本發(fā)明涉及用于治療癌癥的曲沙他濱(troxacitabine)的磷前體藥物和它們的衍生物，所述癌癥尤其是肝癌如肝細胞癌(hcc)和繼發(fā)性肝癌。本發(fā)明進一步涉及包含這些化合物的組合物和組合，以及它們在癌癥治療中的使用方法，所述癌癥尤其是肝癌如hcc。
發(fā)明背景
原發(fā)性肝癌是世界上第六種最常見的癌癥，并且是癌癥死亡的第二個主要原因。在所有原發(fā)性惡性肝癌當中占大約85％的最常見的、并且發(fā)病率繼續(xù)上升的肝癌是肝細胞癌(hcc)，它由變成惡性的肝細胞形成。由肝細胞形成的另一個類型的癌癥是肝胚細胞瘤，它是罕有的惡性腫瘤，主要出現(xiàn)在兒童中，并且在所有兒童癌癥當中占大約1％，在年齡15歲以下的所有原發(fā)性肝癌當中占大約79％。繼發(fā)性肝癌或肝轉(zhuǎn)移是在身體的其它地方起始、隨后蔓延到肝的癌癥。繼發(fā)性肝癌的實例包括許多通常類型的癌癥，例如，結(jié)腸、直腸、肺和乳腺癌。肝癌還可以由肝內(nèi)的其它結(jié)構(gòu)形成，例如，膽管、血管和免疫細胞。膽管癌(膽管細胞癌和膽管細胞囊腺癌)占原發(fā)性肝癌的大約6％。
盡管手術(shù)切除和肝移植是早期hcc的潛在治療方法，但20％以上的患者最終復(fù)發(fā)或遇到其它問題，并且大部分hcc診斷在這些治療的過遲階段進行。局部治療，例如，射頻消蝕，響應(yīng)率超過60％，但它們只適合于一定比例的患者，并且并不總是有療效。至今使用的化學(xué)治療對于hcc的效果非常有限，迄今為止，響應(yīng)率不超過25％。目前，索拉非尼(sorafenib)是治療晚期或不可切除的hcc的唯一有效的上市藥物，因此，為了降低復(fù)發(fā)率并且提高總體存活率，還非常需要hcc的其它治療方法。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，許多核苷類似物具有抗癌活性，并且它們構(gòu)成了治療癌癥患者所廣泛使用的化學(xué)治療劑的主要類別。被稱為抗代謝物的這類藥劑包括具有細胞毒性活性的各種嘧啶和嘌呤核苷衍生物。
細胞核苷酸激酶使核苷磷酸化成它們的相應(yīng)的5'-單磷酸酯，并且進一步轉(zhuǎn)變?yōu)樗鼈兊亩姿狨?，隨后轉(zhuǎn)變?yōu)樗幚韺W(xué)活性的三磷酸酯。已知一些核苷的活性很弱，這是由于它們不能有效地被激酶磷酸化，或者根本不是激酶的底物。在磷酸化順序中，核苷類似物的第一次磷酸化是速率限制性的磷酸化，而第二和第三次磷酸化對核苷修飾敏感程度更低。核苷單磷酸酯(核苷酸)本身通常在血液中不穩(wěn)定，并且顯示較差的膜滲透性，因此不適合用作藥物。由于核苷以及核苷類似物的三磷酸酯的高度不穩(wěn)定性和差的細胞滲透性，所以，它們不能被視為可能的藥物候選物。
曲沙他濱(β-l-二氧戊環(huán)胞苷)是細胞毒性的脫氧胞苷類似物，該脫氧胞苷類似物具有非天然的l-構(gòu)型，針對實體和造血惡性腫瘤顯示廣泛的體外和體內(nèi)活性。特別地，已經(jīng)觀察到針對人癌細胞系以及肝細胞、前列腺和腎源的異種移植物的可觀的活性(cancerres.,55,3008-3011,1995)。已經(jīng)顯示的是，曲沙他濱引起通常負責核苷的第一個磷酸化步驟的激酶脫氧胞苷激酶(dck)的突變，不產(chǎn)生或產(chǎn)生極低水平的曲沙他濱單磷酸酯，由此導(dǎo)致耐受性。
在2008年，曲沙他濱進入急性髓性白血病適應(yīng)癥的iii期臨床試驗，但沒有繼續(xù)注冊。曲沙他濱的終止的ii期試驗包括乳腺癌、結(jié)腸直腸癌、胰腺癌、黑素瘤、nsclc、腎腫瘤、前列腺腫瘤和卵巢腫瘤。通常靜脈內(nèi)輸注給予曲沙他濱，由此，與癌癥的位點無關(guān)，使許多組織暴露于藥物。
已經(jīng)顯示，盡管它的親水性，曲沙他濱通過被動擴散而運輸?shù)郊毎校c其它載體運輸?shù)暮塑障啾?，它僅僅非常慢地在癌細胞中積累。
wo2008/030373中公開了在胞嘧啶堿基部分上攜帶前體藥物基團的曲沙他濱的衍生物，并且評價了前體藥物的親脂性和它們的抗腫瘤活性之間的關(guān)系。該專利認為，堿基修飾是期望的，以避免具有5'-oh修飾的酯酶困難。
在d-核苷的5'羥基官能團上的氨基磷酸酯前體藥物已經(jīng)成功地應(yīng)用于抗病毒藥物，例如，用于治療hcv感染的索非布韋(sofosbuvir)。在細胞內(nèi)將索非布韋前體藥物去掩蔽以露出單磷酸酯是一種以特定順序的、涉及若干水解酶的復(fù)雜的多步過程。
氨基磷酸酯前體藥物在癌癥核苷上的應(yīng)用還不太成功。nucana正在研發(fā)acelerin(nuc-1031)，它是用于治療胰腺癌的d-核苷吉西他濱的氨基磷酸酯前體藥物(結(jié)構(gòu)參見wo2005012327的71頁)。然而，即使認為氨基磷酸酯會增強所述化合物的親脂性和細胞滲透性，acelarin前體藥物還必須以iv輸注形式給予，由此使許多健康組織暴露于細胞毒性代謝物。
對于l-核苷的單磷酸酯前體藥物(例如，曲沙他濱)的經(jīng)驗甚至更少。wo2008048128公開了少數(shù)曲沙他濱單磷酸酯前體藥物，包括實施例14的化合物：
對于任何所述化合物，在wo2008048128說明書或該學(xué)術(shù)文獻的其它地方，都沒有公開癌癥或其它生物活性。也沒有這種前體藥物進入臨床試驗的報告。然而，wo2008048128的發(fā)明人已經(jīng)公開了與d-核苷吉西他濱寬泛地相似的前體藥物(baraniak等人，biorgmedchem2014，2133-2040)，其中，所述前體藥物方法似乎在某些組織中起作用，以及d-核苷疊氮胸苷(azidothymidine)(kulic等人，antivirchemchemother2011，21(3)143-150)，其中，所述前體藥物比相應(yīng)的母體核苷的效果低2-20倍。kulic推測，疊氮胸苷前體藥物傾向于首先對核苷進行脫磷酸化，然后磷酸化成為活性的三磷酸酯種類。由于前體藥物方法對吉西他濱(由于它的取代的2'官能團，其類似于rna)起作用，而對疊氮胸苷(它是2'-脫氧的，由此類似于dna)不起作用，所以wo2008048128假設(shè)曲沙他濱的(其是dna類似物，雖然是l-dna)前體藥物很可能是非活性的，類似于疊氮胸苷前體藥物。
balzarini等人在biochembiophysrescomm225，363-369(1996)中描述了cf1109的hiv和hbv活性，其是l-核苷拉夫米定/3tc的氨基磷酸酯前體藥物，具有下列結(jié)構(gòu)∶
balzarini認為，這種氨基磷酸酯前體藥物針對hiv的活性比其母體核苷3tc低～250倍，但是，這種前體藥物“在hepg2.2.15細胞中針對hbv幾乎同樣有效”。換句話說，加入這種大的氨基磷酸甲酯前體藥物基團不會在肝細胞系中提高抗病毒效能。balzarini沒有檢驗該前體藥物在磷酸化成為活性三磷酸酯之前是否代謝為3tc。
本發(fā)明提供了適合于口服給藥的曲沙他濱的磷前體藥物(phosphorusprodrug)，尤其是靶向肝的前體藥物，例如氨基磷酸酯。這些前體藥物具有改善的細胞滲透性的優(yōu)點，這是由于，與曲沙他濱本身相比，它們的親脂性提高，并且由于避開速率限制的第一個磷酸化步驟，可以更有效地形成活性的三磷酸酯。進一步地，本發(fā)明的化合物在肝臟中主要代謝成為活性的三磷酸酯，從而在靶器官中提供高濃度的活性化合物，同時在其它器官中保持由毒性引起的副作用的最小化。
發(fā)明描述
一方面，本發(fā)明提供了由式(i)表示的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽和/或溶劑化物：
其中：
r1是or11或nr5r5’；
r2是h或f；
r5是h、c1-c6烷基、oh、c(＝o)r6、o(c＝o)r6或o(c＝o)or6；
r5'是h或c1-c6烷基；
r6是c1-c22烷基或c3-c7環(huán)烷基；
r11是h或c1-c6烷基；
r13是h、苯基、吡啶基、芐基、吲哚基或萘基，其中，所述苯基、吡啶基、芐基、吲哚基和萘基任選被1、2或3個r22取代；
r15是h、c1-c6烷基、c3-c7環(huán)烷基、c3-c7環(huán)烷基c1-c3烷基、苯基、芐基或吲哚基；
r15'是h或c1-c6烷基；或
r15和r15'與它們連接的碳原子一起形成c3-c7亞環(huán)烷基基團，其中，每個c1-c6烷基任選被選自鹵素、or18和sr18的基團取代，每個c3-c7環(huán)烷基、c3-c7亞環(huán)烷基、苯基和芐基任選被一或兩個獨立地選自c1-c3烷基、鹵素和or18的基團取代；
r16是h、c1-c10烷基、c2-c10烯基、c3-c7環(huán)烷基、c3-c7環(huán)烷基c1-c3烷基、芐基或苯基，其中的任何一個基團任選被1、2或3個各自獨立地選自鹵素、or18和n(r18)2的基團取代；
每個r18獨立地是h、c1-c6烷基、c1-c6鹵代烷基或c3-c7環(huán)烷基；
每個r22獨立地選自鹵素、c1-c6烷基、c2-c6烯基、c1-c6鹵代烷基、c1-c6烷氧基、c1-c6鹵代烷氧基、苯基、羥基c1-c6烷基、c3-c6環(huán)烷基、c1-c6烷基羰基、c3-c6環(huán)烷基羰基、羧基c1-c6烷基、羥基、氨基cn和no2，或與相鄰的環(huán)碳原子連接的任何兩個r22基團可以組合形成-o-(cr23r23')1-6-o-；
r23和r23'獨立地是h或c1-c3烷基。
在一個實施方案中，本發(fā)明提供了由式i表示的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽和/或溶劑化物：
其中：
r1是or11或nr5r5'；
r2是h或f；
r5是h、c1-c6烷基、oh、c(＝o)r6、oc(＝o)r6或oc(＝o)or6；
r5'是h或c1-c6烷基；
r6是c1-c22烷基或c3-c7環(huán)烷基；
r11是h或c1-c6烷基；
r13是h、苯基、吡啶基、芐基、吲哚基或萘基，其中，所述苯基、吡啶基、芐基、吲哚基和萘基任選被1、2或3個r22取代；
r15是h、c1-c6烷基、c3-c7環(huán)烷基、c3-c7環(huán)烷基c1-c3烷基、苯基、芐基或吲哚基；
r15'是h或c1-c6烷基；或
r15和r15'與它們相連接的碳原子一起形成c3-c7亞環(huán)烷基基團，其中，每個c1-c6烷基任選被選自鹵素、or18和sr18的基團取代，每個c3-c7環(huán)烷基、c3-c7亞環(huán)烷基、苯基和芐基任選被一或兩個獨立地選自c1-c3烷基、鹵素和or18的基團取代；
r16是h、c1-c10烷基、c2-c10烯基、c3-c7環(huán)烷基、c3-c7環(huán)烷基c1-c3烷基、芐基或苯基，其中的任何一個基團任選被1、2或3個各自獨立地選自鹵素、or18和n(r18)2的基團取代；
每個r18獨立地是h、c1-c6烷基、c1-c6鹵代烷基或c3-c7環(huán)烷基；
每個r22獨立地選自鹵素、c1-c6烷基、c2-c6烯基、c1-c6鹵代烷基、c1-c6烷氧基、c1-c6鹵代烷氧基、苯基、羥基c1-c6烷基、c3-c6環(huán)烷基、c1-c6烷基羰基、c3-c6環(huán)烷基羰基、羧基c1-c6烷基、羥基、氨基cn、no2和三甲基甲硅烷基，或與相鄰的環(huán)碳原子連接的任何兩個r22基團可以組合形成-o-(cr23r23')1-6-o-；r23和r23'獨立地是h或c1-c3烷基。
式(i)的化合物可以任選以藥學(xué)上可接受的鹽和/或溶劑化物形式提供。在一個實施方案中，提供了藥學(xué)上可接受的鹽形式的本發(fā)明的化合物。在第二個實施方案中，提供了藥學(xué)上可接受的溶劑化物形式的本發(fā)明的化合物。在第三個實施方案中，提供了游離形式的本發(fā)明的化合物。
在本發(fā)明的一般實施方案中，r1是nr5r5'，例如，nh2或nhc(＝o)c1-c6烷基。
r2通常是h。
在優(yōu)選實施方案中，r1是nh2，r2是h。
在供選擇的實施方案中，r1是nh2，r2是f。
通常，在式(i)的化合物中，部分-nhc(r15)(r15')-c(＝o)or16形成氨基酸酯殘基，包括天然和非天然的氨基酸殘基。特別感興趣的是氨基酸殘基，其中，r15'是氫，r15是甲基、異丙基、異丁基或芐基。在一般構(gòu)型中，r15'是h，r15是c1-c3烷基，例如，甲基、乙基、丙基、異丙基。
在r15'是氫、r15不是氫的化合物中，不對稱碳原子的構(gòu)型通常是l-氨基酸的構(gòu)型，從而提供具有式(ia)所示的立體化學(xué)的化合物：
在優(yōu)選的式ia化合物的構(gòu)型中，r15是甲基。
在式ia化合物的進一步的構(gòu)型中，r15是芐基。
在式ia化合物的代表性的構(gòu)型中，
r1是nh2；
r2是h；
r13是苯基、萘基或吲哚基，其中的任何一個基團任選被鹵素如溴或c3-c4環(huán)烷基如環(huán)丙基取代；
r15是c1-c3烷基；
r16是c1-c8烷基。
在式ia化合物的進一步的代表性的構(gòu)型中，
r1是nh2；
r2是h；
r13是萘基；
r15是c1-c3烷基；
r16是c1-c8烷基或芐基。
在式ia化合物的進一步的代表性的構(gòu)型中，
r1是nh2；
r2是h；
r13是苯基，它在4位任選被鹵素如溴或c3-c4環(huán)烷基如環(huán)丙基取代；
r15是甲基；
r16是c3-c8烷基。
在式ia化合物的進一步的代表性的構(gòu)型中，
r1是nh2；
r2是h；
r13是苯基；
r15是甲基；
r16是c3-c8烷基。
在式ia化合物的進一步的代表性的構(gòu)型中，
r1是nh2；
r2是f；
r13是苯基、萘基或吲哚基，其中的任何一個基團任選被鹵素如溴或c3-c4環(huán)烷基如環(huán)丙基取代；
r15是c1-c3烷基；
r16是c1-c8烷基。
在式ia化合物的進一步的代表性的構(gòu)型中，
r1是nh2；
r2是f；
r13是萘基；
r15是c1-c3烷基；
r16是c1-c8烷基或芐基。
在式ia化合物的進一步的代表性的構(gòu)型中，
r1是nh2；
r2是f；
r13是苯基，它在4位任選被鹵素如溴或c3-c4環(huán)烷基如環(huán)丙基取代；
r15是甲基；
r16是c3-c8烷基。
在式ia化合物的進一步的代表性的構(gòu)型中，
r1是nh2；
r2是f；
r13是苯基；
r15是甲基；
r16是c3-c8烷基。
在進一步的構(gòu)型中，r15和r15'與它們連接的碳原子一起形成c3-c7環(huán)烷基，例如，環(huán)丙基或環(huán)丁基。
r16通常是c1-c10烷基或c3-c7環(huán)烷基。
r16的代表性實例(value)包括c1-c3烷基，例如，甲基、乙基、丙基、異丙基。r16的優(yōu)選實例是甲基，r16的進一步優(yōu)選實例是異丙基。
在一個實施方案中，r16是c3-c10烷基。
根據(jù)該實施方案，r16的代表性實例包括支鏈c5-c8烷基。在一個實施方案中，r16的分支點在c1位。在供選擇的實施方案中，r16的分支點在c2位。通常，根據(jù)這些實施方案，r15'是h，r15連接的碳原子的立體化學(xué)是l-氨基酸的立體化學(xué)，從而提供下列通式的化合物：
其中，r161和r162是相同或不同的c1-c3烷基，r163和r164是相同或不同的c1-c3烷基。
通常，在式(ia')的化合物中，r16是2-戊基，即，r161是丙基，r162是甲基。
在式(ia')化合物的進一步的典型構(gòu)型中，r16是2-丁基，即，r161是乙基，r162是甲基。
通常，在式(ia")的化合物中，r16是2-丙基戊基或2-乙基丁基，即，r163和r164二者分別都是丙基或乙基。
r16的進一步的代表性實例包括c3-c7環(huán)烷基，例如，環(huán)己基。
r16的進一步的代表性實例是環(huán)戊基。
r16的進一步的代表性實例是芐基。
r13通常是苯基、萘基或吲哚基，其中的任何一個基團任選被1或2個r22取代。
在本發(fā)明的一個實施方案中，r13是苯基或萘基，其中任何一個基團任選被取代。
在本發(fā)明的一個實施方案中，r13是萘基。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，r13是苯基。
r13的代表性的實例包括任選被一個、兩個或三個r22取代的苯基，從而提供式(ii-aa)的化合物：
其中，當r22存在時，每個r22獨立地選自鹵素、c1-c6烷基、c2-c6烯基和c1-c6烷氧基。通常，苯環(huán)是未取代的或被一個r22取代。
在式(ii-aa)化合物的一個構(gòu)型中，苯環(huán)是未取代的。
在式(ii-aa)化合物的進一步的構(gòu)型中，苯環(huán)被一個r22取代。通常，在該構(gòu)型中，取代基r22位于苯環(huán)的4位。
在本發(fā)明化合物的一個實施方案中，r13是在4位被鹵素(例如，溴)或c3-c4環(huán)烷基(例如，環(huán)丙基)取代的苯基。
在式(ii-aa)化合物的一個構(gòu)型中，苯環(huán)被羧基c1-c6烷基取代。該構(gòu)型的一個代表性實例是下式舉例說明的構(gòu)型：
在式(ii-aa)化合物的一個進一步的構(gòu)型中，苯環(huán)被位于相鄰碳原子上的兩個r22取代，并且兩個r22組合形成-o-ch2-o-，從而形成下列部分的結(jié)構(gòu)：
r13的進一步的代表性實例包括任選取代的吡啶基。通常，吡啶基部分是未取代的，或被一或兩個各自獨立地選自鹵素、c1-c6鹵代烷基、c1-c6烷基、c2-c6烯基、c1-c6烷氧基、羥基、氨基的取代基取代。
在式(i)化合物的典型實施方案中，
r1是nh2或nhc(＝o)c1-c6烷基；
r13是苯基、萘基或吲哚基，其中任何一個基團任選被鹵素、c1-c3烷基、c1-c3烷氧基、c3-c6環(huán)烷基或c1-c3鹵代烷基取代；
r15'是h，r15是c1-c3烷基或芐基；
r16是c1-c10烷基或c3-c7環(huán)烷基。
在式(i)或(ia)化合物的典型實施方案中，
r1是nh2或nhc(＝o)c1-c6烷基；
r13是苯基或萘基，其中任何一個基團任選被鹵素、c1-c3烷基、c1-c3烷氧基、c3-c6環(huán)烷基或c1-c3鹵代烷基取代；
r15'是h，r15是c1-c3烷基或芐基；
r16是c2-c10烷基或c3-c7環(huán)烷基。
在式(i)化合物的進一步的典型實施方案中，
r1是nh2；
r2是h；
r13是苯基；
r15'是h，r15是c1-c3烷基；
r16是c1-c3烷基或環(huán)己基。
在式(i)或(ia)化合物的進一步的典型實施方案中，
r1是nh2；
r2是h；
r13是苯基；
r15'是h，r15是c1-c3烷基或芐基；
r16是c3-c8烷基、環(huán)戊基或環(huán)己基。
本發(fā)明的化合物顯示了抗癌活性，尤其是抗肝癌如hcc的活性，并且可以用作治療患有癌癥的溫血動物尤其是人的藥物。特別地，所述化合物可以用作治療患有肝癌如hcc的人的藥物。
為了避免不希望的副作用，尤其是在其它器官中的毒性，關(guān)鍵的是，將藥物遞送至腫瘤位點，同時減少暴露于正常組織。本發(fā)明的化合物在胃液中是穩(wěn)定的，但容易被肝酶代謝，因此，它們可以在胃中被吸收，并作為掩蔽的細胞毒性藥劑轉(zhuǎn)移到肝中，在肝中吸收、代謝和形成活性的細胞毒性的三磷酸酯形式。因此，本發(fā)明提供了主要在肝中吸收和處理，從而使暴露于身體中的其它器官和毒性副作用最小的化合物。
不受理論束縛，本發(fā)明化合物的抗致癌活性可以直接針對癌癥的快速起作用的致瘤細胞的細胞過程起作用，但可以另外地或者供選擇地通過調(diào)節(jié)腫瘤的微環(huán)境來發(fā)揮它們的作用，例如，抑制血管生成，從而使得到營養(yǎng)的腫瘤處于饑餓狀態(tài)，導(dǎo)致腫瘤生長的抑制。
本發(fā)明的化合物還用于治療繼發(fā)性的肝癌、肝轉(zhuǎn)移，肝轉(zhuǎn)移即來源于體內(nèi)其它器官如結(jié)腸、肺或乳腺并轉(zhuǎn)移至肝臟的癌癥。
本發(fā)明還涉及治療患有癌癥，尤其是肝癌如hcc，的溫血動物尤其是人的方法，所述方法包括：給予有效量的式(i)的化合物或其任何子組。
本發(fā)明還涉及治療患有繼發(fā)性肝癌的溫血動物，尤其是人，的方法，所述方法包括：給予有效量的式(i)的化合物或其任何子組。
所述作為藥物的用途或治療方法包括全身性給予患有癌癥的受試者有效量的式(i)的化合物。
在一方面，本發(fā)明提供了藥物組合物，其包含式(i)的化合物以及藥學(xué)上可接受的佐劑、稀釋劑、賦形劑或載體。
在進一步的方面，本發(fā)明提供了用于治療癌癥的藥物組合物，其包含式(i)的化合物以及藥學(xué)上可接受的佐劑、稀釋劑、賦形劑或載體。
在進一步的方面，本發(fā)明提供了用于治療肝癌如hcc的藥物組合物，其包含式(i)的化合物以及藥學(xué)上可接受的佐劑、稀釋劑、賦形劑或載體。
在進一步的方面，本發(fā)明提供了用于治療繼發(fā)性肝癌的藥物組合物，其包含式(i)的化合物以及藥學(xué)上可接受的佐劑、稀釋劑、賦形劑或載體。
在進一步的方面，本發(fā)明涉及制備本文所列舉的藥物組合物的方法，所述方法包括：使藥學(xué)上可接受的佐劑、稀釋劑、賦形劑和/或載體與治療有效量的式(i)的化合物密切地混合。
在進一步的方面，本發(fā)明提供了用于上述治療或抑制的藥物組合物，所述藥物組合物進一步包含一或多種額外的治療劑。
上述藥物組合物將通常包含有效量(例如，用于人)的式(i)的化合物，不過，當與其它藥劑聯(lián)用或以多劑量使用時，可以使用式(i)化合物的子治療劑量。
在該上下文中，治療有效量是足以產(chǎn)生預(yù)期結(jié)果的量。治療有效量將根據(jù)每種具體情況的個體要求而變化。影響劑量的原因是，例如，所治療的疾病的嚴重程度，所治療的受試者的年齡、體重、一般健康狀況，等等。就抗癌作用而論，這種作用可以抑制腫瘤進一步生長、降低轉(zhuǎn)移的可能性或消除轉(zhuǎn)移，或使腫瘤細胞死亡，導(dǎo)致腫瘤縮小，或在患者的腫瘤消退之后，防止腫瘤再生長。
在進一步的方面，本發(fā)明提供了用作藥物的式(i)化合物。
在進一步的方面，本發(fā)明提供了用于治療癌癥的式(i)化合物。
在進一步的方面，本發(fā)明提供了用于治療肝癌(例如，hcc)的式(i)化合物。
在進一步的方面，本發(fā)明提供了用于治療繼發(fā)性肝癌的式(i)化合物。
在進一步的方面，本發(fā)明提供了用于上述治療的式(i)化合物，所述化合物與一或多種另外的癌癥治療聯(lián)用，例如，其它抗癌癥藥物、手術(shù)、免疫治療和/或局部治療，例如，射頻消蝕。
在進一步的實施方案中，另外的抗癌治療是放療。
在一個實施方案中，另外的抗癌治療是顯示有效的抗腫瘤活性的一或多種其它核苷類似物。
在一方面，本發(fā)明提供了藥物組合，其包含治療有效量的式(i)的化合物和一或多種另外的治療劑，所述另外的治療劑選自化學(xué)治療劑、多耐藥性逆轉(zhuǎn)劑和生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑。
在該方面的一個實施方案中，另外的治療劑是化學(xué)治療劑。
在進一步的方面，本發(fā)明提供了用于制備藥物的式(i)化合物。
在進一步的方面，本發(fā)明提供了用于制備藥物的式(i)化合物，所述藥物用于治療癌癥。
在進一步的方面，本發(fā)明提供了用于制備藥物的式(i)化合物，所述藥物用于治療肝癌，例如，hcc。
在進一步的方面，本發(fā)明提供了用于制備藥物的式(i)化合物，所述藥物用于治療繼發(fā)性的肝癌。
在進一步的方面，本發(fā)明提供了用于治療癌癥的方法，所述方法包括給予受試者(例如，需要其的人)治療有效量的式(i)的化合物。
在進一步的方面，本發(fā)明提供了用于治療肝癌(例如，hcc)的方法，所述方法包括給予受試者(例如，需要其的人)治療有效量的式(i)的化合物。
在進一步的方面，本發(fā)明提供了用于治療繼發(fā)性肝癌的方法，所述方法包括：給予受試者(例如，需要其的人)治療有效量的式(i)的化合物。
在進一步的方面，本發(fā)明提供了用于上述治療的方法，所述方法與一或多種另外的癌癥治療聯(lián)用，例如，其它抗癌癥藥物、手術(shù)、免疫治療和/或局部治療，例如，射頻消蝕。
在一方面，本發(fā)明提供了治療原發(fā)性或繼發(fā)性肝癌的方法，所述方法包括給予藥物組合，所述藥物組合包含治療有效量的式i化合物，進一步包含一或多種選自化學(xué)治療劑、多耐藥性逆轉(zhuǎn)劑和生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑的其它治療劑。
在該方面的一個實施方案中，其它治療劑是化學(xué)治療劑。在一方面，本發(fā)明提供了式(i)的化合物，其選自下面描述的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽：
此外，本發(fā)明涉及制備式(i)化合物的方法、用于制備式(i)化合物的新的中間體以及這種中間體的制備方法。
上文和下文使用的術(shù)語“式(i)的化合物”、“該發(fā)明的化合物”、“本發(fā)明的化合物”或類似的術(shù)語，旨在包括式(i)化合物和式(i)化合物的任何子組，包括所有可能的立體化學(xué)異構(gòu)形式、它們的藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物、季銨和金屬絡(luò)合物。
可以出于給藥目的將本發(fā)明的化合物配制為各種藥物形式。作為合適的組合物，可以列舉藥物的口服給藥通常使用的所有組合物。為了制備本發(fā)明的藥物組合物，將有效量的作為活性成分的具體化合物(任選加成鹽形式或溶劑化物)與藥學(xué)上可接受的載體緊密混合，所述載體根據(jù)希望給藥的制劑形式，可以采用多種形式。這些藥物組合物在適合于口服給藥的單位劑型中是希望的。例如，在制備口服劑型的組合物過程中，在口服液體制劑(例如混懸劑、糖漿劑、酏劑、乳劑和溶液劑)的情況下，可以使用任何常規(guī)的藥物介質(zhì)，例如，水、二醇、油、醇，等等；或在粉劑、丸劑、膠囊劑和片劑的情況下，可以使用固體載體，例如，淀粉、糖、高嶺土、潤滑劑、粘合劑、崩解劑，等等。因為片劑和膠囊劑容易給藥，所以，它們代表最有利的口服劑量單位形式，在這樣的情況下，顯然使用固體藥物載體。還包括的是固體形式制劑，可以在使用之前不久，將其轉(zhuǎn)變?yōu)橐后w形式制劑。
為了容易給藥和劑量的均勻性，配制單位劑型的上述藥物組合物是特別有利的。本文使用的單位劑型是指適合作為單位劑量的物理離散單位，每個單位含有預(yù)定量的、適于產(chǎn)生希望的治療效果的活性組分，以及所需的藥物載體。這種單位劑型的實例是片劑(包括刻痕或包衣片劑)、膠囊劑、丸劑、粉劑小包裝、薄片，等等，以及其分開的多份。
通常，認為抗癌有效日劑量為大約0.01至大約700mg/kg，或大約0.5至大約400mg/kg，或大約1至大約250mg/kg，或大約2至大約200mg/kg，或大約10至大約150mg/kg體重。合適的是，每天以合適的時間間隔，以兩個、三個、四個或更多的子劑量形式給予所需劑量?？梢詫⑺鲎觿┝颗渲茷閱挝粍┬停?，每個單位劑型含有大約1至大約5000mg，或大約50至大約3000mg，或大約100至大約1000mg，或大約200至大約600mg，或大約100至大約400mg活性成分。
本發(fā)明的化合物可以單獨顯示出抗癌作用和/或提高另一種抗癌劑顯示抗癌作用的能力。
本發(fā)明的化合物可以表示為所定義的立體異構(gòu)體。這種化合物的絕對構(gòu)型可以使用本領(lǐng)域已知的方法，例如，x射線衍射或nmr測定，和/或由已知立體化學(xué)的起始原料的本質(zhì)來確定。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物將包括基本上立體異構(gòu)純的指定立體異構(gòu)體的制劑。
本文所述的化合物和中間體的純的立體異構(gòu)形式定義為：基本上不含所述化合物或中間體的相同基本分子結(jié)構(gòu)的其它對映異構(gòu)體或非對映異構(gòu)體形式的異構(gòu)體。具體地，術(shù)語“立體異構(gòu)純”涉及至少80％立體異構(gòu)過量(即，最少90％的一種異構(gòu)體，以及最多10％的其它可能的異構(gòu)體)直至100％立體異構(gòu)過量(即，100％的一種異構(gòu)體，沒有其它異構(gòu)體)的化合物或中間體，更具體地，90％直至100％的立體異構(gòu)過量的化合物或中間體，甚至更具體地，94％直至100％的立體異構(gòu)過量的化合物或中間體，最具體地，97％直至100％的立體異構(gòu)過量的化合物或中間體。應(yīng)該按同樣的方式理解術(shù)語“對映異構(gòu)純”和“非對映異構(gòu)純”，不過應(yīng)該分別考慮所討論的混合物的對映異構(gòu)體過量和非對映異構(gòu)體過量。
通過使用本領(lǐng)域已知的方法，可以獲得本發(fā)明的化合物和中間體的純的立體異構(gòu)形式。例如，使用旋光性的酸或堿，通過選擇性地結(jié)晶它們的非對映異構(gòu)體鹽，可以將對映異構(gòu)體彼此分離。其實例是酒石酸、二苯甲?；剖帷⒍妆锦；剖岷驼聊X磺酸。供選擇地，使用手性固定相，通過色譜技術(shù)，可以分離對映異構(gòu)體。所述純的立體化學(xué)異構(gòu)形式還可以衍生自相應(yīng)的合適起始原料的純立體化學(xué)異構(gòu)形式，條件是，反應(yīng)是立體專一反應(yīng)。
優(yōu)選地，如果需要特定的立體異構(gòu)體，則通過立體特異性的制備方法來合成所述化合物。這些方法將有利地使用對映異構(gòu)純的起始原料。
通過常規(guī)方法，可以單獨地獲得本發(fā)明化合物的非對映異構(gòu)的外消旋體?？梢杂欣厥褂玫暮线m的物理分離方法是，例如，選擇性結(jié)晶和色譜，例如，柱色譜。
當磷原子存在于本發(fā)明的化合物中時，磷原子可以表示手性中心。按照cahn-ingold-prelog優(yōu)先規(guī)則，該中心的手性表示為“r”或“s”。當沒有表示手性時，認為包括r-和s-兩種異構(gòu)體，以及兩者的混合物，即，非對映異構(gòu)體混合物。
在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，包括磷原子具有s-構(gòu)型的立體異構(gòu)體。這些立體異構(gòu)體表示為sp。
在本發(fā)明的其它實施方案中，包括磷原子具有r-構(gòu)型的立體異構(gòu)體。這些立體異構(gòu)體表示為rp。
在本發(fā)明的其它實施方案中，包括非對映異構(gòu)體的混合物，即，磷原子具有r-或s-構(gòu)型的化合物的混合物。
本發(fā)明還包括同位素標記的式(i)化合物，其中，一個或多個原子被該原子的同位素替代，該原子的同位素即，具有相同原子序數(shù)但原子量不同于自然界通常發(fā)現(xiàn)的原子量的原子。可以摻入式(i)化合物中的同位素的實例包括但不限于：氫的同位素，例如，2h和3h(對于氘和氚，還分別表示為d和t)，碳的同位素，例如，11c、13c和14c，氮的同位素，例如，13n和15n，氧的同位素，例如，15o、17o和18o，磷的同位素，例如，31p和32p，硫的同位素，例如，35s，氟的同位素，例如，18f，氯的同位素，例如，36cl，溴的同位素，例如，75br、76br、77br和82br，以及碘的同位素，例如，123i、124i、125i和131i。同位素標記的化合物所包括的同位素的選擇將取決于所述化合物的具體應(yīng)用。例如，對于藥物或底物組織分布試驗，最常使用的化合物是其中摻入放射性同位素(例如，3h或14c)的化合物。對于放射成像應(yīng)用，例如，正電子發(fā)射層析成像(pet)，使用正電子發(fā)射同位素，例如，11c、18f、13n或15o。式(i)的化合物中引入重同位素，例如，氘，即，2h，可以提供更大的代謝穩(wěn)定性，例如，可以導(dǎo)致該化合物的體內(nèi)半衰期增加，或減少劑量需要。
利用類似于本文下面反應(yīng)路線和/或?qū)嵤├枋龅姆椒ǎ褂煤线m的同位素標記的試劑或起始原料來代替相應(yīng)的非同位素標記的試劑或起始原料，或利用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法，可以制備同位素標記的本發(fā)明的化合物。
藥學(xué)上可接受的加成鹽包括式(i)化合物的治療活性的酸和堿加成鹽形式。所關(guān)注的是游離形式，即，式(i)化合物或其任何子組的非鹽形式。
通過用這種合適的酸處理堿形式，可以便利地地獲得藥學(xué)上可接受的酸加成鹽。合適的酸包括，例如，無機酸，例如，氫鹵酸，例如，鹽酸或氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等酸；或有機酸，例如，乙酸、丙酸、羥乙酸、乳酸、丙酮酸、草酸(即，乙二酸)、丙二酸、琥珀酸(即，丁二酸)、馬來酸、富馬酸、蘋果酸(即，羥基丁二酸)、酒石酸、檸檬酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、對甲苯磺酸、環(huán)己氨基磺酸、水楊酸、對氨基水楊酸、雙羥萘酸等酸。反之，通過用合適的堿處理，所述鹽形式可以轉(zhuǎn)變?yōu)橛坞x堿形式。
通過用合適的有機和無機堿處理含有酸性質(zhì)子的式(i)化合物，它們還可以轉(zhuǎn)變?yōu)樗鼈兊臒o毒的金屬或胺加成鹽形式。合適的堿鹽形式包括，例如，銨鹽、堿金屬和堿土金屬鹽，例如，鋰、鈉、鉀、鎂、鈣鹽，等等，與有機堿形成的鹽，例如，苯乍生、n-甲基-d-葡糖胺、海巴明(hydrabamine)鹽，以及與氨基酸形成的鹽，所述氨基酸例如，精氨酸、賴氨酸，等等。
一些式(i)的化合物還可以以它們的互變異構(gòu)形式存在。例如，酰胺基(-c(＝o)-nh-)的互變異構(gòu)形式是亞氨基醇(-c(oh)＝n-)，其可以在具有芳族特征的環(huán)中變得穩(wěn)定。雖然沒有在本文提供的結(jié)構(gòu)式中明確地表明，但這種形式包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。
本文的說明書摘要、說明書和權(quán)利要求所使用的術(shù)語和表述應(yīng)該按照下文的定義來解釋，除非另外說明。每個術(shù)語在每次出現(xiàn)時的含義是獨立的。不管是否單獨使用術(shù)語或與其它術(shù)語組合使用，都適用這些定義，除非另有說明。沒有明確定義的本文使用的術(shù)語或表述，應(yīng)解釋為具有本領(lǐng)域使用的通常含義。為了描述相同結(jié)構(gòu)，化學(xué)名稱、通用名稱和化學(xué)結(jié)構(gòu)可以互換使用。如果使用化學(xué)結(jié)構(gòu)和化學(xué)名稱兩者來提及化學(xué)化合物，并且在結(jié)構(gòu)和名稱之間存在歧義，則以結(jié)構(gòu)為主。
“cm-cn烷基”其本身或在組合術(shù)語中，例如，cm-cn鹵代烷基、cm-cn烷基羰基、cm-cn烷基胺，等等，表示具有指定碳原子數(shù)目的直鏈或支鏈脂族烴基團，例如，c1-c4烷基是指具有1至4個碳原子的烷基。c1-c6烷基具有相應(yīng)的含義，還包括戊基和己基的所有的直鏈和支鏈異構(gòu)體。用于本發(fā)明的優(yōu)選的烷基是c1-c6烷基，包括甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基和正己基，尤其是c1-c4烷基，例如，甲基、乙基、正丙基、異丙基、叔丁基、正丁基和異丁基。通常優(yōu)選甲基和異丙基。烷基可以是未取代的烷基，或被一個或多個可以相同或不同的取代基取代，每個取代基獨立地選自鹵素、烯基、炔基、芳基、環(huán)烷基、氰基、羥基、-o-烷基、-o-芳基、-亞烷基-o-烷基、烷硫基、-nh2、-nh(烷基)、-n(烷基)2、-nh(環(huán)烷基)、-o-c(＝o)-烷基、-o-c(＝o)-芳基、-o-c(＝o)-環(huán)烷基、-c(＝o)oh和-c(＝o)o-烷基。通常優(yōu)選地，烷基是未取代的烷基，除非另外說明。
“c2-cn烯基”表示含有至少一個碳-碳雙鍵并且具有指定碳原子數(shù)目的直鏈或支鏈脂族烴基團，例如，c2-c4烯基是指具有2至4個碳原子的烯基；c2-c6烯基是指具有2至6個碳原子的烯基。非限制性的烯基包括乙烯基、丙烯基、正丁烯基、3-甲基丁-2-烯基、正戊烯基和己烯基。烯基可以是未取代的烯基，或被一個或多個可以相同或不同的取代基取代，每個取代基獨立地選自：鹵素、烯基、炔基、芳基、環(huán)烷基、氰基、羥基、-o-烷基、-o-芳基、-亞烷基-o-烷基、烷硫基、-nh2、-nh(烷基)、-n(烷基)2、-nh(環(huán)烷基)、-o-c(＝o)-烷基、-o-c(＝o)-芳基、-o-c(＝o)-環(huán)烷基、-c(＝o)oh和-c(＝o)o-烷基。通常優(yōu)選地，烯基是未取代的烯基，除非另外說明。
“c2-cn炔基”表示含有至少一個碳-碳三鍵并且具有指定碳原子數(shù)目的直鏈或支鏈脂族烴基團，例如，c2-c4炔基是指具有2至4個碳原子的炔基；c2-c6炔基是指具有2至6個碳原子的炔基。非限制性的烯基包括乙炔基、丙炔基、2-丁炔基、3-甲基丁炔基、戊炔基和己炔基。炔基可以是未取代的炔基，或被一個或多個可以相同或不同的取代基取代，每個取代基獨立地選自：鹵素、烯基、炔基、芳基、環(huán)烷基、氰基、羥基、-o-烷基、-o-芳基、-亞烷基-o-烷基、烷硫基、-nh2、-nh(烷基)、-n(烷基)2、-nh(環(huán)烷基)、-o-c(＝o)-烷基、-o-c(＝o)-芳基、-o-c(＝o)-環(huán)烷基、-c(o)oh和-c(o)o-烷基。通常優(yōu)選地，炔基是未取代的炔基，除非另外說明。
本文使用的術(shù)語“cm-cn鹵代烷基”表示cm-cn烷基，其中，至少一個c原子被鹵素取代(例如，cm-cn鹵代烷基可以含有一個至三個鹵素原子)，優(yōu)選氯或氟。典型的鹵代烷基是c1-c2鹵代烷基，其中，鹵素合適地是氟。示例性的鹵代烷基包括氟甲基、二氟甲基和三氟甲基。
本文使用的術(shù)語“cm-cn羥烷基”表示cm-cn烷基，其中，至少一個c原子被一個羥基取代。典型的cm-cn羥烷基是其中一個c原子被一個羥基取代的cm-cn烷基。示例性的羥烷基包括羥甲基和羥乙基。
本文使用的術(shù)語“cm-cn氨基烷基”表示cm-cn烷基，其中，至少一個c原子被一個氨基取代。典型的cm-cn氨基烷基是其中一個c原子被一個氨基取代的cm-cn烷基。示例性的氨基烷基包括氨甲基和氨乙基。
本文使用的術(shù)語“cm-cn亞烷基”表示具有指定碳原子數(shù)目的直鏈或支鏈的二價烷基。用于本發(fā)明的優(yōu)選的cm-cn亞烷基是c1-c3亞烷基。亞烷基的非限制性的實例包括：-ch2-、-ch2ch2-、-ch2ch2ch2-、-ch(ch3)ch2ch2-、-ch(ch3)-和-ch(ch(ch3)2)-。
術(shù)語“me”是指甲基，“meo”是指甲氧基。
術(shù)語“cm-cn烷基羰基”表示式cm-cn烷基-c(＝o)-的基團，其中，cm-cn烷基部分如上所述。通常,“cm-cn烷基羰基”是c1-c6烷基-c(＝o)-?！癱m-cn烷氧基”表示基團cm-cn烷基-o-，其中，cm-cn烷基如上所述。具體關(guān)注的是c1-c4烷氧基，包括甲氧基、乙氧基、正丙氧基、異丙氧基、叔丁氧基、正丁氧基和異丁氧基。通常優(yōu)選甲氧基和異丙氧基。c1-c6烷氧基具有相應(yīng)的含義，包括戊氧基和己氧基的所有的直鏈和支鏈異構(gòu)體。
術(shù)語“cm-cn烷氧基羰基”表示式cm-cn烷氧基-c(＝o)-的基團，其中，cm-cn烷氧基部分如上所述。通常，“cm-cn烷氧基羰基”是c1-c6烷氧基-c(＝o)-。
術(shù)語“氨基”表示基團-nh2。
術(shù)語“鹵素”表示鹵素基團，例如，氟、氯、溴或碘。通常，鹵素基團是氟或氯。
術(shù)語“芳基”是指苯基、聯(lián)苯基或萘基。
術(shù)語“雜環(huán)烷基”表示穩(wěn)定的飽和單環(huán)3-7元環(huán)，其含有1-3個獨立地選自o、s和n的雜原子。在一個實施方案中，穩(wěn)定的飽和單環(huán)3-7元環(huán)含有1個選自o、s和n的雜原子。在第二個實施方案中，穩(wěn)定的飽和單環(huán)3-7元環(huán)含有2個獨立地選自o、s和n的雜原子。在第三個實施方案中，穩(wěn)定的飽和單環(huán)3-7元環(huán)含有3個獨立地選自o、s和n的雜原子。含有1-3個獨立地選自o、s和n的雜原子的穩(wěn)定的飽和單環(huán)3-7元環(huán)通?？梢允?-7元環(huán)，例如，5或6元環(huán)。雜環(huán)烷基可以是未取代的，或被一個或多個可以相同或不同的取代基取代，每個取代基獨立地選自：鹵素、烯基、炔基、芳基、環(huán)烷基、氰基、羥基、-o-烷基、-o-芳基、-亞烷基-o-烷基、烷硫基、-nh2、-nh(烷基)、-n(烷基)2、-nh(環(huán)烷基)、-o-c(＝o)-烷基、-o-c(＝o)-芳基、-o-c(＝o)-環(huán)烷基、-c(＝o)oh和-c(＝o)o-烷基。通常優(yōu)選地，雜環(huán)烷基是未取代的雜環(huán)烷基，除非另外說明。
術(shù)語“雜芳基”表示穩(wěn)定的單或二環(huán)芳族環(huán)系統(tǒng)，其含有1-4個獨立地選自o、s和n的雜原子，每個環(huán)具有5或6個環(huán)原子。在本發(fā)明的一個實施方案中，穩(wěn)定的單或二環(huán)芳族環(huán)系統(tǒng)含有一個選自o、s和n的雜原子，每個環(huán)具有5或6個環(huán)原子。在本發(fā)明的第二個實施方案中，穩(wěn)定的單或二環(huán)芳族環(huán)系統(tǒng)含有兩個獨立地選自o、s和n的雜原子，每個環(huán)具有5或6個環(huán)原子。在本發(fā)明的第三個實施方案中，穩(wěn)定的單或二環(huán)芳族環(huán)系統(tǒng)含有三個獨立地選自o、s和n的雜原子，每個環(huán)具有5或6個環(huán)原子。在本發(fā)明的第四個實施方案中，穩(wěn)定的單或二環(huán)芳族環(huán)系統(tǒng)含有四個獨立地選自o、s和n的雜原子，每個環(huán)具有5或6個環(huán)原子。
雜芳基的一個實施方案包括黃酮。
術(shù)語“c3-cn環(huán)烷基”表示具有指定碳原子數(shù)目的環(huán)狀的單價烷基，例如，c3-c7環(huán)烷基是指具有3至7個碳原子的環(huán)狀的單價烷基。用于本發(fā)明的優(yōu)選的環(huán)烷基是c3-c4烷基，即，環(huán)丙基和環(huán)丁基。環(huán)烷基可以是未取代的，或被一個或多個可以相同或不同的取代基取代，每個取代基獨立地選自：鹵素、烯基、炔基、芳基、環(huán)烷基、氰基、羥基、-o-烷基、-o-芳基、-亞烷基-o-烷基、烷硫基、-nh2、-nh(烷基)、-n(烷基)2、-nh(環(huán)烷基)、-o-c(＝o)-烷基、-o-c(＝o)-芳基、-o-c(＝o)-環(huán)烷基、-c(＝o)oh和-c(＝o)o-烷基。通常優(yōu)選地，環(huán)烷基是未取代的環(huán)烷基，除非另外說明。
術(shù)語“氨基cm-cn烷基”表示被氨基取代的上述cm-cn烷基，即，所述烷基部分的一個氫原子被nh2-基團替代。通常，“氨基cm-cn烷基”是氨基c1-c6烷基。
術(shù)語“氨基cm-cn烷基羰基”表示上述cm-cn烷基羰基，其中，所述烷基部分的一個氫原子被nh2-基團替代。通常，“氨基cm-cn烷基羰基”是氨基c1-c6烷基羰基。氨基cm-cn烷基羰基的實例包括但不限于：甘氨?；胏(＝o)ch2nh2，丙氨?；胏(＝o)ch(nh2)ch3，纈氨?；胏＝och(nh2)ch(ch3)2，亮氨?；胏(＝o)ch(nh2)(ch2)3ch3，異亮氨?；胏(＝o)ch(nh2)ch(ch3)(ch2ch3)，以及正亮氨?；胏(＝o)ch(nh2)(ch2)3ch3，等等。該定義不局限于天然存在的氨基酸。
當與碳原子連接時，本文使用的術(shù)語“(＝o)”形成羰基部分。應(yīng)注意，當原子的化合價允許時，一個原子只可以攜帶一個氧代基團。
術(shù)語“單磷酸酯、二磷酸酯和三磷酸酯”是指基團∶
如本文所使用，定義中使用的任何分子部分上的基團位置可以在該部分的任何位置上，只要它是化學(xué)上穩(wěn)定的即可。當任何變量在任何部分中出現(xiàn)不止一次時，每個定義是獨立的。
術(shù)語“溶劑化物”包括式(i)化合物以及其鹽能夠形成的任何藥學(xué)上可接受的溶劑化物。這種溶劑化物是，例如，水合物、醇化物，例如，乙醇化物、丙醇化物，等等，尤其是水合物。
本文使用的術(shù)語“前體藥物”表示作為藥物前體物的化合物，當給予受試者時，它能夠通過代謝和/或化學(xué)過程而容易地在體內(nèi)轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚曰衔铩?/p>
本文使用的術(shù)語“靶向肝臟的前體藥物”表示主要在肝中代謝為它的活性物的前體藥物。
本文使用的術(shù)語“肝癌”旨在包括原發(fā)性和繼發(fā)性的肝癌，即分別指起源于肝的癌癥，以及其它器官的癌癥的肝轉(zhuǎn)移。
按照上面提供的定義和技術(shù)領(lǐng)域的通常用法來解釋相關(guān)術(shù)語。
通常，使用chemdrawultra12.0生成本申請所使用的化合物的名稱。另外，如果沒有例如，用粗線或虛線表示結(jié)構(gòu)或結(jié)構(gòu)的部分的立體化學(xué)，則將所述結(jié)構(gòu)或該結(jié)構(gòu)的部分解釋為包括它的所有立體異構(gòu)體。
一般合成方法
利用各種方法，例如，下面所示和所描述的說明性的合成反應(yīng)路線中描述的方法，可以制備本發(fā)明的化合物。使用的起始原料和試劑可以從商品供應(yīng)商獲得，或可以按照參考文獻中列出的文獻方法，使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法來制備。
反應(yīng)路線1舉例說明了式(i)化合物的一般途徑。
反應(yīng)路線1
在惰性溶劑，如醚，例如，乙醚或thf，或鹵代烴，例如，二氯甲烷中，在堿，例如，n-甲基咪唑(nmi)，或格氏試劑，例如，叔丁基氯化鎂，等等的存在下，如上所述制備的可商購的曲沙他濱衍生物(1a)與所需要的氨基磷酸酯試劑(1b)縮合，其中，lg是合適的離去基團，例如，鹵素，例如，氯化物或活化的苯酚，例如，五氯苯酚、對硝基苯酚、五氟苯酚，等等，得到氨基磷酸酯衍生物(1c)。
從三氯氧磷(pocl3)起始，利用兩步反應(yīng)，可以制備上述反應(yīng)路線中所使用的氨基磷酸酯試劑(1b)，其中，lg是氯，即氨基磷酸酯氯化物(phosphoramidochloridate)，如反應(yīng)路線2所述。
反應(yīng)路線2
在惰性溶劑如et2o中，pocl3與所需要的醇r13oh縮合，提供二氯磷酸烷氧基酯或二氯磷酸芳氧基酯(2a)。隨后與氨基酸衍生物(2b)反應(yīng)，提供氨基磷酸酯氯化物，其中，r3是h(2c)。
如果需要的話，所獲得的氨基磷酸酯氯化物(2c)可以轉(zhuǎn)化為具有活化苯酚作為離去基團(例如，五氟苯酚或?qū)?no2-苯酚)的相應(yīng)的磷?；瘎?，一般如反應(yīng)路線3所述。
反應(yīng)路線3
通過在堿，例如，三乙胺或類似的堿的存在下，氯衍生物(2c)與所需要的活化苯酚的反應(yīng)，可以便利地進行這種轉(zhuǎn)化，由此提供磷?；瘎?3a)和(3b)。
技術(shù)人員了解上面反應(yīng)路線所使用的各個保護基(pg)，并且文獻中詳細地描述了它們的應(yīng)用和另外供選擇的方案，參見，例如，greenet.w.,wutsp.g.m.protectivegroupsinorganicsynthesis,2nded.newyork:wiley；1995。
本文使用的術(shù)語“n-保護基”或“n-保護的”是指保護氨基酸或肽的n端的那些基團，或在合成過程期間阻止氨基進行不希望有的反應(yīng)的那些基團。greene中公開了通常使用的n-保護基。n-保護基包括?；?，甲酰基、乙?；⒈；⑿挛祯；⑹宥』阴；?-氯乙?；?、2-溴乙酰基、三氟乙酰基、三氯乙酰基、鄰苯二甲酰基、鄰硝基苯氧基乙酰基、α-氯丁酰基、苯甲?；?-氯苯甲?；?、4-溴苯甲酰基、4-硝基苯甲酰基，等等；磺?；?，例如，苯磺?；妆交酋；鹊?；氨基甲酸酯形成基團，例如，芐氧羰基、對氯芐氧羰基、對甲氧基芐氧羰基、對硝基芐氧羰基、2-硝基芐氧羰基、對溴芐氧羰基、3,4-二甲氧基芐氧羰基、4-甲氧基芐氧羰基、2-硝基-4,5-二甲氧基芐氧羰基、3,4,5-三甲氧基芐氧羰基、1-(對聯(lián)苯基)-1-甲基乙氧羰基、α,α-二甲基-3,5-二甲氧基芐氧羰基、二苯甲氧羰基、叔丁氧羰基、二異丙基甲氧羰基、異丙氧羰基、乙氧羰基、甲氧羰基、烯丙氧基羰基、2,2,2-三氯乙氧羰基、苯氧羰基、4-硝基苯氧羰基、芴基-9-甲氧羰基、環(huán)戊基氧羰基、金剛烷基氧羰基、環(huán)己基氧羰基、苯基硫代羰基，等等；烷基，例如，芐基、三苯甲基、芐氧基甲基，等等；以及甲硅烷基，例如，三甲基甲硅烷基，等等。優(yōu)選的n-保護基包括甲?；?、乙酰基、苯甲酰基、新戊酰基、叔丁基乙酰基、苯磺酰基、芐基(bz)、叔丁氧羰基(boc)和芐氧羰基(cbz)。
在如上greene中，也詳細地綜述了羥基和/或羧基保護基，例如，甲基、取代的甲醚，例如，甲氧基甲基、甲基硫甲基、芐氧基甲基、叔丁氧基甲基、2-甲氧基乙氧基甲基，等等，甲硅烷基醚，例如，三甲基甲硅烷基(tms)、叔丁基二甲基甲硅烷基(tbdms)、三芐基甲硅烷基、三苯甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基、三異丙基甲硅烷基等等，取代的乙醚，例如，1-乙氧基甲基、1-甲基-1-甲氧基乙基、叔丁基、烯丙基、芐基、對甲氧苯甲基、二苯甲基、三苯甲基，等等，芳烷基，例如，三苯甲基，以及pixyl(9-羥基-9-苯基氧雜蒽衍生物，尤其是氯化物)。酯羥基保護基包括酯，例如，甲酸酯、芐基甲酸酯、氯乙酸酯、甲氧基乙酸酯、苯氧基乙酸酯、新戊酸酯、金剛烷酸酯、三甲基苯甲酸酯、苯甲酸酯，等等。碳酸酯羥基保護基包括甲基、乙烯基、烯丙基、肉桂基、芐基，等等。
實施方案的詳細描述
現(xiàn)在，用下列實施例說明本發(fā)明的各個實施方案和中間體。這些實施例是為了進一步說明本發(fā)明，對本發(fā)明的范圍沒有限制性。利用chemdrawultra軟件，cambridgesoft，12.0.2版生成化合物名稱。
除了以上定義之外，在上面的合成反應(yīng)路線和下面實施例中使用下列縮寫。如果沒有定義本文使用的縮寫，那么它具有其公認的含義。
bn∶芐基
bop-cl：雙(2-氧代-3-噁唑烷基)膦酰氯
dcc：二環(huán)己基碳二亞胺
dcm：二氯甲烷
diea∶二異丙基乙胺
dmap∶4-二甲基氨基吡啶
dmf∶n,n-二甲基甲酰胺
etoac：乙酸乙酯
et3n：三乙胺
etoh∶乙醇
et2o∶乙醚
lc∶液相色譜
hoac：乙酸
hplc∶高效液相色譜
mecn：乙腈
meoh：甲醇
nt：3-硝基-1,2,4-三唑
on：過夜
pg：保護基
ph∶苯基
rt∶室溫
test：雙(三乙氧基甲硅烷基)丙基-四硫化物
thf：四氫呋喃
tfa∶三氟乙酸
tfaa∶三氟乙酸酐
tips：三異丙基甲硅烷基
曲沙他濱的制備
步驟1)：((2,2-二甲氧基乙氧基)甲基)苯(tr-1)
在0℃下，向攪拌的2,2-二甲氧基乙醇(50g，0.471mol)的dmf(200ml)溶液中加入芐基溴(56.03ml，0.471mol)和naoh(20.7g，0.518mol)，并將該反應(yīng)混合物在室溫下攪拌16小時。反應(yīng)完畢后(tlc)，加入飽和氯化鈉水溶液(500ml)，并用dcm(1l)萃取該反應(yīng)混合物，干燥(na2so4)有機相，濃縮，將得到的粗品在60-120硅膠上用硅膠柱色譜純化，使用4-6％etoac/己烷洗脫，得到標題化合物(60g，60％)，為液體。
步驟2)：(5s)-5-((4s)-2-((芐氧基)甲基)-1,3-二氧戊環(huán)-4-基)-3,4-二羥基呋喃-2(5h)-酮(tr-2)
將l-抗壞血酸(44.9g，0.255mol)加入到化合物tr-1(60g，0.306mol)的無水乙腈(898ml)溶液中，隨后加入ptsa一水合物(15.5g，0.076mol)，并將該反應(yīng)混合物在90℃下加熱1小時。反應(yīng)完畢后(tlc)，蒸出一半體積的乙腈，并將該過程重復(fù)兩次。完全除去溶劑，獲得標題化合物的立體異構(gòu)體的混合物(91g)。該產(chǎn)物不用進一步純化，直接用于下一步。
步驟3)：(2r)-2-((4s)-2-((芐氧基)甲基)-1,3-二氧戊環(huán)-4-基)-2-羥基乙酸(tr-3)
在室溫下，將化合物tr-2(91.7g，0.297mol)加入到攪拌的k2co3(86.3g，0.625mol)的水(509ml)溶液中。慢慢地加入h2o2(80ml，0.71mol，30％v/v)，并將該溶液冷卻至0℃，隨后攪拌24小時。減壓除去溶劑，加入etoh(100ml)，并將該混合物在回流下加熱30分鐘，然后過濾。將etoh(100ml)加入到所得到的固體殘余物中，并將該混合物在回流下加熱30分鐘(兩次)。真空濃縮收集的濾液，得到標題化合物(90g)，為固體。
步驟4)：(2s,4s)-2-((芐氧基)甲基)-1,3-二氧戊環(huán)-4-甲酸(tr-4a)和(2r,4s)-2-((芐氧基)甲基)-1,3-二氧戊環(huán)-4-甲酸(tr-4b)
在30分鐘期間內(nèi)，將次氯酸鈉(650ml，0.881mol，9-10％的水溶液)逐滴加入到劇烈攪拌的化合物tr-3(90g，0.294mol)和rucl3.xh2o(1.22g，0.0058mol)的水溶液(ml，ph＝8，室溫)中。加入1mnaoh溶液，使ph值維持在8的水平上。將該反應(yīng)混合物在室溫下攪拌3小時，然后在35℃下加熱12小時。反應(yīng)完畢后(tlc)，在0℃下，將1.5nhcl加入到該反應(yīng)混合物中，直到達到ph6為止，然后加入etoac(1l)。用鹽水(2x100ml)洗滌有機相，干燥(na2so4)，過濾，并濃縮。將得到的粗品在230-400硅膠上用硅膠柱色譜純化，使用20％etoac/石油醚洗脫，得到化合物4a+4b的異構(gòu)體的混合物。然后，在硅膠230-400上用柱色譜分離該異構(gòu)體，使用0.9％meoh/dcm和0.1％acoh作為洗脫劑，得到2r異構(gòu)體(20g，28％)。
步驟5)：乙酸(2s)-2-((芐氧基)甲基)-1,3-二氧戊環(huán)-4-基酯(tr-5)
向化合物tr-4a(33g，0138mol)的乙腈(660ml)溶液中加入吡啶(13.2ml)和乙酸鉛(79.8g，0.180mol)，并將該混合物在室溫下攪拌16小時。反應(yīng)完畢后(tlc)，過濾該反應(yīng)混合物，濃縮濾液，并將殘余物加入到etoac(500ml)中，用水(100ml)和飽和氯化鈉水溶液(100ml)洗滌，用na2so4干燥。除去溶劑之后，在60-120硅膠上用柱色譜純化粗品，使用12-15％etoac/石油醚梯度洗脫，得到標題化合物(16g，47％)，為液體。
步驟6)：乙酸(2s)-2-(羥甲基)-1,3-二氧戊環(huán)-4-基酯(tr-6)
向攪拌的化合物tr-5(16g)的無水甲醇(160ml)溶液中加入pd/c(3.2g，20％w/w)，并將該反應(yīng)混合物氫化3小時。反應(yīng)完畢后(tlc)，通過硅藻土過濾該反應(yīng)混合物。減壓濃縮濾液，所得到的粗品標題化合物(10g，97％)直接用于下一步。
步驟7)：乙酸((2s)-4-乙酰氧基-1,3-二氧戊環(huán)-2-基)甲基酯(tr-7)
在0℃下，向攪拌的化合物tr-6(5.74g，0.0354mol)的吡啶(107ml)溶液中加入乙酸酐(8.22ml，0.080mol)，并將該反應(yīng)混合物在室溫下攪拌16小時。反應(yīng)完畢后(tlc)，將該反應(yīng)混合物用稀hcl(10ml)淬滅，并萃取到etoac(100ml)中。分離有機相，干燥(na2so4)，過濾，并濃縮。將得到的粗品在230-400硅膠上用柱色譜純化，使用10-15％etoac/石油醚的梯度洗脫，得到標題化合物(4.97g，68％)，為液體。
步驟8)：乙酸((2s,4s)-4-(4-(芐基氨基)-2-氧代嘧啶-1(2h)-基)-1,3-二氧戊環(huán)-2-基)甲基酯(tr-8a)
將n-苯甲?；奏?12.1g，56.3mmol)、硫酸銨(催化量)和六甲基二硅氮烷(hmds)(67.4ml，418mmol)的混合物回流1小時。在40℃下，減壓除去hmds，并將殘余物加入到無水1,2-二氯乙烷(57ml)中，加入化合物tr-7(5.7g，27.9mmol)的無水1,2-二氯乙烷(57ml)溶液，隨后滴加tmsotf(10.2ml，45.7mmol)。將該反應(yīng)混合物在室溫下攪拌1小時，然后，加入nahco3水溶液，并將該混合物攪拌30分鐘。通過硅藻土過濾所得到的固體，并將濾液加入到etoac(200ml)中，用水(50ml)洗滌，并干燥(na2so4)。減壓除去溶劑之后，將粗品在230-400硅膠上用柱色譜純化，使用10-15％etoac/石油醚的梯度洗脫，得到端基異構(gòu)體的混合物，通過sfc純化，進一步分離該混合物，得到標題化合物(3g，30％)，為白色固體。
步驟9)：4-氨基-1-((2s,4s)-2-(羥甲基)-1,3-二氧戊環(huán)-4-基)嘧啶-2(1h)-酮(tr-9)
將化合物tr-8a(3g)、飽和甲醇氨溶液(180ml)的混合物在室溫下、在密封管中攪拌16小時。反應(yīng)完畢后(tlc)，減壓除去溶劑，在230-400硅膠上用柱色譜純化粗品，用10-13％meoh/dcm的梯度進行洗脫，得到標題化合物(1.5g，85％)，為固體。
1hnmr400mhzdmso-d6δ:3.63-3.65(2h),4.04-4.07(2h),4.92-4.94(1h),5.18-5.21(1h),5.72-5.74(1h),6.16-6.18(1h),7.14(1h),7.26(1h),7.80-7.82(1h).
5-f-曲沙他濱的制備
步驟1)：苯甲酸((2s,4r)-4-(4-苯甲酰氨基-5-氟-2-氧代嘧啶-1(2h)-基)-1,3-二氧戊環(huán)-2-基)甲基酯(5-f-ta)和苯甲酸((2s,4s)-4-(4-苯甲酰氨基-5-氟-2-氧代嘧啶-1(2h)-基)-1,3-二氧戊環(huán)-2-基)甲基酯(5-f-tr-1b)
將5-氟苯甲酰基胞嘧啶(9.1g，39.5mmol)、硫酸銨(催化量)和六甲基二硅氮烷(140ml)的混合物回流14小時。在40℃下，減壓除去hmds，并將殘余物加入到無水1,2-二氯乙烷(50ml)中，加入化合物苯甲酸((2s)-4-乙酰氧基-1,3-二氧戊環(huán)-2-基)甲基酯(7g，26.30mmol)的無水1,2-二氯乙烷(50ml)溶液中，隨后滴加tms-otf(11.6g，52.6mmol)。將該反應(yīng)混合物在室溫下攪拌2小時，然后，將nahco3水溶液加入到該反應(yīng)混合物中，并將該混合物再攪拌30分鐘。通過硅藻土濾出所得到的固體，并將濾液加入到etoac(500ml)中，用水(50ml)洗滌，并干燥(na2so4)。減壓除去溶劑，在230-400硅膠上用柱色譜純化粗品，使用50-60％etoac/石油醚的梯度洗脫，得到純的標題化合物(1.7g，18％)，為固體。
步驟2)：4-氨基-5-氟-1-((2s,4s)-2-(羥甲基)-1,3-二氧戊環(huán)-4-基)嘧啶-2(1h)-酮(5-f-tr)
在密封管中，將化合物5-f-tr-1b(1.7g)、飽和的甲醇氨溶液(34ml)的混合物攪拌16小時，然后，減壓除去溶劑，并將粗品在230-400硅膠上用柱色譜純化，使用5％meoh/dcm的梯度洗脫，得到標題化合物(0.8g，68％)，為固體。
制備以下苯酚，并在本發(fā)明化合物的中間體的制備中使用∶
苯酚1
步驟a)：1-(3-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)苯基)乙酮(ph1-a)
將咪唑(4.46g，65.5mmol)加入到3-羥苯乙酮(4.46g，32.8mmol)的dmf(6ml)溶液中。5分鐘之后，加入tbdms-cl(4.69g，31.1mmol)的dmf(4ml)溶液。將該反應(yīng)混合物在室溫下攪拌90分鐘，然后倒入含有5％etoac(200ml)的己烷中，并用1mhcl(60ml)、水(60ml)、飽和碳酸氫鈉(2x60ml)、水(60ml)和鹽水(60ml)洗滌。用na2so4干燥有機層，過濾，濃縮，并將得到的殘余物通過硅膠快速色譜純化，用己烷/etoac洗脫，得到標題化合物(5.7g，69％)。
步驟b)：叔丁基二甲基(3-(丙-1-烯-2-基)苯氧基)硅烷(ph1-b)
在氮氣氛圍中，溴化甲基(三苯基鏻)(10.2g，28.4mmol)懸浮在無水thf(30ml)中，并將該懸浮液冷卻至0℃。將正丁基鋰(17.8ml，28.4mmol)滴加到該混合物中，并將得到的溶液在室溫下攪拌30分鐘。將ph1-a(5.7g，22.8mmol)加入到該混合物中，并使該反應(yīng)在室溫下進行60分鐘。用碳酸氫鈉水溶液淬滅該反應(yīng)，并用乙醚(50ml)萃取。將有機層用碳酸氫鈉溶液洗滌，干燥(na2so4)，過濾并濃縮。將得到的殘余物通過硅膠塞純化，用己烷洗脫，得到標題化合物(3.9g，69％)。
步驟c)：叔丁基二甲基(3-(1-甲基環(huán)丙基)苯氧基)硅烷(ph1-c)
在氮氣氛圍中，在10分鐘期間內(nèi)，將二乙基鋅/己烷(439.2mmol)滴加到冷卻(0℃)的烯烴ph1-b(3.9g，15.7mmol)的1,2-二氯乙烷(60ml)溶液中。滴加二碘甲烷(6.32ml，78.5mmol)，并將該得到的混合物在0℃下攪拌30分鐘，隨后達到室溫過夜。將該混合物倒入冰冷的氯化銨溶液中，并用乙醚萃取。將有機層用飽和碳酸氫鈉洗滌，干燥(na2so4)，過濾并濃縮。將粗品加入到己烷中，并棄去殘余的二碘甲烷。濃縮己烷層，粗品不用進一步純化，直接用于下一步。
步驟d)：3-(1-甲基環(huán)丙基)苯酚(苯酚1)
將ph1-c(3.45g，13.1mmol)加入到1m的四丁基氟化銨的thf溶液(20ml，20mmol)中，并將所得到的溶液在室溫下攪拌過夜。將該反應(yīng)用1mhcl(50ml)淬滅，并用乙酸乙酯(100ml)萃取。用鹽水(2x50ml)洗滌有機層，干燥(na2so4)，過濾并濃縮。通過硅膠快速色譜純化殘余物，用2-丙醇、etoac和己烷的混合物洗脫，得到標題化合物(0.56g，29％)。ms147.1[m-h]-。
苯酚2
使用制備苯酚1所描述的方法，由4-羥苯乙酮(6.0g，44.1mmol)制備標題化合物。收率∶53％。
苯酚3
步驟a)：1-(3-(芐氧基)苯基)環(huán)戊醇(ph3-a)
將用鎂升溫的碘加入到鎂屑(magnesiumtunings，1.29g，52.8mmol)的無水thf(50ml)懸浮液中。將該混合物回流，并加入大約5％的3-溴苯酚的溶液(13.9g，52.8mmol)。當反應(yīng)開始時，滴加入溴化物的溶液，然后，將該混合物再回流一小時。將該混合物冷卻至大約5℃，并滴加入環(huán)戊酮(4.44g，52.8mmol)的thf(50ml)溶液。將該混合物在室溫下攪拌72小時，然后，用冷的飽和氯化銨溶液淬滅該反應(yīng)，并用乙醚(x3)萃取。用鹽水洗滌有機相，干燥(na2so4)，過濾并濃縮。用硅膠色譜純化產(chǎn)物(異己烷/etoac)，得到標題化合物(8.5g，54％)。
步驟b)：1-(芐氧基)-3-(環(huán)戊-1-烯-1-基)苯(ph3-b)
將對甲苯磺酸加入到ph3-a(8.4g，28.2mmol)的苯(100ml)溶液中。將該混合物用dmf阱回流三個小時，然后冷卻至室溫，用乙醚稀釋，并用飽和碳酸氫鈉溶液和鹽水洗滌。干燥(na2so4)有機相，過濾并濃縮。用硅膠色譜純化產(chǎn)物(異己烷/etoac)，得到標題化合物(6.45g，91％)。ms249.4[m-h]-。
步驟c)：3-環(huán)戊基苯酚(苯酚3)
在parr中，在10％pd/碳(1.5g)的存在下，將ph3-b(6.4g，26mmol)的etoac(75ml)和etoh(75ml)溶液在22℃和40psi下氫化過夜。濾出催化劑，用etoac和etoh洗滌。減壓蒸發(fā)溶劑，并用硅膠色譜分離產(chǎn)物(異己烷/etoac)，得到標題化合物(3.6g，82％)。ms161.2[m-h]-。
苯酚4
步驟a)：叔丁基(3-環(huán)丙基苯氧基)二甲基硅烷(ph4-a)
將(3-溴苯氧基)(叔丁基)二甲基硅烷(5.46g，19mmol)、環(huán)丙基硼酸(2.12g，24.7mmol)、正磷酸鉀(14.1g，66.5mmol)、三環(huán)己基膦(0.53g，1.9mmol)和pd(oac)2(0.21g，0.95mmol)的甲苯(80ml)和水(4ml)懸浮液在110℃下攪拌過夜。用乙醚稀釋該漿液，并用水和鹽水洗滌。干燥(mgso4)有機相，過濾并濃縮。用快速柱色譜純化粗品(etoac/己烷)，得到標題化合物(1.94g，41％)。
步驟b)：3-環(huán)丙基苯酚(苯酚4)
將1m四丁基氟化銨(10.1ml，10.1mmol)加入到ph4-a(1,94g，7,81mmol)的thf(25ml)溶液中。將該溶液攪拌2小時，然后蒸發(fā)溶劑，將殘余物溶于etoac中，并用濃nh4cl(aq)洗滌兩次，用鹽水洗滌一次。干燥(mgso4)有機相，過濾并濃縮。用快速柱色譜純化粗品(己烷/乙酸乙酯，9:1，含有1％異丙醇)，得到稍微不純的標題化合物(1.24g，119％)。
苯酚5
步驟a)：2-(4-溴苯氧基)四氫-2h-吡喃(ph5-a)
將4-溴苯酚(3.75g，21.7mmol)溶于3,4-二氫-2h-吡喃(16ml，175mmol)中，加入催化量的對甲苯磺酸(15mg，0.09mmol)，并將該混合物在22℃下攪拌45分鐘。將該混合物用乙醚稀釋，用1mnaoh(aq，x2)、水洗滌，干燥(na2so4)，濃縮，得到標題化合物(5.57g，99％)。
步驟b)：2-(4-環(huán)丙基苯氧基)四氫-2h-吡喃(ph5-b)
在15分鐘期間內(nèi)，將0.5m環(huán)丙基溴化鎂的thf(6.5ml，3.25mmol)溶液加入到ph5-a(552.5mg，2,15mmol)、znbr(144mg，0.64mmol)、三叔丁基膦四氟硼酸鹽(35.6mg，0.12mmol)和pd(oac)2(29.5mg，0.13mmol)的thf(4ml)溶液中。將該混合物在22℃下攪拌90分鐘，然后在冰浴上冷卻，并加入冰水(10ml)。用etoac萃取該混合物三次，并將萃取物用鹽水洗滌，隨后干燥(na2so4)，過濾，濃縮。用硅膠柱色譜純化殘余物(石油醚/etoac)，得到標題化合物(292mg，62％)。
步驟c)：4-環(huán)丙基苯酚(苯酚5)
將對甲苯磺酸一水合物(18.9mg，0.1mmol)加入到ph5-b(2.28g，10.45mmol)的meoh(15ml)溶液中。將該混合物在120℃下、在微波反應(yīng)器中加熱5分鐘，然后濃縮，用硅膠柱色譜純化(石油醚/etoac)。將得到的固體用石油醚結(jié)晶，得到標題化合物(1.08g，77％)。
苯酚6
步驟a)：1-(3-甲氧基苯基)環(huán)丁醇(ph6-a)
在0和10℃之間，將1m3-甲氧基苯基溴化鎂的thf溶液(2.11g，99.8mmol)逐滴加入到攪拌的環(huán)丁酮(6.66g，95mmol)的乙醚(65ml)溶液中。在0-10℃下，將該混合物攪拌三個小時，然后，將該混合物加入到冰冷的飽和nh4cl(300ml)和水(300ml)溶液中。將該混合物攪拌10分鐘，然后，用乙醚萃取三次。干燥有機相(na2so4)，過濾，并濃縮。將得到的粗品用硅膠色譜純化(異己烷/etoac)，得到標題化合物(16.9g，86％)。
步驟b)：1-環(huán)丁基-3-甲氧基苯(ph6-b)
將10％pd/碳(2.5g)加入到ph6-a(15.4g，86.1mmol)的乙醇(200ml)溶液中，并將該混合物在60psi下、在parr中氫化。18小時之后，再加入10％pd/碳(1.5g)，并將該混合物在60psi下進一步氫化18小時。濾出催化劑并用etoh和etoac洗滌。減壓濃縮該溶液，并將粗品用硅膠色譜分離(異己烷/etoac)，得到標題化合物(14.0g，77％)。
步驟c)：3-環(huán)丁基苯酚(苯酚6)
在0℃下，將1m三溴化硼(18.1g，72.2mmol)的dcm溶液逐滴加入到ph6-b(10.6g，65.6mmol)的無水dcm(65ml)溶液中。將該混合物在-5℃下攪拌2.5小時，然后用冷的飽和nh4cl溶液淬滅該反應(yīng)，并用dcm萃取三次。干燥(na2so4)有機相，過濾并濃縮。將得到的粗品用硅膠色譜純化(異己烷/etoac)，得到標題化合物(9.73g，88％)。
苯酚7
步驟a)：1-(4-(芐氧基)苯基)環(huán)丁醇(ph7-a)
在≈1小時期間內(nèi)，在回流下，將1-(芐氧基)-4-溴苯(2.63g，100mmol)的乙醚∶thf(1∶1，100ml)溶液逐滴加入到鎂屑(2.43g)和痕量碘的乙醚(50ml)懸浮液中。當加入完成時，將該混合物回流四小時，然后冷卻到≈0℃。加入無水thf(50ml)，隨后緩慢的加入環(huán)丁酮(7.01g，100mmol)的乙醚(50ml)溶液，并使該混合物達到室溫。攪拌兩個小時之后，加入冷的飽和nh4cl溶液(500ml)，并將該混合物攪拌15分鐘，然后用etoac萃取兩次。將有機相用鹽水洗滌，用硫酸鈉干燥，并減壓蒸發(fā)。用硅膠柱色譜純化產(chǎn)物，得到標題化合物(12.5g，42％)。
步驟b)：4-環(huán)丁基苯酚(苯酚7)
在氬氣氛圍中，將10％pd/碳(2.55g，21.5mmol)加入到ph7-a(12.4g，41.4mmol)的絕對etoh(110ml)溶液中，并將該混合物在45psi下、在室溫下氫化18小時。濾出催化劑，用乙醇洗滌，并濃縮該溶液。用硅膠色譜純化產(chǎn)物(異己烷-etoac)。將合適的級分合并，濃縮，并將殘余物用石油醚結(jié)晶，得到標題化合物(3.15g，51％)。
苯酚8
4-(1-甲基環(huán)戊基)苯酚(苯酚8)
在30分鐘期間內(nèi)，將1-甲基環(huán)戊醇(2.00g，20.0mmol)和苯酚(2.07g，22.0mmol)的戊烷(50ml)溶液逐滴加入到新的alcl3(1.33g，10mmol)的戊烷(100ml)懸浮液。將得到的混合物在氮氣氛圍中、在室溫下攪拌72小時，然后，將該反應(yīng)混合物倒入水/冰和hcl(12m，20mmol，1.66ml)中。用水(50ml)和鹽水(50ml)洗滌有機相，干燥(na2so4)，過濾，并濃縮。用硅膠柱色譜純化粗品(meoh-dcm)，得到標題化合物(426mg，12％)。
苯酚9
步驟a)：2-(4-溴-3-甲基苯氧基)四氫-2h-吡喃(ph9-a)
將pts(16mg，0.086mmol)加入到4-溴-3-甲酚(4.0g，21.4mmol)的3,4-二氫-2-h-吡喃(16ml，175mmol)溶液中。將該反應(yīng)混合物在室溫下攪拌1小時，然后，用乙醚稀釋，并用1mnaoh(aq)和水洗滌。干燥(na2so4)有機相，過濾并濃縮。用硅膠柱色譜純化粗品(etoac/庚烷)，得到標題化合物(3.32g，57％)。
步驟b)：2-(4-環(huán)丙基-3-甲基苯氧基)四氫-2h-吡喃(ph9-b)
將ph9-a(3.12g，11.5mmol)、znbr2(2.59g，11.5mmol)、三叔丁基膦四氟硼酸鹽(0.2g，0.69mmol)和pd(oac)2(258mg，1.15mmol)放入燒瓶中，并將該燒瓶用氮氣吹掃幾次。加入thf(10ml)，同時攪拌，隨后在5分鐘期間內(nèi)，逐滴加入0.5m環(huán)丙基溴化鎂/thf(35ml，17.4mmol)。將該混合物在室溫下攪拌，然后通過硅藻土塞過濾，并用meoh洗脫。濃縮該溶液，用硅膠柱色譜純化粗品(etoac/庚烷)，得到標題化合物(1.69g，57％)。
步驟c)：4-環(huán)丙基-3-甲酚(苯酚9)
將ph9-b(1.70g，7.30mmol)溶于meoh(20ml)中，并加入ptsxh2o(318mg，1.67mmol)。將該混合物在22℃下攪拌30分鐘，然后濃縮。用柱色譜純化粗品(etoac/庚烷)，得到標題化合物(704mg，65％)。
苯酚10
步驟a)：4-環(huán)丙基-1-甲氧基-2-甲基苯(ph10-a)
按照ph9的步驟b所描述的方法，使4-溴-1-甲氧基-2-甲基苯(4.39g，21.9mmol)與環(huán)丙基溴化鎂反應(yīng)，得到標題化合物(1.54g，43％)。
步驟b)：4-環(huán)丙基-2-甲酚(苯酚10)
在氮氣氛圍中，在0℃下，將bbr3(5ml，5mmol)加入到ph10-a(1.54g，9.49mmol)的dcm(7.5ml)溶液中。將該反應(yīng)攪拌2小時，然后用meoh(3ml)淬滅，并濃縮。將粗品溶于etoac中，并用鹽水洗滌。干燥(na2so4)有機相，過濾并濃縮。用硅膠柱色譜純化粗品，得到標題化合物(826mg，59％)。ms147.11[m-h]-。
苯酚11
4-環(huán)丙基-3-甲氧基苯酚(苯酚11)
按照苯酚9的制備中所描述的方法，由4-溴-3-甲氧基苯酚(1.11g，5.49mmol)制備標題化合物。收率∶40％。
苯酚12
步驟a)：3-(二甲基氨基)-1-(3-羥基苯基)丙-1-酮(ph12-a)
將幾滴hcl加入到3-乙酰苯酚(4.08g，30mmol)、多聚甲醛(4.05g，45mmol)和鹽酸二甲胺(2.69g，33mmol)的絕對etoh(100ml)溶液中，并將該反應(yīng)混合物回流18小時。再加入鹽酸二甲胺(0.55eq，1.22g)、多聚甲醛(0.5eq，1.35g)和hcl(0.5ml)，并將該反應(yīng)混合物再回流4小時，然后冷卻至室溫。收集沉淀的白色固體，用冷的etoh(50ml)和冷的丙酮(10ml)洗滌，隨后冷凍干燥，得到標題化合物(2.59g，38％)，其不經(jīng)進一步純化，可在下一步直接使用。
步驟b)：環(huán)丙基(3-羥基苯基)甲酮(苯酚12)
在室溫下，將nah(60％礦物油分散體)(1.13g，28.2mmol)分批加入到攪拌的三甲基碘化亞砜(6.20g，28.2mmol)的dmso(100ml)懸浮液中。1小時之后，在攪拌和冷卻下，分批加入固體ph12-a(2.59g，11.3mmol)。將該反應(yīng)混合物在室溫下攪拌40小時，然后倒入冷水(200ml)中，并用dcm(3x100ml)萃取。用飽和nh4cl水溶液(2x100ml)洗滌有機相，干燥(na2so4)，過濾并濃縮。用硅膠柱色譜純化所得到的粗品(meoh/dcm)，得到標題化合物(883mg，48％)。
苯酚13
步驟a)：環(huán)丙基(4-羥基苯基)甲酮(ph13)
在大約30分鐘期間內(nèi)，將對羥基-γ-氯苯丁酮(4.95g)分為幾部分加入到naoh溶液(8ml，水溶液，50％w/w)中，然后加入naoh(35ml，水溶液，25％w/w)，隨后一批加入對羥基-γ-氯苯丁酮(4.95g)。將溫度降低至140℃，并加入naoh(8g)。90分鐘之后，加入水(10ml)，再經(jīng)過60分鐘之后，將該反應(yīng)混合物冷卻，用水稀釋，用hoac(≈27-30ml)中和至ph≈7。過濾所形成的沉淀，用水洗滌，并真空干燥。在40℃下，將固體在chcl3(200ml)中研磨10分鐘，然后在室溫下過夜。在30分鐘期間內(nèi)，將該漿液加熱至40℃，然后過濾。干燥(mgso4)濾液，過濾并濃縮至≈70ml。加入己烷，形成油，其最終變成晶體。過濾該漿液，用chcl3/己烷洗滌固體，并干燥，得到標題化合物(4.15g，51％)。
苯酚14
步驟a)：3-(1-羥基-2,2-二甲丙基)苯酚(ph14-a)
在30分鐘期間內(nèi)，將t.bu-mgbr(1.5eq)逐滴加入到冷的(-10℃)3-羥基苯甲醛(2.00g，16.4mmol)在乙醚(20ml)中的混合物中。在加入期間，加入thf(20ml)。使該混合物達到23℃，并攪拌6小時。加入更多的t.bu-mgbr(0.7eq)，并將該混合物攪拌過夜，然后冷卻，并用飽和nh4cl水溶液淬滅該反應(yīng)。將etoac加入到該混合物中，隨后加入1mhcl水溶液，直到獲得均勻混合物為止。分離各相，用鹽水洗滌有機相，干燥(na2so4)，過濾并濃縮。用柱色譜純化所得到的粗品，得到標題化合物(1.1g，37％)。
步驟b)：1-(3-羥基苯基)-2,2-二甲基丙-1-酮(ph14)
向烘干的圓底燒瓶中加入
苯酚15
1-(4-羥基苯基)-2,2-二甲基丙-1-酮(ph15)
按照苯酚14的制備中所描述的方法，使4-羥基苯甲醛(3g，24.6mmol)反應(yīng)，得到標題化合物(538mg，17％)。
氨基酸1
步驟a)：(s)-(s)-2-((叔丁氧羰基)氨基)丙酸仲丁酯(aa1-a)
將l-boc-丙氨酸(2.18g，11.5mmol)溶于無水dcm(40ml)中，并加入醇(r)-丁-2-醇(938mg，12.6mmol)。將該混合物冷卻至大約5℃，并一批加入edc(3.31g，17.2mmol)，隨后分批加入dmap(140mg，1.15mmol)。使該混合物達到室溫，并攪拌過夜，然后用乙酸乙酯(～300ml)稀釋，并將有機相用飽和碳酸氫鈉溶液洗滌三次，用鹽水洗滌一次。用硫酸鈉干燥有機相，并減壓濃縮。用硅膠色譜分離產(chǎn)物，用異己烷和10％乙酸乙酯洗脫，得到標題化合物(2.78g，98％)。
步驟b)：(s)-(s)-2-氨基丙酸仲丁酯(aa1-b)
在65℃下，將aa1-a(2.77g，11.3mmol)和對甲苯磺酸一水合物(2.15g，11.3mmol)在etoac(45ml)中的混合物攪拌16小時，然后減壓濃縮。將得到的殘余物用乙醚結(jié)晶，得到標題化合物(3.20g，89％)。
氨基酸2
(s)-(r)-2-氨基丙酸(戊-2-基)酯(aa2)
按照aa1的制備中所描述的方法，但使用(r)-戊-2-醇來代替(r)-丁-2-醇，得到標題化合物(4.6g)。
氨基酸3
(s)-(s)-2-氨基丙酸(戊-2-基)酯(aa3)
按照aa1的制備中所描述的方法，使用(s)-戊-2-醇來代替(r)-丁-2-醇，得到標題化合物(8.3g)。
制備下列中間體，并且可以在本發(fā)明化合物的制備中使用∶
中間體1
步驟a)：(r)-2-((叔丁氧羰基)氨基)丙酸4-氟芐酯(i-1a)
將boc-l-alaoh(19.92mmol)、dmap(1.99mmol)和(4-氟苯基)甲醇(23.9mmol)溶于ch2cl2(100ml)中。向此溶液中加入三乙胺(23.9mmol)，隨后加入edcl(23.9mmol)，并將得到的反應(yīng)混合物在室溫下、在氮氣氛圍中攪拌過夜。將該反應(yīng)混合物用ch2cl2(100ml)稀釋，用飽和nahco3水溶液(2x50ml)、飽和nacl水溶液(2x50ml)洗滌，干燥(na2so4)并濃縮。將得到的殘余物用硅膠柱色譜純化，用正己烷-etoac(95:5至60:40)洗脫，得到標題化合物(4.44g)，為白色蠟狀固體。ms:296[m-h]-。
步驟b)：(r)-2-氨基丙酸4-氟芐酯(i-1b)
將化合物i-1a(14.93mmol)溶于4mhcl/二噁烷(40ml)中，在室溫下攪拌30分鐘，蒸干，得到標題化合物的鹽酸鹽(3.4g)，為白色粉末。ms:198[m+h]+。
步驟c)：(2r)-2-((氯(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸4-氟芐酯(i-1)
在-78℃下，將phopocl2(4.28mmol)逐滴加入到化合物i-5b(4.28mmol)的ch2cl2溶液中，隨后逐滴加入三乙胺(8.56mmol)。將得到的反應(yīng)混合物在-78℃下、在ar氛圍中攪拌，并達到室溫過夜。在硅膠上蒸發(fā)該反應(yīng)混合物，并通過色譜純化(正己烷/etoac(88:12)-(0:100))。得到標題化合物(769mg)。31p-nmr(cdci3)δ:7.85(s)和7.54(s)(rp和sp非對映異構(gòu)體)。
中間體2
步驟a)：(s)-(r)-2-((叔丁氧羰基)氨基)丙酸仲丁酯(i-2a)
將l-boc-丙氨酸(2.18g，11.5mmol)溶于無水dcm(40ml)中，并加入醇(r)-丁-2-醇(938mg，12.6mmol)。將該混合物冷卻至大約5℃，并一批加入edc(3.31g，17.2mmol)，隨后分批加入dmap(140mg，1.15mmol)。使該混合物達到室溫，并攪拌過夜，然后用乙酸乙酯(～300ml)稀釋，并將有機相用飽和碳酸氫鈉溶液洗滌三次，用鹽水洗滌一次。用硫酸鈉干燥有機相，并減壓濃縮。用硅膠色譜分離產(chǎn)物，用異己烷和10％乙酸乙酯洗脫，得到標題化合物(2.78g，98％)。
步驟b)：(s)-(r)-2-氨基丙酸仲丁酯(i-2b)
在65℃下，將i-10a(2.77g，11.3mmol)和對甲苯磺酸一水合物(2.15g，11.3mmol)在etoac(45ml)中的混合物攪拌16小時，然后減壓濃縮。將得到的殘余物用乙醚結(jié)晶，得到標題化合物(3.20g，89％)。
步驟c)：(2s)-(r)-2-(((4-硝基苯氧基)(苯氧基)磷?；?氨基)丙酸仲丁酯(i-2)
在氮氣氛圍中，在-30℃下，將二氯磷酸苯酯(1eq)加入到化合物i-10b(3.15g，9.92mmol)的dcm(75ml)溶液中，隨后逐滴加入三乙胺(2eq)。使該混合物達到室溫，并攪拌過夜，然后冷卻至大約5℃，加入固體4-硝基苯酚(1eq，15mmol)，隨后逐滴加入三乙胺(1eq，15mmol)，并將該混合物在室溫下攪拌4小時，然后減壓濃縮，用乙酸乙酯(40ml)和醚(40ml)稀釋，并在室溫下保持過夜。濾出三乙胺-hcl鹽，并將濾液減壓濃縮。將得到的殘余物用硅膠柱色譜純化，用異己烷-乙酸乙酯洗脫，得到標題化合物(4.19g，79％)。
按照i-2的制備中所描述的方法，使用合適的醇，制備下列化合物∶
中間體6，非對映異構(gòu)體-1&-2
利用sfc，分離化合物i-6的兩個非對映異構(gòu)體，得到i-6-dia-1和i-6-dia-2。
中間體7
步驟a)：(s)-2-氨基丙酸環(huán)辛酯(i-7a)
向l-丙氨酸(1.7g，19.1mmol)和環(huán)辛醇(25ml，191mmol)的甲苯(100ml)漿液中加入對甲苯磺酸一水合物(3.6g，19.1mmol)。將該反應(yīng)混合物在回流溫度下加熱25小時，并使用dean-stark分水器，從該反應(yīng)中除去水。減壓濃縮該混合物，并將殘余物在真空下保持過夜。向殘余物(27g)中加入乙醚(100ml)。過濾收集白色沉淀，用乙醚(3x50ml)洗滌，真空干燥，得到標題化合物(4.84g，68％)。
步驟b)：(2s)-2-(((4-硝基苯氧基)(苯氧基)磷?；?氨基)丙酸環(huán)辛酯(i-7)
按照i-2的步驟c的制備中所描述的方法，使化合物i-7a反應(yīng)，得到標題化合物(4.7g，76％)
中間體8
(2s)-2-(((4-硝基苯氧基)(苯氧基)磷?；?氨基)丙酸環(huán)庚酯(i-22)
按照化合物i-7的制備所描述的方法，但使用環(huán)庚醇(27ml，224mmol)來代替環(huán)辛醇，得到標題化合物(5.72g，55％)。
中間體9
(2s)-2-(((4-硝基苯氧基)(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸環(huán)己酯(i-23)
按照i-2的步驟c的制備所描述的方法，但使用(s)-2-氨基丙酸環(huán)己酯來代替(s)-2-氨基丙酸3,3-二甲基丁酯，得到標題化合物(10.6g，82％)。
中間體10
(s)-2-((雙(4-硝基苯氧基)磷?；?氨基)丙酸2-乙基丁酯(i-10)
將(s)-2-氨基丙酸-2-乙基丁酯(5g，14.49mmol)加入到雙(4-硝基苯基)氯磷酸酯(6.14g，17.1mmol)的dcm(50ml)溶液中，將該混合物在冰浴中冷卻，并逐滴加入et3n(4.77ml，34.2mmol)。15分鐘之后，除去冷卻，并將該反應(yīng)混合物在23℃下攪拌，直到根據(jù)tlc完成反應(yīng)為止。然后，加入乙醚，過濾該混合物，將濾液濃縮，并用硅膠柱色譜純化，得到標題化合物(2.05g，82％)。
中間體11
步驟a)：(s)-2-氨基丙酸異丙酯(i-11a)
在0℃下，將socl2(29ml，400mmol)逐滴加入到l-丙氨酸的hcl鹽(17.8g，200mmol)的異丙醇(700ml)懸浮液中。將該懸浮液在室溫下攪拌過夜，然后濃縮，得到標題化合物(29.2g，87％)。
步驟b)：(2s)-2-(((((s)-1-異丙氧基-1-氧代丙-2-基)氨基)(4-硝基苯氧基)磷酰基)-氨基)丙酸異丙酯(i-11)
在-60℃下，將二氯磷酸-4-硝基苯酯(1.8g，7mmol)的dcm溶液逐滴加入到胺i-11a(2.35g，14mmol)和三乙胺(7.7ml，56mmol)的dcm溶液中。使該反應(yīng)混合物達到室溫，攪拌過夜，濃縮，隨后用乙酸乙酯和醚稀釋，并在室溫下保持過夜。濾出三乙胺-hcl鹽，減壓濃縮濾液，將得到的殘余物用硅膠色譜純化，用異己烷-乙酸乙酯洗脫，得到標題化合物(1.6g，50％)。
中間體12
步驟a)：(s)-2-((叔丁氧羰基)氨基)丙酸新戊酯(i-12a)
在-5℃下，將edac和dmap分批加入到boc-丙氨酸(18.9g，100mmol)和新戊醇(13.0ml，120mmol)的dcm(200ml)溶液中。使該反應(yīng)混合物達到室溫，并攪拌72小時。加入etoac(700ml)，并將有機相用飽和nahco3溶液洗滌三次，用鹽水洗滌一次，然后濃縮。將得到的殘余物用柱色譜純化，用己烷-etoac(90/10至80/20)洗脫，得到標題化合物(21g，81％)。
步驟b)：(s)-2-氨基丙酸新戊酯(i-12b)
在-65℃下，將對甲苯磺酸(15.6g，82.0mmol)加入到boc保護的胺i-12a(21.1g，82.0mmol)的etoac(330ml)溶液中。將該反應(yīng)混合物在-65℃下攪拌8小時，然后使其達到室溫過夜。然后，過濾該混合物，濃縮，得到標題化合物(21g，78％)。
(2s)-2-(((((s)-1-(新戊基氧基)-1-氧代丙-2-基)氨基)(4-硝基苯氧基)-磷?；?氨基)丙酸新戊酯(i-12)
在1小時期間內(nèi)，在-50℃下，將4-硝基苯酚二氯磷酸酯逐滴加入到胺i-12b(3.90g，24.5mmol)的dcm(100ml)溶液中。使該反應(yīng)混合物達到室溫，攪拌過夜，濃縮，隨后用乙醚稀釋，并在室溫下保持過夜。過濾該混合物，減壓濃縮濾液，將得到的殘余物用硅膠色譜純化，用異己烷-乙酸乙酯洗脫，得到標題化合物(4.8g，77％)。
中間體32
(2s)-(r)-2-(((全氟苯氧基)(苯氧基)磷?；?氨基)丙酸仲丁酯(i-32)
在-70℃下，在氮氣氛圍中，在15分鐘期間內(nèi)，將et3n(10.9ml，78.1mmol)逐滴加入到攪拌的(s)-(r)-2-氨基丙酸仲丁酯的pts鹽(12.0g，37.7mmol)的dcm(50ml)溶液中。在1小時期間內(nèi)，向該混合物中加入二氯磷酸苯酯(5.61ml，37.7mmol)的dcm(50ml)溶液。將該反應(yīng)混合物在-70℃下再攪拌30分鐘，然后在2小時期間內(nèi)升溫至0℃，并攪拌1小時。在20分鐘期間內(nèi)，將五氟苯酚(6.94g，37.7mmol)和et3n(5.73ml，41.1mmol)的dcm(30ml)溶液加入到該混合物中。將該粗品混合物在0℃下攪拌18小時，然后濃縮。將殘余物加入到thf(100ml)中，濾出不溶性物質(zhì)，并用thf洗滌若干次。蒸發(fā)溶劑，并將殘余物與甲基叔丁基醚一起研磨。濾出不溶性物質(zhì)，并用甲基叔丁基醚洗滌。將合并的濾液濃縮，并將粗品固體用正己烷/etoac(80:20；100ml)超聲處理。濾出固體，用正己烷/etoac(80:20)洗滌，得到純的標題化合物的磷立體異構(gòu)體，為白色固體(2.3g，13％)。
中間體33
(2s)-2-(((全氟苯氧基)(苯氧基)磷?；?氨基)丙酸乙酯(i-33)
按照i-32所描述的方法，但從(s)-2-氨基丙酸乙酯的hcl鹽(11.0g，71.1mmol)起始，制備標題化合物的純的磷立體異構(gòu)體。收率：8.56g，27％。
中間體34
(2s)-2-(((全氟苯氧基)(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸2-乙基丁酯(i-34)
按照i-32所描述的方法，但從(s)-2-氨基丙酸2-乙基丁酯的pts鹽(18.8g，54.4mmol)起始，制備標題化合物的純的磷立體異構(gòu)體。收率：27.0g，99％。
lc-ms496.44[m+h]+。
中間體35
(2s)-2-(((全氟苯氧基)(苯氧基)磷?；?氨基)丙酸丁酯(i-35)
將二氯磷酸苯酯(12.4ml，83.1mmol)加入到冷的(-20℃)(s)-2-氨基丙酸丁酯(26.4g，83.1mmol)的二氯甲烷(200ml)漿液中。將該混合物攪拌10分鐘，然后在15分鐘期間逐滴加入et3n(25.5ml，183mmol)。將該混合物在-20℃下攪拌1小時，然后在0℃下攪拌30分鐘。將該混合物在冰浴中保持冷卻，加入全氟苯酚(15.3g，0.08mol)，隨后逐滴加入et3n(11.6ml，0.08mol)。將該混合物攪拌過夜，并慢慢地達到20℃。加入乙醚，并通過硅藻土過濾該混合物，濃縮，用硅膠柱色譜純化，用石油醚/etoac(9:1->8:2)洗脫。將合適的級分合并，濃縮，并用石油醚-etoac(9:1)結(jié)晶，得到純的標題化合物的磷立體異構(gòu)體，為白色固體(2.23g，5.8％)。
中間體36
步驟a)：l-丙氨酸異丙酯鹽酸鹽(i-36a)
在冷卻下，在-7至0℃下，在30分鐘期間內(nèi)，將亞硫酰二氯(80.2g，0.674mol,1.5eq)加入到2-丙醇(400ml)中，隨后在0℃下，加入l-丙氨酸(40.0g，0.449mol)。將流量指示器和具有27.65％的氫氧化鈉(228g)和水(225g)的混合物的洗滌器與出口相連接。將該反應(yīng)混合物在67℃下攪拌兩個小時，然后在70℃下攪拌一個小時，在20-25℃下攪拌過夜。利用60℃浴，將該反應(yīng)混合物在47-50℃下減壓(250-50mbar)蒸餾。當蒸餾變得非常緩慢時，將甲苯(100ml)加入到殘余油中，并利用60℃浴，繼續(xù)在48-51℃下減壓(150-50mbar)蒸餾，直到變得非常緩慢為止，將甲基叔丁基醚(tbme)(400ml)加入到殘余油中，并在有效的攪拌下，在34-35℃下，使該兩相系統(tǒng)析晶。當觀察到結(jié)晶時，將該混合物在一個小時期間內(nèi)冷卻至23℃，并過濾分離沉淀。用tbme(100ml)洗滌濾餅，不用加熱，減壓干燥至恒重，得到標題化合物(67.7g，90％)，為白色固體。
步驟b)：(s)-2-(((s)-(全氟苯氧基)(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸異丙酯(i-36)
在氮氣氛圍中，在0℃下，將二氯磷酸苯酯(62.88g，0.298mol，1.0eq)加入到l-丙氨酸異丙酯鹽酸鹽(50.0g，0.298mol)的dcm(310ml)溶液中，用dcm(39ml)洗滌，完成加入。將該混合物冷卻，并在冷卻下，在70分鐘期間內(nèi)加入三乙胺(63.35g，0.626mol，2.1eq)，保持溫度不高于-14℃，用dcm(39ml)洗滌，完成加入。將該混合物在-15至-20℃下攪拌一個小時，然后加熱到-8℃，在42分鐘期間內(nèi)，在冷卻下，加入五氟苯酚(60.38g，0.328mol，1.1eq)和三乙胺(33.19g，0.328mol，1.1eq)的dcm(78ml)溶液，保持溫度不高于0℃，用dcm(39ml)洗滌，完成加入。將該混合物在0℃下攪拌一個小時，隨后在+5℃下攪拌過夜。過濾取出形成的沉淀，用dcm(95ml)洗滌濾餅。將合并的濾液在5℃下用水(2x190ml)洗滌。在32-38℃下，減壓(650-600mbar)蒸餾有機相，繼續(xù)蒸餾，直到殘余體積大約170ml為止，獲得部分結(jié)晶的物質(zhì)。加入乙酸乙酯(385ml)，并將得到的透明溶液在43-45℃下減壓(300-250mbar)蒸餾。繼續(xù)蒸餾，直到獲得大約345ml的殘余體積為止。將該透明溶液冷卻至36℃，加入(s)-2-(((s)-(全氟苯氧基)(苯氧基)磷?；?氨基)丙酸異丙酯(20mg)的晶種(按照j.org.chem.，2011，76，8311-8319中描述的的方法制備)，誘導(dǎo)結(jié)晶。將該混合物在一個小時期間內(nèi)冷卻至27℃，然后在47分鐘期間內(nèi)加入正庚烷(770ml)，并將該混合物再攪拌37分鐘。加入三乙胺(6.03g，0.2eq)，并將該混合物在23-25℃下攪拌過夜。過濾分離沉淀。用乙酸乙酯∶正庚烷(1:9，80ml)洗滌濾餅，不用加熱，減壓(低于0.1mbar)干燥至恒重，得到標題化合物(75.64g，56％)，為白色結(jié)晶物質(zhì)。
1hnmr(cdcl3,300mhz)δ7.38-7.32(m,2h),7.27-7.24(m,2h),7.23-7.19(m,1h),5.10-4.98(m,1h),4.20-4.08(m,1h),4.03-3.96(m,1h),1.46(dd,7.2,0.6hz,3h),1.26-1.23(2xd,6h)；
13cnmr(cdcl3,100mhz)δ172.7(d,j＝8.8hz),150.4(d,j＝7.1hz),143.4-143.0(m),141.0-140.2(m),140.0-139.8(m),137.6-137.2(m),136.8-136.2(m),130.0(d,j＝0.82hz),125.8(d,j＝1.4hz),120.3(d,j＝5.0hz),69.8,50.6,(d,j＝1.9hz),21.8(d,j＝1.9hz),21.2(d,j＝4.4hz)；
標題化合物的結(jié)晶性能和nmr光譜數(shù)據(jù)與公開的數(shù)據(jù)(j.org.chem.，2011，76，8311-8319)一致，由此證明了標題化合物的磷原子的s立體化學(xué)。
中間體37
步驟a)：(s)-2-氨基丙酸環(huán)己酯(i-37a)
將乙酰氯(4.2ml，59.3mmol)滴加到攪拌的環(huán)己醇的溶液(50ml)中，隨后加入l-苯丙氨酸(4.0g，24.2mmol)。將該反應(yīng)混合物加熱至100℃，保持16小時，然后減壓濃縮，與乙醚/己烷(1:1)一起研磨，干燥，得到標題化合物(6g，88％)，為白色固體，不用進一步純化，直接在下一步中使用。
步驟b)：(s)-2-(((s)-(全氟苯氧基)(苯氧基)磷?；?氨基)丙酸環(huán)己酯(i-37)
在-70℃下，在30分鐘內(nèi)向攪拌的化合物i-37a(7.0g，24.6mmol)的無水dcm(42ml)溶液中逐滴加入三乙胺(7.17ml，51.5mmol)，隨后在1小時內(nèi)加入二氯磷酸苯酯(5.15g，34.5mmol)的無水dcm(21ml)溶液。將該反應(yīng)混合物在-70℃下再攪拌30分鐘，然后在2小時內(nèi)升溫至0℃，并攪拌1小時。在1小時內(nèi)向該混合物中加入五氟苯酚(4.94g，26.8mmol)和三乙胺(3.74ml，26.8mmol)的無水dcm(28ml)溶液。將該混合物在0℃下攪拌4小時，然后在5℃下保持16小時。過濾反應(yīng)混合物，并將濾液減壓濃縮。將粗品固體溶于etoac(300ml)中，用水(50ml)洗滌，干燥，并減壓除去溶劑。將獲得的固體與20％etoac/己烷一起研磨，過濾，用己烷洗滌，干燥，得到標題化合物的單一非對映異構(gòu)體(3.0g，21％)，為固體。
中間體38
(2s)-2-(((4-硝基苯氧基)(苯氧基)磷?；?氨基)丙酸異丙酯(i-38)
在-78℃下，在30分鐘期間內(nèi)，向攪拌的二氯磷酸-4-硝基苯酯(5g，19.8mmol)的無水dcm(40ml)溶液中加入苯酚(1.86g，19.8mmol)和三乙胺(3ml，21.8mmol)的無水dcm(50ml)溶液。將該混合物在此溫度下攪拌60分鐘，然后在-5℃下，在15分鐘期間內(nèi)，轉(zhuǎn)移到含有化合物(s)-2-氨基丙酸異丙酯(3.3g，19.8mmol)的無水dcm(40ml)溶液的另一個燒瓶中。在-5℃下，在20分鐘期間內(nèi)，向該混合物中加入第二批tea(6ml，43.3mmol)。將該混合物在0℃下攪拌3小時，然后減壓除去溶劑。將殘余物加入到etoac(200ml)中，用水(50ml)洗滌，用na2so4干燥，減壓除去溶劑，得到油狀粗品，用柱色譜純化，使用0-20％etoac/己烷梯度和230-400目硅膠，得到比例為約1:1的非對映異構(gòu)體的混合物。利用sfc分離兩個非對映異構(gòu)體，得到標題化合物，異構(gòu)體1(1.5g，20％)和異構(gòu)體2(1.5g，18％)，為固體。
按照中間體i-38的制備中所描述的方法，使用合適的氨基酸酯和苯酚，制備表1所列的化合物，并分離非對映異構(gòu)體。
表1
實施例1
步驟a)：乙酸((2s,4s)-4-(2,4-二氧代-3,4-二氫嘧啶-1(2h)-基)-1,3-二氧戊環(huán)-2-基)甲基酯(1a)
在密封管中，將化合物tr-8(0.15g，0.41mmol)、1,2-二甲氧基乙烷(1.5ml)和水(0.96ml)的混合物在125℃下加熱48小時。反應(yīng)完畢后(tlc)，將該反應(yīng)混合物冷卻至室溫，并減壓除去溶劑。在230-400硅膠上用柱色譜純化粗品殘余物，使用3-7％的meoh/dcm的梯度，得到呈固體的化合物1a(0.08g，80％)和呈固體的化合物1b(0.02g)。
步驟b)：1-((2s,4s)-2-(羥甲基)-1,3-二氧戊環(huán)-4-基)嘧啶-2,4(1h,3h)-二酮(1b)
在密封管中，將nh3的meoh的飽和溶液(1.6ml)中的化合物1a(0.08g，0.31mmol)在室溫下攪拌4小時。反應(yīng)完畢后(tlc)，減壓除去溶劑，在60-120硅膠上用柱色譜純化殘余物，使用5-7％的meoh/dcm，得到標題化合物(0.06g，90％)，為固體。
步驟c)：(2s)-2-(((((2s,4s)-4-(2,4-二氧代-3,4-二氫嘧啶-1(2h)-基)-1,3-二氧戊環(huán)-2-基)甲氧基)(苯氧基)磷?；?氨基)丙酸異丙酯(1c)
在-5℃下，向攪拌的化合物1b(60mg，0.28mmol)的dmpu(0.6ml)溶液中滴加入叔丁基氯化鎂(0.57ml，0.98mmol，1.7m，在thf中)。將該混合物在-5℃下攪拌30分鐘，然后在室溫下攪拌30分鐘。在-5℃下，加入((全氟苯氧基)(苯氧基)磷?；?-l-丙氨酸異丙酯(0.25g，0.56mmol)的無水thf(2.5ml)溶液，并將該反應(yīng)混合物在室溫下攪拌8小時。反應(yīng)完畢后(tlc)，加入水(15ml)，并用etoac(30ml)萃取該混合物。用飽和氯化鈉水溶液(10ml)洗滌有機相，干燥(na2so4)，過濾并濃縮，將得到的粗品在230-400硅膠上用柱色譜純化，使用4-5％的meoh/dcm梯度，得到標題化合物(55mg，38％)，為固體。ms(es+)[484.0]+。
1hnmr(dmso-d6,400mhz)δ1.15-1.20(10h),3.73-3.75(1h),4.11-4.27(4h),4.84-4.90(1h),5.14(1h),5.51-5.53(1h),6.06-6.12(1h),6.26-6.27(1h),7.17-7.23(3h),7.36-7.40(2h),7.57-7.60(1h),11.37(1h)。
實施例2
(2s)-2-(((((2s,4s)-4-(4-氨基-2-氧代嘧啶-1(2h)-基)-1,3-二氧戊環(huán)-2-基)甲氧基)(苯氧基)磷?；?氨基)丙酸異丙酯(2)
按照實施例1的步驟c所描述的方法，使曲沙他濱(tr-9)(50mg，0.23mmol)與磷?；瘎﹊-36(0.26g，0.58mmol)反應(yīng)，得到標題化合物(30mg，26％)，為固體。ms(es+)483.34[m+h]+。
1hnmr(dmso-d6,400mhz)δ1.14-1.24(9h),3.32-3.38(1h),4.05-4.21(4h),4.84-4.26(1h),5.14(1h),5.68-5.70(1h),6.07-6.13(1h),6.23-6.25(1h),7.16-7.24(5h),7.34-7.39(2h),7.59-7.61(1h)。
實施例3
(2s)-2-(((((2s,4s)-4-(4-氨基-2-氧代嘧啶-1(2h)-基)-1,3-二氧戊環(huán)-2-基)甲氧基)(苯氧基)磷?；?氨基)丙酸異丙酯(3)
按照實施例1的步驟c所描述的方法，使曲沙他濱(50mg，0.23mmol)與磷酰化劑i-38(0.24g，0.58mmol)反應(yīng)，得到標題化合物(40mg，35％)，為固體。ms(apci)481.0[m-h]-。
1hnmr(dmso-d6,400mhz)δ1.14-1.20(9h),3.76-3.77(1h),4.10-4.18(2h),4.22-4.25(2h),4.84-4.87(1h),5.17-5.186(1h),5.69-5.70(1h),6.03-6.08(1h),6.24-6.26(1h),7.17-7.25(5h),7.36-7.40(2h),7.62-7.64(1h)。
實施例4
(2s)-2-(((((2s,4s)-4-(4-氨基-2-氧代嘧啶-1(2h)-基)-1,3-二氧戊環(huán)-2-基)甲氧基)(苯氧基)磷?；?氨基)丙酸異丙酯(4)
按照實施例1的步驟c所描述的方法，使曲沙他濱(50mg，0.23mmol)與磷?；瘎﹊-37(0.33g，0.58mmol)反應(yīng)，得到標題化合物(30mg，22％)，為固體。ms(apci)599.47[m+h]+。
按照實施例1的步驟c所描述的方法，使用合適的中間體i-#dia-1或i-#dia-2，制備表2所列的化合物的純的非對映異構(gòu)體。
表2
類似地，按照實施例1的步驟c所描述的方法，使用合適的中間體，制備表3所列的化合物的純的非對映異構(gòu)體。
表3
記錄了所有舉例說明的化合物的證明其結(jié)構(gòu)的nmr和ms數(shù)據(jù)。
實施例35
(2s)-2-(((((2s,4s)-4-(2-氧代-4-棕櫚酸酰胺基嘧啶-1(2h)-基)-1,3-二氧戊環(huán)-2-基)甲氧基)(苯氧基)磷?；?氨基)丙酸異丙酯(35dia-1和35dia-2)
按照wo2008/030373所描述的方法，用棕櫚酸酐?；衔?和3，得到標題化合物。
實施例36
(2s)-2-(((((2s,4s)-4-(2-氧代-4-棕櫚酸酰胺基嘧啶-1(2h)-基)-1,3-二氧戊環(huán)-2-基)甲氧基)(苯氧基)磷?；?氨基)丙酸甲酯(36)
按照wo2008/030373所描述的方法，用棕櫚酸酐?；衔?7dia-2，得到標題化合物。
對比例
步驟a)：(2s)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲基)氨基)-n-(2-氧代-1,3,2-氧雜硫雜磷雜環(huán)戊烷-2-基)丙酰胺
在氮氣氛圍中，向冰冷的(s)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲基)氨基)丙酰胺(1.40g，3.58mmol)和三乙胺(0.60ml，4.30mol)的二氯甲烷(8ml)溶液中逐滴加入2-氯-1,3,2-氧雜硫雜磷雜環(huán)戊烷(0.542g，3.80mmol)的溶液。使該反應(yīng)達到室溫，并攪拌過周末。將該溶液冷卻至0℃，并慢慢地加入(叔丁基過氧)三甲硅烷(1.16g，7.17mmol)的庚烷溶液。將該反應(yīng)混合物攪拌90分鐘，然后真空濃縮。將殘余物懸浮在乙酸乙酯(10ml)中，過濾除去鹽酸鹽，并真空除去溶劑。將殘余物溶于無水乙腈(10ml)中，所得到的溶液不用進一步純化，可在下面的步驟中直接使用。假定得到定量的產(chǎn)率，和基于31p-nmr的80％純度。
步驟b)：((s)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲基)氨基)丙?；?氨基磷酸((2s,4s)-4-(4-氨基-2-氧代嘧啶-1(2h)-基)-1,3-二氧戊環(huán)-2-基)甲基氫酯
在氮氣氛圍中，將dmap(229mg，1.88mmol)加入到化合物tr-9(100mg，0.469mmol)的無水吡啶(5ml)溶液中，隨后緩慢的加入(2s)-2-((雙(4-甲氧基苯基)(苯基)甲基)氨基)-n-(2-氧代-1,3,2-氧雜硫雜磷雜環(huán)戊烷基)丙酰胺(361mg，0.563mmol)的無水乙腈(2ml)溶液。將得到的溶液在室溫下、在氮氣氛圍中攪拌46小時，然后濃縮。在gemini-nx5mc18(100x30mm)上用制備hplc純化殘余物，使用20％b至80％b的梯度，經(jīng)過17分鐘，流速35ml/min。溶劑a∶95％水，5％乙腈(10mm，在乙酸銨中)；溶劑b∶10％水，90％乙腈(10mm，在乙酸銨中)。將含有產(chǎn)物的級分合并，冷凍干燥，得到標題化合物(80mg，26％)。ms(es+)664.26[m+h]+。
步驟c)：((s)-2-氨基丙酰基)氨基磷酸((2s,4s)-4-(4-氨基-2-氧代嘧啶-1(2h)-基)-1,3-二氧戊環(huán)-2-基)甲基氫酯
將水(50ml)加入到前述步驟的化合物(80.5mg，0.121mmol)的二氯甲烷溶液中，隨后加入乙酸(500ml)。將該溶液在室溫下攪拌12分鐘，然后加入tfa(75ml)，并將得到的溶液在室溫下攪拌5分鐘，用甲苯(10ml)稀釋，濃縮至干，并真空干燥。將殘余物加入到含有10％乙腈的水(10ml)中，并用含有10％己烷的甲基叔丁基醚(2x10ml)洗滌。收集水層，冷凍干燥過夜，得到目標產(chǎn)物的雙-tfa鹽(80mg)，按照lc-ms的純度為～75％。利用制備hplc，在hypercarb(21.2x100mm，i＝271nm)上進一步純化所獲得的殘余物，使用0％至35％乙腈/水的梯度。將含有產(chǎn)物的級分合并，并冷凍干燥。ms(es+)364.10[m+h]+。利用1h和13cnmr來確定結(jié)構(gòu)。
所選擇的示例性化合物的nmr數(shù)據(jù)∶
化合物8dia-1
1hnmr(dmso-d6,400mhz)δ0.81-0.84(6h),1.20-1.22(11h),1.59(1h),3.82-3.97(3h),4.08-4.16(2h),4.22-4.23(2h),5.16(1h),5.67-5.69(1h),6.05-6.10(1h),6.23-6.24(1h),7.16-7.23(m,5h),7.34-7.38(m,2h),7.60-7.62(m,1h)。
化合物8dia-2
1hnmr(dmso-d6,400mhz)δ0.81-0.84(6h),1.22-1.27(11h),1.57(1h),3.81-3.89(2h),3.95-3.98(1h),4.05-4.07(1h),4.10-4.20(3h),5.128(1h),5.68-5.69(1h),6.13-6.14(1h),6.22-6.24(1h),7.16-7.21(5h),7.34-7.38(2h),7.58-7.60(1h)。
化合物9dia-1
31pnmr(dmso-d6)δ4.354。
1hnmr(dmso-d6,400mhz)δ1.24-1.26(3h),3.98-4.01(1h),4.12-4.14(2h),4.27-4.29(2h),5.00-5.08(2h),5.16-5.18(1h),5.64-5.66(2h),6.25-6.27(1h),6.34(1h),7.17-7.22(2h),7.31-7.33(5h),7.45-7.46(2h),7.55-7.59(2h),7.63-7.64(1h),7.74-7.77(1h),7.95-7.97(1h),8.08-8.11(1h)。
化合物9dia-2
31pnmr(dmso-d6)64.159。
1hnmr(dmso-d6,400mhz)δ1.25-1.26(3h),3.97-4.01(1h),4.08-4.16(2h),4.23-4.29(2h),5.04-5.16(3h),5.65-5.66(1h),6.26(1h),6.36-6.42(1h),7.17-7.24(2h),7.326(5h),7.41-7.49(2h),7.57-7.64(3h),7.74-7.76(1h),7.95-7.97(1h),8.10-8.12(1h)。
化合物11-dia-1
1hnmr(dmso-d6,400mhz)δ0.23(9h),0.78-0.82(3h),1.08-1.12(3h),1.20-1.22(3h),1.44-1.49(2h),3.77-3.79(1h),4.09-4.23(4h),4.67-4.72(1h),5.16-5.16(1h),5.69-5.70(1h),6.04-6.10(1h),6.23-6.25(1h),7.15-7.24(4h),7.48-7.50(2h),7.61-7.63(1h)。
化合物11dia-2
1hnmr(dmso-d6,400mhz)δ0.22-0.24(9h),0.78-0.82(3h),1.10-1.11(3h),1.22-1.24(3h),1.46-1.50(2h),4.05-4.07(1h),4.11-4.22(4h),4.70-4.71(1h),5.14(1h),5.69-5.71(1h),6.07-6.11(1h),6.23-6.25(1h),7.16-7.24(4h),7.49-7.51(2h),7.60-7.62(1h)。
對于靶向肝臟的前體藥物，重要的是，恰當?shù)靥幚砬绑w藥物。前體藥物應(yīng)該在小腸液中穩(wěn)定，在首過代謝過程中，在肝中被肝酶處理，形成單磷酸酯。然后，所形成的單磷酸酯在肝細胞中被細胞激酶合成代謝(anabolized)為活性的三磷酸酯。另外，抗癌癥藥物應(yīng)該對于增殖細胞具有毒性。例如，下面列出了評價化合物的這些性能的合適方法。
在人腸s9部分((his9)和人肝s9部分((hls9)中的穩(wěn)定性
在dmso中，制備每個試驗化合物的儲備溶液(10mm)，并在-20℃下儲存。在開始實驗之前，在50％乙腈/水中，將試驗化合物稀釋至500μμ。在50mm磷酸鉀緩沖液(ph7.4)中，制備反應(yīng)混合物，其含有5mmmgcl2、1mmnadph和5μμ試驗化合物，總體積250μl。加入人類肝或腸s9部分(0.4mg蛋白/ml的最終濃度，xenotech)，使反應(yīng)開始。在37℃，在定軌振蕩器上，培養(yǎng)該反應(yīng)混合物。在目標時間點(0、10、30和60分鐘)，獲取50μl的等分樣品，并通過與含有內(nèi)標的150μl乙腈混合，使反應(yīng)終止。利用500μμ溶液，通過在沸騰的人類s9(0.4mg蛋白/ml)、5mmmgcl2和50mm磷酸鉀緩沖液(ph7.4)中，將該溶液稀釋到5μμ的最終濃度，來制備每個試驗化合物的標準溶液。將標準品和樣品保持在冰上30分鐘，然后在3000g下、在10℃下離心20分鐘，然后，將10μl上清液與200μl的50％乙腈/水混合。將0.5μμ的每個試驗化合物(在50％乙腈/水中)注入到lc/ms-ms中，測定子離子、去簇電壓(declusteringpotential)(dp)、碰撞能量(ce)和碰撞室出口電壓(cxp)，以便形成lc/ms-ms方法。使用帶有qtrap5500系統(tǒng)的c18柱分離所述化合物。流動相由溶劑a(98％水、2％乙腈、0.1％乙酸或10mm乙酸銨)和溶劑b(80％乙腈、20％水、0.1％乙酸或10mm乙酸銨)組成。使用0％至100％的溶劑b的梯度，洗脫所述化合物。注射5μl的標準點和樣品，用qtrap5500分析。
基于每個時間點的峰面積，相對于設(shè)置為5μμ的標準物，測定母體化合物的數(shù)量。使用excel軟件，由試驗化合物的消失曲線，測定內(nèi)在清除率(clint)和半衰期(t1/2)。
細胞毒性試驗
在加入化合物之前24小時，接種細胞。將每個試驗化合物(從100μμ連續(xù)稀釋)加入到huh7(1.5x104個細胞/孔)或hepg2(1.5x104個細胞/孔)中，并在37℃下培養(yǎng)5天。只有培養(yǎng)基的對照物用于測定最小吸收值和未經(jīng)處理的細胞值。在生長期的最后，將polyscienceseuropegmbh的xtt染料加入到每個孔中。使用只有培養(yǎng)基的對照孔作為空白，利用sunrise(tecan)，讀出在450nm下的吸光度(參考波長600nm)。通過比較(與細胞對照物相比)抑制程度相對于化合物濃度繪圖，測定50％抑制值(cc50)。將稀釋系列的結(jié)果擬合成s形的劑量反應(yīng)曲線。
為了檢驗在人類腸s9部分(his9)和人類肝s9部分(hls9)中的穩(wěn)定性，以及在huh7、hep3b和hepg2細胞中的細胞毒性，在這些試驗中，評價本發(fā)明的化合物。表b1概括了這些結(jié)果。
表b1
na＝未獲得
三磷酸酯形成試驗
在該試驗中，一式三份地檢驗每個化合物。
使用在12孔板中接種的新的人類肝細胞(biopredic，france)。每個孔接種0.76x106個細胞，并在co2培養(yǎng)箱中，在37℃下，在1ml培養(yǎng)基中用10μμ化合物的dmso溶液(0.1％dmso)培養(yǎng)8小時。將生長在dmem(含有抗生素和10％胎牛血清)中的huh7細胞接種在12孔板中，2x105個細胞/孔。24小時之后，加入1ml的10μμ化合物(在培養(yǎng)基中)，并將細胞再培養(yǎng)6-8小時。
通過用1ml冰冷的hank's平衡溶液(ph7.2)洗滌每個孔兩次使培養(yǎng)終止，隨后加入0.5ml冰冷的70％甲醇。加入甲醇之后，立即利用細胞刮棒，使細胞層從孔底部脫離，并用自動吸管上下地吸取5-6次。將細胞懸液轉(zhuǎn)入玻璃瓶中，并在-20℃下儲存過夜。
然后，在10℃下，在14000rpm下，在eppendorf離心機5417r中，將樣品(每個樣品包含各個水平的前體藥物、游離核苷以及單、二和三磷酸酯)旋轉(zhuǎn)和離心10分鐘。利用插套(insert)，將上清液轉(zhuǎn)入2ml玻璃瓶中，并如下進行生物分析∶
將內(nèi)標(茚地那韋)加入到每個樣品中，并在兩個柱系統(tǒng)(與qtrap5000質(zhì)譜儀偶聯(lián))上分析所述樣品(注射體積10μl)。兩個柱系統(tǒng)由兩個二元泵x和y、兩個開關(guān)閥和自動進樣器組成。使用的兩個hplc柱是synergypolar-rp50*4.6mm，4μm顆粒，以及biobasicax50*2.1mm，5μm顆粒。lc流速是0.4-0.6ml/min(在重建條件的步驟中，使用更高的流速)。polar-rp柱的hplc流動相由10mmol/l乙酸銨/2％乙腈(流動相a)和10mmol/l乙酸銨/90％乙腈(流動相b)組成，biobasicax柱的hplc流動相由10mmol/l乙酸銨/2％乙腈(流動相c)和1％氫氧化銨/2％乙腈(流動相d)組成。泵y的hplc梯度起始于0％流動相b，并且保持2分鐘。在載樣階段，使流動相通過polar-rp和biobasicax柱，前體藥物、核苷和內(nèi)標保留在polar-rp柱上；而核苷(單、二和三磷酸酯)洗脫到biobasicax柱上，并保留在那里。
在下一步，將液流從polar-rp柱切換至ms，流動相c從泵x切換至biobasicax柱。用0％b至100％b的梯度，經(jīng)過大約兩分鐘，洗脫polar-rp柱上的化合物，并使用多反應(yīng)監(jiān)控模式(mrm)，利用陽性或陰性模式進行分析。在最后的步驟中，將biobasicax柱的液流切換至ms，用50％d的梯度，經(jīng)過大約7分鐘，洗脫磷酸酯，并使用mrm，利用陽性或陰性模式進行分析。在最后步驟期間，將兩個柱重建條件。
然后，通過與標準曲線(通過分析已知濃度的三磷酸酯的標準樣品來制備)對比，測定每個化合物的三磷酸酯濃度。在與試驗樣品相同的基質(zhì)中，操作標準樣品。由于肝細胞供體之間的磷酸化水平的變化，試驗的每個操作需要內(nèi)標化合物，以便能夠?qū)⒈舜瞬煌牟僮鞯慕Y(jié)果分級。
在整個說明書和后面的權(quán)利要求中，除非上下文另外需要，否則，單詞“包括”以及其變體，例如，“包含”和“含有”，意味著包括所表明的整數(shù)、步驟、整數(shù)組或步驟組，但不排除任何其它整數(shù)、步驟、整數(shù)組或步驟組。
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