優(yōu)先權聲明本申請要求2014年10月13日提交的題為“copicoatomeralphasubunitnucleicacidmoleculesthatconferresistancetocoleopteranandhemipteranpests”的美國臨時專利申請系列號62/063199的申請日的利益，在此將其公開全體并入本文。公開領域本發(fā)明一般性地涉及由昆蟲害蟲(例如鞘翅目害蟲和半翅目害蟲)引起的植物損害的遺傳控制。在特定的實施方案中，本發(fā)明涉及目標編碼和非編碼多核苷酸的鑒定、及其重組dna技術在昆蟲害蟲細胞中轉錄后阻遏或抑制目標編碼多核苷酸和非編碼多核苷酸表達從而提供植保作用的用途。背景西方玉米根蟲(wcr)(diabroticavirgiferavirgiferaleconte，玉米根螢葉甲)是北美的一種破壞性最大的玉米根蟲物種，在美國中西部玉米種植區(qū)受到特別關注。北方玉米根蟲(ncr)(巴氏根螢葉甲)是與wcr共棲大致相同范圍的近緣物種。有幾種葉甲屬的其他相關亞種是美洲的嚴重害蟲：墨西哥玉米根蟲(mcr)[墨西哥玉米根螢葉甲(d.virgiferazeaekrysanandsmith)]；南方玉米根蟲(scr)(十一星根螢葉甲)；黃瓜條根螢葉甲(d.balteataleconte)；d.undecimpunctatatenella；南美葉甲(d.speciosagermar)、和d.u.undecimpunctatamannerheim。美國農業(yè)部估計玉米根蟲每年造成10億美元收入損失，包括8億美元產量損失和2億美元處理成本。wcr和ncr兩者都以卵的形式在夏季期間潛伏在土壤中。這些昆蟲在整個冬季都停留在卵階段。卵是橢圓的、白色、且長度小于0.004英寸。幼蟲在5月下旬或6月上旬孵出，卵孵化的精確時間由于溫度差異和位置而在各年間有所變化。新孵出的幼蟲是白色的蠕蟲，長度小于0.125英寸。一旦孵出，幼蟲便開始以玉米根為食。玉米根蟲經歷三個幼蟲齡。在進食幾周后，幼蟲蛻皮，進入若蟲階段。它們在土壤中化蛹，然后它們在7月和8月中以成蟲從土壤出現(xiàn)。成體根蟲長度約0.25英寸。玉米根蟲幼蟲在玉米和幾種其他禾本科物種上完成發(fā)育。在黃色狗尾草上飼養(yǎng)的幼蟲較晚出現(xiàn)，并且作為成蟲比玉米上飼養(yǎng)的幼蟲具有更小的頭殼尺寸。ellsbury等人，(2005)environ.entomol.34:627-634。wcr成蟲以玉米穗絲、花粉、和暴露的穗尖上的籽粒為食。如果wcr成蟲在存在玉米生殖組織之前出現(xiàn)，則它們可以以葉組織為食，由此減緩植物生長，且偶而殺死宿主植物。然而，當優(yōu)選的穗絲和花粉變得可得到時，成蟲會快速向其移動。ncr成蟲也以玉米植物的生殖組織為食，但相比之下很少以玉米葉為食。玉米中的大部分根蟲損傷由幼蟲進食引起。新孵出的根蟲最初以細的玉米根毛為食，并鉆入根尖中。隨著幼蟲長得更大，它們以初生根為食并鉆入其中。在有大量玉米根蟲時，幼蟲嚙食往往導致根部被一直修剪到玉米桿基部。嚴重的根損傷干擾根將水和養(yǎng)分轉運到植物中的能力，降低植物生長，并導致籽粒產生減少，由此經常急劇降低總產量。嚴重的根損傷還經常導致玉米植物的倒伏，其使收獲變得更難，并進一步降低產量。此外，成蟲以玉米生殖組織為食可以導致穗尖的穗絲修剪。如果這種“穗絲剪切”在花粉脫落期間足夠嚴重，則傳粉可能受到破壞。可以通過作物輪作、化學殺蟲劑、生物殺蟲劑(例如，孢子形成革蘭氏陽性細菌蘇云金芽孢桿菌(bt))、表達bt毒素的轉基因植物、或這些手段的組合來嘗試控制玉米根蟲。作物輪作的重大缺陷是過度限制了農田的用途。此外，一些根蟲物種可以在玉米之外的作物田間產卵，或者長期的滯育(diapause)可導致卵孵化經歷多年，因此會降低用玉米和大豆實施的作物輪作的效率。化學殺蟲劑是最為人們所倚重的實現(xiàn)玉米根蟲控制的手段。然而，使用化學殺蟲劑并不是完美的玉米根蟲控制策略；如果把化學殺蟲劑的成本與使用殺蟲劑后仍可能發(fā)生的根蟲害所致的損失相加，則美國每年由于玉米根蟲可能損失超過10億美元。大的幼蟲群體、大雨、和不適當?shù)臍⑾x劑應用均可導致玉米根蟲控制不充分。此外，殺蟲劑的連續(xù)使用可能選擇殺蟲劑抗性根蟲品系，并且由于殺蟲劑中許多對非靶物種有毒性，有嚴重的影響環(huán)境之虞。椿象和其他半翅目昆蟲(heteroptera)構成了另一大類重要的農業(yè)害蟲。已知全世界有超過50個椿象的近緣物種引起作物損害。mcpherson&mcpherson(2000)stinkbugsofeconomicimportanceinamericanorthofmexicocrcpress。這些昆蟲孳生于許多重要作物，包括玉米、大豆、水果、蔬菜、和谷物。椿象在達到成體期之前要經歷多個蛹期。從卵發(fā)育到成蟲的時間約為30-40天。若蟲和成體均以來自軟組織的汁液為食，它們還將消化酶注入到軟組織中，引起口外組織的消化和壞死。然后攝入消化的植物材料和養(yǎng)分。植物維管系統(tǒng)水分和養(yǎng)分的耗竭導致植物組織破壞。對于籽粒和種子發(fā)育的損害最為顯著，因為產量和萌發(fā)顯著減少。在溫暖的氣候下會出現(xiàn)多個世代，導致顯著的蟲害壓力。當前的椿象管理依賴于單塊田的殺蟲劑處理。因此，迫切需要替代的管理策略，以將正在發(fā)生的作物損失降低到最低限度。rna干擾(rnai)是一種利用內源細胞途徑的方法，由此對足夠大小的整個或任何部分靶基因序列特異性的干擾rna(irna)分子(例如，雙鏈rna(dsrna)分子)導致由其編碼的mrna的降解。在最近幾年，在許多物種和實驗系統(tǒng)，例如線蟲秀麗隱桿線蟲、植物、昆蟲胚胎、和組織培養(yǎng)物中的細胞中，已經使用rnai進行基因“敲低”。參見，例如fire等人，(1998)nature391:806-811；martinez等人，(2002)cell110:563-574；mcmanus和sharp(2002)naturerev.genetics3:737-747。rnai通過包括切丁酶(dicer)蛋白質復合物的內源途徑完成mrna的降解。切丁酶將長的dsrna分子切割成約20個核苷酸的短片段，稱作小干擾rna(sirna)。sirna解旋成兩個單鏈rna：乘客鏈(passengerstrand)和引導鏈(guidestrand)。乘客鏈被降解，引導鏈則被整合到rna誘導的沉默復合物(risc)中。美國專利7,612,194和美國專利公開文本2007/0050860、2010/0192265、和2011/0154545披露了自玉米根螢葉甲若蟲分離的9112種表達序列標簽(est)序列的文庫。在美國專利7,612,194和美國專利公開號2007/0050860中提出將與其中披露的玉米根螢葉甲液泡型h+-atp酶(v-atp酶)的幾個特定部分序列之一互補的核酸分子與啟動子可操作連接，以在植物細胞中表達反義rna。美國專利公開文本no.2010/0192265提出將啟動子與核酸分子可操作連接以在植物細胞中表達反義rna，所述核酸分子與具有未知且未公開的功能的玉米根螢葉甲基因的特定部分序列互補(該部分序列據(jù)稱與秀麗隱桿線蟲中的c56c10.3基因產物58％相同)。美國專利公開文本no.2011/0154545提出將啟動子與核酸分子可操作連接以在植物細胞中表達反義rna，所述核酸分子與玉米根螢葉甲外被體(coatomer)β亞基基因的兩個特定部分序列互補。此外，美國專利7,943,819公開了自玉米根螢葉甲幼蟲、若蟲、和切開的中腸分離的906種表達序列標簽(est)序列的文庫，并且提出了將啟動子與核酸分子可操作連接以在植物細胞中表達雙鏈rna，所述核酸分子與玉米根螢葉帶電的多泡體蛋白4b基因的特定部分序列互補。除了v-atp酶的幾個特定部分序列和未知功能的基因的特定部分序列之外，在美國專利7,612,194和美國專利公開文本2007/0050860、2010/0192265和2011/0154545中沒有進一步提出使用其中列出的超過9000個序列中的任何特定序列進行rna干擾。此外，美國專利7,612,194、以及美國專利公開文本2007/0050860、2010/0192265、和2011/0154545都沒有教示提供的超過9000個序列中哪些其他序列在用作dsrna或sirna時在玉米根蟲物種中會是致命的、甚至沒有教示其有任何其他方面的用處。除了帶電多泡體蛋白4b基因的特定部分序列之外，美國專利7,943,819沒有提出使用其文中的超過900個序列的任何特定序列進行rna干擾。此外，美國專利7,943,819沒有教示其提供的超過900個序列中哪些其他序列在用作dsrna或sirna時在玉米根蟲物種中會是致命的、甚至沒有教示其有任何其他方面的用處。美國專利申請公開文本u.s.2013/040173和pct申請公開文本wo2013/169923描述了源自玉米根螢葉甲snf7基因的序列在玉米中進行rna干擾的用途。(還公開于bolognesi等人，(2012)plosone7(10):e47534.doi:10.1371/journal.pone.0047534)。與玉米根蟲dna互補的絕大多數(shù)序列(如上述)用作dsrna或sirna時不提供對玉米根蟲物種的植保作用。例如，baum等人(2007、naturebiotechnology25:1322-1326)描述了rnai對幾個wcr基因靶的抑制作用。這些作者報告，在超過520ng/cm2的極高irna(例如，dsrna)濃度下，他們測試的26個靶基因中有8個不能提供實驗上顯著的鞘翅目害蟲死亡率。美國專利7,612,194和美國專利申請公開2007/0050860的作者們首次報道了在玉米植株中靶向西方玉米根蟲的植物體內(inplanta)rnai。baumetal.(2007)nat.biotechnol.25(11):1322-6。這些作者們描述了一種高通量體內餌食rnai系統(tǒng)，用來篩選用于開發(fā)轉基因rnai玉米的潛在靶基因。在290種靶物的初始基因池中，只有14種基因展現(xiàn)了幼蟲控制潛力。最有效的雙鏈rna(dsrna)中之一靶向了編碼囊泡性atp酶亞單位a(v-atpase)的基因，導致相應的內源mrna的迅速阻遏，并以低濃度的dsrna引發(fā)了特異性的rnai應答。由此，這些作者首次記錄了植物體內rnai作為害蟲管理工具的潛力，同時證明，有效的靶物是無法先驗地準確鑒定的，即使從較小的一組候選基因鑒定亦然。公開概要本文中公開了用于控制昆蟲害蟲的核酸分子(例如，靶基因、dna、dsrna、sirna、mirna、shrna、和hprna)及其使用方法，所述昆蟲害蟲包括，例如，鞘翅目害蟲，諸如玉米根螢葉甲(d.virgiferaleconte)(西方玉米根蟲，“wcr”)；巴氏根螢葉甲(d.barberismithandlawrence、北方玉米根蟲，“ncr”)；十一星根螢葉甲(d.u.howardibarber；南方玉米根蟲，“scr”)；墨西哥玉米根螢葉甲(d.v.zeaekrysanandsmith、墨西哥玉米根蟲，“mcr”)；黃瓜條根螢葉甲(d.balteataleconte)；d.u.tenella；南美葉甲(d.speciosagermar)；d.u.undecimpunctatamannerheim；和半翅目害蟲，諸如英雄美洲蝽(euschistusheros(fabr.)(新熱帶棕椿象，“bsb”)、褐椿象(e.servus)(say)(棕椿象)；稻綠蝽(nezaraviridula(l.)(南部綠椿象)、蓋德擬壁蝽(piezodorusguildinii(westwood)(紅帶椿象)、和茶翅蝽(halyomorphahylys(棕翅椿象)、chinaviahilare(say)(綠椿象)；c.marginatum(palisotdebeauvois)；dichelopsmelacanthus(dallas)；d.furcatus(f.)；edessameditabunda(f.)；thyantaperditor(f.)(新熱帶紅肩椿象)；horciasnobilellus(berg)(棉紅蝽)；taediastigmosa(berg)；dysdercusperuvianus(guérin-méneville)；neomegalotomusparvus(westwood)；leptoglossuszonatus(dallas)；niesthreasidae(f.)；lygushesperus(knight)(西方牧草盲蝽)；和牧草盲蝽[l.lineolaris(palisotdebeauvois)]。在具體的實例中，公開了示例性核酸分子，其與昆蟲害蟲中的一個或多個天然核酸序列的至少一部分可以同源。在這些和進一步的實例中，天然核酸可以是靶基因，其產物可以，例如但不限于：涉及代謝過程；或者涉及幼蟲/若蟲發(fā)育。在一些實例中，借助于包含與靶基因同源的多核苷酸的核酸分子，靶基因表達的翻譯后抑制在鞘翅目和/或半翅目害蟲中可以是致命的，或導致其生長和/或發(fā)育的降低。在具體的實例中，可選擇由外殼蛋白復合物alpha亞單位(本文中稱為copialpha亞單位和copialpha)構成的基因作為轉錄后沉默的靶基因。在具體實例中，有用于轉錄后抑制的靶基因是本文稱為copialpha的新基因。因此本文中公開了包含：copialpha(seqidno:1和seqidno:84)、copialpha(seqidno:1和seqidno:84)的互補物、以及前述任一者的片段的分離的核酸分子。還公開了包含編碼與靶基因產物內的氨基酸序列(例如本文中稱為copialpha的基因的產物)至少約85％相同的多肽的多核苷酸的核酸分子。例如，核酸分子可以包含編碼與seqidno:2或seqidno:85至少85％相同的多肽(copialpha蛋白)的多核苷酸。在具體的實例中，核酸分子包含的核苷酸序列編碼與copialpha的產物內的氨基酸序列至少85％相同的多肽。進一步公開了包含編碼這樣的多核苷酸的核酸分子，所述多核苷酸是編碼與靶基因產物內的氨基酸序列至少85％相同的多肽的多核苷酸的反向互補物。還公開了用于產生irna(例如，dsrna、sirna、mirna、shrna、和hprna)分子的cdna多核苷酸，所述irna與鞘翅目和/或半翅目害蟲靶基因(例如copialpha)的全部或部分互補。在特定的實施方案中，dsrna、sirna、mirna、shrna、和/或hprna可以在體外產生，或由遺傳修飾的生物(如植物或細菌)在體內產生。在特定的實例中，公開了可用于產生與copialpha(seqidno:1和seqidno:84)的全部或部分互補的irna分子。進一步公開了用于抑制鞘翅目和/或半翅目害蟲中必需基因的表達的手段、以及用于給植物提供鞘翅目和/或半翅目害蟲抗性的手段。用于抑制鞘翅目和/或半翅目害蟲中必需基因表達的手段是由下述至少一者構成的單鏈或雙鏈rna分子：seqidno:3(copialpha區(qū)域1，本文中有時稱作copialphareg1)或seqidno:4(copialpha區(qū)域2，本文中有時稱作copialphareg2)，或seqidno:72(copialpha版本1，本文中有時稱作copialphaver1)，或seqidno:73(copialpha版本2，本文中有時稱作copialphaver2)，或seqidno:74(葉甲屬copialpha版本3，本文中有時稱作copialphaver3)，或seqidno:75(copialpha版本4，本文中有時稱作copialphaver4)，或seqidno:86(英雄美洲蝽copialpha區(qū)域1，本文中有時稱作bsb_copialpha-1)，或seqidno:87(英雄美洲蝽copialpha區(qū)域2，本文中有時稱作bsb_copialpha-2)，或它們的互補物。用于抑制鞘翅目和/或半翅目害蟲中的必需基因表達的手段的功能等同物包括與包含seqidno:1或seqidno:84的wcr或bsb基因的全部或部分基本上同源的單鏈或雙鏈rna分子。給植物提供鞘翅目和/或半翅目害蟲抗性的手段是這樣的dna分子，其包含與啟動子可操作連接的、編碼用于抑制鞘翅目和/或半翅目害蟲中的必需基因的表達的手段的核苷酸序列，其中所述dna分子能夠整合到玉米植物的基因組中。公開了控制昆蟲害蟲(例如鞘翅目和/或半翅目害蟲)群體的方法，所述方法包括向昆蟲害蟲(例如鞘翅目和/或半翅目害蟲)提供irna(例如，dsrna、sirna、shrna、mirna、和hprna)分子，所述irna分子在被所述害蟲攝取之后發(fā)揮作用而抑制該害蟲體內的生物功能，其中所述irna分子包含選自以下的核苷酸序列的全部或部分：seqidno:1、seqidno:3、seqidno:4、seqidno:72、seqidno:73、seqidno:74、seqidno:75、seqidno:84、seqidno:86和seqidno:87；seqidno:1、seqidno:3、seqidno:4、seqidno:72、seqidno:73、seqidno:74、seqidno:75、seqidno:84、seqidno:86和seqidno:87的互補物；葉甲屬生物(例如wsr)或半翅目生物(例如bsb)的包含seqidno:1、seqidno:3、seqidno:4、seqidno:72、seqidno:73、seqidno:74、seqidno:75、seqidno:84、seqidno:86和seqidno:87中任一者之全部或部分的天然編碼序列；葉甲屬生物或半翅目生物的包含seqidno:1、seqidno:3、seqidno:4、seqidno:72、seqidno:73、seqidno:74、seqidno:75、seqidno:84、seqidno:86和seqidno:87中任一者之全部或部分的天然編碼序列的互補物；葉甲屬生物或半翅目生物的轉錄為包含seqidno:1、seqidno:3、seqidno:4、seqidno:72、seqidno:73、seqidno:74、seqidno:75、seqidno:84、seqidno:86和seqidno:87中任一者之全部或部分的天然rna分子的天然非編碼序列；以及葉甲屬生物或半翅目生物的轉錄為包含seqidno:1、seqidno:3、seqidno:4、seqidno:72、seqidno:73、seqidno:74、seqidno:75、seqidno:84、seqidno:86和seqidno:87中任一者之全部或部分的天然rna分子的天然非編碼序列的互補物。本文中還公開了方法，其中可將dsrna、mirna、sirna、shrna、和/或hprna在基于餌食的測定中(diet-basedassay)提供給鞘翅目和/或半翅目害蟲，或提供在表達dsrna、mirna、sirna、shrna、和/或hprna的遺傳修飾的植物細胞中。在這些和另外的實例中，dsrna、shrna、mirna、sirna、和/或hprna可被鞘翅目幼蟲和/或半翅目害蟲蛹攝入。然后，本發(fā)明的dsrna、sirna、shrna、mirna、和/或hprna的攝入可在該幼蟲/蛹中導致rnai，進而可導致對于該鞘翅目和/或半翅目害蟲的活力必需的基因的沉默，并最終導致幼蟲/蛹死亡。因此，公開了方法，其中給鞘翅目和/或半翅目害蟲提供核酸分子，所述核酸分子包含可用于控制鞘翅目和/或半翅目害蟲的示例性核酸序列。在特定的實例中，通過使用本發(fā)明的核酸分子控制的鞘翅目和/或半翅目害蟲可以是wcr、ncr、scr、mcr、d.balteata、d.u.tenella、南美葉甲、d.u.undecimpunctata、英雄美洲蝽(euchistusheros)、褐椿象(e.servus)、蓋德擬壁蝽(piezodorusguildinii)、茶翅蝽(halyomorphahalys)、稻綠蝽(nezaraviridula)、綠蝽(chinaviahilare)、c.marginatum、dichelopsmelacanthus、d.furcatus、edessameditabunda、thyantaperditor、horciasnobilellus、taediastigmosa、dysdercusperuvianus、neomegalotomusparvus、leptoglossuszonatus，niesthreasidae，和/或牧草盲蝽(lyguslineolari)。參考下文結合附圖進行的對若干實施方案的詳細說明，前述的特征以及其他特征將會更加自明。附圖簡述圖1包括用于使用用單一一對引物從單個轉錄模板生成dsrna的策略的描述。圖2是用于自兩個轉錄模板的生成dsrna的策略的描述。序列表中的序列的簡述使用如37c.f.r.§1.822規(guī)定的核苷酸堿基的標準字母縮寫，示出了所附序列表中列出的核酸序列。所列出的核酸和氨基酸序列定義了具有以所記載的方式排列的核苷酸和氨基酸單體的分子(即分別為多核苷酸和多肽)。每個列出的核酸和氨基酸序列也定義了包含以所記載的方式排列的核苷酸和氨基酸單體的多核苷酸或多肽的類屬(genus)。鑒于遺傳密碼的冗余，可以理解的是，某個包含編碼序列的核苷酸序列同樣可還描述一個多核苷酸類屬，其中的多核苷酸和由參考序列組成的多核苷酸編碼相同的多肽。還應當理解，某個氨基酸序列可描述編碼該多肽的多核苷酸orf的類屬。對于每個核酸序列僅顯示了一條鏈，僅顯示每個核酸序列的一條鏈，任何對所展示的鏈的提述應理解為包括對互補鏈。由于一級核酸序列的互補序列和反向互補序列必然被該一級序列所公開，所以對核酸序列的任何提述也包括核酸序列的互補序列和反向互補序列，但另有明確說明或者從該序列出現(xiàn)的上下文可以明確看出并非如此的除外。此外，如本領域所知，rna鏈的核苷酸序列決定于轉錄該rna的dna的序列(除了胸腺嘧啶(t)被尿嘧啶(u)核堿基替換之外)，對于某個rna序列而言，任何對編碼它的dna序列的提述也包括了該序列。在所附序列表中：seqidno:1顯示了來自玉米根螢葉甲的包含copialpha亞單位的dna。seqidno:2顯示來自玉米根螢葉甲的copialpha蛋白質的氨基酸序列。seqidno:3顯示被用于體外dsrna合成的來自玉米根螢葉甲的copialphareg1(區(qū)域1)的dna序列(未顯示5’和3’末端的t7啟動子序列)。seqidno:4顯示被用于體外dsrna合成的來自玉米根螢葉甲的copialphareg2(區(qū)域2)的dna序列(未顯示5’和3’末端的t7啟動子序列)。seqidno:5顯示t7噬菌體啟動子的dna序列。seqidno:6顯示被用于體外dsrna合成的yfp編碼區(qū)區(qū)段的dna序列(未顯示5’和3’末端的t7啟動子序列)。seqidno:7至10顯示引物，這些引物被用于擴增copialpha亞單位序列中包含copialphareg1和copialphareg2的部分。seqidno:11呈現(xiàn)如pdab117217中所見的來自玉米根螢葉甲的copialpha發(fā)夾v3-rna-形成序列。大寫字母的堿基為copialpha有義鏈、下劃線的小寫字母堿基包含st-ls1內含子、無下劃線的小寫字母堿基為copialpha反義鏈.aggtgtaaactgggcatctttccatccaactctgcctcttattgcctctggtgctgatgacagacaagtaaaattatggagaatgaatgattctaaagcatgggaaggactagtaccggttgggaaaggtatgtttctgcttctacctttgatatatatataataattatcactaattagtagtaatatagtatttcaagtatttttttcaaaataaaagaatgtagtatatagctattgcttttctgtagtttataagtgtgtatattttaatttataacttttctaatatatgaccaaaacatggtgatgtgcaggttgatccgcggttacttcccatgctttagaatcattcattctccataattttacttgtctgtcatcagcaccagaggcaataagaggcagagttggatggaaagatgcccagtttacacctseqidno:12呈現(xiàn)如pdab117218中所見的來自玉米根螢葉甲的copialpha發(fā)夾v4-rna-形成序列。大寫字母堿基為copialpha有義鏈、下劃線的小寫字母堿基包含st-ls1內含子、無下劃線的小寫字母堿基為copialpha反義鏈.tttattccatcctagacaggaactgattctctcaaacagtgaagataaaactattagagtttgggatacaactaaaagaacttgcctacatacatttaaaagggaaaatggactagtaccggttgggaaaggtatgtttctgcttctacctttgatatatatataataattatcactaattagtagtaatatagtatttcaagtatttttttcaaaataaaagaatgtagtatatagctattgcttttctgtagtttataagtgtgtatattttaatttataacttttctaatatatgaccaaaacatggtgatgtgcaggttgatccgcggttacattttcccttttaaatgtatgtaggcaagttcttttagttgtatcccaaactctaatagttttatcttcactgtttgagagaatcagttcctgtctaggatggaataaaseqidno:13顯示如pdab110853中所見的yfp發(fā)夾-rna-形成序列v2。大寫字母堿基為yfp有義鏈，下劃線的堿基包含st-ls1內含子，小寫字母、無下劃線的堿基為yfp反義鏈。atgtcatctggagcacttctctttcatgggaagattccttacgttgtggagatggaagggaatgttgatggccacacctttagcatacgtgggaaaggctacggagatgcctcagtgggaaaggactagtaccggttgggaaaggtatgtttctgcttctacctttgatatatatataataattatcactaattagtagtaatatagtatttcaagtatttttttcaaaataaaagaatgtagtatatagctattgcttttctgtagtttataagtgtgtatattttaatttataacttttctaatatatgaccaaaacatggtgatgtgcaggttgatccgcggttactttcccactgaggcatctccgtagcctttcccacgtatgctaaaggtgtggccatcaacattcccttccatctccacaacgtaaggaatcttcccatgaaagagaagtgctccagatgacatseqidno:14顯示包含st-ls1內含子的序列。seqidno:15顯示如pdab101556中所見的yfp蛋白編碼序列。seqidno:16顯示膜聯(lián)蛋白區(qū)域1的dna序列。seqidno:17顯示膜聯(lián)蛋白區(qū)域2的dna序列。seqidno:18顯示β血影蛋白2區(qū)域1的dna序列。seqidno:19顯示β血影蛋白2區(qū)域2的dna序列。seqidno:20顯示mtrp-l4區(qū)域1的dna序列。seqidno:21顯示mtrp-l4區(qū)域2的dna序列。seqidno:22至49顯示被用于擴增yfp、膜聯(lián)蛋白、β血影蛋白2及mtrp-l4的基因區(qū)域以供dsrna合成的引物。seqidno:50顯示編碼tip41樣蛋白的玉米dna序列。seqidno:51顯示寡核苷酸t(yī)20nv的dna序列。seqidno:52至56顯示用于測量玉米轉錄物水平的引物和探針的序列。seqidno:57顯示被用于二元載體骨架檢測的specr編碼區(qū)域的一部分的dna序列。seqidno:58顯示被用于基因組拷貝數(shù)分析的aad1編碼區(qū)域的一部分的dna序列。seqidno:59顯示玉米轉化酶基因的dna序列。seqidno:60至68顯示被用于基因拷貝數(shù)分析的引物和探針。seqidno:69至71顯示被用于玉米表達分析的引物和探針的序列。seqidno:72顯示被用于體外dsrna合成的來自玉米根螢葉甲的copialphaver1(版本1)的dna序列(未顯示5’和3’末端的t7啟動子序列)。seqidno:73顯示被用于體外dsrna合成的來自玉米根螢葉甲的copialphaver2(版本2)的dna序列(未顯示5’和3’末端的t7啟動子序列)。seqidno:74顯示被用于體外dsrna合成的來自玉米根螢葉甲的copialphaver3(版本3)dna序列(未顯示5’和3’末端的t7啟動子序列)。seqidno:75顯示seqidno:77顯示被用于體外dsrna合成的來自玉米根螢葉甲的copialphaver4(版本4)dna序列(未顯示5’和3’末端的t7啟動子序列)。seqidno:76-83顯示引物，所述引物被用于擴增玉米根螢葉甲copialpha序列的包含copialphaver1、copialphaver2、alphaver3和copialphaver4的部分。seqidno:84顯示示例性的來自新熱帶褐椿象(英雄美洲蝽)的bsbcopialpha轉錄物的dna序列。seqidno:85顯示來自英雄美洲蝽copialpha蛋白的氨基酸序列。seqidno:86顯示被用于體外dsrna合成的來自英雄美洲蝽的bsb_copialpha-1的dna序列(未顯示5’和3’末端的t7啟動子序列)。seqidno:87顯示被用于體外dsrna合成的來自英雄美洲蝽的bsb_copialpha-2的dna序列(未顯示5’和3’末端的t7啟動子序列)。seqidno:88-91顯示引物，所述引物被用于擴增來自英雄美洲蝽copialpha-1的包含bsb_copialpha-2的序列的部分。seqidno:92是靶定yfp的dsrna:yfpv2的有義鏈。seqidno:93-94顯示被用于擴增靶定yfp的dsrna:yfpv2的部分的引物。seqidno:95呈現(xiàn)yfp發(fā)夾序列(yfpv2-1)。大寫字母堿基為yfp有義鏈，下劃線的小寫字母堿基包含rtm1內含子，無下劃線的小寫字母堿基為yfp反義鏈。atgtcatctggagcacttctctttcatgggaagattccttacgttgtggagatggaagggaatgttgatggccacacctttagcatacgtgggaaaggctacggagatgcctcagtgggaaagtccggcaacatgtttgacgtttgtttgacgttgtaagtctgatttttgactcttcttttttctccgtcacaatttctacttccaactaaaatgctaagaacatggttataactttttttttataacttaatatgtgatttggacccagcagatagagctcattactttcccactgaggcatctccgtagcctttcccacgtatgctaaaggtgtggccatcaacattcccttccatctccacaacgtaaggaatcttcccatgaaagagaagtgctccagatgacat詳細說明i.若干實施方案的概覽本文中公開了用于遺傳控制昆蟲(例如鞘翅目或半翅目)害蟲侵染的方法和組合物。還提供了用于鑒定對于昆蟲害蟲的生命周期必需的一個或多個基因，作為靶基因用于rnai介導的昆蟲害蟲群體控制的方法?？稍O計編碼rna分子的dna質粒載體來抑制生長、存活、和/或發(fā)育所必需的靶基因。在一些實施方案中，所述rna分子可能能夠形成dsrna分子。在一些實施方案中，提供了通過與昆蟲害蟲中靶基因的編碼或非編碼序列互補的核酸分子來轉錄后阻抑靶基因表達或抑制靶基因的方法。在這些和另外的實施方案中，昆蟲害蟲可以攝取一種或多種從與靶基因的編碼或非編碼序列互補的核酸分子的全部或部分轉錄的dsrna、sirna、shrna、mirna、和/或hprna分子，由此提供植物保護效果。因此，一些實施方案涉及使用與靶基因的編碼和/或非編碼序列互補的irna(例如dsrna、sirna、shrna、mirna、和/或hprna)對靶基因產物的表達進行序列特異性抑制，以實現(xiàn)對昆蟲(例如鞘翅目和/或半翅目)害蟲的至少部分控制。公開了一組分離純化的核酸分子，其包含，例如，如seqidno:1、seqidno:3、seqidno:4、seqidno:72、seqidno:73、seqidno:74、seqidno:75、seqidno:84、seqidno:86、seqidno:87任一者中列出的多核苷酸及其片段。在一些實施方案中，可以從該序列、其片段、或包含這些多核苷酸中一種或多種的基因表達穩(wěn)定化的dsrna分子，用于靶基因的轉錄后沉默或抑制。在某些實施方案中，分離和純化的核酸分子包含seqidno:1的全部或部分。在其他的實施方案中，分離和純化的核酸分子包含seqidno:3的全部或部分。在進一步的實施方案中，分離和純化的核酸分子包含seqidno:4的全部或部分。在進一步的實施方案中，分離和純化的核酸分子包含seqidno:72的全部或部分。在其他的實施方案中，分離和純化的核酸分子包含seqidno:73的全部或部分。在另外的實施方案中，分離和純化的核酸分子包含seqidno:74，seqidno:75、seqidno:、84、seqidno:、86或seqidno:87的全部或部分。一些實施方案涉及在其基因組中具有編碼至少一種irna(例如，dsrna)分子的至少一種重組dna的重組宿主細胞(例如，植物細胞)。在特定的實施方案中，dsrna分子可以在被鞘翅目和/或半翅目害蟲攝取時產生，使該害蟲中的靶基因發(fā)生轉錄后沉默或抑制其表達。重組dna可以包含，例如：seqidno:1、seqidno:3、seqidno:4、seqidno:72、seqidno:73、seqidno:74、seqidno:75、seqidno:84、seqidno:86或seqidno:87中任一者；seqidno:1、seqidno:3、seqidno:4、seqidno:72、seqidno:73、seqidno:74、seqidno:75、seqidno:84、seqidno:86或seqidno:87中任一者的片段；包含seqidno:1、seqidno:3、seqidno:4、seqidno:72、seqidno:73、seqidno:74、seqidno:75、seqidno:84、seqidno:86或seqidno:87中一者或更多者的基因的部分序列；或其互補物。一些實施方案涉及重組宿主細胞，所述細胞在其基因組中具有重組dna，所述重組dna具有編碼至少一種irna(例如，dsrna)分子，所述irna分子包含由seqidno:1和/或seqidno:84編碼的rna的全部或部分；和/或其互補物。當被昆蟲(例如鞘翅目和/或半翅目)害蟲攝入時，irna分子可以在該鞘翅目和/或半翅目害蟲中沉默或抑制包含seqidno:1和/或seqidno:84的靶基因的表達，從而導致害蟲的進食、生長和/或發(fā)育停止。在一些實施方案中，在其基因組中具有編碼至少一種能夠形成dsrna分子的rna分子的至少一種重組dna的重組宿主細胞可以是轉化的植物細胞。一些實施方案涉及包含這樣的轉化的植物細胞的轉基因植物。除了這樣的轉基因植物之外，還提供了任何轉基因植物世代的后代植物、轉基因種子、和轉基因植物產品，它們均包含重組dna。在特定的實施方案中，可以在轉基因植物細胞中表達能夠形成dsrna分子的rna分子。因此，在這些和其他實施方案中，可以從轉基因植物細胞分離dsrna分子。在特定的實施方案中，轉基因植物是選自下組的植物，包括：玉米(zeamays)、大豆(glycinemax)、和禾本科(poaceae)的植物。一些實施方案涉及用于調控昆蟲(例如鞘翅目和/或半翅目)害蟲細胞中靶基因表達的方法。在這些和其他實施方案中，可以提供核酸分子，其中所述核酸分子包含編碼能夠形成dsrna分子的rna分子的多核苷酸。在特定的實施方案中，編碼能夠形成dsrna分子的rna分子的多核苷酸可與啟動子可操作連接，并且還可與轉錄終止序列可操作連接。在特定的實施方案中，用于調控昆蟲害蟲細胞中靶基因表達的方法可包括：(a)用包含編碼能夠形成dsrna分子的rna分子的多核苷酸的載體轉化植物細胞；(b)在足以容許形成包含多個轉化的植物細胞的植物細胞培養(yǎng)物的條件下培養(yǎng)所述轉化的植物細胞；(c)選擇已將載體整合到其基因組中的轉化的植物細胞；和(d)確定選擇的轉化的植物細胞包含由載體的所述多核苷酸序列編碼的、能夠形成dsrna分子的rna分子。可以從基因組中整合有載體、且包含由載體的所述多核苷酸編碼的dsrna分子的植物細胞再生植物。因此，還公開了在其基因組中整合有載體的轉基因植物，所述載體具有編碼能夠形成dsrna分子的rna分子的多核苷酸，其中轉基因植物包含由所述載體的所述多核苷酸編碼的dsrna分子。在特定的實施方案中，植物中能夠形成dsrna分子的rna分子的表達足以調控接觸所述轉化的植物或植物細胞(例如通過以轉化的植物、植物的一部分(例如，根)或植物細胞為食)的昆蟲(例如鞘翅目和/或半翅目)害蟲細胞中靶基因的表達，使得害蟲的生長和/或存活被抑制。本文中公開的轉基因植物可以展現(xiàn)出對昆蟲害蟲侵染的抗性和/或增強的耐受性。特定的轉基因植物可以展現(xiàn)出對一種或多種選自下組的鞘翅目和/或半翅目害蟲的抗性和/或增強的保護：wcr、ncr、scr、mcr、玉米根螢葉甲、d.u.tenella、南美葉甲、d.u.undecimpunctatamannerheim、英雄美洲蝽、蓋德擬壁蝽、茶翅蝽、稻綠蝽、綠蝽、褐椿象、dichelopsmelacanthus；dichelopsfurcatus；edessameditabunda；thyantaperditor；chinaviamarginatum；horciasnobilellus；taediastigmosa；dysdercusperuvianus；neomegalotomusparvus；leptoglossuszonatus；niesthreasidae；lygushesperus；和lyguslineolaris。本文中還公開了用于將控制劑(如irna分子等)投送給昆蟲(例如鞘翅目和/或半翅目)害蟲的方法。這樣的控制劑可以直接或間接地阻礙昆蟲害蟲群體進食、生長或以其他方式致害宿主的能力。在一些實施方案中，提供了這樣的方法，包括將穩(wěn)定化的dsrna分子遞送至昆蟲害蟲以抑制該害蟲中的至少一種靶基因，從而導致rnai并減少或消除害蟲宿主中的植物損害。在一些實施方案中，抑制昆蟲害蟲中靶基因表達的方法可以導致害蟲中生長、存活、和/或發(fā)育的停止。在一些實施方案中，提供了包含irna(例如，dsrna)分子的組合物(例如，局部用組合物)，供用于植物、動物、和/或植物或動物的環(huán)境以消除或降低昆蟲(例如鞘翅目和/或半翅目)害蟲的侵染。在特定的實施方案中，組合物可以是要喂給昆蟲害蟲的營養(yǎng)組合物或食物來源。一些實施方案包括使害蟲可得到所述營養(yǎng)組合物或食物來源。包含irna分子的組合物的攝入可導致一個或多個害蟲細胞攝取所述分子，進而可導致害蟲細胞中至少一種靶基因表達的抑制。通過在害蟲的宿主中提供一種或多種包含irna分子的組合物，可以在任何存在昆蟲害蟲的宿主組織或環(huán)境之中或之上限制或消除該害蟲侵染對植物或植物細胞的攝入或損傷。本文中公開的組合物和方法可與針對其他靶(例如ras相對物或rop(美國專利申請公開號20150176025)和rnapii(美國專利申請公開號20150176009))的irna分子組合一起使用。這種影響害蟲中(例如幼蟲中)多種靶序列的潛力可以增加功效，并且還可以改善涉及irna技術的可持續(xù)的昆蟲害蟲管理策略。本文中公開的組合物和方法可與用于控制昆蟲(例如鞘翅目和/或半翅目)害蟲所致?lián)p害的其他方法和組合物組合一起使用。例如，本文中所描述的用于針對昆蟲害蟲保護植物的irna分子可以在這樣的方法中使用，所述方法包括另外使用一種或多種針對昆蟲害蟲有效的化學劑、針對這樣的害蟲有效的生物殺蟲劑、作物輪作、展現(xiàn)出與rnai介導的方法和rnai組合物的特征不同的特征(例如，在植物中重組產生對于昆蟲害蟲有害的蛋白質(例如，bt毒素))的重組遺傳技術。ii.縮寫bsb新熱帶棕椿象(英雄美洲蝽，euschistusheros)dsrna雙鏈核糖核酸est表達序列標簽gi生長抑制ncbi美國國家生物技術信息中心gdna基因組dnairna抑制性核糖核酸orf開放閱讀框rnai核糖核酸干擾mirna微小核糖核酸sirna小抑制性核糖核酸shrna短發(fā)夾核糖核酸hprna發(fā)夾核糖核酸utr非翻譯區(qū)wcr西方玉米根蟲(玉米根螢葉甲)ncr北方玉米根蟲(巴氏根螢葉甲)mcr墨西哥玉米根蟲(墨西哥玉米根螢葉甲)pcr聚合酶鏈式反應qpcr定量聚合酶鏈式反應riscrna誘導的沉默復合物scr南方玉米根蟲(十一星根螢葉甲)sem均值標準誤yfp綠色熒光蛋白iii.術語在以下描述和表中，使用了許多術語。為了提供對說明書和權利要求書的清楚且一致的理解，包括要賦予此類術語的范圍，提供了以下定義：鞘翅目害蟲：如本文中使用的，術語“鞘翅目害蟲”指以農業(yè)作物和作物產品，包括玉米和其它真正的禾本科為食的、屬于鞘翅目(coleoptera)的昆蟲，包括屬于葉甲屬的害蟲。在具體的例子中，鞘翅目害蟲選自下列清單，包括：玉米根螢葉甲(wcr)；巴氏根螢葉甲(ncr)；十一星根螢葉甲(scr)；墨西哥玉米根螢葉甲(mcr)；黃瓜條根螢葉甲；d.u.tenella；和d.u.undecimpunctatamannerheim。(與生物)接觸：如本文中使用的，與生物(例如，鞘翅目害蟲和/或半翅目害蟲)“接觸”或被生物“攝取”等術語，就核酸分子而言，包括核酸分子內化到生物中，例如但不限于：生物攝取分子(例如，通過進食)；使生物與包含核酸分子的組合物接觸；以及用包含核酸分子的溶液浸泡生物。重疊群：如本文中使用的，術語“重疊群”指從一組來源于單一遺傳來源的重疊dna區(qū)段重建的dna序列。玉米植物：如本文中使用的，術語“玉米植物”指物種玉蜀黍(玉米)的植物。表達：如本文中使用的，編碼多核苷酸(例如，基因或轉基因)的“表達”是指這樣的過程，通過該過程，核酸轉錄單元(包括，例如gdna或cdna)的編碼信息被轉化為細胞的操作部分、非操作部分、或結構部分(常常包括蛋白質的合成)?；虮磉_可能受到外部信號的影響，例如細胞、組織、或生物暴露于增加或降低基因表達的物質。基因表達也可以在從dna到rna再到蛋白質的途徑中的任何位置受到調節(jié)。例如，通過控制對轉錄、翻譯、rna運輸和加工、中間分子比如mrna的降解的作用，或通過在特異性蛋白分子已經產生之后的活化、失活、區(qū)室化、或降解，或它們的組合，由此發(fā)生基因表達的調節(jié)。通過本領域已知的任何方法，包括但不限于，northern印跡、rt-pcr、western印跡，或體外、原位或體內蛋白活性測定，可以在rna水平或蛋白質水平測量基因表達。遺傳物質：如本文中使用的，術語“遺傳物質”包括所有基因和核酸分子，諸如dna和rna。半翅目害蟲：如本文中使用的，術語“半翅目害蟲”指屬于半翅目(hemiptera)的昆蟲，包括但不限于蝽科(pentatomidae)、盲蝽科(miridae)、紅蝽科(pyrrhocoridae)、緣蝽科(coreidae)、蛛蝽科(alydidae)、和姬緣蝽科(rhopalidae)等科中的昆蟲，其以范圍很廣的宿主植物為食，具有刺吸式口器。在特定的實例中，半翅目宿主選自下組：英雄美洲蝽[euschistusheros(fabr.)](新熱帶棕椿象)、稻綠蝽nezaraviridula(l.)(南方綠椿象)、蓋德擬壁蝽[piezodorusguildinii(westwood)](紅帶椿象)、茶翅蝽[halyomorphahalys(棕色大理石椿象)、綠蝽[chinaviahilare(say)](綠色椿象)、褐椿象[euschistusservus(say)](棕色椿象)、dichelopsmelacanthus(dallas)、dichelopsfurcatus(f.)、edessameditabunda(f.)、thyantaperditor(f.)(新熱帶紅肩椿象)、chinaviamarginatum(palisotdebeauvois)、horciasnobilellus(berg)(棉紅蝽)、taediastigmosa(berg)、dysdercusperuvianus(guérin-méneville)、neomegalotomusparvus(westwood)、leptoglossuszonatus(dallas)、niesthreasidae(f.)、lygushesperus(knight)(西方牧草盲蝽)、和牧草盲蝽[lyguslineolaris(palisotdebeauvois)]。抑制：如本文中使用的，術語“抑制”在用于描述對編碼多核苷酸(例如基因)的影響時是指從編碼多核苷酸轉錄的mrna和/或編碼多核苷酸的肽、多肽、或蛋白質產物的細胞水平的可測量的降低。在一些實例中，抑制編碼多核苷酸的表達可以使得表達大致消失?！疤禺愋砸种啤笔侵冈趯崿F(xiàn)特異性抑制的細胞中對靶編碼多核苷酸的抑制不對其他編碼多核苷酸(例如，基因)的表達產生影響。昆蟲：如本文用于害蟲的，術語“害蟲”特別包括鞘翅目昆蟲害蟲和半翅目害蟲。在一些實施方案中，該術語還包括某些其它害蟲。分離的：“分離的”生物學組分(諸如核酸、肽或蛋白質)是已經從該組分所天然存在的生物細胞中的其他生物學組分(即，其他染色體和染色體外的dna和rna、和蛋白質)實質性分開、分開產生、或純化出來，同時實現(xiàn)組分中的化學或功能變化(例如，核酸可以通過斷開將核酸連接到染色體中的其余dna的化學鍵而從染色體分離)。已經“分離的”核酸分子和蛋白質包括通過標準純化方法純化的核酸分子和蛋白質。該術語還包括通過在宿主細胞內重組表達制備的核酸分子和蛋白質，以及化學合成的核酸分子、蛋白質和肽。核酸分子：如本文中使用的，術語“核酸分子”可以是指核苷酸的聚合物形式，可包括rna、cdna、gdna的有義和反義鏈，以及上述情形的合成形式和混合聚合物。核苷酸或核堿基可以是指核糖核苷酸、脫氧核糖核苷酸、或這兩種類型核苷酸的任一者的修飾形式。如本文中使用的“核酸分子”與“核酸”和“多核苷酸”是同義詞。除非另外指明，核酸分子通常在長度上具有至少10個堿基。根據(jù)慣例，核酸分子的核苷酸序列從分子的5’至3’端閱讀。核酸分子的“互補物”(即互補序列)是指具有可以與該核酸分子的核堿基形成堿基對(即，a-t/u，和g-c)的核堿基的多核苷酸。一些實施方案包括包含轉錄為rna分子的模板dna的核酸，所述rna分子是mrna分子的互補序列。在這些實施方案中，轉錄為mrna分子的核酸的互補物以5'至3'方向存在，使得rna聚合酶(其以5'至3'方向轉錄dna)將從互補物轉錄出可以與mrna分子雜交的核酸。因此，除非另有明確說明或者從上下文中可以清楚地看出另有所指，術語“互補物”是指具有可以與特定核苷酸序列的核堿基形成堿基對的從5'至3'的核堿基的多核苷酸。類似地，除非另有明確說明或者從上下文中可以清楚地看出另有所指，核酸的“反向互補物”是指相反取向的互補物。前述內容在以下圖示中示出：5’atgatgatg3’多核苷酸5’tactactac3’該多核苷酸的“互補物”5’catcatcat3’該多核苷酸的“反向互補物”本發(fā)明的一些實施方案包括形成發(fā)夾rna的irna分子。在這些irna分子中，rna干擾的靶核酸的互補物和反向互補物可以出現(xiàn)在同一分子中，使得單鏈rna分子在包含互補和反向互補的多核苷酸的區(qū)域上可以“回折”并與自身雜交，如下面的圖示所示：5’augaugaug–接頭多核苷酸–caucaucau3’、其雜交而形成：“核酸分子”包括所有多核苷酸，例如：dna的單鏈和雙鏈形式；rna的單鏈形式；和rna的雙鏈形式(dsrna)。術語“核苷酸序列”或“核酸序列”是指作為個別單鏈或在雙鏈體中的核酸有義和反義鏈兩者。術語“核糖核酸”(rna)包括irna(抑制性rna)、dsrna(雙鏈rna)、sirna(小干擾rna)、mrna(信使rna)、mirna(微小rna)、shrna(小發(fā)夾rna)、hprna(發(fā)夾rna)、trna(轉運rna)(無論是裝載還是卸下相應的?；被?、和crna(互補rna)。術語“脫氧核糖核酸”(dna)包括cdna、gdna、和dna-rna雜交體。術語“多核苷酸”、“核酸”、其“區(qū)段”，或其“片段”，如本領域技術人員將理解的，包括，例如，gdna、核糖體rna、轉運rna、rna、信使rna、操縱子、和較小的工程化多核苷酸，其編碼或可適用于編碼肽、多肽、或蛋白質；以及核酸分子中的功能和/或結構元件，由其相應的核苷酸序列界定。寡核苷酸：寡核苷酸是短的核酸聚合物。寡核苷酸可通過切割較長核酸區(qū)段、或通過使單獨的核苷酸前體聚合而形成。自動合成儀能夠合成長度多達幾百個堿基的寡核苷酸。由于寡核苷酸可與互補的核酸結合，因此它們可用作檢測dna或rna的探針。由dna(寡脫氧核糖核苷酸)組成的寡核苷酸可以用于pcr，pcr是一種用于擴增dna和rna(逆轉錄成cdna)序列的技術。在pcr中，寡核苷酸一般被稱為“引物”，其允許dna聚合酶延伸寡核苷酸并復制互補鏈。核酸分子可以包括天然存在的核苷酸和/或修飾核苷酸，它們通過天然存在和/或非天然存在的核苷酸連接而連接在一起。本領域技術人員易于理解，核酸分子可被化學修飾或生物化學修飾，或者可以含有非天然的或衍生化的核苷酸堿基。這些修飾包括，例如，標記物、甲基化、用類似物取代一個或多個天然存在的核苷酸、核苷酸間修飾(例如，如不帶電連接(unchargedlinkage)的修飾：例如甲基膦酸鹽、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等；帶電連接(chargedlinkage)的修飾：例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等；懸垂部分的修飾：例如肽類；嵌入劑修飾：例如吖啶、補骨脂素等；螯合劑修飾；烷化劑(alkylator)修飾；和修飾的連接：例如α異頭核酸等)。術語“核酸分子”還包括任何拓撲結構，包括單鏈的、雙鏈的、部分雙鏈體的、三鏈體的、發(fā)夾形的(hairpinned)、圓形的、掛鎖形的結構。如本文中使用的，就dna而言，術語“編碼序列”、“結構核苷酸序列”、或“結構核酸分子”是指這樣的核苷酸序列，當被置于適當?shù)恼{節(jié)序列控制下時，其通過轉錄和mrna最終翻譯成多肽。就rna而言，術語“編碼序列”指翻譯成肽、多肽或蛋白質的核苷酸序列。編碼序列的邊界由5’端的翻譯起始密碼子和3’端的翻譯終止密碼子所界定。編碼多核苷酸包括但不限于：基因組dna；cdna；est；和重組核苷酸序列?；蚪M：如本文中所使用的，術語“基因組”是指存在于細胞核內的染色體dna，并且也指存在于細胞的亞細胞組成部分內的細胞器dna。在本發(fā)明的一些實施方案中，可以將dna分子導入植物細胞中，使得dna分子整合到植物細胞的基因組中。在這些和另外的實施方案中，dna分子可以整合到植物細胞的核dna中，或整合到植物細胞的葉綠體或線粒體的dna中。術語“基因組”在其應用于細菌時，指細菌細胞內的染色體和質粒兩者。在本發(fā)明的一些實施方案中，可以將dna分子導入細菌中，使得dna分子整合到細菌的基因組中。在這些和另外的實施方案中，dna分子可以整合于染色體，或者作為穩(wěn)定的質粒定位或位于穩(wěn)定的質粒中。序列同一性：如本文中使用的術語“序列同一性”或“同一性”，在兩個核酸或多肽序列的情況下，是指在指定比較窗口上以最大對應性比對時，這兩個序列中相同的殘基。如本文中使用的，術語“序列同一性百分比”可以是指通過在比較窗口上比較分子的兩個最優(yōu)比對序列(例如，核酸序列或多肽序列)確定的值，其中為了實現(xiàn)這兩個序列的最優(yōu)比對，該比較窗口中的序列部分相比于參考序列(其不包含添加或缺失)可以包含添加或缺失(即，空位)。通過確定在兩個序列中出現(xiàn)相同核苷酸或氨基酸殘基的位置的數(shù)目而產生匹配位置數(shù)，用該匹配位置數(shù)除以比較窗口中位置的總數(shù)，將結果乘以100而產生序列同一性的百分比，從而計算出該百分比。每個位置與參考序列相比均相同的序列被認為是與參考序列是100％相同的，反之亦然。用于比較的序列比對方法是本領域技術人員熟知的。各種程序和比對算法例如描述于smith和waterman(1981)adv.appl.math.2:482；needleman和wunsch(1970)j.mol.biol.48:443；pearson和lipman(1988)proc.natl.acad.sci.u.s.a.85:2444；higgins和sharp(1988)gene73:237-244；higgins和sharp(1989)cabios5:151-153；corpet等人，(1988)nucleicacidsres.16:10881-10890；huang等人，(1992)comp.appl.biosci.8:155-165；pearson等人，(1994)methodsmol.biol.24:307-331；tatiana等人(1999)femsmicrobiol.lett.174:247-250。序列比對方法和同源性計算的詳細考慮事項可見于例如，altschul等人，(1990)j.mol.biol.215:403-410。美國國家生物技術信息中心(ncbi)基本局部比對搜索工具(blasttm；altschul等人(1990))可在幾個來源訪問，包括美國國家生物技術信息中心(bethesda、md)、以及在互聯(lián)網上，其與幾種序列分析程序結合使用。怎樣使用該程序確定序列同一性的描述可在互聯(lián)網上blasttm的“幫助”部分獲得。為了比較核酸序列，可以采用利用默認參數(shù)的默認blosum62矩陣集的blasttm(blastn)程序的“blast2序列”函數(shù)。在用這種方法評估時，與參考序列具有較大相似性的核酸序列將顯示出同一性百分比的增加?？商禺愋噪s交/特異性互補：如本文中使用的，術語“可特異性雜交”和“特異性互補”是表明互補性的足夠程度的術語，該互補性足以使得在核酸分子與靶核酸分子之間發(fā)生穩(wěn)定且特異的結合。在兩個核酸分子之間的雜交兩種涉及核酸分子的核酸序列之間的反平行比對的形成。然后，兩個分子能夠與相反鏈上的相應堿基形成氫鍵以形成雙鏈體分子，如果該雙鏈體分子足夠穩(wěn)定，則可使用本領域中熟知的方法檢出。核酸分子與其可特異性雜交的靶序列不一定是100％互補的。然而，對于特異性雜交而言必須存在的序列互補性的量依賴所使用的雜交條件而變化。導致特定嚴格程度的雜交條件會根據(jù)選擇的雜交方法的性質和雜交的核酸序列的組成和長度而變化。通常，雜交的溫度和雜交的離子強度(尤其是na+和/或mg++濃度)將決定雜交嚴格性。洗滌緩沖液的離子強度和洗滌溫度也會影響嚴格性。關于獲得特定嚴格性程度所需要的雜交條件的計算是本領域普通技術人員已知的，并且論述于例如sambrook等人(編輯)molecularcloning:alaboratorymanual、2nded.、vol.1-3、coldspringharborlaboratorypress、coldspringharbor、ny、1989、chapters9and11和更新；以及hames和higgins(編輯)nucleicacidhybridization、irlpress、oxford、1985。關于核酸雜交的進一步詳細說明和指導例如可見于tijssen、"overviewofprinciplesofhybridizationandthestrategyofnucleicacidprobeassays,"inlaboratorytechniquesinbiochemistryandmolecularbiology-hybridizationwithnucleicacidprobes、parti、chapter2、elsevier、ny、1993；以及ausubel等人編輯，currentprotocolsinmolecularbiology、chapter2、greenepublishingandwiley-interscience、ny、1995和更新。如本文中使用的，“嚴格條件”涵蓋僅在雜交分子與靶核酸分子內的同源序列之間存在大于80％的序列匹配時才發(fā)生雜交的條件。“嚴格條件”包括另外的特定嚴格性水平。因此，如本文中使用的，“中等嚴格性”條件為具有超過80％的以上序列匹配(即具有少于20％錯配)的分子將會雜交的條件；“高嚴格性”條件為具有超過90％的匹配(即具有少于10％錯配)的序列將會雜交的條件(即，具有小于10％的錯配)；并且“極高嚴格性”條件為具有超過95％的匹配(即具有少于15％錯配)的序列將會雜交的條件。以下是代表性的非限制性雜交條件：高嚴格性條件(檢測出共享至少90％序列同一性的序列)：在5xssc緩沖液中在65℃雜交16小時；在2xssc緩沖液中在室溫下洗滌兩次，每次15分鐘；并且在0.5xssc緩沖液中在65℃洗滌兩次，每次20分鐘。中等嚴格性條件(檢測出共享至少80％序列同一性的序列)：在5x到6xssc緩沖液中在65--70℃雜交16-20小時；在2xssc緩沖液中在室溫下洗滌兩次，每次5-20分鐘；并且在1xssc緩沖液中在55-70℃洗滌兩次，每次30分鐘。非嚴格對照條件(共享至少50％序列同一性的序列會雜交)：在6xssc緩沖液中在室溫到55℃雜交16-20小時；在2x到3xssc緩沖液中在室溫到55℃洗滌至少兩次，每次20-30分鐘。如本文中使用的，術語“基本上同源”或“實質同源性”就核酸而言是指具有這樣的連續(xù)核堿基的多核苷酸，所述連續(xù)核堿基在嚴格條件下與參考核酸雜交。例如，與seqidno:1和/或seqidno:84中任一個的參考核酸序列基本上同源的序列的核酸是在嚴格條件(例如，上文列出的中等嚴格性條件)下與seqidno:1和/或seqidno:84中任一個的參考核酸雜交的那些核酸?；旧贤吹亩嗪塑账峥梢跃哂兄辽?0％序列同一性。例如，基本上同源的多核苷酸可以具有約80％到100％序列同一性，諸如約79％；80％；約81％；約82％；約83％；約84％；約85％；約86％；約87％；約88％；約89％；約90％；約91％；約92％；約93％；約94％；約95％；約96％；約97％；約98％；約98.5％；約99％；約99.5％；和約100％。實質性同源性的特性與特異性雜交緊密相關。例如，當存在足夠的互補程度時，核酸分子可特異性地雜交，以便避免核酸在特異性結合是期望的情況下(例如，在嚴格雜交條件下)與非靶多核苷酸的非特異性結合。如本文中使用的，術語“直系同源物”是指兩種或更多種物種中已經從共同的祖先核酸進化并且可以在所述兩種或更多種物種中保留相同功能的基因。如本文中使用的，當一個多核苷酸以5’至3’方向閱讀的每個核苷酸與另一多核苷酸以3’至5’方向閱讀時的每個核苷酸序列互補時，兩個核酸分子被認為展現(xiàn)出“完全互補性”。與參考多核苷酸互補的多核苷酸將展現(xiàn)出與參考多核苷酸的反向互補物相同的序列。這些術語和描述是本領域中定義明確的，并且是本領域普通技術人員容易理解的?？刹僮?地)連接：當?shù)谝欢嗪塑账崤c第二多核苷酸處于功能性關系中時，則第一多核苷酸與第二多核苷酸是可操作連接的。當以重組方式產生時，可操作連接的多核苷酸通常是連續(xù)的，并且在需要將兩個蛋白質編碼區(qū)連接在一起的場合，二者在同一個閱讀框內(例如，在翻譯融合的orf中)。然而，可操作連接的核酸不一定是連續(xù)的。在有關調節(jié)性遺傳元件和編碼多核苷酸的語境下使用時，術語“可操作連接”意味著該調節(jié)元件影響該連接的編碼序列的表達?！罢{節(jié)元件”或“控制元件”是指影響轉錄的周期和水平/量、rna加工或穩(wěn)定性、或相關編碼多核苷酸的翻譯的多核苷酸。調節(jié)元件可以包括啟動子；翻譯前導；內含子；增強子；莖環(huán)結構；阻抑物結合多核苷酸；具有終止序列的多核苷酸；具有多腺苷酸化識別序列的多核苷酸等。特定的調節(jié)元件可位于與其可操作連接的編碼多核苷酸的上游和/或下游。并且，與編碼多核苷酸可操作連接的特定調節(jié)序列可位于雙鏈核酸分子的相關互補鏈上。啟動子：如本文中使用的，術語“啟動子”是指可以在轉錄起始上游的、且可能涉及rna聚合酶與其他蛋白質的識別和結合而啟動轉錄的dna區(qū)域。啟動子可與用于在細胞中表達的編碼多核苷酸可操作連接，或者啟動子可與編碼信號序列的多核苷酸可操作連接，所述多核苷酸可與用于在細胞中表達的編碼多核苷酸可操作連接?！爸参飭幼印笨梢允悄軌騿又参锛毎D錄的啟動子。在發(fā)育控制下的啟動子的實例包括優(yōu)先啟動某些組織中的轉錄的啟動子，所述組織例如葉、根、種子、纖維、木質部導管、管胞、或厚壁組織。這樣的啟動子稱為“組織優(yōu)先”啟動子。僅啟動某些組織中的轉錄的啟動子被稱為“組織特異性”啟動子。“細胞類型特異性”啟動子主要驅動一個或多個器官中某些細胞類型(例如，根或葉中的維管細胞)中的表達?！罢T導型”啟動子可以是可以在環(huán)境控制之下的啟動子。可通過誘導型啟動子啟動轉錄的環(huán)境條件的實例包括厭氧條件和光的存在。組織特異性啟動子、組織優(yōu)先啟動子、細胞類型特異性啟動子、和誘導型啟動子構成“非組成型”啟動子類別?！敖M成型”啟動子是可在大多數(shù)環(huán)境條件下或在大多數(shù)組織或細胞類型中有活性的啟動子。在本發(fā)明的一些實施方案中可以使用任何誘導型啟動子。參見ward等人，(1993)plantmol.biol.22:361-366。利用誘導型啟動子，轉錄速率響應于誘導劑而增加。誘導型啟動子的實例包括但不限于：來自響應于銅的acei系統(tǒng)的啟動子；響應于苯磺酰胺除草劑安全劑的來自玉米的in2基因啟動子；來自tn10的tet阻抑物；和來自類固醇激素基因的誘導型啟動子，其轉錄活性可通過糖皮質激素誘導(schena等人，(1991)proc.natl.acad.sci.usa88:0421)。示例性的組成型啟動子包括，但不限于：來自植物病毒的啟動子，例如來自花椰菜花葉病毒(camv)的35s啟動子；來自水稻肌動蛋白基因的啟動子；泛素啟動子；pemu；mas；玉米h3組蛋白啟動子；和als啟動子，歐洲油菜als3結構基因5'的xba1/ncoi片段(或與所述xba1/ncoi片段相似的多核苷酸)(國際pct公布號美國專利wo96/30530)。另外，在本發(fā)明的一些實施方案中可以利用任何組織特異性或組織優(yōu)先啟動子。用包含與組織特異性啟動子可操作連接的編碼多核苷酸的核酸分子轉化的植物可唯一地或優(yōu)先地在特異性組織中產生所述編碼多核苷酸的產物。示例性的組織特異性或組織優(yōu)先啟動子包括但不限于：種子特異性啟動子，如來自菜豆蛋白基因的啟動子；葉特異性和光誘導型啟動子，如來自cab或rubisco的啟動子；花藥特異性啟動子，如來自lat52的啟動子；花粉特異性啟動子，如來自zm13的啟動子；以及小孢子優(yōu)先啟動子，如來自apg的啟動子。大豆植物：如本文中使用的，術語“大豆植物”是指屬于大豆屬物種(glycinesp.)的植物，例如大豆(glycinemax)。轉化：如本文中使用的，術語“轉化”或“轉導”是指將一個或多個核酸分子轉移到細胞中。當核酸分子通過核酸分子并入細胞基因組中、或通過附加型復制而由該細胞穩(wěn)定復制時，細胞被轉導到該細胞中的核酸分子“轉化”。如本文中使用的，術語“轉化”涵蓋可將核酸分子導入這種細胞中的所有技術。實例包括但不限于：用病毒載體轉染；用質粒載體轉化；電穿孔(fromm等人，(1986)nature319:791-3)；脂質體轉染(felgner等人，(1987)proc.natl.acad.sci.usa84:7413-7)；顯微注射(mueller等人，(1978)cell15:579-85)；土壤桿菌介導的轉移(fraley等人，(1983)proc.natl.acad.sci.usa80:4803-7)；直接dna攝?。缓臀⒘＾Z擊(klein等人，(1987)nature327:70)。轉基因：外源核酸。在一些實例中，轉基因可以是編碼rna的dna，所述rna能夠形成dsrna分子的一條或兩條鏈，包含與存在于鞘翅目和/或半翅目害蟲中的核酸分子互補的多核苷酸。在另外的實例中，轉基因可以為基因(例如除草劑耐性基因、編碼工業(yè)或藥學上有用的化合物的基因、或編碼期望的農業(yè)性狀的基因)。在這些和其他實例中，轉基因可以含有與轉基因的編碼多核苷酸可操作連接的調節(jié)元件(例如，啟動子)。載體：引入到細胞中，例如產生轉化的細胞的核酸分子。載體可以包含允許其在宿主細胞中復制的遺傳元件，諸如復制起點。載體的實例包括但不限于：質粒；粘粒；噬菌體；和攜帶外源dna或rna進入細胞中的病毒。載體還可包括一種或多種基因、包括產生反義分子的基因、和/或選擇標志物基因和本領域已知的其他遺傳元件。載體可以轉導、轉化或感染細胞，由此引起細胞表達核酸分子和/或由該載體編碼的蛋白質。任選地，載體包括輔助核酸分子實現(xiàn)進入細胞中的物質(例如脂質體、蛋白質包衣等)。產量：相對于在相同生長位置在相同時間且在相同條件下生長的檢驗品種的產量，約100％或更大的穩(wěn)定化產量。在特定的實施方案中，“提高的產量”或“提高產量”意指相對于在含有相當大密度的對該作物有害的鞘翅目和/或半翅目害蟲(本申請的組合物和方法以所述害蟲為目標)的相同生長位置在相同時間且在相同條件下生長的檢驗品種的產量，具有105％或更大的穩(wěn)定化產量的栽培種。除非特別指明或暗示，如本文中使用的術語“一個”、“一種”和“該”表示“至少一個/種”。除非另外特別地解釋，本文中使用的全部技術術語和科學術語具有與屬于本公開的領域之內的普通技術人員通常所理解的相同的含義?？梢栽谝韵鲁霭嫖镏姓业椒肿由飳W中常見術語的定義：例如，lewin’sgenesx、jones&bartlettpublishers、2009(isbn100763766321)；krebs等人(編輯)，theencyclopediaofmolecularbiology、blackwellscienceltd.、1994(isbn0-632-02182-9)；和meyersr.a.(編輯)，molecularbiologyandbiotechnology:acomprehensivedeskreference、vchpublishers、inc.、1995(isbn1-56081-569-8)。除非另有說明，所有百分比均以重量計，所有溶劑混合物比例以體積計。所有溫度以攝氏度計。iv.包含昆蟲害蟲多核苷酸的核酸分子a.概述本文中描述了可用于控制昆蟲害蟲的核酸分子。在一些實例中，昆蟲害蟲是鞘翅目和/或半翅目昆蟲害蟲。描述的核酸分子包括靶多核苷酸(例如，天然基因、和非編碼多核苷酸)、dsrna、sirna、shrna、hprna、和mirna。例如，在一些實施方案中描述了dsrna、mirna、sirna、shrna和/或hprna分子，其可與鞘翅目和/或半翅目害蟲中的一種或多種天然核酸的全部或部分特異性地互補。在這些和另外的實施方案中，天然核酸可以是一種或多種靶基因，其產物可以例如但不限于：涉及幼蟲/若蟲發(fā)育。本文中描述的核酸分子在導入包含至少一種與該核酸分子特異性互補的天然核酸的細胞中時，可以在細胞中啟動rnai，隨后降低或消除該天然核酸的表達。在一些實例中，借助于與靶基因特異性互補的核酸分子降低或消除靶基因表達，可導致害蟲的生長、發(fā)育和/或進食停止。在一些實施方案中，可以選擇昆蟲害蟲中的至少一種靶基因，其中靶基因包含copialpha(seqidno:1或seqidno:84)。在具體的實例中，選自鞘翅目和/或半翅目害蟲中的靶基因，其中該靶基因包含新的核苷酸序列，該序列包含copialpha(seqidno:1或seqidno:84)。在一些實施方案中，靶基因可以是包含這樣的多核苷酸的核酸分子，該多核苷酸能夠在計算機上翻譯成包含連續(xù)氨基酸序列的多肽：所述連續(xù)氨基酸序列與copialpha(seqidno:1或seqidno:84)多核苷酸的蛋白質產物的氨基酸序列至少約85％相同(例如，至少84％、85％、約90％、約95％、約96％、約97％、約98％、約99％、約100％、或100％相同)。靶基因可以是昆蟲害蟲中的任何核酸，對該序列的轉錄后抑制會對該害蟲的生長和/或存活造成有害影響，從而，例如，給植物提供針對該害蟲的保護效益。在具體的實例中，靶基因是這樣的核酸分子，其包含能夠在計算機上反向翻譯為多肽的多核苷酸，所述多肽包含與seqidno:1或seqidno:84的氨基酸序列至少約85％相同、約90％相同、約95％相同、約96％相同、約97％相同、約98％相同、約99％相同、約100％相同、或100％相同的連續(xù)氨基酸序列。依照一些實施方案提供了dna，其表達生成包含這樣的多核苷酸的rna分子，該多核苷酸與由昆蟲(例如鞘翅目和/或半翅目)害蟲中的編碼多核苷酸編碼的天然rna分子的全部或部分特異性地互補。在一些實施方案中，在昆蟲害蟲攝入表達的rna分子后，可以獲得害蟲細胞中編碼多核苷酸的下調。在特定的實施方案中，害蟲細胞中編碼序列的下調可以對害蟲的生長、發(fā)育、和/或存活產生有害影響。在一些實施方案中，靶多核苷酸包括轉錄的非編碼性rna，諸如5’utr；3’utr；剪接前導；內含子；末端內含子(outron)(例如，隨后在反式剪接中修飾的5'utrrna)；donatron(例如，提供反式剪接的供體序列需要的非編碼rna)；和昆蟲害蟲靶基因的其他非編碼轉錄rna。這樣的多核苷酸可以衍生自單順反子和多順反子基因兩者。因此，本文中結合一些實施方案還描述了包含至少一種多核苷酸的irna分子(例如，dsrna、mirna、sirna、shrna和hprna)，所述多核苷酸與昆蟲(例如鞘翅目和/或半翅目)害蟲中的靶核酸的全部或部分特異性地互補。在一些實施方案中，irna分子可以包含與多個靶核酸，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、或更多個靶核酸的全部或部分互補的多核苷酸。在特定的實施方案中，irna分子可以在體外產生，或通過遺傳修飾的生物(如植物或細菌)在體內產生。還公開了cdna，其可以用于產生與昆蟲害蟲中的靶核酸的全部或部分特異性地互補的dsrna分子、sirna分子、mirna分子、shrna分子、和/或hprna分子。進一步描述了在實現(xiàn)特定宿主靶標的穩(wěn)定轉化中使用的重組dna構建體。轉化的宿主靶標可以從重組dna構建體表達有效水平的dsrna、sirna、mirna分子、shrna分子、和/或hprna分子。因此，還描述了植物轉化載體，其包含與在植物細胞中功能性的異源啟動子可操作連接的至少一個多核苷酸，其中多核苷酸的表達生成包含與昆蟲害蟲中的靶核酸的全部或部分特異性地互補的連續(xù)核堿基串的rna分子。在特定實例中，可用于控制昆蟲(例如鞘翅目和/或半翅目)害蟲的核酸分子可以包括：從葉甲屬或半翅目生物分離的包含copialpha(seqidno:1或seqidno:84)的天然核酸的全部或部分；核苷酸序列，其在表達時生成這樣的rna分子：所述rna分子包含與由copialpha(seqidno:1或seqidno:84)編碼的天然rna分子的全部或部分特異性地互補的多核苷酸；irna分子(例如，dsrna、mirna、sirna、shrna和hprna)，所述irna分子包含與copialpha(seqidno:1或seqidno:84)的全部或部分特異性地互補的至少一個多核苷酸；可用于產生dsrna分子、sirna分子、mirna、shrna和/或hprna分子的cdna序列，所述分子與copialpha(seqidno:1或seqidno:84)的全部或部分特異性地互補；以及用于在實現(xiàn)特定宿主靶標的穩(wěn)定轉化中使用的重組dna構建體，其中轉化的宿主靶標包含一種或多種前述的核酸分子。b.核酸分子本發(fā)明提供了，除其他事項外，抑制昆蟲(例如鞘翅目和/或半翅目)害蟲的細胞、組織、或器官中的靶基因表達的irna(例如，dsrna、mirna、sirna、shrna和hprna)分子；和能夠在細胞或微生物中表達為irna分子以抑制昆蟲害蟲的細胞、組織、或器官中的靶基因表達的dna分子。本發(fā)明的一些實施方案提供了分離的核酸分子，其包含至少一個(例如，一個、兩個、三個、或更多個)選自下組的多核苷酸：seqidno:1或seqidno:84中任一者；seqidno:1或seqidno:84中任一者的互補物；seqidno:1或seqidno:84中任一者的至少15個連續(xù)核苷酸的片段；seqidno:1或seqidno:84中任一者的至少15個連續(xù)核苷酸的片段的互補物；葉甲屬生物(例如wcr)的包含seqidno:1的天然編碼多核苷酸；半翅目生物的包含seqidno:84的天然編碼多核苷酸；葉甲屬生物(例如wcr)的包含seqidno:1的天然編碼多核苷酸的互補物；半翅目生物的包含seqidno:84的天然編碼多核苷酸的互補物；葉甲屬生物的轉錄為包含seqidno:1的天然rna分子的天然非編碼序列；半翅目生物的轉錄為包含seqidno:84的天然rna分子的天然非編碼序列；葉甲屬生物的轉錄為包含seqidno:1的天然rna分子的天然非編碼序列的互補物；半翅目生物的轉錄為包含seqidno:84的天然rna分子的天然非編碼序列的互補物；葉甲屬生物的包含seqidno:1的天然編碼多核苷酸的至少15個連續(xù)核苷酸的片段；半翅目生物的包含seqidno:84的天然編碼多核苷酸的至少15個連續(xù)核苷酸的片段；葉甲屬生物的包含seqidno:1的天然編碼多核苷酸的至少15個連續(xù)核苷酸的片段的互補物；半翅目生物的包含seqidno:84的天然編碼多核苷酸的至少15個連續(xù)核苷酸的片段的互補物；葉甲屬生物的轉錄為包含seqidno:1的天然rna分子的天然非編碼序列的至少15個連續(xù)核苷酸的片段；半翅目生物的轉錄為包含seqidno:84的天然rna分子的天然非編碼序列至少15個連續(xù)核苷酸的片段；葉甲屬生物的轉錄為包含seqidno:1的天然rna分子的天然非編碼序列的至少15個連續(xù)核苷酸的片段的互補物；以及半翅目生物的轉錄為包含seqidno:84的天然rna分子的天然非編碼序列的至少15個連續(xù)核苷酸的片段的互補物。在特定實施方案中，所述分離的多核苷酸與鞘翅目和/或半翅目害蟲接觸或被所述昆蟲害蟲攝取抑制該害蟲的生長、發(fā)育和/或進食。在一些實施方案中，本發(fā)明的核酸分子可以包含至少一個(例如，一個、兩個、三個、或更多個)dna，其能夠在細胞或微生物中表達為irna分子以抑制鞘翅目和/或半翅目害蟲的細胞、組織、或器官中的靶基因表達。這樣的dna可以與在包含該dna分子的細胞中具備功能的啟動子可操作連接，以啟動或增強編碼的能夠形成dsrna分子的rna的轉錄。在一個實施方案中，所述至少一個(例如，一個、兩個、三個、或更多個)dna可衍生自選自包含seqidno:1或seqidno:84的群組的多核苷酸。seqidno:1或seqidno:84的衍生物包括seqidno:1或seqidno:84的片段。在一些實施方案中，這樣的片段可包含例如seqidno:1和/或seqidno:84的至少約15個連續(xù)核苷酸，或其互補物。因此，這樣的片段可包含，例如，seqidno:1或seqidno:84的15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200個或更多個連續(xù)核苷酸，或其互補物。在某些實例中，這樣的片段可包含，例如，seqidno:1或seqidno:84的至少19個連續(xù)核苷酸，或其互補物。因此，seqidno:1或seqidno:84的片段可以包含，例如，seqidno:1和/或seqidno:84的19、20、21、22、23、24、25、26、27、28，29或30、約40、(例如，35、36、37、38、39、40、41、42、43、44和45)、約50、約60、約70、約80、約90、約100、約110、約120、約130、約140、約150、約160、約170、約180、約190、約200或更多個連續(xù)核苷酸，或其互補物。一些實施方案包括將部分或完全穩(wěn)定化的dsrna分子導入鞘翅目和/或半翅目害蟲中以抑制鞘翅目和/或半翅目害蟲的細胞、組織或器官中靶基因的表達。當表達為irna分子(例如，dsrna、mirna、sirna、shrna、和hprna)并被鞘翅目和/或半翅目害蟲攝取時，包含seqidno:1或seqidno:84的一個或多個片段的多核苷酸可以引起下列一項或多項：鞘翅目和/或半翅目害蟲的死亡、發(fā)育停止、生長抑制、性別比變化、產卵量(broodsize)減少、感染停止、和/或進食停止。例如，在一些實施方案中，提供這樣的dsrna分子：該dsrna分子包含與鞘翅目和/或半翅目害蟲靶基因序列基本同源的約15個至約300個、或約19個至約300個核苷酸的核苷酸序列，并且包含含有seqidno:1或seqidno:84的核苷酸序列的一個或多個片段。這種dsrna分子的表達可能例如導致攝取dsrna分子的鞘翅目和/或半翅目害蟲中的死亡和/或生長抑制。在某些實施方案中，本發(fā)明提供的dsrna分子包含與來自包含seqidno:1或seqidno:84的靶基因的轉錄物互補的多核苷酸，和/或與seqidno:1或seqidno:84的片段互補的核苷酸序列，所述靶基因在昆蟲害蟲中的抑制導致對于害蟲的生長、發(fā)育、或其他生物學功能必需的蛋白質或多核苷酸物質的減少或消除。選擇的核苷酸序列可以與下列各項展現(xiàn)出約80％到約100％序列同一性：seqidno:1或seqidno:84中任一者；seqidno:1或seqidno:84中所示的核苷酸序列的連續(xù)片段；或前述任一者的互補物。例如，選定的多核苷酸可以與下列任一項展現(xiàn)出79％、80％、約81％、約82％、約83％、約84％、約85％、約86％、約87％、約88％、約89％、約90％、約91％、約92％、約93％、約94％、約95％、約96％、約97％、約98％、約98.5％、約99％、約99.5％、或約100％的序列同一性：seqidno:1或seqidno:84；seqidno:1或seqidno:84中所示對的核苷酸序列的連續(xù)片段；和前述任一者的互補物。在一些實施方案中，能夠在細胞或微生物中表達為irna分子以抑制靶基因表達的dna分子可以包含與存在于一個或多個靶昆蟲害蟲物種(例如鞘翅目或半翅目害蟲物種)中的天然多核苷酸的全部或部分特異性地互補的單個多核苷酸，或者dna分子可以是從多個這樣的特異性互補多核苷酸構建而成的嵌合體。在一些實施方案中，核酸分子可以包含以“間隔物”分開的第一和第二多核苷酸。間隔物可以是任何包含促進第一和第二多核苷酸之間的二級結構形成(在期望的情況下)的核苷酸序列的區(qū)域。在一個實施方案中，間隔物是mrna的有義或反義編碼多核苷酸的一部分?；蛘撸g隔物可以包含能夠與核酸分子可操作連接的核苷酸或其同源物的任何組合。在一些實例中，間隔物可以是內含子(例如st-ls1內含子或rtm1內含子)。例如，在一些實施方案中，dna分子可以包含編碼一種或多種不同irna分子的多核苷酸，其中每種不同irna分子分別包含第一多核苷酸和第二多核苷酸，其中第一和第二多核苷酸彼此互補。第一和第二多核苷酸在rna分子內可以通過間隔物連接。間隔物可以構成第一多核苷酸或第二多核苷酸的一部分。包含第一和第二多核苷酸的rna分子的表達可以通過第一和第二多核苷酸的特異性分子內堿基配對而導致dsrna分子的形成。第一多核苷酸或第二多核苷酸可以與對于昆蟲害蟲(例如鞘翅目和/或半翅目害蟲)而言天然的多核苷酸(例如，靶基因、或轉錄的非編碼多核苷酸)、其衍生物、或其互補多核苷酸基本上相同。dsrna核酸分子包含聚合核糖核苷酸的雙鏈，并且可以包含對磷酸-糖主鏈或核苷的修飾?？梢赃m宜調整rna結構的修飾以使得特異性抑制能夠發(fā)生。在一個實施方案中，可以通過普遍存在的酶促過程來修飾dsrna分子，以便能夠生成sirna分子。此酶促過程可以利用體外或體內的rna酶iii酶，如真核生物中的切丁酶。參見elbashir等人，(2001)nature411:494-8；以及hamilton和baulcombe(1999)science286(5441):950-2。切丁酶或功能等效的rna酶iii酶將較大的dsrna鏈和/或hprna分子切割成較小的寡核苷酸(例如，sirna)，每個所述寡核苷酸長度為約19-25個核苷酸。由這些酶生成的sirna分子具有2到3個核苷酸3’突出物、和5’磷酸和3’羥基末端。由rna酶iii酶生成的sirna分子在細胞中解旋，并分成單鏈rna。然后，sirna分子與從靶基因轉錄的rna特異性地雜交，并且這兩種rna分子隨后通過固有的細胞rna降解機制而被降解。這個過程可以導致由靶生物中的靶基因編碼的rna的有效降解或消除。結果導致靶向基因的轉錄后沉默。在一些實施方案中，通過內源rna酶iii酶從異源核酸分子產生的sirna分子可以有效介導鞘翅目和/或半翅目害蟲中靶基因的下調。在一些實施方案中，核酸分子可以包括至少一種可被轉錄成單鏈rna分子的非天然存在的多核苷酸，所述單鏈rna分子能夠在體內通過分子間雜交形成dsrna分子。這樣的dsrna常常進行自組裝，并且可以在昆蟲(例如鞘翅目和/或半翅目)害蟲的營養(yǎng)來源中提供，以實現(xiàn)靶基因的轉錄后抑制。在這些和另外的實施方案中，核酸分子可以包含兩種不同的非天然存在的核苷酸序列，其中每種序列與昆蟲害蟲中的不同靶基因特異性地互補。當向例如鞘翅目和/或半翅目害蟲以dsrna分子的形式提供這樣的核酸分子時，dsrna分子抑制害蟲中至少兩種不同靶基因的表達。c.獲得核酸分子可以使用昆蟲(例如鞘翅目或半翅目)害蟲中的多種多核苷酸作為靶標來設計核酸分子，如irna和編碼irna的dna分子。然而，天然多核苷酸的選擇并非是直截了當?shù)倪^程。例如，鞘翅目或半翅目害蟲的天然多核苷酸中僅有少數(shù)會是有效的靶標。特定的天然多核苷酸是否可以被本發(fā)明的核酸分子有效下調，抑或特定的天然多核苷酸的下調是否會對昆蟲害蟲的生長、發(fā)育和/或生存具有有害影響，都是無法肯定地預測的。絕大多數(shù)的鞘翅目和半翅目害蟲天然多核苷酸，如自這些害蟲分離的est(例如，如美國專利7,612,194中所列出的鞘翅目害蟲多核苷酸)，對害蟲的生長、發(fā)育和/或存活沒有有害影響。同樣無法預測的是，在可以對害蟲具有有害影響的天然多核苷酸中哪些能夠在重組技術中使用，從而在宿主植物中表達與這樣的天然多核苷酸互補的核酸分子，并且在進食后對害蟲造成有害影響，同時不對宿主植物引起損害。在一些實施方案中，核酸分子(例如，要在昆蟲(例如鞘翅目和/或半翅目)害蟲的宿主植物中提供的dsrna分子)被選擇為靶向這樣的cdna，其編碼對于害蟲發(fā)育必需的蛋白質或蛋白質部分(如涉及代謝或分解代謝生物化學途徑、細胞分裂、能量代謝、消化、宿主植物識別等的多肽)。如本文中描述的，靶害蟲生物攝入含有一種或多種dsrna——所述dsrna的至少一個區(qū)段與靶害蟲生物細胞中產生的rna的至少一個基本上相同的區(qū)段特異地互補——的組合物，可以導致靶生物的死亡或其他抑制?？梢允褂脧睦ハx害蟲衍生的多核苷酸(dna或rna)來構建對該害蟲侵染有抗性的植物細胞。例如，可以轉化鞘翅目和/或半翅目害蟲的宿主植物(例如，玉米或大豆)，使其含有從鞘翅目和/或半翅目害蟲衍生的如本文中提供的一種或多種多核苷酸。轉化到宿主中的多核苷酸可以編碼一種或多種rna，其在轉化的宿主內的細胞或生物學流體中形成dsrna結構，這樣，如果/當害蟲與轉基因宿主形成營養(yǎng)關系時，就有dsrna可用。這可以導致害蟲細胞中一種或多種基因表達的阻抑，最終導致死亡或其生長或發(fā)育的抑制。因此，在一些實施方案中，靶向實質參與昆蟲(例如鞘翅目和/或半翅目)害蟲的生長、發(fā)育和生殖的基因。本發(fā)明中使用的其他靶基因可以包括例如那些在害蟲的運動、遷移、生長、發(fā)育、感染性、和進食位置的建立中發(fā)揮重要作用的靶基因。因此，靶基因可以是管家基因或轉錄因子。另外，本發(fā)明中使用的天然昆蟲害蟲多核苷酸也可以從植物、病毒、細菌或昆蟲基因的同源物(例如，直系同源物)衍生，所述同源物的功能對于本領域技術人員是已知的，且其多核苷酸與害蟲的基因組中的靶基因可特異性地雜交。通過雜交鑒定已知核苷酸序列的基因同源物的方法是本領域技術人員已知的。在一些實施方案中，本發(fā)明提供了用于獲得包含用于產生irna(例如，dsrna、mirna、sirna、shrna、和hprna)分子的多核苷酸的核酸分子的方法。一種這樣的實施方案包括：(a)對一種或多種靶基因分析其在昆蟲(例如鞘翅目和/或半翅目)害蟲中在dsrna介導的基因阻抑后的表達、功能和表型；(b)用探針探查cdna或gdna文庫，所述探針包含來自靶向的害蟲的多核苷酸的全部或部分或其同源物，所述靶向的害蟲在dsrna介導的阻抑分析中展現(xiàn)出改變的(例如，降低的)生長或發(fā)育表型；(c)鑒定與探針特異性雜交的dna克??；(d)分離步驟(b)中鑒定的dna克??；(e)對包含步驟(d)中分離的克隆的cdna或gdna片段測序，其中測序的核酸分子包含rna的全部或大部分或其同源物；和(f)化學合成基因的全部或大部分、mirna、sirna、hprna、mrna、shrna、或dsrna。在另外的實施方案中，用于獲得包含用于產生大部分的irna(例如，dsrna、mirna、sirna、shrna、和hprna)分子的多核苷酸的核酸片段的方法包括：(a)合成第一和第二寡核苷酸引物，其與來自靶向的昆蟲(例如鞘翅目和/或半翅目)害蟲的天然多核苷酸的一部分特異性地互補；和(b)使用步驟(a)的第一和第二寡核苷酸引物擴增克隆載體中存在的cdna或gdna插入物，其中擴增的核酸分子包含mirna、sirna、mrna、hprna、shrna或dsrna分子的大部分。核酸可以通過多種途徑分離、擴增、或產生。例如，可以通過pcr擴增從gdna或cdna文庫衍生的靶多核苷酸(例如，靶基因或靶轉錄的非編碼多核苷酸)、或其部分而獲得irna(例如，dsrna、mirna、sirna、shrna、和hprna)分子?？梢詮陌猩锾崛na或rna，并且可以使用本領域普通技術人員已知的方法從其制備核酸文庫。可使用自靶生物生成的gdna或cdna文庫進行靶基因的pcr擴增和測序?？梢允褂么_認的pcr產物作為體外轉錄的模板以在最低限度的啟動子的情況下生成有義和反義rna?；蛘?，可以使用標準化學，如亞磷酰胺化學，通過許多技術(參見，例如ozaki等人，(1992)nucleicacidsresearch、20:5205-5214；和agrawal等人，(1990)nucleicacidsresearch、18:5419-5423)，包括使用自動化dna合成儀(例如，p.e.biosystems、inc.(fostercity、calif.)392或394型dna/rna合成儀)的任一者來合成核酸分子。參見，例如，beaucage等人，(1992)tetrahedron、48:2223-2311；美國專利4,980,460、4,725,677、4,415,732、4,458,066、和4,973,679。也可以采用備選化學，其生成非天然主鏈基團，如硫代磷酸酯、氨基磷酸酯，等等。本發(fā)明的rna、dsrna、mirna、sirna、shrna、或hprna分子可以由本領域技術人員可以通過手動或自動反應以化學或酶促方式產生，或者在包含含有編碼rna、dsrna、mirna、sirna、shrna、或hprna分子的多核苷酸的核酸分子的細胞中體內產生。還可以通過部分或完全有機合成產生rna，可以通過體外酶促或有機合成引入任何經修飾的核糖核苷酸。可以通過細胞rna聚合酶或噬菌體rna聚合酶(例如，t3rna聚合酶、t7rna聚合酶、和sp6rna聚合酶)合成rna分子?？捎糜诳寺『捅磉_多核苷酸的表達構建體是本領域中已知的。參見，例如，國際pct公布號wo97/32016；及美國專利5,593,874、5,698,425、5,712,135、5,789,214、和5,804,693。可以在導入細胞中之前純化化學合成或通過體外酶促合成合成的rna分子。例如，可以通過用溶劑或樹脂提取、沉淀、電泳、色譜法、或其組合從混合物純化rna分子?；蛘撸梢栽诓患兓蜃钚〕潭燃兓那闆r下使用化學合成或通過體外酶促合成而合成的rna分子，例如，以避免由于樣品加工所致的損失。可以將rna分子干燥貯存或溶解在水溶液中。溶液可以含有緩沖劑或鹽以促進dsrna分子雙鏈體鏈的退火和/或穩(wěn)定化。在實施方案中，可以通過單一自身互補的rna鏈或者從兩條互補rna鏈形成dsrna分子。dsrna分子可以在體內或在體外合成。細胞的內源rna聚合酶可以在體內介導一條或兩條rna鏈的轉錄，或者可以使用克隆的rna聚合酶在體內或在體外介導轉錄。通過宿主器官、組織、或細胞類型中的特異性轉錄(例如，通過使用組織特異性啟動子進行)；刺激宿主中的環(huán)境條件(例如，通過使用響應于感染、脅迫、溫度、和/或化學誘導物的誘導型啟動子)；和/或在宿主的某個發(fā)育階段或年齡人工造成轉錄(例如，通過使用發(fā)育階段特異性啟動子)，在昆蟲害蟲中靶基因的轉錄后抑制可以是宿主靶向性的。形成dsrna分子的rna鏈(不論是體外還是體內轉錄的)可以也可以不是多聚腺苷酸化的，并且可以能夠也可以不能被細胞翻譯機制翻譯成多肽。d.重組載體和宿主細胞轉化在一些實施方案中，本發(fā)明還提供了用于導入細胞(例如，細菌細胞、酵母細胞、或植物細胞)中的dna分子，其中dna分子包含這樣的多核苷酸，該多核苷酸在表達為rna并被昆蟲(例如鞘翅目和/或半翅目)害蟲攝取后，可實現(xiàn)對害蟲的細胞、組織或器官中靶基因的阻抑。因此，一些實施方案提供了重組核酸分子，其包含能夠在植物細胞中表達為irna(例如，dsrna、mirna、sirna、shrna、和hprna)分子以抑制昆蟲害蟲中靶基因表達的多核苷酸。為了啟動或增強表達，這樣的重組核酸分子可以包含一種或多種調節(jié)元件，所述調節(jié)元件可以與能夠表達為irna的多核苷酸可操作連接。在植物中表達基因阻抑分子的方法是已知的，并且可以用于表達本發(fā)明的多核苷酸。參見，例如，國際pct公開號wo06/073727；和美國專利公開號2006/0200878a1)。在具體的實施方案中，本發(fā)明的重組dna分子可以包含編碼可形成dsrna分子的rna的多核苷酸。這樣的重組dna分子可以編碼可形成dsrna分子的rna，其被攝取后能夠抑制昆蟲(例如鞘翅目和/或半翅目)害蟲細胞中內源靶基因的表達。在許多實施方案中，轉錄的rna可以形成dsrna分子，所述dsrna分子可以以穩(wěn)定化形式提供；例如，以發(fā)夾和莖和環(huán)結構的形式提供。在某些實施方案中，dsrna分子的一條鏈可以通過從與選自下組的任意多核苷酸基本上同源的多核苷酸轉錄而形成：seqidno:1；seqidno:1的互補物；seqidno:1的至少15個連續(xù)核苷酸的片段；seqidno:1的至少15個連續(xù)核苷酸的片段的互補物；葉甲屬生物(例如wcr)的包含seqidno:1的天然編碼序列；葉甲屬生物的包含seqidno:1的天然編碼序列的互補物；葉甲屬生物的轉錄為包含seqidno:1的天然rna分子的天然非編碼序列；葉甲屬生物的轉錄為包含seqidno:1的天然rna分子的天然非編碼序列的互補物；葉甲屬生物的包含seqidno:1的天然編碼序列的至少15個連續(xù)核苷酸的片段；葉甲屬生物的包含seqidno:1的天然編碼序列的至少15個連續(xù)核苷酸的片段的互補物；英雄美洲蝽生物的轉錄為包含seqidno:1的天然rna分子的天然非編碼序列的至少15個連續(xù)核苷酸的片段；和英雄美洲蝽生物的轉錄為包含seqidno:1的天然rna分子的天然非編碼序列的至少15個連續(xù)核苷酸的片段的互補物。在其他實施方案中，dsrna分子的一條鏈可以通過從與下述選自下組的多核苷酸基本上同源的多核苷酸轉錄而形成：seqidno:84；seqidno:84的互補物；seqidno:84的至少15個連續(xù)核苷酸的片段；seqidno:84的至少15個連續(xù)核苷酸的片段的互補物；半翅目生物的包含seqidno:84的天然編碼序列；半翅目生物的包含seqidno:84的天然編碼序列的互補物；半翅目生物的轉錄為包含seqidno:84的天然rna分子的天然非編碼序列；半翅目生物的轉錄為包含seqidno:84的天然rna分子的天然非編碼序列的互補物；半翅目生物的包含seqidno:84的天然編碼序列的至少15個連續(xù)核苷酸的片段；半翅目生物的包含seqidno:84的天然編碼序列的至少15個連續(xù)核苷酸的片段的互補物；半翅目生物的轉錄為包含seqidno:84的天然rna分子的天然非編碼序列的至少15個連續(xù)核苷酸的片段；和半翅目生物的轉錄為包含seqidno:84的天然rna分子的天然非編碼序列的至少15個連續(xù)核苷酸的片段的互補物。在特定的實施方案中，編碼可形成dsrna分子的重組dna分子可包含編碼區(qū)，其中至少兩個多核苷酸如此排列，使得相對于至少一個啟動子，一個多核苷酸處于有義取向，另一多核苷酸處于反義取向，其中該有義多核苷酸和該反義多核苷酸通過間隔物連接或聯(lián)接，所述間隔物具有，例如，約5個(～5)至約一千個(～1000)核苷酸。間隔物可以在有義和反義多核苷酸之間形成環(huán)。有義多核苷酸或反義多核苷酸可以與靶基因(例如，包含seqidno:1或seqidno:84的基因)或其片段基本上同源。然而，在一些實施方案中，重組dna分子可以編碼可以形成沒有間隔物的dsrna分子的rna。在實施方案中，有義編碼多核苷酸和反義編碼多核苷酸可以是不同的長度。通過在本發(fā)明的重組核酸分子中創(chuàng)建適當?shù)谋磉_盒，可以容易地將鑒定為對昆蟲害蟲具有有害影響或者針對該害蟲的植物保護效果的多核苷酸摻入表達的dsrna分子中。例如，可以通過如下步驟將這樣的多核苷酸表達為具有莖和環(huán)結構的發(fā)夾：采用對應于靶基因多核苷酸(例如，seqidno:1或seqidno:84，或其片段)的第一區(qū)段；將此多核苷酸與第二區(qū)段間隔物區(qū)連接，所述第二區(qū)段間隔物區(qū)與第一區(qū)段不是同源或互補的；并將這與第三區(qū)段連接，其中第三區(qū)段的至少一部分與第一區(qū)段基本上互補。這樣的構建體通過第一區(qū)段與第三區(qū)段的分子內堿基配對而形成莖和環(huán)結構，其中環(huán)結構形式包含第二區(qū)段。參見，例如，美國專利公開文本2002/0048814和2003/0018993；以及國際pct公開文本wo94/01550和wo98/05770?？梢岳缫噪p鏈結構諸如莖環(huán)結構(例如，發(fā)夾)形式生成dsrna分子，由此通過共表達靶基因的片段(例如在另外的植物表達盒上的靶基因的片段)增強靶向天然鞘翅目和/或半翅目害蟲序列的sirna的產生，這可導致sirna產生增強，或者降低甲基化以防止dsrna發(fā)夾啟動子的轉錄基因沉默。本發(fā)明的實施方案包括將本發(fā)明的重組核酸分子導入植物中(即，轉化)以實現(xiàn)一種或多種irna分子的昆蟲(例如鞘翅目和/或半翅目)害蟲抑制水平的表達。重組dna分子可以例如是載體，如線性或閉合環(huán)狀質粒。載體系統(tǒng)可以是單一載體或質粒，或者共同含有要導入宿主基因組中的總dna的兩個或更多個載體或質粒。另外，載體可以是表達載體?？梢岳鐚⒈景l(fā)明的核酸適當?shù)夭迦胼d體中，在一種或多種宿主中發(fā)揮功能以驅動連接的編碼多核苷酸或其他dna元件表達的合適啟動子控制下。許多載體可用于此目的，適當載體的選擇主要將取決于要插入載體中的核酸的大小和要用載體轉化的特定宿主細胞。每種載體含有不同的組分，根據(jù)其功能(例如，dna擴增或dna表達)及與其相容的特定宿主細胞而定。為了對轉基因植物賦予對昆蟲(例如鞘翅目和/或半翅目)害蟲的保護，例如可以在重組植物的組織或流體內將重組dna轉錄成irna分子(例如，形成dsrna分子的rna分子)。irna分子可包含與可引起宿主植物物種損害的害蟲內的相應轉錄多核苷酸基本上同源且可特異性雜交的多核苷酸。例如，害蟲可以通過攝取包含irna分子的轉基因宿主植物的細胞或流體而接觸在轉基因宿主植物細胞中轉錄的irna分子。因此，在特定實例中，靶基因的表達在侵染轉基因宿主植物的鞘翅目和/或半翅目害蟲內受到irna分子阻抑。在一些實施方案中，對靶鞘翅目和/或半翅目害蟲中靶基因表達的阻抑可以導致植物被保護免遭害蟲攻擊。為了使irna分子能夠被投送給與已經用本發(fā)明的重組核酸分子轉化的植物細胞存在營養(yǎng)關系的害蟲，需要在植物細胞中表達(即，轉錄)irna分子。因此，重組核酸分子可以包含與一種或多種調節(jié)元件(諸如在宿主細胞中發(fā)揮功能的異源啟動子元件)可操作連接的本發(fā)明的多核苷酸，所述宿主細胞諸如其中要擴增核酸分子的細菌細胞，或其中要表達核酸分子的植物細胞。適合于用于本發(fā)明的核酸分子的啟動子包括誘導型、病毒的、合成的、或組成型的那些啟動子，它們都是本領域中熟知的。描述這樣的啟動子的非限制性實例包括美國專利6,437,217(玉米rs81啟動子)；5,641,876(水稻肌動蛋白啟動子)；6,426,446(玉米rs324啟動子)；6,429,362(玉米pr-1啟動子)；6,232,526(玉米a3啟動子)；6,177,611(組成型玉米啟動子)；5,322,938、5,352,605、5,359,142、和5,530,196(camv35s啟動子)；6,433,252(玉米l3油質蛋白啟動子)；6,429,357(水稻肌動蛋白2啟動子和稻肌動蛋白2內含子)；6,294,714(光誘導型啟動子)；6,140,078(鹽誘導型啟動子)；6,252,138(病原體誘導型啟動子)；6,175,060(磷缺乏誘導型啟動子)；6,388,170(雙向啟動子)；6,635,806(γ薏苡辛(coixin)啟動子)；及美國專利公開號2009/757,089(玉米葉綠體醛縮酶啟動子)。其他啟動子包括膽脂堿合酶(nos)啟動子(ebert等人，(1987)proc.natl.acad.sci.usa84(16):5745-9)和章魚堿合酶(ocs)啟動子(兩者都在根癌土壤桿菌的腫瘤誘導質粒上攜帶)；花椰菜花葉病毒組(caulimovirus)啟動子，如花椰菜花葉病毒(camv)19s啟動子(lawton等人，(1987)plantmol.biol.9:315-24)；camv35s啟動子(odell等人，(1985)nature313:810-2；玄參花葉病毒35s啟動子(walker等人，(1987)proc.natl.acad.sci.usa84(19):6624-8)；蔗糖合酶啟動子(yang和russell(1990)proc.natl.acad.sci.usa87:4144-8)；r基因復合物啟動子(chandler等人，(1989)plantcell1:1175-83)；葉綠素a/b結合蛋白基因啟動子；camv35s(美國專利5,322,938、5,352,605、5,359,142、和5,530,196)；fmv35s(美國專利6,051,753和5,378,619)；pclsv啟動子(美國專利5,850,019)；scp1啟動子(美國專利6,677,503)；和agrtu.nos啟動子(genbanktm登錄號v00087；depicker等人，(1982)j.mol.appl.genet.1:561-573；bevan等人，(1983)nature304:184-7)。在特定的實施方案中，本發(fā)明的核酸分子包含組織特異性啟動子，如根特異性啟動子。根特異性啟動子驅動專門或優(yōu)先在根組織中表達可操作連接的編碼多核苷酸。根特異性啟動子的實例是本領域中已知的。參見，例如，美國專利5,110,732；5,459,252和5,837,848；opperman等人，(1994)science263:221-3；和hirel等人，(1992)plantmol.biol.20:207-18。在一些實施方案中，可以在兩個根特異性啟動子之間克隆依照本發(fā)明的用于鞘翅目和/或半翅目害蟲控制的多核苷酸或片段，所述根特異性啟動子相對于所述多核苷酸或片段以相反的轉錄方向排布，在轉基因植物細胞中可操作，并且在轉基因植物細胞中表達以在轉基因植物細胞中產生rna分子，rna分子隨后可形成dsrna分子，如上文所述。昆蟲害蟲可以攝取植物組織中表達的irna分子，從而實現(xiàn)對靶基因表達的阻抑。其他可任選地與核酸可操作連接的調節(jié)元件包括5'utr，5'utr作為位于啟動子元件和編碼多核苷酸之間的翻譯前導元件發(fā)揮功能。翻譯前導元件存在于完全加工的mrna中，并且其可以影響初級轉錄物的加工和/或rna的穩(wěn)定性。翻譯前導元件的例子包括玉米和矮牽牛熱休克蛋白前導物(美國專利no.5,362,865)、植物病毒外殼蛋白前導序列、植物rubisco前導序列等。參見，例如，turner和foster(1995)molecularbiotech.3(3):225-36。5'utr的非限制性實例包括gmhsp(美國專利no.5,659,122)；phdnak(美國專利5,362,865)；atant1；tev(carrington和freed(1990)j.virol.64:1590-7)；和agrtunos(genbanktm登錄號v00087；和bevan等人，(1983)nature304:184-7)。其他任選地與核酸可操作連接的調節(jié)元件還包括3'非翻譯元件、3'轉錄終止區(qū)、或多腺苷酸化區(qū)。這些是位于多核苷酸下游的遺傳元件，并且包括提供多腺苷酸化信號的多核苷酸、和/或能夠影響轉錄或mrna加工的其他調節(jié)信號。多腺苷酸化信號在植物中發(fā)揮功能，導致多腺苷酸化的核苷酸被添加至mrna前體的3'端。多腺苷酸化元件可以源自多種植物基因或t-dna基因。3'轉錄終止區(qū)的一個非限制性實例是膽脂堿合酶3'區(qū)(nos3'；fraley等人，(1983)proc.natl.acad.sci.usa80:4803-7)。在ingelbrecht等人，(1989)plantcell1:671-80中提供了使用不同3'非翻譯區(qū)的實例。多腺苷酸化信號的非限制性實例包括來自豌豆rbcs2基因的信號(ps.rbcs2-e9；coruzzi等人，(1984)emboj.3:1671-9)和agrtu.nos(登錄號e01312)。一些實施方案可以包括植物轉化載體，該植物轉化載體包含分離純化的dna分子，該dna分子包含與本發(fā)明的一種或多種多核苷酸可操作連接的至少一種上文描述的調節(jié)元件。在表達時，一種或多種多核苷酸生成一種或多種包含多核苷酸的irna分子，所述多核苷酸與昆蟲(例如鞘翅目和/或半翅目)害蟲中的天然rna分子的全部或部分特異性地互補。因此，多核苷酸可以包含編碼靶向的鞘翅目和/或半翅目害蟲rna轉錄物內存在的多核糖核苷酸的全部或部分的區(qū)段，并且可以包含被靶向的害蟲轉錄物的全部或部分的反向重復。植物轉化載體可以含有與超過一種靶多核苷酸特異性互補的多核苷酸，由此容許產生超過一種dsrna以抑制靶害蟲的一個或多個群體或物種的細胞中兩種或更多種基因的表達?？梢詫⑴c不同基因中存在的多核苷酸特異性互補的多核苷酸區(qū)段組合成單一復合核酸分子，以便在轉基因植物中表達。這樣的區(qū)段可以是連續(xù)的或者由間隔物分開。在一些實施方案中，可以通過在同一質粒中依次插入另外的多核苷酸來修飾已經含有本發(fā)明的至少一個多核苷酸的本發(fā)明質粒，其中所述另外的多核苷酸與原有的至少一個多核苷酸可操作連接于相同的調節(jié)元件。在一些實施方案中，核酸分子可以設計為抑制多種靶基因。在一些實施方案中，要抑制的多種基因可以獲自相同的昆蟲(例如鞘翅目和/或半翅目)害蟲物種，這樣做可以增強核酸分子的有效性。在其他實施方案中，基因可以來自不同的昆蟲害蟲，這樣可以拓寬藥劑有效的害蟲的范圍。當靶向多種基因以實現(xiàn)阻抑、或表達和阻抑的組合時，可以工程化多順反子dna元件。本發(fā)明的重組核酸分子或載體可以包含賦予轉化的細胞，諸如植物細胞可選擇表型的選擇標志物。也可以使用選擇標志物來選擇包含本發(fā)明的重組核酸分子的植物或植物細胞。標志物可以編碼殺生物劑抗性、抗生素抗性(例如，卡那霉素、遺傳霉素(g418)、博來霉素、潮霉素，等等)、或除草劑耐性(例如，草甘膦等)。選擇標志物的實例包括但不限于編碼卡那霉素抗性并且可以使用卡那霉素、g418等選擇的neo基因；編碼雙丙氨磷抗性的bar基因；編碼草甘膦耐性的突變體epsp合酶基因；賦予對溴苯腈的抗性的腈水解酶基因；賦予咪唑啉酮或磺酰脲耐性的突變體乙酰乳酸合酶基因(als)；和甲氨蝶呤抗性dhfr基因?？捎枚喾N選擇標志物，其賦予對氨芐青霉素、博來霉素、氯霉素、慶大霉素、潮霉素、卡那霉素、林可霉素、甲氨蝶呤、膦絲菌素、嘌呤霉素、大觀霉素、利福平、鏈霉素和四環(huán)素等的抗性。這樣的選擇標志物的實例展示于，例如美國專利5,550,318；5,633,435；5,780,708和6,118,047。本發(fā)明的重組核酸分子或載體還可以包含可篩選標志物。可以使用可篩選標志物來監(jiān)測表達。示例性篩選標志物包括β-葡糖醛酸糖苷酶或uida基因(gus)，其編碼已知的多種生色底物的酶(jefferson等人，(1987)plantmol.biol.rep.5:387-405)；r基因座基因，其編碼調節(jié)植物組織中花色素苷色素(紅色)產生的產物(dellaporta等人，(1988)"molecularcloningofthemaizer-njallelebytransposontaggingwithac."收錄于18thstadlergeneticssymposium、p.gustafson和r.appels編輯，(newyork:plenum)、pp.263-82)；β-內酰胺酶基因(sutcliffe等人，(1978)proc.natl.acad.sci.usa75:3737-41)；編碼已知多種生色底物的酶(例如，padac，一種生色頭孢菌素)的基因；螢光素酶基因(ow等人，(1986)science234:856-9)；xyle基因,其編碼能轉化生色兒茶酚的兒茶酚雙加氧酶(zukowski等人，(1983)gene46(2-3):247-55)；淀粉酶基因(ikatu等人，(1990)bio/technol.8:241-2)；酪氨酸酶基因，其編碼能夠將酪氨酸氧化為dopa和多巴醌(dopaquinone)(其繼而縮合成黑色素)的酶(katz等人，(1983)j.gen.microbiol.129:2703-14))；和α-半乳糖苷酶。在一些實施方案中，在用于創(chuàng)建轉基因植物和在植物中表達異源核酸的方法中，可以使用如上文所描述的重組核酸分子來制備表現(xiàn)出對昆蟲(例如鞘翅目和/或半翅目)害蟲的易感性降低的轉基因植物。例如，可以通過將編碼irna分子的核酸分子插入植物轉化載體中，并將這些導入植物中來制備植物轉化載體。用于宿主細胞轉化的適合方法包括任何能將dna導入細胞中的方法，如通過原生質體轉化(參見，例如，美國專利5,508,184)，通過干燥/抑制介導的dna攝取(參見，例如，potrykus等人.(1985)mol.gen.genet.199:183-8)，通過電穿孔(參見，例如，美國專利5,384,253)，通過用碳化硅纖維攪拌(參見，例如，美國專利5,302,523和5,464,765)，通過土壤桿菌介導的轉化(參見，例如，美國專利5,563,055；5,591,616；5,693,512；5,824,877；5,981,840；和6,384,301)，以及通過加速dna包被的顆粒(參見，例如，美國專利5,015,580、5,550,318、5,538,880、6,160,208、6,399,861、和6,403,865)，等。特別可用于轉化玉米的技術描述于例如美國專利7,060,876和5,591,616；以及國際pct公布wo95/06722中。通過應用諸如此類的這些技術，幾乎任何物種的細胞都可被穩(wěn)定轉化。在一些實施方案中，轉化dna被整合到宿主細胞的基因組中。在多細胞物種的情況下，轉基因細胞可再生為轉基因生物?？梢允褂萌魏芜@些技術來產生轉基因植物，例如在轉基因植物的基因組中包含編碼一種或多種irna分子的一種或多種核酸。用于將表達載體導入植物中的廣泛使用的方法是基于土壤桿菌的天然轉化系統(tǒng)。根癌土壤桿菌和發(fā)根土壤桿菌是將植物細胞遺傳轉化的植物致病性土壤細菌。根癌土壤桿菌和發(fā)根土壤桿菌的ti和ri質粒分別攜帶負責植物遺傳轉化的基因。ti(誘導腫瘤)-質粒含有被稱為t-dna的大片段，其被轉移到轉化的植物中。ti質粒的另一個片段，vir區(qū)，負責t-dna的轉移。t-dna區(qū)的邊界為末端重復序列。在修飾的二元載體中，腫瘤誘導基因已缺失，vir區(qū)的功能用于轉移以t-dna邊界元件為界的外來dna。t區(qū)還可含有用于轉基因細胞和植物有效恢復的選擇標志物、以及插入用于轉移諸如編碼核酸的dsrna之類多核苷酸的多克隆位點。因此，在一些實施方案中，植物轉化載體來源于根癌土壤桿菌的ti質粒(參見，例如，美國專利4,536,475、4,693,977、4,886,937、和5,501,967；以及歐洲專利no.ep0122791)或發(fā)根土壤桿菌的ri質粒。其他的植物轉化載體包括，例如但不限于，由herrera-estrella等人，(1983)nature303:209-13；bevan等人，(1983)nature304:184-7；klee等人，(1985)bio/technol.3:637-42；以及在歐洲專利no.ep0120516中所描述的那些載體，以及從任何前述文獻來源的那些載體。可以修飾天然地與植物相互作用的其他細菌，如中華根瘤菌屬、根瘤菌屬、和中慢生根瘤菌屬，以介導到許多各種各樣的植物中的基因轉移。通過獲取卸甲ti質粒和適合的二元載體，可以使這些植物相關的共生細菌能夠勝任基因轉移。在提供外源dna到受體細胞的遞送之后，通常鑒定出轉化的細胞用于進一步培養(yǎng)和植物再生。為了提高鑒定轉化細胞的能力，人們可能期望采用如前提出的選擇或篩選標志物基因，與用來再生轉化體的轉化載體一道使用。在采用選擇標志物的情況下，通過使細胞暴露于選擇劑或藥劑，鑒定出在潛在轉化的細胞群中的轉化細胞。在采用篩選標志物的情況下，可針對期望的標志物基因性狀來篩選細胞。暴露于選擇劑后存活的細胞、或者在篩選測定中已被評分為陽性的細胞，可以在支持植物再生的介質中進行培養(yǎng)。在一些實施方案中，可通過包含其他物質，如生長調節(jié)劑來改良任何適合的植物組織培養(yǎng)基(例如，ms和n6培養(yǎng)基)?？蓪⒔M織維持在具有生長調節(jié)劑的基本培養(yǎng)基上，直到可得到足夠的組織用于啟動植物再生工作時為止，或者在重復多輪的手動選擇之后，直到組織形態(tài)適合于再生時為止(例如，至少2周)，然后轉移到有助于芽形成的介質中。定期轉移培養(yǎng)物，直到已經出現(xiàn)充分的芽形成時為止。一旦形成芽，將它們轉移到有助于根形成的介質中。一旦形成足夠的根，可將植物轉移到土壤中，以便進一步生長和成熟。為了證實再生植物中感興趣核酸分子(例如，編碼一種或多種irna分子的dna，所述irna分子抑制鞘翅目和/或半翅目害蟲中的靶基因表達)的存在，可以進行多種測定法。這樣的測定法例如包括：分子生物學測定，如southern和northern印跡、pcr、和核酸測序；生物化學測定，如檢測蛋白質產物的存在，例如通過免疫學手段(elisa和/或western印跡)或借助于酶功能；植物部分測定，如葉或根測定；和再生的全植物的表型分析?？衫缤ㄟ^使用對感興趣核酸分子特異的寡核苷酸引物進行pcr擴增來分析整合事件。pcr基因分型應當理解為包括但不限于，來源于分離的宿主植物愈傷組織的gdna的聚合酶鏈反應(pcr)擴增，所述愈傷組織預期含有整合到基因組中的感興趣核酸分子，然后進行標準克隆和pcr擴增產物的序列分析。pcr基因分型方法已被很好地描述(例如rios、g等人，(2002)plantj.32:243-53)，并可應用于來源于任何植物物種(例如，玉米或大豆)或組織類型(包括細胞培養(yǎng)物)的gdna。采用依賴于土壤桿菌的轉化方法形成的轉基因植物一般含有插入一個染色體中的單個重組dna。該單個重組dna的多核苷酸被稱為“轉基因事件”或“整合事件”。這樣的轉基因植物對于插入的外源多核苷酸而言是雜合的。在一些實施方案中，通過含有單個外源基因的獨立分離的轉基因植物與自身(例如t0植物)有性交配(自交)以產生tl種子，可獲得相對于轉基因為純合的轉基因植物。所產生的tl種子的四分之一相對于所述轉基因是純合的。萌發(fā)tl種子產生的植物可用于測試雜合性，所述測試一般使用snp測定或熱擴增測定，使得允許在雜合子和純合子之間進行區(qū)分(即，接合型測定)。在特定的實施方案中，在植物細胞中產生具有昆蟲(例如鞘翅目和/或半翅目)害蟲-抑制效果的至少2、3、4、5、6、7、8、9種或10種或更多種不同irna分子?？梢詮囊氩煌D化事件中的多種核酸、或從引入單一轉化事件中的單一核酸表達irna分子(例如，dsrna分子)。在一些實施方案中，在單一啟動子的控制下表達多個irna分子。在其他實施方案中，在多個啟動子的控制下表達多個irna分子?？梢员磉_包含多個多核苷酸的單一irna分子，所述多核苷酸各自與在相同昆蟲害蟲物種的不同群體中或在不同的昆蟲害蟲物種中的一個或多個昆蟲害蟲內的不同基因座(例如由seqidno:1或seqidno:84定義的基因座)同源。除了用重組核酸分子直接轉化植物之外，可通過使具有至少一個轉基因事件的第一植物與缺乏這種事件的第二植物雜交來制造轉基因植物。例如，可將包含編碼irna分子的多核苷酸的重組核酸分子導入易于轉化的第一植物品系中而產生轉基因植物，其中轉基因植物可與第二植物品系雜交而使編碼irna分子的多核苷酸滲入到第二植物品系中。在一些方面，包括由自轉化的植物細胞衍生的轉基因植物產生的種子和商業(yè)產品，其中種子或商業(yè)產品包含可檢出量的本發(fā)明的核酸。在一些實施方案中，例如，可以通過獲得轉基因植物并從它們制備食物或飼料來生產這樣的商業(yè)產品。包含本發(fā)明的一種或多種多核苷酸的商業(yè)產品包括例如但不限于：植物的粕、油類、碾碎的或完整的籽?；蚍N子，和包含含有本發(fā)明的一種或多種核酸的重組植物或種子的任何粕、油、或碾碎的或完整的籽粒的任何食物產品。在一種或多種商品或商業(yè)產品中的檢出本發(fā)明的一種或多種核酸，事實上證明該商品或商業(yè)產品是由為了控制昆蟲(例如鞘翅目和/或半翅目)害蟲的目的，設計為表達本發(fā)明的一種或多種irna分子的轉基因植物生產的。在一些實施方案中，包含本發(fā)明的核酸分子的轉基因植物或種子也可在其基因組中包含至少一個其他的轉基因事件，包括但不限于：自其轉錄靶向昆蟲害蟲中與由seqidno:1或seqidno:84定義者不同的基因座的irna分子的轉基因事件，所述不同的基因座舉例而言可為選自下組的一個或多個基因座：caf1-180(美國專利申請公開號2012/0174258)、vatpasec(美國專利申請公開號2012/0174259)、rho1(美國專利申請公開號2012/0174260)、vatpaseh(美國專利申請公開號2012/0198586)、ppi-87b(美國專利申請公開號2013/0091600)、rpa70(美國專利申請公開號2013/0091601)、和rps6(美國專利申請公開號2013/0097730)；自其轉錄靶向與鞘翅目和/或半翅目害蟲不同的生物(例如，植物寄生性線蟲)中的基因的irna分子的轉基因事件；編碼殺蟲蛋白(例如，蘇云金芽孢桿菌、產堿桿菌屬(例如美國專利申請公開號2014/0033361)、或假單胞菌屬(例如pct申請公開號wo2015038734)殺蟲蛋白)的基因；除草劑耐性基因(例如提供對草甘膦耐性的基因)；以及促成轉基因植物中的期望表型的基因，所述期望表型例如產量增加、脂肪酸代謝改變、或細胞質雄性不育的恢復。在特定的實施方案中，可以在植物中將編碼本發(fā)明irna分子的多核苷酸與其他昆蟲控制和疾病性狀組合以實現(xiàn)增強的植物疾病和昆蟲損害的期望性狀。例如，由于對所述性狀的抗性的概率在田間將發(fā)生降低，組合采用獨特作用模式的昆蟲控制性狀可以對受保護的轉基因植物提供優(yōu)越的持久性，該持久性優(yōu)于含有單一控制性狀的植物。v.鞘翅目和/或半翅目害蟲中的靶基因阻抑a.概述在本發(fā)明的一些實施方案中，可以對鞘翅目和/或半翅目害蟲提供至少一種可用于控制鞘翅目和/或半翅目害蟲的核酸分子，其中所述核酸分子在害蟲中導致rnai介導的基因沉默。在特定的實施方案中，可以對鞘翅目和/或半翅目宿主提供irna分子(例如，dsrna、mirna、sirna、shrna、和hprna)。在一些實施方案中，可以通過使核酸分子與害蟲接觸來對害蟲提供可用于控制鞘翅目和/或半翅目害蟲的核酸分子。在這些和另外的實施方案中，可以在害蟲的進食基質，例如營養(yǎng)組合物中提供可用于控制鞘翅目和/或半翅目害蟲的核酸分子。在這些和另外的實施方案中，可以通過攝取被害蟲攝取的包含核酸分子的植物材料來提供可用于控制鞘翅目和/或半翅目害蟲的核酸分子。在某些實施方案中，核酸分子通過表達導入植物材料中的重組核酸而存在于植物材料中，所述導入例如通過用包含重組核酸的載體轉化植物細胞，并從轉化的植物細胞再生植物材料或全植物來進行。b.rna介導的靶基因阻抑在實施方案中，本發(fā)明提供了irna分子(例如，dsrna、mirna、sirna、shrna、和hprna)，可以設計此類分子使之靶向昆蟲害蟲(例如，鞘翅目(例如wcr或ncr)或半翅目(例如bsb)害蟲)的轉錄組中的必需天然多核苷酸(例如，必需基因)，例如設計有至少一條鏈包含與靶多核苷酸特異性互補的多核苷酸的irna分子。如此設計的irna分子的序列可以與靶多核苷酸相同，或者可以含有不會阻止irna分子與其靶多核苷酸之間的特異性雜交的錯配。本發(fā)明的irna分子可以在用于昆蟲(例如鞘翅目和/或半翅目)害蟲中基因阻抑的方法中使用，由此降低由害蟲對植物(例如，包含irna分子的受保護的轉化植物)引起的損害水平或發(fā)生率。如本文中使用的，術語“基因阻抑”是指用于降低由于基因轉錄成mrna及隨后mrna翻譯而產生的蛋白質水平，包括降低基因或編碼多核苷酸的蛋白質表達，包括任何公知的轉錄后抑制表達和轉錄阻抑表達的方法。通過從靶向阻抑的基因轉錄的mrna的全部或部分與用于阻抑的相應irna分子之間的特異性同源性而介導轉錄后抑制。另外，轉錄后抑制是指通過核糖體結合的細胞中可用的mrna量的實質性且可測量的降低。在其中rnai分子是dsrna分子的實施方案中，切丁酶這種酶可以將dsrna分子切割成短sirna分子(大約20個核苷酸長)。借助于切丁酶對dsrna分子的活性而生成的雙鏈sirna分子可以分成兩個單鏈sirna：“乘客鏈”和“引導鏈”。乘客鏈可以被降解，而引導鏈可以摻入risc中。通過引導鏈與mrna分子的特異性互補多核苷酸的特異性雜交，隨后通過酶argonaute(risc復合物的催化組分)切割而發(fā)生轉錄后抑制。在本發(fā)明的實施方案中，可以使用任何形式的irna分子。本領域技術人員會理解的是，在制備過程中及在對細胞提供irna分子的步驟過程中，dsrna分子一般比單鏈rna分子更穩(wěn)定，并且一般在細胞中也是更穩(wěn)定的。因此，例如，雖然在一些實施方案中sirna和mirna分子可能是同等有效的，但是dsrna分子可以由于其穩(wěn)定性而被選用。在特定的實施方案中，提供了包含多核苷酸的核酸分子，所述多核苷酸可以在體外表達以產生irna分子，所述irna分子與由昆蟲(例如鞘翅目和/或半翅目)害蟲基因組內的多核苷酸編碼的核酸分子基本上同源。在某些實施方案中，體外轉錄的irna分子可以是包含莖環(huán)結構的穩(wěn)定化的dsrna分子。在昆蟲害蟲接觸體外轉錄的irna分子后，可以發(fā)生對該昆蟲害蟲中靶基因(例如，必需基因)的轉錄后抑制。在本發(fā)明的一些實施方案中，在用于對昆蟲(例如鞘翅目和/或半翅目)害蟲中靶基因的轉錄后抑制的方法中利用包含多核苷酸的至少15個連續(xù)核苷酸(例如至少19個連續(xù)核苷酸)的核酸分子的表達，其中所述多核苷酸選自下組：seqidno:1；seqidno:1的互補物；seqidno:1的至少15個連續(xù)核苷酸的片段；seqidno:1的至少15個連續(xù)核苷酸的片段的互補物；葉甲屬生物的包含seqidno:1的天然編碼多核苷酸；自葉甲屬生物的包含seqidno:1的天然編碼多核苷酸表達的rna的互補物；自葉甲屬生物的包含seqidno:1的天然編碼多核苷酸表達的rna；自葉甲屬生物的包含seqidno:1的天然編碼多核苷酸表達的rna的互補物；自葉甲屬生物的轉錄為包含seqidno:1的天然rna分子的天然非編碼序列表達的rna的互補物；葉甲屬生物(例如wcr)的包含seqidno:1的天然編碼序列的至少15個連續(xù)核苷酸的片段；葉甲屬生物的包含seqidno:1的天然編碼序列的至少15個連續(xù)核苷酸的片段的互補物；葉甲屬生物的轉錄為包含seqidno:1的天然rna分子的天然非編碼序列的至少15個連續(xù)核苷酸的片段；和葉甲屬生物的轉錄為包含seqidno:1的天然rna分子的天然非編碼序列的至少15個連續(xù)核苷酸的片段的互補物。在某些實施方案中，可以使用與前述任一項至少約80％相同(例如，79％，約80％、約81％、約82％、約83％、約84％、約85％、約86％、約87％、約88％、約89％、約90％、約91％、約92％、約93％、約94％、約95％、約96％、約97％、約98％、約99％、約100％、和100％)的核酸分子的表達。在這些實施方案和進一步的實施方案中，可以表達這樣的核酸分子，其與昆蟲(例如鞘翅目和/或半翅目)害蟲的至少一個細胞中存在的rna分子特異性雜交。在本發(fā)明的特定實施方案中，在用于轉錄后抑制鞘翅目害蟲中的靶基因的方法中可以利用包含核苷酸序列的至少15個連續(xù)核苷酸的核酸分子的表達，其中所述核苷酸序列選自下組：seqidno:1；seqidno:1的互補物；seqidno:1的至少15個連續(xù)核苷酸的片段；seqidno:1的至少15個連續(xù)核苷酸的片段的互補物；葉甲屬生物(例如wcr)的包含seqidno:1的天然編碼序列；葉甲屬生物(例如wcr)的包含seqidno:1的天然編碼序列的互補物；葉甲屬生物的轉錄為包含seqidno:1的天然rna分子的天然非編碼序列；葉甲屬生物的轉錄為包含seqidno:1的天然rna分子的天然非編碼序列的互補物；葉甲屬生物(例如wcr)的包含seqidno:1的天然編碼序列的至少15個連續(xù)核苷酸的片段；葉甲屬生物的包含seqidno:1的天然編碼序列的至少15個連續(xù)核苷酸的片段的互補物；葉甲屬生物的轉錄為包含seqidno:1的天然rna分子的天然非編碼序列的至少15個連續(xù)核苷酸的片段；和葉甲屬生物的轉錄為包含seqidno:1的天然rna分子的天然非編碼序列的至少15個連續(xù)核苷酸的片段的互補物。在某些實施方案中，可以使用與前述任一項至少約80％相同(例如，80％、約81％、約82％、約83％、約84％、約85％、約86％、約87％、約88％、約89％、約90％、約91％、約92％、約93％、約94％、約95％、約96％、約97％、約98％、約99％、約100％、和100％)的核酸分子的表達。在這些實施方案和進一步的實施方案中，可以表達這樣的核酸分子，其與鞘翅目害蟲的至少一個細胞中存在的rna分子特異性雜交。在具體的實例中，這樣的核酸分子可包含包含seqidno:1的核苷酸序列。在本發(fā)明的特定實施方案中，在用于轉錄后抑制半翅目害蟲中的靶基因的方法中利用包含核苷酸序列的至少15個連續(xù)核苷酸的核酸分子的表達，其中所述核苷酸序列選自下組：seqidno:84；seqidno:84的互補物；seqidno:84的至少15個連續(xù)核苷酸的片段；seqidno:84的至少15個連續(xù)核苷酸的片段的互補物；半翅目生物的包含seqidno:84的天然編碼序列；半翅目生物的包含seqidno:84的天然編碼序列的互補物；半翅目生物的轉錄為包含seqidno:84的天然rna分子的天然非編碼序列；半翅目生物的轉錄為包含seqidno:84的天然rna分子的天然非編碼序列的互補物；半翅目生物的轉錄為包含seqidno:84的天然rna分子的天然非編碼序列的互補物；半翅目生物的包含seqidno:84的天然編碼序列至少15個連續(xù)核苷酸的片段；半翅目生物的包含seqidno:84的天然編碼序列至少15個連續(xù)核苷酸的片段的互補物；半翅目生物的轉錄為包含seqidno:84的天然rna分子的天然非編碼序列的至少15個連續(xù)核苷酸的片段；和半翅目生物的轉錄為包含seqidno:84的天然rna分子的天然非編碼序列的至少15個連續(xù)核苷酸的片段的互補物。在特定實施方案中，在某些實施方案中，可以使用與前述任一項至少約80％相同(例如，80％、約81％、約82％、約83％、約84％、約85％、約86％、約87％、約88％、約89％、約90％、約91％、約92％、約93％、約94％、約95％、約96％、約97％、約98％、約99％、約100％、和100％)的核酸分子的表達。在這些實施方案和進一步的實施方案中，可以表達這樣的核酸分子，其與半翅目害蟲的至少一個細胞中存在的rna分子特異性雜交。在具體的實例中，這樣的核酸分子可包含包含seqidno:84的核苷酸序列。本發(fā)明的一些實施方案的重要特征在于，rnai轉錄后抑制系統(tǒng)能夠容忍靶基因中預期由于遺傳突變、株系多態(tài)性、或進化趨異而可能發(fā)生的序列變異。導入的核酸分子可以不必與靶基因的初級轉錄產物或完全加工的mrna絕對同源，只要導入的核酸分子與靶基因的初級轉錄產物或完全加工的mrna可特異性雜交即可。而且，相對于靶基因的初級轉錄產物或完全加工的mrna，導入的核酸分子可以不必是全長的。使用本文的irna技術抑制靶基因是序列特異性的；即，靶向與irna分子基本上同源的多核苷酸進行遺傳抑制。在一些實施方案中，可以使用包含具有與靶基因的一部分相同的核苷酸序列的多核苷酸的rna分子進行抑制。在這些和另外的實施方案中，可以使用包含相對于靶多核苷酸具有一個或多個插入、缺失和/或點突變的多核苷酸的rna分子。在特定的實施方案中，irna分子和靶基因的一部分可以共享例如至少約80％、至少約81％、至少約82％、至少約83％、至少約84％、至少約85％、至少約86％、至少約87％、至少約88％、至少約89％、至少約90％、至少約91％、至少約92％、至少約93％、至少約94％、至少約95％、至少約96％、至少約97％、至少約98％、至少約99％、至少約100％、和100％的序列同一性。或者，dsrna分子的雙鏈體區(qū)可以與靶基因轉錄物的一部分可特異性地雜交。在可特異性雜交的分子中，展現(xiàn)出較大同源性的小于全長的多核苷酸可補償較長的、同源性較低的多核苷酸。dsrna分子的雙鏈體區(qū)中與靶基因轉錄物的一部分相同的多核苷酸的長度可以是至少約15、25、50、100、200、300、400、500個、或至少約1000個堿基。在一些實施方案中，可以使用大于20個到100個核苷酸的多核苷酸。在特定的實施方案中，可以使用大于約200個到300個核苷酸的多核苷酸。在特定的實施方案中，根據(jù)靶基因的大小，可以使用大于約500個到1000個核苷酸的多核苷酸。在某些實施方案中，可以將害蟲(例如鞘翅目或半翅目害蟲)中靶基因的表達在害蟲細胞內抑制至少10％；至少33％；至少50％；或至少80％，使得發(fā)生顯著抑制。顯著抑制是指高于閾值的抑制，所述抑制導致可檢出的表型(例如，生長停止、進食停止、發(fā)育停止、和誘導性死亡，等等)，或與所抑制的靶基因對應的rna和/或基因產物的可檢出降低。雖然在本發(fā)明的某些實施方案中，在害蟲的基本上所有細胞中均發(fā)生抑制，但在其他實施方案中，僅在表達靶基因的細胞的一個子集中發(fā)生抑制。在一些實施方案中，細胞中的轉錄阻抑由細胞中展現(xiàn)出與啟動子dna或其互補物的實質性序列同一性的dsrna分子的存在所介導，從而產生所謂的“啟動子反式阻抑”。基因阻抑可以在可以攝取或接觸此類dsrna分子的昆蟲害蟲中針對靶基因發(fā)揮效果，例如通過害蟲攝取或接觸含有dsrna分子的植物材料。在啟動子反式阻抑中使用的dsrna分子可以特異性地設計為抑制或阻抑昆蟲害蟲細胞中一種或多種同源或互補多核苷酸的表達。美國專利5,107,065；5,759,829；5,283,184；和5,231,020中公開了通過反義或有義取向的rna進行轉錄后基因阻抑以調節(jié)植物細胞中的基因表達。c.對昆蟲害蟲提供的irna分子的表達可以許多體外或體內形式的任一種進行表達用于在昆蟲(例如鞘翅目和/或半翅目)害蟲中rnai介導的基因抑制的irna分子。然后，可以對害蟲提供irna分子，例如通過使irna分子與害蟲接觸，或通過引起害蟲攝取或以別的方式內在化irna分子。一些實施方案包括鞘翅目和/或半翅目害蟲的經轉化的宿主植物、經轉化的植物細胞、和經轉化的植物的后代。經轉化的植物細胞和經轉化的植物可以工程化改造為，例如，在異源啟動子控制下表達一種或多種irna分子，以提供害蟲保護效果。因此，當在昆蟲害蟲在進食期間食用轉基因植物或植物細胞時，害蟲可以攝取轉基因植物或細胞中表達的irna分子。也可以將本發(fā)明的多核苷酸導入廣泛而多樣的原核和真核微生物宿主中以產生irna分子。術語“微生物”包括原核和真核物種，如細菌和真菌。基因表達的調變可以包括對此類表達的部分或完全阻抑。在另一個實施方案中，用于阻抑昆蟲(例如鞘翅目和/或半翅目)害蟲中基因表達的方法包括在害蟲宿主的組織中提供基因阻抑量的至少一種如本文中所描述的多核苷酸在轉錄后形成的dsrna分子，其至少一個區(qū)段與害蟲細胞內的mrna互補。昆蟲害蟲所攝取的dsrna分子，包括其修飾的形式，如mirna、sirna、shrna、或hprna分子，可以與自copialphadna分子(例如包含選自seqidno:1或seqidno:84的多核苷酸者)轉錄的rna分子至少約80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或約100％相同。因此，提供了用于制備dsrna分子的分離的且基本上純化的核酸分子，包括但不限于非天然存在的多核苷酸和重組dna構建體，其在導入昆蟲害蟲時阻抑或抑制其中的內源編碼多核苷酸或靶編碼多核苷酸的表達。特定的實施方案提供了用于遞送irna分子以轉錄后抑制昆蟲(例如鞘翅目和/或半翅目)植物害蟲中的一種或多種靶基因并控制該植物害蟲群體的遞送系統(tǒng)。在一些實施方案中，所述遞送系統(tǒng)涉及包括對宿主轉基因植物細胞或包含在宿主細胞中轉錄的rna分子的宿主細胞內容物的攝取。在這些和另外的實施方案中，創(chuàng)建轉基因植物細胞或轉基因植物，其含有可提供本發(fā)明的穩(wěn)定化dsrna分子的重組dna構建體。包含編碼特定irna分子的核酸的轉基因植物細胞和轉基因植物可以如下產生：采用重組dna技術(這些基礎技術是本領域中熟知的)構建包含編碼本發(fā)明的irna分子(例如，穩(wěn)定化的dsrna分子)的多核苷酸的植物轉化載體；以此轉化植物細胞或植物；并以此生成含有轉錄的irna分子的轉基因植物細胞或轉基因植物。為了對轉基因植物賦予針對昆蟲(例如鞘翅目和/或半翅目)害蟲的保護，可以例如將重組dna分子轉錄成irna分子，如dsrna分子、sirna分子、shrna分子、mirna分子、或hprna分子。在一些實施方案中，從重組dna分子轉錄的rna分子可以在重組植物的組織或流體內形成dsrna分子。這樣的dsrna分子可以包含在多核苷酸的一部分中，所述多核苷酸與可侵染宿主植物的類型的昆蟲害蟲內的dna轉錄的相應多核苷酸相同。害蟲內靶基因的表達被所述dsrna分子所阻抑，并且該害蟲中靶基因表達的阻抑導致該轉基因植物對該害蟲有抗性。已經顯示dsrna分子的調控作用可適用于害蟲中表達的多種基因，包括例如負責細胞代謝或細胞轉化的內源基因，包括管家基因；轉錄因子；蛻皮相關基因；和編碼涉及細胞代謝或正常生長和發(fā)育的多肽的其他基因。為了從體內轉基因或表達構建體轉錄，可以在一些實施方案中使用調節(jié)區(qū)(例如，啟動子、增強子、沉默子、和多聚腺苷酸化信號)以轉錄一條或多條rna鏈。因此，在一些實施方案中，如上文提出的，在產生irna分子中使用的多核苷酸可以與在植物宿主細胞中有功能的一種或多種啟動子元件可操作連接。啟動子可以是通常駐留于宿主基因組中的內源啟動子。在可操作連接的啟動子元件控制下的本發(fā)明的多核苷酸可以進一步被其他有利地影響其轉錄和/或所得轉錄物的穩(wěn)定性的元件所側翼。這樣的元件可以位于可操作連接啟動子的上游、表達構建體3'端的下游、并且可以同時存在于啟動子的上游和表達構建體3'端的下游。一些實施方案提供了用于降低由以植物為食的昆蟲(例如鞘翅目和/或半翅目)害蟲引起的對宿主植物(例如，玉米植物)的損害的方法，其中所述方法包括在宿主植物中提供表達本發(fā)明的至少一種核酸分子的轉化植物細胞，其中所述核酸分子在被害蟲攝取后發(fā)揮功能以抑制該害蟲內靶多核苷酸的表達，該表達抑制導致該害蟲的死亡和/或生長降低，由此降低由該害蟲引起的對宿主植物的損害。在一些實施方案中，核酸分子包含dsrna分子。在這些和另外的實施方案中，核酸分子包含dsrna分子，所述dsrna分子各自包含超過一種與鞘翅目和/或半翅目害蟲細胞中表達的核酸分子可特異性地雜交的多核苷酸。在一些實施方案中，核酸分子由一種多核苷酸組成，所述多核苷酸與昆蟲害蟲細胞中表達的核酸分子可特異性地雜交。在一些實施方案中，提供了用于提高玉米作物產量的方法，其中所述方法包括將本發(fā)明的至少一種核酸分子導入玉米植物中；栽培玉米植物以容許表達包含核酸的irna分子，其中包含所述核酸的irna分子的表達可抑制昆蟲(例如鞘翅目和/或半翅目)害蟲損害和/或生長，由此降低或消除由于害蟲侵染所致的產量損失。在一些實施方案中，irna分子是dsrna分子。在這些和另外的實施方案中，核酸分子包含dsrna分子，所述dsrna分子各自包含超過一種與昆蟲害蟲細胞中表達的核酸分子特異性可雜交的多核苷酸。在一些實例中，所述核酸分子包含與鞘翅目和/或半翅目害蟲細胞中表達的核酸分子可特異性地雜交的多核苷酸。在一些實施方案中，提供了用于調變昆蟲(例如鞘翅目和/或半翅目)害蟲中靶基因表達的方法，所述方法包括：用包含編碼本發(fā)明的至少一種irna分子的多核苷酸的載體轉化植物細胞，其中所述多核苷酸與啟動子和轉錄終止元件可操作連接；在足以容許形成包含多個轉化植物細胞的植物細胞培養(yǎng)物的條件下培養(yǎng)經轉化的植物細胞；選擇已經將核酸分子整合到其基因組中的轉化植物細胞；對轉化植物細胞篩選由整合的核酸分子編碼的irna分子的表達；選擇表達irna分子的轉基因植物細胞；并且用選擇的轉基因植物細胞喂養(yǎng)昆蟲害蟲。也可以從表達由整合的核酸分子編碼的irna分子的轉化植物細胞再生植物。在一些實施方案中，irna分子是dsrna分子。在這些和另外的實施方案中，核酸分子包含dsrna分子，所述dsrna分子各自包含超過一種與昆蟲害蟲細胞中表達的核酸分子可特異性地雜交的多核苷酸。在一些實例中，核酸分子包含與鞘翅目和/或半翅目害蟲細胞中表達的核酸分子可特異性地雜交的多核苷酸?？梢詫⒈景l(fā)明的irna分子作為來自摻入植物細胞基因組中的重組基因的表達產物、或者摻入應用于種植前種子的包衣或種子處理中而摻入植物物種(例如，玉米)的種子之內。包含重組基因的植物細胞被視為轉基因事件。本發(fā)明的實施方案中還包括用于將irna分子投送給昆蟲(例如鞘翅目和/或半翅目)害蟲的遞送系統(tǒng)。例如，可以將本發(fā)明的irna分子直接導入害蟲的細胞中。用于導入的方法可以包括將irna與來自害蟲的宿主的植物組織直接混合，以及對宿主植物組織應用包含本發(fā)明的irna分子的組合物。例如，可將irna分子噴霧到植物表面上?；蛘撸梢酝ㄟ^微生物表達irna分子，并且可以將微生物施加到植物表面上，或通過物理手段諸如注射導入根或莖中。如上文論述的，也可以對轉基因植物進行遺傳工程改造，使其以足以殺死已知侵染植物的昆蟲害蟲的量表達至少一種irna分子。通過化學或酶促合成產生的irna分子也可以以符合常見農業(yè)實踐的方式配制，并且作為噴霧產品使用以控制昆蟲害蟲所致的植物損害。配制劑可以包含有效的葉覆蓋需要的適當輔料(例如粘著劑(sticker)和濕潤劑)，以及保護irna分子(例如，dsrna分子)免于uv損傷的uv保護劑。這樣的添加劑通常在生物殺蟲劑產業(yè)中使用，并且是本領域技術人員熟知的。這樣的應用可以與其他噴霧殺蟲劑應用(基于生物學的或其他方面)組合以增強針對害蟲的植物保護。本文中所討論的所有參考文獻，包括本文引用的出版物，專利和專利申請，均通過引用并入本文，只要與本公開的明確細節(jié)不沖突，如同單獨地和具體地明示將每篇參考文獻通過引用并入本文一樣。本文所討論的參考文獻僅為其在本申請的申請日之前的公開內容而提供。本文中任何內容不應被解釋為承認發(fā)明人無權憑借在先發(fā)明而先于這些公開。提供以下實施例以展示某些具體特征和/或方面。這些實施例不應被理解為將本公開限于本文中描述的具體特征或方面。實施例實施例1昆蟲餌食生物測定樣品制備和生物測定使用rnai試劑盒合成并純化了若干dsrna分子(包括對應于copialphareg1(seqidno:3)、copialphareg2(seqidno:4)、copialphaver1(seqidno:72)、copialphaver2(seqidno:73)、copialphaver3(seqidno:74)、和copialphaver4(seqidno:75)的那些)。將純化的dsrna分子準備在te緩沖液中，并且所有生物測定均包含由該緩沖液組成的對照處理，用作wcr(玉米根螢葉甲)的死亡率或生長抑制的背景檢查。使用nanodroptm8000分光光度計(thermoscientific，wilmington，de)測量生物測定緩沖液中dsrna分子的濃度。在使用飼喂人工昆蟲餌食的新生昆蟲幼蟲的生物測定中測試樣品的昆蟲活性。wcr卵獲自cropcharacteristics，inc(farmington，mn)。生物測定在特別為昆蟲生物測定設計的128孔塑料托盤(c-dinternational，pitman，nj)中進行。每個孔含有約1.0ml設計用于鞘翅目昆蟲生長的人工餌食。通過移液管將60μl等份的dsrna樣品遞送到每個孔的餌食的表面(40μl/cm2)。dsrna樣品濃度作為孔中每平方厘米(ng/cm2)表面積(1.5cm2)的dsrna量來計算。將處理的托盤保持在通風櫥中，直到餌食表面上的液體蒸發(fā)或吸收到餌食中。在破殼后的幾個小時內，用濕潤的駱駝毛刷拾取幼蟲個體，并且將其放置在處理的餌食(每孔一個或兩個幼蟲)上。然后用透明塑料粘合片密封128孔塑料托盤上帶蟲的孔，并通氣以允許氣體交換。將生物測定盤在受控環(huán)境條件(28℃，～40％相對濕度，16:8(光照:黑暗))下保持9天，而后記錄暴露于每個樣品的昆蟲總數(shù)、死亡的昆蟲數(shù)、和存活昆蟲的重量。計算每個處理的平均百分比死亡率和平均生長抑制。生長抑制(gi)計算如下:gi＝[1-(twit/tnit)/(twibc/tnibc)]，其中twit是處理中活昆蟲的總重量；tnit是處理中的昆蟲總數(shù)；twibc是背景檢查中的活昆蟲的總重量(緩沖液對照)；和tnibc是背景檢查中的昆蟲總數(shù)(緩沖液對照)。統(tǒng)計學分析使用jmptm軟件sas、cary、nc)進行。lc50(致死濃度)定義為50％的測試昆蟲被殺死時的劑量。gi50(生長抑制)定義為試驗昆蟲的平均生長(例如活體重)為在背景檢查樣品中觀察到的平均值的50％時的劑量。重復進行的生物測定證明，特定樣品被攝取后導致了玉米根蟲幼蟲的令人驚訝且意想不到的死亡率和生長抑制。實施例2候選靶基因的鑒定選擇多個wcr(玉米根螢葉甲)發(fā)育期進行匯集的轉錄組分析，以提供通過rnai轉基因植物抗性技術控制的候選靶基因序列。在一個范例中，從約0.9gm的完整第一齡wcr幼蟲(孵化后4到5天；保持在16℃)分離總rna，并使用下述基于苯酚/tri-的方法(molecularresearchcenter、cincinnati、oh)進行純化：將幼蟲于室溫在具有10mltri的15ml勻漿器中均質化，直到獲得均勻的懸浮液時為止。在室溫溫育5分鐘后，將勻漿分配到1.5ml微量離心管中(每管1ml)，添加200μl氯仿，并將混合物強力振搖15秒。在室溫提取10分鐘之后，通過在4℃以12,000xg離心分離各個相。將上層相(包含約0.6ml)小心轉移到另一個無菌的1.5ml管中，并添加等體積的室溫異丙醇。在室溫溫育5到10分鐘之后，將混合物在12,000xg(4℃或25℃)離心8分鐘。將上清液小心取出并棄去，并將rna離心沉淀通過用75％乙醇渦旋振蕩洗滌兩次，在每次洗滌后通過在7,500xg(4℃或25℃)離心5分鐘回收。小心去除乙醇，讓離心沉淀風干3至5分鐘，然后溶解在無核酸酶的無菌水中。通過在260nm和280nm測量吸光度(a)測定rna濃度。從約0.9gm幼蟲的典型提取產生超過1mg的總rna，其中a260/a280比為1.9。如此提取的rna在80℃貯存，直到進一步處理。通過使等份跑1％瓊脂糖凝膠確定rna質量。在經高溫滅菌的容器中，使用經depc(焦碳酸二乙酯)處理的水稀釋的高溫滅菌的10xtae緩沖液(tris乙酸鹽edta；1x濃度為0.04mtris乙酸鹽，1mmedta(乙二胺四乙酸鈉鹽，ph8.0)制成瓊脂糖凝膠溶液。使用1xtae作為運行緩沖液。在使用前，用rnaseawaytm(invitrogeninc.、carlsbad、ca)清潔電泳槽和造孔梳。將2μlrna樣品與8μlte緩沖液(10mmtrishclph7.0；1mmedta)和10μlrna樣品緩沖液(目錄號70606；emd4bioscience、gibbstown、nj)混合。將樣品于70℃加熱3分鐘，冷卻至室溫，每孔上樣5μl(含有1μg到2μgrna)。將市售的rna分子量標記物在分離的孔中同時運行以進行分子大小比較。在60伏特下跑膠2小時。由服務提供商(eurofinsmwgoperon、huntsville、al)利用隨機引發(fā)從幼蟲總rna制備標準化的cdna文庫。在eurofinsmwgoperon通過gsflx454titaniumtm系列化學以1/2板的規(guī)模對標準化的幼蟲cdna文庫進行測序，其產生具有平均讀段長度348bp的超過600,000個讀段。將350,000個讀段裝配成超過50,000個重疊群。使用公眾可訪問的程序f0rmatdb(可在ncbi訪問)將未裝配的讀段和重疊群兩者都轉換成可blast的數(shù)據(jù)庫。類似地從其他wcr發(fā)育期收獲的材料制備了總rna和標準化的cdna文庫。合并代表各個發(fā)育期的cdna文庫成員，構建了用于靶基因篩選的匯集的轉錄組文庫。利用關于其他昆蟲如果蠅屬(drosophila)和擬谷盜屬(tribolium)中的致死性rnai效應的信息選擇了用于rnai靶向的候選基因。這些基因被假設為對于鞘翅目昆蟲的存活和生長是必需的。對于選定的靶基因，在轉錄物組序列數(shù)據(jù)庫中鑒定其同源物，如下文所述。通過pcr擴增靶基因的全長或部分序列來制備用于產生雙鏈rna(dsrna)的模板。使用候選蛋白質編碼多核苷酸針對含有未裝配的葉甲屬序列讀段或已裝配的重疊群的可blast數(shù)據(jù)庫進行tblastn搜索。對于與葉甲屬序列的顯著命中(定義為：對于重疊群同源性，好于e-20；對于未裝配的序列讀段同源性，好于e-10)，使用blastx針對ncbi非冗余數(shù)據(jù)庫加以確認。此blastx搜索的結果確認，在tblastn搜索中鑒定的葉甲屬同源物候選基因序列確實包含葉甲屬基因，或者是針對葉甲屬序列中存在的非葉甲屬候選基因序列的最佳命中。在大多數(shù)情況下，被注釋為編碼蛋白質的擬谷盜屬候選基因呈現(xiàn)出明確的與葉甲屬轉錄物組序列中的一種或多種序列的序列同源性。在少數(shù)情況下可明顯看出，某些基于與非葉甲屬候選基因的同源性選擇的葉甲屬重疊群或未裝配的序列讀段有重疊，而且重疊群的裝配未能連接起這些重疊。在這些情況下，使用sequenchertmv4.9(genecodescorporation、annarbor、mi)將序列裝配成更長的重疊群。一種編碼葉甲屬copialpha(seqidno:1)的候選靶基因被鑒定為可能導致鞘翅目害蟲死亡、生長抑制、發(fā)育抑制、或wcr中的生殖抑制的候選靶基因。與wcrcopialpha有同源性的基因copi指的是抑制順式高爾基體膜上出芽過程的特異性外殼蛋白復合物(nickel,etal.2002.journalofcellscience115、3235-3240)。copi外被體復合物由七個亞單位組成。copi外被體alpha是這些亞單位之一。該復合物的功能是將囊泡從高爾基復合體的順式末端轉移回到粗糙內質網——這些囊泡原來被合成之處。其它同樣含有該結構域的玉米根螢葉甲蛋白可能有共同的結構和/或功能性質，因此編碼這些蛋白質之一的基因可能包括了可能導致鞘翅目害蟲死亡、生長抑制、發(fā)育抑制、或抑制wcr中的繁殖的候選靶基因。seqidno:1和seqidno:87的序列是新的。該序列未提供在公共數(shù)據(jù)庫中，并且沒有在wo/2011/025860；美國專利申請?zhí)?0070124836；美國專利申請?zhí)?0090306189；美國專利申請?zhí)杣s20070050860；美國專利申請no.20100192265；或美國專利no.7,612,194中公開。葉甲屬copialpha序列(seqidno:1)與來自赤擬谷盜(triboliumcasetanum)的一個序列(genbank登錄號xm_962379.2)的某個片段有一定相關。葉甲屬copialpha氨基酸序列(seqidno:2)的最接近的同系物是具有genbank登錄號xp_967472.1的金龜子(triboliumcasetanum)蛋白(90％相似；在同源區(qū)域上81％相同)。copialphadsrna轉基因可與其他dsrna分子組合以提供冗余的rnai靶向和協(xié)同的rnai效應。表達靶向copialpha的dsrna的轉基因玉米事件用于防止玉米根蟲引起的噬根性損害(rootfeedingdamage)。copialphadsrna轉基因提供了新的作用模式，可以用來與蘇云金芽孢桿菌、產堿桿菌屬、或假單胞菌屬殺蟲蛋白技術在昆蟲抗性管理基因疊加(insectresistancemanagementgenepyramid)中組合，以減緩根蟲群體對這兩種根蟲控制技術中的任一者發(fā)展抗性。利用該葉甲屬候選基因，本文中稱為copialpha，的序列的全長或部分克隆來生成用于dsrna合成的pcr擴增子。seqidno:1顯示葉甲屬copialpha的4037bpdna序列。seqidno:3顯示copialphareg1的400bpdna序列。seqidno:72顯示copialphaver1的123bpdna序列。seqidno:73顯示copialphaver2的120bpdna序列。seqidno:74顯示copialphaver3的107bpdna序列。seqidno:75顯示copialphaver4的110bpdna序列。實施例3擴增靶基因以產生dsrna設計引物來通過pcr擴增每個靶基因的編碼區(qū)部分。參見表1。在適當?shù)那闆r下，將t7噬菌體啟動子元件(ttaatacgactcactatagggaga；seqidno:5)引入擴增的有義或反義鏈的5'端。參見表1。從wcr提取總dna，并使用相反向的引物，使用第一鏈cdna作為模板進行pcr反應，引物的位置可擴增天然靶基因序列的全部或部分。還從包含黃色熒光蛋白(yfp)(seqidno:6；shagin等人，(2004)mol.biol.evol.21(5):841-50)編碼區(qū)的dna克隆擴增了dsrna。表1.用于擴增示例性copialpha靶基因和yfp陰性對照基因的編碼區(qū)部分的引物和引物對實施例4rnai構建體通過pcr制備模板和dsrna合成。圖1中顯示了一種提供特異性模板用于產生copialpha和yfpdsrna的策略。使用表1中的引物對、以及從分離自wcr第一齡幼蟲的總rna制備的第一鏈cdna(作為pcr模板)，制備了準備在copialphadsrna合成中使用的模板dna。對于每個選定的gho/sec24b2、sec24b1和yfp靶基因區(qū)，pcr擴增在擴增的有義和反義鏈的5'端導入了一個t7啟動子元件(yfp區(qū)段擴增自yfp編碼區(qū)的dna克隆)。將給定基因的每個區(qū)域的在有義鏈和反義鏈5’末端均具有t7啟動子序列的pcr產物用來產生dsrna。見圖1。被特定引物對擴增的dsrna模板序列是:seqidno:3(copialphareg1)、seqidno:4(copialphareg2)、copialphaver1(seqidno:72)、copialphaver2(seqidno:73)、copialphaver3(seqidno:74)、copialphaver4(seqidno:75)、和yfp(seqidno:6)。合成用于昆蟲生物測定的雙鏈rna，并使用rnai試劑盒遵循制造商的說明書(invitrogen)進行純化。使用nanodroptm8000分光光度計(thermoscientific、wilmington、de)測量dsrna的濃度。植物轉化載體的構建使用化學合成的片段(dna2.0、menlopark、ca)的組合以及標準分子克隆方法，組裝包含具有copialpha(seqidno:1)的區(qū)段的用于發(fā)夾形成的靶基因構建體的入門載體(pdab117217和pdab117218)。通過(在單一轉錄單位內)安排兩個拷貝的copialpha靶基因序列的區(qū)段彼此相反取向來易化rna初級轉錄物形成分子內發(fā)夾，其中兩個區(qū)段相隔一個st-ls1內含子序列(seqidno:14，vancanneyt等人，(1990)mol.gen.genet.220(2):245-50)。因此，初級mrna轉錄物含有被內含子序列分開的兩個copialpha基因區(qū)段，其中兩個區(qū)段互為大的反向重復序列。用一個拷貝玉米泛素1啟動子(美國專利5,510,474)來驅動初級mrna發(fā)夾轉錄物的產生，并用包含玉米過氧化物酶5基因的(zmper53'utrv2；美國專利號6,699,984)的3'非翻譯區(qū)的片段來終止表達發(fā)夾rna的基因的轉錄。入門載體pdab117211包含copialpha發(fā)夾v3rna構建體(seqidno:11)，其含有copialpha(seqidno:1)的一個區(qū)段。入門載體pdab117212包含copialpha發(fā)夾v4-rna構建體(seqidno:12)，其含有不同于pdab117211中所見的copialpha(seqidno:1)區(qū)段。使用上述入門載體pdab117211和pdab117212與典型的二元目標載體(pdab109805)進行標準重組反應，分別產生了用于土壤桿菌介導的玉米胚轉化的copialpha發(fā)夾rna表達轉化載體(分別為pdab114515和pdab115770)。通過典型的二元目標載體(pdab109805)與入門載體pdab101670的標準重組反應，構建包含表達yfp發(fā)夾dsrna的基因的陰性對照二元載體pdab110853。入門載體pdab101670包含處于玉米泛素1啟動子(如上文)的表達控制之下的yfp發(fā)夾序列(seqidno:13)和包含來自玉米過氧化物酶5基因(如上文)的3'非翻譯區(qū)的片段。二元目標載體pdab109805包含處于甘蔗桿狀dna病毒(scbv)啟動子(schenk等人，(1999)plantmolec.biol.39:1221-30)的調節(jié)之下的除草劑抗性基因(芳氧基鏈烷酸酯雙加氧酶；aad-1v3)(美國專利7838733(b2)和wrightetal.(2010)proc.natl.acad.sci.u.s.a.107:20240-5)。一段人造5’utr序列，其由來自玉米條紋病毒(msv)外殼蛋白基因5’utr以及來自玉米醇脫氫酶1(adh1)基因的內含子6組成，定位在上述scbv啟動子區(qū)段的3’末端和aad-1編碼區(qū)的起始密碼子之間。利用一個包含玉米脂肪酶基因的3'非翻譯區(qū)(zmlip3'utr；美國專利號7,179,902)的片段來終止aad-1mrna的轉錄。通過典型的二元目標載體(pdab9989)與入門載體pdab100287的標準重組反應，構建了另一個包含表達yfp蛋白的基因的陰性對照二元載體pdab101556。二元目標載體pdab9989包含處于玉米泛素1啟動子(如上文)的表達調節(jié)之下的除草劑抗性基因(芳氧基鏈烷酸酯雙加氧酶；aad-1v3)(如上文)和一個包含來自玉米脂肪酶基因的3'非翻譯區(qū)(zmlip3'utr；如上文)的片段。入門載體pdab100287包含處于玉米泛素1啟動子(如上文)的表達控制之下的yfp編碼區(qū)(seqidno:15)和一個包含來自玉米過氧化物酶5基因(如上文)的3'非翻譯區(qū)的片段。seqidno:11呈現(xiàn)如pdab117217中所見的copialpha發(fā)夾v3形成序列。seqidno:12呈現(xiàn)如pdab117218中所見的copialpha發(fā)夾v4形成序列。實施例5候選靶基因的篩選在基于餌食的測定中，當將設計為抑制實施例2中鑒定的靶基因序列的合成dsrna給予至wcr時，引起了死亡和生長抑制。觀察到copialphareg1、copialphareg2、copialphaver1、copialphaver2、copialphaver3、andcopialphaver4在此測定中相比于其他被篩選的dsrna顯示出大大增加的功效。重復的生物測定證明，對分別來源于copialphareg1、copialphareg2、copialphaver1、copialphaver2、copialphaver3和copialphaver4的dsrna制備物的攝取導致西方玉米根蟲幼蟲的死亡和/或生長抑制。表2和表3顯示了在wcr幼蟲暴露于這些dsrna9天之后的基于餌食的飼喂生物測定的結果，以及從黃色熒光蛋白(yfp)編碼區(qū)(seqidno:6)制備的dsrna的陰性對照樣品獲得的結果。表2.利用西方玉米根蟲幼蟲進食9天之后獲得的copialphadsrna餌食進食測定的結果。anova分析發(fā)現(xiàn)在平均百分比死亡率和平均生長抑制(gi)上的顯著差異。使用tukey--kramer檢驗分離平均值。*sem＝均值標準誤。刮弧中的字母指明統(tǒng)計水平。不是由相同字母連接的水平是顯著不同的(p<0.05)。**te＝trishcl(1mm)加edta(1mm)緩沖液，ph7.2。***yfp＝黃色熒光蛋白表3.copialphadsrna對wcr幼蟲的口服效力(ng/cm2)的總結。以前有人提出，某些葉甲屬物種基因可以用于rnai介導的昆蟲控制。參見美國專利公開號2007/0124836，其公開了906個序列，以及美國專利7,612,194，其公開了9,112個序列。然而確定了，許多被提示對rnai介導的昆蟲控制基因對控制葉甲屬無效。還確定了，與表明其他對于rnai介導的昆蟲控制有用的基因相比，序列copialphareg1、copialphareg2、copialphaver1、copialphaver2、copialphaver3和copialphaver4各自提供了令人驚奇和出乎意料的優(yōu)越的葉甲屬控制。例如，美國專利7,612,194提出，膜聯(lián)蛋白、β血影蛋白2和mtrp-l4都在rnai介導的昆蟲控制中有效。seqidno:16為膜聯(lián)蛋白區(qū)1(reg1)的dna序列，seqidno:17為膜聯(lián)蛋白區(qū)2(reg2)的dna序列。seqidno:18為β血影蛋白2區(qū)1(reg1)的dna序列，seqidno:19為β血影蛋白2區(qū)2(reg2)的dna序列。seqidno:20為mtrp-l4區(qū)1(reg1)的dna序列，并且seqidno:21為mtrp-l4區(qū)2(reg2)的dna序列。還使用了yfp序列(seqidno:6)產生用作陰性對照的dsrna。分別利用上述序列通過實施例3中的方法來產生dsrna。提供用于產生dsrna的特異性模板的策略顯示在圖2中。使用表4中的引物對和從分離自wcr第一齡幼蟲的總rna制備的第一鏈cdna(作為pcr模板)，制備了準備了在dsrna合成中使用的模板dna。(yfp從dna克隆擴增。)對于每個選擇的靶基因區(qū)，進行兩個單獨的pcr擴增。第一個pcr擴增在擴增的有義鏈的5'端引入t7啟動子元件。第二個反應在反義鏈的5'端引入t7啟動子元件。然后將每個靶基因區(qū)的兩個pcr擴增片段以大致相等的量混合，并將混合物用作dsrna產生的轉錄模板。參見圖2。合成雙鏈rna，并使用rnai試劑盒遵循制造商的說明書(invitrogen)進行純化。使用nanodroptm8000分光光度計(thermoscientific、wilmington、de)測量dsrna的濃度。并通過上述相同的基于餌食的生物測定方法測試每一種dsrna。表4列出了用來產生yfp、膜聯(lián)蛋白reg1、膜聯(lián)蛋白reg2、β血影蛋白2reg1、β血影蛋白2reg2、mtrp-l4reg1、和mtrp-l4reg2dsrna分子的引物的序列。用于圖2顯示的方法的yfp引物序列也在表4中列出。表5呈現(xiàn)了wcr幼蟲在暴露于這些dsrna分子9天之后的基于餌食的飼喂生物測定的結果。重復的生物測定證明，在以上西方玉米根蟲幼蟲中，攝取這些dsrna沒有導致超過te緩沖液、水、或yfp蛋白等對照樣品中所見的死亡或生長抑制。表4.用來擴增基因的編碼區(qū)的多個部分的引物和引物對。表5.利用西方玉米根蟲幼蟲9天之后獲得的餌食進食測定的結果。*te＝trishcl(10mm)加edta(1mm)緩沖液，ph8。**yfp＝黃色熒光蛋白實施例6包含殺蟲發(fā)夾dsrna的轉基因玉米組織的產生土壤桿菌介導的轉化.在土壤桿菌介導的轉化之后，制成了通過表達穩(wěn)定地整合到植物基因組中的嵌合基因而產生一種或多種殺蟲dsrna分子(例如，至少一種dsrna分子，其包含靶向包含copialpha，seqidno:1)的基因的dsrna分子)的轉基因玉米細胞、組織、和植物。采用超二元或二元轉化載體的玉米轉化方法是本領域中已知的，正如例如美國專利號8,304,604中(在此通過提述并入其全部內容)所描述。通過轉化的組織在含吡氟氯禾靈的培養(yǎng)基上生長的能力選擇它們，并視情況適宜篩選其dsrna產生?？梢詫⒁徊糠诌@樣的轉化的組織培養(yǎng)物提供給新生玉米根蟲幼蟲以進行生物測定，基本上如實施例1中所描述。土壤桿菌培養(yǎng)啟動.將包含上述(實施例4)二元轉化載體pdab114515、pdab115770、pdab110853或pdab101556的土壤桿菌菌株dat13192細胞(wo2012/016222a2)的甘油儲劃線接種在含有適當抗生素的ab基本培養(yǎng)基平板(watson等人，(1975)j.bacteriol.123:255-264)上，并在20℃培養(yǎng)3天。然后將培養(yǎng)物劃線接種在含有相同抗生素的yep平板(g/l:酵母提取物10；蛋白胨10；nacl、5)上，并在20℃溫育1天。土壤桿菌培養(yǎng).在實驗當天，以適合于實驗中的構建體數(shù)目的體積制備接種培養(yǎng)基和乙酰丁香酮的儲液，并將其移液到無菌的一次性250ml燒瓶中。接種培養(yǎng)基(frame等人，(2011)genetictransformationusingmaizeimmaturezygoticembryos.收錄于plantembryoculturemethodsandprotocols:methodsinmolecularbiology.t.a.thorpeande.c.yeung、(eds)、springerscienceandbusinessmedia、llc.pp327-341)含有:2.2gm/lms鹽；1xisu改良的ms維生素(frame等人，同上)；68.4gm/l蔗糖；36gm/l葡萄糖；115mg/l脯氨酸；和100mg/l肌醇；ph為5.4)。將乙酰丁香酮以200μm的終濃度(從100％二甲亞砜中的1m儲液)添加到含有接種培養(yǎng)基的燒瓶中，并充分混合溶液。對于每種構建體，來自yep平板的1或2個滿接種環(huán)的土壤桿菌懸浮在一次性50ml無菌離心管內15ml的接種培養(yǎng)基/乙酰丁香酮儲液中，在分光光度計中在550nm(od550)處測量溶液的光密度。然后使用另外的接種培養(yǎng)基/乙酰丁香酮混合物將懸液稀釋到0.3到0.4的od550。然后將土壤桿菌懸液的管水平放置在設置為在室溫下約75rpm的平臺搖床上，并在進行胚切開的同時振搖1到4小時。玉米棒消毒和胚分離.未成熟玉米胚從玉米近交系b104(hallauer等人，(1997)cropscience37:1405-1406)植物獲得，所述植物在溫室中培養(yǎng)，并進行自花授粉或近親授粉以產生玉米棒。在授粉后大約10到12天收獲玉米棒。在實驗當天，將玉米棒脫殼，并通過浸沒在20％市售漂白劑(ultragermicidalbleach，6.15％次氯酸鈉；加兩滴吐溫tm20)的溶液中并振搖20到30分鐘進行表面消毒，隨后在層流罩內在無菌去離子水中沖洗三次。從每個玉米棒無菌切下未成熟合子胚(1.8到2.2mm長)并隨機分配到微量離心管中，每根微量離心管含有2.0ml的液體接種培養(yǎng)基中的適當土壤桿菌細胞的懸液，其中含200μm乙酰丁香酮，并添加了2μl的10％s233表面活性劑(evonikindustries；essen、germany)。對于一套給定的實驗，每次轉化均使用來自匯集的玉米棒的胚。土壤桿菌共培養(yǎng).在分離之后，將胚在搖動平臺上放置5分鐘。然后將管的內容物傾倒到共培養(yǎng)基的平板上，所述培養(yǎng)基含有4.33gm/lms鹽；1xisu改良的ms維生素；30gm/l蔗糖；700mg/ll-脯氨酸；在koh中的3.3mg/l的麥草畏(3,6-二氯-o-茴香酸或3,6-二氯-2-甲氧基苯甲酸)；100mg/l肌醇(myo-inositol)；100mg/l酪蛋白酶水解物；15mg/lagno3；200μm溶于dmso中的乙酰丁香酮；和3gm/lgelzantm，ph為5.8。用無菌一次性移液管移除液態(tài)土壤桿菌懸液。然后借助于顯微鏡，使用無菌鑷子使胚定向為盾片面向朝上。蓋上平板，用3mtmmicroporetm醫(yī)用膠帶密封，并放置在具有大約60μmolm-2s-1的光合有效輻射(par)的連續(xù)光照的25℃培養(yǎng)箱中。愈傷組織選擇和轉基因事件的再生.在共培養(yǎng)期之后，將胚轉移到靜息培養(yǎng)基上，靜息培養(yǎng)基的組成為：4.33gm/lms鹽；1xisu改良的ms維生素；30gm/l蔗糖；700mg/ll-脯氨酸；溶于koh中的3.3mg/l的麥草畏；100mg/l肌醇；100mg/l酪蛋白酶水解物；15mg/lagno3；0.5g/lmes(2-(n-嗎啉代)乙磺酸一水合物；phytotechnologieslabr.；lenexa、ks)；250mg/l羧芐青霉素；和2.3gm/lgelzantm；ph為5.8。將不超過36個胚移到每個平板上。將平板放置在透明的塑料盒中，在27℃下在大約50μmolm-2s-1par的連續(xù)光照下溫育7到10天。然后將愈傷的胚轉移(<18個/板)到選擇培養(yǎng)基i上，所述培養(yǎng)基由具有100nm吡氟氯禾靈酸(r-haloxyfopacid)(0.0362mg/l；用于選擇包含aad-1基因的愈傷組織)的靜息培養(yǎng)基(上文)構成。將平板返回到透明盒中，在27℃下在大約50μmolm-2s-1par的連續(xù)光照下溫育7天。然后將愈傷的胚轉移(<12個/板)到選擇培養(yǎng)基ii上，所述培養(yǎng)基由具有500nm吡氟氯禾靈酸(0.181mg/l)的靜息培養(yǎng)基組成。將平板返回到透明盒中，在27℃下在大約50μmolm-2s-1par的連續(xù)光照下溫育14天。這一選擇步驟允許轉基因愈傷組織進一步增殖和分化。將增殖中的胚性愈傷組織轉移到(<9個/板)預再生培養(yǎng)基上。預再生培養(yǎng)基含有4.33g/lms鹽；1xisu改良的ms維生素；45gm/l蔗糖；350mg/ll-脯氨酸；100mg/l肌醇；50mg/l酪蛋白酶水解物；1.0mg/lagno3；0.25gm/lmes；溶于naoh中的0.5mg/l萘乙酸；溶于乙醇中的2.5mg/l脫落酸；1mg/l6-芐氨基嘌呤；250mg/l羧芐青霉素；2.5gm/lgelzantm；和0.181mg/l吡氟氯禾靈酸；ph為5.8。將平板保存在透明盒中，在27℃下在大約50μmolm-2s-1par的連續(xù)光照下溫育7天。然后將再生中的愈傷組織轉移到(<6個/板)phytatraystm(sigma-aldrich)中的再生培養(yǎng)基上，在28℃以每天16小時光照/8小時黑暗(以大約160μmolm-2s-1par)溫育14天，直到發(fā)出芽和根為止。再生培養(yǎng)基含有4.33gm/lms鹽；1xisu改良的ms維生素；60gm/l蔗糖；100mg/l肌醇；125mg/l羧芐青霉素；3gm/lgellantm膠；和0.181mg/l吡氟氯禾靈酸；ph為5.8。然后分離具有主根的小芽，并不經選擇直接轉移到伸長培養(yǎng)基上。伸長培養(yǎng)基含有4.33gm/lms鹽；1xisu改良的ms維生素；30gm/l蔗糖；和3.5gm/lgelritetm:ph為5.8。通過它們在含有吡氟氯禾靈的培養(yǎng)基上生長的能力而選擇出轉化植物芽，將所述芽從phytatraystm移栽到填充有生長培養(yǎng)基(promixbx；premiertechhorticulture)的小盆中，小盆用杯子或humi-domes(arcoplastics)覆蓋，然后在conviron生長室中煉苗(27℃晝/24℃夜，16小時光周期，50-70％rh，200μmolm-2s-1par)。在一些情況下，分析推定的轉基因小植物的轉基因相對拷貝數(shù)，這使用設計用于檢測整合到玉米基因組中的aad1除草劑耐受基因的引物通過定量實時pcr測定來完成。此外，利用rnaqpcr測定來檢測在推定的轉化體表達的dsrna中st-ls1內含子序列的存在。然后將選定的轉化小植物移動到溫室中，以便進一步生長和測試。轉移t0植物和在溫室中定植以進行生物測定和產生種子.當植物達到v3-v4期時，將其移栽到iecustomblend(profile/metromix160)土壤混合物中，在溫室中(光曝露類型：光或同化作用；高光限值：1200par；16-小時晝長；27℃晝/24℃夜)培植至開花。將要用于昆蟲生物測定的植物從小盆移栽到tinustm350-4(spencer-lemaireindustries、acheson、alberta、canada)(每每事件一個植物)。在移栽到約四天后，侵染植物以進行生物測定。通過對t0轉基因植物的穗絲授粉，其中花粉從非轉基因良種近交系b104或其他適當?shù)幕ǚ酃w采集而來，并種植所得的種子而獲得t1代植物。在可能時進行互交。實施例7轉基因玉米組織的分子分析對在評估噬根損害的同日從溫室培植的植物采集的葉和根的樣品進行了玉米組織的分子分析(例如，rnaqpcr)。用對per53'utr的rnaqpcr測定結果來驗證發(fā)夾轉基因的表達。(在非轉化的玉米植物中預期會檢出低水平的per53'utr，因為在玉米組織中通常存在內源per5基因表達)。用針對表達的rna中的st-ls1內含子序列(為形成dsrna發(fā)夾分子所必需)的rnaqpcr測定結果來驗證發(fā)夾轉錄物的存在。測量了相對于內源玉米基因的rna水平的轉基因rna表達水平。通過dnaqpcr分析檢測基因組dna中aad1編碼區(qū)的一部分，用來估計轉基因插入拷貝數(shù)。從培植在環(huán)境室中的植物采集樣品用于這些分析。將結果與旨在檢測單拷貝天然基因的一部分的測定法的dnaqpcr結果進行比較，并將簡單事件(具有一個或兩個copialpha轉基因拷貝)推進到溫室中的進一步研究。另外，用旨在檢測大觀霉素抗性基因(specr；包含在t-dna外部的二元載體質粒上)的一部分的qpcr測定法來確定轉基因植物是否含有無關的整合的質粒骨架序列。發(fā)夾rna轉錄物表達水平:per53'utrqpcr.通過per53'utr序列的實時定量pcr(qpcr)來分析愈傷組織細胞事件或轉基因植物，以確定全長發(fā)夾轉錄物的相對表達水平，與內部玉米基因(seqidno:50；genbank登錄號bt069734)的轉錄物水平比較，所述內部玉米基因編碼tip41-樣蛋白(即，genbank登錄號at4g34270的玉米同源物；具有74％同一性的tblastx得分)。使用rnaeasytm96試劑盒(qiagen、valencia、ca)分離rna。洗脫后，根據(jù)試劑盒建議的方案進行總rna的dnase1處理。然后在nanodroptm8000分光光度計(thermoscientific)上將rna定量，并將濃度歸一化為25ng/μl。大體上按照制造商推薦的方案，使用高容量cdna合成試劑盒(invitrogen)制備第一鏈cdna，反應體積10μl，含有5μl變性rna。略微改變該方案以包括將10μl的100μmt20vn寡核苷酸(idt)(seqidno:51；ttttttttttttttttttttvn，其中v是a、c、或g，n是a、c、g、或t/u)添加到隨機引物儲備預混物的1ml管中，以制備隨機引物和寡dt混合的工作儲備液。在cdna合成后，以無核酸酶的水將樣品以1:3稀釋，并儲存在-20℃直到用于測定時為止。在lightcyclertm480(rochediagnostics、indianapolis、in)上以10μl的反應體積分別進行per53'utr和tip41樣轉錄物的實時pcr測定。對于per53'utr測定，利用引物p5u76s(f)(seqidno:52)和p5u76a(r)(seqidno:53)，以及rocheuniversalprobetm(upl76；目錄號4889960001；用fam標記)運行反應。對于tip41-樣參考基因測定，使用引物tipmxf(seqidno:54)和tipmxr(seqidno:55)、以及標記有hex(六氯熒光素)的探針hxtip(seqidno:56)。所有測定都包括沒有模板的陰性對照(僅有預混物)。為制備標準曲線，在源板中還包括空白(源孔中加水)，以檢查樣品交叉污染。在表6中列出了引物和探針序列。用于檢測各種轉錄物的反應成分配方在表7中公開，pcr反應條件概述于表8中。在465nm處激發(fā)fam(6-羧基熒光素亞磷酰胺)熒光部分，并測量在510nm處的熒光；hex(六氯熒光素)熒光部分的對應值為533nm和580nm。表6.被用于轉基因玉米中轉錄物水平的分子分析的多多核苷酸。*tip41樣蛋白**nav序列無法從供應商獲得表7.用于轉錄物檢測的pcr反應配方。表8.用于rnaqpcr的熱循環(huán)儀條件。使用lightcyclertm軟件v1.5，根據(jù)供應商的推薦利用二階導數(shù)最大算法計算cq值，通過相對定量分析數(shù)據(jù)。對于表達分析，使用δδct方法(即，2-(cqtarget–cqref))計算表達值，所述方法依賴于比較兩個靶之間的cq值的差異，其中假定對于優(yōu)化的pcr反應條件，每個循環(huán)產物都加倍，基值選擇為2。發(fā)夾轉錄物大小和完整性:northern印跡測定.在一些情況下，利用northern印跡(rna印跡)分析來確定在表達copialpha發(fā)夾dsrna的轉基因植物中copialpha發(fā)夾rna的分子大小，從而獲得轉基因植物的另外的分子表征。所有的材料和設備在使用之前用rnazap(ambion/invitrogen)處理。將組織樣品(100mg到500mg)采集到2mlsafelockeppendorf管中，用配備三個鎢珠的kleckotm組織粉碎器(garciamanufacturing、visalia、ca)在1mltrizol(invitrogen)中破碎5分鐘，然后在室溫(rt)下溫育10分鐘。任選地，將樣品在4℃在11,000rpm下離心10分鐘，并將上清液轉移到新鮮的2mlsafelockeppendorf管中。在將200μl的氯仿添加到勻漿中之后，通過翻轉該管2到5分鐘進行混合，然后在rt下溫育10分鐘，并在4℃在12,000xg下離心15分鐘。將上層相轉移到無菌的1.5mleppendorf管中，添加600μl的100％異丙醇，在rt溫育10分鐘到2小時之后，然后在4°到25℃在12,000xg下離心10分鐘。棄去上清液，用1ml的70％乙醇將rna離心沉淀物洗滌兩次，在兩次洗滌之間，在4°到25℃在7,500xg下離心10分鐘。棄去乙醇，將離心沉淀物快速風干3到5分鐘，然后重懸在50μl無核酸酶的水中。使用nanodrop(thermo-fisher)對總rna定量，并將樣品歸一化為5μg/10μl。然后向每個樣品中加入10μl的乙二醛(ambion/invitrogen)。將5到14ng的digrna標準標志物預混物(rocheappliedscience、indianapolis、in)分配并添加到等體積的乙二醛中。在50℃使樣品和標志物rna變性45分鐘，并保存在冰上，直到上樣到在northernmaxtm10x乙二醛運行緩沖液(ambion/invitrogen)中的1.25％seakemgoldtm瓊脂糖(lonza、allendale、nj)凝膠上為止，通過在65伏特/30ma下電泳2小時15分鐘分離rna。電泳之后，在2xssc沖洗凝膠5分鐘，在凝膠doc工作站(biorad、hercules、ca)上成像，然后在rt過夜使rna被動轉移到尼龍膜(millipore)上，其中使用10xssc作為轉移緩沖液(由3m氯化鈉和300mm檸檬酸三鈉組成的20xssc，ph7.0)。轉膜后，在2xssc中沖洗膜5分鐘，通過uv使rna與該膜交聯(lián)(agilent/stratagene)，并使該膜在室溫下干燥2天。使膜在緩沖液(ambion/invitrogen)中預雜交1到2小時。探針由含有感興趣序列(例如，seqidno:11或seqidno:12的反義序列部分，視情況適宜)的pcr擴增產物組成，其通過rocheappliedsciencedig程序用地高辛配基標記。在雜交管中推薦的緩沖液中60℃的溫度下雜交過夜。雜交后，對印跡進行dig洗滌，包裝，暴露于膠片1到30分鐘，然后將膠片顯影，所有這些都通過dig試劑盒的供應商推薦的方法來進行。轉基因拷貝數(shù)確定.將大約等同于2個葉沖孔塊的玉米葉片收集在96孔的收集平板(qiagen)中。用配備一個不銹鋼珠的kleckotm組織粉碎器(garciamanufacturing、visalia、ca)在biosprint96ap1溶解緩沖液(與biosprint96plantkit一起提供；qiagen)中進行組織破碎。組織浸軟之后，使用biosprint96plantkit和biosprint96提取機器人以高通量形式分離基因組dna(gdna)。在設立qpcr反應之前，以2:3的dna:水稀釋基因組dna。qpcr分析.通過使用480系統(tǒng)的實時pcr，借助水解探針測定來進行轉基因檢測。使用probedesignsoftware2.0設計了要在水解探針測定中用于檢測st-ls1內含子序列(seqidno:14)、或檢測specr基因(即，負載在二元載體質粒上的大觀霉素抗性基因；seqidno:68；在表9中的spc1寡核苷酸)的一部分的寡核苷酸。此外，使用primerexpress軟件(appliedbiosystems)設計了要在水解探針測定中用于檢測aad-1耐除草劑基因(seqidno:62；在表9中的gaad1寡核苷酸)的區(qū)段的寡核苷酸。表9顯示了引物和探針序列。測定用內源玉米染色體基因(轉化酶(seqidno:59；genbank登錄號u16123；在本文中稱為ivr1)的試劑多重化，所述基因用作內部參考序列以確保在每個測定中都存在gdna。為了擴增，制備了在10μl體積的多重反應物中的1x終濃度的480probes母液混合物(rocheappliedscience)，其含有每種引物各0.4μm，以及每種探針各0.2μm(表10)。如表11中概述進行兩步擴增反應。fam-和hex-標記探針的熒光團活化和發(fā)射如上文所述；cy5偶聯(lián)物在650nm處最大激發(fā)，并且在670nm處發(fā)最大熒光。使用擬合點算法(軟件發(fā)行版本1.5)和相對定量模塊(基于δδct方法)，根據(jù)實時pcr數(shù)據(jù)確定cp得分(熒光信號與背景閾值雜交的點)。如前所述處理數(shù)據(jù)(上文；rnaqpcr)。表9.用于基因拷貝數(shù)確定和二元載體質粒骨架檢測的引物和探針(具有熒光偶聯(lián)物)的序列。cy5＝花青-5表10.用于基因拷貝數(shù)分析和質粒骨架檢測的反應成分成分量(μl)儲液終濃度2x緩沖液5.02x1x適當?shù)恼蛞?.410μm0.4適當?shù)姆聪蛞?.410μm0.4適當?shù)奶结?.45μm0.2ivr1-正向引物0.410μm0.4ivr1-反向引物0.410μm0.4ivr1-探針0.45μm0.2h2o0.6na*nagdna2.0nd**nd總計10.0*na＝不適用**nd＝未確定表11.用于dnaqpcr的熱循環(huán)儀條件實施例8轉基因玉米的生物測定體外昆蟲生物測定.通過生物測定方法來證實在植物細胞中產生的本主題發(fā)明的dsrna的生物活性。參見，例如，baum等人，(2007)nat.biotechnol.25(11):1322-1326。人們能夠例如通過在受控的飼喂環(huán)境下給靶昆蟲喂食來源于產生殺蟲dsrna的植物的各種植物組織或組織片來證實效力?；蛘?，從來源于產生殺蟲dsrna的植物的各種植物組織制備提取物，并將提取的核酸分配在用于如以前在本文中描述的生物測定的人工餌食上面。將這樣的飼喂測定的結果與類似方式進行的采用來自不產生殺蟲dsrna的宿主植物的適當對照組織、或其他對照樣品的生物測定進行比較。關于轉基因玉米事件的昆蟲生物測定.選擇從經洗滌的卵孵化的兩條西方玉米根蟲幼蟲(1到3日齡)并將其置于生物測定托盤的每個孔中。然后將這些孔用“拉-揭”(pulln’peel)護蓋(bio-cv-16、bio-serv)覆蓋，并置于具有18小時/6小時光照/黑暗周期的28℃培養(yǎng)箱中。在初始侵染9日之后，評估幼蟲死亡率，其按照死亡昆蟲占的每次處理中昆蟲總數(shù)的百分比來計算。將昆蟲樣品在-20℃冷凍兩天，然后匯集來自每個處理的昆蟲幼蟲并稱重。生長抑制百分比按照實驗處理的平均重量除以兩個對照孔處理的平均重量的均值來計算。數(shù)據(jù)表示為(陰性對照的)生長抑制百分比。將超過對照平均重量的平均重量歸一化為零。溫室中的昆蟲生物測定.從cropcharacteristics(farmington、mn)收到帶有西方玉米根蟲(wcr，玉米根螢葉甲)卵的土壤。在28℃溫育wcr卵10到11天。洗掉卵上的土壤，將卵置于0.15％瓊脂溶液中，濃度調節(jié)至每0.25ml等份大約75個到100個卵。將一份卵懸浮液加入培養(yǎng)皿中以設置孵化平板，用于監(jiān)測孵化速率。用150到200個wcr卵侵染中生長的玉米植物周圍的土壤。允許昆蟲攝食2周，在這段時間之后，對每個植物給出“根評級”。利用一個節(jié)損傷量表進行分級，大體上如oleson等人，(2005、j.econ.entomol.98:1-8)所述。將通過了這個生物測定的植物移栽到5加侖的盆中供產生種子。用殺蟲劑處理移植物以防止進一步根蟲損害和昆蟲釋放到溫室中。將植物人工授粉以產生種子。保存由這些植物產生的種子以評估植物的t1和后續(xù)世代。溫室生物測定包括兩種陰性對照植物。轉基因陰性對照植物通過用包含設計為產生黃色熒光蛋白(yfp)的基因或yfp發(fā)夾dsrna的載體轉化而生成(參見實施例4)。非轉化的陰性對照植物從品系7sh382或b104的種子培植而來。在兩個不同的日期進行生物測定，其中每一組植物材料中均包括陰性對照。表12顯示了copialpha發(fā)夾植物的分子分析和生物測定的結果匯總?？疾炜偨Y在表12中的生物測定結果揭示了一項令人驚奇和出乎意料的觀察結果，即，大多數(shù)包含表達含有seqidno:1區(qū)段(例如，如seqidno:11和seqidno:12所例示)的copialpha發(fā)夾dsrna的構建體的轉基因玉米植物受到保護而免于通過喂養(yǎng)西方玉米根蟲幼蟲招致的根損害。37個被分級的事件中的二十二個具有0.5或更低的根評級。表13顯示了陰性對照植物的分子分析和生物測定的合并結果。大多數(shù)植物不具有針對wcr幼蟲喂養(yǎng)的保護，雖然34株被評級的植物中有5株具有0.75或更低的根評級。有時觀察到陰性對照植物組中存在一些具有根評級分數(shù)低的植物，這反映了在溫室環(huán)境中進行這種類型生物測定的易變性和困難性。表12.表達copialpha發(fā)夾v3和copialpha發(fā)夾v3的玉米植物的溫室生物測定和分子分析結果。*rtl＝針對tip4-樣基因轉錄物水平測量的相對轉錄物水平。**ng＝由于植物尺寸小而未評級。***nd＝未進行表13.包含轉基因的陰性對照植物和非轉化玉米植物的溫室生物測定和分子分析結果。*rtl＝針對tip4樣基因轉錄物水平測量的相對轉錄物水平。**ng＝由于植物尺寸小未予分級***nd＝未進行。實施例9包含鞘翅目害蟲序列的轉基因玉米如實施例6中所述生成10個到20個轉基因t0玉米植物。獲得另外的10--20個表達針對rnai構建體的發(fā)夾dsrna的t1玉米獨立品系用于玉米根蟲攻擊。發(fā)夾dsrna可按照seqidno:11、seqidno:12中所列出而衍生，或者進一步包含seqidno:1。更多的發(fā)夾dsrna衍生自例如鞘翅目害蟲序列，例如像caf1-180(美國專利申請公開號2012/0174258)、vatpasec(美國專利申請公開號2012/0174259)、rho1(美國專利申請公開號2012/0174260)、vatpaseh(美國專利申請公開號2012/0198586)、ppi-87b(美國專利申請公開號2013/0091600)、rpa70(美國專利申請公開號2013/0091601)、或rps6(美國專利申請公開號2013/0097730)。這些通過rt-pcr或其他分子分析方法得以證實。來自選定的獨立t1系的總rna制備物在某些情況下用于rt-pcr，其中引物被設計為在每個rnai構建體中的發(fā)夾表達盒的st-ls1內含子中結合。另外，用于rnai構建體中每個靶基因的特異性引物在某些情況下用于擴增在植物內sirna產生所需要的預加工mrna，并用于確認所述預加工mrna的產生。對于每個靶基因的期望條帶的擴增可確認每個轉基因玉米植物中發(fā)夾rna的表達。隨后在某些情況下利用rna印跡雜交在獨立轉基因系中確認靶基因的dsrna發(fā)夾加工成sirna。而且，與靶基因具有80％以上序列同一性、具有錯配序列的rnai分子對玉米根蟲的影響類似于與靶基因具有100％序列同一性的rnai分子。錯配序列與天然序列的配對在同一個rnai構建體中形成發(fā)夾dsrna，由此產生出能夠影響攝食中的鞘翅目害蟲的生長、發(fā)育和生存力的植物加工的sirna。對應于靶基因的dsrna、sirna、或mirna的植物體內遞送以及被鞘翅目害蟲進食后的攝取，導致鞘翅目害蟲中的靶基因由于rna介導的基因沉默而下調。當靶基因在發(fā)育的一個或多個階段發(fā)揮重要作用的時候，鞘翅目害蟲的生長、發(fā)育和生殖受到影響，而且在wcr、ncr、scr、mcr、玉米根螢葉甲、d.u.tenella、和d.u.undecimpunctatamannerheim的至少一者的情況下，會導致鞘翅目害蟲無法成功侵染、攝食、發(fā)育、和/或生殖，或導致其死亡。然后通過靶基因的選擇和rnai的成功應用來控制鞘翅目害蟲。轉基因rnai品系和非轉化玉米的表型比較.選用于創(chuàng)建發(fā)夾dsrna的靶鞘翅目害蟲基因或序列與任何已知的植物基因bn序列都沒有相似性。因此不期望靶向這些鞘翅目害蟲基因或序列的構建體的(系統(tǒng)性)rnai的產生或活化對轉基因植物會有任何有害影響。然而，將轉基因系的發(fā)育和形態(tài)特征與非轉化植物、以及用沒有發(fā)夾表達基因的“無效”(null)載體轉化的那些轉基因系進行比較。比較了植物根、芽、葉和生殖特征。轉基因植物和非轉化植物在根長和生長模式上沒有可觀察到的差異。植物地上部特征，諸如高度、葉數(shù)和大小、開花時間、花大小和外觀之類，是相似的?？偟膩碚f，在體外以及在溫室土壤中培養(yǎng)時，在轉基因系和沒有表達靶irna分子的那些品系之間沒有可觀察的形態(tài)差異。實施例10包含鞘翅目害蟲序列和另外的rnai構建體的轉基因玉米轉基因玉米植物在其基因組中包含異源編碼多核苷酸，所述異源編碼多核苷酸被轉錄成靶向鞘翅目害蟲之外的生物的irna分子，對這樣的轉基因植物通過土壤桿菌或whiskerstm方法(參見petolino和arnold(2009)methodsmol.biol.526:59-67)進行二次轉化，以產生一種或多種殺蟲dsrna分子(例如，至少一種dsrna分子，包括靶向包含seqidno:1的基因的dsrna分子)。基本上如實施例4中所述制備植物轉化質粒載體，經由土壤桿菌或whiskerstm-介導的轉化方法遞送到獲自轉基因hiii或b104玉米植物的玉米懸浮細胞或未成熟玉米胚中，所述玉米植物在其基因組中包含異源編碼多核苷酸，所述異源編碼多核苷酸被轉錄成靶向鞘翅目害蟲之外的生物的irna分子。實施例11包含rnai構建體和另外的鞘翅目害蟲控制序列的轉基因玉米轉基因玉米植物在其基因組中包含被轉錄成靶向鞘翅目害蟲生物的irna分子的異源編碼多核苷酸(例如，至少一種dsrna分子，包括靶向包含seqidno:1的基因的dsrna分子)，對于這樣的轉基因玉米植物，通過土壤桿菌或whiskerstm方法(參見petolino和arnold(2009)methodsmol.biol.526:59-67)進行二次轉化以產生一種或多種殺蟲蛋白分子，例如，cry1b、cry1i、cry2a、cry3、cry7a、cry8、cry9d、cry14、cry18、cry22、cry23、cry34、cry35、cry36、cry37、cry43、cry55、cyt1a和cyt2c殺蟲蛋白?；旧先鐚嵤├?中所述制備植物轉化質粒載體，經由土壤桿菌或whiskerstm-介導的轉化方法遞送到獲自轉基因b104玉米植物的玉米懸浮細胞或未成熟玉米胚中，所述玉米植物在其基因組中包含被轉錄成靶向鞘翅目害蟲生物的irna分子的異源編碼多核苷酸。獲得產生用于控制鞘翅目害蟲的irna分子和殺蟲蛋白的雙重轉化植物。實施例12新熱帶棕椿象(英雄美洲蝽)在copialpharnai注射后的死亡新熱帶棕椿象(bsb；英雄美洲蝽)群落.將bsb飼養(yǎng)在27℃、相對濕度65％、16:8小時的光照:黑暗循環(huán)的培養(yǎng)箱中。將經2-3天收集的1克卵接種在5l容器中，容器底部有濾紙盤，并用#18目篩蓋住容器以便通風。每個飼養(yǎng)容器產生約300-400只成蟲bsb。在所有階段，昆蟲均每周三次喂養(yǎng)新鮮青豆，每周更換一小袋含有向日葵種子，大豆和花生(3:1:1重量比)的種子混合物。水在帶有棉塞作為捻子的小瓶中補充。經最初兩周后，每周一次將昆蟲轉移到新的容器上。bsb人工餌食.用如下制備的bsb人工餌食(在制備兩周內使用)。在magic混合器中將凍干綠豆混合成細粉，同時在另一臺magic混合器中將生(有機)花生混合。在大的magic混合器中合并混合的干成分(重量百分比:綠豆35％；花生35％；蔗糖5％；維生素復合物(例如用于昆蟲的vanderzant維生素混合物，sigma-aldrich,目錄號v1007)0.9％)，加蓋并充分振搖以將這些成分混合。然后將混合的干成分添加到混合碗。在另一容器中，將水和苯菌靈抗真菌劑(50ppm；25μl20,000ppm溶液/50ml餌食液)充分混合，然后添加到干成分混合物中。人工混合所有成分，直到溶液完全混合時為止。將餌食成形為期望的大小，松散地包裝在鋁箔中，在60℃加熱4小時，然后冷卻，在4℃儲存。bsb轉錄組組裝.選擇六個bsb發(fā)育期用于mrna文庫制備。從冷凍在-70℃的昆蟲提取總rna，并將其在設備(mpbiomedicals)上的lysingmatrixa2ml管(mpbiomedicals、santaana、ca)中的10倍體積的溶解/結合緩沖液中均質化。使用mirvanatmmirna分離試劑盒(ambion；invitrogen)根據(jù)制造商的方案提取總mrna。使用hiseqtm系統(tǒng)(sandiego、ca)的rna測序提供了用于在rnai昆蟲控制技術中使用的候選靶基因序列。hiseqtm為六個樣品生成了總共約3.78億個讀段。使用trinity匯編程序軟件(grabherr等人，(2011)naturebiotech.29:644-652)針對每個樣品將讀段逐一匯編。合并匯編的轉錄物以生成匯集的轉錄組。這個bsb匯集的轉錄組含有378,457個序列。bsbcopialpha直系同源物鑒定.使用αcop蛋白序列αcop-pa和αcop-pb：genbank登錄號np_477395和np_728648，分別作為查詢進行bsb匯集的轉錄組的tblastn搜索。bsbcopialpha(seqidno:84)被鑒定為英雄美洲蝽候選靶基因產物，其預測的肽序列為seqidno:85。模板制備和dsrna合成.使用試劑(lifetechnologies)，從提取自單一年輕成蟲(約90mg)的總bsbrna制備cdna。使用微量管研磨棒(pelletpestle)(fisherbrand目錄號12-141-363)和研磨棒混合器(pestlemotormixer)(cole-parmer、vernonhills、il)，在裝有200μl的的1.5ml微量離心管中將昆蟲均質化。均質化之后，再添加800μl的使勻漿渦旋，然后在室溫下溫育五分鐘。通過離心去除細胞碎片，上清液轉移到新的管中。按照制造商推薦的提取方案，將rna離心沉淀在室溫下干燥，并重懸于來自gfxpcrdnaandgelextractionkit(illustratm；gehealthcarelifesciences)的200μltris緩沖液中，使用洗脫緩沖液類型4(即10mmtris-hcl，ph8.0)。使用nanodroptm8000分光光度計(thermoscientific，wilmington，de)測定rna濃度。cdna擴增.使用針對rt-pcr的superscriptiiifirst-strandsynthesissystemtm(invitrogen)，根據(jù)供應商的推薦方案，從5μg的bsb總rna模板和寡dt引物反向轉錄而成cdna。用無核酸酶的水將轉錄反應的終體積調節(jié)為100μl。dna模板擴增用于dsrna轉錄。使用引物bsb_αcop-1-for(seqidno:88)與bsb_αcop-1-rev(seqidno:89)來擴增bsb_copialpha區(qū)域1，又稱bsb_copialpha-1模板(seqidno:86)。使用引物bsb_αcop-2-for(seqidno:90)和bsb_αcop-2-rev(seqidno:91)來擴增bsb_copialpha區(qū)域2，又稱bsb_copialpha-2模板(seqidno:87)。用1μl的cdna(上述)進行觸地(touch-down)pcr(退火溫度從60℃降至50℃，以10℃/循環(huán)降低)來擴增該dna模板。在35個循環(huán)的pcr中產生了分別包含bsb_copialpha-1和bsb_copialpha-2的494bp和495bp的片段。上述程序也被用于使用yfpv2-f(seqidno:93)和yfpv2-r(seqidno:94)引物擴增301bp陰性對照模板yfpv2(seqidno:92)。bsb_copialpha-1、bsb_copialpha-2和yfpv2引物在其5'端含有t7噬菌體啟動子元件(seqidno:5)，因此使得yfpv2和bsb_copialphadna片段能夠用于dsrna轉錄。dsrna合成.利用megascripttmrnai試劑盒(ambion)，根據(jù)制造商的說明，使用2μl的pcr產物(上文)作為模板合成dsrna。(參見圖1)。在nanodroptm8000分光光度計上將dsrna定量并在無核酸酶的0.1xte緩沖液(1mmtrishcl，0.1mmedta，ph7.4)中稀釋到500ng/μl。dsrna注射到bsb血腔中.在27℃培養(yǎng)箱中，在65％相對濕度和16:8小時的光:暗光周期下，用綠豆和種子餌食喂養(yǎng)作為群落的bsb。用小刷子輕輕操作第二齡若蟲(每只重1到1.5mg)以防損傷，并將它們置于冰上培養(yǎng)皿中，以使昆蟲預冷和固定。給每只昆蟲注射55.2nl的500ng/μldsrna溶液(即，27.6ngdsrna；18.4到27.6μg/g體重的劑量)。注射使用配備有從drummond3.5英寸#3-000＝203-g/x玻璃毛細管拉制而成的注射針的nanojecttmii注入器(drummondscientific、broomhall、pa)。將針尖打破，用輕礦油裝填毛細管，然后充填2到3μl的dsrna。將dsrna注射到若蟲的腹部(每次試驗每dsrna注射10個昆蟲)，在不同的三天重復試驗。經過注射的昆蟲(每孔5個)被轉移到含有一團人工bsb餌食并覆蓋有pull-n-peeltm蓋片(bio-cv-4；bio-serv)的32孔托盤(bio-rt-32rearingtray；bio-serv、frenchtown、nj)中。借助于帶有棉花芯的裝有1.25ml水的1.5ml微量離心管提供水分。將這些托盤在26.5℃、60％濕度和16:8小時光:暗光周期下溫育。在注射之后7天，獲取生存力計數(shù)和重量。注射鑒定了bsbgho是致死性dsrna靶.在bsb注射實驗中使用靶向yfp編碼區(qū)的區(qū)段yfpv2的dsrna作為陰性對照。如表1中總結的，將27.6ng的bsb_copialpha-1和bsb_copialpha-2dsrna注射到第二齡bsb若蟲的血腔中，在七天內產生了數(shù)字上更高的死亡率。每種dsrna每次試驗注射10只昆蟲。表1.bsb_copialpha-2dsrna注射到第二齡棕椿象若蟲的血腔中注射七天之后的結果。實施例13包含半翅目害蟲序列的轉基因玉米如實施例7中所述，生成10到20個包含表達載體的轉基因t0玉米植物，所述表達載體含有seqidno:84、seqidno:86和/或seqidno87的核酸。獲得另外的10-20個t1玉米獨立系，其表達針對rnai構建體的發(fā)夾dsrna，用于bsb攻擊?？梢垣@得包含如seqidno:86或seqidno:87中所示，或進一步包含seqidno:84的發(fā)夾dsrna。這些通過rt-pcr或其他分子分析方法得以證實。任選地用選定的獨立t1系的總rna制備物進行rt-pcr，其中引物設計為結合每個rnai構建體中的發(fā)夾表達盒的st-ls1內含子中。另外，任選地用針對rnai構建體中每個靶基因的特異性引物進行擴增，并且在植物體內確認產生sirna所需要的預加工mrna的產生。每個靶基因的各期望條帶的擴增可確認每個轉基因玉米植物中發(fā)夾rna的表達。任選地隨后在獨立轉基因系中利用rna印跡雜交來確認靶基因的dsrna發(fā)夾加工成sirna。而且，與靶基因具有80％以上序列同一性的具有錯配序列的rnai分子以類似于與靶基因具有100％序列同一性的rnai分子所見的方式影響玉米根蟲。錯配序列與天然序列的配對在同一個rnai構建體中形成發(fā)夾dsrna，從而投放出能夠影響攝食的半翅目害蟲的生長、發(fā)育和生存力的植物加工的sirna。在植物體內投予對應于靶基因的dsrna、sirna、shrna、或mirna，隨后被半翅目害蟲通過攝食而攝取，結果導致半翅目害蟲中的靶基因由于rna介導的基因沉默作用而下調。當靶基因在所影響的半翅目害蟲的生長、發(fā)育和生殖的一個或多個階段中發(fā)揮重要功能時，并且在英雄美洲蝽、蓋德擬壁蝽、茶翅蝽、稻綠蝽、擬綠蝽、和褐椿象中至少一者的情況下，可導致半翅目害蟲無法成功侵染、進食、發(fā)育、和/或生殖，或導致其死亡。然后選定的靶基因的和rnai的成功應用用來控制半翅目害蟲。轉基因rnai系和非轉化玉米的表型比較.選用于創(chuàng)建發(fā)夾dsrna的靶半翅目害蟲基因或序列與任何已知的植物基因序列都沒有相似性。因此可以預期，靶向這些半翅目害蟲基因或序列的構建體的(系統(tǒng)性)rnai的產生或者激活不會對轉基因植物產生任何有害影響。盡管如此，將轉基因系的發(fā)育和形態(tài)特征與非轉化植物、以及用沒有發(fā)夾表達基因的“空”載體轉化的轉基因系進行比較。比較植物根、芽、葉和生殖特征。轉基因植物和非轉化植物在根長和生長模式上沒有可觀察到的差異。諸如高度、葉數(shù)和大小、開花時間、花大小和外觀之類的植物地上部特征是相似的?？偟膩碚f，在體外以及在溫室土壤中培養(yǎng)時，在轉基因品系和沒有表達靶irna分子的品系之間沒有可觀察到的形態(tài)差異。實施例14包含半翅目害蟲序列的轉基因大豆生成10到20個包含下述核酸的表達載體的轉基因t0大豆植物，所述核酸含有seqidno:84、seqidno:86和/或87，所述植物按照本領域已知的方式生成，包括例如通過如下所述的土壤桿菌介導的轉化。用氯氣將成熟大豆(glycinemax)種子消毒十六小時過夜。用氯氣消毒之后，將種子置于laminartm層流罩內的開放容器中以驅散氯氣。接著，使用黑盒，在黑暗中24℃下使消毒過的種子吸收無菌h2o十六小時。分割種子大豆的制備.包含部分胚軸的大豆種子分割方案需要制備縱向切開的大豆種子材料，縱向切開使用固定在解剖刀上的10號刀片，沿著種子的種臍分離并去除種皮，并將種子分開為兩個子葉部分。小心地部分移除胚軸，其中約1/2-1/3的胚軸仍然附著在子葉的節(jié)端。接種.然后將包含部分胚軸的分割大豆種子在根癌土壤桿菌(例如，菌株eha101或eha105)溶液中浸沒約30分鐘，根癌土壤桿菌攜帶包含seqidno:84、seqidno:86和/或seqidno:87的二元質粒。在浸入帶胚軸的子葉之前，將根癌土壤桿菌溶液稀釋到λ＝0.6od650的終濃度。共培養(yǎng).接種后，將分割的大豆種子與根癌土壤桿菌菌株在共培養(yǎng)基(wang、kan.agrobacteriumprotocols.2.1.newjersey:humanapress、2006.print.)上共培養(yǎng)5天，共培養(yǎng)基置于培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿用一片濾紙覆蓋。芽誘導.在共培養(yǎng)5天之后，將分割的大豆種子在含有b5鹽、b5維生素、28mg/l二價鐵、38mg/lna2edta、30g/l蔗糖、0.6g/lmes、1.11mg/lbap、100mg/ltimentintm、200mg/l頭孢噻肟、和50mg/l萬古霉素的液體芽誘導(si)(ph5.7)培養(yǎng)基中洗滌。然后將分割的大豆種子在含有b5鹽、b5維生素、7g/lnoble瓊脂、28mg/l二價鐵、38mg/lna2edta、30g/l蔗糖、0.6g/lmes、1.11mg/lbap、50mg/ltimentintm、200mg/l頭孢噻肟、50mg/l萬古霉素的芽誘導i(sii)培養(yǎng)基(ph5.7)上培養(yǎng)，其中子葉的平坦一側向上，而子葉的節(jié)端埋入培養(yǎng)基中。在培養(yǎng)2周之后，將來自轉化的分割大豆種子的外植體轉移到芽誘導ii(siii)培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基含有補充了6mg/l草丁膦的sii培養(yǎng)基。芽伸長.在siii培養(yǎng)基上培養(yǎng)2周之后，將子葉從外植體移除，通過在子葉的基部做切口切下含有胚軸的齊平的(flush)芽墊。將分離自子葉的芽墊轉移到芽伸長(se)培養(yǎng)基上。該se培養(yǎng)基含有ms鹽、28mg/l二價鐵、38mg/lna2edta、30g/l蔗糖和0.6g/lmes、50mg/l天冬酰胺、100mg/ll--焦谷氨酸、0.1mg/liaa、0.5mg/lga3、1mg/l玉米素核苷、50mg/ltimentintm、200mg/l頭孢噻肟、50mg/l萬古霉素、6mg/l草丁膦、7g/lnoble瓊脂，(ph5.7)。每2周將培養(yǎng)物轉移到新鮮的se培養(yǎng)基上。培養(yǎng)物在生長室中在24℃下培養(yǎng)，使用18h光周期，光強為80-90μmol/m2sec。生根.對于從子葉芽墊發(fā)出的伸長芽，通過在子葉芽墊基部切割伸長芽加以分離，并將伸長芽浸入1mg/liba(吲哚-3-丁酸)中1-3分鐘促進生根。接著，將伸長芽轉移到phyta托盤中的生根培養(yǎng)基(ms鹽、b5維生素、28mg/l二價鐵、38mg/lna2edta、20g/l蔗糖和0.59g/lmes、50mg/l天冬酰胺、100mg/ll-焦谷氨酸、7g/lnoble瓊脂，ph5.6)中。栽培.在convirontm生長室24℃、18h光周期培養(yǎng)1-2周之后，將已經生根的芽轉移到帶蓋的圣代杯內的土壤混合物中，放到convirontm生長室(型號cmp4030和cmp3244、controlledenvironmentslimited、winnipeg、manitoba、canada)內，置于長的白晝條件下(16小時光照/8小時黑暗)，光強度為120-150μmol/m2sec，溫度(22℃)和濕度(40-50％)恒定，以馴化小植物。生根的小植物在圣代杯中馴化數(shù)周之后，轉移到溫室中進行進一步的馴化并定植強健的轉基因大豆植物。獲得另外的10-20個表達針對rnai構建體的發(fā)夾dsrna的t1大豆獨立系用于bsb攻擊。可以獲得如seqidno:86和/或seqidno:87中所示，或進一步包含seqidno:84的發(fā)夾dsrna。這些通過rt-pcr或其他分子分析方法加以確認。任選用來自選擇的獨立t1系的總rna制備物進行rt-pcr，其中引物設計為結合每個rnai構建體中的發(fā)夾表達盒中的st-ls1內含子。另外，任選用針對rnai構建體中每個靶基因的特異性引物進行擴增，并且在植物體內確認產生sirna所需要的預加工mrna的產生。每個靶基因的期望條帶的擴增可確認每個轉基因玉米植物中發(fā)夾rna的表達。任選地隨后在獨立轉基因系中利用rna印跡雜交來確認靶基因的dsrna發(fā)夾加工成sirna。此外，與靶基因具有80％以上序列同一性且具有錯配序列的rnai分子影響玉米根蟲的方式類似于與靶基因具有100％序列同一性的rnai分子。錯配序列與天然序列的配對在同一個rnai構建體中形成發(fā)夾dsrna，從而投放出能夠影響攝食的半翅目害蟲的生長、發(fā)育和生存力的植物加工的sirna。在植物內投放對應于靶基因的dsrna、sirna、shrna、或mirna，隨后被半翅目害蟲通過攝食而攝取，結果導致半翅目害蟲中的靶基因由于rna介導基因沉默作用而下調。當靶基因在發(fā)育的一個或多個階段中重要時，半翅目害蟲的生長、發(fā)育和/或存活受影響，并且在英雄美洲蝽、蓋德擬壁蝽、茶翅蝽、稻綠蝽、綠蝽(acrosternumhilare)、褐椿象中至少一者的情況下，可導致半翅目害蟲無法成功侵染、進食、發(fā)育和/或生殖，或導致其死亡。然后選定的靶基因的和rnai的成功應用可用來控制半翅目害蟲。轉基因rnai系和非轉化玉米的表型比較.選用于創(chuàng)建發(fā)夾dsrna的靶半翅目害蟲基因或序列與任何已知的植物基因序列都沒有相似性。因此可以預期，靶向這些半翅目害蟲基因或序列的構建體的(系統(tǒng)性)rnai的產生或者激活不會對轉基因植物產生任何有害影響。盡管如此，將轉基因系的發(fā)育和形態(tài)特征與非轉化植物、以及用沒有發(fā)夾表達基因的“空”載體轉化的轉基因系進行比較。比較植物根、芽、葉和生殖特征。轉基因植物和非轉化植物在根長和生長模式上沒有可觀察到的差異。諸如高度、葉數(shù)和大小、開花時間、花大小和外觀之類的植物地上部特征是相似的?？偟膩碚f，在體外以及在溫室土壤中培養(yǎng)時，在轉基因品系和沒有表達靶irna分子的品系之間沒有可觀察到的形態(tài)差異。實施例15人工飲食的英雄美洲蝽生物測定在使用人工餌食的copialphadsrna飼喂測定中，與注射實驗(實施例12)相同，設置具有一顆約18mg的人工飼料小丸和水的32孔托盤。將濃度為200ng/μl的dsrna加入到食物小丸和水樣品中，向兩個孔中的每一個加入100μl。向每個孔中加入5只第2齡的英雄美洲蝽若蟲。以水樣品和靶向yfp轉錄物的dsrna作為陰性對照。在三個不同的日期重復實驗。稱重存活的昆蟲，并在處理8天后測定死亡率。實施例16包含半翅目害蟲序列的轉基因擬南芥使用與實施例4相似的標準分子方法產生包含用于發(fā)夾形成的靶基因構建體的擬南芥轉化載體，所述構建體包含copialpha(seqidno:84)的區(qū)段。使用標準的基于土壤桿菌的方法進行擬南芥轉化。用草銨膦耐受性選擇標志物選擇t1種子。產生轉基因t1擬南芥植物，并產生純合的單拷貝t2轉基因植物用于昆蟲研究。對具有花序的生長中的擬南芥植物進行生物測定。將五至十只昆蟲放置在每株植物上，并在14天內監(jiān)測存活。擬南芥轉化載體的構建.使用化學合成的片段(dna2.0，menlopark，ca)的組合，以及標準的分子克隆方法，組裝基于入門載體pdab3916的入門克隆，這些入門克隆包含用于發(fā)夾形成的靶基因構建體，靶基因構建體包含copialpha(seqidno:84)。通過將靶基因區(qū)段的兩個拷貝以相反方向排列(在單個轉錄單元內)，兩個區(qū)段被st-ls1內含子序列(seqidno:14)(vancanneytetal.(1990)mol.gen.genet.220(2)：245-50)所分隔，可以易化rna初級轉錄物的分子內發(fā)夾形成。因此，初級mrna轉錄物包含兩個copialpha基因區(qū)段序列，它們彼此作為對方的大反向重復序列，由內含子序列分隔開。使用一個擬南芥泛素10啟動子(callisetal.(1990)j.biologicalchem.265：12486-12493))的拷貝來驅動初級mrna發(fā)夾轉錄物的產生，并且使用包含來自根癌土壤桿菌的開放閱讀框23(atuorf233'utrv1；美國專利號5,428,147)的3'非翻譯區(qū)的片段來終止表達發(fā)夾rna的基因的轉錄。將上述pdab3916載體內的發(fā)夾克隆用于標準重組反應，使用典型的二元目的載體pdab101836，以產生用于土壤桿菌介導的擬南芥轉化的發(fā)夾rna表達轉化載體。二元目的載體pdab101836包含在木薯葉脈花葉病毒啟動子(csvmv啟動子v2，美國專利號us7601885；verdaguer等人(1996)plantmol.biol.31:1129-1139))控制下的除草劑耐受基因dsm-2v2(美國專利申請?zhí)?011/0107455)。使用包含來自根癌土壤桿菌開放閱讀框1的3'非翻譯區(qū)(atuorf13'utrv6；huang等人(1990)j.bacteriol，172：1814-1822)的片段來終止dsm2v2mrna的轉錄。通過標準重組反應用典型的二元目的載體(pdab101836)和入門載體pdab3916構建包含表達yfp發(fā)夾rna的基因的陰性對照二元構建體pdab114507。入門構建體pdab112644包含在擬南芥泛素10啟動子(如上)的表達控制下的yfp發(fā)夾序列(hpyfpv2-1，seqidno:95)和包含來自根癌土壤桿菌的orf233'非翻譯區(qū)的片段(如上所述)。包含殺蟲發(fā)夾rna的轉基因擬南芥的產生：土壤桿菌介導的轉化.將含有發(fā)夾序列的二元質粒電穿孔到土壤桿菌菌株gv3101(pmp90rk)中。通過重組土壤桿菌菌落的質粒制備物的限制性分析確認重組土壤桿菌克隆。使用qiagenplasmidmaxkit(qiagen，cat#12162)根據(jù)制造商推薦的方案從土壤桿菌培養(yǎng)物中提取質粒。擬南芥轉化和t1選擇.將12至15株擬南芥植物(columbia栽培種)在溫室中的4”盆中生長，光強度為250μmol/m2，25℃和18:6小時光照:黑暗條件。轉化前一周修剪主花莖。通過將10μl的重組土壤桿菌甘油儲在28℃、225rpm振蕩下在100mllb肉湯(sigmal3022)+100mg/l壯觀霉素+50mg/l卡那霉素中溫育72小時來制備土壤桿菌接種物。收獲土壤桿菌細胞，并將其懸浮于5％蔗糖+0.04％silwet-l77(lehleseedscat#vis-02)+10μg/l苯甲氨基嘌呤(ba)溶液中至od6000.8～1.0，然后浸花。將植株的地上部分浸入土壤桿菌溶液5-10分鐘，輕柔攪動，然后將植株轉移到溫室中進行正常生長，并定期澆水和施肥，直到種子定植。實施例17轉基因擬南芥的生長和生物測定選擇用發(fā)夾rnai構建體轉化的t1擬南芥.將來自每次轉化的至多達200mg的t1種子在0.1％瓊脂糖溶液中分層。將種子種植在裝有5號陽光培養(yǎng)基(sunshinemedia)的發(fā)芽盤(10.5”×21”×1”；t.o.plasticsinc.，clearwater，mn)中。在種植后6天和9天，選擇對280g/ha的(草銨膦)具有耐受性的轉化體。將選出的事件移植到4”直徑的盆中。在移植的一周內進行插入拷貝分析，插入拷貝分析使用rochelightcycler480的水解定量實時pcr(qpcr)。使用lightcyclerprobedesignsoftware2.0(roche)，針對dsm2v2選擇標記設計pcr引物和水解探針。將植物維持在24℃，在強度為100-150me/m2×s的熒光和白熾燈下以16:8小時光:暗光周期。英雄美洲蝽植物飼養(yǎng)生物測定.為每個構建體選擇至少四個低拷貝事件(1-2個插入)、四個中拷貝事件(2-3個插入)和四個高拷貝(≥4個插入)事件。使植物生長至開花期(植物有花和長角果)。土壤表面覆蓋有～50ml體積的白色沙子，便于鑒別昆蟲。將五到十二齡的英雄美洲蝽若蟲引入每株植物。植物用直徑3”，高16”，壁厚0.03”的塑料管(產品號484485，visipackfentonmo)覆蓋；用尼龍網蓋住管子以隔離昆蟲。在conviron培養(yǎng)箱中將植物保持在正常溫度、光照和澆水條件下。在14天中，收集昆蟲并稱重，計算死亡率百分比以及生長抑制(1-處理重量/對照重量)。用表達yfp發(fā)夾的植物作為對照。t2擬南芥種子生成和t2生物測定.對于每個構建體，從選定的低拷貝(1-2個插入)事件產生t2種子。如上所述，對植物(純合的和/或雜合的)進行英雄美洲蝽飼養(yǎng)生物測定。從純合子收獲t3種子并儲存用于將來分析。上文已經通過實施例詳細描述了具體實施方案，但本公開可能容許各種修改和替代形式。然而，應當理解，本公開不旨在限于所公開的特定形式。相反，本公開應覆蓋落入由附隨的權利要求及其法律上等同物限定的本公開的范圍內的所有修改、等同物和替代物。序列表<110>美國陶氏益農公司k·納瓦h·李c·耿n·埃蘭戈m·j·亨利m·蘭加薩米a·t·伍斯利k·阿羅拉p·甘德拉s·e·沃登e·菲什里維奇<120>賦予鞘翅目和半翅目害蟲抗性的copi外被體alpha亞單位核酸分子<130>74228<150>62/063199<151>2014-10-13<160>95<170>patentinversion3.5<210>1<211>4037<212>dna<213>玉米根螢葉甲(diabroticavirgifera)<400>1ttgctgttcaactcttaactcgtaatcgtaaaacttgtaaataagaagaagaatgaagaa60gaaaagtttgacgtgtcaggttttaaaggtttgatttccacgtcaatagtggtaaatttg120ttaaaagtatatattttcttgtagtaaaagacggttttttgttgaaatgtgctaataatg180cgataagtattgtatagagttataactgagcctaatcattgtgttttaaaaactatcatg240ttaactaagtttgaaacgaaatccgcccgggtaaaagggctgtcttttcaccctaaacgt300ccctggatcttaactagtcttcacaatggttgtatccaattatgggactaccgtatgtgc360accctcctagagaaatttgatgagcatgatggccctgtaagaggcatttgcttccacaat420caacagcccttatttgtttctggtggtgatgattacaagatcaaagtatggaattacaaa480caaaaacgatgcatttttactctattgggtcatttagattatattcgtacaacattgttc540caccatgaatatccatggatagtttccgcatctgatgatcaaactatcaggatctggaat600tggcagagcagaacttgcatttgtgttttaactggacacaatcactatgttatgtgtgta660agttttcatccttctgaagatttgctggtgtcagcttcattggattccactgtcagagtt720tgggacatttcaggcttaagaaagaaaaatgtagctccaggtccagcaggactagaggaa780catttgaagaatccaggagcaactgatctttttggtcaagcagatgcagttgtaaaacat840gtgttagagggtcatgatagaggtgtaaactgggcatctttccatccaactctgcctctt900attgcctctggtgctgatgacagacaagtaaaattatggagaatgaatgattctaaagca960tgggaagttgatacatgccgaggccactggcataatgtttcttgtgttttattccatcct1020agacaggaactgattctctcaaacagtgaagataaaactattagagtttgggatacaact1080aaaagaacttgcctacatacatttaaaagggaaaatgaaagattctggataatggcatca1140catccaaacctcaacttgtttgctgctggacatgatggtggaatggttatattcaagctt1200gagcgtgaacgtccagcttacacagtacatggcaacctcctgtattatgttaaagaacgt1260tacttacgaaaacttgattttaccacatctaaagatgttccagtcattcagattcgtggt1320ggaggaaaaataccagtttataagatgtcctttaatccagctgaaaatgctgttcttctt1380tctacaagaacttcaaacttggataatagcacatacgatttatatgtgattccaaaagag1440caggagagagatgatcaagtaccagaagctgaaagcaaaaggtcttctggacttacggca1500ttatgggttgcaagaaacagatttgccgttttggacaggactcatcaactaattatcaag1560aacttgaaaaacgaagtcaccaagaaggtacaaactcctacatgtgatgaagtattttat1620gctggtactggaatgctgttattaagagattctgaacatgttactctgtttgacgttcaa1680cagaagagaactttagcacaagtgaaaattaacaaatgcagatacgttgtctggtcgtct1740gatatgtcccacttggctctcctttccaaacacaacgtgactatttgtaataggaaattg1800gatgttttatgttgtttacacgaaaatactagagtgaaatctggagcttgggatgataca1860ggagtttttatttatactacaagcaaccatttgaaatatacacttaaaaacggtgaccaa1920ggaattattagaaccctcgatcttccaatatacatcaccagagtaagaggaaaccagatc1980ttttgccttgatcgtgaatgcaaaccacgggtattgacagtggattcaatggaatacaaa2040ttcaaacttgcattaattaatcacaaatatgaagaagttttgtatatggtta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