克氏錐蟲（trypanosomacruzi）是引起被稱為查加斯病的熱帶寄生蟲病的鞭毛蟲原生動物。在查加斯病過程中，受感染的患者通常通過急性期，隨后為慢性期，其具有介于溫和和威脅生命之間的不同癥狀。只有在初期階段，患者才能對抗寄生蟲治療有響應(yīng)。一些患者發(fā)生導(dǎo)致死亡的心臟或腸道并發(fā)癥?？耸襄F蟲通常通過昆蟲載體(即錐獵蝽亞科(subfamilytriatominae)(獵蝽科(familyreduviidae)，德文：“raubwanzen”)的吸血“親吻蟲”)傳播給人類和其他哺乳動物。該疾病也可通過輸血和器官移植、攝入被寄生蟲污染的食物而傳播以及從母親傳播到胎兒。為了防止查加斯病的進(jìn)一步傳播，重要的是基于血液中的寄生蟲的存在和針對克氏錐蟲的抗體篩選獻(xiàn)血和醫(yī)療產(chǎn)品，特別是在主要感染的區(qū)域，如墨西哥、中南美洲和美國南部。如今，幾種血清學(xué)診斷方法可用來檢測克氏錐蟲的感染，例如，通過間接免疫熒光、間接血細(xì)胞凝集、補體固定、免疫印跡技術(shù)和elisa檢測針對克氏錐蟲的抗體。還應(yīng)用分子生物學(xué)方法(例如pcr)和復(fù)雜的媒介生物診斷方法。在媒介生物診斷法中，使載體傳播的感染物，實驗室培育的、無病原體昆蟲(此處為：接吻蟲)從患者吸取血液。然后檢查昆蟲的腸內(nèi)容物中病原體(此處為：克氏錐蟲)的存在。這些方法中的每一種在靈敏度和特異性方面都顯示出其自身的弱點和優(yōu)勢，因此目前還沒有可用的金標(biāo)準(zhǔn)方法。在開始開發(fā)查加斯測定法用于檢測抗體中，應(yīng)用了且仍正在使用天然抗原裂解物。然而，使用裂解物，在該抗原組合物中僅代表克氏錐蟲的三個發(fā)育階段之一，使得存在錯過其他兩個階段的感染的特定可能性。更現(xiàn)代的測定法應(yīng)用代表克氏錐蟲感染的所有階段的重組抗原的混合物。用于檢測針對克氏錐蟲抗原的抗體的血清學(xué)測定已經(jīng)在現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)中廣泛描述。例如silveira等人(trendsinparasitology2001,vol.17no.6,p.286-291)描述了已經(jīng)由幾個實驗室分離了與血清診斷相關(guān)的克氏錐蟲重組抗原。這些基因中的幾個具有串聯(lián)重復(fù)的序列，得到顯示重復(fù)的氨基酸序列基序的蛋白。在用于檢測針對克氏錐蟲的抗體的血清學(xué)測定中廣泛使用的抗原之一是jl7，uniprot數(shù)據(jù)庫條目號q4cs87，其也通過同義詞fra、ag1和h49描述(對于綜述，參見例如cotrim等人1995,molbiochemparasitol71,89-98和umezawa等人1999,jclinmicrobiol,1554-1560)。silveira等人(同上)也描述了用于elisa測定中的各種額外的克氏錐蟲抗原的幾種混合物中的fra(jl7)。沒有公開特定jl7相關(guān)多肽。valiente-gabioud等人(exp.parasitol.2011,127,p.672-679)討論了重復(fù)性對克氏錐蟲fra(jl7)蛋白的免疫原性和抗原性的影響。建議使用四個重復(fù)的重復(fù)以得到令人滿意的來自人受感染血清的elisa信號。沒有解決測定特異性的問題，并且沒有公開特定jl7多肽?；谏鲜鰆l7序列的所有抗原變體都攜帶在克氏錐蟲的品系和分離株之間高度保守的68個氨基酸的重復(fù)。jl7是推定的226個氨基酸的鈣蛋白酶半胱氨酸肽酶，其包含所述68個氨基酸的基序的約3.5個重復(fù)(參見圖1)。然而，攜帶幾個相同或非常相似重復(fù)的抗原通常容易受到干擾，所述干擾由存在于待分析抗克氏錐蟲抗體的存在的樣品中的igm或igg分子或風(fēng)濕因子的非特異性結(jié)合引起。因此，在提供用于檢測克氏錐蟲感染的重組jl7抗原組合物和診斷方法時可以看到問題，所述重組jl7抗原組合物和診斷方法克服了在干擾敏感性方面的缺點。該問題通過如權(quán)利要求中所指定的本發(fā)明來解決。請求保護(hù)的抗原和組合物以及診斷方法提供了具有高特異性和靈敏度和可靠再現(xiàn)性的免疫診斷溶液。發(fā)明概述本發(fā)明涉及適合于檢測分離的生物樣品中針對克氏錐蟲jl7抗原的抗體的jl7抗原的變體。這些抗原包含jl7特異性氨基酸序列，所述jl7特異性序列由兩個拷貝的seqidno.2組成，其中所述兩個拷貝中的每一個與seqidno.2具有至少90％的氨基酸同一性，并且其中所述多肽中不存在進(jìn)一步的克氏錐蟲特異性氨基酸序列。本發(fā)明還涉及可用于檢測針對克氏錐蟲的抗體的多肽的組合物，其包含上述表征的jl7抗原連同克氏錐蟲多肽1f8、cruzipain、kmp-11和par-2中的至少一種。此外，本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生jl7抗原的方法以及用于使用jl7多肽檢測克氏錐蟲抗體的診斷方法。此外，本發(fā)明涉及包含所述jl7多肽或克氏錐蟲多肽的組合物的試劑盒。公開的氨基酸序列的說明：seqidno.1顯示了下述的部分序列：克氏錐蟲蛋白jl7(uniprot條目q4cs87)，也稱為fra、ag1、h49；完全描述性名稱：鈣蛋白酶半胱氨酸肽酶，推定。seqidno.1顯示了上述uniprot數(shù)據(jù)庫條目的氨基酸位置62-287，得到長度為226個氨基酸的多肽。全長蛋白包含氨基酸1至1275。seqidno.2顯示了抗原jl7短1，也顯示為seqidno.1的氨基酸位置1-68seqidno.3顯示了抗原jl7短2，也顯示為seqidno.1的氨基酸位置69-136seqidno.4顯示了對應(yīng)于seqidno.2和3的組合的抗原jl7短1+2，也顯示為seqidno.1的氨基酸位置1-136seqidno.5顯示了對應(yīng)于seqidno.1的氨基酸位置137-226的抗原jl7短3+4seqidno.6顯示了對應(yīng)于seqidno.1的氨基酸位置137-204的抗原jl7短3seqidno.7顯示了可以添加至根據(jù)本發(fā)明的多肽的n-端末端或優(yōu)選根據(jù)本發(fā)明的多肽的c端末端的六組氨酸標(biāo)簽。該標(biāo)簽用于促進(jìn)蛋白純化。附圖說明：圖1完整jl7氨基酸序列中的重復(fù)的結(jié)構(gòu)。上部：比對所有四個重復(fù)，其顯示了氨基酸同一性(粗體字母)和差異(正常加下劃線的字母)。下部：jl7變體的示意圖及其重復(fù)結(jié)構(gòu)域的相對位置。jl7短1+2代表根據(jù)本發(fā)明的jl7抗原。圖2：jl7、jl7短1、jl7短2、jl7短1+2和jl7短3+4的遠(yuǎn)uvcd光譜。在jasco-720分光偏振計上在恒溫槽座中在20℃下記錄光譜。在0.1cm比色杯中，蛋白濃度為0.2mg/ml。緩沖液為10mm磷酸鉀ph7.5。帶寬為1nm，分辨率為1nm，掃描速度為50nm/min，響應(yīng)為2s。8次記錄光譜，并將其平均化，以便改善信噪比。將信號轉(zhuǎn)化為摩爾橢圓率(以度cm2dmol-1給出)。jl7和jl7短1+2的光譜指向具有高含量的α-螺旋結(jié)構(gòu)元件(在208nm和222nm的信號帶)的蛋白。jl7短1、jl7短2和jl7短3+4的光譜表明具有高度無序結(jié)構(gòu)(200nm附近的信號帶)的蛋白。發(fā)明詳述克氏錐蟲jl7抗原及其氨基酸序列的特性已經(jīng)在現(xiàn)有技術(shù)中廣泛描述。然而，由具有多個重復(fù)的抗原引起的診斷克氏錐蟲測定法的對干擾的敏感性增加的問題尚未得到充分解決。當(dāng)例如非特異性igm分子或非特異性igg與待分析樣品中存在的風(fēng)濕因子一起產(chǎn)生陽性測試結(jié)果時，對干擾的高易損性可能導(dǎo)致假陽性結(jié)果，假裝抗克氏錐蟲抗體存在于樣品中，而實際上樣品應(yīng)當(dāng)被檢測為陰性。假陽性結(jié)果導(dǎo)致測定特異性的不期望的降低。然而，在傳染病的診斷方法中，參數(shù)監(jiān)管機構(gòu)要求高度的特異性。令人驚訝的是，我們已經(jīng)鑒定了jl7變體，其一方面的確仍然具有足夠的被樣品抗體結(jié)合的抗原特性，另一方面不會導(dǎo)致假陽性結(jié)果。完整的jl7多肽具有68個氨基酸的基序的約3.5個重復(fù)。問題是一個重復(fù)是否足以提供合適的診斷稀有試劑。當(dāng)重復(fù)1和2(分別命名為jl7短1，seqidno.2和jl7短2，seqidno.3)作為分離的抗原表達(dá)時，無一縮短的變體能夠正確檢測所有陽性樣品(表2)。對于由約1.5個重復(fù)組成的縮短變體(被稱為jl7短3+4)(如seqidno.5中所示)也是如此。然而，當(dāng)所述68個氨基酸基序的兩個重復(fù)被相鄰地放在一起(諸如seqidno.4中)時，已最初使用具有3.5個重復(fù)的完整jl7多肽診斷為陽性的樣品證明實際上是假陽性樣品。另一方面，具有68個氨基酸重復(fù)的兩個重復(fù)的所述jl7多肽(如seqidno.2中所示)能夠正確地可靠地檢測真陽性樣品為陽性，即含有針對克氏錐蟲的抗體。因此，本發(fā)明涉及適合于檢測分離的生物樣品中針對克氏錐蟲jl7抗原的抗體的多肽，其包含jl7特異性氨基酸序列，所述jl7特異性序列由兩個拷貝的seqidno.2組成，其中所述兩個拷貝中的每一個與seqidno.2具有至少90％的氨基酸同一性，并且其中所述多肽中不存在進(jìn)一步的克氏錐蟲特異性氨基酸序列。根據(jù)本發(fā)明，兩個拷貝的seqidno.2可以彼此直接相鄰，使得在兩個拷貝之間不存在另外的氨基酸。作為替代方案，它們可以通過不存在于jl7特異性序列中的接頭序列分開。這兩個拷貝的seqidno.2不需要完全相同，但兩個序列必須顯示與seqidno.2相比至少90％的氨基酸同一性。例如，seqidno.4(jl7短1+2)包含seqidno.2(jl7短1)和seqidno.3(jl7短2)。seqidno.2簡單地顯示與seqno.2的100％氨基酸同一性，且seqidno.3的68個氨基酸中的66個與seqidno.2相同，導(dǎo)致97%的氨基酸同一性程度。作為另一個實例，圖1中顯示的重復(fù)3(seqidno.6)與seqidno.2相比具有6個氨基酸位置的差異，導(dǎo)致91％氨基酸同一性(62/68)。根據(jù)本發(fā)明，jl7多肽因此可以包含其中jl7特異性部分由seqidno.2和3或seqidno.2和6或seqidno3和6組成的氨基酸序列。在優(yōu)選的模式中，jl7特異性部分由seqidno.4(其為seqidno2和3的組合)組成。為了清楚起見，還有62、63、64、65、66或67個氨基酸的較短長度的jl7特異性氨基酸序列(其中縮短的jl7片段的所有剩余氨基酸殘基與seqidno.2相同)滿足與seqidno.2的至少90％氨基酸同一性(例如62/68=91％)的要求。在另一個實施方案中，與seqidno.2的氨基酸同一性的要求為至少95％。優(yōu)選地，所述縮短的jl7片段的缺失涉及n-和c-末端氨基酸殘基，使jl7seqidno.2序列的核心完整。重要的是，除了jl7特異性氨基酸序列之外，根據(jù)本發(fā)明的多肽中不存在進(jìn)一步的克氏錐蟲特異性氨基酸序列。為了清楚起見，在多肽中不存在超出明確描述的那些的還有其它jl7特異性氨基酸序列。因此，本發(fā)明中不涵蓋如seqidno.1中所公開的全長jl7。為了提供本發(fā)明的清楚性，例如seqidno.4(其已經(jīng)攜帶seqidno.2中所示的序列基序的兩個重復(fù))的還有幾個分子不能存在于同一多肽鏈上。根據(jù)本發(fā)明，還考慮jl7抗原的變體，只要滿足這樣的先決條件：jl7特異性序列由兩個拷貝的seqidno.2組成，每個拷貝與seqidno.2具有至少90％的氨基酸同一性。在一個實施方案中，與seqidno.2的所述氨基酸同一性為至少95％。只要維持體外診斷免疫測定中的免疫反應(yīng)性，即變體仍然能夠結(jié)合并檢測樣品中存在的抗克氏錐蟲抗體，則變體分類為這樣。變體也是已經(jīng)例如通過將接頭氨基酸序列、標(biāo)記物、標(biāo)簽、氨基酸序列或載體部分共價連接至多肽或抗原而修飾的jl7多肽。術(shù)語“變體”還涉及翻譯后修飾的蛋白，諸如糖基化或磷酸化蛋白，或便于克隆、表達(dá)、純化和折疊的融合蛋白。術(shù)語jl7變體、jl7抗原、jl7多肽或jl7抗原多肽或蛋白在本說明書中同義使用。術(shù)語克氏錐蟲(trypanosomacruzi(=t.cruzi))特異性抗原或克氏錐蟲多肽也被理解為同義，并且各自指可以在任何天然存在的克氏錐蟲品系中發(fā)現(xiàn)的多肽序列，也稱為氨基酸序列，其可通過國際蛋白序列數(shù)據(jù)庫(諸如uniprot)獲得。通常為了檢測克氏錐蟲感染的所有階段，在用于檢測克氏錐蟲抗體的測定中應(yīng)用幾種不同的克氏錐蟲抗原。因此，本發(fā)明的一個進(jìn)一步方面是適用于檢測分離的生物樣品中針對克氏錐蟲抗原的抗體的多肽的組合物，其包含如上所指定的jl7多肽和至少一種選自1f8、cruzipain、kmp-11和par-2的克氏錐蟲多肽。來自這些額外抗原的氨基酸序列是現(xiàn)有技術(shù)中已知的，并且可以從公開獲得的數(shù)據(jù)庫檢索，所述數(shù)據(jù)庫諸如uniprot；例如1f8(uniprot條目q4d1q2)，也稱為fcabp、tc24或tc28；cruzipain(uniprot條目q9tw51)，也稱為cruzain、gp51/57、ag163b6；kmp-11(uniprot條目q9u6z1)；par2(uniprot條目q01530)，也稱為pfr2。術(shù)語組合物意味著將分離的單獨的克氏錐蟲多肽組合成混合物。該術(shù)語不應(yīng)包括這樣的多肽：其已在一個單個氨基酸鏈上重組表達(dá)或合成、使得所有多肽作為多抗原-融合多肽位于僅一個多肽鏈上。換句話說，排除了天然不出現(xiàn)在單個多肽鏈上的幾個表位的多表位融合抗原。相反，額外克氏錐蟲多肽1f8、cruzipain、kmp-11和par2中的每一種在分開的多肽鏈上表達(dá)或作為分開的多肽鏈化學(xué)合成。通過在一個容器或管中混合個別克氏錐蟲多肽、導(dǎo)致產(chǎn)生組合物來產(chǎn)生組合物。所述組合物可以是液體，即將克氏錐蟲多肽以水或緩沖液可溶形式添加至混合物。合適的緩沖液成分是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。所述組合物也可以是固體，即其包含凍干或其它干燥形式的克氏錐蟲抗原。此外，本發(fā)明涉及產(chǎn)生如上進(jìn)一步描述的可溶性和免疫反應(yīng)性克氏錐蟲jl7多肽的方法，所述方法包括以下步驟：a)培養(yǎng)用表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，所述表達(dá)載體包含可操作連接的編碼克氏錐蟲jl7多肽的重組dna分子，b)表達(dá)所述克氏錐蟲jl7多肽，和c)純化所述克氏錐蟲jl7多肽。本發(fā)明的另一個方面是用于檢測分離的樣品中對于克氏錐蟲特異性的抗體的方法，其中如上所公開的克氏錐蟲jl7多肽或通過上面定義的方法獲得的克氏錐蟲jl7多肽或剛剛描述的克氏錐蟲多肽的組合物用作所述克氏錐蟲抗體的捕獲試劑和/或結(jié)合配偶體。又另一個實施方案是用于檢測分離的樣品中的對于克氏錐蟲特異性的抗體的方法，所述方法包括a)通過將體液樣品與根據(jù)本發(fā)明的克氏錐蟲jl7多肽或已經(jīng)描述的組合物或通過本說明書前述段落中說明的方法獲得的克氏錐蟲jl7多肽混合而形成免疫反應(yīng)混合物b)將所述免疫反應(yīng)混合物保持足以使體液樣品中存在的針對所述多肽樣品的組合物的抗體與所述克氏錐蟲多肽的組合物免疫反應(yīng)以形成免疫反應(yīng)產(chǎn)物的時間段；和c)檢測所述免疫反應(yīng)產(chǎn)物中的任一種的存在和/或濃度。在一個進(jìn)一步方面，根據(jù)本發(fā)明的免疫測定方法適用于檢測所有可溶性免疫球蛋白亞類的克氏錐蟲抗體，包括作為查加斯診斷的最相關(guān)亞類的igg和igm。本發(fā)明進(jìn)一步涉及用于以所謂的雙抗原夾心形式dags檢測分離的樣品中對于克氏錐蟲特異性的抗體的方法。所述用于檢測分離的樣品中對于克氏錐蟲特異性的抗體的方法優(yōu)選以雙抗原夾心(dags)形式進(jìn)行。在此測定中，需要和利用抗體結(jié)合至少兩個具有其兩個(igg、iga、ige)或十個(igm)互補位的給定抗原的不同分子的能力。在所述dags免疫測定中，“固相抗原”和“檢測抗原”的基本結(jié)構(gòu)基本上相同，使得樣品抗體在兩種特異性抗原之間形成橋。因此，兩種抗原必須是相同的或免疫交叉反應(yīng)性的，使得一種抗體能夠結(jié)合兩種抗原。進(jìn)行此測定的基本要求是一種或多種相關(guān)表位存在于兩種抗原上。兩種抗原之一可以結(jié)合固相，而另一抗原攜帶可檢測的標(biāo)記物。該方法包括以下步驟：a)向分離的樣品添加可以直接或間接地結(jié)合至固相的第一克氏錐蟲jl7多肽和第二克氏錐蟲jl7多肽，所述第一克氏錐蟲多肽攜帶作為生物親和(bioaffine)結(jié)合對的一部分的效應(yīng)基團(tuán)，且所述第二克氏錐蟲jl7多肽攜帶可檢測的標(biāo)記物，其中所述第一和第二克氏錐蟲jl7多肽特異性結(jié)合所述抗克氏錐蟲抗體，b)形成包含所述第一克氏錐蟲jl7多肽、所述樣品抗體和所述第二克氏錐蟲jl7多肽的免疫反應(yīng)混合物，其中在形成所述免疫反應(yīng)混合物之前、期間或之后添加攜帶所述生物親和結(jié)合對的相應(yīng)效應(yīng)基團(tuán)的固相，c)將所述免疫反應(yīng)混合物保持足以使體液樣品中針對所述第一和第二克氏錐蟲jl7多肽的克氏錐蟲抗體與所述第一和第二克氏錐蟲多肽免疫反應(yīng)以形成免疫反應(yīng)產(chǎn)物的時間段，d)將液相與固相分離e)檢測所述固相或液相或兩者中所述免疫反應(yīng)產(chǎn)物中的任一種的存在。在所述夾心方法的優(yōu)選模式中，第一克氏錐蟲jl7多肽攜帶生物素部分，并且第二克氏錐蟲jl7多肽用可以檢測其信號的電化學(xué)發(fā)光釕絡(luò)合物標(biāo)記。本發(fā)明還涵蓋克氏錐蟲jl7多肽或克氏錐蟲特異性多肽的組合物或通過上述定義的重組生產(chǎn)方法獲得的jl7多肽(全部都在本說明書中上面進(jìn)一步描述)在用于檢測抗克氏錐蟲抗體的體外診斷測試中的用途。本發(fā)明的另一個方面是用于檢測抗克氏錐蟲抗體的試劑盒，其包含根據(jù)本發(fā)明的克氏錐蟲jl7多肽或通過上述進(jìn)一步描述的生產(chǎn)方法獲得的jl7多肽或jl7多肽和至少一種選自1f8、cruzipain、kmp-11和par2的額外克氏錐蟲抗原的組合物。所述試劑盒可用于檢測抗克氏錐蟲抗體的體外診斷測試，并且可以進(jìn)一步含有分開小瓶中的對照和標(biāo)準(zhǔn)溶液以及一種或多種溶液中或凍干形式的另外的試劑與通常的添加劑、緩沖液、鹽、洗滌劑等，以及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的使用說明書。本發(fā)明在實施例部分中進(jìn)一步舉例說明。實施例1克氏錐蟲jl7抗原變體的克隆和純化為了研究適用于免疫診斷測試中的克氏錐蟲jl7抗原的最小尺寸，生成了由一個或兩個重復(fù)單元組成的幾種變體。編碼如表1中所列的克氏錐蟲抗原的合成基因購自eurofinsmwgoperon(ebersberg,germany)?；趎ovagen(madison,wi,usa)的pet24a表達(dá)質(zhì)粒，進(jìn)行以下克隆步驟。用nde1和xho1消化載體，并插入包含各自克氏錐蟲抗原的盒。將所得質(zhì)粒的插入物測序，并發(fā)現(xiàn)其編碼所需蛋白。所得蛋白的氨基酸序列顯示于本發(fā)明的序列方案中。所有重組克氏錐蟲多肽變體都含有c末端六組氨酸標(biāo)簽(seqidno.7)，以促進(jìn)ni-nta輔助的純化。seqidno概述于表1中。所有克氏錐蟲抗原都根據(jù)以下方案純化。使攜帶表達(dá)質(zhì)粒的大腸桿菌bl21(de3)細(xì)胞在加有卡那霉素(30μg/ml)的lb培養(yǎng)基中生長至od600為1，并通過添加異丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)至1mm的最終濃度而誘導(dǎo)細(xì)胞溶質(zhì)過表達(dá)，生長溫度為37℃。誘導(dǎo)后4小時，通過離心(5000xg，20分鐘)而收獲細(xì)胞，冷凍并儲存于-20℃。對于細(xì)胞裂解，將冷凍的沉淀物重懸浮于每50ml緩沖液(蛋白酶抑制劑混合物)25mm磷酸鈉ph8.5、6mmmgcl2、10u/mlbenzonase?、1片complete?和1片complete?edta-free中，并通過高壓均質(zhì)化來裂解所得懸浮液。將粗裂解物補充直至50mm磷酸鈉、10mm咪唑。離心后，將上清液施加至預(yù)先平衡于緩沖液a(50mm磷酸鈉ph8.5、100mm氯化鈉、10mm咪唑)中的ni-nta(鎳-次氮基三乙酸酯)柱上。洗脫前，將咪唑濃度提高至40mm，以除去污染蛋白。然后通過應(yīng)用250mm的咪唑濃度來洗脫蛋白。最后，將蛋白進(jìn)行大小排阻色譜，并將含蛋白級分合并并濃縮。表1：克氏錐蟲jl7抗原變體seqidno的概述?？耸襄F蟲抗原seqidno.jl71jl7短12jl7短23jl7短1+24jl7短3+45jl7短36實施例2光譜測量圓二色光譜(cd)是選擇以評價蛋白中的二級結(jié)構(gòu)的方法。酰胺區(qū)(190-250nm)中的橢圓率反映了蛋白骨架(即二級結(jié)構(gòu))中的規(guī)則重復(fù)元件。用具有恒溫槽座的jasco-720分光偏振計記錄近-uvcd光譜，并將其轉(zhuǎn)化為摩爾橢圓率。緩沖液為10mm磷酸鉀ph7.5。路徑長度為0.1cm，蛋白濃度為0.2mg/ml。帶寬為1nm，掃描速度為50nm/min(分辨率為1nm)，且響應(yīng)為2s。為了改善信噪比，八次測量光譜，并將其平均化。圖2顯示jl7、jl7短1、jl7短2、jl7短1+2和jl7短3+4的遠(yuǎn)uvcd光譜。jl7和jl7短1+2的光譜指向具有高含量的α-螺旋結(jié)構(gòu)元件(在208nm和222nm的信號帶)的蛋白。jl7短1、jl7短2和jl7短3+4的光譜表明具有高度無序結(jié)構(gòu)(200nm附近的信號帶)的蛋白。因此，結(jié)構(gòu)良好的變體jl7短1+2在免疫測定中顯示最佳結(jié)果(實施例4和表2)的發(fā)現(xiàn)是一致的。我們假設(shè)較短的變體jl7短1、jl7短2和jl7短3+4不能維持這樣的三維結(jié)構(gòu)，其維持可被樣品抗體結(jié)合的重要的可識別表位。jl7短1+2以比較短變體jl7短1、jl7短2和jl7短3+4更好可接近的方式將相關(guān)表位呈遞給樣品抗體，所述較短變體jl7短1、jl7短2和jl7短3+4不具有氨基酸序列seqidno.2的兩個完整重復(fù)。實施例3生物素和釕部分與克氏錐蟲jl7抗原變體的偶聯(lián)重組蛋白的賴氨酸ε-氨基分別用n-羥基-琥珀酰亞胺活化的生物素和釕標(biāo)記物以～10mg/ml的蛋白濃度進(jìn)行修飾。對于生物素和釕標(biāo)記物綴合，將標(biāo)記物/蛋白摩爾比分別調(diào)整至5:1至15:1。反應(yīng)緩沖液為50mm磷酸鉀(ph8.5)、150mmkcl、0.5mmedta。反應(yīng)在室溫下進(jìn)行30分鐘，并通過添加緩沖的l-賴氨酸至10mm的最終濃度來終止。偶聯(lián)反應(yīng)后，通過將粗蛋白綴合物通過凝膠過濾柱(superdex200hiload)來除去未反應(yīng)的游離標(biāo)記物。實施例4在免疫診斷測試中評價重組克氏錐蟲jl7抗原變體的免疫反應(yīng)性和對干擾的易損性在自動化cobas?e601分析儀(rochediagnosticsgmbh)中評價不同蛋白的免疫反應(yīng)性。以雙抗原夾心形式進(jìn)行測量。由此，將生物素-綴合物(即捕獲抗原)固定在鏈霉抗生物素蛋白-包被的磁珠的表面上，而檢測-抗原攜帶絡(luò)合的釕陽離子作為信號傳導(dǎo)部分。cobas?e601中的信號檢測基于電化學(xué)發(fā)光。在特異性免疫球蛋白分析物存在的情況下，顯色釕絡(luò)合物橋接至固相，并在鉑電極處激發(fā)后發(fā)射620nm的光。信號輸出為任意光單位。用抗克氏錐蟲陽性和陰性人血清和購自幾個來源的血漿樣品進(jìn)行測量。根據(jù)本發(fā)明的重組克氏錐蟲jl7抗原變體以雙抗原夾心(dags)免疫測定形式成對評價。例如，jl7-生物素綴合物與含有50mmmes(ph6.5)、150mmnacl、0.1%聚多卡醇、0.2％牛白蛋白、0.01％n-甲基異噻唑酮、0.1%oxy-pyrion的測定緩沖液中各濃度為100ng/ml的jl7-釕絡(luò)合物綴合物一起進(jìn)行評價。使用的樣品體積為30μl。抗克氏錐蟲陰性人血清用作對照?？箍耸襄F蟲陽性人血清用于評價各變體的抗原性。表2：通過使用重組克氏錐蟲jl7抗原變體檢測人血清中的抗克氏錐蟲抗體在表2中，顯示了表1中所列的所有克氏錐蟲jl7抗原變體(除了jl7短3)的免疫活性。根據(jù)制造商的說明書，用商購的chagas測定法(來自biokits.a.的bioelisachagas)測試了表2的所有樣品，所述chagas測定法使用幾種克氏錐蟲抗原，但沒有jl7。包含來自巴伐利亞紅十字會的獻(xiàn)血者(n=998)的特異性研究揭示，由于巴伐利亞(德國)不是查加斯病的地方性地區(qū)的事實，預(yù)期4個樣品對于抗克氏錐蟲抗體是假反應(yīng)性的，并且批準(zhǔn)的bioelisachagas(biokits.a.)也是無反應(yīng)性的。為了決定樣品是反應(yīng)性還是非反應(yīng)性的，確定平均背景信號(陰性樣品的平均值)，并且計算了平均背景信號的4.5倍(4.5x平均值)的截止值。根據(jù)測定條件，個別選擇作為用于確定樣品是反應(yīng)性還是非反應(yīng)性的閾值的截止值。此程序是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。此外，可以通過將信號計數(shù)除以預(yù)定的截止值(數(shù)據(jù)未顯示)來將絕對信號計數(shù)均一化。因此，陽性、即反應(yīng)性樣品將顯示為大于1(>1)的均一化值，而來自非反應(yīng)性樣品的結(jié)果將具有0和1之間的值。參見表2，顯然，克氏錐蟲jl7抗原變體的反應(yīng)性強烈取決于完整重復(fù)單元的數(shù)目。因此，分離的重復(fù)單元1或2和與縮短的單元4融合的重復(fù)單元3顯示顯著降低的抗原性。其對干擾的易損性似乎立刻被強烈削弱。與此相反，如在變體jl7短1+2的情況下，兩個完整重復(fù)單元的融合體維持整個抗原性，如在完整的jl7分子中一樣，并且同時正確地鑒定陰性和陽性樣品。四個干擾樣品中的兩個顯示測量信號的顯著減少。其中jl7特異性部分僅由seqidno.2(和與其具有至少90％氨基酸序列同一性或在一個實施方案中具有至少95％氨基酸序列同一性的變體)的兩個重復(fù)組成的jl7變體的使用相當(dāng)?shù)卦黾恿丝箍耸襄F蟲免疫測定的特異性。序列表<110>rochediagnosticsgmbhandhoffmann-larocheag<120>重組克氏錐蟲jl7抗原變體及其用于檢測查加斯病的用途<130>p32734wo-ir<160>7<170>patentinversion3.5<210>1<211>226<212>prt<213>克氏錐蟲<400>1metgluglngluargargglnleuleuglulysaspproargargasn151015alaarggluilealaalaleugluglusermetasnalaargalagln202530gluleualaargglulyslysleualaaspargalapheleuaspgln354045lysprogluglyvalproleuarggluleuproleuaspaspaspser505560aspphevalalametgluglngluargargglnleuleuglulysasp65707580proargargasnalalysgluilealaalaleugluglusermetasn859095alaargalaglngluleualaargglulyslysleualaaspargala100105110pheleuaspglnlysprogluglyvalproleuarggluleuproleu115120125aspaspaspseraspphevalsermetgluglngluargargglnleu130135140leuglulysaspproargargasnvalglnlysilealaaspleuglu145150155160glusermetasnalaargalaglngluleualaargglulyslysleu165170175alaaspargalapheleuaspglnlysprogluglyvalserleuarg180185190gluleuproleuaspaspaspseraspphevalsermetgluglnglu195200205argargglnleuleuglulysaspproarglysasnvalglnileval210215220alaasp225<210>2<211>68<212>prt<213>克氏錐蟲<400>2metgluglngluargargglnleuleuglulysaspproargargasn151015alalysgluilealaalaleugluglusermetasnalaargalagln202530gluleualaargglulyslysleualaaspargalapheleuaspgln354045lysprogluglyvalproleuarggluleuproleuaspaspaspser505560aspphevalala65<210>3<211>68<212>prt<213>克氏錐蟲<400>3metgluglngluargargglnleuleuglulysaspproargargasn151015alalysgluilealaalaleugluglusermetasnalaargalagln202530gluleualaargglulyslysleualaaspargalapheleuaspgln354045lysprogluglyvalproleuarggluleuproleuaspaspaspser505560aspphevalser65<210>4<211>136<212>prt<213>克氏錐蟲<400>4metgluglngluargargglnleuleuglulysaspproargargasn151015alaarggluilealaalaleugluglusermetasnalaargalagln202530gluleualaargglulyslysleualaaspargalapheleuaspgln354045lysprogluglyvalproleuarggluleuproleuaspaspaspser505560aspphevalalametgluglngluargargglnleuleuglulysasp65707580proargargasnalalysgluilealaalaleugluglusermetasn859095alaargalaglngluleualaargglulyslysleualaaspargala100105110pheleuaspglnlysprogluglyvalproleuarggluleuproleu115120125aspaspaspseraspphevalser130135<210>5<211>90<212>prt<213>克氏錐蟲<400>5metgluglngluargargglnleuleuglulysaspproargargasn151015valglnlysilealaaspleugluglusermetasnalaargalagln202530gluleualaargglulyslysleualaaspargalapheleuaspgln354045lysprogluglyvalserleuarggluleuproleuaspaspaspser505560aspphevalsermetgluglngluargargglnleuleuglulysasp65707580proarglysasnvalglnilevalalaasp8590<210>6<211>68<212>prt<213>克氏錐蟲<400>6metgluglngluargargglnleuleuglulysaspproargargasn151015valglnlysilealaaspleugluglusermetasnalaargalagln202530gluleualaargglulyslysleualaaspargalapheleuaspgln354045lysprogluglyvalserleuarggluleuproleuaspaspaspser505560aspphevalser65<210>7<211>15<212>prt<213>人工序列<220><223>六組氨酸標(biāo)簽<400>7glyglyglyserglyglyglyleugluhishishishishishis151015當(dāng)前第1頁12