相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用

本申請(qǐng)要求2014年10月23日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)62/067,952的優(yōu)先權(quán)益。該優(yōu)先權(quán)申請(qǐng)的全部?jī)?nèi)容并入本文以用于所有目的。

本文公開(kāi)了核苷酸類(lèi)似物，在合成測(cè)序(sequencing-by-synthesis:sbs)中使用核苷酸類(lèi)似物的方法和信號(hào)約束方法。

背景技術(shù)：

用于給dna和rna測(cè)序的一些方法會(huì)遭遇：在堿添加中不準(zhǔn)確，向dna模板引入疤痕，以及由于在反應(yīng)中存在染料而導(dǎo)致不可接受的高背景噪音，從而削弱染料信號(hào)。需要用于對(duì)dna和rna測(cè)序的有效方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本文描述了具有以下化學(xué)式的核苷酸類(lèi)似物：

其中n為0、1、2、3、4、5、6或7；l不存在或者是連接基團(tuán)；r¹是核苷堿基；r²是氫或保護(hù)基團(tuán)(blockinggroup)；b是結(jié)合分子；x是檢測(cè)標(biāo)記。在一些實(shí)施方案中，r²是保護(hù)基團(tuán)，并且保護(hù)基團(tuán)是-nh2、-ch2ch＝ch2、-ch2n3、聚乙二醇或經(jīng)取代或未經(jīng)取代的烷基。在一些實(shí)施方案中，l是連接基團(tuán)，并且連接基團(tuán)是經(jīng)取代或未經(jīng)取代的烷基，經(jīng)取代或未經(jīng)取代的烯基或經(jīng)取代或未經(jīng)取代的芳基。任選地，連接基團(tuán)是亞甲基或經(jīng)取代的苯基。連接基團(tuán)可進(jìn)一步包括猝滅劑。任選地，結(jié)合分子是生物素、抗體、氨基酸、膽固醇、異硫氰酸熒光素或肽。任選地，檢測(cè)標(biāo)記是含有陽(yáng)離子基團(tuán)的分子、含有陰離子基團(tuán)的分子、熒光(fluorescent)分子(例如熒光染料)、熒光性分子(afluorogenicmolecule)、金屬、還原標(biāo)記、含硫分子或經(jīng)取代的或未經(jīng)取代的烷基。

本文還描述了用于為靶核酸測(cè)序并約束信號(hào)的方法。用于為靶核酸測(cè)序的方法包括提供模板核酸、引物、聚合酶和具有以下結(jié)構(gòu)的核苷酸類(lèi)似物：

其中n為0、1、2、3、4、5、6或7；l不存在或者是連接基團(tuán)；r¹是核苷堿基；r²是氫或保護(hù)基團(tuán)；b是結(jié)合分子；x是檢測(cè)標(biāo)記，其中所述檢測(cè)標(biāo)記被猝滅。該方法還包括：通過(guò)并入核苷酸類(lèi)似物來(lái)延伸引物；提供磷酸酶以在結(jié)合分子和連接基團(tuán)之間或在結(jié)合分子和末端磷酸酯之間進(jìn)行切割，從而產(chǎn)生核苷酸類(lèi)似物的包含標(biāo)記和結(jié)合分子的片段，其中標(biāo)記是未被猝滅的；將片段與固定在表面上的捕獲元件結(jié)合；以及檢測(cè)來(lái)自被捕獲在表面上的片段的標(biāo)記的熒光發(fā)射。在一些實(shí)施方案中，結(jié)合分子包含寡核苷酸。

在一些實(shí)施方案中，捕獲元件是含硫或含硫醇的分子。在一些實(shí)施方案中，捕獲元件是鏈霉親和素、抗體、蛋白質(zhì)或樹(shù)枝狀聚合物。在一些實(shí)施方案中，捕獲元件包含與模板核酸互補(bǔ)的固定的寡核苷酸。

在一些實(shí)施方案中，模板核酸是包含互補(bǔ)捕獲序列的多個(gè)拷貝的固定化dna連環(huán)體。

在一些實(shí)施方案中，連接基團(tuán)還包含猝滅劑。任選地，提供步驟可以包括從連接基團(tuán)置換猝滅劑。

在一些實(shí)施方案中，該方法還可以包括從固體表面上的捕獲元件去除片段。任選地，去除步驟包括加熱片斷和捕獲元件。任選地，去除步驟包括用緩沖液洗滌片斷和捕獲元件。任選地，去除步驟包括添加酶以將片段從捕獲元件切割開(kāi)。

該方法還可以包括將保護(hù)基團(tuán)從并入的核苷酸類(lèi)似物切割開(kāi)。

在一些實(shí)施方案中，使用熒光共振能量轉(zhuǎn)移來(lái)執(zhí)行檢測(cè)步驟。

本文進(jìn)一步描述的是測(cè)序方法。測(cè)序方法包括：組合模板核酸、與模板互補(bǔ)的引物、包含含氮堿基和可檢測(cè)標(biāo)記的核苷酸類(lèi)似物和聚合酶；在使得在引物延伸反應(yīng)中所述引物延伸的條件下維持在組合步驟中的組分以產(chǎn)生互補(bǔ)多核苷酸，其中所述含氮堿基通過(guò)所述聚合酶并入所述互補(bǔ)多核苷酸，并且所述可檢測(cè)標(biāo)記通過(guò)聚合酶與所述含氮堿基分離，并且未并入所述互補(bǔ)多核苷酸中，并且其中分離的所述可檢測(cè)標(biāo)記被捕獲元件結(jié)合；以及檢測(cè)由捕獲元件結(jié)合的可檢測(cè)標(biāo)記，其中所述檢測(cè)提供序列信息。

一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案的細(xì)節(jié)在附圖和下面的描述中闡述。其他特征、目的和優(yōu)點(diǎn)將根據(jù)說(shuō)明書(shū)和附圖以及權(quán)利要求書(shū)變得顯而易見(jiàn)。

附圖說(shuō)明

圖1a-d顯示了使用核苷酸類(lèi)似物的合成測(cè)序的方法的步驟。圖1e是圖1a-d的插圖。

圖2顯示了描述核苷酸類(lèi)似物轉(zhuǎn)化為熒光分子的方案。

圖3顯示了含有固定化dna連環(huán)體并包含互補(bǔ)捕獲序列的多個(gè)拷貝的液滴卡通圖。

圖4是顯示使用核苷酸類(lèi)似物的合成測(cè)序方法，其中熒光片段通過(guò)瞬時(shí)二溴馬來(lái)酰亞胺接頭連接到陣列的表面。

圖5是顯示使用含有生物素作為結(jié)合分子的核苷酸類(lèi)似物的合成測(cè)序方法的方案。該方案中的捕獲元件與引物的5'末端結(jié)合。

圖6是顯示使用含有生物素作為結(jié)合分子的核苷酸類(lèi)似物的合成測(cè)序方法的方案。該方案中的捕獲元件與寡核苷酸在引物的5'末端結(jié)合。

圖7是顯示合成測(cè)序方法的方案，其中通過(guò)雜交進(jìn)行表面捕獲。

圖8是顯示合成測(cè)序方法的方案，其中核苷酸類(lèi)似物含有猝滅劑并通過(guò)雜交進(jìn)行表面捕獲。

圖9a和9b包含合成測(cè)序方案，其中通過(guò)含鏈霉親和素的捕獲元件進(jìn)行表面捕獲。

圖10包含合成測(cè)序方案，其中通過(guò)單色系統(tǒng)中的誘導(dǎo)物進(jìn)行表面捕獲。

圖11包含合成測(cè)序方案，其中通過(guò)含硼酸鹽猝滅劑的捕獲元件進(jìn)行表面捕獲。

圖12包含合成測(cè)序方案，其中通過(guò)含鏈霉親和素的捕獲元件進(jìn)行表面捕獲。

圖13包含合成測(cè)序方案，其中通過(guò)雙色系統(tǒng)中的誘導(dǎo)物進(jìn)行表面捕獲。

圖14a-e示出了使用核苷酸類(lèi)似物的合成測(cè)序方法的步驟。

定義

本文所用的術(shù)語(yǔ)“可檢測(cè)標(biāo)記”或“檢測(cè)標(biāo)記”是指可用于提供可檢測(cè)和/或可量化信號(hào)的任何原子或分子。合適的標(biāo)記包括放射性同位素、熒光團(tuán)、發(fā)色團(tuán)、質(zhì)量標(biāo)記、電子致密顆粒、磁性顆粒、自旋標(biāo)記、發(fā)射化學(xué)發(fā)光的分子、電化學(xué)活性分子、酶、輔因子和酶底物。在一些實(shí)施方案中，檢測(cè)標(biāo)記是含有帶電基團(tuán)的分子(例如，含有陽(yáng)離子基團(tuán)的分子或含有陰離子基團(tuán)的分子)、熒光分子(例如熒光染料)、熒光性(fluorogenic)分子或金屬。任選地，檢測(cè)標(biāo)記是熒光性標(biāo)記。熒光性標(biāo)記可以是任何能夠在處于非猝滅形式時(shí)發(fā)出光的標(biāo)記(例如，當(dāng)不被另一種試劑猝滅時(shí))。當(dāng)被合適的激發(fā)波長(zhǎng)激發(fā)時(shí)，熒光部分以特定的發(fā)射波長(zhǎng)發(fā)射光能(即發(fā)熒光)。當(dāng)熒光部分和猝滅劑部分非常接近時(shí)，由熒光部分發(fā)射的光能被猝滅劑部分吸收。任選地，檢測(cè)標(biāo)記是熒光染料。在一些實(shí)施方案中，熒光染料是熒光素、羅丹明、吩噁嗪、吖啶、香豆素或其衍生物。在一些實(shí)施方案中，熒光性染料是羧基熒光素。合適的熒光性染料的其他示例包括在alexafluor產(chǎn)品系(lifetechnologies；carlsbad，ca)下可商購(gòu)的熒光性染料。任選地，標(biāo)記是氧化還原標(biāo)記。任選地，標(biāo)記是還原標(biāo)簽，含硫分子或經(jīng)取代或未經(jīng)取代的烷基。

術(shù)語(yǔ)“染料”在本技術(shù)領(lǐng)域具有其標(biāo)準(zhǔn)含義。本文所用的術(shù)語(yǔ)“熒光染料”通常是指當(dāng)通過(guò)電磁輻射源(例如燈、光電二極管或激光)照射時(shí)，通過(guò)熒光機(jī)構(gòu)發(fā)射較長(zhǎng)波長(zhǎng)的電磁輻射的任何染料。

術(shù)語(yǔ)“報(bào)道分子”是指能夠產(chǎn)生熒光信號(hào)的分子。報(bào)道分子是可檢測(cè)標(biāo)記的示例?！扳鐒┓肿印笔侵改軌蛭帐芗?bào)道分子的熒光能從而猝滅否則將從受激報(bào)道分子釋放的熒光信號(hào)的分子。為了使猝滅劑分子猝滅受激的熒光團(tuán)，通常有利的是猝滅劑分子在從報(bào)道分子的激發(fā)開(kāi)始但在報(bào)道分子釋放所存儲(chǔ)的熒光能量之前的某個(gè)時(shí)間處于受激報(bào)道分子的最小猝滅距離之內(nèi)。在基于鄰近的猝滅應(yīng)用中，報(bào)道分子和猝滅劑分子彼此充分接近，使得每當(dāng)報(bào)道分子被激發(fā)時(shí)，受激態(tài)的能量轉(zhuǎn)移到猝滅劑分子，其中其被非輻射地散發(fā)或以與報(bào)道分子的發(fā)射頻率不同的發(fā)射頻率發(fā)射。幾個(gè)非輻射能量傳遞機(jī)構(gòu)在較短距離上工作，并且適用于基于鄰近的猝滅應(yīng)用。

術(shù)語(yǔ)“配體”和“抗配體”是指抗配體對(duì)的成員?！翱古潴w對(duì)”是指彼此特異性結(jié)合的第一分子和第二分子。通常，樣品中的結(jié)合對(duì)的第一成員與結(jié)合對(duì)的第二成員的“特異性結(jié)合”通過(guò)第一成員與第二成員的結(jié)合來(lái)證實(shí)，反之亦然，其中第一成員與第二成員比樣品中其他組分具有更大的親和力和特異性。結(jié)合對(duì)成員之間的結(jié)合可能是非共價(jià)的。結(jié)合配偶體不必限于成對(duì)的單分子。例如，單個(gè)配體可以通過(guò)兩種或更多種抗配體的協(xié)同作用結(jié)合。結(jié)合對(duì)或結(jié)合配偶體之間的結(jié)合導(dǎo)致結(jié)合復(fù)合物的形成，有時(shí)稱(chēng)為配體/抗配體復(fù)合物或簡(jiǎn)單地作為配體/抗配體。示例性結(jié)合對(duì)包括但不限于：(a)與相應(yīng)抗體或其結(jié)合部分或片段組合的半抗原或抗原性化合物；(b)核酸適配體和蛋白質(zhì)；(c)非免疫結(jié)合對(duì)(例如生物素-抗生物素蛋白、生物素-鏈霉親和素、生物素-中性抗生蛋白)；(d)激素-激素結(jié)合蛋白；(e)受體-受體激動(dòng)劑或拮抗劑；(f)凝集素-碳水化合物；(g)酶-酶輔因子；(h)酶-酶抑制劑；和(i)能夠形成核酸雙鏈體的互補(bǔ)的寡核苷酸或多核苷酸對(duì)。

具體實(shí)施方式

1.概述

在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了用于測(cè)序(例如，合成測(cè)序(sbs))的改進(jìn)的系統(tǒng)。這些系統(tǒng)利用了包含并入新合成的模板互補(bǔ)鏈中的含氮堿基(例如a、t、g或c)或類(lèi)似物的核苷酸類(lèi)似物，以及稱(chēng)為標(biāo)記元件的由于所述并入而與堿基分離可釋放的標(biāo)記部分。系統(tǒng)還使用捕獲元件，當(dāng)標(biāo)簽元件被釋放時(shí)，捕獲元件與標(biāo)記元件結(jié)合。捕獲元件與模板核酸共定位，使得結(jié)合的標(biāo)簽元件可以與模板相關(guān)聯(lián)。本發(fā)明提供核苷酸類(lèi)似物、使用本發(fā)明的核苷酸類(lèi)似物測(cè)序的方法和測(cè)序系統(tǒng)。這些類(lèi)似物、方法和系統(tǒng)在該第1節(jié)中總體上進(jìn)行描述。第2節(jié)描述特別適用于測(cè)序方法的某些可磷酸酶切割的核苷酸類(lèi)似物。第3節(jié)描述了本發(fā)明的系統(tǒng)。第4節(jié)提供了說(shuō)明性的示例。

1.1核苷酸類(lèi)似物

在一個(gè)方面，本發(fā)明的核苷酸類(lèi)似物包含式[i]：

[x-b]-[q-k]-pn[i]

在式[i]中，pn是核苷酸或脫氧核糖核苷酸單磷酸酯，或任意一種的類(lèi)似物，其包含能夠與模板核酸的互補(bǔ)核苷酸堿基配對(duì)的含氮堿基。通常，含氮堿基選自腺嘌呤(a)、胞嘧啶(c)、鳥(niǎo)嘌呤(g)、胸腺嘧啶(t)、尿嘧啶(u)及其衍生物。k是包含至少三個(gè)(例如3-10)磷酸酯或其類(lèi)似物的可切割連接部分，使得核苷酸類(lèi)似物是用于dna聚合酶的底物。q是猝滅部分。在一些實(shí)施方案中，[q-k]是寡磷酸酯，并且都是可切割的連接部分(例如用于堿性磷酸酶的底物)和猝滅部分。x是可檢測(cè)標(biāo)記；稱(chēng)為結(jié)合分子的b是配體-抗配體對(duì)的成員。下面提及的標(biāo)簽元件包括[x-b]。圍繞x和b的括號(hào)([x-b])表示x和b可以以任何多種結(jié)構(gòu)連接，條件是k處的裂解將x和b從q分離開(kāi)來(lái)，并且不將x與b分離。

當(dāng)可檢測(cè)標(biāo)簽x和猝滅部分q在它們彼此接近的情況下，在諸如照明之類(lèi)的檢測(cè)條件下相互作用，使得接近于q的標(biāo)記x的可檢測(cè)信號(hào)(或不存在信號(hào))可以與在x和q不接近時(shí)(例如當(dāng)在k處的裂解破壞q或允許x從q擴(kuò)散使得它們被物理分離時(shí))的信號(hào)區(qū)分開(kāi)來(lái)。猝滅劑可檢測(cè)標(biāo)記組合的示例如下所述。猝滅劑的一個(gè)示例是寡磷酸酯，如通過(guò)引用并入本文以用于所有目的美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)20130053252所例證的。

在一些實(shí)施方案中，可檢測(cè)標(biāo)記是能夠產(chǎn)生熒光信號(hào)的報(bào)道分子。示例性的報(bào)道分子是熒光有機(jī)染料，其可被衍生化以附著于核酸或其他有機(jī)分子。優(yōu)選地，猝滅劑分子也是有機(jī)染料，其可以是或可以不是熒光的，具體取決于本發(fā)明的實(shí)施方案。例如，在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，猝滅劑分子是熒光性的。通常，猝滅劑分子是熒光性的或者僅僅通過(guò)非輻射衰變從報(bào)道物釋放轉(zhuǎn)移的能量，猝滅劑的吸收帶應(yīng)基本上與報(bào)道分子的熒光發(fā)射帶重疊。本領(lǐng)域已知并且可以使用從受激的報(bào)道分子吸收能量但不通過(guò)輻射釋放能量的非熒光猝滅劑分子(nfqm)，例如blackhole猝滅劑。

在文獻(xiàn)中有大量實(shí)用的指南可用于選擇適用于特定探針的報(bào)道物-猝滅劑對(duì)，如以下參考文獻(xiàn)所例示的：grimmetal.,2013,“thechemistryofsmall-moleculefluorogenicprobes,”progmolbioltranslsci.113:1-34,其通過(guò)引用并入本發(fā)明，以及oushikietal.,2012,“near-infraredfluorescenceprobesforenzymesbasedonbindingaffinitymodulationofsquaryliumdyescaffold,”analchem.84:4404-10；clegg,1992,"fluorescenceresonanceenergytransferandnucleicacids,"methodsofenzymology,211:353-89；wuetal.1994,"resonanceenergytransfer:methodsandapplications,"anal.biochem.218:1-13；pesceetal.,editors,fluorescencespectroscopy(marceldekker,newyork,1971)；whiteetal.,fluorescenceanalysis:apracticalapproach(marceldekker,newyork,1970)；等等。文獻(xiàn)還包括提供熒光分子和nfqm的詳盡列表以及它們的用于選擇報(bào)道物-猝滅劑對(duì)的相關(guān)光學(xué)性質(zhì)的參考文獻(xiàn)，例如,berlman,handbookoffluorescencespectraofaromaticmolecules,2ndedition(academicpress,newyork,1971)；griffiths,colourandconstitutionoforganicmolecules(academicpress,newyork,1976)；bishop,editor,indicators(pergamonpress,oxford,1972)；haugland,handbookoffluorescentprobesandresearchchemicals(molecularprobes,eugene,1992)pringsheim,fluorescenceandphosphorescence(intersciencepublishers,newyork,1949)；等等。此外，在文獻(xiàn)中有廣泛的指導(dǎo)，以用于通過(guò)可添加至寡核苷酸的常見(jiàn)反應(yīng)性基團(tuán)而衍生化報(bào)道分子和猝滅劑分子以進(jìn)行共價(jià)連接，如以下參考文獻(xiàn)所例示的：ullman等人的美國(guó)專(zhuān)利no.3,996,345；khanna等人的美國(guó)專(zhuān)利no.4,351,760；等等。為了所有目的，上述出版物中的每一個(gè)的全部?jī)?nèi)容通過(guò)引用并入本文。

示例性的報(bào)道物-猝滅劑對(duì)可以選自呫噸染料(其包含熒光素)和羅丹明染料。這些化合物的許多合適形式可廣泛用于商業(yè)上，其苯基部分上的取代基可以用作鍵合位點(diǎn)或用作與寡核苷酸連接的鍵合官能團(tuán)。另一組熒光化合物是萘胺，其具有α或β位的氨基。這些萘氨基化合物中包括1-二甲基氨基萘基-5-磺酸鹽、1-苯胺基-8-萘磺酸鹽和2-對(duì)甲苯胺基-6-萘磺酸鹽。其他染料包括3-苯基-7-異氰酸香豆素(3-phenyl-7-isocyanatocoumarin)；吖啶，如9-異硫氰酸吖啶(9-isothiocyanatoacridine)和吖啶橙；n-(對(duì)-(2-苯并噁唑基)苯基)馬來(lái)酰亞胺；苯并二唑；二苯乙烯；芘等等。

在一些實(shí)施方案中，報(bào)道分子和猝滅劑分子選自熒光素和羅丹明染料。這些染料和適當(dāng)?shù)倪B接方法在許多參考文獻(xiàn)中有描述，例如khannaetal.(上文引用)；marshall,histochemicalj.,7:299-303(1975)；menchen等人的美國(guó)專(zhuān)利no.5,188,934；menchen等人的歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)no.87310256.0；以及bergot等人的國(guó)際申請(qǐng)pct/us90/05565。可用作探針的可檢測(cè)標(biāo)記的熒光團(tuán)包括但不限于羅丹明、花青3(cy3)、花青5(cy5)、熒光素、vic^tm、liz^tm、tamra^tm、5-fam^tm、6-fam^tm、6-hex、calfluorgreen520、calfluorgold540、calfluororange560、calfluorred590、calfluorred610、calfluorred615、calfluorred635和texasred(分子探針)。在特定的實(shí)施方案中，用作猝滅劑的分子包括但不限于四甲基羅丹明(tamra)，dabcyl(dabsyl，dabmi或甲基紅)蒽醌，硝基噻唑，硝基咪唑，孔雀石綠，blackholequenchers^tm(黑孔猝滅劑)，例如bhq1(biosearchtechnologies),iowablack^tm或zen猝滅劑(來(lái)自integrateddnatechnologies,inc.)，tidequencher2(tq2)和tidequencher3(tq3)(來(lái)自aatbioquest)。

猝滅劑可以是二甲基氨基苯磺酸(dimethylaminozobenzenesulfonicacid)；可從biosearchtechnologies(petaluma，ca)商購(gòu)獲得的blackholequencher染料；qxlquenchers，其可從anaspec，inc.(fremont，ca)商購(gòu)獲得；猝滅劑，其可從integrateddnatechnologies(coralville，iowa)的iowablack產(chǎn)品系列中商購(gòu)獲得，包括iowablackfq和iowablackrq；和irdyeqc-1，其可從li-corbiosciences(lincoln，ne)商購(gòu)獲得。

通過(guò)明智地選擇標(biāo)記，可以進(jìn)行分析，其中在單個(gè)反應(yīng)中不同標(biāo)記被以不同波長(zhǎng)激發(fā)和/或檢測(cè)。參見(jiàn)例如fluorescencespectroscopy(pesceetal.,eds.)marceldekker,newyork,(1971)；whiteetal.,fluorescenceanalysis:apracticalapproach,marceldekker,newyork,(1970)；berlman,handbookoffluorescencespectraofaromaticmolecules,2nded.,academicpress,newyork,(1971)；griffiths,colourandconstitutionoforganicmolecules,academicpress,newyork,(1976)；indicators(bishop,ed.).pergamonpress,oxford,19723；以及haugland,handbookoffluorescentprobesandresearchchemicals,molecularprobes,eugene(1992)。通常，報(bào)道分子和猝滅劑分子之間的距離將被最小化以增加猝滅劑分子的有效性。報(bào)道分子和猝滅劑分子的位置可以有策略地選擇，使得在核苷酸類(lèi)似物中，報(bào)道分子和猝滅劑分子分隔小于20nm、10nm、7.5nm、6nm、5nm、4nm、3nm、1nm、0.8nm、0.6nm、0.4nm或更小。

1.2使用的方法

圖14

本發(fā)明的核苷酸分子(例如，式[i]-[iv])在改進(jìn)的合成測(cè)序反應(yīng)中的使用可以參考圖14引入。讀者應(yīng)理解，許多變化和替代方法被構(gòu)思，其包括偏離圖14的大綱的變化和方法。

圖14顯示固定在底物上的單個(gè)核酸模板分子(測(cè)序靶)。實(shí)際上，本發(fā)明用于大規(guī)模并行的測(cè)序。因此，在一種方法中，使用核酸模板分子陣列進(jìn)行測(cè)序，該陣列可以是例如但不限于單個(gè)分子的陣列(參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利no.7,666,593)；連環(huán)體的陣列(參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利no.8,445,194)，或克隆擴(kuò)增產(chǎn)物陣列?？傮w上參見(jiàn)shendureandji,2008“next-generationdnasequencing”naturebiotechnology26:1135–45。

圖14(a)顯示了本發(fā)明的核苷酸類(lèi)似物。參考式[i]，為簡(jiǎn)便起見(jiàn)，在該論述中，x是熒光染料，b是抗原，[q-k]是寡聚磷酸酯，它既是x的猝滅劑，也是可切割的連接部分(用于堿性磷酸酶的底物)，并且n是與寡磷酸酯連接的脫氧核糖核苷酸。因此，圖14中的核苷酸類(lèi)似物具有結(jié)構(gòu)[1a]，其中p是四磷酸酯。

[x—b]—[q—k]—pn[i]

[x—b]—p2-9—pn[ia]

該陣列與用于合成測(cè)序的試劑組合，該試劑包括dna聚合酶和磷酸酶。

圖14(b)說(shuō)明通過(guò)聚合酶的作用并入pn。在一些實(shí)施方案中，每個(gè)互補(bǔ)鏈延伸至多一個(gè)核苷酸類(lèi)似物(每個(gè)周期)，因?yàn)閜n包含阻止進(jìn)一步聚合的可逆保護(hù)基團(tuán)。該并入反應(yīng)產(chǎn)生具有x-b-p2-9結(jié)構(gòu)的片段，其中x是未猝滅的。

圖14(c)說(shuō)明在第一輪并入后，將并入的核苷酸類(lèi)似物暴露于切割試劑堿性磷酸酶，導(dǎo)致在k處的裂解并產(chǎn)生稱(chēng)為標(biāo)簽元件的包含x和b的片段。標(biāo)簽元件從并入的核苷酸類(lèi)似物擴(kuò)散并被捕獲元件捕獲(例如，被束縛)。在圖14中，捕獲元件是識(shí)別b表位并因此特異性結(jié)合[x-b]的抗體。更一般地，在本公開(kāi)中，捕獲元件通常包含作為b的抗配體的結(jié)合部分b'(“bprime”)。應(yīng)當(dāng)理解，盡管b和b'可以被稱(chēng)為配體-抗配體對(duì)，但更精確的表征是包含b'的捕獲元件捕獲包含b的標(biāo)簽元件。

在圖14的實(shí)施方案中，捕獲元件被固定或約束在接近模板核酸的位置(例如，與模板核酸在相同的底物上以及在鄰近模板核酸的底物上)，使得給定捕獲元件處的結(jié)合事件可以與附近的捕獲部分相關(guān)聯(lián)。對(duì)于陣列中任何給定的模板核酸(或擴(kuò)增子的連環(huán)體或克隆群體等)，更多的某些捕獲元件之一將接近或關(guān)聯(lián)于固定的模板核酸，使得釋放的片段具有高的靠近模板被捕獲的可能性。

圖14(d)示出了在標(biāo)簽元件并入捕獲元件，與捕獲元件切割開(kāi)以及與捕獲元件結(jié)合之后，洗去過(guò)量的試劑、未并入的核苷酸類(lèi)似物和未結(jié)合的片段。

圖14(e)示出了來(lái)自x的信號(hào)可以被檢測(cè)并和將pn并入到與模板互補(bǔ)的鏈中相關(guān)聯(lián)。

可以進(jìn)行另外的一些測(cè)序，其可以尤其涉及除去阻斷部分、去除標(biāo)簽元件和/或捕獲元件等。

圖1

圖1所示的實(shí)施方案對(duì)于引入本發(fā)明也是有用的，其顯示了對(duì)底物(例如硅芯片)上的核酸進(jìn)行測(cè)序的方法。圖1a-d的插圖在圖1e示出。使用dna連環(huán)體的陣列(例如dna納米球(dnb)，completegenomics,inc.,mountainview,ca)描繪該方法。如圖1a所示，延伸寡核苷酸(在圖1a-d中示出為沒(méi)有垂直延伸的水平線(xiàn))和具有固定在其表面上的捕獲元件的寡核苷酸(在圖1a-d中描繪為具有垂直延伸的水平線(xiàn))添加到陣列中并通過(guò)退火而被固定到dna連環(huán)體。延伸寡核苷酸與“引物位置”雜交。捕獲元件被描繪為圖1a中的寡核苷酸/抗體綴合物或多單元抗體結(jié)構(gòu)。捕獲元件允許結(jié)合分子附著到dnb結(jié)構(gòu)上或者捕獲元件允許結(jié)合分子附著到與dnb結(jié)構(gòu)分離的表面(例如，到與dnb結(jié)構(gòu)相鄰的表面)。

如圖1b所示，將聚合酶(如圖1b和1c所示為餅狀)與四個(gè)核苷酸類(lèi)似物(a、c、g和t)一起添加到陣列中。每個(gè)核苷酸類(lèi)似物可能含有不同的檢測(cè)標(biāo)記。磷酸酶和一種或多種另外的猝滅化學(xué)品也加到陣列中。聚合酶并入與dnb模板上的下一個(gè)核苷酸互補(bǔ)的核苷酸類(lèi)似物(例如，與延伸寡核苷酸相鄰)，磷酸酶切割五磷酸酯熒光性染料部分(即，配體染料復(fù)合物)。在圖1b中，通過(guò)聚合酶并入t核苷酸類(lèi)似物。聚合酶對(duì)dnb上的多個(gè)引物位置執(zhí)行該反應(yīng)。如上所述，并入的核苷酸類(lèi)似物的3'末端上的保護(hù)基團(tuán)阻止聚合酶持續(xù)到下一個(gè)循環(huán)。熒光性標(biāo)記在此階段保持猝滅。

圖1c顯示了含有通過(guò)聚合酶釋放的猝滅染料的片段。磷酸酶和猝滅化學(xué)品消除了磷酸酯的猝滅能力(即，染料變得未猝滅)，并且還允許未猝滅的標(biāo)記通過(guò)捕獲元件與表面相互作用并被保留。dnb表面上的捕獲元件可以是例如寡核苷酸-抗體綴合物或表面修飾結(jié)構(gòu)，例如包含抗體的樹(shù)枝狀聚合物。應(yīng)當(dāng)理解，可以使用任何合適的配體-抗配體對(duì)來(lái)固定染料或染料綴合物。任選地，可以用熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fret)受體涂覆抗體以增加轉(zhuǎn)移到染料的能量。

盡管圖1a顯示了捕獲寡核苷酸和捕獲結(jié)構(gòu)，但通常只使用一種捕獲結(jié)構(gòu)。

為了除去熒光信號(hào)并從dnb洗去多余的試劑和未并入的核苷酸類(lèi)似物，捕獲寡核苷酸可以暴露于釋放劑，該釋放劑例如通過(guò)減少抗體對(duì)結(jié)合抗原的親和力破壞配體-抗配體(例如，染料-抗體)的相互作用。任選地，捕獲寡核苷酸和延伸寡聚體中的δg雜交差異可用于僅去除捕獲寡核苷酸。所有添加的試劑(例如，過(guò)量的猝滅化學(xué)品)也在洗滌步驟期間被除去。在已經(jīng)去除前一個(gè)循環(huán)的所有試劑后，然后除去保護(hù)基團(tuán)。例如，可以向陣列中添加化學(xué)試劑以從延伸的延伸寡核苷酸(例如延伸的引物)中除去保護(hù)基團(tuán)，得到3'-羥基。如圖1d所示，陣列準(zhǔn)備好重復(fù)這個(gè)循環(huán)過(guò)程。

許多變化

對(duì)于讀者，顯而易見(jiàn)的是，許多變化和替代方法是預(yù)料得到的，包括偏離圖1和圖14的大綱的變化和方法。下面更詳細(xì)地討論本發(fā)明的某些方面。

用于為靶核酸測(cè)序的方法包括提供模板核酸、引物、聚合酶和核苷酸類(lèi)似物。

模板核酸

在各種實(shí)施方案中，模板多核苷酸是dna(例如cdna、基因組dna或擴(kuò)增產(chǎn)物)或rna。在各種實(shí)施方案中，多核苷酸是雙鏈或單鏈的。

在一些實(shí)施方案中，將模板核酸固定在固體表面上。在一些實(shí)施方案中，將模板核酸固定在底物(例如珠、流通池、墊、微流體裝置中的通道等)中。底物可以包括硅、玻璃、金、聚合物、pdmf等。

在一些實(shí)施方案中，模板核酸被固定化或包含在液滴內(nèi)(任選地固定在珠上或液滴內(nèi)的其他底物上)。

在一些實(shí)施方案中，模板核酸是包含互補(bǔ)捕獲序列的多個(gè)拷貝(有時(shí)與dnb類(lèi)比稱(chēng)為“銜接物序列”)的固定化dna連環(huán)體。

重要的是，在本文的某些附圖、說(shuō)明性實(shí)施方案和討論中，模板核酸被表示為dna連環(huán)體，例如dna納米球(例如，dnb；參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利no.7,666,593)。然而，應(yīng)當(dāng)理解，該方法不需要dnb，但可以是任何模板，例如dna連環(huán)體、樹(shù)枝狀聚合物(dendrimer)、克隆的模板群(例如，通過(guò)橋擴(kuò)增或wildfire擴(kuò)增產(chǎn)生的)或單個(gè)多核苷酸分子。因此，重要的是，本說(shuō)明書(shū)應(yīng)該被閱讀，好像每次參考作為模板的連環(huán)體另一方面涉及其他形式的模板。

核苷酸類(lèi)似物

描述了測(cè)序的某些方面。重要的是，本文提供了使用本文所述的核苷酸類(lèi)似物對(duì)靶核酸進(jìn)行測(cè)序的方法。本文公開(kāi)的方法不限于本文所述的特定類(lèi)似物，并且不限于熒光檢測(cè)系統(tǒng)，而可以廣泛地應(yīng)用于如下所述的其他系統(tǒng)。考慮到這一點(diǎn)，為了方便和清楚，將參考這些類(lèi)似物來(lái)描述該系統(tǒng)。

酶

使用dna聚合酶將本發(fā)明的核苷酸類(lèi)似物并入與模板互補(bǔ)的鏈中。示例性的聚合酶是dna指導(dǎo)的dna聚合酶(ec2.7.7.7)。對(duì)于一些應(yīng)用，rna指導(dǎo)的dna聚合酶(ec2.7.7.49)是合適的。

在一些實(shí)施方案中，提供磷酸酶或切割試劑以切割結(jié)合分子和末端磷酸酯之間或在結(jié)合分子和連接基團(tuán)之間的鍵。在一些實(shí)施方案中，在上述引物延伸反應(yīng)期間提供磷酸酶或切割試劑(例如，聚合酶和磷酸酶同時(shí)存在)。在其他實(shí)施方案中，在上述引物延伸反應(yīng)后提供磷酸酶或切割試劑。在核苷酸類(lèi)似物含有連接基團(tuán)的實(shí)施方案中，在結(jié)合分子和連接基團(tuán)之間的鍵被切割開(kāi)。在一些實(shí)施方案中，連接基團(tuán)是ph敏感連接基團(tuán)或uv可切割連接基團(tuán)。在這些實(shí)施方案中，通過(guò)進(jìn)行含有核苷酸類(lèi)似物的溶液或混合物的ph的變化或通過(guò)uv光處理，結(jié)合分子和連接基團(tuán)之間的鍵可被切割開(kāi)。在其中核苷酸類(lèi)似物是根據(jù)式ii的化合物并且不含連接基團(tuán)(即，不存在連接基團(tuán))的實(shí)施方案中，磷酸酶切割結(jié)合分子和末端磷酸酯之間的鍵。在其中核苷酸類(lèi)似物是根據(jù)式iii或式iv的化合物并且不含有連接基團(tuán)(即不存在連接基團(tuán))的實(shí)施方案中，切割試劑切割開(kāi)在結(jié)合分子和末端磷酸酯之間的鍵。示例性的切割試劑包括例如磷化氫、還原劑或氧化劑。因此，磷酸酶或切割試劑產(chǎn)生包括檢測(cè)標(biāo)記和結(jié)合分子(即x-b-)的核苷酸類(lèi)似物的片段(即，(ii)、(iii)或(iv)的片段)。釋放的片段可以稱(chēng)為標(biāo)簽元件。

在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，使用磷酸酶來(lái)產(chǎn)生標(biāo)簽元件。在一些實(shí)施方案中，使用堿性磷酸酶(ec3.1.3.1)。在一些實(shí)施方案中，使用酸性磷酸酶(ec3.1.3.2)。在一些實(shí)施方案中，使用除磷酸酶之外的切割試劑。

在一些實(shí)施方案中，磷酸酶可以與dna結(jié)合(例如，與互補(bǔ)捕獲序列結(jié)合)。任選地，可以向猝滅化學(xué)品提供磷酸酶以猝滅任何背景信號(hào)。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，磷酸酶和猝滅化學(xué)品可以相伴地或依次提供。磷酸酶和/或猝滅化學(xué)品消除磷酸酯的猝滅能力以產(chǎn)生具有未猝滅標(biāo)記的片段。

保護(hù)基團(tuán)

當(dāng)并入的核苷酸類(lèi)似物含有保護(hù)基團(tuán)時(shí)(即，當(dāng)式ii的r²為保護(hù)基團(tuán)時(shí))，所得的延伸引物不能進(jìn)一步延伸(即，通過(guò)另外的核苷酸類(lèi)似物進(jìn)行的隨后的并入被阻斷)，直到保護(hù)基團(tuán)被除去。

用于dna測(cè)序的保護(hù)基團(tuán)是本領(lǐng)域熟知的。

在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，核苷酸類(lèi)似物的脫氧核糖3'-位是未封閉的。在一些實(shí)施方案中，可逆封閉包括在3'-位，其可以有益于減少流動(dòng)循環(huán)數(shù)。在這些實(shí)施方案中，聚合酶可以是therminator酶(newenglandbiolabs，inc.；ipswich，ma)。替代地，循環(huán)可以使用例如taq聚合酶順序進(jìn)行而不進(jìn)行3'-位封閉。

可以從并入的核苷酸類(lèi)似物中除去保護(hù)基團(tuán)，從而允許在隨后的循環(huán)中并入下一個(gè)堿基。任選地，可通過(guò)化學(xué)方法除去保護(hù)基團(tuán)。例如，可以通過(guò)酶裂解反應(yīng)或水解反應(yīng)除去保護(hù)基團(tuán)。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)使用還原劑(如二硫蘇糖醇(dtt)或三(2-羧乙基)膦(tcep))除去保護(hù)基團(tuán)。任選地，通過(guò)改變含有并入的核苷酸類(lèi)似物的溶液或混合物的ph來(lái)除去保護(hù)基團(tuán)。任選地，通過(guò)使用磷化氫從并入的核苷酸類(lèi)似物洗滌保護(hù)基團(tuán)來(lái)除去保護(hù)基團(tuán)。

捕獲元件

包含未猝滅標(biāo)記的標(biāo)簽元件能夠與捕獲元件相互作用。標(biāo)記元件和捕獲元件之間的相互作用可以是任何合適的配體-抗-配體相互作用。在一些實(shí)施方案中，配體-抗配體相互作用是標(biāo)簽元件的核酸部分與捕獲元件的互補(bǔ)核酸部分的雜交，或者標(biāo)簽元件與結(jié)合部分(如抗體或適配體)之間的相互作用。

捕獲元件可以直接或間接地固定在表面上。在一些實(shí)施方案中，表面可以是其上固定或定位模板序列的表面。在一些實(shí)施方案中，表面可以是除含有模板序列的表面以外的表面。

在標(biāo)簽元件包含寡核苷酸部分的情況下，捕獲元件可以包含與寡核苷酸部分雜交或結(jié)合的互補(bǔ)序列?；パa(bǔ)序列可以稱(chēng)為捕獲序列。

在一些情況下，捕獲元件是具有捕獲序列的多個(gè)拷貝的固定化dna連環(huán)體。在一些情況下，通過(guò)與用于基于連接的測(cè)序中的dnb類(lèi)似，可將連環(huán)體的捕獲序列稱(chēng)為錨定序列。通常，連環(huán)體還包含模板序列。例如，連環(huán)體可以包含包含模板序列和捕獲序列的單體的多個(gè)(例如，50-500)拷貝。

在一些情況下，捕獲元件是包含捕獲序列的多個(gè)拷貝的樹(shù)枝狀聚合物。在一些情況下，捕獲元件是包含包含捕獲序列的多核苷酸的固定化克隆群(擴(kuò)增反應(yīng)的產(chǎn)物)的簇。

捕獲元件可以包含與標(biāo)簽元件結(jié)合的部分的多個(gè)拷貝。例如，當(dāng)捕獲元件是核酸連環(huán)體、樹(shù)枝狀聚合物或簇時(shí)，捕獲序列可以表示為1至10⁶倍，有時(shí)為50-10⁴倍，有時(shí)為50-500倍。

在一些實(shí)施方案中，捕獲元件為或包含寡核苷酸，該寡核苷酸包含10-100個(gè)堿基，更經(jīng)常為12-50個(gè)堿基，有時(shí)為10至15個(gè)堿基。

在一些實(shí)施方案中，捕獲元件包括硫基或硫醇基團(tuán)。

在一些實(shí)施方案中，捕獲元件包括鏈霉親和素、抗體、適配體、蛋白質(zhì)或樹(shù)枝狀聚合物。

捕捉元件可以經(jīng)由如說(shuō)明性實(shí)施方案5中所述的中間結(jié)構(gòu)間接地固定。捕獲元件可以在結(jié)合標(biāo)簽元件之前或之后被固定。

在一些實(shí)施方案中，捕獲元件，例如鏈霉親和素或抗體，可以與聚合酶偶聯(lián)而不干擾聚合酶的功能。在這些示例中，在延伸反應(yīng)之前沒(méi)有為每個(gè)循環(huán)添加新的捕獲元件的單獨(dú)步驟。

在一些實(shí)施例中，捕獲元件被限制在液滴內(nèi)。

在一些實(shí)施方案中，捕獲元件如鏈霉親和素或抗體可以與聚合酶偶聯(lián)而不干擾聚合酶的功能。在這些示例中，在延伸反應(yīng)之前沒(méi)有為每個(gè)循環(huán)添加新的捕獲元件的單獨(dú)步驟。

洗滌步驟

任選地，在并入和切割步驟之后，從表面除去(例如沖洗掉)過(guò)量的試劑和未并入的核苷酸類(lèi)似物。

檢測(cè)/成像

然后使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)(例如電荷耦合器件任選地與過(guò)濾器組合使用)來(lái)檢測(cè)來(lái)自片段的標(biāo)記的熒光發(fā)射。示例性的檢測(cè)方法包括熒光顯微鏡、全內(nèi)反射熒光顯微鏡、高傾斜照明顯微鏡或平行共焦顯微鏡。

標(biāo)記

在一些實(shí)施方案中，使用少于四個(gè)的檢測(cè)標(biāo)記，如例如在美國(guó)專(zhuān)利no.8,617,881中所述的。在一些實(shí)施方案中，使用兩個(gè)標(biāo)記。在一些實(shí)施方案中，如下文所述使用單個(gè)標(biāo)記?？梢允褂脝我换螂p色圖案(例如，使用單個(gè)或兩個(gè)檢測(cè)過(guò)濾器或通道)。

去除標(biāo)簽元件

本文所述的方法還可以包括從表面上的捕獲元件去除標(biāo)簽元件。

在一些實(shí)施方案中，去除步驟包括加熱片斷和捕獲元件。在一些實(shí)施方案中，去除步驟包括用緩沖液或雜交破壞劑(例如甲酰胺)洗滌片段捕獲元件復(fù)合物。任選地，緩沖液具有低的鹽含量以破壞雜交。在設(shè)計(jì)本發(fā)明的測(cè)序系統(tǒng)的元件時(shí)，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將選擇在不破壞其他相互作用的情況下破壞某些相互作用的洗滌步驟。例如，可以設(shè)計(jì)系統(tǒng)以避免破壞被測(cè)序的模板和延伸的引物的關(guān)聯(lián)。在一些實(shí)施方案中，去除步驟包括添加酶以將片段從表面上的捕獲元件切割開(kāi)。在一些實(shí)施方案中，去除步驟包括添加還原劑或置換劑以從表面上的捕獲元件去除片段。

2.3'-o-修飾的末端磷酸酯-標(biāo)記的可切割的核苷酸類(lèi)似物

本文描述的是適用于無(wú)疤痕逐步合成測(cè)序方法的3'-o-修飾的末端磷酸酯-標(biāo)記的可切割的核苷酸類(lèi)似物。

與其他可逆終止劑相反，本文所述的核苷酸類(lèi)似物的優(yōu)點(diǎn)包括消除疤痕，從而導(dǎo)致更快和更有效的并入，更容易的合成過(guò)程，以及不存在或減少的熒光背景和由磷酸酯猝滅染料。由于沒(méi)有熒光背景，所以可以使用非常高濃度的核苷酸以在非常短的時(shí)間內(nèi)將3'-o-修飾的末端磷酸酯-標(biāo)記的核苷酸的并入驅(qū)動(dòng)到完成，這進(jìn)而通過(guò)合成測(cè)序中使用的未標(biāo)記的可逆終止子消除隨后的“填入”反應(yīng)步驟。在一種方法中，將具有3'保護(hù)基團(tuán)但缺少另外的磷酸酯和染料的核苷酸的混合物與染料標(biāo)記的分子混合，或者隨后進(jìn)行追蹤反應(yīng)，以填充在該循環(huán)期間未延伸的任何位點(diǎn)。

用于本文所述方法的核苷酸類(lèi)似物包括由式ii表示的化合物：

在式ii中，n為0、1、2、3、4、5、6或7。

也在式ii中，l不存在或者是連接基團(tuán)。在一些實(shí)施方案中，l是選自經(jīng)取代或未經(jīng)取代的烷基、經(jīng)取代或未經(jīng)取代的烯基或者經(jīng)取代或未經(jīng)取代的芳基的連接基團(tuán)。例如，連接基團(tuán)可以是亞甲基或經(jīng)取代的苯基。在一些實(shí)施方案中，連接基團(tuán)還包含猝滅劑，其示例在本領(lǐng)域已知并在上文描述，其在本文中表示為“q”。

另外在式ii中，r¹是適合用作核苷堿基的含氮堿基。例如，r¹可以是選自腺嘌呤(a)、胞嘧啶(c)、鳥(niǎo)嘌呤(g)、胸腺嘧啶(t)、尿嘧啶(u)及這些的衍生物的堿基。

此外，在式ii中，r²是氫或保護(hù)基團(tuán)。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“保護(hù)基團(tuán)”是指可以被切割以在核苷酸類(lèi)似物的3'-位上提供羥基的任何基團(tuán)。保護(hù)基團(tuán)可以通過(guò)物理方式、化學(xué)方式、熱和/或光來(lái)切割。任選地，所述保護(hù)基團(tuán)可通過(guò)酶法來(lái)切割。在一些實(shí)施方案中，保護(hù)基團(tuán)是含氨基的保護(hù)基團(tuán)(例如-nh2)。在一些實(shí)施方案中，保護(hù)基團(tuán)是含烯丙基的保護(hù)基團(tuán)(例如-ch2ch＝ch2)。在一些實(shí)施方案中，保護(hù)基團(tuán)是含疊氮基的保護(hù)基團(tuán)(例如，-ch2n3)。在一些實(shí)施方案中，保護(hù)基團(tuán)是含烷氧基的保護(hù)基團(tuán)(例如-ch2och3)。在一些實(shí)施方案中，保護(hù)基團(tuán)是聚乙二醇(peg)。在一些實(shí)施方案中，保護(hù)基團(tuán)是經(jīng)取代或未經(jīng)取代的烷基(即經(jīng)取代或未經(jīng)取代的烴)。

也在式ii中，b是結(jié)合分子。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“結(jié)合分子”是指核苷酸類(lèi)似物的部分，其在從連接基團(tuán)(如果存在)斷裂時(shí)或者當(dāng)連接基團(tuán)不存在而從磷酸酯部分?jǐn)嗔褧r(shí)與本文所述的捕獲元件相互作用。在一些實(shí)施方案中，結(jié)合分子是生物素、抗體、氨基酸、膽固醇、異硫氰酸熒光素或肽。任選地，結(jié)合分子含有硫(-s-)或硫醇(-sh)部分。任選地，結(jié)合分子含有寡核苷酸。

此外，在式ii中，x是如上所述的檢測(cè)標(biāo)記。

根據(jù)式ii的核苷酸類(lèi)似物的示例包括以下：

在替代的實(shí)施方案中，根據(jù)式ii的核苷酸類(lèi)似物是與含有三個(gè)磷酸基團(tuán)(即，n＝0)的化合物1、化合物2、化合物3、化合物4、化合物5、化合物6、化合物7或化合物8相似的化合物。

本文所述方法中有用的核苷酸類(lèi)似物還包括由式iii表示的化合物：

在式iii中，n為0、1、2、3、4、5、6或7。

也在式iii中，l不存在或者是連接基團(tuán)。在一些實(shí)施方案中，l是選自經(jīng)取代或未經(jīng)取代的烷基、經(jīng)取代或未經(jīng)取代的烯基或經(jīng)取代或未經(jīng)取代的芳基的連接基團(tuán)。例如，連接基團(tuán)可以是亞甲基或經(jīng)取代的苯基。在一些實(shí)施方案中，連接基團(tuán)還包含在本文中表示為“q”的猝滅劑。例如，猝滅劑可以是二甲基氨基苯磺酸；可從biosearchtechnologies(petaluma，ca)商購(gòu)獲得的blackholequencher染料；qxlquenchers，其可從anaspec，inc.(fremont，ca)商購(gòu)獲得；猝滅劑，其可從integrateddnatechnologies(coralville，iowa)的iowablack產(chǎn)品系列中商購(gòu)獲得，包括iowablackfq和iowablackrq；和irdyeqc-1，其可從li-corbiosciences(lincoln，ne)商購(gòu)獲得。

另外在式iii中，r¹是適合用作核苷堿基的含氮堿基。例如，r¹可以是選自腺嘌呤(a)、胞嘧啶(c)、鳥(niǎo)嘌呤(g)、胸腺嘧啶(t)、尿嘧啶(u)及其衍生物的堿基。

另外在式iii中，b是結(jié)合分子。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“結(jié)合分子”是指核苷酸類(lèi)似物的部分，其在從連接基團(tuán)(如果存在)斷裂時(shí)或者當(dāng)連接基團(tuán)不存在而從磷酸酯部分?jǐn)嗔褧r(shí)與本文所述的捕獲元件相互作用。在一些實(shí)施方案中，結(jié)合分子是生物素、抗體、氨基酸、膽固醇、異硫氰酸熒光素或肽。任選地，結(jié)合分子含有硫(-s-)或硫醇(-sh)部分。任選地，結(jié)合分子含有寡核苷酸。

此外，在式iii中，x是檢測(cè)標(biāo)記。在一些實(shí)施方案中，檢測(cè)標(biāo)記是含有帶電基團(tuán)的分子(例如，含有陽(yáng)離子基團(tuán)的分子或含有陰離子基團(tuán)的分子)、熒光分子(例如熒光染料)、熒光性分子或金屬。任選地，檢測(cè)標(biāo)記是熒光性標(biāo)記。熒光性標(biāo)記可以是任何能夠在處于不猝滅形式時(shí)(例如，當(dāng)不被另一種試劑猝滅時(shí))發(fā)出光的標(biāo)記。熒光部分當(dāng)被合適的激發(fā)波長(zhǎng)激發(fā)時(shí)，以特定的發(fā)射波長(zhǎng)發(fā)射光能(即發(fā)熒光)。當(dāng)熒光部分和猝滅劑部分非常接近時(shí)，由熒光部分發(fā)射的光能被猝滅劑部分吸收。任選地，檢測(cè)標(biāo)記是熒光性染料。在一些實(shí)施方案中，熒光性染料是熒光素、羅丹明、吩噁嗪、吖啶、香豆素或其衍生物。在一些實(shí)施方案中，熒光性染料是羧基熒光素。合適的熒光性染料的其他示例包括在alexafluor產(chǎn)品系列(lifetechnologies；carlsbad，ca)下可商購(gòu)的熒光性染料。熒光性染料還可以是例如在grimmetal.,2013,progressinmolecularbiologyandtranslationalscience,113卷,第1章,第1-34頁(yè)中所描述的。任選地，標(biāo)記是氧化還原標(biāo)記。任選地，標(biāo)記是還原標(biāo)簽、含硫分子或經(jīng)取代或未經(jīng)取代的烷基。

根據(jù)式iii的核苷酸類(lèi)似物的示例包括以下：

在替代的實(shí)施方案中，根據(jù)式iii的核苷酸類(lèi)似物是與含有三個(gè)磷酸基團(tuán)(即，n＝0)的化合物9、化合物10、化合物11、化合物12、化合物13、化合物14、化合物15或化合物16相似的化合物。

本文所述方法中有用的核苷酸類(lèi)似物還包括由式iv表示的化合物：

在式iv中，n為0、1、2、3、4、5、6或7。

也在式iv中，l不存在或者是連接基團(tuán)。在一些實(shí)施方案中，l是選自經(jīng)取代或未經(jīng)取代的烷基、經(jīng)取代或未經(jīng)取代的烯基或經(jīng)取代或未經(jīng)取代的芳基的連接基團(tuán)。例如，連接基團(tuán)可以是亞甲基或經(jīng)取代的苯基。在一些實(shí)施方案中，連接基團(tuán)還包含在本文中表示為“q”的猝滅劑。例如，猝滅劑可以是二甲基氨基苯磺酸；可從biosearchtechnologies(petaluma，ca)商購(gòu)獲得的blackholequencher染料；qxlquenchers，其可從anaspec，inc.(fremont，ca)商購(gòu)獲得；猝滅劑，其可從integrateddnatechnologies(coralville，iowa)的iowablack產(chǎn)品系列中商購(gòu)獲得，包括iowablackfq和iowablackrq；和irdyeqc-1，其可從li-corbiosciences(lincoln，ne)商購(gòu)獲得。

另外在式iv中，r¹是適合用作核苷堿基的含氮堿基。例如，r¹可以是選自腺嘌呤(a)、胞嘧啶(c)、鳥(niǎo)嘌呤(g)、胸腺嘧啶(t)、尿嘧啶(u)及其衍生物的堿基。

此外，在式iv中，r²是氫或保護(hù)基團(tuán)。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“保護(hù)基團(tuán)”是指可以被切割以在核苷酸類(lèi)似物的3'-位上提供羥基的任何基團(tuán)。保護(hù)基團(tuán)可以通過(guò)物理方式、化學(xué)方式、熱和/或光來(lái)切割。任選地，所述保護(hù)基團(tuán)可通過(guò)酶法來(lái)切割。在一些實(shí)施方案中，保護(hù)基團(tuán)是含氨基的保護(hù)基團(tuán)(例如-nh2)。在一些實(shí)施方案中，保護(hù)基團(tuán)是含烯丙基的保護(hù)基團(tuán)(例如-ch2ch＝ch2)。在一些實(shí)施方案中，保護(hù)基團(tuán)是含疊氮基的保護(hù)基團(tuán)(例如，-ch2n3)。在一些實(shí)施方案中，保護(hù)基團(tuán)是含烷氧基的保護(hù)基團(tuán)(例如-ch2och3)。在一些實(shí)施方案中，保護(hù)基團(tuán)是聚乙二醇(peg)。在一些實(shí)施方案中，保護(hù)基團(tuán)是經(jīng)取代或未經(jīng)取代的烷基(即經(jīng)取代或未經(jīng)取代的烴)。

還在式iv中，b是結(jié)合分子。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“結(jié)合分子”是指核苷酸類(lèi)似物的部分，其在從連接基團(tuán)(如果存在)斷裂時(shí)或者當(dāng)連接基團(tuán)不存在而從磷酸酯部分?jǐn)嗔褧r(shí)與本文所述的捕獲元件相互作用。在一些實(shí)施方案中，結(jié)合分子是生物素、抗體、氨基酸、膽固醇、異硫氰酸熒光素或肽。任選地，結(jié)合分子含有硫(-s-)或硫醇(-sh)部分。任選地，結(jié)合分子含有寡核苷酸。

此外，在式iv中，x是檢測(cè)標(biāo)記。在一些實(shí)施方案中，檢測(cè)標(biāo)記是含有帶電基團(tuán)的分子(例如，含有陽(yáng)離子基團(tuán)的分子或含有陰離子基團(tuán)的分子)、熒光分子(例如熒光染料)、熒光性分子或金屬。任選地，檢測(cè)標(biāo)記是熒光性標(biāo)記。熒光性標(biāo)記可以是任何能夠在處于非猝滅形式時(shí)(例如，當(dāng)不被另一種試劑猝滅時(shí))發(fā)出光的標(biāo)記。熒光部分當(dāng)被合適的激發(fā)波長(zhǎng)激發(fā)時(shí)，以特定的發(fā)射波長(zhǎng)發(fā)射光能(即發(fā)熒光)。當(dāng)熒光部分和猝滅劑部分非常接近時(shí)，由熒光部分發(fā)射的光能被猝滅劑部分吸收。任選地，檢測(cè)標(biāo)記是熒光性染料。在一些實(shí)施方案中，熒光性染料是熒光素、羅丹明、吩噁嗪、吖啶、香豆素或其衍生物。在一些實(shí)施方案中，熒光性染料是羧基熒光素。合適的熒光性染料的其他示例包括在alexafluor產(chǎn)品系列(lifetechnologies；carlsbad，ca)下可商購(gòu)的熒光性染料。任選地，標(biāo)記是氧化還原標(biāo)記。任選地，標(biāo)記是還原標(biāo)簽、含硫分子或經(jīng)取代或未經(jīng)取代的烷基。

根據(jù)式iv的核苷酸類(lèi)似物的示例包括以下：

在替代的實(shí)施方案中，根據(jù)式iv的核苷酸類(lèi)似物是與含有三個(gè)磷酸基團(tuán)(即，n＝0)的化合物17、化合物18、化合物19或化合物20相似的化合物。

合適的核苷酸類(lèi)似物的其他示例在圖1-14中描繪。

本文所述的化合物可以以本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的有機(jī)合成領(lǐng)域中已知的各種方式或其變化來(lái)制備。本文所述的化合物可以由容易獲得的原料制備。最佳反應(yīng)條件可以隨所用的具體反應(yīng)物或溶劑而變化，但這些條件可由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定。

關(guān)于式i、式ii、式iii和式iv以及本文所述的化合物的變化包括如針對(duì)各化合物所述的各種組分的加成、減少或移動(dòng)。類(lèi)似地，當(dāng)分子中存在一個(gè)或多個(gè)手性中心時(shí)，可以改變分子的手性。此外，化合物合成可涉及各種化學(xué)基團(tuán)的保護(hù)和去保護(hù)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定保護(hù)和去保護(hù)的使用以及合適的保護(hù)基(protectinggroup)的選擇。保護(hù)基的化學(xué)性質(zhì)可以在例如wutsandgreene,protectivegroupsinorganicsynthesis,4thed.,wiley&sons,2006中找到，其全部?jī)?nèi)容通過(guò)引用并入本文。如本文所述的各種化合物的合成和隨后的測(cè)試以確定功效是能預(yù)料到的。

產(chǎn)生本文所述化合物的反應(yīng)可以在可由有機(jī)合成領(lǐng)域的技術(shù)人員選擇的溶劑中進(jìn)行。在使得反應(yīng)得以進(jìn)行的條件(即溫度和壓力)下，溶劑可以與起始材料(反應(yīng)物)、中間體或產(chǎn)物基本上不反應(yīng)。反應(yīng)可以在一種溶劑中或多種溶劑的混合物中進(jìn)行?？梢愿鶕?jù)本領(lǐng)域已知的任何合適的方法監(jiān)測(cè)產(chǎn)物或中間體形成。例如，產(chǎn)品形成可通過(guò)光譜手段(如通過(guò)核磁共振光譜(如¹h或¹³c)紅外光譜、分光光度法(如紫外可見(jiàn))或質(zhì)譜法)或通過(guò)色譜法(如高效液相色譜法(hplc)或薄層色譜法)進(jìn)行監(jiān)測(cè)。

任選地，本文所述的化合物可以通過(guò)使用市售的dntp合成。市售的dtnp可以通過(guò)磷酸酯綴合反應(yīng)與接頭或結(jié)合分子綴合?？梢酝ㄟ^(guò)使化合物與保護(hù)基反應(yīng)來(lái)封閉dntp的3'-位。綴合和封閉反應(yīng)可以以任何順序進(jìn)行。

本文提供了使用本文所述的核苷酸類(lèi)似物對(duì)靶核酸進(jìn)行測(cè)序的方法。本文公開(kāi)的方法不限于本文所述的特定類(lèi)似物，并且不限于熒光檢測(cè)系統(tǒng)，而可以廣泛地應(yīng)用于其他系統(tǒng)，如下文所述?？紤]到這一點(diǎn)，為了方便和清楚，將參考這些類(lèi)似物來(lái)描述該系統(tǒng)。

在本方法中，在通過(guò)引物延伸反應(yīng)將核苷酸類(lèi)似物并入多核苷酸后，檢測(cè)核苷酸類(lèi)似物的同一性。在一種方法中，對(duì)靶核酸進(jìn)行測(cè)序包括以下步驟：(1)提供本文所述的模板核酸、引物、聚合酶和核苷酸類(lèi)似物；(2)通過(guò)并入核苷酸類(lèi)似物(和任選的其他核苷酸)延伸引物；(3)提供磷酸酶以切割(在不存在連接基團(tuán)的情況下)在結(jié)合分子和末端磷酸酯之間或(在存在連接基團(tuán)的情況下)在結(jié)合分子和連接基團(tuán)之間的并入的核苷酸類(lèi)似物，從而產(chǎn)生式ii、式iii或式iv的包含標(biāo)簽和結(jié)合分子的片段，其中標(biāo)記是未被猝滅的；(4)將片段與固定在表面上的捕獲元件結(jié)合；以及(5)檢測(cè)來(lái)自表面上捕獲的片段的標(biāo)記物的熒光發(fā)射。以下進(jìn)一步描述每個(gè)步驟。

用于對(duì)靶核酸進(jìn)行測(cè)序的方法包括提供模板核酸、引物、聚合酶和核苷酸類(lèi)似物。

任選地，所提供的核苷酸類(lèi)似物是根據(jù)式ii、式iii或式iv的四種核苷酸類(lèi)似物的混合物，每種包含不同的堿基(即，不同的r¹基團(tuán))。在一些實(shí)施方案中，四種核苷酸類(lèi)似物中的每一種都包含不同的檢測(cè)標(biāo)記(即，不同的x基團(tuán))。例如，根據(jù)式ii的核苷酸類(lèi)似物的混合物可以包括以下化合物：

其中x¹、x²、x³和x⁴分別表示不同的檢測(cè)標(biāo)簽。在一些實(shí)施方案中，使用一種或多種不同的或另外的堿基，例如u(尿嘧啶)或i(肌苷)。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)使標(biāo)簽與磷酸酯鄰近而使標(biāo)簽猝滅。

如上所述，在一些實(shí)施方案中，使用少于四個(gè)的檢測(cè)標(biāo)記，如例如在美國(guó)專(zhuān)利no.8,617,881中所述的。在一些實(shí)施例中，使用兩個(gè)標(biāo)記。在一些實(shí)施方案中，使用單個(gè)標(biāo)記，如下文所述。

聚合酶使核苷酸類(lèi)似物并入核酸，從而延伸引物。當(dāng)并入的核苷酸類(lèi)似物含有保護(hù)基團(tuán)時(shí)(即當(dāng)r²為保護(hù)基團(tuán)時(shí))，不能進(jìn)一步延伸所得的延伸的引物(即，通過(guò)另外的核苷酸類(lèi)似物進(jìn)行的隨后的并入被阻擋)直至保護(hù)基團(tuán)被除去。

任選地，提供磷酸酶以切割在結(jié)合分子和末端磷酸酯之間或在結(jié)合分子和連接基團(tuán)之間的鍵。在一些實(shí)施方案中，在上述引物延伸反應(yīng)期間提供磷酸酶。在其他實(shí)施方案中，在上述引物延伸反應(yīng)后提供磷酸酶。在其中核苷酸類(lèi)似物是根據(jù)式ii的化合物并且不含有連接基團(tuán)(即，不存在連接基團(tuán)的情況下)的實(shí)施方案中，磷酸酶切割在結(jié)合分子和末端磷酸酯之間的鍵。磷酸酶因此產(chǎn)生核苷酸類(lèi)似物的包含檢測(cè)標(biāo)記和結(jié)合分子(即x-b-)的片段(即，(ii)、(iii)或(iv)的片段)。

在一些實(shí)施方案中，提供切割試劑以產(chǎn)生核苷酸類(lèi)似物的包含檢測(cè)標(biāo)記和結(jié)合分子的片段。在其中核苷酸類(lèi)似物是根據(jù)式iii或式iv的化合物的實(shí)施方案中，檢測(cè)標(biāo)記和結(jié)合分子可以通過(guò)如本文所述的切割試劑(例如，通過(guò)膦、tcep、dtt或還原劑)從核苷酸類(lèi)似物釋放。這種切割使得結(jié)合分子的表位能以本文所述的捕獲方法中可被捕獲元件識(shí)別的形式暴露。

在一些實(shí)施方案中，磷酸酶可以與dna結(jié)合(例如，與互補(bǔ)捕獲序列)結(jié)合。任選地，可以提供猝滅化學(xué)品與磷酸酶以猝滅任何背景信號(hào)。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，磷酸酶和猝滅化學(xué)品可以相伴地或依次提供。磷酸酶和/或猝滅化學(xué)品消除磷酸酯的猝滅能力以產(chǎn)生具有非猝滅標(biāo)記的片段。片段的非猝滅標(biāo)記發(fā)光。

3.系統(tǒng)

本發(fā)明提供用于實(shí)施本文所述方法的系統(tǒng)和試劑盒。示例性試劑盒包含本文所述的核苷酸類(lèi)似物、捕獲元件或酶中的一種或多種。本發(fā)明的系統(tǒng)可以包括包含固定的捕獲元件的底物。

4.說(shuō)明性實(shí)施方式

以下實(shí)施例旨在進(jìn)一步說(shuō)明本文所述的方法和組合物的某些方面，并不意圖限制權(quán)利要求書(shū)的范圍。

說(shuō)明性實(shí)施方案1：熒光分子的生產(chǎn)

圖2示出了本文所述的包含熒光標(biāo)簽的核苷酸類(lèi)似物。如圖2所示，聚合酶將核苷酸并入延伸的多核苷酸中，導(dǎo)致包含熒光分子和三磷酸的片段的釋放。熒光被三磷酸酯基團(tuán)猝滅。磷酸酶然后從磷酸酯末端切割開(kāi)熒光性標(biāo)簽，得到包含非猝滅熒光分子的標(biāo)簽。

說(shuō)明性實(shí)施方案2：含有dnb的液滴

使用本文所述的核苷酸類(lèi)似物的合成測(cè)序的方法可以在液滴內(nèi)進(jìn)行。圖3示出了定位在由疏水表面包圍的親水區(qū)域(“斑點(diǎn)(spot)”)的高密度陣列的親水區(qū)域上的液滴。參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利7,666,593；drmanacetal.,2010,science327(5961):78-81。示例性疏水表面包括cytop，一種無(wú)定形含氟聚合物(bellexinternationalcorporation，wilmington，de)。應(yīng)認(rèn)識(shí)到，當(dāng)向這種表面添加水溶液時(shí)，液滴自發(fā)形成。本文所述的測(cè)序反應(yīng)可以在含有dna模板和捕獲元件的液滴內(nèi)進(jìn)行。dna模板可以固定在液滴內(nèi)的陣列表面上或珠上。該系統(tǒng)的一個(gè)示例性特征是液滴限制了試劑的擴(kuò)散，包括可以由液滴內(nèi)的捕獲元件捕獲的標(biāo)簽元件。在一個(gè)實(shí)施方案中，dna模板是包含捕獲序列(捕獲元件)的多個(gè)拷貝的固定化dna連環(huán)體。例如，通過(guò)在dna和表面上的涂層之間的相互作用將連環(huán)體固定在表面上。任選地，可以將連環(huán)體固定在液滴內(nèi)的珠或其他底物上。在聚合捕獲循環(huán)完成時(shí)，陣列表面可以如本文所述進(jìn)行洗滌。

示例性實(shí)施方案3：使用可逆瞬時(shí)接頭的表面捕獲

圖4示出了根據(jù)本發(fā)明的一種測(cè)序方法，其中標(biāo)簽元件和末端磷酸酯通過(guò)硫-氧鍵連接。通過(guò)聚合酶并入核苷酸并用磷酸酶處理產(chǎn)生可以任選地通過(guò)可逆接頭連接到結(jié)合分子(b)上的含硫標(biāo)簽元件(例如，磺化熒光染料)。替代地，含硫標(biāo)簽元件通過(guò)可逆接頭直接連接到捕獲元件上。在一種方法中，如圖4所示，含硫標(biāo)簽元件與二溴馬來(lái)酰亞胺反應(yīng)以產(chǎn)生可逆的瞬時(shí)接頭。熒光含硫片段和二溴馬來(lái)酰亞胺復(fù)合物然后結(jié)合固定在表面上的捕獲元件。在該實(shí)施例中，捕獲元件包括硫醇聚合物，例如bsa(包含35個(gè)半胱氨酸殘基)。然后為了信號(hào)，使用檢測(cè)器掃描該陣列，并用谷胱甘肽或β-巰基乙醇洗滌陣列以除去熒光含硫片段和二溴馬來(lái)酰亞胺復(fù)合物。用于本發(fā)明的方法中的示例性氧化還原基因標(biāo)簽描述于美國(guó)專(zhuān)利公布20140001055。

示例性實(shí)施例4：通過(guò)捕獲元件在引物的5'-末端的表面捕獲

圖5描繪了其中捕獲元件結(jié)合到引物的5'端(而不是例如陣列表面)的實(shí)施方案。在該配置中，捕獲元件更接近于核苷酸并入位點(diǎn)，從而確保對(duì)標(biāo)簽元件的更有效的捕獲。并非意圖受到特定機(jī)制的束縛，標(biāo)簽元件-磷酸酯復(fù)合物的快速去磷酸化在捕獲元件之前使擴(kuò)散最小化。在圖5中，生物素用作核苷酸類(lèi)似物中的結(jié)合分子。

在循環(huán)完成后，在檢測(cè)到捕獲的信號(hào)后，通過(guò)使用含有鏈霉親和素的洗滌緩沖液來(lái)除去生物素，然后用測(cè)序緩沖液洗滌以除去鏈霉親和素，從而再生陣列。

說(shuō)明性實(shí)施方案5：通過(guò)捕獲元件與寡核苷酸在引物的5'末端結(jié)合的表面捕獲

圖6描述了測(cè)序方法，其中捕獲元件是配體-抗配體對(duì)(例如鏈霉親和素)的第一個(gè)成員和寡核苷酸的綴合物。捕獲元件上的寡核苷酸與固定在陣列或珠表面上的第二寡核苷酸互補(bǔ)，或與測(cè)序引物連接。當(dāng)標(biāo)簽片段(這里顯示為包含生物素)結(jié)合捕獲元件的抗配體(此處顯示為鏈霉親和素)時(shí)，發(fā)生捕獲元件的捕獲，并且捕獲元件的寡核苷酸部分與固定的互補(bǔ)寡核苷酸雜交。在一些實(shí)施方案中，捕獲元件的寡核苷酸和固定的互補(bǔ)寡核苷酸是短的，例如10-50個(gè)堿基，有時(shí)10-15個(gè)堿基。

選擇短寡核苷酸和結(jié)合分子，使得結(jié)合分子對(duì)標(biāo)簽元件具有強(qiáng)親和力，而短寡核苷酸對(duì)捕獲序列(或其他固定化的互補(bǔ)寡核苷酸)具有低親和力。這使得結(jié)合分子在循環(huán)結(jié)束時(shí)能被洗去。

應(yīng)當(dāng)理解，在捕獲元件被間接固定化的其他實(shí)施方案中，捕獲元件的寡核苷酸部分和固定化的互補(bǔ)寡核苷酸可以用不同的配體-抗配體對(duì)替代。

說(shuō)明性實(shí)施方案6：通過(guò)雜交的表面捕獲

圖7示出了一種核苷酸類(lèi)似物，其中核苷酸類(lèi)似物的結(jié)合部分是寡核苷酸。在該實(shí)施方案中，核苷酸-寡磷酸酯通過(guò)寡核苷酸與標(biāo)簽部分連接，使其不可雜交。在圖示的實(shí)施方案中，核苷酸-寡磷酸酯通過(guò)肽鍵與寡核苷酸的鳥(niǎo)嘌呤連接(即肽核酸結(jié)構(gòu))。在并入核苷酸之后，使用磷酸酶以去除寡磷酸酯。

說(shuō)明性實(shí)施方式7：通過(guò)雜交的表面捕獲

圖8示出了其中猝滅劑位于連接到類(lèi)似物的末端磷酸酯的可切割接頭上的實(shí)施方案。在圖8中，核苷酸類(lèi)似物類(lèi)似于圖7所示的核苷酸類(lèi)似物。然而，圖8的核苷酸類(lèi)似物包括連接于該類(lèi)似物的末端磷酸酯的可切割接頭上的猝滅劑。

說(shuō)明性實(shí)施方案8：通過(guò)去除捕獲元件的再生

圖9a示出了其中標(biāo)簽元件的結(jié)合部分被封閉以使其不能結(jié)合相應(yīng)抗配體的實(shí)施方案。在圖示中，封閉結(jié)合部分的結(jié)構(gòu)包括猝滅劑。圖9a還示出了其中捕獲元件-標(biāo)簽元件復(fù)合物在成像之后被去除而不是僅去除標(biāo)簽元件的實(shí)施方案。

在該示例中，標(biāo)簽元件包含熒光團(tuán)、生物素和猝滅劑。捕獲元件包含與鏈霉親和素綴合的寡核苷酸(“寡核苷酸拴系的鏈霉親和素”)。顯示捕獲元件與連環(huán)體的固定化互補(bǔ)序列(銜接物序列)雜交，但也可以以其他形式雜交到互補(bǔ)寡核苷酸。應(yīng)認(rèn)識(shí)到，連環(huán)體上的互補(bǔ)序列不能作為“捕獲元件”，盡管它可能在結(jié)構(gòu)上類(lèi)似。相反，互補(bǔ)序列類(lèi)似于說(shuō)明性實(shí)施方案5的固定化互補(bǔ)寡核苷酸。

在一個(gè)實(shí)施方案(如圖所示)中，鏈霉親和素的生物素結(jié)合位點(diǎn)被4'-羥基偶氮苯-2-羧酸(haba)(鏈霉親和素的一種弱結(jié)合類(lèi)似物)占據(jù)。

通過(guò)聚合酶引入堿基并通過(guò)磷酸酶切割后，生物素是未封閉的并且可自由結(jié)合鏈霉親和素捕獲元件，置換更弱結(jié)合的haba。

陣列以?xún)蓚€(gè)步驟再生。首先，通過(guò)破壞捕獲元件的寡核苷酸部分和與其結(jié)合的互補(bǔ)序列的締合以及去除(洗去)捕獲元件-標(biāo)簽元件復(fù)合物來(lái)除去捕獲元件標(biāo)簽元件復(fù)合物?？梢酝ㄟ^(guò)任何合適的方法進(jìn)行破壞，例如用緩沖液(任選低鹽條件)洗滌表面，用雜交破壞劑(如甲酰胺)洗滌，或加熱以熔化寡核苷酸雙鏈體。其次，通過(guò)添加另外的寡核苷酸拴系的鏈霉親和素(即新的捕獲元件)來(lái)置換捕獲元件。

因?yàn)椴东@元件在每個(gè)周期從陣列中除去，所以熒光受體分子可以是強(qiáng)勁地(或不可逆地)結(jié)合捕獲元件。

說(shuō)明性實(shí)施方案9：通過(guò)去除捕獲元件的再生

圖9b示出了說(shuō)明性實(shí)施方案8的方法的變體。在該變體中，核苷酸類(lèi)似物任選地不包括磷酸酯以外的猝滅劑。熒光團(tuán)連接到鏈霉親和素捕獲元件，并且相應(yīng)的猝滅劑附著于haba分子。haba猝滅劑通過(guò)捕獲標(biāo)簽元件而被置換。fret相互作用允許一個(gè)照明波長(zhǎng)以通過(guò)激發(fā)鏈霉親和素-fret供體并將該能量轉(zhuǎn)移到生物素-fret受體熒光團(tuán)來(lái)激發(fā)所有生物素綴合的熒光團(tuán)。haba的置換使得能夠吸收適當(dāng)?shù)牟ㄩL(zhǎng)，這進(jìn)而使得能夠檢測(cè)適當(dāng)?shù)膲A基。單個(gè)堿基的順序添加使得單個(gè)檢測(cè)部分能夠存在并減輕對(duì)磷酸酯切割的需要。

應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，該說(shuō)明性實(shí)施方案和說(shuō)明性實(shí)施方案8存在各種變體的實(shí)施方案。例如，可以使用生物素和鏈霉親和素以外的配體-抗配體組合，可以使用除寡核苷酸以外的捕獲元件，haba可以被省略等。

說(shuō)明性實(shí)施方案10：其中核酸類(lèi)似物不會(huì)包含(或任選地包含)熒光團(tuán)的單色系統(tǒng)

任選地，可以使用單色系統(tǒng)，通常需要單個(gè)堿基的順序流動(dòng)。在這種方法中，核苷酸類(lèi)似物含有通過(guò)聚合酶釋放的“誘導(dǎo)物”，該聚合酶在α和β磷酸酯之間進(jìn)行切割并引發(fā)磷酸酶，從而導(dǎo)致“誘導(dǎo)物”的釋放。誘導(dǎo)物激活捕獲元件上的猝滅的染料。如該說(shuō)明性實(shí)施方案中所使用的，“捕獲元件”是指結(jié)合誘導(dǎo)物而不一定結(jié)合標(biāo)簽元件的分子。在圖10中，“捕獲元件”是含有寡核苷酸拴接的單體fab和熒光團(tuán)的綴合物的復(fù)合物。如圖10所示，誘導(dǎo)物可以是抗原，捕獲元件可以是抗體、適配體或其他結(jié)合分子?？贵w結(jié)合位點(diǎn)被猝滅劑和抗原的綴合物占據(jù)。在通過(guò)聚合酶并入堿基并通過(guò)磷酸酶切割之后，抗原是未封閉的并且可自由結(jié)合捕獲元件。在該實(shí)施方案中，抗原置換猝滅劑-抗原復(fù)合物以結(jié)合抗體。在不存在猝滅劑的情況下，抗體可以發(fā)射熒光以用于檢測(cè)。

應(yīng)認(rèn)識(shí)到，在該實(shí)施方案中，核苷酸類(lèi)似物的結(jié)構(gòu)是

ant-c-pn[1-4]

其中“ant”是指抗原，c是可裂解位點(diǎn)(例如，可被堿性磷酸酶切割的磷酸酯鍵)并且pn如上文所述的。

用于該方法的合適抗原的示例包括但不限于生物素、fitc、小分子(如氨基酸)、膽固醇和肽。

在結(jié)合后，對(duì)底物進(jìn)行成像。在循環(huán)完成時(shí)通過(guò)用緩沖液(任選地含有如本文所述的切割試劑或具有低ph或低鹽條件)或用雜交破壞劑(如甲酰胺)洗滌表面而使陣列再生，并且釋放抗原。任選地，可以通過(guò)加熱和熔化寡核苷酸來(lái)使陣列再生。

在一些實(shí)施方案中，可以使用單色合成測(cè)序程序。例如，可以包含不同量的生物素作為可以基于核苷酸而變化的誘導(dǎo)物(如說(shuō)明性實(shí)施方案9中進(jìn)一步描述的)。例如，a可以包含大于99％的生物素；t可以包含約50％的生物素；c可以包括約25％的生物素，并且g可包括少于10％的生物素或不含生物素。由于在單一延伸步驟中本文所述的核苷酸類(lèi)似物達(dá)到了近100％的并入(例如，大于98％、大于99％或大于99.9％)，并且沒(méi)有序列上下文相關(guān)的信號(hào)猝滅(染料不是在并入的核苷酸上)，因此，對(duì)于每個(gè)堿基所獲得的信號(hào)與具有生物素的核苷酸的比值足夠成正比。使用控制循環(huán)或多個(gè)實(shí)際循環(huán)，可以為每個(gè)dna斑點(diǎn)定義強(qiáng)度歸一化因子和/或背景值。此外，可以為每個(gè)歸檔圖像定義強(qiáng)度或背景歸一化或校正因子。

示例性實(shí)施例11：通過(guò)含硼酸鹽猝滅劑捕獲元件的表面捕獲

圖11顯示了一種變體，其中與猝滅劑-硼酸鹽綴合物復(fù)合的寡核苷酸拴系的fam-鋅螯合物固定在模板附近。核苷酸類(lèi)似物包含染料(例如甲基或texred)-標(biāo)記的末端磷酸酯。jangetal.,2005,j.org.chem.70:9603–9606描述了合適的螯合劑。

聚合酶結(jié)合堿基并釋放染料/磷酸酯復(fù)合物。染料/磷酸酯復(fù)合物然后通過(guò)拴系的fam-鋅螯合復(fù)合物捕獲，置換猝滅劑-硼酸鹽，以產(chǎn)生未猝滅的復(fù)合物。在沒(méi)有猝滅的情況下，可能發(fā)生熒光發(fā)射(在甲基標(biāo)記的情況下)和/或fret(在texred標(biāo)記的情況下)。

如圖11所示，在循環(huán)完成時(shí)通過(guò)洗滌未猝滅的捕獲螯合復(fù)合物來(lái)再生該陣列。

說(shuō)明性實(shí)施例12：通過(guò)含有鏈霉親和素的捕獲元件的表面捕獲

在圖12所示的實(shí)施方案中，核苷酸類(lèi)似物含有作為結(jié)合分子的封閉的生物素和猝滅的fret對(duì)。猝滅的fret對(duì)具有背景低的優(yōu)點(diǎn)。生物素結(jié)合到末端磷酸脂，因此被封閉而不與鏈霉親和素結(jié)合。在通過(guò)聚合酶引入堿基并通過(guò)磷酸酶切割之后，生物素是未封閉的并且可自由結(jié)合捕獲元件(例如鏈霉親和素)。此外，猝滅劑分子被釋放，使得熒光團(tuán)不被猝滅。

如在圖12所描繪的合成測(cè)序的實(shí)施方案中所示，捕獲元件(圖12中標(biāo)記為“結(jié)合分子”)可以是具有針對(duì)標(biāo)簽元件的抗體的寡核苷酸。在圖12中，捕獲元件是寡核苷酸拴系的單體鏈霉親和素和熒光團(tuán)分子的綴合物。核苷酸類(lèi)似物可為該方法提供四色或雙色系統(tǒng)。具體地，由于使用相同的捕獲元件，因此不同染料的配體和抗配體結(jié)合的親和力沒(méi)有偏差。由于所有分子以相對(duì)相似的速率被捕獲，因此經(jīng)標(biāo)記的分子的比例可以在混合物中辨別。因此，高親和力結(jié)合限制了擴(kuò)散，從而能夠檢測(cè)雙色系統(tǒng)中的染料比例。

鏈霉親和素定位信號(hào)。在足夠的時(shí)間后，對(duì)底物進(jìn)行成像。在循環(huán)完成時(shí)通過(guò)用緩沖液(任選低鹽條件)或用雜交破壞劑(如甲酰胺)洗滌表面來(lái)再生該陣列。任選地，可以通過(guò)加熱和熔化寡核苷酸來(lái)再生陣列。然后置換捕獲元件。

說(shuō)明性實(shí)施方式13通過(guò)雙色系統(tǒng)中的誘導(dǎo)物的表面捕獲

如在圖13所描繪的合成測(cè)序的實(shí)施方案中所示，可以使用兩種不同的捕獲元件。第一捕獲元件可以是寡核苷酸-拴系的單體fab和熒光團(tuán)分子的綴合物與抗原-熒光猝滅劑分子的綴合物之間的復(fù)合物。第二捕獲元件可以是寡核苷酸拴系的單體鏈霉親和素和熒光團(tuán)分子的綴合物和haba熒光猝滅劑分子的綴合物之間的復(fù)合物。

核苷酸類(lèi)似物含有封閉誘導(dǎo)物，例如生物素或抗原表位。在通過(guò)聚合酶并入堿基并通過(guò)磷酸酶切割之后，抗原或生物素是未封閉的并且可自由結(jié)合捕獲元件。然后，未封閉的抗原可以置換抗原-猝滅劑分子。未封閉的生物素可以置換haba猝滅劑分子。在這種方法中，抗原可以與一種染料結(jié)合，而生物素可以與不同的染料相關(guān)聯(lián)。進(jìn)而，熒光團(tuán)不再猝滅，并且可以被檢測(cè)?？乖氖纠ɡ缟锼?、fitc、小分子(如氨基酸)、膽固醇和肽。

在結(jié)合后，對(duì)底物進(jìn)行成像。在循環(huán)完成時(shí)通過(guò)用緩沖液(任選低鹽條件)或雜交破壞劑(如甲酰胺)洗滌表面來(lái)再生該陣列。任選地，可以通過(guò)加熱和熔化寡核苷酸來(lái)再生陣列。然后置換捕獲元件。

所附權(quán)利要求的化合物和方法的范圍不受本文所述的具體化合物和方法的限制，這些化合物和方法意在說(shuō)明權(quán)利要求的幾個(gè)方面，并且功能上等同的任何化合物和方法在本公開(kāi)的范圍內(nèi)?；衔锖头椒ǖ某吮疚乃竞退鲋獾母鞣N修飾將落入所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。此外，雖然僅具體描述了這些化合物和方法的某些代表性的化合物、方法和方面，但其他化合物和方法以及化合物和方法的各種特征的組合將落入所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)，即使沒(méi)有具體敘述也如此。因此，本文可以明確地提及步驟、元件、組件或組分的組合；然而，包括步驟、元素、組件和組分的所有其他組合，即使沒(méi)有明確說(shuō)明也如此。本文引用的所有出版物、專(zhuān)利和專(zhuān)利申請(qǐng)的全部?jī)?nèi)容通過(guò)引用并入本文以用于所有目的。