本發(fā)明涉及利用了具有生產(chǎn)順式-5-羥基-l-哌可酸的能力的酶的順式-5-羥基-l-哌可酸的制造方法。

背景技術(shù)：

順式-5-羥基-l-哌可酸(以下有時(shí)稱為“5oh-pa”)是作為藥品的中間體等而有用的化合物。已知順式-5-羥基-l-哌可酸可以利用生物學(xué)方法由l-哌可酸進(jìn)行制造。

已經(jīng)報(bào)道了百脈根中慢生根瘤菌(mesorhizobiumloti)maff303099來源的bab52605蛋白質(zhì)、苜蓿中華根瘤菌(sinorhizobiummeliloti)1021來源的cac47686蛋白質(zhì)(以下有時(shí)稱為“smph”)具有將l-脯氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)轫樖?4-羥基脯氨酸的能力(專利文獻(xiàn)1)。

bab52605蛋白質(zhì)雖然具有將l-哌可酸轉(zhuǎn)變?yōu)轫樖?5-羥基-l-哌可酸的能力，但據(jù)報(bào)道，其生產(chǎn)率比較低(專利文獻(xiàn)2)。

雖然報(bào)道了cac47686蛋白質(zhì)也具有將l-哌可酸轉(zhuǎn)變?yōu)轫樖?5-羥基-l-哌可酸的能力，但其在由l-哌可酸生產(chǎn)順式-5-羥基-l-哌可酸的同時(shí)，還生產(chǎn)出幾乎等量的順式-3-羥基哌可酸(以下有時(shí)稱為“3oh-pa”)(專利文獻(xiàn)2)。

另外，專利文獻(xiàn)2中報(bào)道了表達(dá)由segniliparusrugosusatccbaa-974來源的efv12517蛋白質(zhì)的注釋的更上游的48個(gè)堿基(相當(dāng)于16個(gè)氨基酸)所表達(dá)的多核苷酸(cis基因)編碼的蛋白質(zhì)(以下有時(shí)稱為“sruph”)的大腸桿菌具有l(wèi)-哌可酸的順式-5位羥化酶活性，能夠?qū)-哌可酸轉(zhuǎn)變?yōu)轫樖?5-羥基-l-哌可酸。但是，如本說明書的實(shí)施例中所示，該蛋白質(zhì)在由l-哌可酸生產(chǎn)順式-5-羥基-l-哌可酸的同時(shí)，生產(chǎn)出約2％的順式-3-羥基哌可酸。

專利文獻(xiàn)3中報(bào)道了由l-哌可酸生產(chǎn)順式-5-羥基-l-哌可酸的方法。在專利文獻(xiàn)3中報(bào)道了，為了抑制不需要的順式-3-羥基哌可酸的生產(chǎn)而改變了smph的基因，但即使改變smph的基因，也會(huì)生產(chǎn)出約9％的順式-3-羥基哌可酸。

在非專利文獻(xiàn)1中也報(bào)道了smph由l-哌可酸生產(chǎn)順式-5-羥基-l-哌可酸和順式-3-羥基哌可酸。在非專利文獻(xiàn)1中報(bào)道了，為了提高順式-5-羥基-l-哌可酸的生產(chǎn)率而改變了smph基因，但即使改變smph基因，也會(huì)生產(chǎn)出約4％的順式-3-羥基哌可酸。

現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)

專利文獻(xiàn)

專利文獻(xiàn)1：wo2009/139365

專利文獻(xiàn)2：wo2013/187438

專利文獻(xiàn)3：wo2013/169725

非專利文獻(xiàn)

非專利文獻(xiàn)1：koketsu等、acssynth.biol,doi:10.1021/sb500247a

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

發(fā)明所要解決的問題

由此可見，雖然利用生物學(xué)方法由l-哌可酸制造順式-5-羥基-l-哌可酸的方法是已知的，但每種方法的順式-5-羥基-l-哌可酸的生產(chǎn)率均低，并且，會(huì)一定程度地生產(chǎn)出順式-3-羥基-l-哌可酸。因此，作為要求高純度的藥品的中間體等的制造方法，期望更高效地制造高純度的順式-5-羥基-l-哌可酸的方法。

本發(fā)明的課題在于提供順式-3-羥基-l-哌可酸的生成少、更高效地制造光學(xué)純度高的順式-5-羥基-l-哌可酸的新方法。

用于解決問題的手段

本發(fā)明人們?yōu)榱私鉀Q上述問題進(jìn)行了深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，xenorhabdusdoucetiaefrm16株來源的蛋白質(zhì)(以下有時(shí)稱為“xdph”)和xenorhabdusromaniistr.pr06-a株來源的蛋白質(zhì)(以下有時(shí)稱為“xrph”)具有高的l-哌可酸的順式-5位羥化酶活性。而且發(fā)現(xiàn)，通過使用編碼這些蛋白質(zhì)的dna制作轉(zhuǎn)化體并使該轉(zhuǎn)化體細(xì)胞、其制備物和/或培養(yǎng)液與l-哌可酸發(fā)生作用，能夠以高光學(xué)純度及高濃度制造順式-5-羥基-l-哌可酸。本發(fā)明是基于這些發(fā)現(xiàn)而完成的。

即，本發(fā)明的主旨如下所述。

[1]一種順式-5-羥基-l-哌可酸的制造方法，其特征在于，使α-酮戊二酸依賴型l-哌可酸羥化酶、具有生產(chǎn)該酶的能力的微生物或細(xì)胞、該微生物或細(xì)胞的處理物、和/或?qū)υ撐⑸锘蚣?xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)而得到的含有該酶的培養(yǎng)液與l-哌可酸發(fā)生作用，生成順式-5-羥基-l-哌可酸，

上述α-酮戊二酸依賴型l-哌可酸羥化酶包含下述(a)、(b)或(c)所示的多肽：

(a)具有序列編號(hào)4或11所表示的氨基酸序列的多肽；

(b)具有在序列編號(hào)4或11所表示的氨基酸序列中缺失、置換和/或添加了1個(gè)或幾個(gè)氨基酸而得到的氨基酸序列、且具有α-酮戊二酸依賴型l-哌可酸羥化酶活性的多肽；或

(c)具有與序列編號(hào)4或11所表示的氨基酸序列具有60％以上的同一性的氨基酸序列、且具有α-酮戊二酸依賴型l-哌可酸羥化酶活性的多肽。

[2]如[1]所述的順式-5-羥基-l-哌可酸的制造方法，其中，編碼上述α-酮戊二酸依賴型l-哌可酸羥化酶的dna包含下述(d)、(e)或(f)所示的dna：

(d)具有序列編號(hào)1、9或10所表示的堿基序列的dna；

(e)包含在序列編號(hào)1、9或10所表示的堿基序列中置換、缺失和/或添加了1個(gè)或幾個(gè)堿基而得到的堿基序列、且編碼具有α-酮戊二酸依賴型l-哌可酸羥化酶活性的多肽的dna；或

(f)包含在嚴(yán)格條件下與序列編號(hào)1、9或10所表示的堿基序列的互補(bǔ)鏈雜交的堿基序列、且編碼具有α-酮戊二酸依賴型l-哌可酸羥化酶活性的多肽的dna。

[3]如[1]或[2]所述的順式-5-羥基-l-哌可酸的制造方法，其中，使α-酮戊二酸依賴型l-哌可酸羥化酶、具有生產(chǎn)該酶的能力的微生物或細(xì)胞、該微生物或細(xì)胞的處理物、和/或?qū)υ撐⑸锘蚣?xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)而得到的含有該酶的培養(yǎng)液在α-酮戊二酸和二價(jià)鐵離子的存在下與上述l-哌可酸發(fā)生作用。

[4]一種α-酮戊二酸依賴型l-哌可酸羥化酶蛋白質(zhì)，其具有與l-哌可酸發(fā)生作用而生成順式-5-羥基-l-哌可酸的活性，并且包含下述(a)、(b)或(c)所示的多肽：

(a)具有序列編號(hào)4或11所表示的氨基酸序列的多肽；

(b)具有在序列編號(hào)4或11所表示的氨基酸序列中缺失、置換和/或添加了1個(gè)或幾個(gè)氨基酸而得到的氨基酸序列、且具有α-酮戊二酸依賴型l-哌可酸羥化酶活性的多肽；或

(c)具有與序列編號(hào)4或11所表示的氨基酸序列具有60％以上的同一性的氨基酸序列、且具有α-酮戊二酸依賴型l-哌可酸羥化酶活性的多肽。

[5]一種多肽，其具有序列編號(hào)11所表示的氨基酸序列。

發(fā)明效果

根據(jù)本發(fā)明，能夠由l-哌可酸更高效地制造光學(xué)純度高的順式-5-羥基-l-哌可酸。此外，由于順式-3-羥基-l-哌可酸的生成少，因此在工業(yè)規(guī)模的制造中能夠以低成本制造高純度的順式-5-羥基-l-哌可酸。

附圖說明

圖1是示出導(dǎo)入有各種l-哌可酸羥化酶基因的大腸桿菌的sds-聚丙烯酰胺電泳法的結(jié)果的圖(電泳照片)。箭頭示出l-哌可酸羥化酶的條帶。

圖2是示出由導(dǎo)入有各種l-哌可酸羥化酶基因的大腸桿菌得到的反應(yīng)產(chǎn)物的分析結(jié)果的圖。

圖3是示出各種l-哌可酸羥化酶的活性的溫度依賴性的圖。

具體實(shí)施方式

以下，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。

本說明書中，“將l-哌可酸轉(zhuǎn)變?yōu)轫樖?5-羥基-l-哌可酸的能力”是指以α-酮戊二酸依賴的方式在l-哌可酸的5位碳原子上添加羥基的能力。

是否具有“將l-哌可酸轉(zhuǎn)變?yōu)轫樖?5-羥基-l-哌可酸的能力”例如可以通過如下方法進(jìn)行確認(rèn)：在含有l(wèi)-哌可酸作為底物、進(jìn)而含有α-酮戊二酸作為輔酶的反應(yīng)體系中，使作為測(cè)定對(duì)象的酶與l-哌可酸發(fā)生作用，直接測(cè)定由l-哌可酸轉(zhuǎn)變而來的順式-5-羥基-l-哌可酸的量。

另外，本說明書中的“酶”也包括純化酶(包括部分純化的酶)、使用公知的固定化技術(shù)固定化的酶、例如固定化于聚丙烯酰胺、卡拉膠等載體上的酶等。

本說明書中，“具有將l-哌可酸轉(zhuǎn)變?yōu)轫樖?5-羥基-l-哌可酸的能力的微生物或細(xì)胞”(以下有時(shí)稱為“本發(fā)明的微生物或細(xì)胞”)只要具有“能夠在l-哌可酸的5位碳原子上添加羥基的能力”，則沒有特別限制，可以是內(nèi)源性地具有上述能力的微生物或細(xì)胞，也可以是通過育種而賦予了上述能力的微生物或細(xì)胞。作為通過育種而賦予了上述能力的手段，可以采用基因重組處理(轉(zhuǎn)化)、突變處理等公知的方法。作為轉(zhuǎn)化的方法，可以使用導(dǎo)入目的基因、通過在染色體上改變啟動(dòng)子等表達(dá)調(diào)節(jié)序列等來強(qiáng)化目的基因的表達(dá)等方法。

需要說明的是，作為“微生物或細(xì)胞”的種類，可以列舉后述的宿主生物或宿主細(xì)胞中記載的微生物或細(xì)胞。另外，本說明書中，作為“具有能夠在l-哌可酸的5位碳原子上添加羥基的能力的微生物或細(xì)胞”，不限定于活的微生物或細(xì)胞，也包括作為生物體來說已死亡但仍具有酶能力的微生物或細(xì)胞。

本說明書中，作為“宿主生物”的生物的種類，沒有特別限定，可以列舉大腸桿菌、枯草桿菌、棒狀桿菌、假單胞菌屬細(xì)菌、芽孢桿菌屬細(xì)菌、根瘤菌屬細(xì)菌、乳桿菌屬細(xì)菌、琥珀酸桿菌屬細(xì)菌(サクシノバチルス屬細(xì)菌)、厭氧螺菌屬細(xì)菌、放線桿菌屬細(xì)菌等原核生物、酵母、絲狀真菌等菌類、植物、動(dòng)物等真核生物。其中，優(yōu)選為大腸桿菌、酵母、棒狀桿菌，特別優(yōu)選為大腸桿菌。

本說明書中，作為“宿主細(xì)胞”的細(xì)胞的種類，沒有特別限定，可以使用動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞等。

本說明書中，“表達(dá)載體”是指用于通過整合入編碼具有期望功能的蛋白質(zhì)的多核苷酸并導(dǎo)入宿主生物而在上述宿主生物中復(fù)制和表達(dá)具有期望功能的蛋白質(zhì)的遺傳因子?？梢粤信e例如質(zhì)粒、病毒、噬菌體、粘粒等，但不限定于此。優(yōu)選表達(dá)載體為質(zhì)粒。

本說明書中，“轉(zhuǎn)化體”是指使用上述表達(dá)載體等導(dǎo)入目的基因、從而變得能夠表現(xiàn)出與具有期望功能的蛋白質(zhì)相關(guān)的期望性狀的微生物或細(xì)胞。

本說明書中，“微生物或細(xì)胞的處理物”是指下述物質(zhì)等：對(duì)微生物或細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)并將該微生物或細(xì)胞1)利用有機(jī)溶劑等進(jìn)行處理而得到的含有具有期望功能的蛋白質(zhì)的物質(zhì)、2)進(jìn)行冷凍干燥而得到的含有具有期望功能的蛋白質(zhì)的物質(zhì)、3)固定化于載體等中而得到的含有具有期望功能的蛋白質(zhì)的物質(zhì)、4)利用物理方法或利用酶破壞而得到的含有具有期望功能的蛋白質(zhì)的物質(zhì)。

本說明書中，“對(duì)微生物或細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)而得到的含有酶的培養(yǎng)液”是指，1)微生物或細(xì)胞的培養(yǎng)液、2)利用有機(jī)溶劑等對(duì)微生物或細(xì)胞的培養(yǎng)液進(jìn)行處理而得到的培養(yǎng)液、3)利用物理方法或利用酶將微生物或細(xì)胞的細(xì)胞膜破壞而得到的培養(yǎng)液。

<使用α-酮戊二酸依賴型l-哌可酸羥化酶的順式-5-羥基-l-哌可酸的制造方法>

本發(fā)明的順式-5-羥基-l-哌可酸的制造方法的特征在于，使α-酮戊二酸依賴型l-哌可酸羥化酶、具有生產(chǎn)該酶的能力的微生物或細(xì)胞、該微生物或細(xì)胞的處理物、和/或?qū)υ撐⑸锘蚣?xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)而得到的含有該酶的培養(yǎng)液與l-哌可酸發(fā)生作用。如后所述，本發(fā)明的制造方法優(yōu)選在α-酮戊二酸和二價(jià)鐵離子的存在下進(jìn)行。

本發(fā)明中使用的α-酮戊二酸依賴型l-哌可酸羥化酶(以下有時(shí)稱為“本發(fā)明的l-哌可酸羥化酶”)將l-哌可酸羥化時(shí)的位置選擇性和立體選擇性高，因此，通過使用該酶，能夠高效地得到光學(xué)純度高的順式-5-羥基-l-哌可酸。

本發(fā)明的α-酮戊二酸依賴型l-哌可酸羥化酶只要是具有將l-哌可酸轉(zhuǎn)變?yōu)轫樖?5-羥基-l-哌可酸的能力的酶則沒有特別限制，優(yōu)選為具有序列編號(hào)4或11記載的氨基酸序列的酶、或?yàn)樵摪被嵝蛄械耐次锴揖哂笑?酮戊二酸依賴型l-哌可酸羥化酶活性的酶。即，本發(fā)明的l-哌可酸羥化酶優(yōu)選為包含下述(a)、(b)或(c)所示的多肽的酶。

(a)具有序列編號(hào)4或11所表示的氨基酸序列的多肽；

(b)具有在序列編號(hào)4或11所表示的氨基酸序列中缺失、置換和/或添加了1個(gè)或幾個(gè)氨基酸而得到的氨基酸序列、且具有α-酮戊二酸依賴型l-哌可酸羥化活性的多肽；或

(c)具有與序列編號(hào)4或11所表示的氨基酸序列具有60％以上的同一性的氨基酸序列、且具有α-酮戊二酸依賴型l-哌可酸羥化活性的多肽。

作為本發(fā)明中可使用的、具有序列編號(hào)4或11記載的氨基酸序列的α-酮戊二酸依賴型l-哌可酸羥化酶的同源物，如上述(b)所述，只要保持α-酮戊二酸依賴型l-哌可酸羥化活性，可以列舉具有在序列編號(hào)4或11記載的氨基酸序列中缺失、置換或添加了1個(gè)或幾個(gè)氨基酸而得到的氨基酸序列的同源物。在此，“1個(gè)或幾個(gè)氨基酸”例如為1個(gè)～100個(gè)、優(yōu)選為1個(gè)～50個(gè)、更優(yōu)選為1個(gè)～20個(gè)、進(jìn)一步優(yōu)選為1個(gè)～10個(gè)、特別優(yōu)選為1個(gè)～5個(gè)氨基酸。

另外，作為上述同源物，如上述(c)所述，只要保持α-酮戊二酸依賴型l-哌可酸羥化活性，也可以為與序列編號(hào)4或11所示的氨基酸序列全長(zhǎng)具有至少60％以上、優(yōu)選80％以上、更優(yōu)選90％以上、進(jìn)一步優(yōu)選95％、特別優(yōu)選99％以上的序列同一性的蛋白質(zhì)。

序列編號(hào)4記載的氨基酸序列是基于xenorhabdusdoucetiaefrm16株的公知的基因組信息而得到的氨基酸序列。

序列編號(hào)11記載的氨基酸序列是基于利用使用pcr的公知方法從xenorhabdusromaniistr.pr06-a株克隆化而得的基因信息而得到的氨基酸序列。

包含序列編號(hào)4或11的氨基酸序列及其同源物的本發(fā)明的l-哌可酸羥化酶可選擇性地將l-哌可酸的5位碳原子羥化，因此能夠以高效率生成順式-5-羥基-l-哌可酸。

需要說明的是，在本發(fā)明的制造方法中，也可以并用多個(gè)α-酮戊二酸依賴型l-哌可酸羥化酶。

本發(fā)明中可使用的α-酮戊二酸依賴型l-哌可酸羥化酶可以由xenorhabdusdoucetiaefrm16株或xenorhabdusromaniistr.pr06-a株純化得到，也可以通過對(duì)于編碼α-酮戊二酸依賴型l-哌可酸羥化酶的dna利用pcr、雜交等公知的方法將該基因克隆化、并使其在適當(dāng)?shù)乃拗髦羞M(jìn)行表達(dá)而得到。

作為編碼具有序列編號(hào)4或11所示的氨基酸序列的α-酮戊二酸依賴型l-哌可酸羥化酶的dna，可以分別列舉包含序列編號(hào)1、9或10的堿基序列的dna，只要編碼具有α-酮戊二酸依賴型l-哌可酸羥化活性的蛋白質(zhì)，也可以為包含序列編號(hào)1、9或10的堿基序列的dna的同源物。即，作為本發(fā)明的編碼l-哌可酸羥化酶的dna，可以列舉下述(d)、(e)或(f)所示的堿基序列。

(d)具有序列編號(hào)1、9或10所表示的堿基序列的dna；

(e)包含在序列編號(hào)1、9或10所表示的堿基序列中置換、缺失和/或添加了1個(gè)或幾個(gè)堿基而得到的堿基序列、且編碼具有α-酮戊二酸依賴型l-哌可酸羥化活性的多肽的dna；或

(f)包含在嚴(yán)格條件下與序列編號(hào)1、9或10所表示的堿基序列的互補(bǔ)鏈雜交的堿基序列、且編碼具有α-酮戊二酸依賴型l-哌可酸羥化活性的多肽的dna。

作為同源物，可以列舉例如如上述(e)所述包含在序列編號(hào)1、9或10的堿基序列中置換、缺失或添加1個(gè)或幾個(gè)堿基而得到的堿基序列的dna。在此所述的1個(gè)或幾個(gè)堿基例如為1個(gè)～300個(gè)、優(yōu)選為1個(gè)～150個(gè)、更優(yōu)選為1個(gè)～60個(gè)、進(jìn)一步優(yōu)選為1個(gè)～30個(gè)、特別優(yōu)選為1個(gè)～15個(gè)堿基。

需要說明的是，序列編號(hào)1是為了用于大腸桿菌表達(dá)而對(duì)編碼序列編號(hào)4的氨基酸序列的xenorhabdusdoucetiaefrm16株的基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化而得到的堿基序列。這樣根據(jù)作為轉(zhuǎn)化對(duì)象的宿主的不同對(duì)密碼子進(jìn)行了優(yōu)化的dna當(dāng)然也包含在本發(fā)明中可使用的編碼α-酮戊二酸依賴型l-哌可酸羥化酶的dna中。

此外，作為上述dna的同源物，如上述(f)所述，只要編碼具有α-酮戊二酸依賴型l-哌可酸羥化活性的蛋白質(zhì)，可以為在嚴(yán)格條件下與序列編號(hào)1、9或10的堿基序列的互補(bǔ)鏈雜交的dna。在此，“在嚴(yán)格條件下雜交的堿基序列”是指使用dna作為探針，通過在嚴(yán)格條件下利用菌落雜交法、噬菌斑雜交法或southern印記雜交法等而得到的dna的堿基序列。作為嚴(yán)格條件，可以列舉例如下述條件：在菌落雜交法和噬菌斑雜交法中，使用固定有來源于菌落或噬菌斑的dna或該dna的片段的過濾器，在0.7mol/l～1.0mol/l的氯化鈉水溶液的存在下、在65℃進(jìn)行雜交后，使用0.1～2×ssc溶液(1×ssc的組成為150mmol/l氯化鈉水溶液、15mmol/l檸檬酸鈉水溶液)，在65℃的條件下對(duì)過濾器進(jìn)行清洗。

各雜交可以基于molecularcloning:alaboratorymannual(分子克隆實(shí)驗(yàn)指南),第2版,冷泉港實(shí)驗(yàn)室,冷泉港,紐約,1989.等記載的方法進(jìn)行。

本領(lǐng)域技術(shù)人員可以通過使用定點(diǎn)突變法(nucleicacidsres.10,pp.6487(1982)、methodsinenzymol.100,pp.448(1983)、molecularcloning、pcrapracticalapproachirlpresspp.200(1991))等在序列編號(hào)1、9或10的dna中適當(dāng)導(dǎo)入置換、缺失、插入和/或添加突變而得到如上所述的dna同源物。

另外，也可以基于序列編號(hào)4或11的氨基酸序列或其一部分、序列編號(hào)1、9或10所表示的堿基序列或其一部分，對(duì)例如dnadatabankofjapan(日本dna數(shù)據(jù)庫(kù))(ddbj)等數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源性檢索而獲得α-酮戊二酸依賴型l-哌可酸羥化酶的氨基酸信息或編碼該酶的dna的堿基序列信息。

在本發(fā)明的羥基-l-哌可酸的制造方法中，可以將α-酮戊二酸依賴型l-哌可酸羥化酶直接用于反應(yīng)，但優(yōu)選使用含有α-酮戊二酸依賴型l-哌可酸羥化酶的微生物或細(xì)胞、該微生物或細(xì)胞的處理物、和/或?qū)υ撐⑸锘蚣?xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)而得到的含有該酶的培養(yǎng)液。

作為含有α-酮戊二酸依賴型l-哌可酸羥化酶的微生物或細(xì)胞，可以使用原本就具有α-酮戊二酸依賴型l-哌可酸羥化酶的微生物或細(xì)胞，但優(yōu)選使用利用編碼α-酮戊二酸依賴型l-哌可酸羥化酶的基因進(jìn)行了轉(zhuǎn)化的微生物或細(xì)胞。

另外，作為含有α-酮戊二酸依賴型l-哌可酸羥化酶的微生物或細(xì)胞的制備物，例如可以使用將該微生物或細(xì)胞用丙酮、二甲亞砜(dmso)、甲苯等有機(jī)溶劑、表面活性劑進(jìn)行處理而得到的制備物、進(jìn)行冷凍干燥處理而得到的制備物、利用物理方法或利用酶進(jìn)行破碎而得到的制備物等微生物或細(xì)胞的制備物、將微生物或細(xì)胞中的酶級(jí)分以粗制物或純化物的形式取出而得到的制備物、以及將這些制備物固定于以聚丙烯酰胺凝膠、卡拉膠等為代表的載體上而得到的制備物等。

作為對(duì)含有α-酮戊二酸依賴型l-哌可酸羥化酶的微生物或細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)而得到的培養(yǎng)液，例如可以使用該微生物或細(xì)胞與液體培養(yǎng)基的混懸液，在該微生物或細(xì)胞為分泌表達(dá)型微生物或細(xì)胞的情況下，可以使用通過離心分離等除去該微生物或細(xì)胞后而得到的上清或其濃縮物。

通過將如上所述分離出的編碼α-酮戊二酸依賴型l-哌可酸羥化酶的dna以可表達(dá)的方式插入到公知的表達(dá)載體中，可提供α-酮戊二酸依賴型l-哌可酸羥化酶表達(dá)載體。然后，通過利用該表達(dá)載體對(duì)宿主細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化，能夠得到導(dǎo)入有編碼α-酮戊二酸依賴型l-哌可酸羥化酶的dna的轉(zhuǎn)化體。轉(zhuǎn)化體也可以通過利用同源重組等方法將編碼α-酮戊二酸依賴型l-哌可酸羥化酶的dna以可表達(dá)的狀態(tài)整合到宿主的染色體dna中而得到。

作為轉(zhuǎn)化體的制作方法，具體而言，可以例示下述方法：將編碼α-酮戊二酸依賴型l-哌可酸羥化酶的dna導(dǎo)入到在微生物等宿主細(xì)胞中穩(wěn)定存在的質(zhì)粒載體、噬菌體載體、病毒載體中并將所構(gòu)建的表達(dá)載體導(dǎo)入到該宿主細(xì)胞中，或者直接將該dna導(dǎo)入到宿主基因組中，對(duì)其遺傳信息進(jìn)行轉(zhuǎn)錄、翻譯。此時(shí)，優(yōu)選在宿主中在dna的5’-側(cè)上游連接適當(dāng)?shù)膯?dòng)子，更優(yōu)選進(jìn)一步在3’-側(cè)下游連接終止子。作為這樣的啟動(dòng)子和終止子，只要是已知在用作宿主的細(xì)胞中發(fā)揮功能的啟動(dòng)子和終止子則沒有特別限定，例如，在“微生物學(xué)基礎(chǔ)講座8基因工程、共立出版”等中詳細(xì)記載了在宿主微生物中可利用的載體、啟動(dòng)子和終止子。

作為用于表達(dá)α-酮戊二酸依賴型l-哌可酸羥化酶的作為轉(zhuǎn)化對(duì)象的宿主微生物，只要宿主本身不會(huì)對(duì)l-哌可酸的反應(yīng)造成不利影響則沒有特別限定，具體可以列舉如下所示的微生物。

屬于埃希氏菌(escherichia)屬、芽孢桿菌(bacillus)屬、假單胞菌(pseudomonas)屬、沙雷氏菌(serratia)屬、短桿菌(brevibacterium)屬、棒狀桿菌(corynebacterium)屬、鏈球菌(streptococcus)屬、乳桿菌(lactobacillus)屬等的已建立了宿主載體系統(tǒng)的細(xì)菌。

屬于紅球菌(rhodococcus)屬、鏈霉菌(streptomyces)屬等的已建立了宿主載體系統(tǒng)的放線菌。屬于酵母菌(saccharomyces)屬、克魯維酵母(kluyveromyces)屬、裂殖酵母(schizosaccharomyces)屬、接合酵母(zygosaccharomyces)屬、解脂耶氏酵母菌(yarrowia)屬、絲孢酵母菌(trichosporon)屬、紅冬孢酵母(rhodosporidium)屬、漢遜酵母(hansenula)屬、畢赤酵母(pichia)屬、念珠菌(candida)屬等已建立了宿主載體系統(tǒng)的酵母。

屬于脈孢菌(neurospora)屬、曲霉(aspergillus)屬、頭孢霉(cephalosporium)屬、木霉(trichoderma)屬等的已建立了宿主載體系統(tǒng)的霉菌。

用于轉(zhuǎn)化體制作的程序、適合于宿主的重組載體的構(gòu)建和宿主的培養(yǎng)方法可以基于分子生物學(xué)、生物工程、基因工程的領(lǐng)域中慣用的技術(shù)來進(jìn)行(例如，molecularcloning(分子克隆)中記載的方法)。

以下，具體地列舉優(yōu)選的宿主微生物、各微生物的優(yōu)選轉(zhuǎn)化方法、載體、啟動(dòng)子、終止子等的示例，但本發(fā)明不限定于這些示例。

在埃希氏菌屬、特別是大腸桿菌(escherichiacoli)中，作為質(zhì)粒載體，可以列舉pbr、puc系質(zhì)粒等，可以列舉lac(β-半乳糖苷酶)、trp(色氨酸操縱子)、tac、trc(lac、trp的融合)、λ噬菌體pl、pr等來源的啟動(dòng)子等。另外，作為終止子，可以列舉trpa來源、噬菌體來源、rrnb核糖體rna來源的終止子等。

在芽孢桿菌屬中，作為載體，可以列舉pub110系質(zhì)粒、pc194系質(zhì)粒等，另外，也可以整合到染色體中。作為啟動(dòng)子和終止子，可以利用堿性蛋白酶、中性蛋白酶、α-淀粉酶等的酶基因的啟動(dòng)子、終止子等。

在假單胞菌屬中，作為載體，可以列舉在惡臭假單胞菌(pseudomonasputida)、洋蔥假單胞菌(pseudomonascepacia)等中建立的通常的宿主載體系統(tǒng)、參與甲苯化合物的分解的質(zhì)粒、以tol質(zhì)粒為基礎(chǔ)的廣宿主載體(包含來源于rsf1010等的自主復(fù)制所需的基因)pkt240(gene,26,273-82(1983))等。

在短桿菌屬、特別是乳糖發(fā)酵短桿菌(brevibacteriumlactofermentum)中，作為載體，可以列舉paj43(gene39,281(1985))等質(zhì)粒載體。作為啟動(dòng)子和終止子，可以利用在大腸桿菌中使用的各種啟動(dòng)子和終止子。

在棒狀桿菌屬、特別是谷氨酸棒桿菌(corynebacteriumglutamicum)中，作為載體，可以列舉pcs11(日本特開昭57-183799號(hào)公報(bào))、pcb101(mol.gen.genet.196,175(1984))等質(zhì)粒載體。

在酵母菌(saccharomyces)屬、特別是釀酒酵母菌(saccharomycescerevisiae)中，作為載體，可以列舉yrp系、yep系、ycp系、yip系質(zhì)粒等。另外，可以利用醇脫氫酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、酸性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、磷酸甘油酸激酶、烯醇酶等各種酶基因的啟動(dòng)子、終止子。

在裂殖酵母(schizosaccharomyces)屬中，作為載體，可以列舉mol.cell.biol.6,80(1986)中記載的粟酒裂殖酵母來源的質(zhì)粒載體等。特別是paur224由寶生物株式會(huì)社銷售，可以容易地利用。

在曲霉(aspergillus)屬中，黑曲霉(aspergillusniger)、米曲霉(aspergillusoryzae)等在霉菌中研究得最多，可用于向質(zhì)粒、染色體中整合，可以利用菌體外蛋白酶、淀粉酶來源的啟動(dòng)子(trendsinbiotechnology7,283-287(1989))。

另外，除了上述以外，已建立了適應(yīng)于各種微生物的宿主載體系統(tǒng)，可以適當(dāng)使用這些宿主載體系統(tǒng)。

另外，除了微生物以外，在植物、動(dòng)物中也建立了各種宿主、載體系統(tǒng)，特別是建立了在昆蟲(例如蠶)等動(dòng)物中(nature315,592-594(1985))、菜籽、玉米、土豆等植物中大量表達(dá)異種蛋白質(zhì)的系統(tǒng)、使用大腸桿菌無細(xì)胞提取液或小麥胚芽等的無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)的系統(tǒng)，可以適當(dāng)利用。

在本發(fā)明的制造方法中，通過使α-酮戊二酸依賴型l-哌可酸羥化酶、具有生產(chǎn)該酶的能力的微生物或細(xì)胞、該微生物或細(xì)胞的處理物、和/或?qū)υ撐⑸锘蚣?xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)而得到的含有該酶的培養(yǎng)液在α-酮戊二酸的存在下與作為反應(yīng)底物的l-哌可酸發(fā)生作用，能夠制造順式-5-羥基-l-哌可酸。

本發(fā)明的制造方法只要使α-酮戊二酸、以及α-酮戊二酸依賴型l-哌可酸羥化酶、具有生產(chǎn)該酶的能力的微生物或細(xì)胞、該微生物或細(xì)胞的處理物、和/或?qū)υ撐⑸锘蚣?xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)而得到的含有該酶的培養(yǎng)液與l-哌可酸發(fā)生作用，則沒有特別限制，但通常優(yōu)選在水性介質(zhì)中或該水性介質(zhì)與有機(jī)溶劑的混合物中進(jìn)行。本發(fā)明的制造方法優(yōu)選進(jìn)一步在二價(jià)鐵離子的存在下進(jìn)行。

作為上述水性介質(zhì)，可以列舉例如水或緩沖液。

另外，作為上述有機(jī)溶劑，可以使用甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇、1-丁醇、叔丁醇等醇類溶劑、丙酮、二甲亞砜等反應(yīng)底物的溶解度高的溶劑。另外，作為上述有機(jī)溶劑，也可以使用對(duì)除去反應(yīng)副產(chǎn)物等有效的乙酸乙酯、乙酸丁酯、甲苯、氯仿、正己烷等。

作為反應(yīng)底物的l-哌可酸通常在底物濃度為0.01％w/v～90％w/v、優(yōu)選為0.1％w/v～30％w/v的范圍內(nèi)使用。反應(yīng)底物可以在反應(yīng)開始時(shí)一次性添加，但從減少存在酶的底物抑制時(shí)的影響的觀點(diǎn)和提高產(chǎn)物的蓄積濃度的觀點(diǎn)出發(fā)，優(yōu)選連續(xù)地或間歇地添加。

α-酮戊二酸通常在與底物為等摩爾或更多、優(yōu)選為等摩爾～1.2倍摩爾的范圍內(nèi)添加。α-酮戊二酸可以在反應(yīng)開始時(shí)一次性添加，但從減少對(duì)酶具有抑制作用時(shí)的影響的觀點(diǎn)和提高產(chǎn)物的蓄積濃度的觀點(diǎn)出發(fā)，優(yōu)選連續(xù)地或間歇地添加。另外，也可以添加葡萄糖等宿主可代謝的廉價(jià)的化合物來代替α-酮戊二酸，使宿主進(jìn)行代謝，將該過程中產(chǎn)生的α-酮戊二酸用于反應(yīng)。

本發(fā)明的制造方法優(yōu)選在二價(jià)鐵離子的存在下進(jìn)行。二價(jià)鐵離子通常優(yōu)選在0.01mmol/l～100mmol/l、優(yōu)選在0.1mmol/l～10mmol/l的范圍內(nèi)使用。二價(jià)鐵離子可以以硫酸鐵等的形式在反應(yīng)開始時(shí)一次性添加，但在反應(yīng)中添加的二價(jià)鐵離子被氧化為三價(jià)、形成沉淀而減少的情況下，追加添加也是有效的。另外，在本發(fā)明的l-哌可酸羥化酶、具有生產(chǎn)該酶的能力的微生物或細(xì)胞、該微生物或細(xì)胞的處理物、和/或?qū)υ撐⑸锘蚣?xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)而得到的含有該酶的培養(yǎng)液中已經(jīng)含有足夠量的二價(jià)鐵離子的情況下，也不是一定要進(jìn)行添加。

反應(yīng)在通常為4℃～60℃、優(yōu)選為15℃～45℃、特別優(yōu)選為20℃～40℃的反應(yīng)溫度下在通常為ph3～ph11、優(yōu)選為ph5～ph8下進(jìn)行。反應(yīng)時(shí)間通常為約1小時(shí)～約72小時(shí)。

關(guān)于向反應(yīng)液中添加的微生物或細(xì)胞、該微生物或細(xì)胞的處理物、和/或?qū)υ撐⑸锘蚣?xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)而得到的含有該酶的培養(yǎng)液的量，例如在添加細(xì)胞的情況下，按照該細(xì)胞的濃度以濕菌體重量計(jì)通常為約0.1％w/v～約50％w/v、優(yōu)選為1％w/v～20％w/v的方式添加到反應(yīng)液中，在使用處理物的情況下，求出酶的比活性，以添加后達(dá)到上述細(xì)胞濃度的量進(jìn)行添加。

通過本發(fā)明的制造方法生成的羥基-l-哌可酸可以通過在反應(yīng)結(jié)束后利用離心分離、膜處理等對(duì)反應(yīng)液中的菌體、蛋白質(zhì)等進(jìn)行分離、然后將利用1-丁醇、叔丁醇等有機(jī)溶劑進(jìn)行的萃取、蒸餾、使用離子交換樹脂或硅膠等的柱層析、等電點(diǎn)晶析或利用一鹽酸鹽、二鹽酸鹽、鈣鹽等進(jìn)行的晶析等適當(dāng)組合而進(jìn)行純化。

[實(shí)施例]

以下，利用實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)地對(duì)本發(fā)明進(jìn)行說明，但本發(fā)明并不限定于此。

實(shí)施例1

α-酮戊二酸依賴型哌可酸羥化酶基因的克隆

由dna2.0公司人工合成了編碼xenorhabdusdoucetiaefrm16株來源的推測(cè)的l-脯氨酸順式-4-羥化酶xdph(genbank登錄號(hào)cdg16639、序列編號(hào)4)的為了用于大腸桿菌表達(dá)而進(jìn)行了密碼子優(yōu)化的基因序列(xdph_ecodon、序列編號(hào)1)，插入到pjexpress411(dna2.0)中，制作成質(zhì)粒pj411xdph。

同樣地，也進(jìn)行了公知的顯示出哌可酸5位羥化活性的代表性的酶基因的克隆。由dna2.0公司人工合成了編碼segniliparusrugosusnbrc101839株來源的l-哌可酸順式-5-羥化酶sruph(genbank登錄號(hào)efv12517、序列編號(hào)6)和苜蓿中華根瘤菌(sinorhizobiummeliloti)1021株來源的l-脯氨酸順式-4-羥化酶smph(genbank登錄號(hào)cac47686、序列編號(hào)5)的、為了用于大腸桿菌表達(dá)而進(jìn)行了密碼子優(yōu)化的基因序列sruph_ecodon(序列編號(hào)3)和smph_ecodon(序列編號(hào)2)，分別插入到pjexpress411(dna2.0)和pjexpress401中，制作成質(zhì)粒pj411sruph、pj401smph。合成針對(duì)smph_ecodon的引物smph_f(序列編號(hào)7)和smph_r(序列編號(hào)8)，使用它們以質(zhì)粒dna為模板按照常規(guī)方法進(jìn)行pcr反應(yīng)，得到約1.0kbp的dna片段。利用限制性內(nèi)切酶ndei、hindiii對(duì)所得到的dna片段進(jìn)行消化，按照常規(guī)方法與利用ndei、hindiii消化后的pet24a(novagen)連接，由此分別得到pet24smph。

實(shí)施例2

α-酮戊二酸依賴型哌可酸羥化酶基因表達(dá)菌體的獲取和表達(dá)量的確認(rèn)

接著，使用所得到的各質(zhì)粒按照常規(guī)方法對(duì)大腸桿菌(escherichiacoli)bl21(de3)(invitrogen制)進(jìn)行轉(zhuǎn)化，得到重組大腸桿菌bl21(de3)/pj411xdph、bl21(de3)/pj411sruph、bl21(de3)/pet24smph。為了得到表達(dá)所導(dǎo)入的基因的菌體，對(duì)于各重組大腸桿菌，使用含有卡那霉素和lac啟動(dòng)子誘導(dǎo)物質(zhì)的液體lb培養(yǎng)基在28℃下培養(yǎng)4小時(shí)～6小時(shí)后，在15℃下進(jìn)一步培養(yǎng)約40小時(shí)，然后收集菌體。

將所得到的重組大腸桿菌以濁度od630為約10的方式懸浮到ph7的50mmol/lmes(2-嗎啉乙磺酸)緩沖液中。在冰上對(duì)該懸浮液0.5ml進(jìn)行超聲波破碎處理，然后以12000rpm的轉(zhuǎn)速進(jìn)行離心分離，由此分離成上清和殘?jiān)?。將所得到的上清作為可溶性?jí)分，將殘?jiān)鳛椴蝗苄约?jí)分。

按照常規(guī)方法對(duì)所得到的可溶性級(jí)分和不溶性級(jí)分進(jìn)行處理后，利用sds-聚丙烯酰胺電泳法確認(rèn)所表達(dá)的蛋白質(zhì)表達(dá)量。將結(jié)果示于圖1。

實(shí)施例3

α-酮戊二酸依賴型哌可酸羥化酶的活性確認(rèn)

在塑料管內(nèi)將5mmol/ll-哌可酸、10mmol/lα-酮戊二酸、1mmol/ll-抗壞血酸、0.5mmol/l硫酸鐵、以及以約2mg/ml的蛋白質(zhì)濃度添加有實(shí)施例2中得到的各粗制酶液的液體0.2ml在30℃下振蕩1小時(shí)。

利用1-氟-2,4-二硝基苯基-5-l-丙氨酰胺(fdaa)使反應(yīng)產(chǎn)物形成衍生物，然后利用uplc‐ms(waters制)進(jìn)行分析。結(jié)果如圖2所示，確認(rèn)到由使用各粗制酶液進(jìn)行了反應(yīng)后的液體生成了與5-羥基哌可酸標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間5.3分鐘一致的化合物。各酶液顯示出的5-羥基哌可酸生成活性(u/g)以單位蛋白質(zhì)量(g)計(jì)分別算出為4.1u/g、8.9u/g、3.1u/g。此處的單位(u)表示在1分鐘內(nèi)生成1微摩爾的底物的能力。

另外，確認(rèn)到由smph反應(yīng)產(chǎn)物生成了認(rèn)為是順式-3-羥基哌可酸的保留時(shí)間為6.0分鐘的化合物。將利用色譜圖上的羥基哌可酸峰的面積值對(duì)順式-3-羥基哌可酸在總羥基哌可酸量中所占的比例進(jìn)行比較的結(jié)果示于表2。可知xdph反應(yīng)產(chǎn)物中僅生成了0.17％的順式-3-羥基哌可酸。

需要說明的是，利用hplc的羥基哌可酸的分析條件如下述表1所示。

實(shí)施例4

羥化反應(yīng)的溫度依賴性的確認(rèn)

為了確認(rèn)各酶反應(yīng)的溫度依賴性，將各羥化酶的粗制酶液在各種溫度下溫育1小時(shí)30分鐘后，測(cè)定在30℃下反應(yīng)1小時(shí)后的5-羥基哌可酸生成量。將所得到的結(jié)果以將各酶的最高活性值設(shè)為100(％)時(shí)的相對(duì)活性的形式示于圖3。

表1

a)lc的設(shè)定

b)洗脫條件

c)ms的條件

表2

實(shí)施例5

α-酮戊二酸依賴型哌可酸羥化酶基因的克隆

以xenorhabdusdoucetiaefrm16株及其近緣種xenorhabdusromaniistr.pr06-a株來源的染色體dna作為模板，使用擴(kuò)增推測(cè)的l-脯氨酸順式-4-羥化酶xdph基因(xdphori：genbank登錄號(hào)fo704550-xdd1_0936、序列編號(hào)9)的引物xdphfus-f(序列編號(hào)12)和xdphfus-r(序列編號(hào)13)，利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)分別擴(kuò)增出約1kbp的dna片段。使用in-fusionhd克隆試劑盒(寶生物株式會(huì)社制)按照常規(guī)方法將所得到的兩種dna片段插入到利用限制性內(nèi)切酶ncoi、hindiii消化后的pqe60(qiagen)中，分別得到pqexdphori、pqexrphori。

接著，使用所得到的各質(zhì)粒，按照常規(guī)方法對(duì)大腸桿菌(escherichiacoli)jm109進(jìn)行轉(zhuǎn)化，得到重組大腸桿菌jm109/pqexdphori和jm109/pqexrphori。按照常規(guī)方法對(duì)插入到pqe60中的基因序列進(jìn)行確認(rèn)，決定了xenorhabdusromaniistr.pr06-a株來源的氨基酸羥化酶的基因序列(xrph_ori、序列編號(hào)10)和氨基酸序列(xrph、序列編號(hào)11)。xrph相對(duì)于xdph具有99％的同一性。

為了得到表達(dá)所導(dǎo)入的基因的菌體，使用含有氨芐青霉素的液體lb培養(yǎng)基對(duì)各重組大腸桿菌培養(yǎng)一夜后，收集菌體。

在塑料管內(nèi)添加20mmol/ll-哌可酸、15mmol/lα-酮戊二酸、10mmol/l三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽(tcep)、0.5mmol/l硫酸鐵、10mmol/l檸檬酸鈉、1％nymeen、以及將由所得到的重組大腸桿菌jm109/pqexdphori、jm109/pqexrphori的培養(yǎng)液0.4ml得到的菌體用ph6.5的50mmol/l雙(2-羥乙基)亞氨基三(羥甲基)甲烷緩沖液懸浮而得到的液體0.2ml，制成總?cè)萘繛?ml的反應(yīng)液，使其在20℃下振蕩20小時(shí)。

使用accq·tag(waters公司制)使反應(yīng)后的液體形成衍生物后，以下述條件的hplc條件進(jìn)行分析，測(cè)定所生成的5-羥基-l-哌可酸。

柱：xbridgec185μm(2.1×150mm)(waters公司制)

洗脫液a：10mmol/l乙酸銨(ph5)

洗脫液b：甲醇(0～0.5分鐘0.5～18分鐘18～19分鐘19～29.5分鐘29.5～40分鐘40～43分鐘(60％))

流速：0.3ml/分鐘

檢測(cè)：熒光檢測(cè)器

溫度：30℃

將測(cè)定結(jié)果示于表3。確認(rèn)到不僅xenorhabdusdoucetiaefrm16株來源的羥化酶xdph保持了哌可酸5位羥化活性，xenorhabdusromaniistr.pr06-a株來源的羥化酶也保持了哌可酸5位羥化活性。

表3

序列表

<110>株式會(huì)社api（apicorporation）

<120>順式-5-羥基-l-哌可酸的制造方法（methodofproducingcis-5-hydroxy-l-pipecolicacid）

<130>ap351-15399

<150>jp2014-229685

<151>2014-11-12

<160>13

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>882

<212>dna

<213>artificalsequence

<220>

<223>xdph_ecodon

<400>1

atgatgagcgcaaaactgctggcaagcattgaattgaaccaagaacagatcgagcatgat60

ctgaatattgttggtagcgagatcctggacgtggcgtacagcgagtatgcgtgcggcaat120

tggggtaccattaccctgtggaaccacagcggcgatgctggcgaccagacgagccgcgaa180

tacgttggtcaggcccgtccgactgagctgggccagcaattagactgcattaatcagctg240

atccgtaacaatttcaacatcagcctgatcaagagcgtgcgcatcttccgtagctataac300

ggtggtgcgatctatccgcacattgactacttggaattcaaccaaggttttaagcgcgtg360

cacctggttctgaaatccgaccgttcatgtctgaatagcgaagagaacacggtttatcac420

atgctgcctggtgaagtgtggtttgtcgatggtcatagcgcgcactcggcgatgagcctg480

agccgtgtcggcaagtactcgctggtcctggactttgattctggcgccaaattcgaagat540

ctgtattctgagagccacaccctgtgtgttgataacctggagccggacattatccatgac600

cgccagccactgccgaccagcctgcgtgatagcctggcacacattgctgagcatgcggat660

gaattcaatatccaatccattctgttcctggccacccgttttcactttagctacgcagtg720

agcattcgtgagtacttccaactcctggacgagtgcttttctcgcaacccgtacaagtcc780

gttcgcgagcgttacgaagcgctgaaagacattttggtgcgtagcggttataccagccac840

aatgtcaatcatttcaacagcttgtccggtgtcacgatcggc882

<210>2

<211>843

<212>dna

<213>artificalsequence

<220>

<223>smph_ecodon

<400>2

atgagcacccattttctcggcaaggtaaagtttgatgaagcgcgtttggcagaggacttg60

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