相關(guān)申請(qǐng)案的交叉引用

本專利申請(qǐng)案要求2014年10月02日提交的美國(guó)申請(qǐng)案序列號(hào)62/059,056及2015年2月24日提交的美國(guó)申請(qǐng)案序列號(hào)62/120,149的優(yōu)先權(quán)權(quán)益，所述申請(qǐng)案以引用的方式并入本文中。

發(fā)明背景

乙型肝炎病毒(縮寫為“hbv”)為肝dna病毒家族的成員。該病毒粒子(有時(shí)稱為病毒體)包括外脂質(zhì)膜及由蛋白質(zhì)構(gòu)成的二十面體狀核蛋白殼核心。核蛋白殼囊封病毒dna及具有反轉(zhuǎn)錄酶活性的dna聚合酶。外膜含有參與易感染細(xì)胞(典型地，肝臟肝細(xì)胞)的病毒結(jié)合及進(jìn)入的嵌埋蛋白質(zhì)。除感染性病毒粒子以外，可在已感染個(gè)體的血清中發(fā)現(xiàn)缺乏核心的絲狀及球形體。這些粒子不具傳染性且是由形成被稱為表面抗原(hbsag)的病毒體的表面的一部分且在病毒生命周期中過量產(chǎn)生的脂質(zhì)及蛋白質(zhì)構(gòu)成。

hbv的基因組由環(huán)狀dna組成，但其不同尋常，這是因?yàn)樵揹na不完全為雙鏈。全長(zhǎng)鏈的一端連接于病毒dna聚合酶。該基因組為3020至3320個(gè)核苷酸長(zhǎng)(對(duì)于全長(zhǎng)鏈)及1700至2800個(gè)核苷酸長(zhǎng)(對(duì)于較短鏈)。負(fù)義(非編碼)與病毒mrna互補(bǔ)。細(xì)胞感染后不久即在核中發(fā)現(xiàn)病毒dna。存在四種已知的由該基因組編碼的基因，稱為c、x、p及s。核心蛋白由基因c(hbcag)編碼，且其起始密碼子前面為產(chǎn)生前驅(qū)核心蛋白的上游同框aug起始密碼子。hbeag由前驅(qū)核心蛋白的蛋白水解處理產(chǎn)生。dna聚合酶由基因p編碼?；騭為編碼表面抗原(hbsag)的基因。hbsag基因?yàn)橐粋€(gè)長(zhǎng)開放閱讀框，但含有三個(gè)同框“起始”(atg)密碼子，從而將該基因分成三部分，即pre-s1、pre-s2及s。由于多個(gè)起始密碼子，故而產(chǎn)生稱為大、中及小的三種不同尺寸的多肽。尚未完全了解由基因x編碼的蛋白質(zhì)的功能，但其與發(fā)展肝癌相關(guān)。hbv的復(fù)制是復(fù)雜的過程。盡管復(fù)制發(fā)生在肝臟中，但該病毒擴(kuò)散至血液，在已感染人士的血液中發(fā)現(xiàn)病毒蛋白質(zhì)及針對(duì)其的抗體。hbv的結(jié)構(gòu)、復(fù)制及生物學(xué)性質(zhì)綜述于d.glebe及c.m.bremer,seminarsinliverdisease,第33卷,第2期,第103-112頁(yè)(2013)中。

人類感染hbv可導(dǎo)致傳染性發(fā)炎性肝臟疾病。已感染的個(gè)體可能多年不展現(xiàn)癥狀。據(jù)估計(jì)，全世界人口中約有三分之一已在其生命中的某一時(shí)間點(diǎn)經(jīng)感染，包括35000萬長(zhǎng)期攜帶者。

該病毒通過傳染性血液或體液暴露來傳播。圍產(chǎn)期感染也可為主要感染途徑。急性疾病造成肝臟發(fā)炎、嘔吐、黃疸及可能死亡。慢性乙型肝炎最終可能造成肝硬化及肝癌。

盡管大部分感染hbv的人士通過其免疫系統(tǒng)的作用清除該感染，但一些感染人士遭受侵襲性感染過程(猛暴型肝炎)；而其它為長(zhǎng)期感染，從而增加其肝臟疾病的幾率。目前已批準(zhǔn)若干種藥療法用于治療hbv感染，但已感染的個(gè)體以不同的成功程度響應(yīng)這些藥療法，且這些藥療法中無一種能從已感染人士體內(nèi)清除該病毒。

丁型肝炎病毒(hdv)為僅可在存在乙型肝炎病毒(hbv)的情況下繁殖的小環(huán)形包被rna病毒。具體而言，hdv需要hbv表面抗原蛋白來繁殖其自身。與僅感染hbv相比，感染hbv及hdv兩者導(dǎo)致更嚴(yán)重的并發(fā)癥。這些并發(fā)癥包括在急性感染時(shí)經(jīng)歷肝衰竭的可能性更大及快速進(jìn)展至肝硬化，慢性感染時(shí)發(fā)展肝癌的幾率增加。在所有肝炎感染中，丁型肝炎與乙型肝炎病毒的組合具有最高死亡率。hdv的傳播途徑類似于hbv。感染在很大程度上局限于處在高h(yuǎn)bv感染風(fēng)險(xiǎn)下的人士，尤其是注射藥物使用者，及接受凝血因子濃縮劑的人士。

因而，持續(xù)需要用于治療人的hbv感染以及用于治療人的hbv/hdv感染的組合物和方法。

發(fā)明概要

如本文中更充分描述，在一個(gè)方面，本發(fā)明提供經(jīng)分離的雙鏈sirna分子，所述分子各自包括有義鏈和與該有義鏈雜交的反義鏈。本發(fā)明這個(gè)方面的sirna靶向hbv基因組的一個(gè)或多個(gè)基因和/或轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。本發(fā)明這個(gè)方面的sirna分子的實(shí)例為本文中的表a中所闡述的sirna分子。本發(fā)明的sirna分子當(dāng)以治療量施用給感染hbv或hbv/hdv的人類受試者時(shí)可用于例如治療hbv感染和/或hdv感染。更一般而言，本發(fā)明提供能夠在體外及體內(nèi)抑制hbv基因表達(dá)或使其沉默的sirna分子。

在另一方面，本發(fā)明提供經(jīng)分離的單鏈核酸分子，諸如表a中所闡述的sirna分子的經(jīng)分離的有義鏈和反義鏈。上述經(jīng)分離的有義鏈和反義鏈闡述于本文中的表b中。如本文中更充分描述，本發(fā)明的sirna和單鏈核酸分子經(jīng)修飾且包括一個(gè)或多個(gè)una部分和/或一個(gè)或多個(gè)2'o-甲基修飾(參見例如表a及表b)。

本發(fā)明還提供包括一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明sirna分子(參見例如表a中所描述的sirna分子)的組合物，諸如藥物組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包括兩個(gè)不同的本發(fā)明sirna分子(例如，選自本文中的表a中所披露的sirna分子的兩個(gè)不同的sirna分子)的組合物。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包括三個(gè)不同的本發(fā)明sirna分子(例如，選自本文中的表a中所披露的sirna分子的三個(gè)不同的sirna分子)的組合物。選自本文中的表a中所披露的sirna分子的兩個(gè)不同的sirna分子的所有可能的組合(“二元組合”)闡述于本文中的實(shí)施例2中。選自本文中的表a中所披露的sirna分子的三個(gè)不同的sirna分子的所有可能的組合(“三元組合”)闡述于本文中的實(shí)施例3中。因而，在一個(gè)方面，本發(fā)明提供包括表a中所闡述的sirna的上述二元或三元組合之一的組合物(例如藥物組合物)。

本發(fā)明還提供核酸-脂質(zhì)粒子及其配制物，其中所述脂質(zhì)粒子各自包括本文中所描述的sirna、陽(yáng)離子脂質(zhì)及非陽(yáng)離子脂質(zhì)及任選存在的抑制粒子聚集的綴合脂質(zhì)中的一種或多種(例如混合液)?？砂ㄔ诒景l(fā)明脂質(zhì)粒子中的sirna分子的實(shí)例為表a中所闡述的sirna分子及上述sirna的組合(例如，本文中所描述的二元和三元組合)。典型地，sirna完全囊封在脂質(zhì)粒子內(nèi)。本發(fā)明的脂質(zhì)粒子可用于例如向感染hbv或hbv/hdv的人體細(xì)胞(例如，肝細(xì)胞)中遞送治療有效量的sirna，從而治療hbv感染和/或hdv感染和/或改善hbv感染和/或hdv感染的一種或多種癥狀。

本發(fā)明還提供一種藥物組合物，其包含靶向hbv基因表達(dá)的sirna分子之一或其混合液及藥學(xué)上可接受的載體。舉例而言，本發(fā)明提供各自包括表a中所闡述的靶向hbv基因表達(dá)的sirna分子中的一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)的藥物組合物。關(guān)于包括囊封于脂質(zhì)粒子內(nèi)的sirna混合液的配制物，不同的sirna分子可共囊封于同一脂質(zhì)粒子中，或混合液中所存在的各類型的sirna種類可囊封在其自身的粒子中，或一些sirna種類可共囊封于同一粒子中，而其它sirna種類囊封在配制物內(nèi)不同的粒子中。典型地，本發(fā)明的sirna分子完全囊封在脂質(zhì)粒子中。

本發(fā)明的核酸-脂質(zhì)粒子可用于向感染hbv或hbv/hdv的人預(yù)防性或治療性遞送使一個(gè)或多個(gè)hbv基因表達(dá)沉默的sirna分子，從而改善人的hbv感染和/或hdv感染的至少一種癥狀。在一些實(shí)施方案中，將本文中所描述的一種或多種sirna分子配制于核酸-脂質(zhì)粒子中，且將所述粒子施用給需要這種治療的哺乳動(dòng)物(例如，人)。在某些情況下，可向所述哺乳動(dòng)物施用治療有效量的核酸-脂質(zhì)粒子，(例如，用于治療人的hbv和/或hdv感染)。本發(fā)明的核酸-脂質(zhì)粒子尤其可用于靶向作為大部分hbv基因表達(dá)部位的人肝細(xì)胞。核酸-脂質(zhì)粒子的施用可通過本領(lǐng)域中已知的任何途徑，諸如經(jīng)口、鼻內(nèi)、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌肉內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、病灶內(nèi)、氣管內(nèi)、皮下或皮內(nèi)。在特定實(shí)施方案中，核酸-脂質(zhì)粒子全身施用，例如經(jīng)由經(jīng)腸或非經(jīng)腸施用途徑。

在一些實(shí)施方案中，通過在核酸-脂質(zhì)粒子施用之后檢測(cè)得自哺乳動(dòng)物的生物樣品中的hbvrna或蛋白水平來判定hbv基因表達(dá)下調(diào)。在其它實(shí)施方案中，通過在核酸-脂質(zhì)粒子施用之后檢測(cè)得自哺乳動(dòng)物的生物樣品中的hbvmrna或蛋白水平來判定hbv基因表達(dá)下調(diào)。在某些實(shí)施方案中，通過在粒子施用之后監(jiān)測(cè)哺乳動(dòng)物中與hbv感染相關(guān)的癥狀來檢測(cè)hbv基因表達(dá)下調(diào)。

在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供向活細(xì)胞中引入使hbv基因表達(dá)沉默的sirna的方法，所述方法包括在sirna得以進(jìn)入所述細(xì)胞且使所述細(xì)胞內(nèi)的乙型肝炎病毒基因表達(dá)沉默的條件下使所述細(xì)胞與本發(fā)明的核酸-脂質(zhì)粒子接觸的步驟，其中所述核酸-脂質(zhì)粒子包括靶向hbv的sirna。

在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種用于改善人的一種或多種與乙型肝炎病毒和/或丁型肝炎病毒感染相關(guān)的癥狀的方法，所述方法包括向所述人施用治療有效量的本發(fā)明核酸-脂質(zhì)粒子的步驟。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明這個(gè)方面的方法中所使用的核酸-脂質(zhì)粒子包括獨(dú)立地選自表a中所闡述的sirna的一種、兩種或三種或、更多種不同的sirna。

在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供在有需要的哺乳動(dòng)物(例如人)中使hbv基因表達(dá)沉默的方法，其中所述方法各自包括向所述哺乳動(dòng)物施用本發(fā)明的核酸-脂質(zhì)粒子的步驟。

在另一方面，本發(fā)明提供用于治療和/或改善人的一種或多種與hbv和/或hdv感染相關(guān)的癥狀的方法，其中所述方法各自包括向所述人施用治療有效量的本發(fā)明核酸-脂質(zhì)粒子的步驟。

本發(fā)明的某些實(shí)施方案提供通過向感染hdv的hdv個(gè)體施用治療有效量的一種或多種抑制hbv表面抗原合成的本發(fā)明組合物或核酸粒子來抑制hdv復(fù)制和/或改善hdv感染的一種或多種癥狀的組合物和方法。

在另一方面，本發(fā)明提供用于在有需要的哺乳動(dòng)物(例如，感染hbv或hbv/hdv的人)中抑制hbv表達(dá)的方法，其中所述方法各自包括向所述哺乳動(dòng)物施用治療有效量的本發(fā)明核酸-脂質(zhì)粒子的步驟。

在另一方面，本發(fā)明提供用于治療人的hbv和/或hdv感染的方法，其中所述方法各自包括向所述人施用治療有效量的本發(fā)明核酸-脂質(zhì)粒子的步驟。

在另一方面，本發(fā)明提供本發(fā)明的sirna分子用于在活細(xì)胞中抑制乙型肝炎病毒基因表達(dá)的用途。

在另一方面，本發(fā)明提供本發(fā)明的藥物組合物用于在活細(xì)胞中抑制乙型肝炎病毒基因表達(dá)的用途。

本發(fā)明的組合物(例如，sirna分子及其經(jīng)分離的有義鏈及反義鏈，及核酸-脂質(zhì)粒子)也可用于例如生物測(cè)定法(例如，體內(nèi)或體外測(cè)定法)中以得到對(duì)一種或多種hbv基因和/或轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的表達(dá)的抑制，從而研究hbv和/或hdv復(fù)制及生物學(xué)，和/或研究或調(diào)節(jié)一種或多種hbv基因或轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的功能。舉例而言，可使用生物測(cè)定法篩選本發(fā)明的sirna分子以鑒別可抑制hbv和/或hdv復(fù)制且作為用于治療人的hbv和/或hdv感染和/或改善與人的hbv和/或hdv感染相關(guān)的至少一種癥狀的候選治療劑的sirna分子。

根據(jù)以下詳細(xì)描述和圖，本發(fā)明的其它目標(biāo)、特征及優(yōu)勢(shì)對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員將顯而易見。

具體實(shí)施方式

引言

本文中所描述的sirna藥物療法有利地提供用于治療人類hbv和/或hdv感染及與其相關(guān)的癥狀的重要新組合物和方法。本發(fā)明的實(shí)施方案可例如每日一次、每周一次或每數(shù)周一次(例如，每?jī)芍?、三周、四周、五周或六周一?施用。

此外，本文中所描述的核酸-脂質(zhì)粒子使得能夠?qū)⒅T如sirna的核酸藥物有效遞送至體內(nèi)的靶組織和細(xì)胞中。脂質(zhì)粒子的存在可防止核酸酶在血流中降解，允許優(yōu)先在靶組織中累積且提供藥物進(jìn)入sirna可執(zhí)行其預(yù)定rna干擾功能的細(xì)胞質(zhì)的手段。

定義

除非另外說明，否則如本文中所使用，以下術(shù)語(yǔ)具有屬于其的含義。

術(shù)語(yǔ)“乙型肝炎病毒”(縮寫為hbv)是指作為病毒的肝病毒家族的一部分且能夠在人中引起肝臟發(fā)炎的正嗜肝dna病毒(orthohepadnavirus)屬病毒種類。

術(shù)語(yǔ)“丁型肝炎病毒”(縮寫為hdv)是指能夠在人中引起肝臟發(fā)炎的丁型肝炎病毒屬病毒種類。

如本文中所使用的術(shù)語(yǔ)“小干擾rna”或“sirna”是指當(dāng)sirna與靶基因或序列處于同一細(xì)胞中時(shí)能夠減少或抑制靶基因或序列的表達(dá)(例如，通過介導(dǎo)與sirna序列互補(bǔ)的mrna降解或抑制其翻譯)的雙鏈rna(即，雙鏈體rna)。sirna可與靶基因或序列具有實(shí)質(zhì)性或完全一致性，或可包含錯(cuò)配區(qū)(即，錯(cuò)配模體)。在某些實(shí)施方案中，sirna的長(zhǎng)度可為約19至25個(gè)(雙鏈體)核苷酸，且長(zhǎng)度優(yōu)選為約20至24、21至22或21至23個(gè)(雙鏈體)核苷酸。sirna雙鏈體可包含具有約1至約4個(gè)核苷酸或約2至約3個(gè)核苷酸的3'懸垂物及5'磷酸酯末端。sirna的實(shí)例包括而不限于由兩個(gè)獨(dú)立的分子組裝的雙鏈聚核苷酸分子，其中一條鏈為有義鏈且另一條鏈為互補(bǔ)反義鏈。

sirna優(yōu)選由化學(xué)方式合成。sirna也可通過用大腸桿菌rna酶iii或dicer使較長(zhǎng)dsrna(例如，長(zhǎng)度大于約25個(gè)核苷酸的dsrna)裂解來產(chǎn)生。這些酶將dsrna處理成生物學(xué)活性sirna(參見例如yang等人,proc.natl.acad.sci.usa,99:9942-9947(2002)；calegari等人,proc.natl.acad.sci.usa,99:14236(2002)；byrom等人,ambiontechnotes,10(1):4-6(2003)；kawasaki等人,nucleicacidsres.,31:981-987(2003)；knight等人,science,293:2269-2271(2001)；和robertson等人,j.biol.chem.,243:82(1968))。dsrna的長(zhǎng)度優(yōu)選為至少50個(gè)核苷酸至約100、200、300、400或500個(gè)核苷酸。dsrna的長(zhǎng)度可長(zhǎng)達(dá)1000、1500、2000、5000個(gè)核苷酸或更長(zhǎng)。dsrna可編碼完整基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或部分基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。在某些情況下，sirna可由質(zhì)粒編碼(例如，轉(zhuǎn)錄為自動(dòng)折疊成具有發(fā)夾環(huán)的雙鏈體的序列)。

詞組“抑制靶基因的表達(dá)”是指本發(fā)明的sirna能夠使靶基因(例如，hbv基因組內(nèi)的基因)的表達(dá)沉默、減少或受到抑制。為了研究基因沉默的程度，使測(cè)試樣品(例如，得自表達(dá)該靶基因的相關(guān)生物體的生物樣品或表達(dá)該靶基因的培養(yǎng)中細(xì)胞的樣品)與能使靶基因的表達(dá)沉默、減少或受到抑制的sirna接觸。將測(cè)試樣品中靶基因的表達(dá)與未與sirna接觸的對(duì)照樣品(例如，得自表達(dá)該靶基因的相關(guān)生物體的生物樣品或表達(dá)該靶基因的培養(yǎng)中細(xì)胞的樣品)中靶基因的表達(dá)相比較。對(duì)照樣品(例如，表達(dá)靶基因的樣品)可分配值100％。在特定實(shí)施方案中，當(dāng)測(cè)試樣品的值相對(duì)于對(duì)照樣品(例如，僅緩沖液、靶向不同的基因的sirna序列、錯(cuò)義sirna序列等)為約100％、99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％、85％、84％、83％、82％、81％、80％、79％、78％、77％、76％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％或0％時(shí)，達(dá)成靶基因的表達(dá)的沉默、抑制或減少。適合的測(cè)定法包括而不限于使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)檢查蛋白質(zhì)或mrna水平，諸如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的斑點(diǎn)印跡法、northern印跡法、原位雜交、elisa、免疫沈淀法、酶功能以及表型測(cè)定法。諸如sirna的治療性核酸的“有效量”或“治療有效量”為足以產(chǎn)生所要效應(yīng)，例如，與在不存在sirna的情況下所檢測(cè)的正常表達(dá)水平相比靶序列的表達(dá)受到抑制的量。在特定實(shí)施方案中，當(dāng)利用sirna所獲得的值相對(duì)于對(duì)照(例如，僅緩沖液、靶向不同的基因的sirna序列、錯(cuò)義sirna序列等)為約100％、99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％、85％、84％、83％、82％、81％、80％、79％、78％、77％、76％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％或0％時(shí)，達(dá)成對(duì)靶基因或靶序列的表達(dá)的抑制。適用于測(cè)量靶基因或靶序列的表達(dá)的測(cè)定法包括但不限于使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)檢查蛋白質(zhì)或mrna水平，諸如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的斑點(diǎn)印跡法、northern印跡法、原位雜交、elisa、免疫沈淀法、酶功能以及表型測(cè)定法。

如本文中所使用的術(shù)語(yǔ)“核酸”是指含有至少兩個(gè)呈單鏈或雙鏈形式的核苷酸(即，脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)的聚合物且包括dna和rna。“核苷酸”含有糖脫氧核糖(dna)或核糖(rna)、堿基及磷酸基。核苷酸經(jīng)由磷酸基連接在一起?！皦A基”包括嘌呤和嘧啶，其還包括天然化合物腺嘌呤、胸嘧啶、鳥嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、肌苷和天然類似物，及嘌呤和嘧啶的合成衍生物，其包括但不限于放置諸如但不限于胺、醇、硫醇、羧酸酯及烷基鹵化物的新反應(yīng)基團(tuán)的修飾。核酸包括含已知核苷酸類似物或經(jīng)修飾的主鏈殘基或鍵聯(lián)的核酸，其為合成的、天然存在的及非天然存在的且其具有與參考核酸類似的結(jié)合性質(zhì)。這種類似物和/或經(jīng)修飾的殘基的實(shí)例包括而不限于硫代磷酸酯、磷酰胺、甲基膦酸酯、手性甲基膦酸酯、2'-o-甲基核糖核苷酸及肽-核酸(pna)。另外，核酸可包括一個(gè)或多個(gè)una部分。

術(shù)語(yǔ)“核酸”包括任何寡核苷酸或聚核苷酸，其中含有至多60個(gè)核苷酸的片段一般稱為寡核苷酸，而更長(zhǎng)的片段稱為聚核苷酸。脫氧核糖寡核苷酸由稱為脫氧核糖的5-碳糖組成，該脫氧核糖該糖的5’與3’碳處被共價(jià)接合于磷酸，以形成交替的未分支鏈聚合物。dna可呈例如反義分子、質(zhì)粒dna、預(yù)凝聚dna、pcr產(chǎn)物、載體、表達(dá)盒、嵌合序列、染色體dna或這些群組的衍生物及組合形式。核糖寡核苷酸由類似的重復(fù)結(jié)構(gòu)組成，其中5-碳糖為核糖。rna可呈以下形式：小干擾rna(sirna)、dicer底物dsrna、小發(fā)夾rna(shrna)、不對(duì)稱干擾rna(airna)、微型rna(mirna)、mrna、trna、rrna、trna、病毒rna(vrna)及其組合。因此，在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)“聚核苷酸”和“寡核苷酸”是指由天然存在的堿基、糖和糖間(主鏈)鍵聯(lián)組成的核苷酸聚合物或寡聚物或核苷單體。術(shù)語(yǔ)“聚核苷酸”和“寡核苷酸”也包括包含非天然存在的單體的聚合物或寡聚物或其具有類似功能的部分。這種經(jīng)修飾或取代的寡核苷酸往往優(yōu)于天然形式，這是由于諸多性質(zhì)的原因，舉例而言，諸如增強(qiáng)的細(xì)胞攝取、降低的免疫原性及增加的在核酸酶存在下的穩(wěn)定性。

除非另外指示，否則特定核酸序列也隱含其經(jīng)保守修飾的變異體(例如，簡(jiǎn)并密碼子取代)、等位基因、直系同源物、snp和互補(bǔ)序列以及明確指示的序列。具體而言，簡(jiǎn)并密碼子取代可通過以下方式來達(dá)成：產(chǎn)生一個(gè)或多個(gè)所選(或所有)密碼子的第三位經(jīng)混合堿基和/或脫氧肌苷殘基取代的序列(batzer等,nucleicacidres.,19:5081(1991)；ohtsuka等,j.biol.chem.,260:2605-2608(1985)；rossolini等,mol.cell.probes,8:91-98(1994))。

本發(fā)明涵蓋經(jīng)分離或基本上純化的核酸分子及含有那些分子的組合物。在本發(fā)明的上下文中，“經(jīng)分離”或“經(jīng)純化”的dna分子或rna分子為除其天然環(huán)境中以外存在的dna分子或rna分子。經(jīng)分離的dna分子或rna分子可呈經(jīng)純化形式存在，或可存在于非天然環(huán)境中，舉例而言，諸如轉(zhuǎn)殖基因宿主細(xì)胞。舉例而言，“經(jīng)分離”或“經(jīng)純化”的核酸分子或其生物學(xué)活性部分當(dāng)通過重組技術(shù)產(chǎn)生時(shí)基本上不含其它細(xì)胞物質(zhì)或培養(yǎng)基或當(dāng)化學(xué)合成時(shí)基本上不含化學(xué)前驅(qū)物或其它化學(xué)物質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施方案中，“經(jīng)分離”的核酸不含在得到該核酸的生物體的基因組dna中天然地側(cè)接該核酸的序列(即，位于該核酸的5'及3'端的序列)。舉例而言，在各種實(shí)施方案中，經(jīng)分離的核酸分子可含有少于約5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb在得到該核酸的細(xì)胞的基因組dna中天然地側(cè)接該核酸分子的核苷酸序列。

術(shù)語(yǔ)“基因”是指包含產(chǎn)生多肽或前驅(qū)多肽所必需的編碼序列的部分長(zhǎng)度或整個(gè)長(zhǎng)度的核酸(例如，dna或rna)序列。

如本文中所使用的“基因產(chǎn)物”是指諸如rna轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或多肽的基因產(chǎn)物。

術(shù)語(yǔ)“解鎖核堿基類似物”(縮寫為“una”)是指核糖環(huán)的c2'原子與c3'原子非共價(jià)鍵聯(lián)的非環(huán)狀核堿基。術(shù)語(yǔ)“解鎖核堿基類似物”包括具有稱為結(jié)構(gòu)a的以下結(jié)構(gòu)的核堿基類似物：

結(jié)構(gòu)a

其中r為羥基，且堿基為任何天然或非天然堿基，舉例而言，諸如腺嘌呤(a)、胞嘧啶(c)、鳥嘌呤(g)及胸嘧啶(t)。可用于實(shí)施本發(fā)明的una包括美國(guó)專利序列號(hào)8,314,227中稱為非環(huán)狀2'-3'-閉聯(lián)核苷酸單體的分子，該專利以全文引用的方式并入本文中。

術(shù)語(yǔ)“脂質(zhì)”是指包括但不限于脂肪酸酯的有機(jī)化合物群組，且以不溶于水中但可溶于許多有機(jī)溶劑中為特征。其通常分成至少三類：(1)“簡(jiǎn)單脂質(zhì)”，其包括脂肪和油以及蠟；(2)“復(fù)合脂質(zhì)”，其包括磷脂和糖脂；及(3)“衍生脂質(zhì)”，諸如類固醇。

術(shù)語(yǔ)“脂質(zhì)粒子”包括可用于向相關(guān)靶部位(例如細(xì)胞、組織、器官及類似物)遞送治療性核酸(例如sirna)的脂質(zhì)配制物。在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的脂質(zhì)粒子典型地由陽(yáng)離子脂質(zhì)、非陽(yáng)離子脂質(zhì)及任選存在的可防止粒子聚集的已綴合脂質(zhì)形成。包括核酸分子(例如，sirna分子)的脂質(zhì)粒子稱為核酸-脂質(zhì)粒子。典型地，核酸完全囊封在脂質(zhì)粒子內(nèi)，從而保護(hù)核酸免于酶促降解。

在某些情況下，核酸-脂質(zhì)粒子非常適用于全身施用，這是由于其在靜脈內(nèi)(i.v.)注射后可展現(xiàn)較長(zhǎng)循環(huán)壽命、其可在遠(yuǎn)側(cè)部位(例如，與施用部位物理上隔開的部位)積聚且其可在這些遠(yuǎn)側(cè)部位介導(dǎo)靶基因表達(dá)的沉默。核酸可與凝聚劑復(fù)合且囊封在脂質(zhì)粒子內(nèi)，如pct公開案第wo00/03683號(hào)中所闡述，該案的公開內(nèi)容出于所有目的以全文引用的方式并入本文中。

本發(fā)明的脂質(zhì)粒子典型地具有約30nm至約150nm、約40nm至約150nm、約50nm至約150nm、約60nm至約130nm、約70nm至約110nm、約70nm至約100nm、約80nm至約100nm、約90nm至約100nm、約70至約90nm、約80nm至約90nm、約70nm至約80nm、或約30nm、35nm、40nm、45nm、50nm、55nm、60nm、65nm、70nm、75nm、80nm、85nm、90nm、95nm、100nm、105nm、110nm、115nm、120nm、125nm、130nm、135nm、140nm、145nm或150nm的平均直徑且基本上是無毒的。另外，當(dāng)存在于本發(fā)明的脂質(zhì)粒子中時(shí)，核酸在水溶液中抗核酸酶降解。核酸-脂質(zhì)粒子及其制備方法披露于例如美國(guó)專利公開案第20040142025號(hào)和第20070042031號(hào)中，其公開內(nèi)容出于所有目的以全文引用的方式并入本文中。

如本文中所使用，“經(jīng)脂質(zhì)囊封”可能是指提供諸如sirna的治療性核酸以完全囊封、部分囊封或兩者的脂質(zhì)粒子。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，核酸(例如，sirna)完全囊封于脂質(zhì)粒子中(例如，以形成核酸-脂質(zhì)粒子)。

術(shù)語(yǔ)“脂質(zhì)綴合物”是指抑制脂質(zhì)粒子聚集的綴合脂質(zhì)。所述脂質(zhì)綴合物包括但不限于peg-脂質(zhì)綴合物，諸如與二烷基氧基丙基偶合的peg(例如，peg-daa綴合物)、與二?；视团己系膒eg(例如，peg-dag綴合物)、與膽固醇偶合的peg、與磷脂?；掖及放己系膒eg及與神經(jīng)酰胺綴合的peg(參見例如美國(guó)專利第5,885,613號(hào))、陽(yáng)離子peg脂質(zhì)、聚噁唑啉(poz)-脂質(zhì)綴合物(例如，poz-daa綴合物)、聚酰胺寡聚物(例如，atta-脂質(zhì)綴合物)及其混合物。poz-脂質(zhì)綴合物的其它實(shí)例描述于pct公開案第wo2010/006282號(hào)中。peg或poz可直接與脂質(zhì)綴合，或可經(jīng)由接頭(linker)部分與脂質(zhì)連接。適合于使peg或poz與脂質(zhì)偶合的任何接頭部分均可使用，包括例如非含酯接頭部分及含酯接頭部分。在某些優(yōu)選實(shí)施方案中，使用非含酯接頭部分，諸如酰胺或氨基甲酸酯。

術(shù)語(yǔ)“兩性脂質(zhì)”部分是指任何適合的物質(zhì)，其中所述脂質(zhì)物質(zhì)的疏水性部分適應(yīng)疏水相，而親水性部分適應(yīng)水相。親水性特征來源于存在諸如碳水化合物、磷酸酯、羧酸、硫酸根、氨基、巰基、硝基、羥基及其它類似基團(tuán)的極性或帶電基團(tuán)?？赏ㄟ^包括非極性基團(tuán)(包括但不限于長(zhǎng)鏈飽和及不飽和脂族烴基)且這種基團(tuán)經(jīng)一個(gè)或多個(gè)芳族、環(huán)脂族或雜環(huán)基團(tuán)取代而賦予疏水性。兩性化合物的實(shí)例包括但不限于磷脂、胺脂及鞘脂。

磷脂的代表性實(shí)例包括但不限于磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酸、棕櫚酰油酰磷脂酰膽堿、溶血磷脂酰膽堿、溶血磷脂酰乙醇胺、二棕櫚酰磷脂酰膽堿、二油磷脂酰膽堿、二硬脂酰磷脂酰膽堿及二亞油酰磷脂酰膽堿。缺乏磷的其它化合物，諸如鞘脂、鞘糖脂家族、二?；视秃挺?酰氧基酸，也在命名為兩性脂質(zhì)的群組內(nèi)。另外，上述兩性脂質(zhì)可與其它脂質(zhì)混合，包括甘油三酯及固醇。

術(shù)語(yǔ)“中性脂質(zhì)”是指在所選ph值下呈不帶電或中性兩性離子形式存在的許多脂質(zhì)種類中的任一種。在生理ph值下，這種脂質(zhì)包括例如二?；字Ｄ憠A、二?；字Ｒ掖及贰⑸窠?jīng)酰胺、鞘磷脂、腦磷脂、膽固醇、腦苷脂及二酰基甘油。

術(shù)語(yǔ)“非陽(yáng)離子脂質(zhì)”是指任何兩性脂質(zhì)以及任何其它中性脂質(zhì)或陰離子脂質(zhì)。

術(shù)語(yǔ)“陰離子脂質(zhì)”是指在生理ph值下帶負(fù)電的任何脂質(zhì)。這些脂質(zhì)包括但不限于磷脂酰甘油、心磷脂、二?；字＝z氨酸、二?；字?、n-十二酰基磷脂酰乙醇胺、n-琥珀酰磷脂酰乙醇胺、n--戊二酰磷脂酰乙醇胺、賴氨酰磷脂酰甘油、棕櫚酰油酰磷脂酰甘油(popg)及與中性脂質(zhì)接合的其它陰離子修飾基團(tuán)。

術(shù)語(yǔ)“疏水性脂質(zhì)”是指具有非極性基團(tuán)(包括但不限于長(zhǎng)鏈飽和及不飽和脂族烴基)且這種基團(tuán)任選經(jīng)一個(gè)或多個(gè)芳族、環(huán)脂族或雜環(huán)基取代的化合物。適合的實(shí)例包括但不限于二?；视?、二烷基甘油、n,n-二烷基氨基-1,2-二?；趸?3-氨基丙烷及1,2-二烷基-3-氨基丙烷。

術(shù)語(yǔ)“陽(yáng)離子脂質(zhì)”和“氨基脂質(zhì)”在本文中可互換用于包括具有一、二、三或更多個(gè)脂肪酸或脂肪烷基鏈及一個(gè)ph值可滴定氨基頭部基團(tuán)(例如烷基氨基或二烷基氨基頭部基團(tuán))的那些脂質(zhì)及其鹽。陽(yáng)離子脂質(zhì)典型地在低于陽(yáng)離子脂質(zhì)的pka的ph值下經(jīng)質(zhì)子化(即，帶正電)且在高于該pka的ph值下基本上為中性的。本發(fā)明的陽(yáng)離子脂質(zhì)也可稱為可滴定陽(yáng)離子脂質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，陽(yáng)離子脂質(zhì)包含：可質(zhì)子化三級(jí)胺(例如，ph值可滴定)頭部基團(tuán)；c18烷基鏈，其中各烷基鏈獨(dú)立地具有0至3(例如，0、1、2或3)個(gè)雙鍵；及介于該頭部基團(tuán)與烷基鏈之間的醚、酯或酮鍵聯(lián)。這種陽(yáng)離子脂質(zhì)包括但不限于dsdma、dodma、dlindma、dlendma、γ-dlendma、dlin-k-dma、dlin-k-c2-dma(也稱為dlin-c2k-dma、xtc2及c2k)、dlin-k-c3-dma、dlin-k-c4-dma、dlen-c2k-dma、γ-dlen-c2k-dma、dlin-m-c2-dma(也稱為mc2)及dlin-m-c3-dma(也稱為mc3)。

術(shù)語(yǔ)“鹽”包括任何陰離子及陽(yáng)離子復(fù)合物，諸如陽(yáng)離子脂質(zhì)與一個(gè)或多個(gè)陰離子之間所形成的復(fù)合物。陰離子的非限制性實(shí)例包括無機(jī)陰離子和有機(jī)陰離子，例如氫陰離子、氟離子、氯離子、溴離子、碘離子、草酸根(例如半草酸根)、磷酸根、膦酸根、磷酸氫根、磷酸二氫根、氧離子、碳酸根、碳酸氫根、硝酸根、亞硝酸根、氮陰離子、亞硫酸氫根、硫離子、亞硫酸根、硫酸氫根、硫酸根、硫代硫酸根、硫酸氫根、硼酸根、甲酸根、乙酸根、苯甲酸根、檸檬酸根、酒石酸根、乳酸根、丙烯酸根、聚丙烯酸根、富馬酸根、馬來酸根、衣康酸根、羥乙酸根、葡糖酸根、蘋果酸根、杏仁酸根、巴豆酸根、抗壞血酸根、水楊酸根、聚甲基丙烯酸根、高氯酸根、氯酸根、亞氯酸根、次氯酸根、溴酸根、次溴酸根、碘酸根、烷基磺酸根、芳基磺酸根、砷酸根、亞砷酸根、鉻酸根、重鉻酸根、氰離子、氰酸根、硫氰酸根、氫氧根、過氧根、高錳酸根及其混合物。在特定實(shí)施方案中，本文中所披露的陽(yáng)離子脂質(zhì)的鹽為結(jié)晶鹽。

術(shù)語(yǔ)“烷基”包括含有1至24個(gè)碳原子的直鏈或支鏈、非環(huán)狀或環(huán)狀飽和脂族烴。代表性飽和直鏈烷基包括但不限于甲基、乙基、正丙基、正丁基、正戊基、正己基及類似基團(tuán)，而飽和支鏈烷基包括而不限于異丙基、第二丁基、異丁基、第三丁基、異戊基及類似基團(tuán)。代表性飽和環(huán)狀烷基包括但不限于環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基及類似基團(tuán)，而不飽和環(huán)狀烷基包括而不限于環(huán)戊烯基、環(huán)己烯基及類似基團(tuán)。

術(shù)語(yǔ)“烯基”包括在相鄰碳原子之間含有至少一個(gè)雙鍵的如以上所定義的烷基。烯基包括順式和反式異構(gòu)體兩種。代表性直鏈和支鏈烯基包括但不限于乙烯基、丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、異丁烯基、1-戊烯基、2-戊烯基、3-甲基-1-丁烯基、2-甲基-2-丁烯基、2,3-二甲基-2-丁烯基及類似基團(tuán)。

術(shù)語(yǔ)“炔基”包括在相鄰碳之間另外含有至少一個(gè)三鍵的如以上所定義的任何烷基或烯基。代表性直鏈和支鏈炔基包括而不限于乙炔基、丙炔基、1-丁炔基、2-丁炔基、1-戊炔基、2-戊炔基、3-甲基-1-丁炔基及類似基團(tuán)。

術(shù)語(yǔ)“?；卑ㄆ渲羞B接點(diǎn)上的碳經(jīng)如以下所定義的氧代取代的任何烷基、烯基或炔基。以下為?；姆窍拗菩詫?shí)例：-c(＝o)烷基、-c(＝o)烯基及-c(＝o)炔基。

術(shù)語(yǔ)“雜環(huán)”包括5至7元單環(huán)或7至10元雙環(huán)雜環(huán)，其為飽和、不飽和或芳族的，且其含有1或2個(gè)獨(dú)立地選自氮、氧和硫的雜原子，且其中所述氮和硫雜原子可任選經(jīng)氧化，且該氮雜原子可任選經(jīng)季銨化，包括以上雜環(huán)中的任一者與苯環(huán)稠合的雙環(huán)狀環(huán)。雜環(huán)可經(jīng)由任何雜原子或碳原子連接。雜環(huán)包括但不限于如以下所定義的雜芳基以及嗎啉基、吡咯烷酮、吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、乙內(nèi)酰脲基、戊內(nèi)酰胺基、環(huán)氧乙烷基、環(huán)氧丙烷基、四氫呋喃基、四氫吡喃基、四氫吡啶基、四氫嘧啶基、四氫噻吩基、四氫噻吡喃基、四氫嘧啶基、四氫噻吩基、四氫噻吡喃基及類似基團(tuán)。

術(shù)語(yǔ)“任選經(jīng)取代的烷基”、“任選經(jīng)取代的烯基”、“任選經(jīng)取代的炔基”、“任選經(jīng)取代的酰基”及“任選經(jīng)取代的雜環(huán)”意謂當(dāng)經(jīng)取代時(shí)至少一個(gè)氫原子經(jīng)取代基置換。在氧代取代基(＝o)的情況下，兩個(gè)氫原子經(jīng)置換。就此而言，取代基包括但不限于氧代、鹵素、雜環(huán)、-cn、-or^x、-nr^xr^y、-nr^xc(＝o)r^y、-nr^xso2r^y、-c(＝o)r^x、-c(＝o)or^x、-c(＝o)nr^xr^y、-sonr^x及-sonnr^xr^y，其中n為0、1或2，r^x與r^y相同或不同且獨(dú)立地為氫、烷基或雜環(huán)，且烷基及雜環(huán)取代基各自可進(jìn)一步經(jīng)一個(gè)或多個(gè)以下基團(tuán)取代：氧代、鹵素、-oh、-cn、烷基、-or^x、雜環(huán)、-nr^xr^y、-nr^xc(＝o)r^y、-nr^xso2r^y、-c(＝o)r^x、-c(＝o)or^x、-c(＝o)nr^xr^y、-sonr^x及-sonnr^xr^y。術(shù)語(yǔ)“任選經(jīng)取代”當(dāng)用于取代基清單之前時(shí)意謂該清單中的取代基各自可任選如本文中所描述經(jīng)取代。

術(shù)語(yǔ)“鹵素”包括氟、氯、溴及碘。

術(shù)語(yǔ)“融合性”是指脂質(zhì)粒子與細(xì)胞的膜融合的能力。所述膜可為胞質(zhì)膜或圍繞胞器(例如內(nèi)體、核等)的膜。

如本文中所使用，術(shù)語(yǔ)“水溶液”是指完全或部分由水構(gòu)成的組合物。

如本文中所使用，術(shù)語(yǔ)“有機(jī)脂質(zhì)溶液”是指完全或部分由具有脂質(zhì)的有機(jī)溶劑構(gòu)成的組合物。

術(shù)語(yǔ)“電子致密核心”當(dāng)用于描述本發(fā)明的脂質(zhì)粒子時(shí)是指當(dāng)使用低溫透射電子顯微術(shù)(“cyrotem”)檢視時(shí)脂質(zhì)粒子內(nèi)部部分的深色外觀。本發(fā)明的一些脂質(zhì)粒子具有電子致密核心且缺乏脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)。本發(fā)明的一些脂質(zhì)粒子具有電子致密中心，缺乏脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)，且具有逆六方相或立方相結(jié)構(gòu)。盡管不希望受理論束縛，但認(rèn)為非雙層脂質(zhì)封裝提供內(nèi)含水及核酸的脂質(zhì)柱體三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，即，基本上為經(jīng)含核酸的水性通道貫穿的脂質(zhì)小滴。

如本文中所使用的“遠(yuǎn)側(cè)部位”是指物理上分開的部位，其不限于相鄰毛細(xì)血管床，而是包括廣泛分布于生物體中的部位。

與核酸-脂質(zhì)粒子有關(guān)的“血清穩(wěn)定性”意謂所述粒子在暴露于將顯著降解游離dna或rna的血清或核酸酶測(cè)定后不顯著降解。適合的測(cè)定包括例如標(biāo)準(zhǔn)血清測(cè)定、dna酶測(cè)定或rna酶測(cè)定。

如本文中所使用，“全身遞送”是指導(dǎo)致諸如sirna的活性劑在生物體內(nèi)的廣泛生物分布的遞送。一些施用技術(shù)可導(dǎo)致某些藥劑而非其它藥劑的全身遞送。全身遞送意謂使適用(優(yōu)選為治療)量的藥劑暴露于身體的大部分。為了獲得廣泛生物分布，一般需要一定的血液生存期，使得所述藥劑在到達(dá)施用部位遠(yuǎn)側(cè)的疾病部位之前不會(huì)快速降解或清除(諸如通過首先通過器官(肝、肺等)或通過快速非特異性細(xì)胞結(jié)合)。脂質(zhì)粒子的全身遞送可通過本領(lǐng)域中已知的任何手段來進(jìn)行，包括例如靜脈內(nèi)、皮下和腹膜內(nèi)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，脂質(zhì)粒子的全身遞送是通過靜脈內(nèi)遞送。

如本文中所使用的“局部遞送”是指將諸如sirna的活性劑直接遞送至生物體內(nèi)的目標(biāo)部位。舉例而言，可通過直接注入疾病部位、其它目標(biāo)部位或目標(biāo)器官(諸如肝臟、心臟、胰臟、腎臟及其類似物)中來局部遞送藥劑。

如本文中所使用的術(shù)語(yǔ)“病毒粒子負(fù)載”是指諸如血液的體液中所存在的病毒粒子(例如，hbv和/或hdv)的數(shù)目的度量。舉例而言，粒子負(fù)載可表示為例如每毫升血液的病毒粒子數(shù)目。粒子負(fù)載測(cè)試可使用基于核酸擴(kuò)增的測(cè)試以及非基于核酸的測(cè)試來進(jìn)行(參見例如puren等人,thejournalofinfectiousdiseases,201:s27-36(2010))。

術(shù)語(yǔ)“哺乳動(dòng)物”是指任何哺乳動(dòng)物種類，諸如人、小鼠、大鼠、狗、貓、倉(cāng)鼠、豚鼠、兔、家畜及其類似物。

某些實(shí)施方案的描述

本發(fā)明提供靶向一個(gè)或多個(gè)hbv基因的表達(dá)的sirna分子、包含所述sirna中的一種或多種(例如，混合液)的核酸-脂質(zhì)粒子以及遞送和/或施用所述核酸-脂質(zhì)粒子的方法(例如，用于治療人的hbv和/或hdv感染)。

在一個(gè)方面，本發(fā)明提供靶向一個(gè)或多個(gè)hbv基因的表達(dá)的sirna分子。在某些情況下，本發(fā)明提供包含靶向hbv基因組的不同區(qū)域的sirna的組合(例如，混合液、匯集物或混合物)的組合物。在某些情況下，本發(fā)明的sirna分子能夠在體外或體內(nèi)抑制hbv和/或hdv的復(fù)制。

在特定實(shí)施方案中，本發(fā)明提供表a中所示的sirna分子，其中各雙鏈sirna分子的上鏈自左向右為5'至3'方向上的有義鏈；且各雙鏈sirna分子的下鏈自左向右為5'至3'方向上的反義鏈。如表a中所示，所述sirna分子可包含一個(gè)或多個(gè)具有2'-o-甲基修飾的核糖核苷酸和/或一個(gè)或多個(gè)una部分。以下表a中所示的ic50值是使用實(shí)施例1中所描述的測(cè)定法來測(cè)定的。

表a.

在其它實(shí)施方案中，如本文中的表b中所闡述，本發(fā)明提供表a中所闡述的sirna分子的經(jīng)分離的有義鏈和反義鏈(即，經(jīng)分離的單鏈核酸分子)。表b中所闡述的核酸序列布置為序列配對(duì)，其中各配對(duì)包括有義鏈及其互補(bǔ)反義鏈。各序列配對(duì)(有義鏈加反義鏈)以對(duì)應(yīng)于表a中所示的名稱的特定名稱加以鑒別。

表b中所示的這些經(jīng)分離的有義鏈和反義鏈可用于例如制造可用于在體內(nèi)或體外減少一個(gè)或多個(gè)hbv基因的表達(dá)的sirna分子。這些經(jīng)分離的有義鏈和反義鏈也可用于例如作為雜交探針，以用于鑒別和測(cè)量得自感染hbv或hbv/hdv的人的諸如組織或血液樣品的生物材料中的hbv基因組的量。

在特定實(shí)施方案中，本發(fā)明的寡核苷酸(諸如表b中所闡述的有義和反義rna鏈)與靶聚核苷酸序列特異性雜交或互補(bǔ)。如本文中所使用的術(shù)語(yǔ)“特異性雜交”和“互補(bǔ)”指示互補(bǔ)性程度足以在dna或rna靶標(biāo)與寡核苷酸之間發(fā)生穩(wěn)定且特異性結(jié)合。應(yīng)理解，寡核苷酸未必與其將特異性雜交的靶核酸序列100％互補(bǔ)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，當(dāng)寡核苷酸與靶序列結(jié)合干擾靶序列的正常功能，從而造成其效用或表達(dá)損失時(shí)，寡核苷酸為可特異性雜交的，且互補(bǔ)性程度足以避免寡核苷酸與非靶序列在需要特異性結(jié)合的條件下，即，在體內(nèi)測(cè)定或治療性治療的情況下時(shí)在生理?xiàng)l件下或在體外測(cè)定情況下時(shí)在進(jìn)行測(cè)定的條件下的非特異性結(jié)合。因而，寡核苷酸與其靶向或特異性雜交的基因或mrna序列區(qū)域相比可包括1、2、3或更多個(gè)堿基取代。

表b.

因而，本發(fā)明的某些實(shí)施方案提供一種經(jīng)分離的雙鏈sirna分子，其選自由1m(seqidno:1和2)、2m(seqidno:3和4)、3m(seqidno:5和6)、4m(seqidno:7和8)、5m(seqidno:9和10)、6m(seqidno:11和12)、7m(seqidno:13和14)、8m(seqidno:15和16)、9m(seqidno:17和18)、10m(seqidno:19和20)、11m(seqidno:21和22)、12m(seqidno:23和24)、13m(seqidno:25和26)、14m(seqidno:27和28)、15m(seqidno:29和30)組成的組。

本發(fā)明的某些實(shí)施方案還提供一種經(jīng)分離的核酸分子，其選自由seqidno:1、seqidno:3、seqidno:5、seqidno:7、seqidno:9、seqidno:11、seqidno:13、seqidno:15、seqidno:17、seqidno:19、seqidno:21、seqidno:23、seqidno:25、seqidno:27和seqidno:29組成的組。

本發(fā)明的某些實(shí)施方案還提供一種經(jīng)分離的核酸分子，其選自由seqidno:2、seqidno:4、seqidno:6、seqidno:8、seqidno:10、seqidno:12、seqidno:14、seqidno:16、seqidno:18、seqidno:20、seqidno:22、seqidno:24、seqidno:26、seqidno:28和seqidno:30組成的組。

本發(fā)明還提供一種組合物，其包含一個(gè)或多個(gè)本文中所描述的經(jīng)分離的雙鏈sirna分子(例如，表a中所描述的sirna分子)。

在某些實(shí)施方案中，所述組合物包含選自由1m(seqidno:1和2)、2m(seqidno:3和4)、3m(seqidno:5和6)、4m(seqidno:7和8)、5m(seqidno:9和10)、6m(seqidno:11和12)、7m(seqidno:13和14)、8m(seqidno:15和16)、9m(seqidno:17和18)、10m(seqidno:19和20)、11m(seqidno:21和22)、12m(seqidno:23和24)、13m(seqidno:25和26)、14m(seqidno:27和28)、15m(seqidno:29和30)組成的組的兩個(gè)不同的雙鏈sirna分子。在某些實(shí)施方案中，所述兩個(gè)不同的雙鏈sirna分子的組合選自實(shí)施例2中所描述的組合中的任一種。

在某些實(shí)施方案中，所述組合物包含選自由1m(seqidno:1和2)、2m(seqidno:3和4)、3m(seqidno:5和6)、4m(seqidno:7和8)、5m(seqidno:9和10)、6m(seqidno:11和12)、7m(seqidno:13和14)、8m(seqidno:15和16)、9m(seqidno:17和18)、10m(seqidno:19和20)、11m(seqidno:21和22)、12m(seqidno:23和24)、13m(seqidno:25和26)、14m(seqidno:27和28)、15m(seqidno:29和30)組成的組的三個(gè)不同的雙鏈sirna分子。在某些實(shí)施方案中，所述三個(gè)不同的雙鏈sirna分子的組合選自實(shí)施例3中所描述的組合中的任一種。

本發(fā)明還提供一種藥物組合物，其包含一種或多種(例如，混合液)本文中所描述的sirna和藥學(xué)上可接受的載體。

在某些實(shí)施方案中，本文中所描述的組合物包含一個(gè)或多個(gè)sirna分子，其使乙型肝炎病毒基因的表達(dá)沉默。

在另一方面，本發(fā)明提供一種靶向hbv基因表達(dá)的核酸-脂質(zhì)粒子。核酸-脂質(zhì)粒子典型地包含一種或多種(例如，混合液)本文中所描述的經(jīng)分離的雙鏈sirna分子(例如，如表a中所描述)、陽(yáng)離子脂質(zhì)和非陽(yáng)離子脂質(zhì)。在某些情況下，核酸-脂質(zhì)粒子還包含抑制粒子聚集的綴合脂質(zhì)。核酸-脂質(zhì)粒子優(yōu)選包含一種或多種(例如，混合液)本文中所描述的經(jīng)分離的雙鏈sirna分子、陽(yáng)離子脂質(zhì)、非陽(yáng)離子脂質(zhì)和抑制粒子聚集的綴合脂質(zhì)。

在某些實(shí)施方案中，所述核酸-脂質(zhì)粒子包含選自由1m(seqidno:1和2)、2m(seqidno:3和4)、3m(seqidno:5和6)、4m(seqidno:7和8)、5m(seqidno:9和10)、6m(seqidno:11和12)、7m(seqidno:13和14)、8m(seqidno:15和16)、9m(seqidno:17和18)、10m(seqidno:19和20)、11m(seqidno:21和22)、12m(seqidno:23和24)、13m(seqidno:25和26)、14m(seqidno:27和28)、15m(seqidno:29和30)組成的組的兩個(gè)不同的雙鏈sirna分子。在某些實(shí)施方案中，所述兩個(gè)不同的雙鏈sirna分子的組合選自實(shí)施例2中所描述的組合中的任一種。

在某些實(shí)施方案中，所述核酸-脂質(zhì)粒子包含選自由1m(seqidno:1和2)、2m(seqidno:3和4)、3m(seqidno:5和6)、4m(seqidno:7和8)、5m(seqidno:9和10)、6m(seqidno:11和12)、7m(seqidno:13和14)、8m(seqidno:15和16)、9m(seqidno:17和18)、10m(seqidno:19和20)、11m(seqidno:21和22)、12m(seqidno:23和24)、13m(seqidno:25和26)、14m(seqidno:27和28)、15m(seqidno:29和30)組成的組的三個(gè)不同的雙鏈sirna分子。在某些實(shí)施方案中，所述三個(gè)不同的雙鏈sirna分子的組合選自實(shí)施例3中所描述的組合中的任一種。

在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的sirna完全囊封在核酸-脂質(zhì)粒子中。關(guān)于包含sirna混合液的配制物，混合液(例如，具有不同序列的sirna化合物)中所存在的不同類型sirna種類可共同囊封于同一粒子中，或混合液中所存在的各類型sirna種類可囊封在單獨(dú)粒子中。sirna混合液可使用兩種、三種或更多種單獨(dú)的sirna(各自具有獨(dú)特序列)以相同、相似或不同的濃度或摩爾比的混合物配制于本文中所描述的粒子中。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用相同、相似或不同的濃度或摩爾比的各sirna種類配制sirna(對(duì)應(yīng)于具有不同的序列的多種sirna)的混合液，且將不同類型的sirna共囊封于同一粒子中。在另一實(shí)施方案中，混合液中所存在的各類型sirna種類是以相同、相似或不同的sirna濃度或摩爾比囊封在不同的粒子中，且因而形成的粒子(各自含有不同的sirna有效負(fù)荷)分開施用(例如，根據(jù)治療方案，在不同的時(shí)間)，或一起作為單一單位劑量(例如，與藥學(xué)上可接受的載體一起)組合并施用。本文中所描述的粒子具有血清穩(wěn)定性，對(duì)核酸酶降解具有抗性，且對(duì)諸如人的哺乳動(dòng)物實(shí)質(zhì)上無毒。

本發(fā)明的核酸-脂質(zhì)粒子中的陽(yáng)離子脂質(zhì)可包含例如具有本文中所描述的式i至式iii的一種或多種陽(yáng)離子脂質(zhì)或任何其它陽(yáng)離子脂質(zhì)種類。在一個(gè)實(shí)施方案中，陽(yáng)離子脂質(zhì)為二烷基脂質(zhì)。在另一實(shí)施方案中，陽(yáng)離子脂質(zhì)為三烷基脂質(zhì)。在一個(gè)特定實(shí)施方案中，陽(yáng)離子脂質(zhì)選自由以下各項(xiàng)組成的組：1,2-二亞油基氧基-n,n-二甲基氨基丙烷(dlindma)、1,2-二亞麻基氧基-n,n-二甲基氨基丙烷(dlendma)、1,2-二-γ-亞麻基氧基-n,n-二甲基氨基丙烷(γ-dlendma；化合物(15))、2,2-二亞油基-4-(2-二甲基氨基乙基)-[1,3]-二氧戊環(huán)(dlin-k-c2-dma)、2,2-二亞油基-4-二甲基氨基甲基-[1,3]-二氧戊環(huán)(dlin-k-dma)、二亞油基甲基-3-二甲基氨基丙酸酯(dlin-m-c2-dma)、4-(二甲基氨基)丁酸(6z,9z,28z,31z)-三十七碳-6,9,28,31-四烯-19-基酯(dlin-m-c3-dma；化合物(7))、其鹽及其混合物。

在另一特定實(shí)施方案中，陽(yáng)離子脂質(zhì)選自由以下各項(xiàng)組成的組：1,2-二亞油基氧基-n,n-二甲基氨基丙烷(dlindma)、1,2-二亞麻基氧基-n,n-二甲基氨基丙烷(dlendma)、1,2-二-γ-亞麻基氧基-n,n-二甲基氨基丙烷(γ-dlendma；化合物(15))、3-((6z,9z,28z,31z)-三十七碳-6,9,28,31-四烯-19-基氧基)-n,n-二甲基丙-1-胺(dlin-mp-dma；化合物(8))、4-(二甲基氨基)丁酸(6z,9z,28z,31z)-三十七碳-6,9,28,31-四烯-19-基酯(化合物(7))、5-(二甲基氨基)戊酸(6z,16z)-12-((z)-癸-4-烯基)二十二碳-6,16-二烯-11-基酯(化合物(13))、其鹽或其混合物。

在某些實(shí)施方案中，陽(yáng)離子脂質(zhì)占粒子中所存在的總脂質(zhì)的約48摩爾％至約62摩爾％。

本發(fā)明的核酸-脂質(zhì)粒子中的非陽(yáng)離子脂質(zhì)可包含例如一種或多種陰離子脂質(zhì)和/或中性脂質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，非陽(yáng)離子脂質(zhì)包含以下中性脂質(zhì)組分之一：(1)磷脂與膽固醇或其衍生物的混合物；(2)膽固醇或其衍生物；或(3)磷脂。在某些優(yōu)選實(shí)施方案中，磷脂包含二棕櫚?；字Ｄ憠A(dppc)、二硬脂?；字Ｄ憠A(dspc)或其混合物。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，非陽(yáng)離子脂質(zhì)為dppc與膽固醇的混合物。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，非陽(yáng)離子脂質(zhì)為dspc與膽固醇的混合物。

在某些實(shí)施方案中，非陽(yáng)離子脂質(zhì)包含磷脂與膽固醇或其衍生物的混合物，其中所述磷脂占粒子中所存在的總脂質(zhì)的約7摩爾％至約17摩爾％且膽固醇或其衍生物占粒子中所存在的總脂質(zhì)的約25摩爾％至約40摩爾％。

本發(fā)明的核酸-脂質(zhì)粒子中的脂質(zhì)綴合物抑制粒子聚集，且可包含例如本文中所描述的脂質(zhì)綴合物中的一種或多種。在一個(gè)特定實(shí)施方案中，脂質(zhì)綴合物包含peg-脂質(zhì)綴合物。peg-脂質(zhì)綴合物的實(shí)例包括但不限于peg-dag綴合物、peg-daa綴合物及其混合物。在某些實(shí)施方案中，所述peg-脂質(zhì)綴合物選自由peg-二?；视?peg-dag)綴合物、peg-二烷基氧基丙基(peg-daa)綴合物、peg-磷脂綴合物、peg-神經(jīng)酰胺(peg-cer)綴合物及其混合物組成的組。在某些實(shí)施方案中，peg-脂質(zhì)綴合物為peg-daa綴合物。在某些實(shí)施方案中，脂質(zhì)粒子中的peg-daa綴合物可包含peg-二癸基氧基丙基(c10)綴合物、peg-二月桂基氧基丙基(c12)綴合物、peg-二肉豆蔻基氧基丙基(c14)綴合物、peg-二棕櫚基氧基丙基(c16)綴合物、peg-二硬脂基氧基丙基(c18)綴合物或其混合物。在某些實(shí)施方案中，其中peg-daa綴合物為peg-二肉豆蔻基氧基丙基(c14)綴合物。在另一實(shí)施方案中，peg-daa綴合物為化合物(66)(peg-c-dma)綴合物。在另一實(shí)施方案中，脂質(zhì)綴合物包含poz脂質(zhì)綴合物，諸如poz-daa綴合物。

在某些實(shí)施方案中，抑制粒子聚集的綴合脂質(zhì)占粒子中所存在的總脂質(zhì)的約0.5摩爾％至約3摩爾％。

在某些實(shí)施方案中，核酸-脂質(zhì)粒子具有約5:1至約15:1的總脂質(zhì):sirna質(zhì)量比。

在某些實(shí)施方案中，核酸-脂質(zhì)粒子具有約30nm至約150nm的中值直徑。

在某些實(shí)施方案中，核酸-脂質(zhì)粒子具有電子致密核心。

在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供核酸-脂質(zhì)粒子，其包含：(a)一種或多種(例如，混合液)本文中所描述的sirna分子(例如，參見表a)；(b)一種或多種陽(yáng)離子脂質(zhì)或其鹽，其占粒子中所存在的總脂質(zhì)的約50摩爾％至約85摩爾％；(c)一種或多種非陽(yáng)離子脂質(zhì)，其占粒子中所存在的總脂質(zhì)的約13摩爾％至約49.5摩爾％；及(d)一種或多種抑制粒子聚集的綴合脂質(zhì)，其占粒子中所存在的總脂質(zhì)的約0.5摩爾％至約2摩爾％。

在這個(gè)實(shí)施方案的一個(gè)方面，核酸-脂質(zhì)粒子包含：(a)一種或多種(例如，混合液)本文中所描述的sirna分子(例如，參見表a)；(b)陽(yáng)離子脂質(zhì)或其鹽，其占粒子中所存在的總脂質(zhì)的約52摩爾％至約62摩爾％；(c)磷脂與膽固醇或其衍生物的混合物，其占粒子中所存在的總脂質(zhì)的約36摩爾％至約47摩爾％；及(d)peg-脂質(zhì)綴合物，其占粒子中所存在的總脂質(zhì)的約1摩爾％至約2摩爾％。在一個(gè)特定實(shí)施方案中，配制物為四組分系統(tǒng)，其包含約1.4摩爾％peg-脂質(zhì)綴合物(例如，peg2000-c-dma)、約57.1摩爾％陽(yáng)離子脂質(zhì)(例如，dlin-k-c2-dma)或其鹽、約7.1摩爾％dppc(或dspc)及約34.3摩爾％膽固醇(或其衍生物)。

在這個(gè)實(shí)施方案的另一方面，核酸-脂質(zhì)粒子包含：(a)一種或多種(例如，混合液)本文中所描述的sirna分子(例如，參見表a)；(b)陽(yáng)離子脂質(zhì)或其鹽，其占粒子中所存在的總脂質(zhì)的約56.5摩爾％至約66.5摩爾％；(c)膽固醇或其衍生物，其占粒子中所存在的總膽固醇的約31.5摩爾％至約42.5摩爾％；及(d)peg-脂質(zhì)綴合物，其占粒子中所存在的總脂質(zhì)的約1摩爾％至約2摩爾％。在一個(gè)特定實(shí)施方案中，配制物為三組分系統(tǒng)，其不含磷脂且包含約1.5摩爾％peg-脂質(zhì)綴合物(例如，peg2000-c-dma)、約61.5摩爾％陽(yáng)離子脂質(zhì)(例如，dlin-k-c2-dma)或其鹽及約36.9摩爾％膽固醇(或其衍生物)。

其它配制物描述于pct公開案第wo09/127060號(hào)及已公開的美國(guó)專利申請(qǐng)公開案第us2011/0071208a1號(hào)中，其公開內(nèi)容出于所有目的以全文引用的方式并入本文中。

在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明提供核酸-脂質(zhì)粒子，其包含：(a)一種或多種(例如，混合液)本文中所描述的sirna分子(例如，參見表a)；(b)一種或多種陽(yáng)離子脂質(zhì)或其鹽，其占粒子中所存在的總脂質(zhì)的約2摩爾％至約50摩爾％；(c)一種或多種非陽(yáng)離子脂質(zhì)，其占粒子中所存在的總脂質(zhì)的約5摩爾％至約90摩爾％；及(d)一種或多種抑制粒子聚集的綴合脂質(zhì)，其占粒子中所存在的總脂質(zhì)的約0.5摩爾％至約20摩爾％。

在這個(gè)實(shí)施方案的一個(gè)方面，核酸-脂質(zhì)粒子包含：(a)一種或多種(例如，混合液)本文中所描述的sirna分子(例如，參見表a)；(b)陽(yáng)離子脂質(zhì)或其鹽，其占粒子中所存在的總脂質(zhì)的約30摩爾％至約50摩爾％；(c)磷脂與膽固醇或其衍生物的混合物，其占粒子中所存在的總脂質(zhì)的約47摩爾％至約69摩爾％；及(d)peg-脂質(zhì)綴合物，其占粒子中所存在的總脂質(zhì)的約1摩爾％至約3摩爾％。在一個(gè)特定實(shí)施方案中，配制物為四組分系統(tǒng)，其包含約2摩爾％peg-脂質(zhì)綴合物(例如，peg2000-c-dma)、約40摩爾％陽(yáng)離子脂質(zhì)(例如，dlin-k-c2-dma)或其鹽、約10摩爾％dppc(或dspc)及約48摩爾％膽固醇(或其衍生物)。

在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明提供核酸-脂質(zhì)粒子，其包含：(a)一種或多種(例如，混合液)本文中所描述的sirna分子(例如，參見表a)；(b)一種或多種陽(yáng)離子脂質(zhì)或其鹽，其占粒子中所存在的總脂質(zhì)的約50摩爾％至約65摩爾％；(c)一種或多種非陽(yáng)離子脂質(zhì)，其占粒子中所存在的總脂質(zhì)的約25摩爾％至約45摩爾％；及(d)一種或多種抑制粒子聚集的綴合脂質(zhì)，其占粒子中所存在的總脂質(zhì)的約5摩爾％至約10摩爾％。

在這個(gè)實(shí)施方案的一個(gè)方面，核酸-脂質(zhì)粒子包含：(a)一種或多種(例如，混合液)本文中所描述的sirna分子(例如，參見表a)；(b)陽(yáng)離子脂質(zhì)或其鹽，其占粒子中所存在的總脂質(zhì)的約50摩爾％至約60摩爾％；(c)磷脂與膽固醇或其衍生物的混合物，其占粒子中所存在的總脂質(zhì)的約35摩爾％至約45摩爾％；及(d)peg-脂質(zhì)綴合物，其占粒子中所存在的總脂質(zhì)的約5摩爾％至約10摩爾％。在某些情況下，配制物中的非陽(yáng)離子脂質(zhì)混合物包含：(i)占粒子中所存在的總脂質(zhì)的約5摩爾％至約10摩爾％的磷脂；及(ii)占粒子中所存在的總脂質(zhì)的約25摩爾％至約35摩爾％的膽固醇或其衍生物。在一個(gè)特定實(shí)施方案中，配制物為四組分系統(tǒng)，其包含約7摩爾％peg-脂質(zhì)綴合物(例如，peg750-c-dma)、約54摩爾％陽(yáng)離子脂質(zhì)(例如，dlin-k-c2-dma)或其鹽、約7摩爾％dppc(或dspc)及約32摩爾％膽固醇(或其衍生物)。

在這個(gè)實(shí)施方案的另一方面，核酸-脂質(zhì)粒子包含：(a)一種或多種(例如，混合液)本文中所描述的sirna分子(例如，參見表a)；(b)陽(yáng)離子脂質(zhì)或其鹽，其占粒子中所存在的總脂質(zhì)的約55摩爾％至約65摩爾％；(c)膽固醇或其衍生物，其占粒子中所存在的總膽固醇的約30摩爾％至約40摩爾％；及(d)peg-脂質(zhì)綴合物，其占粒子中所存在的總脂質(zhì)的約5摩爾％至約10摩爾％。在一個(gè)特定實(shí)施方案中，配制物為三組分系統(tǒng)，其不含磷脂且包含約7摩爾％peg-脂質(zhì)綴合物(例如，peg750-c-dma)、約58摩爾％陽(yáng)離子脂質(zhì)(例如，dlin-k-c2-dma)或其鹽及約35摩爾％膽固醇(或其衍生物)。

適用配制物的其它實(shí)施方案描述于已公開的美國(guó)專利申請(qǐng)公開案第us2011/0076335a1號(hào)中，該案出于所有目的以全文引用的方式并入本文中。

在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，核酸-脂質(zhì)粒子包含：(a)一種或多種(例如，混合液)本文中所描述的sirna分子(例如，參見表a)；(b)陽(yáng)離子脂質(zhì)或其鹽，其占粒子中所存在的總脂質(zhì)的約48摩爾％至約62摩爾％；(c)磷脂與膽固醇或其衍生物的混合物，其中磷脂占粒子中所存在的總脂質(zhì)的約7摩爾％至約17摩爾％且其中膽固醇或其衍生物占粒子中所存在的總脂質(zhì)的約25摩爾％至約40摩爾％；及(d)peg-脂質(zhì)綴合物，其占粒子中所存在的總脂質(zhì)的約0.5摩爾％至約3.0摩爾％。下文包括本發(fā)明這個(gè)方面的例示性脂質(zhì)配制物a-z。

例示性脂質(zhì)配制物a包括以下組分(其中組分的百分比值為摩爾百分比)：peg-脂質(zhì)(1.2％)、陽(yáng)離子脂質(zhì)(53.2％)、磷脂(9.3％)、膽固醇(36.4％)，其中所存在的脂質(zhì)的實(shí)際量可變化例如±5％(或例如±4摩爾％、±3摩爾％、±2摩爾％、±1摩爾％、±0.75摩爾％、±0.5摩爾％、±0.25摩爾％或±0.1摩爾％)。舉例而言，在一個(gè)代表性實(shí)施方案中，peg-脂質(zhì)為peg-c-dma(化合物(66))(1.2％)，陽(yáng)離子脂質(zhì)為1,2-二亞油基氧基-n,n-二甲基氨基丙烷(dlindma)(53.2％)，磷脂為dppc(9.3％)，且膽固醇以36.4％存在，其中所存在的脂質(zhì)的實(shí)際量可變化例如±5％(或例如±4摩爾％、±3摩爾％、±2摩爾％、±1摩爾％、±0.75摩爾％、±0.5摩爾％、±0.25摩爾％或±0.1摩爾％)。因而，本發(fā)明的某些實(shí)施方案提供一種基于核酸-脂質(zhì)粒子的配制物a，其包含本文中所描述的一種或多種sirna分子。舉例而言，在某些實(shí)施方案中，基于核酸脂質(zhì)粒子的配制物a可包含兩個(gè)不同的sirna分子，其中所述兩個(gè)不同的sirna分子的組合選自實(shí)施例2中所描述的組合中的任一種。在某些其它實(shí)施方案中，基于核酸脂質(zhì)粒子的配制物a可包含三個(gè)不同的sirna分子，其中所述三個(gè)不同的sirna分子的組合選自實(shí)施例3中所描述的組合中的任一種。在某些實(shí)施方案中，核酸-脂質(zhì)粒子具有約5:1至約15:1或約5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1或15:1或其任何分?jǐn)?shù)或其中的范圍的總脂質(zhì):sirna質(zhì)量比。在某些實(shí)施方案中，核酸-脂質(zhì)粒子具有約9:1的總脂質(zhì):sirna質(zhì)量比(例如，8.5:1至10:1或8.9:1至10:1或9:1至9.9:1的脂質(zhì):藥物比，包括9.1:1、9.2:1、9.3:1、9.4:1、9.5:1、9.6:1、9.7:1及9.8:1)。

例示性脂質(zhì)配制物b包括以下組分(其中組分的百分比值為摩爾百分比)：peg-脂質(zhì)(0.8％)、陽(yáng)離子脂質(zhì)(59.7％)、磷脂(14.2％)、膽固醇(25.3％)，其中所存在的脂質(zhì)的實(shí)際量可變化例如±5％(或例如±4摩爾％、±3摩爾％、±2摩爾％、±1摩爾％、±0.75摩爾％、±0.5摩爾％、±0.25摩爾％或±0.1摩爾％)。舉例而言，在一個(gè)代表性實(shí)施方案中，peg-脂質(zhì)為peg-c-domg(化合物(67))(0.8％)，陽(yáng)離子脂質(zhì)為1,2-二亞油基氧基-n,n-二甲基氨基丙烷(dlindma)(59.7％)，磷脂為dspc(14.2％)，且膽固醇以25.3％存在，其中所存在的脂質(zhì)的實(shí)際量可變化例如±5％(或例如±4摩爾％、±3摩爾％、±2摩爾％、±1摩爾％、±0.75摩爾％、±0.5摩爾％、±0.25摩爾％或±0.1摩爾％)。因而，本發(fā)明的某些實(shí)施方案提供一種基于核酸-脂質(zhì)粒子的配制物b，其包含本文中所描述的一種或多種sirna分子。舉例而言，在某些實(shí)施方案中，基于核酸脂質(zhì)粒子的配制物b可包含兩個(gè)不同的sirna分子，其中所述兩個(gè)不同的sirna分子的組合選自實(shí)施例2中所描述的組合中的任一種。在某些其它實(shí)施方案中，基于核酸脂質(zhì)粒子的配制物b可包含三個(gè)不同的sirna分子，其中所述三個(gè)不同的sirna分子的組合選自實(shí)施例3中所描述的組合中的任一種。在某些實(shí)施方案中，核酸-脂質(zhì)粒子具有約5:1至約15:1或約5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1或15:1或其任何分?jǐn)?shù)或其中的范圍的總脂質(zhì):sirna質(zhì)量比。在某些實(shí)施方案中，核酸-脂質(zhì)粒子具有約9:1的總脂質(zhì):sirna質(zhì)量比(例如，8.5:1至10:1或8.9:1至10:1或9:1至9.9:1的脂質(zhì):藥物比，包括9.1:1、9.2:1、9.3:1、9.4:1、9.5:1、9.6:1、9.7:1及9.8:1)。

例示性脂質(zhì)配制物c包括以下組分(其中組分的百分比值為摩爾百分比)：peg-脂質(zhì)(1.9％)、陽(yáng)離子脂質(zhì)(52.5％)、磷脂(14.8％)、膽固醇(30.8％)，其中所存在的脂質(zhì)的實(shí)際量可變化例如±5％(或例如±4摩爾％、±3摩爾％、±2摩爾％、±1摩爾％、±0.75摩爾％、±0.5摩爾％、±0.25摩爾％或±0.1摩爾％)。舉例而言，在一個(gè)代表性實(shí)施方案中，peg-脂質(zhì)為peg-c-domg(化合物(67))(1.9％)，陽(yáng)離子脂質(zhì)為1,2-二-γ-亞麻基氧基-n,n-二甲基氨基丙烷(γ-dlendma；化合物(15))(52.5％)，磷脂為dspc(14.8％)，且膽固醇以30.8％存在，其中所存在的脂質(zhì)的實(shí)際量可變化例如±5％(或例如±4摩爾％、±3摩爾％、±2摩爾％、±1摩爾％、±0.75摩爾％、±0.5摩爾％、±0.25摩爾％或±0.1摩爾％)。因而，本發(fā)明的某些實(shí)施方案提供一種基于核酸-脂質(zhì)粒子的配制物c，其包含本文中所描述的一種或多種sirna分子。舉例而言，在某些實(shí)施方案中，基于核酸脂質(zhì)粒子的配制物c可包含兩個(gè)不同的sirna分子，其中所述兩個(gè)不同的sirna分子的組合選自實(shí)施例2中所描述的組合中的任一種。在某些其它實(shí)施方案中，基于核酸脂質(zhì)粒子的配制物c可包含三個(gè)不同的sirna分子，其中所述三個(gè)不同的sirna分子的組合選自實(shí)施例3中所描述的組合中的任一種。在某些實(shí)施方案中，核酸-脂質(zhì)粒子具有約5:1至約15:1或約5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1或15:1或其任何分?jǐn)?shù)或其中的范圍的總脂質(zhì):sirna質(zhì)量比。在某些實(shí)施方案中，核酸-脂質(zhì)粒子具有約9:1的總脂質(zhì):sirna質(zhì)量比(例如，8.5:1至10:1或8.9:1至10:1或9:1至9.9:1的脂質(zhì):藥物比，包括9.1:1、9.2:1、9.3:1、9.4:1、9.5:1、9.6:1、9.7:1及9.8:1)。

例示性脂質(zhì)配制物d包括以下組分(其中組分的百分比值為摩爾百分比)：peg-脂質(zhì)(0.7％)、陽(yáng)離子脂質(zhì)(60.3％)、磷脂(8.4％)、膽固醇(30.5％)，其中所存在的脂質(zhì)的實(shí)際量可變化例如±5％(或例如±4摩爾％、±3摩爾％、±2摩爾％、±1摩爾％、±0.75摩爾％、±0.5摩爾％、±0.25摩爾％或±0.1摩爾％)。舉例而言，在一個(gè)代表性實(shí)施方案中，peg-脂質(zhì)為peg-c-dma(化合物(66))(0.7％)，陽(yáng)離子脂質(zhì)為3-((6z,9z,28z,31z)-三十七碳-6,9,28,31-四烯-19-基氧基)-n,n-二甲基丙-1-胺(dlin-mp-dma；化合物(8))(60.3％)，磷脂為dspc(8.4％)，且膽固醇以30.5％存在，其中所存在的脂質(zhì)的實(shí)際量可變化例如±5％(或例如±4摩爾％、±3摩爾％、±2摩爾％、±1摩爾％、±0.75摩爾％、±0.5摩爾％、±0.25摩爾％或±0.1摩爾％)。因而，本發(fā)明的某些實(shí)施方案提供一種基于核酸-脂質(zhì)粒子的配制物d，其包含本文中所描述的一種或多種sirna分子。舉例而言，在某些實(shí)施方案中，基于核酸脂質(zhì)粒子的配制物d可包含兩個(gè)不同的sirna分子，其中所述兩個(gè)不同的sirna分子的組合選自實(shí)施例2中所描述的組合中的任一種。在某些其它實(shí)施方案中，基于核酸脂質(zhì)粒子的配制物d可包含三個(gè)不同的sirna分子，其中所述三個(gè)不同的sirna分子的組合選自實(shí)施例3中所描述的組合中的任一種。在某些實(shí)施方案中，核酸-脂質(zhì)粒子具有約5:1至約15:1或約5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1或15:1或其任何分?jǐn)?shù)或其中的范圍的總脂質(zhì):sirna質(zhì)量比。在某些實(shí)施方案中，核酸-脂質(zhì)粒子具有約9:1的總脂質(zhì):sirna質(zhì)量比(例如，8.5:1至10:1或8.9:1至10:1或9:1至9.9:1的脂質(zhì):藥物比，包括9.1:1、9.2:1、9.3:1、9.4:1、9.5:1、9.6:1、9.7:1及9.8:1)。

例示性脂質(zhì)配制物e包括以下組分(其中組分的百分比值為摩爾百分比)：peg-脂質(zhì)(1.8％)、陽(yáng)離子脂質(zhì)(52.1％)、磷脂(7.5％)、膽固醇(38.5％)，其中所存在的脂質(zhì)的實(shí)際量可變化例如±5％(或例如±4摩爾％、±3摩爾％、±2摩爾％、±1摩爾％、±0.75摩爾％、±0.5摩爾％、±0.25摩爾％或±0.1摩爾％)。舉例而言，在一個(gè)代表性實(shí)施方案中，peg-脂質(zhì)為peg-c-dma(化合物(66))(1.8％)，陽(yáng)離子脂質(zhì)為4-(二甲基氨基)丁酸(6z,9z,28z,31z)-三十七碳-6,9,28,31-四烯-19-基酯(化合物(7))(52.1％)，磷脂為dppc(7.5％)，且膽固醇以38.5％存在，其中所存在的脂質(zhì)的實(shí)際量可變化例如±5％(或例如±4摩爾％、±3摩爾％、±2摩爾％、±1摩爾％、±0.75摩爾％、±0.5摩爾％、±0.25摩爾％或±0.1摩爾％)。因而，本發(fā)明的某些實(shí)施方案提供一種基于核酸-脂質(zhì)粒子的配制物e，其包含本文中所描述的一種或多種sirna分子。舉例而言，在某些實(shí)施方案中，基于核酸脂質(zhì)粒子的配制物e可包含兩個(gè)不同的sirna分子，其中所述兩個(gè)不同的sirna分子的組合選自實(shí)施例2中所描述的組合中的任一種。在某些其它實(shí)施方案中，基于核酸脂質(zhì)粒子的配制物e可包含三個(gè)不同的sirna分子，其中所述三個(gè)不同的sirna分子的組合選自實(shí)施例3中所描述的組合中的任一種。在某些實(shí)施方案中，核酸-脂質(zhì)粒子具有約5:1至約15:1或約5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1或15:1或其任何分?jǐn)?shù)或其中的范圍的總脂質(zhì):sirna質(zhì)量比。在某些實(shí)施方案中，核酸-脂質(zhì)粒子具有約9:1的總脂質(zhì):sirna質(zhì)量比(例如，8.5:1至10:1或8.9:1至10:1或9:1至9.9:1的脂質(zhì):藥物比，包括9.1:1、9.2:1、9.3:1、9.4:1、9.5:1、9.6:1、9.7:1及9.8:1)。

例示性脂質(zhì)配制物f包括以下組分(其中組分的百分比值為摩爾百分比)：peg-脂質(zhì)(0.9％)、陽(yáng)離子脂質(zhì)(57.1％)、磷脂(8.1％)、膽固醇(33.8％)，其中所存在的脂質(zhì)的實(shí)際量可變化例如±5％(或例如±4摩爾％、±3摩爾％、±2摩爾％、±1摩爾％、±0.75摩爾％、±0.5摩爾％、±0.25摩爾％或±0.1摩爾％)。舉例而言，在一個(gè)代表性實(shí)施方案中，peg-脂質(zhì)為peg-c-domg(化合物(67))(0.9％)，陽(yáng)離子脂質(zhì)為1,2-二亞麻基氧基-n,n-二甲基氨基丙烷(dlendma)、1,2-二-γ-亞麻基氧基-n,n-二甲基氨基丙烷(γ-dlendma；化合物(15))(57.1％)，磷脂為dspc(8.1％)，且膽固醇以33.8％存在，其中所存在的脂質(zhì)的實(shí)際量可變化例如±5％(或例如±4摩爾％、±3摩爾％、±2摩爾％、±1摩爾％、±0.75摩爾％、±0.5摩爾％、±0.25摩爾％或±0.1摩爾％)。因而，本發(fā)明的某些實(shí)施方案提供一種基于核酸-脂質(zhì)粒子的配制物f，其包含本文中所描述的一種或多種sirna分子。舉例而言，在某些實(shí)施方案中，基于核酸脂質(zhì)粒子的配制物f可包含兩個(gè)不同的sirna分子，其中所述兩個(gè)不同的sirna分子的組合選自實(shí)施例2中所描述的組合中的任一種。在某些其它實(shí)施方案中，基于核酸脂質(zhì)粒子的配制物f可包含三個(gè)不同的sirna分子，其中所述三個(gè)不同的sirna分子的組合選自實(shí)施例3中所描述的組合中的任一種。在某些實(shí)施方案中，核酸-脂質(zhì)粒子具有約5:1至約15:1或約5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1或15:1或其任何分?jǐn)?shù)或其中的范圍的總脂質(zhì):sirna質(zhì)量比。在某些實(shí)施方案中，核酸-脂質(zhì)粒子具有約9:1的總脂質(zhì):sirna質(zhì)量比(例如，8.5:1至10:1或8.9:1至10:1或9:1至9.9:1的脂質(zhì):藥物比，包括9.1:1、9.2:1、9.3:1、9.4:1、9.5:1、9.6:1、9.7:1及9.8:1)。

例示性脂質(zhì)配制物g包括以下組分(其中組分的百分比值為摩爾百分比)：peg-脂質(zhì)(1.7％)、陽(yáng)離子脂質(zhì)(61.6％)、磷脂(11.2％)、膽固醇(25.5％)，其中所存在的脂質(zhì)的實(shí)際量可變化例如±5％(或例如±4摩爾％、±3摩爾％、±2摩爾％、±1摩爾％、±0.75摩爾％、±0.5摩爾％、±0.25摩爾％或±0.1摩爾％)。舉例而言，在一個(gè)代表性實(shí)施方案中，peg-脂質(zhì)為peg-c-domg(化合物(67))(1.7％)，陽(yáng)離子脂質(zhì)為1,2-二亞麻基氧基-n,n-二甲基氨基丙烷(dlendma)、1,2-二-γ-亞麻基氧基-n,n-二甲基氨基丙烷(γ-dlendma；化合物(15))(61.6％)，磷脂為dppc(11.2％)，且膽固醇以25.5％存在，其中所存在的脂質(zhì)的實(shí)際量可變化例如±5％(或例如±4摩爾％、±3摩爾％、±2摩爾％、±1摩爾％、±0.75摩爾％、±0.5摩爾％、±0.25摩爾％或±0.1摩爾％)。因而，本發(fā)明的某些實(shí)施方案提供一種基于核酸-脂質(zhì)粒子的配制物g，其包含本文中所描述的一種或多種sirna分子。舉例而言，在某些實(shí)施方案中，基于核酸脂質(zhì)粒子的配制物g可包含兩個(gè)不同的sirna分子，其中所述兩個(gè)不同的sirna分子的組合選自實(shí)施例2中所描述的組合中的任一種。在某些其它實(shí)施方案中，基于核酸脂質(zhì)粒子的配制物g可包含三個(gè)不同的sirna分子，其中所述三個(gè)不同的sirna分子的組合選自實(shí)施例3中所描述的組合中的任一種。在某些實(shí)施方案中，核酸-脂質(zhì)粒子具有約5:1至約15:1或約5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1或15:1或其任何分?jǐn)?shù)或其中的范圍的總脂質(zhì):sirna質(zhì)量比。在某些實(shí)施方案中，核酸-脂質(zhì)粒子具有約9:1的總脂質(zhì):sirna質(zhì)量比(例如，8.5:1至10:1或8.9:1至10:1或9:1至9.9:1的脂質(zhì):藥物比，包括9.1:1、9.2:1、9.3:1、9.4:1、9.5:1、9.6:1、9.7:1及9.8:1)。

例示性脂質(zhì)配制物h包括以下組分(其中組分的百分比值為摩爾百分比)：peg-脂質(zhì)(1.1％)、陽(yáng)離子脂質(zhì)(55.0％)、磷脂(11.0％)、膽固醇(33.0％)，其中所存在的脂質(zhì)的實(shí)際量可變化例如±5％(或例如±4摩爾％、±3摩爾％、±2摩爾％、±1摩爾％、±0.75摩爾％、±0.5摩爾％、±0.25摩爾％或±0.1摩爾％)。舉例而言，在一個(gè)代表性實(shí)施方案中，peg-脂質(zhì)為peg-c-dma(化合物(66))(1.1％)，陽(yáng)離子脂質(zhì)為5-(二甲基氨基)戊酸(6z,16z)-12-((z)-癸-4-烯基)二十二碳-6,16-二烯-11-基酯(化合物(13))(55.0％)，磷脂為dspc(11.0％)，且膽固醇以33.0％存在，其中所存在的脂質(zhì)的實(shí)際量可變化例如±5％(或例如±4摩爾％、±3摩爾％、±2摩爾％、±1摩爾％、±0.75摩爾％、±0.5摩爾％、±0.25摩爾％或±0.1摩爾％)。因而，本發(fā)明的某些實(shí)施方案提供一種基于核酸-脂質(zhì)粒子的配制物h，其包含本文中所描述的一種或多種sirna分子。舉例而言，在某些實(shí)施方案中，基于核酸脂質(zhì)粒子的配制物h可包含兩個(gè)不同的sirna分子，其中所述兩個(gè)不同的sirna分子的組合選自實(shí)施例2中所描述的組合中的任一種。在某些其它實(shí)施方案中，基于核酸脂質(zhì)粒子的配制物h可包含三個(gè)不同的sirna分子，其中所述三個(gè)不同的sirna分子的組合選自實(shí)施例3中所描述的組合中的任一種。在某些實(shí)施方案中，核酸-脂質(zhì)粒子具有約5:1至約15:1或約5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1或15:1或其任何分?jǐn)?shù)或其中的范圍的總脂質(zhì):sirna質(zhì)量比。在某些實(shí)施方案中，核酸-脂質(zhì)粒子具有約9:1的總脂質(zhì):sirna質(zhì)量比(例如，8.5:1至10:1或8.9:1至10:1或9:1至9.9:1的脂質(zhì):藥物比，包括9.1:1、9.2:1、9.3:1、9.4:1、9.5:1、9.6:1、9.7:1及9.8:1)。

例示性脂質(zhì)配制物i包括以下組分(其中組分的百分比值為摩爾百分比)：peg-脂質(zhì)(2.6％)、陽(yáng)離子脂質(zhì)(53.1％)、磷脂(9.4％)、膽固醇(35.0％)，其中所存在的脂質(zhì)的實(shí)際量可變化例如±5％(或例如±4摩爾％、±3摩爾％、±2摩爾％、±1摩爾％、±0.75摩爾％、±0.5摩爾％、±0.25摩爾％或±0.1摩爾％)。舉例而言，在一個(gè)代表性實(shí)施方案中，peg-脂質(zhì)為peg-c-dma(化合物(66))(2.6％)，陽(yáng)離子脂質(zhì)為5-(二甲基氨基)戊酸(6z,16z)-12-((z)-癸-4-烯基)二十二碳-6,16-二烯-11-基酯(化合物(13))(53.1％)，磷脂為dspc(9.4％)，且膽固醇以35.0％存在，其中所存在的脂質(zhì)的實(shí)際量可變化例如±5％(或例如±4摩爾％、±3摩爾％、±2摩爾％、±1摩爾％、±0.75摩爾％、±0.5摩爾％、±0.25摩爾％或±0.1摩爾％)。因而，本發(fā)明的某些實(shí)施方案提供一種基于核酸-脂質(zhì)粒子的配制物i，其包含本文中所描述的一種或多種sirna分子。舉例而言，在某些實(shí)施方案中，基于核酸脂質(zhì)粒子的配制物i可包含兩個(gè)不同的sirna分子，其中所述兩個(gè)不同的sirna分子的組合選自實(shí)施例2中所描述的組合中的任一種。在某些其它實(shí)施方案中，基于核酸脂質(zhì)粒子的配制物i可包含三個(gè)不同的sirna分子，其中所述三個(gè)不同的sirna分子的組合選自實(shí)施例3中所描述的組合中的任一種。在某些實(shí)施方案中，核酸-脂質(zhì)粒子具有約5:1至約15:1或約5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1或15:1或其任何分?jǐn)?shù)或其中的范圍的總脂質(zhì):sirna質(zhì)量比。在某些實(shí)施方案中，核酸-脂質(zhì)粒子具有約9:1的總脂質(zhì):sirna質(zhì)量比(例如，8.5:1至10:1或8.9:1至10:1或9:1至9.9:1的脂質(zhì):藥物比，包括9.1:1、9.2:1、9.3:1、9.4:1、9.5:1、9.6:1、9.7:1及9.8:1)。

例示性脂質(zhì)配制物j包括以下組分(其中組分的百分比值為摩爾百分比)：peg-脂質(zhì)(0.6％)、陽(yáng)離子脂質(zhì)(59.4％)、磷脂(10.2％)、膽固醇(29.8％)，其中所存在的脂質(zhì)的實(shí)際量可變化例如±5％(或例如±4摩爾％、±3摩爾％、±2摩爾％、±1摩爾％、±0.75摩爾％、±0.5摩爾％、±0.25摩爾％或±0.1摩爾％)。舉例而言，在一個(gè)代表性實(shí)施方案中，peg-脂質(zhì)為peg-c-dma(化合物(66))(0.6％)，陽(yáng)離子脂質(zhì)為1,2-二亞油基氧基-n,n-二甲基氨基丙烷(dlindma)(59.4％)，磷脂為dppc(10.2％)，且膽固醇以29.8％存在，其中所存在的脂質(zhì)的實(shí)際量可變化例如±5％(或例如±4摩爾％、±3摩爾％、±2摩爾％、±1摩爾％、±0.75摩爾％、±0.5摩爾％、±0.25摩爾％或±0.1摩爾％)。因而，本發(fā)明的某些實(shí)施方案提供一種基于核酸-脂質(zhì)粒子的配制物j，其包含本文中所描述的一種或多種sirna分子。舉例而言，在某些實(shí)施方案中，基于核酸脂質(zhì)粒子的配制物j可包含兩個(gè)不同的sirna分子，其中所述兩個(gè)不同的sirna分子的組合選自實(shí)施例2中所描述的組合中的任一種。在某些其它實(shí)施方案中，基于核酸脂質(zhì)粒子的配制物j可包含三個(gè)不同的sirna分子，其中所述三個(gè)不同的sirna分子的組合選自實(shí)施例3中所描述的組合中的任一種。在某些實(shí)施方案中，核酸-脂質(zhì)粒子具有約5:1至約15:1或約5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1或15:1或其任何分?jǐn)?shù)或其中的范圍的總脂質(zhì):sirna質(zhì)量比。在某些實(shí)施方案中，核酸-脂質(zhì)粒子具有約9:1的總脂質(zhì):sirna質(zhì)量比(例如，8.5:1至10:1或8.9:1至10:1或9:1至9.9:1的脂質(zhì):藥物比，包括9.1:1、9.2:1、9.3:1、9.4:1、9.5:1、9.6:1、9.7:1及9.8:1)。

例示性脂質(zhì)配制物k包括以下組分(其中組分的百分比值為摩爾百分比)：peg-脂質(zhì)(0.5％)、陽(yáng)離子脂質(zhì)(56.7％)、磷脂(13.1％)、膽固醇(29.7％)，其中所存在的脂質(zhì)的實(shí)際量可變化例如±5％(或例如±4摩爾％、±3摩爾％、±2摩爾％、±1摩爾％、±0.75摩爾％、±0.5摩爾％、±0.25摩爾％或±0.1摩爾％)。舉例而言，在一個(gè)代表性實(shí)施方案中，peg-脂質(zhì)為peg-c-domg(化合物(67))(0.5％)，陽(yáng)離子脂質(zhì)為4-(二甲基氨基)丁酸(6z,9z,28z,31z)-三十七碳-6,9,28,31-四烯-19-基酯(化合物(7))(56.7％)，磷脂為dspc(13.1％)，且膽固醇以29.7％存在，其中所存在的脂質(zhì)的實(shí)際量可變化例如±5％(或例如±4摩爾％、±3摩爾％、±2摩爾％、±1摩爾％、±0.75摩爾％、±0.5摩爾％、±0.25摩爾％或±0.1摩爾％)。因而，本發(fā)明的某些實(shí)施方案提供一種基于核酸-脂質(zhì)粒子的配制物k，其包含本文中所描述的一種或多種sirna分子。舉例而言，在某些實(shí)施方案中，基于核酸脂質(zhì)粒子的配制物k可包含兩個(gè)不同的sirna分子，其中所述兩個(gè)不同的sirna分子的組合選自實(shí)施例2中所描述的組合中的任一種。在某些其它實(shí)施方案中，基于核酸脂質(zhì)粒子的配制物k可包含三個(gè)不同的sirna分子，其中所述三個(gè)不同的sirna分子的組合選自實(shí)施例3中所描述的組合中的任一種。在某些實(shí)施方案中，核酸-脂質(zhì)粒子具有約5:1至約15:1或約5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1或15:1或其任何分?jǐn)?shù)或其中的范圍的總脂質(zhì):sirna質(zhì)量比。在某些實(shí)施方案中，核酸-脂質(zhì)粒子具有約9:1的總脂質(zhì):sirna質(zhì)量比(例如，8.5:1至10:1或8.9:1至10:1或9:1至9.9:1的脂質(zhì):藥物比，包括9.1:1、9.2:1、9.3:1、9.4:1、9.5:1、9.6:1、9.7:1及9.8:1)。

例示性脂質(zhì)配制物l包括以下組分(其中組分的百分比值為摩爾百分比)：peg-脂質(zhì)(2.2％)、陽(yáng)離子脂質(zhì)(52.0％)、磷脂(9.7％)、膽固醇(36.2％)，其中所存在的脂質(zhì)的實(shí)際量可變化例如±5％(或例如±4摩爾％、±3摩爾％、±2摩爾％、±1摩爾％、±0.75摩爾％、±0.5摩爾％、±0.25摩爾％或±0.1摩爾％)。舉例而言，在一個(gè)代表性實(shí)施方案中，peg-脂質(zhì)為peg-c-domg(化合物(67))(2.2％)，陽(yáng)離子脂質(zhì)為1,2-二-γ-亞麻基氧基-n,n-二甲基氨基丙烷(γ-dlendma；化合物(15))(52.0％)，磷脂為dspc(9.7％)，且膽固醇以36.2％存在，其中所存在的脂質(zhì)的實(shí)際量可變化例如±5％(或例如±4摩爾％、±3摩爾％、±2摩爾％、±1摩爾％、±0.75摩爾％、±0.5摩爾％、±0.25摩爾％或±0.1摩爾％)。因而，本發(fā)明的某些實(shí)施方案提供一種基于核酸-脂質(zhì)粒子的配制物l，其包含本文中所描述的一種或多種sirna分子。舉例而言，在某些實(shí)施方案中，基于核酸脂質(zhì)粒子的配制物l可包含兩個(gè)不同的sirna分子，其中所述兩個(gè)不同的sirna分子的組合選自實(shí)施例2中所描述的組合中的任一種。在某些其它實(shí)施方案中，基于核酸脂質(zhì)粒子的配制物l可包含三個(gè)不同的sirna分子，其中所述三個(gè)不同的sirna分子的組合選自實(shí)施例3中所描述的組合中的任一種。在某些實(shí)施方案中，核酸-脂質(zhì)粒子具有約5:1至約15:1或約5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1或15:1或其任何分?jǐn)?shù)或其中的范圍的總脂質(zhì):sirna質(zhì)量比。在某些實(shí)施方案中，核酸-脂質(zhì)粒子具有約9:1的總脂質(zhì):sirna質(zhì)量比(例如，8.5:1至10:1或8.9:1至10:1或9:1至9.9:1的脂質(zhì):藥物比，包括9.1:1、9.2:1、9.3:1、9.4:1、9.5:1、9.6:1、9.7:1及9.8:1)。

例示性脂質(zhì)配制物m包括以下組分(其中組分的百分比值為摩爾百分比)：peg-脂質(zhì)(2.7％)、陽(yáng)離子脂質(zhì)(58.4％)、磷脂(13.1％)、膽固醇(25.7％)，其中所存在的脂質(zhì)的實(shí)際量可變化例如±5％(或例如±4摩爾％、±3摩爾％、±2摩爾％、±1摩爾％、±0.75摩爾％、±0.5摩爾％、±0.25摩爾％或±0.1摩爾％)。舉例而言，在一個(gè)代表性實(shí)施方案中，peg-脂質(zhì)為peg-c-dma(化合物(66))(2.7％)，陽(yáng)離子脂質(zhì)為1,2-二亞油基氧基-n,n-二甲基氨基丙烷(dlindma)(58.4％)，磷脂為dppc(13.1％)，且膽固醇以25.7％存在，其中所存在的脂質(zhì)的實(shí)際量可變化例如±5％(或例如±4摩爾％、±3摩爾％、±2摩爾％、±1摩爾％、±0.75摩爾％、±0.5摩爾％、±0.25摩爾％或±0.1摩爾％)。因而，本發(fā)明的某些實(shí)施方案提供一種基于核酸-脂質(zhì)粒子的配制物m，其包含本文中所描述的一種或多種sirna分子。舉例而言，在某些實(shí)施方案中，基于核酸脂質(zhì)粒子的配制物m可包含兩個(gè)不同的sirna分子，其中所述兩個(gè)不同的sirna分子的組合選自實(shí)施例2中所描述的組合中的任一種。在某些其它實(shí)施方案中，基于核酸脂質(zhì)粒子的配制物m可包含三個(gè)不同的sirna分子，其中所述三個(gè)不同的sirna分子的組合選自實(shí)施例3中所描述的組合中的任一種。在某些實(shí)施方案中，核酸-脂質(zhì)粒子具有約5:1至約15:1或約5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1或15:1或其任何分?jǐn)?shù)或其中的范圍的總脂質(zhì):sirna質(zhì)量比。在某些實(shí)施方案中，核酸-脂質(zhì)粒子具有約9:1的總脂質(zhì):sirna質(zhì)量比(例如，8.5:1至10:1或8.9:1至10:1或9:1至9.9:1的脂質(zhì):藥物比，包括9.1:1、9.2:1、9.3:1、9.4:1、9.5:1、9.6:1、9.7:1及9.8:1)。

例示性脂質(zhì)配制物n包括以下組分(其中組分的百分比值為摩爾百分比)：peg-脂質(zhì)(3.0％)、陽(yáng)離子脂質(zhì)(53.3％)、磷脂(12.1％)、膽固醇(31.5％)，其中所存在的脂質(zhì)的實(shí)際量可變化例如±5％(或例如±4摩爾％、±3摩爾％、±2摩爾％、±1摩爾％、±0.75摩爾％、±0.5摩爾％、±0.25摩爾％或±0.1摩爾％)。舉例而言，在一個(gè)代表性實(shí)施方案中，peg-脂質(zhì)為peg-c-dma(化合物(66))(3.0％)，陽(yáng)離子脂質(zhì)為1,2-二亞油基氧基-n,n-二甲基氨基丙烷(dlindma)(53.3％)，磷脂為dppc(12.1％)，且膽固醇以31.5％存在，其中所存在的脂質(zhì)的實(shí)際量可變化例如±5％(或例如±4摩爾％、±3摩爾％、±2摩爾％、±1摩爾％、±0.75摩爾％、±0.5摩爾％、±0.25摩爾％或±0.1摩爾％)。因而，本發(fā)明的某些實(shí)施方案提供一種基于核酸-脂質(zhì)粒子的配制物n，其包含本文中所描述的一種或多種sirna分子。舉例而言，在某些實(shí)施方案中，基于核酸脂質(zhì)粒子的配制物n可包含兩個(gè)不同的sirna分子，其中所述兩個(gè)不同的sirna分子的組合選自實(shí)施例2中所描述的組合中的任一種。在某些其它實(shí)施方案中，基于核酸脂質(zhì)粒子的配制物n可包含三個(gè)不同的sirna分子，其中所述三個(gè)不同的sirna分子的組合選自實(shí)施例3中所描述的組合中的任一種。在某些實(shí)施方案中，核酸-脂質(zhì)粒子具有約5:1至約15:1或約5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1或15:1或其任何分?jǐn)?shù)或其中的范圍的總脂質(zhì):sirna質(zhì)量比。在某些實(shí)施方案中，核酸-脂質(zhì)粒子具有約9:1的總脂質(zhì):sirna質(zhì)量比(例如，8.5:1至10:1或8.9:1至10:1或9:1至9.9:1的脂質(zhì):藥物比，包括9.1:1、9.2:1、9.3:1、9.4:1、9.5:1、9.6:1、9.7:1及9.8:1)。

例示性脂質(zhì)配制物o包括以下組分(其中組分的百分比值為摩爾百分比)：peg-脂質(zhì)(1.5％)、陽(yáng)離子脂質(zhì)(56.2％)、磷脂(7.8％)、膽固醇(34.7％)，其中所存在的脂質(zhì)的實(shí)際量可變化例如±5％(或例如±4摩爾％、±3摩爾％、±2摩爾％、±1摩爾％、±0.75摩爾％、±0.5摩爾％、±0.25摩爾％或±0.1摩爾％)。舉例而言，在一個(gè)代表性實(shí)施方案中，peg-脂質(zhì)為peg-c-dma(化合物(66))(1.5％)，陽(yáng)離子脂質(zhì)為1,2-二亞油基氧基-n,n-二甲基氨基丙烷(dlindma)(56.2％)，磷脂為dppc(7.8％)，且膽固醇以34.7％存在，其中所存在的脂質(zhì)的實(shí)際量可變化例如±5％(或例如±4摩爾％、±3摩爾％、±2摩爾％、±1摩爾％、±0.75摩爾％、±0.5摩爾％、±0.25摩爾％或±0.1摩爾％)。因而，本發(fā)明的某些實(shí)施方案提供一種基于核酸-脂質(zhì)粒子的配制物o，其包含本文中所描述的一種或多種sirna分子。舉例而言，在某些實(shí)施方案中，基于核酸脂質(zhì)粒子的配制物o可包含兩個(gè)不同的sirna分子，其中所述兩個(gè)不同的sirna分子的組合選自實(shí)施例2中所描述的組合中的任一種。在某些其它實(shí)施方案中，基于核酸脂質(zhì)粒子的配制物o可包含三個(gè)不同的sirna分子，其中所述三個(gè)不同的sirna分子的組合選自實(shí)施例3中所描述的組合中的任一種。在某些實(shí)施方案中，核酸-脂質(zhì)粒子具有約5:1至約15:1或約5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1或15:1或其任何分?jǐn)?shù)或其中的范圍的總脂質(zhì):sirna質(zhì)量比。在某些實(shí)施方案中，核酸-脂質(zhì)粒子具有約9:1的總脂質(zhì):sirna質(zhì)量比(例如，8.5:1至10:1或8.9:1至10:1或9:1至9.9:1的脂質(zhì):藥物比，包括9.1:1、9.2:1、9.3:1、9.4:1、9.5:1、9.6:1、9.7:1及9.8:1)。

例示性脂質(zhì)配制物p包括以下組分(其中組分的百分比值為摩爾百分比)：peg-脂質(zhì)(2.1％)、陽(yáng)離子脂質(zhì)(48.6％)、磷脂(15.5％)、膽固醇(33.8％)，其中所存在的脂質(zhì)的實(shí)際量可變化例如±5％(或例如±4摩爾％、±3摩爾％、±2摩爾％、±1摩爾％、±0.75摩爾％、±0.5摩爾％、±0.25摩爾％或±0.1摩爾％)。舉例而言，在一個(gè)代表性實(shí)施方案中，peg-脂質(zhì)為peg-c-domg(化合物(67))(2.1％)，陽(yáng)離子脂質(zhì)為3-((6z,9z,28z,31z)-三十七碳-6,9,28,31-四烯-19-基氧基)-n,n-二甲基丙-1-胺(dlin-mp-dma；化合物(8))(48.6％)，磷脂為dspc(15.5％)，且膽固醇以33.8％存在，其中所存在的脂質(zhì)的實(shí)際量可變化例如±5％(或例如±4摩爾％、±3摩爾％、±2摩爾％、±1摩爾％、±0.75摩爾％、±0.5摩爾％、±0.25摩爾％或±0.1摩爾％)。因而，本發(fā)明的某些實(shí)施方案提供一種基于核酸-脂質(zhì)粒子的配制物p，其包含本文中所描述的一種或多種sirna分子。舉例而言，在某些實(shí)施方案中，基于核酸脂質(zhì)粒子的配制物p可包含兩個(gè)不同的sirna分子，其中所述兩個(gè)不同的sirna分子的組合選自實(shí)施例2中所描述的組合中的任一種。在某些其它實(shí)施方案中，基于核酸脂質(zhì)粒子的配制物p可包含三個(gè)不同的sirna分子，其中所述三個(gè)不同的sirna分子的組合選自實(shí)施例3中所描述的組合中的任一種。在某些實(shí)施方案中，核酸-脂質(zhì)粒子具有約5:1至約15:1或約5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1或15:1或其任何分?jǐn)?shù)或其中的范圍的總脂質(zhì):sirna質(zhì)量比。在某些實(shí)施方案中，核酸-脂質(zhì)粒子具有約9:1的總脂質(zhì):sirna質(zhì)量比(例如，8.5:1至10:1或8.9:1至10:1或9:1至9.9:1的脂質(zhì):藥物比，包括9.1:1、9.2:1、9.3:1、9.4:1、9.5:1、9.6:1、9.7:1及9.8:1)。

例示性脂質(zhì)配制物q包括以下組分(其中組分的百分比值為摩爾百分比)：peg-脂質(zhì)(2.5％)、陽(yáng)離子脂質(zhì)(57.9％)、磷脂(9.2％)、膽固醇(30.3％)，其中所存在的脂質(zhì)的實(shí)際量可變化例如±5％(或例如±4摩爾％、±3摩爾％、±2摩爾％、±1摩爾％、±0.75摩爾％、±0.5摩爾％、±0.25摩爾％或±0.1摩爾％)。舉例而言，在一個(gè)代表性實(shí)施方案中，peg-脂質(zhì)為peg-c-dma(化合物(66))(2.5％)，陽(yáng)離子脂質(zhì)為5-(二甲基氨基)戊酸(6z,16z)-12-((z)-癸-4-烯基)二十二碳-6,16-二烯-11-基酯(化合物(13))(57.9％)，磷脂為dspc(9.2％)，且膽固醇以30.3％存在，其中所存在的脂質(zhì)的實(shí)際量可變化例如±5％(或例如±4摩爾％、±3摩爾％、±2摩爾％、±1摩爾％、±0.75摩爾％、±0.5摩爾％、±0.25摩爾％或±0.1摩爾％)。因而，本發(fā)明的某些實(shí)施方案提供一種基于核酸-脂質(zhì)粒子的配制物q，其包含本文中所描述的一種或多種sirna分子。舉例而言，在某些實(shí)施方案中，基于核酸脂質(zhì)粒子的配制物q可包含兩個(gè)不同的sirna分子，其中所述兩個(gè)不同的sirna分子的組合選自實(shí)施例2中所描述的組合中的任一種。在某些其它實(shí)施方案中，基于核酸脂質(zhì)粒子的配制物q可包含三個(gè)不同的sirna分子，其中所述兩個(gè)不同的sirna分子的組合選自實(shí)施例3中所描述的組合中的任一種。在某些實(shí)施方案中，核酸-脂質(zhì)粒子具有約5:1至約15:1或約5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1或15:1或其任何分?jǐn)?shù)或其中的范圍的總脂質(zhì):sirna質(zhì)量比。在某些實(shí)施方案中，核酸-脂質(zhì)粒子具有約9:1的總脂質(zhì):sirna質(zhì)量比(例如，8.5:1至10:1或8.9:1至10:1或9:1至9.9:1的脂質(zhì):藥物比，包括9.1:1、9.2:1、9.3:1、9.4:1、9.5:1、9.6:1、9.7:1及9.8:1)。

例示性脂質(zhì)配制物r包括以下組分(其中組分的百分比值為摩爾百分比)：peg-脂質(zhì)(1.6％)、陽(yáng)離子脂質(zhì)(54.6％)、磷脂(10.9％)、膽固醇(32.8％)，其中所存在的脂質(zhì)的實(shí)際量可變化例如±5％(或例如±4摩爾％、±3摩爾％、±2摩爾％、±1摩爾％、±0.75摩爾％、±0.5摩爾％、±0.25摩爾％或±0.1摩爾％)。舉例而言，在一個(gè)代表性實(shí)施方案中，peg-脂質(zhì)為peg-c-dma(化合物(66))(1.6％)，陽(yáng)離子脂質(zhì)為3-((6z,9z,28z,31z)-三十七碳-6,9,28,31-四烯-19-基氧基)-n,n-二甲基丙-1-胺(化合物(8))(54.6％)，磷脂為dspc(10.9％)，且膽固醇以32.8％存在，其中所存在的脂質(zhì)的實(shí)際量可變化例如±5％(或例如±4摩爾％、±3摩爾％、±2摩爾％、±1摩爾％、±0.75摩爾％、±0.5摩爾％、±0.25摩爾％或±0.1摩爾％)。因而，本發(fā)明的某些實(shí)施方案提供一種基于核酸-脂質(zhì)粒子的配制物r，其包含本文中所描述的一種或多種sirna分子。舉例而言，在某些實(shí)施方案中，基于核酸脂質(zhì)粒子的配制物r可包含兩個(gè)不同的sirna分子，其中所述兩個(gè)不同的sirna分子的組合選自實(shí)施例2中所描述的組合中的任一種。在某些其它實(shí)施方案中，基于核酸脂質(zhì)粒子的配制物r可包含三個(gè)不同的sirna分子，其中所述三個(gè)不同的sirna分子的組合選自實(shí)施例3中所描述的組合中的任一種。在某些實(shí)施方案中，核酸-脂質(zhì)粒子具有約5:1至約15:1或約5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1或15:1或其任何分?jǐn)?shù)或其中的范圍的總脂質(zhì):sirna質(zhì)量比。在某些實(shí)施方案中，核酸-脂質(zhì)粒子具有約9:1的總脂質(zhì):sirna質(zhì)量比(例如，8.5:1至10:1或8.9:1至10:1或9:1至9.9:1的脂質(zhì):藥物比，包括9.1:1、9.2:1、9.3:1、9.4:1、9.5:1、9.6:1、9.7:1及9.8:1)。

例示性脂質(zhì)配制物s包括以下組分(其中組分的百分比值為摩爾百分比)：peg-脂質(zhì)(2.9％)、陽(yáng)離子脂質(zhì)(49.6％)、磷脂(16.3％)、膽固醇(31.3％)，其中所存在的脂質(zhì)的實(shí)際量可變化例如±5％(或例如±4摩爾％、±3摩爾％、±2摩爾％、±1摩爾％、±0.75摩爾％、±0.5摩爾％、±0.25摩爾％或±0.1摩爾％)。舉例而言，在一個(gè)代表性實(shí)施方案中，peg-脂質(zhì)為peg-c-dma(化合物(66))(2.9％)，陽(yáng)離子脂質(zhì)為5-(二甲基氨基)戊酸(6z,16z)-12-((z)-癸-4-烯基)二十二碳-6,16-二烯-11-基酯(化合物(13))(49.6％)，磷脂為dppc(16.3％)，且膽固醇以31.3％存在，其中所存在的脂質(zhì)的實(shí)際量可變化例如±5％(或例如±4摩爾％、±3摩爾％、±2摩爾％、±1摩爾％、±0.75摩爾％、±0.5摩爾％、±0.25摩爾％或±0.1摩爾％)。因而，本發(fā)明的某些實(shí)施方案提供一種基于核酸-脂質(zhì)粒子的配制物s，其包含本文中所描述的一種或多種sirna分子。舉例而言，在某些實(shí)施方案中，基于核酸脂質(zhì)粒子的配制物s可包含兩個(gè)不同的sirna分子，其中所述兩個(gè)不同的sirna分子的組合選自實(shí)施例2中所描述的組合中的任一種。在某些其它實(shí)施方案中，基于核酸脂質(zhì)粒子的配制物s可包含三個(gè)不同的sirna分子，其中所述三個(gè)不同的sirna分子的組合選自實(shí)施例3中所描述的組合中的任一種。在某些實(shí)施方案中，核酸-脂質(zhì)粒子具有約5:1至約15:1或約5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1或15:1或其任何分?jǐn)?shù)或其中的范圍的總脂質(zhì):sirna質(zhì)量比。在某些實(shí)施方案中，核酸-脂質(zhì)粒子具有約9:1的總脂質(zhì):sirna質(zhì)量比(例如，8.5:1至10:1或8.9:1至10:1或9:1至9.9:1的脂質(zhì):藥物比，包括9.1:1、9.2:1、9.3:1、9.4:1、9.5:1、9.6:1、9.7:1及9.8:1)。

例示性脂質(zhì)配制物t包括以下組分(其中組分的百分比值為摩爾百分比)：peg-脂質(zhì)(0.7％)、陽(yáng)離子脂質(zhì)(50.5％)、磷脂(8.9％)、膽固醇(40.0％)，其中所存在的脂質(zhì)的實(shí)際量可變化例如±5％(或例如±4摩爾％、±3摩爾％、±2摩爾％、±1摩爾％、±0.75摩爾％、±0.5摩爾％、±0.25摩爾％或±0.1摩爾％)。舉例而言，在一個(gè)代表性實(shí)施方案中，peg-脂質(zhì)為peg-c-domg(化合物(67))(0.7％)，陽(yáng)離子脂質(zhì)為1,2-二亞油基氧基-n,n-二甲基氨基丙烷(dlindma)(50.5％)，磷脂為dppc(8.9％)，且膽固醇以40.0％存在，其中所存在的脂質(zhì)的實(shí)際量可變化例如±5％(或例如±4摩爾％、±3摩爾％、±2摩爾％、±1摩爾％、±0.75摩爾％、±0.5摩爾％、±0.25摩爾％或±0.1摩爾％)。因而，本發(fā)明的某些實(shí)施方案提供一種基于核酸-脂質(zhì)粒子的配制物t，其包含本文中所描述的一種或多種sirna分子。舉例而言，在某些實(shí)施方案中，基于核酸脂質(zhì)粒子的配制物t可包含兩個(gè)不同的sirna分子，其中所述兩個(gè)不同的sirna分子的組合選自實(shí)施例2中所描述的組合中的任一種。在某些其它實(shí)施方案中，基于核酸脂質(zhì)粒子的配制物t可包含三個(gè)不同的sirna分子，其中所述三個(gè)不同的sirna分子的組合選自實(shí)施例3中所描述的組合中的任一種。在某些實(shí)施方案中，核酸-脂質(zhì)粒子具有約5:1至約15:1或約5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1或15:1或其任何分?jǐn)?shù)或其中的范圍的總脂質(zhì):sirna質(zhì)量比。在某些實(shí)施方案中，核酸-脂質(zhì)粒子具有約9:1的總脂質(zhì):sirna質(zhì)量比(例如，8.5:1至10:1或8.9:1至10:1或9:1至9.9:1的脂質(zhì):藥物比，包括9.1:1、9.2:1、9.3:1、9.4:1、9.5:1、9.6:1、9.7:1及9.8:1)。

例示性脂質(zhì)配制物u包括以下組分(其中組分的百分比值為摩爾百分比)：peg-脂質(zhì)(1.0％)、陽(yáng)離子脂質(zhì)(51.4％)、磷脂(15.0％)、膽固醇(32.6％)，其中所存在的脂質(zhì)的實(shí)際量可變化例如±5％(或例如±4摩爾％、±3摩爾％、±2摩爾％、±1摩爾％、±0.75摩爾％、±0.5摩爾％、±0.25摩爾％或±0.1摩爾％)。舉例而言，在一個(gè)代表性實(shí)施方案中，peg-脂質(zhì)為peg-c-domg(化合物(67))(1.0％)，陽(yáng)離子脂質(zhì)為1,2-二亞油基氧基-n,n-二甲基氨基丙烷(dlindma)(51.4％)，磷脂為dspc(15.0％)，且膽固醇以32.6％存在，其中所存在的脂質(zhì)的實(shí)際量可變化例如±5％(或例如±4摩爾％、±3摩爾％、±2摩爾％、±1摩爾％、±0.75摩爾％、±0.5摩爾％、±0.25摩爾％或±0.1摩爾％)。因而，本發(fā)明的某些實(shí)施方案提供一種基于核酸-脂質(zhì)粒子的配制物u，其包含本文中所描述的一種或多種sirna分子。舉例而言，在某些實(shí)施方案中，基于核酸脂質(zhì)粒子的配制物u可包含兩個(gè)不同的sirna分子，其中所述兩個(gè)不同的sirna分子的組合選自實(shí)施例2中所描述的組合中的任一種。在某些其它實(shí)施方案中，基于核酸脂質(zhì)粒子的配制物u可包含三個(gè)不同的sirna分子，其中所述三個(gè)不同的sirna分子的組合選自實(shí)施例3中所描述的組合中的任一種。在某些實(shí)施方案中，核酸-脂質(zhì)粒子具有約5:1至約15:1或約5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1或15:1或其任何分?jǐn)?shù)或其中的范圍的總脂質(zhì):sirna質(zhì)量比。在某些實(shí)施方案中，核酸-脂質(zhì)粒子具有約9:1的總脂質(zhì):sirna質(zhì)量比(例如，8.5:1至10:1或8.9:1至10:1或9:1至9.9:1的脂質(zhì):藥物比，包括9.1:1、9.2:1、9.3:1、9.4:1、9.5:1、9.6:1、9.7:1及9.8:1)。

例示性脂質(zhì)配制物v包括以下組分(其中組分的百分比值為摩爾百分比)：peg-脂質(zhì)(1.3％)、陽(yáng)離子脂質(zhì)(60.0％)、磷脂(7.2％)、膽固醇(31.5％)，其中所存在的脂質(zhì)的實(shí)際量可變化例如±5％(或例如±4摩爾％、±3摩爾％、±2摩爾％、±1摩爾％、±0.75摩爾％、±0.5摩爾％、±0.25摩爾％或±0.1摩爾％)。舉例而言，在一個(gè)代表性實(shí)施方案中，peg-脂質(zhì)為peg-c-domg(化合物(67))(1.3％)，陽(yáng)離子脂質(zhì)為1,2-二亞麻基氧基-n,n-二甲基氨基丙烷(dlendma)(60.0％)，磷脂為dspc(7.2％)，且膽固醇以31.5％存在，其中所存在的脂質(zhì)的實(shí)際量可變化例如±5％(或例如±4摩爾％、±3摩爾％、±2摩爾％、±1摩爾％、±0.75摩爾％、±0.5摩爾％、±0.25摩爾％或±0.1摩爾％)。因而，本發(fā)明的某些實(shí)施方案提供一種基于核酸-脂質(zhì)粒子的配制物v，其包含本文中所描述的一種或多種sirna分子。舉例而言，在某些實(shí)施方案中，基于核酸脂質(zhì)粒子的配制物v可包含兩個(gè)不同的sirna分子，其中所述兩個(gè)不同的sirna分子的組合選自實(shí)施例2中所描述的組合中的任一種。在某些其它實(shí)施方案中，基于核酸脂質(zhì)粒子的配制物v可包含三個(gè)不同的sirna分子，其中所述三個(gè)不同的sirna分子的組合選自實(shí)施例3中所描述的組合中的任一種。在某些實(shí)施方案中，核酸-脂質(zhì)粒子具有約5:1至約15:1或約5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1或15:1或其任何分?jǐn)?shù)或其中的范圍的總脂質(zhì):sirna質(zhì)量比。在某些實(shí)施方案中，核酸-脂質(zhì)粒子具有約9:1的總脂質(zhì):sirna質(zhì)量比(例如，8.5:1至10:1或8.9:1至10:1或9:1至9.9:1的脂質(zhì):藥物比，包括9.1:1、9.2:1、9.3:1、9.4:1、9.5:1、9.6:1、9.7:1及9.8:1)。

例示性脂質(zhì)配制物w包括以下組分(其中組分的百分比值為摩爾百分比)：peg-脂質(zhì)(1.8％)、陽(yáng)離子脂質(zhì)(51.6％)、磷脂(8.4％)、膽固醇(38.3％)，其中所存在的脂質(zhì)的實(shí)際量可變化例如±5％(或例如±4摩爾％、±3摩爾％、±2摩爾％、±1摩爾％、±0.75摩爾％、±0.5摩爾％、±0.25摩爾％或±0.1摩爾％)。舉例而言，在一個(gè)代表性實(shí)施方案中，peg-脂質(zhì)為peg-c-dma(化合物(66))(1.8％)，陽(yáng)離子脂質(zhì)為1,2-二亞油基氧基-n,n-二甲基氨基丙烷(dlindma)(51.6％)，磷脂為dspc(8.4％)，且膽固醇以38.3％存在，其中所存在的脂質(zhì)的實(shí)際量可變化例如±5％(或例如±4摩爾％、±3摩爾％、±2摩爾％、±1摩爾％、±0.75摩爾％、±0.5摩爾％、±0.25摩爾％或±0.1摩爾％)。因而，本發(fā)明的某些實(shí)施方案提供一種基于核酸-脂質(zhì)粒子的配制物w，其包含本文中所描述的一種或多種sirna分子。舉例而言，在某些實(shí)施方案中，基于核酸脂質(zhì)粒子的配制物w可包含兩個(gè)不同的sirna分子，其中所述兩個(gè)不同的sirna分子的組合選自實(shí)施例2中所描述的組合中的任一種。在某些其它實(shí)施方案中，基于核酸脂質(zhì)粒子的配制物w可包含三個(gè)不同的sirna分子，其中所述三個(gè)不同的sirna分子的組合選自實(shí)施例3中所描述的組合中的任一種。在某些實(shí)施方案中，核酸-脂質(zhì)粒子具有約5:1至約15:1或約5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1或15:1或其任何分?jǐn)?shù)或其中的范圍的總脂質(zhì):sirna質(zhì)量比。在某些實(shí)施方案中，核酸-脂質(zhì)粒子具有約9:1的總脂質(zhì):sirna質(zhì)量比(例如，8.5:1至10:1或8.9:1至10:1或9:1至9.9:1的脂質(zhì):藥物比，包括9.1:1、9.2:1、9.3:1、9.4:1、9.5:1、9.6:1、9.7:1及9.8:1)。

例示性脂質(zhì)配制物x包括以下組分(其中組分的百分比值為摩爾百分比)：peg-脂質(zhì)(2.4％)、陽(yáng)離子脂質(zhì)(48.5％)、磷脂(10.0％)、膽固醇(39.2％)，其中所存在的脂質(zhì)的實(shí)際量可變化例如±5％(或例如±4摩爾％、±3摩爾％、±2摩爾％、±1摩爾％、±0.75摩爾％、±0.5摩爾％、±0.25摩爾％或±0.1摩爾％)。舉例而言，在一個(gè)代表性實(shí)施方案中，peg-脂質(zhì)為peg-c-dma(化合物(66))(2.4％)，陽(yáng)離子脂質(zhì)為1,2-二-γ-亞麻基氧基-n,n-二甲基氨基丙烷(γ-dlendma；化合物(15))(48.5％)，磷脂為dppc(10.0％)，且膽固醇以39.2％存在，其中所存在的脂質(zhì)的實(shí)際量可變化例如±5％(或例如±4摩爾％、±3摩爾％、±2摩爾％、±1摩爾％、±0.75摩爾％、±0.5摩爾％、±0.25摩爾％或±0.1摩爾％)。因而，本發(fā)明的某些實(shí)施方案提供一種基于核酸-脂質(zhì)粒子的配制物x，其包含本文中所描述的一種或多種sirna分子。舉例而言，在某些實(shí)施方案中，基于核酸脂質(zhì)粒子的配制物x可包含兩個(gè)不同的sirna分子，其中所述兩個(gè)不同的sirna分子的組合選自實(shí)施例2中所描述的組合中的任一種。在某些其它實(shí)施方案中，基于核酸脂質(zhì)粒子的配制物x可包含三個(gè)不同的sirna分子，其中所述三個(gè)不同的sirna分子的組合選自實(shí)施例3中所描述的組合中的任一種。在某些實(shí)施方案中，核酸-脂質(zhì)粒子具有約5:1至約15:1或約5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1或15:1或其任何分?jǐn)?shù)或其中的范圍的總脂質(zhì):sirna質(zhì)量比。在某些實(shí)施方案中，核酸-脂質(zhì)粒子具有約9:1的總脂質(zhì):sirna質(zhì)量比(例如，8.5:1至10:1或8.9:1至10:1或9:1至9.9:1的脂質(zhì):藥物比，包括9.1:1、9.2:1、9.3:1、9.4:1、9.5:1、9.6:1、9.7:1及9.8:1)。

例示性脂質(zhì)配制物y包括以下組分(其中組分的百分比值為摩爾百分比)：peg-脂質(zhì)(2.6％)、陽(yáng)離子脂質(zhì)(61.2％)、磷脂(7.1％)、膽固醇(29.2％)，其中所存在的脂質(zhì)的實(shí)際量可變化例如±5％(或例如±4摩爾％、±3摩爾％、±2摩爾％、±1摩爾％、±0.75摩爾％、±0.5摩爾％、±0.25摩爾％或±0.1摩爾％)。舉例而言，在一個(gè)代表性實(shí)施方案中，peg-脂質(zhì)為peg-c-dma(化合物(66))(2.6％)，陽(yáng)離子脂質(zhì)為5-(二甲基氨基)戊酸(6z,16z)-12-((z)-癸-4-烯基)二十二碳-6,16-二烯-11-基酯(化合物(13))(61.2％)，磷脂為dspc(7.1％)，且膽固醇以29.2％存在，其中所存在的脂質(zhì)的實(shí)際量可變化例如±5％(或例如±4摩爾％、±3摩爾％、±2摩爾％、±1摩爾％、±0.75摩爾％、±0.5摩爾％、±0.25摩爾％或±0.1摩爾％)。因而，本發(fā)明的某些實(shí)施方案提供一種基于核酸-脂質(zhì)粒子的配制物y，其包含本文中所描述的一種或多種sirna分子。舉例而言，在某些實(shí)施方案中，基于核酸脂質(zhì)粒子的配制物y可包含兩個(gè)不同的sirna分子，其中所述兩個(gè)不同的sirna分子的組合選自實(shí)施例2中所描述的組合中的任一種。在某些其它實(shí)施方案中，基于核酸脂質(zhì)粒子的配制物y可包含三個(gè)不同的sirna分子，其中所述三個(gè)不同的sirna分子的組合選自實(shí)施例3中所描述的組合中的任一種。在某些實(shí)施方案中，核酸-脂質(zhì)粒子具有約5:1至約15:1或約5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1或15:1或其任何分?jǐn)?shù)或其中的范圍的總脂質(zhì):sirna質(zhì)量比。在某些實(shí)施方案中，核酸-脂質(zhì)粒子具有約9:1的總脂質(zhì):sirna質(zhì)量比(例如，8.5:1至10:1或8.9:1至10:1或9:1至9.9:1的脂質(zhì):藥物比，包括9.1:1、9.2:1、9.3:1、9.4:1、9.5:1、9.6:1、9.7:1及9.8:1)。

例示性脂質(zhì)配制物z包括以下組分(其中組分的百分比值為摩爾百分比)：peg-脂質(zhì)(2.2％)、陽(yáng)離子脂質(zhì)(49.7％)、磷脂(12.1％)、膽固醇(36.0％)，其中所存在的脂質(zhì)的實(shí)際量可變化例如±5％(或例如±4摩爾％、±3摩爾％、±2摩爾％、±1摩爾％、±0.75摩爾％、±0.5摩爾％、±0.25摩爾％或±0.1摩爾％)。舉例而言，在一個(gè)代表性實(shí)施方案中，peg-脂質(zhì)為peg-c-domg(化合物(67))(2.2％)，陽(yáng)離子脂質(zhì)為4-(二甲基氨基)丁酸(6z,9z,28z,31z)-三十七碳-6,9,28,31-四烯-19-基酯(化合物(7))(49.7％)，磷脂為dppc(12.1％)，且膽固醇以36.0％存在，其中所存在的脂質(zhì)的實(shí)際量可變化例如±5％(或例如±4摩爾％、±3摩爾％、±2摩爾％、±1摩爾％、±0.75摩爾％、±0.5摩爾％、±0.25摩爾％或±0.1摩爾％)。因而，本發(fā)明的某些實(shí)施方案提供一種基于核酸-脂質(zhì)粒子的配制物z，其包含本文中所描述的一種或多種sirna分子。舉例而言，在某些實(shí)施方案中，基于核酸脂質(zhì)粒子的配制物z可包含兩個(gè)不同的sirna分子，其中所述兩個(gè)不同的sirna分子的組合選自實(shí)施例2中所描述的組合中的任一種。在某些其它實(shí)施方案中，基于核酸脂質(zhì)粒子的配制物z可包含三個(gè)不同的sirna分子，其中所述三個(gè)不同的sirna分子的組合選自實(shí)施例3中所描述的組合中的任一種。在某些實(shí)施方案中，核酸-脂質(zhì)粒子具有約5:1至約15:1或約5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1或15:1或其任何分?jǐn)?shù)或其中的范圍的總脂質(zhì):sirna質(zhì)量比。在某些實(shí)施方案中，核酸-脂質(zhì)粒子具有約9:1的總脂質(zhì):sirna質(zhì)量比(例如，8.5:1至10:1或8.9:1至10:1或9:1至9.9:1的脂質(zhì):藥物比，包括9.1:1、9.2:1、9.3:1、9.4:1、9.5:1、9.6:1、9.7:1及9.8:1)。

因此，本發(fā)明的某些實(shí)施方案提供一種本文中所描述的核酸-脂質(zhì)粒子，其中所述脂質(zhì)是如配制物a、b、c、d、e、f、g、h、i、j、k、l、m、n、o、p、q、r、s、t、u、v、w、x、y或z中的任一種中所描述加以配制。

本發(fā)明還提供包含核酸-脂質(zhì)粒子及藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物。

本發(fā)明的核酸-脂質(zhì)粒子可用于例如治療性遞送使一個(gè)或多個(gè)hbv基因的表達(dá)沉默的sirna。在一些實(shí)施方案中，將靶向hbv基因或轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的不同區(qū)域(例如重疊和/或非重疊序列)的sirna的混合液配制成相同或不同的核酸-脂質(zhì)粒子，且將所述粒子施用給需要這種治療的哺乳動(dòng)物(例如，人)。在某些情況下，可向哺乳動(dòng)物施用治療有效量的核酸-脂質(zhì)粒子，例如，用于治療人的hbv和/或hdv感染。

在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種將本文中所描述的一種或多種sirna分子引入細(xì)胞中的方法，其是通過使該細(xì)胞與本文中所描述的核酸-脂質(zhì)粒子接觸。

在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種用于將使乙型肝炎病毒基因的表達(dá)沉默的一種或多種sirna分子引入細(xì)胞中的方法，所述方法是通過使該細(xì)胞與本文中所描述的核酸-脂質(zhì)粒子在sirna借此進(jìn)入所述細(xì)胞且使所述細(xì)胞內(nèi)的乙型肝炎病毒基因的表達(dá)沉默的條件下接觸。在某些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞處于諸如人的哺乳動(dòng)物中。在某些實(shí)施方案中，人已被診斷患有乙型肝炎病毒感染或乙型肝炎病毒/丁型肝炎病毒感染。在某些實(shí)施方案中，乙型肝炎病毒基因表達(dá)的沉默使哺乳動(dòng)物中的乙型肝炎病毒和/或丁型肝炎病毒粒子負(fù)載相對(duì)于不存在核酸-脂質(zhì)粒子時(shí)的乙型肝炎病毒和/或丁型肝炎病毒粒子負(fù)載減少至少約50％(例如，約55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)。

在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種用于在細(xì)胞中使乙型肝炎病毒基因的表達(dá)沉默的方法，所述方法包括使包含已表達(dá)的乙型肝炎病毒基因的細(xì)胞與本文中所描述的核酸-脂質(zhì)粒子或組合物(例如，藥物組合物)在sirna借此進(jìn)入所述細(xì)胞且使所述細(xì)胞內(nèi)的乙型肝炎病毒基因表達(dá)沉默的條件下接觸的步驟。在某些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞處于諸如人的哺乳動(dòng)物中。在某些實(shí)施方案中，人已被診斷患有乙型肝炎病毒感染或乙型肝炎病毒/丁型肝炎病毒感染。在某些實(shí)施方案中，人已被診斷患有由乙型肝炎病毒感染或乙型肝炎病毒/丁型肝炎病毒感染所造成的肝病。在某些實(shí)施方案中，乙型肝炎病毒基因表達(dá)的沉默使哺乳動(dòng)物中的乙型肝炎病毒和/或丁型肝炎病毒粒子負(fù)載相對(duì)于不存在核酸-脂質(zhì)粒子時(shí)的乙型肝炎病毒和/或丁型肝炎病毒粒子負(fù)載減少至少約50％(例如，約55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)。

在一些實(shí)施方案中，通過以下施用途徑之一來施用本文中所描述的核酸-脂質(zhì)粒子或組合物(例如，藥物組合物)：經(jīng)口、鼻內(nèi)、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌肉內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、病灶內(nèi)、氣管內(nèi)、皮下及皮內(nèi)。在特定實(shí)施方案中，例如經(jīng)由經(jīng)腸或非經(jīng)腸施用途徑全身施用核酸-脂質(zhì)粒子。

在某些方面，本發(fā)明提供用于在有需要的哺乳動(dòng)物(例如，人)中使hbv基因表達(dá)沉默的方法，所述方法包括向所述哺乳動(dòng)物施用治療有效量的包含本文中所描述的一種或多種sirna(例如，表a中所示的一種或多種sirna)的核酸-脂質(zhì)粒子。在一些實(shí)施方案中，施用包含本文中所描述的一種或多種sirna的核酸-脂質(zhì)粒子使hbvrna水平相對(duì)于在不存在所述sirna時(shí)(例如，緩沖液對(duì)照或無關(guān)非hbv靶向sirna對(duì)照)所檢測(cè)的hbvrna水平減少至少約5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(或其中的任何范圍)。在其它實(shí)施方案中，施用包含一種或多種hbv靶向sirna的核酸-脂質(zhì)粒子使hbvrna水平相對(duì)于陰性對(duì)照(例如，諸如緩沖液對(duì)照或無關(guān)非hbv靶向sirna對(duì)照)減少至少約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100天或更多天(或其中的任何范圍)。

在其它方面，本發(fā)明提供用于在有需要的哺乳動(dòng)物(例如，人)中使hbv基因表達(dá)沉默的方法，所述方法包括向所述哺乳動(dòng)物施用治療有效量的包含本文中所描述的一種或多種sirna(例如，表a中所描述的sirna)的核酸-脂質(zhì)粒子。在一些實(shí)施方案中，施用包含一種或多種hbvsirna的核酸-脂質(zhì)粒子使hbvmrna水平相對(duì)于在不存在所述sirna時(shí)(例如，緩沖液對(duì)照或無關(guān)非hbv靶向sirna對(duì)照)所檢測(cè)的hbvmrna水平減少至少約5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(或其中的任何范圍)。在其它實(shí)施方案中，施用包含一種或多種hbv靶向sirna的核酸-脂質(zhì)粒子使hbvmrna水平相對(duì)于陰性對(duì)照(例如，諸如緩沖液對(duì)照或無關(guān)非hbv靶向sirna對(duì)照)減少至少約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100天或更多天(或其中的任何范圍)。

本發(fā)明的某些實(shí)施方案提供本文中所描述的核酸-脂質(zhì)粒子或組合物(例如，藥物組合物)，其用于在哺乳動(dòng)物(例如，人)中的細(xì)胞中使乙型肝炎病毒基因的表達(dá)沉默。

本發(fā)明的某些實(shí)施方案提供本文中所描述的核酸-脂質(zhì)粒子或組合物(例如，藥物組合物)的用途，其用以制備用于在哺乳動(dòng)物(例如，人)中的細(xì)胞中使乙型肝炎病毒基因的表達(dá)沉默的藥劑。

在其它方面，本發(fā)明提供用于在有需要的哺乳動(dòng)物(例如，人)中治療、預(yù)防hbv和/或hdv感染、降低罹患其的風(fēng)險(xiǎn)或可能性(例如，降低易感染性)、延遲其發(fā)作和/或改善一個(gè)或多與其相關(guān)的癥狀的方法，所述方法包括向所述哺乳動(dòng)物施用治療有效量的包含本文中所描述的靶向hbv基因表達(dá)的一種或多種sirna(例如，如表a中所描述)的核酸-脂質(zhì)粒子。人中與hbv和/或hdv感染相關(guān)的癥狀的實(shí)例包括發(fā)燒、腹痛、尿液色深、關(guān)節(jié)疼痛、食欲不振、惡心、嘔吐、虛弱、疲勞及皮膚發(fā)黃(黃疸)。

本發(fā)明的某些實(shí)施方案提供一種用于在哺乳動(dòng)物中治療乙型肝炎病毒和/或丁型肝炎病毒感染的方法，所述方法包括向所述哺乳動(dòng)物施用治療有效量的如本文中所描述的核酸-脂質(zhì)粒子或組合物(例如，藥物組合物)的步驟。

本發(fā)明的某些實(shí)施方案提供一種核酸-脂質(zhì)粒子或組合物(例如，藥物組合物)，其用于在哺乳動(dòng)物(例如，人)中治療乙型肝炎病毒和/或丁型肝炎病毒感染。

本發(fā)明的某些實(shí)施方案提供核酸-脂質(zhì)粒子或組合物(例如，藥物組合物)的用途，其用以制備用于在哺乳動(dòng)物(例如，人)中治療乙型肝炎病毒和/或丁型肝炎病毒感染的藥劑。

本發(fā)明的某些實(shí)施方案提供一種用于在哺乳動(dòng)物中改善與乙型肝炎病毒和/或丁型肝炎病毒感染相關(guān)的一種或多種癥狀的方法，所述方法包括向所述哺乳動(dòng)物施用治療有效量的包含本文中所描述的一種或多種sirna分子(例如，如表a中所描述)的本文中所描述的核酸-脂質(zhì)粒子或組合物(例如，藥物組合物)的步驟。在某些實(shí)施方案中，粒子經(jīng)由全身途徑施用。在某些實(shí)施方案中，核酸-脂質(zhì)粒子的sirna抑制乙型肝炎病毒基因在哺乳動(dòng)物中的表達(dá)。在某些實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物為人。在某些實(shí)施方案中，人患有肝病。

本發(fā)明的某些實(shí)施方案提供一種如本文中所描述的核酸-脂質(zhì)粒子或組合物(例如，藥物組合物)，其用于在哺乳動(dòng)物(例如，人)中改善一種或多種與乙型肝炎病毒和/或丁型肝炎病毒感染相關(guān)的癥狀。

本發(fā)明的某些實(shí)施方案提供如本文中所描述的核酸-脂質(zhì)粒子或組合物(例如，藥物組合物)的用途，其用以制備用于在哺乳動(dòng)物(例如，人)中改善一種或多種與乙型肝炎病毒和/或丁型肝炎病毒感染相關(guān)的癥狀的藥劑。

本發(fā)明的某些實(shí)施方案提供一種用于在哺乳動(dòng)物(例如，人)中抑制hdv的復(fù)制和/或改善hdv感染的一種或多種癥狀的方法，所述方法包括向所述哺乳動(dòng)物施用治療有效量的如本文中所描述的核酸-脂質(zhì)粒子或組合物(例如，藥物組合物)的步驟，其中所述核酸-脂質(zhì)粒子或組合物抑制hbv表面抗原的合成。

本發(fā)明的某些實(shí)施方案提供一種如本文中所描述的核酸-脂質(zhì)粒子或組合物(例如，藥物組合物)，其用于在哺乳動(dòng)物(例如，人)中抑制hdv的復(fù)制和/或改善hdv感染的一種或多種癥狀，其中所述核酸-脂質(zhì)粒子或組合物抑制hbv表面抗原的合成。

本發(fā)明的某些實(shí)施方案提供如本文中所描述的核酸-脂質(zhì)粒子或組合物(例如，藥物組合物)的用途，其用以制備用于在哺乳動(dòng)物(例如，人)中抑制hdv的復(fù)制和/或改善hdv感染的一種或多種癥狀的藥劑，其中所述核酸-脂質(zhì)粒子或組合物抑制hbv表面抗原的合成。

本發(fā)明的某些實(shí)施方案提供一種如本文中所描述的核酸-脂質(zhì)粒子或組合物(例如，藥物組合物)，其用于醫(yī)學(xué)療法中。

在其它方面，本發(fā)明提供用于在有需要的哺乳動(dòng)物(例如，人)(例如，罹患hbv感染或hbv/hdv感染的人)中使hbv和/或hdv不活化的方法，所述方法包括向所述哺乳動(dòng)物施用治療有效量的包含本文中所描述的靶向hbv基因表達(dá)的一種或多種sirna的核酸-脂質(zhì)粒子。在一些實(shí)施方案中，施用包含一種或多種hbv靶向sirna的核酸-脂質(zhì)粒子使hbv蛋白水平(例如，hbv表面抗原蛋白)相對(duì)于不存在所述sirna時(shí)(例如，緩沖液對(duì)照或無關(guān)非hbv靶向sirna對(duì)照)所檢測(cè)的hbv蛋白水平下降、減少或降低至少約5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(或其中的任何范圍)。

舉例而言，可使用分支dna測(cè)定法(affymetrix)測(cè)量hbvmrna。分支dna測(cè)定法為使用bdna分子擴(kuò)增來自所俘獲的靶rna的信號(hào)的夾心核酸雜交法。

除其在出于治療目的使任一hbv基因的表達(dá)沉默方面的效用以外，本文中所描述的sirna也可用于研究及開發(fā)應(yīng)用以及診斷、預(yù)防、預(yù)后、臨床及其它健康照護(hù)應(yīng)用。作為一個(gè)非限制性實(shí)例，sirna可用于針對(duì)測(cè)試hbv基因家族的特定成員是否具有作為治療標(biāo)靶的潛力的標(biāo)靶驗(yàn)證研究。

產(chǎn)生sirna分子

sirna可呈若干形式提供，包括例如作為一個(gè)或多個(gè)經(jīng)分離的小干擾rna(sirna)雙鏈體、作為較長(zhǎng)的雙鏈rna(dsrna)或作為自dna質(zhì)粒中的轉(zhuǎn)錄盒轉(zhuǎn)錄的sirna或dsrna。在一些實(shí)施方案中，可由酶或通過部分/總有機(jī)合成來產(chǎn)生sirna，且可通過體外酶促或有機(jī)合成來引入經(jīng)修飾的核糖核苷酸。在某些情況下，各鏈通過化學(xué)方式制備。合成rna分子的方法在本領(lǐng)域中為已知的，例如，如verma和eckstein(1998)中所描述或如本文中所描述的化學(xué)合成方法。

用于分離rna、合成rna、使核酸雜交、制造及篩選cdna庫(kù)以及進(jìn)行pcr的方法在本領(lǐng)域中為熟知的(參見例如gubler及hoffman,gene,25:263-269(1983)；sambrook等人,同上；ausubel等人,同上)，pcr方法同樣如此(參見例如美國(guó)專利第4,683,195號(hào)和第4,683,202號(hào)；pcrprotocols:aguidetomethodsandapplications(innis等人編,1990))。表達(dá)庫(kù)對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員也是熟知的。披露本發(fā)明所使用的一般方法的其它基本文稿包括sambrook等人,molecularcloning,alaboratorymanual(第2版,1989)；kriegler,genetransferandexpression:alaboratorymanual(1990)；及currentprotocolsinmolecularbiology(ausubel等人編,1994)。這些參考文獻(xiàn)的公開內(nèi)容出于所有目的以全文引用的方式并入本文中。

sirna優(yōu)選由化學(xué)方式合成。包含本發(fā)明的sirna分子的寡核苷酸可使用本領(lǐng)域中已知的多種技術(shù)中的任一種來合成，諸如以下文獻(xiàn)中所描述的那些技術(shù)：usman等人,j.am.chem.soc.,109:7845(1987)；scaringe等人,nucl.acidsres.,18:5433(1990)；wincott等人,nucl.acidsres.,23:2677-2684(1995)；及wincott等人,methodsmol.bio.,74:59(1997)。寡核苷酸的合成利用常用核酸保護(hù)基和偶合基，諸如5'端的二甲氧基三苯甲基以及3'端的亞磷酰胺。作為一個(gè)非限制性實(shí)例，可在appliedbiosystems合成器上使用0.2μmol規(guī)模方案進(jìn)行小規(guī)模合成?；蛘?，0.2μmol規(guī)模的合成可在得自protogene(paloalto，ca)的96孔板合成器上進(jìn)行。然而，更大或更小的合成規(guī)模也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。用于寡核苷酸合成的適合試劑、用于rna脫保護(hù)的方法以及用于rna純化的方法對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員為已知的。

可由兩個(gè)不同的寡核苷酸組裝sirna分子，其中一個(gè)寡核苷酸包含sirna的有義鏈且另一個(gè)包含sirna的反義鏈。舉例而言，可分開合成各鏈且在合成和/或脫保護(hù)之后通過雜交或連接而接合在一起。

含有治療性核酸的載體系統(tǒng)

a.脂質(zhì)粒子

在某些方面，本發(fā)明提供包含一種或多種sirna分子(例如，表a中所描述的一種或多種sirna分子)和一種或多種陽(yáng)離子(氨基)脂質(zhì)或其鹽的脂質(zhì)粒子。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的脂質(zhì)粒子還包含一種或多種非陽(yáng)離子脂質(zhì)。在其它實(shí)施方案中，脂質(zhì)粒子還包含一種或多種能夠減少或抑制粒子聚集的綴合脂質(zhì)。

本發(fā)明的脂質(zhì)粒子優(yōu)選包含一種或多種sirna分子(例如，表a中所描述的sirna分子)、陽(yáng)離子脂質(zhì)、非陽(yáng)離子脂質(zhì)和抑制粒子聚集的綴合脂質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，將sirna分子完全囊封在脂質(zhì)粒子的脂質(zhì)部分內(nèi)，使得脂質(zhì)粒子中的sirna分子在水溶液中對(duì)核酸酶降解具有抗性。在其它實(shí)施方案中，本文中所描述的脂質(zhì)粒子對(duì)諸如人的哺乳動(dòng)物實(shí)質(zhì)上無毒。本發(fā)明的脂質(zhì)粒子典型地具有約30nm至約150nm、約40nm至約150nm、約50nm至約150nm、約60nm至約130nm、約70nm至約110nm或約70至約90nm的平均直徑。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的脂質(zhì)粒子具有約30nm至約150nm的中值直徑。本發(fā)明的脂質(zhì)粒子還典型地具有約1:1至約100:1、約1:1至約50:1、約2:1至約25:1、約3:1至約20:1、約5:1至約15:1或約5:1至約10:1的脂質(zhì):核酸比(例如，脂質(zhì):sirna比)(質(zhì)量/質(zhì)量比)。在某些實(shí)施方案中，核酸-脂質(zhì)粒子具有約5:1至約15:1的脂質(zhì):sirna質(zhì)量比。

在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的脂質(zhì)粒子為血清穩(wěn)定性核酸-脂質(zhì)粒子，其包含一種或多種sirna分子(例如，如表a中所描述的sirna分子)、陽(yáng)離子脂質(zhì)(例如，如本文中所闡述的一種或多種具有式i至式iii的陽(yáng)離子脂質(zhì)或其鹽)、非陽(yáng)離子脂質(zhì)(例如，一種或多種磷脂與膽固醇的混合物)和抑制粒子聚集的綴合脂質(zhì)(例如，一種或多種peg-脂質(zhì)綴合物)。脂質(zhì)粒子可包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個(gè)靶向本文中所描述的一個(gè)或多個(gè)基因的sirna分子(例如，表a中所描述的sirna分子)。核酸-脂質(zhì)粒子及其制備方法描述于例如美國(guó)專利第5,753,613號(hào)、第5,785,992號(hào)、第5,705,385號(hào)、第5,976,567號(hào)、第5,981,501號(hào)、第6,110,745號(hào)和第6,320,017號(hào)以及pct公開案第wo96/40964號(hào)中，其公開內(nèi)容各自出于所有目的以全文引用的方式并入本文中。

在本發(fā)明的核酸-脂質(zhì)粒子中，一個(gè)或多個(gè)sirna分子(例如，如表a中所描述的sirna分子)可完全囊封在粒子的脂質(zhì)部分內(nèi)，從而保護(hù)sirna免于核酸酶降解。在某些情況下，核酸-脂質(zhì)粒子中的sirna在所述粒子于37℃下暴露于核酸酶至少約20、30、45或60分鐘之后基本上不降解。在某些其它情況下，核酸-脂質(zhì)粒子中的sirna在所述粒子在37℃下于血清中培育至少約30、45或60分鐘或至少約2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34或36小時(shí)之后基本上不降解。在其它實(shí)施方案中，使sirna與所述粒子的脂質(zhì)部分復(fù)合。本發(fā)明配制物的益處之一為核酸-脂質(zhì)粒子組合物對(duì)諸如人的哺乳動(dòng)物實(shí)質(zhì)上無毒。

術(shù)語(yǔ)“完全囊封”指示核酸-脂質(zhì)粒子中的sirna(例如，如表a中所描述的sirna分子)在暴露于血清或會(huì)顯著降解游離dna或rna的核酸酶測(cè)定之后不顯著降解。在完全囊封的系統(tǒng)中，在正常將降解100％游離sirna的治療中，優(yōu)選少于約25％的處于粒子中的sirna降解，更優(yōu)選少于約10％且最優(yōu)選少于約5％的處于粒子中的sirna降解?！巴耆曳狻币仓甘竞怂?脂質(zhì)粒子為血清穩(wěn)定的，即，其在體內(nèi)施用后不快速分解成其組成部分。

在核酸的情形下，完全囊封可通過進(jìn)行使用當(dāng)與核酸締合時(shí)具有增強(qiáng)的熒光的染料的膜不滲透性熒光染料排除測(cè)定法來測(cè)定。諸如和(invitrogencorp.；carlsbad，ca)的特定染料可用于質(zhì)粒dna、單鏈脫氧核糖核苷酸和/或單鏈或雙鏈核糖核苷酸的定量測(cè)定。囊封是通過向脂質(zhì)體配制物中添加染料，測(cè)量所產(chǎn)生的熒光且將其與添加少量非離子清潔劑后所觀測(cè)的熒光相比較來測(cè)定。清潔劑介導(dǎo)的脂質(zhì)體雙層破環(huán)釋放所囊封的核酸，從而允許其與膜不滲透性染料相互作用。核酸囊封率可計(jì)算為e＝(io-i)/io，其中i和io是指添加清潔劑前后的熒光強(qiáng)度(參見wheeler等人,genether.,6:271-281(1999))。

在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種核酸-脂質(zhì)粒子組合物，其包含多種核酸-脂質(zhì)粒子。

在一些情況下，核酸-脂質(zhì)粒子組合物包含完全囊封在粒子的脂質(zhì)部分內(nèi)的sirna分子，使得約30％至約100％、約40％至約100％、約50％至約100％、約60％至約100％、約70％至約100％、約80％至約100％、約90％至約100％、約30％至約95％、約40％至約95％、約50％至約95％、約60％至約95％、約70％至約95％、約80％至約95％、約85％至約95％、約90％至約95％、約30％至約90％、約40％至約90％、約50％至約90％、約60％至約90％、約70％至約90％、約80％至約90％或至少約30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％(或其任何分?jǐn)?shù)或其中的范圍)的粒子中囊封有sirna。

在其它情況下，核酸-脂質(zhì)粒子組合物包含完全囊封在粒子的脂質(zhì)部分內(nèi)的sirna分子，使得約30％至約100％、約40％至約100％、約50％至約100％、約60％至約100％、約70％至約100％、約80％至約100％、約90％至約100％、約30％至約95％、約40％至約95％、約50％至約95％、約60％至約95％、約70％至約95％、約80％至約95％、約85％至約95％、約90％至約95％、約30％至約90％、約40％至約90％、約50％至約90％、約60％至約90％、約70％至約90％、約80％至約90％或至少約30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％(或其任何分?jǐn)?shù)或其中的范圍)的輸入sirna囊封在粒子中。

視本發(fā)明的脂質(zhì)粒子的預(yù)定用途而定，組分的比例可變化且特定配制物的遞送效率可使用例如核內(nèi)體釋放參數(shù)(erp)測(cè)定法加以測(cè)量。

1.陽(yáng)離子脂質(zhì)

多種陽(yáng)離子脂質(zhì)或其鹽中的任一種均可單獨(dú)或與一種或多種其它陽(yáng)離子脂質(zhì)種類或非陽(yáng)離子脂質(zhì)種類組合用于本發(fā)明的脂質(zhì)粒子中。陽(yáng)離子脂質(zhì)包括其(r)和/或(s)對(duì)映異構(gòu)體。

在本發(fā)明的一個(gè)方面，陽(yáng)離子脂質(zhì)為二烷基脂質(zhì)。舉例而言，二烷基脂質(zhì)可包括包含兩條飽和或不飽和烷基鏈的脂質(zhì)，其中所述烷基鏈各自可經(jīng)取代或未經(jīng)取代。在某些實(shí)施方案中，這兩條烷基鏈各自包含至少例如8個(gè)碳原子、10個(gè)碳原子、12個(gè)碳原子、14個(gè)碳原子、16個(gè)碳原子、18個(gè)碳原子、20個(gè)碳原子、22個(gè)碳原子或24個(gè)碳原子。

在本發(fā)明的一個(gè)方面，陽(yáng)離子脂質(zhì)為三烷基脂質(zhì)。舉例而言，三烷基脂質(zhì)可包括包含三條飽和或不飽和烷基鏈的脂質(zhì)，其中所述烷基鏈各自可經(jīng)取代或未經(jīng)取代。在某些實(shí)施方案中，這三條烷基鏈各自包含至少例如8個(gè)碳原子、10個(gè)碳原子、12個(gè)碳原子、14個(gè)碳原子、16個(gè)碳原子、18個(gè)碳原子、20個(gè)碳原子、22個(gè)碳原子或24個(gè)碳原子。

在一個(gè)方面，具有以下結(jié)構(gòu)的式i陽(yáng)離子脂質(zhì)可用于本發(fā)明：

或其鹽，其中：

r¹與r²相同或不同且獨(dú)立地為氫(h)或任選經(jīng)取代的c1-c6烷基、c2-c6烯基或c2-c6炔基，或r¹與r²可接合以形成具有4至6個(gè)碳原子及1或2個(gè)選自由氮(n)、氧(o)及其混合物組成的組的雜原子的任選經(jīng)取代的雜環(huán)；

r³不存在或?yàn)闅?h)或c1-c6烷基以提供季胺；

r⁴與r⁵相同或不同且獨(dú)立地為任選經(jīng)取代的c10-c24烷基、c10-c24烯基、c10-c24炔基或c10-c24酰基，其中r⁴和r⁵中至少一個(gè)包含至少兩個(gè)不飽和位點(diǎn)；且

n為0、1、2、3或4。

在一些實(shí)施方案中，r¹和r²獨(dú)立地為任選經(jīng)取代的c1-c4烷基、c2-c4烯基或c2-c4炔基。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，r¹和r²均為甲基。在其它優(yōu)選實(shí)施方案中，n為1或2。在其它實(shí)施方案中，當(dāng)ph值高于陽(yáng)離子脂質(zhì)的pka時(shí)r³不存在且當(dāng)ph值低于陽(yáng)離子脂質(zhì)的pka時(shí)r³為氫，以便將氨基頭部基團(tuán)質(zhì)子化。在一個(gè)替代實(shí)施方案中，r³為任選經(jīng)取代的c1-c4烷基以提供季胺。在其它實(shí)施方案中，r⁴和r⁵獨(dú)立地為任選經(jīng)取代的c12-c20或c14-c22烷基、c12-c20或c14-c22烯基、c12-c20或c14-c22炔基或c12-c20或c14-c22?；?，其中r⁴和r⁵中至少一個(gè)包含至少兩個(gè)不飽和位點(diǎn)。

在某些實(shí)施方案中，r⁴和r⁵獨(dú)立地選自由十二碳二烯基部分、十四碳二烯基部分、十六碳二烯基部分、十八碳二烯基部分、二十碳二烯基部分、十二碳三烯基部分、十四碳三烯基部分、十六碳三烯基部分、十八碳三烯基部分、二十碳三烯基部分、花生四烯?；糠旨岸剂；糠忠约捌漉；苌?例如，亞油酰基、次亞油酰基、γ-亞油酰基等)組成的組。在一些情況下，r⁴和r⁵之一包含支鏈烷基(例如植烷基部分)或其?；苌?例如，植烷?；糠?。在某些情況下，十八碳二烯基部分為亞油基部分。在某些其它情況下，十八碳三烯基部分為亞麻基部分或γ-亞麻基部分。在某些實(shí)施方案中，r⁴和r⁵均為亞油基部分、亞麻基部分或γ-亞麻基部分。在特定實(shí)施方案中，式i的陽(yáng)離子脂質(zhì)為1,2-二亞油基氧基-n,n-二甲基氨基丙烷(dlindma)、1,2-二亞麻基氧基-n,n-二甲基氨基丙烷(dlendma)、1,2-二亞油基氧基-(n,n-二甲基)-丁基-4-胺(c2-dlindma)、1,2-二亞油酰氧基-(n,n-二甲基)-丁基-4-胺(c2-dlindap)或其混合物。

在一些實(shí)施方案中，式i的陽(yáng)離子脂質(zhì)與一個(gè)或多個(gè)陰離子形成鹽(優(yōu)選為結(jié)晶鹽)。在一個(gè)特定實(shí)施方案中，式i的陽(yáng)離子脂質(zhì)為其草酸(例如，半草酸)鹽，鹽優(yōu)選為結(jié)晶鹽。

諸如dlindma及dlendma以及其它陽(yáng)離子脂質(zhì)的陽(yáng)離子脂質(zhì)的合成描述于美國(guó)專利公開案第20060083780號(hào)中，該案的公開內(nèi)容出于所有目的以全文引用的方式并入本文中。諸如c2-dlindma及c2-dlindap以及其它陽(yáng)離子脂質(zhì)的陽(yáng)離子脂質(zhì)的合成描述于國(guó)際專利申請(qǐng)案第wo2011/000106號(hào)中，該案的公開內(nèi)容出于所有目的以全文引用的方式并入本文中。

在另一方面，具有以下結(jié)構(gòu)的式ii的陽(yáng)離子脂質(zhì)(或其鹽)可用于本發(fā)明：

其中r¹與r²相同或不同且獨(dú)立地為任選經(jīng)取代的c12-c24烷基、c12-c24烯基、c12-c24炔基或c12-c24?；籸³與r⁴相同或不同且獨(dú)立地為任選經(jīng)取代的c1-c6烷基、c2-c6烯基或c2-c6炔基，或r³與r⁴可接合以形成具有4至6個(gè)碳原子及1或2個(gè)選自氮和氧的雜原子的任選經(jīng)取代的雜環(huán)；r⁵不存在或?yàn)闅?h)或c1-c6烷基以提供季胺；m、n和p相同或不同且獨(dú)立地為0、1或2，其限制條件為m、n和p不同時(shí)為0；q為0、1、2、3或4；且y與z相同或不同且獨(dú)立地為o、s或nh。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，q為2。

在一些實(shí)施方案中，式ii的陽(yáng)離子脂質(zhì)為2,2-二亞油基-4-(2-二甲基氨基乙基)-[1,3]-二氧戊環(huán)(dlin-k-c2-dma；“xtc2”或“c2k”)、2,2-二亞油基-4-(3-二甲基氨基丙基)-[1,3]-二氧戊環(huán)(dlin-k-c3-dma；“c3k”)、2,2-二亞油基-4-(4-二甲基氨基丁基)-[1,3]-二氧戊環(huán)(dlin-k-c4-dma；“c4k”)、2,2-二亞油基-5-二甲基氨基甲基-[1,3]-二噁烷(dlin-k6-dma)、2,2-二亞油基-4-n-甲基哌嗪基-[1,3]-二氧戊環(huán)(dlin-k-mpz)、2,2-二亞油基-4-二甲基氨基甲基-[1,3]-二氧戊環(huán)(dlin-k-dma)、2,2-二油?；?4-二甲基氨基甲基-[1,3]-二氧戊環(huán)(do-k-dma)、2,2-二硬脂酰基-4-二甲基氨基甲基-[1,3]-二氧戊環(huán)(ds-k-dma)、2,2-二亞油基-4-n-嗎啉基-[1,3]-二氧戊環(huán)(dlin-k-ma)、2,2-二亞油基-4-三甲基氨基-[1,3]-二氧戊環(huán)氯化物(dlin-k-tma·cl)、2,2-二亞油基-4,5-雙(二甲基氨基甲基)-[1,3]-二氧戊環(huán)(dlin-k²-dma)、2,2-二亞油基-4-甲基哌嗪-[1,3]-二氧戊環(huán)(d-lin-k-n-甲基哌嗪)或其混合物。在優(yōu)選實(shí)施方案中，式ii的陽(yáng)離子脂質(zhì)為dlin-k-c2-dma。

在一些實(shí)施方案中，式ii的陽(yáng)離子脂質(zhì)與一個(gè)或多個(gè)陰離子形成鹽(優(yōu)選為結(jié)晶鹽)。在一個(gè)特定實(shí)施方案中，式ii的陽(yáng)離子脂質(zhì)為其草酸(例如，半草酸)鹽，鹽優(yōu)選為結(jié)晶鹽。

諸如dlin-k-dma以及其它陽(yáng)離子脂質(zhì)的陽(yáng)離子脂質(zhì)的合成描述于pct公開案第wo09/086558號(hào)中，該案的公開內(nèi)容出于所有目的以全文引用的方式并入本文中。諸如dlin-k-c2-dma、dlin-k-c3-dma、dlin-k-c4-dma、dlin-k6-dma、dlin-k-mpz、do-k-dma、ds-k-dma、dlin-k-ma、dlin-k-tma.cl、dlin-k²-dma及d-lin-k-n-甲基哌嗪以及其它陽(yáng)離子脂質(zhì)的陽(yáng)離子脂質(zhì)的合成描述于2009年10月9日提交的名為“improvedaminolipidsandmethodsforthedeliveryofnucleicacids”的pct申請(qǐng)案第pct/us2009/060251號(hào)中，該案的公開內(nèi)容出于所有目的以全文引用的方式并入本文中。

在另一方面，具有以下結(jié)構(gòu)的式iii陽(yáng)離子脂質(zhì)可用于本發(fā)明：

或其鹽，其中：r¹與r²相同或不同且獨(dú)立地為任選經(jīng)取代的c1-c6烷基、c2-c6烯基或c2-c6炔基，或r¹與r²可接合以形成具有4至6個(gè)碳原子及1或2個(gè)選自由氮(n)、氧(o)及其混合物組成的組的雜原子的任選經(jīng)取代的雜環(huán)；r³不存在或?yàn)闅?h)或c1-c6烷基以提供季胺；r⁴和r⁵不存在或存在且當(dāng)存在時(shí)相同或不同且獨(dú)立地為任選經(jīng)取代的c1-c10烷基或c2-c10烯基；且n為0、1、2、3或4。

在一些實(shí)施方案中，r¹和r²獨(dú)立地為任選經(jīng)取代的c1-c4烷基、c2-c4烯基或c2-c4炔基。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，r¹和r²均為甲基。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，r⁴和r⁵均為丁基。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，n為1。在其它實(shí)施方案中，當(dāng)ph值高于陽(yáng)離子脂質(zhì)的pka時(shí)r³不存在且當(dāng)ph值低于陽(yáng)離子脂質(zhì)的pka時(shí)r³為氫，以便將氨基頭部基團(tuán)質(zhì)子化。在一個(gè)替代實(shí)施方案中，r³為任選經(jīng)取代的c1-c4烷基以提供季胺。在其它實(shí)施方案中，r⁴和r⁵獨(dú)立地為任選經(jīng)取代的c2-c6或c2-c4烷基或c2-c6或c2-c4烯基。

在一個(gè)替代實(shí)施方案中，式iii的陽(yáng)離子脂質(zhì)包含介于氨基頭部基團(tuán)與兩個(gè)烷基鏈之一者或兩者之間的酯鍵聯(lián)。在一些實(shí)施方案中，式iii的陽(yáng)離子脂質(zhì)與一個(gè)或多個(gè)陰離子形成鹽(優(yōu)選為結(jié)晶鹽)。在一個(gè)特定實(shí)施方案中，式iii的陽(yáng)離子脂質(zhì)為其草酸(例如，半草酸)鹽，鹽優(yōu)選為結(jié)晶鹽。

盡管式iii中的烷基鏈各自在位置6、9和12上含有順式雙鍵(即，順,順,順-δ⁶,δ⁹,δ¹²)，但在一個(gè)替代實(shí)施方案中，兩條烷基鏈之一者或兩者中的這些雙鍵中一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)可呈反式構(gòu)形。

在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，式iii的陽(yáng)離子脂質(zhì)具有以下結(jié)構(gòu)：

諸如γ-dlendma(15)以及其它陽(yáng)離子脂質(zhì)的陽(yáng)離子脂質(zhì)的合成描述于2009年7月1日提交的名為“improvedcationiclipidsandmethodsforthedeliveryofnucleicacids”的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)案第61/222,462號(hào)中，該案的公開內(nèi)容出于所有目的以全文引用的方式并入本文中。

諸如dlin-m-c3-dma(“mc3”)以及其它陽(yáng)離子脂質(zhì)(例如，mc3的某些類似物)的陽(yáng)離子脂質(zhì)的合成描述于2009年6月10日提交的名為“novellipidsandcompositionsforthedeliveryoftherapeutics”的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)案第61/185,800號(hào)和2009年12月18日提交的名為“methodsandcompositionsfordeliveryofnucleicacids”的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)案第61/287,995號(hào)中，其公開內(nèi)容出于所有目的以全文引用的方式并入本文中。

可包括在本發(fā)明的脂質(zhì)粒子中的其它陽(yáng)離子脂質(zhì)或其鹽的實(shí)例包括但不限于陽(yáng)離子脂質(zhì)，諸如wo2011/000106中所描述的那些陽(yáng)離子脂質(zhì)，其公開內(nèi)容出于所有目的以全文引用的方式并入本文中；以及陽(yáng)離子脂質(zhì)，諸如n,n-二油烯基-n,n-二甲基氯化銨(dodac)、1,2-二油烯基氧基-n,n-二甲基氨基丙烷(dodma)、1,2-二硬脂基氧基-n,n-二甲基氨基丙烷(dsdma)、n-(1-(2,3-二油烯基氧基)丙基)-n,n,n-三甲基氯化銨(dotma)、n,n-二硬脂基-n,n-二甲基溴化銨(ddab)、n-(1-(2,3-二油?；趸?丙基)-n,n,n-三甲基氯化銨(dotap)、3-(n-(n',n'-二甲基氨基乙烷)-氨甲?；?膽固醇(dc-chol)、n-(1,2-二肉豆蔻基氧基丙-3-基)-n,n-二甲基-n-羥基乙基溴化銨(dmrie)、2,3-二油烯基氧基-n-[2(精胺-甲酰胺基)乙基]-n,n-二甲基-1-丙烷三氟乙酸銨(dospa)、二(十八烷基)酰胺甘氨?；?dogs)、3-二甲基氨基-2-(膽固醇-5-烯-3-β-氧基丁-4-氧基)-1-(順,順-9,12-十八碳二烯氧基)丙烷(clindma)、2-[5'-(膽固醇-5-烯-3-β-氧基)-3'-氧雜戊氧基)-3-二甲基-1-(順,順-9',1-2'-十八碳二烯氧基)丙烷(cplindma)、n,n-二甲基-3,4-二油烯基氧基苯甲胺(dmoba)、1,2-n,n'-二油烯基氨甲酰基-3-二甲基氨基丙烷(docarbdap)、1,2-n,n'-二亞油基氨甲酰基-3-二甲基氨基丙烷(dlincarbdap)、1,2-二亞油基氨甲酰基氧基-3-二甲基氨基丙烷(dlin-c-dap)、1,2-二亞油基氧基-3-(二甲基氨基)乙酰氧基丙烷(dlin-dac)、1,2-二亞油基氧基-3-嗎啉基丙烷(dlin-ma)、1,2-二亞油?；?3-二甲基氨基丙烷(dlindap)、1,2-二亞油基硫-3-二甲基氨基丙烷(dlin-s-dma)、1-亞油酰基-2-亞油基氧基-3-二甲基氨基丙烷(dlin-2-dmap)、1,2-二亞油基氧基-3-三甲基氨基丙烷氯化物鹽(dlin-tma·cl)、1,2-二亞油酰基-3-三甲基丙烷氯化物鹽(dlin-tap·cl)、1,2-二亞油基氧基-3-(n-甲基哌嗪基)丙烷(dlin-mpz)、3-(n,n-二亞油基氨基)-1,2-丙二醇(dlinap)、3-(n,n-二油烯基氨基)-1,2-丙二醇(doap)、1,2-二亞油基氧代-3-(2-n,n-二甲基氨基)環(huán)氧丙烷(dlin-eg-dma)、1,2-二油烯基氨甲?；趸?3-二甲基氨基丙烷(do-c-dap)、1,2-二肉豆蔻基油?；?3-二甲基氨基丙烷(dmdap)、1,2-二油?；?3-三甲基氨基丙烷氯化物(dotap·cl)、二亞油基甲基-3-二甲基氨基丙酸酯(dlin-m-c2-dma；也稱為dlin-m-k-dma或dlin-m-dma)及其混合物。可包括在本發(fā)明的脂質(zhì)粒子中的其它陽(yáng)離子脂質(zhì)或其鹽描述于美國(guó)專利公開案第20090023673號(hào)中，該案的公開內(nèi)容出于所有目的以全文引用的方式并入本文中。

諸如clindma以及其它陽(yáng)離子脂質(zhì)的陽(yáng)離子脂質(zhì)的合成描述于美國(guó)專利公開案第20060240554號(hào)中，該案的公開內(nèi)容出于所有目的以全文引用的方式并入本文中。諸如dlin-c-dap、dlindac、dlinma、dlindap、dlin-s-dma、dlin-2-dmap、dlintma·cl、dlintap·cl、dlinmpz、dlinap、doap和dlin-eg-dma以及其它陽(yáng)離子脂質(zhì)的陽(yáng)離子脂質(zhì)的合成描述于pct公開案第wo09/086558號(hào)中，該案的公開內(nèi)容出于所有目的以全文引用的方式并入本文中。諸如do-c-dap、dmdap、dotap·cl、dlin-m-c2-dma以及其它陽(yáng)離子脂質(zhì)的陽(yáng)離子脂質(zhì)的合成描述于2009年10月9日提交的名為“improvedaminolipidsandmethodsforthedeliveryofnucleicacids”的pct申請(qǐng)案第pct/us2009/060251號(hào)中，該案的公開內(nèi)容出于所有目的以全文引用的方式并入本文中。許多其它陽(yáng)離子脂質(zhì)和相關(guān)類似物的合成已描述于美國(guó)專利第5,208,036號(hào)、第5,264,618號(hào)、第5,279,833號(hào)、第5,283,185號(hào)、第5,753,613號(hào)和第5,785,992號(hào)以及pct公開案第wo96/10390號(hào)中，其公開內(nèi)容各自出于所有目的以全文引用的方式并入本文中。另外，可使用陽(yáng)離子脂質(zhì)的許多市售制劑，例如，諸如(包括dotma和dope，可得自invitrogen)；(包括dospa和dope，可得自invitrogen)；和(包括dogs，可得自promegacorp.)。

在一些實(shí)施方案中，陽(yáng)離子脂質(zhì)占粒子中所存在的總脂質(zhì)的約50摩爾％至約90摩爾％、約50摩爾％至約85摩爾％、約50摩爾％至約80摩爾％、約50摩爾％至約75摩爾％、約50摩爾％至約70摩爾％、約50摩爾％至約65摩爾％、約50摩爾％至約60摩爾％、約55摩爾％至約65摩爾％或約55摩爾％至約70摩爾％(或其任何分?jǐn)?shù)或其中的范圍)。在特定實(shí)施方案中，陽(yáng)離子脂質(zhì)占粒子中所存在的總脂質(zhì)的約50摩爾％、51摩爾％、52摩爾％、53摩爾％、54摩爾％、55摩爾％、56摩爾％、57摩爾％、58摩爾％、59摩爾％、60摩爾％、61摩爾％、62摩爾％、63摩爾％、64摩爾％或65摩爾％(或其任何分?jǐn)?shù))。

在其它實(shí)施方案中，陽(yáng)離子脂質(zhì)占粒子中所存在的總脂質(zhì)的約2摩爾％至約60摩爾％、約5摩爾％至約50摩爾％、約10摩爾％至約50摩爾％、約20摩爾％至約50摩爾％、約20摩爾％至約40摩爾％、約30摩爾％至約40摩爾％、或約40摩爾％(或其任何分?jǐn)?shù)或其中的范圍)。

適用于本發(fā)明的脂質(zhì)粒子中的陽(yáng)離子脂質(zhì)的其它百分比及范圍描述于pct公開案第wo09/127060號(hào)、美國(guó)已公開申請(qǐng)案第us2011/0071208號(hào)、pct公開案第wo2011/000106號(hào)和美國(guó)已公開申請(qǐng)案第us2011/0076335號(hào)中，這些專利的公開內(nèi)容出于所有目的以全文引用的方式并入本文中。

應(yīng)理解，本發(fā)明的脂質(zhì)粒子中所存在的陽(yáng)離子脂質(zhì)的百分比為目標(biāo)量，且配制物中所存在的陽(yáng)離子脂質(zhì)的實(shí)際量可變化例如±5摩爾％。舉例而言，在一種例示性脂質(zhì)粒子配制物中，陽(yáng)離子脂質(zhì)的目標(biāo)量為57.1摩爾％，但陽(yáng)離子脂質(zhì)的實(shí)際量可為該目標(biāo)量±5摩爾％、±4摩爾％、±3摩爾％、±2摩爾％、±1摩爾％、±0.75摩爾％、±0.5摩爾％、±0.25摩爾％或±0.1摩爾％，配制物的其余部分由其它脂質(zhì)組分組成(加和達(dá)粒子中所存在的總脂質(zhì)的100摩爾％；然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，總摩爾％可能由于四舍五入而稍微偏離100％，例如99.9摩爾％或100.1摩爾％)。

可用于包括在本發(fā)明中所使用的脂質(zhì)粒子中的陽(yáng)離子脂質(zhì)的其它實(shí)例如下所示：

n,n-二甲基-2,3-雙((9z,12z)-十八碳-9,12-二烯基氧基)丙-1-胺(5)

2-(2,2-二((9z,12z)-十八碳-9,12-二烯基)-1,3-二氧戊環(huán)-4-基)-n,n-二甲基乙胺(6)

4-(二甲基氨基)丁酸(6z,9z,28z,31z)-三十七碳-6,9,28,31-四烯-19-基酯(7)

3-((6z,9z,28z,31z)-三十七碳-6,9,28,31-四烯-19-基氧基)-n,n-二甲基丙-1-胺(8)

5-(二甲基氨基)戊酸(z)-12-((z)-癸-4-烯基)二十二碳-16-烯-11-基酯(53)

6-(二甲基氨基)己酸(6z,16z)-12-((z)-癸-4-烯基)二十二碳-6,16-二烯-11-基酯(11)

5-(二甲基氨基)戊酸(6z,16z)-12-((z)-癸-4-烯基)二十二碳-6,16-二烯-11-基酯(13)

5-(二甲基氨基)戊酸12-癸基二十二烷-11-基酯(14)。

2.非陽(yáng)離子脂質(zhì)

本發(fā)明的脂質(zhì)粒子中所使用的非陽(yáng)離子脂質(zhì)可為能夠產(chǎn)生穩(wěn)定復(fù)合物的多種中性不帶電、兩性離子或陰離子脂質(zhì)中的任一種。

非陽(yáng)離子脂質(zhì)的非限制性實(shí)例包括磷脂，諸如卵磷脂、磷脂酰乙醇胺、溶血卵磷脂、溶血磷脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰肌醇、鞘磷脂、卵鞘磷脂(esm)、腦磷脂、心磷脂、磷脂酸、腦苷脂、二鯨蠟基磷酸酯、二硬脂酰基磷脂酰膽堿(dspc)、二油?；字Ｄ憠A(dopc)、二棕櫚酰磷脂酰膽堿(dppc)、二油?；字８视?dopg)、二棕櫚酰磷脂酰甘油(dppg)、二油?；字Ｒ掖及?dope)、棕櫚酰油酰磷脂酰膽堿(popc)、棕櫚酰油酰磷脂酰乙醇胺(pope)、棕櫚酰油酰磷脂酰甘油(popg)、二油?；字Ｒ掖及?-(n-馬來酰亞胺基甲基)-環(huán)己烷-1-甲酸酯(dope-mal)、二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺(dppe)、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺(dmpe)、二硬脂?；字Ｒ掖及?dspe)、單甲基磷脂酰乙醇胺、二甲基磷脂酰乙醇胺、二反油酰基磷脂酰乙醇胺(depe)、硬脂酰油酰磷脂酰乙醇胺(sope)、溶血磷脂酰膽堿、二亞油酰磷脂酰膽堿及其混合物。也可使用其它二?；字Ｄ憠A及二?；字Ｒ掖及妨字?。這些脂質(zhì)中的?；鶅?yōu)選為來源于具有c10-c24碳鏈的脂肪酸的酰基，例如月桂?；?、肉豆寇?；?、棕櫚?；⒂仓；蛴王；?。

非陽(yáng)離子脂質(zhì)的其它實(shí)例包括固醇，諸如膽固醇及其衍生物。膽固醇衍生物的非限制性實(shí)例包括極性類似物，諸如5α-膽甾烷醇、5β-糞甾烷醇、膽固醇基-(2'-羥基)-乙醚、膽固醇基-(4'-羥基)-丁基醚及6-酮基膽甾烷醇；非極性類似物，諸如5α-膽甾烷、膽甾烯酮、5α-膽甾烷酮、5β-膽甾烷酮及癸酸膽固醇酯；及其混合物。在優(yōu)選實(shí)施方案中，膽固醇衍生物為極性類似物，諸如膽固醇基-(4'-羥基)-丁基醚。膽固醇基-(2'-羥基)-乙醚的合成描述于pct公開案第wo09/127060號(hào)中，其公開內(nèi)容出于所有目的以全文引用的方式并入本文中。

在一些實(shí)施方案中，脂質(zhì)粒子中所存在的非陽(yáng)離子脂質(zhì)包含一種或多種磷脂與膽固醇或其衍生物的混合物或由其組成。在其它實(shí)施方案中，脂質(zhì)粒子中所存在的非陽(yáng)離子脂質(zhì)包含一種或多種磷脂或由其組成，例如無膽固醇脂質(zhì)粒子配制物。在其它實(shí)施方案中，脂質(zhì)粒子中所存在的非陽(yáng)離子脂質(zhì)包含膽固醇或其衍生物或由其組成，例如無磷脂脂質(zhì)粒子配制物。

適用于本發(fā)明中的非陽(yáng)離子脂質(zhì)的其它實(shí)例包括非含磷脂質(zhì)，例如，諸如硬脂胺、十二烷胺、十六烷胺、棕櫚酸乙酰酯、蓖麻酸甘油酯、硬脂酸十六烷基酯、肉豆蔻酸異丙酯、兩性丙烯酸類聚合物、三乙醇胺硫酸月桂酯、烷基芳基硫酸酯聚乙氧基脂肪酸酰胺、二(十八烷基)二甲基溴化銨、神經(jīng)酰胺、鞘磷脂及其類似物。

在一些實(shí)施方案中，非陽(yáng)離子脂質(zhì)占粒子中所存在的總脂質(zhì)的約10摩爾％至約60摩爾％、約20摩爾％至約55摩爾％、約20摩爾％至約45摩爾％、約20摩爾％至約40摩爾％、約25摩爾％至約50摩爾％、約25摩爾％至約45摩爾％、約30摩爾％至約50摩爾％、約30摩爾％至約45摩爾％、約30摩爾％至約40摩爾％、約35摩爾％至約45摩爾％、約37摩爾％至約45摩爾％或約35摩爾％、36摩爾％、37摩爾％、38摩爾％、39摩爾％、40摩爾％、41摩爾％、42摩爾％、43摩爾％、44摩爾％或45摩爾％(或其任何分?jǐn)?shù)或其中的范圍)。

在脂質(zhì)粒子含有磷脂與膽固醇或膽固醇衍生物的混合物的實(shí)施方案中，混合物可占粒子中所存在的總脂質(zhì)的多達(dá)約40摩爾％、45摩爾％、50摩爾％、55摩爾％或60摩爾％。

在一些實(shí)施方案中，混合物中的磷脂組分可占粒子中所存在的總脂質(zhì)的約2摩爾％至約20摩爾％、約2摩爾％至約15摩爾％、約2摩爾％至約12摩爾％、約4摩爾％至約15摩爾％或約4摩爾％至約10摩爾％(或其任何分?jǐn)?shù)或其中的范圍)。在某些實(shí)施方案中，混合物中的磷脂組分占粒子中所存在的總脂質(zhì)的約5摩爾％至約17摩爾％、約7摩爾％至約17摩爾％、約7摩爾％至約15摩爾％、約8摩爾％至約15摩爾％或約8摩爾％、9摩爾％、10摩爾％、11摩爾％、12摩爾％、13摩爾％、14摩爾％或15摩爾％(或其任何分?jǐn)?shù)或其中的范圍)。作為一個(gè)非限制性實(shí)例，包含磷脂與膽固醇的混合物的脂質(zhì)粒子配制物可包含例如相對(duì)于粒子中所存在的總脂質(zhì)占約7摩爾％(或其任何分?jǐn)?shù))的諸如dppc或dspc的磷脂與占約34摩爾％(或其任何分?jǐn)?shù))的膽固醇或膽固醇衍生物的混合物。作為另一個(gè)非限制性實(shí)例，包含磷脂與膽固醇的混合物的脂質(zhì)粒子配制物可包含例如相對(duì)于粒子中所存在的總脂質(zhì)占約7摩爾％(或其任何分?jǐn)?shù))的諸如dppc或dspc的磷脂與占約32摩爾％(或其任何分?jǐn)?shù))的膽固醇或膽固醇衍生物的混合物。

進(jìn)一步舉例而言，可用于實(shí)施本發(fā)明的脂質(zhì)配制物具有約10:1的脂質(zhì)與藥物(例如sirna)比(例如，9.5:1至11:1或9.9:1至11:1或10:1至10.9:1的脂質(zhì):藥物比)。在某些其它實(shí)施方案中，可用于實(shí)施本發(fā)明的脂質(zhì)配制物具有約9:1的脂質(zhì)與藥物(例如sirna)比(例如，8.5:1至10:1或8.9:1至10:1或9:1至9.9:1的脂質(zhì):藥物比，包括9.1:1、9.2:1、9.3:1、9.4:1、9.5:1、9.6:1、9.7:1和9.8:1)。

在其它實(shí)施方案中，混合物中的膽固醇組分可占粒子中所存在的總脂質(zhì)的約25摩爾％至約45摩爾％、約25摩爾％至約40摩爾％、約30摩爾％至約45摩爾％、約30摩爾％至約40摩爾％、約27摩爾％至約37摩爾％、約25摩爾％至約30摩爾％或約35摩爾％至約40摩爾％(或其任何分?jǐn)?shù)或其中的范圍)。在某些優(yōu)選實(shí)施方案中，混合物中的膽固醇組分占粒子中所存在的總脂質(zhì)的約25摩爾％至約35摩爾％、約27摩爾％至約35摩爾％、約29摩爾％至約35摩爾％、約30摩爾％至約35摩爾％、約30摩爾％至約34摩爾％、約31摩爾％至約33摩爾％或約30摩爾％、31摩爾％、32摩爾％、33摩爾％、34摩爾％或35摩爾％(或其任何分?jǐn)?shù)或其中的范圍)。

在脂質(zhì)粒子不含磷脂的實(shí)施方案中，膽固醇或其衍生物可占粒子中所存在的總脂質(zhì)的多達(dá)約25摩爾％、30摩爾％、35摩爾％、40摩爾％、45摩爾％、50摩爾％、55摩爾％或60摩爾％。

在一些實(shí)施方案中，無磷脂脂質(zhì)粒子配制物中的膽固醇或其衍生物可占粒子中所存在的總脂質(zhì)的約25摩爾％至約45摩爾％、約25摩爾％至約40摩爾％、約30摩爾％至約45摩爾％、約30摩爾％至約40摩爾％、約31摩爾％至約39摩爾％、約32摩爾％至約38摩爾％、約33摩爾％至約37摩爾％、約35摩爾％至約45摩爾％、約30摩爾％至約35摩爾％、約35摩爾％至約40摩爾％或約30摩爾％、31摩爾％、32摩爾％、33摩爾％、34摩爾％、35摩爾％、36摩爾％、37摩爾％、38摩爾％、39摩爾％或40摩爾％(或其任何分?jǐn)?shù)或其中的范圍)。作為一個(gè)非限制性實(shí)例，脂質(zhì)粒子配制物可包含占粒子中所存在的總脂質(zhì)的約37摩爾％(或其任何分?jǐn)?shù))的膽固醇。作為另一個(gè)非限制性實(shí)例，脂質(zhì)粒子配制物可包含占粒子中所存在的總脂質(zhì)的約35摩爾％(或其任何分?jǐn)?shù))的膽固醇。

在其它實(shí)施方案中，非陽(yáng)離子脂質(zhì)占粒子中所存在的總脂質(zhì)的約5摩爾％至約90摩爾％、約10摩爾％至約85摩爾％、約20摩爾％至約80摩爾％、約10摩爾％(例如，僅磷脂)或約60摩爾％(例如，磷脂與膽固醇或其衍生物)(或其任何分?jǐn)?shù)或其中的范圍)。

適用于本發(fā)明的脂質(zhì)粒子中的非陽(yáng)離子脂質(zhì)的其它百分比及范圍描述于pct公開案第wo09/127060號(hào)、美國(guó)已公開申請(qǐng)案第us2011/0071208號(hào)、pct公開案第wo2011/000106號(hào)和美國(guó)已公開申請(qǐng)案第us2011/0076335號(hào)中，其公開內(nèi)容出于所有目的以全文引用的方式并入本文中。

應(yīng)理解，本發(fā)明的脂質(zhì)粒子中所存在的非陽(yáng)離子脂質(zhì)的百分比為目標(biāo)量，且配制物中所存在的非陽(yáng)離子脂質(zhì)的實(shí)際量可變化例如±5摩爾％、±4摩爾％、±3摩爾％、±2摩爾％、±1摩爾％、±0.75摩爾％、±0.5摩爾％、±0.25摩爾％或±0.1摩爾％。

3.脂質(zhì)綴合物

除陽(yáng)離子脂質(zhì)和非陽(yáng)離子脂質(zhì)以外，本發(fā)明的脂質(zhì)粒子可還包含脂質(zhì)綴合物。綴合脂質(zhì)為適用的，因?yàn)槠淇煞乐沽Ｗ泳奂?。適合的綴合脂質(zhì)包括但不限于peg-脂質(zhì)綴合物、poz-脂質(zhì)綴合物、atta-脂質(zhì)綴合物、陽(yáng)離子聚合物-脂質(zhì)綴合物(cpl)及其混合物。在某些實(shí)施方案中，粒子包含peg-脂質(zhì)綴合物或atta-脂質(zhì)綴合物與cpl。

在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，脂質(zhì)綴合物為peg-脂質(zhì)。peg-脂質(zhì)的實(shí)例包括但不限于如例如pct公開案第wo05/026372號(hào)中所描述的與二烷基氧基丙基偶合的peg(peg-daa)、如例如美國(guó)專利公開案第20030077829號(hào)和第2005008689號(hào)中所描述的與二?；视团己系膒eg(peg-dag)、與諸如磷脂酰乙醇胺的磷脂偶合的peg(peg-pe)、如例如美國(guó)專利第5,885,613號(hào)中所描述的與神經(jīng)酰胺綴合的peg、與膽固醇或其衍生物綴合的peg及其混合物。這些專利文獻(xiàn)的公開內(nèi)容出于所有目的以全文引用的方式并入本文中。

適用于本發(fā)明的其它peg-脂質(zhì)包括而不限于mpeg2000-1,2-二-o-烷基-sn3-氨甲酰基甘油酯(peg-c-domg)。peg-c-domg的合成描述于pct公開案第wo09/086558號(hào)中，其公開內(nèi)容出于所有目的以全文引用的方式并入本文中。其它適合的peg-脂質(zhì)綴合物包括而不限于1-[8'-(1,2-二肉豆蔻酰-3-丙氧基)-甲酰胺基-3',6'-二氧雜辛基]氨甲酰基-ω-甲基-聚(乙二醇)(2kpeg-dmg)。2kpeg-dmg的合成描述于美國(guó)專利第7,404,969號(hào)中，該專利出于所有目的以全文引用的方式并入本文中。

peg為具有兩個(gè)末端羥基的乙烯peg重復(fù)單元的線性水溶性聚合物。peg系按其分子量加以分類；舉例而言，peg2000具有約2,000道爾頓的平均分子量，且peg5000具有約5,000道爾頓的平均分子量。peg可購(gòu)自sigmachemicalco.及其它公司，且包括但不限于以下各項(xiàng)：?jiǎn)渭籽趸垡叶?mepeg-oh)、單甲氧基聚乙二醇-琥珀酸酯(mepeg-s)、單甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亞胺基琥珀酸酯(mepeg-s-nhs)、單甲氧基聚乙二醇-胺(mepeg-nh2)、單甲氧基聚乙二醇-三氟乙磺酸酯(mepeg-tres)、單甲氧基聚乙二醇-咪唑基-羰基(mepeg-im)以及含有末端羥基替代末端甲氧基的所述化合物(例如，ho-peg-s、ho-peg-s-nhs、ho-peg-nh2等)。其它peg，諸如美國(guó)專利第6,774,180號(hào)和第7,053,150號(hào)中所描述的那些peg(例如，mpeg(20kda)胺)也可用于制備本發(fā)明的peg-脂質(zhì)綴合物。這些專利的公開內(nèi)容出于所有目的以全文引用的方式并入本文中。另外，單甲氧基聚乙二醇-乙酸(mepeg-ch2cooh)尤其可用于制備peg-脂質(zhì)綴合物，包括例如peg-daa綴合物。

本文中所描述的peg-脂質(zhì)綴合物的peg部分可包含介于約550道爾頓至約10,000道爾頓范圍內(nèi)的平均分子量。在某些情況下，peg部分具有約750道爾頓至約5,000道爾頓(例如，約1,000道爾頓至約5,000道爾頓、約1,500道爾頓至約3,000道爾頓、約750道爾頓至約3,000道爾頓、約750道爾頓至約2,000道爾頓等)的平均分子量。在優(yōu)選實(shí)施方案中，peg部分具有約2,000道爾頓或約750道爾頓的平均分子量。

在某些情況下，peg可任選由烷基、烷氧基、?；蚍蓟〈eg可直接與脂質(zhì)綴合，或可經(jīng)由接頭部分與脂質(zhì)連接。適合于使peg與脂質(zhì)偶合的任何接頭部分均可使用，包括例如非含酯接頭部分和含酯接頭部分。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，接頭部分為非含酯接頭部分。如本文中所使用，術(shù)語(yǔ)“非含酯接頭部分”是指不含羧酸酯鍵(-oc(o)-)的接頭部分。適合的非含酯接頭部分包括但不限于酰胺基(-c(o)nh-)、氨基(-nr-)、羰基(-c(o)-)、氨基甲酸酯(-nhc(o)o-)、脲(-nhc(o)nh-)、二硫鍵(-s-s-)、醚(-o-)、琥珀?；?-(o)cch2ch2c(o)-)、琥珀酰胺基(-nhc(o)ch2ch2c(o)nh-)、醚、二硫鍵以及其組合(諸如含有氨基甲酸酯接頭部分和酰胺基接頭部分的接頭)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，使用氨基甲酸酯接頭使peg與脂質(zhì)偶合。

在其它實(shí)施方案中，使用含酯接頭部分使peg與脂質(zhì)偶合。適合的含酯接頭部分包括例如碳酸酯(-oc(o)o-)、琥珀?；⒘姿狨?-o-(o)poh-o-)、磺酸酯及其組合。

存在多種具有不同鏈長(zhǎng)度及飽和度的?；溁鶊F(tuán)的磷脂酰乙醇胺可與peg綴合以形成脂質(zhì)綴合物。這種磷脂酰乙醇胺可購(gòu)自市面，或可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)技術(shù)分離或合成。含有碳鏈長(zhǎng)度介于c10至c20范圍內(nèi)的飽和或不飽和脂肪酸的磷脂?；?乙醇胺優(yōu)選。也可使用具有單不飽和或雙不飽和脂肪酸及飽和與不飽和脂肪酸的混合物的磷脂酰乙醇胺。適合的磷脂酰乙醇胺包括但不限于二肉豆蔻?；字Ｒ掖及?dmpe)、二棕櫚?；字Ｒ掖及?dppe)、二油?；字Ｒ掖及?dope)和二硬脂?；字Ｒ掖及?dspe)。

術(shù)語(yǔ)“atta”或“聚酰胺”包括而不限于美國(guó)專利第6,320,017號(hào)和第6,586,559號(hào)中所描述的化合物，其公開內(nèi)容出于所有目的以全文引用的方式并入本文中。這些化合物包括具有下式的化合物：

其中r為選自由氫、烷基和酰基組成的組的成員；r¹為選自由氫和烷基組成的組的成員；或任選地，r和r¹與其所綴合的氮形成疊氮基部分；r²為選自氫、任選經(jīng)取代的烷基、任選經(jīng)取代的芳基和氨基酸側(cè)鏈的組的成員；r³為選自由氫、鹵素、羥基、烷氧基、巰基、肼基、氨基和nr⁴r⁵組成的組的成員，其中r⁴和r⁵獨(dú)立地為氫或烷基；n為4至80；m為2至6；p為1至4；且q為0或1。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)顯而易見，其它聚酰胺可用于本發(fā)明化合物中。

術(shù)語(yǔ)“二酰基甘油”或“dag”包括具有2條脂肪?；渞¹和r²的化合物，兩者獨(dú)立地具有通過酯鍵聯(lián)與甘油的1位和2位鍵結(jié)的介于2與30個(gè)之間的碳。?；蔀轱柡偷幕蚓哂胁煌牟伙柡投?。適合的?；ǖ幌抻谠鹿瘐；?c12)、肉豆寇?；?c14)、棕櫚?；?c16)、硬脂酰基(c18)和二十碳?；?c20)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，r¹與r²相同，即，r¹與r²均為肉豆寇酰基(也即，二肉豆蔻?；?，r¹與r²均為硬脂?；?即，二硬脂?；?等。二?；视途哂幸韵峦ㄊ剑?/p>

術(shù)語(yǔ)“二烷基氧基丙基”或“daa”包括具有2條烷基鏈r¹和r²的化合物，兩者獨(dú)立地具有介于2與30個(gè)之間的碳。烷基可為飽和的或具有不同的不飽和度。二烷基氧基丙基具有以下通式：

在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，peg-脂質(zhì)為具有下式的peg-daa綴合物：

其中r¹和r²獨(dú)立地選擇且為具有約10至約22個(gè)碳原子的長(zhǎng)鏈烷基；peg為聚乙二醇；且l為如以上所描述的非含酯接頭部分或含酯接頭部分。長(zhǎng)鏈烷基可為飽和或不飽和的。適合的烷基包括但不限于癸基(c10)、月桂基(c12)、肉豆蔻基(c14)、棕櫚基(c16)、硬脂基(c18)及二十烷基(c20)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，r¹與r²相同，即，r¹與r²均為肉豆蔻基(即，二肉豆蔻基)，r¹與r²均為硬脂基(即，二硬脂基)等。

在以上式vii中，peg具有介于約550道爾頓至約10,000道爾頓范圍內(nèi)的平均分子量。在某些情況下，peg具有約750道爾頓至約5,000道爾頓(例如，約1,000道爾頓至約5,000道爾頓、約1,500道爾頓至約3,000道爾頓、約750道爾頓至約3,000道爾頓、約750道爾頓至約2,000道爾頓等)的平均分子量。在優(yōu)選實(shí)施方案中，peg具有約2,000道爾頓或約750道爾頓的平均分子量。peg可任選經(jīng)烷基、烷氧基、?；蚍蓟〈?。在某些實(shí)施方案中，末端羥基經(jīng)甲氧基或甲基取代。

在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，“l(fā)”為非含酯接頭部分。適合的非含酯接頭包括但不限于酰胺基接頭部分、氨基接頭部分、羰基接頭部分、氨基甲酸酯接頭部分、脲接頭部分、醚接頭部分、二硫鍵接頭部分、琥珀酰胺基接頭部分及其組合。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，非含酯接頭部分為氨基甲酸酯接頭部分(也即，peg-c-daa綴合物)。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，非含酯接頭部分為酰胺基接頭部分(也即，peg-a-daa綴合物)。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，非含酯接頭部分為琥珀酰胺基接頭部分(也即，peg-s-daa綴合物)。

在特定實(shí)施方案中，peg-脂質(zhì)綴合物選自：

使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)和試劑合成peg-daa綴合物。應(yīng)認(rèn)識(shí)到，peg-daa綴合物將含有各種酰胺、胺、醚、硫、氨基甲酸酯及脲鍵聯(lián)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)識(shí)到，用于形成這些鍵的方法和試劑為熟知的且容易獲得的。參見例如march,advancedorganicchemistry(wiley1992)；larock,comprehensiveorganictransformations(vch1989)；及furniss,vogel’stextbookofpracticalorganicchemistry,第5版(longman1989)。也應(yīng)理解，所存在的任何官能團(tuán)可能均需要在peg-daa綴合物合成中的不同的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行保護(hù)及脫保護(hù)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)識(shí)到，這種技術(shù)為熟知的。參見例如green和wuts,protectivegroupsinorganicsynthesis(wiley1991)。

peg-daa綴合物優(yōu)選為peg-二癸基氧基丙基(c10)綴合物、peg-二月桂基氧基丙基(c12)綴合物、peg-二肉豆蔻基氧基丙基(c14)綴合物、peg-二棕櫚基氧基丙基(c16)綴合物或peg-二硬脂基氧基丙基(c18)綴合物。在這些實(shí)施方案中，peg優(yōu)選具有約750道爾頓或約2,000道爾頓的平均分子量。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，peg-脂質(zhì)綴合物包含peg2000-c-dma，其中“2000”表示peg的平均分子量，“c”表示氨基甲酸酯接頭部分，且“dma”表示二肉豆蔻基氧基丙基。在另一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，peg-脂質(zhì)綴合物包含peg750-c-dma，其中“750”表示peg的平均分子量，“c”表示氨基甲酸酯接頭部分，且“dma”表示二肉豆蔻基氧基丙基。在特定實(shí)施方案中，peg的末端羥基經(jīng)甲基取代。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)容易了解，其它二烷基氧基丙基可用于本發(fā)明的peg-daa綴合物中。

除上述以外，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)容易了解可使用其它親水性聚合物替代peg。可用于替代peg的適合聚合物的實(shí)例包括但不限于聚乙烯吡咯烷酮、聚甲基噁唑啉、聚乙基噁唑啉、聚羥基丙基甲基丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺及聚二甲基丙烯酰胺、聚乳酸、聚乙醇酸及衍生纖維素，諸如羥甲基纖維素或羥乙基纖維素。

除上述組分以外，本發(fā)明的脂質(zhì)粒子可還包含陽(yáng)離子聚(乙二醇)(peg)脂質(zhì)或cpl(參見例如chen等人,bioconj.chem.,11:433-437(2000)；美國(guó)專利第6,852,334號(hào)；pct公開案第wo00/62813號(hào)，其公開內(nèi)容出于所有目的以全文引用的方式并入本文中)。

適合的cpl包括具有式viii的化合物：

a-w-y(viii)，

其中a、w和y如以下所描述。

關(guān)于式viii，“a”為充當(dāng)脂質(zhì)錨定點(diǎn)的脂質(zhì)部分，諸如兩性脂質(zhì)、中性脂質(zhì)或疏水性脂質(zhì)。適合的脂質(zhì)實(shí)例包括但不限于二?；视?、二烷基甘油、n,n-二烷基氨基-1,2-二?；趸?3-氨基丙烷和1,2-二烷基-3-氨基丙烷。

“w”為聚合物或寡聚物，諸如親水性聚合物或寡聚物。親水性聚合物優(yōu)選為非免疫原性或具有低固有免疫原性的生物相容性聚合物。或者，親水性聚合物在與適當(dāng)?shù)淖魟┮黄鹗褂脮r(shí)可具有弱抗原性。適合的非免疫原性聚合物包括但不限于peg、聚酰胺、聚乳酸、聚乙醇酸、聚乳酸/聚乙醇酸共聚物及其組合。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，聚合物具有約250至約7,000道爾頓的分子量。

“y”為聚陽(yáng)離子部分。術(shù)語(yǔ)聚陽(yáng)離子部分是指在所選ph值下，優(yōu)選在生理ph值下具有正電荷，優(yōu)選至少2個(gè)正電荷的化合物、衍生物或官能團(tuán)。適合的聚陽(yáng)離子部分包括堿性氨基酸及其衍生物，諸如精氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、賴氨酸和組氨酸；精胺；亞精胺；陽(yáng)離子樹枝狀聚合物；聚胺；聚胺糖；及氨基多糖。聚陽(yáng)離子部分可為線性的，諸如結(jié)構(gòu)上呈分枝或樹枝狀的線性四賴氨酸。聚陽(yáng)離子部分在所選ph值下具有介于約2至約15個(gè)之間的正電荷，優(yōu)選介于約2至約12個(gè)之間的正電荷，且更優(yōu)選介于約2至約8個(gè)之間的正電荷。選擇使用何種聚陽(yáng)離子部分可由所需粒子應(yīng)用的類型決定。

聚陽(yáng)離子部分上的電荷可分布在整個(gè)粒子部分周圍，或替代地，其可為該粒子部分的一個(gè)特定區(qū)域中的電荷密度的離散性凝集，例如電流沖擊。如果電荷密度分布于粒子上，則電荷密度可平均分布或不平均分布。本發(fā)明涵蓋聚陽(yáng)離子部分的電荷分布的所有變化方案。

脂質(zhì)“a”和非免疫原性聚合物“w”可通過各種方法且優(yōu)選通過共價(jià)連接來連接。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法可用于共價(jià)連接“a”與“w”。適合的鍵聯(lián)包括但不限于酰胺、胺、羧基、碳酸酯、氨基甲酸酯、酯和腙鍵聯(lián)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解，“a”和“w”必須具有互補(bǔ)官能團(tuán)以實(shí)現(xiàn)鍵聯(lián)。這兩個(gè)基團(tuán)(一個(gè)處于脂質(zhì)上且另一個(gè)處于聚合物上)的反應(yīng)將提供所要鍵聯(lián)。舉例而言，當(dāng)脂質(zhì)為二?；视颓夷┒肆u基經(jīng)活化(例如用nhs和dcc)以形成活性酯且隨后與含有氨基的聚合物，諸如與聚酰胺反應(yīng)時(shí)(參見例如美國(guó)專利第6,320,017號(hào)和第6,586,559號(hào)，其公開內(nèi)容出于所有目的以全文引用的方式并入本文中)，這兩個(gè)基團(tuán)之間將形成酰胺鍵。

在某些情況下，聚陽(yáng)離子部分可具有連接的配位體，諸如靶向配位體或用于復(fù)合鈣的螯合部分。優(yōu)選地，在連接配位體之后，陽(yáng)離子部分維持正電荷。在某些情況下，所連接的配位體具有正電荷。適合的配位體包括但不限于具有反應(yīng)性官能團(tuán)的化合物或裝置，且包括脂質(zhì)、兩性脂質(zhì)、載體化合物、生物親和性化合物、生物材料、生物聚合物、生物醫(yī)學(xué)裝置、分析檢測(cè)化合物、治療活性化合物、酶、肽、蛋白質(zhì)、抗體、免疫刺激物、放射性標(biāo)記、熒光團(tuán)、生物素、藥物、半抗原、dna、rna、多糖、脂質(zhì)體、病毒體、膠束、免疫球蛋白、官能團(tuán)、其它靶向部分或毒素。

在一些實(shí)施方案中，脂質(zhì)綴合物(例如，peg-脂質(zhì))占粒子中所存在的總脂質(zhì)的約0.1摩爾％至約3摩爾％、約0.5摩爾％至約3摩爾％或約0.6摩爾％、0.7摩爾％、0.8摩爾％、0.9摩爾％、1.0摩爾％、1.1摩爾％、1.2摩爾％、1.3摩爾％、1.4摩爾％、1.5摩爾％、1.6摩爾％、1.7摩爾％、1.8摩爾％、1.9摩爾％、2.0摩爾％、2.1摩爾％、2.2摩爾％、2.3摩爾％、2.4摩爾％、2.5摩爾％、2.6摩爾％、2.7摩爾％、2.8摩爾％、2.9摩爾％或3摩爾％(或其任何分?jǐn)?shù)或其中的范圍)。

在其它實(shí)施方案中，脂質(zhì)綴合物(例如peg-脂質(zhì))占粒子中所存在的總脂質(zhì)的約0摩爾％至約20摩爾％、約0.5摩爾％至約20摩爾％、約2摩爾％至約20摩爾％、約1.5摩爾％至約18摩爾％、約2摩爾％至約15摩爾％、約4摩爾％至約15摩爾％、約2摩爾％至約12摩爾％、約5摩爾％至約12摩爾％或約2摩爾％(或其任何分?jǐn)?shù)或其中的范圍)。

在其它實(shí)施方案中，脂質(zhì)綴合物(例如peg-脂質(zhì))占粒子中所存在的總脂質(zhì)的約4摩爾％至約10摩爾％、約5摩爾％至約10摩爾％、約5摩爾％至約9摩爾％、約5摩爾％至約8摩爾％、約6摩爾％至約9摩爾％、約6摩爾％至約8摩爾％或約5摩爾％、6摩爾％、7摩爾％、8摩爾％、9摩爾％或10摩爾％(或其任何分?jǐn)?shù)或其中的范圍)。

應(yīng)理解，本發(fā)明的脂質(zhì)粒子中所存在的脂質(zhì)綴合物的百分比為目標(biāo)量，且配制物中所存在的脂質(zhì)綴合物的實(shí)際量可變化例如±5摩爾％、±4摩爾％、±3摩爾％、±2摩爾％、±1摩爾％、±0.75摩爾％、±0.5摩爾％、±0.25摩爾％或±0.1摩爾％。

適用于本發(fā)明的脂質(zhì)粒子中的脂質(zhì)綴合物的其它百分比及范圍描述于pct公開案第wo09/127060號(hào)、美國(guó)已公開申請(qǐng)案第us2011/0071208號(hào)、pct公開案第wo2011/000106號(hào)和美國(guó)已公開申請(qǐng)案第us2011/0076335號(hào)中，其公開內(nèi)容出于所有目的以全文引用的方式并入本文中。

本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解，脂質(zhì)綴合物的濃度可視所采用的脂質(zhì)綴合物和脂質(zhì)粒子的膜融合速率而變化。

通過控制脂質(zhì)綴合物的組成和濃度，可控制脂質(zhì)綴合物自脂質(zhì)粒子中交換出的速率且轉(zhuǎn)而控制脂質(zhì)粒子的膜融合速率。舉例而言，當(dāng)使用peg-daa綴合物作為脂質(zhì)綴合物時(shí)，可改變脂質(zhì)粒子的膜融合速率，例如通過改變脂質(zhì)綴合物的濃度、通過改變peg的分子量或通過改變peg-daa綴合物上的烷基的鏈長(zhǎng)度及飽和度。另外，其它變量，包括例如ph值、溫度、離子強(qiáng)度等，可用于改變和/或控制脂質(zhì)粒子的膜融合速率。在閱讀本發(fā)明后，可用于控制脂質(zhì)粒子的膜融合速率的其它方法對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員將顯而易見。此外，通過控制脂質(zhì)綴合物的組成和濃度，可控制脂質(zhì)粒子尺寸。

b.其它載體系統(tǒng)

適用于本發(fā)明的其它基于脂質(zhì)的載體系統(tǒng)的非限制性實(shí)例包括脂質(zhì)復(fù)合物(參見例如美國(guó)專利公開案第20030203865號(hào)；及zhang等人,j.controlrelease,100:165-180(2004))、ph值敏感性脂質(zhì)復(fù)合物(參見例如美國(guó)專利公開案第20020192275號(hào))、可逆遮蔽脂質(zhì)復(fù)合物(參見例如美國(guó)專利公開案第20030180950號(hào))、基于陽(yáng)離子脂質(zhì)的組合物(參見例如美國(guó)專利第6,756,054號(hào)；和美國(guó)專利公開案第20050234232號(hào))、陽(yáng)離子脂質(zhì)體(參見例如美國(guó)專利公開案第20030229040號(hào)、第20020160038號(hào)和第20020012998號(hào)；美國(guó)專利第5,908,635號(hào)；及pct公開案第wo01/72283號(hào))、陰離子脂質(zhì)體(參見例如美國(guó)專利公開案第20030026831號(hào))、ph值敏感性脂質(zhì)體(參見例如美國(guó)專利公開案第20020192274號(hào)；及au2003210303)、經(jīng)抗體涂布的脂質(zhì)體(參見例如美國(guó)專利公開案第20030108597號(hào)；及pct公開案第wo00/50008號(hào))、細(xì)胞類型特異性脂質(zhì)體(參見例如美國(guó)專利公開案第20030198664號(hào))、含核酸和肽的脂質(zhì)體(參見例如美國(guó)專利第6,207,456號(hào))、含經(jīng)可釋放親水性聚合物衍生化的脂質(zhì)的脂質(zhì)體(參見例如美國(guó)專利公開案第20030031704號(hào))、脂質(zhì)俘獲的核酸(參見例如pct公開案第wo03/057190號(hào)和第wo03/059322號(hào))、脂質(zhì)囊封的核酸(參見例如美國(guó)專利公開案第20030129221號(hào)；和美國(guó)專利第5,756,122號(hào))、其它脂質(zhì)體組合物(參見例如美國(guó)專利公開案第20030035829號(hào)和第20030072794號(hào)；和美國(guó)專利第6,200,599號(hào))、脂質(zhì)體與乳液的穩(wěn)定混合物(參見例如ep1304160)、乳液組合物(參見例如美國(guó)專利第6,747,014號(hào))及核酸微乳液(參見例如美國(guó)專利公開案第20050037086號(hào))。

適用于本發(fā)明的基于聚合物的載體系統(tǒng)的實(shí)例包括但不限于陽(yáng)離子聚合物-核酸復(fù)合物(即，聚復(fù)合物)。為了形成聚復(fù)合物，核酸(例如sirna分子，諸如表a中所描述的sirna分子)典型地與將核酸凝集于能夠與細(xì)胞表面上的陰離子蛋白聚糖相互作用且通過胞吞作用進(jìn)入細(xì)胞的帶正電粒子中的具有線性、分支、星形或樹枝狀聚合結(jié)構(gòu)的陽(yáng)離子聚合物復(fù)合。在一些實(shí)施方案中，聚復(fù)合物包含核酸(例如sirna分子，諸如表a中所描述的sirna分子)與陽(yáng)離子聚合物，諸如聚乙烯亞胺(pei)(參見例如美國(guó)專利第6,013,240號(hào)；可作為體內(nèi)用jetpei^tm(pei的線性形式)購(gòu)自qbiogene,inc.(carlsbad，ca))、聚丙烯亞胺(ppi)、聚乙烯吡咯烷酮(pvp)、聚-l-賴氨酸(pll)、二乙基氨基乙基(deae)-葡多糖、聚(β-氨基酯)(pae)聚合物(參見例如lynn等人,j.am.chem.soc.,123:8155-8156(2001))、殼多糖、聚酰胺胺(pamam)樹枝狀聚合物(參見例如kukowska-latallo等人,proc.natl.acad.sci.usa,93:4897-4902(1996))、卟啉(參見例如美國(guó)專利第6,620,805號(hào))、聚乙烯醚(參見例如美國(guó)專利公開案第20040156909號(hào))、多環(huán)脒(參見例如美國(guó)專利公開案第20030220289號(hào))、包含一級(jí)胺、亞胺、胍和/或咪唑基的其它聚合物(參見例如美國(guó)專利第6,013,240號(hào)；pct公開案第wo/9602655號(hào)；pct公開案第wo95/21931號(hào)；zhang等人,j.controlrelease,100:165-180(2004)；及tiera等人,curr.genether.,6:59-71(2006))及其混合物的復(fù)合物。在其它實(shí)施方案中，聚復(fù)合物包含如美國(guó)專利公開案第20060211643號(hào)、第20050222064號(hào)、第20030125281號(hào)和第20030185890號(hào)以及pct公開案第wo03/066069號(hào)中所描述的陽(yáng)離子聚合物-核酸復(fù)合物；如美國(guó)專利公開案第20040071654號(hào)中所描述的生物可降解聚(β-氨基酯)聚合物-核酸復(fù)合物；如美國(guó)專利公開案第20040142475號(hào)中所描述的含聚合物基質(zhì)的微粒；如美國(guó)專利公開案第20030157030號(hào)中所描述的其它微粒組合物；如美國(guó)專利公開案第20050123600號(hào)中所描述的凝集核酸復(fù)合物；及如au2002358514及pct公開案第wo02/096551號(hào)中所描述的納米膠囊和微膠囊。

在某些情況下，sirna可與環(huán)糊精或其聚合物復(fù)合?；诃h(huán)糊精的載體系統(tǒng)的非限制性實(shí)例包括美國(guó)專利公開案第20040087024號(hào)中所描述的經(jīng)環(huán)糊精修飾的聚合物-核酸復(fù)合物；美國(guó)專利第6,509,323號(hào)、第6,884,789號(hào)和第7,091,192號(hào)中所描述的線性環(huán)糊精共聚物-核酸復(fù)合物；和美國(guó)專利第7,018,609號(hào)中所描述的環(huán)糊精聚合物復(fù)合劑-核酸復(fù)合物。在某些其它情況下，sirna可與肽或多肽復(fù)合?；诘鞍踪|(zhì)的載體系統(tǒng)的實(shí)例包括但不限于pct公開案第wo95/21931中所描述的陽(yáng)離子寡肽-核酸復(fù)合物。

脂質(zhì)粒子的制備

本發(fā)明的核酸-脂質(zhì)粒子，其中核酸(例如，如表a中所描述的sirna)俘獲在該粒子的脂質(zhì)部分內(nèi)且防止降解，可通過本領(lǐng)域中已知的任何方法來形成，包括但不限于連續(xù)混合法、直接稀釋法及在線稀釋法。

在特定實(shí)施方案中，陽(yáng)離子脂質(zhì)可包含單獨(dú)或與其它陽(yáng)離子脂質(zhì)組合的具有式i至式iii的脂質(zhì)或其鹽。在其它實(shí)施方案中，非陽(yáng)離子脂質(zhì)為卵鞘磷脂(esm)、二硬脂?；字Ｄ憠A(dspc)、二油?；字Ｄ憠A(dopc)、1-棕櫚?；?2-油酰基-磷脂酰膽堿(popc)、二棕櫚酰基磷脂酰膽堿(dppc)、單甲基磷脂酰乙醇胺、二甲基磷脂酰乙醇胺、14:0pe(1,2-二肉豆蔻?；字Ｒ掖及?dmpe)、16:0pe(1,2-二棕櫚?；字Ｒ掖及?dppe))、18:0pe(1,2-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(dspe))、18:1pe(1,2-二油酰基磷脂酰乙醇胺(dope))、18:1反式pe(1,2-二反油酰基-磷脂酰乙醇胺(depe))、18:0-18:1pe(1-硬脂?；?2-油?；字Ｒ掖及?sope))、16:0-18:1pe(1-棕櫚?；?2-油?；字Ｒ掖及?pope))、基于聚乙二醇的聚合物(例如peg2000、peg5000、經(jīng)peg修飾的二酰基甘油或經(jīng)peg修飾的二烷基氧基丙基)、膽固醇、其衍生物或其組合。

在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供經(jīng)由連續(xù)混合法產(chǎn)生的核酸-脂質(zhì)粒子，例如，包括如下步驟的方法：在第一儲(chǔ)存器中提供包含sirna的水溶液；在第二儲(chǔ)存器中提供有機(jī)脂質(zhì)溶液(其中所述有機(jī)脂質(zhì)溶液中所存在的脂質(zhì)溶解于有機(jī)溶劑中，例如低碳烷醇，諸如乙醇)；及混合該水溶液與該有機(jī)脂質(zhì)溶液，使得該有機(jī)脂質(zhì)溶液與該水溶液混合以便基本上立即產(chǎn)生脂質(zhì)囊泡(例如脂質(zhì)體)，從而將sirna囊封在脂質(zhì)囊泡內(nèi)。這種方法和進(jìn)行這種方法的設(shè)備詳細(xì)描述于美國(guó)專利公開案第20040142025號(hào)中，該案的公開內(nèi)容出于所有目的以全文引用的方式并入本文中。

向混合環(huán)境中，諸如在混合室中連續(xù)引入脂質(zhì)和緩沖溶液的動(dòng)作引起用緩沖溶液連續(xù)稀釋脂質(zhì)溶液，從而在混合后基本上立即產(chǎn)生脂質(zhì)囊泡。如本文中所使用，詞組“用緩沖溶液連續(xù)稀釋脂質(zhì)溶液”(及變化形式)一般意謂在水化過程中用足以實(shí)現(xiàn)囊泡產(chǎn)生的力度足夠快速地稀釋脂質(zhì)溶液。通過混合包含核酸的水溶液與有機(jī)脂質(zhì)溶液，在緩沖溶液(即，水溶液)存在下對(duì)有機(jī)脂質(zhì)溶液進(jìn)行連續(xù)逐步稀釋以產(chǎn)生核酸-脂質(zhì)粒子。

使用連續(xù)混合法形成的核酸-脂質(zhì)粒子典型地具有約30nm至約150nm、約40nm至約150nm、約50nm至約150nm、約60nm至約130nm、約70nm至約110nm、約70nm至約100nm、約80nm至約100nm、約90nm至約100nm、約70nm至約90nm、約80nm至約90nm、約70nm至約80nm、小于約120nm、110nm、100nm、90nm或80nm、或約30nm、35nm、40nm、45nm、50nm、55nm、60nm、65nm、70nm、75nm、80nm、85nm、90nm、95nm、100nm、105nm、110nm、115nm、120nm、125nm、130nm、135nm、140nm、145nm或150nm(或其任何分?jǐn)?shù)或其中的范圍)的尺寸。因而形成的粒子不會(huì)聚集且任選經(jīng)尺寸化以達(dá)成均勻粒子尺寸。

在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供經(jīng)由直接稀釋法產(chǎn)生的核酸-脂質(zhì)粒子，該方法包括形成脂質(zhì)囊泡(例如脂質(zhì)體)溶液并且將該脂質(zhì)囊泡溶液立即并直接引入含有受控量的稀釋緩沖液的收集容器中。在優(yōu)選方面，收集容器包括一個(gè)或多個(gè)經(jīng)配置以攪拌該收集容器的內(nèi)含物從而促進(jìn)稀釋的組件。在一個(gè)方面，收集容器中所存在的稀釋緩沖液的量基本上等于引入其中的脂質(zhì)囊泡溶液的體積。作為一個(gè)非限制性實(shí)例，處于45％乙醇中的脂質(zhì)囊泡溶液當(dāng)引入含有等體積稀釋緩沖液的收集容器中時(shí)將有利地產(chǎn)生較小粒子。

在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供經(jīng)由在線稀釋法產(chǎn)生的核酸-脂質(zhì)粒子，其中含有稀釋緩沖液的第三儲(chǔ)存器與第二混合區(qū)流體偶合。在這個(gè)實(shí)施方案中，第一混合區(qū)中所形成的脂質(zhì)囊泡(例如脂質(zhì)體)溶液立即且直接與第二混合區(qū)中的稀釋緩沖液混合。在優(yōu)選方面，第二混合區(qū)包括經(jīng)布置以使得脂質(zhì)囊泡溶液及稀釋緩沖液流體作為相對(duì)180°的流體相遇的t形連接器；然而，可使用提供較淺角度的連接器，例如約27°至約180°(例如約90°)。泵機(jī)構(gòu)將可控緩沖液流體遞送至第二混合區(qū)。在一個(gè)方面，將供應(yīng)至第二混合區(qū)的稀釋緩沖液的流速控制為基本上等于自第一混合區(qū)引入其中的脂質(zhì)囊泡溶液的流速。這個(gè)實(shí)施方案有利地允許進(jìn)一步控制與第二混合區(qū)中的脂質(zhì)囊泡溶液混合的稀釋緩沖液的流動(dòng)，且因此也允許進(jìn)一步控制第二混合過程中脂質(zhì)囊泡溶液于緩沖液中的濃度。對(duì)稀釋緩沖液流速的這種控制有利地允許在降低的濃度下進(jìn)行小粒子尺寸形成。

這些方法及進(jìn)行這些直接稀釋及在線稀釋方法的設(shè)備詳細(xì)描述于美國(guó)專利公開案第20070042031號(hào)中，該案的公開內(nèi)容出于所有目的以全文引用的方式并入本文中。

使用直接稀釋及在線稀釋方法形成的核酸-脂質(zhì)粒子典型地具有約30nm至約150nm、約40nm至約150nm、約50nm至約150nm、約60nm至約130nm、約70nm至約110nm、約70nm至約100nm、約80nm至約100nm、約90nm至約100nm、約70nm至約90nm、約80nm至約90nm、約70nm至約80nm、小于約120nm、110nm、100nm、90nm或80nm、或約30nm、35nm、40nm、45nm、50nm、55nm、60nm、65nm、70nm、75nm、80nm、85nm、90nm、95nm、100nm、105nm、110nm、115nm、120nm、125nm、130nm、135nm、140nm、145nm或150nm(或其任何分?jǐn)?shù)或其中的范圍)的尺寸。因而形成的粒子不會(huì)聚集且任選經(jīng)尺寸化以達(dá)成均勻粒子尺寸。

如果有需要，則本發(fā)明的脂質(zhì)粒子可通過可用于對(duì)脂質(zhì)粒進(jìn)行尺寸化的任何方法進(jìn)行尺寸化?？蛇M(jìn)行尺寸化以達(dá)成所要尺寸范圍及相對(duì)狹窄的粒子尺寸分布。

若干技術(shù)可用于將粒子尺寸化至所要尺寸。用于脂質(zhì)體且同樣適用于本發(fā)明粒子的一種尺寸化方法描述于美國(guó)專利第4,737,323號(hào)中，該專利的公開內(nèi)容出于所有目的以全文引用的方式并入本文中。通過浴液或探針超聲處理對(duì)粒子懸浮液進(jìn)行超聲處理產(chǎn)生漸進(jìn)性尺寸減小，使粒子尺寸降至小于約50nm。均質(zhì)化為依賴于剪切能從而使較大粒子破碎成較小粒子的另一方法。在一典型均質(zhì)化程序中，使粒子再循環(huán)通過標(biāo)準(zhǔn)乳液均質(zhì)器直至觀測(cè)到所選粒子尺寸，典型地介于約60nm與約80nm之間。在兩種方法中，可通過常規(guī)激光束粒子尺寸辨別法或qels來監(jiān)測(cè)粒子尺寸分布。

粒子經(jīng)由小孔隙聚碳酸酯膜或不對(duì)稱陶瓷膜擠出也是一種用于使粒子尺寸降至相對(duì)明確的尺寸分布的有效方法。典型地，懸浮液循環(huán)通過該膜一個(gè)或多次直至達(dá)成所要粒子尺寸分布。粒子可依次經(jīng)由更小孔隙的膜擠出，以達(dá)成尺寸逐漸減小。

在一些實(shí)施方案中，粒子中所存在的核酸(例如sirna分子)如例如美國(guó)專利申請(qǐng)案第09/744,103號(hào)中所描述進(jìn)行預(yù)凝集，該案的公開內(nèi)容出于所有目的以全文引用的方式并入本文中。

在其它實(shí)施方案中，該方法可還包括添加可用于使用本發(fā)明組合物實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的脂質(zhì)轉(zhuǎn)染的非脂質(zhì)聚陽(yáng)離子。適合的非脂質(zhì)聚陽(yáng)離子的實(shí)例包括溴化己二甲銨(以商標(biāo)名出售，得自aldrichchemicalco.，milwaukee，wisconsin，usa)或己二甲銨的其它鹽。其它適合的聚陽(yáng)離子包括例如聚-l-鳥氨酸、聚-l-精氨酸、聚-l-賴氨酸、聚-d-賴氨酸、聚烯丙胺及聚乙烯亞胺的鹽。優(yōu)選在形成粒子之后添加這些鹽。

在一些實(shí)施方案中，所形成的核酸-脂質(zhì)粒子中的核酸(例如sirna)與脂質(zhì)比(質(zhì)量/質(zhì)量比)將介于約0.01至約0.2、約0.05至約0.2、約0.02至約0.1、約0.03至約0.1或約0.01至約0.08的范圍內(nèi)。起始物質(zhì)(輸入)的比也屬于這個(gè)范圍內(nèi)。在其它實(shí)施方案中，粒子制備使用每10mg總脂質(zhì)約400μg核酸，或約0.01至約0.08且更優(yōu)選為約0.04的核酸與脂質(zhì)質(zhì)量比，此對(duì)應(yīng)于每50μg核酸1.25mg總脂質(zhì)。在其它優(yōu)選實(shí)施方案中，粒子具有約0.08的核酸:脂質(zhì)質(zhì)量比。

在其它實(shí)施方案中，所形成的核酸-脂質(zhì)粒子中的脂質(zhì)與核酸(例如sirna)比(質(zhì)量/質(zhì)量比)將介于約1(1:1)至約100(100:1)、約5(5:1)至約100(100:1)、約1(1:1)至約50(50:1)、約2(2:1)至約50(50:1)、約3(3:1)至約50(50:1)、約4(4:1)至約50(50:1)、約5(5:1)至約50(50:1)、約1(1:1)至約25(25:1)、約2(2:1)至約25(25:1)、約3(3:1)至約25(25:1)、約4(4:1)至約25(25:1)、約5(5:1)至約25(25:1)、約5(5:1)至約20(20:1)、約5(5:1)至約15(15:1)、約5(5:1)至約10(10:1)或約5(5:1)、6(6:1)、7(7:1)、8(8:1)、9(9:1)、10(10:1)、11(11:1)、12(12:1)、13(13:1)、14(14:1)、15(15:1)、16(16:1)、17(17:1)、18(18:1)、19(19:1)、20(20:1)、21(21:1)、22(22:1)、23(23:1)、24(24:1)或25(25:1)的范圍或其任何分?jǐn)?shù)或其中的范圍內(nèi)。起始物質(zhì)(輸入)的比也屬于此范圍內(nèi)。

如先前所論述，綴合脂質(zhì)可還包括cpl。本文中論述多種用于制造脂質(zhì)粒子-cpl(含cpl的脂質(zhì)粒子)的一般方法。兩種一般技術(shù)包括“后插入”技術(shù)，即，將cpl插入例如預(yù)先形成的脂質(zhì)粒子中；及“標(biāo)準(zhǔn)”技術(shù)，其中cpl在例如脂質(zhì)粒子形成步驟期間包括在脂質(zhì)混合物中。后插入技術(shù)產(chǎn)生cpl主要處于脂質(zhì)粒子雙層膜的外面中的脂質(zhì)粒子，而標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)提供cpl處于內(nèi)面與外面上的脂質(zhì)粒子。該方法尤其可用于由磷脂制造的囊泡(其可含有膽固醇)以及含有peg-脂質(zhì)的囊泡(諸如peg-daa及peg-dag)。制造脂質(zhì)粒子-cpl的方法教示于例如美國(guó)專利第5,705,385號(hào)、第6,586,410號(hào)、第5,981,501號(hào)、第6,534,484號(hào)和第6,852,334號(hào)、美國(guó)專利公開案第20020072121號(hào)及pct公開案第wo00/62813號(hào)中，其公開內(nèi)容出于所有目的以全文引用的方式并入本文中。

試劑盒

本發(fā)明還提供提供呈試劑盒形式的脂質(zhì)粒子。在一些實(shí)施方案中，試劑盒包括經(jīng)隔室化以容納脂質(zhì)粒子的各種要素(例如活性劑，諸如sirna分子及粒子的個(gè)別脂質(zhì)組分)的容器。試劑盒優(yōu)選包括容納本發(fā)明的脂質(zhì)粒子的容器(例如小瓶或安瓿)，其中所述粒子通過本文中所闡述的方法之一產(chǎn)生。在某些實(shí)施方案中，該試劑盒可還包括核內(nèi)體膜去穩(wěn)定劑(例如鈣離子)。該試劑盒典型地含有呈處于藥學(xué)上可接受的載體中的懸浮液形式或呈脫水形式的本發(fā)明粒子組合物與其復(fù)水(如果凍干)及施用說明書。

本發(fā)明的配制物可經(jīng)改適以優(yōu)先靶向相關(guān)特定細(xì)胞、組織或器官。核酸-脂質(zhì)粒子的優(yōu)先靶向可通過控制脂質(zhì)粒子本身的組成來進(jìn)行。在特定實(shí)施方案中，本發(fā)明的試劑盒包括這些脂質(zhì)粒子，其中所述粒子呈懸浮液形式或呈脫水形式存在于容器中。

在某些情況下，可能需要靶向部分連接于脂質(zhì)粒子表面以進(jìn)一步增強(qiáng)粒子的靶向。連接靶向部分(例如抗體、蛋白質(zhì)等)與脂質(zhì)(諸如本發(fā)明粒子中所使用的那些脂質(zhì))的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。

脂質(zhì)粒子的施用

一旦形成后，本發(fā)明的脂質(zhì)粒子尤其可用于將sirna分子(例如表a中所描述的sirna分子)引入細(xì)胞中。因此，本發(fā)明還提供用于將sirna分子引入細(xì)胞中的方法。在特定實(shí)施方案中，將sirna分子引入受感染細(xì)胞中。該方法可通過首先如以上所描述形成粒子且隨后使所述粒子與細(xì)胞接觸足以將sirna遞送至細(xì)胞的時(shí)間段而在體外或體內(nèi)進(jìn)行。

本發(fā)明的脂質(zhì)粒子(例如核酸脂質(zhì)粒子)可吸收至幾乎任何與其混合或接觸的細(xì)胞類型。一旦吸收后，粒子可由細(xì)胞的一部分吞噬，與細(xì)胞膜交換脂質(zhì)，或與細(xì)胞融合。粒子的sirna部分的轉(zhuǎn)移或并入可經(jīng)由這些途徑中的任一種來進(jìn)行。具體而言，當(dāng)融合發(fā)生時(shí)，粒子膜并入細(xì)胞膜中且粒子的內(nèi)含物與細(xì)胞內(nèi)液合并。

本發(fā)明的脂質(zhì)粒子(例如核酸-脂質(zhì)粒子)可單獨(dú)或呈與根據(jù)施用途徑及標(biāo)準(zhǔn)醫(yī)藥實(shí)務(wù)選擇的藥學(xué)上可接受的載體(例如生理鹽水或磷酸鹽緩沖液)的混合物的形式施用。一般而言，將采用正常緩沖生理鹽水(例如135至150mmnacl)作為藥學(xué)上可接受的載體。其它適合的載體包括例如水、緩沖水、0.4％生理鹽水、0.3％甘氨酸及其類似物，包括用于增強(qiáng)穩(wěn)定性的糖蛋白，諸如白蛋白、脂蛋白、球蛋白等。其它適合的載體描述于例如remington’spharmaceuticalsciences,mackpublishingcompany,philadelphia,pa,第17版(1985)中。如本文中所使用，“載體”包括任何及所有溶劑、分散介質(zhì)、媒劑、包衣劑、稀釋劑、抗細(xì)菌劑及抗真菌劑、等滲劑及吸收延遲劑、緩沖劑、載體溶液、懸浮液、膠體及其類似物。詞組“藥學(xué)上可接受”是指當(dāng)施用給人時(shí)不產(chǎn)生過敏性或類似不良反應(yīng)的分子實(shí)體及組合物。

一般在脂質(zhì)粒子形成之后添加藥學(xué)上可接受的載體。因而，在形成脂質(zhì)粒子之后，可將粒子稀釋于藥學(xué)上可接受的載體中，諸如正常緩沖生理鹽水。

藥物配制物中的粒子濃度可廣泛變化，即，以重量計(jì)低于約0.05％，通常為或至少為約2％至5％，至多達(dá)約10％至90％，并且將根據(jù)所選擇的特定施用模式，主要由流體體積、黏度等加以選擇。舉例而言，可增加濃度以降低與治療相關(guān)的流體負(fù)載。此在患有動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)的充血性心臟衰竭或嚴(yán)重高血壓的患者中可能尤其理想?；蛘?，可將包含刺激性脂質(zhì)的粒子稀釋至低濃度以減輕施用部位的炎癥。

本發(fā)明的藥物組合物可通過常規(guī)的熟知滅菌技術(shù)進(jìn)行滅菌。水溶液可經(jīng)包裝以供使用，或在無菌條件下過濾并凍干，在施用前將凍干制劑與無菌水溶液組合。所述組合物可視需要含有藥學(xué)上可接受的輔助物質(zhì)以接近生理?xiàng)l件，諸如ph值調(diào)節(jié)及緩沖劑、張力調(diào)節(jié)劑及其類似物，例如乙酸鈉、乳酸鈉、氯化鈉、氯化鉀及氯化鈣。另外，粒子懸浮液可包括儲(chǔ)存時(shí)保護(hù)脂質(zhì)以防自由基及脂質(zhì)過氧化損傷的脂質(zhì)保護(hù)劑。諸如α生育酚的親脂性自由基淬滅劑及諸如鐵草胺的水溶性鐵特異性螯合劑是適合的。

在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的脂質(zhì)粒子尤其可用于治療性遞送一種或多種sirna分子(例如表a中所描述的sirna分子)的方法。具體而言，本發(fā)明的一個(gè)目標(biāo)在于提供通過使一個(gè)或多個(gè)hbv基因的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯下調(diào)或沉默而治療人的hbv和/或hdv感染的體內(nèi)方法。

a.體內(nèi)施用

已使用核酸-脂質(zhì)粒子，諸如pct公開案第wo05/007196號(hào)、第wo05/121348號(hào)、第wo05/120152號(hào)和第wo04/002453號(hào)中所描述的那些核酸-脂質(zhì)粒子達(dá)成用于體內(nèi)療法的全身性遞送，例如經(jīng)由身體系統(tǒng)(諸如循環(huán))將本文中所描述的sirna分子，諸如表a中所描述的sirna遞送至遠(yuǎn)程靶細(xì)胞，其公開內(nèi)容出于所有目的以全文引用的方式并入本文中。本發(fā)明還提供完全囊封的脂質(zhì)粒子，其保護(hù)sirna以防在血清中發(fā)生核酸酶降解，非免疫原性，尺寸較小且適合于重復(fù)給與。另外，一種或多種sirna分子可于本發(fā)明的脂質(zhì)粒子中單獨(dú)施用，或與包含肽、多肽或諸如常規(guī)藥物的小分子的脂質(zhì)粒子組合施用(例如共同施用)。

對(duì)于體內(nèi)施用，施用可用本領(lǐng)域中已知的任何方式進(jìn)行，例如通過注射、經(jīng)口施用、吸入(例如鼻內(nèi)或氣管內(nèi))、經(jīng)皮施用或直腸施用。施用可經(jīng)由單次或分次劑量來實(shí)現(xiàn)。藥物組合物可非經(jīng)腸施用，即，關(guān)節(jié)內(nèi)、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下或肌肉內(nèi)。在一些實(shí)施方案中，通過推注經(jīng)靜脈內(nèi)或腹膜內(nèi)施用藥物組合物(參見例如美國(guó)專利第5,286,634號(hào))。細(xì)胞內(nèi)核酸遞送也論述于straubringer等人,methodsenzymol.,101:512(1983)；mannino等人,biotechniques,6:682(1988)；nicolau等人,crit.rev.ther.drugcarriersyst.,6:239(1989)；及behr,acc.chem.res.,26:274(1993)中。施用基于脂質(zhì)的治療劑的其它方法描述于例如美國(guó)專利第3,993,754號(hào)、第4,145,410號(hào)、第4,235,871號(hào)、第4,224,179號(hào)、第4,522,803號(hào)和第4,588,578號(hào)中。脂質(zhì)粒子可通過在疾病部位直接注射或通過在疾病部位的遠(yuǎn)側(cè)部位注射來施用(參見例如culver,humangenetherapy,maryannliebert,inc.,publishers,newyork.第70-71頁(yè)(1994))。上述參考文獻(xiàn)的公開內(nèi)容出于所有目的以全文引用的方式并入本文中。

在本發(fā)明的脂質(zhì)粒子經(jīng)靜脈內(nèi)施用的實(shí)施方案中，所述粒子的總注射劑量中至少約5％、10％、15％、20％或25％在注射之后于血漿中存在約8、12、24、36或48小時(shí)。在其它實(shí)施方案中，所述脂質(zhì)粒子的總注射劑量中多于約20％、30％、40％且多達(dá)約60％、70％或80％在注射之后于血漿中存在約8、12、24、36或48小時(shí)。在某些情況下，多種粒子中多于約10％在施用之后于哺乳動(dòng)物的血漿中存在約1小時(shí)。在某些其它情況下，脂質(zhì)粒子的存在在施用所述粒子之后至少約1小時(shí)可檢測(cè)到。在一些實(shí)施方案中，sirna分子的存在在施用之后約8、12、24、36、48、60、72或96小時(shí)可在細(xì)胞中檢測(cè)到。在其它實(shí)施方案中，sirna分子下調(diào)靶序列(諸如病毒或宿主序列)的表達(dá)在施用之后約8、12、24、36、48、60、72或96小時(shí)可檢測(cè)到。在其它實(shí)施方案中，sirna分子下調(diào)靶序列(諸如病毒或宿主序列)的表達(dá)優(yōu)先在受感染細(xì)胞和/或能夠被感染的細(xì)胞中發(fā)生。在其它實(shí)施方案中，sirna分子在施用部位的近側(cè)或遠(yuǎn)側(cè)部位的細(xì)胞中的存在或效應(yīng)在施用之后約12、24、48、72或96小時(shí)或約6、8、10、12、14、16、18、19、20、22、24、26或28天可檢測(cè)到。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的脂質(zhì)粒子非經(jīng)腸或經(jīng)腹膜內(nèi)施用。

本發(fā)明的組合物可單獨(dú)或與其它適合的組分組合制成氣霧劑配制物(即，其可“霧化”)以便經(jīng)由吸入(例如經(jīng)鼻內(nèi)或經(jīng)氣管內(nèi))施用(參見brigham等人,am.j.sci.,298:278(1989))。氣霧劑配制物可放置于加壓可接受的推進(jìn)劑中，諸如二氯二氟甲烷、丙烷、氮?dú)饧捌漕愃莆铩?/p>

在某些實(shí)施方案中，藥物組合物可通過鼻內(nèi)噴霧、吸入和/或其它氣霧劑遞送媒劑來遞送。用于經(jīng)由鼻用氣霧劑噴霧將核酸組合物直接遞送至肺部的方法已描述于例如美國(guó)專利第5,756,353號(hào)和第5,804,212號(hào)中。同樣，使用鼻內(nèi)微粒樹脂及溶血磷脂?；视突衔镞f送藥物(美國(guó)專利5,725,871)在醫(yī)藥技術(shù)中也是熟知的。類似地，呈聚四氟乙烯負(fù)載基質(zhì)形式的透黏膜藥物遞送描述于美國(guó)專利第5,780,045號(hào)中。上述專利的公開內(nèi)容出于所有目的以全文引用的方式并入本文中。

適用于非經(jīng)腸施用(舉例而言，諸如關(guān)節(jié)內(nèi)(關(guān)節(jié)中)、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮內(nèi)、腹膜內(nèi)及皮下途徑)的配制物包括水性及非水性等滲無菌注射溶液，其可含有抗氧化劑、緩沖劑、抑細(xì)菌劑及使得配制物與預(yù)定受體的血液等滲的溶質(zhì)；以及水性及非水性無菌懸浮液，其可包括懸浮劑、增溶劑、增稠劑、穩(wěn)定劑及防腐劑。在實(shí)施本發(fā)明時(shí)，舉例而言，優(yōu)選通過靜脈內(nèi)輸注、經(jīng)口、局部、腹膜內(nèi)、囊泡內(nèi)或鞘內(nèi)施用組合物。

一般而言，當(dāng)經(jīng)靜脈內(nèi)施用時(shí)，脂質(zhì)粒子配制物系與適合的藥物載體一起配制。許多藥學(xué)上可接受的載體可用于本發(fā)明的組合物和方法中。適用于本發(fā)明的配制物見于例如remington’spharmaceuticalsciences,mackpublishingcompany,philadelphia,pa,第17版(1985)中。可使用多種水性載體，例如水、緩沖水、0.4％生理鹽水、0.3％甘氨酸及其類似物，且可包括用于增強(qiáng)穩(wěn)定性的糖蛋白，諸如白蛋白、脂蛋白、球蛋白等。一般而言，將采用正常緩沖生理鹽水(135至150mmnacl)作為藥學(xué)上可接受的載體，但其它適合的載體將滿足需要。這些組合物可通過諸如過濾的常規(guī)脂質(zhì)粒滅菌技術(shù)進(jìn)行滅菌。所述組合物可視需要含有藥學(xué)上可接受的輔助物質(zhì)以接近生理?xiàng)l件，諸如ph值調(diào)節(jié)及緩沖劑、張力調(diào)節(jié)劑、潤(rùn)濕劑及其類似物，例如乙酸鈉、乳酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、單月桂酸脫水山梨醇酯、油酸三乙醇胺酯等。這些組合物可使用以上所提及的技術(shù)進(jìn)行滅菌，或替代地，其可在無菌條件下產(chǎn)生。所得水溶液可經(jīng)包裝以供使用，或在無菌條件下過濾并凍干，在施用前將凍干制劑與無菌水溶液組合。

在某些應(yīng)用中，本文中所披露的脂質(zhì)粒子可經(jīng)由經(jīng)口施用個(gè)體加以遞送。所述粒子可并有賦形劑且以可食用錠劑、經(jīng)頰錠劑、喉錠、膠囊劑、丸劑、口含錠、酏劑、嗽口水、懸浮液、經(jīng)口噴霧、糖漿、糯米片及其類似物的形式使用(參見例如美國(guó)專利第5,641,515號(hào)、第5,580,579號(hào)和第5,792,451號(hào)，其公開內(nèi)容出于所有目的以全文引用的方式并入本文中)。這些經(jīng)口劑量形式也可含有以下各項(xiàng)：黏合劑、明膠、賦形劑、潤(rùn)滑劑和/或調(diào)味劑。當(dāng)單位劑型為膠囊劑時(shí)，除以上所描述的材料以外，其也可含有液體載體。各種其它材料可作為包衣劑存在或以其它方式調(diào)節(jié)劑量單位的物理形式。固然，用于制備任何單位劑型的任何材料均應(yīng)為醫(yī)藥學(xué)純的且在所采用的量下實(shí)質(zhì)上無毒。

典型地，這些經(jīng)口配制物可含有至少約0.1％或更多脂質(zhì)粒子，但固然，所述粒子的百分比可變化且宜在總配制物重量或體積的約1％或2％與約60％或70％之間或更大。自然，可能制備的各治療上適用的組合物中的粒子用量使得將在該化合物的任何指定單位劑量下獲得適合劑量。制備這種藥物配制物的領(lǐng)域的技術(shù)人員將預(yù)見諸如溶解度、生物利用率、生物半衰期、施用途徑、產(chǎn)品保質(zhì)期以及其它藥理學(xué)考慮的因素，且因而多種劑量及治療方案可為理想的。

適合于經(jīng)口施用的配制物可由以下各項(xiàng)組成：(a)液體溶液，諸如有效量的封裝sirna分子(例如，表a中所描述的sirna分子)懸浮于諸如水、生理鹽水或peg400的稀釋劑中；(b)膠囊劑、扁囊劑或錠劑，各自含有預(yù)定量的sirna分子，呈液體、固體、顆粒或明膠形式；(c)于適當(dāng)液體中的懸浮液；及(d)適合的乳液。錠劑形式可包括乳糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、磷酸鈣、玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、微晶纖維素、明膠、膠體二氧化硅、滑石、硬脂酸鎂、硬脂酸及其它賦形劑、著色劑、填充劑、黏合劑、稀釋劑、緩沖劑、潤(rùn)濕劑、防腐劑、調(diào)味劑、染料、崩解劑及藥學(xué)上相容的載體中的一種或多種。口含錠形式可包含處于調(diào)味劑(例如蔗糖)中的sirna分子，以及包含處于惰性基質(zhì)中的治療性核酸的喉錠，諸如明膠及甘油或蔗糖及阿拉伯膠乳液、凝膠及除sirna分子以外還含有本領(lǐng)域中已知的載體的類似物。

在其用途的另一實(shí)例中，脂質(zhì)粒子可并入多種局部劑型中。舉例而言，含核酸-脂質(zhì)粒子的懸浮液可配制為凝膠劑、油劑、乳液、局部乳膏、糊劑、軟膏、洗液、泡沫、慕思及其類似物并施用。

當(dāng)制備本發(fā)明脂質(zhì)粒子的藥物制劑時(shí)，優(yōu)選使用大量已經(jīng)純化以減少或消除空粒子的粒子或與外表面締合的含諸如sirna的治療劑的粒子。

本發(fā)明的方法可在多種宿主中實(shí)施。優(yōu)選宿主包括哺乳動(dòng)物物種，諸如靈長(zhǎng)類(例如人及黑猩猩以及其它非人類靈長(zhǎng)類)、犬、貓、馬、牛、綿羊、山羊、嚙齒動(dòng)物(例如大鼠及小鼠)、兔形目動(dòng)物及豬。

所施用的粒子的量將視sirna分子與脂質(zhì)的比、所使用的特定sirna、所治療的hbv菌株、患者的年齡、體重及病狀以及臨床醫(yī)師的判斷而定，但一般將介于每公斤體重約0.01與約50mg之間，優(yōu)選介于約0.1與約5mg/kg體重之間或每次施用(例如注射)約10⁸至10¹⁰個(gè)粒子。

b.體外施用

對(duì)于體外應(yīng)用，sirna分子可遞送至于培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的任何細(xì)胞中。在優(yōu)選實(shí)施方案中，細(xì)胞為動(dòng)物細(xì)胞，更優(yōu)選為哺乳動(dòng)物細(xì)胞且最優(yōu)選為人細(xì)胞。

細(xì)胞與脂質(zhì)粒子之間的接觸當(dāng)在體外進(jìn)行時(shí)在生物學(xué)上相容的培養(yǎng)基中發(fā)生。粒子的濃度視特定應(yīng)用而廣泛變化，但一般介于約1μmol與約10mmol之間。用脂質(zhì)粒子處理細(xì)胞一般在生理溫度(約37℃)下進(jìn)行約1至48小時(shí)、優(yōu)選約2至4小時(shí)之時(shí)間段。

在一組優(yōu)選實(shí)施方案中，將脂質(zhì)粒子懸浮液添加至60％至80％匯合接種細(xì)胞中，細(xì)胞密度為約10³至約10⁵個(gè)細(xì)胞/毫升、更優(yōu)選為約2×10⁴個(gè)細(xì)胞/毫升。添加至細(xì)胞中的懸浮液的濃度優(yōu)選為約0.01至0.2μg/ml，更優(yōu)選為約0.1μg/ml。

在細(xì)胞組織培養(yǎng)可能需要的程度上，在本領(lǐng)域中是熟知的。舉例而言，freshney,cultureofanimalcells,amanualofbasictechnique,第3版,wiley-liss,newyork(1994)；kuchler等人,biochemicalmethodsincellcultureandvirology,dowden,hutchinsonandross,inc.(1977)及其中所引用的參考文獻(xiàn)提供細(xì)胞培養(yǎng)的一般指導(dǎo)。培養(yǎng)細(xì)胞系統(tǒng)通常呈單細(xì)胞層形式，但也使用細(xì)胞懸浮液。

使用核內(nèi)體釋放參數(shù)(erp)測(cè)定法，可優(yōu)化本發(fā)明的核酸-脂質(zhì)粒子的遞送效率。erp測(cè)定法詳細(xì)描述于美國(guó)專利公開案第20030077829號(hào)中，其公開內(nèi)容出于所有目的以全文引用的方式并入本文中。更具體而言，erp測(cè)定法的目的在于基于脂質(zhì)粒子的各種陽(yáng)離子脂質(zhì)及輔助脂質(zhì)組分對(duì)結(jié)合/吸收或與核內(nèi)體膜融合/去穩(wěn)定的相對(duì)效應(yīng)來辨別其效應(yīng)。此測(cè)定法允許定量測(cè)定脂質(zhì)粒子的各組分對(duì)遞送效率有何影響，從而優(yōu)化脂質(zhì)粒子。通常，erp測(cè)定法測(cè)量報(bào)告蛋白質(zhì)(例如熒光素酶、β-半乳糖苷酶、綠色熒光蛋白(gfp)等)的表達(dá)，且在一些情況下，經(jīng)優(yōu)化以用于表達(dá)質(zhì)粒的脂質(zhì)粒子配制物也將適用于囊封sirna。在其它情況下，erp測(cè)定法可能適于測(cè)量靶序列在存在或不存在sirna時(shí)的轉(zhuǎn)錄或翻譯的下調(diào)。通過比較各種脂質(zhì)粒子各自的erp，可容易地確定優(yōu)化系統(tǒng)，例如在細(xì)胞中具有最高吸收的脂質(zhì)粒子。

c.脂質(zhì)粒子的檢測(cè)

在一些實(shí)施方案中，在約1、2、3、4、5、6、7、8或更多個(gè)小時(shí)可在個(gè)體中檢測(cè)到本發(fā)明的脂質(zhì)粒子。在其它實(shí)施方案中，可在施用粒子之后約8、12、24、48、60、72或96小時(shí)或約6、8、10、12、14、16、18、19、22、24、25或28天在個(gè)體中檢測(cè)到本發(fā)明的脂質(zhì)粒子?？稍诘米詡€(gè)體的細(xì)胞、組織或其它生物樣品中檢測(cè)粒子的存在。所述粒子可例如通過直接檢測(cè)粒子、檢測(cè)sirna序列、檢測(cè)相關(guān)靶序列(即，通過檢測(cè)相關(guān)序列的表達(dá)或減少的表達(dá))、檢測(cè)ebov蛋白(例如干擾素)調(diào)節(jié)的化合物、檢測(cè)個(gè)體中的病毒負(fù)載或其組合加以檢測(cè)。

1.粒子的檢測(cè)

本發(fā)明的脂質(zhì)粒子可使用本領(lǐng)域中已知的任何方法加以檢測(cè)。舉例而言，可使用本領(lǐng)域中所熟知的方法使標(biāo)記直接或間接偶合于脂質(zhì)粒子的組分?？墒褂枚喾N標(biāo)記，其中標(biāo)記的選擇視所需敏感性、與脂質(zhì)粒子組分綴合的容易性、穩(wěn)定性要求及可利用的儀器及處理規(guī)定而定。適合的標(biāo)記包括但不限于光譜標(biāo)記，諸如熒光染料(例如熒光素及衍生物，諸如異硫氰酸熒光素(fitc)及oregongreen^tm；若丹明及衍生物，諸如得克薩斯紅、異硫氰酸四若丹明(tritc)等、洋地黃毒苷、生物素、藻紅蛋白、amca、cydyes^tm及其類似物；放射性標(biāo)記，諸如³h、¹²⁵i、³⁵s、¹⁴c、³²p、³³p等；酶，諸如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶等；光譜比色標(biāo)記，諸如膠態(tài)金或有色玻璃或塑料珠粒，諸如聚苯乙烯、聚丙烯、膠乳等。該標(biāo)記可使用本領(lǐng)域中已知的任何手段加以檢測(cè)。

2.核酸的檢測(cè)

本文中通過本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的許多手段中的任一種來檢測(cè)并定量核酸(例如sirna分子)。核酸的檢測(cè)可通過熟知的方法來進(jìn)行，諸如southern分析、northern分析、凝膠電泳、pcr、放射性標(biāo)記、閃爍計(jì)數(shù)及親和色譜法。也可采用其它分析型生物化學(xué)方法，諸如分光光度法、x射線照相術(shù)、電泳、毛細(xì)管電泳、高效液相色譜法(hplc)、薄層色譜法(tlc)及超擴(kuò)散色譜法。

核酸雜交形式的選擇不重要。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知多種核酸雜交形式。舉例而言，常用形式包括夾心測(cè)定法及競(jìng)爭(zhēng)或易位測(cè)定法。雜交技術(shù)一般描述于例如“nucleicacidhybridization,apracticalapproach”,hames及higgins編,irlpress(1985)中。

可通過使用放大所檢測(cè)的靶核酸的核酸擴(kuò)增系統(tǒng)來提高雜交測(cè)定法的敏感性。適用于擴(kuò)增序列以用作分子探針或用于產(chǎn)生核酸片段以供隨后亞克隆的體外擴(kuò)增技術(shù)是已知的。足以指導(dǎo)技術(shù)人員進(jìn)行這種體外擴(kuò)增方法的技術(shù)的實(shí)例，包括聚合酶鏈反應(yīng)(pcr)、連接酶鏈反應(yīng)(lcr)、qβ-復(fù)制酶擴(kuò)增及其它rna聚合酶介導(dǎo)的技術(shù)(例如nasba^tm)見于以下文獻(xiàn)中：sambrook等人,molecularcloning:alaboratorymanual,coldspringharborlaboratorypress(2000)；及ausubel等人,shortprotocolsinmolecularbiology,currentprotocols編,greenepublishingassociates,inc.及johnwiley&sons,inc.(2002)；以和美國(guó)專利第4,683,202號(hào)；pcrprotocols,aguidetomethodsandapplications(innis等人編)academicpressinc.sandiego,ca(1990)；arnheim&levinson(1990年10月1日),c&en36；thejournalofnihresearch,3:81(1991)；kwoh等人,proc.natl.acad.sci.usa,86:1173(1989)；guatelli等人,proc.natl.acad.sci.usa,87:1874(1990)；lomell等人,j.clin.chem.,35:1826(1989)；landegren等人,science,241:1077(1988)；vanbrunt,biotechnology,8:291(1990)；wu及wallace,gene,4:560(1989)；barringer等人,gene,89:117(1990)；以及sooknanan及malek,biotechnology,13:563(1995)。體外克隆經(jīng)擴(kuò)增的核酸的改良方法描述于美國(guó)專利第5,426,039號(hào)中。本領(lǐng)域中所描述的其它方法為基于核酸序列的擴(kuò)增(nasba^tm，cangene，mississauga，ontario)及qβ-復(fù)制酶系統(tǒng)。這些系統(tǒng)可用于直接鑒別突變體，其中設(shè)計(jì)pcr或lcr引物以便僅在存在所選序列時(shí)延伸或連接?；蛘撸话憧墒褂美绶翘禺愋詐cr引物來擴(kuò)增所選序列且稍后探測(cè)所擴(kuò)增的目標(biāo)區(qū)域中指示突變的特定序列。上述參考文獻(xiàn)的公開內(nèi)容出于所有目的以全文引用的方式并入本文中。

用作例如體外擴(kuò)增方法中的探針、用作基因探針或用作抑制劑組分的核酸典型地根據(jù)由beaucage等人,tetrahedronletts.,22:18591862(1981)所描述的固相亞磷酰胺三酯法，例如，如needhamvandevanter等人,nucleicacidsres.,12:6159(1984)中所描述使用自動(dòng)合成儀進(jìn)行化學(xué)合成。必要時(shí)典型地通過如pearson等人,j.chrom.,255:137149(1983)中所描述的天然丙烯酰胺凝膠電泳或通過陰離子交換hplc進(jìn)行聚核苷酸的純化?？墒褂胢axam及gilbert(1980),grossman及moldave(編)academicpress,newyork,methodsinenzymology,65:499的化學(xué)降解法驗(yàn)證合成聚核苷酸的序列。

用于測(cè)定轉(zhuǎn)錄水平的替代手段為原位雜交。原位雜交測(cè)定法是熟知的且概述于angerer等人,methodsenzymol.,152:649(1987)中。在原位雜交測(cè)定法中，將細(xì)胞固定于固體載體，典型地玻璃載物片。如果欲探測(cè)dna，則利用熱或堿使細(xì)胞變性。隨后使細(xì)胞與雜交溶液在中等溫度下接觸以允許欲標(biāo)記的特定探針退火。優(yōu)選用放射性同位素或熒光報(bào)告基因標(biāo)記探針。

實(shí)施例

將通過特定實(shí)施例更詳細(xì)地描述本發(fā)明。以下實(shí)施例是出于說明的目的而提供，而不欲以任何方式限制本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)容易地識(shí)別可加以變化或修改以產(chǎn)生本質(zhì)上相同的結(jié)果的多種非重要參數(shù)。

實(shí)施例1.

本實(shí)施例描述用于測(cè)試表a中所闡述的15個(gè)sirna序列的hbv基因沉默活性的生物測(cè)定。

編輯hbv基因組序列(登記號(hào)eu939600.1)以完美匹配所有候選sirna。具體地，在計(jì)算機(jī)上接合以下四個(gè)序列區(qū)，包括各序列區(qū)域的5'和3'端上的30bp側(cè)接序列且含有候選sirna的靶位點(diǎn)：212至803、1062至1922、2237至2460及2783至2862。插入六個(gè)突變(位置454c>t；位置598t>c；位置1206a>c；位置1287a>c；及位置1461g>c，相對(duì)于eu939600.1)以確保所有候選sirna與這個(gè)合成一致hbv靶片段完美互補(bǔ)。合成一致hbv靶片段，其中限制酶位點(diǎn)xhoi和noti分別添加至5'和3'端，以便有助于克隆于psicheck-2雙熒光素酶載體中。xhoi/noti克隆位點(diǎn)介于psicheck-2雙熒光素酶載體上的海腎熒光素酶的終止密碼子與聚腺苷酸化信號(hào)之間。

通過在dual-glo測(cè)定系統(tǒng)(promega，madison，wi，usa)中測(cè)量海腎熒光素酶(r-luc)活性相對(duì)于螢火蟲熒光素酶(f-luc)活性的降低來測(cè)試候選sirna的hbv基因沉默活性。簡(jiǎn)而言之，將cos-7細(xì)胞以25,000個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種于96孔板中且使用lipofectamine2000以每孔100ng報(bào)告質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)染。在37℃/5％co2下培育4小時(shí)之后，移除培養(yǎng)基且用hbvsirna以一式四份以不同濃度轉(zhuǎn)染cos-7細(xì)胞，隨后在以上所描述的條件下再培育20小時(shí)。通過熒光檢測(cè)來測(cè)定兩種熒光素酶的表達(dá)。將經(jīng)hbv-sirna處理的樣品的r-luc/f-luc表達(dá)相對(duì)于經(jīng)陰性(非靶向)sirna處理的細(xì)胞中的r-luc/f-luc表達(dá)平均值標(biāo)準(zhǔn)化。作為陽(yáng)性對(duì)照，包括針對(duì)r-luc的sirna。通過xlfit功能(idbsmathiq)計(jì)算50％抑制濃度(ic50)。

實(shí)施例2.

本實(shí)施例描述選自名為1m至15m(參見表a)的sirna組中的兩個(gè)不同的sirna的所有可能的“二元”組合。如本申請(qǐng)案的實(shí)施例2和實(shí)施例3中所使用的術(shù)語(yǔ)“組合”意謂所組合的sirna分子共同存在于同一物質(zhì)組合物中(例如，一起溶解于同一溶液內(nèi)；或一起存在于同一脂質(zhì)粒子內(nèi)；或一起存在于脂質(zhì)粒子的同一藥物配制物中，但藥物配制物內(nèi)的各脂質(zhì)粒子可能包括或可能不包括該sirna組合的各不同的sirna)。所組合的sirna分子通常不共價(jià)連接在一起。

個(gè)別sirna各自以名稱1m至15m加以鑒別，如表a中所示。組合內(nèi)的各sirna編號(hào)以短劃線(-)隔開；舉例而言，記法“1m-2m”表示sirna編號(hào)1m與sirna編號(hào)2m的組合。短劃線不意謂組合內(nèi)的不同的sirna分子彼此共價(jià)連接。不同的sirna組合由分號(hào)隔開。組合中的sirna編號(hào)的順序不重要。舉例而言，組合1m-2m等效于組合2m-1m，因?yàn)榇藘蓚€(gè)記法描述sirna編號(hào)1m與sirna編號(hào)2m的同一組合。

本實(shí)施例中所描述的sirna組合可用于例如實(shí)施本發(fā)明以便治療人的hbv和/或hdv感染且改善與hbv感染和/或hdv感染相關(guān)的至少一種癥狀。

sirna1m至15m的二元sirna組合為：1m-2m；1m-3m；1m-4m；1m-5m；1m-6m；1m-7m；1m-8m；1m-9m；1m-10m；1m-11m；1m-12m；1m-13m；1m-14m；1m-15m；2m-3m；2m-4m；2m-5m；2m-6m；2m-7m；2m-8m；2m-9m；2m-10m；2m-11m；2m-12m；2m-13m；2m-14m；2m-15m；3m-4m；3m-5m；3m-6m；3m-7m；3m-8m；3m-9m；3m-10m；3m-11m；3m-12m；3m-13m；3m-14m；3m-15m；4m-5m；4m-6m；4m-7m；4m-8m；4m-9m；4m-10m；4m-11m；4m-12m；4m-13m；4m-14m；4m-15m；5m-6m；5m-7m；5m-8m；5m-9m；5m-10m；5m-11m；5m-12m；5m-13m；5m-14m；5m-15m；6m-7m；6m-8m；6m-9m；6m-10m；6m-11m；6m-12m；6m-13m；6m-14m；6m-15m；7m-8m；7m-9m；7m-10m；7m-11m；7m-12m；7m-13m；7m-14m；7m-15m；8m-9m；8m-10m；8m-11m；8m-12m；8m-13m；8m-14m；8m-15m；9m-10m；9m-11m；9m-12m；9m-13m；9m-14m；9m-15m；10m-11m；10m-12m；10m-13m；10m-14m；10m-15m；11m-12m；11m-13m；11m-14m；11m-15m；12m-13m；12m-14m；12m-15m；13m-14m；13m-15m；及14m-15m。

實(shí)施例3.

本實(shí)施例描述選自名為1m至15m(參見表a)的sirna分子群組中的三個(gè)不同的sirna的所有可能的“三元”組合。個(gè)別sirna各自以名稱1m至15m加以鑒別，如表a中所示。各sirna編號(hào)以短劃線(-)隔開；舉例而言，記法“1m-2m-3m”表示sirna編號(hào)1m、sirna編號(hào)2m及sirna編號(hào)3m的組合。短劃線不意謂組合內(nèi)的不同的sirna分子彼此共價(jià)連接。不同的sirna組合由分號(hào)隔開。組合中的sirna編號(hào)的順序不重要。舉例而言，組合1m-2m-3m等效于組合3m-2m-1m，因?yàn)榇藘蓚€(gè)記法描述sirna編號(hào)1m與sirna編號(hào)2m及sirna編號(hào)3m的同一組合。

本實(shí)施例中所描述的sirna組合適用于例如實(shí)施本發(fā)明以便治療人的hbv和/或hdv感染且改善與hbv感染和/或hdv感染相關(guān)的至少一種癥狀。

sirna1m至15m的三元sirna組合為：1m-2m-3m；1m-2m-4m；1m-2m-5m；1m-2m-6m；1m-2m-7m；1m-2m-8m；1m-2m-9m；1m-2m-10m；1m-2m-11m；1m-2m-12m；1m-2m-13m；1m-2m-14m；1m-2m-15m；1m-3m-4m；1m-3m-5m；1m-3m-6m；1m-3m-7m；1m-3m-8m；1m-3m-9m；1m-3m-10m；1m-3m-11m；1m-3m-12m；1m-3m-13m；1m-3m-14m；1m-3m-15m；1m-4m-5m；1m-4m-6m；1m-4m-7m；1m-4m-8m；1m-4m-9m；1m-4m-10m；1m-4m-11m；1m-4m-12m；1m-4m-13m；1m-4m-14m；1m-4m-15m；1m-5m-6m；1m-5m-7m；1m-5m-8m；1m-5m-9m；1m-5m-10m；1m-5m-11m；1m-5m-12m；1m-5m-13m；1m-5m-14m；1m-5m-15m；1m-6m-7m；1m-6m-8m；1m-6m-9m；1m-6m-10m；1m-6m-11m；1m-6m-12m；1m-6m-13m；1m-6m-14m；1m-6m-15m；1m-7m-8m；1m-7m-9m；1m-7m-10m；1m-7m-11m；1m-7m-12m；1m-7m-13m；1m-7m-14m；1m-7m-15m；1m-8m-9m；1m-8m-10m；1m-8m-11m；1m-8m-12m；1m-8m-13m；1m-8m-14m；1m-8m-15m；1m-9m-10m；1m-9m-11m；1m-9m-12m；1m-9m-13m；1m-9m-14m；1m-9m-15m；1m-10m-11m；1m-10m-12m；1m-10m-13m；1m-10m-14m；1m-10m-15m；1m-11m-12m；1m-11m-13m；1m-11m-14m；1m-11m-15m；1m-12m-13m；1m-12m-14m；1m-12m-15m；1m-13m-14m；1m-13m-15m；1m-14m-15m；2m-3m-4m；2m-3m-5m；2m-3m-6m；2m-3m-7m；2m-3m-8m；2m-3m-9m；2m-3m-10m；2m-3m-11m；2m-3m-12m；2m-3m-13m；2m-3m-14m；2m-3m-15m；2m-4m-5m；2m-4m-6m；2m-4m-7m；2m-4m-8m；2m-4m-9m；2m-4m-10m；2m-4m-11m；2m-4m-12m；2m-4m-13m；2m-4m-14m；2m-4m-15m；2m-5m-6m；2m-5m-7m；2m-5m-8m；2m-5m-9m；2m-5m-10m；2m-5m-11m；2m-5m-12m；2m-5m-13m；2m-5m-14m；2m-5m-15m；2m-6m-7m；2m-6m-8m；2m-6m-9m；2m-6m-10m；2m-6m-11m；2m-6m-12m；2m-6m-13m；2m-6m-14m；2m-6m-15m；2m-7m-8m；2m-7m-9m；2m-7m-10m；2m-7m-11m；2m-7m-12m；2m-7m-13m；2m-7m-14m；2m-7m-15m；2m-8m-9m；2m-8m-10m；2m-8m-11m；2m-8m-12m；2m-8m-13m；2m-8m-14m；2m-8m-15m；2m-9m-10m；2m-9m-11m；2m-9m-12m；2m-9m-13m；2m-9m-14m；2m-9m-15m；2m-10m-11m；2m-10m-12m；2m-10m-13m；2m-10m-14m；2m-10m-15m；2m-11m-12m；2m-11m-13m；2m-11m-14m；2m-11m-15m；2m-12m-13m；2m-12m-14m；2m-12m-15m；2m-13m-14m；2m-13m-15m；2m-14m-15m；3m-4m-5m；3m-4m-6m；3m-4m-7m；3m-4m-8m；3m-4m-9m；3m-4m-10m；3m-4m-11m；3m-4m-12m；3m-4m-13m；3m-4m-14m；3m-4m-15m；3m-5m-6m；3m-5m-7m；3m-5m-8m；3m-5m-9m；3m-5m-10m；3m-5m-11m；3m-5m-12m；3m-5m-13m；3m-5m-14m；3m-5m-15m；3m-6m-7m；3m-6m-8m；3m-6m-9m；3m-6m-10m；3m-6m-11m；3m-6m-12m；3m-6m-13m；3m-6m-14m；3m-6m-15m；3m-7m-8m；3m-7m-9m；3m-7m-10m；3m-7m-11m；3m-7m-12m；3m-7m-13m；3m-7m-14m；3m-7m-15m；3m-8m-9m；3m-8m-10m；3m-8m-11m；3m-8m-12m；3m-8m-13m；3m-8m-14m；3m-8m-15m；3m-9m-10m；3m-9m-11m；3m-9m-12m；3m-9m-13m；3m-9m-14m；3m-9m-15m；3m-10m-11m；3m-10m-12m；3m-10m-13m；3m-10m-14m；3m-10m-15m；3m-11m-12m；3m-11m-13m；3m-11m-14m；3m-11m-15m；3m-12m-13m；3m-12m-14m；3m-12m-15m；3m-13m-14m；3m-13m-15m；3m-14m-15m；4m-5m-6m；4m-5m-7m；4m-5m-8m；4m-5m-9m；4m-5m-10m；4m-5m-11m；4m-5m-12m；4m-5m-13m；4m-5m-14m；4m-5m-15m；4m-6m-7m；4m-6m-8m；4m-6m-9m；4m-6m-10m；4m-6m-11m；4m-6m-12m；4m-6m-13m；4m-6m-14m；4m-6m-15m；4m-7m-8m；4m-7m-9m；4m-7m-10m；4m-7m-11m；4m-7m-12m；4m-7m-13m；4m-7m-14m；4m-7m-15m；4m-8m-9m；4m-8m-10m；4m-8m-11m；4m-8m-12m；4m-8m-13m；4m-8m-14m；4m-8m-15m；4m-9m-10m；4m-9m-11m；4m-9m-12m；4m-9m-13m；4m-9m-14m；4m-9m-15m；4m-10m-11m；4m-10m-12m；4m-10m-13m；4m-10m-14m；4m-10m-15m；4m-11m-12m；4m-11m-13m；4m-11m-14m；4m-11m-15m；4m-12m-13m；4m-12m-14m；4m-12m-15m；4m-13m-14m；4m-13m-15m；4m-14m-15m；5m-6m-7m；5m-6m-8m；5m-6m-9m；5m-6m-10m；5m-6m-11m；5m-6m-12m；5m-6m-13m；5m-6m-14m；5m-6m-15m；5m-7m-8m；5m-7m-9m；5m-7m-10m；5m-7m-11m；5m-7m-12m；5m-7m-13m；5m-7m-14m；5m-7m-15m；5m-8m-9m；5m-8m-10m；5m-8m-11m；5m-8m-12m；5m-8m-13m；5m-8m-14m；5m-8m-15m；5m-9m-10m；5m-9m-11m；5m-9m-12m；5m-9m-13m；5m-9m-14m；5m-9m-15m；5m-10m-11m；5m-10m-12m；5m-10m-13m；5m-10m-14m；5m-10m-15m；5m-11m-12m；5m-11m-13m；5m-11m-14m；5m-11m-15m；5m-12m-13m；5m-12m-14m；5m-12m-15m；5m-13m-14m；5m-13m-15m；5m-14m-15m；6m-7m-8m；6m-7m-9m；6m-7m-10m；6m-7m-11m；6m-7m-12m；6m-7m-13m；6m-7m-14m；6m-7m-15m；6m-8m-9m；6m-8m-10m；6m-8m-11m；6m-8m-12m；6m-8m-13m；6m-8m-14m；6m-8m-15m；6m-9m-10m；6m-9m-11m；6m-9m-12m；6m-9m-13m；6m-9m-14m；6m-9m-15m；6m-10m-11m；6m-10m-12m；6m-10m-13m；6m-10m-14m；6m-10m-15m；6m-11m-12m；6m-11m-13m；6m-11m-14m；6m-11m-15m；6m-12m-13m；6m-12m-14m；6m-12m-15m；6m-13m-14m；6m-13m-15m；6m-14m-15m；7m-8m-9m；7m-8m-10m；7m-8m-11m；7m-8m-12m；7m-8m-13m；7m-8m-14m；7m-8m-15m；7m-9m-10m；7m-9m-11m；7m-9m-12m；7m-9m-13m；7m-9m-14m；7m-9m-15m；7m-10m-11m；7m-10m-12m；7m-10m-13m；7m-10m-14m；7m-10m-15m；7m-11m-12m；7m-11m-13m；7m-11m-14m；7m-11m-15m；7m-12m-13m；7m-12m-14m；7m-12m-15m；7m-13m-14m；7m-13m-15m；7m-14m-15m；8m-9m-10m；8m-9m-11m；8m-9m-12m；8m-9m-13m；8m-9m-14m；8m-9m-15m；8m-10m-11m；8m-10m-12m；8m-10m-13m；8m-10m-14m；8m-10m-15m；8m-11m-12m；8m-11m-13m；8m-11m-14m；8m-11m-15m；8m-12m-13m；8m-12m-14m；8m-12m-15m；8m-13m-14m；8m-13m-15m；8m-14m-15m；9m-10m-11m；9m-10m-12m；9m-10m-13m；9m-10m-14m；9m-10m-15m；9m-11m-12m；9m-11m-13m；9m-11m-14m；9m-11m-15m；9m-12m-13m；9m-12m-14m；9m-12m-15m；9m-13m-14m；9m-13m-15m；9m-14m-15m；10m-11m-12m；10m-11m-13m；10m-11m-14m；10m-11m-15m；10m-12m-13m；10m-12m-14m；10m-12m-15m；10m-13m-14m；10m-13m-15m；10m-14m-15m；11m-12m-13m；11m-12m-14m；11m-12m-15m；11m-13m-14m；11m-13m-15m；11m-14m-15m；12m-13m-14m；12m-13m-15m；12m-14m-15m；及13m-14m-15m。

實(shí)施例4.

本實(shí)施例描述一種建立個(gè)別hbvsirna分子的免疫刺激概況的方法。

自健康成年志愿者收集人全血于個(gè)別含肝素真空容器中。將血液收集管倒置8次以防止凝結(jié)且與無菌生理鹽水1:1混合，隨后將180微升(μl)此混合物接種于96孔透明聚苯乙烯組織培養(yǎng)板。同時(shí)，使用pbs作為稀釋劑來制備各經(jīng)lnp配制的sirna分子的10x溶液。二十微升各10x經(jīng)lnp配制的sirna添加至含180μl血液:生理鹽水的孔中以產(chǎn)生600nm的最終sirna濃度。對(duì)于各供體，在三個(gè)重復(fù)孔中測(cè)試各sirna分子。在37℃/5％co2下將經(jīng)分離的人血液與個(gè)別sirna分子一起培育24小時(shí)。培育后，通過使培育板以1200rpm自旋20分鐘來收集血漿。自各孔收集至少125μl血漿且轉(zhuǎn)移至無菌96孔板中并且用透明乙酸酯板密封件密封。

經(jīng)由luminex測(cè)定法(luminexcorp，austintx，usa)，通過定量人干擾素α2(ifnα2)、白介素1受體拮抗劑(il-1ra)、白介素6(il-6)及單核細(xì)胞趨化因子蛋白-1(mcp-1)與跟單獨(dú)pbs一起培育的人全血相比的相對(duì)誘導(dǎo)水平來產(chǎn)生各sirna分子的免疫刺激概況。在luminex200系統(tǒng)上俘獲數(shù)據(jù)且使用xponent3.1.871.0軟件使用相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)曲線的邏輯5參數(shù)加權(quán)擬合進(jìn)行內(nèi)插。匯集人全血三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)且在技術(shù)復(fù)制物中加以測(cè)定。表1中的數(shù)據(jù)為經(jīng)pbs處理的得自十二名供體的血液的變化倍數(shù)平均值。對(duì)于此實(shí)驗(yàn)，使用未經(jīng)化學(xué)修飾的sirna(s鏈序列5'-3'：gaaggccagacgcgaauuatt；seqidno:31)作為陽(yáng)性對(duì)照，對(duì)于所指示的細(xì)胞因子，相對(duì)于經(jīng)pbs處理的血液產(chǎn)生以下倍數(shù)增加：25.1(ifnα2)；14.3(il-1ra)；1,226.5(il-6)；及51.6(mcp-1)。

實(shí)施例5.

作為評(píng)估hbvsirna的有義(s)鏈?zhǔn)欠衲軌蛞餽nai基因調(diào)低的手段，構(gòu)建基于熒光素酶的報(bào)告質(zhì)粒以充當(dāng)s鏈沉默的傳感器。s鏈沉默的潛在含義包括對(duì)與本文中所描述的hbvsirna的s鏈具有互補(bǔ)性的內(nèi)源性基因的不希望或不合需要的“脫靶”效應(yīng)。理想sirna將不顯示s鏈基因沉默能力。

為了構(gòu)建s鏈感測(cè)報(bào)告質(zhì)粒，將實(shí)施例1中所描述的hbv靶片段克隆于psi-check2質(zhì)粒載體的逆補(bǔ)體方向，介于海腎熒光素酶終止密碼子與聚腺苷酸化信號(hào)之間。名為“psi-hbvbackward”的所得質(zhì)粒轉(zhuǎn)錄僅允許由s鏈而非反義鏈實(shí)現(xiàn)rnai沉默的海腎熒光素酶-hbvmrna。值得注意的是，因?yàn)楫?dāng)靶mrna與所述sirna鏈之間存在完美互補(bǔ)性時(shí)rnai基因沉默效應(yīng)最穩(wěn)定，所以這個(gè)報(bào)告基因設(shè)計(jì)提供觀測(cè)s鏈的任何沉默能力的最可能時(shí)機(jī)。預(yù)期部分互補(bǔ)性將僅產(chǎn)生較弱或不產(chǎn)生基因沉默。無所注內(nèi)源性人mrna與表a中所列出的sirna的s鏈完全互補(bǔ)。

通過在雙熒光素酶報(bào)告基因(dlr)測(cè)定系統(tǒng)(promega，madison，wi，usa)中測(cè)量海腎熒光素酶(rluc)活性相對(duì)于螢火蟲熒光素酶(fluc)活性的降低來測(cè)試hbvsirna的基因沉默活性。在逆轉(zhuǎn)染程序中將cos-7細(xì)胞用于96孔板。各孔含有25,000個(gè)細(xì)胞及40ng質(zhì)粒加所指示濃度的與lipofectamine2000復(fù)合的sirna。在37℃/5％co2下培育24小時(shí)之后，移除培養(yǎng)基且處理細(xì)胞以便進(jìn)行熒光測(cè)量。自dualreporter試劑盒中，將50ul被動(dòng)溶解緩沖液(1×濃縮)添加至各孔，避光保存，且在100rpm下振蕩30min。通過熒光檢測(cè)來評(píng)估溶解產(chǎn)物中兩種熒光素酶的表達(dá)。計(jì)算rluc/fluc比且相對(duì)于僅經(jīng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞(“陰性對(duì)照”)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

所報(bào)告的數(shù)據(jù)為一式三份轉(zhuǎn)染孔的平均值(表2)。％rluc/fluc相對(duì)于陰性對(duì)照值100將指示無基因沉默。

表2

在與實(shí)驗(yàn)樣品相同的劑量下直接靶向海腎熒光素酶基因的陽(yáng)性對(duì)照sirna分別產(chǎn)生16.1、37.3及91.1的平均％rluc/fluc相對(duì)于陰性對(duì)照值。

使用本實(shí)施例中所披露的細(xì)胞類型、轉(zhuǎn)染方法及劑量水平，所指示的sirna的中靶基因沉默(即，采用“psi-hbv”報(bào)告基因質(zhì)粒)產(chǎn)生以下％rluc/fluc相對(duì)于陰性對(duì)照值，表明這些sirna的中靶沉默在這種細(xì)胞類型及轉(zhuǎn)染條件下確實(shí)起作用：

3m：在劑量水平50、5及1ng/ml下分別為9.7、18.2、54.7；及

12m：在劑量水平50、5及1ng/ml下分別為11:2、24.9、59.5。

總而言之，這些結(jié)果指示本文中所描述的hbvsirna的s鏈不顯示明顯rnai基因沉默能力。因此，s鏈引發(fā)不需要的內(nèi)源性基因沉默的可能性較低或可忽略。