背景技術(shù)：

干細(xì)胞是用于治療應(yīng)用、醫(yī)學(xué)研究、藥物測試等的有吸引力的細(xì)胞來源。不幸的是，細(xì)胞作為同種異體移植物的使用是有問題的。干細(xì)胞的擴(kuò)增至大量是細(xì)胞治療的先決條件，但是成體msc具有有限的增殖能力。這是現(xiàn)有技術(shù)中的公知常識，即用于來自骨髓(bm)分離的msc的主要方法是當(dāng)將全骨髓置于塑料培養(yǎng)皿中時其粘附在塑料上的能力，并且在4小時后，將非粘附細(xì)胞洗出。該規(guī)程還可以包括在具有低粘度和低滲透壓的高密度溶液(例如ficoll、percoll)中密度離心bm，以獲得含有msc的bm的單核部分。另外，來自固體組織(比如骨)的msc可以通過將小塊骨放置在瓶內(nèi)并通過骨外植體(explant)長出的細(xì)胞而分離。可選地，也可以使用膠原酶消化過程。然而，細(xì)胞與其它類型的細(xì)胞如造血干細(xì)胞的污染導(dǎo)致可能發(fā)生異質(zhì)群體，損害(compromising)msc樣本的純度。為了克服這個問題，已經(jīng)開發(fā)了兩種類似的技術(shù)，磁珠分選和熒光激活細(xì)胞分選(facs)。另外，熒光激活細(xì)胞分選(facs)是一種分離msc的方法。離體擴(kuò)增是msc分離后的下一個必要步驟，其允許msc的自由離體自動更新(renovation)，目標(biāo)是生產(chǎn)治療上顯著的細(xì)胞數(shù)量，這取決于幾個因素，比如供體依賴性(年齡、性別、創(chuàng)傷的存在和全身性疾病的存在)或方法依賴性。

即使msc可以在相對短的時間段內(nèi)由于快速增殖而極大地擴(kuò)增，然而在現(xiàn)有技術(shù)中沒有允許在沒有廣泛的體外培養(yǎng)的情況下，生產(chǎn)治療上相關(guān)數(shù)量的msc的方法，這意味著使用酶處理從瓶至瓶的多輪細(xì)胞傳代。在這種條件下的msc擴(kuò)增已經(jīng)顯示逐漸降低其msc最大分化潛能。廣泛的繼代培養(yǎng)(subcultivation)損害細(xì)胞的功能，導(dǎo)致與生長停滯和細(xì)胞凋亡相關(guān)的細(xì)胞衰老。另一方面，有數(shù)據(jù)表明延長的培養(yǎng)可導(dǎo)致自發(fā)的轉(zhuǎn)化獲得致瘤潛能。此外，顯示msc的特定特性在培養(yǎng)期間喪失。第5代和第10代以上的細(xì)胞與該代次以下的細(xì)胞相比，msc的心臟保護(hù)作用降低。這可以通過降低的血管內(nèi)皮生長因子釋放潛能來解釋(crisostomo等人，2006；digirolamo等人，1999；muraglia等人，2000；rubio等人，2005；stenderup等人，2003)。因此，現(xiàn)有技術(shù)中存在的所有方法應(yīng)該在擴(kuò)增細(xì)胞的產(chǎn)量和質(zhì)量之間做出折衷，這限制了它們在細(xì)胞治療中的使用。

本發(fā)明中描述的方法和細(xì)胞組合物克服了上述限制，比如多次細(xì)胞傳代、細(xì)胞衰老、分化降低和生長因子生產(chǎn)降低、冷凍保存細(xì)胞數(shù)量有限。相比之下，我們提供了降低細(xì)胞傳代、降低體外細(xì)胞操作和相應(yīng)增加分化能力和生長因子生產(chǎn)、穩(wěn)定的核型、實(shí)際上無限數(shù)量的冷凍保存的細(xì)胞。

引用的所有出版物、專利和專利出版物以所有目的通過引用整體并入本文。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明涉及在體外獲得和/或擴(kuò)增從外植體組織分離的干細(xì)胞群的方法。該方法優(yōu)選包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)組織至少一個收獲周期的步驟。收獲周期通常包括以下步驟：在外植體細(xì)胞的培養(yǎng)基中保持組織，持續(xù)足以獲得半?yún)R合干細(xì)胞培養(yǎng)物的時間段，并收集這些細(xì)胞用于最終的干細(xì)胞群。優(yōu)選地，在每個收獲周期之前，組織被最低程度的操作。

在具體實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及從外植體組織獲得原代衍生干細(xì)胞的擴(kuò)增群的體外方法，所述方法包括：

a.洗滌和最低程度操作外植體組織；

b.在具有培養(yǎng)基第一培養(yǎng)表面中在體外培養(yǎng)所述外植體組織以建立原代衍生干細(xì)胞的培養(yǎng)物；

c.從培養(yǎng)基收集原代衍生干細(xì)胞；和

d.將外植體組織轉(zhuǎn)移到具有培養(yǎng)基的第二培養(yǎng)表面；

e.用外植體組織重復(fù)步驟b、c和d至少一次，從而獲得從外植體組織原代衍生的擴(kuò)增的群。

優(yōu)選地，這些方法包括洗滌和最低程度操作外植體組織。優(yōu)選地，在每個收獲周期之前，外植體組織不被酶促或化學(xué)處理或解剖。優(yōu)選地，從外植體組織獲得原代衍生的干細(xì)胞的擴(kuò)增群的方法還包括在生長培養(yǎng)基上傳代原代衍生的干細(xì)胞并從生長培養(yǎng)基收集干細(xì)胞的步驟。傳代可以在每個收獲周期多次或結(jié)束后進(jìn)行。

所述方法可以進(jìn)一步包括傳代外植的細(xì)胞并在生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)傳代的細(xì)胞。在一些方面，在培養(yǎng)基中至少一個收獲周期培養(yǎng)組織包括最初在含有少于5％血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)組織，然后在含有15％血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)組織。在含有少于5％血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)組織的持續(xù)時間為3天。在含有15％血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)組織的持續(xù)時間為7天。在一些實(shí)施方案中，培養(yǎng)基和生長培養(yǎng)基是dmem，例如，培養(yǎng)基是dmem-f12和/或生長培養(yǎng)基是dmem-低葡萄糖(dmem-lowglucose)。在一些方面，生長培養(yǎng)基不補(bǔ)充非必需氨基酸。在一些實(shí)施方案中，外植的細(xì)胞和/或傳代細(xì)胞具有穩(wěn)定的核型。

本發(fā)明還涉及干細(xì)胞的治療組合物，其包含從至少第一收獲周期獲得的外植的細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，組合物包含從前3個收獲周期、前65個收獲周期或前100個收獲周期獲得的外植的細(xì)胞。在一些方面，組合物包含從至少第1代(p1)、從p1至p3或從p1至p50獲得的傳代的細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，組合物可以在冷凍條件下儲存，而在組合物解凍后不改變其干細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)。

在本發(fā)明的方法和組合物的一些實(shí)施方案中，干細(xì)胞是神經(jīng)嵴(neuronalcrest)或外周神經(jīng)系統(tǒng)起源。在一些方面，干細(xì)胞是成體或產(chǎn)后干細(xì)胞、非胚胎干細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，組織是牙髓或產(chǎn)后組織，例如臍帶或胎盤。

附圖說明

圖1描述了從臍帶(uc)分離干細(xì)胞的示意圖。a組描述了5cm的uc塊的分離。b組描述了uc組織的洗滌；c組描述了切成小塊的uc組織。d組表示已經(jīng)機(jī)械地轉(zhuǎn)移到基礎(chǔ)培養(yǎng)基中并在塑料培養(yǎng)板中培養(yǎng)的小塊uc組織。e組顯示培養(yǎng)表面上cd105陽性的干細(xì)胞的粘附。f組描述了間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)。

圖2描述了以工業(yè)規(guī)模培養(yǎng)干細(xì)胞的方法。

圖3描述了在生物技術(shù)、醫(yī)學(xué)、藥物、美容、營養(yǎng)等中使用的干細(xì)胞分離和機(jī)械轉(zhuǎn)移的非酶方法。

圖4描述了不同供體的片段的分離和這些片段在相同瓶中的共培養(yǎng)。從不同的hla匹配、部分匹配和/或不匹配的供體獲得的片段可以在相同的瓶中培養(yǎng)以生產(chǎn)msc，只要它們不表現(xiàn)任何免疫反應(yīng)的信號。

圖5描述了“一次”干細(xì)胞分離的組織來源冷凍保存的常規(guī)方法(a)和本申請的組織來源冷凍保存(b)。

圖6描述了正常msc與ep或ips細(xì)胞之間的主要差異。

圖7描述了hidpsc在兩種類型的生長培養(yǎng)基中的生長。

圖8描述了idpsc腹膜內(nèi)接種對感染mtb和牛分枝桿菌菌株(mbovis)的c57bl/6小鼠的肺細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子的作用。

圖9描述了通過熒光顯微鏡可視化的用于角膜移植的idpsc中的角膜緣(limbal)干細(xì)胞標(biāo)記物的免疫染色。比例尺表示50μm的距離。a組描述了idpsc中p63的核定位。b組是a組與dapi核染色的合并圖像。c組描述了整聯(lián)蛋白β1的膜定位。d組描述了波形蛋白、中間絲的檢測。e組描述了連接蛋白43的檢測，其是細(xì)胞膜蛋白。f組描述了abcg2(一種漿膜蛋白)的檢測。g組描述了k3/12的弱陽性免疫染色。h組描述了陰性對照。

圖10描述了在idpsc中角膜緣干細(xì)胞標(biāo)記物(abcg2、連接蛋白43和k12)的表達(dá)的rt-pcr分析。泳道1是100bp指示(ladder)。泳道2是人角膜組織樣本。泳道3是人角膜緣組織樣本。第4行是idpsc樣本。

圖11描述了牙髓中干細(xì)胞的龕。a組，齒由冠部和根部組成。b組顯示了牙髓的血管周圍的龕(a)和神經(jīng)叢(b)的位置。c組描述了在血管周圍的龕(a)和神經(jīng)叢(b)中巢蛋白的免疫染色。d組顯示了成牙質(zhì)細(xì)胞下(subodontoblastic)的龕(c)和無細(xì)胞和富含細(xì)胞的區(qū)域(d)的位置。e組和f組分別描述了在成牙質(zhì)細(xì)胞下的龕(c)和無細(xì)胞和富含細(xì)胞區(qū)域(d)中巢蛋白的免疫染色。

圖12描述了臍帶中神經(jīng)干細(xì)胞的推定龕。a組顯示了羊膜上皮中神經(jīng)絲(nf)的表達(dá)。b組顯示了靜脈中低親和力神經(jīng)生長因子(p75或cd271)的表達(dá)。c組顯示了從推定的神經(jīng)干細(xì)胞龕分離的干細(xì)胞的β-iii微管蛋白的陽性免疫染色。d組顯示從推定的神經(jīng)干細(xì)胞龕分離的干細(xì)胞的gfap的陽性免疫染色。

圖13描述了臍帶組織中不同的干細(xì)胞龕中轉(zhuǎn)錄因子比如oct3/4、nanog和sox2的表達(dá)。白色箭頭描述了表達(dá)這些轉(zhuǎn)錄因子的細(xì)胞，而黑色箭頭描述了缺乏這些轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)的細(xì)胞。

具體實(shí)施方式

美國專利申請公開號2004/0136967公開了從臍帶基質(zhì)獲得干細(xì)胞的方法，包括從臍帶的外植體分離細(xì)胞或者酶促游離(freeing)細(xì)胞，例如膠原酶或胰蛋白酶。然后用另一載玻片覆蓋組織切片并在完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)。因此，現(xiàn)有技術(shù)沒有教導(dǎo)外植體培養(yǎng)物的可重復(fù)使用。

與現(xiàn)有技術(shù)的擴(kuò)大干細(xì)胞群的方法不同，本發(fā)明使用多次收獲周期來增加培養(yǎng)的干細(xì)胞群。還不同于現(xiàn)有技術(shù)的方法，起源組織不被解剖(dissected)，而是機(jī)械地切片或磨碎用以重復(fù)的收獲周期。組織應(yīng)該被最低程度操作。收獲周期是指將組織轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)表面以建立例如干細(xì)胞的新的外植體培養(yǎng)物的周期。在本發(fā)明中，收獲的周期(用于干細(xì)胞來源的組織轉(zhuǎn)移)可以通過多次周期重復(fù)，例如1至100次轉(zhuǎn)移。多次收獲周期建立多次原代培養(yǎng)以提供具有獨(dú)特特征的干細(xì)胞的大規(guī)模供應(yīng)。換言之，本發(fā)明提供了穩(wěn)健的大規(guī)模培養(yǎng)干細(xì)胞的方法，其通過重復(fù)原代培養(yǎng)的從最低程度操作的組織來源收獲的干細(xì)胞，所述最低程度操作的組織來源通過相同組織的重復(fù)收獲周期。出乎意料地，重復(fù)收獲周期導(dǎo)致在每個周期中獲得的粘附細(xì)胞的數(shù)量增加。并且令人驚奇的是，我們發(fā)現(xiàn)通過重復(fù)的外植體培養(yǎng)，通過非酶促收獲暴露于含有抗生素/抗真菌劑和補(bǔ)充劑的培養(yǎng)生長培養(yǎng)基的最低程度操作的組織塊，我們可以多次啟動(initiate)第0代(p0)條件，由于在整個重復(fù)收獲周期提供足夠的干細(xì)胞數(shù)量期間低代次的核型穩(wěn)定性，提高了安全性的機(jī)會。

在現(xiàn)有技術(shù)中，對于非治療應(yīng)用，主要是診斷目的，部分已知最低程度操作組織的方法。特別地，這些目的包括培養(yǎng)器官(例如角膜)和組織外植體，用于有毒的、致癌的、治療物質(zhì)、生物制劑的作用評估或敏感性測試。最近，我們已經(jīng)公開了這種技術(shù)用于分離牙髓干細(xì)胞的應(yīng)用。這種方法的主要目的是保持培養(yǎng)的組織結(jié)構(gòu)，例如，實(shí)質(zhì)和間質(zhì)在其結(jié)構(gòu)和功能方面是保守的。因此，在培養(yǎng)期間的在體外的器官類似于在體內(nèi)的器官功能。此外，我們還利用培養(yǎng)外植體的方法用于從器官的塊分離細(xì)胞，這以前在現(xiàn)有技術(shù)中被用于診斷、篩選方法：分離的組織被分離，在無菌條件下最低程度處理，切成小塊并放置在含有培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)皿中。

外植體培養(yǎng)是這樣一種培養(yǎng)，即其中細(xì)胞留在其周圍細(xì)胞外基質(zhì)中，其更準(zhǔn)確地模擬在體內(nèi)干細(xì)胞/祖細(xì)胞從龕(niches)遷移到外部環(huán)境，并且祖細(xì)胞遷移出組織并粘附于培養(yǎng)皿的表面。兩種方法具有相似之處，因?yàn)樗鼈儽Ａ袅谁h(huán)境和干細(xì)胞龕。利用該方法用于干細(xì)胞擴(kuò)增是有益的，因?yàn)樵谂囵B(yǎng)時間下的組織經(jīng)受缺氧。然而，培養(yǎng)基提供了足夠的營養(yǎng)供應(yīng)以支持最低程度操作的組織的外植體細(xì)胞和組織內(nèi)的細(xì)胞保持在有活力的狀態(tài)。與現(xiàn)有技術(shù)的教導(dǎo)相比，這種益處是意想不到的，并且在保持干細(xì)胞的未分化狀態(tài)方面提供了巨大的優(yōu)勢。因此，作為小器官和外植體的牙髓的機(jī)械轉(zhuǎn)移是連續(xù)地分離干細(xì)胞以便在分離后保持其原始表征不變的策略。牙髓是松散的結(jié)締組織，并且該器官可以在重量上變化。dp更輕，趨于流動而沒有粘附和細(xì)胞長出(outgrowth)。為了加速髓組織對基底的附著，可以使用無菌蓋玻片，甚至提供更多的缺氧條件。使用蓋玻片是在多次收獲周期期間在組織干細(xì)胞龕內(nèi)誘導(dǎo)缺氧的另一個實(shí)例。

在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及從最低程度操作的組織通過至少一個收獲周期在體外擴(kuò)增至原代衍生和傳代的干細(xì)胞擴(kuò)增群的方法。在每個收獲周期期間，外植體細(xì)胞的數(shù)量是用經(jīng)典的酶促衍生的干細(xì)胞擴(kuò)增分離的細(xì)胞數(shù)目的至少兩倍。收獲周期的數(shù)量可以是至少三個周期(h1-h3)，至少65個周期(h1-h65)或高達(dá)100個收獲周期(h1-h100)。每個收獲周期包括在具有抗生素的補(bǔ)充的培養(yǎng)基中，將最低程度操作的組織片段(例如非酶促地或化學(xué)處理的，未解剖的)保持至外植體細(xì)胞，持續(xù)足以獲得半?yún)R合的干細(xì)胞培養(yǎng)物的時間段，并收集這些細(xì)胞用于最終干細(xì)胞群。這一代培養(yǎng)的細(xì)胞是收獲周期的原代(p0)。

所述方法包括洗滌最低程度操作的組織，并在體外保持組織至至少一次收獲，使得干細(xì)胞，比如各種類型的間充質(zhì)多能和多能干細(xì)胞附著于培養(yǎng)表面或珠。來自收獲周期的每個外植體培養(yǎng)物為p0，并且作為隨后傳代或生物反應(yīng)器系統(tǒng)的來源。外植體培養(yǎng)可以傳代多達(dá)50代。細(xì)胞可以酶促地或非酶促地傳代。在重復(fù)的收獲周期中，組織和細(xì)胞可以保持在含有抗微生物溶液的生長因子和/或dmem補(bǔ)充的生長培養(yǎng)基中。在一些方面，通過使用本發(fā)明的方法從一塊組織獲得的干細(xì)胞的總數(shù)是通過經(jīng)典的酶促衍生的干細(xì)胞擴(kuò)增可以獲得的干細(xì)胞的數(shù)量的至少三倍。在一些實(shí)施方案中，通過本發(fā)明的方法獲得的干細(xì)胞的總數(shù)量比通過經(jīng)典的酶促衍生的干細(xì)胞擴(kuò)增獲得的干細(xì)胞的數(shù)量至少3到至少65倍高。因此，本發(fā)明涉及與使用相同組織來源的經(jīng)典方法相比，增加從單一或混合供體的組織/液體來源獲得的干細(xì)胞數(shù)量的方法。

組織可以在建立外植體培養(yǎng)物之前冷凍保存。來自外植體培養(yǎng)和隨后代次的粘附細(xì)胞也可以被冷凍保存。冷凍后的細(xì)胞活力大于50-90％，這使得它們適合于工業(yè)和治療應(yīng)用。在該方法的一些方面，根據(jù)描述的方法，治療組合物獲得自多次收獲周期期間獲得的混合的冷凍-解凍的間充質(zhì)干細(xì)胞的批次。該批次可以包括來自混合的收獲周期或相同收獲周期的混合代次的細(xì)胞。用于研究和臨床應(yīng)用的一批細(xì)胞可以是包含來自不同收獲周期的p0細(xì)胞的組合物。

在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種細(xì)胞治療的方法，包括將根據(jù)本發(fā)明的方法分離的批次注射和/或植入人或動物的需要治療的位置。該批細(xì)胞可以來自不同收獲周期和代次直接冷凍庫存(stock)的混合細(xì)胞。該批次細(xì)胞也可以在施用至人或動物之前從冷凍庫存的細(xì)胞培養(yǎng)。在一些實(shí)施方案中，測試該批次細(xì)胞的靶向治療所需的功能參數(shù)，比如釋放的相關(guān)因子和/或測試的相關(guān)的生物標(biāo)記物。根據(jù)本發(fā)明的方法分離的最終干細(xì)胞群表達(dá)間充質(zhì)標(biāo)記物。最終的干細(xì)胞群還可以表達(dá)多能標(biāo)記物、神經(jīng)外胚層標(biāo)記物和/或周細(xì)胞標(biāo)記物。在一些實(shí)施方案中，優(yōu)選地，最終干細(xì)胞群表達(dá)間充質(zhì)和一些多能標(biāo)記物，尤其是神經(jīng)外胚層、上皮標(biāo)記物和/或周細(xì)胞標(biāo)記物。在一些實(shí)施方案中，優(yōu)選地，干細(xì)胞缺乏mhcii類表達(dá)，比如hlaii(hla-dr)表達(dá)。對于神經(jīng)元應(yīng)用，優(yōu)選的cns因子、測試的標(biāo)記物，比如β微管蛋白、sox2或sox10；或神經(jīng)元生長因子和肽，比如gdnf，ngf和bdnf。該批細(xì)胞可以具有測試的其分化能力。在一些方面，本發(fā)明還涉及用于細(xì)胞治療的緩沖的治療組合物，其中ph不是酸性和細(xì)胞毒性。

本發(fā)明的一個實(shí)施方案還涉及從最低程度操作組織在體外在擴(kuò)增培養(yǎng)中獲得原代干細(xì)胞的方法，其中所述組織不被化學(xué)品或酶處理或解剖完全分解。這些方法包括：從在細(xì)胞培養(yǎng)室中的所述組織連續(xù)地、周期性地或間歇地收獲粘附的干細(xì)胞，所述組織保持在含有抗微生物溶液的補(bǔ)充的生長培養(yǎng)基中，并從第一次收獲傳代培養(yǎng)的細(xì)胞，重復(fù)步驟。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，重復(fù)收獲步驟，并且對于每個收獲步驟，將傳代步驟重復(fù)至少一次、兩次或三次。多次收獲周期后培養(yǎng)物中產(chǎn)生的干細(xì)胞可以混合，并通過相關(guān)生物標(biāo)記物的質(zhì)量控制測試功能性。這些細(xì)胞可以在治療使用之前冷凍。

表1比較了從本發(fā)明的方法和現(xiàn)有技術(shù)的方法獲得的細(xì)胞的數(shù)量。

表1.從不同來源獲得的成體間充質(zhì)干細(xì)胞的比較：

在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括用抗生素和緩沖溶液從組織洗滌過量的血液，并對收集的組織進(jìn)行消毒。組織還被機(jī)械地分解(dissociated)成組織片段，其中組織被切割成無顯微鏡眼睛可見的塊。例如，組織片段應(yīng)當(dāng)大于1mm。將組織片段暴露于補(bǔ)充的培養(yǎng)基中。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，補(bǔ)充的培養(yǎng)基基于dmem，更優(yōu)選dmemf12。在幾次培養(yǎng)后，當(dāng)粘附的細(xì)胞達(dá)到半?yún)R合時，將組織片段轉(zhuǎn)移到新平板用于另一個收獲周期。

在一些實(shí)施方案中，每個收獲周期后的干細(xì)胞(p0)培養(yǎng)多代次，以擴(kuò)增培養(yǎng)物中干細(xì)胞的數(shù)量。干細(xì)胞可以傳3代、15代或50代，同時保持正常核型。在一些實(shí)施方案中，在每個重復(fù)周期中，干細(xì)胞獲得自前述重復(fù)周期的來自幾個供體或來自相同供體的幾次取樣(例如來自相同供體的乳牙牙髓，通過外科手術(shù)的不同組織取樣)混合的組織塊。來源組織可以新鮮獲得，或者在細(xì)胞庫、冷凍保存后解凍獲得。

在外植體收獲之后，未分化或分化的細(xì)胞的酶促分裂/傳代可以在現(xiàn)有技術(shù)中已知的經(jīng)典細(xì)胞培養(yǎng)條件下，或在生物反應(yīng)器條件下，在無菌塑料瓶、玻璃器皿、無菌袋、微載體(micro-carries)、微纖維反應(yīng)器等中進(jìn)行。

在一個實(shí)施方案中，可以通過機(jī)械轉(zhuǎn)移、營養(yǎng)不足和缺氧條件加速干細(xì)胞擴(kuò)增的方法。在一些實(shí)施方案中，該方法包括以下步驟：

(i)獲得產(chǎn)后、年輕或成體間充質(zhì)細(xì)胞和前體干細(xì)胞，其來自最低程度操作的組織(優(yōu)選分離自含有神經(jīng)外胚層起源的干細(xì)胞龕的細(xì)胞和周細(xì)胞的組織，或/和上皮來源的組織，即牙組織、產(chǎn)后組織，比如胎盤、羊膜、臍帶；毛囊和外胚層(under-extodermal)來源的脂肪組織等。

(ii)其中所述組織基本上被測試活力，用抗生素、抗真菌條件保持，基本上清除血液，機(jī)械分離成小塊(優(yōu)選約0.5-5mm以便暴露于補(bǔ)充培養(yǎng)基)。

(iii)來自最低程度操作的組織的所述干細(xì)胞集落形成是在非酶促地/機(jī)械方法下進(jìn)行的。

(iv)所述集落形成基本上通過機(jī)械操作和培養(yǎng)基暴露以及細(xì)胞粘附于塑料器皿、珠或粘附表面誘導(dǎo)，其中所述集落起始發(fā)生在缺氧/饑餓壓力條件、低血清培養(yǎng)基5％或更低下約第3天或更晚，或在正常培養(yǎng)生長條件下更晚起始。

(v)重復(fù)多次收獲提供具有高細(xì)胞數(shù)量的低傳代數(shù)的用途，其中每個收獲發(fā)生新的原代培養(yǎng)，其中在最初收獲后組織尺寸減小，從隨后收獲的細(xì)胞收獲壓力和持續(xù)時間比最初原代收獲培養(yǎng)快約兩倍。

(vi)從這種最低程度操作的組織獲得的所述細(xì)胞與起源于模擬體內(nèi)條件的多干細(xì)胞龕在體內(nèi)和體外表達(dá)相同的標(biāo)記物。

(vii)所述集落形成的術(shù)語(term)可以在壓力-缺氧條件下被基本上誘導(dǎo)和加速至少兩倍，所述壓力-缺氧條件可以由化學(xué)壓力例如缺氧、機(jī)械壓力例如在蓋玻片壓力；或/和補(bǔ)充饑餓下誘導(dǎo)，優(yōu)選血清5％和更少(參見下面的實(shí)施例ms2)。

(viii)來自多次重復(fù)收獲的干細(xì)胞的原代收獲的集落形成單位后被酶促或非酶促傳代后，暴露于適于細(xì)胞增殖的條件，其中在優(yōu)選實(shí)施例中，血清補(bǔ)充為約15％，或進(jìn)行生長因子和額外的補(bǔ)充。如果使用本領(lǐng)域公知的低葡萄糖dmem以加速缺氧/壓力條件，所述增殖可以顯著加速(參見下面的實(shí)施例ms3)。

用于細(xì)胞治療的移植可在緩沖的藥物組合物、水凝膠、植入支架內(nèi)進(jìn)行，具有或不具有額外的活性添加劑或協(xié)同的藥物或生物成分等。

所獲得的細(xì)胞可以通過單次但優(yōu)選重復(fù)的施用方式通過全身或/和局部施用途徑施用細(xì)胞來用于各種細(xì)胞治療應(yīng)用，如下面實(shí)施例中所示的，在狗中多發(fā)性硬化治療等治療中，其中通過2-3次，優(yōu)選>2次，3次或4次重復(fù)注射細(xì)胞獲得最佳結(jié)果，以改善癥狀。在更優(yōu)選的方法中，應(yīng)當(dāng)在疾病的相對早期階段施用細(xì)胞，其中過程的可逆性可以通過細(xì)胞治療調(diào)節(jié)。

以上列出的優(yōu)勢將被轉(zhuǎn)化為多種客戶利益：

·預(yù)期允許穩(wěn)健和可重復(fù)的工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)明確定義和表征的干細(xì)胞

·來自早期代次的高質(zhì)量的起始材料用于未來生物反應(yīng)器擴(kuò)增

·cellavita細(xì)胞的獨(dú)特的蛋白表達(dá)模式允許簡單和標(biāo)準(zhǔn)化的表征

圖3顯示了干細(xì)胞分離和片段的機(jī)械轉(zhuǎn)移的非酶促方法的可能應(yīng)用。細(xì)胞或分離的片段可以被凍干、沉淀、提取和純化或進(jìn)一步加工以分離生物活性分子。這些分子可以用作新的未知分子的測序和合成的模板，以產(chǎn)生用于美容(aesthetic)(恢復(fù)青春(rejuvenation))外部和內(nèi)部使用的“混合物(cocktails)”或治療霜劑。另一方面，msc可用于治療各種疾病、損傷和創(chuàng)傷，如干細(xì)胞治療。這些細(xì)胞還可以用作在癌癥治療中遞送各種治療或自殺分子的載體。這些細(xì)胞還可用于遺傳和組織工程，具有或不具有支持物(或支架)的器官打印，以及與多種疾病中的其它類型的細(xì)胞和/或干細(xì)胞組合。

然而，我們發(fā)現(xiàn)分離的干細(xì)胞的最終群可以同時表現(xiàn)相似但也明確的特性，如表2所示，根據(jù)干細(xì)胞龕，其可以影響干細(xì)胞特性。

表2.uc和dp組織中的不同的干細(xì)胞龕

雖然表2顯示了兩種組織的實(shí)例，但是本公開不限于這些組織，并且可以包括任何類型的組織：

a.衍生自胚胎外胚層和神經(jīng)嵴(舌下和下頜下組織、唾液和淚腺、牙乳頭、齒葉(dentallamina)、hertwig上皮根鞘、牙囊、牙周韌帶、皮膚、胎記等)；

b.衍生自胚外中胚層(卵黃囊和羊膜、臍帶、胎盤和胎膜)；和

c.衍生自胚胎中胚層(脂肪組織和骨髓)。

所有這些組織可以用作片段的來源，其可以根據(jù)圖1和2加工，并根據(jù)圖3和4使用。

在a，b，c中描述的，但不限于這些實(shí)例，從不同組織來源獲得的每種干細(xì)胞類型可用于各種目的和多種適應(yīng)癥的細(xì)胞治療和再生醫(yī)學(xué)。同時，一旦這些干細(xì)胞具有不同的胚胎起源，它們可以組合使用以便在治療性治療中提供增強(qiáng)的或協(xié)同的或補(bǔ)充的作用。示例性組織來源包括：臍帶、牙/牙周組織、下頜組織、粘膜組織、胃腸組織、胎盤、羊水或羊膜囊、神經(jīng)元組織(例如含有神經(jīng)或神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的組織)、從神經(jīng)嵴或周圍神經(jīng)系統(tǒng)起源、肌肉、骨、皮膚(真皮、表皮、含角質(zhì)細(xì)胞或含黑素細(xì)胞的組織、包皮、整形手術(shù)或活檢衍生的皮膚)、脂肪的/脂肪組織、血液和其它體液、乳腺組織、內(nèi)皮組織、睪丸組織、卵巢、心臟組織、肝臟、骨組織、肺組織，唾液腺組織、胰腺組織、心臟和脾衍生的組織。

干細(xì)胞分離和機(jī)械轉(zhuǎn)移的非酶促方法也可以擴(kuò)展到具有最低程度變異的其它組織，比如臍帶(圖1)。例如，從臍帶(uc)分離5cm的塊(圖1a)，用無菌溶液如生理鹽水溶液洗滌以便除去過量的血液過量(圖1b)。將最初的uc組織塊切成甚至更小的組織片段用于培養(yǎng)(c組)，并機(jī)械地轉(zhuǎn)移到基礎(chǔ)培養(yǎng)基中(圖1d)?；A(chǔ)培養(yǎng)基可以對于每種類型的干細(xì)胞是特異性的，其具體制劑取決于組織起源。cd105陽性的干細(xì)胞從組織遷移以粘附到培養(yǎng)表面上(圖1e)。在圖1f中，可觀察到起源自小uc組織片段的間充質(zhì)干細(xì)胞(msc)的培養(yǎng)物。

該方法可以容易地轉(zhuǎn)化為工業(yè)規(guī)模培養(yǎng)，如圖2所示。從uc分離多個片段并置于各種培養(yǎng)瓶中用于msc生產(chǎn)。在體外擴(kuò)增后，使用酶處理這些細(xì)胞，其可以用于細(xì)胞治療和用于其它目的。uc片段的幾種機(jī)械轉(zhuǎn)移可以提供大量的msc，其可以用于生產(chǎn)生物活性分子。

本發(fā)明的另一個實(shí)施方案涉及包括根據(jù)該方法分離的干細(xì)胞對患者的治療方案。該方案開始于全身施用干細(xì)胞以保護(hù)性地調(diào)節(jié)患者的免疫和炎癥狀態(tài)。當(dāng)通過測量患者中的細(xì)胞因子和免疫球蛋白和其它免疫調(diào)節(jié)因子(例如用血液測試)證實(shí)抗炎免疫調(diào)節(jié)作用時，可以將干細(xì)胞的局部植入用于再生細(xì)胞療法。

功能測定可以包括協(xié)同因子的表征，比如例如疾病的抗炎、抗微生物和再生，所述疾病可以具有感染的風(fēng)險，比如醫(yī)院感染、傷口愈合，比如糖尿病性潰瘍、手術(shù)傷口等。

在優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用細(xì)胞療法治療的cellavita技術(shù)應(yīng)當(dāng)與患者接受的其它可接受的醫(yī)學(xué)和支持治療輔助進(jìn)行，但是輔助藥物的體外相容性應(yīng)當(dāng)被測試為不抑制細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)和再生潛能。例如，抗生素、類固醇、抗增殖和免疫抑制劑可以是有毒的，或抑制細(xì)胞活性，因此該方案應(yīng)當(dāng)調(diào)整到相關(guān)的治療方案。

本公開、其方面和實(shí)施方案不限于本文公開的具體材料類型、成分、方法或其它實(shí)施例?，F(xiàn)有技術(shù)中已知的許多額外的材料類型、成分、方法和規(guī)程被預(yù)期用于來自本公開的特定實(shí)施方案。因此，例如，盡管公開了特定的實(shí)施方案，但是這樣的實(shí)施方案和實(shí)施方案的成分可以包括任何與預(yù)期的操作一致的成分、模型、類型、材料、單元、版本、數(shù)量和/或如現(xiàn)有技術(shù)中已知的用于這樣的系統(tǒng)和實(shí)施方案成分。

詞語“示例性”、“實(shí)施例”或其各種形式，在本文中用于表示用作實(shí)施例、實(shí)例或說明。在本文中被描述為“示例性”或“實(shí)施例”的任何方面或設(shè)計(jì)不一定被解釋為相對于其它方面或設(shè)計(jì)是優(yōu)選的或有利的。此外，提供實(shí)施例僅用于清楚和理解的目的，并且不意味著以任何方式限制或約束所公開的主題或本公開的相關(guān)部分。應(yīng)當(dāng)理解，可以表現(xiàn)不同范圍的大量附加或替代實(shí)施例，但為了簡潔的目的已經(jīng)省略。

雖然本公開包括許多不同形式的實(shí)施方案，但是在附圖中示出并且在本文中將詳細(xì)描述特定的實(shí)施方案，應(yīng)理解本公開被認(rèn)為是所公開的方法和系統(tǒng)的原理的實(shí)施例，并不旨在將所公開的概念的廣泛方面限于所示的實(shí)施例。

實(shí)施例

實(shí)施例1：牙髓的活力

maheral-atariabou-asi等人(2011)聲稱根據(jù)kerkis等人，2006的出版物從牙髓(dp)提取的多能細(xì)胞的起源不能是牙髓，因?yàn)?至7歲的患者不具有牙髓，而是所謂的牙胚，所述牙胚是未分化細(xì)胞的聚集體，其將形成具有不同部分的未來的牙齒：牙釉質(zhì)、牙髓、牙齦(gum)、牙骨質(zhì)、骨、血管和神經(jīng)。然而，cordeiro等人(2008)發(fā)現(xiàn)人類脫落的乳牙的干細(xì)胞在體內(nèi)產(chǎn)生dp樣組織。作者將在人牙切片內(nèi)制備的生物可降解支架中種植的shed移植到免疫缺陷小鼠中。他們觀察到由這些細(xì)胞形成組織，證明了與生理的dp很類似的結(jié)構(gòu)和細(xì)胞性。透射電子顯微鏡和免疫組織化學(xué)對牙本質(zhì)涎蛋白的超微結(jié)構(gòu)分析表明shed在體內(nèi)分化為成牙質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞。值得注意的是，shed也分化為內(nèi)皮樣細(xì)胞，如通過用穩(wěn)定地轉(zhuǎn)導(dǎo)有l(wèi)acz的shed工程化的組織中，含血的血管壁內(nèi)襯細(xì)胞的β-半乳糖苷酶染色所證明的。這項(xiàng)工作表明脫落的乳牙構(gòu)成用于dp組織工程的干細(xì)胞的可行來源。

基于提取時髓的顏色，我們在細(xì)胞培養(yǎng)之前篩選有活力的髓。脫落的牙齒應(yīng)具有紅色的髓，作為細(xì)胞活力的指示。紅色指示直到取出的時候髓接受血流。如果髓是灰色的，則可能流入髓的血流已被損害。因此，干細(xì)胞可能壞死并且不再具有恢復(fù)活力(arora等人，2009)。

在接受由倫理委員會(在歐洲的helsinki，在美國的ibr)批準(zhǔn)的知情同意之后，在含有50％青霉素/鏈霉素溶液(100單位/ml青霉素，100單位/ml鏈霉素)和50％磷酸鹽緩沖生理鹽水(pbs)的無菌溶液中重復(fù)洗滌來自健康受試者的新鮮提取的乳牙，進(jìn)行髓提取和培養(yǎng)實(shí)例，再次洗滌新鮮提取的髓，并在補(bǔ)充有3-20％胎牛血清(fbs)、100單位/ml青霉素、100單位/ml鏈霉素的dp組織保持培養(yǎng)基中進(jìn)行髓的活力測試。一旦從最低程度操作的牙髓開始集落形成并且細(xì)胞附著于塑料細(xì)胞培養(yǎng)表面，在重復(fù)隨后的收獲周期之前進(jìn)行安全性測試(無菌性測試和支原體測試)，和或通過傳代來擴(kuò)增細(xì)胞和或冷凍保存組織或細(xì)胞。

如下進(jìn)行髓提取和培養(yǎng)：

·在含有50％青霉素/鏈霉素溶液(100單位/ml青霉素，100單位/ml鏈霉素)和50％磷酸鹽緩沖生理鹽水(pbs)的無菌溶液中重復(fù)洗滌來自健康受試者的新鮮提取的乳牙。

·采用無菌針頭從牙齒取出dp。在含有3％青霉素/鏈霉素的溶液中洗滌新鮮提取的髓。在補(bǔ)充有15％胎牛血清(fbs，hyclone)、100單位/ml青霉素、100單位/ml鏈霉素、2mml-谷氨酰胺和2mm非必需氨基酸的dp組織保持培養(yǎng)基中進(jìn)行髓的活力測試。

·一旦牙髓附著到塑料細(xì)胞培養(yǎng)表面，將從5天到兩周觀察到集落形成。

·進(jìn)行的安全測試為無菌測試和支原體測試。

實(shí)施例2：來自牙髓外植體的干細(xì)胞

在最近的牙起源衍生的干細(xì)胞綜述中(deepaponnaiyan2014)詳細(xì)描述的牙組織的不同實(shí)例描述了來自牙組織的干細(xì)胞的生物標(biāo)志物的不同表征，比如牙髓干細(xì)胞、牙周韌帶干細(xì)胞、來自人脫落的乳牙的干細(xì)胞，來自根尖乳頭的牙囊祖細(xì)胞干細(xì)胞，口腔骨膜干細(xì)胞和最近的來自牙齦結(jié)締組織的。引人注目地，大多數(shù)標(biāo)記物在不同的牙干細(xì)胞之間是相似的，但是notch和cd29標(biāo)記物在來自各種牙源的干細(xì)胞之間的表達(dá)不同。通過我們公開的方法獲得的細(xì)胞的體外和體內(nèi)標(biāo)記物表達(dá)是相同的。

實(shí)施例3：來自在早期代次重復(fù)收獲的畸胎瘤形成人idpsc

畸胎瘤形成是確定細(xì)胞比如胚胎干細(xì)胞(es細(xì)胞)或誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(ips細(xì)胞)的多能性的重要工具。我們的研究使用與gropp等人(2012)最近公開的規(guī)程類似的用于評估細(xì)胞畸胎瘤形成能力的一致規(guī)程。當(dāng)10⁶個細(xì)胞(gropp等人使用10⁵個細(xì)胞)的小鼠es細(xì)胞和人ips細(xì)胞用人工基底膜(matrigel)皮下共移植到免疫缺陷小鼠中時，我們的方法顯示高度可重復(fù)和有效。在100％的情況下，我們觀察到大量動物中的畸胎瘤形成，甚至在移植后直到6個月的隨訪檢查中。我們使用這種方法進(jìn)行其它成體間充質(zhì)干細(xì)胞(msc)的生物安全性分析，比如衍生自乳牙的牙髓、臍帶、脂肪組織等的那些。除了這里描述的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，使用也部分表達(dá)多能標(biāo)記物的來自骨髓、肝、卵黃囊、尿囊和羊水的狗胎兒msc驗(yàn)證了該方法。

畸胎瘤測定方法：

監(jiān)測腫瘤的發(fā)展4個月(～16周)。對于多能細(xì)胞，畸胎瘤的組織學(xué)標(biāo)準(zhǔn)是發(fā)生衍生自所有三個胚層的組織。該分析由病理學(xué)家進(jìn)行。對于成體/間充質(zhì)干細(xì)胞，考慮在細(xì)胞注射部位的正常組織完整性的任何類型或任何變化。

結(jié)果

實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)：

a.小鼠胚胎干細(xì)胞

b.小鼠3t3成纖維細(xì)胞

c.永久的小鼠細(xì)胞系balbc3t3細(xì)胞系，克隆a31

d.人類ips-idpsc

e.人類es細(xì)胞

f.人類idpsc

我們在多種研究中使用前述方法來表征由我們建立的不同小鼠es細(xì)胞系多能性，以及確認(rèn)在第25代以上的es細(xì)胞多能性，以及用于表征從小鼠es細(xì)胞系獲得的亞克隆(sukoyan等人，2002；carta等人，2006；kerkis等人，2007；lavagnolli等人，2007；hayshi等人，2010)。此外，在我們小組最近的出版物中(-braga等人，2011)，該方法用于表征衍生自未成熟牙髓干細(xì)胞(idpsc)的ips細(xì)胞的多能性。在該出版物中，人idpsc用作ips-idpsc的對照。我們表明ips-idpsc形成具有起源于所有三個胚層的組織的畸胎瘤，而idpsc不能夠產(chǎn)生任何類型的畸胎瘤或任何其它類型的腫瘤。

實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)：

a.在早期(n＝10)和晚期代次(n＝10)的idpsc三種不同的原代培養(yǎng)物

b.人原代成纖維細(xì)胞

我們先前報道了idpsc群的分離，其在至少前25代期間，其表達(dá)胚胎干細(xì)胞標(biāo)記物oct-4、nanog、ssea-3、ssea-4、tra-1-60和tra-1-81以及幾種間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記物，同時保持正常核型和干細(xì)胞擴(kuò)增的表征速率。此外，在化學(xué)上確定的培養(yǎng)條件下，這些細(xì)胞可以在體外誘導(dǎo)，經(jīng)歷一致的分化成平滑和骨骼肌、神經(jīng)元、軟骨和骨。盡管idpsc具有小尺寸，并且在細(xì)胞質(zhì)中細(xì)胞器缺乏(paucity)，但它們與表現(xiàn)典型間充質(zhì)/成纖維細(xì)胞樣形態(tài)的天然多能細(xì)胞不同(lizier等人，2012)。idpsc是間充質(zhì)的，與es和ips細(xì)胞不同，其是上皮的(圖5)。msc細(xì)胞和es細(xì)胞(或ips細(xì)胞)之間的主要區(qū)別是msc正在遷移、可塑(plastic)和錨定(anchoring)。msc細(xì)胞合成細(xì)胞外基質(zhì)并且是無細(xì)胞連接的細(xì)胞。

腫瘤形成與上述es和ips細(xì)胞有關(guān)，但與正常msc無關(guān)。idpsc由具有可變數(shù)量的(1-25％的細(xì)胞)表達(dá)多能標(biāo)記物的干細(xì)胞的msc群體組成(kerkis等人，2006；lizier等人，2012)。該規(guī)程適用于idpsc的群體，尤其是使用的細(xì)胞數(shù)方面，其基于20％的idpsc表達(dá)的多能標(biāo)記物計(jì)算。評估5×10⁶的idpsc的致畸性，而不是測試10⁶細(xì)胞。雖然在所有研究的器官中發(fā)現(xiàn)idpscdna的存在，但沒有觀察到腫瘤形成或任何形態(tài)學(xué)改變(lizier等人)。

實(shí)施例4：主要干細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)模式不受牙髓(dp)的冷凍保存影響

由于來自臍帶、羊膜囊、胎盤的新生細(xì)胞和來自牙髓的年輕干細(xì)胞的不成熟性，當(dāng)與它們的成體對照物(骨髓和脂肪組織)相比時，它們顯示出更高的增殖能力和更高的擴(kuò)增率。因此，來自臍帶、羊膜囊、胎盤和牙髓的細(xì)胞可以冷凍保存以備將來用作同種異體治療(組織片段和/或細(xì)胞最初冷凍保存在冰箱(約-80℃)隨后在液氮中(約-196℃))。

我們發(fā)現(xiàn)，在冷凍保存和解凍外植體之前和之后，收獲的細(xì)胞保持相同模式的因子表達(dá)。我們已經(jīng)顯示衍生自最低程度操作的外植體的細(xì)胞，其來自冷凍保存前和后的牙髓和臍帶的重復(fù)收獲長期培養(yǎng)，表達(dá)間充質(zhì)標(biāo)記物(即cd73、cd105、cd90)不表達(dá)造血標(biāo)記物(即cd34、cd45)，并且不表達(dá)至少一種組織相容性標(biāo)記物——hla-dr，并且保持核型穩(wěn)定性，保持多能性(與誘導(dǎo)因子比如視黃酸、bmp-tnf、ngf等培養(yǎng)，分化成不同的譜系包括神經(jīng)元)。

例如，從乳牙中取出的牙髓冷凍保存，然后解凍以分離idpsc。將idpsc培養(yǎng)至收獲0/3代(h0p3)，并通過facs分析與來自新鮮dp的相同代次的hidpsc進(jìn)行比較。發(fā)現(xiàn)兩種細(xì)胞的表達(dá)模式相似(表3)。兩種idpsc對于間充質(zhì)標(biāo)記物(cd105、cd73、cd90)的表達(dá)是陽性的，并且對于造血標(biāo)記物cd45和組織相容性標(biāo)記物hla-dr的表達(dá)是陰性的。

表3.牙髓冷凍保存對hidpsc表型表征的影響

實(shí)施例5：生長培養(yǎng)基對hidpsc生長速率的影響

為了評價用于培養(yǎng)hidpsc的最佳生長條件，在兩種類型的生長培養(yǎng)基中接種等量細(xì)胞并培養(yǎng)5天(表4)。發(fā)現(xiàn)在第2類型的生長培養(yǎng)基中的細(xì)胞生長速率更高(兩倍)(圖7)，因此由dmem-低葡萄糖和補(bǔ)充有15％fbs組成的生長培養(yǎng)基對于細(xì)胞培養(yǎng)是更優(yōu)的。

表4.所使用的各種培養(yǎng)基的組成

實(shí)施例5：從牙髓(dp)起始細(xì)胞的萌發(fā)(sprouting)

在組織培養(yǎng)物中保持dp的兩個相等片段。片段之一在15％fbs存在下培養(yǎng)，另一個在血清饑餓壓力條件(4.8％fbs)下培養(yǎng)。在4.8％fbs存在下，從dp起始細(xì)胞萌發(fā)為3天，在15％fbs存在下為7天。因此，血清饑餓可以減少髓轉(zhuǎn)移所需的時間。因此，在血清饑餓培養(yǎng)基存在下，從牙髓起始細(xì)胞萌發(fā)更快。

實(shí)施例7：晚期群(lp)hidpsc的旁分泌作用包括抗炎、免疫調(diào)節(jié)和抗微生物特性

msc通過旁分泌機(jī)制輔助并通過抗炎和免疫調(diào)節(jié)機(jī)制調(diào)節(jié)再生環(huán)境。

idpsc腹膜內(nèi)接種對靜脈注射感染毒力不同的結(jié)核分枝桿菌(mycobacteriatuberculosis，mtb)和牛分枝桿菌(mycobacteriaumbovis)菌株的c57bl/6小鼠的肺細(xì)胞的細(xì)胞因子產(chǎn)生的作用。如bioplex測試數(shù)據(jù)所示，idpsc接種降低受感染的肺細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子(圖8)。在感染高毒力mtb菌株的肺中觀察到促炎癥(tnf-α，il-1b，mip-2，il-17)和抗炎(il-10)細(xì)胞因子的強(qiáng)烈降低。ifn-g和kc產(chǎn)生的降低較不明顯。僅在接種idpsc的小鼠中觀察到il-4產(chǎn)生的誘導(dǎo)。

腫瘤壞死因子(tnf，cachexin或惡液質(zhì)素，以前稱為腫瘤壞死因子α或tnfα)是參與全身性炎癥的脂肪因子。tnf的主要作用是調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞。tnf是內(nèi)源性熱原，能夠誘導(dǎo)發(fā)熱、凋亡性細(xì)胞死亡、惡病質(zhì)、炎癥并抑制腫瘤發(fā)生和病毒復(fù)制，并通過il1和il6生產(chǎn)細(xì)胞對敗血癥應(yīng)答。tnf生產(chǎn)的調(diào)節(jié)異常涉及多種人類疾病，包括阿爾茨海默氏病。

干擾素γ(ifnγ或ifn-g)是二聚化可溶性細(xì)胞因子，其是干擾素類ii型的唯一成員，被稱為免疫干擾素，一種對于針對病毒和細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌感染和腫瘤控制的先天性和適應(yīng)性免疫關(guān)鍵的細(xì)胞因子。ifnγ是巨噬細(xì)胞的重要活化劑。異常ifnγ表達(dá)與許多炎性和自身免疫性疾病相關(guān)。ifnγ在免疫系統(tǒng)中的重要性部分來自ifnγ直接抑制病毒復(fù)制的能力，并且最重要的是來自ifnγ的免疫刺激和免疫調(diào)節(jié)作用。

白細(xì)胞介素17是通過增加各種組織中的趨化因子生產(chǎn)以將單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞募集到炎癥位點(diǎn)、在遲發(fā)型反應(yīng)中充當(dāng)有效調(diào)節(jié)子的細(xì)胞因子，類似于ifnγ。白細(xì)胞介素17是響應(yīng)于細(xì)胞外病原體侵入免疫系統(tǒng)并誘導(dǎo)病原體細(xì)胞基質(zhì)破壞的促炎細(xì)胞因子。

白細(xì)胞介素-1β(il-1β)也稱為分解代謝物，是一種炎癥響應(yīng)的重要調(diào)節(jié)子的細(xì)胞因子蛋白。它參與多種細(xì)胞活動，包括細(xì)胞增殖、分化和凋亡。il-17最顯著的作用是其參與誘導(dǎo)和調(diào)節(jié)促炎癥響應(yīng)。il-17通常與過敏反應(yīng)相關(guān)。

白細(xì)胞介素-10(il-10)，也稱為人細(xì)胞因子合成抑制因子(csif)，是一種抗炎細(xì)胞因子。il-10是在免疫調(diào)節(jié)和炎癥中具有多效作用的細(xì)胞因子。

趨化因子配體2(cxcl2)也稱為巨噬細(xì)胞炎癥蛋白2(mip-2)，在調(diào)節(jié)中性粒細(xì)胞炎癥響應(yīng)中起主要作用，并且是敗血癥發(fā)展中的調(diào)節(jié)子。kc和巨噬細(xì)胞炎癥蛋白-2(mip-2)是具有c-x-c基序的趨化因子，其在外科損傷后在皮膚中表現(xiàn)出不同的時間模式的表達(dá)。kc和mip-2是中性粒細(xì)胞的化學(xué)引誘物。已知兩種趨化因子在廣譜的急性和慢性炎性情況中表達(dá)，并且被認(rèn)為是確保炎癥反應(yīng)的性質(zhì)和量級的關(guān)鍵決定因素。

實(shí)施例8：通過最低程度操作的組織的多次收獲(lp)獲得的hidpsc的穩(wěn)健的免疫調(diào)節(jié)能力

當(dāng)衍生自單核細(xì)胞衍生的樹突細(xì)胞衍生的共培養(yǎng)時，idpsc呈現(xiàn)免疫調(diào)節(jié)作用。共培養(yǎng)導(dǎo)致lint增殖的能力降低(50％和更多)，并誘導(dǎo)lint分化，使lintcd4⁺/foxp3⁺/il10⁺和lintcd4⁺/foxp3⁺/ifn-γ⁺細(xì)胞的比例顯著增加。在idpsc中沒有觀察到hla-dr表達(dá)的作用。

我們已經(jīng)證明，盡管從最低程度操作的組織重復(fù)收獲獲得的干細(xì)胞(cellavita方法)表達(dá)大多數(shù)多能標(biāo)記物，但是這些干細(xì)胞注射到小鼠中不形成畸胎瘤。

表5.各種哺乳動物物種之間的hidpsc處理的比較，使用新鮮培養(yǎng)衍生的細(xì)胞模型和形成冷凍保存的髓和細(xì)胞的細(xì)胞模型

實(shí)施例9：牙髓中新神經(jīng)叢和成牙質(zhì)細(xì)胞下干細(xì)胞龕的發(fā)現(xiàn)

早期神經(jīng)元標(biāo)記物巢蛋白的免疫染色顯示神經(jīng)叢、血管周圍的龕和成牙質(zhì)細(xì)胞下的龕之間的表達(dá)差異。神經(jīng)叢中的細(xì)胞的巢蛋白呈陽性(圖11c，b)，而血管周圍的龕中的細(xì)胞的巢蛋白呈陰性(圖11c，a)。盡管無細(xì)胞和富含細(xì)胞區(qū)域的龕的巢蛋白是陰性的(圖11d，d和11f，d)，但是成牙質(zhì)細(xì)胞下的龕中的細(xì)胞的巢蛋白也是陽性的(圖11d，c和11e，c)

實(shí)施例10：臍帶中干細(xì)胞的推定的龕的發(fā)現(xiàn)

通過檢測神經(jīng)絲(nf)和低親和力神經(jīng)生長因子受體(p75或cd271)檢測臍帶中的推定干細(xì)胞龕。nf是在神經(jīng)元中發(fā)現(xiàn)的10nm的絲或中間絲。cd271是神經(jīng)營養(yǎng)因子的兩種受體類型之一，其是刺激神經(jīng)元細(xì)胞存活和分化的蛋白質(zhì)生長因子家族。在臍帶組織中發(fā)現(xiàn)nf和cd271。nf的表達(dá)主要在羊膜上皮區(qū)域(圖12a)，而cd271的表達(dá)主要在靜脈和動脈中(圖12b)。從這些龕分離的干細(xì)胞能夠進(jìn)行神經(jīng)元分化，在體外表達(dá)β-iii微管蛋白和膠質(zhì)纖維酸性蛋白(gfap)(圖12c和12d)。

實(shí)施例11：臍帶中多能干細(xì)胞或未成熟前體龕的發(fā)現(xiàn)

檢測到轉(zhuǎn)錄因子，比如oct3/4、nanog和sox2的表達(dá)。使用核定位在wj、靜脈(ve)、動脈(ar)的細(xì)胞中以及在定位于羊膜上皮(aep)的基底層(bl)的細(xì)胞中，適當(dāng)?shù)貦z測到oct3/4蛋白表達(dá)(圖13)。檢測到少量核中表達(dá)所有這三種標(biāo)記物的細(xì)胞，類似于多能干細(xì)胞。因此，我們可以預(yù)測分離了來自ve或ar和來自臍帶的aep的少量“真正的”多能干細(xì)胞。這些細(xì)胞也可以在其它相關(guān)組織中發(fā)現(xiàn)，比如胎盤和衍生自胚外中胚層的組織。

實(shí)施例12：安全性測定-在幾次機(jī)械轉(zhuǎn)移后干細(xì)胞龕的體外培養(yǎng)

眾所周知，干細(xì)胞位于人體的特定解剖部位，稱為干細(xì)胞龕(scn)。每個組織具有其自己的scn，其對從周圍微環(huán)境接受的信號響應(yīng)，做出關(guān)于干細(xì)胞的命運(yùn)的決定。然而，關(guān)于干細(xì)胞在其天然龕內(nèi)的原位生物學(xué)表征，以及這些表征如何可以在msc的體外培養(yǎng)過程中改變了解甚少。例如，細(xì)胞可以停止表達(dá)一些蛋白質(zhì)或開始表達(dá)新的蛋白質(zhì)。這個問題是非常重要的，因?yàn)樗梢栽谂R床研究中具有深遠(yuǎn)的影響，并可以解釋在再生醫(yī)學(xué)中干細(xì)胞的成功和/或失敗。體外培養(yǎng)的細(xì)胞缺乏組織結(jié)構(gòu)以及基于組織環(huán)境(細(xì)胞-細(xì)胞相互作用，特定因子的分泌等)的所有功能。這就是為什么細(xì)胞系可以失去組織特異性功能，并可能獲得與scn中的細(xì)胞完全不同的分子表型。對scn中干細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)模式的研究對于評價干細(xì)胞安全是必要的，尤其是其在人中的使用。

在表6中，我們總結(jié)了通過免疫組織化學(xué)測定體內(nèi)分離后細(xì)胞的組織樣本所獲得的數(shù)據(jù)，以及使用幾種機(jī)械轉(zhuǎn)移培養(yǎng)的細(xì)胞的體外樣本的流式細(xì)胞術(shù)所獲得的數(shù)據(jù)。表6證明在體內(nèi)和體外尤其是牙髓中，由干細(xì)胞表達(dá)的大多數(shù)標(biāo)記物，在機(jī)械轉(zhuǎn)移后獲得的分離細(xì)胞中沒有顯示標(biāo)記物的缺失。在臍帶組織的機(jī)械轉(zhuǎn)移后獲得的細(xì)胞證實(shí)在表達(dá)c-kit和波形蛋白的細(xì)胞頻率中的微小差異。雖然這些結(jié)果來自從牙髓和臍帶組織分離的干細(xì)胞，但是這種安全性測定可以用于來自其它來源的干細(xì)胞，甚至用于液相中的細(xì)胞。

表6.在體內(nèi)和體外來自牙髓和臍帶組織的干細(xì)胞中主要干細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)模式。+++表示高數(shù)量的細(xì)胞，++表示中等數(shù)量的細(xì)胞，+表示低數(shù)量的細(xì)胞。

除非另有定義，否則本文中的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同的含義。盡管在本發(fā)明的實(shí)踐或測試中可以使用與本文所述的那些類似或等同的任何方法和材料，但是本文描述了優(yōu)選的方法和材料。引用的所有出版物，專利和專利出版物為了所有目的通過引用整體并入本文。

本文所討論的出版物僅僅是為了在本申請的申請日之前的公開提供的。本文中的任何內(nèi)容都不應(yīng)被解釋為承認(rèn)本發(fā)明不具有借助于先前發(fā)明的先前發(fā)表的權(quán)利。

應(yīng)當(dāng)理解，本公開的發(fā)明不限于所描述的特定方法、規(guī)程和材料，因?yàn)檫@些可以變化。還應(yīng)當(dāng)理解，本文所使用的術(shù)語僅用于描述特定實(shí)施方案的目的，并且不旨在限定本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的范圍將僅由所附權(quán)利要求限定。

本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到或能夠使用不超過常規(guī)實(shí)驗(yàn)來確定與本文所述的本發(fā)明的具體實(shí)施例的許多等同物。這樣的等同物旨在被所附權(quán)利要求所涵蓋。

參考文獻(xiàn)

1.chenvc等人.(2012)“scalablegmpcompliantsuspensionculturesystemforhumanescells”stemcellres.2012may；8(3):388-402.

2.schirmaier等人:scale-upofadiposetissue-derivedmesenchymalstemcellproductioninstirredsingle-usebioreactorsunderlow-serumconditions.eng.lifesci.2014,14,292–303,

3.vallee等人:adipose-tissueengineering:takingadvantageofthepropertiesofhumanadipose-derivedstem/stromalcells.patholbiol(paris).2009jun；57(4):309-17

4.nekanti等人:optimizationandscale-upofwharton'sjelly-derivedmesenchymalstemcellsforclinicalapplications.stemcellresearch(2010)5,244–254.

5.brookeg,rossettit,pelekanosr,等人:manufacturingofhumanplacenta-derivedmesenchymalstemcellsforclinicaltrials.brjhaematol.144:571–579.2008.

6.govindasamy等人:humanplateletlysatepermitsscale-upofdentalpulpstromalcellsforclinicalapplications.cytotherapy,2011；earlyonline,1–13

7.hanley等人:efficientmanufacturingoftherapeuticmesenchymalstromalcellswiththeuseofthequantumcellexpansionsystem；cytotherapy,2014-08-01,volume16,issue8,1048-1058

8.liziernf,kerkisa,gomescm,heblingj,oliveiracf,caplanai,kerkisi.scaling-upofdentalpulpstemcellsisolatedfrommultipleniches.plosone.2012；7(6):e39885；kerkisi,caplanai.stemcellsindentalpulpofdeciduousteeth.tissueengpartbrev.2012apr；18(2):129-38.

9.maheral-atariabou-asinúriacasalsfarrélluísginertarridalluísginertarridaeduardoferréspadrópatentapplicationtitle:pluripotentstemcellsobtainedfromdentalpulphttp://www.faqs.org/patents/app/20110236356

10.cordeiromm,dongz,kanekot,zhangz,miyazawam,shis,smithaj,je.dentalpulptissueengineeringwithstemcellsfromexfoliateddeciduousteeth.jendod.200834(8):962-9.

11.arorav,arorap,munshiak.bankingstemcellsfromhumanexfoliateddeciduousteeth(shed):savingforthefuturejclinpediatrdent33(4):289–294,2009

12.sukoyanma,kerkisay,mellomr,kerkisie,visintinja,pereiralv.establishmentofnewmurineembryonicstemcelllinesforthegenerationofmousemodelsofhumangeneticdiseases.brazjmedbiolres.2002may；35(5):535-42.

13.cartal,pereiral,arteaga-solise,lee-arteagasy,lenartb,starcherb,merkelca,sukoyanm,kerkisa,hazekin,keenedr,sakaily,ramirezf.fibrillins1and2performpartiallyoverlappingfunctionsduringaorticdevelopment.jbiolchem.2006mar24；281(12):8016-23

14.kerkisa,fonsecasa,serafimrc,lavagnollitm,abdelmassihs,abdelmassihr,kerkisi.invitrodifferentiationofmalemouseembryonicstemcellsintobothpresumptivespermcellsandoocytes.cloningstemcells.2007winter；9(4):535-48.

15.lavagnollitm,fonsecasa,serafimrc,pereiravs,santosej,abdelmassihs,kerkisa,kerkisi.presumptivegermcellsderivedfrommousepluripotentsomaticcellhybrids.differentiation.2009sep-oct；78(2-3):124-30

16.hayashima,guerreirojr,cassolaac,liziernf,kerkisa,camargoac,kerkisi.long-termcultureofmouseembryonicstemcell-derivedadherentneurospheresandfunctionalneurons.tissueengpartcmethods.2010dec；16(6):1493-502.

17.limabl,santosej,fernandesgr,merkelc,mellomr,gomesjp,soukoyanm,kerkisa,massironism,visintinja,pereiralvanewmousemodelformarfansyndromepresentsphenotypicvariabilityassociatedwiththegeneticbackgroundandoveralllevelsoffbn1expression.plosone.2010nov30；5(11):e14136.

18.-bragapc,pignatarigc,maiorkapc,oliveirana,liziernf,wenceslaucv,miglinoma,muotriar,kerkisi.feeder-freederivationofinducedpluripotentstemcellsfromhumanimmaturedentalpulpstemcells.celltransplant.2011；20(11-12):1707-19.

19.deepaponnaiyan--dodentalstemcellsdepictdistinctcharacteristics？—establishingtheir“phenotypicfingerprint”dentresj(isfahan).2014mar-apr；11(2):163–172

20.brito等人.,imbalanceofp75ntr/trkbproteinexpressioninhuntington’sdisease:implicationforneuroprotectivetherapies.celldeathanddisease(2013)4,e595；doi:10.138/cddis.2013.116

21.crisostomopr,wangm,wairiukogm,等人.highpassagenumberofstemcellsadverselyaffectsstemcellactivationandmyocardialprotection.shock.2006；26:575-80.

22.digirolamocm,stokesd,colterd,等人.propagationandsenescenceofhumanmarrowstromalcellsinculture:asimplecolony-formingassayidentifiessampleswiththegreatestpotentialtopropagateanddifferentiate.brjhaematol.1999；107:275-81.

23.muragliaa,canceddar,quartor.clonalmesenchymalprogenitorsfromhumanbonemarrowdifferentiateinvitroaccordingtoahierarchicalmodel.jcellsci.2000；113:1161-6.

24.rubiod,garcia-castroj,martinmc,等人.spontaneoushumanadultstemcelltransformation.cancerres.2005；65:3035-9.

25.stenderupk,justesenj,clausenc,kassemm.agingisassociatedwithdecreasedmaximallifespanandacceleratedsenescenceofbonemarrowstromalcells.bone.2003；33:919-26.