本發(fā)明一般涉及植物生物技術(shù)。更具體地，本發(fā)明涉及由土壤桿菌(土壤桿菌屬，農(nóng)桿菌，agrobacterium)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化植物的方法。
背景技術(shù)：
：：甘蔗(甘蔗屬物種(saccharumspp.))是屬于植物學(xué)科禾本科、源自東南亞、新幾內(nèi)亞和印度尼西亞的大中部地區(qū)的草本植物(daniels&roach,1987,sugarcaneimprovementthroughbreeding(通過(guò)育種的甘蔗改良)p.7-84)。甘蔗是熱帶地區(qū)和亞熱帶地區(qū)種植的最重要的植物種類(lèi)之一，其中超過(guò)2300萬(wàn)公頃的面積分布在超過(guò)121個(gè)國(guó)家(faostatisticalyearbook2012p.233)。甘蔗種植面積正在增加，并且其是用于生產(chǎn)糖、葡萄酒、糖蜜、朗姆酒、卡沙薩(巴西的國(guó)蒸餾酒)和燃料乙醇的原料來(lái)源。在研磨甘蔗后殘留的甘蔗渣可以被用于壓制(balering)和供應(yīng)在研磨機(jī)中所用的熱能和通常銷(xiāo)售給用電設(shè)備電網(wǎng)(consumerelectricalgrid)的電力，以及用作生產(chǎn)乙醇的基料。因此，負(fù)責(zé)在該地區(qū)產(chǎn)生數(shù)以百萬(wàn)計(jì)工作的甘蔗農(nóng)產(chǎn)業(yè)具有主要的社會(huì)重要性，從而通過(guò)出口糖和乙醇以及通過(guò)合理利用植物生物量產(chǎn)生收益。最近，由于對(duì)全球變暖和使用化石燃料的替代來(lái)源(生物燃料)的擔(dān)憂增加，世界對(duì)甘蔗的興趣已經(jīng)顯著增加。由于甘蔗的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)重要性，注意到旨在確定更好的農(nóng)業(yè)栽培實(shí)踐和改進(jìn)的種植品種的質(zhì)量的主要研究工作。在這方面，傳統(tǒng)的植物育種方法已經(jīng)證明限于在具有不同商業(yè)興趣的品種中引入感興趣的基因和性狀。由于這種困難和對(duì)并入所需性狀(諸如例如，增加的生產(chǎn)率，對(duì)昆蟲(chóng)、病原體和除草劑的耐受性，對(duì)非生物脅迫的抗性等)的不斷增長(zhǎng)的需要，分子生物學(xué)方法已經(jīng)被用于操縱甘蔗。植物的遺傳工程包括將感興趣的基因轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞中，使得可以獲得以穩(wěn)定的方式維持并表達(dá)外源基因的可育的和農(nóng)學(xué)優(yōu)勢(shì)的后代。因此，選擇之一是使用體外培養(yǎng)技術(shù)。體外培養(yǎng)技術(shù)之一是體胚發(fā)生(somaticembryogenesis)，其包括由分離的細(xì)胞或一小組細(xì)胞產(chǎn)生胚，其通過(guò)體外培養(yǎng)將產(chǎn)生體胚。在這種情況下，類(lèi)似于合子胚的結(jié)構(gòu)從體細(xì)胞發(fā)育，從而遵循合子胚發(fā)生的特征階段的順序，產(chǎn)生植物而沒(méi)有配子的融合(jimenez.2001.regulationofinvitrosomaticembryogenesiswithemphasisontheroleofendogenoushormones(在強(qiáng)調(diào)內(nèi)源性激素的作用的情況下調(diào)節(jié)體外體胚發(fā)生).revistabrasileiradefisiologiavegetal,v.13,p.196-223)。根據(jù)guerra等人，sementessintéticas。在：torres等人(編輯).1999.culturadetecidosegenéticadeplantas.brasília：embrapa，v.2，p.533-568，體胚的突出特征是存在閉式血管系統(tǒng)(closedvascularsystem)而不存在與初始外植體的組織的血管連接。這種特征與其雙極性(存在芽和根尖)相結(jié)合，使得能夠區(qū)分胚發(fā)生和器官發(fā)生的過(guò)程(falco等人1996.histologicalcharacterizationofinvitroregenerationofsaccharumsp.(甘蔗屬體外再生的組織學(xué)特征)revistabrasileiradefisiologiavegetal,v.9,p.93-97)。根據(jù)suprasanna等人(2005.regulationofsomaticembryogenesisbyplantgrowthregulatorsinsugarcane(通過(guò)甘蔗中植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑來(lái)調(diào)節(jié)體胚發(fā)生).sugartech,v.7,p.123-128)，體胚發(fā)生在甘蔗栽培中的應(yīng)用具有兩個(gè)主要目標(biāo)：發(fā)展植物快速繁殖的可重復(fù)的方法和實(shí)現(xiàn)用于遺傳轉(zhuǎn)化的體胚的有效再生系統(tǒng)。在甘蔗中的胚過(guò)程中已經(jīng)使用了各種類(lèi)型的外植體。根據(jù)lakshmanan等人(2006.developmentalandhormonalregulationofdirectshootorganogenesisandsomaticembryogenesisinsugarcane(saccharumspp.interspecifichybrids)leafculture(甘蔗(甘蔗屬物種中間雜種)葉培養(yǎng)中直接芽器官發(fā)生和體胚發(fā)生的發(fā)育的和激素的調(diào)節(jié)).plantcellreports,v.25,p.1007-1015)，幾乎所有的植物組織產(chǎn)生胚發(fā)生愈傷組織，但是較年輕的葉子(chengalrayan&gallo-meagher.2001.invitrocellularanddevelopmentalbiology-plant(體外細(xì)胞和發(fā)育生物學(xué)-植物),oxon,v.37,p.434-439；lakshmanan等人2006.developmentalandhormonalregulationofdirectshootorganogenesisandsomaticembryogenesisinsugarcane(saccharumspp.interspecifichybrids)leafculture(甘蔗(甘蔗屬物種中間雜種)葉培養(yǎng)中直接芽器官發(fā)生和體胚發(fā)生的發(fā)育的和激素的調(diào)節(jié)).plantcellreports,v.25,p.1007-1015；snyman等人2011.applicationsofinvitroculturesystemsforcommercialsugarcaneproductionandimprovement(體外培養(yǎng)系統(tǒng)在商業(yè)甘蔗生產(chǎn)和改良中的應(yīng)用).invitrocellularanddevelopmentalbiologyplant,v.47,p.234-249,2011)和發(fā)育中的花序(gallo-meagher等人2000.thidiazuronstimulatesshootregenerationofsugarcaneembryogeniccallus(噻苯隆刺激甘蔗胚發(fā)生的愈傷組織的芽再生).invitrocellularanddevelopmentalbiologyplant,v.36,p.37-40)；desai等人2004.currentscience,bangalore,v.87,p.764-768)是非常多產(chǎn)的并且對(duì)于快速生產(chǎn)胚發(fā)生的愈傷組織是優(yōu)選的靶組織。通過(guò)向培養(yǎng)基中加入生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑來(lái)啟動(dòng)體胚發(fā)生，并且其中，生長(zhǎng)素作為胚過(guò)程中最常用的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的種類(lèi)是突出的(cooke等人1993.theroleofauxininplantembryogenesis(在植物胚發(fā)生中生長(zhǎng)素的作用).theplantcell,v.5,p.1494-1495,1993)。2,4d(2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-dichlorophenoxyaceticacid))是甘蔗中體胚發(fā)生的誘導(dǎo)過(guò)程中最常用的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑。植物中體胚的轉(zhuǎn)化是體胚發(fā)生過(guò)程的最后階段。再生通常發(fā)生在沒(méi)有生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑和光存在的培養(yǎng)基中(garcia等人2007.invitromorphogenesispatternsfromshootapicesofsugarcanearedeterminedbylightandtypeofgrowthregulator(通過(guò)光和生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的種類(lèi)來(lái)確定來(lái)自甘蔗芽頂?shù)捏w外形態(tài)發(fā)生模式).plantcell,tissueandorganculture,v.90,p.181-190；watt等人2009.invitrominimalgrowthstorageofsaccharumspp.hybrid(genotype88h0019)attwostagesofdirectsomaticembryogenicregeneration(甘蔗屬物種雜種(基因型88h0019)在直接體胚發(fā)生再生的兩個(gè)階段的體外最小生長(zhǎng)貯存).plantcell,tissueandorganculture,v.96,p.263-271；suprasana,等人2010.profilingofculture-inducedvariationinsugarcaneplantsregeneratedviadirectandindirectsomaticembryogenesisbyusingtransposon-insertionpolymorphism(通過(guò)使用轉(zhuǎn)座子插入多態(tài)性經(jīng)直接和間接體胚發(fā)生再生的甘蔗植物中的培養(yǎng)誘導(dǎo)的變異的剖析研究).sugartech,v.12,p.26-30；vandervyver,c.2010.genetictransformationoftheeuploidsaccharumofficinarumviadirectandindirectembryogenesis(經(jīng)直接和間接胚發(fā)生的整倍體甘蔗的遺傳轉(zhuǎn)化).sugartech,v.12,p.21-25；basnayake等人2011.embryogeniccallusproliferationandregenerationconditionsforgenetictransformationofdiversesugarcanecultivars(多種甘蔗栽培品種的遺傳轉(zhuǎn)化的胚發(fā)生愈傷組織增殖條件和再生條件).plantcellreports,v.30,p.439-448)，然而，這個(gè)過(guò)程可能會(huì)通過(guò)使用不同的調(diào)節(jié)劑來(lái)改善(ali等人2008.anefficientprotocolforlargescaleproductionofsugarcanethroughmicropropagation(通過(guò)微繁殖大規(guī)模生產(chǎn)甘蔗的有效方案).pakistanjournalofbotany,v.40,p.139-149；nieves等人2008.effectofexogenousarginineonsugarcane(saccharumsp.)somaticembryogenesis,freepolyaminesandthecontentsofthesolubleproteinsandproline(外源性精氨酸對(duì)甘蔗(甘蔗屬物種)體胚發(fā)生、游離多胺以及可溶性蛋白質(zhì)和脯氨酸的含量的影響).plantcells,tissueandorganculture,v.95,p.313-320；kaur&gosal.2009.callusdesiccationenhancessomaticembryogenesisandsubsequentshootregenerationinsugarcane(愈傷組織干燥增強(qiáng)了體胚發(fā)生和隨后的在甘蔗中芽再生).indianjournalofbiotechnology,v.8,p.332-334；goel等人2010.invitromorphogenesisinleafsheathexplantsofsugarcanehybridvar.cos99259(甘蔗雜種變體cos99259的葉鞘外植體中的體外形態(tài)發(fā)生).sugartech,v.12,p.172-175；wamaitha等人2010.thidiazuron-inducedrapidshootregenerationviaembryo-likestructureformationfromshoottip-derivedcalluscultureofsugarcane(經(jīng)來(lái)自甘蔗的芽尖源的愈傷組織培養(yǎng)的胚狀結(jié)構(gòu)形成的噻苯隆誘導(dǎo)的快速芽再生).plantbiotechnology,v.27,p.365-368)。重組dna技術(shù)已經(jīng)使得能夠分離基因并穩(wěn)定插入到宿主基因組中(quecini&vieira.2001.plantas在:serafini等人(編輯).biotecnologianaagriculturaenaagroindústria.guaíba:agropecuária,p.278-331)。也稱(chēng)為遺傳轉(zhuǎn)化的這種技術(shù)可以被定義為在宿主基因組中控制引入核酸(dna)，不包括通過(guò)受精(受胎，fecundation)引入。這是一個(gè)更受控制的過(guò)程，其通常只有將限定的dna片段引入到宿主基因組或受體基因組中，并且必須與其整合(brasileiro&dusi.1999.genéticadeplantas.在:torres等人(編輯)culturadetecidosegenéticadeplantas.brasília:embrapa-spi/embrapa-cnph,863p,v.2)。將這些分子穩(wěn)定插入到宿主基因組中產(chǎn)生與重組分子的受體相同的個(gè)體，但同時(shí)添加了新的和特定的特征(quecini&vieira，2001，以上)。存在植物遺傳轉(zhuǎn)化的各種技術(shù)，分為兩類(lèi)：基因的間接和直接轉(zhuǎn)移。間接轉(zhuǎn)移是其中通過(guò)生物載體的作用將外源dna插入基因組的一種轉(zhuǎn)移，而直接轉(zhuǎn)移基于物理-生物化學(xué)過(guò)程。間接轉(zhuǎn)化主要基于由土壤桿菌屬的細(xì)菌介導(dǎo)的系統(tǒng)，并且已經(jīng)是獲得轉(zhuǎn)基因植物最常用的方法。根癌土壤桿菌(根癌農(nóng)桿菌，agrobacteriumtumefaciens)和發(fā)根土壤桿菌(發(fā)根農(nóng)桿菌，a.rhizogenes)是屬于根瘤菌科的植物病原性土壤細(xì)菌(革蘭氏陰性菌)，它們引起雙子葉植物疾病，分別稱(chēng)為冠癭(crowngall)和毛根。在這種植物-病原體相互作用中，當(dāng)將細(xì)菌dna片段(t-dna)轉(zhuǎn)移到整合核基因組的植物細(xì)胞中時(shí)，發(fā)生土壤桿菌和植物細(xì)胞之間基因自然轉(zhuǎn)移的過(guò)程(ream&gelvin.1996.crowngall:advancesinunderstandinginterkingdomgenetransfer(冠癭：在理解跨國(guó)基因轉(zhuǎn)移的研究進(jìn)展).saintpaul:apspress,148p)。細(xì)菌以其天然形式轉(zhuǎn)移作為稱(chēng)作ti(“腫瘤誘導(dǎo)”)的細(xì)菌質(zhì)粒的一部分的t-dna(“轉(zhuǎn)移的dna”)，并且這整合受感染的植物細(xì)胞的基因組。在轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞的t-dna片段中是參與植物激素-構(gòu)成性生物合成(生長(zhǎng)素和細(xì)胞因子)的基因，該生物合成改變已感染組織的正常發(fā)育程序，從而導(dǎo)致腫瘤的形成。此外，它還含有用于合成稱(chēng)為冠癭堿(opines)的糖和胺酸的致癌基因，它們負(fù)責(zé)使用糖和胺酸作為碳源和氮源的細(xì)菌的存活(oger等人1997.geneticallyengineeredplantsproducingopinesaltertheirbiologicalenvironment(產(chǎn)生冠癭堿的基因工程植物改變它們的生物環(huán)境).naturebiotechnology，newyork，v.15,p.369-372)。在右側(cè)邊緣和左側(cè)邊緣上的25個(gè)堿基對(duì)(bp)的重復(fù)末端限定了t-dna，并且對(duì)于其轉(zhuǎn)移是必需的(wang等人1984.cell,cambridge,v.38,p.455-462)。由受傷的植物組織所釋放的酚類(lèi)化合物激活特定區(qū)域(vir)，從而啟動(dòng)到植物細(xì)胞的t-dna轉(zhuǎn)移過(guò)程(stachel等人1985.identificationofthesignalmoleculesproducedbywoundedplantcellsthatactivatet-dnatransferinagrobacteriumtumefaciens(由激活根癌土壤桿菌中t-dna轉(zhuǎn)移的受傷植物細(xì)胞所產(chǎn)生的信號(hào)分子的鑒定).nature,london,v.318,p.624-629)。土壤桿菌還具有確保細(xì)菌細(xì)胞和宿主細(xì)胞之間聯(lián)系的染色體基因(chv)，從而使得能夠形成t鏈復(fù)合物的通道孔(sheng&citovsky.1996.agrobacterium-plantcelldnatransport:havevirulenceproteins,willtravel(土壤桿菌-植物細(xì)胞dna轉(zhuǎn)運(yùn)：具有毒力蛋白，將行進(jìn)).theplantcell,baltimore,v.8,p.1699-1710)。稱(chēng)為vir區(qū)的毒力區(qū)負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)移過(guò)程，并且通過(guò)該區(qū)域的協(xié)調(diào)表達(dá)來(lái)控制鏈-t的誘導(dǎo)過(guò)程和轉(zhuǎn)移。vira基因座(位點(diǎn)，locus)編碼感知受傷植物的代謝物(乙酰丁香酮(acetosyringone))的存在的膜蛋白。在與乙酰丁香酮結(jié)合后，“活化的”vira蛋白修飾virg蛋白，virg蛋白也被組成性地表達(dá)，但是通過(guò)其磷酸化處于較低的規(guī)模。磷酸化的virg蛋白負(fù)責(zé)誘導(dǎo)整個(gè)vir區(qū)的轉(zhuǎn)錄。為了形成t-鏈，操縱子vird編碼能夠在限制區(qū)域-t的25bp內(nèi)識(shí)別和切割的內(nèi)切核酸酶。t-鏈的轉(zhuǎn)移是極性的，始終從右到左。t-鏈以單鏈的形式被轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞中，在該分子的5’部分中受蛋白vird2保護(hù)，并且在整個(gè)t-鏈中受蛋白vire2保護(hù)(zambryski.1992.chroniclefromtheagrobacterium-plantcelldnatransferstory(記錄從土壤桿菌-植物細(xì)胞dna轉(zhuǎn)移故事).annualreviewofplantphysiologyandplantmolecularbiology,paloalto,v.43,p.465-490)。釋放的t-dna受到蛋白vire2在整個(gè)單鏈上的鍵保護(hù)，其也負(fù)責(zé)在細(xì)菌細(xì)胞和植物細(xì)胞之間的途徑中的鏈的結(jié)構(gòu)組織。由基因座virb編碼的蛋白質(zhì)通過(guò)在膜和細(xì)胞壁之間形成通道孔確保通過(guò)細(xì)菌膜的通道(zambryski,1992，以上)。轉(zhuǎn)移的過(guò)程可以分為兩個(gè)主要步驟：在植物細(xì)胞中發(fā)生的細(xì)菌步驟和真核生物步驟(zupan&zambryski.1995.plantphysiology,rockville,v.107,p.1041-1047)。細(xì)菌步驟包括生產(chǎn)和輸出含有t-dna遺傳信息的功能載體(tinland.1996.theintegrationoft-dnaintoplantgenomes(將t-dna整合到植物基因組中).trendinplantscience,kidlington,v.1,p.178-183)。真核生物步驟包括土壤桿菌和宿主細(xì)胞之間的識(shí)別、植物發(fā)病機(jī)理信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)和vir基因的激活(sheng&citovsky.1996，以上)。由于待轉(zhuǎn)移的區(qū)段由其邊緣界定，所以野生型t-dna的編碼區(qū)可以被任何其他dna序列替代，而不損害其從土壤桿菌轉(zhuǎn)移到植物。通過(guò)t-dna的邊緣側(cè)翼的感興趣基因替代致癌基因提供了獲得轉(zhuǎn)基因植物的有效系統(tǒng)(brasileiro&dusi.1999，以上)。用于通過(guò)根癌土壤桿菌轉(zhuǎn)化的載體被稱(chēng)為“卸甲(disarmed)”，即，它們?cè)谄滟|(zhì)粒中不具有致癌基因，但是保留位于質(zhì)粒ti中的毒力基因(vir區(qū))(ream&gelvin.1996.crowgall:advancesinunderstandinginterkingdomgenetransfer(冠癭：在理解跨國(guó)基因轉(zhuǎn)移中的進(jìn)展).saintpaul:aps出版社148p)。這些質(zhì)粒體具有植物啟動(dòng)子和賦予抗生素抗性的細(xì)菌基因，使得這些標(biāo)記對(duì)于選擇細(xì)胞或轉(zhuǎn)化的植物是有效的。因此，將根癌土壤桿菌用作轉(zhuǎn)化載體，其中t-dna片段被消除并被感興趣的基因替代(saciloto.2003.insertionofthepr5kgeneinsugarcanewithaviewtoinducingresistancetothepucciniamelanocephalarustfungus(甘蔗中具有誘導(dǎo)對(duì)黑頂柄銹菌(pucciniamelanocephala)銹病菌(rustfungus)的抗性目的的pr5k基因的插入).74p.master’sdissertationpresentedbeforetheluizdequeirozsuperiorschoolofagriculture,universityofpaulo,piracicaba)，從而失去了引起腫瘤的能力，但能夠轉(zhuǎn)移外源dna。用卸甲的菌株接種的外植體具有再生能力和大的轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)百分比(brasileiro.1998.manualdegenéticadeplantas.brasília:embrapa,cenargen,309p)。甘蔗品種的多倍體和非整倍體基因組的復(fù)雜性(d′hont&glaszmann.2005.unravellingthegenomestructureofpolyploidsusingfishandgish(使用fish和gish解開(kāi)多倍體的基因組結(jié)構(gòu))；examplesofsugarcaneandbanana(甘蔗和香蕉的實(shí)例).cytogeneticandgenomeresearch,basel,v.109,n.1-3,p.27-33)，加至其相對(duì)有限的遺傳基礎(chǔ)，對(duì)常規(guī)植物育種技術(shù)的應(yīng)用造成重大困難。考慮到這種情況，生物技術(shù)可應(yīng)用于植物育種計(jì)劃，以克服或減少常規(guī)方法的一些限制，并且提高甘蔗生物燃料的生產(chǎn)率。為此，可以通過(guò)經(jīng)植物的遺傳轉(zhuǎn)化的基因工程將某些特征并入培養(yǎng)物中，以減少與害蟲(chóng)、植物雜草和疾病相關(guān)的生物脅迫以及與干旱、寒冷、鹽度及其他相關(guān)的生物脅迫的損失。生物技術(shù)還可以做出改變以優(yōu)化糖的含量和質(zhì)量(melotto-passarin.(2009).doctoratethesisinphysiologyandbiochemistryofplantspresentedatthe“l(fā)uizdequeiroz”superiorschoolofagriculture(在paulo大學(xué)“l(fā)uizdequeiroz”高等農(nóng)業(yè)學(xué)院呈現(xiàn)的植物生理學(xué)和生物化學(xué)方面的博士論文),piracicaba,148p.)。甘蔗呈現(xiàn)使得其成為通過(guò)遺傳轉(zhuǎn)化改進(jìn)的優(yōu)良植物的特征，諸如其體外從愈傷組織再生植物的能力(heinz等人1997.cell,tissueandorgancultureinsugarcaneimprovement(甘蔗改良中細(xì)胞、組織和器官培養(yǎng)).在:reinert&bajaj(編輯)appliedandfundamentalaspectsofplantcell,tissueandorganculture(植物細(xì)胞、組織和器官培養(yǎng)的應(yīng)用和基本方面).berlin:springerverlag,p.3-17；irvine1984.thefrequencyofmarkerchangeinsugarcaneplantsregeneratedfromcallusculture(從愈傷組織培養(yǎng)再生的甘蔗植物中標(biāo)記變化的頻率).plantcell,tissueandorganculture,dordrecht,v.3,n.3,p.201-209；chen等人1988.controlandmaintenanceofplantregenerationinsugarcanecalluscultures(甘蔗愈傷組織培養(yǎng)中植物再生的控制與維持).journalofexperimentalbotany,oxford,v.39,p.251-261)，以及其通過(guò)經(jīng)苗將穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化體分配給生產(chǎn)者的無(wú)性繁殖(營(yíng)養(yǎng)繁殖，vegetativepropagation)的商業(yè)規(guī)模的繁殖模式(gallo-meagher&irvine.1996.herbicideresistanttransgenicsugarcaneplantscontainingthebargene(含有bar基因的抗除草劑的轉(zhuǎn)基因的甘蔗植物).cropscience,madison,v.36,n.5,p.1367-1374)。相比之下，不允許在轉(zhuǎn)化中使用合子胚作為靶組織，與玉米、水稻、小麥和其他商業(yè)谷物作物相反。在過(guò)去十年，已經(jīng)進(jìn)行了各種研究以開(kāi)發(fā)甘蔗的遺傳轉(zhuǎn)化的有效方法(chen等人1987.transformationofsugarcaneprotoplastsbydirectuptakeofaselectablechimericgene(通過(guò)直接吸收可選擇的嵌合基因轉(zhuǎn)化甘蔗原生質(zhì)體).theplantcellreports,newyork,v.6,p.297-301；bower&birch.1992.theplantjournal,oxford,v.2,n.3,p.409-416；rathius&birch,r.g.1992.stabletransformationofcallusfromelectroporatedsugarcaneprotoplasts(來(lái)自電穿孔的甘蔗原生質(zhì)體的愈傷組織的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化).plantscience,amsterdam,v.82,p.81-89；smith等人1992.transientexpressionofthecoatproteinofsugarcanemosaicvirusinsugarcaneprotoplastsandexpressioninescherichiacoli(甘蔗花葉病毒的外殼蛋白在甘蔗原生質(zhì)體中的瞬時(shí)表達(dá)以及在大腸桿菌中的表達(dá)).archivesofvirology,vienna,v.125,p.15-23；birch&maretzki,a.1993.transformationofsugarcane(轉(zhuǎn)化甘蔗).在:bajaj,y.p.s.(編輯).plantprotoplastsandgeneticengineeringiv(植物原生質(zhì)體與基因工程iv).biotechnologyinagricultureandforestry.heidelberg:springer-verlag,v.23,p.348-360；gambley等人1993.microprojetiletransformationofsugarcanemeristemsandregenerationofshootsexpressingβ-glucuronidase(甘蔗分生組織的微彈(microprojetile)轉(zhuǎn)化和表達(dá)β-葡萄糖醛酸苷酶的芽的再生).theplantcellreports,newyork,v.12,p.343-346；gambley等人1994.australianjournalofplantphysiology,melbourne,v.21,p.603–612；birch.1997.planttransformation:problemsandstrategiesforpracticalapplication(植物轉(zhuǎn)化：實(shí)際應(yīng)用的問(wèn)題與對(duì)策).annualreviewofplantphysiologyandplantmolecularbiology,paloalto,v.48,p.297-326；arencibia.1998.anefficientprotocolforsugarcane(saccharumspp.l.)transformationmediatedbyagrobacteriumtumefaciens(對(duì)于由根癌土壤桿菌介導(dǎo)的甘蔗(甘蔗屬物種)轉(zhuǎn)化的有效方案).transgenicresearch,newyork,v.7,p.213-222；elliott等人1998.australianjournalofplantphysiology,melbourne,v.25,p.739-743；enriquez-obregon等人1998.plant,berlin,v.206,p.20-27；manickavasagam等人2004.agrobacterium-mediatedgenetictransformationanddevelopmentofherbicide-resistantsugarcane(saccharumspecieshybrids)usingaxillarybuds(使用腋芽的抗除草劑甘蔗(甘蔗屬物種雜種)的土壤桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化和發(fā)育).theplantcellreports,newyork,v.23,n.3,p.134-143)。使用電穿孔的不同轉(zhuǎn)化技術(shù)(rathius&birch.1992.stabletransformationofcallusfromelectroporatedsugarcaneprotoplasts(來(lái)自電穿孔的甘蔗原生質(zhì)體的愈傷組織的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化).plantscience,amsterdam,v.82,p.81-89)，用聚乙二醇(peg)處理(chen等人1987.transformationofsugarcaneprotoplastsbydirectuptakeofaselectablechimericgene(通過(guò)直接吸收可選擇的嵌合基因轉(zhuǎn)化甘蔗原生質(zhì)體).theplantcellreports,newyork,v.6,p.297-301)，微彈轟擊(基因槍?zhuān)琺icroprojectilebombardment)(franks&birch1991.genetransferintointactcellsusingmicroprojectilebombardment(使用微彈轟擊將基因轉(zhuǎn)移到完整細(xì)胞中).australianjournalofplantphysiology,melbourne,v.18,p.471-480)和根癌土壤桿菌(arencibia.1998.anefficientprotocolforsugarcane(saccharumspp.l.)transformationmediatedbyagrobacteriumtumefaciens(對(duì)于由根癌土壤桿菌介導(dǎo)的甘蔗(甘蔗屬物種)轉(zhuǎn)化的有效方案).transgenicresearch,newyork,v.7,p.213-222；elliott等人1998.agrobacterium-mediatedtransformationofsugarcaneusinggfpasascreenablemarker(土壤桿菌介導(dǎo)的使用gfp作為可篩選的標(biāo)記轉(zhuǎn)化甘蔗).australianjournalofplantphysiology,v.25,p.739-743)用于在細(xì)胞和甘蔗愈傷組織中引入標(biāo)記基因。在peg介導(dǎo)的原生質(zhì)體的dna轉(zhuǎn)移后，獲得了第一轉(zhuǎn)基因甘蔗細(xì)胞(chen等人1987.transformationofsugarcaneprotoplastsbydirectuptakeofaselectablechimericgene(通過(guò)直接吸收可選擇的嵌合基因轉(zhuǎn)化甘蔗原生質(zhì)體).theplantcellreports,newyork,v.6,p.297-301)。在有或沒(méi)有毒力基因抑制劑和其他改善感染的處理的情況下，使用根癌土壤桿菌首次嘗試轉(zhuǎn)化甘蔗沒(méi)有成功(birch&maretzki.(1993).transformationofsugarcane(轉(zhuǎn)化甘蔗).在:bajaj,y.p.s.(編輯).plantprotoplastsandgeneticengineeringiv(植物原生質(zhì)體與基因工程iv).biotechnologyinagricultureandforestry.heidelberg:springer-verlag,v.23,p.348–360)。然而，arencibia(1998.anefficientprotocolforsugarcane(saccharumspp.l.)transformationmediatedbyagrobacteriumtumefaciens(對(duì)于由根癌土壤桿菌介導(dǎo)的甘蔗(甘蔗屬物種)轉(zhuǎn)化的有效方案).transgenicresearch,newyork,v.7,p.213-222)能夠在用根癌土壤桿菌菌株lba4404和eha101共培養(yǎng)愈傷組織后再生形態(tài)上正常的轉(zhuǎn)基因的甘蔗植物。幾乎同時(shí)，enriquez-obregon等人(1998,plant,berlin,v.206,p.20-27)報(bào)道了對(duì)商業(yè)除草劑basta(活性成分草銨膦(phosphinothricine))有抗性的甘蔗植物的生產(chǎn)。然而，在出版物之后的時(shí)間，幾乎沒(méi)有實(shí)驗(yàn)室設(shè)法重復(fù)甘蔗中土壤桿菌的這些先進(jìn)工作。在適當(dāng)處理和控制體外培養(yǎng)條件的情況下，考慮胚培養(yǎng)物的最佳年齡、類(lèi)型和階段以及根癌土壤桿菌菌株的毒力的改善顯示了轉(zhuǎn)化效率的提高。這種自然轉(zhuǎn)化模型呈現(xiàn)出轉(zhuǎn)移相對(duì)長(zhǎng)的dna區(qū)段而無(wú)重排的優(yōu)點(diǎn)，從而將少量的轉(zhuǎn)基因拷貝以高表達(dá)率整合到基因組位點(diǎn)中，并且是一種簡(jiǎn)單且低成本的方法(melotto-passarin,2009，以上)。除了生產(chǎn)好的農(nóng)產(chǎn)品外，遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)還提供了研究數(shù)千種植物基因(具有已知功能和未知功能)的可能性，這些植物基因已被近幾年在世界各地進(jìn)行的無(wú)數(shù)基因組項(xiàng)目所鑒定(dong等人2005.plantphysiology,rockville,v.139,p.610-618)。雖然由土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法被用于甘蔗的遺傳操作，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員普遍認(rèn)識(shí)到，方法的效率和再現(xiàn)性也構(gòu)成了待克服的挑戰(zhàn)。在用于轉(zhuǎn)化植物的任何技術(shù)中，存在影響植物中感興趣基因的轉(zhuǎn)移成功以及其隨后穩(wěn)定的整合和表達(dá)的多種因素?？赡苡绊戅D(zhuǎn)化成功的方面之一是與被轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞相關(guān)的土壤桿菌的生長(zhǎng)。眾所周知，如果土壤桿菌的生長(zhǎng)加劇，則從轉(zhuǎn)化細(xì)胞再生植物的機(jī)會(huì)降低。這可能是由于在組織首先經(jīng)歷氧化和褐變過(guò)程和隨后死亡的過(guò)程中由土壤桿菌誘導(dǎo)的壞死。用土壤桿菌接種植物組織本身就是釋放超敏反應(yīng)的過(guò)程，從而導(dǎo)致組織的低存活率。因此，規(guī)劃合適的人工環(huán)境以最大限度地減少由植物組織與土壤桿菌相互作用造成的損害對(duì)于遺傳轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)的成功是至關(guān)重要的。文獻(xiàn)wo200109302公開(kāi)了通過(guò)在土壤桿菌與植物組織的接種和共培養(yǎng)期間使用抑制劑以改善轉(zhuǎn)化效率的形式來(lái)控制土壤桿菌的生長(zhǎng)。優(yōu)選的抑制劑是含有重金屬的化合物(諸如硝酸銀或硫代硫酸銀)、抗生素(諸如羧芐青霉素(carbenicillin))以及抗生素和克拉維酸(clavulanicacid)的組合(諸如阿莫西林鈉-克拉維酸鉀(奧格門(mén)汀/安美汀，augmentin)或特美汀(timetin))。文獻(xiàn)us6,323,396公開(kāi)了一種使用在至關(guān)重要特定生物分子的生物合成上有缺陷的突變土壤桿菌獲得轉(zhuǎn)基因植物的方法。這將使待轉(zhuǎn)化的組織的受控全身感染能夠維持長(zhǎng)時(shí)間，從而增加感染成功的可能性。通過(guò)從孵育培養(yǎng)基中省略這些營(yíng)養(yǎng)物來(lái)消除土壤桿菌。文獻(xiàn)wo2010151634公開(kāi)了在沒(méi)有培養(yǎng)基的情況下干燥條件下的共培養(yǎng)，提及了這有益地減少接種的植物組織的壞死/凋亡，除了在選擇和再生步驟(典型地在共培養(yǎng)步驟之后)期間改進(jìn)了隨后的細(xì)胞存活。文獻(xiàn)wo98/54961公開(kāi)了包括在含有乙烯或乙烯生物合成抑制劑的壞死抑制培養(yǎng)基中培養(yǎng)的抗壞死處理，在與土壤桿菌共培養(yǎng)之前細(xì)胞或組織的熱沖擊處理和用遺傳序列(諸如p35、iap和dad-1)對(duì)禾草(主要是玉米)的細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。文獻(xiàn)wo01/44459描述了抑制在由土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化期間與植物組織褐變相關(guān)的酶(諸如多酚氧化酶(ppo)和過(guò)氧化物酶(pod))的活性或產(chǎn)生的試劑、酶活性所需的金屬螯合劑和含巰基的試劑(例如l-半胱氨酸、半胱氨酸、dtt、抗壞血酸、硫代硫酸鈉和谷胱甘肽)。抑制酶包括氧化酶(ppo)和過(guò)氧化物酶。鑒于現(xiàn)有技術(shù)的該問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種通過(guò)在土壤桿菌與待轉(zhuǎn)化的植物組織共培養(yǎng)期間建立新培養(yǎng)條件而有助于遺傳植物育種程序和新基因(包括具有復(fù)雜多基因特征的那些基因)的功能研究的遺傳轉(zhuǎn)化方法，從而導(dǎo)致與現(xiàn)有方法相比的改善。本發(fā)明人認(rèn)為，由于獲得的優(yōu)點(diǎn)和意想不到的效果，本申請(qǐng)?zhí)岢龅姆椒捎兄谧钚』信d趣植物(包括但不限于甘蔗)的遺傳育種的固有限制。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種使用土壤桿菌轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或植物組織的方法，包括以下步驟：(a)使植物細(xì)胞或組織與含有至少待轉(zhuǎn)移到所述植物細(xì)胞或組織的感興趣的核苷酸序列的土壤桿菌接觸；(b)在能夠支持植物細(xì)胞或組織生長(zhǎng)并抑制土壤桿菌生長(zhǎng)的共培養(yǎng)培養(yǎng)基中共培養(yǎng)植物細(xì)胞或組織；(c)在包含能夠抑制土壤桿菌生長(zhǎng)的試劑和對(duì)轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的選擇劑的培養(yǎng)基中培養(yǎng)步驟(b)的細(xì)胞或組織；(d)選擇至少包含感興趣的序列的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。在一種實(shí)施方式中，該方法另外包括再生轉(zhuǎn)基因植物。在另外的實(shí)施方式中，與相同基因型的非轉(zhuǎn)基因植物相比，轉(zhuǎn)基因植物是農(nóng)藝上優(yōu)良的。在一種實(shí)施方式中，共培養(yǎng)培養(yǎng)基包括使用高于制造商推薦的濃度的以下膠凝劑濃度：瓊脂、agargeltm、phytablendtm、agargellantm、phytageltm、gelzantm、卡拉膠(carrageenan)和結(jié)冷膠(gellangum)。在另外的實(shí)施方式中，膠凝劑的濃度是對(duì)于瓊脂為超過(guò)至少10g/l或?qū)τ赼gargeltm為超過(guò)至少5g/l或?qū)τ赼gargellan為超過(guò)至少5g/l或超過(guò)至少9g/l的phytablendtm或超過(guò)至少2.5g/l的phytageltm或超過(guò)至少4g/l的gelzantm或超過(guò)至少4g/l的結(jié)冷膠或超過(guò)至少10g/l的卡拉膠。在另一實(shí)施方式中，待轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞或組織來(lái)自單子葉植物或雙子葉植物，其中所選擇的單子葉植物可以是水稻、玉米、小麥、高粱、燕麥、芒草(miscanthus)、大麥、其他禾草(grass)和甘蔗。另一方面，本發(fā)明提供了一種通過(guò)以上限定的方法所產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植物、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因組織。在一種實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)基因植物是甘蔗。在另一其他方面，本發(fā)明提供了一種包括使用高于制造商推薦的濃度的膠凝劑濃度的培養(yǎng)基。在一種實(shí)施方式中，培養(yǎng)基包含比本領(lǐng)域通常使用的膠凝劑濃度更大的膠凝劑濃度。在另一實(shí)施方式中，所選擇的膠凝劑是瓊脂、agargeltm、phytablendtm、agargellantm、phytageltm、gelzantm、卡拉膠和結(jié)冷膠，其中膠凝劑的濃度是對(duì)于瓊脂超過(guò)至少10g/l或?qū)τ赼gargeltm是超過(guò)至少5g/l或?qū)τ赼gargellan是超過(guò)至少5g/l或?qū)τ趐hytablendtm是超過(guò)至少9g/l或?qū)τ趐hytageltm是超過(guò)至少2.5g/l或?qū)τ趃elzantm是超過(guò)至少4g/l或?qū)τ诮Y(jié)冷膠是超過(guò)至少4g/l或?qū)τ诳ɡz是超過(guò)至少10g/l。在另一實(shí)施方式中，共培養(yǎng)培養(yǎng)基能夠抑制土壤桿菌的加劇生長(zhǎng)和組織的死亡，和/或提供更大的轉(zhuǎn)化頻率。在另一方面，本發(fā)明提供如上所提供的轉(zhuǎn)化方法用于獲得在與相同基因型的非轉(zhuǎn)基因植物相比下農(nóng)藝上優(yōu)良的轉(zhuǎn)基因植物的用途。附圖說(shuō)明圖1：在共培養(yǎng)三天后土壤桿菌在甘蔗愈傷組織上的生長(zhǎng)。a：在7g/l的agargeltm中的共培養(yǎng)；b：在28g/l的agargeltm中的共培養(yǎng)。圖2：經(jīng)受本發(fā)明的共培養(yǎng)系統(tǒng)的材料(28g/l的agargeltm)。a：在具有50mg/l的遺傳霉素(geneticin)的選擇的再生培養(yǎng)基1中30天。b：在具有50mg/l遺傳霉素的選擇的培養(yǎng)基中，以60天的可追蹤事件再生的植物。圖3：ctc15品種的gus組織化學(xué)評(píng)價(jià)結(jié)果。柱cc7：在7g/l的agargeltm中實(shí)現(xiàn)的共培養(yǎng)；柱cc14：在14g/l的agargeltm中實(shí)現(xiàn)的共培養(yǎng)；柱cc28：在28g/l的agargeltm中實(shí)現(xiàn)的共培養(yǎng)。圖4：對(duì)于9001品種的gus組織化學(xué)評(píng)價(jià)結(jié)果。柱cc7：在7g/l的agargeltm中實(shí)現(xiàn)的共培養(yǎng)；柱cc28：在28g/l的agargeltm中實(shí)現(xiàn)的共培養(yǎng)。圖5：在共培養(yǎng)培養(yǎng)基中不同濃度的agargeltm在ctc15和ctc20品種中的評(píng)估結(jié)果。柱cc0：在液體培養(yǎng)基中實(shí)現(xiàn)的共培養(yǎng)；cc7：在7g/l的agargeltm中實(shí)現(xiàn)的共培養(yǎng)；cc14：在14g/l的agargeltm中實(shí)現(xiàn)的共培養(yǎng)；cc21：在21g/l的agargeltm中實(shí)現(xiàn)的共培養(yǎng)；cc28：在28g/l的agargeltm中實(shí)現(xiàn)的共培養(yǎng)；cc35：在35g/l的agargeltm中實(shí)現(xiàn)的共培養(yǎng)；cc42：在42g/l的agargeltm中實(shí)現(xiàn)的共培養(yǎng)；cc49：在49g/l的agargeltm中實(shí)現(xiàn)的共培養(yǎng)。圖6：ctc15品種的轉(zhuǎn)化效率結(jié)果(陽(yáng)性事件數(shù)/g轉(zhuǎn)化的愈傷組織)。柱cc0：在液體培養(yǎng)基中實(shí)現(xiàn)的共培養(yǎng)；cc7：在7g/l的agargeltm中實(shí)現(xiàn)的共培養(yǎng)；cc14：在14g/l的agargeltm中實(shí)現(xiàn)的共培養(yǎng)；cc21：在21g/l的agargeltm中實(shí)現(xiàn)的共培養(yǎng)；cc28：在28g/l的agargeltm中實(shí)現(xiàn)的共培養(yǎng)；cc35：在35g/l的agargeltm中實(shí)現(xiàn)的共培養(yǎng)；cc42：在42g/l的agargeltm中實(shí)現(xiàn)的共培養(yǎng)；cc49：在49g/l的agargeltm中實(shí)現(xiàn)的共培養(yǎng)。圖7：ctc20品種的轉(zhuǎn)化效率結(jié)果(陽(yáng)性事件數(shù)/g轉(zhuǎn)化的愈傷組織)。柱cc0：在液體培養(yǎng)基中實(shí)現(xiàn)的共培養(yǎng)；cc7：在7g/l的agargeltm中實(shí)現(xiàn)的共培養(yǎng)；cc14：在14g/l的agargeltm中實(shí)現(xiàn)的共培養(yǎng)；cc21：在21g/l的agargeltm中實(shí)現(xiàn)的共培養(yǎng)；cc28：在28g/l的agargeltm中實(shí)現(xiàn)的共培養(yǎng)；cc35：在35g/l的agargeltm中實(shí)現(xiàn)的共培養(yǎng)；cc42：在42g/l的agargeltm中實(shí)現(xiàn)的共培養(yǎng)；cc49：在49g/l的agargeltm中實(shí)現(xiàn)的共培養(yǎng)。圖8：ctc15品種的轉(zhuǎn)化效率結(jié)果(陽(yáng)性事件數(shù)/g轉(zhuǎn)化的愈傷組織)。柱cc7：在7g/l的agargeltm中實(shí)現(xiàn)的共培養(yǎng)；cc14：在14g/l的agargeltm中實(shí)現(xiàn)的共培養(yǎng)；cc28：在28g/l的agargeltm中實(shí)現(xiàn)的共培養(yǎng)。圖9：9001品種的轉(zhuǎn)化效率結(jié)果(陽(yáng)性事件數(shù)/g轉(zhuǎn)化的愈傷組織)。柱cc7：在7g/l的agargeltm中實(shí)現(xiàn)的共培養(yǎng)；cc28：在28g/l的agargeltm中實(shí)現(xiàn)的共培養(yǎng)。具體實(shí)施方式除非另有定義，本文使用的所有技術(shù)術(shù)語(yǔ)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域中技術(shù)人員所理解的相同的含義。在本發(fā)明的描述中所使用的術(shù)語(yǔ)的目的是僅描述具體實(shí)施方式，并且并非被設(shè)計(jì)為限制教導(dǎo)的范圍。除非另有說(shuō)明，否則表示量、百分比和比例的所有數(shù)字以及說(shuō)明書(shū)中和權(quán)利要求書(shū)中所使用的其他數(shù)字應(yīng)被理解為在所有情況下通過(guò)術(shù)語(yǔ)“約”來(lái)修飾。因此，除非另有說(shuō)明，否則說(shuō)明書(shū)中和權(quán)利要求書(shū)中所示的數(shù)值參數(shù)是可根據(jù)待獲得的性質(zhì)而變化的近似值。提供由土壤桿菌介導(dǎo)的用于轉(zhuǎn)化植物的組合物和方法。組合物包括包含組織培養(yǎng)領(lǐng)域中已知的組分和高濃度的膠凝劑的培養(yǎng)基。本發(fā)明的培養(yǎng)基用于植物轉(zhuǎn)化方法，導(dǎo)致提高了轉(zhuǎn)化效率并降低了組織壞死。轉(zhuǎn)化的植物、轉(zhuǎn)化的植物的細(xì)胞、組織和種子也在本文中描述。本發(fā)明的發(fā)明人意外地注意到，在轉(zhuǎn)化過(guò)程中(特別是在共培養(yǎng)步驟中)使用高濃度的膠凝劑導(dǎo)致在接種的植物組織旁邊的細(xì)菌生長(zhǎng)較少，以及因此導(dǎo)致降低的細(xì)胞死亡率和增強(qiáng)的轉(zhuǎn)化效率。在一個(gè)方面，提供了用于轉(zhuǎn)化植物、植物組織或植物細(xì)胞的方法。本文所提供的方法基于由土壤桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移以產(chǎn)生具有目的核苷酸序列的再生植物細(xì)胞。眾所周知，由土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法利用土壤桿菌屬細(xì)菌的天然能力將dna轉(zhuǎn)移到植物染色體中。由土壤桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)化方法在本領(lǐng)域中是已知的。用于轉(zhuǎn)化植物(更優(yōu)選地是甘蔗)的任何合適的方法可用于本發(fā)明的方法中。參見(jiàn)例如wo2010151634；wo2011163292；us5,563,05；us5,981,840；wo94/00977；us5,591,616,negrotto等人2000.plantcellreports19:798-803,arencibia等人1998.transgenicres.7:123-222；arencibia&carmona"sugarcane(saccharumspp.)(“甘蔗(甘蔗屬物種)).2007,inmethodsinmolecularbiology,agrobacteriumprotocols,vol.2,ed.wang(第二版,humanapress,inc.),pp.227-235；delariva等人1998.electron.j.biotechnol.1:118-133；manickavasagam等人2004.plantcellrep.23:134-143；opabode.2006.biotechnol.mol.biol.rev.1:12-20；以及zhang等人2006.jintegr.plantbiol.48:453-459。本發(fā)明的方法代表植物轉(zhuǎn)化和獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的植物(特別是甘蔗)的改進(jìn)，但不限于此，包括在共培養(yǎng)步驟中使用改良的培養(yǎng)基。因此，用于生產(chǎn)具有感興趣的核苷酸序列的可再生植物細(xì)胞的方法通常包括以下步驟：(a)使植物的組織或細(xì)胞與包含載體的土壤桿菌接觸，該載體包含至少一個(gè)包含感興趣的序列的表達(dá)盒，(b)在存在本文所提供的培養(yǎng)基的情況下，將所述組織或所述細(xì)胞與所述土壤桿菌在支持物中共培養(yǎng)；(c)在包含能夠抑制土壤桿菌生長(zhǎng)的試劑和對(duì)轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的選擇劑的培養(yǎng)基中培養(yǎng)步驟(b)的所述組織或所述細(xì)胞；以及(d)選擇至少包含感興趣的序列的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。可選地，該方法可另外包括再生轉(zhuǎn)基因植物的步驟。如本文所用的，“植物”是指整個(gè)植物、植物組織、植物部分(諸如胚)、植物細(xì)胞或一組植物細(xì)胞?？捎糜诒景l(fā)明方法的植物種類(lèi)包括能夠被土壤桿菌轉(zhuǎn)化的植物，包括單子葉植物和雙子葉植物二者。更優(yōu)選地，植物是單子葉植物，并且甚至更優(yōu)選地是用作食物或能量產(chǎn)生的那些植物，諸如水稻、玉米、小麥、大麥、小米、高粱、黑麥、小黑麥(triticale)、甘蔗和其他物種，諸如蔗茅(erianthus)、芒屬(miscanthus)、河八王屬(narenga)、硬穗屬(sclerostachya)和短柄草屬(brachypodium)。包括以下所有的屬：分枝竹(bambusoideae)亞科(例如，簕竹屬(bambusa))，須芒草亞科(andropogonoideae)(例如甘蔗屬、高粱屬(sorghum)和玉蜀黍?qū)?zea))，蘆竹族(arundineae)(例如蘆葦屬(phragmites))，稻亞科(oryzoideae)(例如稻屬(oryza))，黍亞科(panicoideae)(例如黍?qū)?panicum)、狼尾草屬(pennisetum)和狗尾草屬(setaria))，早熟禾亞科(羊茅亞科(festuciadeae))(例如早熟禾屬(poa)、羊茅屬(festuca)、黑麥草屬(lolium)、三毛草屬(trisetum)、剪股穎屬(agrostis)、梯牧草屬(phleum)、鴨茅屬(dactylis)、看麥娘屬(alopecurus)、燕麥屬(avena)、小麥屬(triticum)、黑麥屬(secale)和大麥屬(hordeum))。更具體地，可以根據(jù)本發(fā)明轉(zhuǎn)化的植物是甘蔗?！案收帷北焕斫鉃楦收釋僦参?，優(yōu)選地為物種甘蔗(saccharumofficinarum)、甜根子草(s.spontaneum)、大莖野生種(s.robustum)、細(xì)稈甘蔗(s.berberi)、竹蔗(s.sinense)、食穗種(s.edule)、埃及種(s.aegyptiacum)、甜蔗(s.esculentum)、s.aenicol、斑茅(s.arundinaceum)、肉質(zhì)花穗野生種(s.bengalense)、雙花甘蔗(s.biflorum)、s.ciliare、甘蔗水紅木(s.cylindricum)、s.elephantinum、s.exaltatum、金貓尾(s.fallax)、s.floridulum、大甘蔗(s.giganteum)、白木烏桕(s.japonicum)、s.koenigii、兔尾狀甘蔗(s.laguroides)、纖毛甘蔗(s.munja)、河八王甘蔗(s.narenga)、s.paniceum、s.pophyrocoma、紫紋甘蔗(s.purpuratum)、田茅(s.ravennae)、紅毛草甘蔗(s.roseum)、s.sanguineum、s.sara、中華甘蔗(s.chinense)、s.tinctorium、蒲葦甘蔗(s.versicolor)、紫葉甘蔗(s.violaceum)。甚至更優(yōu)選地，這些是通過(guò)對(duì)商業(yè)物種及其品種進(jìn)行雜交育種所產(chǎn)生的種間雜種?！皩?duì)照”或“植物對(duì)照”提供了用于測(cè)量植物或遺傳改變的植物細(xì)胞中表型變化的參考點(diǎn)。它可以包括，例如：(a)野生型植物或細(xì)胞，即具有與用于產(chǎn)生改變的植物或細(xì)胞的遺傳改變的啟動(dòng)材料相同的基因型；(b)與啟動(dòng)材料相同的基因型但是以無(wú)效構(gòu)建體(即，具有對(duì)于目的性狀沒(méi)有已知作用的構(gòu)建體)進(jìn)行轉(zhuǎn)化的植物或細(xì)胞；(c)在改變的植物或植物細(xì)胞的子代內(nèi)是未轉(zhuǎn)化的分離體(segregant)的植物或植物細(xì)胞，；(d)遺傳上與植物或植物細(xì)胞相同但不暴露于誘導(dǎo)感興趣基因表達(dá)的條件或刺激物的植物或植物細(xì)胞；或(e)在感興趣基因未被表達(dá)的條件下的植物或植物細(xì)胞本身。在步驟a)中，使細(xì)胞或植物組織與土壤桿菌接觸。這是接種階段，并且可以在室溫下和有或沒(méi)有攪拌下持續(xù)至少約一分鐘直至約12小時(shí)、更優(yōu)選地從約5分鐘至約2.5小時(shí)、甚至更優(yōu)選地從約25分鐘至約40分鐘。在接種期間，可以應(yīng)用一些處理來(lái)輔助感染，諸如例如，土壤桿菌溶液的真空滲透和超聲處理。例如，在真空滲透中，與細(xì)菌懸浮液接觸的組織或植物細(xì)胞經(jīng)受真空壓力，優(yōu)選地為-300mmhg至-1000mmhg、更優(yōu)選地為400mmhg至800mmhg、甚至更優(yōu)選地為-500mmhg至-700mmhg，通常進(jìn)行1至10分鐘、更優(yōu)選地為1至7分鐘、甚至更優(yōu)選地為1至5分鐘的時(shí)間段。在另一非限制性實(shí)例中，真空滲透發(fā)生在-700mmhg的真空壓力下持續(xù)5分鐘。此外，在該接種階段，為了提高轉(zhuǎn)化效率，可以在土壤桿菌的懸浮液內(nèi)加入添加劑(諸如乙酰丁香酮)和表面活性劑。可選地，在一些實(shí)施方式中，在上述步驟a)之前，待感染的細(xì)胞或植物組織可以進(jìn)行溫度沖擊預(yù)處理，其中將所述組織或細(xì)胞置于液體植物培養(yǎng)基諸如murashige和skook、gamborg's、chu(n6)、schenk和hildebrand以及本領(lǐng)域技術(shù)人員其他已知的培養(yǎng)基中，所述培養(yǎng)基在將進(jìn)行熱沖擊預(yù)處理的溫度下預(yù)熱。然后將組織或植物細(xì)胞在溫度高于將發(fā)生的接種溫度(例如室溫)的溫度下在培養(yǎng)箱或水加熱槽(熱水浴，waterheatingbath)中孵育。因此例如，溫度沖擊預(yù)處理的溫度可以發(fā)生在約30℃至約55℃、優(yōu)選地約35℃至約50℃、甚至更優(yōu)選地約40℃至45℃的溫度下持續(xù)約1分鐘至約60分鐘、約1分鐘至約50分鐘、約1分鐘至約40分鐘、約1分鐘至約30分鐘、約1分鐘至約20分鐘、約1分鐘至約15分鐘、約1分鐘至約10分鐘分鐘或約1分鐘至約5分鐘的時(shí)間。在另一非限制性實(shí)例中，溫度沖擊處理包括將組織或植物細(xì)胞放置并保持在預(yù)熱至約45℃溫度的液體植物培養(yǎng)基中持續(xù)約5分鐘。此后，丟棄液體培養(yǎng)基，并且用如下所述制備的土壤桿菌懸浮液代替。土壤桿菌在本發(fā)明方法(在上述步驟a)中)中的有用濃度可以根據(jù)所使用的土壤桿菌的菌株、待轉(zhuǎn)化的組織或細(xì)胞、待轉(zhuǎn)化的基因型等而變化。盡管土壤桿菌的濃度可能變化，但通常使用的od600在約0.001至約5的范圍內(nèi)、更優(yōu)選地在約0.05至約2的范圍內(nèi)，并且甚至更優(yōu)選地在約0.1至約1.0的范圍內(nèi)。各種土壤桿菌物種在本領(lǐng)域中是已知的，其可用于本發(fā)明的方法中。參見(jiàn)例如，hooykaas.1989.plantmol.biol.13:327；smith,等人1995.cropscience35:301；chilton.1993.proc.natl.acad.sci.usa90:3119；mollony等人1993.monographtheorapplgenetny,springerverlag19:148,lshida等人1996.naturebiotechnol.14:745；komari,等人1996.theplantjournal10:165。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，土壤桿菌菌株的實(shí)例包括但不限于lba4404、eha101、eha105、agl1、c58c1、gv3101、gv2260等。本發(fā)明的方法中使用的土壤桿菌菌株被修飾為包含一個(gè)或多個(gè)感興趣的基因或者在轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中待表達(dá)的核酸。待轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞的核酸被并入到t-區(qū)中并且側(cè)翼是t-dna的邊緣序列。在ti質(zhì)粒中，該區(qū)域與vir區(qū)域不同，其功能是負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)移和整合。已經(jīng)開(kāi)發(fā)了二元載體的系統(tǒng)，其中被操作成攜帶外源dna和vir功能的卸甲的t-dna存在于分離的質(zhì)粒中。因此，在大腸桿菌中復(fù)制的小質(zhì)粒中構(gòu)建包含外源dna(待轉(zhuǎn)移的核苷酸序列)的修飾的t-dna。該質(zhì)粒通過(guò)三親本接合而轉(zhuǎn)移到根癌土壤桿菌，其含有攜帶毒力基因的相容質(zhì)粒。以反式提供vir功能以將t-dna轉(zhuǎn)移至植物基因組。所述二元載體在本發(fā)明的實(shí)踐中是有用的。因此，明顯的是，植物的轉(zhuǎn)化可能涉及構(gòu)建將在特定細(xì)胞中起作用的表達(dá)盒或表達(dá)載體。所述表達(dá)盒或載體可以包括包含在調(diào)控元件(例如，啟動(dòng)子)的控制下或者可操作性地連接到調(diào)控元件的基因的dna。表達(dá)盒或表達(dá)載體可以含有一個(gè)或多個(gè)基因，諸如可操作性地連接的基因和調(diào)控元件的組合。載體可以是質(zhì)粒，并且可以單獨(dú)使用或者與其他質(zhì)粒組合地使用，以使用轉(zhuǎn)化方法提供經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞來(lái)將感興趣的遺傳序列并入到植物細(xì)胞的遺傳物質(zhì)內(nèi)。術(shù)語(yǔ)dna或“異源”基因、“引入的”、“外源”或“轉(zhuǎn)基因的”是指在細(xì)胞或靶植物的基因組中天然不存在或在被轉(zhuǎn)化的靶植物中在不同位置或在基因組中以相對(duì)于未轉(zhuǎn)化植物不同的關(guān)聯(lián)而存在的重組dna序列或基因。將包含感興趣的核酸的載體引入到土壤桿菌中。術(shù)語(yǔ)“引入”是指在真核細(xì)胞或原核細(xì)胞中提供核酸(例如基因構(gòu)建體、表達(dá)盒)?！耙搿卑▍⒖挤€(wěn)定的轉(zhuǎn)化方法或瞬時(shí)轉(zhuǎn)化方法，以及交叉育種。因此，“引入”包括并入到細(xì)胞的基因組(例如染色體、質(zhì)粒、質(zhì)體或線粒體的dna)中、被轉(zhuǎn)化為自主復(fù)制子或被瞬時(shí)表達(dá)(例如轉(zhuǎn)染的mrna)。本發(fā)明中使用的一般的分子技術(shù)例如由sambrook等人(編輯).1989.molecularcloning:alaboratorymanual,coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,ny提供。通過(guò)遺傳轉(zhuǎn)化，與相同基因型的非轉(zhuǎn)化植物相比可以將植物(優(yōu)選甘蔗植物)修飾成表現(xiàn)出改善的或優(yōu)良的農(nóng)藝學(xué)性狀。例如，可以修飾轉(zhuǎn)基因植物，以便表達(dá)具有對(duì)疾病和昆蟲(chóng)抗性的、具有對(duì)除草劑耐受性的基因，其賦予營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，蔗糖的、纖維的含量的增加，對(duì)植物生長(zhǎng)的影響，對(duì)非生物脅迫的耐受性，生物量的生產(chǎn)增加，木質(zhì)素含量(組成/含量)的改變，不育等。適當(dāng)時(shí)，可以修飾待轉(zhuǎn)移到植物的感興趣的序列以優(yōu)化表達(dá)。例如，可以修飾序列以改善單子葉植物中(更優(yōu)選甘蔗中)的表達(dá)。用于合成優(yōu)化的方法可獲自例如us5,380,831；us5,436,391和murray等人1989.nucleicacidsres.17：477-498的技術(shù)。靶植物的優(yōu)選密碼子可以由感興趣的靶植物中的較高頻率密碼子來(lái)確定?？梢赃M(jìn)行其他修飾以便增加靶植物中的基因表達(dá)，包括例如消除假多聚腺苷酸化(spuriouspolyadenylation)信號(hào)、外顯子-內(nèi)含子剪接信號(hào)、類(lèi)似轉(zhuǎn)座子重復(fù)等。可以將序列的g-c含量調(diào)整到給定靶植物的平均水平，該平均水平是以靶植物中所表達(dá)的已知基因作為參照而計(jì)算的。此外，可以修飾序列以便防止mrna中的發(fā)夾結(jié)構(gòu)。待轉(zhuǎn)移的核酸可以包含在dna構(gòu)建體或表達(dá)盒內(nèi)。構(gòu)建體或表達(dá)盒將包含與感興趣的基因的核酸連接的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)。所述表達(dá)盒設(shè)置有用于插入一個(gè)或多個(gè)感興趣的基因的多個(gè)限制性位點(diǎn)，使得它們保留在調(diào)節(jié)區(qū)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)之下。一個(gè)或多個(gè)表達(dá)盒可用于本發(fā)明的實(shí)踐中。轉(zhuǎn)錄起始區(qū)(啟動(dòng)子)可以是對(duì)宿主天然的或同源的或外源的或異源的。如本文所用的，嵌合基因包含可操作性地連接到轉(zhuǎn)錄起始區(qū)的編碼序列，該轉(zhuǎn)錄起始區(qū)對(duì)于編碼區(qū)是異源的。該盒在5'-3'轉(zhuǎn)錄方向?qū)ǎ恨D(zhuǎn)錄起始區(qū)和翻譯起始區(qū)、感興趣的dna序列、植物中的功能轉(zhuǎn)錄和翻譯終止區(qū)。除了植物啟動(dòng)子之外，源自多種來(lái)源的啟動(dòng)子可以有效地用于植物細(xì)胞中以表達(dá)感興趣的基因。例如，可以使用：細(xì)菌啟動(dòng)子，諸如章魚(yú)堿合酶啟動(dòng)子(octopinesynthasepromoter)、胭脂堿合酶啟動(dòng)子(nopalinesynthasepromoter)、甘露堿合酶啟動(dòng)子；病毒來(lái)源的啟動(dòng)子，諸如花椰菜花葉病毒(camv)的啟動(dòng)子35s和19s、甘蔗桿狀病毒的啟動(dòng)子等。源自植物的啟動(dòng)子包括但不限于：核酮糖-1,6-二磷酸(rubp)羧化酶的小亞基的啟動(dòng)子、β-伴大豆球蛋白(beta-conglycinin)啟動(dòng)子、菜籽蛋白(phaseolin)啟動(dòng)子、醇脫氫酶(alcoholdehydrogenase)啟動(dòng)子(adh)、溫度沖擊蛋白(temperatureshockprotein)的啟動(dòng)子、肌動(dòng)蛋白解聚因子(adf)的啟動(dòng)子和組織特異性(tissue-specific)啟動(dòng)子。啟動(dòng)子還可以含有某些作為可以提高轉(zhuǎn)錄效率的增強(qiáng)子起作用的元件。典型的增強(qiáng)子包括但不限于，醇脫氫酶(adh)的內(nèi)含子1和adh-1的內(nèi)含子6。還可以使用組成型啟動(dòng)子。組成型啟動(dòng)子在幾乎所有細(xì)胞類(lèi)型和幾乎所有的時(shí)間中指引連續(xù)的基因表達(dá)。實(shí)例包括但不限于，肌動(dòng)蛋白、泛素(ubiquitin)和camv35s的啟動(dòng)子。組織特異性啟動(dòng)子負(fù)責(zé)特異性細(xì)胞或組織類(lèi)型中的基因表達(dá)。可以使用的組織特異性啟動(dòng)子的實(shí)例包括在植物發(fā)育的某一階段是有活性的那些啟動(dòng)子。這種啟動(dòng)子的實(shí)例包括但不限于，根特異性、花粉、葉、胚等。在某些情況下，可能期望使用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子負(fù)責(zé)表達(dá)對(duì)特定信號(hào)(諸如物理刺激(例如熱沖擊基因)、光(例如核酮糖-雙磷酸羧化酶1.5)、激素(例如糖皮質(zhì)激素)、抗生素(例如四環(huán)素)、代謝物和脅迫(例如干旱))反應(yīng)的基因?？梢允褂弥参镏械钠渌δ苻D(zhuǎn)錄和翻譯元件，諸如，例如非翻譯的5'前導(dǎo)序列、3'轉(zhuǎn)錄終止序列和多聚腺苷酸添加信號(hào)序列。植物表達(dá)盒可以包括至少一個(gè)可操作性地連接至調(diào)節(jié)元件(例如，啟動(dòng)子)的遺傳標(biāo)記，該遺傳標(biāo)記使得含有該標(biāo)記的轉(zhuǎn)化細(xì)胞能夠通過(guò)陰性選擇(即，抑制不含選擇標(biāo)記基因的細(xì)胞生長(zhǎng))或通過(guò)陽(yáng)性選擇(即，篩選由遺傳標(biāo)記產(chǎn)生的產(chǎn)物)而回收。適合于轉(zhuǎn)化植物的許多遺傳標(biāo)記基因是已知的，并且包括例如對(duì)可代謝地解毒選擇性化學(xué)試劑(其可能是抗生素或除草劑)的酶進(jìn)行編碼的基因，或者對(duì)可能對(duì)抑制劑敏感的改變的靶進(jìn)行編碼的基因。一些陽(yáng)性選擇的方法在本領(lǐng)域中是已知的。因此，基因選擇標(biāo)記使得能夠選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞，而不含有所插入的dna的細(xì)胞的生長(zhǎng)可被該選擇化合物抑制。對(duì)于一個(gè)選擇標(biāo)記基因的優(yōu)選在技術(shù)人員的判斷下發(fā)生，但可以使用以下選擇標(biāo)記中的任一種以及此處未列出的任何其他基因。選擇標(biāo)記的實(shí)例包括但不限于對(duì)卡那霉素(kanamycin)、潮霉素(hygromycin)、博萊霉素(bleomycin)、g418、甲氨蝶呤(methotrexate)、磷絲菌素(phosphinothricin)(雙丙氨磷(bialaphos))、咪唑啉酮(imidazolinone)、草甘膦(glyphosate)、磺脲類(lèi)(sulfonylureas)和三唑并嘧啶(triazolopyrimidine)除草劑(諸如氯磺隆(chlorosulforon)、溴苯腈(bromoxynil)和茅草枯(dalapon))的抗性或耐受性。除了選擇標(biāo)記之外，可能需要使用報(bào)告基因。在一些情況下，可以使用報(bào)告基因而不同時(shí)使用選擇標(biāo)記。報(bào)告基因是通常對(duì)生物或組織受體不提供任何優(yōu)點(diǎn)并且通常編碼提供表型變化或酶性質(zhì)的蛋白質(zhì)的基因。合適的報(bào)告基因包括但不限于在美國(guó)專(zhuān)利號(hào)7,951,923中所描述的β-葡糖醛酸糖苷酶基因(gus)、螢火蟲(chóng)熒光素酶或熒光蛋白(諸如綠色熒光蛋白(gfp)或黃色熒光蛋白(yfp))。待與土壤桿菌接觸的組織可以是任何組織，諸如例如，有效莖(sett)或甘蔗心、葉片、腋芽、莖、莖頂、葉鞘、節(jié)間、葉柄、花梗、根或花序的切片(section)或片段。適合地，外植體是組織的區(qū)段、片(slice)或切片。更優(yōu)選地，待與土壤桿菌連接的組織是胚發(fā)生愈傷組織。更優(yōu)選地，胚發(fā)生愈傷組織是ii型或iii型。胚發(fā)生愈傷組織可以由植物(優(yōu)選由甘蔗植物)的任何合適的組織形成。甘蔗中的組織的培養(yǎng)是眾所周知的，并遵循由ho&vasil.1983.protoplasma,118:169-180；brisibe等人1993.plantscience,89:85-92,以及還由falco等人1996.r.bras.fisiol.veg.,8(2):93-97最初描述的愈傷組織的生產(chǎn)和植物的再生的常規(guī)模型。優(yōu)選地，其使用未成熟組織來(lái)創(chuàng)始愈傷組織，諸如甘蔗心或分生組織。在一些情況下，在與包含感興趣的序列的載體或表達(dá)盒的土壤桿菌接觸之前或同時(shí)，可將組織損傷或壓碎(crush)。因此，靶細(xì)胞包括但不限于分生組織細(xì)胞，i型、ii型和iii型愈傷組織，未成熟胚和配子細(xì)胞，諸如花粉、小孢子、胚珠和胚囊。i型、ii型和iii型愈傷組織可以由包括但不限于未成熟胚、頂生分生組織、腋生分生組織、小孢子等組織來(lái)創(chuàng)始。能夠增殖作為愈傷組織的那些細(xì)胞也是用于遺傳轉(zhuǎn)化的靶細(xì)胞。靶細(xì)胞也可以是體細(xì)胞，其是在植物的正常發(fā)育期間對(duì)其繁殖過(guò)程沒(méi)有幫助的那些細(xì)胞。分生組織細(xì)胞(即，能夠連續(xù)細(xì)胞分裂并由未分化的細(xì)胞學(xué)外觀來(lái)表征，通常在作為根尖、腋生分生組織、芽頂、側(cè)芽等的生長(zhǎng)點(diǎn)被發(fā)現(xiàn))可代表另一類(lèi)型的靶細(xì)胞。由于分化狀態(tài)和分化及全能性的能力，單個(gè)轉(zhuǎn)化的分生組織細(xì)胞可以再生整個(gè)轉(zhuǎn)化的植物。合適的細(xì)胞培養(yǎng)物可以由各種類(lèi)型的外植體創(chuàng)始。例如，對(duì)于甘蔗的品種，外植體可以由合適的植物組織獲得，包括有效莖或甘蔗心(包含頂端分生組織的幼小和卷曲的薄片的組)、葉片、腋芽、莖、莖頂、葉鞘、節(jié)間、葉柄、花梗、種子、根或花序。適宜地，外植體是組織的區(qū)段、片或切片。更優(yōu)選地，外植體是甘蔗樹(shù)苗的頂端甘蔗心部分的切片。外植體可以由在體外、溫室中或田地中生長(zhǎng)的植物獲得。優(yōu)選地，植物年齡少于約24個(gè)月、少于約23個(gè)月、少于約22個(gè)月、少于約21個(gè)月、少于約20個(gè)月、少于約19個(gè)月、少于約18個(gè)月、少于約17個(gè)月、少于約16個(gè)月、少于約15個(gè)月、少于約14個(gè)月、少于約13個(gè)月、少于約12個(gè)月、少于約11個(gè)月、少于約10個(gè)月、小于約9個(gè)月、少于約8個(gè)月、少于約7個(gè)月、少于約6個(gè)月、少于約5個(gè)月、少于約4個(gè)月、少于約3個(gè)月、少于約2個(gè)月或少于約1個(gè)月。優(yōu)選地，植物年齡優(yōu)選地為約24-12個(gè)月、更優(yōu)選地為約12-8個(gè)月、甚至更優(yōu)選地為約4-6個(gè)月。所述組織培養(yǎng)物通常由植物的無(wú)菌碎片創(chuàng)始，諸如上文概述的。已知許多外植體特征影響培養(yǎng)物創(chuàng)始的效率，然而，認(rèn)為通常幼小的、生長(zhǎng)較快的組織或者處于早期發(fā)育階段的組織更有效。在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的外植體可產(chǎn)生分裂細(xì)胞的無(wú)組織細(xì)胞團(tuán)(愈傷組織)，其可在培養(yǎng)中被或多或少無(wú)限期地維持，只要在新鮮培養(yǎng)基中進(jìn)行定期傳代培養(yǎng)?！肮才囵B(yǎng)”步驟(階段b，如上定義的)是指已感染的植物組織或接觸到土壤桿菌的組織在支持物上的孵育，從而使得能夠?yàn)橹参锛?xì)胞轉(zhuǎn)移土壤桿菌的t-dna。該步驟對(duì)應(yīng)于接種之后不久的時(shí)間(使土壤桿菌與植物組織接觸)到細(xì)菌被撤出或滅活的時(shí)刻之間的時(shí)期。在一種實(shí)施方式中，植物組織與土壤桿菌的共培養(yǎng)發(fā)生在如本發(fā)明所提供的培養(yǎng)基上。為了本發(fā)明的目的，“培養(yǎng)基”是指本領(lǐng)域中用于支持植物細(xì)胞或組織的活力和生長(zhǎng)或者整個(gè)植物生長(zhǎng)的任何介質(zhì)，諸如murashige和skook、gamborg's、chu(n6)、schenk和hildebrand等本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。這樣的培養(yǎng)基通常包括限定的組分，但不限于：大量營(yíng)養(yǎng)素，提供了氮、磷、鉀、硫、鈣、鎂和鐵的營(yíng)養(yǎng)來(lái)源；微量營(yíng)養(yǎng)素，諸如硼、鉬、錳、鈷、氯、碘和鋅；碳水化合物，諸如麥芽糖、山梨醇和糖類(lèi)；植物激素；維生素；選擇劑，諸如用于選擇被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞或組織的抗生素或除草劑；酚類(lèi)化合物(優(yōu)選在植物損傷的滲出物中所發(fā)現(xiàn)的那些化合物，諸如乙酰丁香酮、芥子酸(sinapinicacid)、丁香酸(syringicacid)、阿魏酸(ferulicacid)、鄰苯二酚(catechol)、沒(méi)食子酸(gallicacid)等)、抗氧化劑(例如，二硫蘇糖醇(dithiotreitol))和膠凝劑。培養(yǎng)基還可以包括未限定的復(fù)合成分，諸如酪蛋白水解產(chǎn)物、椰子水、酵母提取物和活性炭。在一個(gè)方面，在共培養(yǎng)步驟中使用的培養(yǎng)基在本文中被稱(chēng)為“共培養(yǎng)培養(yǎng)基”，并且可以是本領(lǐng)域已知的植物組織的任何培養(yǎng)基，并且其包含高濃度的膠凝劑?！澳z凝劑”是指增加溶液的粘度而不實(shí)質(zhì)改變其性質(zhì)的任何物質(zhì)，并且包括通常用于植物組織培養(yǎng)的那些膠凝劑，諸如瓊脂、agargeltm、phytablendtm、agargellantm、卡拉膠和結(jié)冷膠(gelzantm、gelritetm、phytageltm)。本發(fā)明的共培養(yǎng)培養(yǎng)基為植物細(xì)胞提供支持、水分、營(yíng)養(yǎng)，同時(shí)其中其防止土壤桿菌的加劇生長(zhǎng)和植物組織的死亡。因此，本發(fā)明的培養(yǎng)基包含比膠凝劑領(lǐng)域中通常使用的濃度更高的濃度。在不限于任何理論或作用機(jī)理的情況下，本發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，使接種的組織經(jīng)歷在共培養(yǎng)基中的共培養(yǎng)步驟(該共培養(yǎng)培養(yǎng)基包含大于通常對(duì)應(yīng)于制造商推薦的量的膠凝劑領(lǐng)域通常使用的濃度)防止土壤桿菌的加劇生長(zhǎng)，其具有接種的植物組織的較低死亡率和較高轉(zhuǎn)化頻率的積極后果。為了本發(fā)明的目的，“高濃度”是指組合物包含至少高于制造商所推薦的那些量的使用量，在本文中被定義為對(duì)于瓊脂為超過(guò)至少10g/l或?qū)τ赼gargeltm為超過(guò)至少5g/l或?qū)τ赼gargellan為超過(guò)至少5g/l或超過(guò)至少9g/l的phytablendtm或超過(guò)至少2.5g/l的phytageltm或超過(guò)至少4g/l的gelzantm或超過(guò)至少4g/l的結(jié)冷膠或超過(guò)至少10g/l的卡拉膠。更優(yōu)選地，agargeltm的濃度范圍為7至70g/l，更優(yōu)選地為7至60g/l，并且甚至更優(yōu)選地為7至50g/l。接種的組織可以被共培養(yǎng)約1至30天、優(yōu)選1至20天、更優(yōu)選地1至10天以及甚至更優(yōu)選地1至5天。在共培養(yǎng)步驟期間，溫度可以是本領(lǐng)域已知的用于靶植物的任何合適的溫度。示例性地，對(duì)于甘蔗，溫度可以在約15℃至約30℃、約16℃至約29℃、約20℃至約25℃、約21℃至約24℃或者約22℃至約23℃的范圍內(nèi)。在一些實(shí)施方式中，共培養(yǎng)步驟在沒(méi)有光的情況下發(fā)生?？蛇x地，在一些實(shí)施方式中，在共培養(yǎng)步驟之后，轉(zhuǎn)化的細(xì)胞可以經(jīng)受靜息(rest)步驟。如本文所用的，“靜息”是指其中將植物細(xì)胞(例如胚發(fā)生愈傷組織)在通過(guò)由土壤桿菌介導(dǎo)的感染而引入感興趣的序列之后孵育的步驟。靜息使得能夠優(yōu)選生長(zhǎng)來(lái)自含有感興趣的序列的轉(zhuǎn)化細(xì)胞的愈傷組織，并且通常在沒(méi)有選擇壓力的情況下進(jìn)行。轉(zhuǎn)化的植物組織經(jīng)受通常包含抑制土壤桿菌生長(zhǎng)的試劑(例如抗生素)的靜息培養(yǎng)基。所述試劑在本領(lǐng)域中是已知的并且包括頭孢噻肟(cefotaxime)、特美汀(timetin)、萬(wàn)古霉素(vancomycin)、羧芐青霉素(carbenicillin)等。所述藥劑的濃度將根據(jù)每種抗生素的標(biāo)準(zhǔn)而變化。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，可以針對(duì)特定的轉(zhuǎn)化方案來(lái)優(yōu)化土壤桿菌抑制劑的濃度而無(wú)需過(guò)度實(shí)驗(yàn)。靜息步驟時(shí)間可以為約1天至約30天、優(yōu)選地約1天至約20天以及甚至更優(yōu)選地約5天至約15天。在靜息步驟期間，溫度可以是本領(lǐng)域已知的用于靶植物的任何合適的溫度。示例性地，對(duì)于甘蔗，溫度可以在約15℃至約30℃、約16℃至約29℃、約17℃至約28℃、約21℃至約27℃或約26℃至約27℃之間變化。在一些實(shí)施方式中，靜息步驟在沒(méi)有光的情況下發(fā)生。當(dāng)不存在靜息步驟時(shí)，可以在向轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞中加入選擇劑之前進(jìn)行延長(zhǎng)的共培養(yǎng)步驟。本文中提供的方法還包括選擇包含感興趣的基因序列的至少一個(gè)拷貝的細(xì)胞(步驟d)。如本文所使用的，“選擇”是指選擇劑用于轉(zhuǎn)化體的情況，其中所述選擇劑將使得含有位于t-dna內(nèi)并由土壤桿菌轉(zhuǎn)移的至少一個(gè)拷貝的基因標(biāo)記的植物細(xì)胞能夠優(yōu)選生長(zhǎng)而損害那些未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。如上所指示的，可以使用任何合適的選擇標(biāo)記。在一些實(shí)施方式中，還加入試劑以抑制土壤桿菌的生長(zhǎng)。例如，取決于所轉(zhuǎn)化的植物物種和基因型，選擇可以在光或黑暗的條件下發(fā)生。在一些情況下，可以在相同培養(yǎng)基中以規(guī)則或不規(guī)則的間隔對(duì)胚發(fā)生愈傷組織或經(jīng)受轉(zhuǎn)化的其他組織進(jìn)行亞培養(yǎng)。在轉(zhuǎn)化愈傷組織的情況下，可以保持單獨(dú)的單個(gè)愈傷組織，以確保每個(gè)愈傷組織只有一個(gè)植物再生，并因此所有再生的植物都源于獨(dú)立的轉(zhuǎn)化事件。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，選擇步驟在黑暗中進(jìn)行約1周至10周、更優(yōu)選地2周至5周、甚至更優(yōu)選地2周至4周以及甚至更優(yōu)選地2周至3周。在選擇期后，在存在選擇劑的情況下繼續(xù)生長(zhǎng)并且因此是遺傳修飾的植物組織可以被操縱和再生，將其置于培養(yǎng)基和合適的生長(zhǎng)條件中?？梢詼y(cè)試如此獲得的轉(zhuǎn)基因植物的感興趣的dna的存在。為了本發(fā)明的目的，術(shù)語(yǔ)“再生”是指包括空中部分和根部的植物的形成。各個(gè)物種的再生在本領(lǐng)域中是公知的。再生植物可以種植在合適的基質(zhì)中，諸如例如土壤。如本文所用的，“遺傳修飾的”或“轉(zhuǎn)基因的”或“穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的”是指包含通過(guò)轉(zhuǎn)化引入其基因組中的感興趣的dna序列的植物細(xì)胞、植物部分、植物組織或植物。對(duì)于本發(fā)明，可以通過(guò)在實(shí)驗(yàn)條件下回收的被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的數(shù)目(或再生的轉(zhuǎn)基因植物或陽(yáng)性事件的數(shù)目)來(lái)測(cè)量“轉(zhuǎn)化效率”或“轉(zhuǎn)化頻率”。例如，當(dāng)將愈傷組織用作用于轉(zhuǎn)化的起始材料時(shí)，轉(zhuǎn)化頻率可以被表示為每克呈遞到轉(zhuǎn)化的愈傷組織所獲得的陽(yáng)性事件的數(shù)目。通過(guò)以下實(shí)施例來(lái)說(shuō)明本發(fā)明，實(shí)施例僅僅是為了例示實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的無(wú)數(shù)方式之一，而不限制本發(fā)明的范圍。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以提出的各種修改或建議包括在權(quán)利要求書(shū)的精神中和范圍中。實(shí)施例實(shí)施例1：植物材料組織培養(yǎng)物通常用于通過(guò)產(chǎn)生潛在可轉(zhuǎn)化并適于再生植物的細(xì)胞來(lái)轉(zhuǎn)化植物。組織培養(yǎng)物的維持需要使用培養(yǎng)基(用于細(xì)胞在體外生長(zhǎng)和維持的營(yíng)養(yǎng)物與植物調(diào)節(jié)劑的混合物)和受控的環(huán)境條件。在轉(zhuǎn)化甘蔗的這個(gè)過(guò)程中使用的組織-外植體是胚發(fā)生愈傷組織。為了獲得胚發(fā)生愈傷組織，收集在田地或溫室中發(fā)育3-12個(gè)月的甘蔗的幼小的、卷曲的葉(心)用于分離初始外植體。在表面消毒之后，在無(wú)菌條件下從分生組織上方的區(qū)域切割約0.05-5mm厚的橫切片。將切片置于scim培養(yǎng)基的表面上。將培養(yǎng)物在26℃±2℃的溫度下保持在黑暗中，并每15天傳代培養(yǎng)進(jìn)行7-28天的三至五個(gè)循環(huán)。在轉(zhuǎn)化前一周，對(duì)于胚發(fā)生特征(不同基因型之間的小結(jié)(nodular)、緊密的、不透明的和稍微黃色的、略有變化的特征)再次選擇愈傷組織。實(shí)施例2：土壤桿菌的制備和愈傷組織的感染包括具有基因ubigus/ubinptii的菌株eha105(hood等人1993.newagrobacteriumhelperplasmidsforgenetransfertoplants(用于基因轉(zhuǎn)移到植物的新土壤桿菌輔助質(zhì)粒).transgenicresearch,v.2,p.208-218)的土壤桿菌的培養(yǎng)物是由保存在-80℃的固體lb加適當(dāng)抗生素的甘油儲(chǔ)備物創(chuàng)始的。將該培養(yǎng)物在28℃的黑暗中保存兩天至三天。通過(guò)將培養(yǎng)物重新懸浮于加200μm的乙酰丁香酮的液體培養(yǎng)基1/2ms中，調(diào)整至0.1-1.0的最終od600，來(lái)制備有待感染植物材料的土壤桿菌懸浮液。目視選擇具有胚發(fā)生特征的愈傷組織，并直接轉(zhuǎn)移到土壤桿菌的懸浮液中，在那里它們?cè)?0rpm恒定攪拌下，在黑暗中保持30分鐘。在此時(shí)期之后，將愈傷組織與土壤桿菌分離，并通過(guò)在濾紙片上干燥來(lái)除去過(guò)量的懸浮液?？商鎿Q地，在感染之前，愈傷組織可以在約45℃下在1/2ms液體培養(yǎng)基中進(jìn)行約5分鐘的處理。另一可選的處理是在約-700mmhg的真空壓力下呈遞已感染的植物材料持續(xù)約5分鐘。實(shí)施例3：愈傷組織的共培養(yǎng)和靜息該步驟在具有7g/l、14g/l、21g/l、28g/l、35g/l、42g/l或49g/l的agargeltm的液體或固體scim培養(yǎng)基(表1)中進(jìn)行，稱(chēng)重在0.5-10g的愈傷組織/板(100×20mm)之間。共培養(yǎng)在黑暗中在22℃的溫度下進(jìn)行1-5天的時(shí)間段。在共培養(yǎng)后，將愈傷組織轉(zhuǎn)移到dt靜息培養(yǎng)基(過(guò)渡培養(yǎng)基，restingmedium)(表1)加上抑菌濃度為200mg/l的以便控制土壤桿菌的不期望的生長(zhǎng)(圖1)。靜息時(shí)間段為在黑暗中在26℃下的5-14天。在此步驟期間，更準(zhǔn)確地說(shuō)是接近5天的培養(yǎng)，對(duì)大部分愈傷組織(大約50單位)進(jìn)行g(shù)us組織化學(xué)測(cè)定以檢測(cè)報(bào)告基因的瞬時(shí)表達(dá)并監(jiān)測(cè)過(guò)程(圖3-5)。實(shí)施例4：轉(zhuǎn)基因植物的選擇和再生將愈傷組織轉(zhuǎn)移至sgt選擇培養(yǎng)基(表1)，當(dāng)使用選擇性基因nptii時(shí)，sgt選擇培養(yǎng)基補(bǔ)充有200mg/l的+50mg/l的遺傳霉素選擇劑。愈傷組織在黑暗中在26℃下在該條件中保留21天。此后，將愈傷組織轉(zhuǎn)移到補(bǔ)充有200mg/l的+30mg/l的遺傳霉素的rg1再生培養(yǎng)基中，并且以4,000勒克司進(jìn)行16小時(shí)的光周期。在光照30天后，顯示出幼苗形成而對(duì)遺傳霉素選擇沒(méi)有明顯脅迫的愈傷組織(圖2)被轉(zhuǎn)移到補(bǔ)充有200mg/l的+30mg/l的遺傳霉素的rg2培養(yǎng)基中。當(dāng)植物達(dá)到平均高度為五厘米時(shí)，收集約20mm的葉區(qū)段以用于定量實(shí)時(shí)pcr分析。用于確定拷貝數(shù)的這種方法被描述為“delta-deltact”(livak&schmittgen.2001.analysisofrelativegeneexpressiondatausingreal-timequantitativepcrandthe2-δδctmethod(使用實(shí)時(shí)定量pcr和2-δδct方法分析相關(guān)基因表達(dá)數(shù)據(jù)).methods25:402-408)，其包括使用由southernblot確認(rèn)的三種植物的基因nptii和gus的拷貝的平均ct作為校準(zhǔn)物(對(duì)照)的方法。用作標(biāo)準(zhǔn)化物的內(nèi)源基因是多聚泛蛋白(polyubiquitin)。使用taqman探針以多重格式進(jìn)行反應(yīng)以檢測(cè)拷貝數(shù)。將轉(zhuǎn)化效率計(jì)算為在每個(gè)實(shí)驗(yàn)中轉(zhuǎn)化的愈傷組織的量(以克計(jì))的陽(yáng)性事件數(shù)之間的比率(圖6-9)。保持植物篩選，以防止事件的亞克隆。為獲得結(jié)果進(jìn)行的這組測(cè)定產(chǎn)生了通過(guò)qpcr技術(shù)所分析的總共526個(gè)獨(dú)立事件。所使用的培養(yǎng)基：表1：培養(yǎng)基顯然，上述實(shí)施例僅作為說(shuō)明呈現(xiàn)，并且對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的其修改和變化被認(rèn)為包括在如所附權(quán)利要求書(shū)中所限定的本發(fā)明的范圍內(nèi)。當(dāng)前第1頁(yè)12當(dāng)前第1頁(yè)12