發(fā)明領(lǐng)域
本發(fā)明涉及酶促水解木質(zhì)纖維素材料和發(fā)酵糖的方法。
發(fā)明背景
木質(zhì)纖維素材料主要由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素構(gòu)成，并且為產(chǎn)生化石燃料的替代能源提供了有吸引力的平臺。該材料可大量獲得，并可被轉(zhuǎn)化為有價值的產(chǎn)品，例如糖或生物燃料，諸如生物乙醇。
從木質(zhì)纖維素材料生產(chǎn)發(fā)酵產(chǎn)物是本領(lǐng)域已知的，其通常包括預(yù)處理、水解、發(fā)酵和任選的回收發(fā)酵產(chǎn)物的步驟。
在水解(其可包括液化、預(yù)糖化和/或糖化步驟)期間，木質(zhì)纖維素材料中存在的纖維素通過纖維素分解酶被部分(通常30-95％，依賴于酶活性和水解條件)轉(zhuǎn)化為還原糖。水解通常在45-50℃的升高的溫度和非無菌條件下在持續(xù)6-168小時的過程中進行(參見kumar，s.，chem.eng.technol.32(2009)，517-526)。
通常，然后通過微生物(例如，酵母)將糖轉(zhuǎn)化為有價值的發(fā)酵產(chǎn)物(例如，乙醇)。發(fā)酵在同一容器或不同容器中在單獨的(優(yōu)選厭氧的)方法步驟中進行。將發(fā)酵期間的溫度調(diào)節(jié)至30-33℃以適應(yīng)微生物(通常為酵母)的生長和乙醇生產(chǎn)。在該發(fā)酵過程期間，通過自水解步驟已存在的酶，剩余的纖維素材料被轉(zhuǎn)化為還原糖，同時產(chǎn)生微生物生物質(zhì)和乙醇。一旦纖維素材料被轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵糖并且所有可發(fā)酵糖被轉(zhuǎn)化為乙醇、二氧化碳和微生物生物質(zhì)，發(fā)酵完成。這可耗費長達6天。水解和發(fā)酵的總過程時間通?？蛇_到13天。
通常，酶生產(chǎn)成本是來自木質(zhì)纖維素材料的發(fā)酵產(chǎn)物的總生產(chǎn)過程中的主要成本因素(參見kumar，s.，chem.eng.technol.32(2009)，517-526)。迄今為止，通過應(yīng)用來自單一微生物來源或來自多種微生物來源(參見wo2008/008793)的具有更寬和/或更高(比)水解活性的酶產(chǎn)物來實現(xiàn)酶生產(chǎn)成本的降低。這導致更低的酶需求、更快的轉(zhuǎn)化速率和/或更高的轉(zhuǎn)化產(chǎn)率，和因此更低的總生產(chǎn)成本。
除了優(yōu)化酶之外，優(yōu)化工藝設(shè)計也是降低發(fā)酵產(chǎn)物生產(chǎn)總成本的重要手段。
出于經(jīng)濟原因，因此期望包括新穎、創(chuàng)新的工藝配置，所述工藝配置旨在降低涉及木質(zhì)纖維素材料的水解和發(fā)酵的方法中的總生產(chǎn)成本。
發(fā)明概述
本發(fā)明的一個目標是提供經(jīng)改進的由木質(zhì)纖維素材料制備糖產(chǎn)物和/或發(fā)酵產(chǎn)物的方法。另一目標是提供涉及水解的方法，其中水解的工藝條件被優(yōu)化。優(yōu)化存在于任何以下特征中。
本發(fā)明中進行的水解過程包括至少兩個步驟：進料步驟和糖化步驟。所述步驟可以在不同的容器中進行。進料步驟開始于將木質(zhì)纖維素材料加入其中存在酶組合物的容器中。因此，水解過程中使用的酶在進料步驟開始時便存在。在進料步驟期間，木質(zhì)纖維素材料通過酶被液化，并且釋放糖。向容器中添加木質(zhì)纖維素材料的速率由容器中存在的材料的粘度決定。因此，可以控制容器中材料的粘度。優(yōu)選地，在進料步驟期間，保持容器中的木質(zhì)纖維素材料為液體，因此其易于混溶(miscible)。這降低了能量成本，降低了混合強度，并因此導致總體上更有效的生產(chǎn)方法。
此外，該水解過程具有以下優(yōu)點：可以在進行進料步驟和/或糖化步驟的容器中在線(online)調(diào)節(jié)ph，并且不需要在將木質(zhì)纖維素材料添加到容器中之前調(diào)節(jié)其ph。
與進料步驟期間容器中存在的材料的粘度相比，糖化步驟期間的木質(zhì)纖維素材料的粘度基本不變。
在進料步驟和/或糖化步驟期間，可以將氧供應(yīng)到容器，例如到容器的頂部空間(headspace)。通過添加氧可獲得許多工藝優(yōu)勢，包括最佳溫度條件、減少的處理時間、減少的酶劑量、酶的重復使用、更高的產(chǎn)率以及其它過程優(yōu)化，從而導致成本降低。
由于可以控制木質(zhì)纖維素材料的添加速率，所以木質(zhì)纖維素材料的供應(yīng)可以與每種類型木質(zhì)纖維素材料的氧需求相平衡。
此外，通過允許木質(zhì)纖維素材料通過容器的富氧頂部空間，可以將氧直接供應(yīng)到木質(zhì)纖維素材料。因此，可不需要借助于例如氣泡或通過劇烈攪拌的額外通氣。這避免了起泡并且減少了攪拌和/或產(chǎn)生穿過容器中的材料的氣流所需的能量消耗。
此外，通過在進料步驟和糖化步驟期間使用不同的酶，可以進一步優(yōu)化水解過程。例如，在進料步驟期間可以使用包含至少兩種纖維素酶(例如內(nèi)切葡聚糖酶和/或溶解性多糖單加氧酶)的酶組合物，而在糖化期間可以使用包含至少兩種纖維素酶(例如纖維二糖水解酶和β-葡糖苷酶)的酶組合物。
在進料步驟期間，熱容易轉(zhuǎn)移到容器中存在的材料中，這是因為低粘度允許均勻混合并因此平均分配熱和溫度。這使得可以優(yōu)化和最小化用于加熱的功率輸入，并避免可使酶活性失活的局部溫度升高。
由于進料步驟和糖化步驟期間受控的低粘度水平，可以控制溶解氧水平而無需廣泛攪拌或混合。這使得可以優(yōu)化和最小化供氧的功率輸入，并避免可導致酶活性局部變化的溶解氧濃度的局部差異。由于對溶解氧的控制，可以限制由氧化引起的酶失活。
通過使用本發(fā)明的方法，可獲得許多工藝優(yōu)勢，包括最佳溫度條件、減少的處理時間、減少的酶劑量、酶的重復使用以及其它過程優(yōu)化，從而導致成本降低。有利地，本發(fā)明提供了這樣的方法，其中在改進的條件下進行水解步驟。本發(fā)明還提供了涉及處理時間減少的水解的方法。本發(fā)明還提供了簡單且穩(wěn)健的方法。
發(fā)明詳述
貫穿本說明書和所附權(quán)利要求書，詞語“包括”和“包含”及其變型均被解釋為包括性的。即，在上下文允許的情況下，這些詞語旨在傳達可包括未具體指出的其他要素或整體。在本文中不使用數(shù)量詞修飾時指代一個/種或多于一個/種的(即，一個/種或至少一個/種的)對象。舉例來說，“要素”可表示一個/種要素或多于一個/種的要素。
本發(fā)明涉及由木質(zhì)纖維素材料制備糖產(chǎn)物的方法，所述方法包括以下步驟：(a)任選地，預(yù)處理所述木質(zhì)纖維素材料；(b)任選地，清洗任選預(yù)處理的木質(zhì)纖維素材料；(c)將任選清洗和/或任選預(yù)處理的木質(zhì)纖維素材料補料分批加入第一容器中，所述第一容器包含含有至少兩種纖維素酶的酶組合物；(d)使用含有至少兩種纖維素酶的酶組合物酶促水解第一容器中任選清洗和/或任選預(yù)處理的木質(zhì)纖維素材料以液化所述木質(zhì)纖維素材料；(e)將液化的木質(zhì)纖維素材料加入第二容器中；(f)使用包含至少兩種纖維素酶的酶組合物酶促水解第二容器中液化的木質(zhì)纖維素材料以獲得糖產(chǎn)物；和(g)任選地，回收所述糖產(chǎn)物。
本發(fā)明還包括其中步驟(e)為任選的方法，即由木質(zhì)纖維素材料制備糖產(chǎn)物的方法，所述方法包括以下步驟：(a)任選地，預(yù)處理木質(zhì)纖維素材料；(b)任選地，清洗任選預(yù)處理的木質(zhì)纖維素材料；(c)將任選清洗和/或任選預(yù)處理的木質(zhì)纖維素材料補料分批加入第一容器中，所述第一容器包含含有至少兩種纖維素酶的酶組合物；(d)使用含有至少兩種纖維素酶的酶組合物酶促水解第一容器中任選清洗和/或任選預(yù)處理的木質(zhì)纖維素材料以液化所述木質(zhì)纖維素材料；(e)任選地，將液化的木質(zhì)纖維素材料加入第二容器中；(f)使用包含至少兩種纖維素酶的酶組合物酶促水解第一和/或第二容器中液化的木質(zhì)纖維素材料以獲得糖產(chǎn)物；和(g)任選地，回收所述糖產(chǎn)物。
本發(fā)明還涉及由木質(zhì)纖維素材料制備發(fā)酵產(chǎn)物的方法，所述方法包括以下步驟：(a)任選地，預(yù)處理木質(zhì)纖維素材料；(b)任選地，清洗任選預(yù)處理的木質(zhì)纖維素材料；(c)將任選清洗和/或任選預(yù)處理的木質(zhì)纖維素材料補料分批加入第一容器中，所述第一容器包含含有至少兩種纖維素酶的酶組合物；(d)使用含有至少兩種纖維素酶的酶組合物酶促水解第一容器中任選清洗和/或任選預(yù)處理的木質(zhì)纖維素材料以液化所述木質(zhì)纖維素材料；(e)將液化的木質(zhì)纖維素材料加入第二容器中；(f)使用包含至少兩種纖維素酶的酶組合物酶促水解第二容器中液化的木質(zhì)纖維素材料以獲得水解的木質(zhì)纖維素材料；(g)任選地，回收所述水解的木質(zhì)纖維素材料；(h)發(fā)酵所述水解的木質(zhì)纖維素材料以產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物；和(i)任選地，回收所述發(fā)酵產(chǎn)物。
本發(fā)明還包括其中步驟(e)任選的方法，即由木質(zhì)纖維素材料制備發(fā)酵產(chǎn)物的方法，所述方法包括以下步驟：(a)任選地，預(yù)處理木質(zhì)纖維素材料；(b)任選地，清洗任選預(yù)處理的木質(zhì)纖維素材料；(c)將任選清洗和/或任選預(yù)處理的木質(zhì)纖維素材料補料分批加入第一容器中，所述第一容器包含含有至少兩種纖維素酶的酶組合物；(d)使用含有至少兩種纖維素酶的酶組合物酶促水解第一容器中任選清洗和/或任選預(yù)處理的木質(zhì)纖維素材料以液化所述木質(zhì)纖維素材料；(e)任選地，將液化的木質(zhì)纖維素材料加入第二容器中；(f)使用包含至少兩種纖維素酶的酶組合物酶促水解第一和/或第二容器中液化的木質(zhì)纖維素材料以獲得水解的木質(zhì)纖維素材料；(g)任選地，回收所述水解的木質(zhì)纖維素材料；(h)發(fā)酵所述水解的木質(zhì)纖維素材料以產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物；和(i)任選地，回收所述發(fā)酵產(chǎn)物。
根據(jù)本發(fā)明方法的步驟(d)也可稱為進料步驟，而根據(jù)本發(fā)明方法的步驟(f)也可稱為糖化步驟。在進料步驟中，將任選清洗和/或任選預(yù)處理的木質(zhì)纖維素材料以補料分批模式加入包含酶組合物的容器中。
本文使用的術(shù)語“第一容器”可以表示單個容器，但也可以表示一組容器。本文使用的術(shù)語“第二容器”可以表示單個容器，但也可以表示一組容器。
在根據(jù)本發(fā)明方法的步驟(c)中，將任選清洗和/或任選預(yù)處理的木質(zhì)纖維素材料加入第一容器中，所述第一容器中已存在包含至少兩種纖維素酶的酶組合物。第一容器中存在的酶組合物可以是水性組合物。在一種實施方式中，在將任選清洗和/或任選預(yù)處理的木質(zhì)纖維素材料加入第一容器之前，第一容器中存在的酶組合物包含一定量的木質(zhì)纖維素材料。在一種實施方式中，已包含一些木質(zhì)纖維素材料的酶組合物的干物質(zhì)含量為0.01-5重量％。可以已經(jīng)存在于酶組合物中的木質(zhì)纖維素材料可以任選地被清洗和/或任選地被預(yù)處理。可以已經(jīng)存在于酶組合物中的木質(zhì)纖維素材料可以任選地被液化。在將木質(zhì)纖維素材料加入第一容器之前，酶組合物中存在一些木質(zhì)纖維素材料可導致第一容器中存在的酶的穩(wěn)定性提高。在一種優(yōu)選的實施方式中，在根據(jù)本發(fā)明方法的步驟(c)中，將任選清洗和/或任選預(yù)處理的木質(zhì)纖維素材料以補料分批模式加入第一容器中，所述第一容器中已存在包含至少兩種纖維素酶的酶組合物。在一種實施方式中，在根據(jù)本發(fā)明方法的步驟(d)期間加入任選清洗和/或任選預(yù)處理的木質(zhì)纖維素材料。這意味著將任選清洗和/或任選預(yù)處理的木質(zhì)纖維素材料分次(inportions)加入容器中，所述容器中已存在包含至少兩種纖維素酶的酶組合物。因此，在根據(jù)本發(fā)明方法的步驟(c)中，將任選清洗和/或任選預(yù)處理的木質(zhì)纖維素材料以補料分批模式加入第一容器中，所述第一容器中已存在包含至少兩種纖維素酶的酶組合物。
在一種實施方式中，在根據(jù)本發(fā)明方法的步驟(d)和/或步驟(f)期間添加額外的酶。
在一種實施方式中，在根據(jù)本發(fā)明方法的步驟(d)期間，通過調(diào)節(jié)任選清洗和/或任選預(yù)處理的木質(zhì)纖維素材料的添加速率來控制第一容器中木質(zhì)纖維素材料的粘度。在根據(jù)本發(fā)明方法的步驟(d)期間，第一容器中木質(zhì)纖維素材料的粘度被保持為低于1000cp。在一種實施方式中，在根據(jù)本發(fā)明方法的步驟(d)期間，第一容器中木質(zhì)纖維素材料的粘度被保持為10-1000cp、10-900cp、10-800cp、10-700cp、10-600cp、10-500cp、10-400cp、10-300cp、10-200cp、優(yōu)選地10-100cp?？梢栽谟糜谒獾臏囟认吕胋rookfielddviii流變儀測定粘度。
在一種實施方式中，將水性組合物，任選地包含至少兩種纖維素酶的水性酶組合物，加入第一容器中。
在一種實施方式中，向第一容器和/或第二容器中加入氧。在一種實施方式中，在處理時間的單一部分或多個部分期間，向第一容器和/或第二容器中加入氧。
可用幾種方式添加氧。例如，氧可作為氧氣、富氧氣體(例如富氧空氣)或空氣而添加。也可以通過原位氧生成來添加氧。例如，可以通過電解生成氧，可以酶促地(例如通過添加過氧化物)產(chǎn)生氧，或可以用化學方法(例如通過氧生成體系，諸如khso5)產(chǎn)生氧。例如，通過過氧化氫酶由過氧化物產(chǎn)生氧。過氧化物可以以溶解的過氧化物的形式添加或通過酶促或化學反應(yīng)生成。如果使用過氧化氫酶作為產(chǎn)生氧的酶，則可以使用用于水解的酶組合物中存在的過氧化氫酶或可以為此目的添加過氧化氫酶。
可連續(xù)或不連續(xù)地添加氧。如何添加氧的實例包括但不限于將氧添加到容器中包含木質(zhì)纖維素材料的液相(例如作為氣泡)以及將氧添加到容器的頂部空間。將氧添加到容器的頂部空間并使木質(zhì)纖維素材料通過富氧頂部空間時，可以提供水解反應(yīng)所需的充足氧。通常，可以控制和/或改變添加到第一容器和/或第二容器的氧的量。通過在所述容器中的部分水解時間期間僅添加氧，可以限制供應(yīng)的氧。另一種選擇是添加低濃度的氧，例如通過使用空氣和再循環(huán)空氣(離開容器的空氣)的混合物或通過用惰性氣體“稀釋”空氣?？梢酝ㄟ^在水解時間的更長期間添加氧，通過添加較高濃度的氧或通過添加更多的空氣來增加氧的添加量。改變攝氧量的另一個選擇是改變水解溫度。較高水解溫度會導致容器內(nèi)容物中氧的最高飽和濃度較低?？刂蒲鯘舛鹊牧硪环N方法是添加耗氧劑和/或氧發(fā)生器?？梢栽诿复偎庵昂?或期間，向纖維素分解材料中加入氧。可以將氧引入，例如吹入木質(zhì)纖維素材料的液體水解容器內(nèi)容物中。也可以將氧吹入容器的頂部空間。
在一種實施方式中，在將木質(zhì)纖維素材料加入第一容器和/或第二容器之前和/或期間，將氧添加到所述容器中。氧可以與進入水解容器的木質(zhì)纖維素材料一起引入。在一種實施方式中，在將木質(zhì)纖維素材料加入第一容器之前和/或期間，將氧添加到木質(zhì)纖維素材料中。氧可被引入將進入容器的材料流中或者與通過容器的外環(huán)流的部分容器內(nèi)容物一起引入。
可以在水解之前、水解的一部分期間、整個水解期間或其任意組合添加氧。如果水解步驟中形成的水解產(chǎn)物或糖產(chǎn)物或水解容器內(nèi)容物中存在的氧可能影響或妨礙隨后的發(fā)酵步驟，則可以在除了步驟(f)中水解的最后一部分之外添加氧。以這種方式，可以在水解的木質(zhì)纖維素材料發(fā)酵之前消耗(大部分)氧。
在一種實施方式中，在本發(fā)明方法的步驟(f)中，酶促水解期間存在的木質(zhì)纖維素材料中的氧濃度(do)是至少0.001mol/m3，優(yōu)選地至少0.002mol/m3，更優(yōu)選地至少0.003mol/m3，甚至更優(yōu)選地至少0.01mol/m3，最優(yōu)選地至少0.02mol/m3，特別地至少0.03mol/m3。在小于1m3的反應(yīng)器中，通過緩慢攪拌將獲得低于0.01mol/m3或0.02mol/m3的木質(zhì)纖維素材料中的氧濃度。在這種規(guī)模劇烈混合或攪拌將頂部空間的部分氣相引入反應(yīng)液中。例如，混合或攪拌可以產(chǎn)生將氧卷入液體中的渦流。通常，對于尺寸高達100升至1m3的反應(yīng)器而言，與(劇烈)混合或攪拌組合地用空氣吹入頂部空間將足夠的氧引入水解反應(yīng)器中的纖維素材料中。在更大規(guī)模時，例如在50m3或更大(例如100m3)的反應(yīng)器中，劇烈攪拌需要如此多的能量以至于從經(jīng)濟學角度來看這無法應(yīng)用于商業(yè)操作方法中。
在一種實施方式中，在本發(fā)明方法的步驟(d)和/或步驟(f)中，酶促水解期間存在的木質(zhì)纖維素材料中的氧濃度(do)優(yōu)選地為水解反應(yīng)條件下氧飽和濃度的至多80％，更優(yōu)選地至多0.12mol/m3，仍然更優(yōu)選地至多0.09mol/m3，甚至更優(yōu)選地至多0.06mol/m3，最優(yōu)選地至多0.045mol/m3，特別地至多0.03mol/m3。溫度和壓力會影響do。
上文給出的優(yōu)選的和示例性的mol/m3值涉及標準大氣壓和約62℃的溫度。本領(lǐng)域技術(shù)人員基于本教導能夠領(lǐng)會到有利的do值。
在酶促水解中，無定形和結(jié)晶多糖或纖維素被水解為糖，例如葡萄糖。無定形多糖例如通過內(nèi)切葡聚糖酶被轉(zhuǎn)化為寡糖，然后寡糖可以通過纖維二糖水解酶和β-葡糖苷酶被轉(zhuǎn)化為葡萄糖。結(jié)晶多糖的轉(zhuǎn)化可以并行地或順序地進行，甚至在大部分無定形多糖被水解時仍繼續(xù)。在結(jié)晶多糖的水解期間，例如在將多糖降解為寡糖的過程中，加入氧與溶解性多糖單加氧酶的組合是有益的。結(jié)晶葡聚糖結(jié)構(gòu)可通過溶解性多糖單加氧酶打開。該類型的酶通過氧化糖苷鍵而打開該結(jié)構(gòu)并使其可用于其他纖維素分解酶而進一步地將寡糖水解為葡萄糖。添加氧是非常有用的，尤其是在結(jié)晶多糖被酶轉(zhuǎn)化的階段。在此階段之外，不添加氧或添加較少的氧可以更有效。
本發(fā)明的方法尤其在中試工廠和工業(yè)規(guī)模顯示出優(yōu)勢。在一種實施方式中，第一容器和/或第二容器具有至少1m3的容積。優(yōu)選地，第一容器和/或第二容器具有至少1m3、至少2m3、至少3m3、至少4m3、至少5m3、至少6m3、至少7m3、至少8m3、至少9m3、至少10m3、至少15m3、至少20m3、至少25m3、至少30m3、至少35m3、至少40m3、至少45m3、至少50m3、至少60m3、至少70m3、至少75m3、至少80m3、至少90m3、至少100m3、至少200m3、至少300m3、至少400m3、至少500m3、至少600m3、至少700m3、至少800m3、至少900m3、至少1000m3、至少1500m3、至少2000m3、至少2500m3的容積。通常，反應(yīng)器小于3000m3或5000m3。第一容器和第二容器可以具有相同的容積，但是也可以具有不同的容積。如果使用幾個第一容器和/或第二容器，則它們可以具有相同的容積，但也可以具有不同的容積。
本發(fā)明的方法有利地聯(lián)合熱穩(wěn)定酶的使用被應(yīng)用。在一種實施方式中，酶組合物源自真菌，優(yōu)選rasamsonia屬的微生物，或酶組合物包含真菌酶，優(yōu)選rasamsonia酶。應(yīng)用于預(yù)處理的木質(zhì)纖維素原料的rasamsonia的纖維素分解酶顯示出在50-70℃范圍內(nèi)的溫度下的最大轉(zhuǎn)化速率。酶在這些環(huán)境下保持活性達14天及更久，而沒有完全停止活性。通過使用最佳溫度條件，最大量的還原糖能在盡可能短的水解時間內(nèi)從木質(zhì)纖維素材料(完全水解)釋放出。以這種方式，在不到5天能夠?qū)崿F(xiàn)葡萄糖形式的纖維素的100％轉(zhuǎn)化。發(fā)酵產(chǎn)物的理論最大產(chǎn)率(以g產(chǎn)物/克葡萄糖計的yps最大)可來源于生物化學教科書。對乙醇而言，根據(jù)酵母中正常的糖酵解發(fā)酵通路，1摩爾葡萄糖(180g)產(chǎn)生2摩爾乙醇(＝2×46＝92g乙醇)。因此，基于葡萄糖的乙醇的理論最大產(chǎn)率為92/180＝0.511g乙醇/g葡萄糖。對丁醇(mw74g/摩爾)或異丁醇而言，理論最大產(chǎn)率是每摩爾葡萄糖1摩爾丁醇。因此，(異)丁醇的yps最大＝74/180＝0.411g(異)丁醇/g葡萄糖。對乳酸而言，同型乳酸發(fā)酵(homolacticfermentation)的發(fā)酵產(chǎn)率是每摩爾葡萄糖2摩爾乳酸(mw＝90g/摩爾)。根據(jù)該化學計量，yps最大＝1g乳酸/g葡萄糖。對其它發(fā)酵產(chǎn)物而言，可以進行類似的計算。應(yīng)用rasamsonia的纖維素分解酶實現(xiàn)的成本降低是總處理時間減少的結(jié)果。
由于本發(fā)明方法中使用的酶的高穩(wěn)定性，可以通過延長水解時間來延長酶的使用和降低酶劑量。例如，0.175ml酶/g木質(zhì)纖維素材料干物質(zhì)導致在72小時內(nèi)從預(yù)處理的原料中釋放還原糖的理論最大值的約90％。當使用0.075ml酶/g木質(zhì)纖維素材料干物質(zhì)時，在120小時內(nèi)實現(xiàn)理論最大值的約90％轉(zhuǎn)化。結(jié)果顯示，由于酶活性的穩(wěn)定性，降低的酶劑量可通過延長水解時間補償，以獲得相同量的還原糖。通過使用穩(wěn)定的(例如rasamsonia的)纖維素分解酶實現(xiàn)成本降低，這是由于需要較低的酶劑量，從而導致相似的水解轉(zhuǎn)化產(chǎn)率。
在將木質(zhì)纖維素材料轉(zhuǎn)化為乙醇的常見方法中，處理步驟優(yōu)選地在腐敗性條件(septiccondition)下進行以降低操作成本。污染微生物的污染和生長可因而發(fā)生并導致不期望的副作用，例如乳酸、甲酸和乙酸生產(chǎn)，基于底物的乙醇的產(chǎn)率損失，毒素和細胞外多糖的產(chǎn)生。這些效果可顯著影響生產(chǎn)成本。高處理溫度和/或短處理時間限制水解和發(fā)酵期間的污染風險。熱穩(wěn)定酶(比如rasamsonia的那些)能在高于60℃的溫度下水解木質(zhì)纖維素原料。在這些溫度下，污染微生物引起不期望副作用的風險將極低至幾乎為零。
在其中乙醇被生產(chǎn)的發(fā)酵步驟期間，溫度典型地在30-37℃之間并且由于產(chǎn)量損失而優(yōu)選地不被升高。通過應(yīng)用短的發(fā)酵處理時間，污染的風險和作用和/或污染物的生長會盡可能多地被減小。使用穩(wěn)定酶(比如rasamsonia的那些)，可應(yīng)用短的發(fā)酵時間，從而盡可能大地降低污染風險和/或污染物生長。以這種方式應(yīng)用rasamsonia的熱穩(wěn)定纖維素分解酶實現(xiàn)的成本降低起因于降低了由于污染導致的處理失敗的風險。
熱預(yù)處理后的第一個步驟是將預(yù)處理的材料冷卻至酶具有最佳活性的溫度。大規(guī)模時，這典型地通過添加(冷卻)水實現(xiàn)，這除了降低溫度外，還減少干物質(zhì)含量。通過使用熱穩(wěn)定酶(比如rasamsonia的那些)，可以實現(xiàn)成本降低，這是因為i)更少需要對預(yù)處理材料冷卻，因為在水解期間允許更高溫度，和ii)添加更少的水，這增加水解和發(fā)酵期間的干物質(zhì)含量并因而增加乙醇工廠的乙醇生產(chǎn)能力(每體積每時間單位產(chǎn)生的量)。通過使用熱穩(wěn)定酶(比如rasamsonia的那些)，成本降低也可通過使用比在有非熱穩(wěn)定酶的方法中所用的水具有更高溫度的冷卻水實現(xiàn)。
水解結(jié)束時，酶活性表現(xiàn)為低的，因為一旦幾乎所有纖維素被轉(zhuǎn)化，幾乎沒有還原糖被釋放出。但是，存在的酶促活性的量僅減少少許，假設(shè)這主要是由于酶對底物的吸附。通過在水解后應(yīng)用固液分離，例如離心、過濾、傾析(cantation)、沉降等等，溶液中的酶活性的60％或更多(例如70％)可被回收并被再利用用于在下一水解期間水解新的預(yù)處理的木質(zhì)纖維素材料。
而且，固液分離后，溶液中的酶可從含有還原糖和來自酶促作用的其它水解產(chǎn)物的溶液中分離出?？山柚虿唤柚紫葘⒚肝降饺魏晤愋偷妮d體上，通過包括但不限于超濾和微濾、離心、傾析、沉降的技術(shù)進行該分離。例如，用0.175ml/g材料干物質(zhì)的酶載量對預(yù)處理的材料水解20小時后，還原糖的理論最大量的50％被釋出，相同水解72小時后，還原糖的理論最大量的90％被釋出。通過離心和超濾，在滲余物中回收60-70％的酶活性，而濾液含有超過80％的釋出的還原糖。通過再利用滲余物自身或被進一步純化和/或濃縮后的滲余物，在下一水解步驟期間的酶劑量可被減少60-70％。通過這種方式通過使用穩(wěn)定纖維素分解酶(例如rasamsonia的那些)實現(xiàn)成本降低是降低的酶劑量的結(jié)果。
包括如上文所述的水解后再循環(huán)酶的方法可與發(fā)酵后再循環(huán)生產(chǎn)乙醇的微生物的方法組合，其中在酶生產(chǎn)發(fā)酵中使用含還原糖的濾液作為底物(純化的和/或濃縮的或稀釋的)和作為底物用于培養(yǎng)生產(chǎn)乙醇的微生物。
酶(比如來自rasamsonia的那些)的熱穩(wěn)定性導致在糟水(thinstillage)中的水解、發(fā)酵和真空蒸餾后剩余的纖維素分解活性。酶的總活性在三個連續(xù)的方法步驟期間降低。真空蒸餾后獲得的糟水可因而被再利用作為酶來源，用于將預(yù)處理材料轉(zhuǎn)化為乙醇的新開始的水解-發(fā)酵-蒸餾處理循環(huán)。糟水可被以濃縮形式或(未)稀釋形式和/或被純化并有或沒有額外的酶補充的形式被使用。
在一個最佳方法中，酶在新處理循環(huán)中再利用之前，補充到糟水中的酶量等于在先前處理循環(huán)的三個連續(xù)處理步驟期間損失的活性量。以這種方式，避免超劑量的酶，并因此獲得酶的最有效使用。而且，通過在第一處理循環(huán)中提供高酶劑量并補充等于在隨后處理循環(huán)中的三個連續(xù)處理步驟期間損失的活性量的酶，可在每個處理循環(huán)中獲得盡可能高的水解速率，導致少于48小時的短的水解時間和酶的最有效使用的組合。
通過在水解期間應(yīng)用混合，酶變得更經(jīng)常地與底物接觸，這導致催化活性被更有效使用。這將導致酶劑量更低并因而導致成本更低，除非混合對酶具有負面作用。穩(wěn)定酶(比如來自rasamsonia的熱穩(wěn)定酶)是穩(wěn)健的并可抵抗(局部)高剪切和高溫環(huán)境，這是漿體劇烈混合期間的情況。在混合系統(tǒng)中使用穩(wěn)定酶因而是有益的并將導致劑量減少并因此導致成本降低。
本文使用的“熱穩(wěn)定”酶表示：酶的最適溫度為60℃或更高，70℃或更高，75℃或更高，80℃或更高，85℃或更高。例如，它們可分離自嗜熱微生物，或者可由本領(lǐng)域技術(shù)人員設(shè)計和人工合成。在一個實施方式中，多核苷酸可分離自或獲自嗜熱或耐熱絲狀真菌或者分離自非嗜熱或非耐熱但被發(fā)現(xiàn)熱穩(wěn)定的真菌。
“嗜熱真菌”表示在50℃或更高的溫度下生長的真菌。“耐熱真菌”表示在45℃或更高(最大值接近50℃)的溫度下生長的真菌。
嗜熱真菌菌株的實例是rasamsoniaemersonii(以前被稱為talaromycesemersoni)。talaromycesemersonii，penicilliumgeosmithiaemersonii和rasamsoniaemersonii在本文中可交換使用。
合適的嗜熱或耐熱真菌細胞可以是humicola、rhizomucor、myceliophthora、rasamsonia、talaromyces、thermomyces、thermoascus或thielavia細胞，優(yōu)選地rasamsonia細胞。優(yōu)選的嗜熱或耐熱真菌是humicolagriseavar.thermoidea、humicolalanuginosa、myceliophthorathermophila、papulasporathermophilia、rasamsoniabyssochlamydoides、rasamsoniaemersonii、rasamsoniaargillacea、rasamsoniaeburnean，rasamsoniabrevistipitata、rasamsoniacylindrospora、rhizomucorpusillus、rhizomucormiehei、talaromycesbacillisporus、talaromycesleycettanus、talaromycesthermophilus、thermomyceslenuginosus、thermoascuscrustaceus、thermoascusthermophilus、thermoascusaurantiacus和thielaviaterrestris。
嗜熱真菌不限于特定分類學等級并出現(xiàn)在真菌進化樹各處。實例是mucorales中的rhizomucor，sordariales中的myceliophthora和eurotiales中的talaromyces、thermomyces和thermoascus(參見mouchacca，1997)。talaromyces物種大部分是嗜溫的，但例外是emersonii和thermophila部分(section)的物種。emersonii部分包括talaromycesemersonii、talaromycesbyssochlamydoides、talaromycesbacillisporus和talaromycesleycettanus，它們?nèi)吭?0℃下生長良好。talaromycesbacillisporus耐熱，talaromycesleycettanus耐熱至嗜熱，talaromycesemersonii和talaromycesbyssochlamydoides尤其嗜熱(參見stolkand和samson，1972)。talaromyces部分thermophila的唯一成員talaromycesthermophilus在50℃下生長迅速(參見stolk和samson，1972)。這些嗜熱的talaromyces物種的目前分類主要基于表型和生理特征，例如它們在高于40℃時生長的能力、囊孢子顏色、子囊果覆蓋物(ascornatalcovering)的結(jié)構(gòu)和特定無性型類型的形成。stolk和samson(1972)陳述：emersonii部分的成員具有paecilomyces(talaromycesbyssochlamydoides和talaromycesleycettanus)或penicilliumcylindrosporum系列(talaromycesemersonii和talaromycesbacillisporus)其中之一的無性型。稍后，基于多種特征例如從端孔而非在頸(collula，neck)上形成分生孢子(penicillium和paecilomyces的特征)，pitt(1979)將屬于penicilliumcylindrosporum系列的物種轉(zhuǎn)移至geosmithia屬。在geosmithia屬內(nèi)，僅geosmithiaargillacea是耐熱的，stolk等人(1969)和evans(1971)提出了與talaromyces部分emersonii成員的聯(lián)系。talaromyces內(nèi)的嗜熱t(yī)alaromyces物種與trichocomaceae的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系未知(參見j.houbraken，antonievanleeuwenhoek2012年2月；101(2)：403-21)。
rasamsonia是包括耐熱的和嗜熱的talaromyces和geosmithia物種的新屬(j.houbraken等人，如上所述)。基于表型、生理和分子數(shù)據(jù)，houbraken等人提出將talaromycesemersonii、talaromycesbyssochlamydoides、talaromyceseburneus、geosmithiaargillacea和geosmithiacylindrospora物種轉(zhuǎn)移至rasamsonia新屬。
優(yōu)選的嗜熱真菌是rasamsoniabyssoehlamydoides、rasamsoniaemersonii、thermomyceslenuginosus、talaromycesthermophilus、thermoascuscrustaceus、thermoascusthermophilus和thermoascusaurantiacus，其中rasamsoniaemersonii是最優(yōu)選的。
“絲狀真菌”包括eumycota和oomycota亞門的所有絲狀形式(如hawksworth等人，在ainsworthandbisby′sdictionaryofthefungi，第8版，1995，cabinternational，universitypress，cambridge，uk中定義)。絲狀真菌的特征為由幾丁質(zhì)、纖維素、葡聚糖、殼聚糖、甘露聚糖和其它復雜多糖構(gòu)成的菌絲壁。營養(yǎng)生長通過菌絲伸長進行且碳分解代謝絕對好氧。絲狀真菌菌株包括但不限于，acremonium，agaricus，aspergillus，aureobasidium，chrysosporium，coprinus，cryptococcus，filibasidium，fusarium，geosmithia，humicola，magnaporthe，mucor，myceliophthora，neocallimastix，neurospora，paecilomyces，penicillium，piromyces，panerochaete，pleurotus，rasamsonia，schizophyllum，talaromyces，thermoascus，thermomyces，thielavia，tolypocladium和trichoderma的菌株。
絲狀真菌的若干菌株在許多培養(yǎng)物保藏機構(gòu)易于被公眾獲得，例如美國典型培養(yǎng)物保藏中心(americantypeculturecollection(atcc))，德國微生物和細胞培養(yǎng)物保藏中心(deutschesammlungvonmikroorganismenundzellkulturengmbh(dsm))，真菌生物多樣性中心(centraalbureauvoorschimmelcultures(cbs))和農(nóng)業(yè)研究服務(wù)專利培養(yǎng)物保藏北區(qū)研究中心(agriculturalresearchservicepatentculturecollection，northernregionalresearchcenter(nrrl))。這些菌株的實例包括aspergillusnigercbs513.88、aspergillusoryzaeatcc20423、ifo4177、atcc1011、atcc9576、atcc14488-14491、atcc11601、atcc12892、p.chrysogenumcbs455.95、penicilliumcitrinumatcc38065、penicilliumchrysogenump2、talaromycesemersoniicbs393.64、acremoniumchrysogenumatcc36225或atcc48272、trichodermareeseiatcc26921或atcc56765或atcc26921、aspergillussojaeatcc11906、chrysosporiumlucknowensec1、garg27k、vkm-f3500-d、atcc44006和其衍生株。
在合適的微生物中表達和生產(chǎn)酶(例如至少2、3或4種不同纖維素酶)的一個優(yōu)勢可以為高的酶組合物產(chǎn)率，其可被用于本發(fā)明所述方法中。
在本發(fā)明的方法中，使用酶組合物。優(yōu)選地，所述組合物是穩(wěn)定的。本文中使用的“穩(wěn)定酶組合物”表示：所述酶組合物在30小時水解反應(yīng)時間后保持活性，優(yōu)選地，在30小時水解反應(yīng)時間后保持其初始活性的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。優(yōu)選地，酶組合物在40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500小時的水解反應(yīng)時間后保持活性。
可通過用合適的微生物(例如rasamsoniaemersonii或aspergillusniger)發(fā)酵合適的底物制備酶組合物，其中酶組合物通過微生物生產(chǎn)?？筛淖兾⑸镆愿倪M或制造組合物。例如，可通過傳統(tǒng)菌株改良程序或通過重組dna技術(shù)使微生物突變。因此，本文提及的微生物可被原樣使用以產(chǎn)生組合物或可被改變以增加產(chǎn)量或產(chǎn)生改變的組合物(其可包含異源酶例如纖維素酶，即這種微生物原本不產(chǎn)生的酶)。優(yōu)選地，真菌更優(yōu)選地絲狀真菌被用來產(chǎn)生組合物。有利地，使用嗜熱或耐熱微生物。任選地，在酶組合物生產(chǎn)期間，使用誘導酶組合物中的酶表達的底物。
酶組合物被用來從包含多糖的木質(zhì)纖維素材料中釋放糖。主要的多糖為纖維素(葡聚糖)、半纖維素(木聚糖、雜木聚糖(heteroxylans)和木葡聚糖(xyloglucans))。另外，一些半纖維素可在例如得自木材的木質(zhì)纖維素材料中作為葡甘露聚糖存在。這些多糖向可溶糖(包括單體和多聚體，例如葡萄糖、纖維二糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、果糖、甘露糖、鼠李糖、核糖、半乳糖醛酸、葡糖醛酸以及其它己糖和戊糖)的酶促水解發(fā)生于共同作用(actinginconcert)的不同酶的作用下。糖產(chǎn)物表示木質(zhì)纖維素材料的酶促水解產(chǎn)物。糖產(chǎn)物包含可溶性糖(包含單體和多聚體二者)。優(yōu)選地，其包含葡萄糖。其它糖的實例為纖維二糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、果糖、甘露糖、鼠李糖、核糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸以及其它己糖和戊糖。糖產(chǎn)物可被原樣使用或者可被進一步加工例如被回收和/或純化。
另外，果膠和其它果膠類物質(zhì)如阿拉伯聚糖(arabinans)可占來自非木本植物組織典型的細胞壁干物質(zhì)的可觀的比例(約四分之一到一半的干物質(zhì)可以是果膠)。
纖維素是由通過β-1，4鍵連接的葡萄糖殘基構(gòu)成的線性多糖。纖維素纖維的線性特性以及β-連接的葡萄糖(相對于α)的化學計量產(chǎn)生比淀粉的高度枝化α-連接結(jié)構(gòu)更傾向于鏈間氫鍵結(jié)合的結(jié)構(gòu)。因此，纖維素聚合物與淀粉中存在的纖維相比通常溶解度更小，并且形成更緊密結(jié)合的纖維。
以下更詳細描述可被包括在用于本發(fā)明的穩(wěn)定酶組合物中的酶：
溶解性多糖單加氧酶，內(nèi)切葡聚糖酶(eg)和外切纖維二糖水解酶(cbh)催化不溶性纖維素水解成產(chǎn)物例如纖維寡糖(纖維二糖作為主要產(chǎn)物)，而β-葡糖苷酶(bg)將寡糖(主要是纖維二糖和纖維三糖)轉(zhuǎn)化成葡萄糖。
半纖維素是復雜聚合物，并且其組成常常在生物之間、組織類型之間大幅變化。通常，半纖維素的主要成分是β-1，4-連接的木糖(一種五碳糖)。然而，所述木糖通常在木糖的0-3和/或0-2原子枝化，并且可以被與阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、葡糖醛酸、半乳糖醛酸的鍵或者通過乙酸酯化(和阿魏酸對阿拉伯糖的酯化)被取代。半纖維素也可含有葡聚糖，所述葡聚糖是β-連接的六碳糖(例如先前提到的β-(1，3)(1，4)葡聚糖和雜葡聚糖)和另外的葡甘露聚糖(其中葡萄糖和甘露糖均存在于線性主鏈中，彼此通過β-鍵連接)的總稱。
木聚糖酶與其它輔助酶例如α-l-阿拉伯呋喃糖酶、阿魏酸酯酶和乙酰木聚糖酯酶、葡糖醛酸酶和β-木糖苷酶一起催化半纖維素的水解。
果膠類物質(zhì)包括果膠、阿拉伯聚糖、半乳聚糖和阿拉伯半乳聚糖。果膠是植物細胞壁中最復雜的多糖。它們圍繞一定程度上散布著l-鼠李糖的α(1，4)-連接的d-半乳糖醛酸單元的核心鏈構(gòu)建。在任何細胞壁中都存在符合所述描述的大量結(jié)構(gòu)單元，并且通常認為在單個果膠分子中，不同結(jié)構(gòu)單元的核心鏈彼此連續(xù)。結(jié)構(gòu)單元的主要類型是：半乳糖醛酸(同聚半乳糖醛酸)，其可被甲醇在羧基上取代，被乙酸酯在o-2和o-3上取代；鼠李半乳糖醛酸聚糖i(rgi)，其中半乳糖醛酸單元與帶有(1，4)-連接的半乳聚糖和(1，5)-連接的阿拉伯聚糖側(cè)鏈的鼠李糖交替。阿拉伯聚糖側(cè)鏈可直接與鼠李糖結(jié)合，或者通過半乳聚糖鏈間接結(jié)合；木半乳糖醛酸聚糖(xylogalacturonan)，在半乳糖醛酸的o-3上具有單個木糖基單元(與rgi緊密關(guān)聯(lián))；和鼠李半乳糖醛酸聚糖ii(rgii)，含有罕見糖例如芹菜糖的特別復雜的小型單元。rgii單元可含有兩個芹菜糖殘基，所述芹菜糖殘基在合適的離子條件下能夠與硼酸鹽可逆地形成酯。
本發(fā)明方法中使用的酶組合物優(yōu)選地包含至少兩種活性，但典型的組合物包含多于兩種活性，例如三種、四種、五種、六種、七種、八種、九種或甚至更多種活性。典型地，本發(fā)明方法中使用的酶組合物包含至少兩種纖維素酶。所述至少兩種纖維素酶可以含有相同或不同的活性。本發(fā)明方法中使用的酶組合物還可以包含至少一種不同于纖維素酶的酶。優(yōu)選地，所述至少一種其它酶具有輔助酶活性，即直接或間接導致木質(zhì)纖維素降解的額外活性。這種輔助活性的實例在本文中被提及，包括但不限于半纖維素酶。
因此，本發(fā)明方法中使用的組合物可包含溶解性多糖單加氧酶活性、內(nèi)切葡聚糖酶活性和/或纖維二糖水解酶活性和/或β-葡糖苷酶活性。在本發(fā)明中使用的組合物可包含每種活性種類中的多于一種的酶活性。例如，在本發(fā)明中使用的組合物可包含兩種內(nèi)切葡聚糖酶活性，例如內(nèi)切-1，3(1，4)-β葡聚糖酶活性和內(nèi)切-β-1，4-葡聚糖酶活性。
本發(fā)明方法中使用的組合物可來源于rasamsoniaemersonii。在本發(fā)明中，預(yù)期核心的一組(降解木質(zhì)纖維素的)酶活性可來源于rasamsoniaemersonii。rasamsoniaemersonii能夠提供本文中證明對木質(zhì)纖維素材料的水解而言高度有效的活性組。如果需要，活性組可被來自其它來源的額外的酶活性補充。這種額外的活性可來源于經(jīng)典來源和/或由經(jīng)遺傳改造的生物生產(chǎn)。
本發(fā)明方法中使用的組合物中的活性可以是熱穩(wěn)定的。本文中這表示：該活性的最適溫度為60℃或更高，70℃或更高，75℃或更高，80℃或更高，85℃或更高。本發(fā)明方法中使用的組合物中的活性一般不具有相同的最適溫度，但是優(yōu)選地將是熱穩(wěn)定的。
另外，本發(fā)明方法中使用的組合物中的酶活性可以能夠在低ph下起作用。為了本發(fā)明目的，低ph表示5.5或更低，5或更低，4.9或更低，4.8或更低，4.7或更低，4.6或更低，4.5或更低，4.4或更低，4.3或更低，4.2或更低，4.1或更低，4.0或更低，3.9或更低，3.8或更低，3.7或更低，3.6或更低，3.5或更低的ph。
本發(fā)明方法中使用的組合物中的活性可以通過任何上述最適溫度和ph值的組合來限定。
除了來源于rasamsonia的活性以外，本發(fā)明方法中使用的酶組合物還可包含纖維素酶(例如來源于不同于rasamsonia的來源的纖維素酶)和/或半纖維素酶(例如來源于不同于rasamsonia的來源的半纖維素酶)和/或果膠酶。
本發(fā)明方法中使用的酶組合物可包含一種、兩種、三種、四種或更多種纖維素酶，例如溶解性多糖單加氧酶(lpmo)、內(nèi)切葡聚糖酶(eg)、一種或兩種外切纖維二糖水解酶(cbh)和β-葡糖苷酶(bg)中的一種、兩種、三種或四種或全部。本發(fā)明方法中使用的組合物可包含兩種或更多種任何這些種類的纖維素酶。
本發(fā)明方法中使用的酶組合物可包含一種由本文所述的組合物提供的纖維素酶活性和/或半纖維素酶活性和/或果膠酶活性，和由額外的纖維素酶/半纖維素酶/果膠酶提供的第二類纖維素酶活性和/或半纖維素酶活性和/或果膠酶活性。
在本文中使用時，纖維素酶是能夠降解或改性纖維素的任何多肽。能夠降解纖維素的多肽是能夠催化下述過程的多肽：將纖維素降解成更小的單元，部分地例如降解成纖維素糊精，或者完全降解成葡萄糖單體。根據(jù)本發(fā)明的纖維素酶可產(chǎn)生纖維素糊精與葡萄糖單體的混合類群。這種降解將典型地通過水解反應(yīng)而發(fā)生。
溶解性多糖單加氧酶(lpmo)最近通過cazy被分類在aa9家族(輔助活性家族9)或aa10家族(輔助活性家族10)中。如上面所提及的，溶解性多糖單加氧酶能夠打開結(jié)晶葡聚糖結(jié)構(gòu)。溶解性多糖單加氧酶也可影響纖維寡糖。根據(jù)最新文獻(參見isaksen等，journalofbiologicalchemistry，第289卷，第5期，第2632-2642頁)，gh61(糖苷水解酶家族61或有時被稱為egiv)蛋白是(溶解性)氧依賴性多糖單加氧酶(pmo’s/lpmo’s)。pmo和lpmo在本文可互換使用。文獻中通常提及這些蛋白增強纖維素酶對木質(zhì)纖維素底物的作用。基于一個家族成員中極低的內(nèi)切-1，4-β-d-葡聚糖酶活性測量值，gh61最初被歸類為內(nèi)切葡聚糖酶。本文所使用的術(shù)語“gh61”將被理解為這樣的酶家族，其共有將被歸類到得到確認的cazygh分類系統(tǒng)的家族61(http：//www.cazy.org/gh61.html)中的常見保守序列部分和折疊。糖苷水解酶家族61是糖苷水解酶ec3.2.1家族的成員。gh61最近被cazy重新歸類在家族aa9(輔助活性家族9)。gh61在本文中被用作纖維素酶的一部分。
cbm33(家族33碳水化合物結(jié)合模塊)為溶解性多糖單加氧酶(見isaksen等，journalofbiologicalchemistry，vol.289，no.5，pp.2632-2642)，cazy最近已被重新分類為aa10(輔助活性家族10)中的cbm33。
如本文所用，半纖維素是能夠降解或改性半纖維素的任何多肽。也就是說，半纖維素酶可以能夠降解或改性木聚糖、葡糖醛酸木聚糖、阿拉伯木聚糖、葡甘露聚糖和木葡聚糖的一種或多種。能夠降解半纖維素的多肽是能夠催化下述過程的多肽：將半纖維素降解成更小的多糖，部分地例如降解成寡糖，或者完全降解成糖單體，例如己糖或戊糖單體。根據(jù)本發(fā)明的半纖維素酶可產(chǎn)生寡糖與糖單體的混合類群。這種降解將典型地通過水解反應(yīng)而發(fā)生。
如本文所用，果膠酶是能夠降解或改性果膠的任何多肽。能夠降解果膠的多肽是能夠催化下述過程的多肽：將果膠降解成更小的單元，部分地例如降解成寡糖，或者完全降解成糖單體。根據(jù)本發(fā)明的果膠酶可產(chǎn)生寡糖與糖單體的混合類群。這種降解將典型地通過水解反應(yīng)而發(fā)生。
因此，本發(fā)明方法中使用的酶組合物可包含任何纖維素酶，例如溶解性多糖單加氧酶(例如gh61)，纖維二糖水解酶，內(nèi)切-β-1，4-葡聚糖酶，β-葡糖苷酶或β-(1，3)(1，4)-葡聚糖酶。
如本文所用，纖維二糖水解酶(ec3.2.1.91)是能夠催化纖維素或纖維四糖中1，4-β-d-葡糖苷鍵水解、從鏈末端釋放纖維二糖的任何多肽。這種酶也可以被稱作纖維素酶1，4-β-纖維二糖苷酶(1，4-β-cellobiosidase)，1，4-β-纖維二糖水解酶，1，4-β-d-葡聚糖纖維二糖水解酶，微晶纖維素酶(avicelase)，外切-1，4-β-d-葡聚糖酶，外切纖維二糖水解酶或外切葡聚糖酶。
如本文所用，內(nèi)切-β-1，4-葡聚糖酶(ec3.2.1.4)是能夠催化纖維素、地衣淀粉或谷類β-d-葡聚糖中1，4-β-d-葡糖苷鍵內(nèi)切水解的任何多肽。這種多肽也可以能夠水解也含有1，3-鍵的β-d-葡聚糖中的1，4-鍵。這種酶也可以被稱作纖維素酶、微晶纖維素酶、β-1，4-內(nèi)切葡聚糖水解酶、β-1，4-葡聚糖酶、羧甲基纖維素酶、纖維糊精酶、內(nèi)切-1，4-β-d-葡聚糖酶、內(nèi)切-1，4-β-d-葡聚糖水解酶、內(nèi)切-1，4-β-葡聚糖酶或內(nèi)切葡聚糖酶。
如本文所用，β-葡糖苷酶(ec3.2.1.21)是能夠催化末端、非還原性β-d-葡萄糖殘基水解并釋放β-d-葡萄糖的任何多肽。這種多肽可具有針對β-d-葡糖苷的廣泛特異性，并且也可以水解以下一種或多種：β-d-半乳糖苷、α-l-阿拉伯糖苷、β-d-木糖苷或β-d-巖藻糖苷。這種酶也可以被稱作苦杏仁苷酶、β-d-葡糖苷葡糖水解酶、纖維二糖酶或龍膽二糖酶。
如本文所用，β-(1，3)(1，4)-葡聚糖酶(ec3.2.1.73)是能夠催化含有1，3-和1，4-鍵的β-d-葡聚糖中1，4-β-d-葡糖苷鍵水解的任何多肽。這種多肽可作用于地衣淀粉和谷類β-d-葡聚糖，但不作用于僅含1，3-或1，4-鍵的β-d-葡聚糖。這種酶也可以被稱作地衣淀粉酶(licheninase)，1，3-1，4-β-d-葡聚糖4-葡聚糖水解酶，β-葡聚糖酶，內(nèi)切-β-1，3-1，4葡聚糖酶，地衣多糖酶(lichenase)或混合鍵β-葡聚糖酶。這種酶的替代物是被描述為內(nèi)切-1，3(4)-β-葡聚糖酶的ec3.2.1.6。當其還原基團參與待水解的鍵的葡萄糖殘基自身在c-3處被取代時，這種酶水解β-d-葡聚糖中的1，3-鍵或1，4-鍵。替代性名稱包括內(nèi)切-1，3-β-葡聚糖酶，昆布多糖酶，1，3-(1，3；1，4)-β-d-葡聚糖3(4)葡聚糖水解酶。底物包括昆布多糖，地衣淀粉和谷類β-d-葡聚糖。
本發(fā)明方法中使用的組合物可以包含任何半纖維素酶，例如內(nèi)切木聚糖酶、β-木糖苷酶、α-l-阿拉伯呋喃糖苷酶、α-d-葡糖醛酸酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、香豆酸酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、β-甘露聚糖酶或β-甘露糖苷酶。
如本文所用，內(nèi)切木聚糖酶(ec3.2.1.8)是能夠催化木聚糖中1，4-β-d-木糖苷鍵內(nèi)切水解的任何多肽。這種酶也可以被稱作內(nèi)切-1，4-β-木聚糖酶或1，4-β-d-木聚糖木聚糖水解酶。供替代的選擇是ec3.2.1.136葡糖醛酸阿拉伯木聚糖內(nèi)切木聚糖酶(glucuronoarabinoxylanendoxylanase)，其能夠水解葡糖醛酸阿拉伯木聚糖中1，4木糖苷鍵。
如本文所用，β-木糖苷酶(ec3.2.1.37)是能夠催化1，4-β-d-木聚糖的水解，從非還原性末端去除相繼的d-木糖殘基的任何多肽。這種酶也可以水解木二糖。這種酶也可以被稱作木聚糖1，4-β-木糖苷酶、1，4-β-d-木聚糖木糖水解酶、外切-1，4-β-木糖苷酶或木二糖酶。
如本文所用，α-l-阿拉伯呋喃糖苷酶(ec3.2.1.55)是能夠作用于α-l-阿拉伯呋喃糖苷、含(1，2)和/或(1，3)-和/或(1，5)-鍵的α-l-阿拉伯聚糖、阿拉伯木聚糖和阿拉伯半乳聚糖的任何多肽。這種酶也可以被稱作α-n-阿拉伯呋喃糖苷酶、阿拉伯呋喃糖苷酶或阿拉伯糖苷酶。
如本文所用，α-d-葡糖醛酸糖苷酶(ec3.2.1.139)是能夠催化以下形式反應(yīng)的任何多肽：α-d-葡糖醛酸苷+h(2)o＝醇+d-葡糖醛酸(d-glucuronate)。這種酶也被稱作α-葡糖醛酸糖苷酶或α-葡糖苷酸酶(alpha-glucosiduronase)。這些酶也可水解可作為木聚糖中取代基存在的4-o-甲基化的葡糖醛酸。供替代的選擇是ec3.2.1.131：木聚糖α-1，2-葡糖醛酸糖苷酶，其催化α-1，2-(4-o-甲基)葡糖醛酸基連接的水解。
如本文所用，乙?；揪厶酋ッ?ec3.1.1.72)是能夠催化木聚糖和木寡糖脫乙?；娜魏味嚯摹＿@種多肽可催化來自多聚木聚糖、乙?；咎?、乙?；咸烟?、α-萘基乙酸酯或?qū)ο趸交宜狨サ囊阴；?，但是一般不催化來自于三乙?；嫉囊阴；?。這種多肽一般不作用于乙?；母事毒厶腔蚬z。
如本文所用，阿魏酸酯酶(ec3.1.1.73)是能夠催化以下形式反應(yīng)的任何多肽：阿魏酸基-糖+h(2)o＝阿魏酸(ferulate)+糖。糖可以是例如寡糖或多糖。其典型地可以催化來自酯化的糖的4-羥基-3-甲氧基肉桂酰(阿魏酰)基的水解，所述糖通常是“天然”底物中的阿拉伯糖。對硝基苯酚乙酸酯和阿魏酸甲基酯是典型地更弱的底物。這種酶也可以被稱作肉桂酰基酯水解酶，阿魏酸酯酶或羥基肉桂?；ッ?。也可以被稱作半纖維素酶輔助酶，因為其可幫助木聚糖酶和果膠酶分解植物細胞壁半纖維素和果膠。
如本文所用，香豆?；ッ?ec3.1.1.73)是能夠催化以下形式反應(yīng)的任何多肽：香豆酰基-糖+h(2)o＝香豆酸(coumarate)+糖。糖可以是例如寡糖或多糖。這種酶也可以被稱作反式-4-香豆?；ッ?、反式-對香豆酰基酯酶、對香豆?；ッ富?qū)ο愣顾狨ッ?。這種酶也落入ec3.1.1.73中，從而也可以被稱作阿魏酸酯酶。
如本文所用，α-半乳糖苷酶(ec3.2.1.22)是能夠催化α-d-半乳糖苷(包括半乳糖寡糖、半乳甘露聚糖、半乳聚糖和阿拉伯半乳聚糖)中末端、非還原性α-d-半乳糖殘基水解的任何多肽。這種多肽也可以能夠水解α-d-巖藻糖苷。所述酶也可以被稱作蜜二糖酶。
如本文所用，β-半乳糖苷酶(ec3.2.1.23)是能夠催化β-d-半乳糖苷中末端非還原性β-d-半乳糖殘基水解的任何多肽。這種多肽也可以能夠水解α-l-阿拉伯糖苷。這種酶也可以被稱作外切-(1-＞4)-β-d-半乳聚糖酶或乳糖酶。
如本文所用，β-甘露聚糖酶(ec3.2.1.78)是能夠催化甘露聚糖、半乳甘露聚糖和葡甘露聚糖中1，4-β-d-甘露糖苷鍵隨機水解的任何多肽。這種酶也可以被稱作甘露聚糖內(nèi)切-1，4-β-甘露糖苷酶或內(nèi)切-1，4-甘露聚糖酶。
如本文所用，β-甘露糖苷酶(ec3.2.1.25)是能夠催化β-d-甘露糖苷中末端非還原性β-d-甘露糖殘基水解的任何多肽。這種酶也可以被稱作甘露聚糖酶或甘露糖酶。
本發(fā)明方法中使用的組合物可包含任何果膠酶，例如內(nèi)切多聚半乳糖醛酸酶，果膠甲基酯酶，內(nèi)切-半乳聚糖酶，β-半乳糖苷酶，果膠乙酰基酯酶，內(nèi)切-果膠裂解酶，果膠酸裂解酶，α-鼠李糖苷酶，外切-半乳糖醛酸酶，外切多聚半乳糖醛酸裂解酶，鼠李半乳糖醛酸聚糖水解酶，鼠李半乳糖醛酸聚糖裂解酶，鼠李半乳糖醛酸聚糖乙?；ッ?，鼠李半乳糖醛酸聚糖半乳糖醛酸水解酶，木半乳糖醛酸酶。
如本文所用，內(nèi)切-多聚半乳糖醛酸酶(ec3.2.1.15)是能夠催化果膠酸酯和其它半乳糖醛酸聚糖中1，4-α-d-半乳糖醛酸鍵的隨機水解的任何多肽。這種酶也可以被稱作多聚半乳糖醛酸酶果膠解聚酶，果膠酶(pectinase)，內(nèi)切多聚半乳糖醛酸酶，果膠酶(pectolase)，果膠水解酶，果膠多聚半乳糖醛酸酶，多聚-α-1，4-半乳糖醛酸苷聚糖水解酶，內(nèi)切半乳糖醛酸酶；內(nèi)切-d-半乳糖醛酸酶或多聚(1，4-α-d-半乳糖醛酸苷)聚糖水解酶。
如本文所用，果膠甲基酯酶(ec3.1.1.11)是能夠催化下述反應(yīng)的任何酶：果膠+nh2o＝n甲醇+果膠酸(pectate)。這種酶也被稱為果膠酯酶(pectinesterase)，果膠脫甲氧基酶，果膠甲氧基酶，果膠甲基酯酶，果膠酶，果膠酯酶(pectinoesterase)或果膠果基水解酶(pectinpectylhydrolase)。
如本文所用，內(nèi)切-半乳聚糖酶(ec3.2.1.89)是能夠催化阿拉伯半乳聚糖中1，4-β-d-半乳糖苷鍵的內(nèi)切水解的任何酶。這種酶也被稱為阿拉伯半乳聚糖內(nèi)切-1，4-β-半乳糖苷酶，內(nèi)切-1，4-β-半乳聚糖酶，半乳聚糖酶，阿拉伯半乳聚糖酶或阿拉伯半乳聚糖4-β-d-半乳聚糖水解酶。
如本文所用，果膠乙酰基酯酶在本文中被定義為下述任何酶，所述酶具有催化果膠gaiua殘基羥基處的乙?；拿撘阴５囊阴；ッ富钚?。
如本文所用，內(nèi)切-果膠裂解酶(ec4.2.2.10)是能夠催化(1→4)-α-d-半乳糖醛酸聚糖甲基酯的清除性切割，得到在其非還原末端具有4-脫氧-6-o-甲基-α-d-半乳-4-糖醛?；墓烟堑娜魏蚊浮Ｋ雒敢部杀环Q為果膠裂解酶，果膠反式消除酶(trans-eliminase)，內(nèi)切果膠裂解酶，多聚甲基半乳糖醛酸反式消除酶，果膠甲基反式消除酶，果膠溶解酶，pl，pnl或pmgl或(1→4)-6-o-甲基-α-d-半乳糖醛酸聚糖裂解酶。
如本文所用，果膠酸裂解酶(ec4.2.2.2)是能夠催化(1→4)-α-d-半乳糖醛酸聚糖的消除性切割，得到在其非還原性末端具有4-脫氧-α-d-半乳-4-糖醛酸基的寡糖的任何酶。這種酶也可被稱為多聚半乳糖醛酸反式消除酶，果膠酸反式消除酶，多聚半乳糖醛酸酯裂解酶，內(nèi)切果膠甲基反式消除酶，果膠酸反式消除酶，內(nèi)切半乳糖醛酸反式消除酶，果膠酸裂解酶，果膠裂解酶，α-1，4-d-內(nèi)切多聚半乳糖醛酸裂解酶，pga裂解酶，ppase-n，內(nèi)切-α-1，4-多聚半乳糖醛酸裂解酶，多聚半乳糖醛酸裂解酶，果膠反式消除酶，多聚半乳糖醛酸反式消除酶或(1→4)-α-d-半乳糖醛酸聚糖裂解酶。
如本文所用，α-鼠李糖苷酶(ec3.2.1.40)是能夠催化α-l-鼠李糖苷或替代地鼠李半乳糖醛酸聚糖中末端非還原性α-l-鼠李糖殘基水解的任何多肽。這種酶也可被稱為α-l-鼠李糖苷酶t，α-l-鼠李糖苷酶n或α-l-鼠李糖苷鼠李糖水解酶。
如本文所用，外切-半乳糖醛酸酶(ec3.2.1.82)是能夠從非還原性末端水解果膠酸，釋放二半乳糖醛酸的任何多肽。所述酶也可被稱為外切-多聚-α-半乳糖醛酸苷酶(exo-poly-α-galacturonosidase)、外切多聚半乳糖醛酸苷酶(exopolygalacturonosidase)或外切多聚聚半乳糖醛酸苷酶(exopolygalacturanosidase)。
如本文所用，外切-半乳糖醛酸酶(ec3.2.1.67)是能夠催化以下的任何多肽：(1，4-α-d-半乳糖醛酸苷)n+h2o＝(1，4-α-d-半乳糖醛酸苷)n-1+d-半乳糖醛酸(d-galacturonate)。這種酶也可被稱為半乳糖醛1，4-α-半乳糖醛酸苷酶(galacturan1，4-α-galacturonidase)，外切多聚半乳糖醛酸酶，多聚(半乳糖醛酸)水解酶，外切-d-半乳糖醛酸酶，外切-d-半乳糖醛酸聚糖酶，外切多聚-d-半乳糖醛酸酶或多聚(1，4-α-d-半乳糖醛酸苷)半乳糖醛酸水解酶。
如本文所用，外切多聚半乳糖醛酸裂解酶(ec4.2.2.9)是能夠催化從果膠酸(即脫酯化的果膠)的還原末端消除性切割4-(4-脫氧-α-d-半乳-4-糖醛酸基)-d-半乳糖醛酸的任何多肽。這種酶也可被稱為果膠酸二糖裂解酶，果膠酸外切裂解酶，外切果膠酸反式消除酶，外切果膠酸裂解酶，外切多聚半乳糖醛酸-反式-消除酶，pate，外切-pate，外切-pgl或(1→4)-α-d-半乳糖醛酸聚糖還原末端二糖裂解酶。
如本文所用，鼠李半乳糖醛酸聚糖水解酶是能夠在由二糖[(1，2-α-l-鼠李糖基-(1，4)-α-半乳糖醛酸]組成的嚴格交替的鼠李半乳糖醛酸聚糖結(jié)構(gòu)中以內(nèi)切方式水解半乳基糖醛酸和吡喃鼠李糖基之間鍵的任何多肽。
如本文所用，鼠李半乳糖醛酸聚糖裂解酶是能夠以內(nèi)切方式在鼠李半乳糖醛酸聚糖中通過β-消除切割α-l-rhap-(1→4)-α-d-galpa鍵的任何多肽。
如本文所用，鼠李半乳糖醛酸聚糖乙?；ッ甘悄軌虼呋罄畎肴樘侨┧峋厶侵薪惶娴氖罄钐呛桶肴樘侨┧釟埢麈湹拿撘阴；娜魏味嚯?。
如本文所用，鼠李半乳糖醛酸聚糖半乳糖醛酸水解酶是能夠以外切方式，從嚴格交替的鼠李半乳糖醛酸聚糖結(jié)構(gòu)的非還原性末端水解半乳糖醛酸的任何多肽。
如本文所用，木半乳糖醛酸酶是通過以內(nèi)切方式切割β-木糖取代的半乳糖醛酸主鏈而作用于木半乳糖醛酸聚糖的任何多肽。這種酶也可被稱為木半乳糖醛酸聚糖水解酶。
如本文所用，α-l-阿拉伯糖呋喃糖苷酶(ec3.2.1.55)是能夠作用于α-l-阿拉伯呋喃糖苷、含有(1，2)和/或(1，3)-和/或(1，5)-鍵的α-l-阿拉伯聚糖、阿拉伯木聚糖和阿拉伯半乳聚糖的任何多肽。這種酶也可以被稱為α-n-阿拉伯糖呋喃糖苷酶，阿拉伯糖呋喃糖苷酶或阿拉伯糖苷酶。
如本文所用，內(nèi)切阿拉伯聚糖酶(ec3.2.1.99)是能夠催化1，5-阿拉伯聚糖中1，5-α-阿拉伯呋喃糖苷鍵內(nèi)切水解的任何多肽。這種酶也可被稱為內(nèi)切阿拉伯糖酶，阿拉伯聚糖內(nèi)切-1，5-α-l-阿拉伯糖苷酶，內(nèi)切-1，5-α-l-阿拉伯聚糖酶，內(nèi)切-α-1，5-阿拉伯聚糖酶；內(nèi)切-阿拉伯聚糖酶或1，5-α-l-阿拉伯聚糖1，5-α-l-阿拉伯聚糖水解酶。
本發(fā)明方法中使用的酶組合物一般包含至少兩種纖維素酶和任選地至少一種半纖維素酶和任選地至少一種果膠酶。本發(fā)明方法中使用的組合物可包含gh61，纖維二糖水解酶，內(nèi)切葡聚糖酶和/或β-葡糖苷酶。這種組合物也可以包含一種或多種半纖維素酶和/或一種或多種果膠酶。
另外，本發(fā)明方法中使用的組合物中可以存在淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、木質(zhì)酶、己糖基轉(zhuǎn)移酶、葡糖醛酸糖苷酶或擴展蛋白(expansin)或纖維素誘導蛋白或纖維素整合蛋白或類似蛋白質(zhì)中的一種或多種(例如兩種、三種、四種或所有)(這些也被稱作上文的輔助活性)。
“蛋白酶”包括水解肽鍵的酶(肽酶)，以及水解肽和其它部分(如糖)之間鍵的酶(糖肽酶)。許多蛋白酶歸類為ec3.4，它們適合在本發(fā)明方法中使用。一些特定類型的蛋白酶包括半胱氨酸蛋白酶(包括胃蛋白酶，木瓜蛋白酶)和絲氨酸蛋白酶(包括糜蛋白酶，羧肽酶和金屬內(nèi)切蛋白酶)。
“脂肪酶”包括水解脂質(zhì)、脂肪酸和?；视王?包括磷酸甘油酯)、脂蛋白、二酰基甘油等等的酶。在植物中，脂質(zhì)被用作結(jié)構(gòu)組分，來限制水損失和病原體感染。這些脂質(zhì)包括來自脂肪酸的蠟質(zhì)，以及角質(zhì)和木栓素(suberin)。
“木質(zhì)酶”包括能夠水解或分解木質(zhì)素聚合物結(jié)構(gòu)的酶。能夠分解木質(zhì)素的酶包括木質(zhì)素過氧化物酶、錳過氧化物酶、漆酶和阿魏酸酯酶，和在本領(lǐng)域中已知解聚或以其它方式分解木質(zhì)素聚合物的描述的其它酶。還包括在內(nèi)的是能夠水解在半纖維素糖(主要是阿拉伯糖)和木質(zhì)素之間形成的鍵的酶。木質(zhì)酶包括但不限于以下組的酶：木質(zhì)素過氧化物酶(ec1.11.1.14)、錳過氧化物酶(ec1.11.1.13)、漆酶(ec1.10.3.2)和阿魏酸酯酶(ec3.1.1.73)。
“己糖基轉(zhuǎn)移酶”(2.4.1-)包括能夠催化轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)，但是也能夠催化例如纖維素和/或纖維素降解產(chǎn)物的水解反應(yīng)的酶?？梢栽诒景l(fā)明中使用的己糖基轉(zhuǎn)移酶的例子是β-葡聚糖基轉(zhuǎn)移酶。這種酶可以能夠催化(1，3)(1，4)葡聚糖和/或纖維素和/或纖維素降解產(chǎn)物的降解。
“葡糖醛酸糖苷酶”包括催化葡糖醛酸苷(例如β-葡糖醛酸苷)水解得到醇的酶。許多葡糖醛酸糖苷酶已被表征，并可適合在本發(fā)明中使用，例如β-葡糖醛酸糖苷酶(ec3.2.1.31)，透明質(zhì)酸酶葡糖醛酸糖苷酶(ec3.2.1.36)，葡糖醛?；?二硫葡糖胺葡糖醛酸糖苷酶(3.2.1.56)，甘草酸β-葡糖醛酸糖苷酶(3.2.1.128)或α-d-葡糖醛酸糖苷酶(ec3.2.1.139)。
本發(fā)明方法中使用的組合物可包含擴展蛋白或擴展蛋白樣蛋白質(zhì)，如膨脹因子(swollenin)(見salheimoetal.，eur.j.biochem.269，4202-4211，2002)或膨脹因子樣蛋白質(zhì)。
擴展蛋白參與植物細胞生長期間細胞壁結(jié)構(gòu)的松弛。已經(jīng)提出擴展蛋白破壞纖維素和其它細胞壁多糖之間的氫鍵，但不具有水解活性。認為它們通過這種方式允許纖維素纖維的滑動和細胞壁的擴大。一種擴展蛋白樣蛋白質(zhì)膨脹因子含有n端碳水化合物結(jié)合模塊家族1結(jié)構(gòu)域(cbd)和c端擴展蛋白樣結(jié)構(gòu)域。為了本發(fā)明的目的，擴展蛋白樣蛋白質(zhì)或膨脹因子樣蛋白質(zhì)可包含這種結(jié)構(gòu)域中的一種或兩種和/或可破壞細胞壁的結(jié)構(gòu)(如破壞纖維素結(jié)構(gòu))，任選地不生產(chǎn)可檢測量的還原糖。
本發(fā)明方法中使用的組合物可以是纖維素誘導的蛋白質(zhì)，例如cip1或cip2基因或類似基因的多肽產(chǎn)物(見foreman等人，j.biol.chem.278(34)，31988-31997，2003)，纖維素/纖維體(cellulosome)整合蛋白質(zhì)，例如cipa或cipc基因的多肽產(chǎn)物，或支架蛋白或支架蛋白樣蛋白質(zhì)。支架蛋白和纖維素整合蛋白是多功能整合亞基，其可將纖維素分解亞基組織成多酶復合體。這通過兩類互補結(jié)構(gòu)域(即支架蛋白上的內(nèi)聚結(jié)構(gòu)域(cohesiondomain)和每個酶單元上的錨定結(jié)構(gòu)域(dockerindomain))的相互作用完成。支架蛋白亞基還帶有介導纖維體與其底物結(jié)合的纖維素結(jié)合模塊(cbm)。為了本發(fā)明的目的，支架蛋白或纖維素整合蛋白可包含這種結(jié)構(gòu)域中的一種或兩種。
本發(fā)明方法中使用的組合物可由上文提到的每種酶種類的成員、一個酶種類的若干成員、或這些酶種類或輔助蛋白(即本文提到的本身不具有酶活性，但是幫助木質(zhì)纖維素降解的那些蛋白質(zhì))的任何組合構(gòu)成。
在本發(fā)明的方法中使用的組合物可以由來自以下來源的酶構(gòu)成：(1)供應(yīng)商；(2)經(jīng)克隆的表達酶的基因；(3)培養(yǎng)液(例如由培養(yǎng)基中微生物菌株的生長得到的，其中所述菌株向培養(yǎng)基中分泌蛋白質(zhì)和酶)；(4)如(3)中培養(yǎng)的菌株的細胞裂解物；和/或(5)表達酶的植物材料。本發(fā)明組合物中不同的酶可獲自不同的來源。
酶可以在微生物、酵母、真菌、細菌或植物中外源產(chǎn)生，然后分離并加入例如木質(zhì)纖維素材料中。或者，酶可以在下述發(fā)酵中生產(chǎn)，所述發(fā)酵使用(預(yù)處理的)木質(zhì)纖維素材料(例如玉米稈或麥秸)對生產(chǎn)酶的生物提供營養(yǎng)。通過這種方式，生產(chǎn)酶的植物自身可以作為木質(zhì)纖維素材料，并且被添加進木質(zhì)纖維素材料中。
在本文所述的用途和方法中，上述組合物的組分可以同時(即本身作為單一組合物)或分別或順次提供。
在一種實施方式中，本發(fā)明方法中使用的酶組合物可以是如下所述的完整發(fā)酵液(wholefermentationbroth)。完整發(fā)酵液可包含任意上述多肽或其任何組合。優(yōu)選地，酶組合物為完整發(fā)酵液，其中細胞被殺死。完整發(fā)酵液可包含有機酸(用于殺死細胞)、被殺死的細胞和/或細胞碎片和培養(yǎng)基。在一種實施方式中，完整發(fā)酵液包含第一有機酸成分，其包括至少一種1-5碳有機酸和/或其鹽，以及第二有機酸成分，其包括至少6個或更多碳的有機酸和/或其鹽。在一種實施方式中，第一有機酸成分為醋酸、甲酸、丙酸、其鹽或其任意組合，第二有機酸成分為苯甲酸、環(huán)己烷羧酸、4-甲基戊酸、苯乙酸、其鹽或其任意組合。
如本文使用的術(shù)語“完整發(fā)酵液”指通過未進行或進行了最少回收和/或純化的細胞發(fā)酵而產(chǎn)生的制備物。例如，完整發(fā)酵液是當微生物培養(yǎng)物生長至飽和時并在碳限制性條件下培養(yǎng)以允許蛋白質(zhì)合成(例如，通過宿主細胞表達酶)以及分泌至細胞培養(yǎng)基中而產(chǎn)生的。通常，完整發(fā)酵液是未分級的且包括已經(jīng)使用過的細胞培養(yǎng)基、細胞外酶和微生物，優(yōu)選為非存活的細胞。
如果需要的話，完整發(fā)酵液可以是分級的且可使用經(jīng)分級物質(zhì)中的一個或多個。例如，可從完整發(fā)酵液去除殺死的細胞和/或細胞碎片以提供不含這些成分的組合物。
完整發(fā)酵液可進一步地包括防腐劑和/或抗微生物劑。這種防腐劑和/或試劑是本領(lǐng)域中是已知的。
通常，如本文所述的完整發(fā)酵液為液體，但也可含有不溶性成分，如殺死的細胞、細胞碎片、培養(yǎng)基成分和/或不溶性酶。在一些實施方式中，可去除不溶性成分以提供澄清的完整發(fā)酵液。
如上所述，酶組合物存在于本發(fā)明方法的步驟(d)和步驟(f)中。這些酶組合物可以相同或可以不同。此外，如上所述，在根據(jù)本發(fā)明方法的步驟(d)和/或步驟(f)期間加入額外的酶。加入的酶可以是已存在于步驟(d)和步驟(f)中的酶?；蛘撸鼈兛梢允遣煌拿?。此外，在步驟(d)期間添加的額外的酶與在根據(jù)本發(fā)明方法的步驟(f)期間添加的額外的酶可以不同或可以相同。
本文中使用的木質(zhì)纖維素材料包括任何木質(zhì)纖維素材料和/或半纖維素材料。適于用于本發(fā)明方法的木質(zhì)纖維素材料包括生物質(zhì)，例如原始生物質(zhì)(virginbiomass)和/或非原始生物質(zhì)如農(nóng)業(yè)生物質(zhì)，商業(yè)有機物，建筑和拆除碎片，市政固體廢棄物，廢紙和庭院廢棄物。常見的生物質(zhì)形式包括樹木，灌木叢(shrubs)和草，小麥，麥秸，甘蔗渣，柳枝稷，芒草(miscanthus)，能源甘蔗(energycane)，玉米，玉米稈(cornstover)，玉米殼，玉米芯(corncobs)，蕓苔莖，大豆莖，高粱，玉米粒(包括來自玉米粒的纖維)，來自谷物如玉米、小麥和大麥研磨(包括濕磨和干磨)的通常稱作“麩或纖維”的產(chǎn)物和副產(chǎn)物，以及市政固體廢棄物，廢紙和庭院廢棄物。生物質(zhì)也可以是但不限于草本材料，農(nóng)業(yè)殘余物，林業(yè)殘余物，市政固體廢棄物，廢紙，和漿和造紙廠殘余物。“農(nóng)業(yè)生物質(zhì)”包括樹枝，灌木(bushes)，藤蔓(canes)，玉米和玉米殼，能量作物，森林，水果，花，谷物，草，草本作物，樹葉，樹皮，針葉，原木，根，樹苗，短期輪種木本作物(short-rotationwoodycrops)，灌木叢，柳枝稷，樹木，蔬菜，水果皮，蔓藤(vines)，甜菜漿，小麥麩皮(wheatmidlings)，燕麥殼，和硬木材和軟木材(不包括帶有有害材料的木材)。另外，農(nóng)業(yè)生物質(zhì)包括由農(nóng)業(yè)加工產(chǎn)生的有機廢棄物材料，所述農(nóng)業(yè)加工包括農(nóng)業(yè)和林業(yè)活動，尤其包括林業(yè)木材廢棄物。農(nóng)業(yè)生物質(zhì)可以是前述任一或其任何組合或混合物。
纖維素是具有式(c6h10o5)n的有機化合物，一種由幾百到一萬多個β(1→4)連接的d-葡萄糖單元的直鏈組成的多糖。葡聚糖分子是通過糖苷鍵連接的d-葡萄糖單體的多糖。在本文，對于通過糖苷鍵連接的d-葡萄糖單體的多糖而言，葡聚糖和纖維素可互換地使用。用于定量分析葡聚糖或多糖組成的方法在本領(lǐng)域是公知的且進行了描述的，并且例如概述于carvalhodesouza等人，carbohydratepolymers95(2013)657-663中。通常，葡聚糖的50％到70％是結(jié)晶纖維素，剩余部分是無定形纖維素。
如上所述，可任選地預(yù)處理木質(zhì)纖維素材料。預(yù)處理方法是本領(lǐng)域中已知的，其包括但不限于熱、機械、化學修飾、生物修飾及其任意組合。通常，進行預(yù)處理以提高木質(zhì)纖維素材料中木質(zhì)纖維素材料對酶促水解的可接近性和/或水解半纖維素和/或使半纖維素和/或纖維素和/或木質(zhì)素溶解。在一種實施方式中，預(yù)處理包括用蒸汽爆破、熱水處理或稀酸或稀堿處理來處理木質(zhì)纖維素。
如上所述，可任選地清洗木質(zhì)纖維素材料。任選的清洗步驟可被用于去除可充當發(fā)酵步驟和/或水解步驟的抑制劑的水溶性化合物?？砂幢绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的方式進行清洗步驟。
本發(fā)明方法中使用的酶組合物可極其有效水解木質(zhì)纖維素材料，例如玉米稈或麥秸，然后其可被進一步轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物，例如乙醇、生物氣、丁醇、乳酸、塑料、有機酸、溶劑、動物飼料補充劑、藥物、維生素、氨基酸、酶或化學原料。此外，來自水解之后過程的中間產(chǎn)物(例如作為生物氣生產(chǎn)中的中間體的乳酸)可被用作其它材料的結(jié)構(gòu)單元。本發(fā)明利用乙醇生產(chǎn)進行示例，但這僅作為例證而非限制，提及的其它產(chǎn)物可被同樣地良好生產(chǎn)。
根據(jù)本發(fā)明的方法包括兩個酶促水解步驟：步驟(d)和步驟(f)。在步驟(d)中，主要為了液化木質(zhì)纖維素材料的目的進行水解；而在步驟(f)中，主要為了從木質(zhì)纖維素材料釋放糖的目的進行水解。根據(jù)木質(zhì)纖維素材料和預(yù)處理方法，技術(shù)人員可調(diào)節(jié)不同的反應(yīng)條件例如溫度、酶劑量、水解反應(yīng)時間和干物質(zhì)濃度，以實現(xiàn)期望的水解目的。一些指標在下文給出。
在一種實施方式中，根據(jù)本發(fā)明方法的步驟(d)和/或步驟(f)中的酶促水解在45℃或更高，50℃或更高，55℃或更高，60℃或更高，65℃或更高，或70℃或更高的溫度下進行。水解期間的高溫具有許多優(yōu)勢，所述優(yōu)勢包括在酶組合物的最適溫度下起作用、(細菌)污染風險降低、降低的粘性、需要更少量的冷卻水、使用具有更高溫度的冷卻水、酶的再利用和更多的優(yōu)勢。步驟(d)和/或步驟(f)中的酶促水解中使用的溫度可以不同或者可以相同。
在一種實施方式中，添加的酶組合物的量(本文中也稱為酶劑量或酶負載量)低。在一種實施方式中，酶的量是6mg蛋白/g干物質(zhì)重量或更低，5mg蛋白/g干物質(zhì)或更低，4mg蛋白/g干物質(zhì)或更低，3mg蛋白/g干物質(zhì)或更低，2mg蛋白/g干物質(zhì)或更低或1mg蛋白/g干物質(zhì)或更低(表示為mg蛋白/g干物質(zhì)形式的蛋白)。在一種實施方式中，酶的量是0.5mg酶/g干物質(zhì)重量或更低，0.4mg酶組合物/g干物質(zhì)重量或更低，0.3mg酶/g干物質(zhì)重量或更低，0.25mg酶/g干物質(zhì)重量或更低，0.20mg酶/g干物質(zhì)重量或更低，0.18mg酶/g干物質(zhì)重量或更低，0.15mg酶/g干物質(zhì)重量或更低或0.10mg酶/g干物質(zhì)重量或更低(表示為mg酶/g干物質(zhì)形式的總纖維素酶)。由于酶的活性和穩(wěn)定性，低酶劑量是可行的。在步驟(d)和/或步驟(f)中的酶促水解中添加的酶組合物的量可以不同或者可以相同。
在一種實施方式中，總水解時間是6小時或更長，10小時或更長，20小時或更長，40小時或更長，50小時或更長，60小時或更長，70小時或更長，80小時或更長，90小時或更長，100小時或更長，120小時或更長，130小時或更長。
在一種實施方式中，總水解時間是5-150小時，30-140小時，40-120小時，45-110小時，50-100小時，55-95小時，60-90小時，65-85小時或70-80小時。由于酶組合物的穩(wěn)定性，更長水解反應(yīng)時間是可行的，這對應(yīng)更高的糖產(chǎn)率。本文中使用的“總水解時間”表示步驟(d)和步驟(f)的反應(yīng)時間。
在一種實施方式中，根據(jù)本發(fā)明方法的步驟(d)中的酶促水解時間為3-30小時。
在一種實施方式中，根據(jù)本發(fā)明方法的步驟(f)中的酶促水解時間為3-120小時。
水解期間的ph可由技術(shù)人員選擇。在一種實施方式中，水解期間的ph可以是3.0-6.4。本發(fā)明的穩(wěn)定酶可具有高至2個ph單位，高至3個ph單位，高至5個ph單位的寬ph范圍。最適ph可位于ph2.0至8.0，2.5至7.5，3.0-7.0，3.5-6.5，4.0-5.0，4.0-4.5的界限內(nèi)或約4.2。步驟(d)和/或步驟(f)中的酶促水解中所使用的ph可以不同或者可以相同。步驟(d)和/或步驟(f)中的酶促水解中所使用的酶組合物的最適ph可以不同或者可以相同。
在一種實施方式中，進行水解步驟直到木質(zhì)纖維素材料中的70％或更多，80％或更多，85％或更多，90％或更多，92％或更多，95％或更多的可利用糖被釋放出。
顯著地，本發(fā)明的方法可在水解反應(yīng)中使用高水平的(木質(zhì)纖維素材料的)干物質(zhì)進行。在一種實施方式中，步驟(f)的水解結(jié)束時的干物質(zhì)含量為5wt％或更高、6wt％或更高、7wt％或更高、8wt％或更高、9wt％或更高、10wt％或更高、11wt％或更高、12wt％或更高、13wt％或更高、14wt％或更高、15wt％或更高、16wt％或更高、17wt％或更高、18wt％或更高、19wt％或更高、20wt％或更高、21wt％或更高、22wt％或更高、23wt％或更高、24wt％或更高、25wt％或更高、26wt％或更高、27wt％或更高、28wt％或更高、29wt％或更高、30wt％或更高、31wt％或更高、32wt％或更高、33wt％或更高、34wt％或更高、35wt％或更高、36wt％或更高、37wt％或更高、38wt％或更高、39wt％或更高或者40wt％或更高。
在一種實施方式中，在第二容器中進行根據(jù)本發(fā)明方法的步驟(h)中的發(fā)酵。因此，可以在一個容器中同時進行發(fā)酵和糖化(稱為ssf的方法)。或者，也可在第三容器中進行步驟(h)中的發(fā)酵。優(yōu)選地，在水解之后進行發(fā)酵，可以選擇對于水解和發(fā)酵二者的最佳條件，所述最佳條件對于水解和發(fā)酵可能是不同的。在另一個方面中，本發(fā)明因而包括分步驟發(fā)酵方法，其中微生物被用于發(fā)酵包含糖(例如葡萄糖、l-阿拉伯糖和/或木糖)的碳源。碳源可包括包含l-阿拉伯糖、木糖或葡萄糖單元的任何碳水化合物寡聚體或多聚體，例如木質(zhì)纖維素、木聚糖、纖維素、淀粉、阿拉伯聚糖等等。為了從這種碳水化合物釋放木糖或葡萄糖單元，可將適宜的碳水化合物酶(例如木聚糖酶、葡聚糖酶、淀粉酶等等)添加至發(fā)酵培養(yǎng)基或其可通過經(jīng)修飾的宿主細胞對其進行生產(chǎn)。在后者的情況下，經(jīng)修飾宿主細胞可被遺傳工程改造，以生產(chǎn)并分泌這種碳水化合物酶。使用葡萄糖的寡聚體或多聚體來源的另外優(yōu)勢是，其能在發(fā)酵期間保持低的(較低的)游離葡萄糖濃度，例如通過使用限制速率的碳水化合物酶的量。這繼而會防止對非葡萄糖的糖(例如木糖)代謝和運送所需體系的抑制。在一個優(yōu)選的方法中，經(jīng)修飾宿主細胞發(fā)酵l-阿拉伯糖(任選地木糖)和葡萄糖二者，優(yōu)選地同時發(fā)酵，這種情況下優(yōu)選地使用經(jīng)改造的宿主細胞，所述宿主細胞對葡萄糖抑制不敏感，以防止二次生長(diauxicgrowth)。除了l-阿拉伯糖來源，任選地木糖(和葡萄糖)作為碳源之外，發(fā)酵培養(yǎng)基將進一步包含經(jīng)修飾宿主細胞生長所需的適宜成分。用于微生物(例如酵母或絲狀真菌)生長的發(fā)酵培養(yǎng)基的組成在本領(lǐng)域眾所周知。
在相同條件下的發(fā)酵時間可比在常規(guī)發(fā)酵中更短，其中部分酶促水解在發(fā)酵期間仍必須參與。在一種實施方式中，就50g/l葡萄糖和來自木質(zhì)纖維素材料的相應(yīng)其它糖(例如50g/l木糖，35g/l的l-阿拉伯糖和10g/l的半乳糖)的糖組合而言，發(fā)酵時間是100小時或更短，90小時或更短，80小或更短，70小時或更短，或60小時或更短。對于更稀的糖組合物，可相應(yīng)減少發(fā)酵時間。
發(fā)酵方法可以是需氧或厭氧發(fā)酵方法。厭氧發(fā)酵方法在本文中被定義為下述發(fā)酵方法，所述發(fā)酵方法在沒有氧或基本上沒有氧被消耗的情況下進行，優(yōu)選地少于5、2.5或1mmol/l/h、更優(yōu)選地0mmol/l/h(即氧消耗未被檢測出)的氧被消耗的情況下進行，并且其中有機分子既作為電子供體又作為電子受體。沒有氧時，在糖酵解和生物質(zhì)形成中產(chǎn)生的nadh不可被氧化磷酸化所氧化。為解決該問題，許多微生物使用丙酮酸鹽或其衍生物之一作為電子和氫受體，因此再產(chǎn)生nad+。因而，在一個優(yōu)選的厭氧發(fā)酵方法中，丙酮酸鹽被用作電子(和氫受體)并被還原為發(fā)酵產(chǎn)物，例如乙醇、乳酸、3-羥基丙酸、丙烯酸、乙酸、琥珀酸、檸檬酸、蘋果酸、延胡索酸、氨基酸、1，3-丙烷-二醇、乙烯、甘油、丁醇、p-內(nèi)酰胺抗生素和頭孢菌素。在一個優(yōu)選的實施方式中，發(fā)酵方法是厭氧的。厭氧方法是有利的，因為其比需氧方法更便宜：需要較少專門的設(shè)備。而且，預(yù)計厭氧方法給出比需氧方法更高的產(chǎn)品產(chǎn)出。在需氧條件下，通常生物質(zhì)產(chǎn)率比在厭氧條件下更高。結(jié)果，通常在需氧條件下，期望的產(chǎn)物產(chǎn)率比在厭氧條件下低。
在另一實施方式中，發(fā)酵方法在限氧條件下。更優(yōu)選地，發(fā)酵方法是需氧的并在限氧條件下。限氧發(fā)酵方法是這樣的方法，其中氧消耗被氧從氣體至液體的轉(zhuǎn)化所限制。氧限制的程度由進入氣流的量和組成以及使用的發(fā)酵設(shè)備的實際的混合/質(zhì)量轉(zhuǎn)移特性確定。優(yōu)選地，在限氧條件下的方法中，氧消耗速率為至少5.5，更優(yōu)選地至少6和甚至更優(yōu)選地至少7mmol/l/h。
發(fā)酵方法優(yōu)選地在對經(jīng)修飾細胞而言最佳的溫度下運行。因而，對于大多數(shù)酵母或真菌細胞而言，發(fā)酵方法在低于42℃，優(yōu)選地低于38℃下的溫度下進行。對于酵母或絲狀真菌宿主細胞而言，發(fā)酵方法優(yōu)選地在低于35、33、30或28℃的溫度下并在高于20、22或25℃的溫度下進行。
在本發(fā)明的一種實施方式中，在步驟(h)中，用能夠發(fā)酵至少一種c5糖的微生物進行發(fā)酵。在一種實施方式中，所述方法是用于乙醇生產(chǎn)的方法，其中所述方法包括用能發(fā)酵至少一種c5糖的微生物發(fā)酵含糖培養(yǎng)基的步驟。微生物可以是原核或真核生物。用于所述方法中的微生物可以是經(jīng)遺傳修飾的微生物。合適生物的實例為酵母，例如saccharomyces例如saccharomycescerevisiae，hansenula，issatchenkia，例如issatchenkiaorientalis，pichia，例如pichiastipitis或細菌，例如lactobacillus，例如lactobacilluslactis，geobacillus，zymomonas，例如zymomonasmobilis，clostridium，例如clostridiumphytofermentans。在一種實施方式中，能發(fā)酵至少一種c5糖的微生物是酵母。在一種實施方式中，酵母屬于saccharomyces屬，優(yōu)選地是saccharomycescerevisiae種。根據(jù)本發(fā)明方法的步驟(h)中使用的酵母(例如saccharomycescerevisiae)能夠轉(zhuǎn)化己(c6)糖和戊(c5)糖。根據(jù)本發(fā)明方法的步驟(h)中使用的酵母(例如saccharomycescerevisiae)能夠厭氧發(fā)酵至少一種c6糖和至少一種c5糖。例如，除了葡萄糖之外，酵母還能夠厭氧利用l-阿拉伯糖和木糖。在一種實施方式中，酵母能夠?qū)-阿拉伯糖轉(zhuǎn)化成l-核酮糖和/或木酮糖5-磷酸和/或轉(zhuǎn)化成期望的發(fā)酵產(chǎn)物，例如轉(zhuǎn)化成乙醇。能夠由l-阿拉伯糖產(chǎn)生乙醇的生物體(例如saccharomycescerevisiae菌株)可通過修飾宿主酵母引入來自合適來源的araa(l-阿拉伯糖異構(gòu)酶)、arab(l-核酮糖二草酸酯)和arad(l-核酮糖-5-p4-差向異構(gòu)酶)基因來產(chǎn)生?？蓪⑦@些基因引入宿主細胞中以使所述宿主細胞能夠利用阿拉伯糖。wo2003/095627中描述了這種方法。來自lactobacillusplantarum的araa、arab和arad基因可以使用并公開在wo2008/041840中。來自bacillussubtilis的araa基因以及來自escherichiacoli的arab和arad基因可以使用并公開在ep1499708中。在另一種實施方式中，araa、arab和arad基因可來源于clavibacter、arthrobacter和/或gramella屬中的至少一種，特別是clavibactermichiganensis、arthrobacteraurescens和/或gramellaforsetii中的一種，如wo2009011591中所公開的那樣。在一種實施方式中，酵母還可以包含一個或多個拷貝的木糖異構(gòu)酶基因和/或一個或多個拷貝的木糖還原酶和/或木糖醇脫氫酶。
酵母可以包含一種或多種遺傳修飾以允許酵母發(fā)酵木糖。遺傳修飾的實例有引入一個或多個xyla-基因、xyl1基因和xyl2基因和/或xks1-基因；缺失醛糖還原酶(gre3)基因；過表達ppp-基因tal1、tkl1、rpe1和rki1以允許通過細胞中戊糖磷酸途徑的通量增加。遺傳工程酵母的實例描述于ep1468093和/或wo2006/009434中。
合適商業(yè)酵母的實例有rn1016，其是來自荷蘭dsm的發(fā)酵木糖和葡萄糖的saccharomycescerevisiae菌株。
在一種實施方式中，用于生產(chǎn)乙醇的發(fā)酵方法是厭氧的。厭氧已在本文上文定義過。在另一優(yōu)選的實施方式中，用于生產(chǎn)乙醇的發(fā)酵方法是需氧的。在另一優(yōu)選的實施方式中，用于生產(chǎn)乙醇的發(fā)酵方法在限氧條件下，更優(yōu)選地所述方法是需氧的和在限氧條件下。限氧條件已在本文上文定義過。
乙醇體積生產(chǎn)率優(yōu)選地為至少0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、5.0或10.0g乙醇/升/小時。方法中基于l-阿拉伯糖和任選的木糖和/或葡萄糖的乙醇產(chǎn)率優(yōu)選地為至少20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、95或98％。乙醇產(chǎn)率在本文中被定義為理論最大產(chǎn)率的百分比，對于葡萄糖、l-阿拉伯糖和任選的木糖，理論最大產(chǎn)率為0.51g乙醇/g葡萄糖或木糖。
在一個方面中，與已知乙醇發(fā)酵方法相比，導致乙醇生產(chǎn)的發(fā)酵方法具有若干優(yōu)勢：厭氧方法是可行的；限氧條件是可行的；可獲得較高的乙醇產(chǎn)率和乙醇生產(chǎn)速率；使用的菌株可以能夠使用l-阿拉伯糖和任選地木糖。
替代上述發(fā)酵方法，可使用至少兩種有區(qū)別的細胞，這表示該方法是共發(fā)酵方法。如上所述的發(fā)酵方法的所有優(yōu)選實施方式也是該共發(fā)酵方法的優(yōu)選實施方式：發(fā)酵產(chǎn)物類別、l-阿拉伯糖來源和木糖來源類別、發(fā)酵條件(需氧或厭氧條件、限氧條件、方法進行的溫度、乙醇生產(chǎn)力、乙醇產(chǎn)率)。
可進行發(fā)酵方法而完全無需在發(fā)酵期間調(diào)節(jié)ph。也就是說，所述方法是不用添加任何酸或堿即可進行的方法。然而，這排除了可添加酸的預(yù)處理步驟。要點是本發(fā)明方法中使用的酶組合物能在低ph下起作用，因而不需要為了水解可發(fā)生而調(diào)整酸預(yù)處理原料的酸的ph。因此，本發(fā)明的方法可以是僅使用有機產(chǎn)物不需要無機化學輸入的零廢物方法。
可減少總反應(yīng)時間(或水解步驟和發(fā)酵步驟合起來的反應(yīng)時間)。在一種實施方式中，90％葡萄糖產(chǎn)率下的總反應(yīng)時間為300小時或更少，200小時或更少，150小時或更少，140小時或更少，130小時或更少，120小時或更少，110小時或更少，100小時或更少，90小時或更少，80小時或更少，75小時或更少，或約72小時。相應(yīng)地，在更低的葡萄糖產(chǎn)率下可達到更少總反應(yīng)時間。
可通過本發(fā)明方法生產(chǎn)的發(fā)酵產(chǎn)物包括氨基酸、維生素、藥物、動物飼料補充物、特種化學品、化學原料、塑料、溶劑、燃料或其它有機聚合物、乳酸和乙醇包括燃料乙醇(術(shù)語“乙醇”被理解為包括乙基醇(ethylalcohol)或乙基醇和水的混合物)。
可通過本發(fā)明的方法生產(chǎn)的具體的價值增加產(chǎn)物包括但不限于，生物燃料(包括生物氣、乙醇和丁醇)；乳酸；3-羥基-丙酸；丙烯酸；乙酸；1，3-丙烷-二醇；乙烯；甘油；塑料；特種化學品；有機酸，包括檸檬酸、琥珀酸和馬來酸；溶劑；動物飼料補充物；藥物例如β-內(nèi)酰胺抗生素或頭孢菌素；維生素；氨基酸，例如賴氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、蘇氨酸和天冬氨酸；酶例如蛋白酶、纖維素酶、淀粉酶、葡聚糖酶、乳糖酶、脂肪酶、裂解酶、氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶或木聚糖酶；化學原料；或動物飼料補充物。
根據(jù)本發(fā)明的方法任選地包括回收發(fā)酵產(chǎn)物?？梢砸员绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的方式從發(fā)酵液中分離發(fā)酵產(chǎn)物。對于每種發(fā)酵產(chǎn)物，技術(shù)人員能選擇合適的分離技術(shù)。例如，可以以常規(guī)方式通過蒸餾(例如蒸汽蒸餾/真空蒸餾)將乙醇從酵母發(fā)酵液中分離出。
針對若干木質(zhì)纖維素材料發(fā)現(xiàn)了本發(fā)明的有益效果，因此認為對于各種木質(zhì)纖維素材料的水解均存在所述有益效果。針對若干酶組合物發(fā)現(xiàn)了本發(fā)明的這種有益效果，因此認為對于各種水解酶組合物均存在所述有益效果。
實施例
實施例1
液化過程中木質(zhì)纖維素材料和酶組合物加入水解容器的順序的效果
為了顯示液化過程中木質(zhì)纖維素材料和酶組合物加入水解容器的順序的效果，進行以下實驗。
在兩個攪拌的容器a和b中，利用預(yù)處理的木質(zhì)纖維素材料(37％(w/w)干物質(zhì)的甘蔗秸稈)和酶組合物(100mg富含bg的ewb-ce/gdm)在62℃的溫度和ph4.5下水解8.4小時。
如wo2011/000949中所述生產(chǎn)含tec-210纖維素酶的組合物。含tec-210纖維素酶的組合物(ewb-ce)的完整培養(yǎng)液包含44mg蛋白質(zhì)/g完整培養(yǎng)液。
用349g50mm檸檬酸填充容器a，然后加入預(yù)處理的木質(zhì)纖維素材料(在表1中稱為生物質(zhì))。接下來，將酶組合物加入容器中的木質(zhì)纖維素材料中。此后，將酶組合物和木質(zhì)纖維素材料以表1所述的補料分批模式加入容器中(t＝0時，將1.8g酶組合物加入容器中存在的31g預(yù)處理的木質(zhì)纖維素材料中)。
用349g50mm檸檬酸和酶組合物的總量(24.2g)填充容器b，然后以表1所述的補料分批模式加入預(yù)處理的木質(zhì)纖維素材料(t＝0時，將31g預(yù)處理的木質(zhì)纖維素材料加入容器中存在的全部酶組合物中)。
在水解期間追蹤水解混合物的粘度，并利用brookfielddviii流變儀在1rpm和62℃的溫度下測定。
在酶促水解開始后的第8.4小時加入最終部分。在該時間點，容器a和容器b含有總計430g經(jīng)預(yù)處理的木質(zhì)纖維素材料和24.2g酶組合物，其對應(yīng)于0.056g酶組合物/g預(yù)處理的木質(zhì)纖維素材料。8.4小時后的干物質(zhì)含量為20％(w/w)。
粘度測量的結(jié)果顯示在表2中。結(jié)果顯示：在將木質(zhì)纖維素材料加入已包含酶組合物的容器中的容器b，粘度低于將酶組合物加入存在于容器中的木質(zhì)纖維素材料的粘度。換句話說，當酶促水解的生物質(zhì)進料階段開始時所有酶已存在于水解容器中時，粘度低于將酶加入生物質(zhì)中情況下的粘度。較低的粘度降低了混合的功率輸入要求，其在大規(guī)模時特別重要，并且由于進料階段期間液化木質(zhì)纖維素材料的均勻性增加，從而有利于可重現(xiàn)的取樣。在酶促水解開始時使容器中存在酶組合物(如容器b中)還簡化了過程，這是因為只有一個流必須加入容器中(在容器b中，僅木質(zhì)纖維素材料必須加入；而在容器中，需要加入木質(zhì)纖維素材料和酶組合物)。這種簡化降低了過程失敗的風險。
實施例2
液化過程中將木質(zhì)纖維素材料補料分批加入和分批加入包含酶組合物的水解容器中的效果
為了證明向含有酶組合物的容器中補料分批加入木質(zhì)纖維素材料(在表3中稱為生物質(zhì))相對于向含有酶組合物的容器中分批加入木質(zhì)纖維素材料具有優(yōu)勢，進行以下實驗。
將含有如表3中給出的量的檸檬酸(50mm，ph4.5)和酶組合物的8個相似容器加熱至62℃。將預(yù)處理的木質(zhì)纖維素材料(37％(w/w)干物質(zhì)的甘蔗秸稈)以表3中給出的量分批加入容器1-7中，以使得在酶促水解開始時獲得不同的干物質(zhì)含量。
混合木質(zhì)纖維素材料和酶組合物之后，使用brookfielddviii流變儀在62℃的溫度下測量粘度。測量的粘度代表不同干物質(zhì)含量下木質(zhì)纖維素材料的酶促水解開始時的粘度。
將木質(zhì)纖維素材料以補料分批模式加入容器8中。表3中所示的檸檬酸緩沖液的量(2169g)和酶組合物的量(101g)在酶促水解開始時即存在。接下來，按份(補料分批)加入木質(zhì)纖維素材料，達到表3中給出的生物質(zhì)水平。每次添加之間的時間為1小時。因此，首先向容器中加入176g生物質(zhì)以得到176g生物質(zhì)總量；1小時后，向容器中加入594g生物質(zhì)以得到770g生物質(zhì)總量；另外1小時后，向容器中加入392g生物質(zhì)以得到1162g生物質(zhì)總量等等。在補料分批添加木質(zhì)纖維素材料結(jié)束時，獲得了20％(w/w)干物質(zhì)和0.1g酶/g生物質(zhì)dm的酶劑量。在混合木質(zhì)纖維素材料和酶組合物后，使用brookfielddviii流變儀在62℃的溫度下測量粘度。
表3清楚顯示：相較于向含有酶組合物的容器中分批加入木質(zhì)纖維素材料，向含有酶組合物的容器中補料分批加入木質(zhì)纖維素材料導致更低的粘度。對于高于和低于10％(w/w)的干物質(zhì)含量，情況是如此。
表1：在容器a和b中液化期間，木質(zhì)纖維素材料和酶組合物的添加
表2：粘度測量
表3：在不同干物質(zhì)水平下進行酶水解的容器1-8的含量