相關(guān)申請交叉參考本申請要求2014年8月25日提交的美國臨時(shí)專利申請第62/041,521號的優(yōu)先權(quán)的權(quán)益，其內(nèi)容以全文引用的方式并入本文中。本發(fā)明涉及大麻素的生物合成。具體地說，本發(fā)明涉及與大麻素的合成有關(guān)的酶的生產(chǎn)和處理，并且涉及不同比率的各種大麻素的同時(shí)合成。
背景技術(shù)：
：大麻素為在大麻(屬于大麻科的一年生的植物)中發(fā)現(xiàn)的萜酚化合物。植物含有大于400種化學(xué)物質(zhì)和大約70種大麻素。后者主要在腺毛中聚積。最活性的天然存在的大麻素為四氫大麻酚(thc)，其用于治療各種醫(yī)學(xué)病況，包括青光眼、aids消瘦、神經(jīng)痛、治療與多發(fā)性硬化癥相關(guān)聯(lián)的痙攣、肌肉纖維疼痛以及化學(xué)療法誘發(fā)的惡心。thc對過敏、炎癥、感染、癲癇癥、抑郁、偏頭痛、躁郁癥、焦慮癥、藥物依賴性和藥物戒斷綜合癥的治療也有效。附加的活性大麻素包括大麻二酚(cbd)、thc的異構(gòu)體，其為已知提供針對急性和慢性神經(jīng)退化的保護(hù)的強(qiáng)力抗氧化劑和抗發(fā)炎劑化合物；大麻萜酚(cbg)，在大麻中發(fā)現(xiàn)高濃度，其充當(dāng)高親和力α2腎上腺素受體激動劑、中等親和力5-ht1a受體拮抗劑和低親和力cb1受體拮抗劑，并且可能具有抗抑郁活性；以及大麻環(huán)萜酚(cbc)，其具有抗發(fā)炎、抗真菌和抗病毒特性。許多植物源性大麻素具有多種病的治療潛在性并且可在植物防御中以及在藥理學(xué)中起相關(guān)作用。因此，具有治療特性的大麻素和大麻素類化合物的生物技術(shù)生產(chǎn)具有極度重要性。因此，大麻素由于其在治療各種疾病中的有益效果而被認(rèn)為是有前景的試劑。不管其已知的有益效果如何，大麻素的治療使用受與植物的大規(guī)模種植和維護(hù)相關(guān)聯(lián)的高成本和獲得高收率大麻素的困難妨礙。大麻素從植物組織的提取、分離和純化尤其具有挑戰(zhàn)性，因?yàn)榇舐樗厝菀籽趸⑶覍夂蜔崦舾小４送?，雖然已假設(shè)cbca主要通過酶cbca合成酶由cbga合成，酶尚未分離或克隆。因此存在發(fā)展允許用于治療使用的大麻素的大規(guī)模生產(chǎn)的方法的需要。本發(fā)明解決此需要。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：因此本發(fā)明的目的是提供在本領(lǐng)域中的前述不足的解決方案。為這個(gè)目的，本發(fā)明提供生產(chǎn)一種或多種大麻素或大麻素類似物的方法，其包含以下步驟：(a)選擇根據(jù)式i的化合物：(b)選擇大麻素酸合成酶作為用于將根據(jù)式i的化合物轉(zhuǎn)化成一種或多種大麻素或大麻素類似物的催化劑；(c)使式i化合物與大麻素酸合成酶在包含溶劑和兩親性化合物的反應(yīng)混合物中反應(yīng)；(d)從反應(yīng)混合物中分離在步驟(c)中產(chǎn)生的一種或多種大麻素酸或大麻素類似物；和(e)任選地將在步驟(c)中分離的大麻素酸或大麻素類似物去羧基；其中，r選自-oh、鹵素、-sh或-nrarb基團(tuán)；r1和r2各自獨(dú)立地選自由以下組成的群組：-h、-c(o)ra、-ora、任選經(jīng)取代的c1-c10直鏈或支鏈亞烷基、任選經(jīng)取代的c2-c10直鏈或支鏈亞烯基、任選經(jīng)取代的c2-c10直鏈或支鏈亞炔基、任選經(jīng)取代的c3-c10芳基、任選經(jīng)取代的c3-c10環(huán)烷基、(c3-c10)芳基-(c1-c10)亞烷基、(c3-c10)芳基-(c2-c10)亞烯基以及(c3-c10)芳基-(c1-c10)亞炔基，或r1和r2與它們鍵結(jié)到的碳原子一起形成c5-c10環(huán)狀環(huán)；r3選自由以下組成的群組：h、-c(o)ra以及c1-c10直鏈或支鏈烷基；以及ra和rb各自獨(dú)立地為-h、-oh、-sh、-nh2、(c1-c10)直鏈或支鏈烷基或c3-c10環(huán)烷基。優(yōu)選地，大麻素酸合成酶為大麻二醇酸(cbda)合成酶或四氫大麻酚酸(thca)合成酶。在本發(fā)明的優(yōu)選方面，c5-c10環(huán)狀環(huán)包含一個(gè)或多個(gè)選自氧、硫或氮的雜原子。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選方面，r2為選自由以下組成的群組的直鏈亞烷基：ch3、c2h5、c3h7、c4h9、c5h11、c6h13、c7h15和c8h17。優(yōu)選地，r2為選自由以下組成的群組的c2-c10亞烯基：和并且r4為選自由以下組成的群組的直鏈亞烷基：ch3、c2h5、c3h7、c4h9、c5h11、c6h13、c7h15和c8h17。在另一個(gè)優(yōu)選方面，r2為選自由以下組成的群組的c2-c10直鏈或支鏈亞炔基：和在另外優(yōu)選實(shí)施例中，r2為其中x為-oh、-sh或-nrarb，并且其中ra和rb各自獨(dú)立地為-h、-oh、-sh、-nh2、(c1-c10)直鏈或支鏈烷基，或c3-c10環(huán)烷基。最優(yōu)選地，r為-oh，r1為cooh，r2為c5h11并且r3為-h。在一個(gè)實(shí)施例中，大麻素酸合成酶為通過產(chǎn)生大麻素酸合成酶基因的一種或多種拷貝和過表達(dá)由大麻素酸合成酶基因編碼的蛋白獲得的重組大麻素酸合成酶。在本發(fā)明的優(yōu)選方面，大麻素酸合成酶基因的一種或多種拷貝在體內(nèi)產(chǎn)生，并且所述方法包含步驟(i)將大麻素酸合成酶基因的一種或多種拷貝整合到真核宿主的基因組中以按比例放大蛋白表達(dá)。優(yōu)選地，真核宿主為巴斯德畢赤酵母，并且大麻素酸合成酶基因?yàn)橛脤δ繕?biāo)蛋白分泌的α分泌序列優(yōu)化并且用六個(gè)串聯(lián)組氨酸殘基標(biāo)記的密碼子。步驟(i)可包含通過用一種或多種限制酶消化將大麻素酸合成酶基因線性化；通過凝膠提取來提取大麻素酸合成酶基因；將大麻素酸合成酶基因接合到巴斯德畢赤酵母質(zhì)粒中；以及將質(zhì)粒電穿孔到細(xì)菌細(xì)胞中以產(chǎn)生一種或多種大麻素酸合成酶基因拷貝菌落。在本發(fā)明的優(yōu)選方面，溶劑為dmso，并且在反應(yīng)混合物中dmso的濃度為20％(w/v)。在另外優(yōu)選方面，兩親性化合物為表面活性劑或環(huán)糊精。在優(yōu)選實(shí)施例中，環(huán)糊精為α-環(huán)糊精、β-環(huán)糊精或γ-環(huán)糊精。甚至更優(yōu)選地，環(huán)糊精為硫代丁基醚β-環(huán)糊精鈉鹽或無規(guī)甲基化的β-環(huán)糊精，并且在反應(yīng)混合物中環(huán)糊精的濃度在2mg/ml和28mg/ml之間。在最優(yōu)選實(shí)施例中，在反應(yīng)混合物中環(huán)糊精的濃度為8mg/ml。在一個(gè)實(shí)施例中，大麻素或大麻素類似物為對映異構(gòu)純度為至少95％和優(yōu)選地至少99％的單對映異構(gòu)體。在優(yōu)選實(shí)施例中，大麻素酸合成酶為thca合成酶，并且一種或多種大麻素或大麻素類似物為四氫大麻酚(thca)、大麻環(huán)萜酚(cbca)、thca和cbca，或其類似物。在優(yōu)選方面，兩親性化合物為環(huán)糊精，并且環(huán)糊精與式i化合物的質(zhì)量:質(zhì)量比為28:1或環(huán)糊精與式i化合物的摩爾比為7.3:1。優(yōu)選地，反應(yīng)的步驟(c)在3.8和7.2之間的范圍內(nèi)的ph下進(jìn)行，并且所述方法在每個(gè)指定ph下產(chǎn)生thca、cbca，或如在下表中所示的比率的thca和cbca：優(yōu)選地，在兩小時(shí)內(nèi)98％的式i化合物轉(zhuǎn)化成一種或多種大麻素或大麻素類似物。在不同實(shí)施例中，大麻素酸合成酶為cbda合成酶，并且所述方法產(chǎn)生大麻二酚(cbda)、大麻環(huán)萜酚酸(cbca)、cbda和cbca，或其類似物。優(yōu)選地，兩親性化合物為環(huán)糊精，并且環(huán)糊精與式i化合物的質(zhì)量:質(zhì)量比為11:1或環(huán)糊精與式i化合物的摩爾比為4:1。優(yōu)選地，步驟(c)在3.8和7.2之間的范圍內(nèi)的ph下進(jìn)行。在優(yōu)選實(shí)施例中，所述方法在每個(gè)指定ph下產(chǎn)生cbda、cbca，或如在下表中所示的比率的cbda和cbca：phcbdacbca4.22.5151.1315.211.175.412.455.816.146.2128.136.800最優(yōu)選地，在兩小時(shí)內(nèi)98％的式i化合物轉(zhuǎn)化成一種或多種大麻素或大麻素類似物。在不同實(shí)施例中，本發(fā)明提供生產(chǎn)根據(jù)式ii的一種或多種大麻素或大麻素類似物的方法，其中所述方法包含以下步驟：(a)使根據(jù)式iii的化合物與根據(jù)式iv的化合物反應(yīng)；在催化式iii化合物與式iv化合物反應(yīng)的酶存在下反應(yīng)形成式ii化合物；(b)使式ii化合物與大麻素酸合成酶在包含溶劑和兩親性化合物的反應(yīng)混合物中反應(yīng)以產(chǎn)生一種或多種大麻素或大麻素類似物；(c)從反應(yīng)混合物中分離在步驟(b)中產(chǎn)生的一種或多種大麻素或大麻素類似物；以及(e)任選地將在步驟(c)中分離的一種或多種大麻素或大麻素類似物去羧基；其中，r選自-oh、鹵素、-sh或-nrarb基團(tuán)；r1和r2各自獨(dú)立地選自由以下組成的群組：-h、-c(o)ra、-ora、任選經(jīng)取代的直鏈或支鏈(c1-c10)亞烷基、任選經(jīng)取代的直鏈或支鏈(c2-c10)亞烯基、任選經(jīng)取代的直鏈或支鏈(c2-c10)亞炔基、任選經(jīng)取代的c3-c10芳基、任選經(jīng)取代的c3-c10環(huán)烷基、(c3-c10)芳基-(c1-c10)亞烷基、(c3-c10)芳基-(c2-c10)亞烯基以及(c3-c10)芳基-(c1-c10)亞炔基，或r1和r2與它們鍵結(jié)到的碳原子一起形成c5-c10環(huán)狀環(huán)；r3選自由以下組成的群組：h、-c(o)ra以及c1-c10直鏈或支鏈烷基；r5選自由以下組成的群組：直鏈或支鏈(c1-c10)亞烷基、直鏈或支鏈(c2-c10)亞烯基、直鏈或支鏈(c2-c10)亞炔基、-c(o)-(c1-c10)亞烷基、-c(o)-(c2-c10)亞烯基以及-c(o)-(c2-c10)亞炔基；其中任何亞烷基、亞烯基、亞炔基、芳基、芳基亞烷基或環(huán)烷基經(jīng)一個(gè)或多個(gè)選自由以下組成的群組的基團(tuán)進(jìn)一步取代：-oh、鹵素、-nrbrc、-c(o)ra、-c(o)nrbrc、(c1-c10)烷基、-cn、(c1-c4)烷氧基、(c1-c4)鹵烷基以及(c1-c4)羥基烷基；并且ra、rb以及rc各自獨(dú)立地為-h、-oh、-sh、-nh2、(c1-c10)直鏈或支鏈烷基或c3-c10環(huán)烷基。在一個(gè)實(shí)施例中，r5為選自由以下組成的群組的(c2-c10)亞烯基：和并且r4為選自由以下組成的群組的直鏈亞烷基：ch3、c2h5、c3h7、c4h9、c5h11、c6h13、c7h15和c8h17。在本發(fā)明的優(yōu)選方面，r5為并且r6選自(c1-c10)亞烷基、(c2-c10)亞烯基、-oh、-sh、no2、f、cl、br、-nh2或-nhra。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，大麻素酸合成酶為通過產(chǎn)生大麻素酸合成酶基因的一種或多種拷貝和過表達(dá)由大麻素酸合成酶基因編碼的蛋白獲得的重組大麻素酸合成酶。優(yōu)選地，大麻素酸合成酶基因的一種或多種拷貝在體內(nèi)產(chǎn)生，并且所述方法包含步驟(i)將大麻素酸合成酶基因的一種或多種拷貝整合到真核宿主基因組中以按比例放大蛋白表達(dá)。優(yōu)選地，真核宿主為巴斯德畢赤酵母，并且大麻素酸合成酶基因?yàn)橛脤δ繕?biāo)蛋白分泌的α分泌序列優(yōu)化并且用六個(gè)串聯(lián)組氨酸殘基標(biāo)記的密碼子。步驟(i)可包含通過用一種或多種限制酶消化將大麻素酸合成酶基因線性化；通過凝膠提取來提取大麻素酸合成酶基因；將大麻素酸合成酶基因接合到巴斯德畢赤酵母質(zhì)粒中；以及將質(zhì)粒電穿孔到細(xì)菌細(xì)胞中以產(chǎn)生一種或多種大麻素酸合成酶基因拷貝菌落。在本發(fā)明的優(yōu)選方面，溶劑為dmso，并且在反應(yīng)混合物中dmso的濃度為20％(w/v)。在另外優(yōu)選方面，兩親性化合物為表面活性劑或環(huán)糊精。在優(yōu)選實(shí)施例中，環(huán)糊精為α-環(huán)糊精、β-環(huán)糊精或γ-環(huán)糊精。甚至更優(yōu)選地，環(huán)糊精為硫代丁基醚β-環(huán)糊精鈉鹽或無規(guī)甲基化的β-環(huán)糊精，并且在反應(yīng)混合物中環(huán)糊精的濃度在2mg/ml和28mg/ml之間。在最優(yōu)選實(shí)施例中，在反應(yīng)混合物中環(huán)糊精的濃度為8mg/ml。在一個(gè)實(shí)施例中，大麻素或大麻素類似物為對映異構(gòu)純度為至少95％和優(yōu)選地至少99％的單對映異構(gòu)體。在優(yōu)選實(shí)施例中，大麻素酸合成酶為thca合成酶，并且一種或多種大麻素或大麻素類似物為四氫大麻酚(thca)、大麻環(huán)萜酚(cbca)、thca和cbca，或其類似物。在優(yōu)選方面，兩親性化合物為環(huán)糊精，并且環(huán)糊精與式i化合物的質(zhì)量:質(zhì)量比為28:1或環(huán)糊精與式i化合物的摩爾比為7.3:1。優(yōu)選地，反應(yīng)的步驟(c)在3.8和7.2之間的范圍內(nèi)的ph下進(jìn)行，并且所述方法產(chǎn)生thca、cbca，或如上文所描述的不同比率的thca和cbca。優(yōu)選地，在兩小時(shí)內(nèi)98％的式i化合物轉(zhuǎn)化成一種或多種大麻素或大麻素類似物。在不同實(shí)施例中，大麻素酸合成酶為cbda合成酶，并且所述方法產(chǎn)生大麻二酚(cbda)、大麻環(huán)萜酚酸(cbca)、cbda和cbca，或其類似物。優(yōu)選地，兩親性化合物為環(huán)糊精，并且環(huán)糊精與式i化合物的質(zhì)量:質(zhì)量比為11:1或環(huán)糊精與式i化合物的摩爾比為4:1。優(yōu)選地，步驟(c)在3.8和7.2之間的范圍內(nèi)的ph下進(jìn)行，并且所述方法產(chǎn)生cbda、cbca，或如上文所描述的不同比率的cbda和cbca。最優(yōu)選地，在兩小時(shí)內(nèi)70％的式i化合物轉(zhuǎn)化成一種或多種大麻素或大麻素類似物。在又一實(shí)施例中，本發(fā)明提供用于生產(chǎn)四氫大麻酚、大麻環(huán)萜酚或四氫大麻酚和大麻環(huán)萜酚兩者或其類似物的方法，其中所述方法包含以下步驟：(a)選擇根據(jù)式i的化合物；(b)使式的i化合物與四氫大麻酚酸(thca)合成酶在包含溶劑和兩親性化合物的反應(yīng)混合物中反應(yīng)；(c)改變反應(yīng)混合物的至少一種特性以獲得四氫大麻酚、大麻環(huán)萜酚，或四氫大麻酚和大麻環(huán)萜酚兩者，或其類似物作為產(chǎn)物；(d)從反應(yīng)混合物中分離四氫大麻酚、大麻環(huán)萜酚，或四氫大麻酚和大麻環(huán)萜酚兩者，或其類似物；以及(e)將四氫大麻酚酸、大麻環(huán)萜酚酸，或四氫大麻酚酸和大麻環(huán)萜酚酸兩者，或其類似物去羧基；其中，r選自-oh、鹵素、-sh或-nrarb基團(tuán)；r1和r2各自獨(dú)立地選自由以下組成的群組：-h、-c(o)ra、-ora、任選經(jīng)取代的c1-c10直鏈或支鏈亞烷基、任選經(jīng)取代的c2-c10直鏈或支鏈亞烯基、任選經(jīng)取代的c2-c10直鏈或支鏈亞炔基、任選經(jīng)取代的c3-c10芳基、任選經(jīng)取代的c3-c10環(huán)烷基、(c3-c10)芳基-(c1-c10)亞烷基、(c3-c10)芳基-(c2-c10)亞烯基以及(c3-c10)芳基-(c1-c10)亞炔基，或r1和r2與它們鍵結(jié)到的碳原子一起形成c5-c10環(huán)狀環(huán)；r3選自由以下組成的群組：h、-c(o)ra以及c1-c10直鏈或支鏈烷基；以及ra和rb各自獨(dú)立地為-h、-oh、-sh、-nh2、(c1-c10)直鏈或支鏈烷基或c3-c10環(huán)烷基。在優(yōu)選實(shí)施例中，thca合成酶為通過產(chǎn)生thca合成酶基因的一種或多種拷貝和過表達(dá)由thca合成酶基因編碼的蛋白獲得的重組thca合成酶。優(yōu)選地，thca合成酶基因的一種或多種拷貝在體內(nèi)產(chǎn)生，并且所述方法包含步驟(i)將大麻素酸合成酶基因的一種或多種拷貝整合到真核宿主基因組中以按比例放大蛋白表達(dá)。優(yōu)選地，真核宿主為巴斯德畢赤酵母，并且thca合成酶基因?yàn)橛脤δ繕?biāo)蛋白分泌的α分泌序列優(yōu)化并且用六個(gè)串聯(lián)組氨酸殘基標(biāo)記的密碼子。步驟(i)可包含通過用一種或多種限制酶消化將大麻素酸合成酶基因線性化；通過凝膠提取來提取大麻素酸合成酶基因；將大麻素酸合成酶基因接合到巴斯德畢赤酵母質(zhì)粒中；以及將質(zhì)粒電穿孔到細(xì)菌細(xì)胞中以產(chǎn)生一種或多種大麻素酸合成酶基因拷貝菌落。在本發(fā)明的優(yōu)選方面，溶劑為dmso，并且在反應(yīng)混合物中dmso的濃度為20％(w/v)。在另外優(yōu)選方面，兩親性化合物為表面活性劑或環(huán)糊精。在優(yōu)選實(shí)施例中，環(huán)糊精為α-環(huán)糊精、β-環(huán)糊精或γ-環(huán)糊精。甚至更優(yōu)選地，環(huán)糊精為硫代丁基醚β-環(huán)糊精鈉鹽或無規(guī)甲基化的β-環(huán)糊精，并且在反應(yīng)混合物中環(huán)糊精的濃度在2mg/ml和28mg/ml之間。在最優(yōu)選實(shí)施例中，在反應(yīng)混合物中環(huán)糊精的濃度為8mg/ml。在本發(fā)明的優(yōu)選方面，兩親性化合物為環(huán)糊精，并且環(huán)糊精與式i化合物的質(zhì)量:質(zhì)量比為28:1或環(huán)糊精與式i化合物的摩爾比為7.3:1。優(yōu)選地，改變反應(yīng)混合物的至少一種特性的步驟(c)包含改變在3.8和7.2之間的范圍內(nèi)的反應(yīng)混合物的ph，并且所述方法產(chǎn)生thca、cbca，或如上文所描述的不同比率的thca和cbca。優(yōu)選地，在兩小時(shí)內(nèi)98％的式i化合物轉(zhuǎn)化成一種或多種大麻素或大麻素類似物。在不同實(shí)施例中，本發(fā)明提供用于生產(chǎn)大麻二酚、大麻環(huán)萜酚，或大麻二酚和大麻環(huán)萜酚兩者，或其類似物的方法，其包含以下步驟：(a)選擇根據(jù)式i的化合物；(b)使式i化合物與大麻二醇酸(cbda)合成酶在包含溶劑和兩親性化合物的反應(yīng)混合物中反應(yīng)；(c)改變反應(yīng)混合物的至少一種特性以獲得大麻二酚、大麻環(huán)萜酚，或大麻二酚和大麻環(huán)萜酚兩者，或其類似物作為產(chǎn)物；(d)從反應(yīng)混合物中分離大麻二酚、大麻環(huán)萜酚，或大麻二酚和大麻環(huán)萜酚兩者，或其類似物；以及(e)將大麻二酚、大麻環(huán)萜酚，或大麻二酚和大麻環(huán)萜酚兩者，或其類似物去羧基；其中，r選自-oh、鹵素、-sh或-nrarb基團(tuán)；r1和r2各自獨(dú)立地選自由以下組成的群組：-h、-c(o)ra、-ora、任選經(jīng)取代的c1-c10直鏈或支鏈亞烷基、任選經(jīng)取代的c2-c10直鏈或支鏈亞烯基、任選經(jīng)取代的c2-c10直鏈或支鏈亞炔基、任選經(jīng)取代的c3-c10芳基、任選經(jīng)取代的c3-c10環(huán)烷基、(c3-c10)芳基-(c1-c10)亞烷基、(c3-c10)芳基-(c2-c10)亞烯基以及(c3-c10)芳基-(c1-c10)亞炔基，或r1和r2與它們鍵結(jié)到的碳原子一起形成c5-c10環(huán)狀環(huán)；r3選自由以下組成的群組：h、-c(o)ra以及c1-c10直鏈或支鏈烷基；并且ra和rb各自獨(dú)立地為-h、-oh、-sh、-nh2、(c1-c10)直鏈或支鏈烷基或c3-c10環(huán)烷基。優(yōu)選地，cbda合成酶為通過產(chǎn)生cbda合成酶基因的一種或多種拷貝和通過過表達(dá)由cbda合成酶基因編碼的蛋白獲得的重組cbda合成酶。在本發(fā)明的優(yōu)選方面，cbda合成酶基因的一種或多種拷貝在體內(nèi)產(chǎn)生，并且所述方法包含步驟(i)將cbda合成酶基因的一種或多種拷貝整合到真核宿主基因組中以按比例放大蛋白表達(dá)。優(yōu)選地，真核宿主為巴斯德畢赤酵母，并且cbda合成酶基因?yàn)橛脤δ繕?biāo)蛋白分泌的α分泌序列優(yōu)化并且用六個(gè)串聯(lián)組氨酸殘基標(biāo)記的密碼子。步驟(i)可包含通過用一種或多種限制酶消化將cbda合成酶基因線性化；通過凝膠提取來提取cbda合成酶；將cbda合成酶基因接合到巴斯德畢赤酵母質(zhì)粒中；以及將質(zhì)粒電穿孔到細(xì)菌細(xì)胞中以產(chǎn)生一種或多種大麻素酸合成酶基因拷貝菌落。在本發(fā)明的優(yōu)選方面，溶劑為dmso，并且在反應(yīng)混合物中dmso的濃度為20％(w/v)。在另外優(yōu)選方面，兩親性化合物為表面活性劑或環(huán)糊精。在優(yōu)選實(shí)施例中，環(huán)糊精為α-環(huán)糊精、β-環(huán)糊精或γ-環(huán)糊精。甚至更優(yōu)選地，環(huán)糊精為硫代丁基醚β-環(huán)糊精鈉鹽或無規(guī)甲基化的β-環(huán)糊精，并且在反應(yīng)混合物中環(huán)糊精的濃度在2mg/ml和28mg/ml之間。在最優(yōu)選實(shí)施例中，在反應(yīng)混合物中環(huán)糊精的濃度為8mg/ml。在本發(fā)明的優(yōu)選方面，兩親性化合物為環(huán)糊精，并且環(huán)糊精與式i化合物的質(zhì)量:質(zhì)量比為28:1(w/w)或環(huán)糊精與式i化合物的摩爾比為7.3:1。優(yōu)選地，改變反應(yīng)混合物的至少一種特性的步驟(c)包含改變在3.8和7.2之間的范圍內(nèi)的反應(yīng)混合物的ph，并且所述方法產(chǎn)生cbda、cbca，或如上文所描述的不同比率的cbda和cbca。在優(yōu)選實(shí)施例中，在兩小時(shí)內(nèi)98％的式i化合物轉(zhuǎn)化成一種或多種大麻素或大麻素類似物。在不同實(shí)施例中，本發(fā)明提供用于生產(chǎn)一種或多種大麻素或大麻素類似物的系統(tǒng)，其包含：保持培養(yǎng)基和多個(gè)細(xì)胞的發(fā)酵器，其中細(xì)胞被配置成產(chǎn)生和分泌大麻素合成酶；含有在包含溶劑和兩親性化合物的反應(yīng)混合物中的反應(yīng)物的生物反應(yīng)器，所述反應(yīng)物被配置成與大麻素酸合成酶相互作用以形成第一大麻素和第二大麻素；以及被配置成控制生物反應(yīng)器的條件的控制機(jī)構(gòu)，其中生物反應(yīng)器的條件影響由第一大麻素形成的量相對于由第二大麻素形成的量，并且其中第一大麻素和第二大麻素各自為一種大麻素或大麻素類似物。在優(yōu)選實(shí)施例中，生物反應(yīng)器為含有鎳的塔式生物反應(yīng)器，并且大麻素酸合成酶包括被配置成鍵結(jié)到鎳的標(biāo)簽。在一些實(shí)施例中，生物反應(yīng)器為含有鎳和另一種金屬兩者的塔式生物反應(yīng)器。在一個(gè)實(shí)施例中，在系統(tǒng)中的反應(yīng)物為根據(jù)式i的化合物；其中r選自-oh、鹵素、-sh或-nrarb基團(tuán)；r1和r2各自獨(dú)立地選自由以下組成的群組：-h、-c(o)ra、-ora、任選地經(jīng)取代的c1-c10直鏈或支鏈亞烷基、任選地經(jīng)取代的c2-c10直鏈或支鏈亞烯基、任選地經(jīng)取代的c2-c10直鏈或支鏈亞炔基、任選地經(jīng)取代的c3-c10芳基、任選地經(jīng)取代的c3-c10環(huán)烷基、(c3-c10)芳基-(c1-c10)亞烷基、(c3-c10)芳基-(c2-c10)亞烯基以及(c3-c10)芳基-(c1-c10)亞炔基，或r1和r2與它們鍵結(jié)到的碳原子一起形成c5-c10環(huán)狀環(huán)；r3選自由以下組成的群組：h、-c(o)ra以及c1-c10直鏈或支鏈烷基；并且ra和rb各自獨(dú)立地為-h、-oh、-sh、-nh2、(c1-c10)直鏈或支鏈烷基或c3-c10環(huán)烷基。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，大麻素酸合成酶為大麻二醇酸(cbda)合成酶并且第一大麻素和第二大麻素為大麻二醇酸和大麻環(huán)萜酚酸或其類似物中的一個(gè)或兩個(gè)。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，大麻素酸合成酶為四氫大麻酚酸(thca)合成酶，并且第一大麻素和第二大麻素為四氫大麻酚酸和大麻環(huán)萜酚酸或其類似物中的一個(gè)或兩個(gè)。優(yōu)選地，大麻素酸合成酶與在生物反應(yīng)器中的反應(yīng)物相互作用以形成第一大麻素和第二大麻素兩者，并且生物反應(yīng)器的條件隨ph、溶劑、溫度、壓力和流動速率中的至少一種而變。在優(yōu)選實(shí)施例中，生物反應(yīng)器的條件的改變被配置成致使從1)形成相對于第二大麻素的較高量的第一大麻素偏移到2)形成相對于第一大麻素的較高量的第二大麻素。優(yōu)選地，在系統(tǒng)中溶劑為dmso，并且在反應(yīng)混合物中dmso的濃度為20％(w/v)。在又一優(yōu)選實(shí)施例中，在系統(tǒng)中兩親性化合物為表面活性劑或環(huán)糊精。優(yōu)選地，環(huán)糊精為α-環(huán)糊精，β-環(huán)糊精或γ-環(huán)糊精。甚至更優(yōu)選地，環(huán)糊精為硫代丁基醚β-環(huán)糊精鈉鹽或無規(guī)甲基化的β-環(huán)糊精，并且在反應(yīng)混合物中環(huán)糊精的濃度在2mg/ml和28mg/ml之間。最優(yōu)選地，在反應(yīng)混合物中環(huán)糊精的濃度為8mg/ml。在本發(fā)明的一個(gè)方面，兩親性化合物為環(huán)糊精，并且環(huán)糊精與式i化合物的質(zhì)量:質(zhì)量比為28:1(w/w)，或環(huán)糊精與式i化合物的摩爾比為7.3:1。在優(yōu)選實(shí)施例中，在兩小時(shí)內(nèi)在系統(tǒng)中的98％的式i化合物轉(zhuǎn)化成一種或多種大麻素或大麻素類似物。在本發(fā)明的優(yōu)選方面，在系統(tǒng)中的大麻素酸合成酶為cbda合成酶，并且生物反應(yīng)器的條件的改變包含改變在3.8和7.2之間的范圍內(nèi)的反應(yīng)混合物的ph。優(yōu)選地，所述方法產(chǎn)生cbda、cbca，或如上文所描述不同比率的cbda和cbca。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，大麻素酸合成酶為thca合成酶，并且生物反應(yīng)器的條件的改變包含改變在3.8和7.2之間的范圍內(nèi)的反應(yīng)混合物的ph。優(yōu)選地，所述方法產(chǎn)生thca、cbca，或如上文所描述不同比率的thca和cbca。在又一實(shí)施例中，本發(fā)明提供用于生產(chǎn)至少一種大麻素或大麻素類似物的方法，其包括以下步驟：經(jīng)由自動化遞送系統(tǒng)提供大麻萜酚、大麻素酸合成酶以及包含溶劑和兩親性化合物的反應(yīng)混合物；使大麻萜酚與大麻素酸合成酶在反應(yīng)混合物中反應(yīng)；經(jīng)由自動化遞送系統(tǒng)添加溶劑以停止反應(yīng)；去除溶劑；以及回收通過反應(yīng)產(chǎn)生的至少一種大麻素或大麻素類似物。優(yōu)選地，反應(yīng)混合物包含dmso，并且大麻素酸合成酶為cbda合成酶或thca合成酶。甚至更優(yōu)選地，使大麻萜酚與大麻素酸合成酶反應(yīng)的步驟包含經(jīng)由控制器控制反應(yīng)混合物的ph。因此，在本發(fā)明的優(yōu)選方面，所述方法進(jìn)一步包含控制反應(yīng)混合物的ph以產(chǎn)生預(yù)定量的至少第一大麻素第一大麻素類似物并且控制反應(yīng)混合物的ph以產(chǎn)生預(yù)定量的第一大麻素或第一大麻素類似物和預(yù)定量的第二大麻素或第二大麻素類似物。在優(yōu)選實(shí)施例，第一大麻素或第一大麻素類似物為thca或cbda，并且第二大麻素或第二大麻素類似物為cbca。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，第一大麻素或第一大麻素類似物為thca或cbda，并且第二大麻素或第二大麻素類似物為cbca。在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明提供用于生產(chǎn)至少一種大麻素或大麻素類似物的方法，其包含：使大麻萜酚與大麻素酸合成酶在包含溶劑和兩親性化合物反應(yīng)混合物中反應(yīng)；添加溶劑以停止反應(yīng)；去除溶劑；以及回收通過反應(yīng)產(chǎn)生的大麻素或大麻素類似物。在本發(fā)明的優(yōu)選方面，使大麻萜酚與大麻素酸合成酶反應(yīng)的步驟包含控制反應(yīng)混合物的ph。優(yōu)選地，反應(yīng)混合物的ph通過調(diào)節(jié)反應(yīng)混合物的ph以達(dá)到第一大麻素或第一大麻素類似物與第二大麻素或第二大麻素類似物的預(yù)定比率來控制。甚至更優(yōu)選地，反應(yīng)混合物包含dmso，并且大麻素酸合成酶為cbda合成酶或thca合成酶。在一個(gè)實(shí)施例中，第一大麻素或第一大麻素類似物為thca或cbda，并且第二大麻素或第二大麻素類似物為cbca。在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明提供一種設(shè)備，其包含被配置成遞送第一自動化供應(yīng)的大麻萜酚、大麻素酸合成酶以及包含溶劑和兩親性化合物的反應(yīng)混合物的自動化供應(yīng)系統(tǒng)；被配置成接收第一供應(yīng)并且準(zhǔn)許大麻萜酚和大麻素酸合成酶在反應(yīng)混合物中反應(yīng)，和第二自動化供應(yīng)的溶劑以便停止反應(yīng)的生物反應(yīng)器；以及被配置成去除溶劑并且回收至少第一大麻素或大麻素類似物的提取器。所述設(shè)備可進(jìn)一步包含被配置成調(diào)節(jié)反應(yīng)混合物的至少一種特性以便以預(yù)定比率產(chǎn)生第一大麻素或第一大麻素類似物和第二大麻素或第二大麻素的控制器?？刂破鬟€可被配置成確定第一大麻素或第一大麻素類似物的第一量和第二大麻素或第二大麻素類似物的第二量，并且調(diào)節(jié)反應(yīng)混合物的至少一種特性以便產(chǎn)生第一量的第一大麻素或第一大麻素類似物和第二量的第二大麻素或第二大麻素。優(yōu)選地，反應(yīng)混合物包含dmso，并且大麻素酸合成酶為cbda合成酶或thca合成酶。在本發(fā)明的優(yōu)選方面，第一大麻素或第一大麻素類似物為thca或cbda，并且第二大麻素或第二大麻素類似物為cbca。在又一實(shí)施例中，本發(fā)明提供用于生產(chǎn)不同比率的四氫大麻酚酸(thca)和大麻環(huán)萜酚酸(cbca)或大麻二醇酸(cbda)和大麻環(huán)萜酚酸酸(cbca)的設(shè)備，其包含：生物反應(yīng)器，其包含被配置成遞送(a)第一自動化供應(yīng)的大麻萜酚、大麻素酸合成酶以及包含溶劑和兩親性化合物的反應(yīng)混合物的自動化供應(yīng)系統(tǒng)，其中溶劑為二甲亞砜(dmso)、二甲基甲酰胺(dmf)和異丙醇中的一種或多種，并且在反應(yīng)混合物中溶劑的濃度在5％和30％(w/v)之間，并且其中兩親性化合物為表面活性劑或環(huán)糊精，并且在反應(yīng)混合物中兩親性化合物的濃度在2mg/ml和28mg/ml之間；以及(b)第二自動化供應(yīng)的溶劑以停止反應(yīng)；被配置成從反應(yīng)混合物中去除溶劑并且回收四氫大麻酚酸(thca)和大麻環(huán)萜酚酸(cbca)或大麻二醇酸(cbda)和大麻環(huán)萜酚酸(cbca)的提取器；以及被配置成改變反應(yīng)混合物的ph以產(chǎn)生不同比率的四氫大麻酚酸(thca)和大麻環(huán)萜酚酸(cbca)或大麻二醇酸(cbda)和大麻環(huán)萜酚酸(cbca)，并且調(diào)節(jié)在反應(yīng)混合物中的兩親性化合物的濃度以影響的大麻萜酚酸(cbga)到不同比率的四氫大麻酚酸(thca)和大麻環(huán)萜酚酸(cbca)或大麻二醇酸(cbda)和大麻環(huán)萜酚酸(cbca)的轉(zhuǎn)化率的控制器。在優(yōu)選實(shí)施例中，大麻素合成酶為四氫大麻酚酸合成酶(thca合成酶)或大麻二醇酸合成酶(cbda合成酶)。在本發(fā)明的一個(gè)方面，大麻素合成酶固定于固體支撐物上。在本發(fā)明的另一個(gè)方面，大麻素合成酶為重組大麻素合成酶，并且設(shè)備進(jìn)一步包含大規(guī)模產(chǎn)生重組大麻素合成酶的系統(tǒng)。優(yōu)選地，ph在約3.8到約8.0的范圍內(nèi)。在本發(fā)明的優(yōu)選方面，溶劑為二甲亞砜(dmso)、二甲基甲酰胺(dmf)和異丙醇中的一種或多種，并且在反應(yīng)混合物中溶劑的濃度在5％和30％(w/v)之間。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選方面，兩親性化合物為表面活性劑或環(huán)糊精。環(huán)糊精可為α-環(huán)糊精，β-環(huán)糊精或γ-環(huán)糊精。在本發(fā)明的一個(gè)方面，環(huán)糊精為硫代丁基醚β-環(huán)糊精鈉鹽或無規(guī)甲基化的β-環(huán)糊精，并且在反應(yīng)混合物中環(huán)糊精的濃度在2mg/ml和28mg/ml之間。優(yōu)選地，在反應(yīng)混合物中環(huán)糊精的濃度為8mg/ml。在一個(gè)實(shí)施例中，四氫大麻酚酸(thca)和大麻環(huán)萜酚酸(cbca)或大麻二醇酸(cbda)和大麻環(huán)萜酚酸(cbca)為對映異構(gòu)純度為至少95％的單對映異構(gòu)體。在本發(fā)明的一個(gè)方面中，大麻素合成酶為thca合成酶，并且兩親性化合物為環(huán)糊精。優(yōu)選地，環(huán)糊精與大麻萜酚酸(cbga)的質(zhì)量:質(zhì)量比為28:1，或環(huán)糊精與大麻萜酚酸(cbga)的摩爾比為7.3:1。在本發(fā)明的優(yōu)選方面，設(shè)備產(chǎn)生以下比率的四氫大麻酚酸(thca)和大麻環(huán)萜酚酸(cbca)：phthcacbca41052.331615.67701優(yōu)選地，在兩小時(shí)內(nèi)98％的大麻萜酚酸cbga轉(zhuǎn)化成四氫大麻酚酸(thca)和大麻環(huán)萜酚酸(cbca)。在本發(fā)明的不同方面，大麻素合成酶為cbda合成酶，并且兩親性化合物為環(huán)糊精。優(yōu)選地，環(huán)糊精與大麻萜酚酸(cbga)的質(zhì)量:質(zhì)量比為11:1，或環(huán)糊精與大麻萜酚酸(cbga)的摩爾比為4:1。在本發(fā)明的優(yōu)選方面，設(shè)備產(chǎn)生以下比率的大麻二醇酸(cbda)和大麻環(huán)萜酚酸(cbca)：phcbdacbca4.22.5151.1315.211.175.412.455.816.146.2128.136.800優(yōu)選地，在兩小時(shí)內(nèi)98％的大麻萜酚酸(cbga)轉(zhuǎn)化成大麻二醇酸(cbda)和大麻環(huán)萜酚酸(cbca)。前述整體描述和詳細(xì)描述為示例性和說明性的并且打算提供所要求的本發(fā)明的其他解釋。為詳述理解本發(fā)明，結(jié)合附圖參考以下優(yōu)選實(shí)施例的詳細(xì)描述。本領(lǐng)域的技術(shù)人員從本發(fā)明的以下詳細(xì)描述容易顯而易知其它目標(biāo)、優(yōu)勢和新穎特征。附圖說明圖1示出10％dmso和無環(huán)糊精對thca合成酶活性的影響。100μl在粗發(fā)酵上清液(10×濃縮)中的thca合成酶與50μl在350μlph4.85檸檬酸鹽緩沖液中的2mg/mlcbga反應(yīng)。峰(從左到右)：#1cbga(86.51％)，#2thca(10.4％)，#3cbca(3.09％)。圖2示出20％dmso和無環(huán)糊精對thca合成酶活性的影響。100μl在粗發(fā)酵上清液(10×濃縮)中的thca合成酶與50μl在300μlph4.85檸檬酸鹽緩沖液中的2mg/mlcbga在50μldmso存在下反應(yīng)。峰(從左到右)：#1cbga(54.18％)，#2thca(32.39％)，#3cbca(13.43％)。圖3示出10％dmso和20％環(huán)糊精對thca合成酶活性的影響。100μl在粗發(fā)酵上清液(10×濃縮)中的thca合成酶與50μl在350μl含有2mg環(huán)糊精的ph4.85檸檬酸鹽緩沖液中的2mg/mlcbga反應(yīng)。峰(從左到右)：#1cbga(10.33％)，#2thca(72.37％)，#3cbca(17.3％)。圖4示出10％dmso和40％環(huán)糊精對thca合成酶活性的影響。150μl在粗發(fā)酵上清液(10×濃縮)中的thca合成酶與75μl在525μl含有3mg環(huán)糊精的ph4.85檸檬酸鹽緩沖液中的2mg/mlcbga反應(yīng)。峰(從左到右)：#1cbga(11.50％)，#2thca(72.08％)，#3cbca(16.42％)。圖5示出10％dmso和60％環(huán)糊精對thca合成酶活性的影響。200μl在粗發(fā)酵上清液(10×濃縮)中的thca合成酶與100μl在700μl含有4mg環(huán)糊精的ph4.85檸檬酸鹽緩沖液中的2mg/mlcbga反應(yīng)。峰(從左到右)：#1cbga(10.36％)，#2thca(73.98％)，#3cbca(15.65％)。圖6示出10％dmso和20mg/ml環(huán)糊精對cbda合成酶活性的影響。200μl在粗發(fā)酵上清液(10×濃縮)中的cbda與100μl在700μl含有4mg環(huán)糊精的ph4.85檸檬酸鹽緩沖液中的4mg/mlcbga反應(yīng)。峰(從左到右)：#1cbda(40.63％)，#2cbga(28.43％)，#3cbca(30.95％)。圖7為用于生產(chǎn)大麻素和/或大麻素類似物的系統(tǒng)的框圖。圖8為用于生產(chǎn)大麻素和/或大麻素類似物的系統(tǒng)的框圖。圖9為示出用于生產(chǎn)大麻素的方法的流程圖。圖10為控制器的框圖。圖11示出0mg/ml環(huán)糊精對cbda合成酶反應(yīng)轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)物比率的影響。50μl的10×濃縮的發(fā)酵上清液與25μl的在175μl的ph4.8檸檬酸鹽緩沖液中的5mg/mlcbga反應(yīng)。峰(左到右)：cbda(17.99％)，cbga(65.72％)，cbca(16.30％)。圖12示出2mg/ml環(huán)糊精對cbda合成酶反應(yīng)轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)物比率的影響。50μl的10×濃縮的發(fā)酵上清液與25μl的在175μl的含有2mg/ml環(huán)糊精的ph4.8檸檬酸鹽緩沖液中的5mg/mlcbga反應(yīng)。峰(左到右)：cbda(29.53％)，cbga(47.40％)，cbca(23.08％)。圖13示出8mg/ml環(huán)糊精對cbda合成酶反應(yīng)轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)物比率的影響。50μl的10×濃縮的發(fā)酵上清液與8.25μl的在175μl的含有8mg/ml環(huán)糊精的ph4.8檸檬酸鹽緩沖液中的5mg/mlcbga反應(yīng)。峰(左到右)：cbda(33％)，cbga(41.98％)，cbca(25.02％)。圖14示出12mg/ml環(huán)糊精對cbda合成酶反應(yīng)轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)物比率的影響。50μl的10×濃縮的發(fā)酵上清液與25μl的在175μl的含有12mg/ml環(huán)糊精的ph4.8檸檬酸鹽緩沖液中的5mg/mlcbga反應(yīng)。峰(左到右)：cbda(30.63％)，cbga(45.22％)，cbca(24.15％)。圖15示出16mg/ml環(huán)糊精對cbda合成酶反應(yīng)轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)物比率的影響。50μl的10×濃縮的發(fā)酵上清液與25μl的在175μl的含有16mg/ml環(huán)糊精的ph4.8檸檬酸鹽緩沖液中的5mg/mlcbga反應(yīng)。峰(左到右)：cbda(28.54％)，cbga(49.63％)，cbca(21.84％)。圖16示出20mg/ml環(huán)糊精對cbda合成酶反應(yīng)轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)物比率的影響。50μl的10×濃縮的發(fā)酵上清液與25μl的在175μl的含有20mg/ml環(huán)糊精的ph4.8檸檬酸鹽緩沖液中的5mg/mlcbga反應(yīng)。峰(左到右)：cbda(29.05％)，cbga(50.04％)，cbca(20.91％)。圖17示出28mg/ml環(huán)糊精對cbda合成酶反應(yīng)轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)物比率的影響。50μl的10×濃縮的發(fā)酵上清液與25μl的在175μl的含有28mg/ml環(huán)糊精的ph4.8檸檬酸鹽緩沖液中的5mg/mlcbga反應(yīng)。峰(左到右)：cbda(22.09％)，cbga(59.60％)，cbca(18.32％)。具體實(shí)施方式本發(fā)明提供用于不同大麻素或大麻素類似物的大規(guī)模同時(shí)酶生產(chǎn)的系統(tǒng)和方法，以及用于克隆、表達(dá)和純化在各種ph、溫度和水性/親油性條件下催化thca、cbda、cbca或其類似物的大規(guī)模同時(shí)合成的酶的方法。定義如本文所用，除非另外規(guī)定，否則單數(shù)形式“一個(gè)/種(a/an)”和“所述”包括多個(gè)參考物。因此，舉例來說，提及“一個(gè)/種細(xì)胞”包括多個(gè)/種細(xì)胞，并且提及“一個(gè)/種分子”就是提及一或多個(gè)/種分子。如本文中所用，“約”將被本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員理解并且在一定程度上將取決于其使用的情況而變化。如果使用本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員不清楚的術(shù)語，那么考慮到其使用的情況，“約”將意味著達(dá)到特定術(shù)語的正或負(fù)10％。術(shù)語“烷基”指的是具有規(guī)定數(shù)目碳原子的直鏈或支鏈飽和烴。舉例來說，(c1-c10)烷基意指包括(但不限于)甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、異戊基、新戊基、己基、異己基和新己基等。烷基可未經(jīng)取代或任選地經(jīng)一個(gè)或多個(gè)如下文所述的取代基取代。術(shù)語“烯基”指的是具有規(guī)定數(shù)目碳原子和至少一個(gè)雙鍵的直鏈或支鏈不飽和烴。(c2-c10)烯基的實(shí)例包括(但不限于)乙烯、丙烯、1-丁烯、2-丁烯、異丁烯、仲丁烯、1-戊烯、2-戊烯、異戊烯、1-己烯、2-己烯、3-己烯、異己烯、1-庚烯、2-庚烯、3-庚烯、異庚烯、1-辛烯、2-辛烯、3-辛烯、4-辛烯以及異辛烯。烯基可未經(jīng)取代或任選地經(jīng)一個(gè)或多個(gè)如下文所述的取代基取代。術(shù)語“炔基”指的是具有規(guī)定數(shù)目碳原子和至少一個(gè)三鍵的直鏈或支鏈不飽和烴。(c2-c10)炔基的實(shí)例包括(但不限于)乙炔、丙炔、1-丁炔、2-丁炔、1-戊炔、2-戊炔、1-己炔、2-己炔、3-己炔、1-庚炔、2-庚炔、3-庚炔、1-辛炔、2-辛炔、3-辛炔以及4-辛炔。炔基可未經(jīng)取代或任選地經(jīng)一個(gè)或多個(gè)如下文所述的取代基取代。術(shù)語“烷氧基”指的是具有規(guī)定數(shù)目碳原子的-o-烷基。舉例來說，(c1-c6)烷氧基包括-o-甲基、-o-乙基、-o-丙基、-o-異丙基、-o-丁基、-o-仲丁基、-o-叔丁基、-o-戊基、-o-異戊基、-o-新戊基、-o-己基、-o-異己基以及-o-新己基。術(shù)語“芳基”指的是3到14元單環(huán)、雙環(huán)、三環(huán)或多環(huán)芳香族烴環(huán)系統(tǒng)。芳基的實(shí)例包括萘基、芘基和蒽基。芳基可未經(jīng)取代或任選地經(jīng)一個(gè)或多個(gè)如下文所述的取代基取代。單獨(dú)或作為另一取代基的部分的術(shù)語“亞烷基”、“亞烯基”和“亞芳基”分別意指衍生自以下的二價(jià)基團(tuán)：烷基、環(huán)烷基、烯基、芳基或雜芳基，如-ch2ch2ch2ch2-所例示。對于亞烷基、烯基或芳基連接基團(tuán)，未暗示連接基團(tuán)的方向。術(shù)語“鹵素”和“鹵基”指的是-f、-cl、-br或-i。術(shù)語“雜原子”意指包括氧(o)、氮(n)和硫(s)?！傲u基”指的是-oh基團(tuán)。術(shù)語“羥基烷基”指的是具有規(guī)定數(shù)目碳原子的烷基，其中烷基的氫原子中的一或多個(gè)置換為-oh基團(tuán)。羥基烷基的實(shí)例包括(但不限于)-ch2oh、-ch2ch2oh、-ch2ch2ch2oh、-ch2ch2ch2ch2oh、-ch2ch2ch2ch2ch2oh、-ch2ch2ch2ch2ch2ch2oh以及其支鏈形式。術(shù)語“環(huán)烷基”指的是單環(huán)、雙環(huán)、三環(huán)或多環(huán)3到14元環(huán)系統(tǒng)，其為飽和、不飽和或?yàn)榉枷阕宓?。雜環(huán)可通過任何雜原子或碳原子連接。環(huán)烷基包括如上文所定義的芳基和雜芳基。環(huán)烷基的代表性實(shí)例包括(但不限于)環(huán)乙基、環(huán)丙基、環(huán)異丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基、環(huán)亞丙基、環(huán)亞丁基、環(huán)亞戊基、環(huán)亞己基、苯基、萘基、蒽基、苯并呋喃基以及苯并噻吩基。環(huán)烷基可未經(jīng)取代或任選地經(jīng)一個(gè)或多個(gè)如下文所述的取代基取代。術(shù)語“腈或氰基”可互換使用并且指的是結(jié)合到雜芳基環(huán)、芳基環(huán)和雜環(huán)烷基環(huán)的碳原子的-cn基團(tuán)。術(shù)語“胺或氨基”指的是-nrcrd基團(tuán)，其中rc和rd各自獨(dú)立地指的是氫、(c1-c8)烷基、芳基、雜芳基、雜環(huán)烷基、(c1-c8)鹵烷基以及(c1-c6)羥基烷基。術(shù)語“烷基芳基”指的是c1-c8烷基，其中c1-c8烷基鏈的至少一個(gè)氫原子置換為芳基原子，所述原子可任選地經(jīng)一個(gè)或多個(gè)如下文所述的取代基取代。烷基芳基的實(shí)例包括(但不限于)甲基苯基、乙基萘基、丙基苯基以及丁基苯基?！胺蓟鶃喭榛敝傅氖嵌r(jià)亞烷基，其中c1-c10亞烷基中的一個(gè)或多個(gè)氫原子置換為(c3-c14)芳基。(c3-c14)芳基-(c1-c10)亞烷基的實(shí)例包括但不限于1-苯基亞丁基、苯基-2-亞丁基、1-苯基-2-甲基亞丙基、苯基亞甲基、苯基亞丙基以及萘基亞乙基?！胺蓟鶃喯┗敝傅氖嵌r(jià)亞烯基，其中c2-c10亞烯基中的一個(gè)或多個(gè)氫原子置換為(c3-c14)芳基。術(shù)語“芳基亞炔基”指的是二價(jià)亞炔基，其中c2-c10亞炔基中的一個(gè)或多個(gè)氫原子置換為(c3-c14)芳基。術(shù)語“羧基”和“羧酸酯基”包括可由以下通式表示的此類部分：式中的e為鍵或o，并且rf獨(dú)立地為h、烷基、烯基、芳基或藥學(xué)上可接受的鹽。其中e為o，并且rf如上文所定義，所述部分在本文中稱為羧基，并且具體來說，當(dāng)rf為氫時(shí)，所述式表示“羧酸”。一般來說，在明確顯示氧置換為硫的情況下，式表示“硫羰基”。除非另外指示，否則“立體異構(gòu)體”意指實(shí)質(zhì)上不含所述化合物的其它立體異構(gòu)體的化合物的一種立體異構(gòu)體。因此，具有一個(gè)手性中心的立體異構(gòu)純化合物實(shí)質(zhì)上不含所述化合物的相反對映異構(gòu)體。具有兩個(gè)手性中心的立體異構(gòu)純化合物將實(shí)質(zhì)上不含所述化合物的其它非對映異構(gòu)體。典型立體異構(gòu)純化合物包含大于約80重量％的所述化合物的一種立體異構(gòu)體以及小于約20重量％的所述化合物的其它立體異構(gòu)體，例如大于約90重量％的所述化合物的一種立體異構(gòu)體以及小于約10重量％的所述化合物的其它立體異構(gòu)體，或大于約95重量％的所述化合物的一種立體異構(gòu)體以及小于約5重量％的所述化合物的其它立體異構(gòu)體，或大于約97重量％的所述化合物的一種立體異構(gòu)體以及小于約3重量％的所述化合物的其它立體異構(gòu)體。本發(fā)明提供用于在無細(xì)胞環(huán)境中大麻素或大麻素類似物的酶合成的方法。還描述一種用于大麻素和大麻素類似物的離體制造的設(shè)備。術(shù)語“類似物”指的是與天然存在的大麻素結(jié)構(gòu)上相關(guān)的化合物，但其化學(xué)和生物學(xué)特性可與天然存在的大麻素不同。在本發(fā)明上下文中，一或多種類似物指的是不呈現(xiàn)天然存在的大麻素的一種或多種非所需副作用的化合物。類似物還指的是通過天然存在的大麻素的化學(xué)、生物學(xué)或半合成轉(zhuǎn)型從天然存在的大麻素衍生的化合物。大麻素化合物包括(但不限于)大麻酚、大麻二酚、δ9-四氫大麻酚、δ8-四氫大麻酚、11-羥基-四氫大麻酚、11-羥基-δ9-四氫大麻酚、左南曲朵、δll-四氫大麻酚、四氫次大麻酚、屈大麻酚、阿曼達(dá)酰胺(amandamide)和大麻隆，以及具有堿性大麻素結(jié)構(gòu)并且經(jīng)以合成方式修飾以提供大麻素類似物的天然或合成分子。本發(fā)明還提供用于大規(guī)?？寺『捅磉_(dá)在生物合成大麻素中起作用的酶的方法以及用于生產(chǎn)可用于制造大麻素和大麻素類似物的生物合成酶的真核表達(dá)系統(tǒng)的使用方法。酵母以及真核和原核細(xì)胞適合于克隆和表達(dá)大麻素酸合成酶，并且包括但不限于大腸桿菌、酵母和桿狀病毒宿主。因此，本發(fā)明公開用于使用粉紅畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)大規(guī)模生產(chǎn)包括(但不限于)四氫大麻酚酸(thca)合成酶和大麻二醇酸(cbda)合成酶的若干大麻素酸合成酶的方法。因此，這些酶的大規(guī)模生產(chǎn)可通過用包含大麻素合成酶基因的dna構(gòu)筑體轉(zhuǎn)化酵母，產(chǎn)生大麻素酸合成酶基因的一個(gè)或多個(gè)拷貝和過表達(dá)由大麻素酸合成酶基因編碼的蛋白進(jìn)行。thca合成酶基因的核酸序列由seqidno:1表示并且編碼在seqidno:2中所闡述的多肽序列。用于巴斯德畢赤酵母表達(dá)的密碼子優(yōu)化的thca合成酶基因的核酸序列由seqidno:3表示，并且編碼在seqidno:4中所闡述的多肽序列，其為包含巴斯德畢赤酵母的α分泌序列的thca合成酶氨基酸序列?！皌hca合成酶表達(dá)”指的是由seqidno:1或由seqidno:3，或seqidno:1或seqidno:3的變體、片段或部分編碼的基因產(chǎn)物的生物合成?！皌hca合成酶表達(dá)”也指的是包含seqidno:2或seqidno:4的多肽，或包含seqidno:2或seqidno:4的多肽的變體、片段或部分的生物合成。“thca合成酶過表達(dá)”表示thca合成酶表達(dá)的增加。thca過表達(dá)影響其中出現(xiàn)過表達(dá)的植物或細(xì)胞的thca或cbca含量的增加。thca過表達(dá)指的是上調(diào)的由seqidno:1或由seqidno:3，或seqidno:1或seqidno:3的任何變體、片段或部分編碼的基因產(chǎn)物的生物合成。cbda合成酶基因的核酸序列(對巴斯德畢赤酵母表達(dá)優(yōu)化的密碼子)由seqidno:5表示并且編碼在seqidno:6中所闡述的多肽序列。用于巴斯德畢赤酵母表達(dá)的cbda合成酶基因的密碼子優(yōu)化的核酸序列由seqidno:7表示并且編碼在seqidno:8中所闡述的多肽序列，其為包含巴斯德畢赤酵母的α分泌序列的cbda合成酶氨基酸序列?！癱bda合成酶表達(dá)”指的是由seqidno:5或由seqidno:7，或seqidno:5或seqidno:7的變體、片段或部分編碼的基因產(chǎn)物的生物合成?！癱bda合成酶表達(dá)”也指包含seqidno:6或seqidno:8的多肽，或包含seqidno:6或seqidno:8的多肽的變體、片段或部分的生物合成?！癱bda合成酶過表達(dá)”表示cbda合成酶表達(dá)的增加。cbda過表達(dá)影響其中出現(xiàn)過表達(dá)的植物或細(xì)胞的cbda或cbca含量的增加。cbda過表達(dá)指的是由seqidno:5或由seqidno:7，或seqidno:5或seqidno:7的任何變體、片段或部分編碼的基因產(chǎn)物的上調(diào)的生物合成。本發(fā)明涵蓋任何核酸、基因、多核苷酸、dna、rna、mrna，或cdna分子，其從植物種的基因組分離或以合成方式產(chǎn)生，其增加大麻素或大麻素類似物的生物合成。此外，此類大麻素酸合成酶序列的表達(dá)在非大麻素生產(chǎn)細(xì)胞(包括酵母、原核細(xì)胞和真核細(xì)胞，如非-大麻素生產(chǎn)植物細(xì)胞、細(xì)菌細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞或酵母細(xì)胞)中生產(chǎn)大麻素或大麻素類似物。dna或rna可為雙鏈或單鏈。單鏈dna可為編碼鏈，也被稱作有義股，或它可為非編碼鏈，也被稱為反義鏈。應(yīng)理解，thca合成酶和cbda合成酶包括分別在seqidno:1、seqidno:3、seqidno:5和seqidno:7中所闡述的序列，以及包含在seqidno:1、seqidno:3、seqidno:5和seqidno:7的變體、片段或部分的核酸分子，其中刪除、取代、插入或添加一種或多種堿基，其中在seqidno:1、seqidno:3、seqidno:5和seqidno:7中的任一個(gè)的變體編碼具有大麻素或大麻素類似物生物合成活性的多肽。因此，即使當(dāng)編碼的氨基酸序列具有一種或多種氨基酸取代、刪除、插入或添加時(shí)，具有“其中刪除、取代、插入或添加一種或多種堿基”的堿基序列的序列保留生理活性。編碼的氨基酸序列的生理活性可使用本領(lǐng)域中已知的常規(guī)酶測定來測試。此外，可存在多種形式的thca合成酶和cbda合成酶，這可是由于基因產(chǎn)物的翻譯后修飾，或由于對應(yīng)的thca合成酶和cbda合成酶的多種形式。具有此類修飾并且編碼大麻素或大麻素類似物生物合成酶的核苷酸序列包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。舉例來說，可刪除聚a尾部或5'-或3'-端部、非翻譯區(qū)域，并且可刪除堿基以達(dá)到刪除氨基酸的程度。只要無移碼結(jié)果，堿基還可被取代。也可“添加”堿基達(dá)到添加氨基酸的程度。然而，任何此類修飾不產(chǎn)生大麻素酸或大麻素酸類似物生物合成酶活性的損失是必需的。在此上下文中經(jīng)修飾的dna可通過修飾本發(fā)明的dna堿基序列獲得，使得在特定部位的氨基酸例如通過定點(diǎn)突變誘發(fā)而取代、刪除、插入或添加，并且仍然保留大麻素酸或大麻素酸類似物生物合成酶活性。編碼的氨基酸序列的大麻素酸或大麻素酸類似物生物合成酶可如上文所描述測定。大麻素或大麻素類似物生物合成序列可從一開始由適當(dāng)堿基合成，例如通過使用本文公開的適當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)序列作為導(dǎo)引物以創(chuàng)建dna分子，其雖然不同于天然dna序列，但是導(dǎo)致產(chǎn)生具有相同或類似氨基酸序列的蛋白。此類型的合成dna分子當(dāng)將dna序列引入非植物細(xì)胞中、編碼異源蛋白時(shí)很有用，其反映不同(非植物)密碼子使用頻率，并且如果使用未修飾的，那么可導(dǎo)致宿主細(xì)胞的低效轉(zhuǎn)譯。所謂“分離的”核酸分子為已從其天然環(huán)境取出的預(yù)期的核酸分子、dna或rna。舉例來說，為了本發(fā)明的目的，認(rèn)為包含于dna構(gòu)筑體中的重組dna分子為分離的。分離的dna分子的另外實(shí)例包括在異源宿主細(xì)胞中維持的重組dna分子或在溶液中部分或大體上純化的dna分子。分離的rna分子包括本發(fā)明的dna分子的體外rna轉(zhuǎn)錄物。根據(jù)本發(fā)明，分離的核酸分子進(jìn)一步包括以合成方式產(chǎn)生的此類分子。“外源性核酸”指的是已人工引入細(xì)胞中的核酸、dna或rna。此類外源性核酸可為在序列引入的細(xì)胞中天然地存在的序列的拷貝或其片段。相比之下，“內(nèi)因性核酸”指的是存在于待基因工程改造的植物或生物體的基因組中的核酸、基因、多核苷酸、dna、rna、mrna，或cdna分子。內(nèi)因性序列為對待基因工程改造的植物或生物體“天然的”，即，原生的?！爱愒春怂帷敝傅氖遣皇窃谛蛄幸氲募?xì)胞中天然存在的序列的拷貝、已引入細(xì)胞中的核酸、dna或rna。此類異源核酸可包含為在序列已引入的細(xì)胞中天然存在的序列的拷貝或其片段的節(jié)段?！扒逗虾怂帷卑谄渲芯幋a序列天然地出現(xiàn)的細(xì)胞中不同于它相關(guān)聯(lián)的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)的連接到轉(zhuǎn)錄起始區(qū)的編碼序列或其片段。本申請是針對與在seqidno:1、seqidno:3、seqidno:5和seqidno:7中描述的核酸序列至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的此類核酸分子。優(yōu)選的為與在seqidno:1、seqidno:3、seqidno:5和seqidno:7中的任一個(gè)中示出的核酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的核酸分子。在兩個(gè)核酸序列之間的差別可出現(xiàn)在參考核苷酸序列的5'或3'末端位置或在那些末端位置之間的任何位置，或在參考序列中或在參考序列內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)連續(xù)基團(tuán)中的核苷酸中單獨(dú)地穿插。實(shí)際上，任何特定核酸分子與參考核苷酸序列是否至少95％、96％、97％、98％或99％相同指的是使用在本領(lǐng)域中熟知的標(biāo)準(zhǔn)算法在兩個(gè)分子之間進(jìn)行比較，并且可通常使用公開可用的計(jì)算機(jī)程序如blast算法確定。本發(fā)明進(jìn)一步提供分別包含seqidno:1、seqidno:3、seqidno:5和seqidno:7的核苷酸序列的核酸分子，其編碼活性大麻素或大麻素類似物生物合成酶，其中所述酶具有分別對應(yīng)于seqidno:2、seqidno:4、seqidno:6和seqidno:8的氨基酸序列，或seqidno:2、seqidno:4、seqidno:6和seqidno:8中任一個(gè)的變體、片段或部分，并且其中本發(fā)明的蛋白涵蓋不更改大麻素或大麻素類似物生物合成酶的功能的氨基酸取代、添加和刪除?！白凅w”為偏離特定基因或蛋白的標(biāo)準(zhǔn)或給定核苷酸或氨基酸序列的核苷酸或氨基酸序列。術(shù)語“同種型”、“同型”和“類似物”也指核苷酸或氨基酸序列的“變體”形式。通過添加、去除或取代一個(gè)或多個(gè)氨基酸或改變核苷酸序列而更改的氨基酸序列可被認(rèn)為是“變體”序列。變體可具有“保守”改變，其中經(jīng)取代的氨基酸具有類似結(jié)構(gòu)或化學(xué)特性，例如用異白氨酸置換白氨酸。變體可具有“非保守”改變，例如用色氨酸置換甘氨酸。類似微小變化還可包括氨基酸刪除或插入，或兩者。確定哪些氨基酸殘基可被取代、插入或刪除的指導(dǎo)可使用在本領(lǐng)域中熟知的計(jì)算機(jī)程序發(fā)現(xiàn)。本發(fā)明涵蓋基因工程改造“非大麻素或大麻素類似物產(chǎn)生細(xì)胞”，其中核酸序列編碼與大麻素或大麻素類似物的產(chǎn)生有關(guān)的酶。非大麻素或大麻素類似物產(chǎn)生細(xì)胞指的是來自不產(chǎn)生大麻素或大麻素類似物的任何生物體的細(xì)胞。例示性細(xì)胞包括但不限于植物細(xì)胞以及昆蟲、哺乳動物、酵母、真菌、藻類或細(xì)菌細(xì)胞?！罢婢?xì)胞”指的是可用編碼大麻素或大麻素類似物生物合成酶的基因轉(zhuǎn)化并且能夠表達(dá)可回收量的酶或其產(chǎn)物的任何真菌細(xì)胞。例示性真菌細(xì)胞包括酵母細(xì)胞如釀酒酵母和巴斯德畢赤酵母。也可使用絲狀真菌如曲霉和木霉的細(xì)胞。大麻素酸合成酶基因序列可從公開可用的數(shù)據(jù)庫獲得。在本發(fā)明的優(yōu)選方面，大麻素酸合成酶基因的一種或多種拷貝在體內(nèi)產(chǎn)生，并且所述方法包含將大麻素酸合成酶基因的一種或多種拷貝整合到真核宿主(如巴斯德畢赤酵母)的基因組中以按比例放大蛋白表達(dá)。優(yōu)選地，大麻素酸合成酶基因?yàn)橛脤δ繕?biāo)蛋白分泌的α分泌序列優(yōu)化或在3'端部用六個(gè)串聯(lián)組氨酸殘基標(biāo)記以有助于純化的密碼子。此方法包含通過用一種或多種限制酶消化將大麻素酸合成酶基因線性化；通過凝膠提取來提取大麻素酸合成酶基因；將大麻素酸合成酶基因接合到巴斯德畢赤酵母質(zhì)粒中；以及將質(zhì)粒電穿孔到細(xì)菌細(xì)胞中以產(chǎn)生一種或多種大麻素酸合成酶基因拷貝菌落。因此，在一個(gè)實(shí)施例中，α-cbda合成酶和α-thca合成酶序列的一種或多種拷貝，例如通過如上文所描述修飾、插入到ppink-hc載體中和轉(zhuǎn)化成大腸桿菌細(xì)胞來產(chǎn)生。轉(zhuǎn)化的細(xì)胞可存儲為瓊脂穿刺液用于將來使用。在酵母細(xì)胞轉(zhuǎn)化之前，含有大麻素酸合成酶相關(guān)基因(goi)的載體從含有轉(zhuǎn)化的大腸桿菌細(xì)胞的瓊脂穿刺液中分離，使用pmei或spei限制酶線性化，并且因此獲得的經(jīng)線性化的質(zhì)粒使用pichiapinktm酵母表達(dá)系統(tǒng)電穿孔到巴斯德畢赤酵母pepb缺陷突變細(xì)胞中。用限制酶pmei線性化指導(dǎo)插入到畢赤酵母基因組的aox1啟動子區(qū)，而用限制酶spei線性化指導(dǎo)插入到trp基因中。轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞可在腺嘌呤缺陷選擇板上生長并且可篩選因此形成的菌落以識別陽性轉(zhuǎn)化體。篩選方法包括(但不限于)顏色篩選方法。通常，需要具有6-10個(gè)相關(guān)基因拷貝的細(xì)胞來獲得大量重組蛋白，例如每升培養(yǎng)物約1.0g到約2.0g蛋白。在一個(gè)實(shí)施例中，攜帶thca合成酶基因或cbda合成酶基因的酵母細(xì)胞的個(gè)別白色菌落例如分別使用bmgy培養(yǎng)基在燒瓶中培養(yǎng)，隨后通過在bmmy培養(yǎng)基中生長來誘導(dǎo)，以誘導(dǎo)thca合成酶或cbda合成酶的表達(dá)，如下文進(jìn)一步描述。簡單來說，含有在每個(gè)培養(yǎng)物中的酶的培養(yǎng)基與細(xì)胞分離，與已知量的底物反應(yīng)并且分析產(chǎn)物。顯示大于20％轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)物用于依據(jù)本發(fā)明的方法商業(yè)合成大麻素或大麻素類似物。使用上述的pichiapinktm酵母表達(dá)系統(tǒng)獲得的大麻素酸合成酶、thca合成酶和cbda合成酶可用于制造大麻素或大麻素類似物。因此獲得的大麻素或大麻素類似物經(jīng)分離、純化并且用作治療劑。在另一實(shí)施例中，因此獲得的大麻素或大麻素類似物進(jìn)行去羧基步驟。根據(jù)本發(fā)明的大麻素合成酶包括(但不限于)大麻二醇酸(cbda)合成酶和四氫大麻酚酸(thca)合成酶。在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明提供用于通過選擇式i化合物和作為用于將式i化合物轉(zhuǎn)化成大麻素或大麻素類似物的催化劑的大麻素酸合成酶來生產(chǎn)大麻素或大麻素類似物的方法。在式i中，r可選自羥基(-oh)、鹵素、巰基(-sh)或-nrarb基團(tuán)。取代基r1和r2各自獨(dú)立地選自由以下組成的群組：-h、-c(o)ra、-ora、任選經(jīng)取代的c1-c10直鏈或支鏈亞烷基、任選經(jīng)取代的c2-c10直鏈或支鏈亞烯基、任選經(jīng)取代的c2-c10直鏈或支鏈亞炔基、任選經(jīng)取代的c3-c10芳基、任選經(jīng)取代的c3-c10環(huán)烷基、(c3-c10)芳基-(c1-c10)亞烷基、(c3-c10)芳基-(c2-c10)亞烯基以及(c3-c10)芳基-(c1-c10)亞炔基?？商娲?，r1和r2與它們鍵結(jié)到的碳原子一起形成c5-c10環(huán)狀環(huán)。對于根據(jù)式i的化合物，r3選自由以下組成的群組：h、-c(o)ra以及c1-c10直鏈或支鏈烷基，并且ra和rb各自獨(dú)立地為-h、-oh、(c1-c10)直鏈或支鏈烷基、-sh、-nh2或c3-c10環(huán)烷基。r2可為直鏈亞烷基或支鏈亞烷基。示例性直鏈亞烷基包括但不限于ch3、c2h5、c3h7、c4h9、c5h11、c6h13、c7h15以及c8h17。例示性支鏈亞烷基為選自以下的基團(tuán)：異丙基、仲丁基、異丁基、新戊基、2-甲基己基或2,3-二甲基己基。在一些實(shí)施例中，r2可為任選經(jīng)取代的直鏈或支鏈亞烷基，其中一個(gè)或多個(gè)氫原子置換為(但不限于)選自以下的基團(tuán)：氯、氟、溴、硝基、氨基、羥基、苯基或苯甲基。在一個(gè)實(shí)施例中，r1和r2與它們鍵結(jié)到的環(huán)碳原子一起形成c5-c10環(huán)狀環(huán)。對于此類式i化合物，所述環(huán)的一個(gè)或多個(gè)碳原子經(jīng)選自氧、硫或氮的雜原子取代。在另一個(gè)實(shí)施例中，r2為(c2-c10)亞烯基并且選自由以下組成的群組：和其中r4為如上文所描述的直鏈或支鏈亞烷基。當(dāng)r2為c2-c10直鏈或支鏈亞炔基時(shí)，r2可為或可替代地，在式i中r2為取代基x為選自-oh、-sh或nrarb的基團(tuán)，并且基團(tuán)ra和rb如上文所定義。在一個(gè)實(shí)施例中，根據(jù)本發(fā)明合成的大麻素和/或大麻素類似物具有羧酸(-cooh)基團(tuán)作為r1取代基，并且可在其用作制藥的或營養(yǎng)藥劑之前進(jìn)行任選的去羧基步驟。具有羧酸基團(tuán)的大麻素或大麻素類似物的實(shí)例包括(但不限于)通過使式i化合物與如上文所描述獲得的大麻素酸合成酶反應(yīng)獲得的化合物，在式i化合物中r為-oh，r1為-cooh，r2為c5h11，并且r3為-h。大麻素或大麻素類似物的合成、分離和純化可通過將大麻素合成酶固定于固體支撐物或通過將合成酶封裝于脂質(zhì)體內(nèi)來改進(jìn)。在一方面，酶被固定到固體支撐物。不受任何理論束縛，本申請的本發(fā)明人已出乎意料地發(fā)現(xiàn)固定有助于酶催化劑的使用和回收、所期望的產(chǎn)物的純化和對映異構(gòu)體過量(ee)的最終產(chǎn)物的保藏，并且提供產(chǎn)物產(chǎn)率的總體改進(jìn)。此外，固定允許經(jīng)固定的酶的再循環(huán)和再使用，這顯著降低與醫(yī)藥級大麻素或大麻素類似物制造相關(guān)聯(lián)的成本。通常，根據(jù)本發(fā)明生產(chǎn)的大麻素和/或大麻素類似物的對映異構(gòu)純度為約90％ee到約100％ee，例如使用本發(fā)明方法生產(chǎn)的大麻素或大麻素類似物可具有約91％ee、約92％ee、約93％ee、約94％ee、約95％ee、約96％ee、約97％ee、約98％ee和約99％ee的對映異構(gòu)純度。通常，待固定的酶可吸附到固體支撐物上，吸附到支撐物上，共價(jià)連接到支撐物或可通過離子相互作用固定到固體支撐物上。在一個(gè)實(shí)施例中，大麻素酸合成酶共價(jià)連接到固體支撐物。將酶連接到固體支撐物的合適策略為生物化學(xué)領(lǐng)域中所熟知并且包括適當(dāng)官能化的支撐物與氨基酸基團(tuán)的側(cè)鏈之間的共價(jià)連接或通過使用適當(dāng)官能化連接基團(tuán)或間隔基分隔支撐物與酶來共價(jià)連接。術(shù)語“連接基團(tuán)”指的是分隔支撐物與酶的任何基團(tuán)。因此，連接基團(tuán)為一端共價(jià)系栓到支撐物表面上的基團(tuán)并且另一端連接到酶的基團(tuán)。例示性連接基團(tuán)包括乙二醇的(c1-c10)亞烷基連接基團(tuán)聚合物，如-(och2-ch2)n-o-基團(tuán)，其中n為0到10的整數(shù)、-(c1-c10)亞烷基-nh-、-(c1-c10)亞烷基硅烷氧基或-(c1-c10)亞烷基-c(o)-。適合于固定酶的支撐物包括(但不限于)amberlite樹脂、duolite樹脂、丙烯酸樹脂如c、deae-sephadex和使用聚乙烯醇制得的凝膠。大麻素發(fā)揮不同生理學(xué)特性并且已知會減輕疼痛、刺激食欲并且已作為用于治療多種疾病病狀的候選治療劑測試，所述疾病如過敏、發(fā)炎、感染、癲癇癥、抑郁癥、偏頭痛、躁郁癥、焦慮癥以及青光眼。大麻素發(fā)揮的生理學(xué)效果受其刺激或鈍化大麻素受體(例如cb1、cb2以及cb3受體)的能力影響。因此，本發(fā)明提供通過改變大麻素和/或大麻素類似物結(jié)合相互作用，和通過確定連接到根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生的大麻素和/或大麻素類似物的取代基的性質(zhì)和定向的在大麻素受體活性位點(diǎn)內(nèi)的配位體的定向來調(diào)節(jié)大麻素受體活性和其制藥特性的方法。因此，在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明提供用于制造具有連接到中心核的結(jié)構(gòu)上不同和相異取代基并且因此呈現(xiàn)不同藥學(xué)上有益特性的大麻素和大麻素類似物的方法。通過使適當(dāng)取代的式iii化合物與式iv化合物在酶(如gppolivetolate香葉基轉(zhuǎn)移酶(聚酮合成酶))存在下接觸實(shí)現(xiàn)結(jié)構(gòu)多樣性以產(chǎn)生式ii化合物。以下流程1結(jié)構(gòu)上說明依據(jù)此實(shí)施例合成式ii化合物的方案。流程1充當(dāng)用于根據(jù)本發(fā)明制造大麻素和/或大麻素類似物的底物的式ii的不同化合物可通過改變在式iii和iv的化合物中r、r1、r2、r3和r5的取代基的性質(zhì)和類型獲得。因此，根據(jù)此實(shí)施例，不同大麻素和/或大麻素類似物可通過使式ii化合物與大麻素酸合成酶(例如如上文所描述獲得的thca合成酶或cbda合成酶)反應(yīng)，隨后將獲得的產(chǎn)物分離并且去羧基以得到大麻素或大麻素類似物來獲得。在式iii中，r可選自羥基(-oh)、鹵素、巰基(-sh)或-nrarb基團(tuán)。取代基r1和r2各自獨(dú)立地選自由以下組成的群組：-h、-c(o)ra、-ora、任選經(jīng)取代的直鏈或支鏈(c1-c10)亞烷基、任選經(jīng)取代的直鏈或支鏈(c2-c10)亞烯基、任選經(jīng)取代的直鏈或支鏈(c2-c10)亞炔基、任選經(jīng)取代的c3-c10芳基、任選經(jīng)取代的c3-c10環(huán)烷基、(c3-c10)芳基-(c1-c10)亞烷基、(c3-c10)芳基-(c2-c10)亞烯基以及(c3-c10)芳基-(c1-c10)亞炔基。在某些實(shí)施例中，r1和r2與它們鍵結(jié)到的碳原子一起形成c5-c10環(huán)狀環(huán)且r3選自由以下組成的群組：h、-c(o)ra以及c1-c10直鏈或支鏈烷基。式iv中的r5可為直鏈或支鏈(c1-c10)亞烷基、直鏈或支鏈(c2-c10)亞烯基、直鏈或支鏈(c2-c10)亞炔基、-c(o)-(c1-c10)亞烷基、-c(o)-(c2-c10)亞烯基以及-c(o)-(c2-c10)亞炔基。對于式ii、iii和iv化合物，任何亞烷基、亞烯基、亞炔基、芳基、芳基亞烷基或環(huán)烷基可經(jīng)一個(gè)或多個(gè)選自由以下組成的群組的基團(tuán)進(jìn)一步取代：-oh、鹵素、-nrbrc、-c(o)ra、-c(o)nrbrc、(c1-c10)烷基、-cn、(c1-c4)烷氧基、(c1-c4)鹵烷基以及(c1-c4)羥基烷基，其中ra、rb以及rc各自獨(dú)立地選自-h、-oh或(c1-c10)直鏈或支鏈烷基、-sh、-nh2或c3-c10環(huán)烷基。根據(jù)一個(gè)實(shí)施例，式iv中的r5可為選自以下的(c2-c10)亞烯基：或其中r4為選自由以下組成的群組的直鏈亞烷基：ch3、c2h5、c3h7、c4h9、c5h11、c6h13、c7h15和c8h17。對于某些式iv化合物，r5為并且基團(tuán)r6選自(c1-c10)亞烷基、(c2-c10)亞烯基、-oh、-sh、no2、f、cl、br、-nh2或-nhra，其中ra如上文所定義。通過過表達(dá)由如上文所描述的重組大麻素酸合成酶基因編碼的蛋白獲得的重組大麻素酸合成酶與根據(jù)式i的底物或與根據(jù)如上文所描述的式ii的底物在包含溶劑和兩親性化合物的反應(yīng)混合物中反應(yīng)，以產(chǎn)生一種或多種大麻素或大麻素類似物。因此形成大麻素或大麻素類似物從反應(yīng)混合物中分離和(任選地)去羧基。優(yōu)選地，重組大麻素酸合成酶為通過上述方法獲得的重組cbda合成酶或重組thca合成酶。在本發(fā)明的優(yōu)選方面，在反應(yīng)混合物中的溶劑為非水性溶劑，如二甲亞砜(dmso)、二甲基甲酰胺(dmf)或異丙醇。在反應(yīng)混合物中溶劑的濃度可在10％和30％(v/v)之間變化。本申請的本發(fā)明人已出乎意料地發(fā)現(xiàn)，在反應(yīng)混合物中的非水性溶劑的濃度影響反應(yīng)速率以及不同大麻素產(chǎn)物之間的比率。因此，下表示出了在由thca合成酶驅(qū)動的反應(yīng)中，在反應(yīng)混合物中濃度為20％(v/v)的dmso的存在增加反應(yīng)速率2.5倍，并且引起反應(yīng)產(chǎn)生比率為5:1的thca和cbca，而在反應(yīng)混合物中濃度為10％(v/v)的dmso的存在產(chǎn)生比率為10:1的thca和cbca。因此，在本發(fā)明的優(yōu)選方面，在反應(yīng)混合物中的非水性溶劑為dmso，并且在反應(yīng)混合物中dmso的濃度最優(yōu)選地為20％(v/v)。表1：dmso濃度對反應(yīng)速率和產(chǎn)物的影響dmso反應(yīng)速率thca:cbca0％1x10％1.2x10:120％2.5x5:125％-1:130％0.3x在本發(fā)明的另外優(yōu)選實(shí)施例中，反應(yīng)混合物還包含兩親性化合物。優(yōu)選地，兩親性化合物為表面活性劑或環(huán)糊精。表面活性劑可包括(但不限于)陽離子表面活性劑、離子表面活性劑和陰離子表面活性劑。最優(yōu)選地，反應(yīng)混合物含有環(huán)糊精。環(huán)糊精為由六個(gè)或更多個(gè)1-4連接α-去羥-葡萄糖部分構(gòu)成的天然環(huán)狀低聚糖，其可由淀粉通過酶反應(yīng)產(chǎn)生。環(huán)糊精根據(jù)葡萄糖單元的數(shù)量歸類為α-環(huán)糊精(六個(gè)單元)、β-環(huán)糊精(七個(gè)單元)和γ-環(huán)糊精(八個(gè)單元)。環(huán)糊精的結(jié)構(gòu)示出如下：在環(huán)糊精分子的外側(cè)上的仲羥基為親水性的，而伯羥基形成疏水性中心腔室。不受任何理論束縛，據(jù)相信，在環(huán)糊精中的疏水性中心腔室結(jié)合在反應(yīng)混合物中的底物作為客體分子，并且雖然無共價(jià)或離子鍵形成，但是因此形成的絡(luò)合物保護(hù)底物并且使其穩(wěn)定。本申請的本發(fā)明人已出乎意料地發(fā)現(xiàn)，在反應(yīng)混合物中的環(huán)糊精的濃度影響底物到產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率以及反應(yīng)的不同產(chǎn)物之間的比率，如在下表中所示。示出了在ph4.85下在反應(yīng)混合物中的環(huán)糊精濃度對cbda合成酶反應(yīng)的影響。如在下表中所示，在cbda合成酶反應(yīng)中，環(huán)糊精的濃度從0mg/ml增大到28mg/ml增加cbga到cbda和cbca的轉(zhuǎn)化率，其中當(dāng)環(huán)糊精濃度為8mg/ml和12mg/ml時(shí)發(fā)現(xiàn)最高轉(zhuǎn)化率(與無環(huán)糊精添加到反應(yīng)比較轉(zhuǎn)化率高20％)。在ph5下添加環(huán)糊精也稍微改變cbda:cbca的比率。當(dāng)環(huán)糊精濃度為20mg/ml時(shí)觀察到最高cbda:cbca比率(cbda:cbca1.41:1)，并且當(dāng)環(huán)糊精濃度為16mg/ml時(shí)觀察到最低cbda:cbca比率(cbda:cbca1.04:1)。表2：環(huán)糊精對cbda合成酶反應(yīng)轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)物比率的影響環(huán)糊精濃度轉(zhuǎn)化率cbda:cbca比率圖0mg/ml40％1.13:1112mg/ml57％1.24:1124mg/mln/an/an/a8mg/ml61％1.28:11312mg/ml60％1.33:11416mg/ml50％1.04:11520mg/ml53％1.41:11628mg/ml45％1.24:117環(huán)糊精可為α-環(huán)糊精，β-環(huán)糊精或γ-環(huán)糊精。在一些實(shí)施例中，環(huán)糊精為硫代丁基醚β-環(huán)糊精鈉鹽或無規(guī)甲基化的β-環(huán)糊精。當(dāng)存在于反應(yīng)混合物中時(shí)，環(huán)糊精的濃度為約0.001mg/ml到約30mg/ml。優(yōu)選地，在反應(yīng)混合物中環(huán)糊精的濃度在2mg/ml和28mg/ml之間。在最優(yōu)選實(shí)施例中，在反應(yīng)混合物中環(huán)糊精的濃度為8mg/ml。如在下表中和在圖11至17中所示，無環(huán)糊精，dmso的量從10％增加到20％將cbga的轉(zhuǎn)化率從13.5％增加到45.8％過夜，并且將thca:cbca的比率從3.33:1改變到2.24:1。在具有10％dmso的反應(yīng)中包括環(huán)糊精，將cbga的轉(zhuǎn)化率增加到89.7％并且產(chǎn)生4.2:1的thca:cbca的比率。將環(huán)糊精的濃度增加到40％或60％得到相同結(jié)果。條件cbgathcacbcathca:cbca圖id10％dmso，無環(huán)糊精86.51％10.40％3.0900％3.37:1120％dmso，無環(huán)糊精54.18％32.39％13.43％2.41:1210％dmso，20％環(huán)糊精10.33％72.37％17.300％4.20:1310％dmso，40％環(huán)糊精11.50％72.08％16.42％4.39:1410％dmso，60％環(huán)糊精10.36％73.98％15.65％4.73:15根據(jù)本發(fā)明的方法生產(chǎn)的大麻素或大麻素類似物可為其中對映異構(gòu)純度為至少95％，并且優(yōu)選地至少99％的單對映異構(gòu)體。本申請的本發(fā)明人還已出乎意料地發(fā)現(xiàn)，反應(yīng)混合物的ph影響獲得的不同大麻素產(chǎn)物之間的比率。因此，在優(yōu)選實(shí)施例中，改變反應(yīng)混合物的ph以獲得期望比率的大麻素產(chǎn)物和/或大麻素類似物產(chǎn)物。因此，當(dāng)與根據(jù)本發(fā)明的式i化合物反應(yīng)時(shí)，thca合成酶可根據(jù)反應(yīng)的ph產(chǎn)生不同比率的四氫大麻酚(thca)、大麻環(huán)萜酚(cbca)、thca和cbca，或其類似物。優(yōu)選地，反應(yīng)在3.8和7.2之間的范圍內(nèi)的ph下進(jìn)行，并且所述方法在每個(gè)指定ph下產(chǎn)生thca、cbca，或如在下表中所示的比率的thca和cbca：表3：ph對thca合成酶反應(yīng)產(chǎn)物的影響phthcacbca41052.331615.67701綜上所述，改變thca合成酶反應(yīng)的ph影響產(chǎn)物。在ph4下，thca為唯一產(chǎn)物。在ph5下，thca:cbca的比率為2.33:1。在ph6下，比率顛倒并且產(chǎn)品組合為thca:cbca1:5.67。在ph7下，cbca為唯一產(chǎn)物。在這些條件下，在兩小時(shí)內(nèi)98％的式i化合物轉(zhuǎn)化成一種或多種大麻素或大麻素類似物。類似地，當(dāng)與式i化合物反應(yīng)時(shí)，cbda合成酶可根據(jù)反應(yīng)的ph產(chǎn)生不同比率的大麻二酚(cbda)、大麻環(huán)萜酚酸(cbca)、cbda和cbca，或其類似物。優(yōu)選地，反應(yīng)在3.8和7.2之間的范圍內(nèi)的ph下進(jìn)行，并且所述方法在每個(gè)指定ph下生產(chǎn)cbda、cbca，或如在下表中所示的比率的cbda和cbca：表4：ph對cbda合成酶反應(yīng)產(chǎn)物的影響phcbdacbca4.22.5151.1315.211.175.412.455.816.146.2128.136.800綜上所述，改變cbda合成酶反應(yīng)的ph影響產(chǎn)物。在ph4.2下，cbda:cbca比率為2.5:1。在ph5下，cbda:cbca的比率為1.13:1。在ph6.8下，不存在由cbda合成酶反應(yīng)形成的產(chǎn)物。在這些條件下，在兩小時(shí)內(nèi)70％的式i化合物轉(zhuǎn)化成一種或多種大麻素或大麻素類似物。本發(fā)明還提供生產(chǎn)根據(jù)式ii的一種或多種大麻素或大麻素類似物的方法，其中所述方法包含以下步驟：(a)使根據(jù)式iii的化合物與根據(jù)式iv的化合物反應(yīng)；在催化式iii化合物與式iv化合物反應(yīng)的酶存在下反應(yīng)形成式ii化合物；(b)使式ii化合物與大麻素酸合成酶在如上文所描述的包含溶劑和兩親性化合物的反應(yīng)混合物中反應(yīng)以產(chǎn)生一種或多種大麻素或大麻素類似物；(c)從反應(yīng)混合物中分離在步驟(b)中產(chǎn)生的一種或多種大麻素或大麻素類似物；以及(e)任選地將在步驟(c)中分離的一種或多種大麻素或大麻素類似物去羧基。式iii中的r可選自-oh、鹵素、-sh或-nrarb基團(tuán)；r1和r2各自獨(dú)立地選自由以下組成的群組：-h、-c(o)ra、-ora、任選地經(jīng)取代的直鏈或支鏈(c1-c10)亞烷基、任選地經(jīng)取代的直鏈或支鏈(c2-c10)亞烯基、任選地經(jīng)取代的直鏈或支鏈(c2-c10)亞炔基、任選地經(jīng)取代的c3-c10芳基、任選地經(jīng)取代的c3-c10環(huán)烷基、(c3-c10)芳基-(c1-c10)亞烷基、(c3-c10)芳基-(c2-c10)亞烯基以及(c3-c10)芳基-(c1-c10)亞炔基，或r1和r2與它們鍵結(jié)到的碳原子一起形成c5-c10環(huán)狀環(huán)；r3選自由以下組成的群組：h、-c(o)ra以及c1-c10直鏈或支鏈烷基。在式iv中的r5可選自由以下組成的群組：直鏈或支鏈(c1-c10)亞烷基、直鏈或支鏈(c2-c10)亞烯基、直鏈或支鏈(c2-c10)亞炔基、-c(o)-(c1-c10)亞烷基、-c(o)-(c2-c10)亞烯基以及-c(o)-(c2-c10)亞炔基；其中任何亞烷基、亞烯基、亞炔基、芳基、芳基亞烷基或環(huán)烷基經(jīng)一個(gè)或多個(gè)選自由以下組成的群組的基團(tuán)進(jìn)一步取代：-oh、鹵素、-nrbrc、-c(o)ra、-c(o)nrbrc、(c1-c10)烷基、-cn、(c1-c4)烷氧基、(c1-c4)鹵烷基以及(c1-c4)羥基烷基；并且ra、rb以及rc各自獨(dú)立地為-h、-oh、-sh、-nh2、(c1-c10)直鏈或支鏈烷基或c3-c10環(huán)烷基。在一個(gè)實(shí)施例中，r5為選自由以下組成的群組的(c2-c10)亞烯基：和并且r4為選自由以下組成的群組的直鏈亞烷基：ch3、c2h5、c3h7、c4h9、c5h11、c6h13、c7h15和c8h17。在本發(fā)明的優(yōu)選方面，r5為并且r6選自(c1-c10)亞烷基、(c2-c10)亞烯基、-oh、-sh、no2、f、cl、br、-nh2或-nhra。在又一實(shí)施例中，本發(fā)明提供用于生產(chǎn)四氫大麻酚、大麻環(huán)萜酚，或四氫大麻酚和大麻環(huán)萜酚兩者，或其類似物的方法，其中所述方法包含以下步驟：(a)選擇根據(jù)式i的化合物；(b)使式i化合物與四氫大麻酚酸(thca)合成酶在包含如上文所描述的溶劑和兩親性化合物的反應(yīng)混合物中反應(yīng)；(c)改變反應(yīng)混合物的至少一種特性，如反應(yīng)的ph、非水性溶劑的性質(zhì)和/或濃度，和/或兩親性化合物(如環(huán)糊精)的濃度，以獲得四氫大麻酚、大麻環(huán)萜酚、或四氫大麻酚和大麻環(huán)萜酚兩者，或其類似物，作為如上文所描述的產(chǎn)物；(d)從反應(yīng)混合物中分離四氫大麻酚、大麻環(huán)萜酚，或四氫大麻酚和大麻環(huán)萜酚兩者，或其類似物；以及(e)將四氫大麻酚、大麻環(huán)萜酚，或四氫大麻酚和大麻環(huán)萜酚兩者，或其類似物去羧基。在式i中的r可選自-oh、鹵素、-sh或-nrarb基團(tuán)；r1和r2各自獨(dú)立地選自由以下組成的群組：-h、-c(o)ra、-ora、任選地經(jīng)取代的c1-c10直鏈或支鏈亞烷基、任選地經(jīng)取代的c2-c10直鏈或支鏈亞烯基、任選地經(jīng)取代的c2-c10直鏈或支鏈亞炔基、任選地經(jīng)取代的c3-c10芳基、任選地經(jīng)取代的c3-c10環(huán)烷基、(c3-c10)芳基-(c1-c10)亞烷基、(c3-c10)芳基-(c2-c10)亞烯基以及(c3-c10)芳基-(c1-c10)亞炔基，或r1和r2與它們鍵結(jié)到的碳原子一起形成c5-c10環(huán)狀環(huán)；r3選自由以下組成的群組：h、-c(o)ra以及c1-c10直鏈或支鏈烷基；并且ra和rb各自獨(dú)立地為-h、-oh、-sh、-nh2、(c1-c10)直鏈或支鏈烷基或c3-c10環(huán)烷基。在不同實(shí)施例中，本發(fā)明還提供用于生產(chǎn)大麻二酚、大麻環(huán)萜酚，或大麻二酚和大麻環(huán)萜酚兩者，或其類似物的方法，其包含以下步驟：(a)選擇根據(jù)式i的化合物；(b)使式i化合物與大麻二醇酸(cbda)合成酶在包含如上文所描述的溶劑和兩親性化合物的反應(yīng)混合物中反應(yīng)；(c)改變反應(yīng)混合物的至少一種特性，如反應(yīng)的ph、非水性溶劑的性質(zhì)和/或濃度，和/或兩親性化合物(如環(huán)糊精)的濃度，以獲得大麻二酚、大麻環(huán)萜酚，或大麻二酚和大麻環(huán)萜酚兩者，或其類似物作為產(chǎn)物；(d)從反應(yīng)混合物中分離大麻二酚、大麻環(huán)萜酚，或大麻二酚和大麻環(huán)萜酚兩者，或其類似物；以及(e)將大麻二酚、大麻環(huán)萜酚，或大麻二酚和大麻環(huán)萜酚兩者，或其類似物去羧基。在式i中的r可選自-oh、鹵素、-sh或-nrarb基團(tuán)；r1和r2各自獨(dú)立地選自由以下組成的群組：-h、-c(o)ra、-ora、任選地經(jīng)取代的c1-c10直鏈或支鏈亞烷基、任選地經(jīng)取代的c2-c10直鏈或支鏈亞烯基、任選地經(jīng)取代的c2-c10直鏈或支鏈亞炔基、任選地經(jīng)取代的c3-c10芳基、任選地經(jīng)取代的c3-c10環(huán)烷基、(c3-c10)芳基-(c1-c10)亞烷基、(c3-c10)芳基-(c2-c10)亞烯基以及和(c3-c10)芳基-(c1-c10)亞炔基，或r1和r2與它們鍵結(jié)到的碳原子一起形成c5-c10環(huán)狀環(huán)；r3選自由以下組成的群組：h、-c(o)ra以及c1-c10直鏈或支鏈烷基；并且ra和rb各自獨(dú)立地為-h、-oh、-sh、-nh2、(c1-c10)直鏈或支鏈烷基或c3-c10環(huán)烷基。因此，本發(fā)明人已設(shè)計(jì)通過改變反應(yīng)的ph、在反應(yīng)混合物中的非水性溶劑的性質(zhì)和/或濃度和/或兩親性化合物(如環(huán)糊精)的濃度以期望比率和控制方式生產(chǎn)不同大麻素和/或大麻素類似物的方法。用于生產(chǎn)大麻素或大麻素類似物的設(shè)備和方法提供設(shè)備或系統(tǒng)用于根據(jù)本發(fā)明的方法生產(chǎn)一種或多種大麻素或大麻素類似物。設(shè)備可包含發(fā)酵器、過濾器、生物反應(yīng)器和控制機(jī)構(gòu)。圖7描繪設(shè)備100，其被配置成根據(jù)實(shí)施例生產(chǎn)至少一種大麻素和/或至少一種大麻素類似物。如在圖7中所示，設(shè)備100包括發(fā)酵器10、過濾器20、生物反應(yīng)器30和控制機(jī)構(gòu)(控制器)40。發(fā)酵器10保持細(xì)胞培養(yǎng)基12和多個(gè)細(xì)胞14。細(xì)胞14產(chǎn)生并分泌大麻素酸合成酶。在用于制造大麻素酸合成酶的在發(fā)酵器10中生長的細(xì)胞14可為酵母、原核或真核細(xì)胞，其已被遺傳修飾以包括編碼大麻素酸合成酶蛋白的核酸序列或基因。在某些實(shí)施例中，編碼大麻素合成酶蛋白的核酸序列經(jīng)修飾以在其5'末端包括酵母α分泌序列并且在其3'末端并入6-殘基組氨酸標(biāo)簽。添加酵母α分泌序列允許向用于真核細(xì)胞生長的培養(yǎng)基12中分泌大麻素酸合成酶蛋白。在發(fā)酵器10中產(chǎn)生大麻素酸合成酶之后，將包含培養(yǎng)基12和細(xì)胞14(和大麻素合成酶)的上清液沿路徑運(yùn)輸?shù)竭^濾器20。過濾器20可過濾上清液以至少部分分離細(xì)胞14與含有所表達(dá)的酶的培養(yǎng)基12。通常，過濾器20分離至少80％的總細(xì)胞14與培養(yǎng)基。在一些實(shí)施例中，過濾器20分離至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的總細(xì)胞14與培養(yǎng)基12。在過濾之后，將細(xì)胞14運(yùn)輸回發(fā)酵器10。在一個(gè)實(shí)施例中，過濾器20可為包括多個(gè)過濾器和貯存器以純化大麻素合成酶的過濾和純化系統(tǒng)。在通過過濾器20之后，大麻素酸合成酶流入生物反應(yīng)器30并且通過入口32進(jìn)入生物反應(yīng)器30。生物反應(yīng)器30還包括用于反應(yīng)物(如底物cbga或根據(jù)上文所述的式i化合物的其它底物)的入口34。在一些實(shí)施例中，生物反應(yīng)器30可為具有支撐物36的塔式生物反應(yīng)器。支撐物36可為浸漬有二價(jià)金屬離子的固體支撐物，或其表面用二價(jià)金屬離子官能化的支撐物。通常，瓊脂糖凝膠、瓊脂糖或其它生物聚合物用作用于結(jié)合二價(jià)金屬離子(如鎳、鈷、鎂和錳)的支撐物。此類支撐物具有對在所表達(dá)大麻素酸合成酶上存在的組氨酸標(biāo)簽的強(qiáng)親和力并且可用于螯合合成酶以及將其與可干擾或阻礙大麻素合成的其它非必需蛋白質(zhì)和碎片分離。用于合成大麻素的生物反應(yīng)器30被配置成用于分批和連續(xù)合成工藝以允許商業(yè)生產(chǎn)醫(yī)藥學(xué)上適用的大麻素。在一個(gè)實(shí)施例中，生物反應(yīng)器30被配置成用于分批合成，在所述分批合成中在工藝開始時(shí)固定培養(yǎng)基的組成、酶和底物的濃度并且在催化期間不允許改變。當(dāng)生物反應(yīng)器30的培養(yǎng)基中的期望產(chǎn)物的濃度達(dá)到預(yù)定值或底物濃度低于預(yù)定水平(如至不存在底物到產(chǎn)物的可檢測催化轉(zhuǎn)化的程度)時(shí)，合成終止。在一個(gè)實(shí)施例中，因此，his標(biāo)記的大麻素酸合成酶在向生物反應(yīng)器30中引入已知量的底物(例如大麻萜酚酸(cbga))或式i、式ii化合物之前螯合到生物反應(yīng)器30內(nèi)的含有鎳的樹脂支撐物上。在替代實(shí)施例中，在向生物反應(yīng)器30引入含有大麻素酸合成酶的培養(yǎng)基之前，cbga或式i或式ii化合物可存在于具有鎳樹脂支持物的生物反應(yīng)器30內(nèi)?？啥ㄆ诨虺掷m(xù)監(jiān)測生物反應(yīng)器30內(nèi)的反應(yīng)進(jìn)展。舉例來說，可采用光學(xué)監(jiān)測系統(tǒng)50來檢測在生物反應(yīng)器內(nèi)的培養(yǎng)基中產(chǎn)物濃度隨時(shí)間的變化?？商娲?，可監(jiān)測底物濃度的降低直到合成的信號終止。因此產(chǎn)生的大麻素產(chǎn)物容易使用標(biāo)準(zhǔn)溶劑萃取或色譜純化方法從培養(yǎng)基中回收。監(jiān)測系統(tǒng)50可為下文進(jìn)一步描述的控制機(jī)構(gòu)40(控制器)的一部分或可與其相互作用。分批加工模式的替代為連續(xù)加工模式，其中向生物反應(yīng)器30中連續(xù)添加限定量的底物和培養(yǎng)基，同時(shí)從生物反應(yīng)器30去除相等量的含有大麻素產(chǎn)物的培養(yǎng)基以維持恒定產(chǎn)物形成速率。培養(yǎng)基可通過入口32進(jìn)入生物反應(yīng)器30并且通過出口38離開生物反應(yīng)器?？墒褂每刂茩C(jī)構(gòu)40控制生物反應(yīng)器的條件。控制機(jī)構(gòu)40可耦接到生物反應(yīng)器30，或可替代地可與生物反應(yīng)器30無線或遠(yuǎn)程相互作用?？刂茩C(jī)構(gòu)40還可用于控制發(fā)酵器10條件，如氧氣水平、攪動、ph和進(jìn)料速率?？刂茩C(jī)構(gòu)40還可控制材料進(jìn)出發(fā)酵器10、過濾器20和生物反應(yīng)器30的流速(例如通過控制至少一個(gè)泵)。在一些實(shí)施例中，控制機(jī)構(gòu)40被配置成基于從光學(xué)監(jiān)測系統(tǒng)50獲得的信息控制發(fā)酵器10、過濾器20和生物反應(yīng)器30中的至少一種的條件?？刂茩C(jī)構(gòu)40可包括具有處理器和存儲裝置的處理電路。處理器和存儲器被配置成完成或促進(jìn)在本申請中描述的各種過程和功能，如控制生物反應(yīng)器30的ph、溫度和壓力，或改變培養(yǎng)基進(jìn)出生物反應(yīng)器30的流動速率。在一些實(shí)施例中，為了促進(jìn)ph、溫度、壓力和流動速率的控制，控制機(jī)構(gòu)40可被配置成與在傳感器組60中的至少一個(gè)傳感器通信。傳感器組60可包括ph傳感器62、溫度傳感器64和壓力傳感器66。控制機(jī)構(gòu)40可包括用于反饋類控制的比例-積分-微分(pid)控制器。控制機(jī)構(gòu)40可進(jìn)一步被配置成經(jīng)由脈波寬度調(diào)變(pwm)技術(shù)調(diào)節(jié)材料進(jìn)出發(fā)酵器10、過濾器20生物反應(yīng)器30的流動速率。圖10描繪控制機(jī)構(gòu)40?？刂茩C(jī)構(gòu)40包括耦接到通信總線48的處理器43?？刂茩C(jī)構(gòu)40進(jìn)一步包括主存儲器42，如隨機(jī)存取存儲器(ram)或其它動態(tài)存儲器裝置，其耦接到總線48用于存儲信息，并且配置成存儲待由處理器43執(zhí)行的指令。主存儲器42進(jìn)一步被配置成在由處理器43執(zhí)行指令期間存儲臨時(shí)變量和中間信息?？刂茩C(jī)構(gòu)40可另外包括連接到總線48用于存儲信息和指令的只讀存儲器(rom)44或其它靜態(tài)存儲裝置。此外，存儲裝置46(如固態(tài)裝置、磁碟或光碟)可耦接到總線48用于持久存儲信息和指令。此外，控制機(jī)構(gòu)40可耦接(經(jīng)由總線48)到顯示器77(如液晶顯示器或有源矩陣顯示器)用于向用戶顯示信息。在一些實(shí)施例中，輸入裝置11(如鍵盤)還可耦接到總線48用于通信信息，并且將命令傳達(dá)到處理器43。在一些實(shí)施例中，輸入裝置11具有觸摸屏顯示器。在一些實(shí)施例中，生物反應(yīng)器30不是柱反應(yīng)器。相反，如在圖8中所示，生物反應(yīng)器30包含多個(gè)微量滴定板并且提供于系統(tǒng)200中。系統(tǒng)200(如同系統(tǒng)100)包括被配置成控制生物反應(yīng)器30的控制器40。控制器40可控制生物反應(yīng)器30的環(huán)境條件和到生物反應(yīng)器30的材料的供應(yīng)，并且還可控制在多個(gè)微量滴定板上進(jìn)行的操作。在一些實(shí)施例中，系統(tǒng)200的微量滴定板中的每個(gè)具有96個(gè)孔。在其它實(shí)施例中，至少一個(gè)微量滴定板具有384個(gè)孔、1,536個(gè)孔、3456個(gè)孔，或9600個(gè)孔。在具有96孔微量滴定板的實(shí)施例中，酶反應(yīng)可在96個(gè)孔中的每個(gè)中進(jìn)行。在每個(gè)孔中的反應(yīng)在0.5ml的體積中或在超過0.5ml的體積中進(jìn)行。上述設(shè)備被配置成通過參考圖9實(shí)施下文描述的技術(shù)生產(chǎn)大麻素酸或大麻素酸類似物，具體地說，thca和cbca或cbda和cbca。圖9示出用于根據(jù)實(shí)施例生產(chǎn)大麻素或大麻素類似物的自動化方法(900)。方法包括在每個(gè)孔中提供大麻素cbg、dmso和大麻素生物合成酶(901)。大麻素生物合成酶可為(例如)thca合成酶。大麻素生物合成酶通過發(fā)酵器10通過使用編碼thca合成酶的基因轉(zhuǎn)化的酵母生長來生產(chǎn)，如上文所描述。另一方面，大麻素cbg為化學(xué)合成。大麻素cbg、dmso和大麻素生物合成酶可被認(rèn)為是引入生物反應(yīng)器中的‘起始物質(zhì)’以最終產(chǎn)生至少一種大麻素或大麻素類似物。大麻素cbg、dmso和大麻素生物合成酶可經(jīng)由自動移液提供于每個(gè)孔中。換句話說，設(shè)備(如系統(tǒng)100、200)可包含可例如通過控制機(jī)構(gòu)40控制的機(jī)械化部件，以便將適當(dāng)量的大麻素cbg、dmso和大麻素生物合成酶中的至少一種遞送到微量滴定板的每個(gè)孔。在一些實(shí)施方案中，在圖9中所示的操作可借助此類自動化反復(fù)地進(jìn)行。舉例來說，自動化分配系統(tǒng)或自動化遞送系統(tǒng)可被構(gòu)造為供應(yīng)機(jī)構(gòu)并且用于遞送cbg、dmso和thca合成酶中的至少一種和溶劑。在一些實(shí)施方案中，系統(tǒng)100、200可被配置成具有被配置成使樣品制備和轉(zhuǎn)移自動化的可編程樣品更換器。可編程樣品更換器可為(例如)由美國威斯康星州米德爾敦的吉爾森公司(gilson,inc.ofmiddleton,wisconsin,usa)生產(chǎn)的gilson223樣品更換器并且可用蠕動泵和/或注射泵操作。方法進(jìn)一步包括當(dāng)這些材料分布在孔中時(shí)，使大麻素cbg和大麻素生物合成酶(如thca合成酶)在dmso中反應(yīng)(902)。在一些實(shí)施方案中，方法進(jìn)一步包括確定待由反應(yīng)產(chǎn)生的thca與cbca的比率或cbda與cbca的比率(903)。在一些實(shí)施方案中，控制機(jī)構(gòu)40確定待產(chǎn)生的thca的量和cbca的量，或待產(chǎn)生的cbda的量或cbca的量。接下來，方法包括確定反應(yīng)混合物的ph是否需要調(diào)節(jié)以便產(chǎn)生thca與cbca的預(yù)定比率或cbda與cbca的預(yù)定比率(904)。具體地說，ph可通過改變反應(yīng)混合物的組成來調(diào)節(jié)以獲得期望比率的thca:cbca或期望比率的cbda:cbca。反應(yīng)在thca和cbca或cbda和cbca的生產(chǎn)中達(dá)到極點(diǎn)(905)。方法進(jìn)一步包括將溶劑自動移液到微量滴定板的每個(gè)孔中(906)。添加溶劑導(dǎo)致反應(yīng)的停止。方法另外包括在將溶劑引入孔中并且停止反應(yīng)之后，回收在溶劑層中的大麻素或大麻素類似物。當(dāng)反應(yīng)已停止時(shí)，去除所得溶劑層(907)，并且大麻素或大麻素類似物為可回收的。更具體地說，大麻素或大麻素類似物可經(jīng)由真空蒸發(fā)或乙醇提取從存在于每個(gè)孔中的溶劑級分中回收(908)。在一些實(shí)施例中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器用于去除溶劑。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器可為自動化旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，如由德國羅滕堡(rothenburgobdertauber,germany)的genser科學(xué)儀器(genserscientificinstrumentsofrothenburgobdertauber,germany)生產(chǎn)的全自動旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器。一旦去除溶劑，則大麻素或大麻素類似物保留在孔的底部中。方法進(jìn)一步包括再懸浮大麻素或大麻素類似物(909)。大麻素或大麻素類似物可再懸浮于乙醇、脂質(zhì)體或脂質(zhì)膠束中。在圖9中示出的方法允許回收大麻素或大麻素類似物，其可容易調(diào)配成藥品和包括飲料、糖果和化妝品的大麻灌注產(chǎn)品，以及其它實(shí)例。大麻素或大麻素類似物可容易經(jīng)由hplc純化用于制藥應(yīng)用。在至少一個(gè)實(shí)施方案中，在存在或不存在穩(wěn)定劑的情況下的0.5mg的緩沖的cbg、緩沖的thca合成酶或緩沖的cbda合成酶和dmso被自動移液到微量滴定板的多個(gè)孔的每個(gè)中。在一些實(shí)施方案中，添加的dmso可具有20％的最終濃度。當(dāng)培育2小時(shí)、4小時(shí)、12小時(shí)和24小時(shí)時(shí)，在多個(gè)孔的每個(gè)中的隨之而來的反應(yīng)通常產(chǎn)生大約0.5mg的大麻素。因此，對于包括96個(gè)孔的微量滴定板，系統(tǒng)100生產(chǎn)約48mg的大麻素。因此，當(dāng)使用多個(gè)微量滴定板時(shí)，生產(chǎn)的大麻素的量‘按比例增加’。舉例來說，如果使用21個(gè)微量滴定板，每個(gè)具有96個(gè)孔，那么根據(jù)上述技術(shù)可生產(chǎn)1008mg(約1克的大麻素)。使用315個(gè)微量滴定板生產(chǎn)大約150克的大麻素。在一些實(shí)施方案中，大于0.5mg的體積可用于反應(yīng)混合物。在一些實(shí)施例中，控制器的處理器可被實(shí)施為通用處理器、專用集成電路(asic)、一種或多種現(xiàn)場可編程門陣列(fpga)、一組處理組件或其它合適的電子處理組件。存儲裝置(例如存儲器、存儲器單元、存儲裝置等)為用于存儲數(shù)據(jù)的一種或多種裝置(例如ram、rom、閃存、硬盤貯存等)和/或用于完成或促進(jìn)上述各種過程和功能的計(jì)算機(jī)代碼。存儲裝置可為或包括易失性存儲器或非易失性存儲器。存儲裝置可包括數(shù)據(jù)庫組件、目標(biāo)代碼組件、腳本組件或用于支持本申請案中所述的多種活動和信息結(jié)構(gòu)的任何其它類型的信息結(jié)構(gòu)。根據(jù)一個(gè)實(shí)施例，存儲裝置經(jīng)由處理線路可聯(lián)通連接到處理器并且包括用于執(zhí)行(例如由處理線路和/或處理器)一種或多種本文所述的方法的計(jì)算機(jī)代碼。本公開涵蓋用于實(shí)現(xiàn)多種操作(如控制生物反應(yīng)器的條件)的方法、設(shè)備和任何機(jī)器可讀媒體上的程序產(chǎn)品。本公開的實(shí)施例可使用現(xiàn)有計(jì)算機(jī)處理器或通過為這一或另一目的并入的針對適當(dāng)系統(tǒng)的專用計(jì)算機(jī)處理器，或通過硬接線系統(tǒng)來實(shí)施。本發(fā)明范圍內(nèi)的實(shí)施例包括包含用于攜帶或儲存有機(jī)器可執(zhí)行指令或數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)的機(jī)器可讀媒體的程序產(chǎn)品。此類機(jī)器可讀媒體可為可通過通用或?qū)Ｓ糜?jì)算機(jī)或其它具有處理器的機(jī)構(gòu)存取的任何可用媒體。舉例來說，此類機(jī)器可讀媒體可包括ram、rom、eprom、eeprom、cd-rom或其它光盤存儲裝置、磁盤存儲裝置、其它磁性存儲裝置、固態(tài)儲存裝置或任何其它可用于攜帶或存儲機(jī)器可執(zhí)行指令或數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)形式的所需程序代碼并且可由通用或?qū)Ｓ糜?jì)算機(jī)或具有處理器的其它機(jī)器存取的任何其它媒體。當(dāng)信息經(jīng)網(wǎng)絡(luò)或另一通信連接(硬接線、無線或硬接線或無線的組合)轉(zhuǎn)移或提供到機(jī)器時(shí)，所述機(jī)器將連接適當(dāng)?shù)匾暈闄C(jī)器可讀媒體。因此，任何此類連接可適當(dāng)?shù)胤Q為機(jī)器可讀媒體。以上各項(xiàng)的組合也包括在機(jī)器可讀媒體的范圍內(nèi)。機(jī)器可執(zhí)行指令包括例如使通用計(jì)算機(jī)、專用計(jì)算機(jī)或?qū)Ｓ锰幚頇C(jī)器執(zhí)行某一功能或功能組的指令和數(shù)據(jù)。控制機(jī)構(gòu)可進(jìn)一步包括額外裝置(如鍵盤和顯示器)，以使用戶與控制機(jī)構(gòu)交互以控制生物反應(yīng)器的條件。舉例來說，顯示器可包括允許用戶監(jiān)測生物反應(yīng)器的ph、溫度、壓力和流動速率的改變或監(jiān)測系統(tǒng)的任何其它條件以生產(chǎn)大麻素或大麻素類似物的屏幕。本發(fā)明通過以下實(shí)例進(jìn)一步描述，所述實(shí)例不會限制權(quán)利要求書的范圍。實(shí)例a.來自高產(chǎn)量酵母轉(zhuǎn)化體的蛋白質(zhì)的分子克隆、篩選和表達(dá)1.限制消化.通過在37℃下用pmei或spei限制酶消化每個(gè)質(zhì)粒維持兩小時(shí)使thcaα質(zhì)粒dna或cbdaα質(zhì)粒dna線性化。經(jīng)線性化質(zhì)粒在0.8％瓊脂糖凝膠上通過電泳檢驗(yàn)。qiagen凝膠提取試劑盒用于從瓊脂糖凝膠提取經(jīng)線性化質(zhì)粒并且質(zhì)粒在-20℃下冷凍直至使用。2.制備電感受態(tài)酵母細(xì)胞.通過用基因工程改造ade2、pep4基因敲除ppink酵母菌株2的甘油原料接種10mlypd培養(yǎng)基來制備電感受態(tài)pichiapink(ppink)細(xì)胞。這些細(xì)胞在28℃下在125ml具有檔板的燒瓶中生長過夜，使用以270rpm旋轉(zhuǎn)的震蕩器直到培養(yǎng)物的od600達(dá)到指示對數(shù)期生長的1.3單位的值。此培養(yǎng)物然后添加到100mlypd培養(yǎng)基中并且在相同條件下培育過夜。每小時(shí)檢查od600并且在12小時(shí)培育期之后達(dá)到1.3單位的值。在達(dá)到對數(shù)期生長之后，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到500ml離心管并且在4℃和2500rpm下離心沉淀5分鐘。傾析ypd培養(yǎng)液并且添加250ml無菌冰冷水并再懸浮細(xì)胞。然后細(xì)胞在4℃下以2500rpm再離心5分鐘，用另外250ml的水再懸浮以確保去除所有ypd培養(yǎng)基并且在相同條件下再次離心。然后傾析水并且添加50ml的無菌冰冷水并且細(xì)胞在相同條件下再懸浮和離心。然后傾析水并且添加10ml的無菌冰冷1m山梨糖醇并且再懸浮細(xì)胞。然后將懸浮液轉(zhuǎn)移到無菌15ml錐形管并且在與之前相同的條件下離心。然后傾析1m山梨糖醇，添加300μl的無菌冰冷1m山梨糖醇并且細(xì)胞再懸浮且放置在冰上用于使用。3.電穿孔此前冷凍的經(jīng)線性化的質(zhì)粒dna在冰上解凍并且將80μl的電感受態(tài)ppink細(xì)胞添加到試管。然后將此體積轉(zhuǎn)移到0.2cm電穿孔比色皿并且在冰上培育5分鐘。然后比色皿在1640v、200ω和25μf下脈沖，持續(xù)大約4分鐘的總脈沖時(shí)間。緊接在脈沖之后，將1ml的ypds培養(yǎng)基添加到比色皿并且通過移液混合。然后在無震蕩的情況下將比色皿放入28℃培育箱中2小時(shí)，隨后在新鮮pad培養(yǎng)盤上擴(kuò)散300μl。然后將pad培養(yǎng)盤放置到28℃培育箱中大約7至10天并且每天檢測細(xì)胞生長。4.篩選白色菌落指示陽性表達(dá)相關(guān)基因，而紅色菌落指示不表達(dá)。選擇所有白色菌落并且在新鮮pad培養(yǎng)盤上重新劃線并且使其生長3至5天直至出現(xiàn)單獨(dú)的菌落。然后使用單個(gè)菌落在125ml具有檔板的燒瓶中接種10mlbmgy，并且放置到培育箱中在28℃和270rpm下震蕩過夜。當(dāng)od600達(dá)到1.2至1.5(在水中1:10稀釋之后)時(shí)，將接種物轉(zhuǎn)移到50ml錐形管并且以2500rpm離心5分鐘。傾析bmgy并且添加1ml的bmmy。然后將試管用多孔帶覆蓋以允許無菌空氣交換并且放置到在28℃和270rpm下的震蕩培育箱中。在24小時(shí)之后，取出100μl的樣品并且添加100μl的40％甲醇。然后將取出的部分以12,000rpm離心5分鐘并且保存上清液和團(tuán)粒作為t＝1(第1天)樣品。然后在48小時(shí)(t＝2)之后重復(fù)此程序。在72小時(shí)(t＝3)之后收獲剩余樣品作為最終時(shí)間點(diǎn)。然后t＝3上清液旋轉(zhuǎn)通過amicon30kd蛋白質(zhì)過濾器并且在sds-page上運(yùn)行用于觀測蛋白。5.酶轉(zhuǎn)化然后將在4至24小時(shí)具有大于20％cbga到cbda的轉(zhuǎn)化率的樣品按比例放大。簡單來說，酶轉(zhuǎn)化反應(yīng)如下：將來自t＝3樣品的25μl的無細(xì)胞上清液在30℃下培育2小時(shí)，借助在200μl的ph4.8的100mm檸檬酸鹽緩沖液中的25μl的在dmso中的1mg/mlcbga儲備液。在ph5.0下反應(yīng)產(chǎn)生cbga的最終濃度為0.1mg/ml。為了按比例放大，使用單個(gè)菌落在125ml具有檔板的燒瓶中接種10mlbmgy，所述燒瓶在28℃和270rpm下培育過夜。在24小時(shí)之后測量od600，并且當(dāng)它達(dá)到1.2時(shí)，然后使用10ml懸浮液在1l具有檔板燒瓶中接種90ml的bmgy。然后使懸浮液在28℃和270rpm下培育過夜。當(dāng)od600達(dá)到1.2至1.5時(shí)，然后將接種物轉(zhuǎn)移到500ml離心瓶并且在2500rpm下粒化5分鐘。傾析bmgy并且用10ml的bmmy洗滌細(xì)胞團(tuán)粒。在2次洗滌之后，將團(tuán)粒用10ml的bmmy再懸浮，轉(zhuǎn)移到500ml具有檔板燒瓶并且使其在28℃和270rpm下培育過夜。在24小時(shí)之后，取出1ml的樣品(t＝1)并且添加1ml的40％甲醇。在48小時(shí)之后重復(fù)此操作并且在72小時(shí)之后收獲全部樣品體積、分離并分析。下表5示出了具有大于20％的cbga到thca的轉(zhuǎn)化率的小規(guī)模篩選樣品的結(jié)果，選擇其用于按比例放大。表5：具有大于20％的cbga到thca的轉(zhuǎn)化率的小規(guī)模篩選樣品樣品id在含有0.1mg/mlcbga的反應(yīng)中cbga到thca的％轉(zhuǎn)化率。spethc#320.6spethc#428.7spethc#2220.6spethc#2318.7pmethc#532.5pmethc(2)#129.1pmethc(2)#2a27.2pmethc(2)#2531.6pmethc(2)#3627.7pmethc(2)#4132.5pmethc(2)#4227.6pmethc(2)#4640.7pmethc(2)#5126.8pmethc(3)#155.2pmethc(3)#1135.0pmethc(3)#1769.9pmethc(3)#1936.8pmethc(3)#2034.36.用于體外產(chǎn)生多拷貝goi插入物的克隆策略。使用替代酵母表達(dá)系統(tǒng)獲得具有相關(guān)基因的一個(gè)或多個(gè)拷貝的經(jīng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞。來自英杰(invitrogen)的多拷貝畢赤酵母表達(dá)試劑盒用于構(gòu)筑可體外或體內(nèi)產(chǎn)生多拷貝基因插入物的新型質(zhì)粒。體外產(chǎn)生多拷貝插入物為了體外產(chǎn)生多拷貝goi插入物，pao815載體用于克隆相關(guān)基因。通過用在20μl總反應(yīng)體積中的1μl的ecori緩沖液、1μl的每種限制酶(10單位/μl)和1μl的bsa在37℃下培育100ng的含有α-cbda合成酶基因或α-thca合成酶基因的ppink-hc載體維持2h，α-cbda合成酶和α-thca合成酶用來自ppink-hc質(zhì)粒的ecori和bamhi切割。按照相同方案，用ecori和bamhi酶另外消化100ngpao815載體。在消化之后，goi和載體混合物在0.8％瓊脂糖凝膠上在95v下運(yùn)行1h。切除恰當(dāng)大小的帶并且用英杰凝膠提取試劑盒從凝膠提取。經(jīng)線性化載體和基因插入物使用來自的t4dna接合酶方案接合。一旦接合，則含有相關(guān)基因的圓形載體被轉(zhuǎn)化為大腸桿菌top10f-細(xì)胞以在1500v，200ω和25μf下電穿孔4毫秒收獲質(zhì)粒。然后將轉(zhuǎn)化細(xì)胞與250μl的soc培養(yǎng)基(提供有來自英杰的onetop10electrocomptm大腸桿菌)混合并且涂覆在lb-amp100培養(yǎng)盤上在37℃下過夜。第二天早上，用具有5'aox1和3'aox1引物的菌落pcr方案識別陽性菌落。在37℃下，在液體lb-amp100培養(yǎng)基中生長含有相關(guān)基因的陽性菌落過夜。第二天，用英杰快速制備型試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒少量制備并且在進(jìn)一步擴(kuò)增之前在0.8％瓊脂糖凝膠上分析質(zhì)粒濃度。將含有α-thca合成酶和α-cbda合成酶基因的重組pao815質(zhì)粒分成2批，一批用作其中插入相關(guān)基因的第二拷貝的載體并且一批用于提取α-thca合成酶或α-cbda合成酶基因。按照neb的單個(gè)消化方案，首先用bamhi消化載體批料。第二批料用bglii和bamhi限制酶消化。經(jīng)線性化載體和基因在0.8％瓊脂糖凝膠上純化并提取。然后按照neb的t4dna接合酶方案接合載體和基因，并且然后通過如上文所描述的電穿孔被轉(zhuǎn)化為大腸桿菌top10f-細(xì)胞。細(xì)胞在37℃下培育過夜，并且然后通過pcr篩選恰當(dāng)基因插入物?；蛐蛄卸纪ㄟ^測序確認(rèn)。多拷貝質(zhì)粒通過限制酶消化在his4序列區(qū)域線性化并且被轉(zhuǎn)化為感受態(tài)巴斯德畢赤酵母菌株g115(his4，mut+)細(xì)胞。在his-培養(yǎng)盤上生長經(jīng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞用于篩選。對his-培養(yǎng)盤進(jìn)行篩選以確認(rèn)在巴斯德畢赤酵母基因組的his位點(diǎn)處質(zhì)粒的整合。選擇陽性菌落用于蛋白的甲醇誘導(dǎo)、時(shí)間點(diǎn)蛋白sds-凝膠和酶測定。體內(nèi)產(chǎn)生多拷貝插入物為了體內(nèi)產(chǎn)生多拷貝goi插入物，ppic-3.5k載體用作主結(jié)構(gòu)攜帶α-cbda合成酶基因或α-thca合成酶基因的一個(gè)或多個(gè)拷貝和將其插入到巴斯德畢赤酵母gs115菌株基因組中。用來自ppink-hc質(zhì)粒的pmei和bamhi切除α-cbda合成酶和α-thca合成酶基因，在0.8％瓊脂糖凝膠上在95v下維持1h與ppink-hc主結(jié)構(gòu)分離，并且用凱杰或英杰凝膠提取試劑盒從凝膠中提取。ppic-3.5k質(zhì)粒通過來自neb的pmei和bamhi消化，在0.8％瓊脂糖凝膠上運(yùn)行并且用凱杰或英杰凝膠提取試劑盒從凝膠中提取。經(jīng)線性化載體和基因插入物使用來自的英杰t4dna接合酶方案接合在一起。將接合的圓形重組質(zhì)粒電穿孔到大腸桿菌top10f-菌株中，并且細(xì)胞涂覆在lb-amp-100培養(yǎng)盤上。將培養(yǎng)盤在37℃下培育過夜用于形成菌落。應(yīng)用菌落pcr以驗(yàn)證成功轉(zhuǎn)化，并且?guī)в衟pic-3.5k-α-thca合成酶或ppic-3.5k-α-cbda合成酶的菌落在新lb-amp-100培養(yǎng)盤上再劃線以產(chǎn)生更多質(zhì)粒。將ppic-3.5k-α-thca合成酶和ppic-3.5k-α-cbda合成酶通過如上文所描述的電穿孔插入gs115菌株中。然后將轉(zhuǎn)化的gs115細(xì)胞涂覆在具有0.25mg/mml-3mg/ml遺傳霉素的ypd-遺傳霉素培養(yǎng)盤上以選擇一個(gè)或多個(gè)thca合成酶基因和cbda合成酶基因拷貝菌落。選擇在3mg/mlypd-遺傳霉素培養(yǎng)盤上生長的菌落用于thca合成酶和cbda合成酶生產(chǎn)篩選。結(jié)果在兩小時(shí)內(nèi)，使用粗發(fā)酵上清液從cbga到thca和cbca的轉(zhuǎn)化率大于90％(圖3和5)。使用粗發(fā)酵上清液過夜從cbga到cbda和cbca的轉(zhuǎn)化率大于70％。(圖6)。7.酶純化因此獲得的大麻素酸合成酶通過使用2.2cm內(nèi)徑柱尺寸排阻色譜法(sec)純化，并且在柱體積中5ml上清液與粗酶上清液的比率為20:1。簡單來說，測量10g的干葡聚糖凝膠珠粒并且添加到派熱克斯(pyrex)玻璃容器。將100ml的50mm磷酸鹽緩沖液ph7.4以過量的量添加到bio-gelp-100珠粒，并且靜置大于12小時(shí)。(當(dāng)完全水合時(shí)p-100珠粒溶脹12×)。使用真空泵，將水合p-100珠粒和另一種1lph7.450mm磷酸鹽緩沖液脫氣以使珠粒在過量緩沖液中沉降。倒出緩沖液，并且將100ml脫氣的磷酸鹽緩沖液倒入珠粒中，使得珠粒再次沉降。將這些步驟再重復(fù)兩次。隨后將水合p-100倒入玻璃柱中直至形成2至5cm的凝膠床，然后倒入更多凝膠至期望高度并且使它沉降。因此形成的柱在4℃下存儲。在4℃下5ml的thca或cbda合成酶粗上清液運(yùn)行通過柱，并且對于25個(gè)級分以5ml/級分收集。保存所有級分，在4℃下存儲并且分析酶活性，并且通過sds-page凝膠檢查純化效率和分離率。b.大麻素和大麻素類似物酶生產(chǎn)1.酶測定條件標(biāo)準(zhǔn)cbda合成酶/thca合成酶反應(yīng)測定條件如下：酶反應(yīng)在1.5mleppendorf扣帽試管中進(jìn)行。25μl底物如cbga，其溶解于在200μl的100mm檸檬酸鹽緩沖液ph4.85中的1.0mg/ml的dmso中，與25μl酶溶液在30℃下一起培育2小時(shí)。通過添加250μlmeoh終止反應(yīng)并且通過hplc分析。在如下多種條件下測試酶活性：1.測試不同溶劑和條件以提高底物溶解性和遞送，其包括(但不限于)dmso、dmf、ipa、環(huán)糊精(cd)、sds、triton-x。2.在ph4、5、6、7和8下運(yùn)行測定。3.在存在或不存在sds或triton-x的情況下在磷酸鈉緩沖液或檸檬酸鹽緩沖液中運(yùn)行酶測定4.在多種離子強(qiáng)度下運(yùn)行酶測定。5.比較在2h到4天之間的培育時(shí)間的結(jié)果。結(jié)果下表6示出了dmso、dmf、ipa和環(huán)糊精促進(jìn)的大麻素的溶解。環(huán)糊精溶解最多20至25g/l的cbga用于轉(zhuǎn)化。當(dāng)20％dmso(v/v)添加到反應(yīng)混合物時(shí)酶速率提高，并且thca合成酶在反應(yīng)中產(chǎn)生thca和cbca兩者(表7)。表6：溶劑對thca合成酶活性的影響反應(yīng)條件研究參數(shù)％cbga轉(zhuǎn)化率thca:cbca100mm溶劑在dmf中100mmcit50μg酶841.066:1在dmso中100mmcit50μg酶857.96:1在cd中100mmcit50μg酶8112.34:1在ipa中400mmcit50μg酶6111.9:1在20ulcd中100mmnap50μg酶791.11:1在20ulsds中100mmnap50μg酶721.22:1在cd中100mmcit50μg酶+sds810.45:1表7：dmso濃度對thca合成酶速率和產(chǎn)物比率的影響dmsofasterthca:cbca0％1x10％1.2x10:120％2.5x5:125％-1:130％0.3xph對thca合成酶活性的影響在下表8和9中示出。表8：ph對thca合成酶活性的影響phthcacbca41052.331615.67701綜上所述，改變thca合成酶反應(yīng)的ph影響產(chǎn)物。在ph4下，thca為唯一產(chǎn)物。在ph5下，thca:cbca的比率為2.33:1。在ph6下，比率顛倒，并且產(chǎn)品組合為thca:cbca1:5.67。在ph7下，cbca為唯一產(chǎn)物。表9：ph和環(huán)糊精對thca合成酶活性的影響ph對cbda合成酶活性的影響在下表10中示出。表10：ph對cbda合成酶活性的影響phcbdacbca4.22.5151.1315.211.175.412.455.816.146.2128.136.800綜上所述，改變cbda合成酶反應(yīng)的ph影響產(chǎn)物。在ph4.2下，cbda:cbca比率為2.5:1。在ph5下，cbda:cbca的比率為1.13:1。在ph6.8下不存在由cbda合成酶反應(yīng)形成的產(chǎn)物。這些結(jié)果明確示出有可能通過控制酶反應(yīng)的ph來控制由thca合成酶生產(chǎn)的thca:cbca的比率。在存在或不存在sds或triton-x的情況下在磷酸鈉緩沖液或檸檬酸鹽緩沖液中運(yùn)行酶測定。評估環(huán)糊精的不同濃度對大麻素酸合成酶活性的影響。cbda合成酶在ph4.85下的結(jié)果在下表11中示出。表10：環(huán)糊精對cbda合成酶反應(yīng)轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)物比率的影響環(huán)糊精濃度轉(zhuǎn)化率cbda:cbca比率0mg/ml40％1.13:12mg/ml57％1.24:14mg/mln/an/a8mg/ml61％1.27:112mg/ml60％1.33:116mg/ml50％1.04:120mg/ml53％1.0:128mg/ml45％1.24:1這些結(jié)果明確示出在反應(yīng)混合物中的環(huán)糊精的濃度影響底物到產(chǎn)物的酶轉(zhuǎn)化率以及反應(yīng)的不同產(chǎn)物之間的比率。這些實(shí)驗(yàn)還示出，對于cbda合成在酶反應(yīng)混合中理想環(huán)糊精(cd):cbga比率為11:1(質(zhì)量:質(zhì)量)或4:1(摩爾比)，并且對于thca合成酶cd:cbga在酶反應(yīng)混合中理想環(huán)糊精(cd):cbga比率為28:1(質(zhì)量:質(zhì)量)或7.3:1(摩爾比)。在反應(yīng)混合中環(huán)存在此類濃度的糊精在2小時(shí)中產(chǎn)生98％轉(zhuǎn)化率(數(shù)據(jù)未示出)。b.大麻素提取和純化用如上文所描述的大麻素酸合成酶從酶反應(yīng)獲得的大麻素和大麻素類似物通過如下溶劑提取來提?。簩⑷軇┮?:3(v/v)的比率添加到反應(yīng)混合，混合物在室溫下劇烈渦旋2分鐘并且在3200g下離心10分鐘。分離溶劑級分并且儲存于玻璃瓶中。重復(fù)這些步驟并且合并所有提提物并且通過hplc分析。c.通過發(fā)酵生產(chǎn)大麻素酸合成酶大麻素酸合成酶按照英杰‘畢赤酵母發(fā)酵方法指導(dǎo)原則(pichiafermentationprocessguidelines)’通過發(fā)酵生產(chǎn)。一些修改如下：a.接種物燒瓶準(zhǔn)備根據(jù)冷凍丙三醇儲備液的畢赤酵母菌株gs115(mut+、arg+、his-)，接種ypd培養(yǎng)盤。在48小時(shí)之后，在2l具有檔板燒瓶中，在ypd上單個(gè)菌落用于接種300ml的bmgy。培養(yǎng)物在28℃，270rpm下生長直至od600達(dá)到2至6(大約15小時(shí))。b.發(fā)酵器準(zhǔn)備/批料丙三醇在將bioflo3000發(fā)酵器的玻璃容器中的3.5l的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基滅菌并冷卻之后，溫度設(shè)定成不低于27℃并且不超過30℃。通氣和攪動設(shè)定成pid模式(溶解氧依賴性)。用30％nh4oh不斷地將ph值調(diào)節(jié)到6.5。發(fā)酵器用以上產(chǎn)生的300ml的培養(yǎng)物接種。添加在無菌100mm，ph6.5磷酸鹽緩沖液中制備的200ml的20％酪蛋白氨基酸。調(diào)節(jié)溶解氧將維持高于20％。在來自bmgy培養(yǎng)基的丙三醇完全消耗(大約24小時(shí))之后，在此第一發(fā)酵階段結(jié)束時(shí)取10ml樣品并且分析細(xì)胞生長(od600)和濕細(xì)胞重量。團(tuán)粒在-80℃下冷凍用于稍后蛋白的分析。在每一階段結(jié)束時(shí)重復(fù)采樣。c.丙三醇分批進(jìn)料階段添加具有12mlptm微量鹽每升的丙三醇溶液的50％w/v丙三醇以增加細(xì)胞生物質(zhì)。進(jìn)料速率設(shè)定成18.15ml/h/升初始發(fā)酵體積。繼續(xù)丙三醇進(jìn)料直至濕細(xì)胞重量達(dá)到180至220g/升，并且do尖峰用于監(jiān)測丙三醇進(jìn)料批料階段的終點(diǎn)。d.甲醇分批進(jìn)料階段在所有丙三醇消耗之后引發(fā)甲醇誘導(dǎo)以誘導(dǎo)aox1啟動子并且表達(dá)大麻素合成酶。添加具有12mlptm微量鹽每升的甲醇的100％甲醇。進(jìn)料速率初始地設(shè)定在3.6ml/h/升初始發(fā)酵體積。接下來兩小時(shí)調(diào)節(jié)攪動、通氣和氧氣進(jìn)料以維持do高于20％。穩(wěn)定do讀數(shù)推斷完全適于在該點(diǎn)甲醇進(jìn)料加倍到7.3ml/h/升的甲醇。在2小時(shí)之后，甲醇進(jìn)料進(jìn)一步增加到10.9ml/h/升初始發(fā)酵體積。在約2小時(shí)之后或在發(fā)泡的首次跡象時(shí)，添加20至50μl無菌純抗-泡沫204,sigma，以便保持發(fā)酵器的頂部空間清晰并且防止泡沫干擾攪動和各種進(jìn)料。根據(jù)需要發(fā)酵的全部運(yùn)行的大約一天或每隔一天一次添加另外的20至50μl等分試樣。當(dāng)形成10.9ml/h/升時(shí)，測量酶活性并且其后每8小時(shí)監(jiān)測。在初始接種之后5天或在到達(dá)蛋白濃度的平線區(qū)時(shí)停止發(fā)酵。e.收獲細(xì)胞和上清液在收獲時(shí)間，最終發(fā)酵體積幾乎為初始體積的兩倍。細(xì)胞密度增加到～400g/升濕細(xì)胞。將7升的培養(yǎng)物收集到500ml離心瓶中，并且以10,000rpm離心15min以從上清液分離細(xì)胞。使用切向流動過濾將上清液濃縮10×。將上清液的樣品裝載到聚丙烯酰胺凝膠上用于蛋白分析。thca合成酶為大約80kda。30kdatff過濾器用于將發(fā)酵上清液濃縮10×。將tff濃縮上清液的一部分裝載到鎳柱上用于純化酶。通過硫酸銨沉淀(45％至75％)將原始發(fā)酵上清液的一部分分級。f.標(biāo)準(zhǔn)酶活性測定在200μl的100mmph4.8檸檬酸鹽緩沖液中；溶解于dmso中1mg/ml濃度的25μl底物(cbga)；以及25μl酶(上清液)加入1.5mleppendorf扣蓋試管中。試管在30℃下培育2小時(shí)并且通過添加250μlmeoh終止反應(yīng)。通過hplc分析酶的活性。e.來自發(fā)酵的大麻素酸合成酶的濃度/純化在發(fā)酵之后，細(xì)胞通過在10,000rpm×15min下離心與上清液分離。然后如下濃縮和純化酶：使用切向流動過濾將上清液濃縮10×，并且然后使用硫酸銨沉淀分級；在45％至75％之間(nh4)2so4鹽析出的蛋白級分含有合成酶。將tff過濾的上清液裝載到鎳柱上用于酶的純化。f.大麻素底物的化學(xué)合成a.合成香草醇(3,7-二甲基辛-2,6-二烯-1-醇)通過蒸餾玫瑰草油獲得香草醇。在減壓下蒸餾玫瑰草油(新方向芳香族化合物)并且將在139℃-145℃和25mmhg減壓下蒸餾的級分匯聚在一起獲得純香草醇。b.合成橄欖醇使用公開程序(focella,a等人，《有機(jī)化學(xué)雜志(j.org.chem.)》，第42卷,第21期，(1977)，第3456頁至第3457頁)合成橄欖醇。1.6-n-戊基-2-羥基-4-氧代-環(huán)己-2-烯-1-甲酸甲酯向甲醇鈉(32.4g，0.60mol)和丙二酸二甲酯(90g，0.68mol)于230ml無水甲醇中的攪拌溶液中逐份添加75g(0.48mol)的90％3-壬烯-2-酮。然后在n2下回流反應(yīng)混合物3小時(shí)，并且使其冷卻到室溫。減壓蒸餾溶劑并且將殘余物溶解于350ml水中。白色晶體的漿料和幾乎澄清的溶液用80ml氯仿萃取三次。用濃hcl將水層酸化到ph4并且使形成的白色沉淀在過濾之前靜置過夜。在50℃下在高真空下干燥晶體5小時(shí)以獲得106.5g(0.4416mol)(92％)6-正戊基-2-羥基-4-氧代-環(huán)己-2-烯-l-甲酸甲酯(mp96℃-98℃)。使用石油醚:乙酸乙酯(9:1)的混合物使產(chǎn)物再結(jié)晶，并且得到94g純6-正戊基-2-羥基-4-氧代-環(huán)己-2-烯-l-甲酸甲酯(熔點(diǎn)98℃-100℃)。2.1-n-戊基-3,5-二羥基苯(橄欖醇)。向6-n-戊基-2-羥基-4-氧代-環(huán)己-2-烯-l-甲酸甲酯(58.4g，0.24mol)溶解于115ml二甲基甲酰胺中的攪拌冰冷卻溶液中逐滴添加溶解于60ml二甲基甲酰胺中的37.9g(0.23mol)溴。添加結(jié)束時(shí)(約90分鐘)，將反應(yīng)混合物緩慢加熱到80℃，在此期間二氧化碳的逸出變得相當(dāng)劇烈。反應(yīng)維持在這一溫度下直到氣體逸出停止，隨后將反應(yīng)進(jìn)一步加熱到160℃并且在這一溫度下保持大約10小時(shí)。加熱后，使反應(yīng)冷卻并且在減壓下去除溶劑dmf。因此獲得的殘余物用水(80ml)處理并且用250ml乙醚萃取兩次。合并的乙醚層用水洗滌，然后用2×80ml10％亞硫酸氫鈉溶液、2×80ml10％乙酸溶液洗滌，并且然后又用水洗滌。在經(jīng)無水硫酸鈉干燥后，在減壓下去除溶劑得到46.8g黏稠油狀物。在減壓下蒸餾油狀物得到30.3g(0.168mol)(69.3％)橄欖醇作為產(chǎn)物。hplc分析指示97.5％純度。c.合成cbg按照taura等人(1996)，《生物化學(xué)雜志(thejournalofbiologicalchemistry)》，第271卷，第21號，第17411頁至第17416頁公開的方案合成cbg。1.合成2-[(2e)-3,7-二甲基辛-2,6-二烯基]-5-戊基-苯-1,3-二醇(大麻萜酚(cbg))香草醇(3g，0.0194mol)和橄欖醇(2g，0.0111mol)溶解于含有80mg對甲苯磺酸作為催化劑的400ml氯仿中，并且在室溫下在暗處攪拌反應(yīng)混合物12小時(shí)。在12小時(shí)后，用飽和碳酸氫鈉(400ml)并且然后用h2o(400ml)洗滌反應(yīng)混合物。在40℃下在減壓下濃縮氯仿層，并且獲得的殘余物在2.0cm×25cm硅膠柱上使用苯(1000ml)作為洗脫劑進(jìn)行色譜以得到1.4g(0.00442mol)(39.9％)cbg作為產(chǎn)物?？商娲?，如下純化粗cbg。向250ml燒杯中添加7.25g粗cbg和50ml苯。旋動燒瓶以溶解cbg并且添加50g硅膠連同攪拌棒。攪拌溶液過夜，并且然后倒入44cm×2.75cm柱中。用300ml苯洗脫柱。分析洗脫劑(約70ml洗脫份)的cbg。合并含有cbg的洗脫份1、2和3(～230ml)并且在壓力下去除溶劑得到6.464g殘余物，其含有>80％cbg，具有適用于隨后合成步驟中的純度。在一個(gè)實(shí)施例中，通過在250ml燒杯中混合7.25g粗cbg殘余物與硅膠漿料(50ml)來純化粗cbg。緩慢攪拌這一混合物1小時(shí)，并且然后使用細(xì)篩孔濾紙真空過濾。用250ml苯洗滌濾餅直到獲得澄清濾液。在減壓下從濾液中去除溶劑得到6.567g殘余物，其具有>80％cbg。a.合成甲基碳酸鎂(mmc)按照balasubrahmanyam等人，(1973)，《有機(jī)合成(organicsynthesis)，總第v卷，約翰·威利父子公司(johnwiley&sons,inc.)，第439頁至第444頁公開的方案合成甲基碳酸鎂(mmc)。干燥2升三頸燒瓶裝配有機(jī)械攪拌器、冷凝器和1升壓力均衡加料漏斗，其頂部裝配有進(jìn)氣口管。將清潔干燥鎂條(40.0g，1.65mol)置于燒瓶中并且在添加無水甲醇(600ml)之前用氮?dú)獯祾呦到y(tǒng)。通過外部冷卻反應(yīng)混合物控制氫氣逸出。當(dāng)氫氣逸出停止時(shí)，使緩慢氮?dú)饬魍ㄟ^系統(tǒng)并且冷凝器置換為取走蒸餾頭的總冷凝部分。停止氮?dú)饬鞑⑶以跍p壓下從溶液蒸餾大部分甲醇。當(dāng)攪拌甲醇鎂的糊狀懸浮液不再可行時(shí)停止蒸餾。系統(tǒng)再次用氮?dú)獯祾卟⑶艺麴s頭的出口連接到含有礦物油的小捕集器使得可估算從反應(yīng)系統(tǒng)逸出的氣體體積。向反應(yīng)燒瓶中添加無水二甲基甲酰胺(dmf)(700ml)，并且劇烈攪拌所得懸浮液，同時(shí)使無水二氧化碳流通過連接到加料漏斗的進(jìn)氣口管通入反應(yīng)容器。二氧化碳溶解伴隨著懸浮甲醇鎂的放熱反應(yīng)。當(dāng)不再吸附co2時(shí)，在緩慢co2氣體流下加熱無色溶液直到液體蒸餾的溫度達(dá)到140℃，指示已從反應(yīng)混合物中去除殘余甲醇。使用緩慢氮?dú)饬鞔祾叻磻?yīng)混合物以幫助在惰性氛圍下將混合物冷卻到室溫。這獲得具有536mgmmc/mldmf的溶液。8b.合成cbga如下制備6-甲酸-2-[(2e)-3,7-二甲基辛-2,6-二烯基]-5-戊基-苯-1,3-二醇，大麻萜酚酸(cbga)。向10ml錐形瓶中添加1mlmmc的dmf溶液。向此溶液添加2-[(2e)-3,7-二甲基辛-2,6-二烯基]-5-戊基-苯-1,3-二醇(120mg，0.379mmol)。在120℃下加熱燒瓶1小時(shí)，隨后將反應(yīng)混合物溶解于100ml氯仿:甲醇(2:1)溶液中。使用稀hcl將此溶液的ph調(diào)節(jié)到ph2.0，并且然后使用50mlh2o分配。經(jīng)硫酸鈉干燥有機(jī)層并且通過蒸發(fā)去除溶劑。粗反應(yīng)的hplc分析示出～40％cbg轉(zhuǎn)化成cbga。可替代地，在壓力相容容器中密封3.16g(10mmol)的cbg(或任何其它中性大麻素)、8.63g(100mmol)甲基化鎂和44g(1mol)干冰。將容器加熱到50℃，并且將溫度保持在這一值下三小時(shí)。加熱后，容器冷卻到室溫并且緩慢排氣。將反應(yīng)混合物溶解于100ml氯仿:甲醇(2:1)溶劑中。使用稀hcl將此溶液的ph調(diào)節(jié)到ph2.0并且然后使用50mlh2o分配此溶液。經(jīng)硫酸鈉干燥有機(jī)層并且通過蒸發(fā)去除溶劑。粗反應(yīng)混合物的hplc分析示出使用此方案～85％cbg轉(zhuǎn)化成cbga。粗cbga通過色譜法使用2.0cm×25cm硅膠柱純化。使用正己烷:乙酸乙酯的混合物(2:1)(1000ml)洗脫產(chǎn)物，獲得45mg(0.125mmol)(37.5％)期望產(chǎn)物。可替代地，通過使用lh-20親脂性樹脂作為培養(yǎng)基對粗產(chǎn)物進(jìn)行色譜來獲得超高純度cbga。400glh-20sephadex樹脂首先使用2ldcm:氯仿(4:1)溶劑溶脹。將溶脹樹脂重力裝填在44×2.75cm柱中。柱裝載2.1g溶解于少量dcm:氯仿(4:1)溶劑中的粗cbga并且用1.7l相同溶劑洗脫。收集100ml洗脫份。使用此溶劑系統(tǒng)洗脫出為黃色/橙色溶液的未反應(yīng)cbg。通過約1.7l此溶劑之后，不再觀測到黃色/橙色洗脫份并且洗脫溶劑變成100％丙酮以洗脫結(jié)合的cbga。匯聚含有cbga的洗脫份并且去除溶劑獲得0.52gcbga(～90％回收率)。在用丙酮洗脫之前增加通過柱的dcm:氯仿(4:1)溶劑的體積，獲得純度大于99.5％的cbga。c.合成cbgv如下合成cbgv。a.6-n-丙基-2-羥基-4-氧代-環(huán)己-2-烯-1-甲酸甲酯：簡單來說，向丙二酸二乙酯(52.016g，0.323mol)和甲醇鈉(16.206g,0.3mol)的無水甲醇(125ml無水meoh)溶液中逐滴添加3-庚-2-酮(30.1g，0.25mol)。在45℃下在真空烘箱中干燥過夜后稱量粗產(chǎn)物為46.315g。粗產(chǎn)物溶解于石油醚(300ml)中。攪拌后，在添加乙酸乙酯(30ml)以使cbgv沉淀之前，從溶液中過濾任何未溶解的材料。過濾沉淀并且在44℃下在真空烘箱中干燥過夜?；厥湛傆?jì)33.569g(0.157mol)(52.3％)期望產(chǎn)物。b.1-n-丙基-3,5-二羥基苯使用與上文針對合成橄欖醇所述的一種程序類似的程序制造標(biāo)題化合物，不同之處在于使用6-n-丙基-2-羥基-4-氧代-環(huán)己-2-烯-l-甲酸甲酯作為起始物質(zhì)。簡單來說，向6-n-丙基-2-羥基-4-氧代-環(huán)己-2-烯-l-甲酸甲酯的冰冷dmf攪拌溶液中添加溴的dmf溶液。添加溴之后，將反應(yīng)混合物加熱到80℃。加熱伴隨著產(chǎn)生和釋放二氧化碳?xì)怏w。氣體逸出停止后，反應(yīng)的溫度增加到160℃并且繼續(xù)加熱10小時(shí)。然后冷卻反應(yīng)并且減壓去除dmf。用水稀釋粗混合物并且使用乙醚進(jìn)行溶劑萃取。通過去除乙醚和蒸餾剩余的油狀物獲得標(biāo)題化合物。c.2-[(2e)-3,7-二甲基辛-2,6-二烯基]-5-丙基-苯-1,3-二醇，(cbgv)。通過向香草醇和1-n-丙基-3,5-二羥基苯的氯仿溶液中添加對甲苯磺酸進(jìn)行cbgv合成。在室溫下在暗處攪拌反應(yīng)12小時(shí)后，添加水以將粗產(chǎn)物分配到氯仿層。氯仿層然后用飽和碳酸氫鈉洗滌，干燥并且在如上文所述純化之前去除有機(jī)溶劑以用于合成cbg。d.6-羧酸-2-[(2e)-3,7-二甲基辛-2,6-二烯基]-5-丙基-苯-1,3-二醇(cbgva)。如下制備6-甲酸-2-[(2e)-3,7-二甲基辛-2,6-二烯基]-5-丙基-苯-1,3-二醇，大麻萜酚酸(cbgva)。如上文所述制備甲基碳酸鎂(mmc)。向mmc于燒瓶中的dmf溶液添加2-[(2e)-3,7-二甲基辛-2,6-二烯基]-5-丙基-苯-1,3-二醇。在120℃下加熱燒瓶1小時(shí)，隨后將反應(yīng)混合物溶解于氯仿:甲醇的2:1混合物中。用稀hcl將此溶液的ph調(diào)節(jié)到ph2.0，并且使用h2o萃取反應(yīng)混合物。經(jīng)硫酸鈉干燥有機(jī)層并且通過蒸發(fā)去除溶劑。g.大規(guī)模酶生產(chǎn)大麻素100ml的10mm磷酸鈉緩沖液(ph5.0)置于裝配有氧氣鼓泡器和攪拌器的玻璃反應(yīng)容器中。向此溶液添加35g/l的2-羥基丙基-β-環(huán)糊精(hpβcd；hpb)、磺基丁醚β-環(huán)糊精鈉鹽(sbeβcd；或無規(guī)甲基化的β-環(huán)糊精(rmβcd)。以5g小份添加cd以確保完全溶解。向緩沖環(huán)糊精溶液添加2.5g的大麻素酸合成酶底物，例如cbga或cbgv-a或式i、ii或v化合物。cd與底物的摩爾比為約4:1。將60mg的純化的合成酶添加到溶液并且反應(yīng)混合物在30℃下培育8小時(shí)。通過hplc定期監(jiān)測反應(yīng)進(jìn)展，并且使用酶分析檢測和定量過氧化氫的逸出。8小時(shí)后，大于90％的cbga底物轉(zhuǎn)化成thca和cbca。在酸性ph5.0下，thca與cbca的比率為大約10:1。cbc異構(gòu)體的比率為5:1。用95％etoh10:1稀釋水溶液。這使環(huán)糊精沉淀出來，留下大麻素在溶液中。環(huán)糊精真空過濾，用1l的90％etoh洗滌，并且干燥以允許其重新用于將來反應(yīng)。將殘余物懸浮于dcm:氯仿(4:1)溶劑中之后，濃縮含有大麻素的乙醇溶液獲得～25g粗橙色-黃色殘余物。h.大規(guī)模純化大麻素使用lh-20親脂性樹脂，色譜地完成使用此技術(shù)的方法合成的大麻素的純化。簡單來說，4000g樹脂使用20ldcm:氯仿(4:1)溶脹。將溶脹樹脂重力裝填在44×2.75cm柱中。溶脹樹脂的體積為～1350ml。用25g溶解于最少量溶劑中的粗殘余物裝載柱，并且然后用4ldcm:氯仿(4:1)溶劑洗滌來洗脫cbg。在此洗脫期間無大麻素酸從柱洗脫出來。使用1:1到0:1dcm:丙酮溶劑的梯度洗脫來洗脫大麻素酸。梯度的各步驟使用一種溶劑柱體積(4l)。首先洗脫cbca，隨后cbga，并且然后thca。各大麻素的純度為>99.5％。純大麻素可通過在90℃下在真空下加熱酸形式進(jìn)一步加工成其中性或“活性”形式。定量去羧基以得到中性大麻素。必要時(shí)，可進(jìn)行再結(jié)晶以獲得醫(yī)藥級大麻素。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將認(rèn)識到可對本文所述的示例性設(shè)計(jì)和實(shí)施例作出大量修改和改變，并且本發(fā)明不限于此類實(shí)施例。序列表seqidno:1：thca合成酶基因(天然，紫色kush菌株)atgaattgctcagcattttccttttggtttgtttgcaaaataatatttttctttctctcattccatatccaaatttcaatagctaatcctcgagaaaacttccttaaatgcttctcaaaacatattcccaacaatgtagcaaatccaaaactcgtatacactcaacacgaccaattgtatatgtctatcctgaattcgacaatacaaaatcttagattcatctctgatacaaccccaaaaccactcgttattgtcactccttcaaataactcccatatccaagcaactattttatgctctaagaaagttggcttgcagattcgaactcgaagcggtggccatgatgctgagggtatgtcctacatatctcaagtcccatttgttgtagtagacttgagaaacatgcattcgatcaaaatagatgttcatagccaaactgcgtgggttgaagccggagctacccttggagaagtttattattggatcaatgagaagaatgagaatcttagttttcctggtgggtattgccctactgttggcgtaggtggacactttagtggaggaggctatggagcattgatgcgaaattatggccttgcggctgataatatcattgatgcacacttagtcaatgttgatggaaaagttctagatcgaaaatccatgggagaagatctgttttgggctatacgtggtggtggaggagaaaactttggaatcattgcagcatggaaaatcaaactggttgctgtcccatcaaagtctactatattcagtgttaaaaagaacatggagatacatgggcttgtcaagttatttaacaaatggcaaaatattgcttacaagtatgacaaagatttagtactcatgactcacttcataacaaagaatattacagataatcatgggaagaataagactacagtacatggttacttctcttcaatttttcatggtggagtggatagtctagtcgacttgatgaacaagagctttcgtgagttgggtattaaaaaaactgattgcaaagaattgagctggattgatacaaccatcttctacagtggtgttgtaaattacaacactgctaattttaaaaaggaaattttgcttgatagatcagctgggaagaagacggctttctcaattaagttagactatgttaagaaaccaattccagaaactgcaatggtcaaaattttggaaaaattatatgaagaagatgtaggagctgggatgtatgtgttgtacccttacggtggtataatggaggagatttcagaatcagcaattccattccctcatcgagctggaataatgtatgaactttggtacactgcttcctgggagaagcaagaagataatgaaaagcatataaactgggttcgaagtgtttataattttacgactccttatgtgtcccaaaatccaagattggcgtatctcaattatagggaccttgatttaggaaaaactaatcatgcgagtcctaataattacacacaagcacgtatttggggtgaaaagtattttggtaaaaattttaacaggttagttaaggtgaaaactaaagttgatcccaataatttttttagaaacgaacaaagtatcccacctcttccaccgcatcatcattaaseqidno:2：thca合成酶氨基酸序列(天然，紫色kush)mncsafsfwfvckiiffflsfhiqisianprenflkcfskhipnnvanpklvytqhdqlymsilnstiqnlrfisdttpkplvivtpsnnshiqatilcskkvglqirtrsgghdaegmsyisqvpfvvvdlrnmhsikidvhsqtawveagatlgevyywineknenlsfpggycptvgvgghfsgggygalmrnyglaadniidahlvnvdgkvldrksmgedlfwairggggenfgiiaawkiklvavpskstifsvkknmeihglvklfnkwqniaykydkdlvlmthfitknitdnhgknkttvhgyfssifhggvdslvdlmnksfrelgikktdckelswidttifysgvvnyntanfkkeilldrsagkktafsikldyvkkpipetamvkileklyeedvgagmyvlypyggimeeisesaipfphragimyelwytaswekqednekhinwvrsvynfttpyvsqnprlaylnyrdldlgktnhaspnnytqariwgekyfgknfnrlvkvktkvdpnnffrneqsipplpphhhseqidno:3：用α分泌標(biāo)簽優(yōu)化的thca合成酶基因序列密碼子atgagattcccatccatcttcactgctgttttgttcgctgcttcttccgctttggctgctccagttaacactactactgaggacgagactgctcagattccagctgaagctgttattggttactccgacttggaaggtgacttcgacgttgctgttttgccattctccaactccactaacaacggtttgttgttcatcaacactacaatcgcttccattgctgctaaagaagagggagtttccttggagaagagagaggctgaagctaacccaagagaaaacttcttgaagtgtttttccaagcacatcccaaacaacgttgctaaccctaagttggtttacactcagcacgaccagttgtacatgtccttgttgaactccacaatccagaacttgagattcatctccgacactactccaaagccattggttatcgttactccatccaacaactcccacatccaggctactatcttgtgttccaagaaggttggattgcagatcagaacaagatccggtggtcatgacgctgaaggtatgtcctacatttcccaggttccattcgttgttgttgacttgagaaacatgcactccatcaagatcgacgttcactcccaaactgcttgggttgaagctggtgctactttgggtgaagtttactactggatcaacgagaagaacgagaacttgtccttcccaggtggttactgtccaactgttggtgttggtggtcacttttctggtggtggttacggtgctttgatgagaaactacggattggctgctgacaacatcatcgacgctcacttggttaacgttgacggtaaggttttggacagaaagtccatgggtgaggacttgttctgggctattagaggtggtggtggtgagaacttcggtattattgctgcttggaagatcaagttggttgctgttccatccaagtccactatcttctccgttaagaaaaacatggaaatccacggtttggttaagttgtttaacaagtggcagaacattgcttacaagtacgacaaggacttggttttgatgactcacttcatcactaagaacatcactgacaaccacggtaagaacaagactactgttcacggttacttctcttccatcttccacggtggtgttgattccttggttgatttgatgaacaagtctttcccagagttgggtatcaagaaaactgactgtaaagagttctcctggatcgacacaacaatcttctactccggtgttgttaacttcaacactgctaactttaagaaagagatcttgttggacagatccgctggtaaaaagactgctttctccattaagttggactacgttaagaagccaatcccagagactgctatggttaagattttggagaagttgtacgaagaggacgttggtgctggtatgtacgttttgtacccatacggtggtatcatggaagaaatctccgagtccgctattccattcccacacagagctggtattatgtacgagttgtggtacactgcttcttgggagaagcaagaggacaacgaaaagcacatcaactgggttagatccgtttacaacttcactactccttacgtttcccagaacccaagattggcttacttgaactacagagacttggacttgggtaagactaaccacgcttccccaaacaattacacacaggctagaatctggggtgaaaagtacttcggaaagaactttaacagattggttaaggttaagactaaggttgaccctaacaacttcttcagaaacgagcagtccatcccaccattgccaccacatcatcatcaccatcactaaseqidno:4：包含來自用于巴斯德畢赤酵母的密碼子優(yōu)化序列的α分泌標(biāo)簽的thca合成酶氨基酸序列mrfpsiftavlfaassalaapvntttedetaqipaeavigysdlegdfdvavlpfsnstnngllfinttiasiaakeegvslekreaeanprenflkcfskhipnnvanpklvytqhdqlymsllnstiqnlrfisdttpkplvivtpsnnshiqatilcskkvglqirtrsgghdaegmsyisqvpfvvvdlrnmhsikidvhsqtawveagatlgevyywineknenlsfpggycptvgvgghfsgggygalmrnyglaadniidahlvnvdgkvldrksmgedlfwairggggenfgiiaawkiklvavpskstifsvkknmeihglvklfnkwqniaykydkdlvlmthfitknitdnhgknkttvhgyfssifhggvdslvdlmnksfpelgikktdckefswidttifysgvvnfntanfkkeilldrsagkktafsikldyvkkpipetamvkileklyeedvgagmyvlypyggimeeisesaipfphragimyelwytaswekqednekhinwvrsvynfttpyvsqnprlaylnyrdldlgktnhaspnnytqariwgekyfgknfnrlvkvktkvdpnnffrneqsipplpphhhhhhseqidno:5：cbda合成酶基因(天然，基因庫：ab292682.1)atgaagtgctcaacattctccttttggtttgtttgcaagataatatttttctttttctcattcaatatccaaacttccattgctaatcctcgagaaaacttccttaaatgcttctcgcaatatattcccaataatgcaacaaatctaaaactcgtatacactcaaaacaacccattgtatatgtctgtcctaaattcgacaatacacaatcttagattcacctctgacacaaccccaaaaccacttgttatcgtcactccttcacatgtctctcatatccaaggcactattctatgctccaagaaagttggcttgcagattcgaactcgaagtggtggtcatgattctgagggcatgtcctacatatctcaagtcccatttgttatagtagacttgagaaacatgcgttcaatcaaaatagatgttcatagccaaactgcatgggttgaagccggagctacccttggagaagtttattattgggttaatgagaaaaatgagaatcttagtttggcggctgggtattgccctactgtttgcgcaggtggacactttggtggaggaggctatggaccattgatgagaaactatggcctcgcggctgataatatcattgatgcacacttagtcaacgttcatggaaaagtgctagatcgaaaatctatgggggaagatctcttttgggctttacgtggtggtggagcagaaagcttcggaatcattgtagcatggaaaattagactggttgctgtcccaaagtctactatgtttagtgttaaaaagatcatggagatacatgagcttgtcaagttagttaacaaatggcaaaatattgcttacaagtatgacaaagatttattactcatgactcacttcataactaggaacattacagataatcaagggaagaataagacagcaatacacacttacttctcttcagttttccttggtggagtggatagtctagtcgacttgatgaacaagagttttcctgagttgggtattaaaaaaacggattgcagacaattgagctggattgatactatcatcttctatagtggtgttgtaaattacgacactgataattttaacaaggaaattttgcttgatagatccgctgggcagaacggtgctttcaagattaagttagactacgttaagaaaccaattccagaatctgtatttgtccaaattttggaaaaattatatgaagaagatataggagctgggatgtatgcgttgtacccttacggtggtataatggatgagatttcagaatcagcaattccattccctcatcgagctggaatcttgtatgagttatggtacatatgtagttgggagaagcaagaagataacgaaaagcatctaaactggattagaaatatttataacttcatgactccttatgtgtccaaaaatccaagattggcatatctcaattatagagaccttgatataggaataaatgatcccaagaatccaaataattacacacaagcacgtatttggggtgagaagtattttggtaaaaattttgacaggctagtaaaagtgaaaaccctggttgatcccaataacttttttagaaacgaacaaagcatcccacctcttccacggcatcgtcattaaseqidno:6：cbda合成酶氨基酸序列(天然，來自基因庫：ab292682.1)mkcstfsfwfvckiiffffsfniqtsianprenflkcfsqyipnnatnlklvytqnnplymsvlnstihnlrftsdttpkplvivtpshvshiqgtilcskkvglqirtrsgghdsegmsyisqvpfvivdlrnmrsikidvhsqtawveagatlgevyywvneknenlslaagycptvcagghfggggygplmrnyglaadniidahlvnvhgkvldrksmgedlfwalrgggaesfgiivawkirlvavpkstmfsvkkimeihelvklvnkwqniaykydkdlllmthfitrnitdnqgknktaihtyfssvflggvdslvdlmnksfpelgikktdcrqlswidtiifysgvvnydtdnfnkeilldrsagqngafkikldyvkkpipesvfvqileklyeedigagmyalypyggimdeisesaipfphragilyelwyicswekqednekhlnwirniynfmtpyvsknprlaylnyrdldigindpknpnnytqariwgekyfgknfdrlvkvktlvdpnnffrneqsipplprhrhseqidno:7：包含巴斯德畢赤酵母的α分泌序列的密碼子優(yōu)化cbda合成酶基因序列atgagattcccatccatcttcactgctgttttgttcgctgcttcttccgctttggctgctccagttaacactactactgaggacgagactgctcagattccagctgaagctgttattggttactccgacttggaaggtgacttcgacgttgctgttttgccattctccaactccactaacaacggtttgttgttcatcaacactacaatcgcttccattgctgctaaagaagagggagtttccttggagaagagagaggctgaagctaacccaagagaaaacttcttgaagtgtttttcccagtacatcccaaacaacgctacaaacttgaagttggtttacactcagaacaacccattgtacatgtccgttttgaactccacaatccacaacttgagattcacttccgacactactccaaagccattggttatcgttactccatcccacgtttcccacatccagggtactattttgtgttccaagaaggttggattgcagatcagaacaagatccggtggtcacgactctgaaggtatgtcctacatttcccaggttcctttcgttatcgttgacttgagaaacatgagatccatcaagatcgacgttcactcccagactgcttgggttgaagctggtgctactttgggtgaagtttactactgggttaacgagaagaacgagaacttgtccttggctgctggttactgtccaactgtttgtgctggtggtcatttcggtggtggtggttatggtccattgatgagaaactacggtttggctgctgacaacatcatcgacgctcacttggttaacgttcacggtaaggttttggacagaaagtccatgggtgaggacttgttctgggctttgagaggtggtggtgctgaatccttcggtattatcgttgcttggaagatcagattggttgctgttccaaagtccactatgttctccgttaagaaaatcatggaaatccacgaattggttaagttggttaacaagtggcagaacattgcttacaagtacgacaaggatttgttgttgatgactcacttcatcactagaaacatcactgacaaccagggtaagaacaagactgctatccacacttacttctcttccgttttcttgggtggtgttgactccttggttgatttgatgaacaagtccttcccagagttgggtatcaagaaaactgactgtagacagttgtcctggatcgacactatcatcttctactccggtgttgttaactacgacacagacaacttcaacaaagagatcttgttggacagatccgctggacagaacggtgctttcaagatcaagttggactacgttaagaagccaatcccagagtccgttttcgttcagattttggagaagttgtacgaagaggacatcggtgctggtatgtacgctttgtacccatacggtggtatcatggacgaaatttccgagtccgctattccattcccacacagagctggtatcttgtacgagttgtggtacatctgttcttgggagaagcaagaggacaacgagaagcacttgaactggatcagaaacatctacaacttcatgactccatacgtttccaagaacccaagattggcttacttgaactacagagacttggacatcggaatcaacgacccaaagaaccctaacaactacactcaggctagaatctggggtgaaaagtacttcggtaagaacttcgacagattggttaaggttaagactttggttgacccaaacaatttcttcagaaacgagcagtccatccctccattgccaagacatagacatcatcaccatcaccactaaseqidno:8：包含巴斯德畢赤酵母的α分泌序列的密碼子優(yōu)化的cbda合成酶氨基酸序列mrfpsiftavlfaassalaapvntttedetaqipaeavigysdlegdfdvavlpfsnstnngllfinttiasiaakeegvslekreaeanprenflkcfsqyipnnatnlklvytqnnplymsvlnstihnlrftsdttpkplvivtpshvshiqgtilcskkvglqirtrsgghdsegmsyisqvpfvivdlrnmrsikidvhsqtawveagatlgevyywvneknenlslaagycptvcagghfggggygplmrnyglaadniidahlvnvhgkvldrksmgedlfwalrgggaesfgiivawkirlvavpkstmfsvkkimeihelvklvnkwqniaykydkdlllmthfitrnitdnqgknktaihtyfssvflggvdslvdlmnksfpelgikktdcrqlswidtiifysgvvnydtdnfnkeilldrsagqngafkikldyvkkpipesvfvqileklyeedigagmyalypyggimdeisesaipfphragilyelwyicswekqednekhlnwirniynfmtpyvsknprlaylnyrdldigindpknpnnytqariwgekyfgknfdrlvkvktlvdpnnffrneqsipplprhrhhhhhh當(dāng)前第1頁12