發(fā)明領域

本發(fā)明涉及雙特異性鯊魚可變抗體(vnar)結構域的生成及其用途。具體而言，本發(fā)明涉及用于生成和篩選隨機化vnar結構域的多核苷酸文庫以鑒定所需表型的vnar的方法。本發(fā)明方法對于生成新型雙特異性抗體及其用途是特別有用的。

發(fā)明背景

如今生物實體是制藥行業(yè)的主要驅動力之一，如其當前和預測的市場增長率顯著超過整體行業(yè)的市場增長率所例舉。在這組生物藥物內，單克隆抗體(mab)是最高銷售類型的生物制劑，隨后分別是激素、生長因子和融合蛋白。與fc介導的免疫效應子功能組合的同源抗原的高特異性已經(jīng)支持抗體成功作為醫(yī)療應用的有效工具。用許多約40種美國食品和藥品管理局(fda)迄今為止批準的抗體和用臨床開發(fā)中的數(shù)百種mab，mab的治療和經(jīng)濟價值是顯而易見的。

igg-型抗體是結構復雜的、大雜四聚體蛋白，分子量為約150kd。igg-型抗體由兩條重鏈和兩條輕鏈構成。兩個相同的抗原結合位點、即互補位分別由輕鏈的一個可變結構域和重鏈的一個可變結構域構成。

由于存在不同的末端糖，igg分子的fc片段的ch2結構域含有經(jīng)由n-糖基化連接的高度異質的聚糖。fc聚糖影響igg與fc受體和c1q的結合，因此對于igg效應子功能是重要的。具體地，末端糖諸如唾液酸、核心巖藻糖、二等分n-乙酰葡糖胺和甘露糖殘基影響igg與fcγriiia受體的結合，從而影響adcc活性(參見例如stadlmann等人.proteomics.2008jul;8(14):2858-71)。

然而，在某些情況下，由于其固有的物理化學特性，抗體(諸如igg型抗體)的治療和診斷效力可能受到限制。例如，經(jīng)典抗體分子的組織穿透可能受到其大尺寸的約束(參見例如mordenti等人.(1999)toxicolpathol27:536-44)，因此限制了其在體外以及體內診斷方法中的用途。此外，由于其延長的血漿半衰期，常規(guī)抗體的緩慢血液清除率另外構成體內腫瘤成像目的的問題。此外，健康組織對經(jīng)典抗體的非特異性攝取進一步增加了對其在分子成像中的用途構成的限制。

為了試圖克服經(jīng)典抗體的上述限制并提高其總體治療效力，已經(jīng)設計了所謂的“下一代”抗體或抗體片段，以及非基于免疫球蛋白的蛋白支架。下一代抗體的實例包括例如單抗體、scfv、雙抗體，或例如adnectins、親和體、anticalins或半胱氨酸結蛋白(參見例如enever等人(2009)currentopinioninbiotechnology,vol20(4),405–411;l?fbl?m等人curropinbiotechnol.2011dec;22(6):843-8)。

在駱駝類動物和軟骨魚中發(fā)現(xiàn)了在過去幾年由于其非典型結構而受到很多重視的另一類抗體，其具有僅由重鏈構成的天然抗體(參見例如greenberg等人(1995)nature374:168-73;hamers-casterman等人(1993)nature363:446-8)。在這些抗體中，抗原結合位點僅由一個單個結構域(分別稱為vhh和vnar)形成。由于對應于常規(guī)抗體的疏水性vh-vl界面的溶劑暴露區(qū)域的極性和帶電氨基酸的頻率增加，vnar和vhh結構域是高度可溶的。

僅重鏈抗體(hcab)的抗原結合結構域組合了非基于免疫球蛋白的蛋白支架的大部分有益特征(例如小尺寸和高穩(wěn)定性)以及經(jīng)典抗體分子的有利特征(最顯著的是通過免疫生成高度特異性和高親和力結合劑的可行性)。有趣的是，hcab天然互補了上述種類的常規(guī)譜系：盡管經(jīng)典抗體通常具有平面或凹面抗原結合位點，但vnar-和vhh-結構域具有多種額外(在vnar的情況下)和不同的環(huán)結構。這導致得到能夠接近和結合更隱蔽的表位和酶的催化裂縫(其為經(jīng)典抗體難以處理的)的可用互補位的劇烈擴展譜。

盡管駱駝vhh結構域已證明在早期臨床試驗中是成功的(參見例如holz等人(2012)transfusaphersci.2012jun;46(3):343-6)，但用于生物醫(yī)學應用的vnar結構域的工程改造到目前為止還沒有進展。然而，在過去幾年中已經(jīng)取得了表明這些結構域的治療效用的顯著進展。

軟骨魚(鯊魚、rays、skates和吐火銀鮫(chimaeras))表達三種不同同種型的抗體，igm、ignar和原始igw(rumfeltll.等人bmcimmunology2004;5:8;rumfeltll等人journalofimmunology2004;173:1129-39)。在鉸口鯊(ginglymostomacirratum)的血清中首先鑒定了ignar(greenbergas等人nature1995;374:168-73)。ignar是沒有輕鏈的重鏈的同型二聚體。分泌形式的每條鏈由一個可變結構域、隨后五個恒定結構域(最后四個與igw恒定結構域同源)組成。血清ignar水平范圍為約0.1mg/ml至1mg/ml。

基于原子分辨率結構數(shù)據(jù)以及小角度x射線散射，獲得了完整ignar分子的結構模型。在分子內，每個鏈的結構域c1和c3引起ignar的二聚化。盡管缺乏經(jīng)典的鉸鏈區(qū)域，但可變結構域的間隔足夠寬，足以結合多種表位，其也可以通過c1二聚化界面的廣角來促進。兩個c3結構域之間的小角度誘導形成ignar分子的狹窄莖(narrowstalk)。然而，莖的柔性由連接結構域c3和c4的二硫化物橋聯(lián)的接頭誘導。僅重鏈分子大約在分子的中間、在柔性接頭的位置處扭結，造成其特征性形狀。目前還沒有解決任何效應子功能是否由ignar的恒定區(qū)介導。

同型二聚體ignar展現(xiàn)幾種獨特的特征，其負責潛在輕鏈配對的抑制。在典型vh-vl相互作用位點，在哺乳動物中介導這種結合的殘基的保守性不良。相反，這些典型疏水性氨基酸經(jīng)常被極性或帶電殘基代替。對于經(jīng)典抗體，特殊機制確保形成重鏈和輕鏈配對。在內質網(wǎng)內，重鏈經(jīng)由與ch1結構域的相互作用被ig-結合蛋白(bip)來捕獲。對于釋放，輕鏈必須代替bip。因此，僅分泌重鏈和輕鏈配對抗體。

新抗原受體的可變結構域顯示與t細胞受體(tcr)vα和還有免疫球蛋白vκ結構域的序列同源性，而結構上其與vα、vλ和vh結構域相關。此外，由于vnar結構域共享細胞粘附分子的結構特征，所以提示從細胞表面受體進化的ignar將其與vhh(其明顯源自igg譜系)明顯區(qū)別。vnar屬于ig超家族，因此它具有β-夾心折疊。然而，與哺乳動物v結構域相比，該折疊僅由8個、而不是10個β鏈組成，這是由于在框架2-cdr2-區(qū)域中的缺失，其使得vnar結構域是迄今為止動物界中最小的抗體樣抗原結合結構域，分子量為大約12kda(barellec等人,advexpmedbiol2009;655:49-62;stanfieldrl等人science2004;305:1770-3)。

因此，與哺乳動物可變結構域相反，vnar結構域僅具有兩個互補決定區(qū)cdr1和cdr3。主要vnar譜的多樣性主要發(fā)現(xiàn)于cdr3中。在cdr1中，在cdr2截短位點處(其中剩余環(huán)在分子底部形成帶狀結構)和在tcr中對應于hv4的環(huán)中觀察到抗原接觸后的高體細胞突變率。因此，這些突變易發(fā)區(qū)域已分別被命名為hv2和hv4(參見例如dooley等人,pnas(usa)2006;103:1846-51)。

盡管與經(jīng)典抗體(跨越兩條鏈的六個環(huán))相比具有減少數(shù)目的可能的抗原結合環(huán)(跨越單鏈四個環(huán))，但vnar結構域以令人驚訝地高親和力結合抗原。甚至從其中抗原結合僅由cdr3介導的主要譜，也可以產(chǎn)生以低納摩爾范圍內的親和力針對給定抗原的vnar分子。然而，在用稱為e06的抗白蛋白結合結構域免疫后，已觀察到對于vnar結構域的最高記錄的親和力，達到皮摩爾水平的親和力(muller等人,mabs2012;4:673-85)。

基于相應數(shù)目的非典型半胱氨酸殘基，vnar分子已被分類為四種類型。所有類型都通常具有經(jīng)典的ig規(guī)范半胱氨酸，其經(jīng)由二硫鍵穩(wěn)定免疫球蛋白折疊。i型可變結構域在框架區(qū)域2和4中攜帶額外的半胱氨酸，因此在cdr3中攜帶偶數(shù)數(shù)目的配偶體半胱氨酸殘基。與溶菌酶復合的i型vnar的晶體結構的測定顯示，兩個非典型框架半胱氨酸各自與cdr3的那些形成二硫鍵，引起該環(huán)緊緊地保持在hv2的方向。到目前為止，僅在鉸口鯊(ginglymostomacirratum)中鑒定了ignar的i型可變結構域。

ii型結構域分別借助cdr1和cdr3中的另外的半胱氨酸而不同于i型，所述另外的半胱氨酸導致分子內二硫鍵，其使兩個環(huán)密切接近。然而，ii型結構域缺乏將cdr3錨定至i型vnar中的框架的兩個半胱氨酸基序。因此，cdr3區(qū)域形成突出的“手指狀”結構，其傾向于結合至口袋或凹槽(例如，酶的活性位點)中。

iii型結構域在新生魚中表達。類似于ii型結構域，該同種型的特征在于分別在cdr1和cdr3中的另外的非經(jīng)典半胱氨酸。然而，與ii型相反，iii型結構域包含受限制的cdr3多樣性，氨基酸組成和長度高度相似，以及鄰近位于兩環(huán)之間二硫化物橋的cdr1中的保守的色氨酸殘基。

iv型結構域不同于所有描述的vnar類型，因為它們僅包含經(jīng)典二硫鍵。因此，iv型可變結構域的互補位的拓撲結構是更柔性的并且不受物理約束。iv型結構域也稱為iib型(streltsov等人pnas2004;101:12444-9;liu等人,molecularimmunology2007;44:1775-83)。

已經(jīng)鑒定了cdr1中具有不變色氨酸殘基的iv型結構域，從而展現(xiàn)與iii型結構域的一定相似性。除了iii型vnar結構域外，所有類型的vnar結構域都會產(chǎn)生高親合力結合劑。

基于抗體的療法在癌癥治療中的用途在過去二十年中已經(jīng)變得良好確立，并且現(xiàn)在是用于治療具有血液惡性腫瘤和實體瘤的患者的最成功和重要的策略之一?；诳贵w的腫瘤療法的根本基礎是與正常組織相比過表達、突變或選擇性表達的腫瘤細胞的抗原表達。

大多數(shù)批準用于在美國銷售的單克隆抗體(mab)靶向單細胞表面抗原，諸如例如，針對tnfα的阿達木單抗(humira;abbott/abbvie)，針對egfr的panitumumab(vectibix;amgen)，針對cd20的阿伐單抗(arzerra;genmab)。然而，腫瘤細胞通常上調不同的生長促進受體，其可以獨立地起作用或在細胞內交叉對話。通過單特異性抗體靶向一種受體可導致與替代受體的上調以及途徑轉換相關的抗性(kontermann(2012)mabs4:2,182-197)，表明其可能有益于靶向或阻斷腫瘤細胞上的多種細胞表面抗原(靶標)。已經(jīng)認識到這一點，并且目前在臨床試驗中存在超過15種雙特異性抗體，即靶向兩種不同細胞表面抗原的抗體(參見例如garber,natrevdrugdiscov.2014oct31;13(11):799-801)。然而，迄今為止的人雙特異性抗體僅能夠靶向平面或凹面抗原結合位點，從而排除可能治療更有效的抗原結合位點。

因此，鑒于人或人源化雙特異性抗體靶向的經(jīng)典表位的限制，對新型和有效的基于雙特異性抗體的癌癥治療劑存在持續(xù)需求。因此，本發(fā)明的目標是提供克服目前抗原靶向的限制的新型雙特異性抗體。

發(fā)明概述

本發(fā)明人已令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，可以通過將vnari型、ii型和iv型結構域的高變區(qū)2(hv2)的氨基酸序列隨機化來獲得雙特異性vnar結構域。因此，本發(fā)明提供了用于生成具有以下結構的雙特異性鯊魚可變抗體結構域(vnar結構域)的方法：

fw1-cdr1-fw2-hv2-fw3a-hv4-fw3b-cdr3-fw4,

其中所述方法包括以下步驟：

a.將至少一個編碼高變區(qū)2(hv2)的多核苷酸序列隨機化，

b.檢測vnar結構域，其中hv2以相比于參考樣品改變的親和力結合目標抗原，且第二目標抗原被由cdr3和cdr1形成的互補位特異性結合，

c.選擇(b)的vnar結構域。

在一個實施方案中，可以通過本發(fā)明方法隨機化的vnar結構域是vnari型、vnarii型或vnariv型之一。

在一個實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的至少一個編碼所述vnar的多核苷酸上包含的編碼hv2的區(qū)域的多核苷酸的隨機化包括基于密碼子的隨機化、nnb隨機化、nnk隨機化、nns隨機化或偏倚隨機化。

根據(jù)一個實施方案，編碼根據(jù)本發(fā)明的hv2結構域的多核苷酸序列包含核苷酸序列nnn1(nnn)7nnn9，其中

-位置1中的密碼子的50％編碼氨基酸賴氨酸，而剩余50％編碼除半胱氨酸以外的任何氨基酸，且

-密碼子2-8可以編碼任何氨基酸，且

-位置9中的密碼子的50％編碼氨基酸蘇氨酸，而剩余50％編碼除半胱氨酸以外的任何氨基酸。

在一個實施方案中，通過酵母表面展示、噬菌體展示、哺乳動物展示或蛋白陣列之一檢測和/或選擇根據(jù)本發(fā)明的展示與第一抗原的親和力相比于參考樣品改變的vnar。

根據(jù)一個實施方案，根據(jù)本發(fā)明的vnar還包含可檢測標簽。

在一個實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的vnar的可檢測標簽位于vnar的氨基末端和/或羧基末端。

在一個實施方案中，通過流式細胞術、facs、elisa或微流體檢測和/或選擇本發(fā)明vnar。

根據(jù)一個實施方案，本發(fā)明方法的第一和第二目標抗原是細胞表面抗原，優(yōu)選癌細胞表面抗原。

在一個實施方案中，本發(fā)明提供了融合蛋白，其包含根據(jù)本發(fā)明方法的隨機化hv2結構域或包含根據(jù)本發(fā)明方法的隨機化hv2結構域的本發(fā)明vnar結構域。

在一個實施方案中，本發(fā)明融合蛋白包含igg-fc結構域、vh、vl、vhh抗體結構域或其片段之一。

在一個實施方案中，本發(fā)明融合蛋白是人源化的。

在一個實施方案中，本發(fā)明融合蛋白的fc-結構域包含人igg-fc結構域或其序列變體。

根據(jù)一個實施方案，本發(fā)明融合蛋白當與所述第一目標抗原和所述第二目標抗原結合時，在體內誘導adcc。

在一個實施方案中，本發(fā)明提供了可通過本發(fā)明方法獲得的vnar。

在一個實施方案中，本發(fā)明提供了載體，其包含編碼本發(fā)明vnar或本發(fā)明融合體的多核苷酸序列。

在一個實施方案中，本發(fā)明提供了包含根據(jù)本發(fā)明的載體的宿主細胞。

在一個實施方案中，本發(fā)明提供了產(chǎn)生本發(fā)明vnar或vnar融合蛋白的方法，其中所述方法包括以下步驟：

-在足以使本發(fā)明vnar或vnar融合蛋白蛋白表達的條件下，培養(yǎng)至少一種根據(jù)本發(fā)明的宿主細胞，和

-分離和純化本發(fā)明vnar蛋白或vnar融合蛋白。

根據(jù)一個實施方案，本發(fā)明提供了多核苷酸文庫，其包含多個編碼如本文公開的本發(fā)明hv2結構域的多核苷酸。

在一個實施方案中，本發(fā)明多核苷酸文庫包含多個編碼總體結構fw1-cdr1-fw2-hv2-fw3a-hv4-fw3b-cdr3-fw4的i型、ii型或iv型vnar結構域的多核苷酸，其中hv2結構域由根據(jù)本發(fā)明的隨機化多核苷酸序列編碼。

在一個實施方案中，本發(fā)明提供了包含根據(jù)seqidno:2、seqidno:4、seqidno:5的氨基酸序列的雙特異性vnar。

在一個實施方案中，本發(fā)明涉及本發(fā)明vnar或本發(fā)明融合蛋白在制備藥物中的用途。

在一個實施方案中，本發(fā)明提供了包含如本文公開的本發(fā)明vnar或本發(fā)明vnar融合蛋白和藥學上可接受的載體或稀釋劑的藥物組合物。

在一個實施方案中，本發(fā)明涉及治療患有病理狀況的個體的方法，其包括向有需要的個體施用根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物。

在一個實施方案中，待通過本發(fā)明方法治療的病理狀況是癌癥、自身免疫疾病或病毒感染。

在一個實施方案中，待通過本發(fā)明方法治療的個體具有腫瘤。

根據(jù)一個實施方案，待通過本發(fā)明方法治療的個體是人。

在一個實施方案中，本發(fā)明提供了部件試劑盒，其包含雙特異性vnar或本發(fā)明vnar融合蛋白，以及用于檢測本發(fā)明vnar的裝置。

附圖簡述

圖1：顯示常規(guī)互補位(抗原結合位點)的vnar分子。經(jīng)由hv2的隨機化引入新的抗原結合位點，導致產(chǎn)生靶向兩種不同抗原的雙特異性分子。

圖2：各種抗體分子(a)igg分子、(b、c)駱駝科動物和軟骨魚抗體分子(其僅天然僅由重鏈組成)的抗體結構。

圖3：抗體結構的比較：vnar屬于ig超家族且具有β-夾心折疊，然而，相比于哺乳動物v結構域，該折疊僅由8個、而不是10個β-鏈組成，這是由于框架2-cdr2-區(qū)域中的缺失。因此，與哺乳動物可變結構域相反，vnar結構域僅具有兩個互補決定區(qū)cdr1和cdr3。主要vnar譜的多樣性主要發(fā)現(xiàn)于cdr3中。在cdr1中、cdr2截短位點處和tcr中對應于hv4的環(huán)中觀察到高體細胞突變率。因此，這些突變易發(fā)區(qū)域已分別被命名為hv2和hv4。

圖4：已知的不同vnar類型，包括i型、ii型、iii型和iv型。

圖5：酵母表面展示的說明。vnar在釀酒酵母的表面上分別被呈遞為具有n-末端ha-表位和c-末端cmyc-標簽的aga2p融合體，用于檢測表面表達。

圖6：用于同時結合epcam和cd3ε的文庫篩選。二維進行分選。顯示了文庫篩選的第1輪和第4輪、分選門控以及靶濃度。

圖7：使用酵母表面展示驗證雙特異性。與540nmepcam(黑色)或770nmcd3ε或僅與二級檢測試劑孵育的在其表面上表達vnarb1的酵母細胞。

圖8：epcam-和cd3ε-特異性vnar分子b1及其親本分子5005(僅epcam特異性)的序列。以灰色顯示hv2中的隨機化殘基。

圖9：(a)使用酵母表面展示驗證雙特異性。與540nmepcam(黑色)或僅與二級檢測試劑(灰色)孵育的在其表面上表達vnarf1的酵母細胞，(b)使用酵母表面展示驗證雙特異性。與約500nmfc-片段(黑色)或僅與二級檢測試劑(灰色)孵育的在其表面上表達vnarf1的酵母細胞。

圖10：包含竹鯊(chiloscylliumplagiosum)的vnar結構域的殘基43-56的vnar結構域表面暴露的環(huán)hv2的模型；殘基編號根據(jù)物種和vnar類型而不同。

圖11：用于構建具有隨機化hv2的插入物的soe-pcr方案。在2步pcr中生成插入片段。在第一步中，將vnar-片段擴增直至hv2的5'末端(1a)。在第二步中，使用hv2rand_up引物將hv2隨機化。這導致產(chǎn)生在hv2編碼區(qū)的5'末端開始至vnar分子編碼區(qū)的3'末端的片段。在第二pcr中，兩個片段充當自身的引物，以導致全長隨機化hv2vnar插入物以得到引物。在6個循環(huán)后，添加引物以生成足夠量的全長插入物。

序列表

seqidno:1用于hv2結構域的隨機化的人工多核苷酸

seqidno:2vnar克隆b1的氨基酸序列

seqidno:3親本vnar克隆5005的氨基酸序列

seqidno:4vnarepha2-fc的氨基酸序列

seqidno:5vnarepha2_4-fc的氨基酸序列

seqidno:6生物素-受體多肽的氨基酸序列

seqidno:7actev位點

seqidno:8寡核苷酸hv2rand_up

seqidno:9pct-seq-lo

seqidno:10pct-seq-up

seqidno:11hv2rand_soe-lo。

發(fā)明詳述

盡管下面詳細地描述了本發(fā)明，但要理解，本發(fā)明不限于本文所述具體的方法、方案和試劑，因為這些可改變。還要理解，本文所用術語僅用于描述具體實施方案的目的，并無意限制僅由隨附權利要求書限定的本發(fā)明的范圍。除非另有說明，否則本文所用的所有技術和科學術語具有本領域普通技術人員通常理解的相同含義。

下面，將描述本發(fā)明的要素。這些要素與具體實施方案一起列出，然而應理解，它們可以任何方式和以任何數(shù)目組合以產(chǎn)生額外的實施方案。各個描述的實例和優(yōu)選的實施方案不應解釋為僅將本發(fā)明限于明確描述的實施方案。該描述應理解為支持和包括將明確描述的實施方案與任何數(shù)目的公開的和/或優(yōu)選的要素組合的實施方案。此外，本申請中所有所描述的要素的任何排列和組合都應視為通過本申請的描述而公開，除非上下文中另有說明。

在整個本說明書和隨附的權利要求書中，除非上下文另有要求，否則術語“包含(comprise)”和變體諸如“包含(comprises)”和“包含(comprising)”應理解為必然包括規(guī)定的成員、整數(shù)或步驟，但不排除任何其它未規(guī)定的成員、整數(shù)或步驟。術語“由……組成”是術語“包含”的一個具體實施方案，其中不包括任何其它未規(guī)定的成員、整數(shù)或步驟。在本發(fā)明的上下文中，術語“包含”包括術語“由……組成”。

在描述本發(fā)明的上下文中(尤其在權利要求書的上下文中)使用的術語“一(a)”和“一(an)”和“該(the)”和類似指代要解釋為涵蓋單數(shù)和復數(shù)，除非本文另有說明或上下文顯然抵觸。本文值的范圍的引述僅僅意在用作各別提及落入該范圍的每個單獨的值的簡寫方法。除非本文另有說明，否則每個單獨的值都并入到本說明書中，就像本文分別引述其一樣。本說明書的用語都不應解釋為說明對實施本發(fā)明必要的任何非要求保護的要素。

在本說明書的整個文本中引用了若干文件。本文引用的每份文件(包括所有專利、專利申請、科技出版物、生產(chǎn)商說明書、使用說明等)，不論在上文還是在下文，都通過引用以其整體并入到本文中。本文任何東西都不得解釋為承認本發(fā)明因在前的發(fā)明而無資格先于這類公開內容。

所述目標通過本發(fā)明、優(yōu)選通過隨附權利要求書的主題解決。發(fā)明人令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，雙特異性vnar結構域可以通過本發(fā)明方法獲得，所述方法包括以下步驟：(a)將至少一個編碼高變區(qū)2(hv2)的多核苷酸序列隨機化，(b)檢測vnar結構域，其中hv2以相比于參考樣品改變的親和力結合目標抗原，且第二目標抗原被由cdr3和cdr1形成的互補位特異性結合，和(c)選擇(b)的vnar結構域。因此，本發(fā)明方法包括將至少一種編碼至少一種vnar的hv2結構域的多核苷酸序列隨機化，和檢測vnar，其以相比于參考樣品改變的親和力結合第一目標抗原和被由vnar結構域的cdr1和cdr3形成的互補位結合的第二目標抗原，隨后選擇vnar結構域，其顯示對第一目標抗原的改變的親和力。如本發(fā)明方法中使用的術語“vnar結構域”是指由在軟骨魚(諸如例如鯊魚、ray和skate，例如鉸口鯊(ginglymostomacirratum)或竹鯊(c.plagiosum))中發(fā)現(xiàn)的ignar上存在的僅一個單一結構域形成的抗原結合位點。根據(jù)本發(fā)明的vnar結構域可以是如上所公開或例如如kovaleva等人(2014),expertopinbiolther.oct;14(10):1527-39中所公開的vnari型、vnarii型或vnariv型。

在本發(fā)明方法中，第一目標抗原和第二目標抗原可以是例如細胞表面抗原，其例如是指蛋白、多肽或肽，其中蛋白、多肽或肽的至少一個抗原部分暴露在生物膜的表面上，并且可以具有以下共價連接的部分中的一種或多種：一種或多種簡單或復合糖部分(如在糖蛋白中)、脂質部分(如在脂蛋白中)、脂質和糖部分的組合或其他翻譯后修飾?！暗鞍住蓖ǔＪ腔诎被岬木酆衔锏拈L鏈(“多肽”)。蛋白可以由一條、兩條或更多條多肽鏈構成，并且可以進一步含有與多肽鏈結合的一些其他類型的物質(諸如碳水化合物)。蛋白的大小涵蓋5,000至幾十萬克/摩爾(的任意數(shù)字)的相當寬的范圍。用于本發(fā)明方法的術語目標抗原或細胞表面抗原還包括例如受體酪氨酸激酶，諸如例如pdgfr、egfr、vegfr、hgfr、神經(jīng)營養(yǎng)因子r、her2、her3、her4、胰島素r、igfr、csfir、flk、kdr、vegfr2、cck4、met、trka、axl、tie、eph、ryk、ddr、ros、ret、ltk或musk。本發(fā)明方法中的目標抗原可以例如還包含聚糖，其中術語“聚糖”是指由糖苷連接的大量單糖組成的化合物。例如，聚糖可以包括糖胺聚糖，其包含以交替形式與糖醛酸連接的2-氨基糖，并且包括聚合物諸如肝素、硫酸乙酰肝素、軟骨素、角蛋白和皮膚素。在本發(fā)明方法中，第一目標抗原和第二目標抗原可以例如位于相同分子或細胞表面抗原上，或者第一和第二目標抗原可以位于兩個不同的分子上，例如，第一目標抗原可以由細胞表面蛋白或蛋白片段形成，而第二目標抗原可以由非蛋白細胞表面抗原諸如聚糖形成。本發(fā)明的第一和第二目標抗原還可以是腫瘤抗原或細胞表面癌細胞抗原、腫瘤相關抗原或腫瘤特異性抗原，其包含例如由腫瘤細胞表達的任何免疫原性表位。所述蛋白可以由非腫瘤細胞表達，但僅當由腫瘤細胞表達時才例如由于改變(增加或減少)的糖基化而具有免疫原性。或者，所述蛋白可以由腫瘤細胞或癌細胞、但非正常細胞表達。在一個實施方案中，腫瘤抗原、細胞表面癌細胞抗原或腫瘤相關抗原或腫瘤特異性抗原是人腫瘤抗原。例如，腫瘤抗原可以包括黑色素瘤相關的硫酸軟骨素蛋白聚糖(mcsp,uniprotq6uvk1,ncbi登錄np001888)、成纖維細胞活化蛋白(fap,uniprotq12884,q86z29,q99998;ncbi登錄np004451)、表皮生長因子受體(egfr，也稱為erbb1和herl,uniprotp00533;ncbi登錄np_958439,np_958440)、癌胚抗原(cea，也稱為癌胚抗原相關細胞粘附分子5或cd66e;uniprotp06731,ncbi登錄np004354)和cd33(也稱為gp76或唾液酸結合的ig樣凝集素3(siglec-3),uniprotp20138,ncbi登錄np001076087,np001171079)。

如用于本發(fā)明方法，術語“改變的”或“改變的親和力”包括通過例如由vnarhv2形成的互補位，或例如通過由vnarcdr1和cdr3形成的互補位的vnar與一種或多種目標抗原(例如一種、兩種、三種或四種目標抗原)的結合常數(shù)的變化。例如，改變的親和力可以包括與給定目標抗原的降低或增加的親和力，優(yōu)選與目標抗原(可含有線性和/或不連續(xù)的)的增加的親和力。片段的長度沒有臨界上限，其可以(例如)包含抗原序列的幾乎全長，或甚至包含來自靶抗原的兩個或更多個表位的融合蛋白。在一個實施方案中，vnarhv2結構域與第一目標抗原的改變的親和力是至少例如10^-7m、2.5x10^-7m、5x10^-7m、7.5x10^-7m、1x10^-8m、2.5x10^-8m、5x10^-8m、7.5x10^-8m、10^-9m、2.5x10^-9m、5x10^-9m、7.5x10^-9m、10^-10m、2.5x10^-10m、5x10^-10m、7.5x10^-10m、10^-11m、2.5x10^-11m、5x10^-11m、7.5x10^-11m或10^-12m。

與本發(fā)明方法一起使用的術語隨機化是指產(chǎn)生多個序列的方法，其中一個或幾個位置已被隨機化。在一些實施方案中，隨機化是完全的(即，所有四個核苷酸，a、t、g和c可以在隨機化位置發(fā)生。在替代實施方案中，核苷酸的隨機化限于四個核苷酸的子集。隨機化可以應用于編碼高變區(qū)2(hv2)的多核苷酸序列的一個或幾個密碼子。當表達時，所得文庫產(chǎn)生hv2群體，其中一個或多個氨基酸位置可以含有所有20個氨基酸或氨基酸的子集的混合物。

在一個實施方案中，本發(fā)明方法中編碼hv2的多核苷酸序列(hv2編碼區(qū))的隨機化可以包括基于密碼子的隨機化、nnb隨機化、nnk隨機化、nns隨機化或偏倚隨機化。例如，如本發(fā)明方法中使用的基于密碼子的隨機化可以根據(jù)由gaytan等人(1998)chemistry&biology5:519-527描述的方法或根據(jù)monroy-lagos等人(2006),appliedandenvironmentalmicrobiology,may2006,p.3797–3801)進行。在本發(fā)明方法中，nnb隨機化是指在前兩個位置具有每種核苷酸的25％和在第三位置具有c、t和g的33％的簡并密碼子。tyr/ser是指酪氨酸和絲氨酸的均勻混合物。例如，如本發(fā)明方法中使用的“nnk隨機化”可用于產(chǎn)生單一氨基酸變體，其中“n”是指任何堿基(例如a、c、g或t)，而“k”是指g或t。nnk隨機化方案可以編碼覆蓋所有20種天然存在的氨基酸的32種不同的密碼子。蛋白的各位置的氨基酸殘基可以被突變?yōu)椴煌谙嗤恢玫囊吧桶被岬?9種氨基酸中的任一種，導致沿著蛋白的單一氨基酸點突變。最終結果是蛋白變體文庫，其涵蓋具有在文庫中成員與成員不同的一個殘基的多個蛋白的組。

例如，為了減少本發(fā)明方法中編碼本發(fā)明雙特異性vnar的hv結構域的多核苷酸的隨機化中的終止密碼子的頻率，可以包括nns隨機化，其中n表示待包括的隨機三聯(lián)體的數(shù)目，n代表任何核苷酸，s代表標準iupac核苷酸命名中的c或g。由于三個終止密碼子中的兩個(tga和taa)在第三位置具有a，所以預期nns策略相比于nnn策略將終止密碼子的頻率從3/64降低至1/32。本發(fā)明方法中的隨機化可以例如，也是偏倚隨機化，例如序列中的一些位置保持不變，或者選自有限數(shù)量的可能性。例如，在一個實施方案中，包含hv2編碼區(qū)的隨機多核苷酸的第一個和最后一個密碼子可以進行偏倚隨機化，例如，第一密碼子可以包含除了tgt、tgc之外的所有密碼子，并且最后一個密碼子可以是除了tgt、tgc之外的任何密碼子，而在用于第一密碼子的密碼子的50％中，第一密碼子可以選自tta、ttg、ctt、ctc、cta、ctg，而第二密碼子可以選自act、acc、aca、acg。

在一個實施方案中，編碼hv2結構域的多核苷酸序列包含根據(jù)seqidno:1的核苷酸序列，其可以例如根據(jù)上面公開的任何隨機化技術隨機化。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸的第一個密碼子可以在50％的多核苷酸中編碼氨基酸賴氨酸，例如，在50％的多核苷酸中，所述密碼子選自aaa或aag，而在50％的多核苷酸中，可以存在任何密碼子，除了編碼半胱氨酸的tgt、tgc。編碼根據(jù)本發(fā)明的hv2結構域的多核苷酸的密碼子2-8可以編碼任何氨基酸，例如，除taa、tag或tga以外，可存在任何密碼子。編碼根據(jù)本發(fā)明的hv2結構域的多核苷酸的密碼子9可以在50％的多核苷酸中編碼氨基酸蘇氨酸，例如，在50％的多核苷酸中，所述密碼子選自act、acc、aca或acg，除了tgt、tgc之外，可存在任何密碼子。例如，根據(jù)seqidno:1的多核苷酸序列可以包含在寡核苷酸序列(諸如例如，根據(jù)seqidno:8的寡核苷酸序列)中，其可以用于基于pcr的技術(例如soepcr)中以產(chǎn)生多核苷酸文庫，其包含或編碼包含隨機化hv2結構域的vnar蛋白。

在本發(fā)明的一個方面，vnar文庫可以例如使用例如omniscript?逆轉錄試劑盒(qiagen)和odt-寡核苷酸從作為用于cdna合成的模板的來自鯊魚的總rna獲得。pcr擴增的vnar產(chǎn)物可以例如用作用于半合成文庫構建的起始材料。初始文庫可以例如在三個連續(xù)的pcr步驟中建立(參見例如所附實施例中，或例如zielonka,s.等人(2014)journalofbiotechnology)。

在一個實施方案中，通過酵母表面展示、噬菌體展示、哺乳動物展示或蛋白陣列之一檢測和/或選擇本發(fā)明的展示與第一抗原的親和力相比于參考樣品改變的vnar。因此，本發(fā)明方法包括例如使包含隨機化hv2結構域的vnar進行酵母表面展示、噬菌體展示、哺乳動物展示或蛋白陣列之一。例如，編碼包含根據(jù)本發(fā)明的隨機化hv2結構域的vnar的多核苷酸可以進行酵母展示以檢測和選擇與第一抗原的親和力相比于參考樣品改變的vnar。例如，酵母展示可以根據(jù)如rakestraw(參見rakestraw(2011)proteinengineering,design&selectionvol.24,no.6:525-530)提供的方法進行。例如，可以將至少一種編碼本發(fā)明的vnar的多核苷酸例如克隆入secant載體中，由此經(jīng)由例如actev蛋白酶位點(enlyfqg)將本發(fā)明vnar與生物素-受體肽(bap:glndifeaqkiewhe)基因融合。載體可以例如還包含與vnar5'可操作連接的標簽，諸如例如flag標簽(sigma)或myc標簽。標簽和與之可操作連接的5'可以例如是前導序列，諸如源自wtαmfpp的前導序列。表達盒可以例如3'克隆，并在低拷貝prs314酵母/大腸桿菌穿梭載體(atccmanassas,va,usa)中與gal10(半乳糖誘導型)啟動子可操作連接以產(chǎn)生具有不同分泌型前導序列和bap取向的載體組。所有載體都可以例如含有kpni和mlui限制性位點側接的克隆位點，其便于在actev/bap和flag標簽之間引入poi。宿主菌株(源自bj5464a)表達負責將生物素連接至bap標簽上的大腸桿菌bira生物素連接酶。bira(codondevices,inc.)攜帶c末端his-asp-glu-leu內質網(wǎng)保留信號序列，并通過融合至酵母轉化酶分泌前導序列而引導至分泌途徑，并在細胞色素c(cyc1)啟動子的控制下表達。蛋白二硫化物異構酶(pdi)在adh1啟動子的控制下共表達。bira和pdi基因可以例如分別克隆至prs306和prs305載體(atcc)中，然后其可以例如穩(wěn)定地整合至酵母染色體中以產(chǎn)生jac100hsecant表面展示菌株(mata,trp1,pep4::his3,dpdb1,adh-pdi::leu2,cyc1-bira::ura3)。酵母細胞的轉化可以例如通過如所附實施例中所概述的根據(jù)benatuil等人(2011)proteinengineering,design&selectionvol.23,4:155-159的方法或例如根據(jù)rakestraw等人進行，例如如下：ez酵母轉化試劑盒(zymoresearch,orange,ca,usa)可用于用含有本發(fā)明多核苷酸的secant載體轉化jac100h展示菌株。然后可以在30℃下在sc葡萄糖、trp2板(teknova,hollister,ca,usa)上選擇轉化體2天。然后可以挑取單個菌落并將其接種至5ml補充有生物素(2％葡萄糖、0.67％酵母氮堿、0.54%na2hpo4、0.86%nah2po4.h2o、0.5％酪蛋白氨基酸和2.5mg/l生物素)的合成右旋糖酪蛋白氨基酸(sd-caa)氨基酸，并且可以例如在30℃下生長過夜。一旦培養(yǎng)物已例如生長至od600~0.5；可以將其沉淀，然后重懸浮于5ml磷酸鹽緩沖、生物素補充酵母提取物、蛋白胨、半乳糖(ypg)培養(yǎng)基(2％半乳糖、2％蛋白胨、1％酵母提取物、0.025％牛血清白蛋白(bsa)、0.54%na2hpo4、0.86%nah2po4.h2o和2.5mg/l生物素)。然后可以例如將培養(yǎng)物在20℃下?lián)u動24小時。這種ypg中的孵育開始poi的生產(chǎn)和生物素化，并被稱為“預誘導”。

在預誘導后，可以取出2x10⁷個細胞用于抗生物素蛋白標記：例如，可以將細胞首先沉淀并在1ml碳酸鹽緩沖液(4.2%nahco3和0.034%na2co3,ph?8.4)中洗滌三次，然后通過在室溫下在溶解于40ml碳酸鹽緩沖液中的4mg(40ml干體積)3.4kdanhs-peg-生物素(laysanbio,arab,al,usa)中孵育15分鐘而生物素化。在生物素標記后，可以將細胞沉淀并在1ml磷酸鹽緩沖鹽水(pbs)/bsa(1mg/ml)中洗滌三次。在預誘導后，可以取出2x10⁷個細胞用于抗生物素蛋白標記(圖1b)。例如，可以將細胞例如首先沉淀并在1ml碳酸鹽緩沖液(4.2%nahco3和0.034%na2co3,ph?8.4)中洗滌三次，然后通過在室溫下在溶解于40ml碳酸鹽緩沖液中的4mg(40ml干體積)3.4kdanhs-peg-生物素(laysanbio,arab,al,usa)中孵育15分鐘而生物素化。在生物素標記后，可以將細胞例如沉淀并在1ml磷酸鹽緩沖鹽水(pbs)/bsa(1mg/ml)中洗滌三次。然后可以例如通過向每個孔中添加1mlpbs/bsa并在室溫下孵育2分鐘而從板中洗滌細胞。然后可以例如通過上下移液而將細胞懸浮于pbs/bsa中并轉移至1.5ml管。任何剩余的細胞可以例如通過至少一次額外應用1mlpbs/bsa而從板收集，然后轉移至1.5ml管。然后可以例如將細胞沉淀，在1mlpbs/bsa中洗滌三次并置于冰上。然后可以例如將細胞懸浮于40μl20mg/ml抗生物素蛋白(sigma)中，并可以在室溫下孵育10分鐘。預先誘導、但未用抗生物素蛋白標記的細胞將可溶性、生物素化蛋白直接分泌至培養(yǎng)基中。在抗生物素蛋白標記后，可以將細胞沉淀，在1mlpbs/bsa中洗滌兩次，并重懸浮于50μlpbs/bsa中?？梢岳鐚⒍逦⑸募毎臃N至1.2ml誘導培養(yǎng)基中并充分渦旋。通過將ypg/bsa(2％半乳糖、2％蛋白胨、1％酵母提取物和0.025％bsa)通過抗生物素蛋白-瓊脂糖柱(pierce,rockford,il,usa)以除去培養(yǎng)基中天然發(fā)現(xiàn)的生物素來制備誘導培養(yǎng)基。然后，將20.6w/v%(對于hsa)或11w/v%8kda聚乙二醇(sigma)溶解于3ml生物素-過濾的培養(yǎng)基中，并用0.2μm注射器過濾器(bectondickinson,franklinlakes,nj,usa)過濾除菌。最后，可以例如添加100mg/ml抗生物素蛋白至1mg/ml的最終濃度。在誘導培養(yǎng)基中混合細胞后，可以例如將1.2ml培養(yǎng)基/細胞懸浮液添加至六孔板(bectondickinson)的一個孔中，并在20℃或25℃下孵育16小時而不搖動。該誘導允許細胞分泌生物素化的蛋白，其然后將被表面結合的抗生物素蛋白捕獲。

在一個實施方案中，可以例如通過噬菌體展示檢測和/或選擇本發(fā)明的展示與第一抗原的親和力相比于參考樣品改變的vnar。

如本文所用，“噬菌體展示”描述了體外選擇技術，其中根據(jù)本發(fā)明的vnar結構域或例如，包含本發(fā)明的hv2結構域的融合蛋白被基因融合至噬菌體的衣殼蛋白，導致在噬菌體病毒粒子的外部展示融合的蛋白，而編碼融合蛋白或肽的dna位于病毒粒子內。展示的蛋白和其編碼dna之間的該物理連接允許篩選大量本發(fā)明的vnarhv2結構域的變體，或例如包含本發(fā)明vnar結構域的融合蛋白。例如，噬菌體展示可以根據(jù)現(xiàn)有技術中已知的任何方案(諸如例如engberg等人.(1996)molbiotechnol.dec;6(3):287-310的方案)進行。

在一個實施方案中，通過哺乳動物展示檢測和/或選擇本發(fā)明的展示與第一抗原的親和力相比于參考樣品改變的vnar。例如，用于哺乳動物酵母展示的任何方案或技術可用于本發(fā)明方法，諸如例如，wo2008/070367a2中公開的方法。在一個實施方案中，蛋白陣列例如也可用于檢測和/或選擇本發(fā)明vnar結構域，或例如包含本發(fā)明vnar結構域的本發(fā)明融合蛋白。如本發(fā)明方法中使用的術語“蛋白陣列”是指蛋白陣列、蛋白微陣列或蛋白納米陣列。蛋白陣列可以包括例如"protoarray?"，人類蛋白高密度陣列(invitrogencorporation，可在互聯(lián)網(wǎng)得自lnvitrogen.com)。protoarray?高密度蛋白陣列可用于篩選復雜生物混合物，諸如血清，以測定針對人蛋白的自身抗體的存在。術語“蛋白芯片”可以與本發(fā)明方法中的蛋白陣列同義使用。如本發(fā)明方法中使用的術語“參考樣品”是指至少一個或多個，例如，至少10、100、10³、10⁴、10⁵或10⁶個未被隨機化的vnar結構域，或者是指例如至少10、100、10³、10⁴、10⁵或10⁶個在其表面上展示至少一個vnar結構域的細胞，例如，10、100、10³、10⁴、10⁵或10⁶個未被隨機化且其中與第一目標抗原結合未改變的vnar結構域。

在一個實施方案中，本發(fā)明vnar結構域包含可檢測標簽。如本發(fā)明方法中所用的術語可檢測標簽是指與本發(fā)明vnar結構域共價或非共價結合的部分。根據(jù)本發(fā)明的標簽可以例如是可以直接(即，一級標記)或間接(即二級標簽)檢測的分子；例如，可以顯現(xiàn)和/或測量或以其他方式識別標簽，使得可以知道其存在或不存在。示例性標記包括熒光標記(例如綠色熒光蛋白、紅色熒光蛋白、黃色熒光蛋白等)和標記酶，或者例如光學可檢測的標記、結合對的配偶體和表面底物結合分子(或附接標簽)。如技術人員將顯而易見，取決于如何使用標簽，許多分子可以用作多于一種類型的標簽。在一個實施方案中，如下所述的標簽或標記作為融合蛋白并入多肽。根據(jù)本發(fā)明的可檢測標簽可以例如還包括多肽，其提供為本發(fā)明的嵌合vnar分子的一部分，所述本發(fā)明的嵌合vnar分子包含與另一個異源多肽或氨基酸序列融合的第一多肽(例如本發(fā)明vnar結構域)。在一個實施方案中，此嵌合vnar分子包含第一多肽與標簽多肽的融合體?？蓹z測標簽可以由多肽諸如flag、his、myc、ha、v5標簽、s-標簽、sbp標簽或strep-標簽組成，或者可以例如包含蛋白標簽，諸如例如gst-標簽、mbp-標簽、gfp-標簽。

根據(jù)本發(fā)明的可檢測標簽可以例如存在于本發(fā)明vnar結構域或在vnar結構域的氨基或羧基末端包含本發(fā)明vnar結構域的融合蛋白(例如，融合蛋白可以包含至少一個根據(jù)本發(fā)明的vnar結構域)或例如包含至少一個本發(fā)明vnar結構域的融合蛋白上。

在一個實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的vnar結構域的檢測和/或選擇包含流式細胞術、facs、elisa或微流體。如本發(fā)明方法中使用的術語“選擇”是指鑒定和/或分離vnar結構域或例如包含一個或多個本發(fā)明的vnar結構域的融合蛋白或例如在其表面上展示本發(fā)明vnar或例如包含一個或多個本發(fā)明的vnar結構域的融合蛋白的過程。本發(fā)明方法中的選擇可包括技術人員已知的各種技術，諸如例如免疫淘選(immuno-panning)(參見例如wysocki等人,proc.nati.acad.sci.usa第75卷,第6期,第2844-2848頁,1978年6月)、磁激活的細胞分選(macs)、流式細胞術、熒光激活的細胞分選(facs)或基于微滴的微流體法(參見例如mazutis等人,2013,natureprotocols8,870–891)。本發(fā)明的選擇細胞可作為選擇的一部分，例如與通過上文所公開的方法從不在其表面展示目標蛋白的宿主細胞分離或分開。例如，facs可用來將細胞分選至不同的小瓶或容器中，或macs可用來分離在其表面上展示蛋白的宿主細胞，或基于微滴的微流體法可用來選擇和分離在其表面上展示目標蛋白的根據(jù)本發(fā)明的宿主細胞。

根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，第一目標抗原可以是細胞表面抗原，優(yōu)選癌細胞表面抗原或癌細胞表面抗原，諸如上述公開的那些。

在一個實施方案中，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明vnar結構域的融合蛋白。例如，本發(fā)明融合蛋白可以包含以下結構fw1-cdr1-fw2-hv2-fw3a-hv4-fw3b-cdr3-fw4的vnar結構域，其中fwx表示框架x，cdrx表示互補決定區(qū)x，hv2表示本發(fā)明hv2結構域，例如根據(jù)本發(fā)明的隨機化hv2結構域。本發(fā)明vnar結構域可以是例如融合的fc結構域。如用于本發(fā)明方法中的術語“fc結構域”或“fc區(qū)”是指免疫球蛋白的一部分，例如與通過木瓜蛋白酶消化igg分子獲得的可結晶片段有關的igg分子。fc區(qū)包含通過二硫鍵連接的igg分子的2條重鏈的c末端一半。它沒有抗原結合活性，但含有碳水化合物部分以及補體和fc受體(包括fcrn受體)的結合位點。

fc結構域包含通過二硫鍵連接的igg分子的2條重鏈的c末端一半。它沒有抗原結合活性，但含有碳水化合物部分以及補體和fc受體(包括fcrn受體)的結合位點。“fc結構域”包括例如天然序列fc區(qū)和變體fc區(qū)，例如諸如公開于wo02/094852中那些)，以及在fc結構域的多個位置，包括但不限于位置270、272、312、315、356和358觀察到多態(tài)性。在本發(fā)明方法內，術語“fc”可指分離的這個區(qū)域或在抗體、抗體片段或fc融合蛋白的背景下的這個區(qū)域。

例如，iggfc區(qū)可包含iggch2和iggch3結構域。人iggfc區(qū)的“ch2結構域”通常從約位置231的氨基酸殘基延伸到約位置340的氨基酸殘基，其中碳水化合物鏈可與ch2結構域連接?！癱h3結構域”可包含氨基酸c末端至fc區(qū)中的ch2結構域的一段，例如從igg的約位置341的氨基酸殘基至約位置447的氨基酸殘基。所述融合蛋白可以例如還包含一個或多個本發(fā)明vnar結構域與血清白蛋白、優(yōu)選人血清白蛋白的融合體。本發(fā)明融合蛋白可以例如包含vnar結構域作為氨基末端融合體或作為羧基末端融合體。例如，本發(fā)明融合蛋白還可以包含多于一個vndar結構域，例如，本發(fā)明融合蛋白可以包含兩個、三個或四個本發(fā)明vnar結構域，例如，通過與相應融合蛋白的氨基和羧基末端融合。

在本發(fā)明的一個實施方案中，本發(fā)明融合蛋白包含人fc結構域或其序列變體。因此，本發(fā)明融合蛋白可以包含如上文所公開的fc結構域或其序列變體。本發(fā)明fc-vnar融合蛋白的fc結構域的序列變體與如上文所公開的fc結構域具有至少80%、85%、90%、95%或98%或約92%至約98%、例如92%、93%、94%、95%、96%、97%或98％同一性。可以如上所述計算本發(fā)明fc融合蛋白的序列相似性。序列相似性可以在fc結構域的氨基酸序列的整個長度上計算，但也可以在以下氨基酸序列的任何部分或位置上計算：長度為10-200個氨基酸或110-190個氨基酸或120-180個氨基酸或130-170個氨基酸或140-160個氨基酸或10-100個氨基酸或20-90個氨基酸、30-80個氨基酸、40-70個氨基酸、50-60個氨基酸，例如長度為約15-55個氨基酸或長度為約25-115個氨基酸或長度為約35-95個氨基酸或長度為約45-85個氨基酸或長度為約12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、32、34、35、36、37、38、39、40、42、46、48、51、54、56、57、59或60個氨基酸。

例如，本發(fā)明融合蛋白或如本發(fā)明中公開的任何蛋白的氨基酸序列的序列同一性定義為在比對序列和必要時引入空位以獲得最大百分比序列同一性后，且不考慮任何保守取代作為序列同一性的一部分，與本發(fā)明的目標蛋白中的氨基酸殘基相同的候選序列中的氨基酸殘基的百分比?？捎帽绢I域技術內的各種方式，諸如應用可公開獲得的計算機軟件諸如blast、blast-2、align、align-2或megalign(dnastar)軟件，實現(xiàn)用于測定百分比氨基酸序列同一性的目的的比對。本領域技術人員可確定用于測量比對的合適參數(shù)，包括實現(xiàn)所比較序列全長內的最大比對所需的任何算法。

例如，還可通過公開于altschul等,bullmath.bio.48:603(1986)和henikoff和henikoff,proc.natlacad.sci.usa1992nov15；89(22):10915-9中的方法，測定百分比序列同一性。簡單地說，使用10的空位開放罰分(gapopeningpenalty)、1的空位延伸罰分(gapextensionpenalty)和下文公開的henikoff和henikoff的“blosum62”評分矩陣(氨基酸用標準一字母代碼表示)，對2個氨基酸序列進行比對以使比對評分最優(yōu)化。然后如下計算百分比同一性：([相同匹配的總數(shù)]/[較長序列的長度加引入較長序列中以比對2個序列的空位數(shù)])*100)。

例如，可獲得的其它確立的算法可用來比對和測定兩個或更多個氨基酸序列的相似性。pearson和lipman的“fasta”相似性搜索算法是用于檢查兩個或更多個氨基酸序列共享的同一性水平的合適的蛋白比對方法(參見例如pearson和lipman,proc.natl.acad.sci.usa&5:2444(1988)和pearson,meth.enzymol.183:63(1990))。簡單地說，fasta首先通過鑒定具有最高同一性密度(densityofidentities)(如果ktup變量為1)或成對同一性(pairsofidentities)(如果ktup=2)的查詢序列和測試序列共有的區(qū)域，來表征序列相似性，而不考慮保守氨基酸取代、插入或缺失。然后通過使用氨基酸取代矩陣比較所有配對氨基酸的相似性，對具有最高同一性密度的10個區(qū)重新評分，并“修整”各區(qū)的末端以僅包括有助于最高評分的那些殘基。如果有其評分大于“截止值(根據(jù)序列的長度和ktup值通過預先確定的方程式計算)”的幾個區(qū)，則檢測修整的起始區(qū)以確定各區(qū)是否可連接以形成具有空位的近似比對。最后，利用needleman-wunsch-sellers算法的修改(needleman和wunsch,j.molbiol.48:444(1970)；sellers,siamj.appl.math.25:787(1974))(其允許氨基酸插入和缺失)，對2個氨基酸序列的最高評分區(qū)進行比對。fasta分析的說明性參數(shù)為：ktup=1，空位開放罰分=10，空位延伸罰分=1，取代矩陣=blosum62。可如pearson,meth.enzymol.183:63(1990)的附錄2中所解釋，通過修改評分矩陣文件(“smatrk”)，將這些參數(shù)引入fasta程序。

在一個實施方案中，本發(fā)明的融合蛋白可以包含本發(fā)明hv2結構域與vh抗體的融合體，例如，通過cdr2和cdr3之間的同框融合，由此替代cdr2和cdr3之間的β-折疊，或例如hv2可以包括在β-折疊中。本發(fā)明hv2-結構域也可以通過接枝至其他免疫球蛋白(諸如例如，igm型抗體)上，或可以例如與vhh抗體融合，代替vhh結構域。

在一個實施方案中，當在體內與第一和第二目標抗原結合時，例如，當本發(fā)明雙特異性融合蛋白與腫瘤或癌細胞上的第一和第二抗原結合、例如與如上所公開的癌細胞表面抗原結合時，本發(fā)明融合蛋白誘導adcc。如用于本發(fā)明融合蛋白的術語adcc(抗體依賴性細胞毒性)是指細胞介導的免疫防御的機制，其中免疫系統(tǒng)的效應細胞活性地裂解靶細胞，其膜表面抗原已被特異性抗體結合。adcc通過例如在nk細胞上表達的cd16(fcγriii)與抗體的fc結構域的結合來介導(參見例如clynes等人(2000)naturemedicine6,443-446)。adcc可以例如通過影響fc結構域與cd16結合的fc結構域中的氨基酸取代而得到改善。例如，shields等人(jbiolchem9(2),6591-6604(2001))顯示fc區(qū)的位置298、333和/或334的氨基酸取代(殘基的eu編號)改善adcc。或者，增加的fc受體結合和效應子功能可以例如通過改變fc區(qū)的糖基化獲得。與fc結構域的asn297連接的兩個復雜雙天線糖寡糖通常被掩埋在ch2結構域之間，與多肽骨架形成廣泛的接觸，并且它們的存在對于抗體介導效應子功能(包括adcc)是至關重要的(lifely等人,glycobiology5,813-822(1995);jefferis等人,immunolrev163,59-76(1998);wright和morrison,trendsbiotechnol15,26-32(1997))。例如β(1,4)-n-乙酰氨基葡糖基轉移酶iii(gntiii)(催化二等分寡糖的形成的糖基轉移酶)的過表達顯著增加抗體的體外adcc活性。因此，用于產(chǎn)生本發(fā)明融合蛋白的細胞系中例如gntiii的過表達可導致本發(fā)明的富含二等分的寡糖的融合蛋白，其通常也是非巖藻糖基化的并且可以表現(xiàn)出增加的adcc。

本發(fā)明融合蛋白的adcc可以例如在宿主細胞或細胞系中額外過表達除了gntiii之外的甘露糖苷酶ii(manii)來進一步增加，因為所得本發(fā)明融合蛋白可以富含復合型的二等分、非巖藻糖基化寡糖(參見例如ferrara等人,biotechnbioeng93,851-861(2006))。例如，從存在于本發(fā)明fc融合蛋白中的寡糖核心的最內部n-乙酰葡糖胺殘基消除巖藻糖也可以增加adcc活性(參見例如shinkawa等人,jbiolchem278,3466-3473(2003))，因此本發(fā)明fc融合蛋白也可以例如在宿主細胞或具有降低的巖藻糖基化的細胞系中產(chǎn)生，通過例如在α(1,6)-巖藻糖基轉移酶缺陷宿主細胞中的表達(參見例如yamane-ohnuki等人,biotechbioeng87,614-622(2004);niwa等人,jimmunolmethods306,151-160(2006))。

在一個實施方案中，本發(fā)明提供了可通過本發(fā)明方法獲得的vnar，例如如上所公開的vnar，其可以是如上所公開的vnari型、ii型或iv型。在一個實施方案中，本發(fā)明還提供了編碼如上所公開的本發(fā)明vnar或vnar融合蛋白的多核苷酸或載體。用于本發(fā)明方法或本發(fā)明融合蛋白的術語載體或表達載體是指能夠染色體外復制的核酸分子。優(yōu)選的載體是能夠自主復制和表達與其連接的核酸的載體。能夠指導與其可操作連接的基因的表達的載體在本文中稱為“表達載體”。通常，用于重組dna技術中的表達載體通常是“質?！钡男问?，其通常是指環(huán)狀雙鏈dna環(huán)，其以其載體形式不與染色體結合。在真核細胞中表達本發(fā)明融合蛋白或本發(fā)明vnar所必需的核酸序列包含例如至少一個啟動子，和增強子、終止和聚腺苷酸化信號以及選擇性標記，諸如例如抗生素耐藥性?？捎糜诒磉_本發(fā)明vnar或vnar融合蛋白的表達載體可以例如包含pcmv、pcdna、p4x3、p4x4、p4x5、p4x6、pvl1392、pvl1393、pacyc177、prs420，或者(如果使用基于病毒的載體系統(tǒng))例如pbabepuro、pwpxl、pxp-衍生的載體。

在一個實施方案中，本發(fā)明提供了包含如上所公開的多核苷酸序列或載體(例如，包含如本文所公開的本發(fā)明vnar或本發(fā)明融合蛋白的編碼序列的多核苷酸或載體或表達載體)的宿主細胞。例如，用于本發(fā)明的宿主細胞可以是酵母細胞、昆蟲細胞或哺乳動物細胞。例如，本發(fā)明的宿主細胞可以是選自sf9、sf21、s2、hi5或bti-tn-5b1-4細胞的昆蟲細胞，或者例如本發(fā)明的宿主細胞可以是選自以下的酵母細胞：釀酒酵母(saccharomycescerevisiae)、多形漢遜酵母(hansenulapolymorpha)、粟酒裂殖酵母(schizosaccharomycespombe)、許旺酵母(schwanniomycesoccidentalis)、乳酸克魯維酵母(kluyveromyceslactis)、解脂耶氏酵母(yarrowialipolytica)和巴斯德畢赤酵母(pichiapastoris)，或者例如本發(fā)明的宿主細胞可以是選自以下的哺乳動物細胞：hek293、hek293t、hek293e、hek293f、ns0、per.c6、mcf-7、hela、cos-1、cos-7、pc-12、3t3、vero、vero-76、pc3、u87、saos-2、lncap、du145、a431、a549、b35、h1299、huvec、jurkat、mda-mb-231、mda-mb-468、mda-mb-435、caco-2、cho、cho-k1、cho-b11、cho-dg44、bhk、age1.hn、namalwa、wi-38、mrc-5、hepg2、l-929、rab-9、sirc、rk13、11b11、1d3、2.4g2、a-10、b-35、c-6、f4/80、iec-18、l2、mh1c1、nrk、nrk-49f、nrk-52e、rmc、cv-1、bt、mdbk、cpae、mdck.1、mdck.2和d-17。

在一個實施方案中，本發(fā)明提供了用于生產(chǎn)如本文所公開的本發(fā)明vnar或vnar融合蛋白的方法，其中本發(fā)明方法包括以下步驟：在足以使本發(fā)明vnar或vnar融合蛋白蛋白表達的條件下培養(yǎng)至少一種如上所公開的本發(fā)明的宿主細胞，以及分離和純化本發(fā)明vnar蛋白或vnar融合蛋白。例如，可使本發(fā)明的宿主細胞在含有10%fbs的dmem中生長，并在37℃下在10%co2中孵育，或例如在無蛋白培養(yǎng)基中孵育以利于隨后的分離和純化，或例如在grace昆蟲培養(yǎng)基、expressfive?sfm(lifetechnologies)或highfive?培養(yǎng)基(lifetechnologies)、ynm培養(yǎng)基、ypd液體培養(yǎng)基或例如pichiapink(lifetechnologies)中孵育。

可例如使本發(fā)明的宿主細胞生長12-408小時，例如約12-約400小時，例如14小時、16小時、18小時、20小時、24小時、36小時、48小時、72小時、96小時-約120小時、144小時、168小時、192、216小時、240小時、264小時、288小時、312小時、336小時、360小時、384小時、408小時。隨后，可分離并純化本發(fā)明vnar或本發(fā)明融合蛋白。例如，可通過層析法，例如離子交換層析法、大小排阻層析法、硫酸銨沉淀或超濾，分離并純化本發(fā)明的蛋白。例如，本發(fā)明vnar或本發(fā)明融合蛋白還可以包含信號序列，其是指能夠使例如通過肽鍵與之可操作連接的多肽穿入宿主細胞的內質網(wǎng)(er)的氨基酸序列。信號肽一般被內肽酶(例如特異性定位于er的信號肽酶)切割掉以釋放(成熟的)多肽。信號肽的長度范圍通常為約10-約40個氨基酸。

在一個實施方案中，本發(fā)明還提供了多核苷酸文庫，其包含多個編碼本發(fā)明的hv2結構域的多核苷酸。本發(fā)明的術語“多核苷酸文庫”或“多個多核苷酸”表示至少兩個不同dna序列的文庫或集合，其至少編碼本發(fā)明hv2結構域，或例如其編碼包含本發(fā)明hv2結構域的vnari型、ii型或iv型之一。例如，所述多核苷酸文庫包含至少1000個不同的dna序列，更優(yōu)選至少10⁴、10⁵、10⁶或至少100、1000或約10³至約10⁷個不同的dna序列，其編碼本發(fā)明hv2結構域。優(yōu)選地，本發(fā)明的多核苷酸文庫包含多個編碼總體結構fw1-cdr1-fw2-hv2-fw3a-hv4-fw3b-cdr3-fw的i型、ii型或iv型vnar結構域的多核苷酸。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了根據(jù)seqidno:2、seqidno:4、seqidno:5的雙特異性vnar分子。

在一個實施方案中，本發(fā)明涉及本發(fā)明vnar或本發(fā)明vnar融合蛋白在制備藥物中的用途。因此，本發(fā)明vnar蛋白或本發(fā)明vnar融合蛋白可以例如用于制備藥物，例如，配制成施用于有需要的個體。本發(fā)明的創(chuàng)造性藥物可以例如為可注射液體、膠囊、錠劑、用于重構的冷凍干燥制劑，并且可以包含例如約0.01mg/ml至約25mg/ml本發(fā)明vnar蛋白或本發(fā)明vnar融合蛋白，或約0.02mg/ml至約20mg/ml、或約0.075mg/ml至約17.5mg/ml、或約0.1mg/ml、0.25mg/ml、0.5mg/ml、0.75mg/ml、1mg/ml、1.5mg/ml、2mg/ml、2.5mg/ml、3mg/ml、3.5mg/ml、3.75mg/ml、4mg/ml、4.25mg/ml、4.5mg/ml、5mg/ml、5.5mg/ml、6mg/ml、6.5mg/ml、7mg/ml、7.5mg/ml、8mg/ml、9mg/ml、9.5mg/ml、10mg/ml、10.5mg/ml、11mg/ml、11.5ml/ml、12mg/ml、12.5mg/ml、12.75mg/ml、13mg/ml、14mg/ml、14.5mg/ml、15mg/ml至約16mg/ml、17mg/ml、18mg/ml、19mg/ml、20mg/ml、21mg/ml、22mg/ml、23mg/ml、24mg/ml、25mg/ml、或例如約26mg/ml至約50mg/ml、例如27mg/ml、28mg/ml、29mg/ml、30mg/ml、31mg/ml、32mg/ml、33mg/ml、34mg/ml、35mg/ml、36mg/ml、37mg/ml、38mg/ml、39mg/ml、40mg/ml、41mg/ml、42mg/ml、43mg/ml、44mg/ml、45mg/ml、46mg/ml、47mg/ml、48mg/ml、49mg/ml、50mg/ml、或例如0.001mg/ml至約0.009mg/ml。

在一個實施方案中，本發(fā)明提供了藥物組合物，其包含如本文所公開的本發(fā)明vnar或vnar融合蛋白和藥學上可接受的載體或稀釋劑。在本發(fā)明的藥物組合物的上下文中，藥學上可接受的載體是指藥學上可接受的材料、組合物或媒介物，諸如液體或固體填充劑、稀釋劑、賦形劑、溶劑或包封材料，諸如脂質體、聚乙二醇(peg)、聚乙二醇化脂質體、納米顆粒等，其參與將主題組合物或治療劑從身體的一個器官或部分攜帶或運輸至身體的另一個器官或部分。每種載體在與制劑的其他成分相容且對患者無害的意義上必須是“可接受的”?？梢猿洚斔帉W上可接受的載體的材料的一些實例包括例如，糖類，諸如乳糖、葡萄糖和蔗糖；或例如淀粉類，諸如玉米淀粉和馬鈴薯淀粉；或例如纖維素及其衍生物，諸如羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素和乙酸纖維素；或例如明膠；或例如賦形劑，諸如可可脂和栓劑蠟；或例如油類，諸如花生油、棉籽油、紅花油、芝麻油、橄欖油、玉米油和大豆油；或例如二醇類，諸如丙二醇；或例如多元醇類，諸如甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；或例如酯類，諸如油酸乙酯和月桂酸乙酯；或例如還可以使用以下物質：等滲鹽水或緩沖(水)溶液，例如磷酸鹽、檸檬酸鹽等，緩沖溶液、含水緩沖溶液，其含有例如鈉鹽，優(yōu)選至少50mm的鈉鹽、鈣鹽，優(yōu)選至少0.01mm的鈣鹽和/或鉀鹽，優(yōu)選至少3mm的鉀鹽。根據(jù)一個優(yōu)選實施方案，鈉、鈣和/或鉀鹽可以以其鹵化物(例如，氯化物、碘化物或溴化物)的形式、其氫氧化物、碳酸鹽、碳酸氫鹽或硫酸鹽等的形式存在。不限于此，鈉鹽的實例包括例如nacl、nai、nabr、na2co3、nahco3、na2so4，任選的鉀鹽的實例包括例如kcl、ki、kbr、k2co3、khco3、k2so4，鈣鹽的實例包括例如cacl2、cai2、cabr2、caco3、caso4、ca(oh)2。此外，上述陽離子的有機陰離子可以包含在本發(fā)明的組合物中。根據(jù)一個更優(yōu)選實施方案，如上所定義的適用于注射目的的本發(fā)明組合物可以含有選自氯化鈉(nacl)、氯化鈣(cacl2)和任選氯化鉀(kcl)的鹽，其中還可存在除氯化物以外的其他陰離子。cacl2還可以被另一鹽如kcl替代。本發(fā)明的組合物可以是相對于特定參考介質高滲、等滲或低滲的，即本發(fā)明的藥物組合物可以具有相對于特定參考介質更高、相同或更低的鹽含量，其中優(yōu)選地，可以使用此類濃度的上述鹽，其不會由于滲透或其他濃縮效應而導致細胞損傷。參考介質是例如以“體內”方法存在的液體，諸如血液、淋巴、胞質溶膠液體或其他體液，或例如液體，其可以在“體外”方法中用作參考介質，諸如常見的緩沖液或液體。此類常見的緩沖液或液體是技術人員已知的。

在一個實施方案中，本發(fā)明涉及治療患有病理病況的有需要的個體的方法，其包括向有需要的人施用如本文所公開的本發(fā)明藥物組合物。例如，本發(fā)明治療方法可以包括向患有病理病況的有需要的人施用約0.001mg/kg至約50mg/kg本發(fā)明藥物組合物，或約0.005mg/kg至約45mg/kg、或約0.01mg/kg至約40mg/kg、或約0.05mg/kg至約35mg/kg、或約0.1mg/kg、0.5mg/kg、0.75mg/kg、1mg/kg、1.5mg/kg、2mg/kg、2.5mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、5mg/kg、6mg/kg、7mg/kg、8mg/kg、9mg/kg、10mg/kg、12.5mg/kg、15mg/kg、17.5mg/kg、20mg/kg、22.5mg/kg、25mg/kg至約26mg/kg、27mg/kg、28mg/kg、29mg/kg、30mg/kg、32.5mg/kg、35mg/kg、37.5mg/kg、40mg/kg、42.5mg/kg、45mg/kg。如所用，術語“mg/kg”是指mg本發(fā)明藥物組合物/kg本發(fā)明中的體重。可以通過本發(fā)明方法治療的病理病況可以是癌癥、自身免疫疾病或病毒感染。如本發(fā)明治療方法的上下文中使用的術語“癌癥”是指由細胞的異常、不受控制的生長引起的多種病況，例如被稱為“癌細胞”的能夠引起癌癥的細胞具有特征性特性，諸如不受控制的增殖、永生化、轉移潛力，快速生長和增殖速度，和/或某些典型的形態(tài)特征。癌細胞可以是例如腫瘤的形式，但此類細胞也可以單獨存在于受試者內，或者可以是非致瘤性癌細胞。如本發(fā)明治療方法的上下文中使用的術語癌癥可以例如是指前列腺癌、乳腺癌、腎上腺癌、白血病、淋巴瘤、骨髓瘤、瓦爾登斯特倫氏巨球蛋白血癥、單克隆丙種球蛋白病、良性單克隆丙種球蛋白病、重鏈疾病、骨和結締組織肉瘤、腦腫瘤、甲狀腺癌、胰腺癌、垂體癌、眼癌、陰道癌、外陰癌、子宮頸癌、子宮癌、卵巢癌、食管癌、胃癌、結腸癌、直腸癌、肝癌、膽囊癌、膽管癌、肺癌、睪丸癌、陰莖癌(penalcancer)、口腔癌、皮膚癌、腎癌、wilms氏腫瘤和膀胱癌。在本發(fā)明治療方法的上下文中，術語自身免疫疾病可以例如是指系統(tǒng)性紅斑狼瘡(sle)、格雷夫斯病、i型和ii型糖尿病、多發(fā)性硬化癥、干燥綜合征、硬皮病、腎小球腎炎、移植排斥反應，例如器官和組織同種異體移植物和異種移植物排斥反應和移植物抗宿主病。如本發(fā)明治療方法的上下文中使用的術語“病毒感染”是指特征在于細胞的病毒轉化、病毒復制和增殖的異常狀態(tài)或病況，諸如例如，皰疹家族病毒、水痘帶狀皰疹病毒(vzv)、eb病毒(ebv)、巨細胞病毒(cmv)等感染。根據(jù)一個優(yōu)選實施方案，待通過如本文公開的本發(fā)明方法治療的個體是人。

在一個實施方案中，本發(fā)明提供了部件試劑盒，其包含如上文所公開的本發(fā)明vnar或vnar融合蛋白以及用于檢測的裝置。因此，本發(fā)明部件試劑盒可以例如包含本發(fā)明vnar或vnar融合蛋白，其呈穩(wěn)定形式諸如例如，凍干的，或作為液體制劑，使得本發(fā)明vnar或vnar融合蛋白足夠穩(wěn)定用于儲存，例如，用于在4℃-10℃下或在環(huán)境溫度下儲存例如至少1-12周，或例如至少1-6個月，或例如至少2-12個月，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11個月。本發(fā)明試劑盒還可以包含用于檢測本發(fā)明vnar蛋白或本發(fā)明vnar融合蛋白的裝置，諸如例如量子點，可檢測標記的抗體，諸如抗體-酶復合物，或與熒光標記偶聯(lián)的抗體。

如本發(fā)明試劑盒的上下文中或如上面公開的本發(fā)明方法的上下文中使用的術語量子點是指半導體材料的單個球狀納米晶體，其中納米晶體的半徑小于或等于該半導體材料的激子玻爾半徑的大小(激子玻爾半徑的值可從存在于以下含有有關半導體性質信息的手冊中的數(shù)據(jù)計算，諸如crchandbookofchemistryandphysics,第83版,lide,davidr.(編輯),crcpress,bocaraton,fla.(2002))。量子點是本領域已知的，因為它們描述于以下參考文獻中，諸如weller,angew.chem.int.ed.engl.32:41-53(1993)；alivisatos,j.phys.chem.100:13226-13239(1996)；以及alivisatos,science271:933-937(1996)。量子點可為例如約1nm-約1000nm直徑，例如10nm、20nm、30nm、40nm、50nm、60nm、70nm、80nm、90nm、100nm、150nm、200nm、250nm、300nm、350nm、400nm、450nm或500nm、優(yōu)選至少約2nm-約50nm、更優(yōu)選qd的直徑為至少約2nm-約20nm(例如約2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20nm)。qd的特征在于其基本均一的納米大小，常常顯示約10%-15%多分散性或大小范圍。qd在激發(fā)后能夠發(fā)射電磁輻射(即qd是光致發(fā)光的)，且包括一種或多種第一半導體材料的“核”，且可被第二半導體材料的“殼”包繞。被半導體殼包繞的qd核稱為“核/殼”qd。包“殼”材料將優(yōu)選具有大于核心材料的帶隙能(bandgapenergy)的帶隙能，并可選擇為具有接近于“核”基質的原子間距的原子間距。核和/或殼可為半導體材料，包括但不限于第ii-vi族(zns、znse、znte、us、cdse、cdte、hgs、hgse、hgte、mgs、mgse、mgte、cas、case、cate、srs、srse、srte、bas、base、bate等)和第iii-v族(gan、gap、gaas、gasb、inn、inp、inas、insb等)和第iv族(ge、si等)材料的那些、pbs、pbse及其合金或混合物。優(yōu)選的殼材料包括zns。

可以例如用于本發(fā)明用于標記抗體的試劑盒(其可以用于檢測本發(fā)明vnar或vnar融合蛋白)的術語“熒光標記”或“熒光染料”或“熒光團”是指在規(guī)定激發(fā)波長下吸收光能并在不同波長下發(fā)射光能的部分?？捎糜诒景l(fā)明中的熒光標記的實例包括但不限于：丹酰氯、dapoxyl、二烷基氨基香豆素、異硫氰酸羅丹明、alexa350、alexa430、alexafluor488、alexafluor532、alexafluor546、alexafluor568、alexafluor594、alexafluor633、alexafluor660、alexafluor680、amca、氨基吖啶、bodipy630/650、bodipy650/665、bodipy-fl、bodipy-r6g、bodipy-tmr、bodipy-trx、bodipyfl、bodipyr6g、bodipytmr、bodipytr、bodipy530/550、bodipy558/568、bodipy564/570、bodipy576/589、bodipy581/591、bodipy630/650、bodipy650/665)、羧基羅丹明6g、羧基-x-羅丹明(rox)、cascade藍、cascade黃、香豆素343、花青染料(cy3、cy5、cy3.5、cy5.5)、丹酰(dansyl)、dapoxyl、二烷基氨基香豆素、4',5'-二氯-2',7'-二甲氧基-熒光素、dm-nerf、伊紅、赤蘚紅、熒光素、fam、羥基香豆素、irdyes(ird40、ird700、ird800)、joe、麗絲胺羅丹明b、marina藍、甲氧基香豆素、naphtho熒光素、oregon綠488、oregon綠500、oregon綠514、pacific藍、pympo、5-羧基-4',5'-二氯-2',7'-二甲氧基熒光素、5-羧基-2',4',5',7'-四氯熒光素、5-羧基熒光素、5-羧基羅丹明、6-羧基羅丹明、6-羧基四甲基氨基、cascade藍、cy2、cy3、cy5,6-fam、丹酰氯、熒光素、hex、6-joe、nbd(7-硝基苯并-2-氧雜-l,3-二唑)、oregon綠488、oregon綠500、oregon綠514、pacific藍、酞酸、對苯二甲酸、間苯二甲酸、甲酚固紫(cresylfastviolet)、甲酚藍紫(cresylblueviolet)、亮甲酚藍、對氨基苯甲酸、赤蘚紅、酞菁、偶氮甲堿、花青、黃嘌呤、琥珀酰熒光素、稀土金屬穴狀絡合物、三聯(lián)吡啶二胺銪(europiumtrisbipyridinediamine)、銪穴狀化合物或螯合物、二胺、雙花青、lajolla藍染料、別藻藍蛋白(allopycocyanin)、allococyaninb、藻青蛋白c、藻青蛋白r、硫胺、藻紅青素、藻紅蛋白r、reg、羅丹明綠、異硫氰酸羅丹明、羅丹明紅、tamra、tet、trit(四甲基羅丹明異硫醇(tetramethylrhodamineisothiol))、四甲基羅丹明或德克薩斯紅。例如，本發(fā)明試劑盒可以用于檢測樣品諸如例如組織活檢樣品、或石蠟切片、組織培養(yǎng)物或體液中如上所公開的癌細胞表面抗原。所述樣品可以例如源自患有病理病況的患者，其中從患者獲得樣品不形成本發(fā)明的一部分。

要理解，本發(fā)明不限于本文所述具體的方法、方案和試劑，因為這些可變化。還要理解，本文所用術語僅用于描述具體實施方案的目的，并無意限制僅受隨附權利要求書限制的本發(fā)明的范圍。除非另有說明，否則本文所用的所有技術和科學術語具有本領域普通技術人員通常理解的相同含義。

實施例

實施例1：用于酵母展示的片段生成的soepcr

為了生成用于酵母表面展示的插入片段，使用來自epcam特異性結合劑5005的質粒dna作為起始材料。平行實施兩次pcr反應，以生成用作第3次pcr的起始材料的兩個dna-片段(參見圖11)。pcr-條件如下：92℃持續(xù)30秒，[92℃持續(xù)30秒，52℃30秒，72℃30秒]x30，隨后72℃持續(xù)5分鐘。對于第3次pcr，將片段a和片段b(參見圖11)以1:1摩爾比(各約50ng)混合并用作模板。在上述pcr-運行的6個循環(huán)后，添加寡核苷酸pct_seq_up和pct_seq_lo以得到具有隨機化hv2編碼區(qū)的最終pcr產(chǎn)物，其被用作用于文庫生成的插入材料。

實施例2：文庫生成

為了生成具有高序列多樣性的酵母文庫，根據(jù)benatuil等人,proteinengdessel2010;23:155-9的方案進行釀酒酵母的轉化。使用釀酒酵母菌株eby100的過夜培養(yǎng)物，將100mlypd培養(yǎng)基接種至od600=0.3，繼續(xù)孵育，直到達到od600=1.6的細胞密度。經(jīng)由以3000rpm離心5分鐘來將細胞與培養(yǎng)基分離。在進一步過程中，將細胞用50ml冰冷水洗滌兩次，并用電穿孔緩沖液洗滌兩次，隨后在30℃下在以180rpm振蕩下，在20ml鋰緩沖液中調節(jié)酵母細胞30分鐘。在用電穿孔緩沖液洗滌最后一個步驟之后，將細胞沉淀重懸浮于100-200μl電穿孔緩沖液中，導致1ml的最終體積，并保持在冰上。

對于每個電穿孔反應，在冷轉化比色皿中將1μg消化的載體骨架和3μgdna插入物與400μl電感受態(tài)細胞混合。電穿孔(u=2.5kv；c=25μf；r<200ω；時間脈沖=5ms)之后，立即添加8ml1m山梨糖醇:ypd培養(yǎng)基的1:1混合物，然后在30℃下以180rpm孵育1小時。在最后一次離心步驟之后，將細胞重懸浮于sdcaa培養(yǎng)基中并孵育兩天。通過在sdcaa板上劃出連續(xù)稀釋的細胞，可以在三天后從菌落計數(shù)測定文庫大小。如果需要更多的電感受態(tài)細胞來制備較大文庫，則將細胞培養(yǎng)和制備按比例放大。

sgcaa培養(yǎng)基：2%(w/v)半乳糖，0.17%(w/v)酵母氮堿，0.5%(w/v)酪蛋白氨基酸，0.5%(w/v)硫酸銨，10%w/v聚乙二醇8000，38mmna2hpo4，62mmnah2po4?h2o[ph7.4]。

實施例3：釀酒酵母中基因表達的誘導

用pct載體轉化的酵母細胞(參見實施例2)用于細胞分選實驗。因為在半乳糖啟動子的控制下，在載體中編碼鯊魚抗體變體，所以可以通過將培養(yǎng)基從含有葡萄糖的培養(yǎng)基更換為含有半乳糖的sgcaa培養(yǎng)基來進行基因表達的誘導。因此，將相應體積的酵母過夜培養(yǎng)物的細胞沉降(14000u/分鐘；2分鐘)，并用于將搖瓶中的50–1000mlsgcaa培養(yǎng)基接種至od600=0.5的細胞密度，在20℃下孵育時間為至少1天。

sgcaa培養(yǎng)基：2%(w/v)半乳糖，0.17%(w/v)酵母氮堿，0.5%(w/v)酪蛋白氨基酸，0.5%(w/v)硫酸銨，10%w/v聚乙二醇8000，38mmna2hpo4，62mmnah2po4?h2o[ph7.4]。

實施例4：用于facs的細胞染色和facs分析

使酵母細胞在sgcaa培養(yǎng)基中生長過夜，并沉淀并用pbs洗滌一次。然后將細胞在足夠體積的1μmepcam中孵育。15分鐘后，再次用pbs洗滌細胞，并添加cd3ε-生物素(1μm)。孵育30-60分鐘后，再次洗滌細胞。使用pe-標記的抗epcam-抗體檢測epcam-結合。使用生物素化的cd3ε和鏈霉抗生物素蛋白-apc或使用his-標記的cd3ε和alexaflur-標記的五his抗體檢測cd3ε-結合。與二級試劑的孵育在冰上實施5分鐘。在用pbs重復洗滌后，將酵母細胞進行二維facs分選(a維：epcam-結合；b維：cd3ε-結合)。類似于此，還實施篩選以選擇針對epcam和人fc的雙特異性結合劑。此處使用his-標記的epcam和alexaflur-標記的五his抗體檢測epcam結合。使用pe-標記的抗人抗體檢測與人fc的結合。

熒光-活化的細胞分選

熒光-活化的細胞分選使用moflocytomation裝置進行，并經(jīng)由summit4.3分析。該裝置能夠測量含有單個細胞的微滴的熒光。通過使用在488nm和640nm發(fā)射光的兩種激光，平行測量單個酵母細胞上的vnar表面呈遞和靶蛋白結合的熒光強度是可能的。在開始細胞分選程序之前，使用熒光標記的珠粒來調整分選裝置的激光。此外，進行液滴-延遲，以確定應當分析的含有細胞的微滴的位置。對于每個分選輪，設置分選門控，其定義應當分選出的細胞的熒光特性。分選門控的設置通常允許0.1％假陽性細胞，如在抗原不存在的情況下通過對照染色所判斷。

在本工作中用于細胞分選實驗的moflo裝置的參數(shù)：

側面散射：650(lin模式)

fl1：650(log模式)

fl2：600(log模式)

fl3：640(log模式)

板的電荷：2,500v

事件率5,000-30,000個事件/s

樣品壓力：60.1psi

鞘壓力：59psi

噴嘴直徑：70μm

分選模式：分選純化1。

在細胞分選后，通過分析已經(jīng)分選的細胞的一小部分來測定分選效率。然后，使細胞在30℃下在sdcaa板上生長2天，隨后用于誘導細胞表面呈遞，用于以下分選輪。對于每個分選輪，在板上孵育后，將分選出的10倍過量的細胞懸浮于10％甘油中，用于低溫保存。

使用的sdcaa培養(yǎng)基包含：2%(w/v)葡萄糖，0.17%(w/v)酵母氮堿，0.5%(w/v)酪蛋白氨基酸，0.5%(w/v)硫酸銨，38mmna2hpo4，62mmnah2po4?h2o[ph7.4]。facs結果顯示于圖6、7和9中。

序列表

<110>merckpatentgmbh

<120>用于生成雙特異性鯊魚可變抗體結構域的方法及其用途

<130>p14/207

<160>11

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>27

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>用于hv2結構域的隨機化的寡核苷酸

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(3)

<223>第一個密碼子(nnn)可以是除tgt、tgc以外的任何密碼子，

其中在50%中，可以存在密碼子tta、ttg、ctt、ctc、cta、ctg之一

<220>

<221>misc_feature

<222>(4)..(24)

<223>可以存在除taa、tga、tag以外的任何密碼子

<220>

<221>misc_feature

<222>(25)..(27)

<223>最后一個密碼子(nnn)可以是除tgt、tgc以外的任何密碼子，

其中在50%中，可以存在密碼子act、acc、aca、acg之一

<400>1

nnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn27

<210>2

<211>110

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>vnar克隆b1氨基酸序列

<400>2

metalaalaargleugluglnthrprothrthrthrthrlysgluala

151015

glygluserleuthrileasncysvalleulysproglutrpthrile

202530

leuglyargthrtyrtrptyrphethrlyslysglythralaphelys

354045

ileglylystrpmetglyglyargtyrseraspthrlysasnthrala

505560

serlysserleuserleuargileseraspleuargvalgluaspser

65707580

glythrtyrhiscysglualaleuiletyrseraspmetglymetile

859095

mettrplysilegluglyglyglythrthrvalthrvallys

100105110

<210>3

<211>110

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>親本vnar克隆5005

<400>3

metalaalaargleugluglnthrprothrthrthrthrlysgluala

151015

glygluserleuthrileasncysvalleulysproglutrpthrile

202530

leuglyargthrtyrtrptyrphethrlyslysglyalathrlyslys

354045

alaargleuserthrglyglyargtyrseraspthrlysasnthrala

505560

serlysserleuserleuargileseraspleuargvalgluaspser

65707580

glythrtyrhiscysglualaleuiletyrseraspmetglymetile

859095

mettrplysilegluglyglyglythrthrvalthrvallys

100105110

<210>4

<211>110

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>vnarepha2-fc

<400>4

metalaalaargleugluglnthrprothrthrthrthrlysgluala

151015

glygluserleuthrileasncysvalleulysproglutrpthrile

202530

leuglyargthrtyrtrptyrphethrlyslysglylysleuasngly

354045

arglysleuarglysglyglyargtyrseraspthrlysasnthrala

505560

serlysserleuserleuargileseraspleuargvalgluaspser

65707580

glythrtyrhiscysglualaleuiletyrseraspmetglymetile

859095

mettrplysilegluglyglyglythrthrvalthrvallys

100105110

<210>5

<211>109

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>epha2_4_fc

<400>5

metalaalaargleugluglnthrprothrthrthrthrlysgluala

151015

glygluserleuthrileasncysvalleulysproglutrpthrile

202530

leuglyargthrtyrtrptyrphethrlyslysglythrargargleu

354045

lysasnleulysthrglyglyargtyrseraspthrlysasnthrala

505560

serlysserleuserleuargileseraspleuargvalgluaspser

65707580

glythrtyrhiscysglualaleuiletyrsermetglymetilemet

859095

trplysilegluglyglyglythrthrvalthrvallys

100105

<210>6

<211>15

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>生物素-受體肽

<400>6

glyleuasnaspilepheglualaglnlysileglutrphisglu

151015

<210>7

<211>7

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>actev位點

<400>7

gluasnleutyrpheglngly

15

<210>8

<211>68

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸hv2rand_up

<220>

<221>misc_feature

<223>在位置22-24的第一個密碼子(nnn)可以是除tgt、tgc以外的任何密碼子，

其中在50%中，可以存在密碼子tta、ttg、ctt、ctc、cta、ctg之一

<220>

<221>misc_feature

<223>在位置22-24的第一個密碼子(nnn)可以是除tgt、tgc以外的任何密碼子，

其中在50%中，可以存在密碼子tta、ttg、ctt、ctc、cta、ctg之一

<220>

<221>misc_feature

<223>在位置45-47的最后一個簡并密碼子(nnn)可以是除tgt、tgc以外的任何密碼子，

其中在50%中，可以存在密碼子act、acc、aca、acg之一

<220>

<221>misc_feature

<223>在23-44的簡并密碼子(nnn)可以編碼任何氨基酸

<220>

<221>misc_feature

<222>(22)..(47)

<223>n是a、c、g或t

<400>8

tggtatttcacaaagaagggcnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnggcggacgatact60

cggacaca68

<210>9

<211>27

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>pct-seq-lo

<400>9

gcgcgctaacggaacgaaaaatagaaa27

<210>10

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>pct-seq-up

<400>10

aggacaatagctcgacgattg21

<210>11

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>hv2rand_soe-lo

<400>11

gcccttctttgtgaaatacca21