參照序列表

本申請(qǐng)包含計(jì)算機(jī)可讀形式的序列表，將其通過(guò)引用結(jié)合在此。

發(fā)明背景

已經(jīng)披露了用于通過(guò)細(xì)胞壁脅迫誘導(dǎo)的啟動(dòng)子來(lái)驅(qū)動(dòng)報(bào)告子蛋白的表達(dá)，鑒別在絲狀真菌中的抗真菌化合物的報(bào)告子系統(tǒng)；一種此類(lèi)誘導(dǎo)的啟動(dòng)子是黑曲霉agsa啟動(dòng)子；提供了使用簡(jiǎn)并引物的全長(zhǎng)agsa基因的克隆，連同ags-同系物從其他真菌中的分離(wo03/020922)。還已經(jīng)描述了黑曲霉中的agsa的滅活(戴姆維爾德r(damveldr.)等人，2004，誘導(dǎo)agsa，黑曲霉中的五個(gè)1,3-α-d-葡聚糖合酶-編碼基因的中的一個(gè)，響應(yīng)細(xì)胞壁脅迫的表達(dá)(expressionofagsa,oneoffive1,3-alpha-d-glucansynthase-encodinggenesinaspergillusniger,isinducedinresponsetocellwallstress)，真菌遺傳學(xué)和生物學(xué)(fungalgeneticsandbiology)42(2005)165-177)。

還披露了在五個(gè)1,3-α-d-葡聚糖合酶-編碼基因中的另一個(gè)，agse中的黑曲霉突變體缺陷；報(bào)道在此類(lèi)突變體中的葡糖氧化酶、磷脂酶a2、和脂肪酶表達(dá)是改進(jìn)的(wo2014/013074)。

發(fā)明領(lǐng)域

本發(fā)明涉及絲狀真菌表達(dá)宿主，其中涉及α-葡聚糖合成的兩種或更多種多肽是滅活的。

發(fā)明概述

本發(fā)明的諸位發(fā)明人對(duì)提高感興趣的酶的生產(chǎn)力感到有興趣，并且發(fā)現(xiàn)與文獻(xiàn)中已經(jīng)報(bào)道的內(nèi)容相反，黑曲霉的agsa-或agse-滅活的單個(gè)突變體提供了它們測(cè)試的蛋白酶的更低表達(dá)(以下示出)。然而，令他們驚訝的是，雙重突變體提供了顯著增加的蛋白酶表達(dá)(以下示出)。

因此，在第一個(gè)方面，本發(fā)明涉及產(chǎn)生感興趣的多肽的突變體絲狀真菌宿主細(xì)胞，其中編碼涉及α-葡聚糖合成的兩種或更多種多肽的兩種或更多種多核苷酸是滅活的，所述的兩種或更多種多肽選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成：

(a)涉及α-葡聚糖合成的多肽，該多肽包括與seqidno:3的黑曲霉agsa多肽的氨基酸序列具有至少70％序列一致性的氨基酸序列，以及涉及α-葡聚糖合成的多肽，該多肽包括與seqidno:6的黑曲霉agse多肽具有至少70％序列一致性的氨基酸序列；

(b)涉及α-葡聚糖合成的多肽，該多肽由以下項(xiàng)編碼：

(i)包括與seqidno:1中的黑曲霉agsa基因組核苷酸序列具有至少70％序列一致性的核苷酸序列的基因組多核苷酸，以及涉及α-葡聚糖合成的多肽，該多肽由包括與seqidno:4的黑曲霉agse基因組核苷酸序列具有至少70％序列一致性的核苷酸序列的基因組多核苷酸編碼，或

(ii)分別示出在seqidno:2和seqidno:5中的(i)的cdna核苷酸序列；和

(c)涉及α-葡聚糖合成的兩種多肽，這些多肽由在中嚴(yán)格條件下與以下項(xiàng)雜交的多核苷酸編碼：

(i)分別是，seqidno:1中的黑曲霉agsa基因組核苷酸序列，和seqidno:4中的黑曲霉agse基因組核苷酸序列；

(ii)分別是，在seqidno:2和seqidno:5中示出的(i)的cdna核苷酸序列，或

(iii)(i)或(ii)的全長(zhǎng)互補(bǔ)體。

在第二個(gè)方面，本發(fā)明涉及在突變體絲狀真菌宿主細(xì)胞中產(chǎn)生感興趣的多肽的方法，所述方法包括以下的步驟：

(a)在有助于感興趣的多肽的產(chǎn)生的條件下，培養(yǎng)如在本發(fā)明的第一個(gè)方面中定義的突變體絲狀真菌宿主細(xì)胞；并且，任選地，

(b)回收這一感興趣的多肽。

在第三個(gè)方面，本發(fā)明涉及構(gòu)建突變的絲狀真菌宿主細(xì)胞的方法，所述方法包括分別地將編碼兩種或更多種多肽的在絲狀真菌宿主細(xì)胞中的兩種或更多種多核苷酸滅活，這些多肽選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成：

(a)涉及α-葡聚糖合成的多肽，該多肽包括與seqidno:3的黑曲霉agsa多肽的氨基酸序列具有至少70％序列一致性的氨基酸序列，以及涉及α-葡聚糖合成的多肽，該多肽包括與seqidno:6的黑曲霉agse多肽具有至少70％序列一致性的氨基酸序列；

(b)涉及α-葡聚糖合成的多肽，該多肽由以下項(xiàng)編碼：

(i)包括與seqidno:1中的黑曲霉agsa基因組核苷酸序列具有至少70％序列一致性的核苷酸序列的基因組多核苷酸，以及涉及α-葡聚糖合成的多肽，該多肽由包括與seqidno:4的黑曲霉agse基因組核苷酸序列具有至少70％序列一致性的核苷酸序列的基因組多核苷酸編碼，或

(ii)分別示出在seqidno:2和seqidno:5中的(i)的cdna核苷酸序列；和

(c)涉及α-葡聚糖合成的兩種多肽，這些多肽由在中嚴(yán)格條件下與以下項(xiàng)雜交的多核苷酸編碼：

(i)分別是，seqidno:1中的黑曲霉agsa基因組核苷酸序列，和seqidno:4中的黑曲霉agse基因組核苷酸序列；

(ii)分別是，在seqidno:2和seqidno:5中示出的(i)的cdna核苷酸序列，或

(iii)(i)或(ii)的全長(zhǎng)互補(bǔ)體。

附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明

圖1示出了在以下實(shí)例中采用的菌株構(gòu)建策略的圖表。

圖2示出了質(zhì)粒phuda1685的示意圖。

圖3示出了質(zhì)粒phuda1701的示意圖。

圖4示出了質(zhì)粒phuda1657的示意圖。

圖5示出了質(zhì)粒phuda1694的示意圖。

定義

cdna：術(shù)語(yǔ)“cdna”意指可以通過(guò)從得自真核或原核細(xì)胞的成熟的、剪接的mrna分子進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄而制備的dna分子。cdna缺乏可以存在于對(duì)應(yīng)基因組dna中的內(nèi)含子序列。早先的初始rna轉(zhuǎn)錄物本是mrna的前體，其在呈現(xiàn)為成熟的剪接的mrna之前要經(jīng)一系列的步驟進(jìn)行加工，包括剪接。

編碼序列：術(shù)語(yǔ)“編碼序列”意指直接指定多肽的氨基酸序列的多核苷酸。編碼序列的邊界一般由一個(gè)開(kāi)放閱讀框架決定，該開(kāi)放閱讀框架從一個(gè)起始密碼子(如atg、gtg或ttg)開(kāi)始并且以一個(gè)終止密碼子(如taa、tag或tga)結(jié)束。編碼序列可以是基因組dna、cdna、合成dna或其組合。

核酸構(gòu)建體：術(shù)語(yǔ)“核酸構(gòu)建體”意指單-鏈或雙-鏈的核酸分子，該核酸分子是從天然存在的基因中分離的，或以本來(lái)不存在于自然界中的方式被修飾成包含核酸的區(qū)段，或是合成的，該核酸分子包括一個(gè)或多個(gè)控制序列。

可操作地連接：術(shù)語(yǔ)“可操作地連接”意指如下配置，其中控制序列相對(duì)于多核苷酸的編碼序列放置在適當(dāng)位置，以使得控制序列指導(dǎo)編碼序列的表達(dá)。

控制序列：術(shù)語(yǔ)“控制序列”是指表達(dá)編碼本發(fā)明的成熟多肽的多核苷酸所必需的核酸序列。每個(gè)控制序列對(duì)于編碼該多肽的多核苷酸來(lái)說(shuō)可以是天然的(即，來(lái)自相同基因)或外源的(即，來(lái)自不同基因)，或相對(duì)于彼此是天然的或外源的。此類(lèi)控制序列包括但不限于前導(dǎo)子、多腺苷酸化序列、前肽序列、啟動(dòng)子、信號(hào)肽序列、以及轉(zhuǎn)錄終止子。至少，控制序列包括啟動(dòng)子，以及轉(zhuǎn)錄和翻譯終止信號(hào)。出于引入有利于將這些控制序列與編碼多肽的多核苷酸的編碼區(qū)連接的特異性限制酶切位點(diǎn)的目的，這些控制序列可以提供有多個(gè)接頭。

表達(dá)：術(shù)語(yǔ)“表達(dá)”包括涉及多肽的產(chǎn)生的任何步驟，包括但不限于轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修飾、翻譯、翻譯后修飾以及分泌。

表達(dá)載體：術(shù)語(yǔ)“表達(dá)載體”意指直鏈或環(huán)狀dna分子，該分子包括編碼多肽的多核苷酸并且可操作地連接至提供用于其表達(dá)的控制序列。

宿主細(xì)胞：術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”意指易于用包括本發(fā)明的多核苷酸的核酸構(gòu)建體或表達(dá)載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)等的任何細(xì)胞類(lèi)型。術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”涵蓋由于復(fù)制期間發(fā)生的突變與親本細(xì)胞不同的親本細(xì)胞的任何后代。

分離的：術(shù)語(yǔ)“分離的”意指處于自然界中不存在的形式或環(huán)境中的物質(zhì)。分離的物質(zhì)的非限制性實(shí)例包括(1)任何非天然存在的物質(zhì)；(2)至少部分地從一個(gè)或多個(gè)或所有與它在自然界中相關(guān)的天然存在的成分中除去的任何物質(zhì)，包括但不限于，任何酶、變體、核酸、蛋白質(zhì)、肽或輔因子，也就是；(3)相對(duì)于在自然界中發(fā)現(xiàn)的物質(zhì)經(jīng)過(guò)人為改變的任何物質(zhì)；或(4)相對(duì)于與它天然相關(guān)聯(lián)的其它組分通過(guò)增加該物質(zhì)的量(例如，在宿主細(xì)胞中的重組生產(chǎn)；編碼該物質(zhì)的基因的多個(gè)拷貝；以及使用比與編碼該物質(zhì)的基因天然相關(guān)聯(lián)的啟動(dòng)子更強(qiáng)的啟動(dòng)子)而改變的任何物質(zhì)。

非常高嚴(yán)格條件：術(shù)語(yǔ)“非常高嚴(yán)格條件”意指對(duì)于長(zhǎng)度為至少100個(gè)核苷酸的探針而言，遵循標(biāo)準(zhǔn)dna印跡程序，在42℃下在5xsspe、0.3％sds、200微克/ml剪切并變性的鮭精dna和50％甲酰胺中預(yù)雜交和雜交12至24小時(shí)。最后在70℃下使用2xssc、0.2％sds將載體材料洗滌三次，每次15分鐘。

高嚴(yán)格條件：術(shù)語(yǔ)“高嚴(yán)格條件”意指對(duì)于長(zhǎng)度為至少100個(gè)核苷酸的探針而言，遵循標(biāo)準(zhǔn)dna印跡程序，在42℃下在5xsspe、0.3％sds、200微克/ml剪切并且變性的鮭精dna和50％甲酰胺中預(yù)雜交和雜交12至24小時(shí)。最后在65℃下使用2xssc、0.2％sds將載體材料洗滌三次，每次15分鐘。

中-高嚴(yán)格條件：術(shù)語(yǔ)“中高嚴(yán)格條件”意指對(duì)于長(zhǎng)度為至少100個(gè)核苷酸的探針而言，遵循標(biāo)準(zhǔn)dna印跡程序，在42℃下在5xsspe、0.3％sds、200微克/ml剪切并變性的鮭精dna和35％甲酰胺中預(yù)雜交和雜交12至24小時(shí)。最后在60℃下使用2xssc、0.2％sds將載體材料洗滌三次，每次15分鐘。

中嚴(yán)格條件：術(shù)語(yǔ)“中嚴(yán)格條件”意指對(duì)于長(zhǎng)度為至少100個(gè)核苷酸的探針而言，遵循標(biāo)準(zhǔn)dna印跡程序，在42℃下在5xsspe、0.3％sds、200微克/ml剪切并變性的鮭精dna和35％甲酰胺中預(yù)雜交和雜交12至24小時(shí)。最后在55℃下使用2xssc、0.2％sds將載體材料洗滌三次，每次15分鐘。

低嚴(yán)格條件：術(shù)語(yǔ)“低嚴(yán)格條件”意指對(duì)于長(zhǎng)度為至少100個(gè)核苷酸的探針而言，遵循標(biāo)準(zhǔn)dna印跡程序，在42℃下于5xsspe、0.3％sds、200微克/ml剪切并變性的鮭精dna以及25％甲酰胺中預(yù)雜交和雜交12至24小時(shí)。最后在50℃下使用2xssc、0.2％sds將載體材料洗滌三次，每次15分鐘。

非常低嚴(yán)格條件：術(shù)語(yǔ)“非常低嚴(yán)格條件”意指對(duì)于長(zhǎng)度為至少100個(gè)核苷酸的探針而言，遵循標(biāo)準(zhǔn)dna印跡程序，在42℃下在5xsspe、0.3％sds、200微克/ml剪切并變性的鮭精dna和25％甲酰胺中預(yù)雜交和雜交12至24小時(shí)。最后在45℃下使用2xssc、0.2％sds將載體材料洗滌三次，每次15分鐘。

序列一致性：兩個(gè)氨基酸序列之間或兩個(gè)核苷酸序列之間的相關(guān)性由參數(shù)“序列一致性”描述。

出于本發(fā)明的目的，使用尼德?tīng)柭?翁施算法(尼德?tīng)柭?needleman)和翁施(wunsch)，1970，分子生物學(xué)雜志(j.mol.biol.)48:443-453)確定兩個(gè)氨基酸序列之間的序列一致性，如在emboss軟件包(emboss：歐洲分子生物學(xué)開(kāi)放軟件包(emboss:theeuropeanmolecularbiologyopensoftwaresuite)，賴斯(rice)等人，2000，遺傳學(xué)趨勢(shì)(trendsgenet.)16:276-277)的尼德?tīng)?needle)程序，優(yōu)選地5.0.0版或更新版本中所執(zhí)行的。所使用的參數(shù)是空位開(kāi)放罰分10，空位延伸罰分0.5，以及eblosum62(blosum62的emboss版本)取代矩陣。將標(biāo)記為“最長(zhǎng)一致性”的needle輸出(使用-nobrief選項(xiàng)獲得)用作百分比一致性并且是如下計(jì)算的：

(一致的殘基x100)/(比對(duì)長(zhǎng)度-比對(duì)中的空位總數(shù))

出于本發(fā)明的目的，使用尼德曼-翁施算法(尼德曼(needleman)和翁施(wunsch)，1970，見(jiàn)上文)來(lái)確定兩個(gè)脫氧核苷酸序列之間的序列一致性，該算法如emboss軟件包(emboss：歐洲分子生物學(xué)開(kāi)放軟件套件，賴斯(rice)等人，2000，見(jiàn)上文)(優(yōu)選5.0.0版或更新版本)的尼德?tīng)柍绦蛩鶎?shí)施的。所使用的參數(shù)是空位開(kāi)放罰分10，空位延伸罰分0.5，以及ednafull(ncbinuc4.4的emboss版)取代矩陣。將標(biāo)記為“最長(zhǎng)一致性”的needle輸出(使用-nobrief選項(xiàng)獲得)用作百分比一致性并且是如下計(jì)算的：

(一致的脫氧核糖核苷酸×100)/(比對(duì)長(zhǎng)度-比對(duì)中的空位總數(shù))

涉及α-葡聚糖合成：術(shù)語(yǔ)“涉及α-葡聚糖合成”意指意指因此涉及編碼參與α-葡聚糖(尤其是α-d-葡聚糖)的合成的酶的多核苷酸。在本發(fā)明的背景下，優(yōu)選的編碼的多肽是1,3α-d-葡聚糖合酶，最優(yōu)選地是來(lái)自黑曲霉的agsa和agse，或它們的等位基因同系物或變體。

發(fā)明詳述

如上述總結(jié)中已經(jīng)概述的，本發(fā)明的第一個(gè)方面涉及產(chǎn)生感興趣的多肽的突變體絲狀真菌宿主細(xì)胞，其中編碼涉及α-葡聚糖合成的兩種或更多種多肽的兩種或更多種多核苷酸是滅活的，第二個(gè)方面涉及在如在第一個(gè)方面中定義的突變體宿主細(xì)胞中產(chǎn)生感興趣的多肽的方法，并且第三個(gè)方面涉及構(gòu)建突變體絲狀真菌宿主細(xì)胞的方法。

本發(fā)明的所有方面需要將編碼涉及α-葡聚糖合成的兩種或更多種多肽的兩種或更多種多核苷酸的絲狀真菌宿主細(xì)胞滅活，所述的兩種或更多種多肽選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成：

(a)涉及α-葡聚糖合成的多肽，該多肽包括與seqidno:3的黑曲霉agsa多肽的氨基酸序列具有至少60％序列一致性的氨基酸序列，和涉及α-葡聚糖合成的的多肽，該多肽包括與seqidno:6的黑曲霉agse多肽具有至少70％序列一致性的氨基酸序列；優(yōu)選地，每個(gè)多肽分別與seqidno:3或seqidno:6具有至少65％，例如，至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性。在一方面，該多肽分別與seqidno:3或seqidno:6的多肽具有多達(dá)10個(gè)(例如1個(gè)、2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)、6個(gè)、7個(gè)、8個(gè)、9個(gè)、或10個(gè))氨基酸的差異。氨基酸改變可以具有次要性質(zhì)，即不顯著影響蛋白質(zhì)的折疊和/或活性的保守氨基酸取代或插入；小缺失，小的氨基的、或羧基的末端延伸，如氨基末端蛋氨酸殘基；小接頭肽；或通過(guò)改變凈電荷或另一功能來(lái)促進(jìn)純化的小延伸，如多組氨酸序列(polyhistidinetract)、抗原性表位或結(jié)合結(jié)構(gòu)域；

(b)涉及α-葡聚糖合成的多肽，該多肽由以下項(xiàng)編碼：

(i)包括核苷酸序列的基因組多核苷酸，該核苷酸序列與seqidno:1中的黑曲霉agsa基因組核苷酸序列具有至少60％序列一致性，和涉及α-葡聚糖合成的多肽，該多肽由基因組多核苷酸編碼，該基因組多核苷酸包括與seqidno:4中的黑曲霉agse基因組核苷酸序列具有至少60％序列一致性的核苷酸序列；優(yōu)選地每個(gè)基因組多核苷酸分別與seqidno:1或seqidno:4具有，至少65％，例如，至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性。在一方面，該多核苷酸分別與seqidno:1或seqidno:4的多核苷酸具有多達(dá)10個(gè)(例如1個(gè)、2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)、6個(gè)、7個(gè)、8個(gè)、9個(gè)、或10個(gè))核苷酸的差異。

(ii)(i)的cdna核苷酸序列，其與seqidno:2中的黑曲霉agsacdna核苷酸序列具有至少60％序列一致性，和涉及α-葡聚糖合成的多肽，該多肽由多核苷酸編碼，該多核苷酸包括包括與seqidno:5中的黑曲霉agsecdna核苷酸序列具有至少60％序列一致性的核苷酸序列；優(yōu)選地每個(gè)cdna多核苷酸分別與seqidno:2或seqidno:5具有至少65％，例如，至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性。在一方面，該多核苷酸分別與seqidno:2或seqidno:5的多核苷酸具有多達(dá)10個(gè)(例如1個(gè)、2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)、6個(gè)、7個(gè)、8個(gè)、9個(gè)、或10個(gè))核苷酸的差異；和

(c)涉及α-葡聚糖合成的兩種多肽，這些多肽由多核苷酸編碼，這些多核苷酸在非常低、低、中、中-高、高、或非常高嚴(yán)格條件下與以下項(xiàng)雜交：

(i)分別是，seqidno:1中的黑曲霉agsa基因組核苷酸序列，和seqidno:4中的黑曲霉agse基因組核苷酸序列；

(ii)分別是，在seqidno:2和seqidno:5中示出的(i)的cdna核苷酸序列，或

(iii)(i)或(ii)的全長(zhǎng)互補(bǔ)體。(薩拉布魯克(sambrook)等人，1989，分子克隆：實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(molecularcloning,alaboratorymanual)，第2版，冷泉港，紐約)。

在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施例中，兩種或更多種多核苷酸編碼涉及α-葡聚糖合成的多肽，該多肽包括與seqidno:3的黑曲霉agsa多肽的氨基酸序列具有至少70％序列一致性的氨基酸序列或其等位基因變體，或由它們組成，以及涉及α-葡聚糖合成的多肽，該多肽包括與seqidno:6的黑曲霉agse多肽具有至少70％序列一致性的氨基酸序列或其等位基因變體，或由它們組成。在另一個(gè)實(shí)施例中，該多肽包括seqidno:3或seqidno:6的成熟多肽，或由它們組成。

seqidno:1或seqidno:2的多核苷酸或其子序列、和seqidno:3的多肽或其片段，連同seqidno:4或seqidno:5的多核苷酸或其子序列，以及seqidno:6的多肽或其片段，可以用于根據(jù)本領(lǐng)域熟知的方法，設(shè)計(jì)核酸探針來(lái)鑒定和克隆編碼涉及α-葡聚糖合成的多肽的多核苷酸，這些多肽來(lái)自不同的屬或種的菌株。具體而言，此類(lèi)探針可以用于按照標(biāo)準(zhǔn)dna印跡程序與感興趣的細(xì)胞的基因組dna或cdna雜交，以便鑒定和分離其中相應(yīng)的基因。此類(lèi)探針可以明顯短于完整序列，但是長(zhǎng)度應(yīng)為至少15，例如至少25、至少35、或至少70個(gè)核苷酸。優(yōu)選地，核酸探針具有至少100個(gè)核苷酸長(zhǎng)度，例如至少200個(gè)核苷酸長(zhǎng)度、至少300個(gè)核苷酸長(zhǎng)度、至少400個(gè)核苷酸長(zhǎng)度、至少500個(gè)核苷酸長(zhǎng)度、至少600個(gè)核苷酸長(zhǎng)度、至少700個(gè)核苷酸長(zhǎng)度、至少800個(gè)核苷酸長(zhǎng)度、或至少900個(gè)核苷酸長(zhǎng)度。dna和rna探針二者均可使用。典型地將探針進(jìn)行標(biāo)記(例如，用³²p、³h、³⁵s、生物素、或抗生物素蛋白)，以檢測(cè)相應(yīng)的基因。本發(fā)明涵蓋此類(lèi)探針。

可以針對(duì)與以上描述的探針雜交并且編碼涉及α-葡聚糖合成的多肽的dna對(duì)從這類(lèi)其他菌株制備的基因組dna或cdna庫(kù)進(jìn)行篩選。來(lái)自此類(lèi)其他菌株的基因組dna或其他dna可以通過(guò)瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳、或其他分離技術(shù)來(lái)分離。來(lái)自文庫(kù)的dna或分離的dna可轉(zhuǎn)移到并固定在硝酸纖維素或其他適合的載體材料上。為了鑒定克隆或雜交的dna，然后將載體材料用于dna印跡。

出于本發(fā)明的目的，雜交指示多核苷酸在非常低至非常高嚴(yán)格條件下與標(biāo)記的核酸探針雜交，所述標(biāo)記的核酸探針對(duì)應(yīng)于(i)seqidno:1或seqidno:4；(ii)seqidno:1或seqidno:4的多肽編碼序列；(iii)在seqidno:2或seqidno:5中示出的其cdna序列；(iv)其全長(zhǎng)互補(bǔ)體；或(v)其子序列?？梢允褂美鐇-射線膠片或本領(lǐng)域已知的任何其他檢測(cè)手段來(lái)檢測(cè)在這些條件下核酸探針雜交的分子。

保守氨基酸取代的實(shí)例是在下組的范圍內(nèi)：堿性氨基酸(精氨酸、賴氨酸及組氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、極性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、異亮氨酸及纈氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸)及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸及蛋氨酸)。通常不改變比活性的氨基酸取代是本領(lǐng)域已知的并且例如由h.諾伊拉特(h.neurath)和r.l.希爾(r.l.hill)，1979，在蛋白質(zhì)(theproteins)，學(xué)術(shù)出版社(academicpress)，紐約(newyork)中進(jìn)行描述。常見(jiàn)取代是ala/ser、val/ile、asp/glu、thr/ser、ala/gly、ala/thr、ser/asn、ala/val、ser/gly、tyr/phe、ala/pro、lys/arg、asp/asn、leu/ile、leu/val、ala/glu、和asp/gly。

可以做出單個(gè)或多個(gè)氨基酸取代、缺失和/或插入并且使用已知的誘變、重組和/或改組方法進(jìn)行測(cè)試，隨后進(jìn)行有關(guān)篩選程序，如由里德哈爾-奧爾森(reidhaar-olson)和薩奧爾(sauer)，1988，科學(xué)(science)241:53-57；博維(bowie)和薩奧爾，1989，美國(guó)科學(xué)院院刊(proc.natl.acad.sci.usa)86:2152-2156；wo95/17413；或wo95/22625所披露的那些?？梢允褂玫钠渌椒òㄒ族e(cuò)pcr、噬菌體展示(例如，羅曼(lowman)等人，1991，生物化學(xué)(biochemistry)30:10832-10837；美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,223,409；wo92/06204)和區(qū)域定向誘變(德比舍爾(derbyshire)等人，1986，基因(gene)46:145；ner等人，1988，dna7:127)。

誘變/改組方法可以與高通量自動(dòng)化篩選方法組合以檢測(cè)由宿主細(xì)胞表達(dá)的克隆的誘變多肽的活性(奈斯(ness)等人，1999，自然生物技術(shù)(naturebiotechnology)17:893-896)?？梢詮乃拗骷?xì)胞回收編碼活性多肽的誘變的dna分子，并且使用本領(lǐng)域內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)方法快速測(cè)序。這些方法允許迅速確定多肽中單個(gè)氨基酸殘基的重要性。

多核苷酸

本發(fā)明還涉及編碼涉及α-葡聚糖合成的多肽的多核苷酸的滅活，如在此所述。

用于分離或克隆多核苷酸的技術(shù)在本領(lǐng)域中是已知的，并包括從基因組dna或cdna，或其組合分離。可以例如通過(guò)使用熟知的聚合酶鏈反應(yīng)(pcr)或表達(dá)文庫(kù)的抗體篩選來(lái)檢測(cè)具有共有結(jié)構(gòu)特征的克隆dna片段，實(shí)現(xiàn)從基因組dna克隆多核苷酸。參見(jiàn)，例如英尼斯(innis)等人，1990，pcr：方法和應(yīng)用指南(pcr：aguidetomethodsandapplication)，學(xué)術(shù)出版社(academicpress)，紐約(newyork)?？梢允褂闷渌怂釘U(kuò)增程序例如連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(lcr)、連接激活轉(zhuǎn)錄(lat)和基于多核苷酸的擴(kuò)增(nasba)。這些多核苷酸可以由曲霉屬菌株或相關(guān)有機(jī)體克隆，并且因此，例如可以是該多核苷酸的多肽編碼區(qū)的等位基因或種變體。

修飾編碼本發(fā)明的多肽的多核苷酸對(duì)于合成與所述多肽基本上類(lèi)似的多肽可為必需的。術(shù)語(yǔ)“實(shí)質(zhì)上類(lèi)似”于該多肽是指該多肽的非天然發(fā)生的形式。這些多肽可能以某種工程化方式而不同于從其天然來(lái)源分離的多肽，例如在比活性、熱穩(wěn)定性、最優(yōu)ph等方面不同的變體。這些變體可以基于以seqidno:1或seqidno:4的多肽編碼序列形式呈現(xiàn)的多核苷酸，或基于seqidno:2或seqidno:5中的其cdna(例如其子序列)，和/或通過(guò)引入不會(huì)導(dǎo)致該多肽的氨基酸序列改變，但對(duì)應(yīng)于預(yù)期用于產(chǎn)生該酶的宿主有機(jī)體的密碼子使用的核苷酸取代，或通過(guò)引入可能產(chǎn)生不同氨基酸序列的核苷酸取代來(lái)構(gòu)建。對(duì)于核苷酸取代的一般描述，參見(jiàn)例如福德(ford)等人，1991，蛋白質(zhì)表達(dá)與純化(proteinexpressionandpurification)2:95-107。

編碼多肽的多核苷酸的滅活或去除

本發(fā)明的不同方面和實(shí)施例都需要編碼兩種或更多種多肽的兩種或更多種多核苷酸的滅活，這些多肽涉及絲狀真菌宿主細(xì)胞中的α-葡聚糖合成。

此類(lèi)滅活可通過(guò)破壞或缺失編碼本發(fā)明的多肽的多核苷酸或其一部分而實(shí)現(xiàn)，當(dāng)在相同的條件下培養(yǎng)時(shí)，這導(dǎo)致突變體細(xì)胞產(chǎn)生少于親本細(xì)胞的多肽。

可以使用本領(lǐng)域熟知的方法通過(guò)消除該多核苷酸的表達(dá)來(lái)構(gòu)建突變體細(xì)胞，例如插入、破壞、替換、或缺失。在一個(gè)優(yōu)選的方面，該多核苷酸是滅活的。要滅活的多核苷酸可以是，例如，對(duì)于活性所必需的編碼區(qū)或其一部分，或編碼區(qū)表達(dá)所需的調(diào)節(jié)元件。此類(lèi)調(diào)節(jié)或控制序列的實(shí)例可以是啟動(dòng)子序列或其功能部分，即足以影響多核苷酸表達(dá)的部分。用于可能的滅活的其他控制序列包括，但不限于前導(dǎo)子、多腺苷酸環(huán)化序列、前肽序列、信號(hào)肽序列、轉(zhuǎn)錄終止子、和轉(zhuǎn)錄激活因子。

通過(guò)使親本細(xì)胞經(jīng)受誘變，并且選擇其中已經(jīng)消除多核苷酸的表達(dá)的突變體細(xì)胞來(lái)進(jìn)行多核苷酸的滅活。誘變可能是特異性的或隨機(jī)的，可以通過(guò)例如使用適合的物理或化學(xué)誘變劑進(jìn)行，通過(guò)使用適合的寡核苷酸進(jìn)行，或通過(guò)將所述dna序列進(jìn)行pcr產(chǎn)生的誘變。此外，誘變可通過(guò)使用這些誘變劑的任意組合來(lái)進(jìn)行。

適用于本發(fā)明目的的物理或化學(xué)誘變劑的實(shí)例包括紫外線(uv)照射，羥胺，n-甲基-n’-硝基-n-亞硝基胍(mnng)，鄰-甲基羥胺，亞硝酸，乙基甲磺酸(ems)，亞硫酸氫鈉，甲酸和核苷酸類(lèi)似物。

當(dāng)使用這些試劑時(shí)，通常通過(guò)如下方法來(lái)進(jìn)行所述誘變：在適合條件下存在優(yōu)選的誘變劑時(shí)溫育待誘變的親本細(xì)胞，并篩選和/或選擇顯示無(wú)基因表達(dá)的突變體細(xì)胞。

該多核苷酸的滅活可以通過(guò)在基因中或在其轉(zhuǎn)錄或翻譯所需的調(diào)控元件中插入、取代、或缺失一個(gè)或多個(gè)核苷酸來(lái)完成。例如，可以插入或去除核苷酸從而導(dǎo)致引入終止密碼子，去除起始密碼子，或改變開(kāi)放閱讀框。這些滅活可根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法通過(guò)定點(diǎn)誘變或pcr產(chǎn)生的誘變來(lái)完成。盡管原則上，滅活可以在體內(nèi)進(jìn)行，即直接在表達(dá)待滅活的多核苷酸的細(xì)胞上進(jìn)行，但如下示例優(yōu)選在體外進(jìn)行。

消除多核苷酸表達(dá)的方便方法的一個(gè)實(shí)例是基于基因置換、基因缺失、或基因破壞的技術(shù)。例如，在基因破壞方法中，將對(duì)應(yīng)于內(nèi)源多核苷酸的核酸序列在體外進(jìn)行誘變以產(chǎn)生缺陷的核酸序列，然后將其轉(zhuǎn)化到親本細(xì)胞中以產(chǎn)生缺陷基因。通過(guò)同源重組，該缺陷的核酸序列替換內(nèi)源多核苷酸。令人希望的是，缺陷的多核苷酸還編碼可用于選擇其中該多核苷酸已經(jīng)被修飾或破壞的轉(zhuǎn)化體的標(biāo)記。在一方面，用例如在此描述的那些選擇性標(biāo)記來(lái)破壞該多核苷酸。

本發(fā)明進(jìn)一步涉及在編碼該多肽的多核苷酸或其控制序列或編碼該多肽的沉默基因中包含破壞或缺失的親本細(xì)胞的突變體細(xì)胞，這導(dǎo)致與親本細(xì)胞相比，該突變體細(xì)胞產(chǎn)生的多肽少或不產(chǎn)生多肽。

這些多肽缺陷型突變體細(xì)胞作為用于原生和異源多肽的表達(dá)的宿主細(xì)胞尤其有用。因此，本發(fā)明進(jìn)一步涉及產(chǎn)生天然或異源多肽的方法，包括(a)在有益于產(chǎn)生該多肽的條件下培養(yǎng)該突變體細(xì)胞；并且(b)回收該多肽。術(shù)語(yǔ)“異源多肽”是指對(duì)該宿主細(xì)胞來(lái)說(shuō)不是原生的多肽，例如天然蛋白質(zhì)的變體。該宿主細(xì)胞可以包括多于一個(gè)拷貝的編碼該原生或異源多肽的多核苷酸。

在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，兩種或更多種多核苷酸的滅活是通過(guò)兩種或更多種多核苷酸和/或它們各自的啟動(dòng)子的突變；優(yōu)選地是通過(guò)兩種或更多種多核苷酸和/或它們各自的啟動(dòng)子從宿主細(xì)胞的基因組部分或完全缺失來(lái)進(jìn)行的。

核酸構(gòu)建體

本發(fā)明還涉及包含編碼根據(jù)本發(fā)明的感興趣的多肽的、可操作地連接至一個(gè)或多個(gè)控制序列上的多核苷酸的核酸構(gòu)建體，該一個(gè)或多個(gè)控制序列在與控制序列相容的條件下指導(dǎo)編碼序列在適合的宿主細(xì)胞中的表達(dá)。

該多核苷酸可以按多種方式操縱，以提供感興趣的多肽的表達(dá)。取決于表達(dá)載體，在多核苷酸插入載體之前操作多核苷酸可能是令人希望的或必需的。用于利用重組dna方法修飾多核苷酸的技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的。

該控制序列可以是啟動(dòng)子，即，被宿主細(xì)胞識(shí)別以對(duì)編碼本發(fā)明的多肽的多核苷酸進(jìn)行表達(dá)的多核苷酸。啟動(dòng)子包含介導(dǎo)多肽表達(dá)的轉(zhuǎn)錄控制序列。啟動(dòng)子可以是在宿主細(xì)胞中顯示轉(zhuǎn)錄活性的任何多核苷酸，包括突變、截短和雜合啟動(dòng)子，并且可以從編碼與宿主細(xì)胞同源或異源的胞外或胞內(nèi)多肽的基因中獲得。

用于指導(dǎo)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體在絲狀真菌宿主細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄的適合啟動(dòng)子的實(shí)例是從以下各項(xiàng)的基因獲得的啟動(dòng)子：構(gòu)巢曲霉乙酰胺酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸穩(wěn)定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaa)、米曲霉taka淀粉酶、米曲霉堿性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶、尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶(wo96/00787)、鑲片鐮孢淀粉葡糖苷酶(wo00/56900)、鑲片鐮孢daria(wo00/56900)、鑲片鐮孢quinn(wo00/56900)、米黑根毛霉(rhizomucormiehei)脂肪酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纖維二糖水解酶i、里氏木霉纖維二糖水解酶ii、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶i、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶ii、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶iii、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶v、里氏木霉木聚糖酶i、里氏木霉木聚糖酶ii、里氏木霉木聚糖酶iii、里氏木霉β-木糖苷酶、以及里氏木霉翻譯延長(zhǎng)因子，以及na2tpi啟動(dòng)子(一種修飾的啟動(dòng)子，其來(lái)自曲霉屬中性α-淀粉酶基因，其中未翻譯的前導(dǎo)子由曲霉屬丙糖磷酸異構(gòu)酶基因的未翻譯的前導(dǎo)子替代；非限制性實(shí)例包括修飾的啟動(dòng)子，其來(lái)自黑曲霉中性α-淀粉酶的基因，其中未翻譯的前導(dǎo)子由構(gòu)巢曲霉或米曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶基因的未翻譯的前導(dǎo)子替代)；以及其突變型啟動(dòng)子、截短型啟動(dòng)子、以及雜合型啟動(dòng)子。其他啟動(dòng)子描述于美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6,011,147中。

控制序列還可以是由宿主細(xì)胞識(shí)別以終止轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄終止子。該終止子可操作地連接到編碼該多肽的多核苷酸的3’-末端。在該宿主細(xì)胞中起作用的任何終止子都可以用于本發(fā)明中。

用于絲狀真菌宿主細(xì)胞的優(yōu)選終止子是從以下各項(xiàng)的基因獲得：構(gòu)巢曲霉乙酰胺酶、構(gòu)巢曲霉鄰氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉taka淀粉酶、尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纖維二糖水解酶i、里氏木霉纖維二糖水解酶ii、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶i、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶ii、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶iii、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶v、里氏木霉木聚糖酶i、里氏木霉木聚糖酶ii、里氏木霉木聚糖酶iii、里氏木霉β-木糖苷酶以及里氏木霉翻譯延長(zhǎng)因子。

該控制序列還可以是在啟動(dòng)子下游并且在基因編碼序列上游的mrna穩(wěn)定子區(qū)域，它增加該基因的表達(dá)。

該控制序列還可以是前導(dǎo)子，一種對(duì)宿主細(xì)胞翻譯很重要的非翻譯mrna區(qū)域。該前導(dǎo)子可操作地連接到編碼該多肽的多核苷酸的5’-末端。可以使用在宿主細(xì)胞中起作用的任何前導(dǎo)子。

用于絲狀真菌宿主細(xì)胞的優(yōu)選前導(dǎo)子是從米曲霉taka淀粉酶和構(gòu)巢曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶的基因獲得。

控制序列還可以是聚腺苷酸化序列，可操作地連接至該多核苷酸的3’-末端并且當(dāng)轉(zhuǎn)錄時(shí)由宿主細(xì)胞識(shí)別為將聚腺苷酸殘基添加至所轉(zhuǎn)錄的mrna的信號(hào)的序列?？梢允褂迷谒拗骷?xì)胞中起作用的任何聚腺苷酸化序列。

用于絲狀真菌宿主細(xì)胞的優(yōu)選聚腺苷酸化序列是從以下各項(xiàng)的基因中獲得的：構(gòu)巢曲霉鄰氨基苯甲酸合成酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉taka淀粉酶以及尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶。

控制序列也可以是編碼信號(hào)肽的信號(hào)肽編碼區(qū)，其中所述信號(hào)肽與多肽的n-末端連接并且指導(dǎo)多肽進(jìn)入細(xì)胞的分泌途徑。多核苷酸的編碼序列的5'-末端可以內(nèi)在地包含在翻譯閱讀框中與編碼多肽的編碼序列的區(qū)段天然連接的信號(hào)肽編碼序列?？商娲?，編碼序列的5’-末端可以包含相對(duì)于編碼序列為外來(lái)的信號(hào)肽編碼序列。在編碼序列不天然地包含信號(hào)肽編碼序列的情況下，可能需要外來(lái)信號(hào)肽編碼序列?？商娲?，外來(lái)信號(hào)肽編碼序列可以單純地替代天然信號(hào)肽編碼序列以便增強(qiáng)多肽的分泌。然而，可以使用指導(dǎo)已表達(dá)多肽進(jìn)入宿主細(xì)胞的分泌途徑的任何信號(hào)肽編碼序列。

用于絲狀真菌宿主細(xì)胞的有效信號(hào)肽編碼序列是從黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉taka淀粉酶、特異腐質(zhì)霉纖維素酶、特異腐質(zhì)霉內(nèi)切葡聚糖酶v、柔毛腐質(zhì)霉脂肪酶和米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶的基因獲得的信號(hào)肽編碼序列。

控制序列也可以是編碼位于多肽n-末端處的前肽的前肽編碼序列。生成的多肽被稱為前體酶(proenzyme)或多肽原(或在一些情況下被稱為酶原(zymogen))。多肽原通常是無(wú)活性的并且可以通過(guò)催化切割或自身催化切割來(lái)自多肽原的前肽而轉(zhuǎn)化為活性多肽。前肽編碼序列可以從以下各項(xiàng)的基因獲得：枯草芽孢桿菌堿性蛋白酶(apre)、枯草芽孢桿菌中性蛋白酶(nprt)、嗜熱毀絲霉漆酶(wo95/33836)、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、以及釀酒酵母α-因子。

在信號(hào)肽序列和前肽序列二者都存在的情況下，該前肽序列定位成緊鄰多肽的n-末端并且該信號(hào)肽序列定位成緊鄰該前肽序列的n-末端。

也可能令人希望的是添加調(diào)節(jié)序列，所述調(diào)節(jié)序列調(diào)節(jié)相對(duì)于宿主細(xì)胞的生長(zhǎng)的多肽的表達(dá)。調(diào)節(jié)序列的實(shí)例是使得基因的表達(dá)響應(yīng)于化學(xué)或物理刺激(包括調(diào)節(jié)化合物的存在)而開(kāi)啟或關(guān)閉的那些。在絲狀真菌中，可以使用黑曲霉葡糖淀粉酶啟動(dòng)子、米曲霉takaα-淀粉酶啟動(dòng)子和米曲霉葡糖淀粉酶啟動(dòng)子、里氏木霉纖維二糖水解酶i啟動(dòng)子以及里氏木霉纖維二糖水解酶ii啟動(dòng)子。調(diào)節(jié)序列的其他實(shí)例是那些允許基因擴(kuò)增的序列。在真核系統(tǒng)中，這些調(diào)控序列包括在甲氨蝶呤存在下被擴(kuò)增的二氫葉酸還原酶基因以及用重金屬擴(kuò)增的金屬硫蛋白基因。在這些情況中，編碼多肽的多核苷酸將與調(diào)控序列可操作地連接。

在本發(fā)明的優(yōu)選地實(shí)施例中，感興趣的多肽是與宿主細(xì)胞同源或異源的；優(yōu)選地，感興趣的多肽是分泌多肽；更優(yōu)選地，它是激素、酶、受體或其一部分、抗體或其一部分、或報(bào)告子；甚至更優(yōu)選地，感興趣的多肽是水解酶、異構(gòu)酶、連接酶、裂解酶、氧化還原酶、或轉(zhuǎn)移酶；并且最優(yōu)選地，感興趣的多肽是α-半乳糖苷酶、α-葡糖苷酶、氨肽酶、淀粉酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、β-木糖苷酶、碳水化物酶、羧肽酶、過(guò)氧化氫酶、纖維二糖水解酶、纖維素酶、幾丁質(zhì)酶、角質(zhì)酶、環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶、脫氧核糖核酸酶、內(nèi)切葡聚糖酶、酯酶、葡糖淀粉酶、轉(zhuǎn)化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、變聚糖酶、氧化酶、果膠分解酶、過(guò)氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、或木聚糖酶。

表達(dá)載體

本發(fā)明還涉及包含編碼如在此定義的感興趣的多肽的多核苷酸、啟動(dòng)子、以及轉(zhuǎn)錄和翻譯終止信號(hào)的重組表達(dá)載體。各種核苷酸和控制序列可以連接在一起以產(chǎn)生重組表達(dá)載體，所述重組表達(dá)載體可以包含一個(gè)或多個(gè)合宜的限制性位點(diǎn)以允許在這樣的位點(diǎn)插入或取代編碼多肽的多核苷酸?？商娲?，該多核苷酸可以通過(guò)將該多核苷酸或包括該多核苷酸的核酸構(gòu)建體插入用于表達(dá)的適當(dāng)載體中來(lái)表達(dá)。在產(chǎn)生該表達(dá)載體時(shí)，該編碼序列位于該載體中，這樣使得該編碼序列與該供表達(dá)的適當(dāng)控制序列可操作地連接。

重組表達(dá)載體可以是可便利地經(jīng)受重組dna程序并且可引起多核苷酸表達(dá)的任何載體(例如，質(zhì)?；虿《?。載體的選擇將典型地取決于該載體與有待引入該載體的宿主細(xì)胞的相容性。該載體可以是一種線性的或閉合的環(huán)狀質(zhì)粒。

載體可以是自主復(fù)制載體，即，作為染色體外實(shí)體存在的載體，其復(fù)制獨(dú)立于染色體復(fù)制，例如，質(zhì)粒、染色體外元件、微染色體或人工染色體。該載體可包含任何用以保證自我復(fù)制的要素?？商娲?，該載體可以是這樣載體，當(dāng)它被引入該宿主細(xì)胞中時(shí)，被整合到基因組中并且與其中已整合了它的一個(gè)或多個(gè)染色體一起復(fù)制。此外，可以使用單一載體或質(zhì)粒或兩個(gè)或更多個(gè)載體或質(zhì)粒(這些載體或質(zhì)粒共同包含待引入到宿主細(xì)胞的基因組中的總dna)或轉(zhuǎn)座子。

該載體優(yōu)選包含允許方便地選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞、轉(zhuǎn)染細(xì)胞、轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞等細(xì)胞的一個(gè)或多個(gè)選擇性標(biāo)記。選擇性標(biāo)記是這樣一種基因，該基因的產(chǎn)物提供了殺生物劑抗性或病毒抗性、重金屬抗性、營(yíng)養(yǎng)缺陷型的原養(yǎng)型等。

用于在絲狀真菌宿主細(xì)胞中使用的選擇性標(biāo)記包括但不限于，adea(磷酸核糖酰氨基咪唑-琥珀羧胺合酶)、adeb(磷酸核糖酰-氨基咪唑合酶)、amds(乙酰胺酶)、argb(鳥(niǎo)氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶)、bar(草丁膦乙酰轉(zhuǎn)移酶)、hph(潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶)、niad(硝酸還原酶)、pyrg(乳清酸核苷-5'-磷酸脫羧酶)、sc(硫酸腺苷基轉(zhuǎn)移酶)、以及trpc(鄰氨基苯甲酸合酶)，連同其等效物。優(yōu)選地用于曲霉細(xì)胞中的是構(gòu)巢曲霉或米曲霉amds和pyrg基因以及吸水鏈霉菌bar基因。在木霉屬細(xì)胞中優(yōu)選使用的是adea、adeb、amds、hph以及pyrg基因。

選擇性標(biāo)記可以是如在wo2010/039889中描述的雙選擇性標(biāo)記系統(tǒng)。在一方面中，雙選擇性標(biāo)記是hph-tk雙選擇性標(biāo)記系統(tǒng)。

載體優(yōu)選包含允許載體整合到宿主細(xì)胞的基因組中或載體在細(xì)胞中獨(dú)立于基因組自主復(fù)制的一個(gè)或多個(gè)元件。

對(duì)于整合到該宿主細(xì)胞基因組中，該載體可以依靠編碼該多肽的多核苷酸序列或者用于通過(guò)同源或非同源重組整合到該基因組中的該載體的任何其他元件?？商娲?，該載體可以包含用于指導(dǎo)通過(guò)同源重組而整合到宿主細(xì)胞基因組中的一個(gè)或多個(gè)染色體中的一個(gè)或多個(gè)精確位置的另外的多核苷酸。為了增加在精確位置整合的可能性，這些整合的元件應(yīng)包含足夠數(shù)量的核酸，例如100至10,000個(gè)堿基對(duì)、400至10,000個(gè)堿基對(duì)、以及800至10,000個(gè)堿基對(duì)，這些堿基對(duì)與對(duì)應(yīng)的靶序列具有高度的序列一致性以提高同源重組的可能性。這些整合元件可以是與宿主細(xì)胞的基因組內(nèi)的靶序列同源的任何序列。此外，這些整合元件可以是非編碼多核苷酸或編碼多核苷酸。在另一方面，該載體可以通過(guò)非同源重組整合到宿主細(xì)胞的基因組中。

對(duì)于自主復(fù)制，該載體可以進(jìn)一步包括使該載體能夠在所討論的宿主細(xì)胞中自主復(fù)制的復(fù)制起點(diǎn)。復(fù)制起點(diǎn)可以是在細(xì)胞中起作用的介導(dǎo)自主復(fù)制的任何質(zhì)粒復(fù)制子。術(shù)語(yǔ)“復(fù)制起點(diǎn)”或“質(zhì)粒復(fù)制子”意指使質(zhì)粒或載體能夠在體內(nèi)復(fù)制的多核苷酸。

在絲狀真菌細(xì)胞中有用的復(fù)制起點(diǎn)的實(shí)例是ama1和ans1(格姆斯(gems)等人，1991，基因(gene)98:61-67；卡倫(cullen)等人，1987，核酸研究(nucleicacidsres.)15:9163-9175；wo00/24883)。ama1基因的分離和包括該基因的質(zhì)?；蜉d體的構(gòu)建可以根據(jù)披露于wo00/24883中的方法完成。

可以將本發(fā)明的多核苷酸的多于一個(gè)的拷貝插入到宿主細(xì)胞中以增加多肽的產(chǎn)生。通過(guò)將序列的至少一個(gè)另外的拷貝整合到宿主細(xì)胞基因組中或者通過(guò)包含與該多核苷酸一起的可擴(kuò)增的選擇性標(biāo)記基因可以獲得多核苷酸的增加的拷貝數(shù)目，其中通過(guò)在適當(dāng)?shù)倪x擇性試劑的存在下培養(yǎng)細(xì)胞可以選擇包含選擇性標(biāo)記基因的經(jīng)擴(kuò)增的拷貝的細(xì)胞、以及由此該多核苷酸的另外的拷貝。

用于連接以上所描述的元件以構(gòu)建本發(fā)明的重組表達(dá)載體的程序是本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員熟知的(參見(jiàn)，例如，薩姆布魯克(sambrook)等人，1989，同上)。

宿主細(xì)胞

本發(fā)明還涉及重組宿主細(xì)胞，這些宿主細(xì)胞包含可操作地連接到一個(gè)或多個(gè)控制序列的本發(fā)明的多核苷酸，這些控制序列指導(dǎo)本發(fā)明的多肽的產(chǎn)生。將包括多核苷酸的構(gòu)建體或載體引入宿主細(xì)胞中，這樣使得該構(gòu)建體或載體被維持作為染色體整合體或作為自主復(fù)制的染色體外載體，如早前所述。術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”涵蓋由于復(fù)制過(guò)程中發(fā)生的突變與親本細(xì)胞不同的親本細(xì)胞的任何后代。宿主細(xì)胞的選擇在很大程度上取決于編碼該多肽的基因及其來(lái)源。

突變體絲狀真菌宿主細(xì)胞可以是枝頂孢霉屬、曲霉屬、短梗霉屬、煙管霉屬(bjerkandera)、擬臘菌屬、金孢子菌屬、鬼傘屬、革蓋菌屬(coriolus)、隱球菌屬、線黑粉菌科(filibasidium)、鐮孢屬、腐質(zhì)霉屬、梨孢菌屬、毛霉屬、毀絲霉屬、新美鞭菌屬、鏈孢菌屬、擬青霉屬、青霉屬、平革菌屬、射脈菌屬(phlebia)、瘤胃壺菌屬、側(cè)耳屬(pleurotus)、裂褶菌屬、籃狀菌屬、嗜熱子囊菌屬、梭孢殼屬、彎頸霉屬、栓菌屬(trametes)或木霉屬細(xì)胞。

例如，絲狀真菌宿主細(xì)胞可以是泡盛曲霉、臭曲霉、煙曲霉、日本曲霉、構(gòu)巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、黑刺煙管菌(bjerkanderaadusta)、干擬蠟菌(ceriporiopsisaneirina)、卡內(nèi)基擬蠟菌(ceriporiopsiscaregiea)、淺黃擬蠟孔菌(ceriporiopsisgilvescens)、潘諾希塔擬蠟菌(ceriporiopsispannocinta)、環(huán)帶擬蠟菌(ceriporiopsisrivulosa)、微紅擬蠟菌(ceriporiopsissubrufa)、蟲(chóng)擬蠟菌(ceriporiopsissubvermispora)、狹邊金孢子菌(chrysosporiuminops)、嗜角質(zhì)金孢子菌、盧克諾文思金孢子菌(chrysosporiumlucknowense)、糞狀金孢子菌(chrysosporiummerdarium)、租金孢子菌、昆士蘭金孢子菌(chrysosporiumqueenslandicum)、熱帶金孢子菌、褐薄金孢子菌(chrysosporiumzonatum)、灰蓋鬼傘(coprinuscinereus)、毛革蓋菌(coriolushirsutus)、桿孢狀鐮孢、谷類(lèi)鐮孢、庫(kù)威鐮孢、大刀鐮孢、禾谷鐮孢、禾赤鐮孢、異孢鐮孢、合歡木鐮孢、尖鐮孢、多枝鐮孢、粉紅鐮孢、接骨木鐮孢、膚色鐮孢、擬分枝孢鐮孢、硫色鐮孢、圓鐮孢、擬絲孢鐮孢、鑲片鐮孢、特異腐質(zhì)霉、柔毛腐質(zhì)霉、米黑毛霉、嗜熱毀絲霉、粗糙鏈孢菌、產(chǎn)紫青霉、黃孢平革菌(phanerochaetechrysosporium)、射脈菌(phlebiaradiata)、刺芹側(cè)耳(pleurotuseryngii)、土生梭孢殼霉、長(zhǎng)域毛栓菌(trametesvillosa)、變色栓菌(trametesversicolor)、哈茨木霉、康寧木霉、長(zhǎng)枝木霉、里氏木霉、或綠色木霉細(xì)胞。

真菌細(xì)胞可以通過(guò)下述過(guò)程轉(zhuǎn)化，所述過(guò)程涉及原生質(zhì)體形成、原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化、以及以本身已知的方式的細(xì)胞壁的再生。用于轉(zhuǎn)化曲霉屬和木霉屬宿主細(xì)胞的適合程序在ep238023和約爾頓(yelton)等人，1984，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊(proc.natl.acad.sci.usa)81:1470-1474以及科里蒂森(christensen)等人，1988，生物/技術(shù)(bio/technology)6:1419-1422中描述。用于轉(zhuǎn)化鐮刀菌屬物種的適合方法在馬拉迪耶(malardier)等人，1989，基因(gene)78:147-156和wo96/00787中描述。

生產(chǎn)方法

本發(fā)明還涉及產(chǎn)生本發(fā)明多肽的方法，所述方法包括：(a)將如在本發(fā)明的第一個(gè)或第三個(gè)方面定義的重組的或突變的體絲狀真菌宿主細(xì)胞在有助于產(chǎn)生該多肽的條件下培養(yǎng)；并且任選地，(b)回收該多肽。

這些宿主細(xì)胞是在適合于使用本領(lǐng)域中已知的方法產(chǎn)生該多肽的一種營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)的。例如，可以通過(guò)搖瓶培養(yǎng)、或在實(shí)驗(yàn)室或工業(yè)發(fā)酵罐中小規(guī)?；虼笠?guī)模發(fā)酵(包括連續(xù)、分批、補(bǔ)料分批或固態(tài)發(fā)酵)培養(yǎng)細(xì)胞，所述培養(yǎng)在適合的培養(yǎng)基中并且在允許表達(dá)和/或分離多肽的條件下進(jìn)行。該培養(yǎng)是使用本領(lǐng)域中已知的程序，在一種適合營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中發(fā)生，該培養(yǎng)基包括碳和氮來(lái)源及無(wú)機(jī)鹽。適合的培養(yǎng)基可從商業(yè)供應(yīng)商獲得或可以根據(jù)公開(kāi)的組成(例如，在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心的目錄中)制備。如果多肽分泌到該營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中，那么可直接從培養(yǎng)基中回收多肽。如果多肽不分泌，那么其可從細(xì)胞裂解液中進(jìn)行回收。

可以使用特異性針對(duì)這些多肽的本領(lǐng)域已知的方法來(lái)檢測(cè)該多肽。這些檢測(cè)方法包括但不限于，特異性抗體的使用、酶產(chǎn)物的形成或酶底物的消失。例如，可以使用酶測(cè)定來(lái)確定該多肽的活性。

可以使用本領(lǐng)域已知的方法來(lái)回收多肽。例如，該多肽可以通過(guò)常規(guī)程序，包括但不限于，收集、離心、過(guò)濾、提取、噴霧干燥、蒸發(fā)或沉淀，從該營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基回收。在一方面，回收包含該多肽的發(fā)酵液。

可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的多種方法純化多肽，所述方法包括但不限于色譜(例如，離子交換色譜法、親和色譜法、疏水色譜法、聚焦色譜法和大小排阻色譜法)、電泳方法(例如，制備性等電聚焦)、差異性溶解(例如，硫酸銨沉淀)、sds-page或提取(參見(jiàn)，例如，蛋白質(zhì)純化(proteinpurification)，編者詹森(janson)和賴登(ryden)，vch出版公司，紐約，1989)，以便獲得基本上純的多肽。

在替代性方面，不回收多肽，而是使用表達(dá)該多肽的本發(fā)明宿主細(xì)胞作為多肽的來(lái)源。

用于培養(yǎng)和回收感興趣的產(chǎn)物的方法可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行。

實(shí)例

黑曲霉α-葡聚糖合酶基因和基因產(chǎn)物

黑曲霉α-葡聚糖合酶(agsa)基因示出在seqidno:1(基因組dna)和seqidno:2(cdna)中。編碼的agsa合酶的氨基酸示出在seqidno:3中。

黑曲霉α-葡聚糖合酶(agse)基因示出在seqidno:4(基因組dna)和seqidno:5(cdna)中。編碼的agsa合酶的氨基酸示出在seqidno:6中。

材料與方法

分子克隆技術(shù)描述于薩姆布魯克，j.(sambrook,j.)，弗里奇，e.f(fritsch,e.f.)，馬尼亞蒂斯，t(maniatis,t.)(1989)分子克?。簩?shí)驗(yàn)手冊(cè)(molecularcloning:alaboratorymanual)(第2版)冷泉港實(shí)驗(yàn)室(coldspringharborlaboratory)，冷泉港(coldspringharbor)，紐約。

酶

用于dna操作的酶(例如限制性內(nèi)切核酸酶，連接酶等)可獲得自新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室公司(newenglandbiolabs，inc.)，并且根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)使用。

培養(yǎng)基和溶液

amg痕量金屬溶液由0.3g檸檬酸、0.68gzncl2、0.25gcuso4·5h2o、0.024gnicl2·6h2o、1.39gfeso4·7h2o、1.356gmnso4·5h2o組成，并且添加去離子水至1升。

cove-n-gly板由218g山梨糖醇、10g甘油、2.02gkno3、50mlcove鹽溶液、25g純凈瓊脂組成，并且添加去離子水至1升。

cove培養(yǎng)基由342.3g的蔗糖、20ml的50xcove鹽溶液、10ml的1m乙酰胺、10ml的1.5mcscl2、25g的諾布爾瓊脂組成，并且添加去離子水至1升。

cove2培養(yǎng)基由30g蔗糖、20ml50xcove鹽溶液、10ml1m乙酰胺、25g純凈瓊脂組成，并且添加去離子水至1升。

cove-n板由342.3g蔗糖、20mlcove鹽溶液、3gnano3、30g純凈瓊脂組成，并且添加去離子水至1升。

cove-n頂層瓊脂糖由342.3g蔗糖、20mlcove鹽溶液、3gnano3、10g低熔點(diǎn)瓊脂糖組成，并且添加去離子水至1升。

cove-njp板由30g蔗糖、20mlcove鹽溶液、3gnano3、30g純凈瓊脂組成，并且添加去離子水至1升。

cove鹽溶液由26gkcl、26gmgso4·7h2o、76gkh2po4、50mlcove痕量金屬溶液組成，并且添加去離子水至1升。

cove痕量金屬由0.04gna2b4o7·10h2o、0.4gcuso4·5h2o、1.2gfeso4·7h2o、1.0gmnso4·5h2o、0.8gna2moo4·2h2o、10gznso4·7h2o組成，并且添加去離子水至1升。

lb培養(yǎng)基由10g的胰蛋白胨、5g的酵母提取物、5g的氯化鈉組成，并且添加去離子水至1升。

lb加氨比西林板由10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、5g氯化鈉、15g細(xì)菌培養(yǎng)用瓊脂、以100μg/ml的氨比西林組成，并且添加去離子水至1升。

mss培養(yǎng)基由70g蔗糖、100g豆粉、三滴普魯尼克(pluronic)消泡劑組成，并且添加去離子水至1升；將ph調(diào)節(jié)至6.0。

不含尿素的mu-1glu培養(yǎng)基由260g葡萄糖、3gmgso4·7h2o、6gk2so4、5gkh2po4、0.5mlamg痕量金屬溶液、幾滴消泡劑組成，并且添加去離子水至1升；將ph調(diào)節(jié)至4.5。

50％尿素由500g尿素組成，并且添加去離子水至1升。

ypg培養(yǎng)基由10g酵母提取物、20g細(xì)菌蛋白胨、20g葡萄糖組成，并且添加去離子水至1升。

stc由0.8m山梨糖醇、25mm或50mmtrisph8、和25mm或50mmcacl2組成。

sptc由stc緩沖液中的40％聚乙二醇4000(peg4000)組成。

soc培養(yǎng)基由20g的胰蛋白胨、5g的酵母提取物、0.5g的nacl、10ml的250mmkcl組成，并且添加去離子水至1升。

tae緩沖液由4.84gtris堿、1.14ml冰乙酸、2ml0.5medta，ph8.0組成，并且添加去離子水至1升。

購(gòu)買(mǎi)的材料

將大腸桿菌dh5-α(東洋公司(toyobo))用于質(zhì)粒構(gòu)建和擴(kuò)增。將商購(gòu)的質(zhì)粒pbluescriptiisk-(斯圖特基因公司(stratagene)#212206)用于pcr片段的克隆。使用凱杰質(zhì)粒試劑盒(plasmidkit)(凱杰公司(qiagen))來(lái)回收擴(kuò)增的質(zhì)粒。使用dna連接試劑盒(寶生物公司(takara))或t4dna連接酶(寶靈曼公司(boehringermannheim))來(lái)進(jìn)行連接。使用擴(kuò)展(expand)tmpcr系統(tǒng)(寶靈曼公司)來(lái)進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)。凝膠提取試劑盒(凱杰公司)被用于純化pcr片段并從瓊脂糖凝膠中提取dna片段。

菌株

表達(dá)宿主菌株黑曲霉c3105由諾維信公司(novozymes)分離，并且它已被遺傳修飾以破壞淀粉葡糖苷酶活性和α-淀粉酶活性的表達(dá)，隨后引入黑曲霉胞嘧啶脫氨酶基因(fcy1)。

質(zhì)粒

質(zhì)粒phuda801被描述于wo2012160093中的實(shí)例4中。

質(zhì)粒phuda1019被描述于wo2012160093中的實(shí)例2中。

用于酶基因的表達(dá)的載體的質(zhì)粒prika147被描述于wo2012160093中的實(shí)例9中。

黑曲霉的轉(zhuǎn)化

親本黑曲霉宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化是使用已知用于絲狀真菌轉(zhuǎn)化的通用方法，如描述于耶爾頓(yelton)等人，“通過(guò)使用trpc質(zhì)粒的黑曲霉的轉(zhuǎn)化”(“transformationofaspergillusnidulansbyusingatrpcplasmid)”，美國(guó)科學(xué)院院刊(procnatlacadsciusa.)1984年3月；81(5):1470-4中，如下來(lái)實(shí)現(xiàn)的：

如果該宿主菌株是一種pyrg缺陷型突變體，將黑曲霉宿主菌株接種至100ml的補(bǔ)充有10mm尿苷的ypg培養(yǎng)基上，并且在32℃下在80rpm下孵育16小時(shí)。將球粒進(jìn)行收集并且用0.6mkcl洗滌，并且將其重懸浮于包含商業(yè)β-葡聚糖酶產(chǎn)品(glucanex^tm，諾維信公司(novozymesa/s)，鮑斯韋丹麥)的20ml0.6mkcl(終濃度為20mg/ml)中。將懸浮液在32℃下在80rpm下孵育直到形成原生質(zhì)體，并且然后用stc緩沖液洗滌兩次。將這些原生質(zhì)體用血紅蛋白計(jì)計(jì)數(shù)，并且在8:2:0.1的stc:stpc:dmso溶液中重懸并調(diào)節(jié)至終濃度為2.5x10⁷個(gè)原生質(zhì)體/ml。將大約4μg的質(zhì)粒dna添加至100μl的原生質(zhì)體懸浮液中，輕輕混合，并且冰上孵育30分鐘。添加1mlsptc，并且將該原生質(zhì)體懸浮液在37℃下孵育20分鐘。在添加10ml50℃cove-n頂層瓊脂糖后，將混合物傾倒于基本培養(yǎng)基上，并且將這些板在30℃下孵育5天。

pcr擴(kuò)增：

pcr條件

用于報(bào)告酶生產(chǎn)的搖瓶培養(yǎng)

將選擇的轉(zhuǎn)化體的孢子接種進(jìn)100ml的mss培養(yǎng)基，并且在30℃下培養(yǎng)3天。將10％的種子培養(yǎng)物以實(shí)驗(yàn)室規(guī)模罐轉(zhuǎn)移至mu-1glu培養(yǎng)基中，用適當(dāng)量的葡萄糖和銨進(jìn)行給料，并且在34℃下培養(yǎng)6天。通過(guò)離心獲得上清液。使用離心后的培養(yǎng)物上清液用于酶測(cè)定。

southern雜交

將所選擇的轉(zhuǎn)化體的菌絲體從在3mlypg培養(yǎng)基中的過(guò)夜培養(yǎng)物中收獲，用蒸餾水沖洗。遵循制造商的說(shuō)明書(shū)，將研磨的菌絲體經(jīng)受使用土壤用fastdnaspin試劑盒(mp生物醫(yī)療)的基因組dna制備。遵循制造商的說(shuō)明書(shū)，使用pcrdig探針合成試劑盒(羅氏應(yīng)用科學(xué)公司(rocheappliedscience)，印第安納州，印第安納波利斯(indianapolis，in))合成非放射性探針。遵循制造商的說(shuō)明書(shū)，使用qiaquicktm凝膠提取試劑盒(凱杰公司(qiageninc.)，巴倫西亞，加利福尼亞州)將dig標(biāo)記的探針進(jìn)行凝膠純化。

將5微克的基因組dna用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶完全消化16小時(shí)(40μl總體積、4u酶/μldna)并且在0.8％瓊脂糖凝膠上運(yùn)行。將該dna在凝膠中通過(guò)用0.2mhcl處理進(jìn)行片段化、變性(0.5mnaoh，1.5mnacl)并且進(jìn)行中和(1mtris，ph7.5；1.5mnacl)用于隨后在20xssc中轉(zhuǎn)移至海邦(hybond)n+膜(安瑪西亞公司(amersham))上。將該dna進(jìn)行uv交聯(lián)到該膜上并且在42℃下在20mldigeasyhyb(羅氏診斷產(chǎn)品有限公司(rochediagnosticscorporation)，曼海姆，德國(guó))中預(yù)雜交1小時(shí)。將變性的探針直接添加至digeasyhyb緩沖液中并且在42℃下進(jìn)行過(guò)夜雜交。在雜交后洗滌(在2xssc中、室溫、5分鐘洗滌兩次；并且在0.1xssc中、68℃洗滌兩次，各15min)，遵循制造商的方案，使用dig檢測(cè)系統(tǒng)和cpd-star(羅氏公司)進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測(cè)。dig-標(biāo)記的dna分子量標(biāo)記ii(羅氏公司)被用于標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)記。

布拉德福德(bradford)測(cè)定(全部蛋白測(cè)定)

布拉德福德(bradford)測(cè)定、比色蛋白測(cè)定是基于染料考馬斯亮藍(lán)g-250的吸光度偏移，其中在酸性條件下，紅色形式的染料轉(zhuǎn)化成其藍(lán)色形式，以結(jié)合正在測(cè)定的蛋白質(zhì)。染料與蛋白質(zhì)的結(jié)合穩(wěn)定化了藍(lán)色陰離子形式。在595nm處的吸光度的增加與結(jié)合的染料的量成比例，并且因此與樣品中存在的蛋白質(zhì)的量(濃度)成比例。

遵循制造商的說(shuō)明書(shū)，將酶樣品用蒸餾水適當(dāng)?shù)叵♂專(zhuān)⑶彝ㄟ^(guò)使用quickstart^tm布拉德福德(bradford)蛋白測(cè)定(伯樂(lè)公司(bio-radinc.))來(lái)測(cè)量它們的蛋白質(zhì)量。

實(shí)例1：質(zhì)粒phuda1685，用于黑曲霉agsa基因的靶標(biāo)基因破壞的載體的構(gòu)建

構(gòu)建質(zhì)粒phuda1685以包含黑曲霉α-葡聚糖合酶(agsa)基因的5’和3’側(cè)翼區(qū)，這兩個(gè)側(cè)翼區(qū)通過(guò)與其終止子重復(fù)一起的作為選擇性標(biāo)記的構(gòu)巢曲霉乳清苷-5’-磷酸脫羧酶基因(pyrg)，和人單純皰疹病毒1(hsv-1)胸苷激酶基因分開(kāi)。hsv-1胸苷激酶基因位于agsa基因的3’側(cè)翼區(qū)的3’端，允許沒(méi)有正確地靶向整合至agsa基因座的黑曲霉轉(zhuǎn)化體的反向選擇。以如下所述的若干個(gè)步驟構(gòu)建質(zhì)粒。

使用以下引物產(chǎn)生包含黑曲霉agsa的5’側(cè)翼區(qū)的pcr產(chǎn)物：

引物agsa1(正義)：5’ggtggcggccgcctgtgaatagctaccagc(seqidno:7)

引物agsa2(反義)：5’ctccactagttgctaatgtattatccatga(seqidno:8)

通過(guò)反應(yīng)中的pcr來(lái)擴(kuò)增所希望的片段，該反應(yīng)由大約100ng黑曲霉c3105的基因組dna、1μl擴(kuò)展高保真聚合酶(羅氏(roche))、100μm引物agsa1、100μm引物agsa2、5xpcr緩沖液(包含mgcl2)、20μl2.5mmdntp混合物(總體積；100μl)組成。將該反應(yīng)在c1000touch^tm熱循環(huán)儀中孵育，編程為：1個(gè)循環(huán)，在94℃下持續(xù)2分鐘；30個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)在94℃下持續(xù)30秒，55℃下持續(xù)30秒，以及72℃下持續(xù)2分鐘；1個(gè)循環(huán)，在72℃下持續(xù)7分鐘；并且4℃保持。將生成的2,509bppcr片段通過(guò)使用tae緩沖液的0.8％瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行純化，從該凝膠切離，并且使用凝膠提取試劑盒進(jìn)行提取。將純化的2,509bppcr片段用noti和spei進(jìn)行消化。

將質(zhì)粒phuda801(wo2012160093a1中的實(shí)例4)用noti和spei進(jìn)行消化，并且通過(guò)使用tae緩沖液的0.8％瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行純化，將其中的9,558bp片段從該凝膠切離，并且使用凝膠提取試劑盒進(jìn)行提取。在一個(gè)反應(yīng)中將9,558bp片段連接至2,509bppcr片段，該反應(yīng)由1μl9,558bp片段、3μl2,509bp片段、1μl5x連接酶緩沖液、5μl2x連接酶緩沖液、以及1μl連接酶(羅氏(roche)快速dna連接試劑盒)組成。將該連接反應(yīng)在室溫下孵育10分鐘。將5μl的連接混合物轉(zhuǎn)化到dh5-α化學(xué)感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞中。將轉(zhuǎn)化體涂布在lb加氨比西林板上，并且在37℃下孵育過(guò)夜。使用qia小量制備試劑盒，將質(zhì)粒dna從若干個(gè)轉(zhuǎn)化體中純化。通過(guò)使用適當(dāng)?shù)南拗菩悦?，隨后通過(guò)使用tae緩沖液的0.8％瓊脂糖凝膠電泳，篩選適當(dāng)連接的質(zhì)粒dna。將一種質(zhì)粒命名為phuda801-5’agsa。

使用以下引物產(chǎn)生包含黑曲霉agsa的3’側(cè)翼區(qū)的pcr產(chǎn)物：

引物agsa3(正義)：5’cttctagagtttaaacaaccgcctcagcag(seqidno:9)

引物agsa4(反義)：5’ttaattaaagaagggcattctatggacgta(seqidno:10)

通過(guò)反應(yīng)中的pcr來(lái)擴(kuò)增所希望的片段，該反應(yīng)由大約100ng黑曲霉c3105的基因組dna、1μl擴(kuò)展高保真聚合酶(羅氏(roche))、100μm引物agsa3、100μm引物agsa4、5xpcr緩沖液(包含mgcl2)、20μl2.5mmdntp混合物(總體積；100μl)組成。將該反應(yīng)在c1000touch^tm熱循環(huán)儀中孵育，編程為：1個(gè)循環(huán)，在94℃下持續(xù)2分鐘；30個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)在94℃下持續(xù)30秒，55℃下持續(xù)30秒，以及72℃下持續(xù)2分鐘；1個(gè)循環(huán)，在72℃下持續(xù)7分鐘；并且4℃保持。將生成的2,299bppcr片段通過(guò)使用tae緩沖液的0.8％瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行純化，從該凝膠切離，并且使用凝膠提取試劑盒進(jìn)行提取。將純化的2,299bppcr片段用xbai和paci進(jìn)行消化。

將質(zhì)粒phuda801-5’agsa用xbai和paci進(jìn)行消化，并且通過(guò)使用tae緩沖液的0.8％瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行純化，將其中的10,030bp片段從該凝膠切離，并且使用凝膠提取試劑盒進(jìn)行提取。在一個(gè)反應(yīng)中將10,030bp片段連接至2,299bppcr片段，該反應(yīng)由1μl10,030bp片段、3μl2,299bp片段、1μl5x連接酶緩沖液、5μl2x連接酶緩沖液、以及1μl連接酶(羅氏(roche)快速dna連接試劑盒)組成。將該連接反應(yīng)在室溫下孵育10分鐘。將5μl的連接混合物轉(zhuǎn)化到dh5-α化學(xué)感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞中。將轉(zhuǎn)化體涂布在lb加氨比西林板上，并且在37℃下孵育過(guò)夜。使用qia小量制備試劑盒，將質(zhì)粒dna從若干個(gè)轉(zhuǎn)化體中純化。通過(guò)使用適當(dāng)?shù)南拗菩悦福S后通過(guò)使用tae緩沖液的0.8％瓊脂糖凝膠電泳，篩選適當(dāng)連接的質(zhì)粒dna。將一種質(zhì)粒命名為phuda1685(圖2)。

實(shí)例2：質(zhì)粒phuda1701，用于黑曲霉agse基因的靶標(biāo)基因破壞的載體的構(gòu)建

構(gòu)建質(zhì)粒phuda1701以包含黑曲霉α-葡聚糖合酶(agse)基因的5’和3’側(cè)翼區(qū)，這兩個(gè)側(cè)翼區(qū)通過(guò)作為選擇性標(biāo)記的構(gòu)巢曲霉乙酰胺酶基因(amds)，和人單純皰疹病毒1(hsv-1)胸苷激酶基因分開(kāi)。該hsv-1胸苷激酶基因位于agse基因的3’側(cè)翼區(qū)的3’端，允許沒(méi)有正確地靶向agse基因座的黑曲霉轉(zhuǎn)化體的反向選擇。以如下所述的若干個(gè)步驟構(gòu)建質(zhì)粒。

使用以下引物產(chǎn)生包含黑曲霉agse的5’側(cè)翼區(qū)的pcr產(chǎn)物：

引物agse1(正義)：5’accgcggtctttcagccagggaatggct(seqidno:11)

引物agse2(反義)：5’ttactagtacacaatagtgcaggtgatgtc(seqidno:12)

通過(guò)反應(yīng)中的pcr來(lái)擴(kuò)增所希望的片段，該反應(yīng)由大約100ng黑曲霉c3105的基因組dna、1μl擴(kuò)展高保真聚合酶(roche)、100μm引物agse1、100μm引物agse2、5xpcr緩沖液(包含mgcl2)、20μl2.5mmdntp混合物(總體積；100μl)組成。將該反應(yīng)在c1000touch^tm熱循環(huán)儀中孵育，編程為：1個(gè)循環(huán)，在94℃下持續(xù)2分鐘；30個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)在94℃下持續(xù)30秒，55℃下持續(xù)30秒，以及72℃下持續(xù)2分鐘；1個(gè)循環(huán)，在72℃下持續(xù)7分鐘；并且4℃保持。將生成的2,300bppcr片段通過(guò)使用tae緩沖液的0.8％瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行純化，從該凝膠切離，并且使用凝膠提取試劑盒進(jìn)行提取。將純化的2,300bppcr片段用sacii和spei進(jìn)行消化。

將質(zhì)粒phuda801(在wo2012160093a1中的實(shí)例4)用sacii和spei進(jìn)行消化，并且通過(guò)使用tae緩沖液的0.8％瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行純化，將其中的9,561bp片段從該凝膠切離，并且使用凝膠提取試劑盒進(jìn)行提取。在一個(gè)反應(yīng)中，將9,561bp片段連接至2,300bppcr片段，該反應(yīng)由1μl9,561bp片段、3μl2,300bp片段、1μl5x連接酶緩沖液、5μl2x連接酶緩沖液、以及1μl連接酶(羅氏(roche)快速dna連接試劑盒)組成。將該連接反應(yīng)在室溫下孵育10分鐘。將5μl的連接混合物轉(zhuǎn)化到dh5-α化學(xué)感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞中。將轉(zhuǎn)化體涂布在lb加氨比西林板上，并且在37℃下孵育過(guò)夜。使用qia小量制備試劑盒，將質(zhì)粒dna從若干個(gè)轉(zhuǎn)化體中純化。通過(guò)使用適當(dāng)?shù)南拗菩悦?，隨后通過(guò)使用tae緩沖液的0.8％瓊脂糖凝膠電泳，篩選適當(dāng)連接的質(zhì)粒dna。將一種質(zhì)粒命名為phuda801-5’agse。

使用以下引物產(chǎn)生包含黑曲霉agse的3’側(cè)翼區(qū)的pcr產(chǎn)物：

引物agse3(正義)：5’tttctagacgccttaatgatgtggtggtg(seqidno:13)

引物agse4(反義)：5’ttaattaaatggcgcccactgctacagg(seqidno:14)

通過(guò)反應(yīng)中的pcr來(lái)擴(kuò)增所希望的片段，該反應(yīng)由大約100ng黑曲霉c3105的基因組dna、1μl擴(kuò)展高保真聚合酶(羅氏(roche))、100μm引物agse3、100μm引物agse4、5xpcr緩沖液(包含mgcl2)、20μl2.5mmdntp混合物(總體積；100μl)組成。將該反應(yīng)在c1000touch^tm熱循環(huán)儀中孵育，編程為：1個(gè)循環(huán)，在94℃下持續(xù)2分鐘；30個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)在94℃下持續(xù)30秒，55℃下持續(xù)30秒，以及72℃下持續(xù)2分鐘；1個(gè)循環(huán)，在72℃下持續(xù)7分鐘；并且4℃保持。將生成的2,280bppcr片段通過(guò)使用tae緩沖液的0.8％瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行純化，從該凝膠切離，并且使用凝膠提取試劑盒進(jìn)行提取。將純化的2,280bppcr片段用xbai和paci進(jìn)行消化。

將質(zhì)粒phuda801-5’agse用xbai和paci進(jìn)行消化，并且通過(guò)使用tae緩沖液的0.8％瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行純化，將其中的9,830bp片段從該凝膠切離，并且使用凝膠提取試劑盒進(jìn)行提取。在一個(gè)反應(yīng)中，將9,830bp片段連接至2,280bppcr片段，該反應(yīng)由1μl9,830bp片段、3μl2,280bp片段、1μl5x連接酶緩沖液、5μl2x連接酶緩沖液、以及1μl連接酶(羅氏(roche)快速dna連接試劑盒)組成。將該連接反應(yīng)在室溫下孵育10分鐘。將5μl的連接混合物轉(zhuǎn)化到dh5-α化學(xué)感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞中。將轉(zhuǎn)化體涂布在lb加氨比西林板上，并且在37℃下孵育過(guò)夜。使用qia小量制備試劑盒，將質(zhì)粒dna從若干個(gè)轉(zhuǎn)化體中純化。通過(guò)使用適當(dāng)?shù)南拗菩悦?，隨后通過(guò)使用tae緩沖液的0.8％瓊脂糖凝膠電泳，篩選適當(dāng)連接的質(zhì)粒dna。將一種質(zhì)粒命名為phuda801-5’agse-3’agse。

將質(zhì)粒phuda801-5’agse-3’agse用xbai和spei進(jìn)行消化，并且通過(guò)使用tae緩沖液的0.8％瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行純化，將其中的9,946bp片段從該凝膠切離，并且使用凝膠提取試劑盒進(jìn)行提取。將質(zhì)粒phuda1019(描述于在wo2012160093中的實(shí)例2中)用xbai和avrii進(jìn)行消化，并且通過(guò)使用tae緩沖液的0.8％瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行純化，將其中的包含amds基因、米曲霉tef1(翻譯延長(zhǎng)因子1)啟動(dòng)子、和米曲霉niad(硝酸還原酶)終止子的3,114bp片段從該凝膠切離，并且使用凝膠提取試劑盒進(jìn)行提取。在一個(gè)反應(yīng)中，將9,946bp片段連接至3,114bp片段，該反應(yīng)由1μl9,946bp片段、3μl3,114bp片段、1μl5x連接酶緩沖液、5μl2x連接酶緩沖液、以及1μl連接酶(羅氏(roche)快速dna連接試劑盒)組成。將該連接反應(yīng)在室溫下孵育10分鐘。將5μl的連接混合物轉(zhuǎn)化到dh5-α化學(xué)感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞中。將轉(zhuǎn)化體涂布在lb加氨比西林板上，并且在37℃下孵育過(guò)夜。使用qia小量制備試劑盒，將質(zhì)粒dna從若干個(gè)轉(zhuǎn)化體中純化。通過(guò)使用適當(dāng)?shù)南拗菩悦?，隨后通過(guò)使用tae緩沖液的0.8％瓊脂糖凝膠電泳，篩選適當(dāng)連接的質(zhì)粒dna。將一個(gè)質(zhì)粒命名為phuda1701(圖3)。

實(shí)例3：黑曲霉c3105agsa基因破壞

黑曲霉c3105中的pyrg基因被解救如下。將菌株c3105接種到包含10mm尿苷和1g/l5-氟-乳清酸(5-foa)的cove-njp培養(yǎng)基上，在30℃下持續(xù)5天。其中已經(jīng)缺失pyrg基因的菌株將在5-foa的存在下生長(zhǎng)；保留該基因的那些將5-foa轉(zhuǎn)換為5-氟-ump，即一種毒性中間體。將這些生長(zhǎng)的菌落用滅菌的牙簽轉(zhuǎn)移到補(bǔ)充有10mm尿苷的cove-n-gly板上，并且在30℃下生長(zhǎng)7天。將分離菌株命名為m1405。

通過(guò)在32℃下持續(xù)16小時(shí)，以80rpm輕微攪動(dòng)，在補(bǔ)充有10mm尿苷的100ml的ypg培養(yǎng)基中培養(yǎng)菌株，來(lái)制備黑曲霉菌株m1405的原生質(zhì)體。將球粒進(jìn)行收集并且用0.6mkcl洗滌，并且將其重懸浮于包含商業(yè)β-葡聚糖酶產(chǎn)品(glucanex^tm，諾維信公司(novozymesa/s)，鮑斯韋丹麥)的20ml0.6mkcl(終濃度為20mg/ml)中。將該懸浮液在32℃下以80rpm孵育直到形成原生質(zhì)體。將原生質(zhì)體通過(guò)襯有的漏斗，過(guò)濾到50ml無(wú)菌塑料離心管中，并且用0.6mkcl進(jìn)行洗滌以提取受陷的原生質(zhì)體。通過(guò)在2,000rpm離心15分鐘收集合并的濾液和上清液。棄去上清液，并且用10-25ml的stc洗滌該球粒，并且在2,000rpm再次離心10分鐘，并且然后用stc緩沖液洗滌兩次。將這些原生質(zhì)體用血紅蛋白計(jì)計(jì)數(shù)，并且在8:2:0.1的stc:stpc:dmso溶液中重懸并調(diào)節(jié)至終濃度為2.5x10⁷個(gè)原生質(zhì)體/ml。

將大約10μg的phuda1685添加至0.3ml的m1405原生質(zhì)體懸浮液，輕輕混合，并且在冰上孵育30分鐘。添加三mlsptc，并且將該原生質(zhì)體懸浮液在37℃下孵育20分鐘。在添加12ml50℃cove-n頂層瓊脂糖之后，將該混合物傾倒于cove-n板上，并且將這些板在30℃下孵育7天。用無(wú)菌牙簽將這些生長(zhǎng)轉(zhuǎn)化體轉(zhuǎn)移到補(bǔ)充有1.5μm5-氟-2-脫氧尿苷(fdu)(即一種殺死表達(dá)包含在phuda1685中的單純皰疹病毒(hsv)胸苷激酶基因(tk)的細(xì)胞的試劑)的cove-njp板上。將單孢子分離物轉(zhuǎn)移至cove-n-gly板上。

通過(guò)dna印跡分析篩選包含用來(lái)破壞agsa基因的phuda1685的黑曲霉菌株m1405的可能的轉(zhuǎn)化體。將每個(gè)孢子純化的轉(zhuǎn)化體在3mlypg培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，并且在30℃下以200rpm搖動(dòng)孵育2天。使用襯有的漏斗來(lái)收集生物質(zhì)。遵循制造商的說(shuō)明書(shū)，將研磨的菌絲體經(jīng)受使用土壤用fastdnaspin試劑盒(mp生物醫(yī)療)的基因組dna制備。

進(jìn)行dna印跡分析，以確認(rèn)agsa基因座的破壞。用spei來(lái)消化來(lái)自每個(gè)轉(zhuǎn)化體的五μg的基因組dna?；蚪Mdna消化反應(yīng)是由5μg的基因組dna、1μlspei、2μl10xne緩沖液4組成，并且水補(bǔ)足至20μl。在37℃下，將基因組dna消化孵育大約16小時(shí)。遵循制造商的建議，將這些消化提交至使用tae緩沖液的0.8％瓊脂糖凝膠電泳，并且使用印跡至hybondn+(ge醫(yī)療集團(tuán)生命科學(xué)部(gehealthcarelifesciences)，曼徹斯特，新罕布什爾州，美國(guó))持續(xù)大約1小時(shí)。將該膜與500bp地高辛標(biāo)記的黑曲霉gasa探針雜交，其中使用如下所示的引物agsa5(正義)和agsa6(反義)通過(guò)pcr，通過(guò)摻入地高辛-11-dutp合成該探針。

正向引物(agsa5)：5’agcagtctcggcggcgagga(seqidno:15)

反向引物(agsa6)：5'attgcccaagcggcgtctca(seqidno:16)

該擴(kuò)增反應(yīng)(100μl)是由以下項(xiàng)組成的：200μmpcrdig標(biāo)記的混合物(vial2)(羅氏應(yīng)用科學(xué)公司(rocheappliedscience)，帕洛阿爾托(paloalto)，加利福尼亞州，美國(guó))，0.5μm引物，高保真酶混合物(vial1)(羅氏應(yīng)用科學(xué)公司(rocheappliedscience)，帕洛阿爾托(paloalto)，加利福尼亞州，美國(guó))，以及作為模板的1μl(100pg/μl)的phuda1685，最終體積為100μl。將該擴(kuò)增反應(yīng)在c1000touch^tm熱循環(huán)儀中孵育，編程為：1個(gè)循環(huán)，在94℃下持續(xù)2分鐘；30個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)在94℃下持續(xù)30秒，55℃下持續(xù)30秒，以及在72℃下持續(xù)30秒；并且保持4℃。通過(guò)使用tae緩沖液的0.8％瓊脂糖凝膠電泳，將pcr產(chǎn)物進(jìn)行分離，其中將0.5kb片段從該凝膠切離，并且使用凝膠提取試劑盒進(jìn)行提取。將變性的探針直接添加至digeasyhyb緩沖液中并且在42℃下進(jìn)行過(guò)夜雜交。在雜交后洗滌(在2xssc中、室溫、5分鐘洗滌兩次；并且在0.1xssc中、68℃洗滌兩次，各15min)，遵循制造商的方案，使用dig檢測(cè)系統(tǒng)和cpd-star(羅氏公司)進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測(cè)。dig-標(biāo)記的dna分子量標(biāo)記ii(羅氏公司)被用于標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)記。

選擇具有在agsa基因座(從11.9kb移位至4.7kb的雜交帶)中的正確整合的表示為m1405-1685-16的轉(zhuǎn)化體agsa突變體菌株，用于之后的實(shí)驗(yàn)。參見(jiàn)圖1。

實(shí)例4：在c3105和m1405-1685-16中的黑曲霉agse基因破壞

通過(guò)在32℃下持續(xù)16小時(shí)，以80rpm輕微攪動(dòng)，在100ml的ypg培養(yǎng)基中培養(yǎng)菌株，來(lái)制備黑曲霉菌株c3105和m1405-1685-16的原生質(zhì)體。將球粒進(jìn)行收集并且用0.6mkcl洗滌，并且將其重懸浮于包含商業(yè)β-葡聚糖酶產(chǎn)品(glucanex^tm，諾維信公司(novozymesa/s)，鮑斯韋丹麥)的20ml0.6mkcl(終濃度為20mg/ml)中。將該懸浮液在32℃下以80rpm孵育直到形成原生質(zhì)體。將原生質(zhì)體通過(guò)襯有的漏斗，過(guò)濾到50ml無(wú)菌塑料離心管中，并且用0.6mkcl進(jìn)行洗滌以提取受陷的原生質(zhì)體。通過(guò)在2,000rpm離心15分鐘收集合并的濾液和上清液。棄去上清液，并且用10-25ml的stc洗滌該球粒，并且在2,000rpm再次離心10分鐘，并且然后用stc緩沖液洗滌兩次。將這些原生質(zhì)體用血紅蛋白計(jì)計(jì)數(shù)，并且在8:2:0.1的stc:stpc:dmso溶液中重懸并調(diào)節(jié)至終濃度為2.5x10⁷個(gè)原生質(zhì)體/ml。

將大約10μg的phuda1701添加至0.3ml的原生質(zhì)體懸浮液中，輕輕混合，并且在冰上孵育30分鐘。添加三mlsptc，并且將該原生質(zhì)體懸浮液在37℃下孵育20分鐘。在添加12ml50℃cove頂層瓊脂糖之后，將該混合物傾倒在cove板上，并且將這些板在30℃下孵育7天。用無(wú)菌牙簽將這些生長(zhǎng)轉(zhuǎn)化體轉(zhuǎn)移至補(bǔ)充有1.5μm5-氟-2-脫氧尿苷(fdu)(即一種殺死表達(dá)包含在phuda1701中的單純皰疹病毒(hsv)胸苷激酶基因(tk)的細(xì)胞的試劑)的cove-2板上。將單孢子分離物轉(zhuǎn)移至cove-n-gly板上。

通過(guò)dna印跡分析篩選包含用來(lái)破壞agse基因的phuda1701的黑曲霉菌株c3105和m1405-1685-16的可能的轉(zhuǎn)化體。將每個(gè)孢子純化的轉(zhuǎn)化體在3mlypg培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，并且在30℃下以200rpm搖動(dòng)孵育2天。使用襯有的漏斗來(lái)收集生物質(zhì)。遵循制造商的說(shuō)明書(shū)，將研磨的菌絲體經(jīng)受使用土壤用fastdnaspin試劑盒(mp生物醫(yī)療)的基因組dna制備。

進(jìn)行dna印跡分析，以確認(rèn)agse基因座的破壞。用hindiii和xbai消化來(lái)自每個(gè)轉(zhuǎn)化體的五μg的基因組dna?；蚪Mdna消化反應(yīng)是由5μg基因組dna、0.5μlhindiii、0.5μlxbai、2μl10xne緩沖液4組成，并且水補(bǔ)足至20μl。在37℃下，將基因組dna消化孵育大約16小時(shí)。遵循制造商的建議，將這些消化提交至使用tae緩沖液的0.8％瓊脂糖凝膠電泳，并且使用印跡至hybondn+(ge醫(yī)療集團(tuán)生命科學(xué)部(gehealthcarelifesciences)，曼徹斯特，新罕布什爾州，美國(guó))持續(xù)大約1小時(shí)。將該膜與500bp地高辛標(biāo)記的黑曲霉agse探針雜交，其中使用如下所示的引物agse5(正義)和agse6(反義)，通過(guò)pcr，通過(guò)摻入地高辛-11-dutp合成該探針。

正向引物(agse5)：5’accgggcatgaacatttaac(seqidno:17)

反向引物(agse6)：5'aagtatttattgtattttgg(seqidno:18)

該擴(kuò)增反應(yīng)(100μl)是由以下項(xiàng)組成的：200μmpcrdig標(biāo)記的混合物(vial2)(羅氏應(yīng)用科學(xué)公司(rocheappliedscience)，帕洛阿爾托(paloalto)，加利福尼亞州，美國(guó))，0.5μm引物，高保真酶混合物(vial1)(羅氏應(yīng)用科學(xué)公司(rocheappliedscience)，帕洛阿爾托(paloalto)，加利福尼亞州，美國(guó))，以及作為模板的1μl(100pg/μl)的phuda1685，最終體積為100μl。將該擴(kuò)增反應(yīng)在c1000touch^tm熱循環(huán)儀中孵育，編程為：1個(gè)循環(huán)，在94℃下持續(xù)2分鐘；30個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)在94℃下持續(xù)30秒，55℃下持續(xù)30秒，以及在72℃下持續(xù)30秒；并且保持4℃。通過(guò)使用tae緩沖液的0.8％瓊脂糖凝膠電泳，將pcr產(chǎn)物進(jìn)行分離，其中將0.5kb片段從該凝膠切離，并且使用凝膠提取試劑盒進(jìn)行提取。將變性的探針直接添加至digeasyhyb緩沖液中并且在42℃下進(jìn)行過(guò)夜雜交。在雜交后洗滌(在2xssc中、室溫、5分鐘洗滌兩次；并且在0.1xssc中、68℃洗滌兩次，各15min)，遵循制造商的方案，使用dig檢測(cè)系統(tǒng)和cpd-star(羅氏公司)進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測(cè)。dig-標(biāo)記的dna分子量標(biāo)記ii(羅氏公司)被用于標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)記。

選擇分別從c3105和m1405-1685-16中產(chǎn)生的兩種菌株(m1405-1701-1和1685-1701-11)，它們給出在agse基因座(由具有從5.4kb移位至3.2kb的雜交帶指示)處的正確整合，用于隨后的實(shí)驗(yàn)。參見(jiàn)圖1。

實(shí)例5：金黃色嗜熱子囊菌金屬蛋白酶基因(ap025)表達(dá)載體phuda1657和phuda1694的構(gòu)建

將質(zhì)粒phuda1657構(gòu)建為包含2個(gè)拷貝的以下項(xiàng)：由串聯(lián)排列的黑曲霉中性淀粉酶啟動(dòng)子ii(pna2)和葡糖淀粉酶終止子(tamg)驅(qū)動(dòng)的金黃色嗜熱子囊菌金屬蛋白酶基因(ap025)、作為選擇性標(biāo)記的構(gòu)巢曲霉乙酰胺酶基因(amds)、以及由黑曲霉酸性穩(wěn)定性淀粉酶啟動(dòng)子(pasaa)和米曲霉硝酸還原酶終止子(tniad)驅(qū)動(dòng)的酵母釀酒酵母flp重組基因(flp)。質(zhì)粒phuda1694具有與phuda1657相同的構(gòu)建，除了具有作為選擇性標(biāo)記而不是amds選擇性標(biāo)記的構(gòu)巢曲霉乳清苷-5’-磷酸脫羧酶基因(pyrg)。以如下所述的若干個(gè)步驟構(gòu)建這些質(zhì)粒。

phuda1260的構(gòu)建

通過(guò)在prika147中從構(gòu)巢曲霉乳清苷-5’-磷酸脫羧酶基因(pyrg)改變至構(gòu)巢曲霉乙酰胺酶基因(amds)來(lái)構(gòu)建質(zhì)粒phuda1260。

遵循制造商的方案(neb，新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室公司(newenglandbiolabs,inc.))，用sphi和spei來(lái)消化質(zhì)粒prika147(描述于wo2012160093中的實(shí)例9中)，并且通過(guò)使用t4dna多聚酶來(lái)填滿其末端。通過(guò)使用tae緩沖液的0.8％瓊脂糖凝膠電泳，將該片段進(jìn)行純化，其中將9,241bp片段從該凝膠切離，并且使用凝膠提取試劑盒進(jìn)行提取。

遵循制造商的方案(neb，新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室公司(newenglandbiolabs,inc.))，用xbai和avrii來(lái)消化質(zhì)粒phuda1019(描述于wo2012160093中的實(shí)例2中)，并且通過(guò)使用t4dna多聚酶來(lái)填滿其末端。通過(guò)使用tae緩沖液的0.8％瓊脂糖凝膠電泳，將該片段進(jìn)行純化，其中將包含amds基因、米曲霉tef1(翻譯延長(zhǎng)因子1)啟動(dòng)子、和米曲霉niad(硝酸還原酶)終止子的3,114bp片段從該凝膠切離，并且使用凝膠提取試劑盒進(jìn)行提取。在一個(gè)反應(yīng)中，將9,241bp片段連接至3,114bp片段，該反應(yīng)由1μl9,241bp片段、3μl3,114bp片段、1μl5x連接酶緩沖液、5μl2x連接酶緩沖液、以及1μl連接酶(羅氏(roche)快速dna連接試劑盒)組成。將該連接反應(yīng)在室溫下孵育10分鐘。將5μl的連接混合物轉(zhuǎn)化到dh5-α化學(xué)感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞中。將轉(zhuǎn)化體涂布在lb加氨比西林板上，并且在37℃下孵育過(guò)夜。使用qia小量制備試劑盒，將質(zhì)粒dna從若干個(gè)轉(zhuǎn)化體中純化。通過(guò)使用適當(dāng)?shù)南拗菩悦?，隨后通過(guò)使用tae緩沖液的0.8％瓊脂糖凝膠電泳，篩選適當(dāng)連接的質(zhì)粒dna。將一種質(zhì)粒命名為phuda1260。(pwl：質(zhì)粒圖和全部序列？)

質(zhì)粒phuda1657的構(gòu)建

使用以下引物產(chǎn)生包含金黃色嗜熱子囊菌金屬蛋白酶基因(ap025)的pcr產(chǎn)物：

引物ap025-1(正義)：5’tttggatccaccatgcgtttcatttctgtctcc(seqidno:19)

引物ap025-2(反義)：5’ccacgtgttagcaaccaaggtatatggcat(seqidno:20)

通過(guò)反應(yīng)中的pcr來(lái)擴(kuò)增所希望的片段，該反應(yīng)由大約100ng包含ap025cdna基因的質(zhì)粒dna(描述于wo2003048353中)、1μl擴(kuò)展高保真聚合酶(roche)、100μm引物ap025-1、100μm引物ap025-2、5xpcr緩沖液(包含mgcl2)、20μl2.5mmdntp混合物(總體積；100μl)組成。將該反應(yīng)在c1000touch^tm熱循環(huán)儀中孵育，編程為：1個(gè)循環(huán)，在94℃下持續(xù)2分鐘；30個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)在94℃下持續(xù)30秒，55℃下持續(xù)30秒，以及在72℃下持續(xù)1分鐘；1個(gè)循環(huán)，在72℃下持續(xù)7分鐘；并且保持4℃。將生成的1,073bppcr片段通過(guò)使用tae緩沖液的0.8％瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行純化，從該凝膠切離，并且使用凝膠提取試劑盒進(jìn)行提取。將純化的1,073bppcr片段用bamhi和pmli進(jìn)行消化。

將質(zhì)粒phuda1260用bamhi和pmli進(jìn)行消化，并且通過(guò)使用tae緩沖液的0.8％瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行純化，其中將10,512bp片段從該凝膠切離，并且使用凝膠提取試劑盒進(jìn)行提取。在一個(gè)反應(yīng)中，將10,512bp片段連接至1,073bppcr片段，該反應(yīng)由1μl10,512bp片段、3μl1,073bp片段、1μl5x連接酶緩沖液、5μl2x連接酶緩沖液、以及1μl連接酶(羅氏(roche)快速dna連接試劑盒)組成。將該連接反應(yīng)在室溫下孵育10分鐘。將5μl的連接混合物轉(zhuǎn)化到dh5-α化學(xué)感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞中。將轉(zhuǎn)化體涂布在lb加氨比西林板上，并且在37℃下孵育過(guò)夜。使用qia小量制備試劑盒，將質(zhì)粒dna從若干個(gè)轉(zhuǎn)化體中純化。通過(guò)使用適當(dāng)?shù)南拗菩悦?，隨后通過(guò)使用tae緩沖液的0.8％瓊脂糖凝膠電泳，篩選適當(dāng)連接的質(zhì)粒dna。將一種質(zhì)粒命名為phuda1555。

將質(zhì)粒phuda1555用spei進(jìn)行消化，通過(guò)使用tae緩沖液的0.8％瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行純化，其中將11,585bp片段從該凝膠切離，并且使用凝膠提取試劑盒進(jìn)行提取。

將質(zhì)粒phuda1555用nhei和spei進(jìn)行消化，通過(guò)使用tae緩沖液的0.8％瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行純化，其中將包含ap025基因、黑曲霉中性淀粉酶啟動(dòng)子ii(pna2)、和葡糖淀粉酶終止子(tamg)的2,699bp片段從該凝膠切離，并且使用凝膠提取試劑盒進(jìn)行提取。在一個(gè)反應(yīng)中，將11,585bp片段連接至2,699bp片段，該反應(yīng)由1μl11,585bp片段、3μl2,699bp片段、1μl5x連接酶緩沖液、5μl2x連接酶緩沖液、以及1μl連接酶(羅氏(roche)快速dna連接試劑盒)組成。將該連接反應(yīng)在室溫下孵育10分鐘。將5μl的連接混合物轉(zhuǎn)化到dh5-α化學(xué)感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞中。將轉(zhuǎn)化體涂布在lb加氨比西林板上，并且在37℃下孵育過(guò)夜。使用qia小量制備試劑盒，將質(zhì)粒dna從若干個(gè)轉(zhuǎn)化體中純化。通過(guò)使用適當(dāng)?shù)南拗菩悦?，隨后通過(guò)使用tae緩沖液的0.8％瓊脂糖凝膠電泳，篩選適當(dāng)連接的質(zhì)粒dna。將一種質(zhì)粒命名為phuda1657(圖4)。

質(zhì)粒phuda1694的構(gòu)建

將質(zhì)粒prika147用nhei和spei進(jìn)行消化，通過(guò)使用tae緩沖液的0.8％瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行純化，其中將7,268bp片段從該凝膠切離，并且使用凝膠提取試劑盒進(jìn)行提取。

將質(zhì)粒phuda1657用nhei和spei進(jìn)行消化，通過(guò)使用tae緩沖液的0.8％瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行純化，其中將包含ap025基因、黑曲霉中性淀粉酶啟動(dòng)子ii(pna2)、和葡糖淀粉酶終止子(tamg)的串聯(lián)構(gòu)建體的5,036bp片段從該凝膠切離，并且使用凝膠提取試劑盒進(jìn)行提取。在一個(gè)反應(yīng)中，將7,268bp片段連接至5,036bp片段，該反應(yīng)由1μl7,268bp片段、3μl5,036bp片段、1μl5x連接酶緩沖液、5μl2x連接酶緩沖液、以及1μl連接酶(羅氏(roche)快速dna連接試劑盒)組成。將該連接反應(yīng)在室溫下孵育10分鐘。將5μl的連接混合物轉(zhuǎn)化到dh5-α化學(xué)感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞中。將轉(zhuǎn)化體涂布在lb加氨比西林板上，并且在37℃下孵育過(guò)夜。使用qia小量制備試劑盒，將質(zhì)粒dna從若干個(gè)轉(zhuǎn)化體中純化。通過(guò)使用適當(dāng)?shù)南拗菩悦?，隨后通過(guò)使用tae緩沖液的0.8％瓊脂糖凝膠電泳，篩選適當(dāng)連接的質(zhì)粒dna。將一種質(zhì)粒命名為phuda1694(圖5)。

實(shí)例6：黑曲霉菌株c3105和m1405-1685-16中的金黃色嗜熱子囊菌金屬蛋白酶基因(ap025)表達(dá)載體phuda1657的引入

應(yīng)當(dāng)通過(guò)flp重組酶，將ap025表達(dá)質(zhì)粒引入四個(gè)預(yù)指定的基因座處，它們是中性淀粉酶i(amya)、中性淀粉酶ii(amyb)、酸性穩(wěn)定淀粉酶(asaa)、以及推定的堿性硫酸酯酶(paya)。

通過(guò)在32℃下持續(xù)16小時(shí)，以80rpm輕微攪動(dòng)，在100ml的ypg培養(yǎng)基中培養(yǎng)菌株，來(lái)制備黑曲霉菌株c3105和m1405-1685-16的原生質(zhì)體。將球粒進(jìn)行收集并且用0.6mkcl洗滌，并且將其重懸浮于包含商業(yè)β-葡聚糖酶產(chǎn)品(glucanex^tm，諾維信公司(novozymesa/s)，鮑斯韋丹麥)的20ml0.6mkcl(終濃度為20mg/ml)中。將該懸浮液在32℃下以80rpm孵育直到形成原生質(zhì)體。將原生質(zhì)體通過(guò)襯有的漏斗，過(guò)濾到50ml無(wú)菌塑料離心管中，并且用0.6mkcl進(jìn)行洗滌以提取受陷的原生質(zhì)體。通過(guò)在2,000rpm離心15分鐘收集合并的濾液和上清液。棄去上清液，并且用10-25ml的stc洗滌該球粒，并且在2,000rpm再次離心10分鐘，并且然后用stc緩沖液洗滌兩次。將這些原生質(zhì)體用血紅蛋白計(jì)計(jì)數(shù)，并且在8:2:0.1的stc:stpc:dmso溶液中重懸并調(diào)節(jié)至終濃度為2.5x10⁷個(gè)原生質(zhì)體/ml。

將大約10μg的phuda1657添加至0.3ml的原生質(zhì)體懸浮液中，輕輕混合，并且在冰上孵育30分鐘。添加三mlsptc，并且將該原生質(zhì)體懸浮液在37℃下孵育20分鐘。添加12ml補(bǔ)充有50微克/ml的5’氟胞嘧啶(5fc)(即一種殺死表達(dá)包含在c3105和m1405-1685-16中的黑曲霉胞嘧啶脫氨酶(fcy1)基因的細(xì)胞的試劑)的50℃cove頂層瓊脂糖之后，將該混合物傾倒在cove板上，并且將這些板在30℃下孵育10天。將這些生長(zhǎng)轉(zhuǎn)化體用無(wú)菌牙簽轉(zhuǎn)移至補(bǔ)充有10μg/ml5’氟胞嘧啶(5fc)的cove-2板上。將單孢子分離物轉(zhuǎn)移至cove-n-gly板上。

通過(guò)dna印跡分析篩選包含用來(lái)引入ap025基因的phuda1657的黑曲霉菌株c3105和m1405-1685-16的可能的轉(zhuǎn)化體。將每個(gè)孢子純化的轉(zhuǎn)化體在3mlypg培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，并且在30℃下以200rpm搖動(dòng)孵育2天。使用襯有的漏斗來(lái)收集生物質(zhì)。遵循制造商的說(shuō)明書(shū)，將研磨的菌絲體經(jīng)受使用土壤用fastdnaspin試劑盒(mp生物醫(yī)療)的基因組dna制備。

進(jìn)行dna印跡分析來(lái)確認(rèn)四個(gè)預(yù)指定的基因座(amya、amyb、asaa、paya)處的ap025基因的引入。用hindiii來(lái)消化來(lái)自每個(gè)轉(zhuǎn)化體的五μg的基因組dna?；蚪Mdna消化反應(yīng)是由5μg基因組dna、0.5μlhindiii、2μl10xne緩沖液4組成，并且水補(bǔ)足至20μl。在37℃下，將基因組dna消化孵育大約16小時(shí)。遵循制造商的建議，將這些消化提交至使用tae緩沖液的0.5％瓊脂糖凝膠電泳，并且使用印跡至hybondn+(ge醫(yī)療集團(tuán)生命科學(xué)部(gehealthcarelifesciences)，曼徹斯特，新罕布什爾州，美國(guó))持續(xù)大約1小時(shí)。將該膜與500bp地高辛標(biāo)記的ap025探針雜交，其中使用如下所示的引物ap025-3(正義)和ap025-4(反義)，通過(guò)pcr，通過(guò)摻入地高辛-11-dutp合成該探針。

正向引物(ap025-3)：5’aggatcagttcctgctccgg(seqidno:21)

反向引物(ap025-4)：5'ggtatatggcattcgcatag(seqidno:22)

該擴(kuò)增反應(yīng)(100μl)是由以下項(xiàng)組成的：200μmpcrdig標(biāo)記的混合物(vial2)(羅氏應(yīng)用科學(xué)公司(rocheappliedscience)，帕洛阿爾托(paloalto)，加利福尼亞州，美國(guó))、0.5μm引物、高保真酶混合物(vial1)(羅氏應(yīng)用科學(xué)公司(rocheappliedscience)，帕洛阿爾托(paloalto)，加利福尼亞州，美國(guó))、以及作為模板的1μl(100pg/μl)的phuda1555，最終體積為100μl。將該擴(kuò)增反應(yīng)在c1000touch^tm熱循環(huán)儀中孵育，編程為：1個(gè)循環(huán)，在94℃下持續(xù)2分鐘；30個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)在94℃下持續(xù)30秒，55℃下持續(xù)30秒，以及在72℃下持續(xù)30秒；并且保持4℃。通過(guò)使用tae緩沖液的0.8％瓊脂糖凝膠電泳，將pcr產(chǎn)物進(jìn)行分離，其中將0.5kb片段從該凝膠切離，并且使用凝膠提取試劑盒進(jìn)行提取。將變性的探針直接添加至digeasyhyb緩沖液中并且在42℃下進(jìn)行過(guò)夜雜交。在雜交后洗滌(在2xssc中、室溫、5分鐘洗滌兩次；并且在0.1xssc中、68℃洗滌兩次，各15min)，遵循制造商的方案，使用dig檢測(cè)系統(tǒng)和cpd-star(羅氏公司)進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測(cè)。dig-標(biāo)記的dna分子量標(biāo)記ii(羅氏公司)被用于標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)記。

選擇分別從親本菌株c3105和m1405-1685-16產(chǎn)生的，各自具有在四個(gè)基因座處的(在6.6kb、7.0kb、8.6kb、和10.1kb的大小的四個(gè)雜交帶)正確整合的兩種菌株(c3105-1657-8和1685-1657-16)，用于隨后的實(shí)驗(yàn)。參見(jiàn)圖1。

實(shí)例7：黑曲霉菌株(m1405-1701-1和1685-1701-11)中的金黃色嗜熱子囊菌金屬蛋白酶基因(ap025)表達(dá)載體phuda1694的引入

應(yīng)當(dāng)通過(guò)flp重組酶，將ap025表達(dá)質(zhì)粒引入四個(gè)預(yù)指定的基因座處，它們是中性淀粉酶i(amya)、中性淀粉酶ii(amyb)、酸性穩(wěn)定淀粉酶(asaa)、以及推定的堿性硫酸酯酶(paya)。

m1405-1701-1和1685-1701-11中的pyrg基因被解救如下。將兩種菌株接種到包含10mm尿苷和1g/l5-氟-乳清酸(5-foa)的cove-njp培養(yǎng)基上，在30℃下持續(xù)5天。其中已經(jīng)缺失pyrg基因的菌株將在5-foa的存在下生長(zhǎng)；保留該基因的那些將5-foa轉(zhuǎn)換為5-氟-ump，即一種毒性中間體。將這些生長(zhǎng)的菌落用滅菌的牙簽轉(zhuǎn)移到補(bǔ)充有10mm尿苷的cove-n-gly板上，并且在30℃下生長(zhǎng)7天。將來(lái)自m1405-1701-1，1685-1701-11的這些分離的菌株分別命名為m1405-1701-p2和1685-1701-11-p1。

通過(guò)在32℃下持續(xù)16小時(shí)，以80rpm輕微攪動(dòng)，在補(bǔ)充有10mm尿苷的100ml的ypg培養(yǎng)基中培養(yǎng)菌株，來(lái)制備黑曲霉菌株m1405-1701-p2和1685-1701-11-p1的原生質(zhì)體。將球粒進(jìn)行收集并且用0.6mkcl洗滌，并且將其重懸浮于包含商業(yè)β-葡聚糖酶產(chǎn)品(glucanex^tm，諾維信公司(novozymesa/s)，鮑斯韋丹麥)的20ml0.6mkcl(終濃度為20mg/ml)中。將該懸浮液在32℃下以80rpm孵育直到形成原生質(zhì)體。將原生質(zhì)體通過(guò)襯有的漏斗，過(guò)濾到50ml無(wú)菌塑料離心管中，并且用0.6mkcl進(jìn)行洗滌以提取受陷的原生質(zhì)體。通過(guò)在2,000rpm離心15分鐘收集合并的濾液和上清液。棄去上清液，并且用10-25ml的stc洗滌該球粒，并且在2,000rpm再次離心10分鐘，并且然后用stc緩沖液洗滌兩次。將這些原生質(zhì)體用血紅蛋白計(jì)計(jì)數(shù)，并且在8:2:0.1的stc:stpc:dmso溶液中重懸并調(diào)節(jié)至終濃度為2.5x10⁷個(gè)原生質(zhì)體/ml。

將大約10μg的phuda1694添加至0.3ml的原生質(zhì)體懸浮液中，輕輕混合，并且在冰上孵育30分鐘。添加三mlsptc，并且將該原生質(zhì)體懸浮液在37℃下孵育20分鐘。添加12ml補(bǔ)充有50μg/ml的5’氟胞嘧啶(5fc)(即一種殺死表達(dá)包含在m1405-1701-p2和1685-1701-11-p1中的黑曲霉胞嘧啶脫氨酶(fcy1)基因的細(xì)胞的試劑)的50℃cove-n頂層瓊脂糖之后，將該混合物傾倒在cove-n板上，并且將這些板在30℃下孵育10天。將這些生長(zhǎng)轉(zhuǎn)化體用無(wú)菌牙簽轉(zhuǎn)移至補(bǔ)充有10微克/ml的5’氟胞嘧啶(5fc)的cove-njp板上。將單孢子分離物轉(zhuǎn)移至cove-n-gly板上。

通過(guò)dna印跡分析篩選包含用來(lái)引入ap025基因的phuda1694的黑曲霉菌株m1405-1701-p2和1685-1701-11-p1的可能的轉(zhuǎn)化體。將每個(gè)孢子純化的轉(zhuǎn)化體在3mlypg培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，并且在30℃下以200rpm搖動(dòng)孵育2天。使用襯有的漏斗來(lái)收集生物質(zhì)。遵循制造商的說(shuō)明書(shū)，將研磨的菌絲體經(jīng)受使用土壤用fastdnaspin試劑盒(mp生物醫(yī)療)的基因組dna制備。

進(jìn)行dna印跡分析來(lái)確認(rèn)四個(gè)預(yù)指定的基因座(amya、amyb、asaa、paya)處的ap025基因的引入。用avrii和hindiii消化來(lái)自每個(gè)轉(zhuǎn)化體的五μg的基因組dna。基因組dna消化反應(yīng)是由5μg基因組dna、0.5μlhindiii、0.5μlavrii、2μl10xne緩沖液4組成，并且水補(bǔ)足至20μl。在37℃下，將基因組dna消化孵育大約16小時(shí)。遵循制造商的建議，將這些消化提交至使用tae緩沖液的0.5％瓊脂糖凝膠電泳，并且使用印跡至hybondn+(ge醫(yī)療集團(tuán)生命科學(xué)部(gehealthcarelifesciences)，曼徹斯特，新罕布什爾州，美國(guó))持續(xù)大約1小時(shí)。將該膜與500bp地高辛標(biāo)記的ap025探針雜交，其中使用如下所示的引物ap025-3(正義)和ap025-4(反義)，通過(guò)pcr，通過(guò)摻入地高辛-11-dutp合成該探針。

正向引物(ap025-3)：5’aggatcagttcctgctccgg(seqidno:23)

反向引物(ap025-4)：5'ggtatatggcattcgcatag(seqidno:24)

該擴(kuò)增反應(yīng)(100μl)是由以下項(xiàng)組成的：200μmpcrdig標(biāo)記的混合物(vial2)(羅氏應(yīng)用科學(xué)公司(rocheappliedscience)，帕洛阿爾托(paloalto)，加利福尼亞州，美國(guó))、0.5μm引物、高保真酶混合物(vial1)(羅氏應(yīng)用科學(xué)公司(rocheappliedscience)，帕洛阿爾托(paloalto)，加利福尼亞州，美國(guó))、以及作為模板的1μl(100pg/μl)的phuda1555，最終體積為100μl。將該擴(kuò)增反應(yīng)在c1000touch^tm熱循環(huán)儀中孵育，編程為：1個(gè)循環(huán)，在94℃下持續(xù)2分鐘；30個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)在94℃下持續(xù)30秒，55℃下持續(xù)30秒，以及在72℃下持續(xù)30秒；并且保持4℃。通過(guò)使用tae緩沖液的0.8％瓊脂糖凝膠電泳，將pcr產(chǎn)物進(jìn)行分離，其中將0.5kb片段從該凝膠切離，并且使用凝膠提取試劑盒進(jìn)行提取。將變性的探針直接添加至digeasyhyb緩沖液中并且在42℃下進(jìn)行過(guò)夜雜交。在雜交后洗滌(在2xssc中、室溫、5分鐘洗滌兩次；并且在0.1xssc中、68℃洗滌兩次，各15min)，遵循制造商的方案，使用dig檢測(cè)系統(tǒng)和cpd-star(羅氏公司)進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測(cè)。dig-標(biāo)記的dna分子量標(biāo)記ii(羅氏公司)被用于標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)記。

選擇分別從m1405-1701和1685-1701-11產(chǎn)生的，各自具有在四個(gè)基因座處(在6.0kb、6.3kb、7.3kb、9.4kb的大小的四個(gè)雜交帶)正確整合的兩種菌株(1701-1694-1和1685-1701-1694-18)，用于隨后的實(shí)驗(yàn)。參見(jiàn)圖1。

實(shí)例8：在搖瓶培養(yǎng)中的ap025蛋白酶表達(dá)評(píng)價(jià)

在30℃下，將黑曲霉菌株c3105-1657-8、1685-1657-16、1701-1694-1、和1685-1701-1694-18在cove-n-gly板上培養(yǎng)約一周。使用無(wú)菌移液管將來(lái)自每個(gè)板的一塊小塞子打洞，將其各自接種到在500ml燒瓶中的100ml的mss培養(yǎng)基中。將這些燒瓶在30℃下以200rpm孵育3天。然后，將10ml的培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至在500ml燒瓶中的100ml的mu1glu培養(yǎng)基中。將這些燒瓶在30℃下以200rpm孵育6天。將每個(gè)培養(yǎng)物在10ml試管中以5,000rpm離心10分鐘，并且回收培養(yǎng)物上清液，用于確定蛋白酶生產(chǎn)力。使用quickstart^tm布拉德福德(bradford)蛋白測(cè)定試劑盒(伯樂(lè)公司(bio-radinc.))進(jìn)行該蛋白酶生產(chǎn)力測(cè)定。將培養(yǎng)物上清液在蒸餾水中適當(dāng)稀釋。使用若干步驟在蒸餾水中稀釋牛血清白蛋白(wako目錄號(hào)519-83921)，起始于0.5mg/ml濃度并且結(jié)束于0.1mg/ml濃度。將包括標(biāo)準(zhǔn)品的每個(gè)稀釋的五μl轉(zhuǎn)移至96孔平底板中。將250μl1x的染料試劑溶液添加至每個(gè)孔中，然后在室溫下孵育5分鐘。在595nm下測(cè)量反應(yīng)的終點(diǎn)。通過(guò)從產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)曲線外推，并且與設(shè)置在100％的黑曲霉菌株c3105-1685-8相比來(lái)確定全部蛋白生產(chǎn)力。

agsa和agse雙基因破壞的菌株相比參照菌株黑曲霉菌株c3105-1657-8給出23％更高的ap025生產(chǎn)力，盡管單個(gè)ags或agse基因破壞的菌株與在搖瓶中的親本參照菌株黑曲霉菌株c3105-1657-8相比示出可比較的或略微更低的蛋白酶ap025生產(chǎn)力(表1)。

表1：在搖瓶培養(yǎng)物中的ap025蛋白酶生產(chǎn)力。

序列表

<110>諾維信公司（novozymesa/s）

<120>絲狀真菌雙重突變體宿主細(xì)胞

<130>nz12887-wo-pct

<160>24

<170>patentin版本3.5

<210>1

<211>7368

<212>dna

<213>黑曲霉

<400>1

atgttcggcacgacggttcagcgctgcgtggtgctcattctggggatactcagcgtcacg60

accgtgggctggccctacgatgagtcgctcgttgattacaacctgaacgagaacaagacc120

gcagagggaccgataaactattggggagaatggccagatcacacctatcatccgtcacca180

gacaactggcgcttccccatctataccatcttcctggatcgcatcgccaacggagatccc240

gctaatgacgatattaacggcaccacctacgagcatgtactcgattcgaatcagatgcgc300

catggcggtgacctagtcggcttgattgacacgctcgattacatcagaggcatgggcttc360

aaggtgagtctattccattgatatcagttcccggtccatccttgactgactgactgatca420

ttctagggaatctacttcgctggtacgggcttgatgaatcttccctggggctacgatggt480

tactccccggtggataccaccctcctcgacaagcaccatggcaccctgtccgactggagg540

cggaccatcaaggagatccacgaccgggatatgtatgtgatcatggataatacattagca600

acgtgagtatgcaccgagtattctagacgaccatgccactaacaatctccccgtgcagtt660

tgagtaacctgatcggtttcaagggccacttgaacgattcggctgatttcaatgcgaaag720

agtacgaggtggagtacgtcaccgagagaacgtacgccgatttccagttcagcaatgact780

acaatgacacctgcaactacccgaaattctggaacgagacgggatacccgttgacgtccg840

gtggcgtgcaagacctgaagggttgctacaacagtgatttcgatcagtatggcgaactcg900

aggcgtttggtaatttccccgactggaagcgacagctcacgaaattcgcttcggtgcaag960

atcgtctgcgagaatggcacaagccggttcgcgatgtcatcacccggcattcctgcattg1020

tgatcgccagtttggacattgatggcttccggtttgataaggccgtccaggccactctgg1080

atccgctgggtgacatgctagcggtctaccgtgaatgtgccaagcaatatggcaagaaga1140

acttcttcctgccgggagagatcacttcgggaaacacctttggtagtctctatcttggcc1200

ggggtcgtcagccaaaccagacgcccgattcggcagacgctggcgcgaagttgacgaatg1260

cttcgtcggattcctacttcctccgcgatgatggcctgcaggcgttggacgctgcagcct1320

ttcactacaccatctatcgttcgatgacccgtttcctgggaatggacgggaacctggtgg1380

ccggctttgacctgcccactgatttcatcgaagcctggaatggcatgctcgtcactaacg1440

acttcatcaatgccttcacgggcgagttggatcccagacatatgtatggagtgtcgaacc1500

aggataactttcgctggcccgccatcaagaatggtacggagaaatacctgctgggtctat1560

acattgttacgctggagctgccgggaatccctttggttctctggggcgaggagcaggaga1620

tgtacgtgttcgatgcgactgcgtccaactatctgttcggtcggcaacccatgacttacc1680

agacggcgtggtggacgcatggctgcttctcgctaaacacctcgaaattctacgatttcc1740

ccaacgacaagggattgaatggttgcaacgatatcacagtgacttacgaccaacggaatc1800

cggcgcacccccttcgcaacatcatgaagcgcatgtttgagattcgggagcagtacccag1860

tggccaatgatggcttcaaccttgagaccatttcccagcttacccaggatatctatcttc1920

cgggttcatcgactaccccgacggtgactggtctctggtcagtgctgcgcagctactacc1980

ccggggttcagaaagaggcctcgagtagcaacgatactctttggcttgtatatcataatg2040

ccaataaaacggaaacctatggcaagaactgtactagcaaggactccgctcttctgtccc2100

cttacgagtcgggcacgaagttgaaaaacctcttctatccctacgatgaactcacgctgc2160

aggatggaccaagtgacgctagcaacggcaccgagtcctacgggtgcacgaccaacatga2220

aattgctgccatgggaattccgggcttacgtcaaggcgagcgacttcgttgaacctggcc2280

ctaccgtcaccgagtttgtccccggccacgatgctcgcctgctgtcttccgaggatactg2340

gggaaacactgaagatccagctgggctactccaaggccatggactgcagtgccatcacga2400

aagcagtctccctgaattcgaccaccgtcaagggcgtcaatgccacccttgacacctcta2460

gcgtgagctgcaccaacgtcaccgccaggacgagcagtaataactacatcggcgaggttc2520

ccactgtttggacctggtccgcgaacctgacaaacgtctatcacggaatccaccagctca2580

ccgtcaagaatgcctccacgacgtctggaacgcgcgtagatgccatcgaccgctttttat2640

tccgagtcggaacccacaccaacccgttaatatcgccactggccaactactctaccagcc2700

tcgtccatcagtcggataacggcagctactatgttcagcatgatgcggccggcgctgacc2760

agttccgctacacgaccgactttggcctgaactggtccaactggacagactacactggtg2820

gtaacacgacgattgaatttccgacttggaccggcacagatgctcaaaagtgggagggca2880

ctcacattcgcgtccagtatttctcccgccttaccggcagcagtgattacatccaggagg2940

gtgattatgactgggaatccggtgtccctcgcagatttccccatctgtggtggaatggcc3000

cgtacaaccaatacggttatgatgccggtctggacagcaagatgcggtttgatactaagg3060

atcgccgctggaaatatgatttcgtttatgaatggccgtccgtcggacagatcagtgtct3120

ggggcactggcaaggacggtgttccggagacaacgaatgtttatggcgatgttgacaact3180

catcggttgtacaggtcttgcctccctcctacttgtcgtcgaacgtgattaatatcaccg3240

agctgccccccttcccgcaccttggctggaccatctctctcaatgatgccaacctccgct3300

atgaattgcttccggtcggatctggatgggcccagctggtactttacatccttctctggg3360

tcgtccctatcttgatggggctggcgggagttttcatcttcatccgcaccttctaccgtg3420

ttgagctgaataccgatggcaatgttgttaaggaggacaagctgccgctgttgttctggc3480

gcaggatgaagggccaatctggaggtgatggccagatggaccgggaagaatcagatgtcg3540

ccgccgtggcaggcgaaatggccattgcaggagcccccgagaaacgccgcacggtcttga3600

tcgccaccatggagtacgatattgcggattggcaggccaaggtcaagattggtggtctgg3660

gagtcatggcccagctcatgtcccaaaacctgggatatcagaatcttatctgggtggttc3720

cctgcgtgggagacatcgaatatcccgaggataccccgacagagccatacatcgtgaaga3780

tcctcgacaacccctatctcgtcaatgtgcagtatcacgttctcaacaatatcacctacg3840

tccttcttgacgctcctgtgttccgccagcagacaaaagccgagccgtatcctccccgca3900

tggatgacctggatagcgccatttactactccgcctggaaccaatgtatcgcagagacca3960

tcaagcgcttcccgtccatcgatctgtatcacatcaacgatttccacggatgcctggcac4020

cgttgtacctcctgcccacacgcacgatccccgtgtgtttgtctctccacaacgccgagt4080

tccagggtctctggcccctccggacccagcaagaaaagaaggaagtctgttcggtcttca4140

acctccccgtcgagacggctaccaaatattgtcaattcggtaatgtgttcaacttgcttc4200

acacaggagcgagttaccttcggttccatcagcgcgggtttggcgcggtcggtgtgtcaa4260

agaagtacggaaagcgttcctgggctcggtatcctattttctggagtttggacaagatcg4320

gtagtctgcccaaccctgacccaactgatacggcggccctggaggatactcctgacgaga4380

aagctctgactcggtcatatgaggaacggatcactgacaagctcgaggcccagaagtggg4440

ctggcctgaccgaggatcgcaacgccgacctcctggtgttcgtcggtcgctggtctaagc4500

agaagggtgtcgatctgattgcggatgtcatccccgccgttctgtctgaccggccgcagg4560

tgcaggtgatctgtgttggtcccatcatcgatctttacggaagactggctgccattaagc4620

tggagaagatcgctgccatgttccctggccgggtcttctcccgacctgagttcactgctt4680

tgcccccgtgtgtcttctctggcgctgacttcgctctgatcccgtctcgtgatgagccat4740

ttggattgattgccgttgagttcggtcggaagggtgcactgggaatcggatctcgcatcg4800

gaggtttgggtcagatgccaggctggtggtacaccgttgaatcagacgccactcgccatc4860

ttctacaccagctgaagactgcgatcaaatctgccctggattcgactcctgaaactcgag4920

cccagatgcgcgcaaactccgctaagcagcgattccccgttctcgagtggatccagaaac4980

tcgagactttgcagcggacatcgatcaagattcatcatgacaagaacaaggacaccgtga5040

ctggttcgatcccggagtctgagagcgtatgggacctgcaaaaccttcagagtgcgcgct5100

attccagtgtggcacttcctaatatggctctgtccagagcggacggcacggaaaccccgc5160

ctgaagccatgatccagcaggcccacgctcgccttcaagagatccaggcatccgagggaa5220

gcagtcgcgacagcagcctcaaccgcaaactgtcactgggtcgccggtccggccctggtc5280

agggcagaaagcgcttgacgaagaggcaagcgaccgcaagccaggcatccactgatcacg5340

gagaagatgagaacgataccgacgctgacgacgaccacaccaggccgcaggaggattaca5400

tttctcccgaggaggccatgcaggccgttaacaacactctaactccccatgctatcactg5460

gagacagtactccccgcgcctcctacttgtctagacccgtatccccgtaccccatctcac5520

agatctctactccagcgtgcccgacaccgccacccatgactcacttccggaccgtttcta5580

tgctgtcgttgccatccgttgttggggaccataaccgcctcagcagtctcggcggcgagg5640

agcagaaccagcccgtcttcgagttgcagaaggtggacccgactttcacggacagcttgg5700

gccacttcacccggcgcttcgagcagtcgcttgagaagttgaacaagaagaactccatca5760

cggactattgcattgaggtctatctgatgaagagtgagcgcaagttctacaattcataca5820

acgacgcccagcttaagaagcagcctaagaaccgttcgctcgcggttcccagctctgaga5880

gtgttgtgcaagaagggcccggtggctcagtcgttcgtcactcgtactccagtgaggatt5940

ctgaaatcaatggggaggatgagattgaccgctggctgatgcggttgggttacacgcgtc6000

cgatcgcagttcagcgattcatgagacgccgcttgggcaattggccagtgtattcactat6060

tcctgggtctgggtcagatcatcgccaccaactccgcacaaatcaccctgcttgtcggcc6120

aggtcggagagaccgctgtgaagctttatgtcatcgccgctatctactgcctgtcctcca6180

tcgcgtggtggttcctgtatcatcggttcccagccgtcatctccctcagtcttccctggt6240

tcatctactgcatggcattcatcgttatcggtgtttcacccttcggtctcacggctctcg6300

gtcgggcctgggctcagaatgttgcggctggcgtctacgccattgcgtcgtctagcggtt6360

ccttgttcttcgctctgaactttggagaccagggtgccgtccctgtcaaggactggatgt6420

tccgcgccagtatcattcaaggtatctcacagatctacacggtcgcgctctggttctgga6480

gctccaaggtcactgccgccgaagtgggaggtgtatctgtagcggccttgagctcctggc6540

gtctcacggccgtggtgatgcccattgctgccctgtgcttcgtgatcggagtcctgctgg6600

ccctgggattgcccaactactaccgtcaagctcccagccgtatcctgttcttctacaagt6660

ctctgttccgccgacgcatcatcctgtggttcttcttcatggtcatcgtccagaactggt6720

tccttgctgccgctttcggccgcaactggtccttcctctggtcgtccaaacacaccaagc6780

cctgggagattgtcctccttgtgttcggcttcttcgtcgtcctatgggtagtcattcttg6840

tcatattccgtgccctgtcgaaggaacacagctggatcttgccagttttcggtctgagtc6900

tgggtgctccccggtgggcacaaacctggtggggaacctccaacatcggctactatctcc6960

cttgggctggcagcttggtgtcggggtcgatcgcttcccgctgcctgtggctctggctgg7020

gactccttgacgagatccaacaagtcggattgggtatgattctgctgcagaccatgactc7080

gcgtgcatgtctgcttcgtcctgttggccgcgcaagcactgggatccatcgccaccatct7140

gcgcccgcggcttcgcgccgaacaagattggccctggggatatctctccggatgtgggca7200

cgtcggtggacaaggtcggtaacgcatggttctggatcgctctcttcttccagctcctgg7260

caaggtaagccttcccacactttcttttctcacgcgagctttatctaacgtttgaacagt7320

tggggcttcctgctcttctaccgccgcgaacagctcaaccgaccctaa7368

<210>2

<211>7194

<212>dna

<213>黑曲霉

<220>

<221>cds

<222>(1)..(7191)

<223>agsa編碼cdna

<400>2

atgttcggcacgacggttcagcgctgcgtggtgctcattctggggata48

metpheglythrthrvalglnargcysvalvalleuileleuglyile

151015

ctcagcgtcacgaccgtgggctggccctacgatgagtcgctcgttgat96

leuservalthrthrvalglytrpprotyraspgluserleuvalasp

202530

tacaacctgaacgagaacaagaccgcagagggaccgataaactattgg144

tyrasnleuasngluasnlysthralagluglyproileasntyrtrp

354045

ggagaatggccagatcacacctatcatccgtcaccagacaactggcgc192

glyglutrpproasphisthrtyrhisproserproaspasntrparg

505560

ttccccatctataccatcttcctggatcgcatcgccaacggagatccc240

pheproiletyrthrilepheleuaspargilealaasnglyasppro

65707580

gctaatgacgatattaacggcaccacctacgagcatgtactcgattcg288

alaasnaspaspileasnglythrthrtyrgluhisvalleuaspser

859095

aatcagatgcgccatggcggtgacctagtcggcttgattgacacgctc336

asnglnmetarghisglyglyaspleuvalglyleuileaspthrleu

100105110

gattacatcagaggcatgggcttcaagggaatctacttcgctggtacg384

asptyrileargglymetglyphelysglyiletyrphealaglythr

115120125

ggcttgatgaatcttccctggggctacgatggttactccccggtggat432

glyleumetasnleuprotrpglytyraspglytyrserprovalasp

130135140

accaccctcctcgacaagcaccatggcaccctgtccgactggaggcgg480

thrthrleuleuasplyshishisglythrleuserasptrpargarg

145150155160

accatcaaggagatccacgaccgggatatgtatgtgatcatggataat528

thrilelysgluilehisaspargaspmettyrvalilemetaspasn

165170175

acattagcaactttgagtaacctgatcggtttcaagggccacttgaac576

thrleualathrleuserasnleuileglyphelysglyhisleuasn

180185190

gattcggctgatttcaatgcgaaagagtacgaggtggagtacgtcacc624

aspseralaasppheasnalalysglutyrgluvalglutyrvalthr

195200205

gagagaacgtacgccgatttccagttcagcaatgactacaatgacacc672

gluargthrtyralaasppheglnpheserasnasptyrasnaspthr

210215220

tgcaactacccgaaattctggaacgagacgggatacccgttgacgtcc720

cysasntyrprolysphetrpasngluthrglytyrproleuthrser

225230235240

ggtggcgtgcaagacctgaagggttgctacaacagtgatttcgatcag768

glyglyvalglnaspleulysglycystyrasnserasppheaspgln

245250255

tatggcgaactcgaggcgtttggtaatttccccgactggaagcgacag816

tyrglygluleuglualapheglyasnpheproasptrplysarggln

260265270

ctcacgaaattcgcttcggtgcaagatcgtctgcgagaatggcacaag864

leuthrlysphealaservalglnaspargleuargglutrphislys

275280285

ccggttcgcgatgtcatcacccggcattcctgcattgtgatcgccagt912

provalargaspvalilethrarghissercysilevalilealaser

290295300

ttggacattgatggcttccggtttgataaggccgtccaggccactctg960

leuaspileaspglypheargpheasplysalavalglnalathrleu

305310315320

gatccgctgggtgacatgctagcggtctaccgtgaatgtgccaagcaa1008

aspproleuglyaspmetleualavaltyrargglucysalalysgln

325330335

tatggcaagaagaacttcttcctgccgggagagatcacttcgggaaac1056

tyrglylyslysasnphepheleuproglygluilethrserglyasn

340345350

acctttggtagtctctatcttggccggggtcgtcagccaaaccagacg1104

thrpheglyserleutyrleuglyargglyargglnproasnglnthr

355360365

cccgattcggcagacgctggcgcgaagttgacgaatgcttcgtcggat1152

proaspseralaaspalaglyalalysleuthrasnalaserserasp

370375380

tcctacttcctccgcgatgatggcctgcaggcgttggacgctgcagcc1200

sertyrpheleuargaspaspglyleuglnalaleuaspalaalaala

385390395400

tttcactacaccatctatcgttcgatgacccgtttcctgggaatggac1248

phehistyrthriletyrargsermetthrargpheleuglymetasp

405410415

gggaacctggtggccggctttgacctgcccactgatttcatcgaagcc1296

glyasnleuvalalaglypheaspleuprothrasppheilegluala

420425430

tggaatggcatgctcgtcactaacgacttcatcaatgccttcacgggc1344

trpasnglymetleuvalthrasnasppheileasnalaphethrgly

435440445

gagttggatcccagacatatgtatggagtgtcgaaccaggataacttt1392

gluleuaspproarghismettyrglyvalserasnglnaspasnphe

450455460

cgctggcccgccatcaagaatggtacggagaaatacctgctgggtcta1440

argtrpproalailelysasnglythrglulystyrleuleuglyleu

465470475480

tacattgttacgctggagctgccgggaatccctttggttctctggggc1488

tyrilevalthrleugluleuproglyileproleuvalleutrpgly

485490495

gaggagcaggagatgtacgtgttcgatgcgactgcgtccaactatctg1536

glugluglnglumettyrvalpheaspalathralaserasntyrleu

500505510

ttcggtcggcaacccatgacttaccagacggcgtggtggacgcatggc1584

pheglyargglnprometthrtyrglnthralatrptrpthrhisgly

515520525

tgcttctcgctaaacacctcgaaattctacgatttccccaacgacaag1632

cyspheserleuasnthrserlysphetyrasppheproasnasplys

530535540

ggattgaatggttgcaacgatatcacagtgacttacgaccaacggaat1680

glyleuasnglycysasnaspilethrvalthrtyraspglnargasn

545550555560

ccggcgcacccccttcgcaacatcatgaagcgcatgtttgagattcgg1728

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<213>黑曲霉

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203020352040

tcgatcctttggtggcttgtgttccgttacttcaaatcggtggtg6174

serileleutrptrpleuvalpheargtyrphelysservalval

204520502055

tgcctctcggctccctggttcttctatggccttgccttccttctg6219

cysleuseralaprotrpphephetyrglyleualapheleuleu

206020652070

atcggctccgctcactttgaacccaattcattcaaccggggttgg6264

ileglyseralahisphegluproasnserpheasnargglytrp

207520802085

atccagaacatcggaagtggatgttacgccgctgcctcgtctagc6309

ileglnasnileglyserglycystyralaalaalaserserser

209020952100

ggttccatcttcttcgccttgaactttggtgacgaaggtggtgcg6354

glyserilephephealaleuasnpheglyaspgluglyglyala

210521102115

ccggtcgaaacctggatcttccgggcttgtctcattcagggtatc6399

provalgluthrtrpilepheargalacysleuileglnglyile

212021252130

cagtcggcttatatcatcggactgtggtattggggttccactctg6444

glnseralatyrileileglyleutrptyrtrpglyserthrleu

213521402145

accaaggcatccagccagggtctgttgacctcgacgaacaacatc6489

thrlysalaserserglnglyleuleuthrserthrasnasnile

215021552160

gccaatagctggaagatgactgccatctgttacccgattgcaatc6534

alaasnsertrplysmetthralailecystyrproilealaile

216521702175

ttcctctgggctgttggattgctgcttctctttggacttcctaac6579

pheleutrpalavalglyleuleuleuleupheglyleuproasn

218021852190

tactatcgccaaaccccgggcaaagtggcctccttttacaagtcc6624

tyrtyrargglnthrproglylysvalalaserphetyrlysser

219522002205

gtattccgccgcaagatcgtcctctggaacttcgttgccgtcatc6669

valpheargarglysilevalleutrpasnphevalalavalile

221022152220

ctgcaaaacttcttcctcagcgcaccgtacggccgcaactggggc6714

leuglnasnphepheleuseralaprotyrglyargasntrpgly

222522302235

ttcctttggtcttccaatcacgccaaggcctggcaaatcgttatt6759

pheleutrpserserasnhisalalysalatrpglnilevalile

224022452250

ctctgtatcgtcttctacgggttcgtctgggcgggcttcctgttc6804

leucysilevalphetyrglyphevaltrpalaglypheleuphe

225522602265

gtcgtcagccgctatttcaagtcccacagctggttcctgcccgtg6849

valvalserargtyrphelysserhissertrppheleuproval

227022752280

tttgcgtgcggacttggagcacctcgcttcattcaaatctggtgg6894

phealacysglyleuglyalaproargpheileglniletrptrp

228522902295

ggtgtctcgggcatcggttacttccttccctgggtctccggaggc6939

glyvalserglyileglytyrpheleuprotrpvalserglygly

230023052310

tatctcggcggagctttggcctcgaggagtctctggctctggctg6984

tyrleuglyglyalaleualaserargserleutrpleutrpleu

231523202325

ggcgtgttggattccatccagggtctcgggttcggtatcatcctc7029

glyvalleuaspserileglnglyleuglypheglyileileleu

233023352340

ctgcagaccctcacccgcatgcacatgctgttcaccctgatctgc7074

leuglnthrleuthrargmethismetleuphethrleuilecys

234523502355

tcgcaggtgcttggttccattgccaccatctgtgcgcgggcgttt7119

serglnvalleuglyserilealathrilecysalaargalaphe

236023652370

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alaproasnasnvalglyproglyprovalserproaspprothr

237523802385

tttggaggaagtgcagtggccaatgcgtggttctgggtggccctg7209

pheglyglyseralavalalaasnalatrpphetrpvalalaleu

239023952400

ttttgtcagctgttggtgtgtgctggcttcctcctcttcttccgg7254

phecysglnleuleuvalcysalaglypheleuleuphephearg

240524102415

aaagagcagctttccaaaccttga7278

lysgluglnleuserlyspro

24202425

<210>6

<211>2425

<212>prt

<213>黑曲霉

<400>6

metlystrpalaileserglythrleuleualacysphealathrthr

151015

alathralatrpprotyraspgluserleuvalasptyrasnpheasn

202530

glnasnglnseralathrasnproalaasptyrtrpglythrtrppro

354045

asnhisthrglyasptyrpheproserproaspasntrpargphepro

505560

valtyrthrleupheleuaspargphevalasnglyaspprothrasn

65707580

aspasnileasnglythrleuphegluhisaspleuargserasngln

859095

metarghisglyglyaspvalalaglyleuleuaspthrleuasptyr

100105110

leuglnglymetglyilelysglyleutyrleualaglythrileleu

115120125

metasnglnprotrpglyseraspglytyrseralaleuaspthrthr

130135140

leuleuaspglnhistyrglyasnleuglnthrtrpargasnalaile

145150155160

thrgluilehislysargglymettyrvalilepheaspasnthrile

165170175

alathrmetglyaspleuileglypheaspglytyrleuasnthrthr

180185190

thrpropheservallysgluhisglnthrvaltrplysthrasparg

195200205

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tyrproargphetrpphegluaspglytyrprovalglnalaserval

225230235240

thrglugluleuvalglycystyrasnserasppheaspglntyrgly

245250255

aspileglualapheglyvalpheproasptrpglnargglnleuala

260265270

lysphealaservalglnaspargleuargglutrpvalproserval

275280285

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290295300

ileaspglypheargtyrasplysalathrglnalathrvalaspala

305310315320

leuglyaspmetserasnalatyrargglucysalaargalavalgly

325330335

lysgluasnphepheilealaglygluilethrglyglyasnthrphe

340345350

glyseriletyrleuglyargglyargglnproasnglnpheproasp

355360365

seralaglualaalametlysleuthrasnthrseraspalaglntyr

370375380

pheleuarggluvalglyhisglualaileaspglyalaalaphehis

385390395400

tyrseriletyrargalaleuthrargpheleuglymetaspglyasn

405410415

leualaalaglytyraspvalprovalasptrpvalaspalatrpasn

420425430

leumetleuglnserasnaspleuvalasnalaasnthrglylysphe

435440445

aspproarghismettyrglyalathrasnglnaspvalpheargtrp

450455460

prothrvalglulysglyvalgluargglnleuleuglyleutyrile

465470475480

thrthrleuleuleuproglyileproleuleuleutrpglygluglu

485490495

glnalaphetyrvalleuaspalathralaserasntyriletyrgly

500505510

argglnalametserproalathralatrpargasphisglycysphe

515520525

serleugluserserglntyrtyrasntrpproilegluserglyarg

530535540

glnglycyshisaspprothrvalalatyrasphisargaspproser

545550555560

hisprovalargasnileilelyshismettyrglnmetargglugln

565570575

pheprovalleuasnaspglytyrthrileglnlysleuserasnhis

580585590

thrgluaspvaltyrtyrleuglyserasnglythralathrgluthr

595600605

glyleutrpserileleuargaspvalasnalaaspvalglnaspleu

610615620

glyseraspalalysasnglnprovaltrpleuvaltyrhisasnthr

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asnargthrileasptyrlyspheaspcysseraspasnaspthrala

645650655

leuilealapropheaspserglythrtrpvallysasnleuphehis

660665670

protyraspgluhisglnleuileaspserprothrlysleuglyleu

675680685

asnglyserthralatyrserglycysleualaasnmetthrmetser

690695700

alatyrglupheargalatyrvalprolysthrargphethrlyspro

705710715720

argprometilethrlysphethrproglyhisaspvalproilearg

725730735

serthrvalalaproasnalaaspgluasnvalgluvalgluiletyr

740745750

phesergluglumetaspcysaspservalthrlysserilethrleu

755760765

serserserthrgluileglylysalaproservalaspserglyser

770775780

valasncyslysservalproalathrasnthrsertrpthrglygln

785790795800

ileproglyvaltrpmettrpalaalaasnleuthrglyvaltyrasn

805810815

glyilehisargleuthrvalasnasnvalserthrgluserglyasn

820825830

alathrthrasnalavalasphispheleupheargileglyglnile

835840845

aspasnprometilepheserseralaasntyrserthrserleuleu

850855860

hislysgluserasnglythrleupheileglnhishisalaalagly

865870875880

alaasplystyrargtyrserthrasntrpglythrthrpheserasp

885890895

trpileasptyrargglyglyasnaspthrileglugluleuglutrp

900905910

serglythrlyslysglnsertrplysglyasnhisvalargvalglu

915920925

tyrtrpserargtrpthrglyserserasptyrvalglngluglyasp

930935940

alaglytrpasngluasnvalproargargpheprohisvalphephe

945950955960

asnglyprotyrasnglntyrglytyraspalaglyleuaspasnval

965970975

valargglnaspservalaspglyleutrplystyrhisphethrala

980985990

glutrpproalaglnalaglnleuasniletrpglymetasnproasp

99510001005

glygluproaspglnsertrpvalleuglyaspalaaspasnasp

101010151020

servalleuaspargmetproproserserleuseralathrleu

102510301035

ileasnilethrgluhisproproserprotyrilesertrpasn

104010451050

ilepheileaspaspglythrmetargpheglnleupheproval

105510601065

glyhisglnasnthrglnilealamettyrvalleuphetrpile

107010751080

ileprovalilethrglyalaalaglyvaltrpalaphemetlys

108510901095

serphetyrlysvallyspheasnglnvalglyvalserglulys

110011051110

hisglnmetileproleualaleuargarglysphelysargasn

111511201125

argasnargglyglyaspglugluasnserasnproleumetarg

113011351140

leualaasnlysserglypheleuglnthraspthralailegly

114511501155

glyalaalaserglylysargargmetvalleuilealathrmet

116011651170

glutyraspilegluasptrpalailelysilelysileglygly

117511801185

leuglyvalmetalaglnleumetglylysthrleuglyhisgln

119011951200

aspleuiletrpvalvalprocysvalglyglyvalasptyrpro

120512101215

valasplysproalaglupromethisvalthrileleuglyasn

122012251230

sertyrgluvalglnvalglntyrhisvalleuasnasnilethr

123512401245

tyrvalleuleuaspalaprovalpheargglnglnserlysser

125012551260

gluprotyrproalaargmetaspaspleuasnseralailetyr

126512701275

tyrseralatrpasnglncysilealaglualacyslysargphe

128012851290

proileaspleutyrhisileasnasptyrhisglyserleuala

129513001305

proleutyrleuleuproaspthrvalproalacysleuserleu

131013151320

hisasnalaglupheglnglyleutrpprometargthrglnlys

132513301335

glulysglugluvalcysservalpheasnleuaspilegluthr

134013451350

valarghistyrvalglnpheglygluvalpheasnleuleuhis

135513601365

serglyalasertyrleuargvalhisglnglnglypheglyala

137013751380

valglyvalserlyslystyrglylysargsertyralaargtyr

138513901395

proilephetrpglyleuarglysvalglyasnleuproasnpro

140014051410

aspproseraspvalglyglutrpserlysgluglnalaserala

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metglyaspasnvalservalaspprothrtyrglualaglyarg

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glyaspleulysargglnalaglnglutrpalaglyleuglugln

144514501455

asnproaspalaaspleuleuvalphevalglyargtrpsermet

146014651470

glnlysglyvalaspleuilealaaspvalmetproalavalleu

147514801485

glualaargproasnvalglnleuilecysvalglyprovalile

149014951500

aspleutyrglylysphealaalaleulysleuasphismetmet

150515101515

lysvaltyrproglyargvalpheserargprogluphethrala

152015251530

leuproprotyrilepheserglyalagluphealaleuilepro

153515401545

serargaspglupropheglyleuvalalavalglupheglyarg

155015551560

lysglyalaleuglyileglyalaargvalglyglyleuglygln

156515701575

metproglytrptrptyrasnvalgluserthralathrserhis

158015851590

leuleuvalglnphelysleualaileaspalaalaleuserser

159516001605

lysthrgluthrargalametmetargalaargseralalysgln

161016151620

argpheprovalalaglntrpvalgluaspleugluileleugln

162516301635

thrthralaileglnvalhisasnlysgluleuvallyshisasn

164016451650

glyargprophethrproserglythrthrthrproglyglyile

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leuserglnproserserproleumetproproglymetglnthr

167016751680

proleualahisserargglusersertyrserasnleuasnarg

168516901695

leuserglutyrvalthraspprolysthrasntyrserargasp

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171517201725

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argglyargargglyargglnargaspserileprogluhisglu

174517501755

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alaglnvalglugluglyargargleuglnalavalglnglngln

179017951800

glyvalglymetprothrserproglyvalargargtyrsergln

180518101815

aspserleuhisproargglnleuproserserproglyproval

182018251830

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185018551860

valvalglythrlysthraspphelysleuglnlysvalasppro

186518701875

phephethraspserthrglyglutyrtyrlysalapheasplys

188018851890

argleuvalglyleuasnglyserasnsergluserglnleucys

189519001905

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191019151920

pheargaspalaargleuglyargleulysserproalaserser

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195519601965

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197019751980

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198519901995

trpprovaltyrserleupheleualaleuglyglnileileala

200020052010

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201520202025

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203020352040

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204520502055

cysleuseralaprotrpphephetyrglyleualapheleuleu

206020652070

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207520802085

ileglnasnileglyserglycystyralaalaalaserserser

209020952100

glyserilephephealaleuasnpheglyaspgluglyglyala

210521102115

provalgluthrtrpilepheargalacysleuileglnglyile

212021252130

glnseralatyrileileglyleutrptyrtrpglyserthrleu

213521402145

thrlysalaserserglnglyleuleuthrserthrasnasnile

215021552160

alaasnsertrplysmetthralailecystyrproilealaile

216521702175

pheleutrpalavalglyleuleuleuleupheglyleuproasn

218021852190

tyrtyrargglnthrproglylysvalalaserphetyrlysser

219522002205

valpheargarglysilevalleutrpasnphevalalavalile

221022152220

leuglnasnphepheleuseralaprotyrglyargasntrpgly

222522302235

pheleutrpserserasnhisalalysalatrpglnilevalile

224022452250

leucysilevalphetyrglyphevaltrpalaglypheleuphe

225522602265

valvalserargtyrphelysserhissertrppheleuproval

227022752280

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228522902295

glyvalserglyileglytyrpheleuprotrpvalserglygly

230023052310

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231523202325

glyvalleuaspserileglnglyleuglypheglyileileleu

233023352340

leuglnthrleuthrargmethismetleuphethrleuilecys

234523502355

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236023652370

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237523802385

pheglyglyseralavalalaasnalatrpphetrpvalalaleu

239023952400

phecysglnleuleuvalcysalaglypheleuleuphephearg

240524102415

lysgluglnleuserlyspro

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<210>7

<211>30

<212>dna

<213>人工序列

<220>

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<213>人工序列

<220>

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<211>30

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>引物agsa3(正義)

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<210>10

<211>30

<212>dna

<213>人工序列

<220>

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<210>11

<211>28

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>引物agse1(正義)

<400>11

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<210>12

<211>30

<212>dna

<213>人工序列

<220>

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<400>12

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<210>13

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<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>引物agse3(正義)

<400>13

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<210>14

<211>28

<212>dna

<213>人工序列

<220>

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<210>15

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

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<210>16

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

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<210>17

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>正向引物(agse5)

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<210>18

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>反向引物(agse6)

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aagtatttattgtattttgg20

<210>19

<211>33

<212>dna

<213>人工序列

<220>

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<210>20

<211>30

<212>dna

<213>人工序列

<220>

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ccacgtgttagcaaccaaggtatatggcat30

<210>21

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>正向引物(ap025-3)

<400>21

aggatcagttcctgctccgg20

<210>22

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>反向引物(ap025-4)

<400>22

ggtatatggcattcgcatag20

<210>23

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>正向引物(ap025-3)

<400>23

aggatcagttcctgctccgg20

<210>24

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>反向引物(ap025-4)

<400>24

ggtatatggcattcgcatag20