與相關(guān)申請的交叉引用

本申請要求于2014年11月13日提交的美國臨時專利申請序列號62/079,227的權(quán)益，所述臨時專利申請通過引用以其整體結(jié)合到本文中。

發(fā)明背景

由于并發(fā)癥，流感(flu)的年度流行病和大流行在全球引起顯著的疾病負(fù)擔(dān)和超額死亡率。認(rèn)為接種flu疫苗是減輕流感引起的疾病負(fù)擔(dān)和死亡率以及預(yù)防未來在人類中大流行的最有效方式。當(dāng)前市場上存在兩種類型的flu疫苗，裂解疫苗（splitfluvaccine）和冷適應(yīng)減弱疫苗。兩種疫苗的缺陷早已得到公認(rèn)。當(dāng)前的裂解flu疫苗具有低免疫原性并且不能響應(yīng)于迅速出現(xiàn)的毒株，例如引起2009大流行的h1n1毒株，在短時間內(nèi)準(zhǔn)備好。對于裂解疫苗弱免疫原性已廣為人知，特別是在老年人和幼兒之中。另一方面，冷減弱疫苗僅允許在2-49歲的人群中使用。這些問題限制了flu疫苗對最需要它們的人群的益處。低成本、豐富和有效疫苗(能夠誘發(fā)更穩(wěn)健的免疫應(yīng)答)的快速生產(chǎn)對于流感，特別是幼兒和老人中的季節(jié)性流感的干預(yù)和預(yù)防是理想的。

自從1997年在香港出現(xiàn)人類感染禽h5n1病毒以來，人類感染禽流感病毒的其它亞型，包括h9n2、h7n7、h6n1、h7n9、h5n6和h10n8，已在家禽中傳播這些禽流感病毒亞型的國家報道。在這些新出現(xiàn)的流感病毒之中，至今已從16個國家鑒定了650例人類感染h5n1病毒，其中386例為致死的(參見，環(huán)球網(wǎng)站：who.int/influenza/human_animal_interface/en_gip_20140124cumulativenumberh5n1cases.pdfua=1)。最近，2013年h7n9病毒在中國的出現(xiàn)已導(dǎo)致450個人類病例，其中165例為致死的(http://www.who.int/influenza/human_animal_interface/influenza_h7n9/riskassessment_h7n9_27june14.pdf)。

在中國還報道了人類感染其它新的禽流感病毒亞型，例如h10n8和h5n6。令人擔(dān)心的是這些亞型中的一些可在人類中獲得進(jìn)一步的適應(yīng)或成為與季節(jié)性flu病毒的重配株并引起新的大流行。h1n12009大流行的經(jīng)歷顯示制備用于人類接種的疫苗從病毒出現(xiàn)到可用于公眾之前需要6個月以上。當(dāng)前的flu疫苗開發(fā)將不滿足大流行流感迅速傳播的性質(zhì)的需求。可以肯定未來將有新的大流行；然而，預(yù)測時間和病毒亞型是不可能的。

新的減弱活流感(flu)疫苗將滿足季節(jié)性和大流行疫苗的需求。與裂解或滅活疫苗相比減弱活flu疫苗具有若干優(yōu)點。第一，減弱活疫苗能夠在接受者中誘發(fā)更好的免疫應(yīng)答；第二，減弱活疫苗使用更少的疫苗免疫；最后，減弱活flu疫苗可通過鼻腔給予容易地應(yīng)用。

發(fā)明概述

開發(fā)新疫苗技術(shù)以滿足大流行預(yù)備狀態(tài)的需求極其重要。因此，本發(fā)明提供可快速和容易生產(chǎn)的減弱流感病毒和疫苗配方。

在一個方面，本發(fā)明提供包含遺傳上修飾的病毒基因組的減弱流感病毒。所述遺傳上修飾的病毒基因組包含非-結(jié)構(gòu)(ns1)編碼段中的中斷和基質(zhì)膜（matrixmembrane）蛋白編碼段中的一個或多個堿基置換。

在另一個方面，本發(fā)明提供包含減弱流感病毒和藥學(xué)上可接受的載體的疫苗配方，所述病毒包含病毒基因組的ns1編碼段中的中斷和病毒基因組的基質(zhì)膜蛋白編碼段中的一個或多個堿基置換。

在另一個方面，本發(fā)明提供用于產(chǎn)生減弱流感病毒的方法，包括：將中斷的流感病毒ns1基因編碼序列引入細(xì)胞或卵中；將流感病毒的基質(zhì)膜編碼序列引入細(xì)胞或卵中，其中所述基質(zhì)膜編碼序列包含一個或多個堿基置換并且所述細(xì)胞或卵包含產(chǎn)生流感病毒顆粒所需的其余流感病毒基因段和病毒蛋白；和培養(yǎng)細(xì)胞或卵，在其中減弱流感病毒被復(fù)制。

在又一個方面，本發(fā)明提供用于誘發(fā)對流感病毒的免疫應(yīng)答的方法，包括給予受試者有效量的包含經(jīng)基因工程改造的減弱流感病毒和藥學(xué)上可接受的載體的疫苗配方，其中所述經(jīng)基因工程改造的減弱流感病毒的基因組編碼中斷的ns1蛋白和一個或多個具有一個或多個錯義突變的基質(zhì)膜蛋白。

在所提供方面的一些實施方案中，ns1編碼段中的中斷為導(dǎo)致敲除所編碼的ns1蛋白的缺失。所述減弱流感病毒可從流感病毒毒株，例如但不限于h7n9、h1n1和h5n1產(chǎn)生。在所提供的病毒、配方和方法的一些實施方案中，所述堿基置換選自g917a置換、a14u置換和其組合。

本文所描述的方法和組合物可與藥學(xué)、醫(yī)學(xué)和獸醫(yī)應(yīng)用，以及基礎(chǔ)科學(xué)研究和方法學(xué)結(jié)合使用，如當(dāng)閱讀本公開內(nèi)容時將對技術(shù)人員顯而易見的。當(dāng)考慮附圖以及詳述時本發(fā)明的這些和其它對象、特征和優(yōu)勢將變得更清楚。

附圖簡述

為了更全面理解本發(fā)明的性質(zhì)，應(yīng)參考結(jié)合附圖所作的下列詳述。

圖1顯示證實與野生型(wsn-wt)相比ns1-del重組病毒(wsn-delns1)中ns1基因的缺失的dna瓊脂糖凝膠結(jié)果。

圖2顯示表明在細(xì)胞中若干傳代后ns1缺失的h1n1(a/wisconsin/1/33)毒株的m段中的置換的測序數(shù)據(jù)。在細(xì)胞中傳代h1n1ns1-del病毒并在傳代病毒穩(wěn)定后測序病毒基因組。在ns1-delh1n1病毒的m段中鑒定到單一置換，a14u。

圖3顯示表明在細(xì)胞中若干傳代后ns1缺失的h7n9病毒的m段中的置換的測序數(shù)據(jù)。在細(xì)胞中傳代h7n9ns1-del病毒并在傳代病毒穩(wěn)定后測序病毒基因組。在ns1-delh7n9病毒的m段中鑒定到單一置換，g917a。

圖4為顯示h1n1ns1-del和野生型h1n1病毒在vero細(xì)胞中的生長性質(zhì)的圖。評估h1n1ns1-del病毒的生長能力并與野生型病毒(wsn-wt)比較。wsn-delns1-m-wt、wsn-delns1-a14u和wsn-delns1-m-ca2為分別包含具有wt、a14u和ca2置換的m段的ns1缺失病毒。ca2用作參考毒株，因為其先前在pr8病毒中已有描述(wielink等人，2012,j.virol86(22):12341.)。在本實驗中，分別用wsnwt或多種ns1-缺失突變體(以0.001moi)感染vero細(xì)胞。使用mdck細(xì)胞通過噬菌斑測定在不同的時間點(感染后天數(shù))評估病毒滴度(pfu)。如圖中所示，我們發(fā)現(xiàn)wsn-delns1-a14u病毒在vero細(xì)胞中比delns1-m-wt和wsn-delns1-m-ca2復(fù)制更高的滴度。

圖5為顯示ns1-del和野生型h7n9病毒在vero細(xì)胞中的生長性質(zhì)的圖。評估h7n9ns1-del病毒(zj1-delns1-m-g917a)的生長能力并與野生型病毒(zj1-wt)比較。

圖6為顯示ns1-del病毒(wsn-delns1-m-a14u)不能抑制受感染細(xì)胞中干擾素β表達(dá)的圖。

圖7顯示表明與野生型m段(表示為wsn-delns1-m-wt)相比ns1-del病毒(表示為wsn-delns1-m-a14u)的m段中的突變增強(qiáng)m2但下調(diào)m3從m段轉(zhuǎn)錄的圖。

圖8顯示小鼠模型中ns1-del和野生型病毒的致病性檢驗的結(jié)果圖。按照說明用5x10⁴的每種病毒或3μg的裂解h7n9疫苗的接種物接種6只小鼠的組群。每日觀察小鼠的體重變化持續(xù)14天(第0天-第14天)。喪失超過其感染前體重的25%的動物依照動物倫理學(xué)的方案安樂死并計入致死性結(jié)果。

圖9顯示對于標(biāo)明的感染后天數(shù)小鼠中的平均體重變化百分?jǐn)?shù)的圖，其表明接種ns1-del疫苗保護(hù)小鼠免于h7n9病毒的致死劑量攻擊。從圖8中所示的實驗存活的小鼠然后用1x10⁵pfu的h7n9wt病毒攻擊。每日觀察小鼠的體重變化持續(xù)14天(第0天到第14天)。喪失超過其感染前體重的25%的動物依照動物倫理學(xué)的方案安樂死并計入致死性結(jié)果。截至h7n9病毒攻擊后實驗的第10天用pbs接種的所有小鼠死亡。用裂解疫苗接種的小鼠顯示明顯的體重喪失但能夠從感染恢復(fù)。用wsn-delnsa-m-a14u接種的小鼠在感染開始時顯示體重輕微下降并迅速恢復(fù)。用wth7n9病毒攻擊后在用h7n9-delns1-m-g917a或h7n9-delns1-m-g917a-a14u接種的小鼠之中未觀察到癥狀或體重喪失。

圖10顯示delns1h1n1病毒交叉保護(hù)高致病性禽h5n1病毒攻擊。小鼠用一劑(10⁴pfu)wsn-delns1-m-a14u、2009h1n1-delns1、2009h1n1-冷適應(yīng)病毒接種或用pbs模擬接種持續(xù)兩周，然后用100mld50的a/vietnam/1194/04h5n1病毒攻擊。h5n1病毒攻擊之后記錄小鼠的體重喪失(a)和(b)存活率持續(xù)14天。

圖11顯示delns1減弱活疫苗提供比冷適應(yīng)疫苗更好的對h5n1病毒的高劑量攻擊的交叉保護(hù)。小鼠用一劑(10⁴pfu)2009h1n1-delns1、h7n9de3ns1-g917a、2009h1n1-冷適應(yīng)病毒接種，或用pbs模擬接種，持續(xù)兩周然后用1000mld50的a/vietnam/1194/04h5n1病毒攻擊。h5n1病毒攻擊之后記錄小鼠的體重喪失(a)和(b)存活率持續(xù)14天。

圖12顯示穩(wěn)定wsn-delns1病毒的構(gòu)建和建立。(a)ns段轉(zhuǎn)錄物以及具有ns1缺失的ns突變體的示意圖。delns1質(zhì)粒通過缺失ns段中范圍為nt57-528的內(nèi)含子區(qū)構(gòu)建。ncr，非編碼區(qū)。(b)拯救的delns1病毒中ns1缺失的確認(rèn)。從p1病毒提取病毒rna，通過rt-pcr擴(kuò)增ns段并使用瓊脂糖凝膠電泳分析。(c)delns1和野生型a/wsn/33病毒的噬菌斑尺寸。(d)每次傳代后delns1病毒的滴度(pfu/ml)。(e)delns1病毒基因組的序列分析揭示m段非編碼區(qū)中核苷酸14位處的a-u置換。非編碼區(qū)用黑線標(biāo)記，a14u突變用箭頭指示。(f)包含m-wt與m-a14u、m-a14u-cm15、m-a14c和m-a14g置換的wsn-delns1病毒的拯救效率比較。nr，未拯救到。(g)包含m-wt或m-a14u的pr8-delns1病毒的拯救效率。delns1病毒在混合的hek293t和mdck細(xì)胞培養(yǎng)物中用標(biāo)注的m-wt或m突變體質(zhì)粒拯救，然后通過噬菌斑測定滴定。標(biāo)繪的值為平均值(±標(biāo)準(zhǔn)差[sd])(n=3)并且代表來自至少5個獨立實驗的數(shù)據(jù)。

圖13顯示m-a14u-delns1病毒在mdck和vero細(xì)胞的生長動力學(xué)。(a和b)使用柱-純化的反向遺傳wsn-wt、wsn-delns1-m-a14u和wsn-delns1-m-wt病毒以復(fù)合感染(moi)0.1感染mdck細(xì)胞(a)或vero細(xì)胞(b)。在標(biāo)明的時間點收集上清液并通過噬菌斑測定滴定病毒。(c)使用柱-純化的反向遺傳pr8-wt和pr8-delns1-m-a14u病毒以moi0.1感染mdck細(xì)胞(左側(cè)面板)和vero細(xì)胞(右側(cè)面板)。感染后24h收集上清液并通過噬菌斑測定滴定。標(biāo)繪的值(平均值±sd；n=3)為來自至少3個獨立實驗的代表性數(shù)據(jù)。

圖14顯示wsn-delns1病毒中ifn-β抑制活性的喪失。(a)在用wsn-wt或wsn-delns1-m-a14u以moi1或用陽性對照，sev，以50ha單位感染之前24小時用ifn-報告基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染hek293t細(xì)胞。24h后，收集細(xì)胞并準(zhǔn)備細(xì)胞裂解物用于評估熒光素酶活性。熒光素酶測定一式三份進(jìn)行，并將值對海腎（renilla）熒光素酶對照歸一化。(b)mdck細(xì)胞用wsn-wt或wsn-delns1-m-a14u以moi0.1感染并培養(yǎng)16h后通過qrt-pcr定量ifn-β和病毒npmrna水平。值對犬肌動蛋白歸一化。(c)通過非變性凝膠電泳分析用wsn-wt、wsn-delns1-m-a14u或sev感染的hek293t細(xì)胞中irf3二聚作用的抑制。(d)比較在用wsn-delns1-m-wt或wsn-delns1-m-a14u病毒感染的mdck細(xì)胞中抑制ifn-β表達(dá)的活性。與對于面板b所描述的實驗相似，mdck細(xì)胞用標(biāo)明的病毒以moi0.1感染，并在感染后16h通過qpcr定量ifn-β和npmrna水平。值對犬肌動蛋白歸一化。(e)6-8周齡的6只balb/c小鼠的組群用5x10⁴pfu的wsn-wt或wsn-delns1-m-a14u突變體病毒鼻內(nèi)接種，感染后每天監(jiān)測體重持續(xù)14天。(f)受感染小鼠的肺組織中病毒的復(fù)制效率。3只小鼠的組群用10⁴pfu的wsn-wt、wsn-delns1-m-wt或wsn-delns1-m-a14u突變體病毒感染，然后在感染后72h安樂死，收集每一小鼠的肺組織并均質(zhì)化用于使用mdck細(xì)胞通過噬菌斑測定滴定病毒。統(tǒng)計顯著性通過單向方差分析(anova)或student’st檢驗分析(**,p<0.01)。標(biāo)繪的條顯示平均值±sd(n=3)，并且結(jié)果代表至少三個獨立實驗。

圖15顯示m-a14u突變對m1和m2蛋白表達(dá)的作用。(a)mdck細(xì)胞用wsn-wt或wsn-delns1-m-a14u病毒以moi2感染。在標(biāo)明的時間點收集細(xì)胞并通過蛋白質(zhì)印跡用特異性抗體分析細(xì)胞裂解物，如材料與方法中所描述的。(b)mdck細(xì)胞用wsn-delns1-m-wt或wsn-delns1-m-a14u病毒以moi0.1感染。感染后16h，收集細(xì)胞裂解物用于用特異性抗體蛋白質(zhì)印跡。(c)mdck細(xì)胞用wsn-wt或wsn-m-a14u病毒以moi5感染。在標(biāo)明的時間點制備細(xì)胞裂解物用于用特異性抗體蛋白質(zhì)印跡。β-微管蛋白作為上樣對照包含在內(nèi)。所有的結(jié)果均代表三個獨立實驗。

圖16顯示m-a14u置換對m轉(zhuǎn)錄物的選擇性剪接的作用。(a)m段轉(zhuǎn)錄物的示意圖。vrnam段的3’ncr的序列以紅色顯示，mrna3剪接供體(sd)位點用黃色突出顯示。供體位點的剪接共有序列在非編碼區(qū)序列上用綠色標(biāo)明(m、a或c；r、a或g)。(b)病毒-感染細(xì)胞中不同mmrna水平的分析。mdck細(xì)胞用標(biāo)明的病毒以moi0.1感染。感染后16h分離總rna。通過定量rt-pcr測定m1、m2、mrna3和m4的mrna水平，如材料與方法中所描述的。(c)hek293t細(xì)胞用phw2000-wsn-m-wt或phw2000-wsn-m-a14u質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，用或不用pcx-wsn-ns1共轉(zhuǎn)染用于共表達(dá)ns1。轉(zhuǎn)染后48h，分離總rna。dna酶處理后，通過定量rt-pcr測定mrna水平。(d)mdck細(xì)胞用pr8-wt、pr8-m-a14u或pr8-delns1-m-a14u病毒以moi0.1感染。感染后16h，分離總rna并通過qpcr測量mrna水平。示出了m2/m1mrna和mrna3/m1mrna比率。標(biāo)繪的所有結(jié)果均指示平均值±sd(n=3)并且代表三個獨立實驗。

圖17顯示m-a14u置換對m2/m1mrna比率的作用。(a)mdck細(xì)胞用wsn-wt、wsn-m-a14u、wsn-m-a14g或wsn-mg12c-cm13病毒以moi5感染。在標(biāo)明的時間點提取總rna并通過定量rt-pcr測定mrna3的水平。(b)wsn-wt、wsn-m-a14u、wsn-m-a14g和wsn-m-g12c-cm13病毒的生長動力學(xué)分析。mdck細(xì)胞用這些病毒以moi0.001感染。在標(biāo)明的時間點收集上清液并通過噬菌斑測定滴定。(c-e)mdck細(xì)胞用wsn-wt、wsn-m-a14u、wsn-delns1-m-wt或wsn-delns1-m-a14u病毒以moi0.1感染。感染后16h，分離總rna，并通過定量rt-pcr測定m2/m1、mrna3/m1和m4/m1mrna比率。(f)mrna3對病毒復(fù)制的作用。hek293t細(xì)胞在用wsn-delns1-m-a14u病毒以moi0.1感染之前24h用pcx-wsnmrna3或?qū)φ蛰d體轉(zhuǎn)染。在標(biāo)明的時間點收集上清液并通過噬菌斑測定滴定病毒。標(biāo)繪的所有條和點指示來自三個獨立實驗的平均值±sd(n=3)。**，學(xué)生t檢驗p=0.0013。

圖18顯示病毒ns1和聚合酶蛋白對mmrna剪接宿主機(jī)構(gòu)的調(diào)節(jié)。(a)hek293t細(xì)胞用遞增量的pcx-wsn-ns1轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后24h，細(xì)胞用wsn-delns1-m-wt、wsn-delns1-m-a14u或wsn-wt病毒以moi0.5感染。轉(zhuǎn)染后8h分離總rna并通過定量rt-pcr分析m1mrna、m2mrna和mrna3水平。(b)用克隆入的phw2000質(zhì)粒的m段（表達(dá)mvrna）的wt和多個突變體，與或不與pcx-wsn-ns1質(zhì)粒一起轉(zhuǎn)染hek293t細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后48h制備細(xì)胞裂解物用于用特異性抗體蛋白質(zhì)印跡。β-微管蛋白作為上樣對照包含在內(nèi)。(c)a14u置換對mvrna復(fù)制的作用。mdck細(xì)胞用wsn-wt、wsn-m-a14u或wsn-m-a14g病毒以moi5感染。轉(zhuǎn)染后4和10h，分離總rna用于qrt-pcr分析，并如上所述測定vrna的相對量。(d)a14u置換增強(qiáng)mvrna復(fù)制。mdck細(xì)胞用wsn-delns1-m-wt或wsn-delns1-m-a14u病毒以moi0.1感染。感染后16h分離總rna。m和npvrna水平通過定量rt-pcr測定，如上所述。標(biāo)繪的所有條顯示平均值±sd(n=3)。結(jié)果代表三個獨立實驗。**,p<0.01;***,p=0.0002(學(xué)生t檢驗)。

序列簡述

seqidno:1：ns-529f，用于反向pcr以缺失ns基因的內(nèi)含子的正向引物。(5’-gacatactgatgaggatgtcaaaaatg-3’)

seqidno:2：ns-56r，用于反向pcr以缺失ns基因的內(nèi)含子的反向引物。(5’-ctgaaagcttgacacagtgtttgg-3’)

seqidno:3：m-478f，用于wsn-m1和pr8-m1的實時pcr的正向引物。(5’-cggtctcataggcaaatggt-3’)

seqidno:4：m-616r，用于wsn-m1的實時pcr的反向引物。(5’-caatatccatggcctctgct-3’)

seqidno:5：wsn-m2-f，用于wsn-m2和pr8-m2的實時pcr的正向引物。(5’-ccgaggtcgaaacgcctatc-3’)

seqidno:6：wsnm2-r，用于wsn-m2、wsn-mrna3和wsn-m4的實時pcr的反向引物。(5’-ctctggcactccttcggtag-3’)

seqidno:7：wsn-mrna3-f，用于wsn-mrna3和pr8-mrna3的實時pcr的正向引物。(5’-agcaaaagcaggcctatc-3’)

seqidno:8：wsn-m4，用于wsn-m4的實時pcr的正向引物。(5’-accgatcttgaggcctatc-3’)

seqidno:9：用于pr8-m1的實時pcr的反向引物。(5’-caacctccatggcctctgct-3’)

seqidno:10：用于pr8-m2和pr8-mrna3的反向引物。(5’-ctttggcactccttccgtag-3’)

seqidno:11：np-625f，用于wsn-np的實時pcr的正向引物。(5’-ggtgagaatggacggagaac-3’)

seqidno:12：np-738r，用于wsn-np的實時pcr的正向引物。(5’-ccggctctctctcacttgat-3’)

seqidno:13：用于犬ifn-β的實時pcr的正向引物。(5’-ccagttccagaaggaggaca-3’)

seqidno:14：用于犬ifn-β的實時pcr的反向引物。(5’-cctgttgtcccaggtgaagt-3’)

seqidno:15：用于犬β-肌動蛋白的實時pcr的正向引物。(5’-cccaaggccaaccgcgagaagat-3’)

seqidno:16：用于犬β-肌動蛋白的實時pcr的反向引物。(5’-gtcccggccagccaggtccag-3’)

發(fā)明詳述

參考僅用于說明性目的的實施例，下文描述了本發(fā)明的幾個方面。應(yīng)理解的是，許多具體細(xì)節(jié)、關(guān)系和方法為提供本發(fā)明的充分理解而列出。然而，相關(guān)領(lǐng)域普通技術(shù)人員將容易地認(rèn)識到本發(fā)明可無一個或多個具體細(xì)節(jié)而實踐或用其它方法、方案、試劑、細(xì)胞系和動物實踐。本發(fā)明不受行為或事件的所說明的排序限制，因為一些行為可能以不同次序和/或與其它行為或事件同時發(fā)生。此外，實現(xiàn)本發(fā)明的方法學(xué)不需要所有的所說明的行為、步驟或事件。所描述的或本文引用的許多技術(shù)和程序為本領(lǐng)域技術(shù)人員所充分理解并使用常規(guī)方法學(xué)普通利用。

本發(fā)明提供制備敲除關(guān)鍵毒力基因，甲型流感病毒干擾素拮抗物，非結(jié)構(gòu)蛋白(ns1)的減弱活甲型流感疫苗毒株(本文指定為ns1-del和delns1；術(shù)語可互換使用)的方法。ns1蛋白的敲除提供兩個優(yōu)點。第一，該病毒毒株對人類無毒力；第二，更重要的是ns1-del疫苗可從宿主誘發(fā)好得多的免疫應(yīng)答，這是因為ns1對于先天和適應(yīng)性免疫二者均為強(qiáng)拮抗物。通常，敲除ns1基因的甲型流感病毒不能在細(xì)胞或卵，例如含胚雞蛋中良好生長；然而，本發(fā)明提供用于通過病毒基因組編碼基質(zhì)膜蛋白的段中的突變，例如a14u或g917a補(bǔ)償病毒復(fù)制中的這一缺陷的機(jī)制。因此，本發(fā)明提供一種產(chǎn)生對人類無毒力并且可在短時間內(nèi)生產(chǎn)以應(yīng)用于季節(jié)性和大流行流感的預(yù)防的減弱疫苗的新方法。

在一個方面，本發(fā)明提供包含遺傳上修飾的病毒基因組的減弱流感病毒。所述遺傳上修飾的病毒基因組包含非-結(jié)構(gòu)(ns1)編碼段中的中斷和基質(zhì)膜蛋白編碼段中的一個或多個堿基置換。所述遺傳修飾導(dǎo)致無ns1蛋白的病毒；然而，該病毒保留其病毒復(fù)制能力(由于基質(zhì)膜蛋白編碼段中的堿基置換，其補(bǔ)償ns1丟失)。

在另一個方面，本發(fā)明提供包含減弱流感病毒和藥學(xué)上可接受的載體的疫苗配方，所述病毒包含病毒基因組ns1編碼段的中斷和病毒基因組的基質(zhì)膜蛋白編碼段的一個或多個堿基置換。

如本文所使用的，術(shù)語“疫苗”或“疫苗配方”是指刺激對特定一種抗原或多種抗原(即，流感病毒)的免疫應(yīng)答的組合物。因此，疫苗指以建立對特定流感病毒的免疫應(yīng)答和/或免疫記憶為目標(biāo)給予受試者的組合物。也考慮疫苗組合物可包含設(shè)計用以增加疫苗產(chǎn)生免疫應(yīng)答的能力的其它物質(zhì)。還考慮本發(fā)明可在本文所公開組合物的混合物中提供一種以上的減弱病毒。例如，混合物可包含減弱h1n1病毒和減弱h5n1病毒。同樣，所公開的方法可包括同時或分別給予多個疫苗。因此，本發(fā)明進(jìn)一步包括給予第二種、第三種、第四種等減弱病毒；其中所述第二種、第三種、第四種等減弱病毒在單獨的疫苗中給予，用于與第一種減弱病毒同時或在第一種減弱病毒之后1、2、3、4、5、6、10、14、18、21、30、60、90、120、180、360天(或中間的任何天數(shù))給予。

如本文關(guān)于組合物和配方所使用的，術(shù)語“藥學(xué)上可接受的”意指由聯(lián)邦或州政府的管理機(jī)關(guān)批準(zhǔn)或在美國藥典或其它用于動物和/或人類的普遍承認(rèn)的藥典中列出。

術(shù)語“載體”指與本文所述組合物一起給予的稀釋劑、賦形劑和/或溶媒。這樣的藥學(xué)載體可為無菌液體，例如水和油，包括石油、動物、蔬菜或合成源的那些，例如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油等。鹽水溶液和水性右旋糖和甘油溶液也可用作液體載體，特別是對于可注射的溶液。合適的藥學(xué)賦形劑包括，但不限于，淀粉、葡萄糖、蔗糖、明膠、乳糖、麥芽、米、面粉、白堊、硅膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油酯、滑石、氯化鈉、甘油、丙烯、二醇、水、乙醇等。本文所述組合物和配方可還包含潤濕劑或乳化劑或懸浮/稀釋劑，或ph緩沖劑，或用于修飾或維持組合物的釋放速率的劑。配方可包括標(biāo)準(zhǔn)載體例如醫(yī)藥級的甘露醇、乳糖、糖精鈉、淀粉、硬脂酸鎂、纖維素、碳酸鎂等。這樣的組合物和疫苗將包含有效量的減弱病毒以及合適量的載體以便基于使用的給予方式為患者提供適當(dāng)形式。

如果用于靜脈內(nèi)給予，可將所述疫苗和組合物包裝在無菌等滲水性緩沖的溶液中。若需要，所述組合物可還包含增溶劑。組合物的組分以單位劑量形式混合在一起或單獨提供。若組合物通過輸注給予，其可用包含無菌醫(yī)藥級水或鹽水的輸注瓶分配。若組合物通過注射給予，可提供無菌水或鹽水的安瓿以便成分可在注射前混合。所述疫苗和組合物還可鼻內(nèi)、氣管內(nèi)、口服、皮內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)或皮下給予受試者。

在另一個方面，本發(fā)明提供用于產(chǎn)生減弱流感病毒的方法，包括：將中斷的流感病毒ns1基因編碼序列引入細(xì)胞或卵中；將流感病毒的基質(zhì)膜編碼序列引入細(xì)胞或卵中，其中所述基質(zhì)膜編碼序列包含一個或多個堿基置換并且其中所述細(xì)胞或卵包含產(chǎn)生流感病毒顆粒所需的其余流感病毒基因段和病毒蛋白；和培養(yǎng)細(xì)胞或卵，在其中減弱流感病毒被復(fù)制。所述ns1中斷，與基質(zhì)膜編碼序列中的一個或多個堿基置換組合，導(dǎo)致保留其在宿主細(xì)胞或卵中的復(fù)制能力的減弱流感病毒。

在又一個方面，本發(fā)明提供用于誘發(fā)對流感病毒的免疫應(yīng)答的方法，包括給予受試者有效量的包含經(jīng)基因工程改造的減弱流感病毒和藥學(xué)上可接受的載體的疫苗配方，其中所述經(jīng)基因工程改造的減弱流感病毒的基因組編碼中斷的ns1蛋白和一個或多個具有一個或多個錯義突變的基質(zhì)膜蛋白。

如本文所使用的，術(shù)語“受試者”指動物。通常，提及受試者時術(shù)語“受試者”和“患者”在本文中可互換使用。正因如此，“受試者”包括進(jìn)行免疫的動物，或本文所述組分的混合物，例如減弱病毒疫苗的接受者。術(shù)語“動物”包括，但不限于，小鼠、大鼠、狗、豚鼠、奶牛、馬、雞、貓、兔、豬、猴、黑猩猩和人類。

如本文所使用的，術(shù)語“有效量”指能夠誘發(fā)必需的免疫應(yīng)答或另外能夠產(chǎn)生預(yù)期治療作用的量。

在本發(fā)明病毒、疫苗配方和方法的一些實施方案中，所述ns1編碼段中的中斷為導(dǎo)致敲除所編碼的ns1蛋白的缺失。在其它實施方案中，ns1編碼段的中斷導(dǎo)致截短的蛋白。截短的ns1蛋白喪失，至少，抑制受感染的細(xì)胞中干擾素β表達(dá)的能力。

在一些實施方案中，所述減弱的流感病毒可從甲型流感病毒毒株產(chǎn)生，例如，但不限于，h7n9、h1n1和h5n1。

在一些實施方案中，所述流感病毒基質(zhì)膜編碼序列中的堿基置換選自g917a置換、a14u置換和其組合。這樣的堿基置換導(dǎo)致編碼的基質(zhì)膜蛋白產(chǎn)物，其包含一個或多個錯義突變。這些突變導(dǎo)致補(bǔ)償ns1功能喪失的突變體基質(zhì)膜蛋白產(chǎn)物，這導(dǎo)致細(xì)胞和/或卵中病毒復(fù)制的至少部分拯救。在一些實施方案中，減弱病毒中病毒復(fù)制的拯救水平與野生型活病毒相當(dāng)。

材料與方法

細(xì)胞和病毒

人胚腎(hek)293t(atcc)和vero細(xì)胞(atcc)在添加10%胎牛血清、100單位/ml盤尼西林和100μg/ml硫酸鏈霉素(lifetechnologies)的dulbecco’s最小必需培養(yǎng)基(dmem)中于37℃培養(yǎng)，而mdck(atcc)細(xì)胞在添加相同量的血清和抗生素的eagle’s最小必需培養(yǎng)基(mem)中生長。甲型流感病毒通過反向遺傳學(xué)拯救并在mdck細(xì)胞中擴(kuò)增，如先前所描述的。病毒使用amiconultra-15離心過濾元件(100kd)(millipore)純化以除去培養(yǎng)基中的細(xì)胞因子。仙臺病毒(sev)在含胚雞蛋中繁殖。

質(zhì)粒構(gòu)建

進(jìn)行反向pcr以缺失插入phw2000載體的ns基因的內(nèi)含子，將質(zhì)粒磷酸化并自身連接。用于反向pcr的引物為5’-gacatactgatgaggatgtcaaaaatg-3’(ns-529f,seqidno:1)和5’-ctgaaagcttgacacagtgtttgg-3’(ns-56r,seqidno:2)。對于點突變，使用quikchangeii定點突變試劑盒(stratagene)。

delns1病毒的傳代

本研究中進(jìn)行delns1病毒的連續(xù)盲傳（blindserialpassage）。首先通過將包含8段流感病毒基因組的8個phw2000質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染入hek293t/mdck混合細(xì)胞培養(yǎng)物拯救delns1病毒；隨后在轉(zhuǎn)染后72h收集上清液并指定為0代(p0)病毒。使用從拯救程序獲得的p0病毒在t25燒瓶中于37℃感染mdck細(xì)胞。二或三天后，轉(zhuǎn)移上清液以感染新鮮mdck細(xì)胞。在每代測量病毒滴度。5次傳代后，當(dāng)亞培養(yǎng)物中的病毒滴度穩(wěn)定時，獲取并分析每一代delns1病毒的全基因組序列。

報道基因測定

將hek293t細(xì)胞接種在48-孔板上并用50ng包含來自m段的非編碼區(qū)的每一檢驗質(zhì)粒和螢火蟲熒光素酶報道基因共轉(zhuǎn)染，連同10ng海腎熒光素酶報道基因作為對照。培養(yǎng)24h后，依照制造商的說明(promega)測量熒光素酶活性。對于ifn-β啟動子活性報道基因測定，細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后24h用標(biāo)明的病毒以復(fù)合感染(moi)1(甲型流感病毒)或50ha單位(sev)感染。使用海腎熒光素酶值將螢火蟲熒光素酶值歸一化。

生長動力學(xué)

用標(biāo)明的病毒以moi0.1感染接種在24-孔板中的80-100%匯合的mdck或vero細(xì)胞。吸收1h后，去除上清液并用500μl磷酸-緩沖鹽水(pbs)洗滌細(xì)胞兩次。用包含1μg/ml甲苯磺?；奖滨Ｂ燃谆?tpck)-處理的胰蛋白酶(sigma)的mem覆蓋感染的細(xì)胞并于37℃孵育。在標(biāo)明的時間點收集上清液并通過噬菌斑測定在mdck細(xì)胞中測定病毒滴度。

噬菌斑測定

在mem中制備每一待檢驗病毒的十倍連續(xù)稀釋。用病毒接種接種在6-孔板上的匯合mdck細(xì)胞，37℃吸附1h然后去除上清液。細(xì)胞用pbs洗滌兩次然后用包含1μg/mltpck-處理的胰蛋白酶的1%mem瓊脂糖覆蓋。將板倒置在37℃培養(yǎng)箱中48h。然后用25%福爾馬林室溫固定板至少2h。用1%結(jié)晶紫/20%乙醇染色后，用自來水洗滌板以去除過量染料。將噬菌斑肉眼可視化并計數(shù)。噬菌斑測定檢測濃度≥1pfu/ml的流感病毒。

蛋白質(zhì)印跡

用標(biāo)明的病毒以moi5感染mdck細(xì)胞并在不同的時間點用細(xì)胞裂解緩沖液(50mmtris-hcl,150mmnacl,和1%tritonx-100,ph7.4)裂解。以12,000g的速度離心15min后丟棄細(xì)胞碎片。如下進(jìn)行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(npage)。不添加sds制備7-8%的聚丙烯酰胺凝膠并省略濃縮膠。

用于n-page的樣品用熒光素酶測定中使用的被動裂解緩沖液裂解。與5x上樣緩沖液(1mtris-hcl[ph6.8],50%甘油,1%溴酚藍(lán))混合后，將樣品儲存在–80℃或立即分析，上樣前將凝膠在4℃以40ma的恒定電流預(yù)運行30min。然后以與對于sds-page相似的方式處理凝膠。小鼠單克隆抗-m1(sc-57881)和兔多克隆抗-irf3(sc-9082)抗體購自santacruzbiotechnology。小鼠單克隆抗-m2(ab5416)購自abcam。小鼠單克隆抗-β-微管蛋白購自sigma。np、ha和ns1使用實驗室自制的抗體分別以1:5,000、1:3,000和1:5,000的稀釋度檢測。

定量實時pcr(qrt-pcr)

在感染或轉(zhuǎn)染之后標(biāo)明的時間點，使用rnaiso(takara)分離總rna。通過dnase(ambion)處理去除dna污染。使用高容量cdna反轉(zhuǎn)錄試劑盒(lifetechnologies)反轉(zhuǎn)錄大約200ng總rna。uni12和oligo(dt)引物分別用于在反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中制備mrna和vrna。使用sybrpremixextaq試劑盒(takara)進(jìn)行實時pcr。用于wsn-m1的引物為5’-cggtctcataggcaaatggt-3’(m-478f,seqidno:3)和5’-caatatccatggcctctgct-3’(m-616r,seqidno:4)。用于wsn-m2的引物為5’-ccgaggtcgaaacgcctatc-3’(wsn-m2-f,seqidno:5)和5’-ctctggcactccttcggtag-3’(wsnm2-r,seqidno:6)。用于wsn-mrna3的正向引物為5’-agcaaaagcaggcctatc-3’(wsn-mrna3-f,seqidno:7)，用于wsn-m4的正向引物為5’-accgatcttgaggcctatc-3’(seqidno:8)。用于wsn-mrna3和wsn-m4的反向引物為wsn-m2-r。用于pr8-m1的正向引物與wsn-m1的正向引物m-478f相同，并且反向引物為5’-caacctccatggcctctgct-3’(seqidno:9)。用于pr8-m2和pr8-mrna3的反向引物為5’-ctttggcactccttccgtag-3’(seqidno:10)，并且正向引物分別為wsn-m2-f和wsn-mrna3-f。用于wsn-np的引物為5’-ggtgagaatggacggagaac-3’(np-625f,seqidno:11)和5’-ccggctctctctcacttgat-3’(np-738r,seqidno:12)。用于犬ifn-β的引物為5’-ccagttccagaaggaggaca-3’(正向，seqidno:13)和5’-cctgttgtcccaggtgaagt-3’(反向，seqidno:14)。

用于犬β-肌動蛋白的引物為5’-cccaaggccaaccgcgagaagat-3’(正向，seqidno:15)和5’-gtcccggccagccaggtccag-3’(反向，seqidno:16)。

使用已建立的方案分析相對mrna水平。qrt-pcr的擴(kuò)增特異性通過每個程序結(jié)束時的熔解曲線分析確認(rèn)。

小鼠感染

小鼠實驗使用6-8周齡的雌性balb/c小鼠進(jìn)行。為了測定肺組織中的病毒復(fù)制，用稀釋在25μlpbs中的1x10⁴pfu的wsn-wt、wsn-delns1-m-wt或wsn-delns1-m-a14u病毒鼻內(nèi)感染3只小鼠的組群。三天后，將小鼠安樂死并移除肺以在1mlpbs中均質(zhì)化。然后通過噬菌斑測定在mdck細(xì)胞中測定病毒滴度。為了測定病毒的致病性，用25μlpbs中5x10⁴pfu的野生型(wt)或delns1-m-a14u病毒或僅用pbs鼻內(nèi)接種6只小鼠的組群，每天記錄感染和對照組小鼠的體重持續(xù)14天。依照動物倫理學(xué)指南，將體重?fù)p失超過初始體重的25%的小鼠安樂死。

本文參考或引用的所有專利、專利申請、臨時申請和出版通過引用以其整體結(jié)合，其包括所有圖片和表格，至其不與本說明書的明確教導(dǎo)矛盾的程度。

下列為說明用于實踐本發(fā)明的程序的實施例。這些實施例不應(yīng)解釋為限制性的。所有百分比均為按重量計并且所有的溶劑混合物比例均為按體積計，除非另外指明。

實施例1–ns1-del病毒中用于病毒復(fù)制的m段中的置換

為了獲得ns1-del病毒毒株，分別將衍生自h1n1、h7n9和h5n1的全長ns基因組段ns克隆入phw2000載體。通過誘變方案敲除ns1的編碼區(qū)，而完整的ns2(或nep)保留在基因組段中(圖1)。ns1-del病毒通過將每一病毒的8段共轉(zhuǎn)染入293t細(xì)胞中拯救。將所得的拯救病毒(滴度非常低或甚至通過常規(guī)測定檢測不到)在a549或vero細(xì)胞中盲傳。收集上清液用于滴定和測序分析。一旦傳代中的病毒滴度穩(wěn)定，比較每一代的序列。將所有8段的序列與親本基因組比較并鑒定置換。在重復(fù)實驗中始終觀察到m段中的兩個置換，即h1n1中的a14u和h7n9中的g917a(圖2和3)。

實施例2–m段中具有置換的ns1-del病毒的生長的表征

在多個細(xì)胞系，包括mdck、vero和a549中分析了衍生自h1n1(wsn毒株)(圖4)和h7n9(zhejiang毒株)(圖5)的ns1-del病毒與野生型副本的生長動力學(xué)。發(fā)現(xiàn)ns1-del病毒能夠在mdck或vero細(xì)胞中生長至一定水平。在vero細(xì)胞中wsn-delns1-a14u病毒復(fù)制至遠(yuǎn)高于delns1-m-wt和wsn-delns1-m-ca2的滴度。ns1-del病毒使用含胚雞蛋進(jìn)一步評估，并且顯示這些病毒能夠在雞蛋中繁殖。

實施例3–ns1-del病毒的干擾素拮抗的表征

ns1蛋白的主要功能為抑制受感染細(xì)胞中的干擾素表達(dá)。進(jìn)行實驗以證明ns1-del病毒不能抑制宿主干擾素表達(dá)(圖6)。確定ns1-del病毒已喪失此功能尤其重要，因為其與流感病毒的毒力有關(guān)。

實施例4–ns1-del病毒的m段中的突變增強(qiáng)m2但下調(diào)m3從m段轉(zhuǎn)錄

由于m2、m3和m4mrna的差異剪接在病毒復(fù)制的調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用，進(jìn)行了實驗，其顯示m段中的置換增強(qiáng)m2但是下調(diào)m3mrna轉(zhuǎn)錄(圖7)。這一發(fā)現(xiàn)提供了對在缺乏ns1蛋白時m的置換對病毒復(fù)制的機(jī)制解釋。

實施例5–ns1-del病毒在小鼠中的表征

為了進(jìn)一步評估ns1-del病毒的致病性質(zhì)，進(jìn)行實驗以檢查小鼠中的ns1-del病毒。用野生型h7n9或ns1-del病毒感染6只小鼠的組群并每天記錄死亡率和體重持續(xù)兩周。發(fā)現(xiàn)用ns-del病毒感染的小鼠不顯示疾病癥狀并且保持穩(wěn)定的體重，而用野生型h7n9病毒感染的小鼠從感染后第2天喪失體重；所有感染小鼠在第6天死亡。該結(jié)果證明ns-del病毒對小鼠無毒力，甚至在高劑量時(圖8)。

實施例6–通過ns1-del病毒免疫保護(hù)小鼠免于致死攻擊

為了檢驗ns1-del疫苗在小鼠中的功效，如圖9中所說明來進(jìn)行實驗。首先用5x10⁴噬菌斑形成單位(pfu)的多個版本的ns-del病毒、裂解疫苗或pbs對照接種6只小鼠的組群。兩周后，用10⁵pfu的野生型h7n9病毒攻擊小鼠。監(jiān)測小鼠的死亡率，并記錄體重持續(xù)14天。圖9中的結(jié)果顯示：(1)用pbs對照接種的小鼠從感染后第3天喪失體重并且所有小鼠在攻擊后第10天死亡；(2)用h7n9ns1-del病毒接種的小鼠在整個實驗期間未顯示明顯體重喪失；(3)用h1n1ns1-del病毒接種的小鼠在感染的最初4天期間顯示輕微體重喪失但其后恢復(fù)并在剩余實驗中保持正常；(4)用一劑裂解h7n9疫苗接種的小鼠在第一周顯示明顯的體重喪失，但小鼠能夠從感染恢復(fù)并恢復(fù)體重。該實驗顯示了使小鼠免于致死劑量的高致病性h7n9病毒攻擊的保護(hù)。ns1-del疫苗提供比裂解疫苗更好的保護(hù)。ns1-delh1n1病毒保護(hù)小鼠免于h7n9攻擊進(jìn)一步提示ns1-del疫苗可提供對異-亞型病毒感染的交叉保護(hù)。

實施例7–ns1-del疫苗對禽h5n1病毒致死攻擊的交叉保護(hù)

進(jìn)行了實驗以驗證delns1疫苗對高致病性禽h5n1病毒致死攻擊的交叉保護(hù)。除了衍生自wsn和h7n9毒株的delns1病毒以外，還相似地構(gòu)建了來自2009大流行h1n1病毒的delns1病毒，其被指定為2009h1n1-delns1并評估對a/vietnam/1194/04h5n1病毒致死攻擊的交叉保護(hù)。為了檢驗接種delns1病毒是否會提供對小鼠中h5n1病毒感染的更好保護(hù)，使用2009h1n1冷適應(yīng)病毒，其被指定為2009h1n1-冷適應(yīng)，作為對照。2009h1n1-冷適應(yīng)病毒在病毒基因組中包含野生型ns1基因。

如圖10中所示，盡管在感染開始時存在一些體重喪失(a)，80%的用wsn-delns1、2009h1n1-delns1和2009h1n1-冷適應(yīng)病毒接種的小鼠從較低致死劑量(100mld50)1194h5n1病毒的攻擊中存活。該結(jié)果表明用冷適應(yīng)或delns1病毒接種會提供對異亞型病毒感染的交叉保護(hù)。然而，基于病毒攻擊后的體重變化與包含野生型ns1基因的同種減弱活病毒相比，2009h1n1-delns1病毒似乎提供更好的保護(hù)(a)。為了進(jìn)一步區(qū)分包含ns1和delns1的疫苗毒株之間的保護(hù)水平，評估了用較高致死劑量(1000mld50)的a/vietnam/1194/04h5n1病毒攻擊的小鼠中的保護(hù)。如圖11中所示，用pbs或2009h1n1-冷適應(yīng)病毒接種的小鼠在h5n1病毒攻擊后6和9天之后死亡(a&b)。然而，80%的用2009h1n1-delns1或h7n9delns1-mg917a病毒接種的小鼠從致死攻擊中存活(b)。在感染開始時僅觀察到小于15%的體重喪失并且小鼠能夠在h5n1病毒攻擊10天后恢復(fù)。綜合起來，這些結(jié)果顯示delns1流感病毒提供比包含野生型ns1的疫苗毒株強(qiáng)得多的交叉保護(hù)。

實施例8–病毒rna的m段的3’非編碼區(qū)(ncr)中的a14u置換支持流感病毒的復(fù)制

本發(fā)明的這一實施方案提供病毒rna的m段的3’ncr中的a14u置換通過調(diào)節(jié)m段mrna的選擇性剪接支持具有ns1缺失的流感病毒的復(fù)制。流感病毒的ns1蛋白具有多種功能并且為毒力的決定因子。delns1流感病毒為用于研究病毒復(fù)制的有用工具并且可用作有效的減弱活疫苗；然而，ns1的缺失嚴(yán)重減少病毒復(fù)制，妨礙功能研究和疫苗生產(chǎn)。本發(fā)明提供在細(xì)胞中持續(xù)傳代的wsn-delns1病毒經(jīng)適應(yīng)而獲得在病毒rna(vrna)的m段的3’ncr中a14u置換，該置換恢復(fù)復(fù)制能力。delns1-m-a14u病毒不能抑制病毒-感染細(xì)胞中的干擾素表達(dá)，為研究ns1不存在時的病毒復(fù)制提供了基本模型。delns1-m-a14u病毒的表征顯示ns1缺乏對其它病毒蛋白的表達(dá)無明顯作用，除了mmrna。m轉(zhuǎn)錄物，m1、m2、mrna3和mrna4的表達(dá)受選擇性剪接調(diào)節(jié)。a14u置換改變mrna3的剪接供體位點共有序列，更改m轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)，在delns1-m-a14u，而非delns1-m-wt病毒-感染的細(xì)胞中m2表達(dá)明顯增加并且mrna3受到顯著抑制。進(jìn)一步的分析揭示a14u置換還影響病毒基因組復(fù)制期間的啟動子功能。m-a14u突變增加delns1病毒感染中的mvrna合成并且在其它病毒蛋白質(zhì)缺乏時增強(qiáng)m2mrna的選擇性剪接。該發(fā)現(xiàn)證明ns1通過調(diào)節(jié)m轉(zhuǎn)錄物的選擇性剪接直接參與流感病毒復(fù)制并提供對于構(gòu)建ns1缺失疫苗毒株重要的戰(zhàn)略信息。

流感病毒的ns1具有多種功能。除了其在對抗宿主抗病毒活性中的作用外，還認(rèn)為ns1牽涉調(diào)節(jié)病毒復(fù)制。ns1蛋白為抑制先天和適應(yīng)性免疫二者的毒力決定因子并且ns1缺失的減弱活病毒有希望作為有效的疫苗。然而，ns1的缺失導(dǎo)致感染期間病毒復(fù)制的嚴(yán)重減弱，這妨礙功能研究和疫苗開發(fā)。提供了在vrnam段的3’ncr中攜帶a14u置換的能夠復(fù)制的delns1病毒。m-a14u突變通過調(diào)節(jié)從m段轉(zhuǎn)錄的mrna的選擇性剪接支持病毒復(fù)制。正因如此，本發(fā)明提供可用作減弱活疫苗的ns1缺失的可復(fù)制毒株。

甲型流感病毒是導(dǎo)致年度流行病以及偶見的大流行的重要的人呼吸道病原體。甲型流感病毒基因組包含8個負(fù)義單鏈rna段。分段的基因組允許不同流感病毒之間頻繁發(fā)生重新分配事件，這導(dǎo)致重配病毒的致病性和傳播性質(zhì)改變。感染周期期間甲型流感病毒的復(fù)制過程受宿主和病毒因子調(diào)節(jié)。流感病毒進(jìn)入細(xì)胞通過病毒血凝素(ha)附著至細(xì)胞唾液酸受體引發(fā)，所述細(xì)胞唾液酸受體介導(dǎo)內(nèi)吞過程以將病毒基因組釋放入細(xì)胞質(zhì)中。病毒基因組隨后經(jīng)由輸入蛋白-α1/輸入蛋白-β1-依賴性核輸入途徑輸入核中，在此處流感病毒利用基因組-結(jié)合病毒rnp聚合酶復(fù)合體和宿主轉(zhuǎn)錄機(jī)構(gòu)復(fù)制病毒基因組和表達(dá)病毒mrna用于蛋白合成。已經(jīng)從病毒-感染細(xì)胞鑒定了至少14種病毒蛋白。在這些病毒蛋白中，pb1、pb2、pa、np、ha、na、m1、m2、ns1和ns2(nep)在受感染細(xì)胞中有規(guī)律地表達(dá)。pb1-f2、pb1-n40和pa-x的表達(dá)不那么一致地被觀察到并且可能與病毒毒株和感染條件有關(guān)。用在m段轉(zhuǎn)錄物中mrna4剪接供體位點處突變的病毒感染期間還報道了一種m2-相關(guān)蛋白，m42的表達(dá)。然而，許多甲型流感病毒體可能未能表達(dá)至少一種必需病毒蛋白并變?yōu)椴荒軓?fù)制的感染顆粒。病毒蛋白的表達(dá)受病毒和宿主二者控制并且病毒蛋白表達(dá)的差異調(diào)節(jié)可導(dǎo)致病毒復(fù)制效率差異，引起可變的致病性感染結(jié)果。

在甲型流感病毒的8個基因組段之中，ns和m段二者均表達(dá)差異剪接的轉(zhuǎn)錄物。從ns和m段分別表達(dá)兩種成熟mrna，ns1和ns2(nep)，和四種mrna，m1、m2、m3和m4。盡管存在四種來自m段的差異剪接的轉(zhuǎn)錄物，在甲型流感感染中僅基質(zhì)(m1)和離子通道(m2)蛋白具有已知作用。m1和m2在病毒復(fù)制期間在病毒核輸出、病毒體包裝和出芽中具有重要功能。對于從m段衍生的其它兩種mrna，mrna3和mrna4，尚未發(fā)現(xiàn)已知的功能。一個病毒mrna動力學(xué)研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的病毒感染期間m1和m2mrna的積累受到調(diào)節(jié)。在ns1和ns2(nep)剪接調(diào)節(jié)中也觀察到相似的現(xiàn)象，其與病毒感染的進(jìn)展協(xié)調(diào)。病毒聚合酶復(fù)合體調(diào)節(jié)流感病毒m1mrna中選擇性5’剪接位點的利用，與細(xì)胞剪接因子sf2/asf協(xié)調(diào)，以控制病毒復(fù)制期間m2mrna的表達(dá)。然而，另一個研究顯示ns1蛋白調(diào)節(jié)m段mrna的剪接并且該活性需要ns1具有rna結(jié)合功能。據(jù)報道通過傳代包含來自a/turkey/turkey/1/05的h5和n1以及來自a/pr/8/34毒株的其余段但缺失ns1的重配病毒在m段中獲得適應(yīng)性置換。雖然這些m段置換的具體功能尚未表征，該研究似乎提示在病毒復(fù)制中ns1與m功能之間存在相互作用。盡管ns1蛋白對病毒復(fù)制不是必需的，但它具有多種功能，并且ns1基因的缺失引起流感病毒復(fù)制的嚴(yán)重減弱。delns1病毒的減弱可能是由于抑制宿主干擾素(ifn)表達(dá)能力的喪失，因為無ns1的病毒在干擾素-缺陷細(xì)胞中能夠正常復(fù)制。然而，若干研究顯示ns1可能還通過其它機(jī)制參與流感病毒轉(zhuǎn)錄和復(fù)制的調(diào)節(jié)。

本發(fā)明的一個實施方案提供從a/wsn/33和a/pr/8/34毒株衍生的delns1流感病毒。盡管ns1基因缺失在有干擾素能力的系統(tǒng)中通常引起嚴(yán)重的病毒減弱，但vrna的m段的3’ncr中的適應(yīng)性置換，a14u，顯著增強(qiáng)delns1病毒的復(fù)制。同樣，delns1病毒不能表達(dá)充足量的m2mrna，可能是因為ns1功能的缺乏，而m-a14u置換恢復(fù)m2表達(dá)。

m段中的a14u突變足以恢復(fù)delns1wsn病毒的生長

盡管流感病毒的ns1蛋白對病毒復(fù)制不是必需，但不表達(dá)功能ns1的病毒嚴(yán)重減弱并且僅能在ifn-缺陷系統(tǒng)中復(fù)制。已使用在細(xì)胞中表達(dá)ns1的輔助病毒來支持用于疫苗研究的delns1病毒的生產(chǎn)。在一個使用包含來自h5n1病毒的ha和na以及來自a/pr/8/34的內(nèi)段的重配病毒的研究中顯示m和ns段中的置換恢復(fù)delns1病毒復(fù)制的生長。然而，恢復(fù)生長的機(jī)制尚未確定。為了更好地理解ns1在病毒復(fù)制中的作用以及為了開發(fā)用于制造delns1病毒的方法，生產(chǎn)了a/wsn/33毒株的delns1版本(圖12a)。ns1的缺失通過病毒基因組檢查確認(rèn)。

噬菌斑分析顯示delns1病毒形成明顯比野生型病毒小的噬菌斑(圖12b和c)。在mdck細(xì)胞中wsn-delns1病毒的復(fù)制能力在三代內(nèi)增加，與原始delns1病毒(p1)相比病毒滴度上升幾乎2logs(圖12d)。序列分析證實產(chǎn)生了變體病毒但僅在vrnam段的3’ncr中發(fā)現(xiàn)一個置換，a14u(m-a14u)；在基因組中未發(fā)現(xiàn)其它突變(圖12e)。為了證實m段中m-a14u的引入不是隨機(jī)事件，重復(fù)該實驗并且獲得相同的a14u變體。為了進(jìn)一步檢驗m-a14u突變是否足以增加delns1病毒的生長，比較wsn-delns1病毒與m-wt或使用反向遺傳學(xué)拯救的m-a14u、m-a14ucm15、m-a14g或m-a14c突變的效率，然后在mdck細(xì)胞中噬菌斑滴定拯救的病毒。

a14g與a14u在生物化學(xué)上相似，因此也拯救了相應(yīng)的病毒，而不是具有a14c突變的那些。為了檢驗a14u堿基配對的潛在中斷，如已經(jīng)觀察到12和13位的突變可影響病毒生長，將在mcrna3’末端的15位處包含額外的互補(bǔ)突變的m-a14u-cm15突變體包含在內(nèi)。a14u置換似乎是獨特的并且不需要互補(bǔ)突變。所拯救的delns1-m-a14u突變體病毒的滴度高達(dá)1.75x10⁵pfu/m，比m-wtdelns1病毒高約750倍(圖12f)。為了檢驗a14u置換是否也可在其它細(xì)胞中出現(xiàn)，在vero細(xì)胞中傳代wsn-delns1病毒。然而，在超過8次傳代后未觀察到突變。

為了進(jìn)一步證實m-a14u還支持其它流感病毒毒株的復(fù)制，將該置換引入a/pr/8/34毒株的delns1版本的m段并且，與用wsn的觀察一致，m-a14u顯著提高所拯救的病毒的滴度(圖12g)，而無m-a14u置換的pr8-delns1病毒不能被拯救。這些結(jié)果表明m-14u置換可在缺乏ns1蛋白表達(dá)下恢復(fù)病毒復(fù)制。

m-a14u置換支持病毒復(fù)制但不抑制ifn表達(dá)

delns1流感病毒不能在mdck細(xì)胞中復(fù)制并且僅可在vero細(xì)胞中生長。生長動力學(xué)分析顯示m-a14udelns1病毒在mdck和vero細(xì)胞二者中能夠復(fù)制達(dá)到與野生型病毒相當(dāng)?shù)牡味?相比低不到1log)(圖13a和b)。相似地，m-a14u置換支持pr8delns1病毒在vero和mdck細(xì)胞中復(fù)制，而無該置換的pr8delns1病毒不能繁殖(圖13c)。ns1蛋白作為宿主抗病毒活性的病毒拮抗物的功能已明確定義。ns1的缺失減弱病毒抑制干擾素表達(dá)的能力，如在報告基因測定中和通過ifn-β活化的qrt-pcr所測量的(圖14a和b)。delns1-m-a14u病毒不能抑制受感染細(xì)胞中irf3的活化(圖14c)。盡管m-a14u使delns1病毒能夠比wsn-delns1-m-wt病毒更有效地生長，該置換對干擾素的抑制無作用(圖14d)。為了進(jìn)一步確定m段中的a14u置換是否可改變病毒在體內(nèi)的致病性性質(zhì)，在小鼠中比較了wsn-wt和wsn-delns1-m-a14u突變體病毒在肺組織中的毒力和復(fù)制。盡管野生型wsn毒株導(dǎo)致受感染小鼠中迅速的體重喪失和死亡，但用wsn-delns1-m-a14u突變體病毒未觀察到明顯的致病性。受感染小鼠的肺組織中的病毒滴度的評估顯示wsn-delns1-m-a14u和wsn-delns1-m-wt突變體二者在肺組織中均復(fù)制不佳，達(dá)到的水平與對于wsn-wt病毒所觀察到的相比低大約3logs(圖14e和f)。因此，m-a14u置換的引入保留delns1病毒所具有的無毒力性質(zhì)，這使其適合用于疫苗開發(fā)。

m-a14u置換影響病毒復(fù)制中m轉(zhuǎn)錄物的剪接。ns1蛋白不是病毒聚合酶復(fù)合體的組分。delns1病毒中m段中單獨的a14u置換恢復(fù)復(fù)制這一觀察提示ns1可牽涉調(diào)節(jié)復(fù)制或從vrnam段轉(zhuǎn)錄。為了理解m-a14u置換在支持ns1缺失病毒的復(fù)制中的作用的分子基礎(chǔ)，檢查了用delns1-m-a14u病毒感染mdck細(xì)胞期間病毒蛋白的表達(dá)。盡管病毒ha和np蛋白的表達(dá)模式在wsn-wt和delns1-ma14u病毒感染中很大程度上相似(圖15a)，與wsn-wt病毒感染相比m-a14udelns1中m2表達(dá)無變化并且m1水平顯著降低。delns1-m-a14u與delns1-m-wt病毒之間病毒蛋白表達(dá)的比較也顯示a14u置換對m1和m2蛋白有作用但對ha和np無作用(圖15b)。然而，m-a14u置換對m2蛋白表達(dá)的增強(qiáng)作用在具有完整ns1功能的wsn病毒中不明顯(圖15c)，提示m-a14u可能對于補(bǔ)償調(diào)節(jié)mmrna的表達(dá)和剪接中的ns1功能的喪失必不可少。

m-a14u突變通過在病毒復(fù)制期間下調(diào)mrna3提高m2mrna的表達(dá)。流感病毒感染期間，在m段轉(zhuǎn)錄時，發(fā)生差異剪接以產(chǎn)生四種轉(zhuǎn)錄物，其中m1和m2mrna分別表達(dá)m1和m2蛋白(圖15a)。mrna3和mrna4的功能未知。值得注意的是，a14u突變位于mrna3剪接共有序列中，該序列覆蓋mmrna的非編碼區(qū)的5’末端的核苷酸(nt)9-17。a14u置換可將mrna3的剪接供體(sd)位點共有序列從cag/gua改變?yōu)閏ag/guu并影響mrna3的產(chǎn)生。同樣，vrnam段中的a14u置換可通過下調(diào)mrna3表達(dá)以增加m2與m1mrna表達(dá)的比率來支持delns1病毒生長。

為了驗證該假設(shè)，使用qrt-pcr分析檢查病毒-感染細(xì)胞中的mrna3水平。正如預(yù)期的，在四種mmrna轉(zhuǎn)錄物之中，wsn-delns1-ma14u病毒-感染的mdck細(xì)胞中m1、m2和m4顯著增加但mrna3幾乎完全消除(圖16b)。相比之下，delns1病毒中npmrna的表達(dá)不受m-a14u置換影響(圖16b)，提示ns1的缺失與從m段表達(dá)的調(diào)節(jié)特異性相關(guān)。

進(jìn)一步地，用表達(dá)全長mmrna的m-a14u或m-wt段質(zhì)粒轉(zhuǎn)染hek293t細(xì)胞。盡管對于m-wt和m-a14u質(zhì)粒m1mrna的水平相似，但來自m-a14u質(zhì)粒的mrna3的表達(dá)顯著下調(diào)并且m2mrna的表達(dá)顯著上調(diào)(圖16c)。ns1的共表達(dá)進(jìn)一步證明了ns1對mmrna轉(zhuǎn)錄的正面作用；a14u置換可在delns1病毒中出現(xiàn)以補(bǔ)償ns1-相關(guān)的mmrna表達(dá)的增強(qiáng)。m-a14u置換在支持從a/pr/8/34毒株衍生的delns1病毒的復(fù)制中具有相似的作用(圖12g和13c)。檢查來自pr8-delns1-m-a14u病毒-感染細(xì)胞的差異剪接的m轉(zhuǎn)錄物發(fā)現(xiàn)與用wsn-delns1-ma14u所觀察到的那些相似的模式(圖16d)，這支持該核苷酸在wsn和pr8兩種毒株中的功能保守性。因此，vrnam段中的m-a14u置換改變病毒感染期間，甚至在缺乏其它病毒蛋白時，m1mrna的剪接模式。

m-a14u突變導(dǎo)致增加的m2mrna與m1mrna的比率

為了進(jìn)一步探究ns1表達(dá)缺乏時m-a14u對病毒復(fù)制的作用的潛在分子機(jī)制，制造下調(diào)mrna3表達(dá)的突變體。m-g12c-cm13突變體病毒顯著下調(diào)mrna3的表達(dá)。同樣，mrna3的表達(dá)在wsn-ma14u、wsn-m-a14g和wsn-mg12c-cm13病毒感染中減少(圖17a)。然而，生長動力學(xué)分析顯示該病毒的復(fù)制減弱，wsn-delns1-m-g12ccm13病毒不能被有效拯救(圖17b)，提示mrna3的下調(diào)可能不與病毒生長直接相關(guān)。m1基質(zhì)蛋白牽涉vrna核輸出，而m2具有離子通道功能并且牽涉流感病毒復(fù)制期間的病毒脫殼和出芽過程。通過調(diào)節(jié)m1mrna的選擇性剪接病毒復(fù)制進(jìn)程期間可能存在m1與m2的表達(dá)的協(xié)調(diào)，并且ns1可能也在其中發(fā)揮作用。delns1病毒感染中m1與m2的比率可能改變，如上文所見(圖15和16)。據(jù)報道m(xù)2在病毒感染的早些時候選擇性表達(dá)，提示m2在病毒復(fù)制早期中的關(guān)鍵作用。除了在病毒脫殼和出牙過程中的作用外，據(jù)報道m(xù)2還與自噬體和炎癥小體相互作用，提示其在病毒復(fù)制期間發(fā)揮其它作用。在缺乏具有多種功能以對抗宿主抗病毒活性的ns1時，delns1病毒可經(jīng)適應(yīng)優(yōu)先表達(dá)m2以試圖維持病毒復(fù)制的最佳平衡。

為了理解m-a14u對m轉(zhuǎn)錄物差異剪接的調(diào)節(jié)的作用，測定了病毒-感染細(xì)胞中m2mrna與m1mrna的比率。比較用wsn-m-a14u、wsn-delns1-m-wt、wsndelns1-m-a14u和wtwsn病毒感染的細(xì)胞中的m2/m1比率。wsn-delns1-m-a14u-感染細(xì)胞中的m2/m1剪接效率比wsn-delns1-m-wt-感染細(xì)胞中高約6倍(圖17c)。然而，wsn-wt與wsn-m-a14um2/m1比率之間的比較揭示盡管a14u置換上調(diào)m2，但該作用不如在wsn-delns1病毒之間所見到的顯著(差異小于2倍)(圖17c)。在wsn-wt-m-a14u和wsndelns1-m-a14u病毒感染二者中mrna3的表達(dá)減少并且m4mrna下調(diào)(圖17d和e)。

為了進(jìn)一步檢驗mrna3對病毒生長的作用，從質(zhì)粒表達(dá)mrna3，但未觀察到對病毒滴度的負(fù)面作用(圖17f)，這提示對于mrna3表達(dá)的選擇性剪接可能是專為調(diào)節(jié)m1和m2mrna的水平。這些結(jié)果支持m-a14u突變導(dǎo)致增加的用于產(chǎn)生m2，并且可能也產(chǎn)生m1，mrna的選擇性剪接以增強(qiáng)ns1表達(dá)缺乏時的病毒復(fù)制這一假設(shè)。

m-a14u突變增強(qiáng)m2mrna的選擇性剪接和mvrna的合成

先前的研究已經(jīng)提示m段mrna的剪接可受病毒rnp復(fù)合體連同宿主因子sf2或ns1調(diào)節(jié)。這些機(jī)制可能與m-a14u置換有關(guān)。m-a14u置換影響m1mrna的剪接效率并且該性質(zhì)為補(bǔ)償ns1表達(dá)的缺乏所需。在其中ns1牽涉病毒復(fù)制期間m轉(zhuǎn)錄物剪接為m2mrna的調(diào)節(jié)的機(jī)制中，看起來很有可能delns1病毒可被迫在通常與ns1相關(guān)的vrnam段的啟動子區(qū)域處的調(diào)節(jié)元件中獲得適應(yīng)性置換以補(bǔ)償ns1功能的缺乏。

為了檢驗該假設(shè)，在delns1-m-wt病毒-感染細(xì)胞中檢查了恢復(fù)ns1表達(dá)對m2/m1比率的作用。用病毒感染之前24h將遞增量的ns1表達(dá)載體轉(zhuǎn)染入hek293t細(xì)胞，通過定量rt-pct評估m(xù)1和m2病毒mrna的表達(dá)。delns1-m-wt病毒-感染細(xì)胞中m2剪接形式的量隨ns1表達(dá)水平增加而增加(圖18a)。使用表達(dá)m段的mrna和vrna二者的質(zhì)粒，觀察到甚至在缺乏其它病毒蛋白時，所有在14位處具有置換的質(zhì)粒表達(dá)比m-wt更高水平的m2蛋白，而非m1，這表明m-a14u與m2剪接形式的上調(diào)相關(guān)(圖18b)。ns1質(zhì)粒m的共轉(zhuǎn)染顯著增強(qiáng)m1從所有這些質(zhì)粒的表達(dá)，并且對于在第14位處或在第12位處具有置換以下調(diào)mrna3的質(zhì)粒(g12c-cm13)m2水平更顯著上調(diào)(圖17a和18b)。該結(jié)果強(qiáng)烈提示ns1可通過下調(diào)用于mrna3的選擇性剪接位點發(fā)揮功能以允許優(yōu)先表達(dá)m1和m2，而該剪接位點的置換允許將m1有效加工為m2剪接形式。

a14u置換發(fā)生在mvrna段(crna的5’或5’mrna)的3’非編碼區(qū)，該區(qū)域也是用于病毒基因組復(fù)制的啟動子區(qū)。該突變可能影響病毒聚合酶復(fù)合體的結(jié)合以增強(qiáng)vrna從m段合成，在病毒復(fù)制期間產(chǎn)生更多的m1mrna用于剪接為m2mrna。檢驗了用在14位包含變異和具有完整ns1基因的突變體病毒感染的細(xì)胞中的mvrna合成水平。從wsn-m-a14u突變體產(chǎn)生的mvrna的水平比wsn-wt病毒高大約15倍(圖18c)。相比之下，對于wsn-m-a14g突變體觀察到與wsn-wt病毒-感染細(xì)胞相比相對更低的mvrna水平(圖18c)。

檢驗了提高的mvrna產(chǎn)生是否與delns1-ma14u病毒感染相關(guān)。mvrna的水平在wsn-delns1-m-a14u中與在wsndelns1-m-wt病毒感染中相比顯著更高，而對于npvrna未觀察到相似的傾向(圖18d)。因此，m-a14u正面影響mvrna合成并且該作用可能對于ns1-缺陷病毒的復(fù)制是必需的。

流感病毒利用病毒聚合酶復(fù)合體和宿主機(jī)構(gòu)在核中轉(zhuǎn)錄和復(fù)制病毒基因組。用于從轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)換為復(fù)制和vrna從核輸出至細(xì)胞質(zhì)的病毒產(chǎn)物的表達(dá)的協(xié)調(diào)對最佳復(fù)制效率至關(guān)重要。病毒蛋白m1和nep(ns2)牽涉vrnp的核輸出。m2為一種結(jié)構(gòu)蛋白并且牽涉輸入早期期間的病毒脫殼過程和病毒感染晚期中的病毒體出芽。m1/m2和ns1/ns2(nep)病毒蛋白分別通過來自m和ns段的選擇性剪接的mrna表達(dá)。盡管來自m或ns段的蛋白不直接牽涉入病毒聚合酶復(fù)合體中，但有提示病毒復(fù)制可通過調(diào)節(jié)m1/m2和ns1/nep(ns2)mrna的選擇性剪接調(diào)節(jié)。盡管流感病毒利用病毒聚合酶復(fù)制并利用帽搶奪（cap-snatching）機(jī)制轉(zhuǎn)錄病毒基因組，但認(rèn)為對于mrna剪接病毒依賴于宿主機(jī)構(gòu)。剪接的ns和mmrna的表達(dá)受到高度調(diào)節(jié)。發(fā)現(xiàn)ns1通過與cpsf相互作用抑制宿主前體mrna剪接并且還可對病毒mrna具有相同作用。

先前的研究顯示病毒和宿主機(jī)制二者均牽涉mmrna的差異剪接的調(diào)節(jié)。由于m1和m2蛋白具有病毒感染的不同階段，例如rnp核輸出、病毒組裝和出芽過程所需的基本功能，控制m1和m2表達(dá)的時間以優(yōu)化病毒基因組復(fù)制的效率對病毒感染至關(guān)重要。vrnam段的3’ncr含有25個核苷酸，其包含用于轉(zhuǎn)錄起始的啟動子和用于mrna的轉(zhuǎn)錄后加工的選擇性剪接位點(圖16a)。病毒聚合酶復(fù)合體可結(jié)合到ncr啟動子區(qū)以封閉用于mrna3表達(dá)的剪接位點，導(dǎo)致替代地利用另一個用于m2mrna的剪接位點。另一個研究發(fā)現(xiàn)在病毒復(fù)制中ns1蛋白調(diào)節(jié)m2的積累。然而，在用delns1病毒感染的vero細(xì)胞中未觀察到ns1對m2積累的調(diào)節(jié)作用。

通過構(gòu)建從a/wsn/33流感病毒毒株衍生的ns1缺失病毒研究了ns1蛋白在病毒復(fù)制中的作用。幾次傳代后delns1病毒中出現(xiàn)m段的非編碼區(qū)中的a14u置換。在細(xì)胞中delns1-m-a14u病毒能夠復(fù)制至與野生型病毒大致相似的水平，表明了ns1蛋白與mvrna轉(zhuǎn)錄或復(fù)制之間的功能連接。從mvrna表達(dá)四種mnra，m1、m2、mrna3和m4。delns1-m-a14u病毒表達(dá)升高水平的從m1mrna剪接的m2，同時抑制mrna3的表達(dá)，這將ns1的作用與m轉(zhuǎn)錄物的選擇性剪接的調(diào)節(jié)相聯(lián)系。a14u對mmrna的選擇性剪接的作用的證據(jù)來自在缺乏其它病毒蛋白時進(jìn)行的包含a14u和其它置換的m段的表達(dá)分析。m-a14u段表達(dá)更高水平的m2蛋白，而m1的水平未改變(圖18b)，提示a14u置換有利于通過宿主剪接機(jī)構(gòu)產(chǎn)生m2。

a14u恰好位于用于mrna3表達(dá)的剪接供體位點內(nèi)(圖16a)，并且似乎有可能該置換消除或影響剪接因子與該基序的結(jié)合，導(dǎo)致選擇鄰近的替代地產(chǎn)生m2mrna的剪接供體位點。該假設(shè)受到該位點的其它置換在缺乏其它病毒蛋白時也增強(qiáng)m2表達(dá)這一證據(jù)的支持(圖18b)。病毒感染之前用ns1-表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞對ns1表達(dá)的恢復(fù)顯著增加delns1-m-wt病毒-感染細(xì)胞中的m2/m1mrna比率，證實ns1直接牽涉m2mrna剪接的調(diào)節(jié)。

a14u置換可具有雙重作用，調(diào)節(jié)vrna合成和mrna剪接，這是因為與delns1-m-wt感染相比mvrna的水平在delns1-m-a14u病毒感染中顯著增強(qiáng)，而對于npvrna未觀察到相似作用。因此，mvrna3’啟動子區(qū)中a14u置換的復(fù)合作用將導(dǎo)致更高的病毒聚合酶復(fù)合體效率，產(chǎn)生更多的vrna用于轉(zhuǎn)錄為mrna，與mrna3剪接位點的封閉組合以允許m2mrna表達(dá)。盡管ns1蛋白不被認(rèn)為是病毒復(fù)制的基本元件，但其作為宿主抗病毒活性的拮抗物具有多重功能。

因此，對于缺乏ns1的病毒在細(xì)胞中復(fù)制，將需要對抗宿主抗病毒活性的替代的病毒元件。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在流感病毒感染期間m2蛋白與炎癥小體和自噬體相互作用。因此，對于處于其中缺乏ns1的條件下的病毒維持最佳復(fù)制可能需要m2，因此為了該目的選擇a14u適應(yīng)性突變體以驅(qū)動較高水平的m2表達(dá)。

由于病毒感染期間ns1干擾先天和適應(yīng)性免疫應(yīng)答二者并且為流感毒力決定因子，delns1病毒被認(rèn)為是有希望的減弱活疫苗候選。動物實驗顯示缺乏ns1的減弱活疫苗可誘發(fā)更好的免疫應(yīng)答。然而，ns1的缺失嚴(yán)重影響病毒復(fù)制，并且難以產(chǎn)生高滴度的減弱病毒用于疫苗應(yīng)用。在本領(lǐng)域先前的將ns1-缺陷病毒繁殖至高滴度的嘗試中，發(fā)現(xiàn)delns1病毒受限于在有限的系統(tǒng)中擴(kuò)增，例如，在ifn-缺陷系統(tǒng)或在ns1-表達(dá)系統(tǒng)中。本發(fā)明證明m段的ncr中的a14u置換足以支持delns1病毒在mdck和vero細(xì)胞二者中復(fù)制至接近野生型病毒的水平。a14u置換在a/wsn/33和a/pr/8/34毒株中對delns1病毒復(fù)制的作用可外推至其它流感病毒毒株和亞型。

實施例9–delns1疫苗保護(hù)小鼠免于野生型病毒的致死劑量攻擊

接種h7n9delns1疫苗對小鼠無有害作用并且提供對野生型h7n9病毒的致死劑量攻擊的全面保護(hù)。接種h1n1delns1疫苗對小鼠無有害作用并且在輕微延遲反應(yīng)之后提供對野生型h7n9病毒的致死劑量攻擊的保護(hù)，表明delns1疫苗提供對異-亞型病毒感染的交叉保護(hù)。盡管裂解h7n9疫苗能夠保護(hù)小鼠免于致死攻擊，但該保護(hù)作用小于用h7n9或h1n1delns1疫苗。

本發(fā)明提供一種簡單和可靠的經(jīng)由在病毒內(nèi)部基因之一中引入置換生產(chǎn)任何亞型的甲型流感病毒的無毒毒株的方法。僅以內(nèi)部基因段之一中的簡單修飾，ns1-缺失病毒即可容易地拯救并繁殖至高滴度，與野生型病毒相當(dāng)。在本發(fā)明所提供的方法中，delns1病毒可不使用輔助病毒而容易地從普通細(xì)胞系拯救并且病毒可在細(xì)胞或卵中繁殖至相對高的滴度。編碼病毒基質(zhì)膜蛋白的基因組m段中的單一核苷酸置換對相應(yīng)ns1缺失病毒經(jīng)由反向遺傳學(xué)的高拯救效率已經(jīng)足夠。由于其在vero細(xì)胞或卵中容易繁殖和已很好地表征的安全性質(zhì)，該ns1-del流感病毒疫苗系統(tǒng)具有其它潛在的應(yīng)用。除了用作甲型流感病毒的多種亞型，包括未來的大流行毒株的減弱活疫苗之外，delns1流感病毒疫苗可用于制造預(yù)防當(dāng)前仍無疫苗的其它呼吸道病毒劑的疫苗。從ns1缺失所產(chǎn)生的空間可插入來自其它病毒例如mers冠狀病毒或ebola的另一個基因段以誘發(fā)細(xì)胞-介導(dǎo)的免疫來對抗這些病原體感染。

應(yīng)理解的是本文所述的實施例和實施方案僅為了說明目的并且根據(jù)此將為本領(lǐng)域技術(shù)人員提示多種修飾或變化，這些修飾和變化包含在本申請的精神和范圍內(nèi)。另外，本文所公開的任何發(fā)明或其實施方案的任何元素或限制可以與任何和/或所有其它元素或限制(單獨或任意組合)或本文所公開的任何其它發(fā)明或其實施方案組合，并且所有這些組合考慮在本發(fā)明的范圍內(nèi)而不對其進(jìn)行限制。