本發(fā)明一般地涉及可用于治療牙齒脫礦的合成蛋白酶抗性肽(syntheticproteinase-resistantpeptide)，包括基于唾液富酪蛋白的融合肽，以及可用于治療牙齒脫礦的蛋白質和肽的遞送系統(tǒng)。

背景技術：

根據(jù)世界衛(wèi)生組織(who)，如今口腔健康已經(jīng)成為整體健康、生活福祉和質量的重要指標。它是世界上最重要的健康管理問題之一，但不幸由于包括社會經(jīng)濟和缺乏意識等種種原因而受到嚴重忽視?？谇唤】禒顩r差導致發(fā)生更嚴重的，有時候甚至惡化的健康并發(fā)癥。這包括在突然發(fā)生心腦血管疾病、卒中、糖尿病發(fā)展、肝臟問題、不良呼吸道并發(fā)癥，妊娠并發(fā)癥以及更多往往具有極端后果的健康問題中直接/間接牽涉到的較差口腔健康。

齲齒是加拿大人口中最常見的慢性病。數(shù)百萬加拿大人失去牙齒，忍受痛苦，并發(fā)展出促成全身疾病如心血管疾病、糖尿病、不良妊娠結局和肺部感染的口腔感染。2004年，加拿大牙醫(yī)服務總額估計為88億美元。在直接成本方面，加拿大的牙科護理現(xiàn)在是包含不同年齡組的大多數(shù)人群中位于心血管疾病之后第二昂貴的疾病類別。人類口腔是不同類型微生物緊密交織多元培養(yǎng)群落的最佳實例之一。這個聯(lián)合體包括不同種類的革蘭氏陽性細菌和革蘭氏陰性細菌，涵蓋了眾多球菌、桿菌、放線菌以及其它能動(motile)和非能動(non-motile)形式，包括不同類型的酵母、真菌和病毒。根據(jù)保守估計，基于體外培養(yǎng)、pcr擴增、16srrna分子分型和熱解測序技術，在口腔中存在多于1000種的不同類型的微生物，它們以浮游形式在唾液中和以高度專一性協(xié)作伙伴關系的多層混合物種生物膜形式在牙齒表面和其它表面上同時共存。這些生物膜通過共同粘附和共聚合的過程與aep的相互作用，以及通過遺傳多樣性微生物之間的特定細胞-細胞相互作用，例如，牙齦二氧化碳嗜纖維菌(capnocytophagagingivalis)和衣氏放線菌(actinomycesisraelii)之間或洛氏普雷沃菌(prevotellaloescheii)和血鏈球菌(streptococcussanguinis)之間各自的細胞間相互作用，而形成。

在口腔中，牙釉質獲得性膜(acquiredenamelpellicle，aep)是一種作為牙釉質表面保護性覆蓋物的包裹物或薄膜。它是特定唾液蛋白、片段、小肽、完整天然蛋白、脂質、碳水化合物和食物顆粒的復雜生物多層異質混合物。其充當口腔中牙釉質表面和第一層微生物生物膜之間的界面。一方面，它通過抵抗牙釉質脫礦化，促進再礦化，減少咀嚼期間的牙釉質機械損傷并調節(jié)aep上的早期微生物定殖組合物來保護牙齒表面。另一方面，它作為許多機會性致病微生物的對接平臺，包括白色念珠菌(candidaalbican)和變形鏈球菌(streptococcusmutans)，其分別是口腔念珠菌病和齲齒的致病菌。這些病原體通過與其它早期和晚期定殖物(colonizers)的共同粘附和共聚合在aep上形成多層生物膜。生物膜是高度復雜、代謝相互依存的且是一個獨立的多物種群落。它們由aep蛋白質和口腔微生物群落之間復雜的物種間和物種內相互作用形成。主要由水(～96-97％)、碳水化合物(1-2％)和蛋白質(<1％)組成。它們具有高度復雜的通道網(wǎng)絡和流體填充的細胞間隙，用于促進營養(yǎng)、酶和代謝物交換，細胞間通訊(intercellularcommunication)以及廢物和其它溶質的清除。這些網(wǎng)絡還由于菌落密度的差異導致廢物的局部積聚和去除，從而造成不同的ph梯度微環(huán)境。

生物膜群落組成嚴格受aep蛋白質組成和微生物與aep組分蛋白之間的高度專一性相互作用支配和控制。與aep相關的主要唾液蛋白家族分別包括酸性富脯氨酸蛋白(aprp)、堿性prp、α-淀粉酶、muc5b、凝集素(agglutinin)、胱抑素(cystatin)、組胺素(histatin)和唾液富酪蛋白(statherin)。aep形成本身是早期薄膜蛋白質在牙釉質上的多階段、動態(tài)、高度競爭和選擇性吸附過程。它占唾液中存在的約2300種蛋白中的約5％。對于形成齲齒，口腔中的細菌必須首先粘附并定殖在牙齒結構上以形成生物膜(通常稱為牙菌斑)?？刂圃谘例X表面定殖的生物種類和數(shù)量的主要驅動力是由牙釉質獲得性膜施加的。aep在牙齒表面上形成相對不溶的結構，其充當牙齒的礦物相和牙菌斑之間的界面。aep對牙齒的礦物質穩(wěn)態(tài)表現(xiàn)出許多理想的特性，包括：1)抗牙釉質脫礦化的部分保護，2)促進牙釉質再礦化，3)防止牙齒表面的晶體生長，4)降低咀嚼期間摩擦力，和5)影響早期微生物定殖物的附著。由于薄膜作為口腔生物膜發(fā)展的堅實支撐，aep組成在預防性牙科領域引起人們極大的興趣。此外，由于由微生物自身產(chǎn)生的細胞外聚合物質(eps)的存在，其作為生物膜的不透性和保護性覆蓋物，因此與浮游微生物相比，這些生物膜對抗微生物劑具有極高的抗性。它們不僅抵抗大多數(shù)可用抗生素的作用，而且抵抗人類免疫細胞的吞噬作用。這些生物膜很難控制和根除。近來病原微生物抗自然宿主防御的耐受性以及針對許多可用抗生素和其它殺菌藥物的多藥耐藥性(mdr)的廣泛傳播的出現(xiàn)已經(jīng)在全球引起了更嚴重的口腔和整體健康相關的威脅。

許多研究一直致力于揭示牙釉質獲得性膜(aep)的性質。aep中的蛋白主要來自唾液腺、細菌產(chǎn)物、牙齦溝液或口腔黏膜。然而，aep肽僅是這些蛋白經(jīng)細菌切割后的產(chǎn)物，并且可以保留或增加親本蛋白的功能特性。aep通過a)中和細菌代謝產(chǎn)生的酸和b)作為再礦化的選擇性滲透膜在牙穩(wěn)態(tài)中起著關鍵的作用。它還有助于決定最終形成微生物生物膜的早期微生物定殖物的組成。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)成熟的aep蛋白質組具有超過130種不同的天然蛋白和磷酸化蛋白，其大小范圍為150kda-5kda，其中約50％是小肽。根據(jù)這些蛋白質在aep發(fā)展中的作用，將其分為3個主要組；ca²⁺結合蛋白、po4^-結合蛋白和與其它唾液蛋白相互作用的蛋白。aep蛋白也根據(jù)其推定的生物功能進行分類，包括炎癥反應、免疫防御、抗微生物活性和再礦化能力。有關唾液和aep的更復雜方面，如蛋白相互作用、診斷和合成類似物的許多研究可能性仍有待深入調查。

aep主要蛋白質之一是唾液富酪蛋白(statherin)，其強有效地抑制主要和次要磷酸鈣沉淀，導致有助于牙釉質表面再礦化的過飽和唾液。唾液富酪蛋白的功能性肽位于n末端。最近，來自該區(qū)域的天然存在的aep肽被鑒定為牙釉質獲得性膜的成員。該肽由9個氨基酸dspspeekflr(其中sp是磷酸化絲氨酸)組成。與其它天然唾液富酪蛋白肽(statherinpeptide)相比，這種稱為dr9的肽鏈在所有研究的濃度中顯示出對羥基磷灰石生長抑制的顯著作用(p<0.05)。

鑒于上述情況，需要鑒定用于口腔健康維護的蛋白和/或肽片段。

技術實現(xiàn)要素：

現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，基于唾液富酪蛋白的融合肽可用于治療牙齒脫礦，包括需要牙釉質表面再礦化的病況。

因此，在本發(fā)明的一個方面，提供了一種新穎的基于唾液富酪蛋白的融合肽，其包含與牙釉質獲得性膜蛋白或肽融合的唾液富酪蛋白肽dsseekflr或其功能等同的肽。

在本發(fā)明的另一方面，提供了一種治療牙齒脫礦的方法。該方法包括使牙釉質表面與基于唾液富酪蛋白的融合肽接觸充分的時間段以提供治療的步驟。

在另一方面，提供了一種水凝膠包封的牙釉質保護性蛋白/肽。

本發(fā)明的這些實施例和其它實施例在發(fā)明詳述以及隨后的參考附圖中進行描述。

附圖簡要說明

圖1顯示了人唾液富酪蛋白(a)、組胺素-1(b)、組胺素-3(c)和組胺素-5(d)的氨基酸序列；

圖2圖示說明了在不同ph條件下溫育120分鐘時包封在殼聚糖納米顆粒中的牛血清白蛋白的釋放行為；

圖3圖示說明了殼聚糖納米顆粒保護組胺素5免于蛋白水解降解；

圖4圖示說明了殼聚糖納米顆?；騞r-9肽對磷酸鈣晶體生長抑制的影響；和

圖5圖示說明了在殼聚糖納米顆粒包封(csn)的組胺素5(his5)存在和不存在時，變形鏈球菌(streptococcusmutans)ua159的生長動力學。

發(fā)明詳述

在一個方面，提供了一種新穎的基于唾液富酪蛋白的融合肽，其包含與第二牙釉質獲得性膜蛋白或肽融合的唾液富酪蛋白肽(statherinpeptide)dsseekflr(seqidno：1)或其功能等同變體。所述基于唾液富酪蛋白的融合肽可用于治療牙齒脫礦。

本發(fā)明的融合肽包含唾液富酪蛋白肽dsseekflr或其功能等同變體。當術語“功能等同變體”涉及本文公開的唾液富酪蛋白肽(statherinpeptide)或其它蛋白和肽(例如組胺素蛋白和肽)時包括天然或非天然存在的變體，其基本上保留唾液富酪蛋白肽的生物學活性，例如治療牙齒脫礦?？梢詫ν僖焊焕业鞍纂倪M行非天然發(fā)生的合成改變以產(chǎn)生功能等同變體，其用于治療意義時可以具有更理想的特性，例如增加的活性或穩(wěn)定性。因此，唾液富酪蛋白肽的功能等同變體可以包括其類似物、片段和衍生物。

根據(jù)本發(fā)明的唾液富酪蛋白肽的功能等同類似物可以引入一個或更多個氨基酸取代、添加或缺失。氨基酸添加或缺失包括末端的和內部的添加或缺失以產(chǎn)生功能等同的肽。適宜的氨基酸添加或缺失的實例包括在蛋白內與活性并非緊密相關的位置產(chǎn)生的那些添加或缺失。關于氨基酸添加，在一個實施方案中，可以將唾液富酪蛋白內天然存在的一個或更多個氨基酸(如圖1所示)加入到唾液富酪蛋白肽，例如在肽的n-端或c-端。唾液富酪蛋白肽內的氨基酸取代，特別是保守氨基酸取代也可以產(chǎn)生其功能等同的類似物。保守取代的實例包括用另一非極性(疏水性)殘基例如丙氨酸、異亮氨酸、纈氨酸或甲硫氨酸取代非極性(疏水性)殘基例如丙氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸；用另一極性殘基取代極性(親水性)殘基例如精氨酸和賴氨酸之間，谷氨酰胺和天冬酰胺之間，谷氨酰胺和谷氨酸之間，以及甘氨酸和絲氨酸之間；用另一堿性殘基取代堿性殘基例如賴氨酸、精氨酸或組氨酸；或者用另一酸性殘基取代酸性殘基例如天冬氨酸或谷氨酸。

根據(jù)本發(fā)明的唾液富酪蛋白肽的功能等同衍生物是其中一個或更多個氨基酸殘基被化學衍生化的唾液富酪蛋白肽或其類似物或片段。氨基酸可以在氨基或羧基衍生化，或者另外一種選擇在其側鏈“r”基團衍生化。肽內氨基酸的衍生可以使肽具有更理想的特性例如增加的穩(wěn)定性或活性。例如，這樣的衍生化分子包括但不限于其中游離氨基已被衍生形成例如胺鹽酸鹽、對甲苯磺?；?、芐氧羰基、叔丁氧基羰基、氯乙?；蚣柞；哪切┓肿?。游離羧基可以被衍生化以形成例如鹽、甲酯和乙酯或其它類型的酯或酰肼。游離羥基可以被衍生化以形成例如o-酰基或o-烷基衍生物。還被包括作為衍生物的是如下的那些肽，其含有一個或更多個二十種標準氨基酸的天然存在的氨基酸衍生物，例如5-羥賴氨酸可以替代賴氨酸；高絲氨酸可以替代絲氨酸；以及鳥氨酸可以替代賴氨酸。還包括磷酸化衍生物，例如dspspeekflr。還包括肽的末端衍生化以防止化學降解或酶降解，包括n-端的乙?；?/p>

所述唾液富酪蛋白肽及其功能等同變體可以使用標準完善的固相肽合成方法(spps)制備。固相肽合成的兩種方法包括boc和fmoc方法。也可以使用基于重組技術的許多合適技術中的任何一種來制備這些肽。應當理解，這樣的技術是本領域技術人員公認的，并且涉及在遺傳工程化的宿主細胞中表達編碼唾液富酪蛋白肽的核酸。編碼唾液富酪蛋白肽的dna可以通過本領域公知的自動化技術來從頭合成，因為蛋白質和核酸序列是已知的。

功能等同變體不需要表現(xiàn)出與唾液富酪蛋白肽相同的活性，但將表現(xiàn)出足夠的活性以使其有效治療牙齒脫礦，例如至少約25％的唾液富酪蛋白肽的生物活性，優(yōu)選至少約50％或更高的唾液富酪蛋白肽的生物活性。

為了形成根據(jù)本發(fā)明的融合肽產(chǎn)物，將唾液富酪蛋白肽與第二牙釉質保護性蛋白或肽融合。所述第二牙釉質保護性蛋白/肽可以是牙釉質獲得性膜(aep)肽，或者可以是合成的牙釉質保護性肽，或是來自另一來源的牙釉質保護性肽，例如來自酸奶提取物或其它奶源的酪蛋白磷酸肽。在一個實施方案中，第二牙釉質保護性蛋白或肽可以是唾液富酪蛋白或肽，即形成二聚體，或者可以是唾液富酪蛋白肽的功能等同肽。在另一個實施方案中，第二牙釉質保護性肽可以是組胺素或組胺素的片段。例如，第二牙釉質保護性蛋白或肽可以是組胺素-1、組胺素-3或組胺素-5(衍生自組胺素3在tyr-24的蛋白水解切割)，其功能等同的片段，或者這些中任一個的功能等同的天然變體或合成變體。合適片段的實例是如上所述的組胺素-5的片段，例如稱為rr14的rkfhekhhshrgyr(seqidno：10)或其功能等同變體。在另一個實施方案中，融合肽可以包括唾液富酪蛋白肽，或不同的唾液富酪蛋白肽，或者第二牙釉質保護性肽，或不同的牙釉質保護性肽的一個或更多個額外的拷貝。

融合肽可以使用已有技術制備，如前所述。唾液富酪蛋白肽和第二牙釉質保護性肽的融合通過與連接實體相對的肽鍵進行；然而，還可以使用確實影響融合肽功能的接頭。

一旦制備并適當純化，根據(jù)本發(fā)明可以使用融合肽來治療哺乳動物的牙齒脫礦。如本文所用，術語“治療(動詞)”、“進行治療”或“治療(名詞)”是指有利地改變牙齒脫礦的方法，包括減緩、逆轉(即再礦化)、降低其進展的嚴重性或防止其進展的那些方法，以及用于治療念珠菌病、牙齦炎、其它口腔疾病等的方法。牙齒脫礦是指通常由于口腔的嚴苛酸性環(huán)境而導致的牙齒硬組織(例如牙釉質、牙本質和/或牙骨質)的破壞。脫礦和其它不利病況也可能由口腔中的有害微生物引起，例如，例如由變形鏈球菌(s.mutans)和白色念珠菌(c.albicans)引起的。因此，牙齒脫礦可能導致蛀牙(toothdecay)或齲齒(dentalcaries)和/或牙齒侵蝕。如本文所用，術語“哺乳動物”意在包括但不限于人類和家畜如狗、貓、馬、牛、豬、綿羊、山羊等。

根據(jù)本發(fā)明的實施方案，融合肽可以單獨施用或者與至少一種藥學上可接受的佐劑組合施用以用于牙齒脫礦的治療。術語“藥學上可接受的”是指可用于藥物和獸醫(yī)學領域，即沒有不可接受的毒性或其它不適合。藥學上可接受的佐劑的實例是常規(guī)用于肽類或核酸類藥物的那些佐劑，例如稀釋劑、賦形劑等?？蓞⒖肌皉emington's：thescienceandpracticeofpharmacy”，第21版，lippincottwilliams&wilkins，2005年，用作藥物制劑的一般指導。佐劑的選擇取決于組合物的預期施用方式。通過片劑、膠囊、溶液或懸浮液口服施用的組合物使用以下佐劑進行制備，所述佐劑包括淀粉如玉米淀粉和馬鈴薯淀粉；纖維素及其衍生物，包括羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素和乙酸纖維素；粉狀黃蓍膠；麥芽；明膠；滑石；硬脂酸；硬脂酸鎂；硫酸鈣；植物油如花生油、棉籽油、芝麻油、橄欖油和玉米油；多元醇如丙二醇、甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；瓊脂；海藻酸；水；等滲鹽水和磷酸鹽緩沖溶液。還可以存在潤濕劑、潤滑劑如月桂基硫酸鈉、穩(wěn)定劑、壓片劑、抗氧化劑、防腐劑、著色劑和調味劑?？梢允褂眠m當?shù)膲A例如甘油三酸酯基來制備用于局部施用的霜劑、凝膠、糊劑或軟膏，并且還可以含有表面活性劑。還可以制備氣溶膠制劑，其中使用合適的推進劑佐劑。也可以將其它佐劑加入到組合物中，而不管其施用方式如何，例如可以將抗微生物劑加入到組合物中，以防止長期保存期間微生物的生長。

為了治療牙齒脫礦，向哺乳動物施用治療有效量的融合肽。術語“治療有效量”是足以提供有益效果的唾液富酪蛋白融合肽的量，而同時不超過可能引起顯著不良反應的量。治療有效的融合肽的劑量將取決于許多因素，包括待治療的病況的性質以及被治療的特定個體。合適的使用劑量包括足以顯示牙釉質中礦物質損失的統(tǒng)計學顯著降低的劑量。在一個實施方案中，約100ng至100μg范圍內的劑量是適當?shù)摹?/p>

在本治療中，融合肽可以通過適于進入牙齒的途徑施用，例如口腔或局部應用。在一個實施方案中，融合肽以溶液的形式提供，用作牙齒清洗劑以便在牙齒周圍涮洗(swish)足夠的時間來治療牙齒脫礦。融合肽可以通過另一種方式以固體形式提供，例如片劑、膠囊或粉末的形式，其可以制備成溶液(通過加入合適的液體如水)用作清洗液。在另一個實施方案中，融合肽以凝膠或糊劑的形式提供以局部施用于牙齒，或用于刷牙。融合肽還可以提供在口香糖和其它可咀嚼的可食用或不可食用的物品(例如出牙產(chǎn)品、動物咀嚼玩具、咀嚼骨等)、膜/凝膠條或片中，或涂覆在口腔衛(wèi)生產(chǎn)品如牙刷、牙線、牙刮匙(dentalpick)上或者用于清潔牙齒的其它裝置上，以及其它口腔使用醫(yī)療裝置上。

如本領域技術人員將理解的，融合肽可以在本方法中與第二治療劑一起施用于哺乳動物，以便于牙科脫礦的治療。所述第二治療劑可以與融合肽或者組合或者分開地同時施用。作為另外一種選擇，可以在施用融合肽之前或之后施用第二治療劑。這種第二治療劑的實例包括可用于治療牙齒脫礦的另一種試劑，包括但不限于：氟化物、酪蛋白磷酸肽、無定形磷酸鈣、增白劑如過氧化物或碳酸氫鈉、密封劑、清新劑和/或抗微生物劑、藥用植物的草藥提取物(例如粉末或纖維形式的meswak^tm(來自山柑藤(salvadorapersica)植物的提取物)、neem(印度苦楝樹(azadirachtaindica)植物)、核桃等)及其組合。

融合肽也可以以編碼融合肽的核酸構建體施用。因此，包含與編碼第二牙釉質獲得性膜蛋白或肽的核酸融合的編碼唾液富酪蛋白肽如dsseekflr、其磷酸化形式(dspspeekflr)或其功能等同變體的核酸序列的構建體可用于治療牙齒脫礦。這樣的構建體可以使用任何適當?shù)挠糜谑┯煤怂岬募夹g來施用于哺乳動物，劑量足以表達治療有效量的融合肽，例如約100ng至100μg的融合肽。

在本發(fā)明的另一方面，在生物相容性聚合物遞送系統(tǒng)中提供了一種牙釉質保護性蛋白/肽，用于施用于口腔以治療牙齒脫礦。合適的牙釉質保護性蛋白或肽包括通過抵抗牙釉質脫礦化，促進再礦化，減少咀嚼期間的牙釉質機械損傷并防止微生物定殖和損傷來保護牙齒表面的蛋白質或肽。合適的牙釉質保護性蛋白/肽的實例包括但不限于本文所述的融合肽，唾液富酪蛋白或其功能等同的肽或組胺素蛋白/肽(例如本文所述的組胺素-1、組胺素-3、組胺素-5或功能等同的片段)。水凝膠遞送系統(tǒng)，例如殼聚糖、藻酸鹽、膠原蛋白、聚(烯丙胺)、功能等同的衍生水凝膠(例如維持生物相容性和包封性質的這些水凝膠的修飾形式)或其混合物提供了生物相容性顆粒，所述生物相容性顆粒提供了包封的蛋白/肽的受控釋放，從而保護蛋白/肽免受口腔惡劣環(huán)境中的降解。通過操縱物理或化學刺激如ph、離子強度、溫度、磁場或生物分子來觸發(fā)蛋白質釋放。例如，由于殼聚糖的ph敏感性，殼聚糖提供包封的牙釉質保護性蛋白/肽的受控釋放。在ph值高于6.5時，由于殼聚糖基質的去質子化，殼聚糖聚合物之間的排斥性降低。這導致殼聚糖孔隙的收縮、緊縮和閉合，防止牙釉質保護性蛋白/肽的釋放，而在口腔酸性條件(ph3-5)下，由于質子化，殼聚糖聚合物的排斥性增加。這導致殼聚糖基質膨脹和孔的開放，允許響應于特定環(huán)境線索以時空方式釋放包封的牙釉質保護性蛋白/肽。類似地，藻酸鹽基于其環(huán)境的離子強度提供包封的蛋白/肽的受控釋放，例如在正常的離子強度(例如唾液)下，藻酸鹽膠囊保留其內容物，而離子強度的增加將誘導藻酸鹽膠囊釋放其內容物。

通過在合適的ph(5-6)下將選定的水凝膠溶液和蛋白/肽與常規(guī)使用的交聯(lián)陰離子(例如焦磷酸鹽(ppi)和三聚磷酸鹽(tpp))組合來制備水凝膠包封的蛋白和/或肽，以允許膠凝而實現(xiàn)納米顆粒，優(yōu)選具有5-20nm范圍內的直徑，例如平均直徑約10nm。加載到納米顆粒中的蛋白或肽的量將隨著蛋白/肽而變化，然而，通?？梢詫崿F(xiàn)納克范圍內的量。

水凝膠包封的蛋白和/或肽納米顆?？梢耘渲茷橐匀玑槍谕僖焊焕业鞍椎娜诤想乃龅姆绞接糜谥委熝例X脫礦，例如配制為口腔(oral)或局部(topical)應用。合適的使用劑量包括足以顯示牙釉質礦物質損失的統(tǒng)計學顯著降低的劑量。在一個實施方案中，合適的納米顆粒劑量是遞送約100ng至100μg范圍內的量的牙釉質保護性蛋白/肽所需的劑量。

如上所述，納米顆?？梢粤硗馀c第二治療劑聯(lián)合使用，或者組合或者同時或者之前或者之后使用以增強其效果。

本發(fā)明的實施方案在以下的具體實施例中描述，其不被解釋為進行限制。

實施例

實施例1–基于唾液富酪蛋白的融合肽

材料和方法

如前所述進行牙釉質樣品制備(siqueiraet.al.2010,jdentres.2010；89:626-630，其相關內容通過引用并入本文)。簡而言之，清潔、沖洗和切片無缺陷的人類第一恒磨牙。移除牙根后，使用金剛石鋸將牙冠徑向切割成4個切片(每個厚度為300μm)，然后使用砂紙打磨至150μm的厚度。每個樣品涂有一層光固化牙齒粘合劑(3mespescotchbond^tmuniversal)和指甲油，不包括天然表面牙釉質上未經(jīng)觸動的2mm窗口。

將樣品隨機分為7組(每組n＝12)，如表1所示。

表1本研究中使用的構建肽，來源于唾液富酪蛋白和組胺素

將每個樣品浸沒在1mg/ml構建肽溶液或蒸餾水(對照組)中，并在37℃下溫育2小時。此后，將樣品在37℃浸沒在1ml脫礦溶液(0.05m乙酸；2.2mmcacl2；2.2mmnah2po4；ph4.5)中12天。之后，用蒸餾水徹底清洗，并用濾紙干燥除去任何剩余的殘留酸。剩余的1ml酸性溶液用于評估在去礦質過程中從牙釉質中釋放的鈣和磷酸鹽濃度。

使用定量比色鈣測定(quantichrom^tmcalciumassaykit，bioassaysystems，hayward，calif.，usa)利用uv-可見分光光度計測定在612nm波長處的光密度以評估溶液的鈣濃度。使用比色測定(picolorlock^tmgolddetectionsystem，innovabiosciences，cambridge，u.k.)和uv-可見分光光度計測定在635nm波長處的光密度以評估磷酸鹽濃度。所有樣品一式兩份進行分析。使用anova和tukeyrangetest進行統(tǒng)計學分析。

結果

平均磷酸鹽和鈣濃度值和標準偏差如表2所示。不共享字母的平均值顯著不同。

表2從人牙釉質釋放的鈣和磷酸鹽的平均值/標準偏差

注：根據(jù)tukey的測試，不同的字母上標表示統(tǒng)計學差異，同一字母上標表示無統(tǒng)計學差異。

對磷酸鹽和鈣二者獲得了相同的相對結果。由橋連接的功能域(dr9-vpagl-rr14和dr9-vplsl-rr14)相比對照沒有提供任何增加的脫礦保護。涂覆有dr9-dr9的樣品顯示出最低的礦物質損失，其顯示出擴大的牙釉質脫礦保護。組合肽(dr9-rr14)在組間保持居中值，與對照組和dr9-dr9顯著不同。

結論

用特定氨基酸序列(橋)連接的唾液富酪蛋白和組胺素功能結構域在礦物質穩(wěn)態(tài)中不提供任何功能改進。組合肽(dr9-rr14)能夠保持前體蛋白之一唾液富酪蛋白的生物學功能。與單一dr9或唾液富酪蛋白相比，dr9-dr9擴大了牙釉質脫礦保護，證明功能域倍增是一種強大的蛋白質進化途徑。

實施例2–殼聚糖微粒

殼聚糖微粒構建：將殼聚糖以不同濃度(0.05、0.1、0.25和0.35％)溶解在0.1-2％乙酸中。將這些殼聚糖溶液在噴霧干燥器中干燥以制備殼聚糖微粒。噴霧干燥參數(shù)包括：入口溫度(157-175℃)和出口溫度(97-105℃)，液體進料流速(1.5-5ml/min)經(jīng)優(yōu)化用于制造均質且均勻大小的顆粒。使用zeta-sizer和掃描電子顯微鏡(sem)表征cp顆粒的尺寸范圍、表面形態(tài)和形貌。初步數(shù)據(jù)闡明了構建殼聚糖顆粒的能力。該實驗使用在0.1％(v/v)乙酸溶液中的0.25％殼聚糖(w/v)，進口溫度為158℃，出口溫度為97℃，流速為1.5ml/min。收集的顆粒用于sem成像，其中觀察到粒徑范圍為1.5-3.0μm。

殼聚糖納米顆粒構建：使用離子凝膠法構建殼聚糖納米顆粒。如上所述將相同濃度的殼聚糖溶于乙酸(1.75×濃度的殼聚糖)中。將三聚五磷酸鈉(stpp)溶液(v/v)與殼聚糖溶液混合以構建納米顆粒。不同的離子凝膠參數(shù)如殼聚糖濃度、殼聚糖/stpp質量比和殼聚糖溶液ph影響經(jīng)優(yōu)化用于構建均質、單分散和均勻尺寸的顆粒。zeta-sizer、zeta電位和tem將用于表征殼聚糖顆粒的尺寸范圍、表面電荷、形態(tài)和形貌。通過cs/stpp離子凝膠化反應進行了構建殼聚糖納米微粒的預試驗。在磁力攪拌器上持續(xù)攪拌過夜將殼聚糖0.25％(w/v)溶解在含有0-0.5％吐溫-80表面活性劑的乙酸溶液(v/v)(1.75x殼聚糖的濃度)中。用1-2mnaoh將溶液的ph調節(jié)至4.0-5.9。將stpp溶液(0.21-6.72mg/ml)逐滴加入殼聚糖溶液中，在磁力攪拌器上以200-1200rpm連續(xù)過夜混合。凍干的殼聚糖顆粒用于tem。使用動態(tài)激光散射(dls)進行膠體懸浮液的流體動力學zeta尺寸測定(hydrodynamiczetasizing)。實現(xiàn)納米顆粒范圍為9.8至11.8nm，并在10.5nm的平均尺寸之內的zeta尺寸分布(zetasizeddistribution)。

通過殼聚糖/tpp離子凝膠化反應進行構建殼聚糖納米顆粒的其它試驗，其中溶解在hcl溶液中的殼聚糖濃度范圍為0.01％至0.1％(8mm；7μl12mhcl/10ml殼聚糖溶液v/v)。三聚磷酸酯(tpp)的濃度范圍為0.01至0.1％。殼聚糖和tpp溶液的初始ph設定為5.5。攪拌速度設定為800rpm。tpp最終濃度范圍為0.01-0.022％。納米懸浮液的最終ph范圍為5.6-6.0。測試所有這些參數(shù)以確定殼聚糖納米顆粒尺寸。使用動態(tài)激光散射和zeta電位表征殼聚糖納米顆粒。殼聚糖納米顆粒流體動力學直徑范圍為120至750nm。另外，納米顆粒表現(xiàn)出正表面電荷，且殼聚糖納米顆粒的zeta電位范圍為26.2±1.8至11.6±2.8mv。

殼聚糖微粒和納米顆粒中aep的包封：基于殼聚糖微粒和納米顆粒構建優(yōu)化參數(shù)，將aep直接與殼聚糖溶液混合。如上所述構建殼聚糖微粒和納米顆粒，并通過zeta尺寸篩選(zetasizing)和sem來表征顆粒。使用反相高效液相色譜(rp-hplc)和/或酶聯(lián)免疫吸附測定法(elisa)通過測量包封程序之前和之后游離肽的量來確定包封程度。

進行組胺素5、dr-9、rr-14和牛血清白蛋白的殼聚糖包封以測定殼聚糖包封率。elisa測定法評估剩余的未包封的蛋白質或肽。結果表明蛋白/肽包封效率范圍為75％至93％，這取決于包封的肽或蛋白(表2)。

表2

包封dr-9的殼聚糖納米顆粒顯示zeta電位為25.53±1.40。因此，殼聚糖包封產(chǎn)生穩(wěn)定的納米顆粒，其將促進aep蛋白/肽進入口腔的遞送和分布。

ph誘導釋放機制：包封的肽釋放研究在包括寬范圍的酸性至堿性ph值(3、4、4.5、5、5.5、6.8、7、7.4和11)的緩沖液中進行。仔細選擇這項研究的ph值以與最常見的口腔環(huán)境事件如牙齒侵蝕(ph3)、齲齒(ph4.5-5.5)或生理唾液ph(ph6.8)相關。將包封在殼聚糖中的相當于800μm的肽在37℃和室溫伴隨35rpm的攪動于5ml不同ph的緩沖液中溫育。以時間間隔(0、5、10、30、60、120、300分鐘)測量從殼聚糖釋放的肽的量。使用rp-hplc來確定每個時間點的肽釋放水平。另外，通過如上所述的zeta尺寸篩選(zetasizing)和sem來測量由ph誘導的膨脹和收縮行為引起的殼聚糖顆粒的尺寸變化。

用殼聚糖包封的牛血清白蛋白納米顆粒在ph7.0(磷酸鹽緩沖液)、ph5.0(乙酸鹽緩沖液)或ph3.0(乙酸)的緩沖液中溫育。用這些特定ph條件處理后，使用elisa測定法測定殼聚糖納米顆粒的蛋白釋放。在ph3.0(與牙齒侵蝕相關的ph)和ph5.0(與齲齒相關的ph)中，牛血清白蛋白的釋放分別是經(jīng)ph7.0(與天然唾液ph相關的ph)處理時的35倍和17倍(圖2)。

蛋白酶保護：將用殼聚糖包封的相當于400μm的唾液蛋白加入到1:5稀釋的全唾液上清液中，并在37℃進一步溫育0、30、60和120分鐘。在初步研究中，唾液的稀釋延緩了降解過程，促進了唾液蛋白的分析。作為對照，將400μm未經(jīng)殼聚糖包封的選定唾液蛋白用1:5稀釋的全唾液上清液于相同時間點進行溫育。還使用第二種對照，其中用殼多糖包封的唾液蛋白用蒸餾水在37℃于相同時間點進行溫育。在加入全唾液上清液后即刻(t＝0)，以及在每個所示的溫育期后，取出樣品，然后煮沸5分鐘以完全破壞蛋白水解活性。煮沸后，將樣品進行反相高效液相色譜(rp-hplc)，以最后確定來自每個時間點的用殼聚糖包封(或未包封)的唾液蛋白的殘存/降解水平。簡言之，將樣品干燥，重懸浮于0.1％tfa中，用0.22μm過濾器(pallcorporation，annarbor，mi)澄清，并施加到與hplc(waters，watford，uk)相連的c¹⁸柱(vydac218ms，4.6×250mm，deerfield，il)上。經(jīng)110分鐘，以1.3ml/min用含有80％乙腈、19.9％h2o和0.1％tfa的緩沖液b的0-55％線性梯度洗脫測試唾液蛋白及其潛在的蛋白片段。在214和230nm處監(jiān)測來自rp-hplc運行的洗脫液。在不同時間點測量與完整測試唾液蛋白相關的峰面積并轉化為百分比值。

將包封在殼聚糖納米顆粒中的和未包封的組胺素5在1:5稀釋的全唾液上清液中溫育。結果表明，殼聚糖納米顆粒能夠保護組胺素5免于蛋白水解降解，從而在全唾液環(huán)境中增加該蛋白的壽命(圖3)。

通過殼聚糖包封的aep蛋白/肽抑制過飽和磷酸鈣溶液的自發(fā)沉淀：為了研究殼聚糖包封的aep蛋白/肽防止晶體生長的能力，將微量滴定板用蛋白/肽在室溫于hepes緩沖液中包被1小時。洗滌孔，然后加入含有磷酸鹽(15mm；ph7.4)、nacl(150mm)和cacl2(50mm)的溶液。將溶液在室溫溫育4小時，形成羥基磷灰石晶體。此期間后，除去溶液，加入5％茜素紅s(ph4.2)，然后加入氯化十六烷基吡啶鎓(cerylpyridiniumchloride)。通過分光光度法在570nm處分析晶體產(chǎn)生。

結果表明，與沒有任何抑制劑的組相比，在所有測試濃度下，殼聚糖納米顆粒和dr-9(未包封)都顯示統(tǒng)計學上顯著的磷酸鈣晶體生長抑制(圖4)。該數(shù)據(jù)表明，dr-9(一種小的天然aep肽)和殼聚糖納米顆粒具有1)防止不希望的磷酸鈣晶體形成，2)促進牙釉質再礦化和3)抑制牙結石形成的有益作用。因此，特定aep蛋白/肽，例如dr-9用殼聚糖納米顆粒包封有望增強磷酸鈣晶體形成抑制作用。

殼聚糖包封唾液蛋白對牙釉質脫礦的影響：使用人牙釉質薄切片進行脫礦研究。使用顯微射線照相術分析牙釉質礦物質。為了確定選擇的殼聚糖包封的唾液蛋白對牙釉質脫礦的影響，首先在37℃將樹脂涂覆的牙釉質切片暴露于濃度為1.0mg/ml的含有殼聚糖包封的唾液蛋白的溶液中2小時。為了模擬齲齒的酸性環(huán)境，將殼聚糖包封的唾液蛋白和對照切片放入盛有3ml含2.2mmcacl2、2.2mmnah2po4,、5mm乙酸，ph4.5的脫礦溶液的獨立管中。將樣品在37℃溫和攪動下溫育12天。所有溶液含有3mm疊氮化鈉作為抑菌劑。脫礦期后立即用蒸餾水充分洗滌，并用濾紙干燥。通過比較暴露于酸性條件之前和之后拍攝的顯微射線照相來評估礦物質損失。

如上所述制備牙釉質片，并用殼聚糖納米顆粒、包封在殼聚糖納米顆粒中的dr-9、dr-9和0.05％naf(金標準組)涂覆。在一些組中，允許腮腺唾液首先吸附到牙釉質片上以模擬aep(表3)。在37℃輕輕攪拌進行吸附2小時。然后用蒸餾水洗滌牙釉質樣品，并浸沒在脫礦溶液(ph4.5)中12天。該溶液用于測量從牙釉質釋放的鈣和磷酸鹽的量。所有涂覆組顯示出比未涂覆組(對照組)統(tǒng)計學顯著的更高的保護。dr-9組顯示了中等程度的脫礦保護，而用殼聚糖納米顆粒包封的dr-9和naf組顯示出更好的酸保護(表3)。

表3

每列中的上標表示根據(jù)tukey測試在肽和對照中沒有統(tǒng)計學差異。p<0.05。每組n＝10。

殼聚糖包封的組胺素5對變形鏈球菌生長的影響：使用ph5的化學改性培養(yǎng)基(chemicallymodifiedmedium，cdm)測試殼聚糖包封的組胺素5(csnp-his5)和對照對變形鏈球菌ua159菌株生長的影響(如mashburn-warrenetal.molmicrobiol,2010.78(3):p.589-606中所述)。相對于沒有殼聚糖補充的對照，將變形鏈球菌早期滯后期細胞暴露于12μg/ml殼聚糖包封的histatin5構建體(csnp-his5)導致完全生長抑制(圖5)。另一方面，變形鏈球菌暴露于空殼聚糖納米顆粒(csnp)導致變形鏈球菌的損傷，但不完全破壞生長(圖5)。

篩選肽對變形鏈球菌生物膜形成的影響：在37℃和5％co2下，在含有10μg/ml殼聚糖包封的組胺素5(csnp-his-5)納米顆粒的ph5的化學限定培養(yǎng)基(chemiclalydefinedmedium，cdm)中變形鏈球菌ua159生物膜在聚苯乙烯微量滴定板上形成18小時。在具有未包封的殼聚糖載體(csnp)或在含有0.5％吐溫80的1mm磷酸鉀緩沖液存在下的cdm培養(yǎng)基中形成對照生物膜。溫育后，除去上清液，生物膜經(jīng)干燥并用0.1％結晶紫溶液染色。

共聚焦激光掃描顯微術(clsm)用于測量生物膜的生長。結果表明，相對于有或沒有csnp的對照，在存在10μg/mlcsnp-his5的情況下，生物膜形成顯著受損。此外，無組胺素5的csnp組表現(xiàn)出生物膜生長的部分減少，再次顯示殼聚糖納米顆粒在酸性環(huán)境下對細菌的抗微生物抑制作用。因此，由于作為殼聚糖包封和aep肽/蛋白質抗微生物活性的結果的協(xié)同作用，用殼聚糖包封的aep蛋白/肽增強了這些化合物抗變形鏈球菌的生物活性。