相關(guān)申請(qǐng)的交叉參照

本申請(qǐng)要求2014年10月24日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)系列號(hào)62/068,316的優(yōu)先權(quán)，其通過(guò)引用以其整體結(jié)合到本文中。

1.領(lǐng)域

本申請(qǐng)涉及應(yīng)用免疫技術(shù)和醫(yī)藥領(lǐng)域。更具體地說(shuō)，它涉及dna基序疫苗設(shè)計(jì)或免疫原設(shè)計(jì)，用于產(chǎn)生針對(duì)難以誘導(dǎo)抗體的任意序列的表位或多糖表位的抗體。

2.背景

人免疫缺陷病毒1型(hiv-1)是一種高度變異的病毒，其可在不同的感染階段，在不同的病毒顆粒/被膜區(qū)中變異，并且甚至在同一患者中顯示出不同的突變。這種高突變率是生產(chǎn)針對(duì)hiv-1的疫苗的多次失敗的主要原因。由許多實(shí)驗(yàn)性疫苗誘導(dǎo)的抗體不能結(jié)合和中和hiv-1病毒顆粒，因?yàn)閔iv-1病毒變異以避免被靶向抗體捕獲。廣泛中和抗體(bnab)，例如b12、447-52d、pgt128、vrc01、10e8，已在非人類(lèi)靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物的被動(dòng)免疫和攻擊研究中表現(xiàn)出保護(hù)作用。然而，到目前為止，由于這些區(qū)域的弱免疫原性，尚沒(méi)有能夠誘導(dǎo)針對(duì)高度保守的hiv-1病毒表位的廣泛中和抗體的疫苗。

此外，hiv-1的表面抗原，gp120，被大量的各種n-連接的聚糖覆蓋。這些宿主來(lái)源的碳水化合物結(jié)構(gòu)包含gp120的一半質(zhì)量并遮蔽了非常多的基礎(chǔ)蛋白表面，其在感染和免疫逃避中發(fā)揮重要的功能作用。已顯示出結(jié)合于gp120的宿主來(lái)源的碳水化合物的廣泛中和抗體如pg9、pg16、pgt128和2g12提供針對(duì)hiv感染的保護(hù)作用。這些結(jié)果提示，誘導(dǎo)結(jié)合gp120的碳水化合物的表位的廣泛中和抗體的疫苗可預(yù)防hiv感染。然而，尚無(wú)在體外合成這些呈現(xiàn)與體內(nèi)gp120的宿主來(lái)源的碳水化合物結(jié)構(gòu)類(lèi)似的構(gòu)型的宿主來(lái)源的多糖的有效方法。另外，宿主來(lái)源的多糖屬于t細(xì)胞非依賴(lài)性抗原，其顯示出弱免疫原性。因此，誘導(dǎo)對(duì)宿主來(lái)源的碳水化合物特異性的抗體是困難的。盡管到目前為止產(chǎn)生的各種類(lèi)型的疫苗—包括減毒疫苗、病毒樣顆粒、蛋白和肽—它們都不能防止高度突變的和高度糖基化的hiv-1感染。

肽基序免疫是一種在hiv動(dòng)物模型(包括小鼠、兔和恒河猴)中，能夠誘導(dǎo)針對(duì)hiv-1被膜蛋白的高度保守和功能性結(jié)構(gòu)域的廣泛中和抗體(bnab)的技術(shù)。雖然針對(duì)弱免疫原性表位的bnab在如在wo/2013/040564中描述的這些實(shí)施例和模型中被肽基序免疫誘導(dǎo)，但它不能引發(fā)針對(duì)宿主來(lái)源的碳水化合物的抗體，所述碳水化合物難以在體外合成以確保其構(gòu)型與在體內(nèi)修飾的天然狀態(tài)類(lèi)似。此外，肽抗原的半壽期遠(yuǎn)短于dna抗原且它不能誘導(dǎo)針對(duì)hiv-1感染的細(xì)胞免疫。盡管針對(duì)hiv的穩(wěn)健細(xì)胞免疫已由先前構(gòu)建的pd1-p24的質(zhì)粒誘導(dǎo)，但針對(duì)hiv-1的中和抗體則不能通過(guò)這樣的方法引發(fā)。到目前為止，尚無(wú)顯示出穩(wěn)健的細(xì)胞免疫的針對(duì)hiv-1的成功疫苗。大量的數(shù)據(jù)表明，bnab對(duì)于抑制hiv-1感染是重要的。因此，存在對(duì)誘導(dǎo)bnab并且還顯示出針對(duì)hiv-1的穩(wěn)健細(xì)胞免疫的hiv-1疫苗的持續(xù)需求。

3.概述

本公開(kāi)內(nèi)容的一個(gè)目的是提供用于引發(fā)針對(duì)hiv的免疫反應(yīng)的dna基序疫苗。更具體地說(shuō)，本申請(qǐng)?zhí)峁┯糜谡T導(dǎo)針對(duì)hiv的廣泛中和抗體(bnab)的dna基序疫苗和糖-dna基序疫苗。

根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，dna基序疫苗包含至少一種包含核酸序列的質(zhì)粒，所述核酸序列編碼在基序序列中心的第一多個(gè)氨基酸殘基，和在側(cè)接第一多個(gè)氨基酸殘基的區(qū)域中的第二和第三多個(gè)隨機(jī)氨基酸殘基，使得第一多個(gè)氨基酸殘基包括氨基酸序列g(shù)pg。

根據(jù)本發(fā)明的另一方面，dna基序疫苗可包含具有pvax載體骨架的質(zhì)粒。在至少一個(gè)方面，所述質(zhì)粒可選自pd1-p24-pvax、pd1-ova-pvax，和ctla4-p24-pvax。

根據(jù)另一方面，dna基序疫苗的質(zhì)粒可包括選自以下的引物：

fc正向5’(ggccccggcnnbnnbnnbnnbnnbnnbatcctgatgcagtacatcaagg)3’(seqidno:7)；

p24反向5’(vnnvnnvnnvnnvnnvnnctcgagcggcaaaactcttg)3’(seqidno:8)；和

ova反向5’(vnnvnnvnnvnnvnnvnnctcgagcggaggggaaaca)3’(seqidno:9)。

根據(jù)另一方面，在基序序列中心的第一多個(gè)氨基酸殘基的長(zhǎng)度范圍可為3至30個(gè)氨基酸殘基。

根據(jù)另一方面，隨機(jī)氨基酸殘基范圍可為5至50個(gè)氨基酸殘基，并由范圍從15至150個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的核苷酸片段編碼。

根據(jù)另一方面，可提供糖-dna基序疫苗，其中糖-dna基序疫苗包含選自160m01、160m02、160m03、295m01、332m01和332m02的質(zhì)粒，和質(zhì)粒包含編碼基序肽nxs/t的糖基化基序基因，其中糖-dna基序疫苗誘導(dǎo)對(duì)gp120特異性的抗體。

根據(jù)進(jìn)一步的方面，糖基化基序肽nxs/t可被修飾以在天冬酰胺(n)的氨基酸殘基上加入宿主來(lái)源的碳水化合物，用于促進(jìn)體內(nèi)肽表達(dá)。

根據(jù)另一方面，糖-dna基序疫苗可誘導(dǎo)針對(duì)糖原表位的抗體，以抑制病毒或細(xì)菌感染，包括hiv感染。

根據(jù)另一方面，糖-dna基序疫苗的質(zhì)粒可包含選自以下的引物：aactgctccttcaacatcaccaccnnbnnbnnbnnbnnbnnbatcctgatgcagtacatcaagg(seqidno:13)；

aacnnbtccnnbaacnnbaccaccnnbnnbnnbnnbnnbnnbatcctgatgcagtacatcaagg(seqidno:14)；

nnbnnbtccnnbaacnnbaccaccnnbnnbnnbnnbnnbnnbatcctgatgcagtacatcaagg(seqidno:15)；

atcaactgcacccgccccnnbnnbnnbnnbnnbnnbatcctgatgcagtacatcaagg(seqidno:16)；

gcccactgcaacatctccnnbnnbnnbnnbnnbnnbatcctgatgcagtacatcaagg(seqidno:17)；

gccnnbtgcaacnnbtccnnbnnbnnbnnbnnbnnbatcctgatgcagtacatcaagg(seqidno:18)；和

vnnvnnvnnvnnvnnvnnctcgagcggaggggaaaca(seqidno:19)。

根據(jù)另一方面，糖-dna基序疫苗包含質(zhì)粒160m01。根據(jù)進(jìn)一步的方面，質(zhì)粒160m01可通過(guò)在hivgp120中插入編碼n160的糖基化肽的基序基因構(gòu)建。

根據(jù)另一方面，糖-dna基序疫苗的質(zhì)粒是具有pvax骨架的pd1-p24質(zhì)粒。

根據(jù)另一方面，本發(fā)明提供抑制hiv-1感染的方法，其包括給予有需要的患者dna基序疫苗。根據(jù)進(jìn)一步的方面，所述方法包括給予具有質(zhì)粒160m01的dna基序疫苗。

根據(jù)另一方面，本發(fā)明提供一種在患者中誘導(dǎo)細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)的方法，其包括給予dna基序疫苗。

根據(jù)另一方面，本發(fā)明提供一種dna基序免疫的方法，其包括用dna基序疫苗免疫動(dòng)物模型或人類(lèi)受試者。

根據(jù)另一方面，本發(fā)明提供一種誘導(dǎo)針對(duì)hiv的廣泛中和抗體的藥劑盒，其中藥劑盒包含治療有效量的dna基序疫苗。根據(jù)進(jìn)一步的方面，藥劑盒的dna基序疫苗可包括選自seqidno:7、8和9的引物。

根據(jù)另一方面，本發(fā)明提供一種誘導(dǎo)針對(duì)hiv的廣泛中和抗體的藥劑盒，所述藥劑盒包含治療有效量的糖-dna基序疫苗。根據(jù)進(jìn)一步的方面，藥劑盒的糖-dna基序疫苗可包括選自seqidno:13、14、15、16、17、18和19的引物。

4.附圖簡(jiǎn)述

圖1a-c包括4個(gè)dna基序質(zhì)粒的表(圖1a)以及基序序列(gpg)的序列確認(rèn)(圖1b)。圖1a中所示的4個(gè)質(zhì)粒構(gòu)建體經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證。圖1a顯示4個(gè)dna基序質(zhì)粒(包括3個(gè)新的dna基序質(zhì)粒庫(kù))的每一個(gè)的組件，其在pvax質(zhì)粒的背景上建立，并且其全部含有插入的基因基序“gpg”。質(zhì)粒ppc被用作對(duì)照，因?yàn)樗狈Σ迦氲幕蚧?。在圖1b中，由在ppmc質(zhì)粒中插入的基因基序編碼的氨基酸序列經(jīng)測(cè)序確定并通過(guò)clustalw軟件比對(duì)。其在weblogo的格式中顯示。氨基酸殘基的高度表示不同的質(zhì)?？寺≈斜Ｊ氐谋嚷?較高的字母表示更大的保守)。x軸表示由插入的基因編碼的氨基酸殘基的位置。圖1c是來(lái)自基序庫(kù)的代表性質(zhì)粒(含有基序序列g(shù)pg)的氨基酸測(cè)序結(jié)果的表。

圖2顯示對(duì)于4個(gè)質(zhì)粒的熒光-活化細(xì)胞分選(facs)蛋白表達(dá)結(jié)果。對(duì)于facs分析，293t細(xì)胞用每個(gè)不同的質(zhì)粒瞬間轉(zhuǎn)染。mock轉(zhuǎn)染被用作無(wú)質(zhì)粒的陰性對(duì)照，而ppc是用作蛋白表達(dá)的陽(yáng)性對(duì)照的背景質(zhì)粒，如先前所表征的。ppmc、pomc和cpmc質(zhì)粒是目前構(gòu)建的dna基序疫苗質(zhì)粒，每個(gè)含有插入的編碼gpg氨基酸基序的基因基序。facs測(cè)定蛋白的表達(dá)。前5個(gè)圖是通過(guò)流式細(xì)胞儀檢查的斑點(diǎn)圖(dotspotdiagrams)，而最后的圖描述每個(gè)相應(yīng)的質(zhì)粒的直方圖，黑實(shí)線作為陰性對(duì)照。

圖3a-b是說(shuō)明從使用3個(gè)dna基序疫苗質(zhì)粒和對(duì)照質(zhì)粒作為免疫原生成抗血清的圖。圖3a顯示通過(guò)elisa檢測(cè)的針對(duì)hiv-1p24的抗血清的滴度。圖3b顯示在使用3個(gè)dna基序疫苗質(zhì)粒和對(duì)照質(zhì)粒用作免疫原生成的樣本上，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢查的與來(lái)自293t細(xì)胞上的不同亞型的hiv的gp160結(jié)合的抗血清。

圖4a-b顯示中和測(cè)定的結(jié)果，具體地說(shuō)是說(shuō)明中和不同亞型的hiv的抗血清特征的圖和表。在圖4a中，ppmc質(zhì)粒導(dǎo)致中和不同亞型的hiv的抗血清的產(chǎn)生(虛線是對(duì)照)。圖4b是列出針對(duì)hiv假病毒的不同抗血清的nd50的匯總表。在nd50下的深色陰影列代表超過(guò)40稀釋度的nd50，和4e10是熟知的用作陽(yáng)性對(duì)照的bnab。

圖5顯示dna基序疫苗誘導(dǎo)的p24-特異性四聚體-陽(yáng)性和長(zhǎng)期記憶cd8+t細(xì)胞反應(yīng)的流式細(xì)胞術(shù)數(shù)據(jù)。特別是，流式細(xì)胞術(shù)的圖顯示在最終免疫后2周，cd8+t細(xì)胞群的hiv-1p24-特異性h2-kd-amqmlkdti-pe四聚體染色，和數(shù)據(jù)被表示為最后的小圖中的柱形圖。

圖6a-b是顯示小鼠模型中dna基序引起的抗原特異性免疫的比較的圖。根據(jù)免疫計(jì)劃表，用100μgdnai.m/ep對(duì)balb/c小鼠進(jìn)行接種。在圖6a-b中，在分別使用特異性肽gaga-i和gag26刺激的balb/c脾細(xì)胞中，通過(guò)elispot測(cè)定法測(cè)定產(chǎn)生ifn-γ-的cd8+細(xì)胞(圖6a)和cd4+細(xì)胞(圖6b)。

圖7a-d顯示對(duì)糖-dna基序質(zhì)粒構(gòu)建體的序列分析和基序序列。在圖7a-c，將含有n160(圖7a)、n295(圖7b)或n332(圖7c)的糖基化結(jié)構(gòu)域的不同結(jié)構(gòu)域在得自hiv數(shù)據(jù)庫(kù)的hiv分離株的4633個(gè)序列中進(jìn)行比對(duì)。y軸代表保守的序列比率，和x軸描述通過(guò)用根據(jù)hxb2編號(hào)標(biāo)記的位置編號(hào)定位的氨基酸殘基。在圖7d中，表格是糖-dna基序構(gòu)建體的概要，其中的每一個(gè)將起著免疫不同的組的作用。所列出的基序序列是通過(guò)插入到pd1-p24質(zhì)粒中的基序基因編碼的序列，如對(duì)于本文根據(jù)一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案描述的ppmc質(zhì)粒。

圖8a-f顯示6個(gè)不同的糖-dna基序質(zhì)粒的序列比對(duì)，如通過(guò)測(cè)序所證實(shí)的。對(duì)每組糖-dna基序質(zhì)粒庫(kù)的超過(guò)60個(gè)克隆測(cè)序，并比對(duì)每個(gè)庫(kù)的測(cè)序結(jié)果。氨基酸殘基的高度代表存在于不同克隆中的殘基的保守百分率。

圖9顯示用指定的不同質(zhì)粒瞬間轉(zhuǎn)染293t細(xì)胞的facs數(shù)據(jù)。mock被用作無(wú)質(zhì)粒的陰性對(duì)照，和ppc是作為陽(yáng)性對(duì)照的背景質(zhì)粒。糖-dna基序質(zhì)粒160m01、160m02、160m03、295m01、332m01和332m02是新構(gòu)建的含有如圖8a-f中所示的不同糖基化基序的質(zhì)粒。

圖10a-b顯示中和測(cè)定的結(jié)果，特別是該圖顯示了針對(duì)不同亞型的hiv的抗血清滴度和中和作用的特征。在圖10a中，針對(duì)p24的抗血清的滴度通過(guò)elisa檢測(cè)。在圖10b中，通過(guò)使用針對(duì)不同亞型的hiv的假病毒中和作用來(lái)表征來(lái)自不同的糖-dna基序免疫的抗血清。陰性對(duì)照是來(lái)自pbs組的抗血清，和vrc01(一種熟知的中和抗體)被用作陽(yáng)性對(duì)照。mulv是由鼠白血病病毒被膜蛋白與pnl4-3骨架的gag-pol構(gòu)成的假病毒，其被用作陰性病毒。

圖11a-b是顯示抗血清結(jié)合gp120的膜印跡或凝膠。與gp120結(jié)合的抗血清通過(guò)蛋白質(zhì)印跡表征。對(duì)于兩種凝膠，泳道1、3、5和7顯示亞型iiib、ada、jr-fl和sf162的gp120蛋白。對(duì)于兩種凝膠，泳道2、4、6和8顯示相同的4個(gè)不同的亞型gp120，其中多糖通過(guò)endoh除去。圖11a顯示與160m01抗血清一起孵育的具有轉(zhuǎn)移gp120的膜。圖11b顯示與來(lái)自hiv陽(yáng)性病人的抗血清一起孵育的具有轉(zhuǎn)移gp120蛋白的膜。

圖12顯示用于構(gòu)建本文根據(jù)一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案描述的dna基序質(zhì)粒的pvax-1載體的關(guān)鍵特征和序列。

4.1定義

如本文所用的術(shù)語(yǔ)例如“a”、“an”或“one”一般指“至少一個(gè)”或“一個(gè)或多個(gè)”，除非另外指明。此外，術(shù)語(yǔ)“包含”意欲指“包括”，因而允許除了那些明確地?cái)⑹鲋獾钠渌M分、特征、條件或步驟的存在。

如本文所用的術(shù)語(yǔ)“抗體”一般包括單克隆和多克隆抗體。更具體地說(shuō)，術(shù)語(yǔ)“抗體”也可包括全長(zhǎng)單克隆抗體、多克隆抗體、多特異性抗體(如，雙特異性抗體)，和抗體片段，只要它們顯示出所需的生物學(xué)活性，即發(fā)揮如在下文的詳細(xì)描述中描述的功能即可。

術(shù)語(yǔ)“抗原”一般指被免疫系統(tǒng)的特異性識(shí)別組件(如，抗體、t-細(xì)胞)識(shí)別的物質(zhì)。

術(shù)語(yǔ)“廣泛中和作用”、“廣泛地中和”等，一般指可中和一種以上亞型的病毒的抗體(如，“廣泛中和抗體[bnab])或血清。

術(shù)語(yǔ)"dna基序疫苗"指包含dna分子的疫苗，所述dna分子具有編碼一種或多種針對(duì)特異性基序氨基酸殘基、蛋白、肽或多肽的基因的dna序列，其在疫苗接受者中產(chǎn)生編碼的基序氨基酸殘基、蛋白、肽或多肽以引發(fā)免疫反應(yīng)。

術(shù)語(yǔ)“表位”一般指被免疫系統(tǒng)，例如被抗體、b-細(xì)胞或t-細(xì)胞識(shí)別的抗原或免疫原中的區(qū)域。如本文所用的，“表位”通常指至少約3-5，優(yōu)選地約5-10或15，且不超過(guò)約1,000個(gè)氨基酸(或其間的任何整數(shù))的序列，其定義本身或作為較大序列的一部分來(lái)結(jié)合響應(yīng)這樣序列而生成的抗體或刺激細(xì)胞免疫反應(yīng)的序列。術(shù)語(yǔ)"表位"可涵蓋與天然序列相同的序列，以及對(duì)天然序列的修飾，例如缺失、添加和取代(通常在性質(zhì)上保守)。在某些實(shí)施方案中，用于本發(fā)明的抗原可僅包含單一表位，gpg。

“hiv”一般指人免疫缺陷病毒1(hiv-1)，除非另外指明。

術(shù)語(yǔ)“免疫原”一般指能夠在個(gè)體中誘導(dǎo)適應(yīng)性免疫反應(yīng)的物質(zhì)，其中所述適應(yīng)性免疫反應(yīng)靶向免疫原。關(guān)于當(dāng)前的應(yīng)用，免疫原將誘導(dǎo)與免疫原反應(yīng)的抗體。換言之，免疫原可以是能夠誘導(dǎo)免疫的抗原。

如本文所用的術(shù)語(yǔ)"核酸片段"和"核酸序列"被理解為任何核酸分子。該術(shù)語(yǔ)包括任何長(zhǎng)度的核酸分子，例如從10至10000個(gè)核苷酸，這取決于應(yīng)用。當(dāng)核酸分子用作藥物，例如在dna療法中，或用于生產(chǎn)根據(jù)本公開(kāi)內(nèi)容的多肽的方法時(shí)，優(yōu)選使用編碼至少一個(gè)表位的分子，其具有長(zhǎng)度約3-10、10-15、15-18、18-100、100-200、200-400、400-1000個(gè)核苷酸，所述分子任選插入載體中。

如本文所用的術(shù)語(yǔ)"多肽"應(yīng)具有其通常的意義。它是一個(gè)任何長(zhǎng)度的氨基酸鏈，包括全長(zhǎng)蛋白、寡肽、短肽及其片段，其中氨基酸殘基通過(guò)共價(jià)肽鍵連接。多肽可通過(guò)糖基化，通過(guò)脂化(例如通過(guò)如mowat等1991所述用棕櫚酰氧基琥珀酰亞胺或如由lustig等1976所述用十二碳酰氯經(jīng)化學(xué)脂化)，通過(guò)包含輔基，或通過(guò)包含額外的氨基酸例如his-標(biāo)簽或信號(hào)肽，經(jīng)化學(xué)修飾。因此，每個(gè)多肽可由特定的氨基酸表征，并由特定的核酸序列編碼。應(yīng)該理解，這樣的序列包括通過(guò)重組或合成方法產(chǎn)生的類(lèi)似物和變體，其中這樣的多肽序列已通過(guò)在重組多肽中取代、插入、添加或缺失一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基進(jìn)行修飾并且在本文所述的任何生物學(xué)測(cè)定中仍然是免疫原性的。取代優(yōu)選地是"保守的"。每個(gè)多肽被特定的核酸序列編碼。應(yīng)該理解，這樣的序列包括其類(lèi)似物和變體，其中這樣的核酸序列已通過(guò)取代、插入、添加或缺失一個(gè)或多個(gè)核酸進(jìn)行修飾。取代優(yōu)選地是在密碼子使用中的沉默取代，其不會(huì)導(dǎo)致氨基酸序列的任何改變，但可能被引入以增強(qiáng)蛋白的表達(dá)。

如本文所用的術(shù)語(yǔ)"治療性免疫"或"治療性免疫反應(yīng)"一般指針對(duì)傳染因子的免疫或引發(fā)免疫反應(yīng)，其改善或消除感染或減輕其至少一種癥狀。

術(shù)語(yǔ)“疫苗”一般指包含免疫原的組合物，并且其能夠誘導(dǎo)免疫反應(yīng)，所述免疫反應(yīng)能夠減少發(fā)展病理狀態(tài)的風(fēng)險(xiǎn)或者能夠誘導(dǎo)治療有效的免疫反應(yīng)，后者可有助于病理狀態(tài)的治愈(或至少減輕其癥狀)。

5.詳細(xì)描述

有兩個(gè)主要的理由導(dǎo)致預(yù)防性aids疫苗失敗。一個(gè)是hiv-1的被膜蛋白是高度突變的。另一個(gè)是hiv-1顆粒被多糖嚴(yán)重覆蓋。

本申請(qǐng)涉及一個(gè)新的疫苗策略，dna基序免疫，其可生成針對(duì)保守的結(jié)構(gòu)域并且也針對(duì)經(jīng)體內(nèi)修飾以引發(fā)抗體的多糖表位的抗體。作為對(duì)于dna基序免疫的概念驗(yàn)證(poc)，一個(gè)dna基序質(zhì)粒庫(kù)(稱(chēng)為ppmc)通過(guò)引入側(cè)接固定的靶定表位兩側(cè)的隨機(jī)核苷酸構(gòu)建。這種固定的靶定表位可編碼范圍5-50個(gè)氨基酸殘基的長(zhǎng)度的氨基酸片段。這種dna基序質(zhì)粒庫(kù)(ppmc)，當(dāng)用作免疫原以接種小鼠時(shí)，誘導(dǎo)100%中和測(cè)試的各種亞型的hiv-1株(在v3區(qū)含有g(shù)pg基序)的gpg-特異性抗體。另外，構(gòu)建含有糖基化基序(如，nxs/t)的6組dna基序庫(kù)(本文稱(chēng)為糖-dna基序)。特別是，160m01糖-dna基序質(zhì)粒疫苗誘導(dǎo)對(duì)gp120的多糖特異性的抗體。

本申請(qǐng)的一個(gè)目的是構(gòu)建一種新的形式的dna疫苗，稱(chēng)為dna基序疫苗。為此，一系列引物庫(kù)被合成以將基序基因引入pvax骨架載體的骨架中。測(cè)序結(jié)果和facs數(shù)據(jù)表明，肽基序構(gòu)建可通過(guò)這些方法，使用本文描述的引物組合，在dna基序質(zhì)粒中復(fù)制(圖1a-b和圖2)。此外，含有糖基化編碼基因的糖-dna基序質(zhì)粒也被構(gòu)建并通過(guò)相同的策略證實(shí)(圖7a-d)。因此，在此創(chuàng)立了引發(fā)所需免疫反應(yīng)的兩種新的技術(shù)，一種利用常規(guī)dna基序疫苗的形式，而另一種使用糖-dna基序。

因此，本申請(qǐng)的另一個(gè)目的是提供一種用于dna基序疫苗的免疫原設(shè)計(jì)的新方法，所述疫苗能夠引起針對(duì)病毒感染(例如，hiv感染)的治療意義的抗體。dna基序免疫的概念驗(yàn)證首次得以實(shí)現(xiàn)。特別是，本文表明ppmc，dna基序質(zhì)粒之一，可誘導(dǎo)針對(duì)含有g(shù)pg表位的天然蛋白的高滴度抗體(圖2)。另外，進(jìn)行了一組hiv假病毒中和實(shí)驗(yàn)，這表明由ppmc誘導(dǎo)的抗血清可中和各種亞型的hiv感染，所述hiv含有在v3環(huán)頂端的gpg表位。

本申請(qǐng)的再另一個(gè)目的是提供能夠誘導(dǎo)穩(wěn)健的細(xì)胞免疫的dna基序疫苗。在dna基序免疫后，提取pbmc和脾細(xì)胞以測(cè)試細(xì)胞免疫的功效。該數(shù)據(jù)顯示，ppmc組誘導(dǎo)對(duì)cd8表位有特異性的高百分比的陽(yáng)性t細(xì)胞(圖5)，并在加入cd4和cd8表位肽后引起細(xì)胞分泌ifn-γ(圖6)。這些數(shù)據(jù)說(shuō)明本文描述的dna基序疫苗可誘導(dǎo)穩(wěn)健的細(xì)胞免疫。

本申請(qǐng)的更進(jìn)一步的目的是提供能夠誘導(dǎo)對(duì)不同的蛋白(例如hiv的gp120)上的宿主來(lái)源的碳水化合物有特異性的抗體的糖-dna基序疫苗。在用160m01質(zhì)粒進(jìn)行糖-dna基序免疫后，通過(guò)蛋白質(zhì)印跡法，測(cè)試抗血清對(duì)gp120的不同亞型和gp120的結(jié)合。結(jié)果表明，由160m01誘導(dǎo)的抗血清可特異性地結(jié)合天然gp120，而不是無(wú)糖原的gp20，表明這樣的抗血清特異性地結(jié)合gp120上的宿主來(lái)源的碳水化合物?？傊?，糖-dna基序可誘導(dǎo)對(duì)宿主來(lái)源的碳水化合物有特異性的抗體。

本申請(qǐng)的進(jìn)一步的目的是提供dna基序疫苗，其能夠在罹患病毒感染的患者中引起產(chǎn)生針對(duì)保守的結(jié)構(gòu)域或宿主來(lái)源的碳水化合物表位的治療有效的抗體和穩(wěn)健的細(xì)胞免疫。在本文測(cè)試的質(zhì)粒中構(gòu)建的dna基序可在動(dòng)物模型中誘導(dǎo)針對(duì)hiv被膜蛋白的保守結(jié)構(gòu)域和糖原的廣泛中和抗體和穩(wěn)健的細(xì)胞免疫。

肽基序免疫，如在wo2013/040564中所述，引起對(duì)不同亞型的hiv-1的nju009中和抗體；而肽免疫的缺點(diǎn)包括呈現(xiàn)出與蛋白免疫和dna免疫對(duì)比的較短的半壽期，其中dna免疫呈現(xiàn)出最長(zhǎng)的半壽期。另外，與肽免疫比較，dna免疫可引起穩(wěn)健的細(xì)胞免疫。此外，在dna免疫期間，dna質(zhì)?？稍诩〖?xì)胞中轉(zhuǎn)染以表達(dá)并用多糖修飾，如果它在體內(nèi)含有糖基化基序的話。目前的結(jié)果建立用于可提高免疫力的dna免疫的pd1靶向dc細(xì)胞的平臺(tái)(pd1-p24、ppc)，同時(shí)引起針對(duì)hiv-1感染的細(xì)胞免疫，而不誘導(dǎo)針對(duì)hiv-1的bnab。最后，如本文描述的進(jìn)一步的結(jié)果說(shuō)明組合pd1靶向dc細(xì)胞的肽基序和dna免疫，以構(gòu)建dna基序免疫的優(yōu)點(diǎn)。

在此，合成一系列引物庫(kù)。在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，基序基因被引入pd1-p24載體的骨架。測(cè)序結(jié)果和facs數(shù)據(jù)表明，通過(guò)目前的引入本文所述的基序基因/引物庫(kù)的方法，肽基序構(gòu)建可在dna基序質(zhì)粒中復(fù)制。dna基序免疫的概念驗(yàn)證被首次顯示，證明ppmc也可誘導(dǎo)對(duì)gpg表位特異性的bnab和穩(wěn)健的細(xì)胞免疫。此外，這種方法被用來(lái)構(gòu)建糖-dna基序，例如160m01，以誘導(dǎo)對(duì)多糖表位的天然構(gòu)型特異性的抗體。hiv顆粒被多糖嚴(yán)重遮蔽，因而對(duì)開(kāi)發(fā)靶向多糖的中和抗體有著迫切的需求。對(duì)于常規(guī)抗原，像蛋白質(zhì)，當(dāng)用注射蛋白免疫動(dòng)物或人類(lèi)時(shí)，誘導(dǎo)抗體是容易的。然而，由于多糖屬于t-細(xì)胞非依賴(lài)性抗原并遭受免疫抑制，其免疫原性比常規(guī)蛋白抗原(如，t-細(xì)胞依賴(lài)性抗原)更弱。此外，在體外合成的多糖要確保其構(gòu)型與其體內(nèi)構(gòu)型一致是很難的。為此，尚無(wú)有效的方法引起對(duì)多糖表位的天然構(gòu)型有特異性的抗體。因此，引入一種新方法，糖-dna基序，以引起針對(duì)多糖的天然構(gòu)型的抗體，是重要的。因此，誘導(dǎo)針對(duì)多糖的抗體的緊急疫苗是必要的。發(fā)明人的糖-dna基序免疫可誘導(dǎo)對(duì)多糖表位的天然構(gòu)型有特異性的抗體。此外，發(fā)明人的糖-dna基序?qū)τ谝呙缭O(shè)計(jì)和對(duì)于引入針對(duì)多糖的抗體是一個(gè)重大的進(jìn)步。

在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，本申請(qǐng)?zhí)峁讉€(gè)超過(guò)現(xiàn)有技術(shù)的進(jìn)步。首先，發(fā)明人引入了一種新的形式的基序抗原，dna基序，其可復(fù)制具有較長(zhǎng)半壽期的肽基序的結(jié)果。其次，dna基序不僅可引起穩(wěn)健的細(xì)胞免疫，而且還引起針對(duì)hiv的bnab。第三，糖-dna基序，另一類(lèi)含有糖基化基序位點(diǎn)的dna基序，可用肌細(xì)胞中的多糖修飾，然后具有天然多糖構(gòu)型的多糖表位可提呈給免疫系統(tǒng)，以誘導(dǎo)對(duì)多糖特異性的抗體。第四，dna基序是一個(gè)作為hiv疫苗的候選物。相信dna基序免疫將在疫苗設(shè)計(jì)的領(lǐng)域宣告了引入針對(duì)具有天然構(gòu)型的弱免疫原性表位和多糖表位的抗體的新的策略。

如本文所公開(kāi)的，本申請(qǐng)的實(shí)施方案包括dna基序疫苗，其包含至少一種質(zhì)粒，其中所述質(zhì)粒包含編碼至少氨基酸序列g(shù)pg的基序基因。在一或多項(xiàng)實(shí)施中，所述質(zhì)粒誘導(dǎo)針對(duì)hiv的廣泛中和抗體(bnab)。在某些實(shí)施方案中，所述質(zhì)粒具有pvax載體骨架。此外，在至少一個(gè)實(shí)施方案中，基序基因被包含在選自pd1-p24-pvax、pd1-ova-pvax和ctla4-p24-pvax的質(zhì)粒內(nèi)。

在某些實(shí)施方案中，p24和ova可在體內(nèi)表達(dá)以提供載體蛋白引入對(duì)基序表位有特異性的抗體的功能。另外，在某些實(shí)施方案中，pd1和/或ctla4通過(guò)靶向樹(shù)突細(xì)胞增強(qiáng)基序表位的免疫反應(yīng)。

在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，所述質(zhì)?？砂x自以下的引物：

fc正向5’(ggccccggcnnbnnbnnbnnbnnbnnbatcctgatgcagtacatcaagg)3’(seqidno:7)；

p24反向5’(vnnvnnvnnvnnvnnvnnctcgagcggcaaaactcttg)3’(seqidno:8)；和

ova反向5’(vnnvnnvnnvnnvnnvnnctcgagcggaggggaaaca)3’(seqidno:9)。

在某些實(shí)施方案中，基序基因可編碼許多能夠被抗體結(jié)合的表位的固定氨基酸殘基。此外，在至少一個(gè)實(shí)施方案中，基序基因可編碼在基序序列中心包含第一多個(gè)固定的氨基酸殘基的基序肽，和在側(cè)接第一多個(gè)固定的氨基酸殘基的區(qū)域中的第二和第三多個(gè)隨機(jī)氨基酸殘基。

在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，固定的氨基酸殘基的長(zhǎng)度范圍為在基序序列的中心的從3至30個(gè)氨基酸殘基。在某些實(shí)施方案中，在基序序列中心的固定的氨基酸殘基的長(zhǎng)度是3-5個(gè)氨基酸殘基、5-8個(gè)氨基酸殘基、8-10個(gè)氨基酸殘基、10-12個(gè)氨基酸殘基、12-15個(gè)氨基酸殘基、15-18個(gè)氨基酸殘基、18-20個(gè)氨基酸殘基、20-25個(gè)氨基酸殘基，或25-30個(gè)氨基酸殘基。在一些實(shí)施方案中，在基序序列中心的固定的氨基酸殘基的長(zhǎng)度是5-30個(gè)氨基酸殘基、8-30個(gè)氨基酸殘基、10-30個(gè)氨基酸殘基、12-30個(gè)氨基酸殘基、15-30個(gè)氨基酸殘基、18-30個(gè)氨基酸殘基，或20-30個(gè)氨基酸殘基。

在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，隨機(jī)氨基酸殘基的范圍是5-50個(gè)氨基酸殘基并由范圍在從15至150個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的核苷酸片段編碼。在某些實(shí)施方案中，隨機(jī)氨基酸殘基由具有15-20個(gè)核苷酸、20-30個(gè)核苷酸、30-40核苷酸、40-50個(gè)核苷酸、50-60個(gè)核苷酸、60-70個(gè)核苷酸、70-80個(gè)核苷酸、80-90個(gè)核苷酸、90-100個(gè)核苷酸、100-110個(gè)核苷酸、110-120個(gè)核苷酸、120-130個(gè)核苷酸、130-140個(gè)核苷酸，或140-150個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的核苷酸片段編碼。在一些實(shí)施方案中，隨機(jī)氨基酸殘基由20-150個(gè)核苷酸、30-150個(gè)核苷酸、40-150個(gè)核苷酸、50-150個(gè)核苷酸、60-150個(gè)核苷酸、70-150個(gè)核苷酸、80-150個(gè)核苷酸、90-150個(gè)核苷酸、100-150個(gè)核苷酸、110-150個(gè)核苷酸、120-150個(gè)核苷酸，或130-150個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的核苷酸片段編碼。

術(shù)語(yǔ)"序列同一性"表示兩個(gè)等長(zhǎng)氨基酸序列之間或兩個(gè)等長(zhǎng)核苷酸序列之間的同源性程度的定量量度。要比較的兩個(gè)序列必須對(duì)齊至最可能的配合，允許插入缺口或作為選擇，在蛋白序列的兩端截短?；蛘撸蛄型恍钥赏ㄟ^(guò)blast程序如blastp程序(pearson,1988)計(jì)算。在某些實(shí)施方案中，比對(duì)如由thompsonjd等1994所述，用具有默認(rèn)參數(shù)的序列比對(duì)方法clustalw進(jìn)行。序列同一性的最小百分比是至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少99.5%和至少99.9%。

在某些實(shí)施方案中，dna編碼為多肽的基序。本文描述的多肽包含多肽的免疫原性部分，例如對(duì)于b-細(xì)胞或t-細(xì)胞的表位。多肽的免疫原性部分是一部分多肽，其在動(dòng)物或人類(lèi)中，和/或在通過(guò)本文描述的任何生物學(xué)測(cè)定法測(cè)定的生物樣本中引起免疫反應(yīng)。多肽的免疫原性部分可以是t-細(xì)胞表位或b-細(xì)胞表位。免疫原性部分可與多肽的一個(gè)或幾個(gè)相對(duì)小的部分相關(guān)，它們可被分散在整個(gè)多肽序列或位于多肽的特定部分。在某些實(shí)施方案中，肽具有從多肽衍生的例如8-11個(gè)氨基酸殘基的長(zhǎng)度。在某些實(shí)施方案中，多肽具有至少7個(gè)氨基酸殘基，例如至少8、至少9、至少10、至少12、至少14、至少16、至少18、至少20、至少22、至少24和至少30個(gè)氨基酸殘基的長(zhǎng)度。在某些實(shí)施方案中，多肽具有最多50、40、35、30、25和20個(gè)氨基酸殘基。在某些實(shí)施方案中，多肽是18，例如17、16、15、14、13、12和甚至11個(gè)氨基酸殘基。在某些實(shí)施方案中，多肽是7-12個(gè)氨基酸殘基。在某些實(shí)施方案中，多肽是11、10、9、8、7、6、5、4、3個(gè)氨基酸殘基。

本文公開(kāi)的多肽的共同特征是它們誘導(dǎo)如在實(shí)施例中說(shuō)明的免疫學(xué)反應(yīng)的能力。要理解本文描述的通過(guò)取代、插入、添加或缺失產(chǎn)生的多肽的變體也可以是免疫原性的，如通過(guò)本文描述的任何測(cè)定法測(cè)定的。

在還有的另外的實(shí)施方案中，基序基因可包含編碼基序肽nxs/t的糖基化基序基因。在至少一個(gè)實(shí)施方案中，糖基化基序肽nxs/t任選地經(jīng)修飾以在天冬酰胺(n)的氨基酸殘基上添加宿主來(lái)源的碳水化合物，用于促進(jìn)體內(nèi)肽表達(dá)。

在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，dna基序疫苗(糖-dna基序疫苗)可誘導(dǎo)對(duì)宿主來(lái)源的碳水化合物特異性的抗體。在還有的另外的實(shí)施方案中，dna基序疫苗能夠誘導(dǎo)針對(duì)糖原表位的抗體，以抑制病毒或細(xì)菌感染，包括hiv感染。

在某些實(shí)施方案中，糖基化基序基因被插入pd1-p24-pvax質(zhì)粒內(nèi)。在至少一個(gè)實(shí)施方案中，糖-dna基序疫苗包含一個(gè)或多個(gè)選自160m01、160m02、160m03、295m01、332m01和332m02的質(zhì)粒。

在某些實(shí)施方案中，所述質(zhì)粒包括選自以下的引物：

aactgctccttcaacatcaccaccnnbnnbnnbnnbnnbnnbatcctgatgcagtacatcaagg(seqidno:13)；

aacnnbtccnnbaacnnbaccaccnnbnnbnnbnnbnnbnnbatcctgatgcagtacatcaagg(seqidno:14)；

nnbnnbtccnnbaacnnbaccaccnnbnnbnnbnnbnnbnnbatcctgatgcagtacatcaagg(seqidno:15)；

atcaactgcacccgccccnnbnnbnnbnnbnnbnnbatcctgatgcagtacatcaagg(seqidno:16)；

gcccactgcaacatctccnnbnnbnnbnnbnnbnnbatcctgatgcagtacatcaagg(seqidno:17)；

gccnnbtgcaacnnbtccnnbnnbnnbnnbnnbnnbatcctgatgcagtacatcaagg(seqidno:18)；和

vnnvnnvnnvnnvnnvnnctcgagcggaggggaaaca(seqidno:19)。

在至少一個(gè)實(shí)施方案中，糖-dna基序疫苗包含質(zhì)粒160m01。在某些實(shí)施方案中，質(zhì)粒160m01可通過(guò)在hivgp120中插入編碼n160的糖基化肽的基序基因構(gòu)建。在還有的另外的實(shí)施方案中，dna基序疫苗可誘導(dǎo)對(duì)gp120的糖原特異性的抗體。

本申請(qǐng)的實(shí)施方案可另外包括一種抑制hiv-1感染的方法，其包括給予有需要的患者一或多種本文描述的dna基序質(zhì)粒疫苗或糖基化基序基因(糖-dna)質(zhì)粒疫苗。

在還有的另外的實(shí)施方案中，糖-dna基序疫苗還可包含至少一種選自xxxxxncsfnittxxxx(seqidno:1)、xxxxxnxsxnxttxxxx(seqidno:2)、xxxxxxxsxnxttxxxx(seqidno:3)、xxxxxinctrpxxxxx(seqidno:4)、xxxxxahcnisxxxxx(seqidno:5)，和xxxxxaxcnxsxxxxx(seqidno:6)的基序肽。

本申請(qǐng)的實(shí)施方案還可包括一種在患者中誘導(dǎo)細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)的方法，其包括將一種或多種dna基序疫苗單獨(dú)，或與本文描述的一種或多種糖基化基序基因質(zhì)粒疫苗組合給予有需要的患者。

本申請(qǐng)的實(shí)施方案還可包括一種dna基序免疫的方法，其包括用一種或多種dna基序疫苗單獨(dú)，或與本文描述的一種或多種糖基化基序基因質(zhì)粒疫苗組合免疫動(dòng)物模型或人類(lèi)受試者。

本申請(qǐng)的至少一個(gè)實(shí)施方案包括用于生成包含本文描述的引物的任何組合的質(zhì)粒庫(kù)，以制備本文所述的dna基序疫苗質(zhì)粒的方法。

5.1抗體和疫苗

在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，本申請(qǐng)?zhí)峁┙Y(jié)合于hiv-1gp120的抗體，如上所述的。術(shù)語(yǔ)“抗體”以其最廣泛的意義使用并尤其包括單克隆抗體(包括全長(zhǎng)單克隆抗體)、多克隆抗體、多特異性抗體(如，雙特異性抗體)，和抗體片段，只要它們呈現(xiàn)出所需的生物學(xué)活性即可。

如本文所用的術(shù)語(yǔ)“單克隆抗體”指從基本上同源的抗體群獲得的抗體，即組成群體的單個(gè)抗體是相同的，除了可能的突變外，如可以小數(shù)量存在的天然發(fā)生的突變。因此，修飾語(yǔ)“單克隆”表示抗體不是離散抗體的混合物的特征。在某些實(shí)施方案中，這樣的單克隆抗體通常包括含有結(jié)合靶的多肽序列的抗體，其中靶-結(jié)合多肽序列通過(guò)包括從多個(gè)多肽序列選擇單一的靶結(jié)合多肽序列的方法獲得。例如，選擇方法可以是從多個(gè)克隆，例如雜交瘤克隆、噬菌體克隆，或重組dna克隆的庫(kù)中選擇獨(dú)特的克隆。應(yīng)該理解，選擇的靶結(jié)合序列可被進(jìn)一步修改，例如，以改進(jìn)對(duì)靶的親和力，使靶結(jié)合序列人源化，改進(jìn)其在細(xì)胞培養(yǎng)中的生產(chǎn)，減少其在體內(nèi)的免疫原性，創(chuàng)建多特異性抗體等，并且包含改變的靶結(jié)合序列的抗體也是如本文所述的單克隆抗體。與多克隆抗體制劑(其通常包括針對(duì)不同的決定簇(表位)的不同的抗體)形成對(duì)比，單克隆抗體制劑的每個(gè)單克隆抗體針對(duì)抗原上的單一決定簇。除了它們的特異性外，單克隆抗體制劑的優(yōu)勢(shì)之處可在于它們通常不被其它免疫球蛋白污染。

修飾語(yǔ)“單克隆”表示從基本上同源的抗體群獲得的抗體的特征，并且不視為需要通過(guò)任何特定方法生產(chǎn)抗體。例如，根據(jù)本申請(qǐng)所用的單克隆抗體可通過(guò)各種技術(shù)制備，包括，但不限于，重組dna方法、噬菌體-展示技術(shù)，和雜交瘤方法。

本文的單克隆抗體特別地包括“嵌合”抗體，其中一部分重鏈和/或輕鏈?zhǔn)桥c從特定物種衍生或?qū)儆谔囟贵w類(lèi)或亞類(lèi)的抗體的對(duì)應(yīng)序列相同或同源的，而鏈的其余部分是與從另一個(gè)物種衍生或?qū)儆诹硪粋€(gè)抗體類(lèi)或亞類(lèi)的抗體以及這樣的抗體的片段的對(duì)應(yīng)序列相同或同源的，只要它們顯示出所需的生物學(xué)活性。

“人抗體”是具有對(duì)應(yīng)于由人產(chǎn)生的和/或使用如本文公開(kāi)的、用于制備人抗體的任何技術(shù)已經(jīng)制得的抗體的氨基酸序列的抗體。人抗體可使用本領(lǐng)域已知的各種技術(shù)制備，包括噬菌體-展示庫(kù)。人抗體也可通過(guò)給予抗原至已經(jīng)修飾以響應(yīng)抗原性攻擊而產(chǎn)生這樣的抗體，但其內(nèi)源的基因座已喪失能力的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物來(lái)制備。

疫苗是建立或改進(jìn)對(duì)特定疾病的免疫的生物學(xué)制劑。疫苗可以是預(yù)防性的(如預(yù)防或改善由任何天然的或"野生的"病原體未來(lái)感染的效果)，暴露后(如防止?jié)摲愿腥镜珱](méi)有臨床癥狀的個(gè)體的重新激活)或治療性的(如用來(lái)治療活動(dòng)性疾病的疫苗，其單獨(dú)或結(jié)合抗生素治療以縮短治療)。

可使用編碼本文描述的基序的核酸片段來(lái)實(shí)現(xiàn)抗原體內(nèi)表達(dá)，即核酸片段可被用于所謂的“dna基序疫苗”。因此，一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案也可涉及一種包含核酸片段的暴露后疫苗，所述疫苗通過(guò)已給予疫苗的動(dòng)物，包括人類(lèi)，實(shí)現(xiàn)抗原的體內(nèi)表達(dá)，表達(dá)的抗原的量有效提供動(dòng)物，包括人類(lèi)的感染的治療。

dna基序疫苗可引起細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)和抗體反應(yīng)二者。因此，dna基序疫苗代表一種對(duì)其它接種模式的有吸引力的替代選擇。

5.2組合物和制劑

本申請(qǐng)的疫苗和/或抗體可被配制為一種藥物形式，優(yōu)選地與藥學(xué)上可接受的載體組合。適合于注射使用的藥物形式包括無(wú)菌水性溶液或分散液和用于無(wú)菌注射溶液或分散液的臨時(shí)制備的無(wú)菌粉末。在注射使用的所有情況下，所述形式必須是無(wú)菌的且必須是存在可注射性的程度的流體。它在生產(chǎn)和貯存條件下必須是穩(wěn)定的且必須防止微生物，例如細(xì)菌和真菌的污染。載體可以是溶劑或分散介質(zhì)，其含有例如，水、乙醇、多元醇(如，甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等)，其合適的混合物，和/或植物油。適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)性可例如通過(guò)使用包衣(例如卵磷脂)，在分散劑的情況下通過(guò)維持所需粒徑，和通過(guò)使用表面活性劑維持。微生物污染的預(yù)防可用各種抗菌劑和抗真菌劑，例如，對(duì)羥基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等進(jìn)行。在某些實(shí)施方案中，優(yōu)選的是包括等滲劑，例如，糖或氯化鈉。注射組合物的延長(zhǎng)吸收可通過(guò)使用延遲吸收的試劑的組合物，例如，單硬脂酸鋁和明膠產(chǎn)生。

在某些實(shí)施方案中，根據(jù)本公開(kāi)內(nèi)容的組合物包含為表達(dá)基序蛋白(或蛋白類(lèi))或肽(或多肽)的質(zhì)粒的免疫原性遞送系統(tǒng)。

為了以水性溶液胃腸外給予，例如，如果必要時(shí)，溶液應(yīng)適當(dāng)?shù)乇痪彌_，而液體稀釋液首先用足夠的鹽水或葡萄糖使呈現(xiàn)為等滲的。這些特定水性溶液可特別適合于靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、腫瘤內(nèi)和腹腔內(nèi)給予。在這一點(diǎn)上，依據(jù)本申請(qǐng)，可以使用的無(wú)菌水性介質(zhì)是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的。例如，一個(gè)劑量可溶于1ml等滲nacl溶液，并且加入到1000ml皮下輸液液體，或者在提議的輸注部位注射。劑量的一些變化將必然會(huì)發(fā)生，這取決于要治療的受試者的病癥。負(fù)責(zé)給藥的人將在任何情況下，確定用于個(gè)體受試者的適當(dāng)劑量。此外，對(duì)于給予人，制劑應(yīng)滿足如fda生物制品辦公室(fdaofficeofbiologics)標(biāo)準(zhǔn)所要求的無(wú)菌、產(chǎn)熱原性，和總體安全性和純度標(biāo)準(zhǔn)。

無(wú)菌注射溶液可在需要時(shí)通過(guò)將所需量的活性化合物摻入含有上面列舉的各種其它成分的適當(dāng)?shù)娜軇┲?，接著?jīng)過(guò)濾滅菌來(lái)制備。一般來(lái)說(shuō)，分散液可通過(guò)將各種無(wú)菌活性成分摻入含有基礎(chǔ)分散介質(zhì)和來(lái)自上面列舉的那些的所需其它成分的無(wú)菌媒介中制備。在制備無(wú)菌注射溶液的無(wú)菌粉末的情況下，優(yōu)選的制劑方法包括從其先前的無(wú)菌-過(guò)濾溶液產(chǎn)生活性成分加任何另外的所需成分的粉末的真空-干燥和冷凍-干燥技術(shù)。

本文公開(kāi)內(nèi)容的組合物可以中性或鹽形式配制。藥學(xué)上可接受的鹽包括酸加成鹽，且其可用無(wú)機(jī)酸例如，如鹽酸或磷酸，或這樣的有機(jī)酸如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等形成。用游離羧基形成的鹽也可從無(wú)機(jī)堿例如，鈉、鉀、銨、鈣或鐵氫氧化物，和這樣的有機(jī)堿如異丙胺、三甲胺、組氨酸、普魯卡因等衍生。在配制時(shí)，溶液應(yīng)以與劑量制劑適配的方式和以治療有效的量給予。制劑可以各種劑型如注射溶液、藥物釋放膠囊等給予。

如本文所用的，“載體”包括，但不限于，溶劑、分散介質(zhì)、溶媒、包衣、稀釋劑、抗菌劑和抗真菌劑、等滲和吸收延遲劑、緩沖劑、載體溶液、助懸劑、膠體、脂質(zhì)體和病毒顆粒。用于藥用活性物質(zhì)的這樣的介質(zhì)和試劑的使用是本領(lǐng)域熟知的。除了在任何常規(guī)介質(zhì)或試劑與活性成分適配的情況下，還包括其在治療性組合物中的應(yīng)用。補(bǔ)充活性成分也可摻入組合物中。

短語(yǔ)“藥學(xué)上可接受的”或“藥理學(xué)上可接受的”指當(dāng)給予人時(shí)，不產(chǎn)生過(guò)敏或類(lèi)似的不利反應(yīng)的分子實(shí)體和組合物。含有作為活性成分的蛋白的水性組合物的制備是本領(lǐng)域完全理解的。通常，這樣的組合物可制備為注射劑，作為液體溶液或者混懸液。在注射前適合于在液體中的溶液或混懸液的固體形式也可制備。

疫苗組合物還可含有提高疫苗的保護(hù)功效的試劑，例如佐劑。佐劑包括用以增加對(duì)肽抗原的保護(hù)免疫反應(yīng)，從而減少疫苗中所必需的抗原的量，和/或產(chǎn)生保護(hù)免疫反應(yīng)所必需的給藥頻率的任何一種或多種化合物。佐劑可包括例如，乳化劑；胞壁酰二肽；吡啶；水性佐劑如氫氧化鋁；含氧金屬鹽；基于殼聚糖的佐劑，和本領(lǐng)域已知的任何各種皂苷、油和其它物質(zhì)，例如ampfaigen、lps、細(xì)菌細(xì)胞壁提取物、細(xì)菌dna、cpg序列、合成寡核苷酸及其組合，草分枝桿菌(mycohacterialplilei)(phlei)細(xì)胞壁提取物(cwe)、草分枝桿菌(m.phlei)dna(m-da)，和m-dna-草分枝桿菌(mphlei)細(xì)胞壁復(fù)合物(mcc)、不耐熱腸毒素(lt)、霍亂毒素(ct)，和霍亂毒素b亞單位(ctb)?？捎米魅榛瘎┑幕衔锇ㄌ烊坏暮秃铣扇榛瘎?，以及陰離子、陽(yáng)離子和非離子化合物。含氧金屬鹽包括al、k、ca、mg、zn、ba、na、li、b、be、fe、si、co、cu、ni、ag、au，和cr的鹽，所述鹽為磷酸鹽、氫氧化物、磷酸鹽、硝酸鹽、碘酸鹽、溴酸鹽、碳酸鹽、水合物、乙酸鹽、檸檬酸鹽、草酸鹽，和酒石酸鹽，及其混合的形式，包括氫氧化鋁、磷酸鋁、硫酸鋁、硫酸鋁鉀、磷酸鈣、maalox(氫氧化鋁和氫氧化鎂的混合物)、氫氧化鈹、氫氧化鋅、碳酸鋅、氯化鋅，和硫酸鋇。在合成化合物中，陰離子乳化劑可包括，例如，月桂酸和油酸的鉀、鈉和銨鹽，脂肪酸的鈣、鎂和鋁鹽，和有機(jī)磺酸鹽如十二烷基硫酸鈉。合成陽(yáng)離子劑包括，例如，十六烷基三乙基溴化銨，而合成非離子劑由甘油酯(如，單硬脂酸甘油酯)、聚氧乙烯乙二醇酯和醚，和脫水山梨醇脂肪酸酯(如，脫水山梨醇單棕櫚酸酯)及其聚氧乙烯衍生物(如，聚氧乙烯脫水山梨醇單棕櫚酸酯)舉例說(shuō)明。天然的乳化劑包括阿拉伯膠、明膠、卵磷脂和膽固醇。

其它合適的佐劑可用油成分，例如單一油、油的混合物、油包水乳液，或水包油乳液形成。油可以是礦物油、植物油，或動(dòng)物油。礦物油是通過(guò)蒸餾技術(shù)從礦脂獲得的液體烴，并且在本領(lǐng)域也稱(chēng)為液體石蠟、液體礦脂，或白礦物油。合適的動(dòng)物油包括，例如，魚(yú)肝油、大比目魚(yú)油、鯡魚(yú)油、大西洋胄胸鯛油(orangeroughyoil)和鯊魚(yú)肝油，前全部可經(jīng)商業(yè)獲得。合適的植物油，包括，例如，菜籽油、杏仁油、棉籽油、玉米油、橄欖油、花生油、紅花油、芝麻油、大豆油等。弗氏完全佐劑(fca)和弗氏不完全佐劑(fia)是兩種通常用于疫苗制劑的普通佐劑，并且也適用于根據(jù)本申請(qǐng)的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案。fca和fia二者是礦物油包水乳液；然而，fca也含有殺滅的分枝桿菌(mycobacteriumsp)。粘膜疫苗的佐劑可以包括半乳糖基神經(jīng)酰胺(galcer)。

免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子也可用于疫苗組合物以增強(qiáng)疫苗功效，例如，作為佐劑。這樣的細(xì)胞因子的非限制性實(shí)例包括干擾素α(ifn-a)、白介素-2(il-2)，和粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(gm-csf)，或其組合。

在某些實(shí)施方案中，在組合物中組合或包含另外的多肽、肽或編碼一種或多種多肽或肽的多核苷酸(作為“共刺激”成分發(fā)揮功能)可能是有利的。這樣的共刺激成分可包括例如在本申請(qǐng)的組合物中的細(xì)胞表面蛋白、細(xì)胞因子或趨化因子。共刺激成分可例如作為多肽或肽，或作為編碼多肽或肽的多核苷酸包括在組合物中。

當(dāng)預(yù)防性提供時(shí)，本申請(qǐng)的免疫原性組合物可在hiv感染或有hiv感染跡象前，或在因aids所致的任何癥狀之前給予受試者，特別在高風(fēng)險(xiǎn)受試者中。預(yù)防性給予免疫原性組合物可用于提供給受試者針對(duì)hiv-1感染的保護(hù)免疫或在已經(jīng)感染hiv-1的受試者中預(yù)防或減緩aids的進(jìn)展。當(dāng)治療性提供時(shí)，免疫原性組合物可用于改善和治療aids癥狀和可有利地在感染后盡可能快地使用，優(yōu)選在aids的任何癥狀出現(xiàn)之前，但也可在疾病癥狀發(fā)生時(shí)(或之后)使用。

5.3劑量

本發(fā)明的dna基序疫苗組合物通常以足以提供益處給受試者的量給予受試者。該量被定義為“治療有效量”。治療有效量將由特定組合物的功效或效力，給藥的持續(xù)時(shí)間或頻率，以及受試者的大小和病情，包括受試者的特定治療反應(yīng)來(lái)確定。另外，在確定治療有效量時(shí)應(yīng)考慮給藥途徑。期望本發(fā)明的dna基序疫苗組合物的治療有效量將在從約0.1μg/kg至1mg/kg總核酸的范圍內(nèi)。合適的劑量包括約5μg/kg-500mg/kg的總dna，10μg/kg-250μg/kg的總dna，或10μg/kg-170μg/kg的總dna。在一個(gè)實(shí)施方案中，人類(lèi)受試者(年齡18-50歲，45-75kg)被給予1.2mg-7.2mg的dna?！翱俤na”和‘總核酸”指編碼獨(dú)特的免疫原性分子的核酸庫(kù)。例如，編碼5種不同的免疫原性分子的劑量50mg的總dna可具有1mg的每種分子。dna基序疫苗可分多次給予，例如約2-6次之間。在一示例性方法中，100μg的dna組合物以0、4和12周給予人類(lèi)受試者(每次給予100μg)。

本申請(qǐng)的治療可包括各種“單位劑量”。單位劑量被定義為含有預(yù)定量的本申請(qǐng)的治療性組合物。要給予的量，和具體途徑和制劑，都在臨床領(lǐng)域的技術(shù)人員的范圍內(nèi)。單位劑量不必作為單一注射給予，而是可包括在規(guī)定的時(shí)間段的連續(xù)輸液。單位劑量可含有至少0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、15.0、25.0或50.0mg的活性成分。任選地，單位劑量含有少于0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、15.0、25.0或50.0mg的活性成分。在至少一個(gè)實(shí)施方案中，單位劑量含有從約0.001mg至約50mg的活性成分。在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，單位劑量含有從約1mg至約10mg的活性成分。

5.4給藥方法

給藥可通過(guò)胃腸外或非-胃腸外途徑。給藥途徑可隨疾病的性質(zhì)變化，并包括，例如靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、皮內(nèi)、透皮、肌內(nèi)、粘膜皮下、經(jīng)皮、氣管內(nèi)、腹腔內(nèi)、灌注和灌洗。在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，給藥通過(guò)粘膜途徑，例如通過(guò)鼻、口(經(jīng)由消化系統(tǒng)的粘膜)、陰道、頰、直腸、舌下、眼部、尿道、肺或耳(經(jīng)耳)途徑。對(duì)于經(jīng)鼻給予，示例性制劑可以是鼻噴霧劑、灌洗液、滴劑或噴射系統(tǒng)。

在至少一個(gè)實(shí)施方案中，疫苗組合物可以單一日劑量給予，或總?cè)談┝靠梢苑珠_(kāi)的劑量，例如，每日2、3或4次給予。而且，疫苗組合物可通過(guò)局部使用合適的鼻內(nèi)媒介，以鼻內(nèi)形式，通過(guò)透皮途徑，使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的透皮貼劑的那些形式，通過(guò)植入泵給予；或通過(guò)任何其它合適的給藥手段給予。為以透皮遞送系統(tǒng)的形式給予，例如，劑量給予在整個(gè)給藥方案中將是連續(xù)的而非間歇的。

利用疫苗組合物的給藥方案可根據(jù)各種因素來(lái)選擇，包括但不限于患者的類(lèi)型、物種、年齡、體重、性別和醫(yī)學(xué)病癥；所治療病癥的嚴(yán)重性；給藥途徑；患者的腎和肝功能；以及所用的特定化合物。普通技術(shù)的臨床醫(yī)師或獸醫(yī)可容易地確定并開(kāi)具為預(yù)防、對(duì)抗或阻止要治療的疾病或病癥的進(jìn)展所需的有效量的藥物。

疫苗給予還可包括一個(gè)引發(fā)-加強(qiáng)方案。在這些方法中，一或多次引發(fā)免疫可接著一或多次加強(qiáng)免疫。對(duì)于每次免疫，實(shí)際免疫原性組合物可以是相同或不同的，免疫原性組合物的類(lèi)型、途徑和免疫原的制劑也可變化。例如，一個(gè)有用的引發(fā)-加強(qiáng)方案提供兩次引發(fā)免疫，相隔4周，接著在最后的引發(fā)免疫后4和8周進(jìn)行兩次加強(qiáng)免疫。在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，引發(fā)或者加強(qiáng)，或二者，可以編碼提及的肽或多肽的dna分子的形式給予。

免疫計(jì)劃表(或方案)是熟知的并可容易地針對(duì)特定受試者和免疫原性組合物確定。同樣地，免疫原可一或多次給予受試者。在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，在免疫原性組合物的分開(kāi)給予之間有固定的時(shí)間間隔。雖然這種時(shí)間間隔對(duì)于每一個(gè)受試者是不同的，通常其范圍是從10天至數(shù)周，并且通常是2、4、6或8周。對(duì)于人，時(shí)間間隔通常是從2至6周。在本申請(qǐng)的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，時(shí)間間隔是較長(zhǎng)的，例如約10周、12周、14周、16周、18周、20周、22周、24周、26周、28周、30周、32周、34周、36周、38周、40周、42周、44周、46周、48周、50周、52周、54周、56周、58周、60周、62周、64周、66周、68周或70周。

免疫方案通常包括從1至6次給予免疫原性組合物，但可具有少至1、2、3、4或5次。誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的方法也可包括給予佐劑與免疫原。在一些情況下，每年、每半年或其它長(zhǎng)的時(shí)間間隔(5-10年)加強(qiáng)免疫可補(bǔ)充初始免疫方案。

至少一個(gè)本申請(qǐng)的實(shí)施方案提供通過(guò)給予本申請(qǐng)的免疫原性組合物，在受試者中誘導(dǎo)針對(duì)hiv的免疫反應(yīng)的方法。這樣的免疫可例如，根據(jù)所需的免疫方案以至少2、4或6周(或更長(zhǎng))的時(shí)間間隔重復(fù)多次。

本申請(qǐng)的免疫原性組合物可單獨(dú)給予，或可與其它hiv免疫原和/或hiv免疫原性組合物，如與“其它”免疫學(xué)、抗原性或疫苗或治療性組合物共同給予或順序給予，從而提供多價(jià)或組合的本申請(qǐng)組合物。此外，給予的成分和方式(順序或共同-給藥)，以及劑量可在考慮這樣的因素如具體受試者的年齡、性別、體重、種族和病情，和給藥途徑后確定。當(dāng)用于組合時(shí)，其它hiv免疫原可在相同的時(shí)間或在不同的時(shí)間作為總的免疫方案的一部分，如，作為引發(fā)-加強(qiáng)方案或其它免疫方案的一部分給予。

可與本文提供的組合物和方法一起使用的其它藥物包括抗-hiv劑，包括例如蛋白酶抑制劑、hiv進(jìn)入抑制劑、逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑，和/或抗-逆病毒核苷類(lèi)似物。合適的化合物可包括，例如，安普那韋(amprenavir)、雙汰芝(retrovir/epivir)、佳息患(茚地那韋)、emtriva(恩曲他濱)、epivir(3tc/拉米夫定)、epzicom、fortovase/invirase(沙奎那韋)、fuzeon(恩夫韋肽)、hivid(ddc/扎西他濱)、kaletra(洛匹那韋)、lexiva(福沙那韋)、諾韋(利托那韋)、rescriptor(地拉委定)、retrovir/azt(齊多夫定)、reyatax(阿扎那韋，bms-232632)、sustiva(依法韋侖)、trizivir(阿巴卡韋/齊多夫定/拉米夫定)、truvada(恩曲他濱/替諾福韋df)、惠妥滋(ddl/地丹諾辛)、惠妥滋ec(ddl，地丹諾辛)、viracept(奈韋拉平)、viread(tenofovirdisoproxilfumarate)、zerit(d4t/司他夫定)，和ziagen(阿巴卡韋)。其它合適的藥物是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。這樣的藥物可在給予組合物和/或采用本文描述的方法之前、期間或者之后使用。

核酶療法也是對(duì)hiv/aids療法的一種選擇。它通過(guò)側(cè)接裂解位點(diǎn)序列的底物識(shí)別序列的突變，使用工程改造的反式裂解核酶以裂解特定序列，因此可被用來(lái)從基因組除去hiv基因例如u5,pol，以實(shí)現(xiàn)hiv復(fù)制抑制。在一個(gè)實(shí)施方案中，為了hiv/aids的治療，本文提供的dna基序疫苗組合物與一種或多種工程改造的反式裂解核酶，或表達(dá)反式裂解核酶的載體組合給予。

基于rna的抗-hiv基因遺傳療法也在各種hiv/aids治療中，其通過(guò)rna干擾抑制病毒復(fù)制?？?hiv基因sirna(小干擾rna)或shrna(短發(fā)夾)可經(jīng)工程改造為用于序列特異性mrna降解。此外，長(zhǎng)反義寡核苷酸可被設(shè)計(jì)以結(jié)合hiv基因的mrna并通過(guò)rnaseh依賴(lài)性路徑觸發(fā)mrna的降解，或阻斷核糖體結(jié)合，因而抑制基因表達(dá)。hiv基因可成為靶標(biāo)，包括但不限于hivenv、u1和反式-激活反應(yīng)(tar)元件。在一個(gè)實(shí)施方案中，本文提供的dna基序疫苗組合物與一種或多種抗-hiv基因分子，或表達(dá)反義rna的載體組合給予，用于hiv/aids治療。

此外，適體也可被用于hiv/aids治療。適體是可以高親和力結(jié)合作為誘餌的蛋白的單鏈rna或dna分子。這些分子，通常為15-40個(gè)堿基長(zhǎng)，可被用作結(jié)合病毒蛋白的誘餌或用作靶向傳遞sirna的媒介。慢病毒載體可用來(lái)表達(dá)這樣的適體，其以對(duì)病毒復(fù)制關(guān)鍵的tar和其它病毒蛋白為靶標(biāo)。在一個(gè)實(shí)施方案中，為治療hiv/aids，本文提供的dna基序疫苗組合物與一種或多種適體，或表達(dá)適體的載體組合給予。

如本文所討論的，“治療”包括療效性治療和預(yù)防性或預(yù)防治療二者，其中目的是預(yù)防或減慢為靶標(biāo)的病理狀態(tài)或病癥。需要治療的那些包括已經(jīng)罹患病癥的那些以及易于罹患所述病癥的那些或其中病癥要預(yù)防的那些。術(shù)語(yǔ)“療法”、“治療的”、“治療”或“處理”包括減少、減輕或抑制或消除疾病的癥狀或進(jìn)展的能力或行動(dòng)。治療的所需效果包括預(yù)防疾病的發(fā)生或復(fù)發(fā)，減輕癥狀，消除疾病的直接或間接病理后果，防止轉(zhuǎn)移，降低疾病進(jìn)展速率，改善或減輕疾病狀況，和緩解或改善預(yù)后。在一些實(shí)施方案中，本申請(qǐng)的方法和組合物被用來(lái)延緩疾病或病癥的發(fā)生或減慢疾病或病癥的進(jìn)展。

根據(jù)本申請(qǐng)的治療可包括治療癌癥或其它腫瘤病癥的方法，其包括給予需要治療的患者本申請(qǐng)的肽、核酸、抗體組合物。在至少一個(gè)實(shí)施方案中，治療還包括給予所述患者化療性藥物，例如前藥形式的藥物。兩種成分可一起給予，例如以合并的丸劑形式，或分開(kāi)給予。給予也可以是序貫或同時(shí)的?！靶蜇灐苯o予表示各成分在不同的時(shí)間或時(shí)間點(diǎn)給予，盡管如此這可能是重疊的。同時(shí)給予表示各成分在相同的時(shí)間給予。

本申請(qǐng)的治療的有效量，或優(yōu)選治療有效量被給予。“有效量”指以必需的劑量和時(shí)間段有效達(dá)到所需治療或預(yù)防結(jié)果的量。有效量可根據(jù)共同給予治療的藥物或前藥變化。本申請(qǐng)的治療的“治療有效量”可根據(jù)因素如疾病狀態(tài)、個(gè)體的年齡、性別和體重，和蛋白引起所需治療結(jié)果的能力而變化。治療有效量涵蓋這樣的量，其中蛋白的任何毒性或有害作用被治療有益效果超過(guò)。治療有效量也涵蓋足以賦予利益，如臨床利益的量。

5.5藥劑盒

本發(fā)明提供含有可用來(lái)治療本文描述的病癥的物質(zhì)的制品和藥劑盒。制品可包括如本文描述的化合物的容器及標(biāo)簽。合適的容器包括，例如，瓶、小瓶，和試管。容器可由各種材料如玻璃或塑料形成。容器容納具有有效治療或預(yù)防hiv感染的dna基序疫苗的組合物。容器上的標(biāo)簽可指示組合物可用于治療特定病癥，并且也可指明給藥的用法說(shuō)明。

在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明可提供用于誘導(dǎo)針對(duì)hiv的bnab的藥劑盒，所述藥劑盒包含治療有效量的dna基序疫苗和/或糖-dna基序疫苗。要理解，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)實(shí)踐，dna基序疫苗和/或糖-dna基序疫苗的任何實(shí)施方案可包括在一個(gè)或多個(gè)藥劑盒中。

6.實(shí)施例

6.1方法

6.1.1構(gòu)建基于spd1的基序疫苗和對(duì)照物

根據(jù)一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案，在載體pvax1的背景下，分別構(gòu)建了3組dna基序質(zhì)粒庫(kù)：ppmc、pomc和cpmc。pvax1載體購(gòu)自invitrogen(商品目錄號(hào)v260-20；eugene,or)。pvax1是設(shè)計(jì)用于開(kāi)發(fā)dna基序疫苗的3.0kb質(zhì)粒載體。構(gòu)建載體以符合食品和藥物管理局(fda)文件：“pointstoconsideronplasmiddnavaccinesforpreventiveinfectiousdiseaseindications”,1996年12月22日發(fā)表。

編碼鼠pd1(spd1)、ctla4、hiv-1p24片段和卵清蛋白的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的序列先前已引入pvax1的骨架以構(gòu)建質(zhì)粒：pd1-p24-fc、pd1-ova-fc和ctla4-p24-fc(見(jiàn),zhou,cheung等2013)。所有質(zhì)粒含有促進(jìn)蛋白純化的兔fc標(biāo)簽。

為將編碼基序靶序列的dna插入所需的質(zhì)粒中，合成3個(gè)引物；

引物01fc正向5’(ggccccggcnnbnnbnnbnnbnnbnnbatcctgatgcagtacatcaagg)3’(seqidno:7)

引物02p24反向5’(vnnvnnvnnvnnvnnvnnctcgagcggcaaaactcttg)3’(seqidno:8)

引物03ova反向5’(vnnvnnvnnvnnvnnvnnctcgagcggaggggaaaca)3’(seqidno:9)

其中v表示核酸可以是a、c或g的任何一個(gè)；其中n表示核酸可以是a、c、g或t的任何一個(gè)；b表示核酸可以是c或者g或者t；和其中vnn表示可編碼可變氨基酸殘基的以上核苷酸的隨機(jī)組合。

下劃線引物序列是與質(zhì)粒骨架互補(bǔ)的序列；引物序列的無(wú)下劃線的左邊部分對(duì)應(yīng)于編碼靶/基序的插入的基因。根據(jù)不同的質(zhì)粒骨架，選擇引物01和02(seqidno:7和seqidno:8)或01與03(seqidno:7和seqidno:9)的組合以運(yùn)行pcr，作為靶向基因插入pd1-p24-fc、pd1-ova-fc和ctla4-p24-fc質(zhì)粒中。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)條件和特別是如下條件進(jìn)行pcr反應(yīng)：根據(jù)takara的primestar(cat.#ro10a)的方案，于94℃開(kāi)始變性2min，接著于94℃15秒，55℃30秒，和68℃4分鐘的35個(gè)循環(huán)，接著于68℃最后延長(zhǎng)10分鐘。

表達(dá)pd1、hiv-1p24，或fc的質(zhì)粒單獨(dú)用作對(duì)照質(zhì)粒。質(zhì)粒通過(guò)限制酶消化和再連接生成，并經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證。dna轉(zhuǎn)染到(hek-)293t細(xì)胞中使用聚乙烯亞胺(pei)進(jìn)行，而蛋白表達(dá)通過(guò)facs使用抗-兔fc抗體檢測(cè)。以類(lèi)似的方式，按照這些方法構(gòu)建和驗(yàn)證糖-dna基序質(zhì)粒。糖-基序序列在圖7d中描述。

6.1.2小鼠免疫

所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)香港大學(xué)實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物技術(shù)和研究中心的活動(dòng)物使用委員會(huì)批準(zhǔn)(committeeontheuseofliveanimalsinteachingandresearchatthelaboratoryanimalunitoftheuniversityofhongkong)。在香港大學(xué)實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物中心(laboratoryanimalunitoftheuniversityofhongkong)，在標(biāo)準(zhǔn)無(wú)病原條件下喂飼6-8周齡雌性balb/c小鼠。在具有可調(diào)節(jié)溫度和濕度的標(biāo)準(zhǔn)條件下，在籠子里圈養(yǎng)小鼠，自由飼喂投擲食物和自來(lái)水，并根據(jù)實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物的護(hù)理和使用指南(guideforthecareanduseoflaboratoryanimals)中概述的標(biāo)準(zhǔn)護(hù)理。免疫程序類(lèi)似于發(fā)明人先前的方案(zhou,cheung等2013)。簡(jiǎn)言之，小鼠經(jīng)i.m.注射(經(jīng)電傳孔)接受5次dna免疫，每3周以100μg/每只小鼠的劑量給予。每次免疫后2周，采集血樣用于血清測(cè)試。最終免疫后2周，處死小鼠，并收集血清和脾細(xì)胞用于免疫反應(yīng)分析。

6.1.3elisa

特異性抗體反應(yīng)通過(guò)如前所述的elisa評(píng)價(jià)(qi,zhang等2009)。簡(jiǎn)言之，高-親和力、蛋白-結(jié)合elisa板(corning)用hiv-1p24蛋白(abcam)涂布。然后加入系列稀釋的血清并用hrp-標(biāo)記的抗-小鼠iggbalb’c/3小鼠血清)抗體(sigma-aldrich)檢測(cè)抗體。相對(duì)抗體滴度被表示為與相同稀釋度的對(duì)照血清樣本的光學(xué)密度讀出比較，產(chǎn)生至少2-倍的光學(xué)密度讀出的樣本的最高稀釋的倒數(shù)。

6.1.4中和

所有血漿樣本在測(cè)試前于56℃經(jīng)熱滅活1小時(shí)。簡(jiǎn)言之，將200tcid50的假型病毒與系列稀釋的抗血清在96-孔板中，按一式三份于37℃孵育1小時(shí)。大約1x10⁴個(gè)ghost.cd4/x4/r5細(xì)胞被穩(wěn)定轉(zhuǎn)染以表達(dá)hiv-1受體cd4，然后加入如前所述的復(fù)合受體ccr5或cxcr4(shang,han等2011)，并于37℃維持培養(yǎng)另外48小時(shí)。中和活性通過(guò)與對(duì)照比較的熒光素酶活性的減少來(lái)測(cè)定。id50滴度基于先前發(fā)表的標(biāo)準(zhǔn)算法(brown,frost等2003)計(jì)算。

6.1.5hiv-1gagp24-特異性t細(xì)胞反應(yīng)的評(píng)價(jià)

產(chǎn)生ifn-γ的t細(xì)胞用如前所述的elispot測(cè)定(millipore)評(píng)價(jià)(zhou,cheung等2013)。10微克/每毫升的hiv-1p24肽(對(duì)于每種肽以最終濃度2μg/ml，由nih捐贈(zèng)，產(chǎn)品目錄號(hào)8117)被用來(lái)在體外刺激脾細(xì)胞。肽gaga-i(amqmlkdti)(seqidno:10)是對(duì)cd8+t細(xì)胞特異性的，而肽gag26(tsnppipvgdiykrwiilgl)(seqidno:11)是對(duì)cd4+t細(xì)胞特異性的。細(xì)胞用500ng/ml的12-豆蔻酸13-乙酸佛波醇酯(pma；sigma-aldrich)加1μg/ml莫能霉素鈣(calciumionocymin)刺激或留在僅分別用作陽(yáng)性和陰性對(duì)照的介質(zhì)中。細(xì)胞于37℃、5%co2，和100%濕度下培養(yǎng)20小時(shí)。斑點(diǎn)用免疫斑點(diǎn)讀出儀和圖像分析儀(thermoscientific)鑒定。四聚體-陽(yáng)性cd8+t細(xì)胞群使用pe-綴合的mhci類(lèi)四聚體h2d-kd-amqmlkdti(seqidno:12)(beckmancoulter)評(píng)價(jià)。

6.1.6endoh消化

5微克的純化gp120通過(guò)于100℃加熱反應(yīng)變性10分鐘，然后按照供應(yīng)商(newenglandbiolabs,ipswich,ma)的推薦程序，于37℃用500單位的endoh處理1小時(shí)。然后使樣本經(jīng)受sds-page和蛋白質(zhì)印跡分析。

6.1.7蛋白質(zhì)印跡

上面的5μg蛋白通過(guò)在7.5%聚丙烯酰胺凝膠中電泳分離并轉(zhuǎn)移至pvdf膜，將其與200稀釋的血清或血漿一起孵育過(guò)夜。抗原-抗體反應(yīng)通過(guò)辣根過(guò)氧化物酶(hrp)-標(biāo)記的抗-人或者抗-小鼠球蛋白(santacruzbiotechnology)和3,3'-二氨基聯(lián)苯胺四鹽酸脫水底物檢測(cè)。

6.2結(jié)果

6.2.1概念驗(yàn)證：dna基序免疫

1)dna基序質(zhì)粒的測(cè)序

構(gòu)建ppmc、pomc和cpmc的dna基序質(zhì)粒庫(kù)(圖1a)后，測(cè)序結(jié)果表明氨基酸殘基gpg位于插入的基因的中心并且側(cè)區(qū)序列由隨機(jī)氨基酸殘基構(gòu)成(圖1b)。這表示dna基序質(zhì)粒庫(kù)用含有g(shù)pg的基序構(gòu)建。

2)表征質(zhì)粒表達(dá)

結(jié)果表明ppmc、pomc和cpmc的庫(kù)質(zhì)粒都在轉(zhuǎn)染的293t細(xì)胞中表達(dá)類(lèi)似水平的蛋白；陽(yáng)性細(xì)胞都可以類(lèi)似水平達(dá)到陽(yáng)性對(duì)照ppc的約30%(圖2)。這顯示這樣的質(zhì)?？稍谡婧思?xì)胞中表達(dá)蛋白。

3)表征抗血清滴度

第五dna基序質(zhì)粒生成針對(duì)p24的高滴度抗血清。ppmc和cpmc組都誘導(dǎo)超過(guò)20,000稀釋的針對(duì)p24的抗血清。同時(shí)，pomc也誘導(dǎo)結(jié)合p24的高滴度抗血清，而不管所述質(zhì)粒不含p24的基因的事實(shí)(圖3a)。先前已表明v3m01通過(guò)結(jié)合在c-末端含有g(shù)pg表位的p24，可誘導(dǎo)抗血清，而目前的質(zhì)粒和方法認(rèn)為，在c-末端的gpgp24的表位有助于pomc的抗血清結(jié)合p24(zhiwei2012)。此外，所有3種由質(zhì)粒ppmc、cpmc和pomc生成的抗血清可結(jié)合在細(xì)胞表面上表達(dá)的jr-fl和ada的gp160，而都不能結(jié)合作為陰性對(duì)照的mulv蛋白(圖3b)。這些結(jié)果表明針對(duì)p24和gp160的高滴度抗血清通過(guò)對(duì)gpg的表位有特異性的ppmc組誘導(dǎo)。

4)抗血清中和作用的表征

通過(guò)使用作為免疫原的ppmc、pomc和cpmc質(zhì)粒生成的抗血清都顯示出針對(duì)不同的hiv亞型的廣泛中和作用(圖4b)。與來(lái)自pomc和cpmc組的抗血清形成對(duì)照，ppmc的抗血清中和在v3尖端中含有g(shù)pg的hiv假病毒的各種亞型，像亞型b、b’、b’ccrf01ae、aecrf08bc；雖然它不能中和在v3尖端中具有g(shù)lg的cne11并且不顯示針對(duì)陰性對(duì)照病毒，vsv-g的中和作用(圖4a和4b)。這些數(shù)據(jù)進(jìn)一步提示ppmc質(zhì)粒執(zhí)行對(duì)gpg表位特異性的中和作用。結(jié)果還顯示ppmc的抗血清不僅可中和慢性病毒，而且還中和傳播/創(chuàng)立病毒，例如ch40。r5和x4hiv病毒都可被ppmc質(zhì)粒生成的抗血清中和。此外，ppmc的nd50稀釋度超過(guò)40稀釋?zhuān)@表明當(dāng)用作疫苗時(shí)，使用ppmc作為免疫原可提供針對(duì)病毒感染的保護(hù)作用(mascola和montefiori2010)。最重要的是，表明ppmc可誘導(dǎo)針對(duì)在v3環(huán)頂端含有g(shù)pg氨基酸殘基的各種類(lèi)型的hiv的bnab。

5)細(xì)胞免疫的表征

facs結(jié)果表明來(lái)自ppmc組的pbmc含有2.57-5.76%cd8⁺t，其對(duì)amqmlkdti(seqidno:12)的表位具有特異性。0.67-1.63%的特異性cd8+t細(xì)胞在組cpmc的pbmc中鑒定。如所期望的，特異性cd8⁺t細(xì)胞在來(lái)自pomc組和陰性對(duì)照的pbmc中少于1%，因?yàn)閜omc組基序抗原含有代替p24的卵清蛋白的表位，因而合理的是，對(duì)p24肽表位特異性的cd8+t細(xì)胞少于1%，如pbs組(圖5)。elispot實(shí)驗(yàn)顯示與pomc和pbs組比較，ppmc和cpmc組可引起針對(duì)p24的特異性cd8和cd4表位的ifn-γ+(圖6a-b)?？傊崾緋pmc和cpmc可誘導(dǎo)針對(duì)hiv的p24的穩(wěn)健的細(xì)胞免疫。

從目前檢測(cè)的質(zhì)粒來(lái)看，表明ppmc是優(yōu)選的針對(duì)hiv感染的候選dna基序疫苗，因?yàn)樗軌蛘T導(dǎo)bnab和穩(wěn)健的細(xì)胞免疫。此外，這是首次證明dna基序免疫的概念。它表明dna基序免疫對(duì)誘導(dǎo)體液和細(xì)胞免疫是有效的。

6.2.2糖-dna基序引入

1)dna基序質(zhì)粒的測(cè)序

根據(jù)一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案，有幾個(gè)結(jié)合hiv顆粒上的多糖的bnab，如2g12、pg9和pgt128。例如，pg9與n160的多糖相互作用，2g12識(shí)別n295的多糖，和n332的多糖涉及結(jié)合pgt128。這樣的不同的多糖結(jié)構(gòu)域在來(lái)自hiv數(shù)據(jù)庫(kù)的4633個(gè)不同的分離的hiv序列中進(jìn)行比對(duì)(圖7a-c)。根據(jù)比對(duì)結(jié)果，它顯示與糖基化基序位點(diǎn)有關(guān)的氨基酸殘基是高度保守的。選擇這些保守的序列以構(gòu)建糖-dna基序質(zhì)粒庫(kù)，如對(duì)ppmc質(zhì)粒構(gòu)建所述的。6組糖-dna基序質(zhì)粒庫(kù)如在圖7d中所示構(gòu)建。

用來(lái)構(gòu)建糖-dna基序質(zhì)粒的引物可包括160m01-f、160m02-f、160m03-f、295mo1-f、332m01-f和332m02-f，其在下面示出：

糖-dna基序質(zhì)粒pcr引物(5’-3’):

多糖表位的天然構(gòu)型可通過(guò)這樣的糖-dna基序免疫呈遞給免疫系統(tǒng)。在構(gòu)建糖-dna基序質(zhì)粒庫(kù)后，對(duì)質(zhì)粒庫(kù)測(cè)序并對(duì)插入的編碼蛋白基序序列的基序基因進(jìn)行比對(duì)(圖8a-f)。測(cè)序比對(duì)結(jié)果如同預(yù)期的那樣，其中插入的基序基因被固定并保持在序列的中心，并存在由側(cè)接靶向基因的核酸編碼的隨機(jī)氨基酸殘基。這表示糖-dna基序質(zhì)粒庫(kù)用在序列中心的靶向糖基化基序位點(diǎn)成功地建立。

2)質(zhì)粒表達(dá)的表征

facs結(jié)果表明糖-dna基序庫(kù)質(zhì)粒都呈遞類(lèi)似百分比的表達(dá)作為陽(yáng)性對(duì)照的蛋白的陽(yáng)性細(xì)胞，所述蛋白由ppc的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至轉(zhuǎn)染的293t細(xì)胞；所述百分比的陽(yáng)性細(xì)胞都達(dá)到約30%(圖9)。提示這樣的糖-dna基序質(zhì)粒也可在真核細(xì)胞中表達(dá)蛋白，而插入的糖-dna基序?qū)Φ鞍妆磉_(dá)沒(méi)有影響。這些結(jié)果也提示糖-dna基序的插入的基序基因可用加入的多糖表達(dá)，其中fc蛋白的下游被表達(dá)，這由facs證實(shí)。

3)表征抗血清滴度和中和作用

第五糖-dna基序質(zhì)粒庫(kù)都生成針對(duì)p24的高滴度抗血清(圖10a)。表明這樣的質(zhì)粒當(dāng)用作免疫原時(shí)引起體液免疫。從小鼠提取的抗血清進(jìn)行針對(duì)不同的亞型的hiv的假病毒中和作用。采用vrc01作為陽(yáng)性對(duì)照和采用來(lái)自pbs組的抗血清作為陰性對(duì)照(圖10b)。當(dāng)考慮中和效力和廣度時(shí)，來(lái)自糖-dna基序質(zhì)粒160m01組的抗血清與來(lái)自其它組的抗血清比較，顯示最佳的中和作用。從糖-dna基序質(zhì)粒160m01生成的抗血清中和所有4種hiv假病毒，包括cne15和ada的兩個(gè)慢性病毒和ch08和pv04的兩個(gè)傳播/創(chuàng)立病毒。它也不能顯示與來(lái)自陰性對(duì)照的抗血清相比的針對(duì)陰性mulv病毒的更好的中和作用。這個(gè)結(jié)果提示160m01糖-dna基序質(zhì)粒庫(kù)可以是hiv-1候選疫苗。

4)160m01抗血清多糖表位的表征

為測(cè)試160m01抗血清是否對(duì)hivgp120的多糖是特異性的，進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡法。結(jié)果表明160m01抗血清分別在泳道1、3、5和7結(jié)合gp120的4個(gè)轉(zhuǎn)移亞型；而在泳道2、4、6和8中沒(méi)有條帶，其中g(shù)p120的4個(gè)轉(zhuǎn)移亞型的多糖由酶endoh除去(圖11a)。為證實(shí)在泳道2、4、6和8的蛋白位于膜中，抗體用脫離緩沖液(strippingbuffer)洗滌，然后與來(lái)自hiv陽(yáng)性患者的抗血清一起孵育。所有的泳道顯示出條帶，并且在泳道2、4、6和8中的條帶與泳道1、3、5和7中的條帶位置相比，出現(xiàn)較低位置，提示endoh酶僅除去gp120的多糖，導(dǎo)致蛋白重量的減輕(圖11b)?？傊?，來(lái)自160m01組的抗血清可在多糖的幫助下結(jié)合gp120。因此，160m01糖-dna基序質(zhì)粒庫(kù)成功地誘導(dǎo)對(duì)天然多糖特異性的抗體。

本發(fā)明不限于本文所述的特定實(shí)施方案的范圍。事實(shí)上，除了本文描述的那些外，本發(fā)明的各種修改對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言從前面的描述和附圖也將變得顯而易見(jiàn)。這樣的修改打算落入所附權(quán)利要求書(shū)的范圍內(nèi)。

在整個(gè)本申請(qǐng)中引用了專(zhuān)利、專(zhuān)利申請(qǐng)和出版物，其公開(kāi)內(nèi)容，特別是，包括所有公開(kāi)的化學(xué)結(jié)構(gòu)，通過(guò)引用結(jié)合到本文中。以上出版物或文件的引用不打算作為任何前述內(nèi)容是相關(guān)的現(xiàn)有技術(shù)的認(rèn)可，也不構(gòu)成關(guān)于這些出版物或文件的內(nèi)容或日期的任何認(rèn)可。本文引用的所有參考文獻(xiàn)通過(guò)引用結(jié)合到本文中，其程度如同各個(gè)單獨(dú)的出版物、專(zhuān)利申請(qǐng)或?qū)＠貏e地和單獨(dú)地指明通過(guò)引用結(jié)合到本文中一樣。

前文所寫(xiě)的說(shuō)明書(shū)被認(rèn)為足以使本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠?qū)嵤┍景l(fā)明。除了本文顯示和描述的那些外，本發(fā)明的各種修改對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言從前面的描述中也將變得顯而易見(jiàn)，并且入所附權(quán)利要求書(shū)的范圍內(nèi)。

縮寫(xiě)

ppmc：pd1-p24-基序-環(huán)-質(zhì)粒

pomc：pd1-ova-基序-環(huán)-質(zhì)粒

cpmc：ctla4-ova-基序-環(huán)-質(zhì)粒

ppc：pd1-p24-環(huán)-質(zhì)粒

id50：50%的抑制劑量

deae：二乙基氨基乙基

pei：聚乙烯亞胺

hiv：人免疫缺陷病毒

aids：獲得性免疫缺陷綜合征

elisa：酶-聯(lián)免疫吸附測(cè)定

氨基酸基序序列

xxxxxncsfnittxxxx,(seqidno:1)

xxxxxnxsxnxttxxxx,(seqidno:2)

xxxxxxxsxnxttxxxx,(seqidno:3)

xxxxxinctrpxxxxx,(seqidno:4)

xxxxxahcnisxxxxx,(seqidno:5)

xxxxxaxcnxsxxxxx(seqidno:6)

肽gaga-i(amqmlkdti)(seqidno:10)

肽gag26(tsnppipvgdiykrwiilgl)(seqidno:11)

h2d-kd-amqmlkdti(seqidno:12)

核酸和引物序列

引物01fc正向5’(ggccccggcnnbnnbnnbnnbnnbnnbatcctgatgcagtacatcaagg)3’(seqidno:7)

引物02p24反向5’(vnnvnnvnnvnnvnnvnnctcgagcggcaaaactcttg)3’(seqidno:8)

引物03ova反向5’(vnnvnnvnnvnnvnnvnnctcgagcggaggggaaaca)3’(seqidno:9)

糖-dna基序質(zhì)粒pcr引物(5’-3’)：

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