本發(fā)明涉及作為gal2變異體的多肽，其在與t354對(duì)應(yīng)的位置處包含至少一個(gè)氨基酸取代和任選地其它氨基酸取代。本發(fā)明另外涉及編碼所述多肽的核酸分子并且涉及含有所述核酸分子的宿主細(xì)胞。本發(fā)明另外涉及用于生產(chǎn)生物乙醇和/或其它生物基化合物的方法，其包含所述核酸分子優(yōu)選地在所述宿主細(xì)胞中的表達(dá)。本發(fā)明還涉及所述多肽、核酸分子或宿主細(xì)胞的用途，其用于生物乙醇和/或其它生物基化合物的生產(chǎn)，和/或用于含有戊糖(優(yōu)選地d-木糖和/或l-阿拉伯糖)的生物材料的重組發(fā)酵。
背景技術(shù)：
：啤酒、葡萄酒和烘焙酵母釀酒酵母(saccharomycescerevisiae)因其將糖發(fā)酵成乙醇和二氧化碳的特征而已用于面包、葡萄酒和啤酒的生產(chǎn)數(shù)個(gè)世紀(jì)。在生物技術(shù)中，釀酒酵母除生產(chǎn)異源蛋白質(zhì)以外，還特別用于生產(chǎn)乙醇用于工業(yè)目的。乙醇作為用于合成的初始底物而用于許多工業(yè)分支。由于油的存在愈加稀少，油價(jià)升高和全世界對(duì)石油的需求持續(xù)增加，所以乙醇作為一種替代燃料變得愈加重要。此外，釀酒酵母也用于生產(chǎn)其它生物燃料或有價(jià)值的生化化合物，如異丁醇、丁二酸、法呢烯/法呢烯或青蒿素。為了使價(jià)格實(shí)惠并且高效的生物燃料生產(chǎn)成為可能，提出使用含有木質(zhì)纖維素的生物質(zhì)本身作為初始底物，如秸稈、來(lái)自木材工業(yè)和農(nóng)業(yè)的廢料以及日常生活垃圾的有機(jī)組分。首先，所述生物質(zhì)是非常方便的，并且其次大量存在。木質(zhì)纖維素的三種主要組分是木質(zhì)素、纖維素和半纖維素。半纖維素，在纖維素之后第二種最常出現(xiàn)的聚合物，是一種高度支化的雜聚物。它由戊糖(l-阿拉伯糖、d-木糖)、糖醛酸(4-o-甲基-d-葡糖醛酸、d-半乳糖醛酸)和己糖(d-甘露糖、d-半乳糖、l-鼠李糖、d-葡萄糖)組成。雖然半纖維素可以比纖維素更易水解，但是它含有通常無(wú)法由酵母釀酒酵母轉(zhuǎn)化的戊糖l-阿拉伯糖和d-木糖。為了能夠使用戊糖進(jìn)行發(fā)酵，這些戊糖必須首先穿過(guò)質(zhì)膜進(jìn)入細(xì)胞。雖然釀酒酵母不能代謝d-木糖或l-阿拉伯糖，但是它可以將d-木糖或l-阿拉伯糖吸收至細(xì)胞中。然而，釀酒酵母不具有特異性轉(zhuǎn)運(yùn)體。轉(zhuǎn)運(yùn)借助于己糖轉(zhuǎn)運(yùn)體來(lái)進(jìn)行。然而，所述轉(zhuǎn)運(yùn)體對(duì)d-木糖的親和力明顯低于d-葡萄糖(kotter和ciriacy,1993)。在如樹(shù)干畢赤酵母(p.stipitis)、休哈塔假絲酵母(c.shehatae)或嗜鞣管囊酵母(p.tannophilus)等能夠代謝d-木糖的酵母(dupreez等人,1986)中，轉(zhuǎn)運(yùn)d-葡萄糖的非特異性低親和力轉(zhuǎn)運(yùn)體以及僅針對(duì)d-木糖的特異性高親和力質(zhì)子同向轉(zhuǎn)運(yùn)體都存在(hahn-hagerdal等人,2001)。在早期實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)一些酵母，如熱帶假絲酵母(candidatropicalis)、嗜鞣管囊酵母(pachysolentannophilus)、樹(shù)干畢赤酵母(pichiastipitis)、休哈塔假絲酵母(candidashehatae)，天生發(fā)酵d-木糖或l-阿拉伯糖或可以至少將其同化。然而，這些酵母完全缺乏將l-阿拉伯糖和d-木糖發(fā)酵成乙醇的能力，或它們僅具有極低乙醇產(chǎn)率(dien等人,1996)。此外，關(guān)于d-木糖和l-阿拉伯糖的吸收幾乎仍未知曉。在酵母休哈塔假絲酵母中，有人假設(shè)質(zhì)子同向轉(zhuǎn)運(yùn)(lucas和uden,1986)。在釀酒酵母中，由半乳糖通透酶gal2已知它可以轉(zhuǎn)運(yùn)d-木糖并且還轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)與d-半乳糖極其類(lèi)似的l-阿拉伯糖。(kou等人,1970)。大部分己糖轉(zhuǎn)運(yùn)體可以介導(dǎo)d-木糖的吸收。近年來(lái)特別結(jié)合木糖的發(fā)酵描述戊糖在釀酒酵母的經(jīng)生物技術(shù)修飾的酵母菌株中的醇類(lèi)發(fā)酵，其中尤其使用酵母菌株樹(shù)干畢赤酵母的各種基因進(jìn)行釀酒酵母的基因修飾。工程改造在此處特別集中于將來(lái)自樹(shù)干畢赤酵母(木糖發(fā)酵酵母)的初始木糖同化基因引入到釀酒酵母中，即到傳統(tǒng)上用于由己糖生產(chǎn)乙醇的酵母中(jin等人2004)。jeppson等人(2006)描述借助于引入與天然利用木糖的酵母樹(shù)干畢赤酵母和休哈塔假絲酵母中類(lèi)似或與細(xì)菌代謝途徑類(lèi)似的木糖代謝途徑而由釀酒酵母發(fā)酵木糖。katahira等人(2006)描述了木質(zhì)纖維素生物質(zhì)(如木屑)的硫酸水解產(chǎn)物作為燃料生物乙醇生產(chǎn)的重要材料。在這一研究中，構(gòu)建能夠發(fā)酵木糖和纖維寡糖的重組酵母菌株。為此，將多種基因整合到此酵母菌株中，即用于細(xì)胞間表達(dá)來(lái)自樹(shù)干畢赤酵母的木糖還原酶和木糖醇脫氫酶以及來(lái)自釀酒酵母的木酮糖激酶并且用于在細(xì)胞表面上呈現(xiàn)來(lái)自棘孢曲霉(aspergillusacleatus)的β-葡糖苷酶。在木屑的硫酸水解產(chǎn)物發(fā)酵中，木糖和纖維寡糖在36小時(shí)之后被重組菌株充分發(fā)酵。pitkanen等人(2005)描述了釀酒酵母菌株的木糖恒化分離株的獲得和表征，所述分離株過(guò)度表達(dá)編碼木糖還原酶和木糖醇脫氫酶的樹(shù)干畢赤酵母的基因和編碼內(nèi)源性木酮糖激酶的基因。所述分離株是從以木糖作為單個(gè)或主要碳源的好氧恒化培養(yǎng)物獲得。在好氧條件下在具有30g/l木糖的基本培養(yǎng)基上，恒化分離株的生長(zhǎng)速率比原始菌株高3倍(0.15h-1相比于0.05h-1)。木糖吸收率增加幾乎兩倍。戊糖磷酸代謝途徑的關(guān)鍵酶(轉(zhuǎn)酮醇酶、轉(zhuǎn)醛醇酶)的活性增加兩倍，而其底物(戊糖-5-磷酸、景天庚酮糖-7-磷酸)的濃度因此降低。brat等人(2009)篩選核酸數(shù)據(jù)庫(kù)關(guān)于編碼假定的木糖異構(gòu)酶的序列并且最后能夠克隆并在釀酒酵母中成功表達(dá)來(lái)自厭氧細(xì)菌植物發(fā)酵梭菌(clostridiumphytofermentans)的高活性新種類(lèi)的木糖異構(gòu)酶。此酶的異源表達(dá)賦予酵母細(xì)胞代謝d-木糖和使用其作為唯一的碳和能量來(lái)源的能力。demeke等人(2013)研發(fā)出一種含有13個(gè)基因的表達(dá)盒，所述基因包括編碼d-木糖異構(gòu)酶的植物發(fā)酵梭菌xyla和戊糖磷酸途徑的酶，并且將所述盒插入在工業(yè)釀酒酵母菌株ethanolred基因組的兩個(gè)復(fù)本中。隨后進(jìn)行ems突變誘發(fā)、基因組重排和在d-木糖富集的木質(zhì)纖維素水解產(chǎn)物中選擇，接著在具有d-木糖的復(fù)合培養(yǎng)基中進(jìn)行多輪進(jìn)化工程改造，逐漸建立非常高效的d-木糖發(fā)酵。becker和boles(2003)描述了釀酒酵母實(shí)驗(yàn)室菌株的工程改造和選擇，所述菌株能夠使用l-阿拉伯糖進(jìn)行生長(zhǎng)并且使其發(fā)酵成乙醇。這可能歸因于由枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)araa以及大腸桿菌arab和arad組成的細(xì)菌l-阿拉伯糖代謝途徑的過(guò)度表達(dá)和同時(shí)在酵母菌株中轉(zhuǎn)運(yùn)l-阿拉伯糖的酵母半乳糖通透酶的過(guò)度表達(dá)。所選菌株的分子分析顯示使用l-阿拉伯糖的預(yù)定前提是l-核酮糖激酶的活性較低。然而，尤其報(bào)告此酵母菌株生長(zhǎng)極慢。wiedemann和boles(2008)顯示來(lái)自地衣芽孢桿菌(bacilluslicheniformis)的l-阿拉伯糖異構(gòu)酶和來(lái)自大腸桿菌的l-核酮糖激酶和l-核酮糖-5-p4-差向異構(gòu)酶的密碼子優(yōu)化基因的表達(dá)有力地提高l-阿拉伯糖轉(zhuǎn)化率。farwick等人(2014)研發(fā)出一種新的用于篩選和工程改造戊糖轉(zhuǎn)運(yùn)體的系統(tǒng)，所述戊糖轉(zhuǎn)運(yùn)體不再受葡萄糖抑制。此系統(tǒng)是基于所有己糖轉(zhuǎn)運(yùn)體和所有己糖/葡糖激酶缺失的d-木糖發(fā)酵酵母菌株(hxt0hxk0菌株)。d-葡萄糖可以不再用作碳源，但是在轉(zhuǎn)運(yùn)水平下干擾d-木糖利用率。因此，可易于選擇允許在濃度增加的d-葡萄糖存在下吸收d-木糖的突變型轉(zhuǎn)運(yùn)體。在進(jìn)化工程改造和突變誘發(fā)方法中使用此系統(tǒng)，作者能夠由釀酒酵母己糖轉(zhuǎn)運(yùn)體生成特異性d-木糖轉(zhuǎn)運(yùn)體。這些突變型轉(zhuǎn)運(yùn)體中的一些在與半乳糖轉(zhuǎn)運(yùn)體gal2的n376對(duì)應(yīng)的位置處具有更換。然而，雖然它們證明具有針對(duì)葡萄糖的抗性，但是其中大部分對(duì)木糖的吸收率降低。wo2008/080505a1公開(kāi)了一種來(lái)自樹(shù)干畢赤酵母的阿拉伯糖轉(zhuǎn)運(yùn)體，其使得酵母細(xì)胞能夠吸收l(shuí)-阿拉伯糖。ep11001841.3公開(kāi)了一種用于構(gòu)建戊糖發(fā)酵酵母的植物擬南芥(arabidopsisthaliana)的特異性阿拉伯糖轉(zhuǎn)運(yùn)體。wo2012/049170a2和wo2012/049173a1公開(kāi)了戊糖和葡萄糖發(fā)酵酵母細(xì)胞，其除了其它核酸之外含有并且表達(dá)具有阿拉伯糖通透酶活性的多肽，所述多肽包含gal2在位置t219變成天冬酰胺或n376變成絲氨酸的突變，使得轉(zhuǎn)運(yùn)體具有針對(duì)葡萄糖的抑制性作用的抗性。所屬領(lǐng)域中仍需要特異性戊糖轉(zhuǎn)運(yùn)體，尤其特異性d-木糖轉(zhuǎn)運(yùn)體，其對(duì)戊糖具有較高親和力和/或較高活性，尤其與葡萄糖抗性組合，允許特異性吸收d-木糖和/或l-阿拉伯糖至細(xì)胞(如酵母細(xì)胞)中，即使在低戊糖濃度下仍具有高吸收率，并且因此促進(jìn)戊糖(尤其d-木糖和/或l-阿拉伯糖)的利用和發(fā)酵，并且尤其在同時(shí)存在葡萄糖的情況下。因此，本發(fā)明的一個(gè)目標(biāo)是提供經(jīng)改善和/或更具特異性的轉(zhuǎn)運(yùn)體，其以較高活性和/或較高親和力轉(zhuǎn)運(yùn)戊糖，如d-木糖和/或l-阿拉伯糖。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：根據(jù)本發(fā)明，此目標(biāo)是由在與seqidno:1氨基酸序列的t354對(duì)應(yīng)的位置處包含至少一個(gè)氨基酸取代的多肽來(lái)實(shí)現(xiàn)，其中所述多肽與seqidno:1氨基酸序列具有至少60％、或優(yōu)選地至少70％或80％或90％或95％序列一致性，并且其中所述多肽具有活體外和/或活體內(nèi)戊糖轉(zhuǎn)運(yùn)功能。根據(jù)本發(fā)明，此目標(biāo)是由編碼本發(fā)明的多肽的核酸分子來(lái)實(shí)現(xiàn)。根據(jù)本發(fā)明，此目標(biāo)是由含有本發(fā)明的核酸分子并且優(yōu)選地表達(dá)所述核酸分子的宿主細(xì)胞來(lái)實(shí)現(xiàn)，其中所述宿主細(xì)胞優(yōu)選地是真菌細(xì)胞并且更優(yōu)選地是酵母細(xì)胞，如酵母屬(saccharomycesspecies)、克魯維酵母屬(kluyveromycessp.)、漢遜酵母屬(hansenulasp.)、畢赤酵母屬(pichiasp.)或耶氏酵母屬(yarrowiasp.)。根據(jù)本發(fā)明，此目標(biāo)是通過(guò)一種用于生產(chǎn)生物乙醇和/或其它生物基化合物的方法來(lái)實(shí)現(xiàn)，所述方法包含優(yōu)選地在根據(jù)本發(fā)明的宿主細(xì)胞中表達(dá)根據(jù)本發(fā)明的核酸分子。根據(jù)本發(fā)明，此目標(biāo)是通過(guò)將根據(jù)本發(fā)明的多肽、根據(jù)本發(fā)明的核酸分子或根據(jù)本發(fā)明的宿主細(xì)胞用于生物乙醇和/或其它生物基化合物的生產(chǎn)，和/或用于含有戊糖(優(yōu)選地d-木糖和/或l-阿拉伯糖)的生物材料的重組發(fā)酵來(lái)實(shí)現(xiàn)。具體實(shí)施方式在下文更詳細(xì)地描述本發(fā)明之前，應(yīng)理解本發(fā)明不限于本文中所描述的具體方法論、方案和試劑，因?yàn)檫@些都可以改變。還應(yīng)理解，本文中所用的術(shù)語(yǔ)僅用于描述具體實(shí)施例的目的，并且不打算限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的范圍將僅受所附權(quán)利要求書(shū)限制。除非另有定義，否則本文中所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)都具有與所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常所理解相同的含義。出于本發(fā)明的目的，本文中所列舉的所有參考文獻(xiàn)都以全文引用的方式并入。gal2變異體如上文所論述，本發(fā)明提供gal2變異體。具體來(lái)說(shuō)，本發(fā)明提供一種多肽，其在與seqidno:1氨基酸序列的t354對(duì)應(yīng)的位置處包含至少一個(gè)氨基酸取代。本發(fā)明的多肽與seqidno:1氨基酸序列具有至少60％、或優(yōu)選地至少70％或80％或90％或95％序列一致性，并且具有活體外和/或活體內(nèi)戊糖轉(zhuǎn)運(yùn)功能。優(yōu)選地，本發(fā)明的多肽是釀酒酵母的gal2。seqidno:1是cen.pk2-1c和cen.pk113-7d的gal2的野生型蛋白質(zhì)或氨基酸序列。cen.pk2-1c的gal2是具有574個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。http://www.yeastgenome.org/cgi-bin/fungi/getseq.pl？seq＝y(tǒng)lr081w_cen.pk113-7d根據(jù)本發(fā)明的多肽，優(yōu)選地gal2變異體，在與seqidno:1氨基酸序列或與seqidno:1氨基酸序列至少60％一致、優(yōu)選地至少70％一致、更優(yōu)選地至少80％一致、甚至更優(yōu)選地至少90％一致、更優(yōu)選地95％一致并且更優(yōu)選地99％一致的氨基酸序列的t354對(duì)應(yīng)的位置處包含至少一個(gè)氨基酸取代。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“在與……對(duì)應(yīng)的位置處”意思指seqidno:1中的相應(yīng)位置，然而，其在相關(guān)多肽鏈中可以具有另一相對(duì)位置編號(hào)。等效取代可以通過(guò)比較兩個(gè)序列中的位置來(lái)確定，所述序列可以出于比較目的進(jìn)行比對(duì)。氨基酸的相對(duì)位置可以由于相關(guān)多肽的不同長(zhǎng)度或相關(guān)多肽中氨基酸的缺失或添加而改變。根據(jù)本發(fā)明的多肽，優(yōu)選地gal2變異體，具有活體外和/或活體內(nèi)戊糖轉(zhuǎn)運(yùn)功能，尤其活體外和/或活體內(nèi)d-木糖和/或l-阿拉伯糖轉(zhuǎn)運(yùn)功能。優(yōu)選地，戊糖是d-木糖和/或l-阿拉伯糖。如本文所用，如果未另外指出，那么術(shù)語(yǔ)“木糖”意思與d-木糖相同，“阿拉伯糖”意思與l-阿拉伯糖相同，并且“葡萄糖”意思與d-葡萄糖相同。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“百分比(％)一致”是指兩個(gè)氨基酸序列之間的序列一致性。一致性可以通過(guò)比較兩個(gè)序列中的位置來(lái)確定，所述序列可以出于比較的目的進(jìn)行比對(duì)。當(dāng)比較序列中的等效位置被相同氨基酸占據(jù)時(shí)，分子被視為在所述位置處一致。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“功能等效物”是指與seqidno.1氨基酸序列并非100％一致并且包含與具有seqidno:1氨基酸序列的蛋白質(zhì)相比不更改或改變蛋白質(zhì)的活性或功能的氨基酸添加和/或插入和/或缺失和/或取代和/或更換的氨基酸序列，即“功能等效物”例如涵蓋具有保守氨基酸取代或較小缺失和/或插入的氨基酸序列，只要這些修飾不實(shí)質(zhì)上影響活體外和/或活體內(nèi)l-阿拉伯糖轉(zhuǎn)運(yùn)功能即可。一般來(lái)說(shuō)，所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員了解以下事實(shí)：蛋白質(zhì)的氨基酸序列中的一些氨基酸更換對(duì)所述蛋白質(zhì)的(二級(jí)或三級(jí))結(jié)構(gòu)、功能和/或活性不具有影響。與本文中所公開(kāi)的氨基酸序列相比具有這類(lèi)“中性”氨基酸更換的氨基酸序列屬于本發(fā)明的范圍。在一優(yōu)選實(shí)施例中，根據(jù)本發(fā)明的在與seqidno.1的t354對(duì)應(yīng)的位置處包含至少一個(gè)氨基酸取代的多肽，優(yōu)選地gal2變異體，包含氨基酸取代t354a。優(yōu)選地，在與t354對(duì)應(yīng)的位置處的氨基酸取代與無(wú)這類(lèi)氨基酸取代的多肽相比增加活體外和/或活體內(nèi)戊糖轉(zhuǎn)運(yùn)功能的活性。優(yōu)選地，在與t354對(duì)應(yīng)的位置處的氨基酸取代與無(wú)這類(lèi)氨基酸取代的多肽相比增加多肽對(duì)戊糖的親和力。-其它氨基酸取代在一個(gè)實(shí)施例中，根據(jù)本發(fā)明的多肽，優(yōu)選地gal2變異體，包含其它氨基酸取代：優(yōu)選地在與seqidno:1氨基酸序列的v71對(duì)應(yīng)的位置處的氨基酸取代。所述其它氨基酸取代優(yōu)選地是v71i。本發(fā)明優(yōu)選地提供以下多肽/gal2變異體：-t354a-t354a/v71i核酸分子如上文所論述，本發(fā)明提供一種核酸分子，其編碼根據(jù)本發(fā)明的多肽。在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的核酸分子另外包含：-載體核酸序列，優(yōu)選地表達(dá)載體序列，和/或-啟動(dòng)子核酸序列和終止子核酸序列，和/或-包含其它調(diào)控核酸序列。在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的核酸分子包含dsdna、ssdna、pna、cna、rna或mrna或其組合。根據(jù)本發(fā)明的核酸分子優(yōu)選地包含與天然存在的核酸序列一致(除添加根據(jù)本發(fā)明的氨基酸取代以外)或經(jīng)密碼子優(yōu)化以便在宿主細(xì)胞中使用的核酸序列。根據(jù)本發(fā)明使用的核酸分子優(yōu)選地是核酸表達(dá)構(gòu)建體。根據(jù)本發(fā)明的核酸表達(dá)構(gòu)建體是例如包含根據(jù)本發(fā)明的核酸分子的表達(dá)盒，或包含根據(jù)本發(fā)明的核酸分子或表達(dá)盒的表達(dá)載體。核酸表達(dá)構(gòu)建體優(yōu)選地包含調(diào)控序列，如啟動(dòng)子和終止序列，其與編碼本發(fā)明的多肽的核酸序列可操作地連接。核酸表達(dá)構(gòu)建體可以另外包含5'和/或3'識(shí)別序列和/或選擇標(biāo)記。宿主細(xì)胞如上文所論述，本發(fā)明提供含有根據(jù)本發(fā)明的核酸分子的宿主細(xì)胞。優(yōu)選地，本發(fā)明的宿主細(xì)胞表達(dá)所述核酸分子。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的宿主細(xì)胞是真菌細(xì)胞并且更優(yōu)選地是酵母細(xì)胞。酵母細(xì)胞優(yōu)選地是選自以下群組的屬的一員：酵母屬、克魯維酵母屬、漢遜酵母屬、畢赤酵母屬或耶氏酵母屬。酵母細(xì)胞更優(yōu)選地是選自以下群組的物種的一員：釀酒酵母、布得利酵母(s.bulderi)、巴奈特酵母(s.barnetti)、少孢酵母(s.exiguus)、葡萄汁酵母(s.uvarum)、糖化酵母(s.diastaticus)、乳酸克魯維酵母(k.lactis)、馬克斯克魯維酵母(k.marxianus)、脆壁克魯維酵母(k.fragilis)、多型漢遜酵母(h.polymorpha)、巴斯德畢赤酵母(p.pastoris)和解脂耶氏酵母(y.lipolytica)，如釀酒酵母、乳酸克魯維酵母、多型漢遜酵母、巴斯德畢赤酵母或解脂耶氏酵母。在一優(yōu)選實(shí)施例中，宿主細(xì)胞屬于物種釀酒酵母。當(dāng)編碼本發(fā)明的多肽(優(yōu)選地gal2變異體)的核酸分子/序列在宿主細(xì)胞(優(yōu)選地酵母細(xì)胞)中表達(dá)時(shí)，宿主細(xì)胞被賦予吸收d-木糖和/或l-阿拉伯糖的能力，d-木糖和/或l-阿拉伯糖接著可以被進(jìn)一步代謝。由此，細(xì)胞能夠在作為碳源的d-木糖和/或l-阿拉伯糖上生長(zhǎng)。優(yōu)選地，宿主細(xì)胞(優(yōu)選地酵母細(xì)胞)與不含有根據(jù)本發(fā)明的核酸分子的細(xì)胞相比對(duì)d-木糖和/或l-阿拉伯糖的吸收率增加。在一優(yōu)選實(shí)施例中，本發(fā)明的宿主細(xì)胞(優(yōu)選地酵母細(xì)胞)另外含有-編碼木糖代謝途徑的蛋白質(zhì)(優(yōu)選地木糖異構(gòu)酶和木酮糖激酶)的核酸分子，和/或-編碼阿拉伯糖代謝途徑的蛋白質(zhì)(優(yōu)選地阿拉伯糖異構(gòu)酶、核酮糖激酶、核酮糖-5-p4-差向異構(gòu)酶)的核酸分子。這類(lèi)宿主細(xì)胞優(yōu)選地具有-增加的d-木糖和/或l-阿拉伯糖利用率和/或-與不含有根據(jù)本發(fā)明的核酸分子的細(xì)胞相比，在d-木糖和/或l-阿拉伯糖下較快的生長(zhǎng)速率。舉例來(lái)說(shuō)，本發(fā)明的宿主細(xì)胞(優(yōu)選地酵母細(xì)胞)可以另外含有編碼阿拉伯糖代謝途徑的蛋白質(zhì)(具體來(lái)說(shuō)阿拉伯糖異構(gòu)酶、核酮糖激酶、核酮糖-5-p4-差向異構(gòu)酶)的核酸分子。優(yōu)選的是細(xì)菌阿拉伯糖代謝途徑的蛋白質(zhì)，具體來(lái)說(shuō)大腸桿菌arabl-核酮糖激酶、大腸桿菌aradl-核酮糖-5-p4-差向異構(gòu)酶和地衣芽孢桿菌araal-阿拉伯糖-異構(gòu)酶。在一優(yōu)選實(shí)施例中，根據(jù)本發(fā)明的宿主細(xì)胞(優(yōu)選地酵母細(xì)胞)通過(guò)基因araa(l-阿拉伯糖-異構(gòu)酶)、arab(l-核酮糖激酶)和arad(l-核酮糖-5-p-4-差向異構(gòu)酶)的引入和表達(dá)來(lái)修飾，并且另外如例如本發(fā)明人在ep1499708b1中所述過(guò)度表達(dá)tal1(轉(zhuǎn)醛醇酶)基因，并且除此以外還含有至少一種根據(jù)本發(fā)明的核酸分子。視酵母細(xì)胞的既定用途而定，所述酵母細(xì)胞可以含有、表達(dá)或過(guò)度表達(dá)編碼其它蛋白質(zhì)(如轉(zhuǎn)醛醇酶tal1和/或tal2、轉(zhuǎn)酮醇酶tkl1和/或tkl2、d-核酮糖-5-磷酸3-表異構(gòu)酶rpe1、核糖-5-磷酸酮醇-異構(gòu)酶rki1)的其它核酸序列或來(lái)自其它生物體的編碼相同酶活性的相應(yīng)序列。舉例來(lái)說(shuō)，本發(fā)明的宿主細(xì)胞(優(yōu)選地酵母細(xì)胞)可以另外過(guò)度表達(dá)編碼木糖代謝途徑的蛋白質(zhì)、具體來(lái)說(shuō)木糖異構(gòu)酶和木酮糖激酶的核酸分子。優(yōu)選的是植物發(fā)酵梭菌或瘤胃壺菌屬(piromyces)xyla木糖異構(gòu)酶和釀酒酵母xks1木酮糖激酶。在一優(yōu)選實(shí)施例中，根據(jù)本發(fā)明的宿主細(xì)胞(優(yōu)選地酵母細(xì)胞)通過(guò)基因xyla(木糖異構(gòu)酶)、xks1(木酮糖激酶)的引入和/或過(guò)度表達(dá)來(lái)修飾并且過(guò)度表達(dá)tal1(轉(zhuǎn)醛醇酶)基因。視酵母細(xì)胞的既定用途而定，所述酵母細(xì)胞可以含有、表達(dá)或過(guò)度表達(dá)編碼其它蛋白質(zhì)(如轉(zhuǎn)醛醇酶tal1和/或tal2、轉(zhuǎn)酮醇酶tkl1和/或tkl2、d-核酮糖-5-磷酸3-表異構(gòu)酶rpe1、核糖-5-磷酸酮醇-異構(gòu)酶rki1)的其它核酸序列或來(lái)自其它生物體的編碼相同酶活性的相應(yīng)序列。用于生產(chǎn)生物乙醇的方法和用途如上文所論述，本發(fā)明提供一種用于生產(chǎn)生物乙醇和/或其它生物基化合物的方法。所述方法包含根據(jù)本發(fā)明的核酸分子優(yōu)選地在根據(jù)本發(fā)明的宿主細(xì)胞中的表達(dá)。如上文所論述，本發(fā)明提供以下各項(xiàng)的用途：-根據(jù)本發(fā)明的多肽，-根據(jù)本發(fā)明的核酸分子，或-根據(jù)本發(fā)明的宿主細(xì)胞，其用于生物乙醇和/或其它生物基化合物的生產(chǎn)，和/或用于含有戊糖(優(yōu)選地d-木糖和/或l-阿拉伯糖)的生物材料的重組發(fā)酵。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“生物基化合物”或“其它生物基化合物”是指由生物材料和原料(生物質(zhì))、特別是通過(guò)使用微生物獲得的化合物和物質(zhì)。(其它)生物基化合物可以是選自(但不限于)以下的化合物：乳酸、乙酸、丁二酸、蘋(píng)果酸或其它有機(jī)酸，1-丁醇、異丁醇、2-丁醇、其它醇，氨基酸、烷烴、萜烯、類(lèi)異戊二烯、溶劑、醫(yī)藥化合物、維生素。優(yōu)選實(shí)施例的進(jìn)一步描述本發(fā)明人已鑒別出gal2變異體，其展現(xiàn)-活體外和/或活體內(nèi)戊糖轉(zhuǎn)運(yùn)功能的活性增加和/或-對(duì)戊糖的親和力增加與野生型或無(wú)相應(yīng)氨基酸取代的gal2多肽相比。因此，本發(fā)明人已鑒別出gal2變異體，其因而賦予宿主細(xì)胞(優(yōu)選地酵母細(xì)胞)吸收d-木糖和/或d-阿拉伯糖的能力和優(yōu)選地，增加對(duì)戊糖(優(yōu)選地d-木糖和/或d-阿拉伯糖)的吸收的能力。為此，還對(duì)實(shí)例和圖式進(jìn)行參考。-l-阿拉伯糖和d-木糖的吸收為使得戊糖(具體來(lái)說(shuō)，d-木糖和/或l-阿拉伯糖)可以被釀酒酵母代謝，它們必須首先被細(xì)胞吸收。針對(duì)戊糖d-木糖測(cè)試的所有己糖轉(zhuǎn)運(yùn)體對(duì)己糖的親和力比對(duì)d-木糖高得多。對(duì)于l-阿拉伯糖，呈現(xiàn)類(lèi)似情況。在迄今構(gòu)建的可以利用戊糖(d-木糖或l-阿拉伯糖)的所有菌株中，報(bào)告生長(zhǎng)相對(duì)緩慢。特別是，為此提出緩慢和不良的戊糖吸收是原因(becker和boles,2003；richard等人,2002)。在由d-葡萄糖和d-木糖或d-葡萄糖和l-阿拉伯糖組成的糖類(lèi)混合物的發(fā)酵中，所述糖不是同時(shí)被轉(zhuǎn)化。由于轉(zhuǎn)運(yùn)體對(duì)d-葡萄糖的高親和力，所以首先代謝d-葡萄糖。發(fā)生所謂的雙峰轉(zhuǎn)換(diauxicshift)。只有在d-葡萄糖被耗盡之后才立刻轉(zhuǎn)化戊糖，生長(zhǎng)期明顯較慢(kuyper等人,2005a；kuyper等人,2005b)。給出不存在特異性針對(duì)戊糖的轉(zhuǎn)運(yùn)體作為解釋。-gal2己糖半乳糖是通過(guò)高親和力轉(zhuǎn)運(yùn)體gal2(km＝1至5mm)轉(zhuǎn)運(yùn)，所述轉(zhuǎn)運(yùn)體同樣親和葡萄糖(km＝1.5至1.9)(參見(jiàn)例如reifenberger等人,1997)。與半乳糖利用所需的其它結(jié)構(gòu)基因(gal1，半乳糖激酶；gal10，變旋酶/udp-葡萄糖-4-差向異構(gòu)酶；gal7，半乳糖-1-磷酸尿苷轉(zhuǎn)移酶)一樣，其表達(dá)在葡萄糖存在下受到抑制并且還需要由半乳糖誘導(dǎo)。gal2也是分解代謝物鈍化的目標(biāo)(horak和wolf,1997)。gal2是僅數(shù)種可以轉(zhuǎn)運(yùn)l-阿拉伯糖的轉(zhuǎn)運(yùn)體之一。與大部分其它己糖轉(zhuǎn)運(yùn)體一樣，其可以轉(zhuǎn)運(yùn)d-木糖。然而，其對(duì)l-阿拉伯糖和d-木糖的親和力相當(dāng)?shù)?。因此，在低d-木糖或l-阿拉伯糖濃度下，吸收活性極低。farwick等人(2014)研發(fā)出允許在d-葡萄糖存在下吸收d-木糖的突變型轉(zhuǎn)運(yùn)體。這些突變型轉(zhuǎn)運(yùn)體中的一些在與半乳糖轉(zhuǎn)運(yùn)體gal2的n376對(duì)應(yīng)的位置處具有氨基酸更換。然而，雖然它們證明具有針對(duì)葡萄糖的抗性，但是其中大部分對(duì)木糖的吸收率降低。本發(fā)明的多肽展現(xiàn)對(duì)木糖的吸收率和/或親和力增加，特別是與使其抵抗受葡萄糖抑制的突變組合。已經(jīng)使用各種突變誘發(fā)方法以及在非常特定的條件下使用具有各種不同修飾的經(jīng)工程改造的酵母菌株的進(jìn)化工程改造來(lái)發(fā)現(xiàn)經(jīng)改善的源于gal2的戊糖轉(zhuǎn)運(yùn)體。這些轉(zhuǎn)運(yùn)體必須在精密的篩選系統(tǒng)中使用生長(zhǎng)測(cè)試和糖吸收分析進(jìn)行測(cè)試。最后，必須對(duì)突變型轉(zhuǎn)運(yùn)體進(jìn)行測(cè)序并且必須從各種突變闡明最后引起特性改善的那些。d-木糖占富含木聚糖的木質(zhì)纖維素生物質(zhì)(如硬木和秸稈)中總糖的多達(dá)35％(參見(jiàn)demeke等人2013)。具有大量阿拉伯糖的生物質(zhì)(數(shù)據(jù)來(lái)源：美國(guó)能源部http://www.eere.energy.gov/biomass/progs/searchl.cgi)：根據(jù)本發(fā)明的gal2變異體也對(duì)其利用率具有極大重要性。在酵母釀酒酵母中使用功能性并且同時(shí)特異性戊糖轉(zhuǎn)運(yùn)體的可能性首先是由木質(zhì)纖維水解產(chǎn)物生產(chǎn)生物乙醇和生產(chǎn)用于其它化學(xué)合成的高級(jí)前體產(chǎn)物，特別是當(dāng)戊糖濃度低并且同時(shí)存在葡萄糖時(shí)。以下清單來(lái)源于研究“來(lái)自生物質(zhì)的高附加值化學(xué)物質(zhì)”(參見(jiàn)wwwl.eere.energy.gov/biomass/pdfs/35523.pdf)。此處，30種化學(xué)物質(zhì)被分類(lèi)為特別有價(jià)值的，其可以由生物質(zhì)產(chǎn)生。c原子數(shù)前30種候選物1氫氣、一氧化碳23丙三醇、3-羥基丙酸、乳酸、丙二酸、丙酸、絲氨酸4乙偶姻、天冬氨酸、反丁烯二酸、3-羥基丁內(nèi)酯、蘋(píng)果酸、丁二酸、蘇氨酸5阿拉伯糖醇、糠醛、谷氨酸、伊康酸、乙酰丙酸、脯氨酸、木糖醇、木糖酸6烏頭酸、檸檬酸鹽、2,5-呋喃二甲酸、葡萄糖二酸、賴(lài)氨酸、左旋葡聚糖、山梨醇一旦這些化學(xué)物質(zhì)由木質(zhì)纖維素通過(guò)生物轉(zhuǎn)化(例如使用酵母發(fā)酵)產(chǎn)生，那么重要的是具有針對(duì)半纖維素糖阿拉伯糖和木糖的特異性、高度活性轉(zhuǎn)運(yùn)體。以下實(shí)例和圖式說(shuō)明本發(fā)明，但不將其局限于此。附圖說(shuō)明圖1：gal2_t354a在eby.vw4000中的生長(zhǎng)測(cè)試轉(zhuǎn)化體在具有20g/l麥芽糖的5mlscm-ura中在30°下培育，用水洗滌并且將od600調(diào)節(jié)至1。因此其隨后連續(xù)稀釋。將5μl滴在相應(yīng)培養(yǎng)基上并且將其在30°下培育三天。采用具有20g/l麥芽糖的scm-ura稀釋液作為對(duì)照物。將具有突變型轉(zhuǎn)運(yùn)體的細(xì)胞滴在具有0.2％和2％葡萄糖的scd-ura以及具有0.2％和2％d-半乳糖的scg-ura上以測(cè)試其功能。此外，使用cen.pk2的野生型和ethanolred以及gal2_ep3.1進(jìn)行比較。具有突變t354a的半乳糖轉(zhuǎn)運(yùn)體來(lái)自hdy.guf10。圖2：gal2_t354a在afy10中的生長(zhǎng)測(cè)試轉(zhuǎn)化體在具有2％乙醇的5mlsce-ura-leu中在30°下培育，用水洗滌并且將od600調(diào)節(jié)至1。因此其隨后連續(xù)稀釋。將5μl滴在相應(yīng)培養(yǎng)基上并且將其在30°下培育五天。采用具有2％乙醇的sce-ura-leu稀釋液作為對(duì)照物。將具有突變型轉(zhuǎn)運(yùn)體的細(xì)胞滴在具有0.2％和2％d-木糖的scx-ura-leu以及具有1％d-木糖與4％d-葡萄糖的sc-ura-leu和具有0.2％d-木糖與2％d-葡萄糖的sc-ura-leu上以測(cè)試其功能。此外，使用cen.pk2的野生型和ethanolred以及gal2_ep3.1進(jìn)行比較。具有突變t354a的半乳糖轉(zhuǎn)運(yùn)體來(lái)自hdy.guf10。圖3：gal2t354a與v71i和l280r組合在eby.vw4000中在30°下四天后的液滴測(cè)試。將數(shù)種稀釋液從左至右滴下(未經(jīng)稀釋、1:10、1:100、1:1000)。圖4：gal2t354a與v71i和l280r組合在afy10中在30°下六天后的液滴測(cè)試。將數(shù)種稀釋液從左至右滴下(未經(jīng)稀釋、1:10、1:100、1:1000)。實(shí)例方法菌株和培養(yǎng)基-細(xì)菌大腸桿菌sure(stratagene)完全培養(yǎng)基lb1％胰蛋白胨、0.5％酵母提取物、0.5％nacl，ph7.5(參見(jiàn)sambrook和russell,2001)為了對(duì)編碼抗生素抗性的質(zhì)粒進(jìn)行選擇，在高壓滅菌之后將40μg/ml氨芐西林(ampicillin)添加至培養(yǎng)基中。固體培養(yǎng)基另外含有1.9％瓊脂。在37℃下進(jìn)行培養(yǎng)。-酵母cen.pk2-1cmataleu2-3,112ura3-52trp1-289his3-δ1mal2-8csuc2(euroscarf,frankfurt)菌株eby.vw4000eby.vw4000(基因型：mataleu2-3,112ura3-52trp1-289his3-δ1mal2-8csuc2δhxt1-17δgal2stlδ::loxpagt1δ::loxpmph2δ::loxpmph3δ::loxp)(wieczorke等人,1999)菌株ethanolred可以從法國(guó)里爾的樂(lè)斯福(lesaffre,lille,france)購(gòu)得。描述于demeke等人(2013)中。菌株hdy.guf10消耗木糖和阿拉伯糖的工業(yè)釀酒酵母菌株來(lái)源于ethanolred(dietz2013)。菌株afy10eby.vw4000glk1δ::loxphxk1δ::loxphxk2δ::loxpylr446wδ::loxppyk2δ::ppgk1-opt.xks1-tpgk1ptpi1-tal1-ttal1ptdh3-tkl1-ttkl1ppfk1-rpe1-trpe1pfba-rki1-trki1loxp(farwick等人,2014)。菌株afy10xafy10+yep-kanr_optxi(farwick等人,2014)。-合成的完全選擇性培養(yǎng)基sc0.67％無(wú)氨基酸和硫酸銨的酵母氮源基礎(chǔ)、0.5％硫酸銨、20mm二氫磷酸鉀(ph6.3)、無(wú)所用質(zhì)粒的營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)記的相應(yīng)氨基酸的氨基酸/核堿基溶液、各自指定濃度的碳源合成的完全培養(yǎng)基中氨基酸和核堿基的濃度(zimmermann,1975)：腺嘌呤(0.08mm)、精氨酸(0.22mm)、組氨酸(0.25mm)、異亮氨酸(0.44mm)、亮氨酸(0.44mm)、賴(lài)氨酸(0.35mm)、甲硫氨酸(0.26mm)、苯丙氨酸(0.29mm)、蘇氨酸(0.48mm)、色氨酸(0.19mm)、酪氨酸(0.34mm)、尿嘧啶(0.44mm)和纈氨酸(0.49mm)。如所指定，使用l-阿拉伯糖、d-葡萄糖、d-半乳糖、d-甘露糖、乙醇和麥芽糖作為碳源。固體完全和選擇性培養(yǎng)基另外含有1.9％瓊脂。在30℃下進(jìn)行酵母細(xì)胞的培養(yǎng)。質(zhì)粒質(zhì)粒參考文獻(xiàn)p426h7becker和boles,2003yep181_phxt7-optxi_clossubtil和boles,2012p426h7_gal2_wtp426h7_gal2_ep3.1p426h7-gal2_etohredp426h7-gal2_guf10p426h7_gal2-t354ap426h7_gal2-v71idna的制備-從大腸桿菌分離質(zhì)粒dna使用genejettmplasmidminiprep試劑盒(fisherscientific)根據(jù)制造商說(shuō)明書(shū)進(jìn)行對(duì)來(lái)自大腸桿菌培養(yǎng)物的質(zhì)粒dna的小規(guī)模制備。使用quiagenplasmidmaxi試劑盒進(jìn)行大規(guī)模制備。-從釀酒酵母分離質(zhì)粒和基因組dna為了從酵母細(xì)胞分離基因組和質(zhì)粒dna，通過(guò)離心(1min，2000×g)收集5-10ml穩(wěn)定期培養(yǎng)物并且在1ml無(wú)菌ddh2o中洗滌一次。將細(xì)胞集結(jié)粒通過(guò)渦旋再懸浮于400μlyp-緩沖液1中并且隨后通過(guò)添加400μlyp-緩沖液2、1/3至2/3體積玻璃珠(φ0.25-0.5mm)并在vxrbasicvibrax(ika)上在2000轉(zhuǎn)/分下振蕩8分鐘而裂解。通過(guò)離心(30sec，16000×g)集結(jié)細(xì)胞碎片并且將650μl清液層轉(zhuǎn)移至新的艾本德管(eppendorftube)。添加325μl冷的yp-緩沖液3，使樣品渦旋并且隨后在冰上培育10分鐘以沉淀蛋白質(zhì)和其它污染物。將樣品離心(10-15min，4℃，16000×g)，將700μl清液層轉(zhuǎn)移至新的艾本德管并且添加700μl異丙醇。在劇烈混合之后，在室溫下培育樣品10分鐘以使得dna沉淀，接著通過(guò)離心(≥30min，rt，16000×g)集結(jié)。將dna離心塊用500μl冷(-20℃)的70％(v/v)乙醇洗滌兩次，在室溫和16000×g下進(jìn)行5分鐘離心步驟，接著在室溫下干燥10分鐘并且視dna離心塊的大小而定，溶解于15-30μl無(wú)菌ddh2o中。-測(cè)定dna濃度dna濃度是通過(guò)光譜光度法在240-300nm的波長(zhǎng)范圍中加以測(cè)量。如果通過(guò)商e260nm/e280nm確定dna的純度是1.8，那么吸光度e260nm＝1.0相當(dāng)于dna濃度是50μgdsdna/ml(sambrook和russell,2001)。-pcr產(chǎn)物的dna純化使用qiagen公司的“qiaquickpcr純化試劑盒”根據(jù)制造商的信息進(jìn)行pcr產(chǎn)物的純化。使用限制性核酸內(nèi)切酶消化dna(限制性消化)為了進(jìn)行dna的位點(diǎn)特異性裂解，在所提供的緩沖液下并且根據(jù)制造商說(shuō)明書(shū)使用來(lái)自newenglandbiolabs(neb)或fermentas的限制性核酸內(nèi)切酶。通常，每微克dna使用1-3個(gè)單位進(jìn)行反應(yīng)，培育2-12小時(shí)。這個(gè)方法用于制備用于重組克隆的載體，確定正確組裝的質(zhì)?；蛱禺愋越到鈦?lái)自混合物的特定質(zhì)粒。聚合酶鏈反應(yīng)(pcr)將不同聚合酶用于此研究中的不同pcr實(shí)驗(yàn)。為了確認(rèn)基因組基因缺失或整合，使用crimsontaq聚合酶(neb)。為了擴(kuò)增orf(用于測(cè)序)、用于重組克隆的基因或擴(kuò)增用于基因組基因缺失或整合的整合盒，使用phusion或q5聚合酶(neb)。pcr反應(yīng)物的組成和相應(yīng)pcr程序呈現(xiàn)在下表中。使用neb主頁(yè)上的tm計(jì)算器工具計(jì)算出引物對(duì)的退火溫度。在mastercyclergradient(eppendorf)、piko熱循環(huán)儀(finnzymes)或progenepcr循環(huán)儀(techne)中進(jìn)行所有pcr。使用crimsontaq聚合酶的pcr反應(yīng)物的組成用于使用crimsontaq聚合酶的反應(yīng)物的pcr程序使用phusion或q5聚合酶的pcr反應(yīng)物的組成用于使用phusion或q5聚合酶的反應(yīng)物的pcr程序融合pcr融合pcr用于構(gòu)建hxt7-n370f的orf以便重組克隆。在第一步中，使用p426h7_hxt7作為模板在兩個(gè)單獨(dú)的q5pcr反應(yīng)中擴(kuò)增hxt7的兩個(gè)重疊片段。使pcr反應(yīng)物在1.5％瓊脂糖膠凝中分離并且從相應(yīng)凝膠塊純化正確的片段。將等摩爾量的兩種片段(最小20ng)用于無(wú)引物的q5pcr反應(yīng)中。此pcr反應(yīng)運(yùn)行6個(gè)循環(huán)，隨后添加1μl正向和反向引物(來(lái)自10μm儲(chǔ)備液)。反應(yīng)接著再運(yùn)行20個(gè)循環(huán)。易錯(cuò)pcr(eppcr)為了生成gal2的隨機(jī)誘變orf，使用genemorphii隨機(jī)誘變?cè)噭┖?agilenttechnologies)。已遵循制造商的方案。已運(yùn)行pcr反應(yīng)33個(gè)循環(huán)。已改變模板dna的量以便達(dá)成不同突變率(參見(jiàn)下表)。eppcr產(chǎn)物分析揭露已符合所需擴(kuò)增規(guī)格。將pcr片段純化并且用作phusionpcr反應(yīng)的模板以延伸具有同源突出的片段末端。不同eppcr中所用模板dna的量和用于dna或rna分離的瓊脂糖凝膠電泳使用具有濃度范圍介于0.7至2.0％(w/v)的瓊脂糖的瓊脂糖凝膠通過(guò)大小分離dna或rna樣品中的片段(sambrook和russell,2001)。將1×tae-緩沖液用于凝膠制備并且用作運(yùn)行緩沖液。使用generuler1kbdna梯(fisherscientific)確定dna片段的大小。將dna樣品與1/5體積的6×dna負(fù)載染料混合，隨后負(fù)載于凝膠上。將rna樣品與相同體積的2×rna負(fù)載染料混合，在96℃下培育10分鐘并且在負(fù)載之前儲(chǔ)存于冰上。視電流、凝膠百分比和預(yù)期片段大小而定，使凝膠在至多6-10v/cm下運(yùn)行30至45分鐘。在凝膠溴化乙錠浴中培育之后，通過(guò)uv光(254nm)觀(guān)測(cè)dna和rna。dna純化和從瓊脂糖凝膠提取dna為了純化dna(例如從pcr反應(yīng)物或在限制性消化之后)和從瓊脂糖凝膠提取dna，根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)使用extractii試劑盒(macherey-nagel)。dna測(cè)序由gatc生物技術(shù)股份公司(德國(guó)康斯坦茨)進(jìn)行dna樣品的測(cè)序。樣品含有30-100ng/μl(質(zhì)粒)或10-50ng/μl(pcr產(chǎn)物)dna。將合適的引物(10μm)與dna樣品一起遞送至gatc生物技術(shù)股份公司。大腸桿菌的轉(zhuǎn)化根據(jù)dower(dower等人,1988)和wirth(wirth,1989)的方案使用bio-radgenepulser通過(guò)電穿孔轉(zhuǎn)化大腸桿菌細(xì)胞。將dna(來(lái)自大腸桿菌或酵母dna制備物)添加至冷凍的感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞中，培育樣品并且在冰上解凍10分鐘。接著將細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移至電穿孔小池并且直接脈沖。將bio-radgenepulser設(shè)定成電壓2.5kv/cm、電阻200ω和電容25μf。緊接在脈沖之后，將細(xì)胞與1ml預(yù)溫?zé)岬膕oc培養(yǎng)基混合并且轉(zhuǎn)移至艾本德管。細(xì)胞在恒溫混勻儀(艾本德)中在37℃下以600-800rpm培育45分鐘，隨后接種于含有卡那霉素(kanamycin)或氨芐西林的選擇性lb瓊脂板上。在細(xì)胞用編碼hxt7的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的情況下，培育是在室溫下在無(wú)振蕩的情況下進(jìn)行4小時(shí)或在20-25℃下在振蕩下進(jìn)行2小時(shí)。釀酒酵母的轉(zhuǎn)化為了轉(zhuǎn)化釀酒酵母，使用偏差很小的gietz等人(gietz和schiestl,2007a,gietz和schiestl,2007b)的liac/ss載體dna/peg方法的兩種不同方案。液體培養(yǎng)物在合適的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)至0.6-1.0的od。培養(yǎng)物的離心和用于洗滌步驟的離心被縮短至在3000×g下2分鐘。單股載體dna是以10mg/ml溶液形式使用，使得轉(zhuǎn)化混合物中dna的體積分別是54μl或74μl。熱休克的持續(xù)時(shí)間是35分鐘。在轉(zhuǎn)化之后，將全細(xì)胞懸浮液直接接種于選擇培養(yǎng)基上，或在轉(zhuǎn)化有顯性選擇標(biāo)記的情況下，轉(zhuǎn)移至5ml適當(dāng)液體培養(yǎng)基進(jìn)行再生。在再生細(xì)胞集結(jié)之后，使其再懸浮于50-100μl培養(yǎng)基中并且接種出。用于轉(zhuǎn)化的dna量是單個(gè)質(zhì)粒大約500ng、用于共轉(zhuǎn)化的多個(gè)質(zhì)粒各≥1000ng和整合dna盒(例如用于基因缺失)≥2000ng和更多?；虻拿艽a子優(yōu)化一些基因的orf已經(jīng)密碼子優(yōu)化。如通過(guò)糖酵解基因的優(yōu)選密碼子所確定，密碼子已被適配成釀酒酵母的密碼子使用。描述于wiedemann等人(wiedemann和boles,2008)中。通過(guò)同源重組(重組克隆)構(gòu)建質(zhì)粒通過(guò)合適dna片段(載體主鏈和插入物)在釀酒酵母中的同源重組來(lái)活體內(nèi)構(gòu)建質(zhì)粒。出于此目的，相應(yīng)載體在插入位點(diǎn)處通過(guò)限制性消化而經(jīng)線(xiàn)性化。任選地，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳和后續(xù)凝膠提取純化所得載體主鏈。插入物被設(shè)計(jì)成側(cè)翼序列(>30bp)與插入目標(biāo)區(qū)同源或在具有多個(gè)插入片段的情況下彼此同源。插入物是通過(guò)pcr擴(kuò)增并且可能通過(guò)使用具有對(duì)應(yīng)5'端(同源突出端)的引物而具備同源序列。釀酒酵母用dna片段轉(zhuǎn)化并且將轉(zhuǎn)化體接種在選擇性培養(yǎng)基上。挑取菌落以接種選擇性液體培養(yǎng)基。將dna從這些培養(yǎng)物分離并且用于大腸桿菌轉(zhuǎn)化以便進(jìn)行質(zhì)粒分離和增殖。含有旋轉(zhuǎn)酶抑制劑基因ccdb的質(zhì)粒對(duì)大部分大腸桿菌菌株具有毒性，因此將ccdb抗性菌株大腸桿菌db3.1用于這些質(zhì)粒。將質(zhì)粒從大腸桿菌單菌落培養(yǎng)物分離并且通過(guò)分析型限制性消化和dna測(cè)序加以驗(yàn)證。為正確的克隆株建立丙三醇儲(chǔ)備培養(yǎng)物。通過(guò)同源重組的基因組基因缺失或插入為了使釀酒酵母基因組中的基因缺失，將標(biāo)記盒通過(guò)同源重組整合到相應(yīng)基因中(carter和delneri,2010，güldener等人,1996，sauer,1987)。標(biāo)記盒是使用5'端與目標(biāo)基因同源的引物通過(guò)pcr使得能夠定點(diǎn)插入來(lái)加以擴(kuò)增。所述盒由顯性標(biāo)記基因(kanmx4/g418、hphnt1/潮霉素b、natnt2/clonnat)構(gòu)成，側(cè)接以啟動(dòng)子(ptef)和終止子(分別是ttef、tcyc1和tadh1)以及l(fā)oxp位點(diǎn)。這些位點(diǎn)允許通過(guò)cre重組酶切除基因組整合的標(biāo)記盒，所述cre重組酶清除標(biāo)記以進(jìn)行另一輪基因缺失。在釀酒酵母用缺失盒轉(zhuǎn)化之后，將細(xì)胞接種在選擇性培養(yǎng)基上并且將復(fù)制物接種在相同培養(yǎng)基上一次。再次將單個(gè)菌落劃線(xiàn)以獲得單個(gè)克隆株，接著將其挑取并且在選擇性培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。從這些培養(yǎng)物分離dna并且使用不同引物組合通過(guò)pcr確認(rèn)正確的整合。如下表中所見(jiàn)稱(chēng)呼用于確認(rèn)的引物。為正確的克隆株建立丙三醇儲(chǔ)備培養(yǎng)物。用于通過(guò)pcr確認(rèn)基因組整合的引物的命名為了標(biāo)記的再循環(huán)，用在半乳糖誘導(dǎo)型gal1啟動(dòng)子(psh47或pnatcre)控制下的編碼cre重組酶的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化細(xì)胞。在簡(jiǎn)單誘導(dǎo)重組酶之后，通過(guò)復(fù)制物接種選擇喪失顯性標(biāo)記的細(xì)胞。由于重組酶的完全表達(dá)在hxt0菌株中是致死的，所以對(duì)這些菌株使用重組酶在非誘導(dǎo)條件下的基本表達(dá)。再次通過(guò)pcr控制盒的去除(參見(jiàn)上文)。據(jù)此進(jìn)行基因盒的整合以便基因的過(guò)度表達(dá)。在這些盒內(nèi)，僅顯性標(biāo)記側(cè)接loxp位點(diǎn)并且被切除，所述盒的其余部分保留在基因組中。引物清單用于細(xì)胞培養(yǎng)的方法和發(fā)酵實(shí)驗(yàn)細(xì)胞密度的分光光度測(cè)定通過(guò)在600nm下測(cè)量光密度(od600)而以分光光度法定量液體培養(yǎng)物中的細(xì)胞濃度。將細(xì)胞培養(yǎng)物或其稀釋液的樣品置于聚苯乙烯(ps)比色杯中并且在ultrospec2100pro分光光度計(jì)(gehealthcare,usa)中在600nm下加以分析。丙三醇儲(chǔ)備培養(yǎng)物為了長(zhǎng)時(shí)間特定菌株和含有質(zhì)粒的大腸桿菌，制備丙三醇儲(chǔ)備培養(yǎng)物。出于此目的，將釀酒酵母的穩(wěn)態(tài)培養(yǎng)物或大腸桿菌的生長(zhǎng)培養(yǎng)物與50％(v/v)丙三醇1:1混合并且儲(chǔ)存在-80℃下。半固體瓊脂培養(yǎng)選擇半固體瓊脂培養(yǎng)方法以擴(kuò)大質(zhì)粒cdna文庫(kù)(在大腸桿菌中)。通過(guò)此方法可以使在液體培養(yǎng)物生長(zhǎng)期間可能存在的代表性偏差減到最小。在30℃下進(jìn)行培育有助于使不穩(wěn)定的克隆株穩(wěn)定(hanahan等人,1991，sassone-corsi,1991)。可以在生命技術(shù)網(wǎng)站找到方案。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，將2×濃縮的lb培養(yǎng)基在攪拌時(shí)與3g/lseaprep瓊脂糖混合，高壓滅菌并且冷卻到37℃。將抗生素和4·105至6·105(每450ml培養(yǎng)基)添加至培養(yǎng)基中并且混合2分鐘。接著將瓶子在冰浴中在0℃下培育1小時(shí)并且隨后平緩地轉(zhuǎn)移至30℃以培育(無(wú)干擾)40-45小時(shí)。在生長(zhǎng)之后，可以通過(guò)在10400×g下離心而從半固體瓊脂集結(jié)細(xì)胞。連續(xù)稀釋液斑點(diǎn)分析(液滴測(cè)試)為了容易比較不同釀酒酵母菌株在各種生長(zhǎng)條件下的生長(zhǎng)，進(jìn)行連續(xù)稀釋液斑點(diǎn)分析。細(xì)胞在適當(dāng)培養(yǎng)基中以液體培養(yǎng)形式生長(zhǎng)至指數(shù)期，通過(guò)離心(2000×g，2min)收集，用無(wú)菌水洗滌兩次并且隨后再懸浮于無(wú)碳源的選擇性培養(yǎng)基中使得od600達(dá)到1.0。由此細(xì)胞懸浮液制備在選擇性培養(yǎng)基中的十倍連續(xù)稀釋液(四個(gè)稀釋步驟)。將6μl各細(xì)胞懸浮液點(diǎn)樣在培養(yǎng)基板上以待檢查并且允許干燥。各板在30℃下培育。好氧分批發(fā)酵在不同大小(培養(yǎng)物體積的5-10倍體積)的振蕩燒瓶中在旋轉(zhuǎn)振蕩器(150-180rpm)上通常在30℃下進(jìn)行好氧分批發(fā)酵。隨著連續(xù)的好氧分批發(fā)酵來(lái)進(jìn)行進(jìn)化工程改造(詳情參見(jiàn)下文)厭氧分批發(fā)酵對(duì)于厭氧分批發(fā)酵，用橡皮塞和發(fā)酵水塞密封振蕩燒瓶。燒瓶的體積匹配100ml的培養(yǎng)物體積。培養(yǎng)物在30℃下在磁性攪拌器上以120rpm連續(xù)攪拌。在此研究中，在od600＝10下進(jìn)行發(fā)酵。出于此目的，收集生長(zhǎng)細(xì)胞并且將在50ml無(wú)碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基中的od600設(shè)定成20。為了開(kāi)始實(shí)驗(yàn)，將此細(xì)胞懸浮液添加至含有50ml補(bǔ)充有2×濃縮碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基的制備燒瓶中。經(jīng)由插入的無(wú)菌針頭和注射器獲取用于測(cè)定細(xì)胞濃度和用于hplc分析的樣品。在發(fā)酵罐中的厭氧發(fā)酵在具有800ml工作體積并且裝備有溫度、ph值、o2和co2傳感器的inforsmultifors發(fā)酵罐(2×1.4l)中進(jìn)行一些使用工業(yè)釀酒酵母菌株的發(fā)酵。用530ml濃縮發(fā)酵培養(yǎng)基(無(wú)碳源和補(bǔ)充劑)填充發(fā)酵罐并且隨后高壓滅菌。在發(fā)酵開(kāi)始之前，將250ml濃縮碳源溶液、100μl/l消泡劑204和其它補(bǔ)充劑(維生素、微量元素和抗生素)添加至濃縮培養(yǎng)基中。用氮?dú)鈨艋l(fā)酵罐以便在最初產(chǎn)生厭氧條件。在實(shí)驗(yàn)期間施加氮?dú)膺M(jìn)料至頂部空間(0.4l/min)以維持厭氧條件。冷卻出氣口以使蒸汽冷凝回流并且隨后通過(guò)管道穿過(guò)氣體洗滌瓶。培養(yǎng)物在300rpm下攪拌，溫度保持在35℃并且通過(guò)自動(dòng)化添加2mkoh或2mh2po4使ph值保持在5.0。當(dāng)達(dá)到所有設(shè)定參數(shù)并且恒定時(shí)，添加細(xì)胞接種物(在20ml發(fā)酵培養(yǎng)基中)。在發(fā)酵期間獲取樣品用于細(xì)胞干重測(cè)定和hplc分析。使用iris5.2軟件(infors)操作發(fā)酵罐并且監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)。測(cè)定細(xì)胞干質(zhì)量為了測(cè)定細(xì)胞干質(zhì)量，將5-10ml液體培養(yǎng)物經(jīng)由預(yù)先洗滌過(guò)并干燥(如下所述)的濾膜(硝化纖維素，孔徑0.45μm)真空過(guò)濾并且隨后用ddh2o洗滌兩次。濾膜在微波烘箱中在120-150w下干燥15分鐘，靜置冷卻并且在干燥器中再另外干燥15分鐘。濾膜在過(guò)濾之前和在干燥之后稱(chēng)重以測(cè)量細(xì)胞干重。已根據(jù)ask等人(ask等人,2013)調(diào)適所述方法。進(jìn)化工程改造以連續(xù)的好氧分批發(fā)酵形式進(jìn)行進(jìn)化工程改造。轉(zhuǎn)化體首先接種在選擇性sce2中以獲得生物質(zhì)并且隨后在具有20g/l木糖的選擇性sc和sm培養(yǎng)基中生長(zhǎng)以使菌株適應(yīng)于木糖利用。在這些初始培養(yǎng)之后，將細(xì)胞切換到具有10g/l木糖的培養(yǎng)基中并且增加葡萄糖濃度以施加進(jìn)化壓力。當(dāng)其達(dá)到后指數(shù)期至早穩(wěn)定期時(shí)，細(xì)胞通過(guò)離心(2000×g，2分鐘)收集并且轉(zhuǎn)移至新鮮培養(yǎng)基以使得od600達(dá)到0.2。每次增加葡萄糖濃度，可以看見(jiàn)適應(yīng)性或生長(zhǎng)未受當(dāng)前葡萄糖濃度負(fù)面影響。向所有培養(yǎng)基(液體和固體)中添加g418以選擇afy10菌株背景。液體培養(yǎng)基另外含有0.5g/l2-脫氧-d-葡萄糖(2-dog)以抑制hxk0表型的抑制突變體的形成。hxk0菌株，而非野生型菌株，對(duì)2-dog具有抗性(subtil和boles,2012)。已通過(guò)將培養(yǎng)物樣品在葡萄糖培養(yǎng)基板上劃線(xiàn)并且還通過(guò)hplc分析證實(shí)不存在葡萄糖消耗。通過(guò)hplc的代謝物分析為了分析代謝物，將無(wú)細(xì)胞樣品(5-10分鐘，4℃，16000×g)與1/9體積的50％(w/v)5-磺基水楊酸混合并且離心(5-10分鐘，4℃，16000×g)。在裝備有hyperrezxpcarbohydrateh+8μm管柱和折射率檢測(cè)器(thermoshodexri-101)的thermoscientificuhplc+系統(tǒng)(dionexultimate3000)中分析清液層。在65℃的管柱溫度下使用5mm硫酸作為流動(dòng)相以0.6ml/min的流動(dòng)速率進(jìn)行分離。使用chromeleon6.80軟件控制系統(tǒng)并且分析數(shù)據(jù)。分析五種標(biāo)準(zhǔn)品(0.01-3％(w/v)濃度的d-葡萄糖、d-木糖、木糖醇、乙酸鹽、丙三醇和乙醇的混合物)以進(jìn)行不同化合物的定量。糖吸收分析如bisson等人(bisson和fraenkel,1983)所述，根據(jù)walsh等人(walsh等人,1994)的修改來(lái)進(jìn)行糖吸收分析。菌株eby.vw4000的轉(zhuǎn)化體在選擇性yepe中生長(zhǎng)以使得od達(dá)到1.1-1.6，通過(guò)離心收集并且冰冷的吸收緩沖液中洗滌兩次(rt，3分鐘，3000×g)。細(xì)胞自此保持在冰上。將細(xì)胞集結(jié)粒再懸浮于冰冷的吸收緩沖液中達(dá)到60mgww/ml的濃度并且等分成110μl。將一個(gè)細(xì)胞懸浮液等分試樣和一種糖溶液在水浴中在30℃下培育4-5分鐘。將100μl細(xì)胞懸浮液吸移到糖溶液(50μl)中，通過(guò)吸液簡(jiǎn)單混合并且培育5(d-[u-14c]-葡萄糖)或20秒(d-[l-14c]-木糖)。通過(guò)將100μl混合物轉(zhuǎn)移至10ml冰冷的淬滅緩沖液中來(lái)停止吸收反應(yīng)，立刻經(jīng)由durapore膜濾器(0.22μm孔徑，millipore)過(guò)濾。將濾膜用10ml冰冷的淬滅緩沖液洗滌兩次，轉(zhuǎn)移至含有4ml閃爍混合液(rotiszintecoplus,roth)的閃爍瓶中并且充分振蕩。除此過(guò)濾樣品(cpm過(guò)濾)之外，將10μl各反應(yīng)物直接轉(zhuǎn)移至具有4ml閃爍混合液的閃爍瓶中以測(cè)定反應(yīng)物中的總計(jì)數(shù)(cpm總共)。為了測(cè)定非特異性結(jié)合于細(xì)胞表面或?yàn)V膜的糖的值(cpm空白)，將33,3μl糖溶液和66,6μl細(xì)胞懸浮液的數(shù)種樣品混合在10ml冰冷的淬滅緩沖液中并且如上所述處理。在wallac1409液體閃爍法計(jì)數(shù)器中分析所有小瓶的放射性。使用2m、500mm或20mm葡萄糖或木糖(在h2o中)的儲(chǔ)備溶液制備用于分析的糖溶液(吸收反應(yīng)中所需濃度的三倍(s，底物濃度)，50μl等分試樣)。在0.2、1、5、25和100mm葡萄糖和1、5、25、66、100、200和500mm木糖的糖濃度下測(cè)量吸收。在25、66和100mm木糖以及額外25和100mm未經(jīng)標(biāo)記的葡萄糖下測(cè)量葡萄糖對(duì)木糖吸收的抑制。糖溶液含有0.135至0.608μcid-[u-14c]-葡萄糖(290-300mci/mmol)或d-[l-14c]-木糖(55mci/mmol)(americanradiolabeledchemicalsinc.,st.louis,mo,usa)。將吸收分析的數(shù)據(jù)用于以下計(jì)算：在培育時(shí)間(t，秒)內(nèi)在特定糖濃度(s，mm)下吸收的糖量(a糖，nmol)：a糖＝((cpm樣品-cpm空白)/(cpm總共·10))·s·100μl每毫克細(xì)胞(m，mgww)計(jì)算所得的轉(zhuǎn)運(yùn)速度(nmol·min-1·mgww-1)：v＝(a糖·60s)/(t·m)使用三個(gè)非依賴(lài)性測(cè)量值在prism5(graphpadsoftware,inc.)中通過(guò)非線(xiàn)性回歸分析和整體曲線(xiàn)擬合進(jìn)行km(米氏常數(shù))、vmax(最大初始吸收速度)和ki(競(jìng)爭(zhēng)性抑制的抑制常數(shù))的計(jì)算。生物信息學(xué)方法從酵母屬基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(sgd，(cherry等人,2012))獲得dna序列。使用praline多序列比對(duì)服務(wù)器((simossis和heringa,2005))在標(biāo)準(zhǔn)設(shè)定加上phobius跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)下進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的序列比對(duì)(等人,2004)。系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)是使用clustalw2系統(tǒng)發(fā)生(larkin等人,2007)由praline比對(duì)計(jì)算所得并且使用phylodendron軟件(http://iubio.bio.indiana.edu/soft/molbio/java/apps/trees/)目測(cè)。蛋白質(zhì)序列之間的相似性和一致性是使用sias(http://imed.med.ucm.es/tools/sias.html)由praline比對(duì)計(jì)算所得。使用aline軟件(bond和schuttelkopf,2009)創(chuàng)建序列比對(duì)圖。實(shí)例1t354a1.1gal2_t354a的研究ethanolred是一種工業(yè)菌株，它是用于木質(zhì)纖維水解產(chǎn)物發(fā)酵的有前景的候選物?？梢詫⒕幋a木糖和阿拉伯糖代謝途徑的酶的基因整合到基因組中，從而產(chǎn)生菌株hdy.guf5(demeke等人,2013)。hdy.guf5針對(duì)木糖進(jìn)一步進(jìn)化并且通過(guò)基因工程進(jìn)行工程改造，最后產(chǎn)生菌株hdy.guf9(dietz2013)。hdy.guf9通過(guò)針對(duì)阿拉伯糖的進(jìn)化工程改造而進(jìn)一步進(jìn)化，產(chǎn)生菌株hdy.guf10。此菌株還具有關(guān)于木糖的經(jīng)改善的生長(zhǎng)行為。木糖消耗率提高約80％，阿拉伯糖消耗率提高約25％。使用放射性糖吸收分析測(cè)定木糖吸收率揭露，hdy.guf10的木糖吸收率比hdy.guf9高35％。由于gal2是釀酒酵母中唯一可以轉(zhuǎn)運(yùn)大量木糖和阿拉伯糖的轉(zhuǎn)運(yùn)體，所以從兩種菌株分離gal2基因并且測(cè)序。與gal2_hdy.guf9相比，在gal2_hdy.guf10中發(fā)現(xiàn)一個(gè)氨基酸取代，它是t354a，可能位于細(xì)胞外側(cè)跨膜螺旋7的轉(zhuǎn)運(yùn)通道內(nèi)。此位置可能發(fā)揮改變轉(zhuǎn)運(yùn)體構(gòu)象的作用。將所需序列從hdy.guf10的染色體dna擴(kuò)增并且克隆到p426中以便研究經(jīng)修飾的gal2p。使用ethanolred的gal2p作為對(duì)照物。將所接收的載體轉(zhuǎn)化到篩選菌株中以測(cè)試在數(shù)種培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)。1.2gal2_t354a的功能測(cè)試首先，使用含載體的vw4000在葡萄糖和麥芽糖培養(yǎng)基上進(jìn)行生長(zhǎng)測(cè)試。將野生型cen.pk2的半乳糖轉(zhuǎn)運(yùn)體以及gal2_ep3.1用作對(duì)照物并且用作比較物。工業(yè)菌株ethanolred的gal2p野生型顯示類(lèi)似cen.pk2野生型的相同生長(zhǎng)，正如所預(yù)期。在半乳糖上gal2_guf10的生長(zhǎng)類(lèi)似兩種野生型的生長(zhǎng)，而在葡萄糖上的生長(zhǎng)看起來(lái)類(lèi)似易錯(cuò)突變體的生長(zhǎng)(圖1)。此外，這也使用afy10來(lái)進(jìn)行，以便研究轉(zhuǎn)化體的木糖特異性和葡萄糖親和力。野生型gal2_etohred不能在低木糖濃度(如0.2％)上生長(zhǎng)。然而，在此培養(yǎng)基上觀(guān)察到gal2_guf10的生長(zhǎng)。盡管如此，gal2_guf10在2％木糖上的生長(zhǎng)仍不如gal2_ep3.1。因此，gal2_guf10似乎具有較高木糖親和力。在具有額外葡萄糖的培養(yǎng)基上，僅易錯(cuò)突變體顯示生長(zhǎng)(圖2)。實(shí)例2t354a/v71i2.1t354a與其它突變組合的作用在來(lái)源于菌株hdy.guf9并在阿拉伯糖上進(jìn)化的菌株ethanolredhdy.guf10中發(fā)現(xiàn)gal2的氨基酸更換t354a。這表明gal2對(duì)阿拉伯糖的轉(zhuǎn)運(yùn)特性得到改善。還顯示hdy.guf10的gal2中的t354a突變可以恢復(fù)在低木糖濃度的生長(zhǎng)。ethanolredgal2和gal2_hdyguf9的序列中的兩個(gè)氨基酸與菌株cen.pk的gal2不同(l280r和v71i)。為了測(cè)定這兩個(gè)差異的作用，用cen.pk的gal2制造質(zhì)粒表達(dá)構(gòu)建體，所述構(gòu)建體具有僅v71i和l280r或與t354a的組合。為了測(cè)定其特性，在構(gòu)建體轉(zhuǎn)化之后用篩選菌株eby.vw4000和afy10進(jìn)行生長(zhǎng)液滴測(cè)試。使用cen.pkgal2野生型、p426_空載體和僅含t354a的cen.pkgal2作為對(duì)照物。2.2具有g(shù)al2t354a與l280r和v71i的組合的細(xì)胞在己糖上的生長(zhǎng)在表達(dá)載體中構(gòu)建以下gal2的變異體：t354a、t354a+v71i、t354a+l280r、l280r和17iv。將其轉(zhuǎn)化到感受態(tài)eby.vw4000細(xì)胞中。接著在不同碳源上進(jìn)行液滴測(cè)試?？梢钥闯?圖3)，僅v71i和l280r對(duì)葡萄糖或半乳糖的吸收沒(méi)有作用。僅t354a強(qiáng)烈削弱在葡萄糖上的生長(zhǎng)。v71i和t354a的組合不介導(dǎo)在葡萄糖上的生長(zhǎng)。然而，t354a和l280r的組合可以介導(dǎo)在葡萄糖上的生長(zhǎng)。然而，生長(zhǎng)比gal2野生型更慢。2.3具有g(shù)al2t354a與l280r和v71i的組合的細(xì)胞在木糖和糖類(lèi)混合物上的生長(zhǎng)將各種構(gòu)建體與載體yep181_phxt7-optxi_clos一起轉(zhuǎn)化到afy10細(xì)胞中，并且進(jìn)行連續(xù)稀釋液生長(zhǎng)液滴測(cè)試。沒(méi)有變異體可以介導(dǎo)在木糖-葡萄糖混合物板上的生長(zhǎng)，表明突變型轉(zhuǎn)運(yùn)體都受葡萄糖抑制。在高木糖濃度(20g/l)下的生長(zhǎng)在各種構(gòu)建體之間沒(méi)有很大不同。然而，在低木糖濃度(2g/l)下的生長(zhǎng)顯示顯著差異：l280r介導(dǎo)類(lèi)似gal2野生型的生長(zhǎng)；l280r和t354a的組合的生長(zhǎng)看起來(lái)類(lèi)似僅t354a或空白載體對(duì)照物。v71i介導(dǎo)在2g/l木糖上的極慢生長(zhǎng)。然而，v71i和t354a的組合介導(dǎo)類(lèi)似gal2野生型的生長(zhǎng)(圖4)，而相比之下，t354a和v71i僅介導(dǎo)在低木糖濃度下的較差生長(zhǎng)。這表明ethanolred的gal2中的氨基酸交換v71i是造成低木糖吸收活性的原因，尤其在低木糖濃度下。此缺陷受額外的t354a更換抑制。這解釋了guf-10與guf-9相比改善的生長(zhǎng)行為。由于guf-10在阿拉伯糖培養(yǎng)基上的進(jìn)化，可以推斷出ethanolred的gal2的阿拉伯糖吸收也通過(guò)抑制v71i更換而因t354a突變得以改善。上述實(shí)施方式、權(quán)利要求書(shū)和/或附圖之所公開(kāi)的特征可以單獨(dú)地和以其任何組合形式作為用于以多樣化形式實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的材料。參考文獻(xiàn)becker,j.和boles,e.(2003)《消耗l-阿拉伯糖并且產(chǎn)生乙醇的經(jīng)修飾的釀酒酵母菌株(amodifiedsaccharomycescerevisiaestrainthatconsumesl-arabinoseandproducesethanol)》.applenvironmicrobiol69(7),4144-50.bratd,bolese,wiedemannb(2009)《細(xì)菌木糖異構(gòu)酶在釀酒酵母中的功能性表達(dá)(functionalexpressionofabacterialxyloseisomeraseinsaccharomycescerevisiae)》.applenvironmicrobiol.75:2304-11.bruders(2011)《分析釀酒酵母中的未知葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體和木糖轉(zhuǎn)運(yùn)體篩選系統(tǒng)的開(kāi)發(fā)(analyseeinesunbekanntenglukosetransportersinsaccharomycescerevisiaeundentwicklungeinesxylose-transporterscreeningsystems)》.diplomathesis(goethefrankfurt).demekemm,dietzh,liy,foulquie-morenomr,mutturis,deprezs,denabtt,boninibm,lideng,dumortierf,verplaetsea,bolese,theveleinjm(2013)《使用代謝和進(jìn)化工程改造對(duì)在木質(zhì)纖維素水解產(chǎn)物中具有高效的d-木糖發(fā)酵和抑制劑耐受性工業(yè)釀酒酵母菌株的開(kāi)發(fā)(developmentofad-xylosefermentingandinhibitortolerantindustrialsaccharomycescerevisiaestrainwithhighperformanceinlignocellulosehydrolysatesusingmetabolicandevolutionaryengineering)》.biotechnolbiofuels.6:89.dien,b.s.,kurtzman,c.p.,saha,b.c.和bothast,r.j.(1996)《對(duì)l-阿拉伯糖發(fā)酵酵母的篩選(screeningforl-arabinosefermentingyeasts)》.applbiochembiotechnol57-58,233-42.dietzh(2013)《戊糖發(fā)酵工業(yè)酵母菌株的構(gòu)建和表征(konstruktionundcharakterisierungvonpentosefermentierendenindustriehefestammen)》.phdthesis.goetheuniversityfrankfurt,germanyfarwicka,bruders,schadewegv,orebm,bolese.《工程改造酵母己糖轉(zhuǎn)運(yùn)體以轉(zhuǎn)運(yùn)d-木糖而不受d-葡萄糖抑制(engineeringofyeasthexosetransporterstotransportd-xylosewithoutinhibitionbyd-glucose)》.procnatlacadsciusa.2014年4月8日；111(14):5159-64.hahn-hagerdal,b.,wahlbom,c.f.,gardonyi,m.,vanzyl,w.h.,corderootero,r.r.和jonsson,l.j.(2001)《針對(duì)木糖利用對(duì)釀酒酵母進(jìn)行的代謝工程改造(metabolicengineeringofsaccharomycescerevisiaeforxyloseutilization)》.advbiochemengbiotechnol73,53-84.horakj和wolfdh(1997)《酵母釀酒酵母中的半乳糖轉(zhuǎn)運(yùn)體的分解代謝物鈍化：泛素化、內(nèi)吞作用和在液泡中降解(cataboliteinactivationofthegalactosetransporterintheyeastsaccharomycescerevisiae:ubiquitination,endocytosis,anddegradationinthevacuole)》.jbacteriol179(5):1541-1549.jeppsonm,bengtssono,frankek,leeh,hahn-hagerdalb,gorwa-grauslundmf.(2006)《對(duì)nadph具有較高k(m)的樹(shù)干畢赤酵母木糖還原酶突變體在重組釀酒酵母中的表達(dá)增加由木糖生產(chǎn)的乙醇(theexpressionofapichiastipitisxylosereductasemutantwithhigherk(m)fornadphincreasesethanolproductionfromxyloseinrecombinantsaccharomycescerevisiae)》.biotechnolbioeng.93(4):665-73.jinys,jeffriestw.(2004)《對(duì)于木糖由重組釀酒酵母代謝的化學(xué)計(jì)量網(wǎng)狀約束(stoichiometricnetworkconstraintsonxylosemetabolismbyrecombinantsaccharomycescerevisiae)》.metabeng.6(3):229-38.katahiras,mizuikea,fukudah,kondoa.(2006)《重組木糖和纖維寡糖同化酵母菌株對(duì)木質(zhì)纖維水解產(chǎn)物的乙醇發(fā)酵(ethanolfermentationfromlignocellulosichydrolysatebyarecombinantxylose-andcellooligosaccharide-assimiliatingyeaststrain)》.applmicrobiolbiotechnol.72(6):1136-43.kotter,p.和ciriacy,m.(1993)《釀酒酵母的木糖發(fā)酵(xylosefermentationbysacharomycescerevisiae)》.applmicrobiolbiotechnol38,776-783.kou,s.c.,christensen,m.s.和cirillo,v.p.(1970)《釀酒酵母中的半乳糖轉(zhuǎn)運(yùn)ii.無(wú)半乳糖激酶細(xì)胞中半乳糖吸收和交換的特征(galactosetransportinsaccharomycescerevisiae.ii.characteristicsofgalactoseuptakeandexchangeingalactokinaselesscells)》.jbacteriol103(3),671-8.kuyper,m.,toirkens,m.j.,diderich,j.a.,winkler,a.a.,vandijken,j.p.和pronk,j.t.(2005b)《對(duì)木糖發(fā)酵釀酒酵母菌株的混合糖利用的進(jìn)化工程改造(evolutionaryengineeringofmixed-sugarutilizationbyaxylose-fermentingsaccharomycescerevisiaestrain)》.femsyeastres5(10),925-34.kuyper,m.,winkler,a.a.,vandijken,j.p.和pronk,j.t.(2004)《用于高效厭氧木糖發(fā)酵的釀酒酵母的最低程度代謝工程改造：原理論證(minimalmetabolicengineeringofsaccharomycescerevisiaeforefficientanaerobicxylosefermentation:aproofofprinciple)》.femsyeastres4(6),655-64.lucas,c.和uden,n.v.(1986)《木糖發(fā)酵酵母休哈塔假絲酵母中的半纖維素單體的轉(zhuǎn)運(yùn)(transportofhemicellulosemonomersinthexylose-fermentingyeastcandidashehatae)》.applmicrobiolbiotechnol23,491-495.pi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