本申請涉及表現(xiàn)出抗菌和/或抗真菌以及促進(jìn)植物生長的活性、被命名為枯草芽孢桿菌亞種shriramensis(bacillussubtilisssp.shriramensis)的屬于芽孢桿菌家族的新型細(xì)菌，還涉及表現(xiàn)出抗菌和/或抗真菌、蛋白水解、淀粉分解的活性的所述新型微生物的提取物的分離和鑒定，還涉及包含所述新型細(xì)菌和/或所述提取物的組合物，和通過使病原微生物和/或真菌與有效量的所述新型細(xì)菌和/或抗菌和/或抗真菌和促進(jìn)植物生長的組合物和/或試劑接觸來抑制病原微生物和/或真菌生長的方法及其用途。
背景技術(shù)：
：：雖然高光強度，極端的溫度變化，低濃度的有機物質(zhì)和稀缺的水，使環(huán)境不適合微生物生長，但是地球的大氣與空氣中的微生物相關(guān)聯(lián)是眾所周知的。在偏遠(yuǎn)的大陸，人口稠密的大陸和偏遠(yuǎn)海洋環(huán)境中，生物材料可分別貢獻(xiàn)大約20％，22％和10％體積的總大氣懸浮顆粒物。它們大多數(shù)來自天然來源，如土壤，湖泊，動物和人類。此外，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，醫(yī)療單位和工業(yè)經(jīng)營如污水處理，動物飼養(yǎng)，發(fā)酵過程和食品加工廠也向環(huán)境中排放活微生物。細(xì)菌形成單細(xì)胞的原核微生物的大領(lǐng)域。細(xì)菌通常長度為幾微米，具有許多不同的形狀，范圍從球菌到桿狀和螺旋狀。細(xì)菌在地球上普遍存在，在土壤中，酸性溫泉，放射性廢物，水和地殼深處，以及在有機物和植物和動物的活體中生長。桿菌是桿狀、革蘭氏陽性、孢子生殖、需氧或兼性厭氧細(xì)菌。大多數(shù)桿菌是腐生菌。每個細(xì)菌僅產(chǎn)生一個孢子，其耐熱，耐冷，耐輻射，耐干燥和耐消毒劑。桿菌表現(xiàn)出一系列的生理能力允許他們生活在廣泛的棲息地，包括許多極端的棲息地，如沙漠，溫泉和北極土壤。芽孢桿菌屬可以是嗜熱的，嗜冷的，嗜酸的，嗜堿的，耐鹽的或嗜鹽的，并且能夠在各種ph值、溫度和鹽濃度下生長。產(chǎn)生抗菌劑對大多數(shù)細(xì)菌似乎是普遍現(xiàn)象。這些細(xì)菌產(chǎn)生極好的一系列的微生物防御系統(tǒng)，包括廣譜經(jīng)典抗生素，代謝副產(chǎn)物如有機酸和溶解劑如溶菌酶。此外，還產(chǎn)生幾種類型的蛋白質(zhì)外毒素和細(xì)菌素，它們是具有殺菌作用模式的生物活性肽部分。來自微生物的生物庫在其多樣性和天然豐度方面是顯著的。尋找新的抗菌劑是極為重要的領(lǐng)域。對抗菌劑的抗性的發(fā)展以驚人的速度增加。目前的解決方案涉及開發(fā)更合理的抗生素使用方法和發(fā)現(xiàn)新的抗菌劑的方法。高度相關(guān)的專利1.控制真菌病原體的新型細(xì)菌菌株和方法(wo/2000/015761)。發(fā)明目的本發(fā)明的目的是提供表現(xiàn)出抗菌和/或抗真菌和促進(jìn)植物生長的活性的新型細(xì)菌。本發(fā)明的目的是分離和鑒定新型細(xì)菌的提取物，其中所述提取物顯示出抗菌和/或抗真菌和促進(jìn)植物生長的活性。本發(fā)明的目的還在于提供抗菌和/或抗真菌和促進(jìn)植物生長的組合物或試劑，其中所述組合物或試劑包含新型細(xì)菌和/或新型細(xì)菌的提取物。本發(fā)明的另一個目的是提供一種通過使病原微生物和/或真菌與有效量的新型細(xì)菌和/或抗菌和/或抗真菌和促進(jìn)植物生長的組合物和/或試劑接觸來抑制病原微生物和/或真菌的生長的方法，其中所述組合物或試劑包含新型細(xì)菌和/或新型細(xì)菌的提取物和/或新型細(xì)菌及其提取物的混合物。本發(fā)明的另一目的是提供新型細(xì)菌以及抗菌和/或抗真菌的組合物或試劑用于抑制病原微生物和/或真菌的生長的用途，其中所述組合物或試劑包含新型細(xì)菌和/或新型細(xì)菌的提取物和/或該新型細(xì)菌及其提取物的混合物。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的一個方面是提供可用于產(chǎn)生抗菌和/或抗真菌代謝物或試劑的分離的新型細(xì)菌。本發(fā)明的一個方面是提供屬于芽孢桿菌屬的新形式的細(xì)菌，其被命名為枯草芽孢桿菌亞種shriramensis(bacillussubtilisssp.shriramensis)并具有登錄號(mtcc-5674)。特別地，本發(fā)明中公開的新型細(xì)菌能夠表現(xiàn)出明顯的抗菌和/或抗真菌和促進(jìn)植物生長的性質(zhì)。本發(fā)明的另一方面是提供抗菌和/或抗真菌和促進(jìn)植物生長的組合物或試劑的生產(chǎn)工藝，其中所述組合物或試劑包含枯草芽孢桿菌亞種shriramensis(mtcc-5674)和/或枯草芽孢桿菌亞種shriramensis(mtcc-5674)的提取物。提供了包含枯草芽孢桿菌亞種shriramensis(mtcc-5674)的組合物。所述組合物可以進(jìn)一步包含藥學(xué)上可接受的賦形劑，稀釋劑和/或載體。提供了含有枯草芽孢桿菌亞種shriramensis(mtcc-5674)的提取物的組合物。還提供了包含枯草芽孢桿菌亞種shriramensis(mtcc-5674)的水性提取物的組合物。所述組合物可以進(jìn)一步包含藥學(xué)上可接受的賦形劑，稀釋劑和/或載體。提供了通過使病原微生物和/或真菌與有效量的枯草芽孢桿菌亞種shriramensis(mtcc-5674)或枯草芽孢桿菌亞種shriramensis(mtcc-5674)的提取物接觸來抑制病原微生物和/或真菌生長的方法?？莶菅挎邨U菌shriramensis(mtcc-5674)和/或枯草芽孢桿菌亞種shriramensis(mtcc-5674)的提取物可任選地含有一種或多種另外的抗菌和/或抗真菌劑和植物生長促進(jìn)劑。在本發(fā)明中提供了枯草芽孢桿菌亞種shriramensis(mtcc-5674)和/或枯草芽孢桿菌亞種shriramensis(mtcc-5674)的提取物在用于抑制病原微生物和/或真菌生長的抗菌和/或抗真菌和促進(jìn)植物生長的組合物或試劑的制劑中的用途。詳細(xì)說明本發(fā)明提供屬于枯草桿菌家族的被命名為枯草芽孢桿菌亞種shriramensis和具有登錄號(mtcc-5674)的新型細(xì)菌，以及抗菌和/或抗真菌和促進(jìn)植物生長的組合物或試劑的生產(chǎn)方法，其中所述組合物或試劑包含枯草芽孢桿菌亞種shriramensis(mtcc-5674)和/或枯草芽孢桿菌亞種shriramensis(mtcc-5674)的提取物。本發(fā)明還提供了通過使微生物和/或真菌與有效量的新型細(xì)菌枯草芽孢桿菌亞種shriramensis(mtcc-5674)和/或包含新型細(xì)菌或其提取物的組合物接觸來抑制病原微生物和/或真菌的方法。本發(fā)明還提供了枯草芽孢桿菌亞種shriramensis(mtcc-5674)，和/或包含新型細(xì)菌枯草芽孢桿菌亞種shriramensis(mtcc-5674)和/或枯草芽孢桿菌亞種shriramensis(mtcc-5674)的提取物的抗菌和/或抗真菌和促進(jìn)植物生長的組合物或試劑在用于抑制病原微生物和/或真菌中的用途。通過在有利條件下在合適的生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)枯草芽孢桿菌亞種shriramensis可將新型枯草芽孢桿菌亞種shriramensis(mtcc-5674)用于大規(guī)模生產(chǎn)抗菌和/或抗真菌和促進(jìn)植物生長的組合物/制劑/試劑。通過深入細(xì)致的研究，本發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)了分離的和培養(yǎng)的可以產(chǎn)生新型試劑的新型細(xì)菌。通過詳細(xì)的實驗研究，本發(fā)明人還發(fā)明了由所述新型微生物生產(chǎn)所述新型試劑的方法。附圖說明圖1-示出了枯草芽孢桿菌亞種shriramensis(mtcc-5674)的分離和純化的平板。(a)示出與真菌菌絲體一起的細(xì)菌生長的母培養(yǎng)板；(b)示出了來自(a)中細(xì)菌菌落的枯草芽孢桿菌亞種shriramensis(mtcc-5674)的純化。箭頭表示推定的細(xì)菌菌落。圖2-對尖孢鐮刀菌菌絲體生長示出抑制的枯草芽孢桿菌亞種shriramensis(mtcc-5674)的純化菌落之一的克隆。圖3-枯草芽孢桿菌亞種shriramensis(mtcc-5674)以及孢子的營養(yǎng)細(xì)菌細(xì)胞的顯微照片。圖4-示出了生長活躍的枯草芽孢桿菌亞種shriramensis(mtcc-5674)菌落的平板。圖5–光學(xué)顯微鏡下的桿狀枯草芽孢桿菌亞種shriramensis(mtcc-5674)。圖6-示出了過氧化氫酶試驗結(jié)果的圖：(a)陰性對照；(b)陽性對照和(c)示出過氧化氫酶活性陽性結(jié)果的枯草芽孢桿菌亞種shriramensis(mtcc-5674)。圖7-示出了枯草芽孢桿菌亞種shriramensis(mtcc-5674)培養(yǎng)物濾液的淀粉分解活性的平板。圖8-是示出o/f(好氧發(fā)酵)試驗結(jié)果的圖，(a)陰性對照(b)示出僅在培養(yǎng)基的頂部顯示顏色變化的枯草芽孢桿菌shriramensis(mtcc-5674)；(c)陽性對照。圖9是示出硫化氫生產(chǎn)試驗結(jié)果的圖，(a)陰性對照(b)枯草芽孢桿菌亞種shriramensis(mtcc-5674)和(c)陽性對照。圖10是示出枯草芽孢桿菌亞種shriramensis(mtcc-5674)的濃縮培養(yǎng)物濾液的sds-page結(jié)果的圖。圖11–示出抗菌和/或抗真菌活性的培養(yǎng)板，(a)枯草芽孢桿菌亞種shriramensis(mtcc-5674)菌落展示的活性和(b)枯草芽孢桿菌亞種shriramensis(mtcc-5674)培養(yǎng)物濾液展示的活性。尖孢鐮刀菌培養(yǎng)物用作試驗真菌。圖12是示出通過管稀釋法進(jìn)行的抗菌和/或抗真菌化合物的mic測定結(jié)果的圖。1至c-2：在含有不同濃度的抗菌和/或抗真菌劑的pdb中孵育后，尖孢鐮刀菌孢子的照片(在光學(xué)顯微鏡下觀察)。1-28(稀釋度1：1至1：100)，c-1-抗菌和/或抗真菌試劑(粗品)中的孢子；c-2-對照(無抗菌劑和/或抗真菌劑的pdb液體培養(yǎng)基中的孢子)。圖13–示出通過瓊脂擴(kuò)散法進(jìn)行的抗菌和/或抗真菌劑的mic測定結(jié)果的圖。1至c-2：生長在檢測板上的尖孢鐮刀菌菌絲體的照片。1-28以1:1至1:100(v/v)稀釋的抗菌和/或抗真菌劑，c1-含抗菌和/或抗真菌劑(粗品)的孔。c2-含有pdb的對照孔；c3-含有70％飽和硫酸銨的對照孔。圖14-示出抗菌和/或抗真菌劑對黑曲霉孢子的作用的圖。(a，b和c)黑曲霉的孢子在pdb培養(yǎng)基中顯示正常的萌發(fā)；(d)黑曲霉孢子在含有枯草芽孢桿菌亞種shriramensis(mtcc-5674)提取物的pdb培養(yǎng)基中不能萌發(fā)。圖15-示出了細(xì)胞裂解物對尖孢鐮刀菌的抗菌和/或抗真菌活性的平板；(1)僅含有溶菌酶的孔(以檢查溶菌酶對真菌尖孢鐮刀菌的效應(yīng))和(2)含有枯草芽孢桿菌亞種shriramensis(mtcc-5674)的細(xì)胞裂解物的孔。圖16-是示出針對多種類型的植物病原真菌和細(xì)菌種的枯草芽孢桿菌亞種shriramensis(mtcc-5674)細(xì)胞/提取物的抗菌和/或抗真菌活性檢測的平板。a.尖孢鐮刀菌，b.鞘腐敗病菌c.木霉菌d.炭疽菌屬e.玉米大斑病菌f.水稻紋枯病g.球殼孢菌h.水稻黃單胞菌。圖17-是示出枯草芽孢桿菌亞種shriramensis(mtcc-5674)提取物在尖孢鐮刀菌存在下對水稻種子發(fā)芽的抗菌和/或抗真菌活性的結(jié)果的平板。(a)用真菌尖孢鐮刀菌孢子處理的水稻種子；(b&c)用真菌尖孢鐮刀菌和枯草芽孢桿菌亞種shriramensis(mtcc-5674)提取物處理的水稻種子。圖18-是示出枯草芽孢桿菌亞種shriramensis(mtcc-5674)對各種植物物種不具有致病性的實驗結(jié)果的平板。(a)水稻，(b)棉花，(c)煙草，(d)玉米和(e)番茄。圖19-是示出枯草芽孢桿菌亞種shriramensis(mtcc-5674)作為生物防治劑的作用的實驗結(jié)果的圖。(a)感染了立枯絲核菌(nfcci-3194)真菌的番茄植物。(b)感染了立枯絲核菌(nfcci-3194)和枯草芽孢桿菌亞種shriramensis(mtcc-5674)的番茄植物和(c)對照番茄植物(未感染立枯絲核菌和枯草芽孢桿菌亞種shriramensis(mtcc-5674)。圖20-是示出(1)草酸青霉菌(nfcci-1997)真菌菌落和(2)枯草芽孢桿菌亞種shriramensis(mtcc-5674)純菌落的平板。圖21-是示出用抗菌/抗真菌劑枯草芽孢桿菌亞種shriramensis(mtcc-5674)的多種制劑包被的玉米種子的平板。1.(對照-1)用不含真菌病原體和生物防治劑的制劑處理的種子；2.(對照-2)用不含生物防治劑的制劑處理的種子；3.(對照-3)用含有商業(yè)殺真菌劑“多菌靈wp50”的制劑處理的種子；4a.用含有枯草芽孢桿菌亞種shriramensis細(xì)胞(5×104cfu)的制劑處理的種子；4b.用含有枯草芽孢桿菌亞種shriramensis細(xì)胞(5×105cfu)的制劑處理的種子；4c.用含有枯草芽孢桿菌亞種shriramensis細(xì)胞(5×106cfu)的制劑處理的種子；4d.用含有枯草芽孢桿菌亞種shriramensis細(xì)胞(5×107cfu)的制劑處理的種子，和5.用僅含有枯草芽孢桿菌亞種shriramensis細(xì)胞(5×107cfu)的制劑處理的種子。圖22-是示出孵育2周后生物防治活性的結(jié)果的平板。1.(對照-1)用不含有真菌病原體和抗真菌劑的制劑-1處理的種子；2.(對照-2)用不含生物防治劑的制劑-2處理的種子；3.(對照-3)用含有商業(yè)殺真菌劑“多菌靈wp50”的制劑-3處理的種子；4a.用含有枯草芽孢桿菌亞種shriramensis(5x104cfu)的制劑-4a處理的種子；4b.用含有枯草芽孢桿菌亞種shriramensis細(xì)胞(5x105cfu)的制劑-4b處理的種子；4c.用含有枯草芽孢桿菌亞種shriramensis細(xì)胞(5x106cfu)的制劑-4c處理的種子；4d.用含有枯草芽孢桿菌亞種shriramensis細(xì)胞(5x107cfu)的制劑-4d處理的種子和5.用僅含有枯草芽孢桿菌亞種shriramensis細(xì)胞(5x107cfu)的制劑-5處理的種子。圖23-是示出孵育4周后生物防治活性的結(jié)果的平板。1.(對照-1)用不含有真菌病原體和抗真菌劑的制劑-1處理的種子；2.(對照-2)用不含生物防治劑的制劑-2處理的種子；3.(對照-3)用含有商業(yè)殺真菌劑“多菌靈wp50”的制劑-3處理的種子；4a.用含有枯草芽孢桿菌亞種shriramensis(5x104cfu)的制劑-4a處理的種子；4b.用含有枯草芽孢桿菌亞種shriramensis細(xì)胞(5x105cfu)的制劑-4b處理的種子；4c.用含有枯草芽孢桿菌亞種shriramensis細(xì)胞(5x106cfu)的制劑-4c處理的種子；4d.用含有枯草芽孢桿菌亞種shriramensis細(xì)胞(5x107cfu)的制劑-4d處理的種子和5.用僅含有枯草芽孢桿菌亞種shriramensis細(xì)胞(5x107cfu)的制劑-5處理的種子。圖24-針對多種人類病原性真菌物種的抗真菌和/或抗菌活性的測定。a，b和c-針對青霉菌的抗真菌和/或抗菌活性的測定，(a)青霉菌真菌菌落(b)菌絲體和(c)枯草芽孢桿菌亞種shriramensis(mtcc-5674)培養(yǎng)物濾液的影響。d，e和f-針對黃曲霉的抗真菌和/或抗菌活性的測定，(d)真菌菌落(e)菌絲體和(f)枯草芽孢桿菌亞種shriramensis(mtcc-5674)培養(yǎng)物濾液的影響。g，h和i-針對黑曲霉的抗真菌和/或抗菌活性的測定，(g)真菌菌落(h)菌絲體和(i)枯草芽孢桿菌亞種shriramensis(mtcc-5674)培養(yǎng)物濾液的影響。j，k和l-針對引起皮膚感染的未知真菌的抗真菌和/或抗菌活性的測定，(j)真菌菌落(k)分生孢子和(l)枯草芽孢桿菌亞種shriramensis(mtcc-5674)培養(yǎng)物濾液的影響。圖25-枯草芽孢桿菌亞種shriramensis(mtcc-5674)制劑對玉米生長和發(fā)育的影響。用含有枯草芽孢桿菌亞種shriramensis(mtcc-5674)的制劑處理的玉米種子顯示出較高的生長速率，生物量和谷物產(chǎn)量。新型細(xì)菌的分離和鑒定本發(fā)明人在進(jìn)行關(guān)于空氣菌群研究時從海得拉巴和帕坦切魯(泰倫加納，印度)的18個不同位置收集空氣樣品。在實驗室中制備含有培養(yǎng)基(t3培養(yǎng)基，travers等人，1987)的一次性培養(yǎng)皿，并將其暴露于不同位置的空氣。將暴露的板密封并在30℃在實驗室溫育器中孵育。在暴露于帕坦切魯?shù)貐^(qū)空氣的平板之一中，觀察到由真菌菌絲體包圍的細(xì)菌菌落(圖1a)。盡管繼續(xù)孵育，間隙區(qū)仍保持，并且真菌菌絲體的生長保持局限于間隙區(qū)的周邊。使用標(biāo)準(zhǔn)微生物學(xué)方法對來自該菌落的微生物進(jìn)行純化(圖1b)。針對普通真菌尖孢鐮刀菌檢測個體菌落(圖2)。其中一個菌落顯示抑制真菌生長，觀察到間隙區(qū)(圖2)。來自菌落的細(xì)菌的顯微鏡檢查顯示出桿狀運動細(xì)菌(圖5)。在培養(yǎng)基中培養(yǎng)6天后，細(xì)菌產(chǎn)生孢子。細(xì)菌的菌落是粘液狀的，凸起的，圓形的，光滑的，并且奶油色至灰白色(圖4)，細(xì)胞示出可變的革蘭氏染色(圖5)。進(jìn)行一系列生化檢測，包括糖類發(fā)酵，過氧化氫酶活性，氧化發(fā)酵檢測，淀粉水解，硫化氫生產(chǎn)檢測，氧化酶活性檢測，脫氧膽酸鹽瓊脂檢測。這些試驗的結(jié)果證實，細(xì)菌是過氧化氫酶陽性，具有淀粉酶活性，強好氧，不產(chǎn)生硫化氫，氧化酶陽性和革蘭氏染色不定的。為了鑒定細(xì)菌，進(jìn)行16sdna測序和fame分析。兩個研究的結(jié)果表明，細(xì)菌與枯草芽孢桿菌亞種subtilis在16sdna序列上的差異為0.37％，fame相似指數(shù)為0.827；且與萎縮芽孢桿菌在16sdna序列上的差異為0.84％，fame相似性指數(shù)0.749。因此，結(jié)果表明該細(xì)菌與枯草芽孢桿菌和萎縮芽孢桿菌相關(guān)，但不與atcc集合中的任何編目的細(xì)菌種類相同。16sdna序列比較結(jié)果fame分析結(jié)果比較序列號相似指數(shù)庫條目名稱10.827枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)20.749萎縮芽孢桿菌(bacillusatrophaeus)分離的細(xì)菌是芽孢桿菌屬的亞種的新成員。根據(jù)細(xì)菌命名慣例，新型細(xì)菌種被命名為枯草芽孢桿菌亞種shriramensis。細(xì)菌儲存在印度昌迪加爾的imtech的微生物典型培養(yǎng)物保藏中心(mtcc)中。這種新品種的儲存號是(mtcc-5674)。具有本發(fā)明提供的登錄/儲存編號(mtcc-5674)的新型細(xì)菌的特征該細(xì)菌是桿狀的，測量為2.45×0.88μm，活動，形成孢子，革蘭氏染色不定；菌落光滑，粘液狀，在早期階段是灰白色至奶油狀，但在延長了時間的孵育中起皺。當(dāng)培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物耗盡時，細(xì)菌轉(zhuǎn)化成孢子，通常孢子形成過程發(fā)生在4天的孵育中，所述孵育是在30℃和200rpm振蕩下、在25×150mm培養(yǎng)管中的含有100μl5×108細(xì)胞接種物的10ml培養(yǎng)基中進(jìn)行的。具有登錄號(mtcc-5674)的枯草芽孢桿菌亞種shriramensis新型細(xì)菌，表現(xiàn)出抗菌和/或抗真菌活性。具有登錄號(mtcc-5674)的枯草芽孢桿菌亞種shriramensis新型細(xì)菌的提取物，表現(xiàn)出抗菌和/或抗真菌活性。細(xì)菌的潛在應(yīng)用和用途的范圍是廣泛的。本發(fā)明提供了從具有登錄號(mtcc-5674)的枯草芽孢桿菌亞種shriramensis新型細(xì)菌產(chǎn)生抗菌和/或抗真菌提取物的方法?？咕?或抗真菌劑的生產(chǎn)和分離用于具有登錄號(mtcc-5674)的枯草芽孢桿菌亞種shriramensis生長的培養(yǎng)基的組成如下：1.胰蛋白胨:0.32％(w/v)2.胰蛋白示:0.24％(w/v)3.酵母提取物:0.18％(w/v)4.nah2po4.h2o:0.044m5.na2hpo4:0.062m6.mncl2:0.0005％(w/v)ph＝6.81.按照附錄i(i)中給出的方法制備培養(yǎng)基，將100ml等分試樣轉(zhuǎn)移到500ml錐形瓶中。將培養(yǎng)基通過在121℃高壓滅菌15分鐘滅菌。2.每個燒瓶用單一純菌落的枯草芽孢桿菌亞種shriramensis(mtcc-5674)接種，并在30℃，200rpm孵育60小時。從培養(yǎng)基中分離抗菌和/或抗真菌劑細(xì)菌在t3液體培養(yǎng)基中生長60小時后，將培養(yǎng)物在4℃以12000rpm離心10分鐘。收集上清液并使用0.22μm圓盤過濾器(millipore/sartorius)過濾。將濾液在適當(dāng)?shù)膬Υ鏃l件下保存用于詳細(xì)實驗以研究抗菌和/或抗真菌活性。本發(fā)明特別提供了一種具有登錄號(mtcc-5674)的枯草芽孢桿菌亞種shriramensis新型微生物，以及由該新型細(xì)菌和/或其提取物或該新型細(xì)菌和/或其提取物的混合物生產(chǎn)抗菌和/或抗真菌組合物的方法。本發(fā)明的一個實施例提供了具有登錄號(mtcc-5674)的、表現(xiàn)出抗菌和/或抗真菌活性的、屬于枯草芽孢桿菌亞種shriramensis的分離的新型細(xì)菌。在本發(fā)明的一個實施例中，提供了具有登錄號(mtcc-5674)的、被命名為枯草芽孢桿菌亞種shriramensis的新型細(xì)菌。在本發(fā)明的另一個實施例中，提供了具有登錄號(mtcc-5674)的枯草芽孢桿菌亞種shriramensis新型細(xì)菌的純培養(yǎng)物。在本發(fā)明的一個實施例中，提供了具有登錄號(mtcc-5674)的枯草芽孢桿菌亞種shriramensis新型細(xì)菌的提取物，其中所述提取物表現(xiàn)出抗菌和/或抗真菌活性。在本發(fā)明的另一個實施例中，提供了具有登錄號(mtcc-5674)的枯草芽孢桿菌亞種shriramensis新型細(xì)菌的提取物，其中所述表現(xiàn)出抗菌和/或抗真菌活性的提取物是水性提取物。在本發(fā)明的另一個實施例中，提供了一種具有登錄號(mtcc-5674)的枯草芽孢桿菌亞種shriramensis新型細(xì)菌的提取物的生產(chǎn)方法，其中在該過程中包括使得具有登錄號(mtcc-5674)的枯草芽孢桿菌亞種shriramensis新型細(xì)菌在營養(yǎng)培養(yǎng)基中生長，并通過使用常規(guī)方法回收具有抗真菌活性的提取物。在本發(fā)明的另一個實施例中，提供了具有登錄號(mtcc-5674)的枯草芽孢桿菌亞種shriramensis新型細(xì)菌的提取物的生產(chǎn)工藝，其中所述工藝包括使所述具有登錄號(mtcc-5674)的枯草芽孢桿菌亞種shriramensis新型細(xì)菌在有氧條件下生長。在本發(fā)明的另一個實施例中，提供了一種具有登錄號(mtcc-5674)的枯草芽孢桿菌亞種shriramensis新型細(xì)菌的提取物的生產(chǎn)工藝，其中所述工藝包括使所述枯草芽孢桿菌亞種shriramensis新型細(xì)菌在營養(yǎng)培養(yǎng)基中生長，回收具有抗菌和/或抗真菌活性的提取物，和可選地包括使用常規(guī)方法濃縮提取物。在本發(fā)明的一個實施例中，提供了包含具有登錄號(mtcc-5674)的枯草芽孢桿菌亞種shriramensis新型細(xì)菌的組合物，其中所述組合物具有抗菌和/或抗真菌活性。在本發(fā)明的另一個實施例中，提供了包含具有登錄號(mtcc-5674)的枯草芽孢桿菌亞種shriramensis新型細(xì)菌的提取物的組合物，其中所述組合物具有抗菌和/或抗真菌活性。在本發(fā)明的另一個實施例中，提供了包含具有登錄號(mtcc-5674)的枯草芽孢桿菌亞種shriramensis新型細(xì)菌以及具有登錄號(mtcc-5674)的枯草芽孢桿菌亞種shriramensis新型細(xì)菌的提取物的組合物，其中所述組合物具有抗菌和/或抗真菌活性。在本發(fā)明的一個實施例中，提供了一種組合物，其包含具有登錄號(mtcc-5674)的枯草芽孢桿菌亞種shriramensis新型細(xì)菌和/或所述新型細(xì)菌枯草芽孢桿菌亞種shriramensis的提取物，或其可選的包括一種或多種抗菌和/或抗真菌劑的組合。在本發(fā)明的另一個實施例中，提供了包含具有登錄號(mtcc-5674)的枯草芽孢桿菌亞種shriramensis新型細(xì)菌的提取物的組合物，其可選地包含一種或多種抗菌和/或抗真菌劑。在本發(fā)明的另一個實施例中，提供了包含具有登錄號(mtcc-5674)的枯草芽孢桿菌亞種shriramensis新型細(xì)菌與其提取物的組合的組合物，其可選地包含一種或多種抗菌和/或抗真菌劑。在本發(fā)明的一個實施例中，提供了包含具有登錄號(mtcc-5674)的枯草芽孢桿菌亞種shriramensis新型細(xì)菌或具有登錄號(mtcc-5674)的枯草芽孢桿菌亞種shriramensis新型細(xì)菌的提取物或其組合的組合物，其可選的包含農(nóng)業(yè)上或藥學(xué)上可接受的載體。在本發(fā)明的另一個實施例中，提供了包含具有登錄號(mtcc-5674)的枯草芽孢桿菌亞種shriramensis新型細(xì)菌的組合物，其可選地包含農(nóng)業(yè)上或藥學(xué)上可接受的載體。在本發(fā)明的另一個實施例中，提供了包含具有登錄號(mtcc-5674)的枯草芽孢桿菌亞種shriramensis新型細(xì)菌的提取物的組合物，其可選地包含農(nóng)業(yè)上或藥學(xué)上可接受的載體。在本發(fā)明的另一個實施例中，提供了包含具有登錄號(mtcc-5674)的枯草芽孢桿菌亞種shriramensis新型細(xì)菌和所述新型細(xì)菌枯草芽孢桿菌亞種shriramensis的提取物的組合的組合物，其可選地包含農(nóng)業(yè)上可接受的載體(參見附錄iii)。在本發(fā)明的一個實施例中，提供了用于抑制病原真菌和/或細(xì)菌生長的方法，其中所述方法包括使病原真菌和/或細(xì)菌與有效量的具有登錄號(mtcc-5674)的枯草芽孢桿菌亞種shriramensis新型細(xì)菌或包含所述新型細(xì)菌或其提取物或其組合的組合物進(jìn)行接觸。在本發(fā)明的一個實施例中，提供了抑制病原真菌和/或細(xì)菌生長的方法，其中所述方法包括使病原真菌和/或細(xì)菌與有效量的具有登錄號(mtcc-5674)的枯草芽孢桿菌亞種shriramensis新型細(xì)菌進(jìn)行接觸。在本發(fā)明的另一個實施例中，提供了抑制病原真菌和/或細(xì)菌生長的方法，其中所述方法包括使病原真菌和/或細(xì)菌與有效量的包含具有登錄號(mtcc-5674)的枯草芽孢桿菌亞種shriramensis新型細(xì)菌的組合物進(jìn)行接觸。在本發(fā)明的另一個實施例中，提供了抑制病原真菌和/或細(xì)菌生長的方法，其中所述方法包括使病原真菌和/或細(xì)菌與有效量的包含枯草芽孢桿菌亞種shriramensis(mtcc-5674)新型細(xì)菌的提取物的組合物進(jìn)行接觸，其中所述提取物具有抗菌和/或抗真菌活性。在本發(fā)明的另一個實施例中，提供了抑制病原真菌和/或細(xì)菌生長的方法，其中所述方法包括使病原真菌和/或細(xì)菌與有效量的包含枯草芽孢桿菌亞種shriramensis(mtcc-5674)新型細(xì)菌和所述新型細(xì)菌枯草芽孢桿菌亞種shriramensis的提取物的組合物進(jìn)行接觸，其中所述提取物具有抗菌活性和/或抗真菌活性。在本發(fā)明的一個實施例中，提供了具有登錄號(mtcc-5674)的枯草芽孢桿菌亞種shriramensis新型細(xì)菌或包含所述新型細(xì)菌或其提取物或其組合的組合物在制備用于抑制病原真菌和/或細(xì)菌生長的抗菌和/或抗真菌組合物中的用途。在本發(fā)明的另一個實施例中，提供了具有登錄號(mtcc-5674)的枯草芽孢桿菌亞種shriramensis新型細(xì)菌在制備用于抑制病原真菌和/或細(xì)菌生長的抗菌和/或抗真菌組合物中的用途。在本發(fā)明的另一個實施例中，提供了包含新型細(xì)菌枯草芽孢桿菌亞種shriramensis(mtcc-5674)在制備用于抑制病原真菌和/或細(xì)菌生長的抗菌和/或抗真菌組合物中的用途。在本發(fā)明的另一個實施例中，提供了包含新型細(xì)菌枯草芽孢桿菌亞種shriramensis(mtcc-5674)的提取物的組合物在制備用于抑制病原真菌和/或細(xì)菌生長的抗菌和/或抗真菌組合物中的用途。在本發(fā)明的另一個實施例中，提供了包含新型細(xì)菌枯草芽孢桿菌亞種shriramensis(mtcc-5674)的提取物和所述新型細(xì)菌枯草芽孢桿菌亞種shriramensis的提取物的組合物在制備用于抑制病原真菌和/或細(xì)菌生長的抗菌和/或抗真菌組合物中的用途。在另一個實施例中，提供了包含具有登錄號(mtcc-5674)的枯草芽孢桿菌亞種shriramensis新型細(xì)菌的藥物的和農(nóng)業(yè)上有效的組合物。在另一個實施例中，提供了包含新型細(xì)菌枯草芽孢桿菌亞種shriramensis(mtcc-5674)的提取物的藥物的和農(nóng)業(yè)上有效的組合物。在本發(fā)明的另一個實施例中，提供了從具有登錄號(mtcc-5674)的枯草芽孢桿菌亞種shriramensis新型細(xì)菌產(chǎn)生所述有效組合物的方法。在本發(fā)明的另一個實施例中，生產(chǎn)所述組合物/提取物所需的步驟和時間伴隨著化合物的最大回收率保持在最小持續(xù)時間。本發(fā)明的其它優(yōu)點或益處與抗菌和/或抗真菌劑一起的細(xì)菌枯草芽孢桿菌亞種shriramensis(mtcc-5674)也產(chǎn)生強的嗜熱蛋白酶和淀粉酶，其即使在暴露于高溫，即121℃15分鐘后，它們也是有活性的。通過以下實施例進(jìn)一步解釋本發(fā)明。然而，本發(fā)明不以任何方式限于這些實施例。以下實施例旨在說明公開內(nèi)容的工作，并且不旨在限制性地應(yīng)用對本發(fā)明范圍的任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，本文所述的具體物質(zhì)的等同替代物或相應(yīng)的改進(jìn)被認(rèn)為在本發(fā)明的范圍內(nèi)。在以下實施例中解釋詳細(xì)方法：本工作中使用的方法在微生物學(xué)中是眾所周知的，其中各個參數(shù)對于本研究而言是變化的和優(yōu)化的。實施例11.1空氣樣品的收集和初步篩選在海得拉巴和帕坦切魯(泰倫加納，印度)的不同地點進(jìn)行空氣取樣。在實驗室中制備含有t3培養(yǎng)基的一次性培養(yǎng)皿，并將其在不同位置暴露于空氣。將暴露的板密封并在30℃下在實驗室培養(yǎng)箱中孵育。在帕坦切魯?shù)貐^(qū)暴露于空氣的其中一個平板中，觀察到由真菌菌絲體包圍的細(xì)菌菌落。1.2初步篩選空氣樣品的抗菌和/或抗真菌活性盡管繼續(xù)孵育，間隙區(qū)仍保持，并且真菌菌絲體的生長保持局限于間隙區(qū)的周邊。使用標(biāo)準(zhǔn)微生物學(xué)方法對來自該菌落的微生物進(jìn)行純化(圖1b)。針對普通真菌尖孢鐮刀菌檢測個體菌落(圖2)。其中一個菌落顯示抑制真菌生長，并觀察到間隙區(qū)(圖2)。1.3新分離株的篩選在顯微鏡下對細(xì)菌的評價顯示其是桿狀運動細(xì)菌(圖5)。在孵育6天后，細(xì)菌產(chǎn)生孢子。細(xì)菌的菌落是粘液狀的，凸起的，圓形的，光滑的，并且奶油色至灰白色(圖4)，并且細(xì)胞顯示可變的革蘭氏染色。實施例22.1新型微生物的表征和鑒定2.1.1具有登錄號(mtcc-5674)的新型分離株枯草芽孢桿菌亞種shriramensis的表征進(jìn)行了一系列生化試驗，包括糖類發(fā)酵，過氧化氫酶試驗，氧化發(fā)酵試驗，淀粉水解，硫化氫生產(chǎn)試驗，氧化酶活性試驗。這些試驗的結(jié)果證實，細(xì)菌是過氧化氫酶陽性的，淀粉酶陽性的，氧化酶陽性的和強好氧的。2.1.1.1枯草芽孢桿菌亞種shriramensis(mtcc-5674)-菌落形態(tài)枯草芽孢桿菌shriramensis(mtcc-5674)的菌落是粘液狀的，凸起的，圓形的，光滑的，并且在顏色上是奶油色至灰白色(圖4)。2.1.1.2培養(yǎng)特征枯草芽孢桿菌亞種shriramensis(mtcc-5674)在30℃(可從15℃增長至55℃)顯示最佳生長。由于它是需氧細(xì)菌，其需要足夠的氧氣用于其生長，需要在液體培養(yǎng)基中連續(xù)振蕩培養(yǎng)。2.1.1.3細(xì)胞形態(tài)學(xué)枯草芽孢桿菌shriramensis(mtcc-5674)細(xì)胞是桿狀，雙桿菌和運動的(圖5)。2.1.1.3.1與枯草芽孢桿菌和萎縮芽孢桿菌相比較，枯草芽孢桿菌亞種shriramensis(mtcc-5674)的菌落生長和形態(tài)2.1.1.4過氧化氫酶試驗材料·枯草芽孢桿菌亞種shriramensis(mtcc-5674)的培養(yǎng)管·過氧化氫方法·將含有l(wèi)b培養(yǎng)基的三個管標(biāo)記為“試驗”，“陽性對照”和“陰性對照”，分別將整環(huán)枯草芽孢桿菌亞種shriramensis(mtcc-5674)，大腸桿菌和肺炎鏈球菌接種在試管中。在30℃下孵育24小時后，在所有管中加入幾滴過氧化氫并觀察氣泡的形成。結(jié)果在“試驗”和“陽性對照”管中形成氣泡，表明枯草芽孢桿菌亞種shriramensis(mtcc-5674)是過氧化氫酶陽性菌(圖6)。2.1.1.5淀粉水解材料·枯草芽孢桿菌shriramensis(mtcc-5674)培養(yǎng)物濾液·淀粉瓊脂板·碘·保溫箱方法根據(jù)附錄i(vi)中提供的方法制備淀粉瓊脂培養(yǎng)基。在含有淀粉瓊脂培養(yǎng)基的平板中以相等的距離制備兩個孔，并標(biāo)記為“試驗”和“陰性對照”。將500μl每份的枯草芽孢桿菌亞種shriramensis(mtcc-5674)培養(yǎng)物濾液和無菌蒸餾水分配到標(biāo)記為“試驗”和“陰性對照”的孔中。將平板在50℃孵育4小時。結(jié)果孵育4小時后，試驗孔周圍的藍(lán)色消失，表明枯草芽孢桿菌亞種shriramensis(mtcc-5674)培養(yǎng)物濾液具有淀粉分解活性。在對照孔周圍的區(qū)域中沒有觀察到藍(lán)色的變化(圖7)。2.1.1.6o/f(氧化-發(fā)酵)試驗材料·hugshleifson氧化發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基·試管·大腸桿菌培養(yǎng)物·枯草芽孢桿菌亞種shriramensis(mtcc-5674)·保溫箱方法將含有hugshleifson氧化發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基(ofbm)(附錄-i(vii)的三個管標(biāo)記為“陰性對照”，“陽性對照”和“試驗”，和整環(huán)糞產(chǎn)堿桿菌，大腸桿菌和枯草芽孢桿菌亞種shriramensis(mtcc-5674)分別接種在試管中。將試管在30℃下溫育48小時，并觀察顏色的變化。結(jié)果從觀察結(jié)果得出結(jié)論，試驗生物體(枯草芽孢桿菌亞種shriramensis(mtcc-5674)是嚴(yán)格需氧的，因為其沒有在培養(yǎng)基的深處發(fā)酵碳水化合物(既沒有氣體形成也沒有顏色變化)。由于在培養(yǎng)基表面上有氧，從而觀察到一些顏色變化，而大腸桿菌在培養(yǎng)基內(nèi)部深處生長得很好，并且發(fā)酵碳水化合物(氣體形成和培養(yǎng)基顏色變化)，表明它是兼性厭氧菌(圖8)。在陰性對照中，既沒有觀察到氣體形成也沒有觀察到顏色變化。2.1.1.7硫化氫生產(chǎn)試驗材料·sim(硫化吲哚動力)培養(yǎng)基·培養(yǎng)管·大腸桿菌培養(yǎng)物·枯草芽孢桿菌亞種shriramensis(mtcc-5674)·保溫箱方法·含有sim[硫化吲哚動力{附錄–i(vii)}]的培養(yǎng)基的管被標(biāo)記為“陰性對照”和”試驗”，并且分別將整環(huán)大腸桿菌和枯草芽孢桿菌亞種shriramensis(mtcc-5674)接種在試管中，在30℃溫育24小時，觀察顏色變化。結(jié)果根據(jù)觀察結(jié)果，已經(jīng)得出結(jié)論，由于培養(yǎng)基沒有變黑，因此試驗生物體對于h2s的生產(chǎn)是陰性的。在陰性對照中觀察到相同的結(jié)果(圖9)。2.1.1.8ph對枯草芽孢桿菌亞種shriramensis(mtcc-5674)生長的影響在標(biāo)準(zhǔn)條件下，使用含有調(diào)節(jié)至3.4至11.0(酸性至堿性)的不同ph值的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基(lb)的培養(yǎng)管來生長枯草芽孢桿shriramensis(mtcc-5674)。在ph為6.4～7.2的范圍內(nèi)觀察到了枯草芽孢桿菌亞種shriramensis(mtcc-5674)的生長，發(fā)現(xiàn)最佳ph為7.0。2.1.1.9枯草芽孢桿菌亞種shriramensis(mtcc-5674)的抗生素敏感性試驗將24小時的枯草芽孢桿菌亞種shriramensis(mtcc-5674)培養(yǎng)物鋪展在t3瓊脂的表面上。將不同的抗生素紙片置于用相應(yīng)抗生素標(biāo)記的t3瓊脂板的表面上。將板在30℃孵育24小時。表1-對枯草芽孢桿菌亞種shriramensis(mtcc-5674)的抗生素敏感性的觀察res-抗性，int-中度的，sen-敏感的結(jié)果從觀察結(jié)果得出結(jié)論：枯草芽孢桿菌亞種shriramensis(mtcc-5674)對抗生素-氨芐青霉素，羧芐青霉素，卡那霉素，恩諾沙星，潔霉素，阿莫西林，克林霉素，新霉素，阿奇霉素是有抗性的。試驗細(xì)菌對慶大霉素，妥布霉素，萬古霉素，新生霉素，磺胺異惡唑，頭孢霉素，氯霉素，頭孢曲松鈉和桿菌肽敏感，并顯示出對苯唑西林，阿米卡星，鏈霉素和紅霉素的中度抗性。2.1.2新分離株枯草芽孢桿菌亞種shriramensis(mtcc-5674)的鑒定為了鑒定細(xì)菌，進(jìn)行16sdna測序和fame分析。兩個研究的結(jié)果表明，該細(xì)菌與枯草芽孢桿菌亞種subtilis在16sdna序列上的差異為0.37％，fame相似指數(shù)為0.827；并且與萎縮芽孢桿菌在16sdna序列上的差異為0.84％，fame相似指數(shù)為0.749。因此，結(jié)果表明該細(xì)菌與枯草芽孢桿菌和萎縮芽孢桿菌相關(guān)，但不與atcc集合中的任何編目的細(xì)菌種類相同。2.1.2.116sdna序列比較的結(jié)果2.1.2.2fame分析比較結(jié)果分離的細(xì)菌是芽孢桿菌屬的新成員。根據(jù)細(xì)菌命名慣例，新型細(xì)菌種被命名為枯草芽孢桿菌亞種shriramensis。細(xì)菌被儲存在印度昌迪加爾的imtech的微生物典型培養(yǎng)物保藏中心(mtcc)中。這種新型物質(zhì)的儲存號是(mtcc-5674)。實施例33.1抗菌和/或抗真菌劑的生產(chǎn)和篩選3.1.1抗菌和/或抗真菌劑的生產(chǎn)材料·t3液體培養(yǎng)基-1升·錐形瓶-容量2l·卡那霉素(30μg/ml)·枯草芽孢桿菌shriramensis(mtcc-5674)接種物·振蕩培養(yǎng)箱(設(shè)置在30℃溫度和200rpm搖動)方法根據(jù)附錄-i(1)中描述的方法制備t3液體培養(yǎng)基。將1ml枯草芽孢桿菌亞種shriramensis(mtcc-5674)培養(yǎng)物接種到無菌t3液體培養(yǎng)基中，并在振蕩培養(yǎng)箱中在30℃下孵育60小時，同時以200rpm振蕩。在枯草芽孢桿菌亞種shriramensis(mtcc-5674)在t3液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)60小時后，將培養(yǎng)基在12000rpm和4℃下離心10分鐘。收集上清液并通過0.22μm過濾器以分離出任何殘留的細(xì)菌細(xì)胞。濾液保持在4℃。3.1.2篩選在上述步驟3.1.1中收集的培養(yǎng)物濾液的抗菌和/或抗真菌活性材料·含有抗菌和/或抗真菌劑的枯草芽孢桿菌亞種shriramensis(mtcc-5674)培養(yǎng)物濾液·pda平板·試驗真菌尖孢鐮刀菌·保溫箱方法為了檢測濾液中抗菌和/或抗真菌劑的活性，在pda瓊脂板的一個角中制備孔，將500μl濾液置于孔中。將整環(huán)真菌尖孢鐮刀菌接種在同一pda瓊脂板的另一個角上，并在室溫下孵育5天。將濾液對真菌尖孢鐮刀菌的抑制活性記錄為孔周圍的以毫米計算的抑菌圈。結(jié)果在孔周圍觀察到14mm的清楚的抑菌圈，這表明用于生產(chǎn)抗菌和/或抗真菌劑的方法是最佳的。3.2抗菌和/或抗真菌劑的表征調(diào)查與枯草芽孢桿菌亞種shriramensis相關(guān)的抗菌和/或抗真菌活性以確定引起抗菌和/或抗真菌活性的試劑的性質(zhì)。材料·t3液體培養(yǎng)基-1升·錐形瓶-容量2l·卡那霉素(30μg/ml)·枯草芽孢桿菌亞種shriramensis(mtcc-5674)接種物·振蕩培養(yǎng)箱方法根據(jù)附錄-i(1)中描述的方法制備t3液體培養(yǎng)基。將1ml24小時的枯草芽孢桿菌亞種shriramensis(mtcc-5674)接種到無菌t3液體培養(yǎng)基中，并在振蕩培養(yǎng)箱中在30℃下孵育60小時，同時以200rpm振蕩。在枯草芽孢桿菌亞種shriramensis(mtcc-5674)在t3液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)60小時后，將培養(yǎng)基在12000rpm和4℃下離心10分鐘。收集上清液并通過0.22μm過濾器以除去任何殘留的細(xì)菌細(xì)胞。3.2.1用枯草芽孢桿菌亞種shriramensis(mtcc-5674)細(xì)菌細(xì)胞進(jìn)行的抗菌和/或抗真菌試驗為了檢測細(xì)胞的抗菌和/或抗真菌劑的活性，將整環(huán)枯草芽孢桿菌亞種shriramensis(mtcc-5674)接種在t3瓊脂板的一個角上，并將整環(huán)真菌尖孢鐮刀菌接種在同一t3瓊脂板的另一角上，并在室溫下孵育5天。將細(xì)菌細(xì)胞對真菌尖孢鐮刀菌的抑制活性記錄為細(xì)菌菌落周圍的以毫米計算的抑菌圈。結(jié)果在細(xì)菌菌落周圍觀察到14mm的清楚的抑菌圈(圖11a)，這表明由細(xì)菌細(xì)胞分泌的活性化合物正在培養(yǎng)基中擴(kuò)散出來，從而產(chǎn)生遠(yuǎn)離細(xì)菌菌落的間隙區(qū)。3.2.2使用枯草芽孢桿菌亞種shriramensis(mtcc-5674)培養(yǎng)物濾液進(jìn)行的抗菌和/或抗真菌試驗為了檢測濾液中抗菌和/或抗真菌劑的性質(zhì)，在pda瓊脂板中制備孔，將500μl濾液置于孔中。將整環(huán)真菌尖孢鐮刀菌接種在同一pda瓊脂板的斜對角并在室溫下孵育5天。將濾液對真菌尖孢鐮刀菌的抑制活性記錄為孔周圍的以毫米計算的抑菌圈。結(jié)果在孔周圍觀察到清楚的14mm的抑菌圈(圖11b)，表明濾液保持抗菌和/或抗真菌活性，從而表明活性化合物被分泌到細(xì)菌細(xì)胞外進(jìn)入培養(yǎng)基中。3.3枯草芽孢桿菌亞種shriramensis(mtcc-5674)抗菌和/或抗真菌劑的mic測定3.3.1抗菌和/或抗真菌劑的凍干材料·枯草芽孢桿菌亞種shriramensis(mtcc-5674)的培養(yǎng)物濾液·硫酸銨·冷凍干燥器方法通過3.1.1中解釋的方法生產(chǎn)和純化抗菌和/或抗真菌劑。將800ml等分培養(yǎng)物濾液與382.18g硫酸銨以70％(w/v)飽和度混合(jing等人，2009修訂協(xié)議)，并通過在4℃下攪拌過夜以緩慢混合溶液。將懸浮液在4℃下以10,000rpm離心10分鐘。將由此獲得的沉淀物在冷凍干燥器中凍干24小時，并將干燥的沉淀物在室溫下儲存。3.3.2枯草芽孢桿菌亞種shriramensis(mtcc-5674)抗菌和/或抗真菌劑的mic方法3.3.2.1管稀釋法3.3.2.2瓊脂擴(kuò)散法·制備凍干抗菌和/或抗真菌劑的儲備溶液通過將1g抗菌和/或抗真菌劑的凍干粉末溶解在50ml磷酸鹽緩沖液(ph7.0)中制備儲備溶液。將儲備溶液的最終濃度調(diào)節(jié)至20μg/μl。該儲備溶液用于以如表-1所示的不同比例的pdb培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋。3.3.2.1管稀釋法材料·1.5ml管·pdb培養(yǎng)基·抗菌和/或抗真菌劑原料·尖孢鐮刀菌孢子懸浮液方法在1.5ml管中進(jìn)行抗菌和/或抗真菌劑的mic測定。用pdb培養(yǎng)基(表-2)制備從10μg/μl(1：1)至198ng/μl(1:100)的不同稀釋度的抗菌和/或抗真菌劑。通過在所有管中加入30μl(5×106cfu/ml)孢子懸浮液進(jìn)行針對尖孢鐮刀菌的mic測定，并在28℃下孵育2天，以180rpm搖動。使用三個對照，一個具有未稀釋的抗菌和/或抗真菌劑儲備，第二個在pdb中有70％硫酸銨，第三個僅具有pdb。在所有三個管中的培養(yǎng)基中接種30μl(5×106cfu/ml)尖孢鐮刀菌孢子懸浮液，并在28℃下孵育2天，同時以180rpm搖動。3.3.2.2瓊脂擴(kuò)散法材料·pda(馬鈴薯葡萄糖瓊脂)平板·pdb(馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)液)培養(yǎng)基·抗菌和/或抗真菌劑儲備·尖孢鐮刀菌方法凍干的枯草芽孢桿菌亞種shriramensis(mtcc-5674)抗菌和/或抗真菌劑的mic測定也通過瓊脂擴(kuò)散法進(jìn)行實施。在pda板上以相等的距離制作了四個孔，其中每個孔直徑為9mm。在pdb(表-3)中制備10μg(1：1)至198ng(1:100)不同稀釋度的抗菌和/或抗真菌劑。將每種稀釋液以200μl等分置于標(biāo)記有各自稀釋度的孔中。將試驗真菌尖孢鐮刀菌接種在pda培養(yǎng)基的中心，并將平板在28℃孵育4天。使用具有三個對照的板作為對照，三個對照中一個含有未稀釋的抗菌和/或抗真菌劑儲備，第二個僅含有pdb液體培養(yǎng)基，第三個含有具有70％硫酸銨的pdb。該活性被測量為孔周圍的以毫米計算的抑菌圈。結(jié)果管稀釋法(圖12)孵育48小時后在光學(xué)顯微鏡下觀察樣品的孢子萌發(fā)。在含有按照比例為1:1,1:2,1:3和1:4稀釋的抗菌和/或抗真菌劑的管中孢子不萌發(fā)。在含有以1:5,1:6,1:7,1:8和1:9的比例稀釋的抗菌和/或抗真菌劑的管中觀察到中度的孢子萌發(fā)，并且在含有抗菌劑和/或抗真菌劑的比例為1:10至1:100的剩余管觀察到正常的孢子萌發(fā)和菌絲體形成(表2)。表-2通過管稀釋法檢測抗菌和/或抗真菌劑的mic瓊脂擴(kuò)散法(圖13)在含有以比例1:1，1:2，1:3和1:4(表3)稀釋的抗菌和/或抗真菌劑的孔周圍，觀察到真菌菌絲體生長的抑制。在含有以比例1:5,1:6和1:7稀釋的抗菌和/或抗真菌劑的孔的周圍觀察到中度抑制，并且在剩余稀釋度中沒有觀察到抑制(從1:8至1:100)(表3)。結(jié)論從上述試驗得出，粗提物粉末至其1:4(v/v)的稀釋物中的抗菌和/或抗真菌劑以濃度依賴性方式抑制孢子萌發(fā)以及菌絲體生長。表3通過瓊脂擴(kuò)散法測定抗菌和/或抗真菌劑的mic3.4檢測新型分離的枯草芽孢桿菌亞種shriramensis(mtcc-5674)的細(xì)胞裂解物的抗菌和/或抗真菌活性材料·pda瓊脂板·lb液體培養(yǎng)基·枯草芽孢桿菌亞種shriramensis(mtcc-5674)細(xì)胞·溶菌酶·保溫箱方法3.4.1枯草芽孢桿菌亞種shriramensis(mtcc-5674)的細(xì)胞裂解根據(jù)附錄i(3)中描述的方法制備lb液體培養(yǎng)基。將枯草芽孢桿菌亞種shriramensis(mtcc-5674)的單個菌落接種到無菌lb液體培養(yǎng)基中，并在30℃下孵育24小時。培養(yǎng)24小時后，以6500rpm，4℃離心收集營養(yǎng)細(xì)胞，將細(xì)胞用無菌蒸餾水洗滌三次，并在37℃下在溶菌酶中孵育2小時進(jìn)行細(xì)胞裂解。裂解后，將懸浮液在4℃下以10,000rpm離心10分鐘以除去細(xì)胞碎片。收集上清液并通過0.22μm過濾器并在4℃儲存。3.4.2細(xì)胞裂解物的抗菌和/或抗真菌測定在petri板中的pda瓊脂的兩個對角端部鉆了兩個孔，并將一個標(biāo)記為”試驗”，另一個作為“對照”。將500μl裂解物的等分試樣加入到試驗孔中，向?qū)φ湛字袃H加入500μl溶菌酶。將試驗真菌尖孢鐮刀菌接種在pda瓊脂的中間，并在室溫下孵育5天。結(jié)果細(xì)胞裂解物對真菌尖孢鐮刀菌沒有表現(xiàn)出抗菌和/或抗真菌活性(圖15)，表明抗菌和/或抗真菌劑主要分泌到培養(yǎng)基中。實施例44.1針對其他致病真菌檢測抗菌和/或抗真菌活性材料·枯草芽孢桿菌亞種shriramensis(mtcc-5674)·植物病原真菌1.立枯絲核菌(在茄科家族成員中引起紋枯病)。2.鞘腐敗病菌(引起水稻中的鞘腐病)3.炭疽菌(引起紅辣椒中的炭疽病)。4.玉米大斑病菌(引起turcicumblight)。5.球孢菌(引起碳腐病)?！3-液體培養(yǎng)基·t3-瓊脂板·pda-瓊脂板·保溫箱方法4.1.1用枯草芽孢桿菌亞種shriramensis(mtcc-5674)細(xì)胞針對各種植物病原真菌檢測抗菌和/或抗真菌活性將整環(huán)枯草芽孢桿菌亞種shriramensis(mtcc-5674)細(xì)胞和整環(huán)試驗真菌接種在標(biāo)記有相應(yīng)真菌的t3板的斜對角，并在28℃下孵育，直到細(xì)菌菌落附近觀察到真菌菌絲體的生長。4.1.2用濾液針對各種植物病原真菌檢測抗菌和/或抗真菌活性將500μl含有抗菌和/或抗真菌劑的培養(yǎng)物濾液的等分試樣加入到在pda瓊脂中制作的孔中，并將整環(huán)試驗真菌接種在用相應(yīng)真菌標(biāo)記的各個板的另一個角上，并在28℃孵育直到在含有培養(yǎng)物濾液的孔附近觀察到真菌菌絲體的生長。以孔周圍形成的抑菌圈的毫米數(shù)記錄濾液對目標(biāo)真菌的抑制活性。結(jié)果在抗菌和/或抗真菌測定中檢測了一系列引起植物疾病的真菌種類，并且在枯草芽孢桿菌亞種shriramensis(mtcc-5674)細(xì)胞及其培養(yǎng)濾液存在下，它們都表現(xiàn)出完全生長抑制。4.2保護(hù)水稻種子免受真菌侵襲的抗菌和/或抗真菌劑功效將水稻種子用尖孢鐮刀菌孢子和枯草芽孢桿菌亞種shriramensis(mtcc-5674)培養(yǎng)物濾液進(jìn)行處理，置于含有普通瓊脂的培養(yǎng)皿中，檢測枯草芽孢桿菌亞種shriramensis(mtcc-5674)抗菌和/或抗真菌劑在抑制對發(fā)芽種子真菌侵襲的功效。對照種子僅用尖孢鐮刀菌真菌孢子處理。結(jié)果在枯草芽孢桿菌亞種shriramensis(mtcc-5674)抗菌和/或抗真菌劑存在的條件下，真菌未能感染種子，所述水稻種子正常發(fā)芽。然而，僅用真菌處理的種子顯示嚴(yán)重的感染并且不能發(fā)芽(圖17)。4.3檢測植物的枯草芽孢桿菌亞種shriramensis(mtcc-5674)的病原性。材料·可噴霧形式的在1％cmc中的枯草芽孢桿菌亞種shriramensis(mtcc-5674)·水稻，棉花，煙草，玉米和番茄植株·噴霧器方法如果可以的話，將枯草芽孢桿菌培養(yǎng)物在一系列植物物種上進(jìn)行廣泛的病原行為檢測。將枯草芽孢桿菌亞種shriramensis(mtcc-5674)接種到2l錐形瓶中的1l無菌lb液體培養(yǎng)基中，30℃孵育24小時，以200rpm搖動。細(xì)菌生長后，以6,500rpm，4℃離心10分鐘收集細(xì)胞。將沉淀物在磷酸鹽緩沖液(ph7.0)中洗滌兩次，并在磷酸鹽緩沖液(ph7.0)中的1％cmc(羧甲基纖維素)中制成漿液。該懸浮液用于噴灑水稻，煙草，玉米，番茄和棉花等作物。結(jié)果從觀察結(jié)果可以看出，噴有枯草芽孢桿菌亞種shriramensis(mtcc-5674)的所有的植物種類(水稻，煙草，玉米，番茄和棉花)均沒有出現(xiàn)任何疾病癥狀，其生長發(fā)育與對照植物相當(dāng)，表明枯草芽孢桿菌亞種shriramensis(mtcc-5674)對植物種類是非致病性的(圖18)。實施例55.1含有枯草芽孢桿菌亞種shriramensis(mtcc-5674)細(xì)胞的抗菌和/或抗真菌組合物的制劑作為生物防治劑材料·枯草芽孢桿菌亞種shriramensis(mtcc-5674)·lb–液體培養(yǎng)基·pdb(馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)液)·磷酸鹽緩沖液(ph7.0)·cmc(羧甲基纖維素)方法5.1.1枯草芽孢桿菌亞種shriramensis(mtcc-5674)細(xì)胞懸浮液的制備將枯草芽孢桿菌shriramensis(mtcc-5674)接種在2l錐形瓶中的1l無菌lb液體培養(yǎng)基中，在30℃下孵育24小時，以200rpm搖動。枯草芽孢桿菌shriramensis(mtcc-5674)生長后，培養(yǎng)物在4℃下以6,500rpm離心10分鐘。將沉淀物在磷酸鹽緩沖液(ph7.0)中洗滌兩次，并與磷酸鹽緩沖液(ph7.0)中的1％cmc(羧甲基纖維素)混合，制備含有6×107cfu/ml的漿液。使用含有枯草芽孢桿菌亞種shriramensis(mtcc-5674)的漿液噴灑在植物上，通過浸漬處理植物幼苗根部。5.1.2檢測含有抗菌和/或抗真菌劑的制劑抑制番茄植株根系感染立枯絲核菌(nfcci-3194)的功效材料·含有枯草芽孢桿菌亞種shriramensis(mtcc-5674)的懸浮液·立枯絲核菌(nfcci-3194)真菌(在茄科家族成員中引起紋枯病)?！oilrite·番茄幼苗5.1.3立枯絲核菌(nfcci-3194)的制備使立枯絲核菌(nfcci-3194)在馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基(根據(jù)附錄i(v)提供的方法制備)中生長6天，隨著立枯絲核菌(nfcci-3194)的生長，將其與soilrite徹底混合，并在室溫下孵育15天，含有真菌的soilrite與土壤以1：1的比例混合?！し延酌绫狙芯渴褂?0厘米高的番茄幼苗。方法試驗按如下描述實施a.將番茄幼苗種植在含有立枯絲核菌(nfcci-3194)的土壤中，但不用枯草芽孢桿菌亞種shriramensis(mtcc-5674)處理。b.用含有枯草芽孢桿菌亞種shriramensis(mtcc-5674)的懸浮液處理番茄幼苗的根部，并種植在含有立枯絲核菌(nfcci-3194)的土壤中。c.未經(jīng)任何處理的番茄幼苗。a.用枯草芽孢桿菌亞種shriramensis(mtcc-5674)細(xì)胞和真菌立枯絲核菌(nfcci-3194)處理幼苗將番茄幼苗根浸于枯草芽孢桿菌亞種shriramensis(mtcc-5674)細(xì)胞制劑中30分鐘。將經(jīng)過處理的幼苗種植在含有與真菌立枯絲核菌(nfcci-3194)混合的土壤的盆中。對照幼苗為了在幼苗中誘導(dǎo)疾病，將番茄幼苗(未處理的)種植在含有與真菌立枯絲核菌(nfcci-3194)混合的土壤的盆中。對于陰性對照，番茄幼苗(未處理的)種植在含有未與真菌立枯絲核菌(nfcci-3194)混合的土壤的盆中。將含有番茄幼苗的所有盆栽移至溫室，保持至結(jié)實期。結(jié)果從觀察結(jié)果可以得出結(jié)論：用枯草芽孢桿菌亞種shriramensis(mtcc-5674)和真菌立枯絲核菌(nfcci-3194)的組合所處理的幼苗生長地非常好，與對照植物相當(dāng)，而種植在含有真菌立枯絲核菌(nfcci-3194)盆中的幼苗(未處理)與對照相比顯示出生長阻滯，花果形成不佳。因此，可以得出結(jié)論：枯草芽孢桿菌亞種shriramensis(mtcc-5674)抑制番茄幼苗根際區(qū)域的真菌立枯絲核菌(nfcci-3194)的生長，保護(hù)幼苗免受引起疾病的真菌之害(圖19)。實施例66.1體外評估可以防治發(fā)芽玉米種子感染土壤和種子真菌病原體草酸青霉菌(nfcci-1997)的枯草芽孢桿菌亞種shriramensis(mtcc-5674)細(xì)胞的最小數(shù)量。6.1.1細(xì)菌和真菌懸浮培養(yǎng)物的制備材料a.枯草芽孢桿菌亞種shriramensis(mtcc-5674)b.草酸青霉菌(nfcci-1997)-植物病原真菌c.多菌靈wp50(商業(yè)殺真菌劑)d.luriabertani培養(yǎng)基(lb)方法6.1.1.1枯草芽孢桿菌亞種shriramensis(mtcc-5674)的懸浮培養(yǎng)物的制備將枯草芽孢桿菌shriramensis(mtcc-5674)的純菌落(fig.20-1)接種在10mllb液體培養(yǎng)基中，并在30℃下以180rpm孵育24小時。為了制備生物防治劑，將1ml新鮮培養(yǎng)物接種在100mllb液體培養(yǎng)基中，并在30℃下以180rpm孵育24小時。通過定期測量培養(yǎng)物在625nm處的吸光度來監(jiān)測培養(yǎng)物的生長。通過離心收集細(xì)菌細(xì)胞，用無菌磷酸鹽緩沖液洗滌，在4℃以5500rpm離心10分鐘。將細(xì)胞最終懸浮于5ml無菌磷酸鹽緩沖液中。該濃縮懸浮液用于制備生物防治制劑。6.1.1.2草酸青霉菌(nfcci-1997)(真菌病原體)懸浮培養(yǎng)物的制備將草酸青霉菌(nfcci-1997)(圖20-2)的純菌落接種在pda板上，在28℃下孵育至孢子形成。將整環(huán)真菌孢子接種在100ml的pdb中，并在28℃下以180rpm孵育7天。將含有真菌孢子的培養(yǎng)物的水相部分收集在50ml聚丙烯試管中。通過在4℃下以8000rpm離心10分鐘的方式用無菌磷酸鹽緩沖液洗滌所述孢子。將所述孢子懸浮在所需體積的無菌磷酸鹽緩沖液中，得到6×104ml-1的cfu。6.1.2使用草酸青霉菌(nfcci-1997)(真菌病原體)感染土壤為了在土壤培養(yǎng)基中保持足夠的真菌孢子負(fù)荷，將50ml真菌孢子懸浮液(6×104cfu/ml)與1kg高壓滅菌的soilrite混合并在28℃下孵育10天。用真菌定殖的soilrite與土壤以1：1的比例均勻混合，并填充在96個杯托中。6.1.3用于生物防治土壤植物病害的枯草芽孢桿菌亞種shriramensis(mtcc-5674)制劑的制備材料a.cmc(羧甲基纖維素)b.蔗糖c.紅色聚合物(無殺真菌劑)d.枯草芽孢桿菌亞種shriramensis(mtcc-5674)細(xì)胞懸液(生物防治劑)e.多菌靈(商業(yè)殺真菌劑)為了評估可以抑制發(fā)芽玉米種子上的草酸青霉素(nfcci-1997)生長和病原性的枯草芽孢桿菌亞種shriramensis(mtcc-5674)的有效濃度，設(shè)計了四種不同制劑(詳細(xì)情況見下表)。將僅含有生物防治劑的制劑、僅含有商業(yè)殺真菌劑的制劑，以及不含生物防治劑的制劑或不含殺真菌劑的制劑用作對照。所有制劑都含有一種結(jié)合材料-cmc(羧甲基纖維素)，碳源(蔗糖)和紅色聚合物(無殺真菌劑)。1.對照-1(無真菌病原體和生物防治劑的制劑)該制劑由1％cmc，2％蔗糖和紅色聚合物組成。該制劑沒有生物防治劑，致病劑和殺真菌劑。用該制劑處理的種子用作對照種子。組成序列號組成重量/體積/數(shù)量最終濃度1cmc1.71μg1.00％w/v2蔗糖3.42μg2.00％w/v3紅色聚合物34μl19.88％v/v4水31.87μl-合計171μl-2.對照-2(具有真菌病原體但不含生物防治劑的制劑)該制劑由1％cmc，2％蔗糖和紅色聚合物組成。其沒有生物防治劑/商業(yè)殺真菌劑，但用該制劑處理的種子播種在接種有草酸青霉菌(nfcci-1997)真菌的土壤中。由于該種子周圍沒有生物或化學(xué)保護(hù)，該真菌大量生長，感染種子并在幼苗中發(fā)展成疾病。用該制劑處理的種子用作患病對照。組成序列號組成重量/體積/數(shù)量最終濃度1草酸青霉菌(nfcci-1997)存在于土壤中-2cmc1.71μg1.00％w/v3蔗糖3.42μg2.00％w/v4紅色聚合物34μl19.88％v/v5水31.87μl-合計171μl-3.對照-3(具有商品殺真菌劑“多菌靈wp50”的制劑)該制劑由1％cmc，2％蔗糖，紅色聚合物和商業(yè)殺真菌劑多菌靈wp50(商品名bavistin)組成，多菌靈以500μg/ml的濃度使用(mohiddin等，2013)。該制劑用于比較生物防治劑和商業(yè)殺真菌劑在抑制發(fā)芽種子附近的真菌生長中的功效。組成序列號組成重量/體積/數(shù)量最終濃度1多菌靈85.50μg2cmc1.71μg1.00％w/v3蔗糖3.42μg2.00％w/v4紅色聚合物34μl19.88％v/v5水31.87μl-合計171μl-4a.具有枯草芽孢桿菌亞種shriramensis(mtcc-5674)的制劑(5×104cfu)該制劑由1％cmc，2％蔗糖，紅色聚合物和枯草芽孢桿菌亞種shriramensis(mtcc-5674)細(xì)胞組成，細(xì)胞濃度為5×104cfu/ml。該制劑具有最少數(shù)量的枯草芽孢桿菌亞種shriramensis(mtcc-5674)細(xì)胞。組成4b.具有枯草芽孢桿菌亞種shriramensis(mtcc-5674)細(xì)胞的制劑(5×105cfu)該制劑由1％cmc，2％蔗糖，紅色聚合物和枯草芽孢桿菌亞種shriramensis(mtcc-5674)細(xì)胞組成，細(xì)胞濃度為5×105cfu/ml。組成4c.具有枯草芽孢桿菌(mtcc-5674)細(xì)胞的制劑(5×106cfu)該制劑由1％cmc，2％蔗糖，紅色聚合物和枯草芽孢桿菌亞種shriramensis(mtcc-5674)細(xì)胞組成。細(xì)胞濃度為5×106cfu/ml。組成4d.具有枯草芽孢桿菌亞種shriramensis細(xì)胞的制劑(5×107cfu)該制劑由1％cmc，2％蔗糖，紅色聚合物和枯草芽孢桿菌亞種shriramensis(mtcc-5674)細(xì)胞組成，細(xì)胞濃度為5×107cfu/ml(5000萬個細(xì)胞/ml載體)。該制劑具有最大數(shù)量的枯草芽孢桿菌亞種shriramensis(mtcc-5674)細(xì)胞。組成5.僅具有枯草芽孢桿菌亞種shriramensis(mtcc-5674)細(xì)胞的制劑(5×107cfu)該制劑由1％cmc，2％蔗糖，紅色聚合物和枯草芽孢桿菌亞種shriramensis(mtcc-5674)細(xì)胞組成，細(xì)胞濃度為5×107cfu/ml。該制劑具有最大數(shù)量的枯草芽孢桿菌亞種shriramensis(mtcc-5674)細(xì)胞，用于研究生物防治劑對種子發(fā)芽和植物生長的影響。組成種子包衣將上面給出的組合物的生物防治制劑涂覆在玉米種子上(圖21)。將每個處理的二十個玉米種子一式三份(共60個種子)用0.1％hgcl2表面滅菌10分鐘，并用95％乙醇沖洗，再每個用無菌水洗滌10分鐘。將干種子用不同制劑的171μl/60粒種子包被并且空氣干燥2小時。種子播種將所有處理的種子播種在96個杯托盤中，每次處理三次重復(fù)。所有的托盤都保存在溫室中并保持在受控的條件下。從種子發(fā)芽開始，托盤被監(jiān)測到5周。數(shù)據(jù)記錄發(fā)芽率在種子播種1周后記錄所有處理種子的發(fā)芽率。疾病發(fā)病種子播種4周后，疾病發(fā)病率以百分比記錄。用于記錄疾病發(fā)病率的公式(hoffmanetal。，2002)如下：結(jié)果種子發(fā)芽和幼苗生存在分別使用制劑-3(對照-3)，4c，1(對照-1)，4b，4d和5處理的種子中記錄了最佳種子發(fā)芽率，即93.33％，96.66％，100.00％，100.00％，100.00％和100.00％，隨后是用制劑-4a和2(對照-2)處理的種子中為83.33％，為33.33％。在用上述所有制劑處理的種子中，除了用制劑-3(其具有商業(yè)殺真菌劑)處理的種子，播種4周后的幼苗存活率記錄為100.00％，這清楚地表明商業(yè)殺真菌劑“多菌靈wp50”，盡管有效地抑制真菌生長，但并不是100.00％有效。含有不同濃度枯草芽孢桿菌亞種shriramensis(mtcc-5674)細(xì)胞的制劑(除了4a-，其具有最少數(shù)量的細(xì)胞)被證明是100.00％的有效保護(hù)枯草芽孢桿菌亞種shriramensis種子免受存在于土壤中的p.oxalicum(nfcci-1997)損害。用制劑-4a(使用細(xì)菌細(xì)胞最少濃度的制劑，為50,000個細(xì)胞/ml載體)處理的種子的發(fā)芽率的下降明確的表明需要基礎(chǔ)劑量的細(xì)菌細(xì)胞使發(fā)芽種子免受存在于土壤中的p.oxalicum(nfcci-1997)的損害。因此，細(xì)菌濃度為5×105cfu/ml(50萬個細(xì)胞/ml)的制劑-4b賦予了針對p.oxalicum(nfcci-1997)的良好保護(hù)，并給予100％的種子發(fā)芽和幼苗存活率，與對照種子相同。疾病發(fā)病率研究結(jié)果表明，處理之間具有顯著差異。用制劑1,4b，4c，4d和5處理的種子沒有表現(xiàn)出任何疾病癥狀并顯示出與對照幼苗相似的健康生長，表明存在于制劑中的生物防治劑枯草芽孢桿菌亞種shriramensis(mtcc-5674)大大抑制了真菌p.oxalicum(nfcci-1997)的生長和病原性，從而保護(hù)了種子免受真菌感染。用制劑-3(其具有商業(yè)殺真菌劑多菌靈50wp)處理的種子顯示出3.57％的疾病發(fā)病率，表明盡管商業(yè)殺真菌劑能夠有效抑制真菌生長，但不如在此研究中使用的生物防治劑好。表-6用不同制劑處理的玉米幼苗的疾病發(fā)病率百分比。分別用制劑4a和2處理的種子中記錄了82％和100％的疾病發(fā)病率。結(jié)果表明，在制劑4a中存在的枯草芽孢桿菌亞種shriramensis(mtcc-5674)細(xì)胞密度對抑制真菌生長無效，因此發(fā)芽種子被真菌感染，并在發(fā)芽2周后死亡。如預(yù)期，用制劑-2(既不具有生物防治劑，又不具有商業(yè)殺真菌劑)處理的種子顯示100％的疾病發(fā)病率，表明真菌感染發(fā)芽種子并在發(fā)芽的2周內(nèi)殺死幼苗。結(jié)論上述結(jié)果清楚地表明濃度為5×105cfu/ml(制劑-4b)的枯草芽孢桿菌亞種shriramensis(mtcc-5674)能有效抑制真菌病原體的生長，并對玉米發(fā)芽幼苗提供100％的保護(hù)。因此，生物防治劑可以成功地用于涂覆種子，以有效控制土壤傳播的致病真菌p.oxalicum(nfcci-1997)。6.2檢測枯草芽孢桿菌亞種shriramensis(mtcc-5674)細(xì)胞制劑在促進(jìn)植物的生長和產(chǎn)量中的功效材料和方法材料1.用6.1.3(4b)中提及的配方處理玉米，番茄和茄子的種子。2.控制玉米，番茄和茄子的種子。方法種子包衣用6.1.3(4b)中提及的制劑處理玉米，番茄和茄子種子，風(fēng)干。種子播種將處理和未處理(對照)的玉米，番茄和茄子種子播種在4米區(qū)域，每個重復(fù)三次，每個重復(fù)含有23個種子。保持標(biāo)準(zhǔn)間距測量，如：植物之間20厘米和60厘米行距。遵循適當(dāng)?shù)霓r(nóng)藝栽培措施，使這些作物種植成熟。結(jié)果植物生長參數(shù)和田間條件下產(chǎn)量顯著增加。用包含枯草芽孢桿菌亞種shriramensis(mtcc-5674)細(xì)胞的制劑包衣的種子在玉米，茄子和番茄中的產(chǎn)量分別提高了17.60％，37.15％和1.58％(表7)。玉米，茄子和番茄植物表現(xiàn)出更高的生長發(fā)育率和生物量積累(圖25中給出了處理和未處理玉米差異的代表性圖片)。早期關(guān)于植物生長促進(jìn)劑的報道也證明含有枯草芽孢桿菌的制劑通過生產(chǎn)60種不同類型的次級代謝物來增強植物的生長并誘導(dǎo)對疾病保護(hù)的全身抗性(compant等，2005和mohankumar等，2015)。表-7枯草芽孢桿菌亞種shriramensis(mtcc-5674)細(xì)胞制劑對玉米，番茄和茄子產(chǎn)量的影響。實施例77.1篩選抗真菌/抗菌劑抑制人類病原真菌生長的功效從各種皮膚和肺部感染的人群中分離出一系列引起人類疾病的真菌物種。針對所有分離的人類病原真菌檢測抗真菌和/或抗菌活性。材料和方法材料1.青霉亞種2.黃曲霉3.黑曲霉4.構(gòu)巢曲霉5.pda板6.從枯草芽孢桿菌亞種shriramensis(mtcc-5674)中分離的抗真菌/抗菌劑方法將500μl含有抗菌和/或抗真菌劑的培養(yǎng)物濾液的等分試樣加入到在pda瓊脂中制備的孔中，并將整環(huán)試驗真菌接種在用相應(yīng)真菌標(biāo)記的各個板的另一個角上并在28℃孵育直到在含有培養(yǎng)物濾液的孔附近觀察到真菌菌絲體的生長。以孔周圍形成的抑菌圈的毫米數(shù)記錄濾液對目標(biāo)真菌的抑制活性。結(jié)果從各種皮膚和肺部感染的人群中分離出一系列引起人類疾病的真菌物種并對其進(jìn)行抗菌和/或抗真菌測定，并且在枯草芽孢桿菌亞種shriramensis(mtcc-5674)培養(yǎng)物濾液存在下，它們都表現(xiàn)出枯草芽孢桿菌亞種shriramensis完全抑制生長(圖24)。結(jié)論從觀察結(jié)果可以看出，從枯草芽孢桿菌亞種shriramensis(mtcc-5674)中分離的抗真菌/抗菌劑也可用于制藥應(yīng)用。參考文獻(xiàn)1.compant,s.,duffy,b.,nowak,j.,clement,c.andbarka,e.a.(2005).useofplantsgrowthpromotingbacteriaforbiocontrolofplantdiseases:principles,mechanismsofaction,andfutureprospects.appl.environ.microbiol.71:4951-4959.sci.worldj.,vol2012,pp.001-012.2.hoffmann,w.a.andpoorter,h.2002.avoidingbiasincalculationsofrelativegrowthrate.ann.bot.,vol.90(1),pp.37-42.3.li,j.yang,q.zhao,l-h,zhang,s.m.,wang,y.x.xiao-yuandzhao,x.y.2009.purificationandcharacterizationofanovelantifungalproteinfrombacillussubtilisstrainb29.j.zhejianguniv.sci.b.,vol.10(4)pp.264–272.4.e.sas-paszt,l.andciesielska,j.2012.technologiesforbeneficialmicroorganismsinoculausedasbiofertilizers.thescientificworldjournalvolume2012,articleid491206,pp.1-12.5.mena-violante,h.g.andolalde-portugal,v.2007.alterationoftomatofruitqualitybyrootinoculationwithplantgrowth-promotingrhizobacteria(pgpr):bacillussubtilisbeb-13bs.sci.hort.,vol.1(113),pp.103–106.6.mohankumar,s.p.,chowdappa,p.andkrishna,v.(2015).developmentofseedcoatingformulationusingconsortiumofbacillussubtilisotpb1andtrichodermaharzianumotpb3forplantgrowthpromotionandinductionofsystemicresistanceinfieldandhorticulturalcrops.indianphytopath.68(1):25-31.7.mohiddin,f.a.andkhan,m.r.2013.toleranceoffungalandbacterialbio-controlagentstosixpesticidescommonlyusedinthecontrolofsoilborneplantpathogens.globalj.pests,dis.cropprot.,vol.1(1),pp.001-004.相關(guān)專利1.anovelstrainofbacillusforcontrollingplantdiseasesandcornrootworm.(ep981540a1).2.strainofbacillussubtilisforagriculturaluse.(wo2009031874a1).3.antifungalbacillussubtilisandamicroorganismwettablepowdercontainingthesame(kr2011075132a).附錄i使用的培養(yǎng)基的組成注意：下面提供了培養(yǎng)基制備的一般方法。以下給出的所有培養(yǎng)基組合物為100ml體積。組分根據(jù)所需數(shù)量而改變。(i)t3液體培養(yǎng)基的制備(ph-6.8)t3培養(yǎng)基的組成序列號組成數(shù)量1胰蛋白胨0.32％(w/v)2胰蛋白示0.24％(w/v)3酵母提取物0.18％(w/v)4nah2po4.h2o0.044m5na2hpo40.062m6mncl2.4h2o0.0005％(w/v)方法將所有培養(yǎng)基成分稱重收進(jìn)玻璃瓶中并溶于蒸餾水中。將具有培養(yǎng)基的容器在121℃下高壓滅菌15分鐘。(ii)t3瓊脂板的制備(ph-6.8)t3培養(yǎng)基的組成序列號組成數(shù)量1胰蛋白胨0.32％(w/v)2胰蛋白示0.24％(w/v)3酵母提取物0.18％(w/v)4nah2po40.044m5na2hpo40.062m6mncl20.0005％(w/v)7瓊脂2.0％(w/v)方法將所有培養(yǎng)基成分稱重收進(jìn)玻璃瓶中并溶于蒸餾水中。將具有培養(yǎng)基的玻璃瓶在121℃下高壓滅菌15分鐘。高壓滅菌后，將培養(yǎng)基倒入無菌培養(yǎng)皿中。(iii)lb液體培養(yǎng)基的制備(ph-7.0)lb培養(yǎng)基的組成序列號組成數(shù)量1胰蛋白胨1.0％(w/v)2酵母提取物0.5％(w/v)3nacl1.0％(w/v)方法將所有培養(yǎng)基成分稱重收進(jìn)玻璃瓶中并溶于蒸餾水中。將具有培養(yǎng)基的容器在121℃下高壓滅菌15分鐘。(ⅳ)lb瓊脂板的制備(ph-7.0)lb培養(yǎng)基的組成序列號組成數(shù)量1胰蛋白胨1.0％(w/v)2酵母提取物0.5％(w/v)3nacl1.0％(w/v)4瓊脂2.0％(w/v)方法將所有培養(yǎng)基成分稱重并收進(jìn)玻璃瓶中并溶于蒸餾水中。將具有培養(yǎng)基的玻璃瓶在121℃下高壓滅菌15分鐘。高壓滅菌后，將培養(yǎng)基倒入無菌培養(yǎng)皿中。(v)pdb液體培養(yǎng)基的制備(ph-6.0)pdb培養(yǎng)基的組成序列號組成數(shù)量1馬鈴薯粉2.0％(w/v)2葡萄糖2.0％(w/v)3壯觀霉素(可選)100μg/ml方法稱量馬鈴薯粉(2.0g)并收進(jìn)含有50ml蒸餾水的250ml玻璃瓶中并煮沸5分鐘。用棉布過濾煮沸的馬鈴薯水。將濾液收集到新鮮的250ml玻璃瓶中，并向其中加入2.0g葡萄糖。使總體積達(dá)到100ml后，將具有培養(yǎng)基的瓶子在121℃高壓滅菌15分鐘。(vi)pda瓊脂板的制備(ph-6.0)pda培養(yǎng)基的組成方法稱量馬鈴薯粉(2.0g)收進(jìn)含有50ml蒸餾水的250ml玻璃瓶中并煮沸5分鐘。用棉布過濾煮沸的馬鈴薯水。將濾液收集在新鮮的250ml玻璃瓶中，加入2.0g葡萄糖和2.0g瓊脂。使總體積達(dá)到100ml后，將具有培養(yǎng)基的瓶子在121℃高壓滅菌15分鐘。將熔融的pda倒入無菌培養(yǎng)皿中。(vii)hugh和leifsonof基礎(chǔ)培養(yǎng)基(ofbm)的制備(ph-7.1)ofbm培養(yǎng)基的組成序列號組成數(shù)量1酪蛋白胨(胰蛋白胨)0.2％0.2％(w/v)2nacl0.5％(w/v)3k2hp040.03％(w/v)4瓊脂2.0％(w/v)5溴百里酚藍(lán)0.004％(w/v)方法將所有培養(yǎng)基成分稱重并收進(jìn)玻璃瓶中并溶于蒸餾水中。將具有培養(yǎng)基的玻璃瓶在121℃下高壓滅菌15分鐘。高壓滅菌后，將培養(yǎng)基倒入無菌培養(yǎng)管中。(vi)sim(硫化吲哚動力)培養(yǎng)基(ph-7.3)的制備sim培養(yǎng)基的組成序列號組成數(shù)量1蛋白胨3.0％(w/v)2牛肉提取物0.3％(w/v)3硫酸亞鐵銨0.02％(w/v)4硫代硫酸鈉0.0025％(w/v)7瓊脂2.0％(w/v)方法將所有培養(yǎng)基成分稱重收進(jìn)玻璃瓶中并溶于蒸餾水中。將具有培養(yǎng)基的玻璃瓶在121℃下高壓滅菌15分鐘。高壓滅菌后，將熔融階段的培養(yǎng)基倒入無菌培養(yǎng)管中。附錄ii制備磷酸鹽緩沖液方法將兩種磷酸鹽都收進(jìn)玻璃燒杯中，將50毫升蒸餾水加入到鹽中，并使用磁棒在磁力攪拌器上攪拌。確保磷酸鹽完全溶解后，用蒸餾水將溶液加至100ml。附錄iii實驗中使用的載體和其他試劑縮寫詞序列號簡寫全稱1atcc美國典型培養(yǎng)物保藏中心2cmc羧甲基纖維素3cfu菌落形成單位4l升5lbluria-bertani6μl微升7mtcc微生物典型培養(yǎng)物保藏中心8ml毫升9mic最低抑菌濃度10min分鐘11m摩爾12nfcci印度國家真菌培養(yǎng)物保藏中心13ofbm氧化發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基14pda馬鈴薯葡萄糖瓊脂15pdb馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)液16rpm每分鐘轉(zhuǎn)速17ssp亞種18sim硫化吲哚動力19v/v體積相比體積20w/v重量相比體積21w/w重量相比重量22wp可濕性粉劑pct/ro/134表當(dāng)前第1頁12當(dāng)前第1頁12