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用于濃縮β?葡聚糖的方法與流程

文檔序號:11236189閱讀:960來源:國知局
用于濃縮β?葡聚糖的方法與流程
本發(fā)明涉及一種用于濃縮β-葡聚糖的方法,其至少包括以下步驟:(a1)使具有濃度[c1]的β-葡聚糖水溶液與至少一種沉淀劑p1接觸以獲得在包含水和至少一種沉淀劑p1的溶劑混合物中沉淀的β-葡聚糖;(b1)使沉淀的β-葡聚糖從包含水和至少一種沉淀劑p1的溶劑混合物中分離以獲得具有濃度[c2]的沉淀的β-葡聚糖;和(c1)向(b1)的沉淀的β-葡聚糖施加力以獲得具有濃度[c3]的沉淀的β-葡聚糖。β-葡聚糖是已知的在幾種微生物中,特別是真菌和酵母中細(xì)胞壁的保存良好的組分(novak,endocrine,metabol&immunedisorders-drugtargets(2009),9:67-75)。在生物化學(xué)上,β-葡聚糖是經(jīng)由糖苷β(1-3)鍵連接的β-葡萄糖的非纖維素聚合物,其表現(xiàn)出與β(1-6)鍵合的葡萄糖分子的某種分支模式(novak,上述引文)。大量緊密相關(guān)的β-葡聚糖表現(xiàn)出類似的分支模式,如裂裥菌素、硬葡聚糖、pendulan、cinerian、昆布多糖、蘑菇多糖和平菇多糖(pleuran),所有這些都表現(xiàn)出β-d-(1-3)-吡喃葡萄糖基單元的線性主鏈,其中單個β-d-吡喃葡萄糖基單元(1-6)連接到具有約0.3的平均支化度的線性主鏈的β-d-吡喃葡萄糖基單元(novak,上述引文;ep-b1463540;stahmann,applenvironmicrobiol(1992),58:3347-3354;kim,biotechnolletters(2006),28:439-446;nikitina,foodtechnolbiotechnol(2007),45:230-237)。所述β-葡聚糖中的至少兩種(裂裥菌素和硬葡聚糖)甚至具有相同的結(jié)構(gòu),并且僅在其分子質(zhì)量,即其鏈長度上略微不同(survase,foodtechnolbiotechnol(2007),107-118)。β-葡聚糖可以特別用作增強采油領(lǐng)域,特別是在三次增強采油領(lǐng)域(eor;也稱為三次采油、tor或改進(jìn)采油ior)中的增稠劑(survase,上述引文)。適用于三次eor的增稠聚合物必須滿足許多具體要求。除了足夠的粘度之外,聚合物還必須非常熱穩(wěn)定,并且即使在高鹽濃度下也保持其增稠效果。用于聚合物驅(qū)替的一類重要的天然來源聚合物包括從葡萄糖獲得的支化均聚多糖,例如如上所述的β-葡聚糖。這種β-葡聚糖的水溶液具有有利的物理化學(xué)性能,使得它們特別適合用于聚合物驅(qū)替。用于制備β-葡聚糖的許多方法包括能夠合成這種生物聚合物的微生物的培養(yǎng)和發(fā)酵。例如ep271907a2、ep504673a1和de4012238a1公開了制備方法,即通過利用攪拌和曝氣分批發(fā)酵真菌裂褶菌(schizophyllumcommune)而進(jìn)行制備。培養(yǎng)介質(zhì)基本上包含葡萄糖、酵母提取物、磷酸二氫鉀、硫酸鎂和水。ep271907a2描述了一種用于分離多糖的方法,其中首先使培養(yǎng)懸浮液離心,并用異丙醇將多糖從上清液中沉淀。第二種方法包括壓力過濾,隨后使獲得的溶液超濾,而沒有公開該方法的細(xì)節(jié)?!皍dorau,“biosynthese,produktionundeigenschaftenvonpilz-glucanen”,habilitationsschrift,technicaluniversityofbrunswick,1997,第70-95頁”和“udorau,biopolymers,編輯a.steinbüchel,第6卷,第63-79頁,wiley-vchpublishers,newyork,2002”描述了通過連續(xù)或分批發(fā)酵而制備裂褶菌。“gitfachzeitunglabor12/92,第1233-1238頁”描述了利用細(xì)胞再循環(huán)而連續(xù)制備支化β-1,3-葡聚糖。wo03/016545a2公開了一種使用齊整小核菌(sclerotiumrolfsii)制備硬葡聚糖的連續(xù)方法。此外,由于經(jīng)濟(jì)原因,β-葡聚糖水溶液的濃度應(yīng)盡可能高,從而將葡聚糖水溶液從生產(chǎn)地點運送到使用地點的努力最小化。為此,通常使β-葡聚糖溶液在運輸之前通過干燥、凍干和/或沉淀而濃縮,以減少其重量。然而,具有低殘留水分的濃縮β-葡聚糖溶液幾乎不能再溶解在水中,并且使粘度(其對于在eor中的溶液的使用是重要的)顯著降低(rau,methodsinbiotechnology(1999),10:43-55,doi:10.1007/978-1-59259-261-6_4;kumar,amjfoodtechnol(2011),6:781-789)。在ep0515216a2中還公開了純化β-1,3-葡聚糖的方法,其包括使微生物產(chǎn)生的1,3-β-葡聚糖的熱堿溶液與水和有機溶劑的混合物接觸,使β-葡聚糖以純的形式沉淀。de60102806t2公開了一種固體形式的干生物聚合物,其包含具有非常明確定義的平均直徑的顆粒。根據(jù)該文獻(xiàn),非常明確定義的顆粒尺寸產(chǎn)生可有利地分散在水中的生物聚合物。au2001235690b2公開了具有特定顆粒直徑的生物聚合物顆粒,例如作為增稠劑或粘度劑、乳化劑和/或穩(wěn)定劑在工業(yè)、食品、化妝品和藥物配制劑中的用途。wo2009/062561a1公開了一種用于制備純化β-(1,3)-d-葡聚糖的方法。us2012/270033a1描述了一種通過在片狀材料的表面上施加包含裂裥菌素和至少一種溶劑的組合物而涂覆片狀含纖維素材料的方法。us4,950,749描述了通過向包含加溶葡聚糖的溶液中加入二價陽離子,然后將該溶液調(diào)節(jié)至堿性ph以導(dǎo)致葡聚糖沉淀而回收非離子葡聚糖的方法。因此,本發(fā)明的目的是提供一種用于獲得高濃縮形式的β-葡聚糖的經(jīng)濟(jì)方法,所述β-葡聚糖可以再溶解在水中以獲得包含β-葡聚糖的水溶液。因此,本發(fā)明在一方面涉及一種濃縮β-葡聚糖的方法,其至少包括以下步驟:(a1)使具有每升水溶液至少2gβ-葡聚糖的濃度[c1]的β-葡聚糖水溶液與至少一種沉淀劑p1接觸,以獲得在包含水和至少一種沉淀劑p1的溶劑混合物中沉淀的β-葡聚糖;(b1)使沉淀的β-葡聚糖從在步驟(a1)中獲得的包含水和至少一種沉淀劑p1的溶劑混合物中分離,以獲得具有濃度[c2]的沉淀的β-葡聚糖;(c1)向步驟(b1)中獲得的沉淀的β-葡聚糖施加力,以獲得具有每升包含β-葡聚糖、水和至少一種沉淀劑p1的沉淀物50-800gβ-葡聚糖的濃度[c3]的沉淀的β-葡聚糖,其中濃度順序為[c1]<[c2]<[c3]。因此,本發(fā)明在一方面涉及一種用于濃縮β-葡聚糖的方法,其至少包括以下步驟:(a1)使具有每升水溶液至少2gβ-葡聚糖的濃度[c1]的β-葡聚糖水溶液與至少一種沉淀劑p1在0-80℃的溫度下,更優(yōu)選在10-70℃的溫度下,甚至更優(yōu)選在10-50℃的溫度下,最優(yōu)選在10-40℃的溫度下接觸,以獲得在包含水和至少一種沉淀劑p1的溶劑混合物中的沉淀的β-葡聚糖;(b1)使沉淀的β-葡聚糖從步驟(a1)中獲得的包含水和至少一種沉淀劑p1的溶劑混合物中分離,以獲得具有濃度[c2]的沉淀的β-葡聚糖;(c1)向步驟(b1)中獲得的沉淀的β-葡聚糖施加力,以獲得具有每升包含β-葡聚糖、水和至少一種沉淀劑p1的沉淀物50-800gβ-葡聚糖的濃度[c3]的沉淀的β-葡聚糖,其中濃度順序為[c1]<[c2]<[c3]。令人驚訝的是,發(fā)現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明方法獲得的高度濃縮形式的β-葡聚糖可以再溶解在水中。通常,在本發(fā)明的上下文中,如果在將溶液在10.000xg下離心2分鐘一次、兩次或三次,優(yōu)選在10.000xg下2分鐘一次或兩次以后,不再能夠看到沉淀物或固體,則認(rèn)為β-葡聚糖水溶液包含再溶解的β-葡聚糖。附圖圖1壓縮滲透性單元的剖視圖示圖2篩分燒杯離心機的剖視圖示圖3篩分燒杯的剖視圖示在下文中將詳細(xì)解釋本發(fā)明方法的單個步驟以及關(guān)于本發(fā)明的細(xì)節(jié)。通常,在本發(fā)明的上下文中,如本文所述待濃縮的β-葡聚糖可以是任何β-葡聚糖。在一個實施方案中,β-葡聚糖是由β-d-(1-3)-吡喃葡糖基單元的線性主鏈組成的聚合物,所述β-d-(1-3)-吡喃葡糖基單元具有與線性主鏈的β-d-吡喃葡糖基單元連接的單個β-d吡喃葡糖基單元(1-6),其中平均支化度約為0.3。在本發(fā)明的上下文中,術(shù)語“平均支化度約0.3”可以意指平均10個β-d-(1-3)-吡喃葡糖基單元中約3個是與單個β-d-吡喃葡糖基單元(1-6)連接。就此而言,術(shù)語“約”可以意指平均支化度可以是0.25-0.35,優(yōu)選0.25-0.33,更優(yōu)選0.27-0.33,最優(yōu)選0.3-0.33。也可以是0.3或0.33。裂裥菌素、硬葡聚糖、裸藻淀粉、茯苓聚糖、纖維素、甲殼質(zhì)、凝膠多糖、昆布多糖、金藻昆布多糖、蘑菇多糖、地衣多糖、平菇多糖和酵母多糖都具有0.25-0.33的平均支化度(novak,上述引文;survase,上述引文);例如,硬葡聚糖和裂裥菌素具有0.3-0.33的平均支化度。β-葡聚糖的平均支化度可以通過本領(lǐng)域已知的方法,例如通過周期氧化分析、甲基化糖分析和nmr測定(brigand,industrialgums,academicpress,newyork/usa(1993),461-472)。在本發(fā)明的上下文中,如本文所描述的待濃縮的β-葡聚糖選自裂裥菌素、硬葡聚糖、裸藻淀粉、茯苓聚糖、纖維素、甲殼質(zhì)、凝膠多糖、昆布多糖、金藻昆布多糖、蘑菇多糖、地衣多糖、平菇多糖和酵母多糖。例如,β-葡聚糖可以是裂裥菌素或硬葡聚糖,特別是裂裥菌素。通常,在本發(fā)明的上下文中,如本文所述待濃縮的β-葡聚糖可以是以其衍生物之一的形式存在的任何β-葡聚糖。β-葡聚糖可以被衍生化,即與其天然存在的狀態(tài)相比,β-葡聚糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)被改變。其衍生物形式的β-葡聚糖優(yōu)選包含選自硫酸鹽、胺、乙酸鹽、磷酸鹽、膦酸鹽和羧甲基的化學(xué)結(jié)構(gòu)部分。以其羧甲基化衍生物形式存在的β-葡聚糖特別描述于us6,342,486中。us6,342,486的公開內(nèi)容通過引用并入本文。本發(fā)明涉及一種用于濃縮裂裥菌素的方法,其至少包括以下步驟:(a1)使具有每升水溶液至少2g裂裥菌素的濃度[c1]的裂裥菌素水溶液與至少一種沉淀劑p1接觸,以獲得在包含水和至少一種沉淀劑p1的溶劑混合物中沉淀的裂裥菌素;(b1)使沉淀的裂裥菌素從步驟(a1)中獲得的包含水和至少一種沉淀劑p1的溶劑混合物中分離,以獲得具有濃度[c2]的沉淀的裂裥菌素;(c1)向步驟(b1)中獲得的沉淀的裂裥菌素施加力,以獲得具有每升包含裂裥菌素、水和至少一種沉淀劑p1的沉淀物50-800g裂裥菌素的濃度[c3]的沉淀的裂裥菌素,其中濃度順序為[c1]<[c2]<[c3]。步驟(b1)和(c1)同時進(jìn)行,或者步驟(b1)和(c1)依次進(jìn)行,即在步驟(c1)之前進(jìn)行步驟(b1)。在步驟(b1)和(c1)同時進(jìn)行的情況下,不測量[c2]。然而,如果在達(dá)到最終濃度[c3]之前終止了本發(fā)明方法,則測量的濃度[c2]在本文所述的[c2]的范圍內(nèi)。步驟(a1):本發(fā)明方法的步驟(a1)包括使具有濃度[c1]的β-葡聚糖水溶液與至少一種沉淀劑p1接觸,以獲得在包含水和至少一種沉淀劑p1的溶劑混合物中沉淀的β-葡聚糖。在本發(fā)明方法的步驟(a1)中所使用的水溶液包含濃度為[c1]的β-葡聚糖。通常,濃度[c1]由本領(lǐng)域技術(shù)人員選擇,或者將由本發(fā)明所使用的β-葡聚糖來源預(yù)先確定。通常,在本發(fā)明方法的步驟(a1)中所使用的水溶液將從滲透物或發(fā)酵過程的肉湯中獲取。在本發(fā)明的一個實施方案中,將引入本發(fā)明方法的步驟(a1)中的β-葡聚糖水溶液預(yù)先過濾、離心或另外處理,以至少部分或完全地除去在產(chǎn)生β-葡聚糖的微生物發(fā)酵期間積累的任何細(xì)胞、細(xì)胞碎片和/或其他細(xì)胞組分。在本發(fā)明的另一實施方案中,引入步驟(a1)中的β-葡聚糖水溶液與發(fā)酵液相同。根據(jù)本發(fā)明的濃度[c1]為每升引入步驟(a1)中的水溶液至少2gβ-葡聚糖,優(yōu)選每升水溶液2-50gβ-葡聚糖,更優(yōu)選每升水溶液5-40gβ-葡聚糖,甚至更優(yōu)選每升水溶液10-40gβ-葡聚糖。根據(jù)本發(fā)明,存在于引入本發(fā)明方法的步驟(a1)的水溶液中的其他組分選自雜質(zhì)、制備β-葡聚糖的方法的副產(chǎn)物、鹽、酸、堿、表面活性劑及其混合物。本發(fā)明方法的步驟(a1)通常在可以處理步驟(a1)中涉及的水溶液和其他組分的任何合適溫度下進(jìn)行,優(yōu)選在0-80℃下,更優(yōu)選在10-70℃下,最優(yōu)選在10-50℃,特別是10-40℃下進(jìn)行。本發(fā)明方法的步驟(a1)優(yōu)選在大氣壓力下進(jìn)行。根據(jù)本發(fā)明方法的步驟(a1),加入至少一種沉淀劑p1。根據(jù)本發(fā)明,通常任何試劑可以用作沉淀劑p1,只要它引起存在于水溶液中的β-葡聚糖沉淀即可。優(yōu)選地,至少一種沉淀溶液p1選自低沸點液體、高沸點液體及其混合物。低沸點液體的實例是甲酸酯如甲酸甲酯,無環(huán)醚類如二甲氧基甲烷,環(huán)醚類如四氫呋喃、2-甲基-1,2-二氧雜環(huán)戊烷,羧酸酯類如乙酸乙酯,醇類如甲醇、乙醇、異丙醇或丙醇,酮類如丙酮或甲基乙基酮,或者它們中至少兩種的混合物。高沸點液體的實例是具有優(yōu)選10-200千道爾頓,更優(yōu)選15-120千道爾頓的分子量的聚乙二醇,具有5-100千道爾頓,更優(yōu)選10-30千道爾頓的分子量的聚丙二醇,或者它們中至少兩種的混合物。通常在步驟(a1)中將至少一種沉淀劑p1加入β-葡聚糖水溶液中,使得沉淀劑p1與水溶液的體積比在每種情況下基于所獲得的總混合物優(yōu)選為0.1:1-20:1,更優(yōu)選0.2:1-2:1,最優(yōu)選0.2:1-1.5:1。為了提供β-葡聚糖的有效沉淀,β-葡聚糖水溶液需要與至少一種沉淀劑p1緊密接觸,其可以通過使用攪拌容器、轉(zhuǎn)子-定子混合器、三通噴嘴或任何可比較的體系而實現(xiàn)。優(yōu)選地,使β-葡聚糖的水溶液與至少一種沉淀劑p1在三通噴嘴中接觸。噴嘴包含用于引入β-葡聚糖水溶液的第一入口和用于引入沉淀劑p1的第二入口。β-葡聚糖的沉淀在三通噴嘴的混合區(qū)域中進(jìn)行,由此獲得無定形固體,并且將沉淀劑p1、水和沉淀的β-葡聚糖的混合物通過出口排出。在使β-葡聚糖的水溶液與至少一種沉淀劑p1接觸后,獲得β-葡聚糖沉淀物以及包含含有水和至少一種沉淀劑p1的溶劑混合物和沉淀的β-葡聚糖的兩相混合物。然后將該混合物優(yōu)選轉(zhuǎn)移到本發(fā)明方法的步驟(b1)。步驟(b1):本發(fā)明方法的步驟(b1)包括使沉淀的β-葡聚糖從包含水和至少一種沉淀劑p1的溶劑混合物中分離,以獲得具有濃度[c2]的沉淀的β-葡聚糖。本發(fā)明方法的步驟(b1)通??梢酝ㄟ^本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法進(jìn)行,例如,特別是離心、沉降、浮選和過濾。優(yōu)選地,本發(fā)明方法的步驟(b1)使用壓濾機,例如膜式壓濾機如自動膜式壓濾機或壓縮滲透性單元,或者過濾離心機,例如反向過濾離心機。在本發(fā)明方法的步驟(b1)之后,獲得具有濃度[c2]的沉淀的β-葡聚糖。根據(jù)本發(fā)明的濃度[c2]優(yōu)選為每升包含β-葡聚糖、水和至少一種沉淀劑p1的沉淀物10-150gβ-葡聚糖,更優(yōu)選每升包含β-葡聚糖、水和至少一種沉淀劑p1的沉淀物30-120gβ-葡聚糖,最優(yōu)選每升包含β-葡聚糖、水和至少一種沉淀劑p1的沉淀物40-80gβ-葡聚糖。本發(fā)明方法的步驟(b1)通常在能夠使沉淀的β-葡聚糖與包含水和至少一種沉淀劑p1的溶劑分離的任何合適溫度下,優(yōu)選在0-80℃下,更優(yōu)選在10-70℃下,最優(yōu)選在10-50℃下,特別是在10-40℃下進(jìn)行。步驟(c1):本發(fā)明方法的步驟(c1)包括向(b1)的β-葡聚糖施加力以獲得具有濃度[c3]的沉淀的β-葡聚糖。進(jìn)行本發(fā)明方法的步驟(c1)以從沉淀的β-葡聚糖中除去其他水溶液,從而獲得具有更高濃度[c3]的沉淀的β-葡聚糖。通常,在本發(fā)明方法的步驟(c1)中,可優(yōu)選通過任何方法進(jìn)行,只要將3-25巴,更優(yōu)選4-15巴的壓力形式的力施加到從步驟(b1)獲得的沉淀的β-葡聚糖即可。優(yōu)選地,本發(fā)明方法的步驟(c1)使用壓濾機,例如膜式壓濾機如自動膜式壓濾機或壓縮滲透性單元,或者過濾離心機,例如反向過濾離心機。壓濾機可以包含用于利用泵將步驟(a1)中獲得的包含水、至少一種沉淀劑p1和沉淀的β-葡聚糖的溶劑混合物在壓力下供入其中濾板和濾布疊加以強制過濾水溶液的裝置中的單元。作為替換,將步驟(a1)中獲得的沉淀的β-葡聚糖通過使用三通噴嘴作為注射器直接供入裝置如壓濾機或者過濾離心機如反相過濾離心機中。在使用壓濾機進(jìn)行本發(fā)明方法的情況下,步驟(b1)和(c1)在壓濾機中依次進(jìn)行,優(yōu)選將3-25巴,更優(yōu)選4-15巴的壓力形式的力用于步驟(c1)。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中,使用如圖1所示的壓縮滲透性單元。如圖1所示的壓縮滲透性單元顯示出濾餅(1)、過濾介質(zhì)(2)、分配板(3)、環(huán)(4)、濾液排出(5)、蓋(6)、擠壓活塞(7)和負(fù)荷傳感器(8)。在本發(fā)明的另一實施方案中,本發(fā)明的步驟(c1)優(yōu)選使用過濾離心機如反相過濾離心機而進(jìn)行。反相過濾離心機可以由heinkelprocesstechnologygmbh,besigheim,德國獲得,尤其描述在“stülpzentrifugehf,001a/2003-2,de19529256a1、de4117323a1、de3729240a1、de69700957t2”。優(yōu)選用于進(jìn)行步驟(c1)的加速度形式的力為50-2000xg,更優(yōu)選60-1500xg,甚至更優(yōu)選70-1500xg。反相過濾離心機通常在無基層下操作。一般而言,然后將限定量的在步驟(a1)或(b1)中獲得的β-葡聚糖引入離心鼓中,將濾液離心,可任選將得到的具有濃度[c3]的β-葡聚糖干燥。例如,可以使具有濃度[c3]的沉淀的β-葡聚糖借助使溫暖氣體如氮氣或蒸汽通過而脫附和干燥。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中,將如圖2所示的篩分燒杯離心機用作反相過濾離心機。如圖2所示的篩分燒杯離心機顯示了用于填充的裝置(1)、頻閃儀(2)、用于旋轉(zhuǎn)的裝置(3)、濾液出口(4)和燒杯(5)。圖3中更詳細(xì)地顯示了燒杯的構(gòu)造。燒杯包括玻璃入口(5.1)、篩分燒杯殼體(5.2)、安裝槽(5.3)、螺帽(5.6)、墊圈環(huán)(5.7)、墊圈(5.8)、濾布(5.9)和穿孔底部(5.10)。也顯示了填充水平(5.4)。在將過濾離心機如反相過濾離心機用于本發(fā)明方法的情況下,步驟(b1)和(c1)同時或依次進(jìn)行。在步驟(b1)和(c1)在過濾離心機中依次進(jìn)行的情況下,逐漸增加呈加速形式的力,使得在第一步驟中,將水和至少一種沉淀劑部分地除去以達(dá)到濃度[c2],在第二步驟中,將沉淀的β-葡聚糖濃縮至所需濃度[c3]。在步驟(b1)和(c1)在過濾離心機中同時進(jìn)行的情況下,將呈加速形式的力調(diào)節(jié)到確保去除水和沉淀劑p1而同時濃縮沉淀的β-葡聚糖達(dá)到所需濃度[c3]的值。在這種情況下,不測量[c2]。然而,如果在達(dá)到最終濃度[c3]之前終止本發(fā)明方法,則將測量如本文所述在[c2]的范圍內(nèi)的濃度[c2]。本發(fā)明方法的步驟(c1)通常在所述力可以施加到沉淀的葡聚糖上的任何合適溫度下,優(yōu)選在0-80℃下,更優(yōu)選在10-70℃下,最優(yōu)選在10-50℃下,特別是在10-40℃下進(jìn)行。在本發(fā)明方法的步驟(c1)之后,獲得具有濃度[c3]的沉淀的β-葡聚糖。本發(fā)明的濃度[c3]為每升包含β-葡聚糖、水和至少一種沉淀劑p1的沉淀物50-800gβ-葡聚糖,優(yōu)選每升包含β-葡聚糖、水和至少一種沉淀劑p1的沉淀物50-600gβ-葡聚糖,更優(yōu)選每升包含β-葡聚糖、水和至少一種沉淀劑p1的沉淀物50-570gβ-葡聚糖。因此,利用本發(fā)明方法,可獲得濃度優(yōu)選為50-800g/l的沉淀的β-葡聚糖。該高濃度產(chǎn)生的優(yōu)點是促進(jìn)至施用地點的運輸,因為高度濃縮的β-葡聚糖可以在沒有大量水的情況下運輸。然后,在施用地點,高度濃縮的β-葡聚糖可以再溶解在水中以獲得即用溶液/分散體。優(yōu)選地,本發(fā)明涉及一種用于濃縮裂裥菌素的方法,其至少包括以下步驟:(a1)使具有每升水溶液至少2g裂裥菌素的濃度[c1]的裂裥菌素水溶液與至少一種沉淀劑p1接觸,以獲得在包含水和至少一種沉淀劑p1的溶劑混合物中沉淀的裂裥菌素;(b1)使步驟(a1)中獲得的沉淀的裂裥菌素由包含水和至少一種沉淀劑p1的溶劑混合物中分離,以獲得具有濃度[c2]的沉淀的裂裥菌素;(c1)向步驟(b1)中獲得的沉淀的裂裥菌素施加力,以獲得具有每升包含裂裥菌素、水和至少一種沉淀劑p1的沉淀物50-800g裂裥菌素的濃度[c3]的沉淀的裂裥菌素,其中濃度順序為[c1]<[c2]<[c3]。優(yōu)選地,本發(fā)明涉及一種用于濃縮裂裥菌素的方法,其至少包括以下步驟:(a1)使具有每升水溶液至少2g裂裥菌素的濃度[c1]的裂裥菌素水溶液與至少一種沉淀劑p1在0-80℃的溫度下,更優(yōu)選在10-70℃的溫度下,甚至更優(yōu)選在10-50℃的溫度下,最優(yōu)選在10-40℃的溫度下,在攪拌容器中,在轉(zhuǎn)子-定子混合器中或在三通噴嘴中接觸,以獲得在包含水和至少一種沉淀劑p1的溶劑混合物中沉淀的裂裥菌素;(b1)使沉淀的裂裥菌素與步驟(a1)中獲得的包含水和至少一種沉淀劑p1的溶劑混合物分離,以獲得具有濃度[c2]的沉淀的裂裥菌素;(c1)向步驟(b1)中獲得的沉淀的裂裥菌素施加力,以獲得具有每升包含裂裥菌素、水和至少一種沉淀劑p1的沉淀物50-800g裂裥菌素的濃度[c3]的沉淀的裂裥菌素,其中濃度順序為[c1]<[c2]<[c3]。更優(yōu)選地,本發(fā)明涉及一種用于濃縮裂裥菌素的方法,其至少包括以下步驟:(a1)使具有每升水溶液至少2g裂裥菌素的濃度[c1]的裂裥菌素水溶液與至少一種沉淀劑p1接觸,以獲得在包含水和至少一種沉淀劑p1的溶劑混合物中沉淀的裂裥菌素;(b1)使沉淀的裂裥菌素由步驟(a1)中獲得的包含水和至少一種沉淀劑p1的溶劑混合物中分離,以獲得具有濃度[c2]的沉淀的裂裥菌素;(c1)向步驟(b1)中獲得的沉淀的裂裥菌素施加力,以獲得每升包含裂裥菌素、水和至少一種沉淀劑p1的沉淀物50-800g裂裥菌素的濃度[c3]的沉淀的裂裥菌素,其中濃度順序為[c1]<[c2]<[c3],步驟(b1)和(c1)在壓濾機中依次進(jìn)行。更優(yōu)選地,本發(fā)明涉及一種用于濃縮裂裥菌素的方法,其至少包括以下步驟:(a1)使具有每升水溶液至少2g裂裥菌素的濃度[c1]的裂裥菌素水溶液與至少一種沉淀劑p1接觸,以獲得在包含水和至少一種沉淀劑p1的溶劑混合物中沉淀的裂裥菌素;(b1)使沉淀的裂裥菌素由步驟(a1)中獲得的包含水和至少一種沉淀劑p1的溶劑混合物中分離,以獲得具有濃度[c2]的沉淀的裂裥菌素;(c1)向步驟(b1)中獲得的沉淀的裂裥菌素施加力,以獲得具有每升包含裂裥菌素、水和至少一種沉淀劑p1的沉淀物50-800g裂裥菌素的濃度[c3]的沉淀的裂裥菌素,其中濃度順序為[c1]<[c2]<[c3],步驟(b1)和(c1)在過濾離心機如反相過濾離心機中同時進(jìn)行,或者在過濾離心機如反相過濾離心機中依次進(jìn)行。更優(yōu)選地,本發(fā)明涉及一種用于濃縮裂裥菌素的方法,其至少包括以下步驟:(a1)使具有每升水溶液至少2g裂裥菌素的濃度[c1]的裂裥菌素水溶液與至少一種沉淀劑p1接觸,以獲得在包含水和至少一種沉淀劑p1的溶劑混合物中沉淀的裂裥菌素;(b1)使沉淀的裂裥菌素由步驟(a1)中獲得的包含水和至少一種沉淀劑p1的溶劑混合物中分離,以獲得具有濃度[c2]的沉淀的裂裥菌素;(c1)向步驟(b1)中獲得的沉淀的裂裥菌素施加力,以獲得具有每升包含裂裥菌素、水和至少一種沉淀劑p1的沉淀物50-800g裂裥菌素的濃度[c3]的沉淀的裂裥菌素,其中濃度順序為[c1]<[c2]<[c3],步驟(b1)和(c1)在過濾離心機中同時進(jìn)行,或者在過濾離心機中依次進(jìn)行或者在壓濾機中依次進(jìn)行。甚至更優(yōu)選地,本發(fā)明涉及一種用于濃縮裂裥菌素的方法,其包括至少以下步驟:(a1)使具有每升水溶液至少2g裂裥菌素的濃度[c1]的裂裥菌素水溶液與至少一種沉淀劑p1在0-80℃的溫度下,更優(yōu)選在10-70℃的溫度下,甚至更優(yōu)選在10-50℃的溫度下,最優(yōu)選在10-40℃的溫度下,在攪拌容器中,在轉(zhuǎn)子-定子混合器中或在三通噴嘴中接觸,以獲得在包含水和至少一種沉淀劑p1的溶劑混合物中沉淀的裂裥菌素;(b1)使沉淀的裂裥菌素由步驟(a1)中獲得的包含水和至少一種沉淀劑p1的溶劑混合物中分離,以獲得具有濃度[c2]的沉淀的裂裥菌素;(c1)向步驟(b1)中獲得的沉淀的裂裥菌素施加力,以獲得具有每升包含裂裥菌素、水和至少一種沉淀劑p1的沉淀物50-800g裂裥菌素的濃度[c3]的沉淀的裂裥菌素,其中濃度順序為[c1]<[c2]<[c3],步驟(b1)和(c1)在過濾離心機中同時進(jìn)行,或者在過濾離心機中依次進(jìn)行或者在壓濾機中依次進(jìn)行。根據(jù)本發(fā)明方法的一個優(yōu)選實施方案,本發(fā)明涉及上述方法,其包括步驟(a1)、(b1)和(c1),并且還包括在步驟(b1)之后進(jìn)行的以下步驟(a2)和(b2):(a1)使具有每升水溶液至少2gβ-葡聚糖的濃度[c1]的β-葡聚糖水溶液與至少一種沉淀劑p1接觸,以獲得在包含水和至少一種沉淀劑p1的溶劑混合物中沉淀的β-葡聚糖;(b1)使沉淀的β-葡聚糖由步驟(a1)中獲得的包含水和至少一種沉淀劑p1的溶劑混合物中分離,以獲得沉淀的β-葡聚糖;(a2)使步驟(b1)中獲得的沉淀的β-葡聚糖與至少一種沉淀劑p2接觸,以獲得在包含水、至少一種沉淀劑p1和至少一種沉淀劑p2的溶劑混合物中沉淀的β-葡聚糖;(b2)使沉淀的β-葡聚糖由步驟(a2)的混合物中分離,以獲得具有濃度[c22]的沉淀的β-葡聚糖;(c1)向步驟(b2)中獲得的沉淀的β-葡聚糖施加力,以獲得具有每升包含β-葡聚糖、水、至少一種沉淀劑p1和至少一種沉淀劑p2的沉淀物50-800gβ-葡聚糖的濃度[c3]的β-葡聚糖,其中濃度順序為[c1]<[c22]<[c3]。以上已經(jīng)描述了本發(fā)明的該優(yōu)選實施方案的步驟(a1)、(b1)和(c1)。額外步驟(a2)和(b2)將在下面進(jìn)行說明。步驟(a2):本發(fā)明方法的步驟(a2)包括使步驟(b1)的具有濃度[c2]的沉淀的β-葡聚糖與至少一種沉淀劑p2接觸,以獲得包含沉淀的β-葡聚糖的混合物。根據(jù)本發(fā)明方法的一個優(yōu)選實施方案,步驟(b1)的沉淀的β-葡聚糖在引入本發(fā)明方法的步驟(a2)之前不以任何方式處理。本發(fā)明方法的步驟(a2)通常在可以處理步驟(b1)的沉淀的β-葡聚糖和步驟(a2)中包含的其他組分的任何合適溫度下,優(yōu)選在0-80℃的溫度下,更優(yōu)選在10-70℃的溫度下,甚至更優(yōu)選在10-50℃的溫度下,最優(yōu)選在10-40℃的溫度下進(jìn)行。本發(fā)明方法的步驟(a2)優(yōu)選在大氣壓力下進(jìn)行。根據(jù)本發(fā)明方法的步驟(a2),加入至少一種沉淀劑p2。根據(jù)本發(fā)明,通常任何試劑可以用作沉淀劑p2,只要它引起存在于包含水和至少一種沉淀劑p1的溶劑混合物中的β-葡聚糖沉淀。根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案,使在本發(fā)明方法的步驟(a2)中使用的至少一種沉淀劑p2與在本發(fā)明方法的步驟(a1)中使用的至少一種沉淀劑p1相同。因此,本發(fā)明優(yōu)選涉及本發(fā)明方法,其中沉淀劑p1和p2是相同的。根據(jù)本發(fā)明的又一實施方案,在本發(fā)明方法的步驟(a2)中使用的至少一種沉淀劑p2與在本發(fā)明方法的步驟(a1)中使用的至少一種沉淀劑p1不是相同的,而是不同的。因此,本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)選涉及本發(fā)明方法,其中沉淀劑p1和p2不是相同的,而是不同的。優(yōu)選地,至少一種沉淀溶液p2選自低沸點液體、高沸點液體及其混合物。低沸點液體的實例是甲酸酯類如甲酸甲酯,無環(huán)醚類如二甲氧基甲烷,環(huán)醚類如四氫呋喃、2-甲基-1,2-二氧雜環(huán)戊烷,羧酸酯類如乙酸乙酯,醇類如甲醇、乙醇、異丙醇或丙醇,酮類如丙酮或甲基乙基酮,或者它們中至少兩種的混合物。高沸點液體的實例是具有優(yōu)選10-200千道爾頓,更優(yōu)選15-120千道爾頓的分子量的聚乙二醇,具有5-100千道爾頓,更優(yōu)選10-30千道爾頓的分子量的聚丙二醇,或者它們中至少兩種的混合物。在步驟(a2)中通常將至少一種沉淀劑p2加入步驟(b1)中獲得的包含水和至少一種沉淀劑p1的沉淀的葡聚糖中,使得沉淀劑p2與在步驟(b1)中獲得的包含水和至少一種沉淀劑p1的沉淀的葡聚糖的體積比在每種情況下基于獲得的總混合物優(yōu)選為0.1:1-20:1,更優(yōu)選0.2:1-2:1,最優(yōu)選0.2:1-1.5:1。在使步驟(b1)中獲得的包含水和至少一種沉淀劑p1的沉淀的葡聚糖與至少一種沉淀劑p2接觸時,進(jìn)一步濃縮β-葡聚糖,并且獲得包含水、至少一種沉淀劑p1和至少一種沉淀劑p2以及沉淀的β-葡聚糖的兩相混合物。然后優(yōu)選將該混合物轉(zhuǎn)移到本發(fā)明方法的步驟(b2)。步驟(b2):步驟(b2)包括使沉淀的β-葡聚糖與步驟(a2)的混合物分離,以獲得具有濃度[c22]的β-葡聚糖。本發(fā)明方法的步驟(b2)通??梢酝ㄟ^本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法進(jìn)行,例如特別是離心、沉降和過濾。因此,本發(fā)明優(yōu)選涉及如上所述的方法,其中步驟(b2)通過離心、沉降和過濾而進(jìn)行。優(yōu)選地,本發(fā)明方法的步驟(b2)使用壓濾機,例如膜式壓濾機如自動膜式壓濾機或壓縮滲透性單元,或者過濾離心機如反相過濾離心機而進(jìn)行。在本發(fā)明方法的步驟(b2)之后,獲得具有濃度[c22]的沉淀的β-葡聚糖。通常,濃度[c22]高于如上所述的濃度[c2]。本發(fā)明方法的步驟(b2)通常在可以使沉淀的β-葡聚糖由溶劑混合物分離的任何合適溫度下,優(yōu)選在0-80℃下,更優(yōu)選在10-70℃下,最優(yōu)選在10-50℃下,特別是在10-40℃下進(jìn)行。本發(fā)明的濃度[c22]優(yōu)選為每升包含β-葡聚糖、水、至少一種沉淀劑p1和至少一種沉淀劑p2的沉淀物10-250gβ-葡聚糖,更優(yōu)選每升包含β-葡聚糖、水、至少一種沉淀劑p1和至少一種沉淀劑p2的沉淀物50-250gβ-葡聚糖,特別優(yōu)選每升包含β-葡聚糖、水、至少一種沉淀劑p1和至少一種沉淀劑p2的沉淀物60-180gβ-葡聚糖。根據(jù)該優(yōu)選實施方案,步驟(c2)利用步驟(b2)中獲得的沉淀的β-葡聚糖進(jìn)行,并且獲得具有所需的高β-葡聚糖濃度[c3]的沉淀β-葡聚糖。本發(fā)明方法的步驟(c2)通常在可以施加力到沉淀的葡聚糖上的任何合適溫度下,優(yōu)選在0-80℃下,更優(yōu)選在10-70℃下,最優(yōu)選在10-50℃下,特別是在10-40℃下進(jìn)行。利用包括步驟(a1)、(b1)和(c1)或進(jìn)一步包括步驟(a2)和(b2)的本發(fā)明方法,可以以顯著高的濃度[c3]獲得β-葡聚糖[c3],這有利于將該產(chǎn)品運送到施用地點。因此,在另一實施方案中,本發(fā)明涉及根據(jù)上述方法獲得的沉淀的β-葡聚糖。特別地,在另一實施方案中,本發(fā)明涉及一種具有每升包含β-葡聚糖、水和至少一種沉淀劑p1的沉淀物50-800gβ-葡聚糖,優(yōu)選每升包含β-葡聚糖、水和至少一種沉淀劑p1的沉淀物50-600gβ-葡聚糖,更優(yōu)選每升包含β-葡聚糖、水和至少一種沉淀劑p1的沉淀物80-250gβ-葡聚糖的濃度的β-葡聚糖,其根據(jù)上述方法獲得。因此,在另一實施方案中,本發(fā)明涉及根據(jù)上述方法獲得的裂裥菌素。特別地,在另一實施方案中,本發(fā)明涉及具有每升包含裂裥菌素、水和至少一種沉淀劑p1的沉淀物50-800g裂裥菌素,優(yōu)選每升包含裂裥菌素、水和至少一種沉淀劑p1的沉淀物50-600g裂裥菌素,更優(yōu)選每升包含裂裥菌素、水和至少一種沉淀劑p1的沉淀物80-250g裂裥菌素的濃度的裂裥菌素,其根據(jù)上述方法獲得。本發(fā)明所要求的β-葡聚糖如裂裥菌素可以在濃縮后進(jìn)一步改性。本發(fā)明所要求的β-葡聚糖如裂裥菌素可以通過氧化、酶轉(zhuǎn)化、酸水解、熱和/或酸糊精化或剪切而轉(zhuǎn)化。本發(fā)明所要求的β-葡聚糖如裂裥菌素也可以化學(xué)、酶促或物理改性。合適的裂裥菌素的化學(xué)衍生物包括酯類如乙酸酯以及半酯類如琥珀酸酯、辛烯基琥珀酸酯和十四碳烯基琥珀酸酯、磷酸酯衍生物,醚類如羥烷基醚和陽離子醚,或者其任何其他衍生物或組合。改性也可以是化學(xué)交聯(lián)。適用于本文的交聯(lián)劑包括磷酰氯、表氯醇、三偏磷酸鈉和己二酸/乙酸混合酸酐。根據(jù)本發(fā)明方法制備的β-葡聚糖可以再溶解在水中。在再溶解之前,本發(fā)明的沉淀的β-葡聚糖溶脹或浸漬的步驟可改進(jìn)再溶解的效果,更重要的是提高所得粘度。然而,沉淀的β-葡聚糖的溶脹或浸漬對于進(jìn)行再溶解而言是不必需的。根據(jù)本文描述和提供的方法,在濃縮后并且如果適用,在溶脹或浸漬之后,使沉淀的β-葡聚糖再溶解在水中。就此而言,水可以是高純度/超純水(根據(jù)歐洲藥典(pheur)或美國藥典(usp)也稱為“純凈水(aquapurificata)”或“純凈水(aquapurified)”))。就本文所述和提供的方法而言,用于再溶解的水的量可以是足以在沉淀之前達(dá)到沉淀的β-葡聚糖溶液體積的量。通常,就本發(fā)明而言,如果在10,000xg下使溶液離心2分鐘后不再能夠看到沉淀物或固體,則認(rèn)為β-葡聚糖溶液包含再溶解的β-葡聚糖。實施例:裂裥菌素由裂裥菌發(fā)酵且隨后通過錯流過濾分離生物質(zhì)而制備。通用方法β-葡聚糖含量的測定1.稱取少量包含β-葡聚糖、水和溶劑的壓濾餅2.用去離子水稀釋3.用手劇烈震蕩,以獲得裂裥菌素樣品4.使用ultraturrax簡單分散裂裥菌素樣品5.制備包含水、葡聚糖酶混合物和裂裥菌素樣品的分析樣品6.制備包含裂裥菌素樣品的空白樣品7.在40℃下溫育分析樣品2-24小時8.通過注射器過濾器過濾分析和空白樣品,并借助hplc分析葡萄糖含量9.由殘留葡萄糖和酶處理后的葡萄糖的差減去水解的水計算葡聚糖濃度沉淀步驟制備包含具有11-12g/l濃度的裂裥菌素的水溶液。裂裥菌素溶液借助泵從進(jìn)料罐運送至混合噴嘴,并在20-25℃的溫度下與溶劑混合。噴嘴具有0.7mm的溶劑入口直徑。裂裥菌素溶液的入口直徑為1.5mm。噴嘴的出口直徑為3mm。裂裥菌素作為無定形沉淀物沉淀。將懸浮液裝入合適的容器并通至固/液分離和分析。根據(jù)上述通用程序進(jìn)行以下實施例。實施例1a和1b使用純丙酮沉淀。丙酮質(zhì)量流速20kg/h。裂裥菌素溶液質(zhì)量流速20kg/h。實施例2使用丙酮/乙醇混合物沉淀。丙酮質(zhì)量流速18kg/h。乙醇質(zhì)量流速2kg/h。裂裥菌素質(zhì)量流速20kg/h。實施例3使用丙酮/乙醇混合物沉淀。丙酮質(zhì)量流速18kg/h。乙醇質(zhì)量流速2kg/h。裂裥菌素質(zhì)量流速20kg/h。實施例4使用丙酮沉淀。丙酮質(zhì)量流速40kg/h。裂裥菌素質(zhì)量流速4kg/h。實施例5使用丙酮沉淀。丙酮質(zhì)量流速40kg/h。裂裥菌素質(zhì)量流速2kg/h。實施例6使用丙酮/乙醇混合物沉淀。丙酮質(zhì)量流速18kg/h。乙醇質(zhì)量流速2kg/h。裂裥菌素質(zhì)量流速20kg/h。實施例7使用丙酮/乙醇混合物沉淀。丙酮質(zhì)量流速18kg/h。乙醇質(zhì)量流速2kg/h。裂裥菌素質(zhì)量流速20kg/h。水的分離和β-葡聚糖的濃縮由圖1所示的中空鋼管制造的壓縮滲透性單元在20-25℃的溫度下使用。管通過裝有濾布的可移動活塞在頂部封閉,并在底部包含另外的濾布[clear25130fpp,可由clearedgefiltration,geldern,德國獲得,透氣性為4l/(dm2min)]。引入不同體積的包含沉淀的β-葡聚糖的含水懸浮液。壓濾機的壓力通過擠壓活塞的自動下降而增加。壓力增加逐步實現(xiàn)(1巴/分鐘)。濾液的流出可以經(jīng)由下部濾布和濾液管線或者上部和下部濾布和濾液管線進(jìn)行。當(dāng)達(dá)到最終壓力時,壓制仍持續(xù)1小時。表1壓縮滲透性單元中的實驗結(jié)果概述作為替換,如圖2所示的篩分燒杯離心機在20-25℃的溫度下使用。表2實施例6實施例7β-葡聚糖溶液與溶劑之比1:11:1溶劑丙酮/乙醇9:1丙酮/乙醇9:1中間旋壓[xg]-101第二溶劑-丙酮最終旋壓[xg]827827葡聚糖含量[g/l]5161篩分燒杯離心機中的實驗結(jié)果概述再溶解將經(jīng)濃縮的β-葡聚糖手工粉碎,即撕成小條。為了再溶解,將材料置于100ml燒杯中,并在攪拌下分階段加滿至初始的40g,使得恢復(fù)葡聚糖的起始濃度。然后將整個樣品轉(zhuǎn)移至兩個錐形離心管中,并使用ultra-turrax(3800rpm;來自ika的t25數(shù)字式ultra-turrax)分散2分鐘。為了檢查整個固體是否已經(jīng)再溶解,將樣品在8500rpm(10.000xg)下離心2分鐘。未溶解的固體在底部聚集并變得可見。如果在離心期間觀察到第二個相,則將混合物再次以3800rpm在ultra-turrax中分散2分鐘。在最后的離心步驟后沒有沉淀物形成時,樣品被認(rèn)為再溶解。這以目測檢查。再溶解后,根據(jù)實施例1a、1b、2、3、4、5、6和7,包含β-葡聚糖的溶液是清澈的。當(dāng)前第1頁12
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