本發(fā)明涉及由碳水化合物給料(例如谷類)共同制備和分離真菌蛋白和乙醇。本發(fā)明還提供用于由碳水化合物給料共同制備真菌蛋白的發(fā)酵系統(tǒng)。

背景技術(shù)：

畜牧業(yè)滿足了對(duì)肉類和乳制品的快速增長(zhǎng)的消費(fèi)者導(dǎo)向的需求，并且使用大約70％的用于放牧和飼料作物生產(chǎn)的全部全球農(nóng)業(yè)用地。然而，增長(zhǎng)的人口和對(duì)肉類和乳制品的變化的飲食偏好將會(huì)對(duì)全球農(nóng)業(yè)用地產(chǎn)生增加的需求。

生物技術(shù)為以較低環(huán)境影響更高效率地制備的肉類替代品提供了一些可能性。明顯的實(shí)例是通過(guò)葡萄糖糖漿的需氧發(fā)酵制備的真菌蛋白(quorn)。其目前作為(相對(duì)昂貴的)健康素食替代物銷售。其較高的成本與精制原料(葡萄糖糖漿)的使用有關(guān)，并且高固定成本與專用適度產(chǎn)量的工廠的投資成本有關(guān)，并且能量成本與需氧發(fā)酵有關(guān)。

家畜飼料主要包含提供大多數(shù)碳水化合物的谷類(玉米、小麥)，連同為最佳營(yíng)養(yǎng)提高蛋白質(zhì)含量的蛋白質(zhì)增強(qiáng)物(主要來(lái)源豆粕)。大約40％的谷物用作家畜飼料。大豆的農(nóng)業(yè)產(chǎn)率通常明顯低于谷類。

從谷物原料發(fā)酵通常將碳水化合物轉(zhuǎn)化，剩下在蛋白質(zhì)中濃縮的干酒糟及其可溶物(distillerdriedgrainswithsolubles,ddgs)殘余物。其在家畜飼料中用作高蛋白質(zhì)組分，然而其較低的可消化性限制了其混合比。

全球生物乙醇產(chǎn)量超過(guò)6千萬(wàn)tepa，2個(gè)主要來(lái)源是谷類(尤其是轉(zhuǎn)化其產(chǎn)量的大約40％的美國(guó)玉米)和巴西甘蔗的發(fā)酵。來(lái)自谷類(玉米/小麥)的生物乙醇的經(jīng)濟(jì)(排除政府激勵(lì))和環(huán)境益處是微乎其微的。存在與關(guān)于陸地使用和能源安全的食物v燃料壓力有關(guān)的明顯的政治問(wèn)題。

us4447534描述了使用酵母制備乙醇的方法，其中生長(zhǎng)條件的控制可以增加酵母和因此的衍生自酵母的單細(xì)胞蛋白質(zhì)的收率。

silva等人(wastemanagement,31(2011),108-114)描述了借助酵母菌如釀酒酵母(saccharomycescerevisiae)和近平滑假絲酵母(candidaparapsilosis)使用酒精生產(chǎn)的殘余物和用于蛋白質(zhì)生產(chǎn)的生物乙醇的方法。單細(xì)胞蛋白形式酵母可用作用于動(dòng)物飼料的補(bǔ)充蛋白質(zhì)的來(lái)源。

wo2009/079183描述了用于改善在谷粒發(fā)酵制備酒精之后殘留的飼料廢料產(chǎn)物的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的方法?？梢杂媚軌?qū)⒗w維素和/或半纖維素分解為一種或多種糖類并且進(jìn)而使用一種或多種糖增殖的微生物將廢料產(chǎn)物發(fā)酵。因?yàn)槲⑸锖械鞍踪|(zhì)，它們的增殖用于增加廢料產(chǎn)物的蛋白質(zhì)含量。雖然描述了包括細(xì)菌、酵母菌和真菌在內(nèi)的各種微生物，但是不存在在廢料產(chǎn)物的分離中提供任何單細(xì)胞蛋白的教導(dǎo)。

將會(huì)理想的是能夠提供一種系統(tǒng)，其可以被調(diào)整為能夠在其他材料的分離中制備真菌蛋白和乙醇二者，同時(shí)任選能夠基于所需要求如普遍的經(jīng)濟(jì)和/或社會(huì)經(jīng)濟(jì)擔(dān)憂而改變每種副產(chǎn)物的量。

提供用于分離的真菌蛋白和/或乙醇的制備、任選共同制備的方法在本發(fā)明的目的之內(nèi)。

發(fā)明概述

在第一方面中，提供一種能夠由碳水化合物給料制備和分離來(lái)源于絲狀真菌的真菌蛋白和乙醇的綜合系統(tǒng)。

碳水化合物給料可以是混合的或單一的給料。

將根據(jù)以上理解的是，可以交換真菌蛋白和乙醇制備的順序，以使得可以在真菌蛋白之前制備乙醇，并且反之亦然。然而，在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，首先制備真菌蛋白，接著制備乙醇。如上所述，本發(fā)明的方法和系統(tǒng)就可以制備的真菌蛋白或乙醇的量而言是綜合的和可控的。通過(guò)用于獲得真菌蛋白或乙醇的底物和生長(zhǎng)條件(尤其是氧含量)的控制，可以以可控方式改變所制備的真菌蛋白或乙醇的量。因此，例如，取決于普遍的商業(yè)要求，可以改變根據(jù)本發(fā)明制備的真菌蛋白與乙醇的比率。這可以手動(dòng)、半自動(dòng)或完全自動(dòng)實(shí)現(xiàn)。例如，在自動(dòng)或半自動(dòng)過(guò)程中，用戶可以向用戶可編程接口中指出或輸入例如所需的真菌蛋白與乙醇的比率，并且之后系統(tǒng)可以控制底物通量和生長(zhǎng)條件，從而實(shí)現(xiàn)所需的真菌蛋白與乙醇的比率。

如在本文中所提及的真菌蛋白應(yīng)被理解為由絲狀真菌如包括fusariumvenenatum的鐮刀菌屬(fusarium)物種具體制備的單細(xì)胞蛋白的形式。

單一給料可以包含多種可代謝底物，通常為一種或多種含有碳水化合物的底物。優(yōu)選地，給料包含一種或多種谷物材料。本發(fā)明的系統(tǒng)可以與可能需要為真菌蛋白制備過(guò)程和乙醇制備過(guò)程提供的單獨(dú)的給料的非綜合系統(tǒng)相區(qū)別。

真菌蛋白可以通過(guò)底物材料的需氧消化獲得。乙醇可以通過(guò)底物材料的厭氧發(fā)酵制備，盡管任選地，可以在厭氧消化期間存在需氧消化的初期階段從而允許能夠生成乙醇的一種或多種微生物的生長(zhǎng)。

在一個(gè)實(shí)施方案中，用于在制備真菌蛋白和乙醇中使用的一種或多種微生物是不同的。在這樣的實(shí)施方案中，能夠制備真菌蛋白的一種或多種微生物是鐮刀菌屬物種，如fusariumvenenatum并且能夠制備乙醇的一種或多種微生物是酵母菌屬物種，如釀酒酵母(saccharomycescerevisiae)。發(fā)明人已經(jīng)觀察到，對(duì)于單一類型的微生物來(lái)說(shuō)，可以能夠制備真菌蛋白和之后的乙醇二者。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的綜合方法采用單一類型的微生物以制備真菌蛋白和乙醇二者。這樣的單一類型的微生物可以是鐮刀菌屬物種如f.venenatum或多個(gè)物種。

在另一個(gè)方面中，提供一種用于由谷物材料共同制備真菌蛋白和乙醇的綜合方法，所述方法包括下列步驟：

a)提供包含一種或多種谷物材料的含水的可發(fā)酵培養(yǎng)液；

b)用微生物使所述含水的可發(fā)酵培養(yǎng)液的至少一部分發(fā)酵，從而分別獲得真菌蛋白或乙醇并且獲得部分發(fā)酵的培養(yǎng)液；

c)將真菌蛋白或乙醇與所述部分發(fā)酵的培養(yǎng)液分開/分離；

d)用微生物使所述部分發(fā)酵的培養(yǎng)液的至少一部分任選地與未發(fā)酵的含水的可發(fā)酵培養(yǎng)液的一部分一起發(fā)酵，從而分別獲得乙醇或真菌蛋白并且獲得廢發(fā)酵殘余物；和

e)將乙醇或真菌蛋白與所述廢發(fā)酵殘余物分離。

所述部分發(fā)酵的培養(yǎng)液可以來(lái)源于已經(jīng)經(jīng)歷了初期發(fā)酵的初期發(fā)酵培養(yǎng)液從而制備真菌蛋白或乙醇。部分發(fā)酵的培養(yǎng)液能夠被發(fā)酵從而制備第二產(chǎn)物，即乙醇或真菌蛋白，這取決于已經(jīng)首先制備了什么。

將會(huì)根據(jù)以上理解的是，可以交換真菌蛋白和乙醇制備的順序，以使得可以在真菌蛋白之前制備乙醇，并且反之亦然。然而，在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，首先制備真菌蛋白，接著制備乙醇。

本發(fā)明的方法可以以分批、連續(xù)或半連續(xù)方式進(jìn)行。

所述方法還可以包括將廢發(fā)酵殘余物(也被稱為酒糟(stillage))分開以獲得濕固體級(jí)分和可溶性級(jí)分的步驟?？梢詫⒖扇苄约?jí)分濃縮并且可以將所得漿液與濕固體級(jí)分合并，可以將其干燥從而獲得被稱為干酒糟及其可溶物(drieddistillersgrainswithsolubles，ddgs)的物質(zhì)。

通常，所述一種或多種谷物材料可以包括小麥、玉米、大麥、水稻、高粱、薺麥、燕麥、黑麥等。谷物可以是食品級(jí)品質(zhì)的或者事實(shí)上可以是不再適用于人類消耗的物質(zhì)?？梢允褂们笆鰧?shí)例中的一種，或者可以在本發(fā)明中采用包含兩種以上類型的谷類的混合物。本發(fā)明并非意在限于可以采用的一種類型或多種類型的谷物，并且這可以僅取決于當(dāng)時(shí)的普遍的經(jīng)濟(jì)因素和/或地理因素和因此的可得性因素。

可以對(duì)一種或多種谷物材料進(jìn)行碾磨、研磨和/或切割處理，從而將谷物材料分解為較小片段并且還可以釋放可以存在于谷物中的蛋白質(zhì)、糖類和其他材料中的一些?？梢詫⒎纸獾牟牧吓c水混合至例如170-500比50g/l的濃度，并且按需要調(diào)節(jié)ph，從而提供發(fā)酵培養(yǎng)液。

可以通過(guò)采用凝膠化、液化和/或糖化中的一種或多種對(duì)可以存在于發(fā)酵培養(yǎng)液中的任何淀粉進(jìn)行水解或部分水解。發(fā)現(xiàn)淀粉在自然界中是耐酶分解的不溶性、不可分散顆粒。凝膠化是淀粉顆粒在熱量和水的存在下的溶脹。此時(shí)，如果不加入α淀粉酶以將淀粉部分水解為糊精，淀粉或研磨的谷物漿料顯著增稠并且將會(huì)難以處理。含有糊精的溶液通常更多地是液體或液化的。α淀粉酶用于降低溶液的粘度并且還用于制備較低分子大小的底物。對(duì)于將糊精水解為葡萄糖的葡糖淀粉酶的有效作用來(lái)說(shuō)，較低分子大小的底物分子是所需的。

可以加入酶如α淀粉酶和葡糖淀粉酶，從而將存在的淀粉分解或水解。α淀粉酶是細(xì)菌的熱穩(wěn)定內(nèi)淀粉酶。其將淀粉分子中隨機(jī)位置的α-1,4鍵水解以迅速降低凝膠化淀粉溶液的粘度。這種酶是含金屬離子的蛋白質(zhì)并且在使用期間為了最大活性和穩(wěn)定性需要少量的鈣離子。所述酶不能水解α-1,6鍵，但是可以在支鏈淀粉繞過(guò)這些分支點(diǎn)。反應(yīng)的產(chǎn)物是糊精-短葡萄糖鏈，以及少量的葡萄糖和麥芽糖。

由真菌產(chǎn)生的葡糖淀粉酶是外淀粉酶。其從分子的非還原性末端開始水解麥芽糖和糊精。葡糖淀粉酶水解α-1,4和α-1,6鍵二者以將糊精完全降解為葡萄糖。酶在ph3.5-4.5活性最優(yōu)。通常，可以以固體物質(zhì)的0.25-1.5％w/w的濃度加入α淀粉酶，并且可以以固體物質(zhì)的0.25-3％w/w的濃度加入葡糖淀粉酶。在酶消化之后，可以對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)液進(jìn)行熱處理，從而破壞酶并且殺死可能存在并且可能干擾后續(xù)工藝步驟的任何細(xì)菌。

然而，酶的加入、ph的調(diào)節(jié)和所需的加熱和冷卻明顯地增加了成本并且因此可以是不合乎需要的。發(fā)明人已經(jīng)觀察到微生物如fusariumvenenatum(f.venenatum)可以進(jìn)行利用未水解谷物谷粒淀粉溶液的發(fā)酵。因?yàn)槌Ｒ?guī)的真菌蛋白制備通常需要葡萄糖作為起始碳源，意外的是，可以使用未經(jīng)過(guò)淀粉水解的材料制備真菌蛋白。當(dāng)在不必須進(jìn)行液化和/或糖化步驟的情況下進(jìn)行本發(fā)明的方法時(shí)，這可以導(dǎo)致大幅的成本節(jié)約。

使用絲狀真菌如f.venenatum進(jìn)行真菌蛋白制備以將可發(fā)酵培養(yǎng)液內(nèi)的材料發(fā)酵。如上所述的淀粉的水解可以或可以不在進(jìn)行發(fā)酵之前進(jìn)行?？梢詾榱擞行У恼婢鞍装l(fā)酵提供氮和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)如vogel鹽的適合的來(lái)源(補(bǔ)充有40g的葡萄糖的大約1l的vogel鹽)。其可以在發(fā)酵之前和/或期間加入。

可以理想的是在發(fā)酵期間包括消泡劑，從而使可能由于例如存在于發(fā)酵培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)而出現(xiàn)的任何發(fā)泡最小化。例如，可以以高達(dá)1％(v/v)的濃度加入油菜籽油。其不僅可以充當(dāng)消泡劑，而且油菜籽油還可以用作碳源并且因此可以被發(fā)酵?？梢詢H需在發(fā)酵的開始加入消泡劑，如油菜籽油。

作為需氧發(fā)酵過(guò)程，真菌蛋白的制備需要加入作為空氣或氧的氧源。連同對(duì)其他發(fā)酵條件的控制，曝氣的程度將會(huì)影響碳水化合物向真菌蛋白和乙醇的相對(duì)轉(zhuǎn)化并且可以用于影響轉(zhuǎn)化率。制備兩種產(chǎn)物(真菌蛋白和乙醇)的綜合方法允許在真菌蛋白發(fā)酵期間不需要使乙醇(其在常規(guī)真菌蛋白發(fā)酵中將會(huì)是廢料副產(chǎn)物)最小化的運(yùn)行條件?？梢砸赃B續(xù)或分階段操作的方式選擇性地改變有利于真菌蛋白/乙醇制備的條件。理想地，可以將運(yùn)行條件分階段以匹配更加能量密集的向真菌蛋白的需氧發(fā)酵的程度，并且能量供應(yīng)分階段以匹配可再生能量可得性的每天能量循環(huán)。

真菌蛋白和/或乙醇發(fā)酵可以作為分批、半連續(xù)、或連續(xù)過(guò)程進(jìn)行。連續(xù)過(guò)程可以提供在維持最佳穩(wěn)態(tài)控制條件和與連續(xù)分離過(guò)程連接的能力方面的優(yōu)點(diǎn)。一旦完成，可以對(duì)真菌蛋白和廢發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行熱處理，從而移除/破壞可能存在的核酸，如rna。例如，之后可以將真菌蛋白與廢發(fā)酵培養(yǎng)基分開/分離，如通過(guò)離心或過(guò)濾，并且之后干燥。之后可以進(jìn)一步處理干燥的真菌蛋白材料，從而提供適合的食品級(jí)材料?？梢詫⒄婢鞍装l(fā)酵廢液(與分離的淀粉水解產(chǎn)物和/或分離的蛋白質(zhì)/纖維固體合并)進(jìn)一步發(fā)酵以用于乙醇制備?？梢允褂冕劸平湍?s.cerevisiae)從而將材料發(fā)酵并且制備乙醇。在finn等人(2006)中描述了典型的過(guò)程。

一旦已經(jīng)進(jìn)行發(fā)酵并且制備乙醇，則需要將乙醇與存在的其他材料分開/分離。這可以通過(guò)例如在(cardonaandsanchez,2007)中描述的連續(xù)蒸餾過(guò)程實(shí)現(xiàn)。這為乙醇提供了高純度，例如其可以通過(guò)經(jīng)過(guò)分子篩而進(jìn)一步純化，從而移除水并且將乙醇進(jìn)一步濃縮。

在蒸餾過(guò)程期間移除的不含乙醇的材料包括通常被稱為酒糟的固體和可溶性物質(zhì)。可以通過(guò)例如壓制或離心將這種固體和可溶性物質(zhì)分離，從而提供濕固體物質(zhì)和液體?？梢詫窆腆w物質(zhì)進(jìn)一步干燥并且可以將液體濃縮，從而提供漿液。可以單獨(dú)或組合使用干燥的固體和漿液，從而提供被稱為干酒糟及其可溶物(ddgs)的物質(zhì)。

可以看出，本發(fā)明提供了一種方法，其能夠?qū)⑤^低等級(jí)/價(jià)值的材料轉(zhuǎn)化為真菌蛋白(其可以用作人類食物來(lái)源)；乙醇(其可以用作生物燃料)；和廢料，如ddgs(其可以用作動(dòng)物飼料)。

詳細(xì)描述

現(xiàn)在將通過(guò)非限制性實(shí)例的方式和參照附圖進(jìn)一步描述本發(fā)明，所述附圖示出：

圖1示出了來(lái)自用于乙醇制備的現(xiàn)有方法的典型構(gòu)造的示意性流程圖；圖2至圖8示出了來(lái)自其中可以由谷粒原料共同制備真菌蛋白和乙醇的根據(jù)本發(fā)明的許多實(shí)例系統(tǒng)構(gòu)造的示意性流程圖。

圖1-用于乙醇制備的現(xiàn)有方法的典型構(gòu)造的流程圖。

圖2-用于使用兩種微生物的真菌蛋白和乙醇制備的共同制備方法的綜合構(gòu)造的流程圖。

圖3-用于使用兩種微生物的真菌蛋白和乙醇制備的共同制備方法的綜合構(gòu)造的另一個(gè)流程圖。

圖4-用于使用兩種微生物和不同原料的真菌蛋白和乙醇制備的共同制備方法的綜合構(gòu)造的另一個(gè)流程圖。

圖5-用于使用單一微生物(需氧發(fā)酵，之后厭氧發(fā)酵)的真菌蛋白和乙醇制備的共同制備方法的可能的綜合構(gòu)造的流程圖。

圖6-用于使用單一微生物(厭氧發(fā)酵，之后需氧發(fā)酵)的真菌蛋白和乙醇制備的共同制備方法的綜合構(gòu)造的流程圖。

圖7-用于使用單一微生物的真菌蛋白和乙醇制備的共同制備方法的綜合構(gòu)造的流程圖。

圖8-用于使用單一微生物(厭氧發(fā)酵，之后需氧發(fā)酵)的真菌蛋白和乙醇制備的共同制備方法的綜合構(gòu)造的流程圖。

圖9-f.venenatum在最低vogel培養(yǎng)基(燒瓶1-3)和補(bǔ)充有vogel鹽的小麥水解產(chǎn)物(燒瓶4-6)中的生長(zhǎng)的比較。將在30℃和150rpm下在定軌搖床上溫育。一式三份進(jìn)行實(shí)驗(yàn)并且估算生物質(zhì)。在72h之后選取樣品(實(shí)驗(yàn)1)。

圖10-利用補(bǔ)充有vogel鹽的小麥水解產(chǎn)物的f.venenatum(vw＝1.5-l)的分批發(fā)酵。示出了在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中干燥生物質(zhì)(●)、葡萄糖(▲)和乙醇(×)趨勢(shì)(實(shí)驗(yàn)1)。

圖11-在不具有酶(●)、具有0.5％w/wα淀粉酶(δ)和具有0.5％w/wα淀粉酶和1％w/w葡糖淀粉酶二者(□)的情況下在定軌搖床上在28℃和150rpm下的搖瓶中生長(zhǎng)的f.venenatum在70g/l含有面粉的水解產(chǎn)物中的生長(zhǎng)。在24、48和72小時(shí)之后選取樣品并且一式三份分析生物質(zhì)含量(實(shí)驗(yàn)1)。

圖12-具有mypg和補(bǔ)充有vogel鹽的小麥水解產(chǎn)物的釀酒酵母搖瓶的光密度(od)和干細(xì)胞重量。將燒瓶在30℃和250rpm下溫育并且所有均含有20g/l葡萄糖作為碳源。使它們生長(zhǎng)并且一式三份分析(實(shí)驗(yàn)2)。

圖13-分別使用mypg和小麥水解產(chǎn)物的借助釀酒酵母的乙醇發(fā)酵。描繪了在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中的光學(xué)密度。在發(fā)酵罐1(●)和發(fā)酵罐2(○)中使用mypg，而在發(fā)酵罐3(□)和發(fā)酵罐4(δ)中使用補(bǔ)充有vogel鹽的小麥水解產(chǎn)物。在8-18h之間曝氣為0.82vvm，否則為0vvm。將溫度維持恒定在30℃并且ph在5.5(實(shí)驗(yàn)2)。

圖14-分別使用mypg和小麥水解產(chǎn)物的借助釀酒酵母的乙醇發(fā)酵。示出了在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中的干燥生物質(zhì)增加。在發(fā)酵罐1(●)和發(fā)酵罐2(○)中使用mypg，而在發(fā)酵罐3(□)和發(fā)酵罐4(δ)中使用補(bǔ)充有vogel鹽的小麥水解產(chǎn)物。在8-18h之間曝氣為0.82vvm，否則為0vvm。將溫度維持恒定在30℃并且ph在5.5(實(shí)驗(yàn)2)。

圖15-使用f.venenatum的綜合方法的第一發(fā)酵的干細(xì)胞重量(dcw)和葡萄糖趨勢(shì)(實(shí)驗(yàn)3)。

圖16-使用釀酒酵母的綜合生物方法的第二部分的干細(xì)胞重量(dcw)、葡萄糖和乙醇趨勢(shì)。

圖17-使用不同曝氣曲線的fusariumvenenatum發(fā)酵的干細(xì)胞重量趨勢(shì)的比較(實(shí)驗(yàn)4)。

圖18-在整個(gè)fusariumvenenatum發(fā)酵過(guò)程中利用不同氧供給的乙醇制備(實(shí)驗(yàn)4)。

圖19-在整個(gè)f.venenatum發(fā)酵過(guò)程中利用不同發(fā)酵培養(yǎng)基和不同氧供給的葡萄糖濃度的趨勢(shì)(實(shí)驗(yàn)4)。

圖20-在f.venenatum發(fā)酵的時(shí)間進(jìn)程期間的溶解氧(do,％)曲線(實(shí)驗(yàn)4)。

將使用以下要點(diǎn)從而解釋各種組分和在圖1-8中例示出的方法中進(jìn)行的步驟：

谷粒碾磨物理分解谷粒以實(shí)現(xiàn)在下游處理中的淀粉提??；

液化是從谷粒中提取并且水解淀粉以獲得適用于物理處理和發(fā)酵的水溶性碳水化合物的過(guò)程。通常使用酶，將谷粒與水混合并且加熱。加熱過(guò)程使用于發(fā)酵的溶液進(jìn)一步滅菌；

通過(guò)傾析、過(guò)濾或離心進(jìn)行固體蛋白質(zhì)和纖維的分離以提供適用于真菌蛋白發(fā)酵的可溶性碳水化合物溶液。該步驟在常規(guī)乙醇生物精制中不是必需的，因?yàn)榭梢詮臐{料中蒸餾發(fā)酵產(chǎn)物乙醇；

需氧發(fā)酵提供真菌蛋白的發(fā)酵生長(zhǎng)。該操作可以以分批或連續(xù)方式進(jìn)行。在受控條件下冷卻的情況下將氮源(例如氨)、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和空氣/氧供給至發(fā)酵罐以促進(jìn)真菌蛋白生長(zhǎng)。通過(guò)經(jīng)由過(guò)程變量如底物通量或/和氧水平操控生理?xiàng)l件，可以控制條件以優(yōu)化真菌蛋白生長(zhǎng)速率/選擇性或者實(shí)現(xiàn)真菌蛋白與乙醇的優(yōu)選比率；

真菌蛋白發(fā)酵釀造的熱處理和分離提供分離的(通過(guò)過(guò)濾或離心)和干燥的固體主體真菌蛋白產(chǎn)物。進(jìn)行混合物的熱處理以降低產(chǎn)物的核酸(rna)含量；

進(jìn)行厭氧發(fā)酵以將殘留的碳水化合物轉(zhuǎn)化為乙醇。這可以使用真菌蛋白和常規(guī)的釀酒的酵母(例如，釀酒酵母(s.cerevisiae))之一或二者進(jìn)行；

蒸餾用于將乙醇與發(fā)酵混合物分離；

干燥從蒸餾的乙醇中移除殘留的水以滿足生物乙醇燃料的要求。這常規(guī)上使用分子篩進(jìn)行；

固體蛋白質(zhì)/纖維與谷粒的分離產(chǎn)生通常用作家畜飼料的高蛋白產(chǎn)物。當(dāng)連同結(jié)合了發(fā)酵混合物的可溶性組分的來(lái)自蒸餾的蒸發(fā)的殘余物一起分離和干燥時(shí)，其通常被稱為干酒糟及其可溶物(ddgs)。

示出了用于單獨(dú)制備生物乙醇的本領(lǐng)域中已知的代表性過(guò)程。在該過(guò)程中，僅描述了用于生物乙醇的制備的厭氧過(guò)程。

如可以從-8中例示出的各種過(guò)程中看到的，本發(fā)明提供其中移除不溶性物質(zhì)如蛋白質(zhì)和纖維的分離階段，從而提供適用于后續(xù)發(fā)酵的包含溶解的碳水化合物的溶液。

在圖2-8中描繪的各種實(shí)施方案中，提供一種綜合方法，其可以制備乙醇和真菌蛋白二者，以及可以用作動(dòng)物飼料產(chǎn)品的廢料，干酒糟及其可溶物(ddgs)。

實(shí)施例部分：

實(shí)驗(yàn)過(guò)程

1.1微生物和培養(yǎng)條件

在真菌蛋白(和乙醇)發(fā)酵中使用的微生物是從atcc購(gòu)買的絲狀真菌f.venenatuma3/5(20334)。主培養(yǎng)物通過(guò)接種含有來(lái)自馬鈴薯葡萄糖瓊脂(pda)板的具有40g/l葡萄糖的最低vogel培養(yǎng)基的液體培養(yǎng)物而制備。它們?cè)诙ㄜ墦u床上在150rpm和28℃下溫育72h，之后將20％甘油加入至培養(yǎng)物中并且將它們?cè)?80℃儲(chǔ)存在低溫小藥瓶中。此外，將pda板在溫育器中在30℃和0％co2下生長(zhǎng)并且之后在4℃儲(chǔ)存。

為了乙醇發(fā)酵，還使用酵母釀酒酵母(由斯特拉斯克萊德藥學(xué)和生物醫(yī)學(xué)科學(xué)研究所的培養(yǎng)物保藏中心提供)。其在含有下列各項(xiàng)的1l的mypg培養(yǎng)基中生長(zhǎng)：3g麥芽提取物、3g酵母提取物、5g蛋白胨和10g葡萄糖，然而葡萄糖在高壓滅菌之后加入從而防止美拉德反應(yīng)(maillardreaction)。將ph調(diào)節(jié)為5.5并且使培養(yǎng)基凝固，加入15g/l瓊脂。將平板用接種環(huán)接種并且在溫育器中在30℃下溫育24h，并且之后在4℃儲(chǔ)存。通過(guò)接種液體培養(yǎng)物并且將其在定軌搖床上在30℃和250rpm下溫育24h，之后加入20％甘油并且在-80℃儲(chǔ)存在低溫小藥瓶中，制備主培養(yǎng)物。

1.2接種物制備

通過(guò)將來(lái)自-80℃細(xì)胞庫(kù)的解凍的小瓶接種至200ml試樣量的vogels培養(yǎng)基中來(lái)制備f.venenatum的接種物。將培養(yǎng)物在30度溫育二十四小時(shí)的時(shí)間段。將50ml試樣量的該培養(yǎng)物(提供10％v/v的接種物)移除并且轉(zhuǎn)移至離心管。將其以8000rpm離心10分鐘的時(shí)間段。將上清液移除并且加入等體積的無(wú)菌蒸餾水以使f.venenatum的粒料重懸。之后將其與之前一樣以8000rpm離心10分鐘的時(shí)間段。再次將上清液移除并且將fusariumvenentum粒料在20ml試樣量的無(wú)菌小麥培養(yǎng)基中重懸。該試樣量用于通過(guò)注射器隔膜端口將生物反應(yīng)器接種。

釀酒酵母接種物的制備遵循類似的方法。將來(lái)自細(xì)胞庫(kù)的小瓶解凍并且用于接種含有mypg培養(yǎng)基的200ml燒瓶。當(dāng)細(xì)胞密度已經(jīng)達(dá)到足夠的水平(大約1au的光密度)時(shí)，按照與對(duì)f.venenatum接種物所進(jìn)行的相同的操作，將50ml試樣量的培養(yǎng)物離心，用蒸餾水洗滌，并且在小麥培養(yǎng)基中重懸。

1.3培養(yǎng)基制備

1.3.1確定成分培養(yǎng)基

根據(jù)vogel(1956)制備用于發(fā)酵和搖瓶的確定成分培養(yǎng)基。使用葡萄糖代替碳源蔗糖，并且使用40g/l而不是15g/l。

1l的培養(yǎng)基含有：2.17g檸檬酸三鈉、5g磷酸二氫鉀、2g硝酸銨、0.2g七水合硫酸鎂、0.1g二水合氯化鈣、0.25mg生物素和5ml微量元素溶液。

對(duì)于微量元素溶液來(lái)說(shuō)，將以下微量元素溶解于95ml蒸餾水中：5g一水合檸檬酸、5g七水合硫酸鋅、1g六水合硫酸鐵銨、0.25g五水合硫酸銅、0.05g一水合硫酸錳、0.05g硼酸和0.05g二水合鉬酸鈉。

1.3.2小麥水解產(chǎn)物(wh)

使用ika分析磨機(jī)將小麥谷粒碾磨為面粉材料。將該面粉溶解在加熱至90℃的蒸餾水中，并且最終面粉濃度在70g/l的區(qū)域內(nèi)。一旦在溶液中，即將系統(tǒng)的ph調(diào)節(jié)為7，之后以所加入的小麥面粉的1％w/w的加載量加入α淀粉酶。將該溶液維持在90℃并且攪拌1小時(shí)的時(shí)間段。之后使溶液冷卻，同時(shí)仍然攪拌，直到達(dá)到在50℃的區(qū)域內(nèi)的溫度。之后使用1m鹽酸將溶液的ph調(diào)節(jié)為4.6-4.8。之后以相對(duì)于所加入的小麥面粉的量1％w/w的加載量再次加入葡糖淀粉酶。之后在振蕩溫育器中在50℃和100rpm下將該溶液溫育16小時(shí)的時(shí)間段。

之后將酶處理的培養(yǎng)基冷卻至室溫，轉(zhuǎn)移至離心管并且以6,000rpm離心10分鐘的時(shí)間段。使用buchner漏斗使上清液經(jīng)過(guò)0.2μm濾紙并且收集濾液用于發(fā)酵過(guò)程。之后再次將濾液高壓滅菌。參照panagiotopoulos等人(2009)、gadonna-widehem等人(2012)和由sigma提供的酶數(shù)據(jù)表，進(jìn)行淀粉水解的操作。

1.4生物質(zhì)估算

針對(duì)在發(fā)酵期間選取的樣品中的每一個(gè)估算f.venenatum和釀酒酵母的生物質(zhì)水平。

使用微纖維過(guò)濾器實(shí)現(xiàn)f.venenatum細(xì)胞重量估算。將玻璃微纖維過(guò)濾器編號(hào)并且記錄干燥過(guò)濾器的質(zhì)量。將過(guò)濾器放置在buchner漏斗中并且使1ml試樣量的發(fā)酵樣品經(jīng)過(guò)過(guò)濾器。對(duì)于每個(gè)樣品一式三份重復(fù)該過(guò)程。隨后將過(guò)濾器放置在佩特里培養(yǎng)皿(petridish)中并且在烘箱中在50℃下干燥24小時(shí)的時(shí)間段。之后將過(guò)濾器再次稱重，并且如果需要，再次干燥，直到觀察到穩(wěn)定讀數(shù)。通過(guò)減去之前記錄的空過(guò)濾器的重量來(lái)計(jì)算生物質(zhì)。因?yàn)橐皇饺葸M(jìn)行該過(guò)程，報(bào)告的值是三個(gè)記錄的重量的平均值。

使用eppendorf管進(jìn)行釀酒酵母干細(xì)胞重量估算。將eppendorf管在干燥器中干燥并且記錄干燥空管的重量。將1ml試樣量的發(fā)酵樣品移液至管中，并且之后以6000rpm離心10分鐘的時(shí)間段。將上清液移除并且將細(xì)胞沉淀干燥。將管再次稱重，直到觀察到穩(wěn)定讀數(shù)，并且減去空管的質(zhì)量以得到所存在的細(xì)胞的質(zhì)量。因?yàn)槭褂昧?ml試樣量的發(fā)酵樣品，提及在這里確定的值作為以g/ml表示的干細(xì)胞重量。再次一式三份分析所有樣品，并且所提及的值是三次重復(fù)的平均值。

1.5葡萄糖量化

使用ysi生物化學(xué)分析儀測(cè)量在每個(gè)樣品中存在的葡萄糖濃度。早期樣品需要應(yīng)用在x10區(qū)域內(nèi)的稀釋因數(shù)，從而將葡萄糖濃度降低至生物化學(xué)分析儀能夠重復(fù)量化的水平。在酵母菌屬發(fā)酵期間，可以直接分析稍后的樣品，而不需要進(jìn)行任何稀釋步驟。

1.6乙醇量化

使用高效液相色譜(hplc)法實(shí)現(xiàn)在樣品中的乙醇的量化。使用rezexroa-h⁺有機(jī)酸色譜柱和0.005n硫酸流動(dòng)相以1ml/分鐘的流量實(shí)現(xiàn)分離。借助折射率檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)。

1.7搖瓶培養(yǎng)

在含有200ml或40ml培養(yǎng)基(mypg或具有vogel鹽的小麥水解產(chǎn)物)的500ml或100ml錐形瓶中進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)物培養(yǎng)。在針對(duì)f.venenatum培養(yǎng)物設(shè)定為150rpm和28℃和針對(duì)釀酒酵母培養(yǎng)物設(shè)定為30℃和250rpm的垂直振動(dòng)器上將燒瓶溫育。

1.8生物反應(yīng)器分批培養(yǎng)

1.8.1f.venenatum分批培養(yǎng)

在下面描述的兩個(gè)不同發(fā)酵系統(tǒng)中進(jìn)行真菌蛋白分批發(fā)酵。發(fā)酵溫度是28℃并且用2m氫氧化鈉將ph控制為6。為了0％的o2值用不含氧的氮?dú)庑?zhǔn)do探針并且用壓縮空氣進(jìn)行斜率校準(zhǔn)。在發(fā)酵條件下進(jìn)行探針校準(zhǔn)。接種物，在垂直振動(dòng)器上在28℃和150rpm下生長(zhǎng)的72小時(shí)搖瓶培養(yǎng)物，占最終發(fā)酵體積的10％v/v。用于發(fā)酵的培養(yǎng)基是mediumn(vogel1956)或補(bǔ)充有vogel鹽的小麥水解產(chǎn)物。在使用小麥水解產(chǎn)物作為發(fā)酵培養(yǎng)基的情況中，無(wú)論何時(shí)需要，均使用油菜籽油作為消泡劑。

1.8.1.1applikon

該發(fā)酵系統(tǒng)的硼硅酸鹽容器具有2l的總?cè)萘坎⑶以?.5l的工作容量下以2:1的高度與直徑的比率進(jìn)行發(fā)酵。發(fā)酵罐配備有四個(gè)可移除擋板和兩個(gè)六刃rushton葉輪，由頂部applikonp100電動(dòng)機(jī)驅(qū)動(dòng)。通過(guò)經(jīng)由位于葉輪下方的環(huán)形噴頭噴射過(guò)濾空氣來(lái)釋放曝氣。用mettlertoledoph探針測(cè)量ph，并且為了確定溶解氧，使用mettlertoledodo探針。使用applikon加熱套管加熱發(fā)酵罐。系統(tǒng)還配備有溫度探針和冷凝器以防止蒸發(fā)。將applikonbio-consoleadi1035單元與applikonbio-controladi1031控制單元組合使用以控制參數(shù)。與該發(fā)酵系統(tǒng)一起使用的攪拌是600rpm。

1.8.2乙醇發(fā)酵

在以下詳細(xì)描述的兩個(gè)不同發(fā)酵系統(tǒng)中進(jìn)行乙醇發(fā)酵。所使用的攪拌是500rpm并且將溫度控制在30℃。在發(fā)酵條件下進(jìn)行po2探針校準(zhǔn)。通過(guò)用不含氧的氮?dú)馄貧鈦?lái)設(shè)定0％的o2值并且用壓縮空氣校準(zhǔn)探針的斜率。用2m硫酸和25％v/v氨將ph控制為5.5的值。在8和18小時(shí)的發(fā)酵時(shí)間之間，僅以0.82vvm將發(fā)酵培養(yǎng)基曝氣。接種物，24小時(shí)搖瓶培養(yǎng)物(30℃，250rpm)，占最終發(fā)酵體積的5％v/v。為了在發(fā)酵期間控制發(fā)泡，根據(jù)需要加入ppg。

1.8.2.1具有dcu3(b.braunbiotech)的biostatc(c15-3)

不銹鋼發(fā)酵罐具有22l的總?cè)萘亢驮试S加熱或冷卻發(fā)酵罐的雙壁。其是側(cè)壁觀察窗口并且配備有四個(gè)擋板以及在環(huán)形噴頭上方的三個(gè)六刃rushton葉輪。po2探針以及ph探針來(lái)自mettlertoledo。高度與直徑的比率是3:1，其中直徑為21cm并且高度為57cm。dcu-3單元允許對(duì)發(fā)酵進(jìn)行控制和監(jiān)測(cè)。在酸和堿泵的幫助下控制ph。此外，系統(tǒng)配備有根據(jù)需

要使用的消泡泵。

1.8.2.2dasgip(eppendorf)

發(fā)酵系統(tǒng)允許進(jìn)行四個(gè)平行發(fā)酵，其可以被獨(dú)立地控制。平底發(fā)酵罐容器具有9cm的直徑和24cm的高度，其等于3:1的高度與直徑的比率。容器具有400-1500ml的工作容量。頂部驅(qū)動(dòng)器攪動(dòng)兩個(gè)六刃rushton葉輪。通過(guò)將空氣經(jīng)由l噴頭泵送通過(guò)無(wú)菌過(guò)濾器實(shí)現(xiàn)曝氣。系統(tǒng)完全配備有加熱容器的主單元、酸和堿泵、ph和po2檢測(cè)單元、溫度檢測(cè)器、尾氣分析、和攪拌控制。

結(jié)果

1.9小麥培養(yǎng)基

按照所概述的操作(1.3)得到用于該發(fā)酵的小麥培養(yǎng)基。這種特別的培養(yǎng)基制備使用溶解于2l蒸餾水中的具有146g小麥面粉的加載量的“rcs”鑒定的批次的小麥。在該過(guò)程中使用1.46g的α淀粉酶和1.5g的葡糖淀粉酶的酶加載量。

在表1中列出了在培養(yǎng)基制備中的各種階段使用ysi生物化學(xué)分析儀測(cè)量的葡萄糖濃度。

表1-在小麥培養(yǎng)基的酶處理期間的各種階段的葡萄糖濃度。

進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)以支持本發(fā)明。

表2-支持本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)。

1.10實(shí)驗(yàn)1

1.10.1目標(biāo)&目的

這個(gè)實(shí)驗(yàn)的目的是研究使用于使用碳水化合物給料(小麥水解產(chǎn)物)的真菌蛋白制備的f.venenatum生長(zhǎng)的可行性。

1.10.2實(shí)驗(yàn)條件

首先在小麥水解產(chǎn)物中并且之后在葡萄糖中(兩種培養(yǎng)基均補(bǔ)充有vogel鹽)使f.venenatum的搖瓶培養(yǎng)物生長(zhǎng)以比較在兩種不同培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線。一式三份完成并且分析搖瓶。在72小時(shí)之后選取樣品并且分析生物質(zhì)和葡萄糖含量(9)。

用于真菌蛋白發(fā)酵的發(fā)酵設(shè)置是：以1slpm曝氣并且將攪拌器速度設(shè)定為1000rpm。將溫度維持在28℃，將ph設(shè)定為6并且用最終發(fā)酵體積的10％v/v的72h搖瓶培養(yǎng)物接種發(fā)酵罐。用于發(fā)酵的小麥水解產(chǎn)物補(bǔ)充有vogel鹽。第一發(fā)酵揭示了在發(fā)酵開始時(shí)強(qiáng)烈的泡沫積累的問(wèn)題。這導(dǎo)致了泡沫中生物質(zhì)的累積，并且總之僅在發(fā)酵培養(yǎng)基的頂部生長(zhǎng)，而不是在溶液中。據(jù)推測(cè)發(fā)泡由小麥水解產(chǎn)物中的蛋白質(zhì)導(dǎo)致，并且因?yàn)樵谥暗陌l(fā)酵中使用的最低vogel培養(yǎng)基不含有蛋白質(zhì)，在之前的分批發(fā)酵中發(fā)泡不是問(wèn)題，并且此外在當(dāng)前使用的工業(yè)過(guò)程中也未帶來(lái)問(wèn)題。

為了克服該問(wèn)題，使用油菜籽油作為消泡劑。選擇油菜籽油，因?yàn)槠淇梢栽谑称芳?jí)產(chǎn)物中使用并且將會(huì)是經(jīng)濟(jì)的溶液。其也可以被鐮刀菌屬用作碳源，這將會(huì)引起較高的收率，并且因?yàn)榘l(fā)泡僅在過(guò)程開始時(shí)是明顯的問(wèn)題，在稍后的時(shí)間點(diǎn)這將不會(huì)是問(wèn)題。

因?yàn)閱为?dú)使用油菜籽油作為消泡劑不能克服接種物在發(fā)酵罐中的液面的頂部上累積的問(wèn)題，使用曝氣和攪拌特征。詳細(xì)地，這意味著，在1.5小時(shí)的時(shí)間進(jìn)程期間緩慢地提高攪拌和曝氣。所使用的攪拌和曝氣速率在以下表中示出。

表3-使用小麥水解產(chǎn)物的f.venenatum的分批發(fā)酵的攪拌和曝氣特征。描繪了提高參數(shù)時(shí)的時(shí)間點(diǎn)。

1.10.3結(jié)果

通過(guò)使用該特征，進(jìn)行了成功的分批發(fā)酵，其可以在10中看到。在該發(fā)酵中的最大達(dá)到的生物質(zhì)是8.97g/l，考慮到49.46g/l的起始葡萄糖濃度，其得到18.1％的收率。這個(gè)達(dá)到的收率僅為在使用最低vogel培養(yǎng)基的分批發(fā)酵中達(dá)到的收率的一半。這很可能是由于嚴(yán)重限制生長(zhǎng)的在發(fā)酵開始時(shí)的強(qiáng)烈的氧限制。溶解氧在發(fā)酵開始時(shí)迅速降低，因?yàn)槠貧夂蛿嚢柙陂_始時(shí)非常低，這對(duì)于向發(fā)酵培養(yǎng)基中的氧傳遞來(lái)說(shuō)是不利的(數(shù)據(jù)未示出)。通過(guò)改善氧供給，可以達(dá)到較高的真菌蛋白收率，同時(shí)在發(fā)酵期間還制備了9.98g/l乙醇作為副產(chǎn)物。未預(yù)期在該發(fā)酵期間這樣的高水平的乙醇的制備，并且將會(huì)完成進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)以研究培養(yǎng)條件對(duì)通過(guò)f.venenatum共同制備乙醇和真菌蛋白的影響(章節(jié)1.13)。

1.10.3.1在部分水解的培養(yǎng)基(未使用酶)中的f.venenatum生長(zhǎng)

由于關(guān)于工藝的經(jīng)濟(jì)效益和購(gòu)買水解酶的高成本和歸因于加熱/冷卻步驟和ph調(diào)整的水解過(guò)程的高成本的因素，考慮使用僅在水中溶解的小麥面粉或僅通過(guò)進(jìn)行液化步驟部分水解的小麥。為了研究這將會(huì)對(duì)鐮刀菌屬菌株的生長(zhǎng)具有什么影響，使鐮刀菌屬在搖瓶中在補(bǔ)充有vogel鹽的不同水解產(chǎn)物中生長(zhǎng)。為此目的，將70g/l小麥面粉溶解在90℃水中，并且之后在一個(gè)樣品中僅用0.5％w/wα淀粉酶進(jìn)行液化步驟并且在另一個(gè)樣品中進(jìn)行額外使用1％w/w葡糖淀粉酶的液化和糖化步驟二者。第三個(gè)樣品不含有任何酶。用hplc分析三個(gè)培養(yǎng)基并且將其用于搖瓶實(shí)驗(yàn)。

不同的水解產(chǎn)物的hplc分析顯示，只有經(jīng)歷了液化和糖化步驟二者的水解產(chǎn)物含有葡萄糖并且70g/l小麥面粉得到48g/l葡萄糖。在含有補(bǔ)充有vogel鹽的200ml培養(yǎng)基的500ml搖瓶中一式三份進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，并且在24、48和72小時(shí)之后選取樣品并且一式三份進(jìn)行分析。

這個(gè)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，f.venenatum可以在僅由加入了vogel鹽的小麥水解產(chǎn)物組成的培養(yǎng)基中等同良好地生長(zhǎng)(11)。因此推斷，其使用溶液中的淀粉作為碳源。完全水解的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)稍快，據(jù)推測(cè)其由對(duì)在鐮刀菌屬中制備淀粉酶以使用淀粉作為能量來(lái)源的需求引起。hplc數(shù)據(jù)(未示出)表明，即使在不具有任何酶的培養(yǎng)基中也存在二糖，其可以在溫育開始時(shí)使用并且這可能是為何在前24小時(shí)中不能觀察到生長(zhǎng)的差異的原因。在72小時(shí)之后，在所有瓶中的生物質(zhì)為大約7g/l干燥生物質(zhì)，并且沒有值得注意的差異。

1.11實(shí)驗(yàn)2

1.11.1目標(biāo)&目的

為了表明真菌蛋白發(fā)酵和乙醇發(fā)酵的過(guò)程的綜合是可能的，進(jìn)行初步實(shí)驗(yàn)以證實(shí)釀酒酵母在小麥水解產(chǎn)物中生長(zhǎng)(章節(jié)1.10.3.1)。還在真菌蛋白發(fā)酵的濾液中使酵母生長(zhǎng)，以觀察是否存在生長(zhǎng)并且確定f.venenatum是否產(chǎn)生抑制釀酒酵母的生長(zhǎng)的任何物質(zhì)(章節(jié)1.11.3.2)。

1.11.2實(shí)驗(yàn)條件

1.11.3結(jié)果

1.11.3.1釀酒酵母在小麥水解產(chǎn)物中的生長(zhǎng)

進(jìn)行搖瓶實(shí)驗(yàn)。為此目的，將100ml搖瓶用40ml培養(yǎng)基填充并且在250rpm和30℃下生長(zhǎng)24h。一式三份使瓶生長(zhǎng)并且進(jìn)行分析。在2中描繪了od和干燥生物質(zhì)測(cè)定的結(jié)果。

該實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，釀酒酵母在補(bǔ)充有vogel鹽的水解的小麥中等同良好地生長(zhǎng)并且因此過(guò)程的綜合是可能的?？梢酝茰y(cè)，小麥水解產(chǎn)物含有蛋白質(zhì)和釀酒酵母生長(zhǎng)所需的其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，因?yàn)閮H含有葡萄糖和vogel鹽的培養(yǎng)基不能促進(jìn)相同的生長(zhǎng)。

1.11.3.2使用小麥水解產(chǎn)物的釀酒酵母的分批發(fā)酵

為了表明兩個(gè)發(fā)酵過(guò)程的綜合是可能的，進(jìn)行使用小麥水解產(chǎn)物的釀酒酵母的發(fā)酵。所使用的發(fā)酵系統(tǒng)是dasgip(eppendorf)，其允許同時(shí)進(jìn)行四個(gè)發(fā)酵。使用mypg進(jìn)行兩個(gè)發(fā)酵作為對(duì)照，并且使用補(bǔ)充有vogel鹽的小麥水解產(chǎn)物(35g/l面粉、0.5％w/wα淀粉酶、1％w/w葡糖淀粉酶)進(jìn)行兩個(gè)發(fā)酵。工作容量是800ml并且進(jìn)行發(fā)酵24小時(shí)，而僅在發(fā)酵時(shí)間的8至18小時(shí)之間存在0.82vvm的曝氣。通過(guò)測(cè)量光密度和測(cè)定干燥生物質(zhì)來(lái)監(jiān)測(cè)酵母的生長(zhǎng)。

在發(fā)酵的時(shí)間進(jìn)程期間，所有四個(gè)發(fā)酵的光密度趨勢(shì)和干燥生物質(zhì)趨勢(shì)二者未顯示出明顯的差異，2和3。

樣品的hplc分析得到以下初始葡萄糖濃度和最終乙醇濃度的值。此外，計(jì)算葡萄糖向乙醇的轉(zhuǎn)化的收率。使用wh的發(fā)酵的收率稍高，但是通常，兩個(gè)發(fā)酵的趨勢(shì)是相似的。

表4：在釀酒酵母發(fā)酵開始時(shí)的葡萄糖濃度和最大乙醇濃度的分析。計(jì)算葡萄糖向乙醇的轉(zhuǎn)化的收率。

1.12實(shí)驗(yàn)3

1.12.1目標(biāo)&目的

這個(gè)實(shí)驗(yàn)的目的是證明用于使用過(guò)期飼料級(jí)小麥作為生長(zhǎng)培養(yǎng)基制備真菌蛋白(f.venenatum)和乙醇(使用釀酒酵母)的綜合生物方法的可行性。之前進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)已經(jīng)表明，可以在水解的小麥培養(yǎng)基上成功地使鐮刀菌屬和酵母菌屬二者生長(zhǎng)(章節(jié)1.10和1.11)。這個(gè)實(shí)驗(yàn)建立于這些發(fā)現(xiàn)之上，試圖使鐮刀菌屬生長(zhǎng)至獲得足夠的生物質(zhì)同時(shí)葡萄糖仍然存在于系統(tǒng)中以被釀酒酵母進(jìn)一步利用的程度。

1.12.2實(shí)驗(yàn)條件

1.12.2.1發(fā)酵過(guò)程

在表5中詳述了實(shí)驗(yàn)條件。

表5-實(shí)驗(yàn)3的實(shí)驗(yàn)條件。

1.12.3取樣&結(jié)果

在接種后以及在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)立刻移除培養(yǎng)基的樣品。

使用ysi生物化學(xué)分析儀(1.5)針對(duì)所收集的樣品中的每一個(gè)估算葡萄糖濃度以及每種生物的生物質(zhì)水平(1.4)。因?yàn)橐皇饺輰?duì)其進(jìn)行分析，報(bào)告的值是三次重復(fù)的平均值(5和圖16)。

使用hplc法(1.6)實(shí)現(xiàn)樣品中的乙醇量化并且還在6中詳述了結(jié)果。

1.12.4討論

這個(gè)實(shí)驗(yàn)證明了將兩個(gè)目標(biāo)發(fā)酵過(guò)程綜合的能力。第一階段證明了使f.venenatum生長(zhǎng)至在10g/l的區(qū)域內(nèi)的生物質(zhì)水平的能力。之后收獲該生物質(zhì)并且將仍然含有在20g/l的區(qū)域內(nèi)的葡萄糖的培養(yǎng)基再次滅菌。該培養(yǎng)基之后用釀酒酵母接種并且隨后實(shí)現(xiàn)該生物的生長(zhǎng)。在大約16小時(shí)的時(shí)間段之后，使培養(yǎng)物氧匱乏以促進(jìn)乙醇的制備。繼續(xù)發(fā)酵，直到達(dá)到大約四十小時(shí)的總發(fā)酵時(shí)間，在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)選取樣品以用于使用先進(jìn)的hplc法的乙醇量化(1.6)。

在fusariumvenentaum的發(fā)酵期間未檢測(cè)到乙醇(數(shù)據(jù)未示出)。在接種和釀酒酵母的初期生長(zhǎng)之后，在樣品中注意到乙醇(大約5g/l)，6。

這說(shuō)明了使用過(guò)期飼料級(jí)小麥作為生長(zhǎng)培養(yǎng)基的綜合兩個(gè)生物方法——用于真菌蛋白制備的fusariumvenenantum發(fā)酵以及隨后的釀酒酵母發(fā)酵和乙醇制備的途徑的可行性。應(yīng)當(dāng)進(jìn)行方法的優(yōu)化以通過(guò)發(fā)酵制備最大收率的真菌蛋白和乙醇，從而提高總體過(guò)程效率。

1.12.5結(jié)論

結(jié)果已經(jīng)證明，用于制備所需產(chǎn)物的兩個(gè)生物方法的綜合是可能的。

1.13實(shí)驗(yàn)4

在嘗試證明用于使用過(guò)期飼料級(jí)小麥作為生長(zhǎng)培養(yǎng)基用fusariumvenenatum制備真菌蛋白(作為食物)和乙醇(作為燃料)的生物方法的可行性中，進(jìn)行多個(gè)發(fā)酵。

1.13.1目標(biāo)&目的

該實(shí)驗(yàn)的目的是證明將fusariumvenenatum用于使用水解的飼料級(jí)小麥作為底物制備真菌蛋白和乙醇二者的生物方法的可行性。

在進(jìn)行之前，實(shí)驗(yàn)已經(jīng)表明，取決于所使用的曝氣曲線，fusariumvenenatum產(chǎn)生生物質(zhì)或乙醇。為此目的，使用三個(gè)不同的曝氣曲線，從而確定生物質(zhì)和乙醇制備的差異。使用利用vogel培養(yǎng)基(vm)的對(duì)照發(fā)酵并且在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中對(duì)其進(jìn)行曝氣。

用無(wú)氧限制的相同級(jí)聯(lián)對(duì)所有四個(gè)發(fā)酵的發(fā)酵時(shí)間的前20小時(shí)進(jìn)行曝氣。在20小時(shí)之后，對(duì)發(fā)酵一(vm1)和二(wh2)進(jìn)一步曝氣，而在20小時(shí)的發(fā)酵之后通過(guò)將曝氣設(shè)定為0.1vvm來(lái)對(duì)發(fā)酵三(wh3)進(jìn)行氧限制。對(duì)于發(fā)酵四(wh4)來(lái)說(shuō)，關(guān)閉曝氣，這導(dǎo)致氧匱乏(oxygenstarvation)。在表6中描繪了所應(yīng)用的條件。

表6-用于研究氧限制的影響的每個(gè)發(fā)酵條件的概述。

1.13.2實(shí)驗(yàn)條件

根據(jù)1.3制備在發(fā)酵二、三和四中使用的小麥水解產(chǎn)物。

1.13.3取樣&結(jié)果

在接種前和剛接種后選取培養(yǎng)基的樣品。之后在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中每天兩次選取樣品。記錄樣品的詳情、它們的時(shí)間和各個(gè)監(jiān)測(cè)的工藝參數(shù)。

使用ysi生物化學(xué)分析儀(1.5)針對(duì)所收集的樣品中的每一個(gè)估算葡萄糖濃度以及每種生物的生物質(zhì)水平(1.4)。因?yàn)橐皇饺輰?duì)其進(jìn)行分析，報(bào)告的值是三次重復(fù)的平均值。使用1.6中描述的hplc法實(shí)現(xiàn)樣品中的乙醇量化。

1.13.3.1發(fā)酵1

在對(duì)fusariumvenenatum無(wú)氧限制的情況下進(jìn)行發(fā)酵一。使用該發(fā)酵作為對(duì)照，由于該原因，使用具有葡萄糖作為碳源的vogel培養(yǎng)基代替小麥水解產(chǎn)物作為發(fā)酵培養(yǎng)基。其目的是比較不同培養(yǎng)基之間的生長(zhǎng)并且確定可能的差異。預(yù)期在發(fā)酵中在無(wú)氧限制的情況下得到更多的生物質(zhì)并且未檢測(cè)到大量的乙醇。

1.13.3.1.1實(shí)驗(yàn)條件

在表7中概述了用于該發(fā)酵過(guò)程的實(shí)驗(yàn)參數(shù)。該發(fā)酵充當(dāng)對(duì)照并且與發(fā)酵二進(jìn)行比較。

表7-發(fā)酵一的實(shí)驗(yàn)條件。

1.13.3.1.2結(jié)果

在發(fā)酵一中，在其中達(dá)到22g/l干燥生物質(zhì)的水平的發(fā)酵的前20小時(shí)中制備大多數(shù)生物質(zhì)。在96小時(shí)之后，當(dāng)存在25g/l干燥生物質(zhì)時(shí)，在發(fā)酵的最后達(dá)到最大干燥生物質(zhì)。在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中未檢測(cè)到乙醇。在20小時(shí)之后，對(duì)于鐮刀菌屬，僅可獲得最初43.5g/l的0.4g/l的葡萄糖?？梢栽?、8和9中看到干燥生物質(zhì)、乙醇和葡萄糖水平的趨勢(shì)。

1.13.3.1.3結(jié)論

如預(yù)期的，在該發(fā)酵中未產(chǎn)生乙醇，而其得到25g/l的大量的生物質(zhì)?？梢酝ㄟ^(guò)將底物進(jìn)料至發(fā)酵罐中并且收獲生物質(zhì)來(lái)增加生物質(zhì)制備。隨著增加生物質(zhì)，可以觀察到增加的粘度，這阻止了混合和氧傳遞。因此，收獲生物質(zhì)可以有益于生物質(zhì)的制備。

1.13.3.2發(fā)酵2

在發(fā)酵二中使用的底物補(bǔ)充有vogel鹽的小麥水解產(chǎn)物，其也在發(fā)酵三(1.13.3.3)和四(1.13.3.4)中使用。其在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中不是氧限制的。將該發(fā)酵與發(fā)酵一進(jìn)行比較，從而得到關(guān)于所使用的培養(yǎng)基之間收率差異的結(jié)論。與使用vogel培養(yǎng)基的發(fā)酵一相比，預(yù)期從該發(fā)酵中得到相近的結(jié)果。

1.13.3.2.1發(fā)酵過(guò)程

在發(fā)酵二中，使用小麥水解產(chǎn)物作為發(fā)酵培養(yǎng)基。將溶解氧的設(shè)定點(diǎn)設(shè)定為30％。在表8中詳述了另外的實(shí)驗(yàn)條件。

表8-發(fā)酵二的實(shí)驗(yàn)條件。

1.13.3.2.2結(jié)果

在7、8和9中示出了使用小麥水解產(chǎn)物和無(wú)氧限制的發(fā)酵的干燥生物質(zhì)、乙醇和葡萄糖趨勢(shì)。盡管在27小時(shí)之后葡萄糖水平達(dá)到0.13g/l，在44小時(shí)之后達(dá)到21g/l的最大干燥生物質(zhì)濃度。乙醇僅在20小時(shí)之后存在，但是之后可以用作碳源，并且在發(fā)酵的另外過(guò)程中不能檢測(cè)到乙醇。

1.13.3.2.3結(jié)論

該發(fā)酵得到與第一發(fā)酵近似相同的生物質(zhì)水平。最初葡萄糖水平較低，這解釋了所達(dá)到的生物質(zhì)水平的差異。此外，除20小時(shí)的樣品外，在整個(gè)發(fā)酵中未檢測(cè)到乙醇。

1.13.3.3發(fā)酵3

在發(fā)酵三中，研究了氧限制對(duì)乙醇制備的影響。將結(jié)果與之前的發(fā)酵進(jìn)行比較，尤其是與具有氧匱乏條件的發(fā)酵(發(fā)酵四)進(jìn)行比較。應(yīng)當(dāng)提供針對(duì)氧的存在對(duì)乙醇制備的影響的進(jìn)一步的認(rèn)識(shí)。

1.13.3.3.1實(shí)驗(yàn)條件

在表9中詳述了實(shí)驗(yàn)條件。使用補(bǔ)充有vogel鹽的小麥水解產(chǎn)物作為發(fā)酵培養(yǎng)基，并且在20小時(shí)階段的無(wú)氧限制之后，將曝氣設(shè)定為0.1vvm，從而氧限制條件。

表9-發(fā)酵三的實(shí)驗(yàn)條件。

1.13.3.3.2結(jié)果

在發(fā)酵三中，起始葡萄糖濃度是34.5g/l并且在27小時(shí)之后葡萄糖從發(fā)酵培養(yǎng)基中耗盡。與在具有在75小時(shí)的發(fā)酵時(shí)間之后檢測(cè)到的11g/l的最大值的在無(wú)氧限制下的發(fā)酵(發(fā)酵1和2)中相比，所制備的生物質(zhì)低得多。在44小時(shí)之后乙醇制備達(dá)到其最高值4.8g/l?？梢栽?、8和9中看到在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中的底物和產(chǎn)物的趨勢(shì)。

1.13.3.3.3結(jié)論

在發(fā)酵三中(在氧限制條件下)，在前24h期間在氧限制條件下制備主要量的乙醇。在發(fā)酵的稍后階段期間，乙醇濃度降低，說(shuō)明其被生物用作碳源。

1.13.3.4發(fā)酵4

在發(fā)酵四中，研究了在20小時(shí)的最初生長(zhǎng)階段之后生物的多大的氧匱乏將會(huì)影響所制備的乙醇的量。預(yù)期在氧匱乏階段期間得到較低水平的生物質(zhì)，但是得到乙醇制備的大幅增加。

1.13.3.4.1實(shí)驗(yàn)條件

在表10中詳述了用于發(fā)酵四的實(shí)驗(yàn)條件。使用小麥水解產(chǎn)物作為發(fā)酵培養(yǎng)基，并且在20小時(shí)的無(wú)氧限制之后，將曝氣設(shè)定為0vvm，從而使鐮刀菌屬氧匱乏。

表10-發(fā)酵四的實(shí)驗(yàn)條件。

1.13.3.4.2結(jié)果

在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中以常規(guī)間隔選取樣品。發(fā)酵四具有32.5g/l的起始葡萄糖濃度并且在27小時(shí)之后耗盡。干燥生物質(zhì)也在27小時(shí)之后到達(dá)峰值(10g/l)。乙醇濃度在發(fā)酵的最后處于其最高值并且達(dá)到11.7g/l。在7、8和9中描繪了所確定的參數(shù)的詳細(xì)情況。

1.13.3.4.3結(jié)論

來(lái)自該發(fā)酵的結(jié)果表明，氧匱乏對(duì)乙醇制備是有利的。在將曝氣關(guān)閉之后，生物質(zhì)不再增加而是降低，直到發(fā)酵結(jié)束。盡管生物質(zhì)濃度降低，乙醇在發(fā)酵的匱乏階段期間繼續(xù)增加并且在過(guò)程最后達(dá)到其最高水平。葡萄糖在27小時(shí)之后耗盡，可能的是，在小麥水解產(chǎn)物中存在的其他低聚糖用于乙醇的制備。

1.13.3.5實(shí)驗(yàn)4結(jié)論

為了理解不同的曝氣曲線對(duì)生物質(zhì)和乙醇制備的影響，對(duì)發(fā)酵的工藝參數(shù)進(jìn)行比較。在7中可以看到，非常清楚，氧限制和氧匱乏的發(fā)酵比未氧限制的發(fā)酵制備明顯較少的干燥生物質(zhì)。然而，在小麥水解產(chǎn)物發(fā)酵的曝氣階段期間(前20h)，生長(zhǎng)速率近似相同(0.34g/l.h)，顯示出過(guò)程的再現(xiàn)性。

此外，研究了在不同發(fā)酵中的第二產(chǎn)物乙醇的制備。在這些發(fā)酵中，觀察到，氧匱乏導(dǎo)致明顯增加的乙醇制備(8)，這與在其他發(fā)酵中達(dá)到的乙醇水平明顯不同。在20小時(shí)之后，使用小麥水解產(chǎn)物進(jìn)行的所有發(fā)酵(發(fā)酵2-4)顯示出相同量的乙醇，這與使用vogel培養(yǎng)基進(jìn)行的發(fā)酵(發(fā)酵1)不同。只有氧匱乏的發(fā)酵在發(fā)酵最后在發(fā)酵培養(yǎng)基中顯示出乙醇。

在8中，描繪了在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中的葡萄糖濃度。在小麥水解產(chǎn)物中的起始葡萄糖濃度比在vogel培養(yǎng)基中稍低，然而在所有發(fā)酵中的消耗率是大約0.40g/l*h。在曝氣階段期間(表11)和在整個(gè)過(guò)程時(shí)間期間(表12)計(jì)算基于葡萄糖的生物質(zhì)和乙醇收率，從而獲得較好的發(fā)酵的比較。

表11-在用于將葡萄糖轉(zhuǎn)化為生物質(zhì)和乙醇的發(fā)酵的曝氣階段(前20h)期間的過(guò)程收率，以及生物質(zhì)和乙醇生產(chǎn)率。

縮寫：vm1：vogel培養(yǎng)基，無(wú)氧限制；wh2：小麥水解產(chǎn)物，無(wú)氧限制；wh3：小麥水解產(chǎn)物，氧限制；wh4：小麥水解產(chǎn)物，氧匱乏。ydcw/glc：基于葡萄糖的生物質(zhì)收率，yetoh/glc：基于葡萄糖的乙醇收率，pdcw：生物質(zhì)生產(chǎn)率，petoh：乙醇生產(chǎn)率

如預(yù)期的，在曝氣階段期間，與在使用小麥水解產(chǎn)物的發(fā)酵(發(fā)酵二-四)中相比，發(fā)酵一(vm1)顯示出基于葡萄糖的較高的生物質(zhì)的轉(zhuǎn)化。生物質(zhì)生產(chǎn)率在vogel培養(yǎng)基(發(fā)酵一，vm1)中也高3倍，說(shuō)明葡萄糖在確定成分培養(yǎng)基(vm)中更高效率地轉(zhuǎn)化為生物質(zhì)。然而，即使在過(guò)程的該階段期間，也有利于在小麥水解產(chǎn)物培養(yǎng)基(發(fā)酵二-四)中的乙醇制備。

在表12中可以看到，盡管在發(fā)酵二期間的生物質(zhì)水平比在發(fā)酵一中低，葡萄糖向生物質(zhì)的轉(zhuǎn)化的總體產(chǎn)率是相似的(～50％)。此外，葡萄糖向乙醇的最高轉(zhuǎn)化和最高乙醇生產(chǎn)率在氧匱乏條件下(wh4)。這意味著，與生物質(zhì)制備(在無(wú)氧限制條件下最高)相比，這些條件有利于乙醇制備。

表12-葡萄糖向生物質(zhì)和乙醇轉(zhuǎn)化的總過(guò)程收率，以及生物質(zhì)和乙醇生產(chǎn)率(總體過(guò)程時(shí)間96h)。

縮寫：vm1：vogel培養(yǎng)基，無(wú)氧限制；wh2：小麥水解產(chǎn)物，無(wú)氧限制；wh3：小麥水解產(chǎn)物，氧限制；wh4：小麥水解產(chǎn)物，氧匱乏。ydcw/glc：基于葡萄糖的生物質(zhì)收率，yetoh/glc：基于葡萄糖的乙醇收率，pdcw：生物質(zhì)生產(chǎn)率，petoh：乙醇生產(chǎn)率

連同監(jiān)測(cè)底物和產(chǎn)物濃度，監(jiān)測(cè)另外的工藝參數(shù)。在中描繪了溶解氧濃度，其提供對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基中氧水平的認(rèn)識(shí)。在20小時(shí)之后，當(dāng)降低曝氣時(shí)，對(duì)發(fā)酵三和四進(jìn)行氧限制。

1.13.3.6結(jié)論

在該報(bào)告中所示的結(jié)果證明，使用fusariumvenenatum由飼料級(jí)小麥水解產(chǎn)物制備生物質(zhì)以及乙醇的假設(shè)是可行的。此外，還第一次證明了，過(guò)程控制(即，操控曝氣條件)有利于生物質(zhì)制備(無(wú)氧限制條件)或乙醇制備(氧匱乏條件)。在可以使生物氧匱乏并且因此可以開始乙醇的發(fā)酵之前，可以以曝氣存在足夠長(zhǎng)以獲得足夠生物質(zhì)濃度的方式進(jìn)行過(guò)程優(yōu)化。

具有氧匱乏條件的過(guò)程對(duì)高乙醇收率來(lái)說(shuō)似乎是優(yōu)選的。即使在非常低的生物質(zhì)水平的情況下，也可以在不存在氧的情況下(發(fā)酵四)制備(并且有利于)大量的乙醇。可以在乙醇制備階段開始之前(過(guò)程的前20h)收獲大量生物質(zhì)。因此，通過(guò)操控工藝條件，可以調(diào)節(jié)該方法，從而得到所需產(chǎn)物。

使用單一生物用于制備兩種產(chǎn)物(生物質(zhì)和乙醇)具有巨大經(jīng)濟(jì)優(yōu)勢(shì)和下游處理優(yōu)勢(shì)?？梢愿鶕?jù)真菌蛋白(生物質(zhì))或乙醇的需求通過(guò)使曝氣階段延長(zhǎng)或縮短來(lái)調(diào)整制造方法?？梢酝ㄟ^(guò)收獲生物質(zhì)并且向發(fā)酵中進(jìn)料更多的小麥水解產(chǎn)物來(lái)進(jìn)一步改善該方法。在不需要曝氣的情況下制備乙醇將會(huì)大幅降低制備成本并且因此將會(huì)影響總體工藝經(jīng)濟(jì)效益。

參考文獻(xiàn)

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