療方法的利益進行判斷，特別是如果t-淋巴細胞已知或預計與作用機制有關。mhc表達的缺失是一種機制，充分說明了哪些受感染的惡性細胞逃避了免疫監(jiān)視。因此，肽的提呈表明，分析過的細胞并沒有利用這種機制。本發(fā)明的肽可用于分析淋巴細胞對肽的反應(如t細胞反應)，或抗體對肽或mhc分子絡合的肽發(fā)生的反應。這些淋巴細胞反應可以作為預后指標，決定是否采取進一步的治療。這些反應也可以用作免疫療法中的替代指標，旨在以不同方式誘導淋巴細胞反應，如接種蛋白疫苗、核酸、自體材料、淋巴細胞過繼轉移。基因治療中，淋巴細胞對肽發(fā)生的反應可以在副作用的評估中考慮。淋巴細胞反應監(jiān)測也可能成為移植療法隨訪檢查中的一種有價值的工具，如，用于檢測移植物抗宿主和宿主抗移植物疾病。本發(fā)明中的肽可用于生成和開發(fā)出針對mhc/肽復合體的特定抗體。這些抗體可用于治療，將毒素或放射性物質靶向病變組織。這些抗體的另一用途是為了成像之目的(如pet)將放射性核素靶向病變組織。這可有助于檢測小轉移灶或確定病變組織的大小和準確位置。因此，本發(fā)明的另一方面是提出產生特異性結合至與hla限制性抗原絡合的i或ii類人主要組織兼容性復合體(mhc)的一種重組抗體的方法，該方法包括：用可溶形式的與hla限制性抗原絡合的(mhc)i或ii類分子對包含表達所述主要組織兼容性說復合體(mhc)i或ii類的基因工程非人哺乳動物進行免疫；將mrna分子與產生所述非人哺乳動物細胞的抗體分離；產生一個噬菌體顯示庫，顯示由所述mrna分子編碼的蛋白分子；以及將至少一個噬菌體與所述噬菌體顯示庫分離，所述的至少一個噬菌體顯示所述抗體特異性地結合至與hla限制性抗原絡合的所述人主要組織兼容性說復合體(mhc)i或ii類。本發(fā)明的另一方面提出一種抗體，其特異性結合至與一種hla限制性抗原絡合的i或ii類人主要組織兼容性說復合體(mhc)，其中該抗體優(yōu)選為多克隆抗體、單克隆抗體、雙特異性抗體和/或嵌合抗體。此外，本發(fā)明的另一個方面涉及產生特異性結合至與hla限制性抗原絡合的i或ii類人主要組織兼容性復合體(mhc)的一種抗體的方法，該方法包括：用可溶形式的與hla限制性抗原絡合的(mhc)i或ii類分子對包含表達所述主要組織兼容性說復合體(mhc)i或ii類的基因工程非人哺乳動物進行免疫；將mrna分子與產生所述非人哺乳動物細胞的抗體分離；產生一個噬菌體顯示庫，顯示由所述mrna分子編碼的蛋白分子；以及將至少一個噬菌體與所述噬菌體顯示庫分離，所述的至少一個噬菌體顯示所述抗體可特異性地結合至與hla限制性抗原絡合的所述人主要組織兼容性說復合體(mhc)i或ii類。產生這種抗體和單鏈i類主要組織兼容性復合體的相應方法，以及產生這些抗體的其他工具在wo03/068201、wo2004/084798、wo01/72768、wo03/070752以及cohencj，etal.recombinantantibodieswithmhc-restricted，peptide-specific，t-cellreceptor-likespecificity：newtoolstostudyantigenpresentationandtcr-peptide-mhcinteractions.jmolrecognit.2003sep-oct；16(5)：324-32.；denkbergg，etal.selectivetargetingofmelanomaandapcsusingarecombinantantibodywithtcr-likespecificitydirectedtowardamelanomadifferentiationantigen.jimmunol.2003sep1；171(5)：2197-207；以及cohencj，etal.directphenotypicanalysisofhumanmhcclassiantigenpresentation：visualization，quantitation，andinsitudetectionofhumanviralepitopesusingpeptide-specific，mhc-restrictedhumanrecombinantantibodies.jimmunol.2003apr15；170(8)：4349-61中進行了披露，為了本發(fā)明之目的，所有參考文獻透過引用被完整地并入本文。優(yōu)選地，該抗體與復合體的結合親和力低于20納摩爾，優(yōu)選為低于10納摩爾，這在本發(fā)明情況下被視為具有揬本發(fā)明的另一方面提出了制備識別特異性肽-mhc復合體的可溶性t細胞受體(stcr)的一種方法。這種可溶性t細胞受體可從特異性t細胞克隆中產生，并且它們的親和力可以透過互補決定區(qū)靶向誘變而增加。為了t細胞受體選擇之目的，可以使用噬菌體展示(美國2010/0113300，liddyn，etal.monoclonaltcr-redirectedtumorcellkilling.natmed2012jun；18(6)：980-987)。為了在噬菌體展示期間以及實際使用為藥物時穩(wěn)定t細胞受體之目的，可透過非天然二硫鍵、其他共價鍵(單鏈t細胞受體)或透過二聚化結構域連接α和β鏈(參見boulterjm，etal.stable，solublet-cellreceptormoleculesforcrystallizationandtherapeutics.proteineng2003sep；16(9)：707-711.；cardkf，etal.asolublesingle-chaint-cellreceptoril-2fusionproteinretainsmhc-restrictedpeptidespecificityandil-2bioactivity.cancerimmunolimmunother2004apr；53(4)：345-357；以及willcoxbe，etal.productionofsolublealphabetat-cellreceptorheterodimerssuitableforbiophysicalanalysisofligandbinding.proteinsci1999nov；8(11)：2418-2423)。t細胞受體可以連接到毒素、藥物、細胞因子(參見us2013/0115191)、結構域招募效應細胞，如抗cd3結構域等，以便對靶細胞執(zhí)行特定的功能。此外，它可能表達于用于過繼轉移的t細胞。進一步的信息可在wo2004/033685a1和wo2004/074322a1中找到。stcr的組合在wo2012/056407a1中進行了描述。wo2013/057586a1中公開了制備的進一步的方法。此外，可用本發(fā)明的肽和/或tcr或抗體或其他結合分子在活檢樣本的基礎上驗證病理師對癌癥的診斷。為了選擇過度提呈的肽，計算了提呈圖，其顯示樣本中位提呈量以及復制變化。該特點使相關腫瘤實體的樣本與正常組織樣本的基線值并列。透過計算調節(jié)線性混合效應模型(j.pinheiro，etal.thenlmepackage：linearandnonlinearmixedeffectsmodels.2007)的p值可以將以上每個特點并入過度提呈分數(shù)中，從而透過假發(fā)現(xiàn)率調整多項檢驗(y.benjaminiandy.hochberg.controllingthefalsediscoveryrate：apracticalandpowerfulapproachtomultipletesting.journaloftheroyalstatisticalsociety.seriesb(methodological)，vol.57(no.1)：289-300，1995)。對于透過質譜法對hla配體的識別和相對定量，對來自沖擊冷凍組織樣本的hla分子進行純化并對hla相關肽進行分離。分離的肽分開，并透過在線納米-電噴霧-電離(nanoesi)液相色譜-譜(lc-ms)實驗進行鑒定。由此產生的肽序列的驗證方法是，將hcc樣本(n＝16個a＊02-陽性樣本，包括13個a＊02：01-陽性樣本，n＝15個a＊24-陽性樣本)中記錄的天然tumap的片段模式與相同序列相應合成參考肽的片段模式進行比較。由于這些肽被直接鑒定為原發(fā)性腫瘤hla分子的配體，因此這些結果為獲得自31名hcc患者的原發(fā)性癌癥組織上確定肽的天然加工和提呈提供了直接證據(jù)。發(fā)現(xiàn)管道v2.1(例如，參見us2013-0096016，并在此透過引用將其整體并入本文)考慮到識別和選擇相關過量提呈的候選肽疫苗，這基于與幾種不同的非癌組織和器官相比癌癥或其他受感染組織的hla限制肽水平直接相對定量結果。這透過以下方法實現(xiàn)：使用專有數(shù)據(jù)分析管道處理的lc-ms采集資料、結合序列識別算法、譜聚類、計算離子、保留時間調整、充電狀態(tài)卷積以及正態(tài)化而開發(fā)無標記差異化定量方法。為每種肽和樣本確立了提呈水平，包括誤差估計值。腫瘤組織大量提呈的肽以及腫瘤與非腫瘤組織和器官中過量提呈的肽已經(jīng)得到確定。對來自hcc組織樣本的hla肽復合體進行純化，并且對hla相關肽使用lc-ms進行分離和分析(見實施例)。本申請中包含的所有tumap使用原發(fā)性hcc樣本的方法進行鑒定，確認其在原發(fā)性hcc上的提呈。在多個hcc腫瘤和正常組織上確定的tumap用無標記lc-ms數(shù)據(jù)的離子計數(shù)方法進行量化。該方法假定肽的lc-ms信號區(qū)域與樣本中其豐度相關。各種lc-ms實驗中肽的所有量化信號在集中趨勢基礎上進行正常化，根據(jù)每個樣品進行平均，并合并入柱狀圖(被稱為提呈圖)。提呈圖整合了不同分析方法，如：蛋白數(shù)據(jù)庫檢索、譜聚類、充電狀態(tài)卷積(除電)和保留時間校準和正態(tài)化。本發(fā)明涉及一種肽，包含選自seqidno：1至seqidno：300的組的一個序列或該序列的與seqidno：1至seqidno：300具有90％同源性(優(yōu)選為相同)的一種變體，或誘導與所述變異肽發(fā)生t細胞交叉反應的一種變體，其中，所述肽不是基本的全長多肽。本發(fā)明進一步涉及一種肽，包含選自seqidno：1至seqidno：300的組的一個序列、或與seqidno：1至seqidno：300具有至少90％同源性(優(yōu)選為相同)的一種變體，其中所述肽或變體的總長度為8至100個、優(yōu)選為8至30個、最優(yōu)選為8至14個氨基酸。本發(fā)明進一步涉及本發(fā)明的肽，其具有與主要組織兼容性復合體(mhc)i或ii類分子結合的能力。本發(fā)明進一步涉及本發(fā)明中的肽，其中肽系由或基本系由根據(jù)seqidno：1至seqidno：300的一個氨基酸序列組成。本發(fā)明進一步涉及本發(fā)明的肽，其中該肽(在化學上)被修飾和/或包含非肽鍵。本發(fā)明進一步涉及本發(fā)明的肽，其中該肽為融合蛋白的一部分，特別包括hla-dr抗原相關不變鏈(li)的n-端氨基酸，或其中該肽與一種抗體(例如，樹突狀細胞特定抗體)融合。本發(fā)明進一步涉及一種核酸，其編碼本發(fā)明所述肽，前提是該肽并非完整(完全)的人蛋白。本發(fā)明進一步涉及一種本發(fā)明的核酸，為dna、cdna、pna、rna，也可能為其組合物。本發(fā)明進一步涉及一種能表達本發(fā)明核酸的表達載體。本發(fā)明進一步涉及本發(fā)明的一種肽、本發(fā)明的一種核酸或本發(fā)明的一種藥用表達載體，特別是用于治療hcc。本發(fā)明進一步涉及含本發(fā)明核酸或本發(fā)明表達載體的一種宿主細胞。本發(fā)明進一步涉及本發(fā)明的宿主細胞，其為抗原提呈細胞，優(yōu)選為樹突細胞。本發(fā)明進一步涉及本發(fā)明中的方法，其中抗原透過與足夠量的含抗原提成細胞的抗原結合被載入表達于合適抗原提呈細胞表面的i或ii類mhc分子。本發(fā)明進一步涉及本發(fā)明的方法，其中該抗原提呈細胞包括一個表達載體，該載體有能力表達含seqidno：1至seqidno：300的肽或所述變體氨基酸序列。本發(fā)明進一步涉及任何所述肽、本發(fā)明的一種核酸、本發(fā)明的一種表達載體、本發(fā)明的一種細胞、本發(fā)明一種作為藥劑或制造藥劑的啟動細胞毒性t淋巴細胞的用途。本發(fā)明進一步涉及一種本發(fā)明的用途，其中藥劑可有效抗癌。本發(fā)明進一步涉及一種本發(fā)明的用途，其中該藥劑為一種疫苗。本發(fā)明進一步涉及一種本發(fā)明的用途，其中藥劑可有效抗癌。本發(fā)明進一步涉及一種本發(fā)明的用途，其中所述癌細胞為hcc細胞或其他實體或血液學腫瘤細胞，例如，胰腺癌、腦癌、腎癌、結腸癌或直腸癌或白血病。本發(fā)明進一步涉及一種基于本發(fā)明肽的特定標志物蛋白和生物標志物，在此成為靶標摂，其可用于診斷和/或判斷hcc的預后。本發(fā)明還涉及這些供癌癥治療使用的新靶點。本文中術語″抗體″為廣義上的定義，既包括多克隆也包括單克隆抗體。除了完整或「全部」的免疫球蛋白分子，″抗體″這一術語還包括這些免疫球蛋白分子和人源化免疫球蛋白分子的片段(如，cdr、fv、fab和fc片段)或聚合物，只要它們表現(xiàn)出本發(fā)明的任何期望屬性(例如，hcc標志物多肽的特異性結合、將毒素傳遞給hcc細胞標志物基因表達水平增加時的hcc細胞和/或抑制hcc標志物多肽的活性)。只要有可能，本發(fā)明的抗體可從商業(yè)來源購買。本發(fā)明的抗體也可能使用已知的方法制得。技術人員會了解全長hcc標志物多肽或其片段可用于制備本發(fā)明的抗體。用于產生本發(fā)明抗體的多肽可部分或全部地由天然源經(jīng)純化而得，也可利用重組dna技術生產。例如，本發(fā)明的編碼肽的cdna，例如，該肽為根據(jù)seqidno：1至seqidno：30多肽的肽，或其中一個變體或片段，可在原核細胞中(如：細菌)或真核細胞(如：酵母、昆蟲或哺乳動物細胞)中表達，之后，可純化重組蛋白，并用于產生一種特異性結合用于產生本發(fā)明抗體的hcc標志物多肽的單克隆或多克隆抗體制劑。本領域的技術人員會認識到，兩種或兩種以上不同集合的單克隆抗體或多克隆抗體能最大限度地增加獲得一種含預期用途所需的特異性和親和力(例如，elisa法、免疫組織化學、體內成像、免疫毒素療法)的抗體的可能性。根據(jù)抗體的用途，用已知的方法對其期望活性進行測試(例如，elisa法、免疫組織化學、免疫治療等；要獲取產生和測試抗體的進一步指導，請參閱，例如，harlowandlane，antibodies：alaboratorymanual，coldspringharborlaboratorypress，coldspringharbor，n.y.，1988，new2ndedition2013)。例如，該抗體可用elisa法或免疫印跡法、免疫組織化學染色福爾馬林固定的癌組織或冰凍的組織切片進行檢測。在初次體外表征后，用于治療或體內診斷用途的抗體根據(jù)已知的臨床測試方法進行檢測。此處使用的術語″單克隆抗體″系指從大量同質抗體中獲得的一種抗體，即，由相同的抗體組成的抗體群，但可能少量提呈的自然突變除外。此處所述的單克隆抗體具體包括″嵌合″抗體，其中一部分重鏈和/或輕鏈與從特定物種中獲得的抗體或屬于特定抗體類型和分類型抗體的相應序列相同(同質)，同時，剩余鏈與從其他物種中獲得的抗體或屬于特定抗體類型和子類型抗體的相應序列以及這些抗體的片段相同(同質)，只要它們表現(xiàn)出預期的拮抗活性(美國4816567號專利，其在此以其整體并入)。本發(fā)明的單克隆抗體可能使用雜交瘤方法制得。在雜交瘤方法中，老鼠或其他適當?shù)乃拗鲃游?，通常用免疫制劑以引發(fā)產生或能產生將特異性結合至免疫制劑的抗體?；蛘?，淋巴細胞可在體外進行免疫。單克隆抗體也可由dna重組方法制得，如：美國4816567號專利所述。編碼本發(fā)明單克隆抗體的dna可很容易地使用傳統(tǒng)程序進行分離和測序(例如：透過使用能與編碼鼠抗體重鏈和輕鏈的基因特異性結合的寡核苷酸探針)。體外方法也適用于制備單價抗體?？贵w消化以產生抗體的片段，尤其是fab片段，可以透過使用本領域已知的常規(guī)技術完成。例如，可以透過使用木瓜蛋白酶完成消化。木瓜蛋白酶消化的實施例在wo94/29348和美國4342566號專利中有描述?？贵w的木瓜蛋白酶消化通常產生兩種相同的抗原結合性片段，稱為fab片段(每個片段都有一個抗原結合點)和殘余fc片段。胃蛋白酶處理產生af(ab′)2片段和pfc′片段。抗體片段，不論其是否附著于其他序列，均可包括特定區(qū)域或特定氨基酸殘基的插入、刪除、替換、或其他選擇性修飾，但前提是，片段的活性與非修飾的抗體或抗體片段相比沒有顯著的改變或損害。這些修飾可提供一些額外的屬性，如：刪除/添加可與二硫鍵結合的氨基酸，以增加其生物壽命、改變其分泌特性等。在任何情況下，抗體片段必須擁有生物活性的特性，如：結合活性、調節(jié)結合域的結合力等?？贵w的功能性或活性區(qū)域可透過蛋白特定區(qū)域的基因突變、隨后表達和測試所表達的多肽進行確定。這些方法為本行業(yè)技術人員所熟知，可包括編碼抗體片段的核酸的特定位點基因突變。本發(fā)明的抗體可進一步包括人源化抗體或人抗體。非人(如：鼠)抗體的人源化形式為嵌合抗體免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段(如：fv、fab、fab′或抗體的其他抗原結合序列)，其中包含從非人免疫球蛋白中獲得的最小序列。人源化抗體包括人免疫球蛋白(受體抗體)，其中來自受體互補決定區(qū)(cdr)的殘基被來自非人物種(供體抗體)(如具有與其特異性、親和力和能力的小鼠、大鼠或兔子)cdr的殘基取代。在某些情況下，人類免疫球蛋白的fv框架(fr)殘基被相應的非人殘基取代。人源化抗體可能還包括既非受體抗體、也非輸入cdr或框架序列中發(fā)現(xiàn)的殘基。一般來說，人源化抗體將包括幾乎所有的至少一個、通常為二個可變域，其中，全部或幾乎全部的cdr區(qū)域均對應于非人免疫球蛋白的區(qū)域并且全部或幾乎全部的fr區(qū)域均為人免疫球蛋白相同序列的區(qū)域。理想情況是，人源化抗體還將包括至少免疫球蛋白恒定區(qū)(fc)的一部分，通常是人免疫球蛋白的恒定區(qū)的一部分。人源化非人抗體的方法為本行業(yè)所熟知。一般來說，人源化抗體具有一個或多個從非人源頭引入的氨基酸殘基。這些非人氨基酸殘基往往被稱為″輸入″殘基，通常從″輸入″可變結構域中獲得。人源化基本上可以透過將嚙齒動物cdr或cdr序列取代為相應的人抗體序列而完成。因此，這種″人源化″抗體為嵌合抗體(美國4816567號專利)，其中大大少于完整的人可變結構域被來自于非人物種的相應序列取代。在實踐中，人源化抗體通常為人抗體，其中有些cdr殘基以及可能的一些fr殘基被來自嚙齒動物抗體中的類似位點的殘基取代。可使用免疫后在內源性免疫球蛋白產生缺失時能產生完整人抗體的轉基因動物(如：小鼠)。例如，它被描述為，嵌合和種系突變小鼠中的抗體重鏈連接區(qū)域基因的純合性缺失導致內源性抗體生成的完全抑制。在此種系變種小鼠中人種系免疫球蛋白基因數(shù)組的轉移在抗原挑戰(zhàn)后將導致人抗體的生成。人抗體也可在噬菌體展示庫中產生。本發(fā)明的抗體優(yōu)選為透過藥用載體的形式給予受試者。通常，在制劑中使用適量的藥用鹽，以使制劑等滲。藥用載體的例子包括生理鹽水、林格氏液和葡萄糖溶液。溶液的ph值優(yōu)選為約5至8，更優(yōu)選為約7至7.5。此外，載體還包括緩釋制劑，如：含有抗體的固體疏水性聚合物半透性基質，其中基質為有形物品形式，如：薄膜、脂質體或微粒。本行業(yè)的技術人員熟知，某些載體可能為更優(yōu)選，取決于例如，抗體的給藥途徑和濃度。該抗體可透過注射(如：靜脈內、腹腔內、皮下、肌肉內)或透過輸注等其他方法給予受試者、患者或細胞，確保其以有效的形式傳輸?shù)窖褐小＿@些抗體也可以透過瘤內或瘤周途徑給予，從而發(fā)揮局部和全身的治療作用。局部或靜脈注射為優(yōu)選?？贵w給藥的有效劑量和時間表可根據(jù)經(jīng)驗確定，并且作出此類決定屬本行業(yè)的技術范圍內。本行業(yè)的技術人員會明白，必須給予的抗體劑量根據(jù)以下因素會有所不同，例如：接受抗體的受試者、給藥途徑、使用的抗體以及其他正在使用的藥物的特定類型。單獨使用的抗體的通常日劑量可能為約1μg/kg至最多100mg/kg體重或更多，這取決于上述因素。給予抗體，優(yōu)選為治療hcc后，治療抗體的療效可透過技術人員熟知的不同方法評估。例如：接受治療的受試者癌癥的大小、數(shù)量和/或分布可使用標準腫瘤成像技術進行監(jiān)測。因治療而給予的抗體與不給予抗體時的病程相比，可阻止腫瘤生長、導致腫瘤縮小、和/或阻止新腫瘤的發(fā)展，這樣的抗體是一種有效治療癌癥的抗體。由于本發(fā)明上述表格中提及的肽以及其潛在的多肽在hcc中呈高表達，而在正常細胞中表達極低，抑制選自包括以下基因的蛋白產物的組的一種蛋白：優(yōu)選用于抑制和抗體和/或tcr抵抗的是glul、gpam、plin2、slc16a1、slc9a3r1、pcbd1、sec16a、akr1c4、abcb11、hal、cyp2e1、c4a、c4b、aldh1l1、crp、acsl4、eef2、hltf、fbxo22、galk1、tmco1、tmem33、znf318、ipo9、amacr、c1qtnf3、cyp4f8、cyp4f3、cyp4f11、cyp4f12、cyp4f2、mocos、a1cf、col18a1、hpr、lbp、c19orf80、cfhr5、itih4、tmem110、larp4、lmf2、slc10a5和slc16a11；進一步優(yōu)選用于抑制和抗體和/或tcr抵抗的是ankfy1、c12orf44、c16orf58、cpsf1、dcaf8、pex19、ddx11、ddx12p、decr2、nme4、dennd5b、dym、edc4、eri3、fam20a、fndc3a，gpr107、gyg2、heatr2、ift81、kctd3，shkbp1、kiaa1324l、klhl24、march6、mbtps2、mir1279、cpsf6、noc4l、nxf1、pank2、pcnxl3、pipsl、psmd4、psmd14、slc35b1、tcp11l2、thnsl2、thoc2、tomm5、trappc6b、trim54、trim55、trim63、uggt2、urb1、vps54、wiz、znf451、rftn2、scfd1、serinc5、cct7p2、cmas、anks1a、c17orf70、cct7、cdk5rap2、clptm1，最優(yōu)選用于抑制和抗體和/或tcr抵抗的是apob、fasn和/或copa；這些標志物的表達或其活性可優(yōu)選融入治療或預防hcc的治療策略中。反義治療的原理是基于這樣的假設：基因表達的序列特異性抑制(透過轉錄或翻譯)可能是透過基因組dna或mrna與互補反義種類之間的雜交而實現(xiàn)。這種雜交核酸雙工的形成干擾目標腫瘤抗原編碼基因組dna的轉錄，或目標腫瘤抗原mrna的加工/運輸/翻譯和/或穩(wěn)定性。反義核酸可用各種方法傳遞。例如，反義寡核苷酸或反義rna可以讓腫瘤細胞吸收的方式直接給予(例如，透過靜脈注射)受試者。另外，編碼反義rna(或rna片段)的病毒或質粒載體可導入體內細胞。還可透過有義序列誘發(fā)反義效果；然而，表型變化的程度大不相同。透過有效的反義治療誘導的表型變化可根據(jù)，例如，靶mrna水平、靶蛋白水平、和/或靶蛋白活性水平的變化進行評估。在一個具體的實施例中，可透過直接向受試者給予反義腫瘤標志物rna而實現(xiàn)反義基因治療抑制hcc靶標/標志物。腫瘤標志物反義rna可透過任何標準技術制造和分離，但最容易的制造方法是在控制高效啟動子(例如，t7啟動子)的情況下使用腫瘤標志物反義cdna經(jīng)體外轉錄制得。腫瘤標志物反義rna給到細胞可透過下文所述的核酸直接給藥方法中的任何一種進行。用于抑制選自上述蛋白質(最優(yōu)選apob、fasn和/或copa)組成的組中的蛋白功能的替代策略涉及使用核酸(例如，sirna或編碼抗蛋白抗體或其部分的核酸，這可被轉入癌細胞或其他細胞，導致細胞內抗體表達和分泌)、蛋白質或小分子、或針對此蛋白的表達、翻譯和/或生物功能的任何其他復合體。在上述的方法中，其中包括將外源性dna給入受試者的細胞并被其吸收(即，基因轉導或轉染)，本發(fā)明的核酸可為裸露dna形式或核酸可位于載體中將核酸傳遞至細胞以抑制hcc標志物蛋白的表達。該載體可以是一種市售的制劑，如腺病毒載體(量子生物技術公司，laval，quebec，canada)。核酸或載體可透過多種機制傳遞至細胞中。例如，可使用市售的脂質體，如：lipofectin、lipofectamine(gibco-25brl公司，gaithersburg，md.)、superfect(qiagen公司，hilden，germany)和transfectam(promegabiotec公司，madison，wis.，us)以及根據(jù)本領域標準程序開發(fā)的其他脂質體，透過這些脂質體傳遞。此外，本發(fā)明的核酸或載體可透過體內電穿孔傳遞，該技術可從genetronics公司(sandiego，us)獲得，以及透過sonoporation機(imarx制藥公司，tucson，arizona，us)的方式傳遞。例如，載體可透過病毒系統(tǒng)(如可包裹重組逆轉錄病毒基因組的逆轉錄病毒載體系統(tǒng))傳遞。重組逆轉錄病毒可用于感染，從而傳遞至抑制選自包括上述蛋白的組的蛋白質表達的受感染細胞反義核酸。當然，將改變的核酸準確地導入至哺乳動物細胞細胞內并不限于使用逆轉錄病毒載體。對于這一程序有廣泛的其他技術可供使用，包括使用腺病毒載體、腺相關病毒(aav)載體、慢病毒載體、假型逆轉錄病毒載體。也可使用物理轉導技術，如脂質體傳遞和受體介導的及其它內吞作用機制。本發(fā)明可與這些技術或其他常用基因轉移方法中的任何方法配合使用。該抗體也可用于體內診斷實驗。一般來說，抗體用放射性核素標記(如：111in、99tc、14c、131i、3h、32p或35s)，從而可免疫閃爍掃描法使腫瘤局限化。在一實施方案中，其中的抗體或片段與兩個或兩個以上選自包括上述蛋白的組的蛋白質靶目標細胞外結構域結合，并且親和力值(kd)低于1x10μm。診斷用抗體可透過各種影像學方法使用適合檢測的探針進行標記。探針檢測方法包括但不限于，熒光、光、共聚焦和電鏡方法；磁共振成像和光譜學技術；透視、計算機斷層掃描和正電子發(fā)射斷層掃描。合適的探針包括但不限于，熒光素、羅丹明、曙紅及其它熒光團、放射性同位素、黃金、釓和其他稀土、順磁鐵、氟-18和其他正電子發(fā)射放射性核素。此外，探針可能是雙功能或多功能的，并且用一種以上的上述方法可進行檢測。這些抗體可用所述的探針直接或間接進行標記?？贵w探針的連接，包括探針的共價連接、將探針融合入抗體、以及螯合化合物的共價連接從而結合探針、以及其他本行業(yè)熟知的方法。對于免疫組織化學方法，疾病組織樣本可能是新鮮或冷凍或可能包埋于石蠟中以及用福爾馬林等防腐劑固定。固定或包埋的切片包括與標記一抗和二抗接觸的樣本，其中該抗體用于檢測原位蛋白的表達。因此，如上所述，本發(fā)明提出了一種肽，其包括選自seqidno：1至seqidno：300群組的一個序列、或與seqidno：1至seqidno：300具有90％同源性的其變體、或誘導與該肽發(fā)生t細胞交叉反應的一個變體。本發(fā)明所訴的肽具有與主要組織兼容性復合體(mhc)i或所述肽拉長版本的ii類分子結合的能力。在本發(fā)明中，″同源性″一詞系指兩個氨基酸序列之間的同一度(參見上文的等同度百分比，如肽或多肽序列。前文所述的″同源″是透過將理想條件下調整的兩個序列與待比較序列進行比對后確定的。此類序列同源性可透過使用clustalw等算法創(chuàng)建一個排列而進行計算。也可用使用一般序列分析軟件，更具體地說，是vectornti、genetyx或由公共數(shù)據(jù)庫提供的其他分析工具。本領域技術人員能評估特定肽變體誘導的t細胞是否可與該肽本身發(fā)生交叉反應(fongl，etal.alteredpeptideligandvaccinationwithflt3ligandexpandeddendriticcellsfortumorimmunotherapy.procnatlacadsciusa.2001jul17；98(15)：8809-14；zarembas，etal.identificationofanenhanceragonistcytotoxictlymphocytepeptidefromhumancarcinoembryonicantigen.cancerres.1997oct15；57(20)：4570-7；colombettis.etal.impactoforthologousmelan-apeptideimmunizationsontheanti-selfmelan-a/hla-a2tcellcross-reactivity.jimmunol.2006jun1；176(11)：6560-7；appayv，etal.decreasedspecificcd8+tcellcross-reactivityofantigenrecognitionfollowingvaccinationwithmelan-apeptide.eurjimmunol.2006jul；36(7)：1805-14)。發(fā)明人用給定氨基酸序列的″變體″表示，一個或兩個氨基酸殘基等的側鏈透過被另一個天然氨基酸殘基的側鏈或其他側鏈取代而發(fā)生改變，這樣，這種肽仍然能夠以含有給定氨基酸序列(由seqidno：1至seqidno：300組成)的肽大致同樣的方式與hla分子結合。例如，一種肽可能被修飾以便至少維持(如沒有提高)其能與hla-a＊02或-dr等合適mhc分子的結合槽相互作用和結合，以及至少維持(如沒有提高)其與啟動t細胞的tcr結合的能力。隨后，這些t細胞可與細胞和殺傷細胞發(fā)生交叉反應，這些細胞表達多肽(其中包含本發(fā)明中定義的同源肽的天然氨基酸序列)。正如科學文獻(godkina，etal.useofelutedpeptidesequencedatatoidentifythebindingcharacteristicsofpeptidestotheinsulin-dependentdiabetessusceptibilityallelehla-dq8(dq3.2).intimmunol.1997jun；9(6)：905-11)和數(shù)據(jù)庫(rammenseeh.etal.syfpeithi：databaseformhcligandsandpeptidemotifs.immunogenetics.1999nov；50(3-4)：213-9)中所述，hla-a結合肽的某些位點通常為錨定殘基，可形成一種與hla結合槽的結合模序相稱的核心序列，其定義由構成結合槽的多肽鏈的極性、電物理、疏水性和空間特性確定。因此，本領域技術人員能夠透過保持已知的錨殘基來修飾seqidno：1至seqidno：300提出的氨基酸序列，并且能確定這些變體是否保持與mhci或ii類分子結合的能力。本發(fā)明的變體保持與啟動t細胞的tcr結合的能力，隨后，這些t細胞可與表達一種包含本發(fā)明定義的同源肽的天然氨基酸序列的多肽的細胞發(fā)生交叉反應并殺死該等細胞。這些基本不與t細胞受體互動的氨基酸殘基可透過取代另一個幾乎不影響t細胞反應并不妨礙與相關mhc結合的氨基酸而得到修飾。因此，除了特定限制性條件外，本發(fā)明的肽可能為任何包括給定氨基酸序列或部分或其變體的肽(發(fā)明人所用的這個術語包括寡肽或多肽)。這些基本不與tcr體互動的氨基酸殘基可透過取代另一個幾乎不影響t細胞反應并不妨礙與相關mhc結合的氨基酸而得到修飾。因此，除了特定限制性條件外，本發(fā)明的肽可能為任何包括給定氨基酸序列或部分或其變體的肽(發(fā)明人所用的這個術語包括寡肽或多肽)。表8：根據(jù)seqidno：1、117和246的肽變體和基序較長的肽也可能適合。mhci類表位(通常長度為8至11個氨基酸)也可能由肽從較長的肽或包含實際表位的蛋白中加工而產生。兩側有實際表位的殘基優(yōu)選為在加工過程中幾乎不影響暴露實際表位所需蛋白裂解的殘基。因此，本發(fā)明提出了mhci類表位的肽和變體，其中所述肽或抗體的總長度為8至100個、優(yōu)選為8至30個、最優(yōu)選為8至14個氨基酸長度(即10、11、12、13、14個氨基酸，如果為拉長ii類結合肽時，長度也可為15、16、17、18、19、20、21或22個氨基酸)。當然，本發(fā)明的肽或變體能與人主要組織兼容性復合體(mhc)i或ii類分子結合。肽或變體與mhc復合體的結合可用本領域內的已知方法進行測試。在本發(fā)明的一個特別優(yōu)選實施方案中，肽系由或基本系由根據(jù)seqidno：1至seqidno：300所選的氨基酸序列組成?！寤居伞M成″系指本發(fā)明的肽，除了根據(jù)seqidno：1至seqidno：300中的任一序列或其變體組成外，還含有位于其他n和/或c端延伸處的氨基酸，而它們不一定能形成作為mhc分子表位的肽。但這些延伸區(qū)域對有效將本發(fā)明中的肽引進細胞具有重要作用。在本發(fā)明的一實施例中，該肽為融合蛋白的一部分，含來自ncbi、genbank登錄號x00497的hla-dr抗原相關不變鏈(p33，以下稱為″ii″)的80個n-端氨基酸等。在其他的融合中，本發(fā)明的肽可以被融合到本文所述的抗體、或其功能性部分，特別是融合入抗體的序列，以便所述抗體進行特異性靶向作用，或者，例如進入本文所述的樹突狀細胞特異性抗體。此外，該肽或變體可進一步修飾以提高穩(wěn)定性和/或與mhc分子結合，從而引發(fā)更強的免疫反應。肽序列的該類優(yōu)化方法是本領域內所熟知的，包括，例如，反式肽鍵和非肽鍵的引入。在反式肽鍵氨基酸中，肽(-co-nh-)并未連接其殘基，但是其肽鍵是反向的。這種逆向反向模擬肽(retro-inversopeptidomimetics)可透過本領域已知的方法制備，例如：meziere等在《免疫學雜志》((1997)j.immunol.159，3230-3237)中所述的方法，以引用的方式并入本文。這種方法涉及制備包含骨架(而并非側鏈)改變的模擬肽。meziere等人(1997年)的研究顯示，這些模擬肽有利于mhc的結合和輔助性t細胞的反應。以nh-co鍵替代co-nh肽鍵的逆向反向肽大大地提高了抗水解性能。非肽鍵為-ch2-nh、-ch2s-、-ch2ch2-、-ch＝ch-、-coch2-、-ch(oh)ch2-和-ch2so-等。美國4897445號專利提出了多肽鏈中非肽鍵(-ch2-nh)的非固相合成法，該方法涉及按標準程序合成的多肽以及透過氨基醛和一種含nacnbh3的氨基酸相互作用而合成的非肽鍵。含上述序列的肽可與其氨基和/或羧基末端的其他化學基團進行合成，從而提高肽的穩(wěn)定性、生物利用度、和/或親和力等。例如，芐氧羰基、丹?；仁杷鶊F或叔丁氧羰基團可加入肽的氨基末端。同樣，乙?；?-芴甲氧羰基可能位于肽的氨基末端。此外，疏水基團、叔丁氧羰基團或氨基團都可能被加入肽的羧基末端。另外，本發(fā)明中的所有肽都可能經(jīng)合成而改變其空間構型。例如，可能使用這些肽的一個或多個氨基酸殘基的右旋體，通常不是其左旋體。更進一步地，本發(fā)明中肽的至少一個氨基酸殘基可被熟知的一個非天然氨基酸殘基取代。諸如此類的改變可能有助于增加本發(fā)明肽的穩(wěn)定性、生物利用度和/或結合作用。同樣，本發(fā)明中的肽或變體可在合成肽之前或之后透過特異氨基酸的反應而進行化學修飾。此類修飾的實施例為本領域所熟知，例如，在r.lundblad所著的《chemicalreagentsforproteinmodification》(3rded.crcpress，2005)中有概述，以參考文獻的方式并入本文。雖然氨基酸的化學修飾方法無限制，但其包括(但不限于)透過以下方法修飾：酰基化、脒基化、賴氨酸吡哆基化、還原烷基化、以2，4，6-三硝基苯磺酸(tnbs)三硝基苯基化氨基團、透過將半胱氨酸過甲酸氧化為磺基丙氨酸而對羧基團和巰基進行氨基修飾、形成易變衍生物、與其他巰基化合物形成混合二硫化合物、與馬來酰亞胺反應，與碘乙酸或碘乙酰胺羧甲基化、在堿性ph值下與氰酸鹽甲氨?；?。在這方面，技術人員參考了《currentprotocolsinproteinscience》(eds.coliganetal.(johnwileyandsonsny1995-2000))中第15章所述的在蛋白質化學修飾相關的廣泛方法。簡言之，修飾蛋白質的精氨酰殘基等往往基于于鄰二羰基化合物(如苯甲酰甲醛、2，3-丁二酮以及1，2-烯巳二酮)的反應而形成加合物。另一個實施例是丙酮醛與精氨酸殘基的反應。半胱氨酸可在賴氨酸和組氨酸等親核位點不作隨同修飾的情況下就得到修飾。因此，有大量試劑可進行半胱氨酸的修飾。sigma-aldrich(http：//www.sigma-aldrich.com)等公司的網(wǎng)站含有具體試劑的信息。蛋白質中二硫鍵的選擇性還原也很普遍。二硫鍵可在生物制藥熱處理中形成和氧化。伍德沃德氏試劑k可用于修飾特定的谷氨酸殘基。n-(3-二甲氨基丙基)-n′-乙基-碳二亞胺可用于形成賴氨酸殘基和谷氨酸殘基的分子內交聯(lián)。例如：焦碳酸二乙酯是修飾蛋白質組氨酸殘基的試劑。組氨酸也可使用4-羥基-2-壬烯醛進行修飾。賴氨酸殘基與其他醹-氨基團的反應，例如，有利于肽結合到蛋白/肽的表面或交聯(lián)處。賴氨酸聚是多(乙烯)乙二醇的附著點，也是蛋白質糖基化的主要修飾位點。蛋白質的蛋氨酸殘基可透過碘乙酰胺、溴乙胺、氯胺t等被修飾。四硝基甲烷和n-乙?；溥蚩捎糜诶野彼釟埢男揎?。經(jīng)二酪氨酸形成的交聯(lián)可透過過氧化氫/銅離子完成。對色氨酸修飾的最近研究中使用了n-溴代琥珀酰亞胺、2-羥基-5-硝基芐溴或3-溴-3-甲基-2-(2-硝苯巰基)-3h-吲哚(bpns-糞臭素)。當?shù)鞍着c戊二醛、聚乙二醇二丙烯酸酯和甲醛的交聯(lián)用于配制水凝膠時，治療性蛋白和含聚乙二醇的肽的成功修飾往往可延長循環(huán)半衰期。針對免疫治療的變態(tài)反應原化學修飾往往透過氰酸鉀的氨基甲?；瘜崿F(xiàn)。一種肽或變體，其中肽被修飾或含非肽鍵，優(yōu)選為本發(fā)明的實施例。一般來說，肽和變體(至少含氨基酸殘基之間的肽聯(lián)接)可使用lukasetal.(solid-phasepeptidesynthesisundercontinuous-flowconditions.procnatlacadsciusa.may1981；78(5)：2791-2795)中以及該文列出的參考文獻所披露的固相肽合成fmoc-聚酰胺模式進行合成。芴甲氧羰基(fmoc)團對n-氨基提供臨時保護。使用n，n-二甲基甲酰胺中的20％二甲基呱啶中對這種堿高度敏感的保護基團進行重復分裂。由于它們的丁基醚(在絲氨酸蘇氨酸和酪氨酸的情況下)、丁基酯(在谷氨酸和天門冬氨酸的情況下)、叔丁氧羰基衍生物(在賴氨酸和組氨酸的情況下)、三苯甲基衍生物(在半胱氨酸的情況下)及4-甲氧基-2，3，6-三甲基苯磺?；苌?在精氨酸的情況下)，側鏈功能可能會受到保護。只要谷氨酰胺和天冬酰胺為c-末端殘基，側鏈氨基功能保護所使用的是由4，4′-二甲氧基二苯基團。固相支撐基于聚二甲基丙烯酰胺聚合物，其由三個單體二甲基丙烯酰胺(骨架單體)、雙丙烯酰乙烯二胺(交聯(lián)劑)和n-丙烯酰肌胺酸甲酯(功能劑)構成。使用的肽-樹脂聯(lián)劑為酸敏感的4-羥甲基苯氧乙酸衍生物。所有的氨基酸衍生物均作為其預制對稱酸酐衍生物加入，但是天冬酰胺和谷氨酰胺除外，它們使用被逆轉的n，n-二環(huán)己基碳二亞胺/1-羥基苯并三唑介導的耦合程序而加入。所有的耦合和脫保護反應用茚三酮、硝基苯磺酸或isotin測試程序監(jiān)測。合成完成后，用濃度為95％含50％清道夫混合物的三氟醋酸，從伴隨去除側鏈保護基團的樹脂支承物中裂解肽。常用的清道夫混合物包括乙二硫醇、苯酚、苯甲醚和水，準確的選擇依據(jù)合成肽的氨基酸組成。此外，固相和液相方法結合使用對肽進行合成是可能的(例如，請參閱bruckdorferetal.，2004以及本文引用的參考文獻)三氟乙酸用真空中蒸發(fā)、隨后用承載粗肽的二乙基乙醚滴定進行去除。用簡單萃取程序(水相凍干后，該程序制得不含清道夫混合物的肽)清除任何存在的清道夫混合物。肽合成試劑一般可從calbiochem-novabiochem(英國諾丁漢)獲得。純化可透過以下技術的任何一種或組合方法進行，如：再結晶法、體積排阻色譜法、離子交換色譜法、疏水作用色譜法以及(通常)反相高效液相色譜法(如使用乙腈/水梯度分離)?？梢允褂帽由V法、電泳特別是毛細管電泳、固相萃取(cspe)、反相高效液相色譜法、酸解后的氨基酸分析、快原子轟擊(fab)質譜分析以及maldi和esi-q-tof質譜分析進行肽分析。另一方面，本發(fā)明提出了一種編碼本發(fā)明中肽或肽變體的核酸(如多聚核苷酸)。多聚核苷酸可能為，例如，dna、cdna、pna、rna或其組合物，它們可為單鏈和/或雙鏈、或多聚核苷酸的原生或穩(wěn)定形式(如：具有硫代磷酸骨架的多聚核苷酸)，并且只要它編碼肽，就可能包含也可能不包含內含子。當然，多聚核苷酸只能編碼加入天然肽鍵并含有天然氨基酸殘基的肽。另一個方面，本發(fā)明提出了一種可根據(jù)本發(fā)明表達多肽的表達載體。對于連接多核苷酸，已經(jīng)開發(fā)出多種方法，尤其是針對dna，可透過向載體補充可連接性末端等方法進行連接。例如，可向dna片段加入補充性均聚物軌道，之后dna片段被插入到載體dna。然后，透過補充性均聚物尾巴的氫鍵結合，將載體和dna片段結合，從而形成重組dna分子。含有一個或多個酶切位點的合成接頭為dna片段與載體連接提供了另一種方法。含各種限制性核酸內切酶的合成接頭可透過多種管道購得，其中包括從國際生物技術公司(internationalbiotechnologiesinc，newhaven，cn，美國)購得。編碼本發(fā)明多肽的dna理想修飾方法是使用saiki等人所采用的聚合酶鏈反應方法。(diagnosisofsicklecellanemiaandbeta-thalassemiawithenzymaticallyamplifieddnaandnonradioactiveallele-specificoligonucleotideprobes.nengljmed.1988sep1；319(9)：537-41)。此方法可用于將dna引入合適的載體(例如，透過設計合適的酶切位點)，也可用于本領域已知的其他有用方法修飾dna。如果使用病毒載體，痘病毒載體或腺病毒載體為優(yōu)選。之后，dna(或在逆轉錄病毒載體情況下，rna)可能表達于合適的宿主，從而制成含本發(fā)明肽或變體的多肽。因此，可根據(jù)已知技術使用編碼本發(fā)明肽或變體的dna，用本文所述方法適當修飾后，構建表達載體，然后表達載體用于轉化合適宿主細胞，從而表達和產生本發(fā)明中的多肽。此類技術包括那些公開于，例如，美國專利4,440,859、4,530,901、4,582,800、4,677,063、4,678,751、4,704,362、4,710,463、4,757,006、4,766,075和4,810,648。編碼含本發(fā)明化合物多肽的dna(或在逆轉錄病毒載體情況下，rna)可能被加入到其他多種dna序列，從而引入到合適的宿主中。同伴dna將取決于宿主的性質、dna引入宿主的方式、以及是否需要保持為游離體還是要相互結合。一般來說，dna可以適當?shù)姆较蚝驼_的表達閱讀框架附著到一種表達載體(如質粒)中。如有必要，該dna可能與所需宿主所識別的相應轉錄和翻譯調節(jié)控制核苷酸序列連接，盡管表達載體中一般存在此類控制功能。然后，該載體透過標準方法被引入宿主。一般來說，并不是所有的宿主都會被載體轉化。因此，有必要選擇轉化過的宿主細胞。選擇方法包括用任何必要的控制元素向表達載體插入一個dna序列，該序列對轉化細胞中的可選擇性屬性(如抗生素耐藥性)進行編碼。另外，有這種選擇屬性的基因可在另外一個載體上，該載體用來協(xié)同轉化所需的宿主細胞。然后，本發(fā)明中的重組dna所轉化的宿主細胞在本文中所述本領域技術人員熟悉的合適條件下培養(yǎng)足夠長的時間，從而表達之后可回收的肽。有許多已知的表達系統(tǒng)，包括細菌(如大腸桿菌和枯草芽孢桿菌)、酵母(如酵母菌)、絲狀真菌(如曲霉菌)、植物細胞、動物細胞及昆蟲細胞。該系統(tǒng)可優(yōu)選為哺乳動物細胞，如來自atcc細胞生物學庫(cellbiologycollection)中的cho細胞。典型的哺乳動物細胞組成型表達載體質粒包括cmv或含一個合適的多聚a尾巴的sv40啟動子以及抗性標志物(如新霉素)。一個實例為從pharmacia公司(piscataway，新澤西，美國)獲得的psvl。一種可誘導型哺乳動物表達載體的例子是pmsg，也可以從pharmacia公司獲得。有用的酵母質粒載體是prs403-406和prs413-416，一般可從stratagenecloningsystems公司(lajolla，ca92037，美國)獲得。質粒prs403、prs404、prs405和prs406是酵母整合型質粒(ylp)，并插入了酵母可選擇性標記物his3、trp1、leu2和ura3。prs413-416質粒為酵母著絲粒質粒(ycp)。基于cmv啟動子的載體(如，來自于sigma-aldrich公司)提供了瞬時或穩(wěn)定的表達、胞漿表達或分泌，以及flag、3xflag、c-myc或matn不同組合物中的n-端或c-端標記。這些融合蛋白可用于檢測、純化及分析重組蛋白。雙標融合為檢測提供了靈活性。強勁的人巨細胞病毒(cmv)啟動子調控區(qū)使得cos細胞中的組成蛋白表達水平高達1mg/l。對于較弱的細胞株，蛋白水平一般低于0.1mg/l。sv40復制原點的出現(xiàn)將導致dna在sv40復制容納性cos細胞中高水平復制。例如，cmv載體可包含細菌細胞中的pmb1(pbr322的衍生物)復制原點、細菌中進行氨芐青霉素抗性選育的鈣-內酰胺酶基因、hghpolya和f1的原點。含前胰島素原引導(ppt)序列的載體可使用抗flag抗體、樹脂和板引導flag融合蛋白分泌到進行純化的培養(yǎng)基中。其他與各種宿主細胞一起應用的載體和表達系統(tǒng)是本領域熟知眾所周知的。在另一個實施方案中，對本發(fā)明的兩個或更多的肽或肽變體進行編碼，因此，以一個連續(xù)順序(類似于″一串珠子″的構建體)表達。在達到目標，所述肽或肽變體可能透過連接符氨基酸的延伸處(例如llllll)連接或融合一起，也可能它們之間沒有任何附加的肽而被連接。這些構建體也可用于癌癥治療，可誘導涉及mhci和mhcii類分子的免疫應答。本發(fā)明還涉及一種宿主細胞，其以本發(fā)明的多核苷酸載體構建轉化而來。宿主細胞可為原核細胞，也可為真核細胞。在有些情況下，細菌細胞為優(yōu)選原核宿主細胞，典型為大腸桿菌株，例如，大腸桿菌菌株dh5(從bethesdaresearchlaboratories公司(bethesda，md，美國)獲得)和rr1(從美國菌種保藏中心(atcc，rockville，md，美國)，atcc編號31343獲得)。首選的真核宿主細胞包括酵母、昆蟲和哺乳動物細胞，優(yōu)選為脊椎動物細胞，如：小鼠、大鼠、猴子或人成纖維細胞和結腸癌細胞株中的細胞。酵母宿主細胞包括yph499、yph500和yph501，一般可從stratagenecloningsystems公司(lajolla，ca92037，美國)獲得。首選哺乳動物宿主細胞包括中國倉鼠卵巢(cho)細胞為atcc中的ccl61細胞、nih瑞士小鼠胚胎細胞nih/3t3為atcc中的crl1658細胞、猴腎源性cos-1細胞為atcc中的crl1650細胞以及人胚胎腎細胞的293號細胞。首選昆蟲細胞為sf9細胞，可用桿狀病毒表達載體轉染。有關針對表達選擇合適宿主細胞的概要，可從教科書(paulinabalbásandargelialorence《methodsinmolecularbiologyrecombinantgeneexpression，reviewsandprotocols》》partone，secondedition，isbn978-1-58829-262-9)和本領域技術人員知道的其他文獻中查到。含本發(fā)明dna結構的適當宿主細胞的轉化可使用大家熟知的方法完成，通常取決于使用載體的類型。對于原核宿主細胞的轉化，可參閱，如：cohen等人(1972)在proc.natl.acad.sci.usa1972，69，2110中以及sambrook等人(1989)所著《molecularcloning，alaboratorymanual》coldspringharborlaboratory，coldspringharbor，ny中使用的方法。酵母細胞的轉化在sherman等人(1986)在methodsinyeastgenetics，alaboratorymanual，coldspringharbor，ny中有描述。beggs(1978)nature275，104-109中所述方法也很有用。對于脊椎動物細胞，轉染這些細胞的試劑等，例如，磷酸鈣和deae-葡聚糖或脂質體配方，可從stratagenecloningsystems公司或lifetechnologies公司(gaithersburg，md20877，美國)獲得。電穿孔也可用于轉化和/或轉染細胞，是本領域用于轉化酵母細胞、細菌細胞、昆蟲細胞和脊椎動物細胞大家熟知的方法。被成功轉化的細胞(即含本發(fā)明dna結構的細胞)可用大家熟知的方法(如pcr)進行識別。另外，上清液存在的蛋白可使用抗體進行檢測。應了解，本發(fā)明中的某些宿主細胞用于制備本發(fā)明中的肽，例如細菌細胞、酵母細胞和昆蟲細胞。但是，其他宿主細胞可能對某些治療方法有用。例如，抗原提呈細胞(如樹突狀細胞)可用于表達本發(fā)明中的肽，使它們可以加加載相應的mhc分子中。因此，本發(fā)明提出了含本發(fā)明中核酸或表達載體的一種宿主細胞。在一個優(yōu)選實施方案中，宿主細胞為抗原提呈細胞，尤其是樹突狀細胞或抗原提呈細胞。2010年4月29日，美國食品和藥物管理局(fda)批準載有含前列腺酸性磷酸酶(pap)的重組融合蛋白可用于治療無癥狀或癥狀輕微的轉移性hrpc(sipuleucel-t)(smallej，etal.placebo-controlledphaseiiitrialofimmunologictherapywithsipuleucel-t(apc8015)inpatientswithmetastatic，asymptomatichormonerefractoryprostatecancer.jclinoncol.2006jul1；24(19)：3089-94.rinietal.combinationimmunotherapywithprostaticacidphosphatasepulsedantigen-presentingcells(provenge)plusbevacizumabinpatientswithserologicprogressionofprostatecancerafterdefinitivelocaltherapy.cancer.2006jul1；107(1)：67-74)。另一方面，本發(fā)明提出了一種配制一種肽及其變體的方法，該方法包括培養(yǎng)宿主細胞和從宿主細胞或其培養(yǎng)基中分離肽。在另一個實施方案中，本發(fā)明中的肽、核酸或表達載體用于藥物中。例如，肽或其變體可制備為靜脈(i.v.)注射劑、皮下(s.c.)注射劑、皮內(i.d.)注射劑、腹膜內(i.p.)注射劑、肌肉(i.m.)注射劑。肽注射的優(yōu)選方法包括s.c.、i.d.、i.p.、i.m.和i.v.注射。dna注射的優(yōu)選方法為i.d.、i.m.、s.c.、i.p.和i.v.注射。例如，給予50μg至1.5mg，優(yōu)選為125μg至500μg的肽或dna，這取決于具體的肽或dna。上述劑量范圍在以前的試驗中成功使用(walteretalnaturemedicine18，1254-1261(2012))。本發(fā)明的另一方面包括一種體外制備啟動的t細胞的方法，該方法包括將t細胞與載有抗原的人mhc分子進行體外連接，這些分子在合適的抗原提呈細胞表面表達足夠的一段時間從而以抗原特異性方式啟動t細胞，其中所述抗原為根據(jù)本發(fā)明所述的一種肽。優(yōu)選情況是足夠量的抗原與抗原提呈細胞一同使用。優(yōu)選情況是，哺乳動物細胞的tap肽轉運載體缺乏或水平下降或功能降低。缺乏tap肽轉運載體的適合細胞包括t2、rma-s和果蠅細胞。tap是與抗原加工相關的轉運載體。人體肽載入的缺陷細胞株t2從屬美國菌種保藏中心(atcc，12301parklawndrive，rockville，maryland20852，美國)目錄號crl1992；果蠅細胞株schneider2號株從屬atcc目錄crl19863；小鼠rma-s細胞株karre等人描述過。(ljunggren，h.-g.，andk.karre.1985.j.exp.med.162：1745)。優(yōu)選情況是，宿主細胞在轉染前基本上不表達mhci類分子。刺激因子細胞還優(yōu)選為表達對t細胞共刺激信號起到重要作用的分子，如，b7.1、b7.2、icam-1和lfa3中的任一種分子。大量mhci類分子和共刺激分子的核酸序列可從genbank和embl數(shù)據(jù)庫中公開獲得。當mhci類表位用作一種抗原時，t細胞為cd8陽性t細胞。如果抗原提呈細胞受到轉染而表達這種表位，則優(yōu)選的細胞包括一個表達載體，該載體有能力表達含seqidno：1至seqidno：300的肽或變體氨基酸序列?？墒褂闷渌恍┓椒▉眢w外生成t細胞。例如，自體腫瘤浸潤性淋巴細胞可用于生成ctl。plebanski等人(inductionofpeptide-specificprimarycytotoxictlymphocyteresponsesfromhumanperipheralblood.eurjimmunol.1995jun；25(6)：1783-7)使用自體外周血淋巴細胞(plb)制備t細胞。另外，也可能用肽或多肽脈沖處理樹突狀細胞或透過與重組病毒感染而制成自體t細胞。此外，b細胞可用于制備自體t細胞。此外，用肽或多肽脈沖處理或用重組病毒感染的巨噬細胞可用于配制自體t細胞。walter等人在2003(cuttingedge：predeterminedavidityofhumancd8t-cellsexpandedoncalibratedmhc/anti-cd28-coatedmicrospheres.jimmunol.2003nov15；171(10)：4974-8)中描述了透過使用人工抗原提呈細胞(aapc)體外啟動t細胞，這也是生成作用于所選肽的t細胞的一種合適方法。在本發(fā)明中，根據(jù)生物素：鏈霉素生物化學方法透過將預制的mhc：肽復合體耦合到聚苯乙烯顆粒(微球)而生成aapc。該系統(tǒng)實現(xiàn)了對aapc上的mhc密度進行精確調節(jié)，這使得可以在血液樣本中選擇地引發(fā)高或低親合力的高效抗原特異性t細胞反應。除了mhc：肽復合體外，aapc還應攜運含共刺激活性的其他蛋白，如耦合至表面的抗-cd28抗體。此外，此類基于aapc的系統(tǒng)往往需要加入適當?shù)目扇苄砸蜃樱?，諸如白細胞介素-12的細胞因子。也可用同種異體細胞制得t細胞，在wo97/26328中詳細描述了一種方法，以參考文獻方式并入本文。例如，除了果蠅細胞和t2細胞，也可用其他細胞來提呈肽，如cho細胞、桿狀病毒感染的昆蟲細胞、細菌、酵母、牛痘感染的靶細胞。另外，可使用植物病毒(例如，參閱portaetal.developmentofcowpeamosaicvirusasahigh-yieldingsystemforthepresentationofforeignpeptides.virology.1994aug1；202(2)：949-55)，其中描述了將豇豆花葉病毒開發(fā)為一種提呈外來肽的高產系統(tǒng)。被啟動的t細胞直接針對本發(fā)明中的肽，有助于治療。因此，本發(fā)明的另一方面提出了用本發(fā)明前述方法制得的啟動t細胞。按上述方法制成的啟動t細胞將會有選擇性地識別異常表達含seqidno：1至seqidno300氨基酸序列的多肽。優(yōu)選情況是，t細胞透過與其含hla/肽復合體的tcr相互作用(如，結合)而識別該細胞。t細胞是殺傷患者靶細胞方法中有用的細胞，其靶細胞異常表達含本發(fā)明中氨基酸序列的多肽。此類患者給予有效量的啟動t細胞。給予患者的t細胞可能源自該患者，并按上述方法啟動(即，它們?yōu)樽泽wt細胞)?；蛘撸瑃細胞不是源自該患者，而是來自另一個人。當然，優(yōu)選情況是該供體為健康人。發(fā)明人使用″健康個人″系指一個人一般狀況良好，優(yōu)選為免疫系統(tǒng)合格，更優(yōu)選為無任何可很容易測試或檢測到的疾病。根據(jù)本發(fā)明，cd8-陽性t細胞的體內靶細胞可為腫瘤細胞(有時表達mhc-ii類抗原)和/或腫瘤周圍的基質細胞(腫瘤細胞)(有時也表達mhc-ii類抗原；(dengjeletal.，2006))。本發(fā)明所述的t細胞可用作治療性組合物中的活性成分。因此，本發(fā)明也提出了一種殺傷患者靶細胞的方法，其中患者的靶細胞異常表達含本發(fā)明中氨基酸序列的多肽，該方法包括給予患者上述有效量的t細胞。發(fā)明人所用的″異常表達″的意思還包括，與正常表達水平相比，多肽過度表達，或該基因在源自腫瘤的組織中未表達，但是在該腫瘤中卻表達?！暹^度表達″系指多肽水平至少為正常組織中的1.2倍；優(yōu)選為至少為正常組織中的2倍，更優(yōu)選為至少5或10倍。t細胞可用本領域已知的方法制得(如，上述方法)。t細胞繼轉移方案為本領域所熟知的方案。綜述可發(fā)現(xiàn)于：gattinonil，etal.adoptiveimmunotherapyforcancer：buildingonsuccess.natrevimmunol.2006may；6(5)：383-93.review.以及morganra，etal.cancerregressioninpatientsaftertransferofgeneticallyengineeredlymphocytes.science.2006oct6；314(5796)：126-9)。本發(fā)明的任一分子(即肽、核酸、抗體、表達載體、細胞，啟動t細胞、t細胞受體或編碼核酸)都有益于治療疾病，其特點在于細胞逃避免疫反應的打擊。因此，本發(fā)明的任一分子都可用作藥劑或用于制造藥劑。這種分子可單獨使用也可與本發(fā)明中的其他分子或已知分子聯(lián)合使用。本發(fā)明中所述的藥劑優(yōu)選為一種疫苗。該疫苗可直接給到患者的受影響器官，也可i.d.、i.m.、s.c.、i.p.和i.v.注射方式全身給藥，或體外應用到來自患者或其細胞株的細胞(隨后再將這些細胞注入到患者中)，或體外用于從來自患者的免疫細胞的一個細胞亞群(然后再將細胞重新給予患者)。如果核酸體外注入細胞，可能有益于細胞轉染，以共同表達免疫刺激細胞因子(如白細胞介素-2)。肽可完全單獨給藥，也可與免疫刺激佐劑相結合(見下文)、或與免疫刺激細胞因子聯(lián)合使用、或以適當?shù)妮斔拖到y(tǒng)給藥(例如脂質體)。該肽也可共軛形成一種合適的載體(如鑰孔蟲戚血藍蛋白(klh)或甘露)到合適的載體(例如，參見wo95/18145)。肽也可能被標記，可能是融合蛋白，或可能是雜交分子。在本發(fā)明中給出序列的肽預計能刺激cd4或cd8t細胞。然而，在有cd4t-輔助細胞的幫助時，cd8t細胞刺激更加有效。因此，對于刺激cd8t細胞的mhc-i類表位，一種雜合分子的融合伙伴或片段提供了刺激cd4陽性t細胞的適當表位。cd4-和cd8刺激表位為本領域所熟知、并包括本發(fā)明中確定的表位。一方面，疫苗包括至少含有seqidno：1至seqidno：300中提出的一種肽以及至少另外一種肽，優(yōu)選為2至50個、更優(yōu)選為2至25個、再優(yōu)選為2至20個、最優(yōu)選為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18個肽。肽可能從一個或多個特定taa中衍生，并且可能與mhci類分子結合。另一方面，疫苗包括至少含有seqidno：1至seqidno：300中提出的一種肽以及至少另外一種肽，優(yōu)選為2至50個、更優(yōu)選為2至25個、再優(yōu)選為2至20個、最優(yōu)選為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18個肽。肽可能從一個或多個特定taa中衍生，并且可能與mhci類分子結合。多聚核苷酸可為基本純化形式，也可包被于載體或輸送系統(tǒng)。核酸可能為dna、cdna、pna、rna，也可能為其組合物。這種核酸的設計和引入方法為本領域所熟知。例如，下列文獻中有其概述：(pascoloetal.，humanperipheralbloodmononuclearcellstransfectedwithmessengerrnastimulateantigen-specificcytotoxict-lymphocytesinvitro.cellmollifesci.2005aug；62(15)：1755-62)。多核苷酸疫苗很容易制備，但這些載體誘導免疫反應的作用模式尚未完全了解。合適的載體和輸送系統(tǒng)包括病毒dna和/或rna，如基于腺病毒、牛痘病毒、逆轉錄病毒、皰疹病毒、腺相關病毒或含一種以上病毒元素的混合病毒的系統(tǒng)。非病毒輸送系統(tǒng)包括陽離子脂質體和陽離子聚合物，是dna輸送所屬領域內熟知的系統(tǒng)。也可使用物理輸送系統(tǒng)，如透過「基因槍」。肽或核酸編碼的肽可以是一種融合蛋白，例如，含刺激t細胞進行上述cdr的表位。本發(fā)明的藥劑也可能包括一種或多種佐劑。佐劑是那些非特異性地增強或加強免疫反應的物質(例如，透過cd8-陽性t細胞和輔助t(th)細胞介導的對一種抗原的免疫應答，因此被視為對本發(fā)明的藥劑有用。適合的佐劑包括(但不僅限于)1018iss、鋁鹽、as15、bcg、cp-870，893、cpg7909、cyaa、dslim、鞭毛蛋白或鞭毛蛋白衍生的tlr5配體、flt3配體、gm-csf、ic30、ic31、咪喹莫特、resiquimod、imufactimp321、白細胞介素il-2、il-13、il-21、干擾素α或β，或其聚乙二醇衍生物、ispatch、iss、iscomatrix、iscoms、lipovac、malp2、mf59、單磷酰脂a、montanideims1312、montanideisa206、montanideisa50v、montanideisa-51、水包油和油包水乳狀液、ok-432、om-174、om-197-mp-ec、ontak、ospa、載體系統(tǒng)、基于聚丙交酯復合乙交酯[plg]和右旋糖苷微粒、重組人乳鐵傳遞蛋白srl172、病毒顆粒和其他病毒樣顆粒、yf-17d、vegftrap、r848、β-葡聚糖、pam3cys、源自皂角苷、分支桿菌提取物和細菌細胞壁合成模擬物的aquila公司的qs21刺激子，以及其他專有佐劑，如：ribi′sdetox、quil或superfos。優(yōu)選佐劑如：弗氏佐劑或gm-csf。前人對一些樹突狀細胞特異性免疫佐劑(如mf59)及其制備方法進行了描述(allisonandkrummel，1995theyinandyangoftcellcostimulation.science.1995nov10；270(5238)：932-3)。也可能使用細胞因子。一些細胞因子直接影響樹突狀細胞向淋巴組織遷移(如，tnf-)，加速樹突狀細胞成熟為t淋巴細胞的有效抗原提呈細胞(如，gm-csf、il-1和il-4)(美國5849589號專利，特別以其完整引用形式并入本文)，并充當免疫佐劑(如il-12、il-15、il-23、il-7、ifn-α、ifn-β)(gabrilovich，1996productionofvascularendothelialgrowthfactorbyhumantumorsinhibitsthefunctionalmaturationofdendriticcellsnatmed.1996oct；2(10)：1096-103)。據(jù)報告，cpg免疫刺激寡核苷酸可提高佐劑在疫苗中的作用。如果沒有理論的約束，cpg寡核苷酸可透過toll樣受體(tlr)(主要為tlr9)啟動先天(非適應性)免疫系統(tǒng)從而起作用。cpg引發(fā)的tlr9活化作用提高了對各種抗原的抗原特異性體液和細胞反應，這些抗原包括肽或蛋白抗原、活病毒或被殺死的病毒、樹突狀細胞疫苗、自體細胞疫苗以及預防性和治療性疫苗中的多糖結合物。更重要的是，它會增強樹突狀細胞的成熟和分化，導致th1細胞的活化增強以及細胞毒性t淋巴細胞(ctl)生成加強，甚至cd4t細胞說明的缺失。甚至有疫苗佐劑的存在也能維持tlr9活化作用誘發(fā)的th1偏移，這些佐劑如：正常促進th2偏移的明礬或弗氏不完全佐劑(ifa)。cpg寡核苷酸與以下其他佐劑或配方一起制備或聯(lián)合給藥時，表現(xiàn)出更強的佐劑活性，如微粒、納米粒子、脂肪乳或類似制劑，當抗原相對較弱時，這些對誘發(fā)強反應尤為必要。它們還能加速免疫反應，使抗原劑量減少約兩個數(shù)量級，在有些實驗中，對不合cpg的全劑量疫苗也能產生類似的抗體反應(krieg，2006)。美國6406705b1號專利對cpg寡核苷酸、非核酸佐劑和抗原結合使用促使抗原特異性免疫反應進行了描述。一種cpgtlr9拮抗劑為mologen公司(德國柏林)的dslim(雙干環(huán)免疫調節(jié)劑)，這是本發(fā)明藥物組合物的優(yōu)選成分。也可使用其他如tlr結合分子，如：rna結合tlr7、tlr8和/或tlr9。其他有用的佐劑例子包括(但不限于)化學修飾性cpg(如cpr、idera)、dsrna模擬物，如，poly(i：c)及其衍生物(如：ampligen、hiltonol、多聚-(iclc)、多聚(ic-r)、多聚(i：c12u))、非cpg細菌性dna或rna以及免疫活性小分子和抗體，如：環(huán)磷酰胺、舒尼替單抗、西樂葆、ncx-4016、西地那非、他達拉非、伐地那非、索拉非尼、替莫唑胺、temsirolimus、xl-999、cp-547632、帕唑帕尼、vegftrap、zd2171、azd2171、抗-ctla4、免疫系統(tǒng)的其他抗體靶向性主要結構(如：抗-cd40、抗-tgfβ、抗-tnfα受體)和sc58175，這些藥物都可能有治療作用和/或充當佐劑。技術人員無需過度進行不當實驗就很容易確定本發(fā)明中有用的佐劑和添加劑的數(shù)量和濃度。首選佐劑是抗-cd40、咪喹莫特、瑞喹莫德、gm-csf、環(huán)磷酰胺、舒尼替尼、貝伐單抗、干擾素α、cpg寡核苷酸及衍生物、多聚(i：c)及衍生物、rna、西地那非和plg或病毒顆粒的微粒制劑。本發(fā)明藥物組合物的一個優(yōu)選實施方案中，佐劑從含集落刺激因子制劑中選擇，如粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(gm-csf，沙格司亭)、環(huán)磷酰胺、咪喹莫特、resiquimod和干擾素-α。本發(fā)明藥物組合物的一個優(yōu)選實施方案中，佐劑從含集落刺激因子制劑中選擇，如粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(gm-csf，沙格司亭)、環(huán)磷酰胺、咪喹莫特和resimiquimod。在本發(fā)明藥物組合物的一個優(yōu)選實施方案中，佐劑為環(huán)磷酰胺、咪喹莫特或resiquimod。更優(yōu)選的佐劑是montanideims1312、montanideisa206、montanideisa50v、montanideisa-51、聚-iclc和抗cd40mab或其組合物。此組合藥物為非腸道注射使用，如皮下、皮內、肌肉注射，也可口服。為此，肽和其他選擇性分子在藥用載體中分解或懸浮，優(yōu)選為水載體。此外，組合物可包含輔料，如：緩沖劑、結合劑、沖擊劑、稀釋劑、香料、潤滑劑等。這些肽也可與免疫刺激物質合用，如：細胞因子。可用于此類組合物的更多輔料可在從a.kibbe所著的handbookofpharmaceuticalexcipients(第3版，2000年，美國醫(yī)藥協(xié)會和制藥出版社)等書中獲知。此組合藥物可用于阻止、預防和/或治療腺瘤或癌性疾病。例如，ep2112253中有示例制劑。本發(fā)明提出了一種藥劑，其用于治療癌癥，特別是hcc和其他惡性腫瘤。本發(fā)明還涉及一種套件，其包括：(a)一個容器，包含上述溶液或凍干粉形式的藥物組合物；(b)可選的第二個容器，其含有凍干粉劑型的稀釋劑或重組溶液；和(c)可選的(i)溶液使用或(ii)重組和/或凍干制劑使用的說明。該套件還步包括一個或多個(iii)緩沖劑，(iv)稀釋劑，(v)過濾液，(vi)針，或(v)注射器。容器最好是瓶子、西林瓶、注射器或試管，可以為多用途容器。藥物組合物最好是凍干的。本發(fā)明中的套件優(yōu)選包含一種置于合適容器中的凍干制劑以及重組和/或使用說明。適當?shù)娜萜靼?，例如瓶子、西林?如雙室瓶)、注射器(如雙室注射器)和試管。該容器可能由多種材料制成，如玻璃或塑料。試劑盒和/或容器最好有容器或關于容器的說明書，指明重組和/或使用的說明。例如，標簽可能表明凍干劑型將重組為上述肽濃度。該標簽可進一步表明制劑用于皮下注射。存放制劑的容器可使用多用途西林瓶，使得可重復給予(例如，2-6次)重組劑型。該套件可進一步包括裝有合適稀釋劑(如碳酸氫鈉溶液)的第二個容器。稀釋液和凍干制劑混合后，重組制劑中的肽終濃度優(yōu)選為至少0.15mg/ml/肽(＝75μg)，不超過3mg/ml/肽(＝1500μg)。該套件還可包括商業(yè)和用戶角度來說可取的其他材料，包括其他緩沖劑、稀釋劑，過濾液、針頭、注射器和帶有使用說明書的包裝插頁。本發(fā)明中的套件可能有一個單獨的容器，其中包含本發(fā)明所述的藥物組合物制劑，該制劑可有其他成分(例如，其他化合物或及其藥物組合物)，也可無其他成分，或者每種成分都有其不同容器。優(yōu)選情況是，本發(fā)明的套件包括與本發(fā)明的一種制劑，包裝后與第二種化合物(如佐劑(例如gm-csf)、化療藥物、天然產品、激素或拮抗劑、抗血管生成劑或抑制劑、凋亡誘導劑或螯合劑)或其藥物組合物聯(lián)合使用。該套件的成分可進行預絡合或每種成分在給予患者之前可放置于單獨的不同容器。該套件的成分可以是一種或多種溶液，優(yōu)選為水溶液，更優(yōu)選為無菌水溶液。該套件的成分也可為固體形式，加入合適的溶劑后轉換為液體，最好放置于另一個不同的容器中。治療套件的容器可能為西林瓶、試管、燒瓶、瓶子、注射器、或任何其他盛裝固體或液體的工具。通常，當成分不只一種時，套件將包含第二個西林瓶或其他容器，使之可以單獨定量。該套件還可能包含另一個裝載藥用液體的容器。優(yōu)選情況是，治療套件將包含一個裝置(如，一個或多個針頭、注射器、滴眼器、吸液管等)，使得可注射本發(fā)明的藥物(本套件的組合物)。本發(fā)明的藥物配方適合以任何可接受的途徑進行肽給藥，如口服(腸道)、鼻內、眼內、皮下、皮內、肌內，靜脈或經(jīng)皮給藥。優(yōu)選為皮下給藥，最優(yōu)選為皮內給藥，也可透過輸液泵給藥。由于本發(fā)明的肽從hcc中分離而得，因此，本發(fā)明的藥劑優(yōu)選用于治療hcc。本發(fā)明進一步包括為個體患者制備個體化藥物的一種方法，其中包括：制造含選自預篩選tumap存儲庫至少一種肽的藥物組合物，其中藥物組合物中所用的至少一種肽選擇為適合于個體患者。在一項實施方案中，藥物組合物為一種疫苗。該方法也可以改動以產生下游應用的t細胞克隆物，如：tcr隔離物或可溶性抗體和其他治療選擇。「個體化藥物」系指專門針對個體患者的治療，將僅用于該等個體患者，包括個體化活性癌癥疫苗以及使用自體組織的過繼細胞療法。如本文所述，″存儲庫″應指已經(jīng)接受免疫原性預篩查和/或在特定腫瘤類型中過量提呈的一組肽?！宕鎯臁逡辉~并不暗示，疫苗中包括的特定肽已預先制造并儲存于物理設備中，雖然預期有這種可能性。明確預期所述肽可以用于新制造每種個體化疫苗，也可能被預先制造和儲存。存儲庫(例如，數(shù)據(jù)庫形式)由腫瘤相關肽組成，其在各種hla-ahla-b和hla-c等位基因hcc患者的腫瘤組織中高度過度表達。其可能含有包括mhci類和mhcii類肽或拉長的mhci類肽。除了從幾種hcc組織中采集的腫瘤相關肽外，存儲庫還可能包含hla-a＊02和hla-a＊24標記肽。這些肽可對tumap誘導的t細胞免疫進行量化比較，從而可得出疫苗抗腫瘤反應能力的重要結論。其次，在沒有觀察到來自患者″自身″抗原tumap的任何疫苗誘導的t細胞反應時，它們可作為來自″f″非自身″抗原的重要陽性對照肽。第三，它還可對患者的免疫功能狀態(tài)得出結論。存儲庫的tumap透過使用一種功能基因組學方法進行鑒定，該方法結合了基因表達分析、質譜法和t細胞免疫學該方法確保了只選擇真實存在于高百分比腫瘤但在正常組織中不表達或僅很少量表達的tumap用于進一步分析。對于初始肽的選擇，患者的hcc樣本和健康供體的血液以循序漸進的方法進行分析：1.惡性材料的hla配體用質譜法確定2.使用全基因組信使核糖核酸(mrna)表達分析法用于確定惡性腫瘤組織(hcc)與一系列正常器官和組織相比過度表達的基因。3.確定的hla配體與基因表達數(shù)據(jù)進行比較。腫瘤組織上過度提呈或選擇性提呈的肽，優(yōu)選為第2步中檢測到的選擇性表達或過度表達基因所編碼的考慮為多肽疫苗的合適候選tumap。4.文獻檢索以確定更多證據(jù)以支持確認為tump的肽的相關性5.過度表達在mrna水平的相關性由腫瘤組織第3步選定的tumap重新檢測而確定，并且在健康組織上缺乏(或不經(jīng)常)檢測。6.為了評估透過選定的肽誘導體內t細胞反應是否可行，使用健康供體以及hcc患者的人t細胞進行體外免疫原性測定。重要的是要認識到，透過本發(fā)明的疫苗引發(fā)的免疫應答在不同的細胞階段和開發(fā)的不同階段攻擊癌癥。而且不同的癌癥相關信號通路被攻擊。這相對于其他疫苗的優(yōu)勢，這些疫苗只針對一個或幾個靶標，這可能會導致腫瘤很容易適應于攻擊(腫瘤逃逸)。此外，并非所有的個體腫瘤都表達相同模式的抗原。因此，幾個腫瘤相關肽的組合確保了每個腫瘤都承擔至少一些靶標。該組合物以這樣特別的方式設計，預期每個hla-a＊02和/或hla-a＊24陽性腫瘤可表達幾種抗原并覆蓋腫瘤生長和維持所需要的幾種獨立的途徑。對于特定于兩個hlai類等位基因(a＊02和a＊24)的每個肽子集，基于基礎的實驗分析這得到獨立的確保。因此，疫苗可易于「現(xiàn)成的」用于較大患者群體。這意味著，預選擇接受疫苗治療的患者可限制為hla分型，無需抗原表達的任何額外的生物標志物評估，但仍然確保多個靶標同時被誘導的免疫應答攻擊，這對于療效很重要(banchereauetal.，2001；walteretal.，2012)。一方面，在將所述肽加入存儲庫之前，對其進行篩查以了解免疫原性。舉例來說(但不限于此)，納入存儲庫的肽的免疫原性的確定方法包括體外t細胞啟動，具體為：用裝載肽/mhc復合體和抗cd28抗體的人工抗原提呈細胞反復刺激來自健康供體的cd8+t細胞。這種方法優(yōu)選用于罕見癌癥以及有罕見表達譜的患者。與含目前開發(fā)為固定組分的多肽混合物相反的是，存儲庫可將腫瘤中抗原的實際表達于疫苗進行更高程度的匹配。在多目標方法中，每名患者將使用幾種現(xiàn)成攝肽的選定單一肽或組合。理論上來說，基于從50抗原肽庫中選擇例如5種不同抗原肽的一種方法可提供大約170萬種可能的藥物產品(dp)組分。在一方面，選擇所述肽用于疫苗，其基于個體患者的適合性，并使用本發(fā)明此處或后文所述的方法。hla表型、轉錄和肽組學資料從患者的腫瘤材料和血液樣本中收集，以確定最合適每名患者且含有″存儲庫″和患者獨特(即突變)tumap的肽。將選擇的那些肽選擇性地或過度表達于患者腫瘤中，并且可能的情況下，如果用患者個體pbmc進行檢測，則表現(xiàn)出很強的體外免疫原性。優(yōu)選的情況是，疫苗所包括的肽的一種確定方法包括：(a)識別由來自個體患者腫瘤樣本提呈的腫瘤相關肽(tumap)；(b)將(a)中鑒定的肽與上述肽的存儲庫(數(shù)據(jù)庫)進行比對；且(c)從與患者中確定的腫瘤相關肽相關的存儲庫(數(shù)據(jù)庫)中選擇至少一種肽。例如，腫瘤樣本提呈的tumap的鑒定方法有：(a1)將來自腫瘤樣本的表達數(shù)據(jù)與所述腫瘤樣本組織類型相對應的正常組織樣本的表達數(shù)據(jù)相比對，以識別腫瘤組織中過度表達或異常表達的蛋白；以及(a2)將表達數(shù)據(jù)與結合到腫瘤樣本中i類mhc和/或ii類分子的mhc配體序列想關聯(lián)，以確定來源于腫瘤過度表達或異常表達的蛋白質的mhc配體。優(yōu)選情況是，mhc配體的序列的確定方法是：洗脫來自腫瘤樣本分離的mhc分子結合肽，并測序洗脫配體。優(yōu)選情況是，腫瘤樣本和正常組織從同一患者獲得。除了使用存儲庫(數(shù)據(jù)庫)模型選擇肽以外，或作為一種替代方法，tumap可能在新患者中進行重新鑒定，然后列入疫苗中。作為一種實施例，患者中的候選tumap可透過以下方法進行鑒定：(a1)將來自腫瘤樣本的表達數(shù)據(jù)與所述腫瘤樣本組織類型相對應的正常組織樣本的表達數(shù)據(jù)相比對，以識別腫瘤組織中過度表達或異常表達的蛋白；以及(a2)將表達數(shù)據(jù)與結合到腫瘤樣本中i類mhc和/或ii類分子的mhc配體序列相關聯(lián)，以確定來源于腫瘤過度表達或異常表達的蛋白質的mhc配體。作為另一實施例，蛋白的鑒定方法為可包含突變，其對于腫瘤樣本相對于個體患者的相應正常組織是獨特的，并且tumap可透過特異性靶向作用于變異來鑒定。例如，腫瘤以及相應正常組織的基因組可透過全基因組測序方法進行測序：為了發(fā)現(xiàn)基因蛋白質編碼區(qū)域的非同義突變，從腫瘤組織中萃取基因組dna和rna，從外周血單核細胞(pbmc)中提取正常非突變基因組種系dna。運用的ngs方法只限于蛋白編碼區(qū)的重測序(外顯子組重測序)。為了這一目的，使用供貨商提供的靶序列富集試劑盒來捕獲來自人樣本的外顯子dna，隨后使用hiseq2000(illumina公司)進行測序。此外，對腫瘤的mrna進行測序，以直接定量基因表達，并確認突變基因在患者腫瘤中表達。得到的數(shù)以百萬計的序列讀數(shù)透過軟件算法處理。輸出列表中包含突變和基因表達。腫瘤特異性體突變透過與pbmc衍生的種系變化比較來確定，并進行優(yōu)化。然后，為了存儲庫可能測試新確定的肽了解如上所述的免疫原性，并且選擇具有合適免疫原性的候選tumap用于疫苗。在一個示范實施方案中，疫苗中所含肽透過以下方法確定：(a)用上述方法識別由來自個體患者腫瘤樣本提呈的腫瘤相關肽(tumap)；(b)將(a)中鑒定的肽與進行腫瘤(與相應的正常組織相比)免疫原性和過量提呈預篩查肽的存儲庫進行比對；(c)從與患者中確定的腫瘤相關肽相關的存儲庫中選擇至少一種肽；及(d)可選地在(a)中選擇至少一種新確定的肽，確認其免疫原性。在一個示范實施方案中，疫苗中所含肽透過以下方法確定：(a)識別由來自個體患者腫瘤樣本提呈的腫瘤相關肽(tumap)；以及(b)在(a)中選擇至少一種新確定的肽，并確認其免疫原性。一旦選定了用于個體化肽疫苗的肽時，則產生疫苗。該疫苗優(yōu)選為一種液體制劑，包括溶解于33％dmso中的個體肽。列入產品的每種肽都溶于dmso中。單個肽溶液濃度的選擇取決于要列入產品中的肽的數(shù)量。單肽-dmso溶液均等混合，以實現(xiàn)一種溶液中包含所有的肽，且濃度為每肽～2.5mg/ml。然后該混合溶液按照1∶3比例用注射用水進行稀釋，以達到在33％dmso中每肽0.826mg/ml的濃度。稀釋的溶液透過0.22μm無菌篩檢程序進行過濾。從而獲得最終本體溶液。最終本體溶液填充到小瓶中，在使用前儲存于-20℃下。一個小瓶包含700ul溶液，其中每種肽含有0.578mg。其中的500μl(每種肽約400μg)將用于皮內注射。下列描述優(yōu)選方案的實施例將對本發(fā)明進行說明(但是不僅限于此)?？紤]到本發(fā)明的目的，文中引用的所有參考文獻透過引用的方式并入在本文中。在圖中，圖1顯示了正常組織(暗灰色)和hcc(淺灰色)中各種肽的過量提呈。圖1a)apob，肽：alvdtlkfv(a＊02)(seqidno：7)，從左至右的組織；1脂肪組織，3腎上腺，2動脈，2骨髓，7大腦，3乳房，13結腸，4食管，2膽囊，3胃腸道，3心臟，16腎臟，4白細胞樣本，45肺，1淋巴結，1卵巢，7胰腺，1周圍神經(jīng)，1腦垂體，3胸膜，1前列腺，6直肌，3骨骼肌肉，1漿膜，3皮膚，4脾臟，7胃，1睪丸，2胸腺，3甲狀腺2子宮，2靜脈，以及20肝臟；圖1b)aldh1l1，肽：klqagtvfv(a＊02)(seqidno：2)，從左至右的組織：1脂肪組織，3腎上腺，2動脈，2骨髓，7大腦，3乳房，13結腸，4食管，2膽囊，3胃腸道，3心臟，16腎臟，4白細胞樣本，45肺，1淋巴結，1卵巢，7胰腺，1周圍神經(jīng)，1腦垂體，3胸膜，1前列腺，6直肌，3骨骼肌肉，1漿膜，3皮膚，4脾臟，7胃，1睪丸，2胸腺，3甲狀腺2子宮，2靜脈，以及20肝臟；圖1c)c8b，肽：ayllqpsqf(a＊24)(seqidno：200)，從左至右的組織：包括2腎上腺，1動脈，4大腦，1乳腺，5結腸，1心臟，13腎臟，9肺，3胰腺，2直肌，3皮膚，1脾臟，12胃，1胸腺，2子宮和9肝臟；圖1d)rad23b肽：kideknfvv(seqidno：63)，1漿膜，1脂肪組織，3腎上腺，2動脈，2骨髓，7大腦，3乳房，13結腸，2膽囊，3胃腸道，3心臟，12腎臟，4白細胞，19肺，43肺，1淋巴結，1卵巢，6胰腺，1周圍神經(jīng)，1腦垂體，3胸膜，1前列腺，6直肌，3骨骼肌肉，3皮膚，4脾臟，5胃，1睪丸，2胸腺，3甲狀腺2子宮，2靜脈，4食管；圖1e)rad23b，肽：kideknfvv(seqidno：63)，顯示的僅是上面提呈肽的樣本：5細胞系，1正常組織(1腎上腺)，16癌組織(2腦癌，4肝癌，5肺癌，1直腸癌，1膀胱癌，3子宮癌)(從左至右)；圖1f)rfngrlppdtllqqv(seqidno：92)，顯示的僅是上面提呈肽的樣本：1漿膜，1脂肪組織，3腎上腺，2動脈，2骨髓，7大腦，3乳房，13結腸，2膽囊，3胃腸道，3心臟，12腎臟，4白細胞，19肺，43肺，1淋巴結，1卵巢，6胰腺，1周圍神經(jīng)，1腦垂體，3胸膜，1前列腺，6直肌，3骨骼肌肉，3皮膚，4脾臟，5胃，1睪丸，2胸腺，3甲狀腺2子宮，2靜脈，4食管；圖1g)rfng，肽：rlppdtllqqv(seqidno：92)，顯示的僅是上面提呈肽的樣本：2細胞系，2正常組織(2腎上腺)，17癌組織(1腦癌，1乳房癌，1食道癌，5肝癌，4肺癌，1卵巢癌，1前列腺癌，2膀胱癌，1子宮癌)(從左至右)；圖1h)flvcr1，肽：svwfgpkev(seqidno：104)，1漿膜，1脂肪組織，3腎上腺，2動脈，2骨髓，7大腦，3乳房，13結腸，2膽囊，3胃腸道，3心臟，12腎臟，4白細胞，19肺，43肺，1淋巴結，1卵巢，6胰腺，1周圍神經(jīng)，1腦垂體，3胸膜，1前列腺，6直肌，3骨骼肌肉，3皮膚，4脾臟，5胃，1睪丸，2胸腺，3甲狀腺2子宮，2靜脈，4食管；圖1i)flvcr1，肽：svwfgpkev(seqidno：104)，顯示的僅是上面提呈肽的樣本：9細胞系，1正常組織(1小腸)，16癌組織(1腦癌，1乳腺癌，5肝癌，5肺癌，1皮膚癌，1胃癌，1膀胱癌，1子宮癌)(從左至右)；圖1j)ikbkap，肽：llfphpvnqv(seqidno：156)，1漿膜，1脂肪組織，3腎上腺，2動脈，2骨髓，7大腦，3乳房，13結腸，2膽囊，3胃腸道，3心臟，12腎臟，4白細胞，19肺，43肺，1淋巴結，1卵巢，6胰腺，1周圍神經(jīng)，1腦垂體，3胸膜，1前列腺，6直肌，3骨骼肌肉，3皮膚，4脾臟，5胃，1睪丸，2胸腺，3甲狀腺2子宮，2靜脈，4食管；圖1k)ikbkap，肽：llfphpvnqv(seqidno：156)，顯示的僅是上面提呈肽的樣本：7細胞系，2原代培養(yǎng)物，1正常組織(1結腸)，34癌組織(1骨髓癌，1乳腺癌，1結腸癌，2食道癌，2白細胞白血病癌癥，4肝癌，11肺癌，3淋巴結癌，5卵巢癌，4膀胱癌)(從左至右)；圖1l)nkd1，肽：fldtpiakv(seqidno：47)，1漿膜，1脂肪組織，3腎上腺，2動脈，2骨髓，7大腦，3乳房，13結腸，2膽囊，3胃腸道，3心臟，12腎臟，4白細胞，19肺，43肺，1淋巴結，1卵巢，6胰腺，1周圍神經(jīng)，1腦垂體，3胸膜，1前列腺，6直肌，3骨骼肌肉，3皮膚，4脾臟，5胃，1睪丸，2胸腺，3甲狀腺2子宮，2靜脈，4食管；圖1m)nkd1，肽：fldtpiakv(seqidno：47)，顯示的僅是上面提呈肽的樣本：1其他疾病(腦膨出)，2正常組織(1肺，1脾)，35癌組織(5腦癌，6結腸癌，1食道癌，6肝癌，9肺癌，1卵巢癌，1前列腺癌，4直腸癌，2胃癌)(從左至右)。圖2顯示了本發(fā)明的源基因的代表性表達特征(與正常腎臟相比的相對表達)，這些基因在一系列正常組織(深灰色)hcc中以及12份hcc樣本(灰色)中高度過度表達或專門表達。圖2a)apob，從左到右的組織：1腎上腺，1動脈，1骨髓，1腦(全)，1乳腺，1結腸，1食道，1心臟，3腎臟，1白細胞樣本，1肝臟，1肺，1淋巴結，1卵巢，1胰腺，1胎盤，1前列腺，1唾液腺，1骨骼肌，1皮膚，1小腸，1脾臟，1胃，1睪丸，1胸腺，1甲狀腺，1膀胱，1子宮頸，1子宮，1靜脈；圖2b)amacr，從左到右的組織：1腎上腺，1動脈，1骨髓，1腦(全)，1乳腺，1結腸，1食道，1心臟，3腎臟，1白細胞樣本，1肝臟，1肺，1淋巴結，1卵巢，1胰腺，1胎盤，1前列腺，1唾液腺，1骨骼肌，1皮膚，1小腸，1脾臟，1胃，1睪丸，1胸腺，1甲狀腺，1膀胱，1子宮頸，1子宮，1靜脈；圖2c)aldh1l1，從左到右的組織：1腎上腺，1動脈，1骨髓，1腦(全)，1乳腺，1結腸，1食道，1心臟，3腎臟，1白細胞樣本，1肝臟，1肺，1淋巴結，1卵巢，1胰腺，1胎盤，1前列腺，1唾液腺，1骨骼肌，1皮膚，1小腸，1脾臟，1胃，1睪丸，1胸腺，1甲狀腺，1膀胱，1子宮頸，1子宮，1靜脈；圖2d)fgg，從左到右的組織：1腎上腺，1動脈，1骨髓，1腦(全)，1乳腺，1結腸，1食道，1心臟，3腎臟，1白細胞樣本，1肝臟，1肺，1淋巴結，1卵巢，1胰腺，1胎盤，1前列腺，1唾液腺，1骨骼肌，1皮膚，1小腸，1脾臟，1胃，1睪丸，1胸腺，1甲狀腺，1膀胱，1子宮頸，1子宮，1靜脈；圖2e)c8b，從左到右的組織：1腎上腺，1動脈，1骨髓，1腦(全)，1乳腺，1結腸，1食道，1心臟，3腎臟，1白細胞樣本，1肝臟，1肺，1淋巴結，1卵巢，1胰腺，1胎盤，1前列腺，1唾液腺，1骨骼肌，1皮膚，1小腸，1脾臟，1胃，1睪丸，1胸腺，1甲狀腺，1膀胱，1子宮頸，1子宮，1靜脈；和圖2f)hsd17b6，從左到右的組織：包括1腎上腺，1動脈，1骨髓，1腦(全)，1乳腺，1結腸，1食道，1心臟，3腎臟，1白細胞樣本，1肝臟，1肺，1淋巴結，1卵巢，1胰腺，1胎盤，1前列腺，1唾液腺，1骨骼肌，1皮膚，1小腸，1脾臟，1胃，1睪丸，1胸腺，1甲狀腺，1膀胱，1子宮頸，1子宮，1靜脈。圖3顯示肽特定多聚體染色后實例性流式細胞儀結果。進一步的解釋見實施例4。圖4顯示肽特定多聚體染色后實例性流式細胞儀結果。進一步的解釋見實施例4。實施例實施例1：細胞表面提呈的腫瘤相關肽的識別和定量組織樣本患者的腫瘤組織獲得自fürallgemeine，viszeral-undtransplantationschirurgie，圖賓根，德國；istitutonazionaletumori″pascale″。分子生物學與病毒腫瘤單元，viamariano，那不勒斯，意大利；bio-optionsinc.，brea，ca，美國；proteogenexinc.，culver城，加州，美國；asterandeurope，roystonherts，英國。所有患者在手術前都獲得了書面知情同意。手術后組織立即進行激凍處理，在分離tumap前儲存于-70℃或以下。從組織樣本中分離hla肽根據(jù)方案(falk，k.，1991；seeger，f.h.t.，1999)略加修改，使用hla-a＊02-特異性抗體bb7.2、hla-a、hla-b、hla-c特異性抗體w6/32、cnbr活化的瓊脂糖凝膠、酸處理和超濾方法以固體組織的免疫沉淀法獲得了激凍組織樣本的hla肽庫。質譜分析獲得的hla肽庫根據(jù)其疏水性用反相色譜(nanoacquityuplcsystem，waters)分離，洗脫肽用裝有電噴霧源的ltq-velos融合雜交質譜(thermoelectron)進行了分析。肽庫被直接加載填充有1.7μmc18反相材料(waters)的分析用熔煉石英微毛細管柱(75μm內徑x250mm)，應用流速為400nl每分鐘。隨后，使用來自流速為300nl每分鐘、濃度為10％至33％溶劑b中的兩步180分鐘二元梯度法對肽進行分離。梯度由溶劑a(含0.1％甲酸的水)和溶劑b(含0.1％甲酸的乙腈)。金鍍膜玻璃毛細管(picotip，newobjective)用于引入到納升電噴霧源。使用前5(top5)策略在數(shù)據(jù)依賴模式下操作ltq-orbitrap質譜儀。簡言之，首先以高精確質量完全掃描在orbitrap開始一個掃描周期(r＝30000)，之后用先前選定離子的動態(tài)排除技術在orbitrap中對5種含量最為豐富的前體離子進行ms/ms掃描(r＝7500)。串聯(lián)質譜以sequest和另一種手動控制器進行解讀。生成的自然肽碎片模式與合成序列相同參考肽的碎片模式進行比較后，確保了被識別的肽序列。無標記相對lc-ms定量透過離子計數(shù)(即透過lc-ms功能提取和分析)來進行(muelleretal.2007a)。該方法假定肽的lc-ms信號區(qū)域與樣本中其豐度相關。提取的特征透過充電狀態(tài)去卷積和保留時間校準進行進一步處理(muelleretal.2007b；sturmetal.2008)。最后，所有的lc-ms特征與序列鑒定結果交叉引用，以將不同樣本和組織的定量數(shù)據(jù)與肽呈遞特征結合。定量數(shù)據(jù)根據(jù)集中數(shù)據(jù)以兩層方式進行正態(tài)化處理，以說明技術和生物學復制變異。因此，每個被識別的肽均可與定量資料相關，從而可得出樣本和組織之間的相對定量。此外，對候選肽獲得的所有定量數(shù)據(jù)進行手動檢查，以確保數(shù)據(jù)的一致性，并驗證自動化分析的準確度。對于每種肽，計算了提呈圖，其顯示樣本平均提呈量以及復制變化。這些特征使hcc樣本與正常組織樣本的基線值并列。示范性過度提呈肽的提呈譜示于圖1中。示范性肽的提呈分數(shù)見表8。表8：提呈分數(shù)。該表列出了與一系列正常組織相比在腫瘤上非常高度過量提呈(+++)、與一系列正常組織相比在腫瘤上高度過量提呈(++)或與一系列正常組織相比在腫瘤上過量提呈(+)的肽。s＊＝磷酸絲氨酸實施例2編碼本發(fā)明肽的基因的表達譜與正常細胞相比在腫瘤細胞上一種肽過度提呈或特定提呈足夠其在免疫治療中有效使用，一些肽為腫瘤特異性的，盡管存在其源蛋白也存在于正常組織中。但是，mrna表達譜增加了免疫治療目標肽選擇中其他級別的安全性。特別是對于具有高安全性風險的治療選擇，諸如親和力成熟的tcr，理想的目標肽將來源于對該腫瘤獨一無二且不出現(xiàn)于正常組織中的蛋白。rna來源與制備手術切除組織標本按如上所述(參見實施例1)在獲得每名患者的書面知情同意后提供。手術后立即速凍腫瘤組織標本，之后在液態(tài)氮中用杵臼勻漿。使用tri試劑(ambion公司，darmstadt，德國)之后用rneasy(qiagen公司，hilden，德國)清理從這些樣本中制備總rna；這兩種方法都根據(jù)制造商的方案進行。健康人體組織中的總rna從商業(yè)途徑獲得(ambion公司，huntingdon，英國；clontech公司，海德堡，德國；stratagene公司，阿姆斯特丹，荷蘭；biochain公司，hayward，ca，美國)?；旌蠑?shù)個人(2至123個人)的rna，從而使每個人的rna得到等加權。所有rna樣本的質量和數(shù)量都在agilent2100bioanalyzer分析儀(agilent公司，waldbronn，德國)上使用rna6000picolabchipkit試劑盒(agilent公司)進行評估。微數(shù)組實驗所有腫瘤和正常組織的rna樣本都使用affymetrixhumangenome(hg)u133a或hg-u133plus2.0affymetrix寡核苷酸芯片(affymetrix公司，santaclara，ca，美國)進行基因表達分析。所有步驟都根據(jù)affymetrix手冊進行。簡言之，如手冊中所述，使用superscriptrtii(invitrogen公司)以及oligo-dt-t7引物(mwgbiotech公司，ebersberg，德國)從5-8μgrna中合成雙鏈cdna。用bioarrayhighyieldrnatranscriptlabellingkit(enzodiagnostics公司，farmingdale，ny，美國)進行u133a測定或用genechipivtlabellingkit(affymetrix公司)進行u133plus2.0測定，之后用鏈霉親和素-藻紅蛋白和生物素化抗鏈霉素蛋白抗體(molecularprobes公司，leiden，荷蘭)進行破碎、雜交和染色，這樣完成體外轉錄。用agilent2500agenearrayscanner(u133a)或affymetrixgene-chipscanner3000(u133plus2.0)對圖像進行掃描，用gcos軟件(affymetrix公司)在所有參數(shù)默認設置情況下對數(shù)據(jù)進行分析。為了實現(xiàn)標準化，使用了affymetrix公司提供的100種管家基因(housekeepinggene)。相對表達值用軟件給定的signallogratio進行計算，正常腎組織樣本的值任意設置為1.0。本發(fā)明的代表性源基因在hcc中高度過度表達的表達譜如圖2所示。進一步代表性基因的表達分數(shù)見表9。表9：表達分數(shù)。該表列出了與一系列正常組織相比在腫瘤上非常高度過度表達(+++)、與一系列正常組織相比在腫瘤上高度過度表達(++)或與一系列正常組織相比在腫瘤上過度表達(+)的基因的肽。實施例3：與hla-a＊02和hla-a＊24結合的uv配體交換/肽本發(fā)明基于t細胞療法的候選肽進一步測試其mhc結合能力(親和性)。單個肽-mhc復合體透過uv-配體交換產生，其中，紫外線敏感肽經(jīng)紫外線照射后裂解，與分析的相關肽交換。只有能夠有效地結合并穩(wěn)定肽接受mhc分子的候選肽才能阻止mhc復合體的解離。為了確定交換反應的產率，將基于穩(wěn)定mhc復合體輕鏈(β2m)的檢測結果進行elisa測定。檢測總體上按照rodenko等人描述的方法進行。(rodenkob，toebesm，hadrupsr，vaneschwj，molenaaram，schumachertn，ovaah.generationofpeptide-mhcclassicomplexesthroughuv-mediatedligandexchange.natprotoc.2006；1(3)：1120-32.)。96孔maxisorp板(nunc)在室溫下在pbs中以2ug/ml鏈霉親和素包被過夜，用4倍洗滌并在37℃下在含封閉緩沖液的2％bsa中封閉1小時。復性的hla-a＊0201/mla-001單體作為標準品，涵蓋15-500ng/ml的范圍。紫外線交換反應的肽-mhc單體在封閉緩沖液中稀釋100倍。樣本在37℃下孵育1小時，洗滌四次，在37℃下以2ug/mlhrp綴合抗-β2m溫育1小時，再次洗滌，并以nh2so4封堵的tmb溶液進行檢測。在450nm處測量吸收。在生成和產生抗體或其片段時和/或t細胞受體或其片段時，通常優(yōu)選顯示為高交換產率(優(yōu)選為高于50％，最優(yōu)選為高于75％)的候選肽，這是因為它們對mhc分子表現(xiàn)出足夠的親合力，并能防止mhc復合體的解離。表10a：mhc-i類結合分數(shù)＜20％＝+；20％-49％＝++；50％-75％＝+++；＞＝75％＝++++表10b：mhc-i類結合分數(shù)hla-i類限制肽與hla-a＊02或hla-a＊24取決于肽序列的結合根據(jù)肽交換產量分類：≥10％＝+；≥20％＝++；≥50＝+++；≥75％＝++++.s＊＝磷酸絲氨酸。實施例4mhc-i類提呈肽的體外免疫原性為了獲得關于本發(fā)明tumap的免疫原性信息，發(fā)明人使用體外t細胞擴增分析方法進行了研究，其中該分析方法基于使用裝載肽/mhc復合體和抗cd28抗體的人工抗原提呈細胞(aapc)進行反復刺激。用這種方法，發(fā)明人可顯示出本發(fā)明目前為止22種hla-a＊0201限制tumap具有免疫原性，這表明這些肽為對抗人cd8+前體t細胞的t細胞表位(表11)。cd8+t細胞體外啟動為了用載有肽-mhc復合體(pmhc)和抗cd28抗體的人工抗原提呈細胞進行體外刺激，發(fā)明人首先從德國曼海姆大學診所在知情同意后獲取健康供體的新鮮hla-a＊02白細胞清除術后產物，使用cd8微珠(miltenyibiotec，bergisch-gladbach，germany)透過積極選擇分離出cd8+t細胞。pbmc和分離出的cd8+淋巴細胞使用前在t細胞培養(yǎng)基(tcm)中培養(yǎng)，培養(yǎng)基包括rpmi-glutamax(invitrogen公司，karlsruhe，德國)并補充10％熱滅活人ab血清(pan-biotech公司，aidenbach，德國)、100u/ml青霉素/100μg/ml鏈霉素(cambrex公司，cologne，德國)，1mm丙酮酸鈉(ccpro公司，oberdorla，德國)和20μg/ml慶大霉素(cambrex公司)。在此步驟，2.5ng/ml的il-7(promocell公司，heidelberg，德國)和10u/ml的il-2(novartispharma公司，nürnberg，德國)也加入tcm。對于pmhc/抗-cd28涂層珠的生成、t細胞的刺激和讀出，使用每刺激條件四個不同pmhc分子以及每個讀出條件8個不同的pmhc分子在高度限定的體外系統(tǒng)中進行。純化的共刺激小鼠igg2a抗人cd28抗體9.3(jungetal.，1987)使用制造商(perbio公司，波恩，德國)推薦的n-羥基琥珀酰亞胺生物素進行化學生物素化處理。所用珠為5.6μm的鏈霉抗生物素蛋白包裹的多聚苯乙烯顆粒(bangslabooratories，伊利諾伊州，美國)。用于陽性和陰性對照刺激物的pmhc分別為a＊0201/mla-001(從melan-a/mart-1中修飾制得的肽elagigiltv)和a＊0201/ddx5-001(從ddx5中獲得的yllpaivhi)。800.000珠/200μl包裹于含有4x12.5ng不同生物素-pmhc的96孔板、進行洗滌，隨后加入體積為200μl的600ng生物素抗-cd28。在37℃下，在含5ng/mlil-12(promocell)的200μltcm中共培養(yǎng)1x106cd8+t細胞與2x105的清洗涂層珠3天，從而啟動刺激。之后，一半培養(yǎng)基與補充80u/mlil-2的新鮮tcm進行交換，并且培養(yǎng)在37℃下持續(xù)4天。這種刺激性周期總共進行3次。對于使用每條件8種不同pmhc分子的pmhc多聚體讀出，二維組合編碼方法如前述使用(andersenetal.，2012)，稍作修飾，涵蓋耦合至5種不同的熒光染料。最后，用live/deadnearir染料(invitrogen公司，karlsruhe，德國)、cd8-fitc抗體克隆sk1(bd公司，heidelberg，德國)和熒光pmhc多聚體而執(zhí)行多聚體分析。對于分析，使用了配有合適激光儀和篩檢程序的bdlsrllsorp細胞儀。肽特異性細胞以占總cd8+細胞的百分比形式進行計算。多聚體分析結果使用flowjo軟件(treestar公司，oregon，美國)進行評估。特定多聚體+cd8+淋巴細胞的體外填裝用與陰性對照刺激組比較而進行檢測。如果健康供體中的至少一個可評價的體外刺激孔在體外刺激后發(fā)現(xiàn)含有特異性cd8+t細胞株(即該孔包含至少1％特定多聚體+cd8+t細胞，并且特定多聚體+的百分比至少為陰性對照刺激中位數(shù)的10倍)，則檢測給定抗原的免疫原性。hcc肽體外免疫原性對于受到測試的hla-i類肽，可透過肽特異性t細胞株的生成證明其體外免疫原性。tumap特異性多聚體對本發(fā)明的三種肽染色后流式細胞儀檢測的典型結果如圖3和圖4所示，同時也含有相應的陰性對照信息。本發(fā)明22種肽的結果匯總于表11a。表11a：本發(fā)明中hlai類肽的體外免疫原性申請人對本發(fā)明的肽所做的體外免疫原性實驗的示例性結果。＜20％＝+；20％-49％＝++；50％-69％＝+++；＞＝70％＝++++序列號肽編號孔供體225qar-001+++++++1apob-003++++++2aldh1l1-001++++++301c1qtnf3-001++++++15slc35b2-001++++++16acsl3-001++++++12gpc3-001+++++7apob-002+++++303mageb2-001+++227samm-001++++4apob-004+++++226tht-001+++++6axin2-001+++232mapkapk5-001++++10uso-001+++304usp14-001+++++219adf-012+++++224ift81-001++++11znf318-001+++14ncst-001+++228acsl4-001+++230ipo9-001+++++表11b：本發(fā)明中其他hlai類肽的體外免疫原性申請人對本發(fā)明的hla-a＊24限制肽所做的體外免疫原性實驗的示例性結果。提示了體外免疫原性實驗的結果。陽性孔和供體(其他可評價)的百分比概括為1-20％＝+；20％-49％＝++；50％-69％＝+++；＞＝70％＝++++序列id號序列陽性孔[％]陽性供體[％]187syptffprf″+″″++++″189afspdshyllf″+″″++″190rynekcfkl″+″″++″191kypdiisri″+″″++++″192syitkpekw″+″″+++″193iypgafvdl″+″″+++″194qyasrfvql″+″″+++″196aylkwisqi″+″″+++″197rwpkksaef″+″″++″198lywshprkf″+″″++″199kfvtvqatf″+″″++″201ayvntfhni″++″″++++″202aygtyrsnf″+″″++++″203yygilqeki″+″″+++″205vyglqrnll″+″″+++″207iylerfpif″++″″++++″208synpaenavll″+″″+++″209vfhprqeli″++″″++++″210aypairyll″+″″++++″211iyipsyfdf″++″″++++″212vygdvisni″+″″++++″215iytgnissf″+″″++″216iyadvgeef″+″″++″217dyipyvfkl″+++″″++++″218vyqgairqi″+″″+++″健康hla-a＊02+供體的肽特異性cd8+t細胞體外反應的示例性結果(圖3)cd8+t細胞制備的方法為：使用抗cd28mab和hla-a＊02涂層的人工apc分別與ima-apob-002(序列號7)肽(a，右圖)或ima-apob-003(b，右圖，序列號1)或ima-aldh1l1-001(c，右圖，序列號2)合成。經(jīng)過3個周期的刺激后，用a＊02/apob-002(a)或a＊02/apob-003(b)或a＊02/aldh1l1-001進行2d多聚體染色檢測肽反應性細胞。左圖(a，b，c)顯示不相關a＊02/肽復合體刺激的細胞的對照染色?；顔渭毎赾d8+淋巴細胞上得到門控。boolean門控幫助排除用不同肽特定的多聚體檢測的假陽性事件。提示了特異性多聚體+細胞和cd8+淋巴細胞的頻率。健康hla-a＊24+供體的肽特異性cd8+t細胞體外反應的示例性結果(圖4)cd8+t細胞制備的方法為：使用抗cd28mab和hla-a＊24涂層的人工apc分別與ima-klhl24-001(序列id號190)肽(a，右圖)或ima-apob-006(b，右圖，序列id號218)合成。經(jīng)過3個周期的刺激后，用a＊24/klhl24-001(a)或a＊24/apob-006(b)的2d多聚體染色法對肽反應性細胞進行檢測。左圖(a和b)顯示用不相關a＊24/肽復合體刺激的細胞對照染色?；顔渭毎赾d8+淋巴細胞上得到門控。boolean門控幫助排除用不同肽特定的多聚體檢測的假陽性事件。提示了特異性多聚體+細胞和cd8+淋巴細胞的頻率。實施例5：肽的合成所有的肽透過使用fmoc策略以標準、廣為接受的固相肽合成法合成。每個肽的身份和純度已使用質譜和rp-hplc分析法確定。用凍干法(三氟乙酸鹽)獲得白色至類白色的肽，純度為＞50％。所有的tumap優(yōu)選作為三氟乙酸鹽或乙酸鹽進行給藥，其他鹽形式也可以。引用的文獻adler，a.s.etal.，genesdev.28(2014)ahn，y.h.etal.，jproteomics.106(2014)akiyama，h.etal.，oncolrep.21(2009)alam，s.m.etal.，endocr.relatcancer16(2009)aleman，g.etal.，amjphysiolendocrinol.metab289(2005)alexanian，a.etal.，cancergenomicsproteomics.9(2012)altenhofer，s.etal.，jbiol.chem.285(2010)alvarez，c.etal.，jbiol.chem.276(2001)ammerpohl，o.etal.，int.jcancer130(2012)andersen，r.s.etal.，nat.protoc.7(2012)arai，e.etal.，carcinogenesis33(2012)araki，t.etal.，jbiol.chem.286(2011)arlt，a.etal.，oncogene28(2009)arndt，s.etal.，oncolrep.18(2007)arner，e.s.etal.，eur.jbiochem.267(2000)atienza，j.m.etal.，molcancerther4(2005)avery-kiejda，k.a.etal.，bmc.cancer14(2014)bachmann，s.b.etal.，molcancer13(2014)balogh，k.etal.，oncogene31(2012)bani，m.r.etal.，molcancerther3(2004)bansal，n.etal.，plos.one.6(2011)barbarulo，a.etal.，oncogene32(2013)bell，j.c.etal.，drugmetabdispos.40(2012)ben-izhak，o.etal.，histopathology41(2002)bergada，l.etal.，labinvest94(2014)bergeron，m.j.etal.，molaspectsmed.34(2013)bhattacharya，c.etal.，molcancer11(2012)bhogaraju，s.etal.，science341(2013)bidkhori，g.etal.，plos.one.8(2013)bieche，i.etal.，breastcancerres6(2004)biswas，s.etal.，biochim.biophys.acta1832(2013)blanke，k.l.etal.，cancercausescontrol25(2014)bodine，s.c.etal.，science294(2001)boehringer，j.etal.，biochem.j448(2012)bojjireddy，n.etal.，jcellsci.(2014)booth，d.g.etal.，emboj30(2011)bouquet，c.etal.，molther14(2006)boylan，k.l.etal.，proteome.sci.8(2010)braumuller，h.etal.，nature(2013)brockmoller，s.f.etal.，jproteome.res11(2012)buch，s.c.etal.，molcarcinog.51suppl1(2012)bull，c.etal.，cancerres74(2014)burrell，r.a.etal.，nature494(2013)butterfield，l.h.etal.，clincancerres12(2006)butterfield，l.h.etal.，clin.cancerres.9(2003)byrne，a.etal.，exp.cellres316(2010)cadenas，c.etal.，cellcycle13(2014)cadoret，a.etal.，oncogene21(2002)cao，h.etal.，biochemistry41(2002)cao，y.etal.，cancerresearch61(2001)cao-ehlker，x.etal.，jbiol.chem.288(2013)carroll，m.etal.，jinterferoncytokineres33(2013)carrouel，f.etal.，jdent.res87(2008)castro，m.etal.，jtransl.med.8(2010)chae，y.s.etal.，med.oncol28(2011)chang，l.o.etal.，cancerres33(1973)chang，y.s.etal.，cancerchemother.pharmacol.59(2007)chapiro，j.etal.，radiol.med.119(2014)charbonneau，b.etal.，amjhematol.87(2012)chatterjee，m.etal.，haematologica98(2013)chen，j.etal.，biochem.biophys.rescommun.420(2012a)chen，m.etal.，proc.natl.acad.sci.u.s.a108(2011a)chen，r.etal.，worldjgastroenterol.17(2011b)chen，x.etal.，jdig.dis.12(2011c)chen，x.q.etal.，med.oncol29(2012b)cheng，l.etal.，genomics102(2013)choi，y.w.etal.，int.jgynecol.cancer17(2007)christa，l.etal.，gastroenterology106(1994)clark，a.g.etal.，cytoskeleton(hoboken.)69(2012)claroda，silvat.etal.，mol.aspectsmed.34(2013)cohen，l.etal.，nature395(1998)collins，c.l.etal.，surgery122(1997)com，e.etal.，jproteomics.75(2012)copps，k.d.etal.，diabetologia55(2012)comen，s.etal.，plos.one.9(2014)cornez，i.etal.，biochem.pharmacol.75(2008)cowling，v.h.，oncogene29(2010)cui，t.etal.，int.joncol39(2011)dasilva，m.g.etal.，exp.clincardiol.17(2012)dadkhah，e.etal.，arch.iranmed.16(2013)darmanis，s.etal.，plos.one.8(2013)darvekar，s.etal.，biochem.j442(2012)darvekar，s.r.etal.，plos.one.9(2014)datta，k.etal.，jbiol.chem.284(2009)david，s.etal.，frontbiosci.(elite.ed)5(2013)dealmagro，m.c.etal.，biochem.pharmacol.81(2011)degroot，j.f.etal.，cancerres65(2005)deb，s.etal.，br.jcancer110(2014)debauve，g.etal.，cellmollifesci.65(2008)decker，t.etal.，jclinlnvest109(2002)decock，a.etal.，genomebiol.13(2012)delcampo，e.m.etal.，molphylogenet.evol.66(2013)delaval，b.etal.，jcellbiol.188(2010)deng，x.d.etal.，asianpac.jcancerprev.15(2014)di，gregorioe.etal.，jmed.genet.50(2013)diggle，c.p.etal.，plos.genet.10(2014)dimitrov，a.etal.，hum.molgenet.18(2009)dmitriev，o.y.，biochem.cellbiol.89(2011)doherty，j.a.etal.，cancerepidemiol.biomarkersprev.20(2011)dong，z.etal.，critrev.oncolhematol.59(2006)dou，r.etal.，cancerlett.336(2013)drazkowska，k.etal.，nucleicacidsres41(2013)edavana，v.k.etal.，drugmetabdispos.41(2013)edwards，p.a.etal.，breastcancerres14(2012)elvenes，j.etal.，plos.one.6(2011)emaduddin，m.etal.，cellcommun.signal.6(2008)enguita-german，m.etal.，worldjhepatol.6(2014)epelbaum，r.etal.，pathol.oncolres4(1998)fan，t.w.etal.，molcancer8(2009)fang，z.q.etal.，genet.molres12(2013)fassas，a.b.etal.，leuk.lymphoma45(2004)feferman，l.etal.，prostatecancerprostatic.dis.16(2013)fei，f.etal.，jcancerresclinoncol(2014a)fei，f.etal.，annsurg.oncol21(2014b)feigelson，h.s.etal.，breastcancerres10(2008)feng，l.etal.，cellbiochem.funct.29(2011)feng，m.etal.，jclininvest124(2014a)feng，s.etal.，int.jbiol.sci.9(2013)feng，y.etal.，jbi0l.chem.289(2014b)feng，y.etal.，freeradic.res46(2012)fernandes，c.f.etal.，biochem.biophys.rescommun.361(2007)ferre，s.etal.，jamsocnephrol.25(2014)ferrer-ferrer，m.etal.，arch.med.res44(2013)filmus，j.etal.，febsj280(2013)fiorito，v.etal.，biochim.biophys.acta1839(2014)fojo，a.t.etal.，proc.natl.acad.sci.u.s.a84(1987)fonseca，a.l.etal.，geneschromosomes.cancer51(2012)fossdal，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int.jcancer122(2008)lekva，t.etal.，plos.one.8(2013)leroy，p.j.etal.，cancerres67(2007)leung，t.etal.，breastcancerres15(2013)levenson，v.v.etal.，somat.cellmolgenet.25(1999)levi，s.etal.，frontpharmacol.5(2014)li，d.etal.，proteincell5(2014a)li，n.etal.，biochem.biophys.rescommun.455(2014)li，x.etal.，med.oncol31(2014b)li，y.etal.，molcellbiol.29(2009)li，y.h.etal.，worldjgastroenterol.18(2012)liang，j.etal.，plos.one.3(2008)lillig，c.h.etal.，antioxid.redox.signal.9(2007)lin，c.h.etal.，jcellbiol.189(2010)lin，m.c.etal.，oraloncol50(2014)lin，s.h.etal.，oncogene23(2004)lin，z.etal.，cellrep.5(2013)linderoth，j.etal.，br.jhaematol.141(2008)line，a.etal.，cancerimmunolimmunother.51(2002)ling，c.etal.，emboj26(2007)linge，a.etal.，jproteome.res13(2014)lioutas，a.etal.，emborep.14(2013)liu，c.etal.，natmed.20(2014)liu，c.etal.，jnatl.cancerinst.105(2013a)liu，h.etal.，carcinogenesis34(2013b)liu，t.w.etal.，proc.natl.acad.sci.u.s.a106(2009a)liu，w.etal.，jbiol.chem.279(2004)liu，y.etal.，curr.drugtargets.13(2012)liu，y.etal.，cancerepidemiol.biomarkersprev.18(2009b)liu，y.etal.，oncolrep.18(2007)ljungberg，b.，curr.opin.urol.17(2007)llovet，j.m.etal.，n.engl.jmed.359(2008)lore，a.e.etal.，jbiol.chem.287(2012)lo，w.y.etal.，jproteome.res6(2007)lombardo，y.etal.，breastcancerres16(2014)lourenco，g.j.etal.，breastcancerrestreat.100(2006)lovelace，l.l.etal.，jbiol.chem.286(2011)lung，h.l.etal.，intjcancer127(2010)lutcke，h.，eur.jbiochem.228(1995)ma，x.j.etal.，proc.natl.acad.sci.u.s.a100(2003)mackiewicz，a.etal.，glycoconj.j12(1995)mahajan，k.etal.，cancerlett.338(2013)mamtani，m.etal.，bmc.resnotes5(2012)mariani，l.etal.，clincancerres7(2001)marina，m.etal.，frontbiosci.(landmark.ed)19(2014)markiewski，m.m.etal.，natimmunol9(2008)martin，t.a.etal.，eur.jcancer40(2004)martinez，h.d.etal.，genescancer2(2011)mathison，j.etal.，pathobiology59(1991)matsubara，j.etal.，cancerepidemiol.biomarkersprev.20(2011)matusiak，d.etal.，jhistochem.cytochem.55(2007)mcguire，t.a.，mdmed.j40(1991)medjkane，s.etal.，cellcycle11(2012)meijers，j.c.etal.，br.jhaematol.108(2000)mercer，c.a.etal.，autophagy.5(2009)mercurio，f.a.etal.，biochemistry51(2012)midorikawa，y.etal.，jpn.jcancerres.93(2002)miled，c.etal.，cancerres65(2005)milkereit，p.etal.，jbiol.chem.278(2003)miller，j.c.etal.，molcarcinog.48(2009)mohelnikova-duchonova，b.etal.，pancreas42(2013)monaco，m.e.etal.，transl.oncol3(2010)morandi，f.etal.，plos.one.7(2012)morrissey，j.j.etal.，urology83(2014)mu，j.etal.，jbiol.chem.272(1997)murray，d.w.etal.，br.jcancer110(2014)murray，j.i.etal.，molbiol.cell15(2004)murrin，l.c.etal.，jneuroimmune.pharmacol.2(2007)murthy，k.g.etal.，genesdev.9(1995)mydlikova，z.etal.，neoplasma57(2010)narita，t.etal.，molcellbiol.23(2003)narjoz，c.etal.，plos.one.9(2014)nelson，e.r.etal.，science342(2013)ngeow，j.etal.，cancerdiscov.4(2014)nibbe，r.k.etal.，mol.cellproteomics.8(2009)nielsen，m.j.etal.，blood108(2006)noda，t.etal.，hepatology55(2012)noh，c.k.etal.，clinbiochem.47(2014)ntikoudi，e.etal.，cancertreat.rev.40(2014)nwosu，v.etal.，hum.molgenet.10(2001)obholz，k.l.etal.，dev.biol.298(2006)oeffner，f.etal.，amjhum.genet.84(2009)ofman，r.etal.，biochem.biophys.rescommun.281(2001)ohshima，k.etal.，molbiol.evol.27(2010)oiso，s.etal.，oncolrep.31(2014)oji，y.etal.，int.joncol44(2014)osada，h.etal.，int.jcancer112(2004)otero-rey，e.m.etal.，oraloncol44(2008)palmer，d.h.etal.，hepatology49(2009)panico，f.etal.，adv.cancerres105(2009)park，b.l.etal.，biochem.biophys.rescommun.363(2007)patel，m.r.etal.，laryngoscope121(2011)patel，s.a.etal.，br.jcancer(2014)pattani，k.m.etal.，plos.one.7(2012)pavelec，d.m.etal.，genetics183(2009)pawlowska，m.etal.，drugmetabdispos.41(2013)pehlivan，d.etal.，eur.jhum.genet.22(2014)pei，z.etal.，plos.one.8(2013)pellanda，h.etal.，int.jbiochem.cellbiol.44(2012)peng，r.etal.，jcellbiol.157(2002)perera，s.etal.，jmusclerescellmotil.33(2012)persaud-sawin，d.a.etal.，hum.molgenet.11(2002)peters，d.g.etal.，cancerepidemiol.biomarkersprev.14(2005)pizon，v.etal.，jcellsci.115(2002)placke，t.etal.，blood124(2014)plebani，r.etal.，neoplasia.14(2012)poh，w.etal.，molcancer11(2012)porkka，k.p.etal.，geneschromosomes.cancer39(2004)pylypenko，o.etal.，molcell11(2003)qi，l.etal.，cancerres74(2014)qin，y.etal.，pigmentcellmelanomares26(2013)quayle，s.n.etal.，neurooncol14(2012)quek，h.h.etal.，dnacellbiol.16(1997)quidville，v.etal.，cancerres73(2013)rajadhyaksha，a.m.etal.，am.jhum.genet.87(2010)rajasekaran，a.k.etal.，nucleicacidsres23(1995)rajendran，m.etal.，cancermetastasisrev.29(2010)rakheja，d.etal.，molgenet.metab93(2008)ramana，c.v.etal.，emboj19(2000)rashad，n.m.etal.，cytokine68(2014)rath，n.etal.，emborep.13(2012)recupero，d.etal.，rom.jmorphol.embryol.51(2010)reinisch，w.etal.，jimmunother.25(2002)rekdal，c.etal.，jbiol.chem.275(2000)ren，y.g.etal.，molbiol.cell15(2004)rennoll，s.a.etal.，biochem.biophys.rescommun.443(2014)rifas，l.etal.，arthritisrheum.60(2009)riihila，p.m.etal.，jinvestdermatol.134(2014)rodriguez，f.j.etal.，jneuropathol.exp.neurol.67(2008)rogov，v.etal.，molcell53(2014)romanuik，t.l.etal.，bmc.genomics10(2009)roodman，g.d.，annn.y.acad.sci.1192(2010)rosado，i.v.etal.，rna.10(2004)rose，a.e.etal.，cancerres71(2011)ross，h.etal.，arch.pathol.labmed.136(2012)rossi，m.r.etal.，cancergenet.cytogenet.161(2005)rotondo，r.etal.，int.jcancer125(2009)rucksaken，r.etal.，cancerbiomark.12(2012)ruiz，f.x.etal.，biochem.j440(2011)ruiz，f.x.etal.，frontpharmacol.3(2012)rutkowski，m.j.etal.，molcancerres8(2010)rylova，s.n.etal.，cancerres62(2002)sahm，f.etal.，cancerres73(2013)sahu，a.etal.，immunolres17(1998)saito，t.etal.，jbiol.chem.278(2003)salahshor，s.etal.，jclinpathol.58(2005)sang，w.etal.，zhonghuabing.lixue.zazhi42(2013)sangro，b.etal.，jclinoncol22(2004)sanz，l.etal.，molcellbiol.15(1995)saponaro，c.etal.，cancerbiomark.14(2014)sarajlic，a.etal.，breastcancerrestreat.143(2014)sasahira，t.etal.，eur.jcancer50(2014)schneider，e.etal.，clinchim.acta374(2006)schofield，a.v.etal.，critrev.biochem.molbiol.48(2013)schulz，e.g.etal.，immunity.30(2009)seifert，m.etal.，jpathol.205(2005)senchenko，v.etal.，oncogene22(2003)shaughnessy，j.d.，jr.etal.，blood118(2011)shen，f.etal.，jcellbiochem.112(2011)shi，m.etal.，worldjgastroenterol.10(2004a)shi，y.etal.，exp.cellres296(2004b)shi，z.z.etal.，clintransl.oncol16(2014)shinji，s.etal.，oncolrep.15(2006)shodeinde，a.etal.，jmolbiochem.2(2013)shubbar，e.etal.，bmc.cancer13(2013)shurbaji，m.s.etal.，amjclinpathol.96(1991)sillars-hardebol，a.h.etal.，gut61(2012)singh，s.etal.，tumour.biol.(2014)smith，p.etal.，clincancerres13(2007)song，c.etal.，jbiol.chem.288(2013)srivenugopal，k.s.etal.，cancerlett.117(1997)staal-vandenbrekelajetal.，br.jcancer76(1997)steen，h.c.etal.，jinterferoncytokineres.32(2012)stefanska，b.etal.，clincancerres20(2014)strassburg，c.p.etal.，jbiol.chem.273(1998)strassburg，c.p.etal.，molpharmacol.52(1997)sudo，h.etal.，genomics95(2010)sugihara，t.etal.，jbiol.chem.276(2001)sun，c.etal.，pathol.respract.210(2014)sun，x.etal.，jpathol.226(2012)sun，x.etal.，proteincell4(2013)sun，x.j.etal.，zhonghuayi.xue.yi.chuanxue.zazhi22(2005)supernat，a.etal.，oncollett.4(2012)surmacz，e.，jmammary.gland.biol.neoplasia.18(2013)suzuki，k.etal.，biochem.biophys.rescommun.368(2008)swallow，c.j.etal.，oncogene24(2005)tabuchi，k.etal.，jneurosci.22(2002)taguchi，o.etal.，clinchim.acta244(1996)takayama，t.etal.，cancer68(1991)takayama，t.etal.，lancet356(2000)takeda，y.etal.，glycobiology24(2014)takemasa，i.etal.，int.joncol40(2012)takeuchi，a.etal.，molcellendocrinol.384(2014)tan，l.z.etal.，amjpathol.183(2013)tan，m.k.etal.，molcellbiol.31(2011)tanahashi，n.etal.，biochem.biophys.rescommun.243(1998)tanaka，m.etal.，molmed.rep.7(2013)tang，l.etal.，arch.med.res43(2012)tang，x.h.etal.，annu.rev.pathol.6(2011)tao，j.etal.，sci.transl.med.3(2011)tao，r.h.etal.，biochem.biophys.rescommun.341(2006)tao，t.etal.，cellres23(2013)tarao，k.etal.，cancer86(1999)tarao，k.etal.，cancer79(1997)tasker，p.n.etal.，osteoporos.int.17(2006)telikicherla，d.etal.，clinproteomics.9(2012)tian，t.etal.，eur.jcancer48(2012)tian，y.etal.，bmc.cancer14(2014)tomiyama，k.etal.，proc.natl.acad.sci.u.s.a107(2010)tomoda，t.etal.，jgastroenterol.hepatol.27(2012)tong，j.etal.，plos.one.8(2013)tortorella，s.etal.，jmembr.biol.247(2014)tran，e.etal.，science344(2014)trougakos，i.p.，gerontology59(2013)tsai，h.y.etal.，oncogene32(2013)uddin，s.etal.，int.jclinexp.pathol.4(2011)uehara，y.etal.，cancerres43(1983)urig，s.etal.，semincancerbiol.16(2006)vainio，p.etal.，am.jpathol.178(2011)vanderspek，p.j.etal.，genomics31(1996)vanzuylen，w.j.etal.，plos.pathog.8(2012)van，denbroek，letal.，proteomics.clinappl.4(2010)van，duinm.etal.，haematologica96(2011)vejda，s.etal.，molcellproteomics.1(2002)vincent，f.etal.，cancerres69(2009)wang，b.s.etal.，cellstress.chaperones.18(2013a)wang，d.etal.，jbiol.chem.277(2002)wang，j.etal.，eur.jcancerprev.22(2013b)wang，j.etal.，jclininvest112(2003)wang，j.etal.，cancerprev.res(phila)6(2013c)wang，j.c.etal.，oncology81(2011)wang，m.etal.，chinjphysiol55(2012)wang，s.k.etal.，plos.genet.9(2013d)wang，s.s.etal.，plos.one.5(2010)wang，x.etal.，urol.int.92(2014)wang，y.etal.，jbiol.chem.274(1999)wang，y.etal.，med.oncol32(2015)wazir，u.etal.，cellmolbiol.lett.18(2013)wazir，u.etal.，anticancerres32(2012)weiss，j.etal.，int.jantimicrob.agents41(2013)welsh，m.m.etal.，carcinogenesis29(2008)wieser，r.，leuk.lymphoma43(2002)wilhelm，s.m.etal.，cancerres.64(2004)williams，a.l.etal.，nature506(2014)witte，i.etal.，celldeath.dis.2(2011)wong，k.k.etal.，leukemia28(2014)wong，n.etal.，jhepatol.38(2003)wu，l.etal.，annhematol.91(2012)wu，n.etal.，int.jmolsci.14(2013a)wu，w.etal.，sci.chinalifesci.56(2013b)wu，x.etal.，am.jclinexp.urol.2(2014)wu，y.m.etal.，cancerres71(2011)xiao，j.etal.，jbiol.chem.276(2001)xie，f.w.etal.，neoplasma61(2014)xu，h.etal.，cellrep.9(2014)xu，x.etal.，proteomics.10(2010)yan，d.etal.，proc.natl.acad.sci.u.s.a98(2001)yang，c.etal.，virchowsarch.463(2013)yang，c.y.etal.，jimmunol192(2014a)yang，h.etal.，oncolrep.24(2010)yang，h.w.etal.，oncogene0(2014b)yang，r.etal.，molcellbiol.31(2011a)yang，z.j.etal.，molcancerther10(2011b)yau，c.etal.，breastcancerres12(2010)ye，x.h.etal.，molgenet.genomics(2014)yoon，j.k.etal.，jtransl.med.12(2014)yoshimura，s.etal.，jcellbiol.191(2010)yoshizuka，n.etal.，molcancerres10(2012)yosten，g.l.etal.，amjphysiolregul.integr.compphysiol303(2012)yu，j.h.etal.，rna.11(2005)yu，k.etal.，plos.genet.4(2008)yue，c.etal.，int.jcancer136(2015)zamanian-daryoush，m.etal.，jbiol.ch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