相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用本申請(qǐng)根據(jù)35u.s.c.§119(e)要求2014年9月29日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?2/056,687的申請(qǐng)日的權(quán)益，該臨時(shí)申請(qǐng)全部?jī)?nèi)容通過(guò)引用并入本文。
背景技術(shù)：
：：將生物或遺傳材料遞送到哺乳動(dòng)物合子中通常是修飾哺乳動(dòng)物基因組的第一步，例如遺傳修飾動(dòng)物模型的創(chuàng)建。這在傳統(tǒng)上和目前通過(guò)使用玻璃針將期望生物/遺傳材料顯微注射到合子中而實(shí)現(xiàn)。dna直接顯微注射早在80年代末就已經(jīng)用于將單純皰疹病毒(hsv)tk基因引入培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞(capecchi，cell，22:479-488，1980年11月)。然而，即使在小的pbr322/tkdna與sv40dna共注射，即每1,000個(gè)細(xì)胞注射15個(gè)轉(zhuǎn)化體時(shí)，轉(zhuǎn)化率也是極低的。此外，該實(shí)驗(yàn)不導(dǎo)致產(chǎn)生成熟生物體，更不用說(shuō)可以表現(xiàn)出表型改變。大約一個(gè)月后，gordon等(proc.natl.acad.sci.u.s.a.,77:7380-7384,1980年12月)首先報(bào)道了他們已經(jīng)成功將tk基因(其被引入到嵌合sv40病毒載體中)顯微注射到小鼠胚胎中，并已經(jīng)在從顯微注射的胚胎發(fā)育的小鼠中觀察到這樣的tk基因。然而，這些小鼠不表達(dá)tk基因產(chǎn)物。也就是說(shuō)，在這些實(shí)驗(yàn)中，沒(méi)有實(shí)現(xiàn)測(cè)試動(dòng)物的表型改變。gordon等報(bào)道的結(jié)果似乎與jaenisch等人早期的研究(proc.natl.acad.sci.u.s.a.,71:1250-1254,1974)一致，其中sv40病毒先前已經(jīng)被證明在引入小鼠胚胎時(shí)在功能和遺傳上無(wú)活性。隨后，在1981年6月，wagner和hoppe提交了針對(duì)通過(guò)顯微注射將外源遺傳材料引入胚胎的美國(guó)實(shí)用新型申請(qǐng)，該申請(qǐng)最終導(dǎo)致美國(guó)專利no.4,873,191的授權(quán)，其是在顯微注射領(lǐng)域中廣泛許可的基礎(chǔ)專利，描述并廣泛要求保護(hù)獲得具有含有并能夠表達(dá)外源遺傳材料的細(xì)胞的哺乳動(dòng)物的顯微注射方法。盡管自80年代初以來(lái)已有許多改進(jìn)，顯微注射仍然技術(shù)上苛刻、勞動(dòng)密集并且耗時(shí)。成功的顯微注射在很大程度上取決于操作員的技術(shù)熟練程度、培訓(xùn)和經(jīng)驗(yàn)等主觀因素。由于它需要在昂貴的顯微注射設(shè)備和具有多年培訓(xùn)和經(jīng)驗(yàn)的操作者方面進(jìn)行大量的前期投資，即使在世界上最優(yōu)秀和資金最充分的學(xué)術(shù)機(jī)構(gòu)中，生產(chǎn)遺傳修飾小鼠模型的能力也經(jīng)常受到限制。此外，顯微注射在通量方面固有地低，需要一次操縱一個(gè)合子，從而限制基因組工程實(shí)驗(yàn)的大小和規(guī)模。電穿孔或電滲透是通過(guò)使用外部施加的電場(chǎng)顯著地增加細(xì)胞質(zhì)膜滲透性和導(dǎo)電性的方法。電穿孔已經(jīng)在分子生物學(xué)中用作將某些材料引入細(xì)胞的方式，例如用分子探針、可改變細(xì)胞功能的藥物或dna分子加載它。在分子生物學(xué)中，電穿孔方法通常用于細(xì)菌、酵母和植物原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化。除了脂質(zhì)膜外，細(xì)菌還具有與脂質(zhì)膜不同并且由肽聚糖及其衍生物構(gòu)成的細(xì)胞壁。然而，細(xì)胞壁是天然多孔的并且只用作保護(hù)細(xì)菌免受嚴(yán)重環(huán)境影響的硬殼。如果細(xì)菌和質(zhì)粒混合在一起，則質(zhì)粒可以在電穿孔后轉(zhuǎn)移到細(xì)胞中。在這個(gè)方法中通常在幾毫米距離上使用數(shù)百伏。該程序也可以用于組織培養(yǎng)細(xì)胞，例如培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞。與細(xì)菌中的轉(zhuǎn)化相反，將外源dna引入真核細(xì)胞的過(guò)程通常稱為轉(zhuǎn)染。電穿孔已經(jīng)用于使用電穿孔電擊杯轉(zhuǎn)染懸浮體中的細(xì)胞。盡管有著克服上述顯微注射的許多障礙，包括低效率/低通量和技術(shù)困難的巨大和明顯需要，電穿孔尚未被本領(lǐng)域技術(shù)人員看做可行的替代方法，并且尚未有報(bào)道使用電穿孔將遺傳材料引入哺乳動(dòng)物胚胎，其隨后發(fā)育成遺傳修飾動(dòng)物。具體來(lái)說(shuō)，電穿孔以前主要用于小鼠中的組織培養(yǎng)細(xì)胞和植入后胚胎(參見(jiàn)mellitzer等.,mech.dev.,118:57-63(2002)；akamatsu等.,proc.natl.acad.sci.u.s.a.,96:9885-9890(1999)；potter等.,proc.natl.acad.sci.u.s.a.,81:7161-7165(1984)；osumi和inoue,methods,24:35-42(2001)；fukuchi-shimogori和grove,science294:1071-1074(2001)以及tabata和nakajima,neuroscience,103:865-872(2001))。在一項(xiàng)研究中，nemec等(theriogenology31:233,1989)描述了通過(guò)電穿孔將新霉素抗性基因(psvneo)引入小鼠1-細(xì)胞胚胎(即，合子)中的嘗試。然而，首先將包含新霉素基因的dna注射到合子的質(zhì)膜與透明帶之間的卵周隙中，以據(jù)作者所說(shuō)在合子經(jīng)受電擊之前，在暴露于電流時(shí)減少外源dna與原核之間的距離。作者報(bào)道在一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，dna印跡分析顯示從轉(zhuǎn)移到假孕icr受體的226個(gè)胚胎產(chǎn)生的55只幼仔中沒(méi)有引入新霉素基因。在使用旨在在電穿孔脈沖期間增加傳遞的總能量的高鹽介質(zhì)的后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，作者再次報(bào)道初步數(shù)據(jù)表明種系傳遞未成功。最近，電穿孔已經(jīng)成功用于將dsrna、sirna、編碼它們的dna載體和嗎啉基化合物遞送到小鼠植入前胚胎中(grabarek等.,genesis,32:269-276(2002)；wang等.,dev.biol.,318:112-125(2008)；和peng等.,plosone,7(8):e43748.doi:10.1371/journal.pone.0043748(2012))。然而，這些試劑在細(xì)胞質(zhì)中起作用，而不是在細(xì)胞核中，如實(shí)現(xiàn)可以通過(guò)種系傳遞的遺傳修飾所需要的。更具體地說(shuō)，這些試劑通過(guò)降解靶基因的mrna或通過(guò)阻斷mrna的翻譯或兩者而抑制其各自的靶基因的表達(dá)而起作用。因此，盡管有著克服用于通過(guò)種系傳遞將外源生物或遺傳材料引入早期胚胎以產(chǎn)生遺傳修飾動(dòng)物的顯微注射的許多缺點(diǎn)(例如低效率)的長(zhǎng)期需要，該流行技術(shù)似乎教導(dǎo)遠(yuǎn)離看似簡(jiǎn)單的技術(shù)，如電穿孔。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的一個(gè)方面提供了產(chǎn)生遺傳修飾哺乳動(dòng)物的方法，所述方法包括通過(guò)電穿孔將材料引入到哺乳動(dòng)物的配子或植入前期胚胎中以修飾所述哺乳動(dòng)物的基因組。在某些實(shí)施方式中，將材料引入到配子中。例如，配子可以是卵子(ovum)或卵(egg)。在某些實(shí)施方式中，所述方法還包括將配子與相反性別的配子融合，并允許發(fā)育成活胎產(chǎn)的遺傳修飾哺乳動(dòng)物。在某些實(shí)施方式中，植入前胚胎是1-細(xì)胞胚胎(即，合子)、2-細(xì)胞胚胎、4-細(xì)胞胚胎、早期桑椹胚或晚期桑椹胚。在某些實(shí)施方式中，所述方法還包括允許(電穿孔的)植入前期胚胎發(fā)育成活胎產(chǎn)的遺傳修飾哺乳動(dòng)物。在某些實(shí)施方式中，材料包含多核苷酸、多肽(例如蛋白)或多核苷酸和多肽兩者。在某些實(shí)施方式中，多聚核苷酸包含ii型cas9蛋白的編碼序列。在某些實(shí)施方式中，多核苷酸包含規(guī)律成簇的間隔短回文重復(fù)(crispr)-crispr相關(guān)(cas)(crispr-cas)系統(tǒng)指導(dǎo)rna，其與哺乳動(dòng)物的基因組中的靶序列雜交。在某些實(shí)施方式中，ii型cas9蛋白和crispr-cas系統(tǒng)指導(dǎo)rna的編碼序列的濃度比是至少約1:1、至少約1.5:1、至少約2:1、至少約2.5:1、至少約3:1或更高。在某些實(shí)施方式中，ii型cas9蛋白的編碼序列的濃度是至少約40ng/μl、至少50ng/μl、至少100ng/μl、至少150ng/μl、至少200ng/μl、至少300ng/μl、至少400ng/μl、至少500ng/μl、至少600ng/μl、至少800ng/μl、或至少1000ng/μl或更高。在某些實(shí)施方式中，材料還包含供體多核苷酸。例如，供體多核苷酸可以是線性或環(huán)狀雙鏈或單鏈dna分子。在某些實(shí)施方式中，多核苷酸包含對(duì)哺乳動(dòng)物的基因組中的靶序列具有特異性的轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)子核酸酶(talen)的編碼序列。在某些實(shí)施方式中，多核苷酸包含對(duì)哺乳動(dòng)物的基因組中的靶序列具有特異性的鋅指核酸酶(zfn)的編碼序列。在某些實(shí)施方式中，多核苷酸包含對(duì)哺乳動(dòng)物的基因組中的靶序列具有特異性的bud衍生核酸酶(budn)的編碼序列。在某些實(shí)施方式中，多核苷酸包含隨機(jī)整合到哺乳動(dòng)物的基因組中的dna。在某些實(shí)施方式中，多核苷酸包含dna載體。在某些實(shí)施方式中，多核苷酸包含rna。在某些實(shí)施方式中，多核苷酸包含將dna片段隨機(jī)或特定整合到哺乳動(dòng)物的基因組中的轉(zhuǎn)座酶。在某些實(shí)施方式中，哺乳動(dòng)物是人、非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物(例如狨、獼猴、黑猩猩)、嚙齒動(dòng)物(例如小鼠、大鼠、沙鼠、豚鼠、倉(cāng)鼠、棉鼠、裸鼴鼠)、兔、家畜哺乳動(dòng)物(例如山羊、綿羊、豬、奶牛、牛、馬、駱駝)、寵物哺乳動(dòng)物(例如狗、貓)、動(dòng)物園哺乳動(dòng)物、有袋類動(dòng)物、瀕危哺乳動(dòng)物及其遠(yuǎn)系繁殖或隨機(jī)繁殖群體。在某些實(shí)施方式中，將配子(在與相反性別的配子融合之后)或植入前胚胎在電穿孔后移植到能夠承載胚胎到分娩期的假孕宿主哺乳動(dòng)物中。在某些實(shí)施方式中，配子(在與相反性別的配子融合之后)或植入前胚胎在移植到假孕宿主哺乳動(dòng)物之前從在其中進(jìn)行電穿孔的培養(yǎng)基移除。在某些實(shí)施方式中，哺乳動(dòng)物的基因組通過(guò)一個(gè)或多個(gè)堿基對(duì)的插入或缺失、通過(guò)異源dna片段的插入、通過(guò)內(nèi)源dna片段的缺失、通過(guò)內(nèi)源dna片段的倒位或易位，或其組合修飾。在某些實(shí)施方式中，哺乳動(dòng)物的基因組通過(guò)nhej(非同源末端連接)、hdr(同源定向修復(fù))或hr(同源重組)修飾。在某些實(shí)施方式中，約2、3、5、10、20、30、40、50、100、125、150、200、250、300或更多個(gè)配子或植入前期胚胎同時(shí)電穿孔。在某些實(shí)施方式中，電穿孔的植入前期胚胎中的至少約50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或更多發(fā)育成胚泡期胚胎，或發(fā)育成活胎產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物。在某些實(shí)施方式中，所有的配子和植入前期胚胎都在同一電擊杯(electroporationcuvette)中電穿孔。在某些實(shí)施方式中，配子或植入前期胚胎在電穿孔之前預(yù)處理以弱化透明帶。在某些實(shí)施方式中，配子或植入前期胚胎在酸性臺(tái)氏液(at)或等同物中預(yù)處理。在某些實(shí)施方式中，電穿孔在1mm電擊杯中進(jìn)行，其使用以下設(shè)置：20-30伏(例如25、26或27伏)、脈沖持續(xù)時(shí)間為1-2ms(例如1.5ms)、1-3個(gè)脈沖、脈沖間隔為100-1000ms(例如約125-130ms)。在某些實(shí)施方式中，配子或植入前期胚胎在電穿孔后冷凍儲(chǔ)存，然后解凍。本發(fā)明的另一方面提供了通過(guò)本發(fā)明的方法中的任一種產(chǎn)生的遺傳修飾哺乳動(dòng)物。應(yīng)理解上文和下文中描述的任何實(shí)施方式都設(shè)想能夠與本發(fā)明的任何其他實(shí)施方式組合，包括僅在實(shí)施例中描述的那些具體實(shí)施方式(通過(guò)引用并入本文)。附圖說(shuō)明圖1a和1b顯示了使用本發(fā)明方法在小鼠胚胎中的crispr介導(dǎo)的基因破壞。具體地，圖1a顯示了靶向tet1基因座的胚胎的基因分型。relp分析顯示在上方小圖中，以及測(cè)序結(jié)果顯示在下方小圖中。用于rflp分析的靶區(qū)域處的限制性位點(diǎn)加粗和加上下劃線。原間隔區(qū)序列鄰近基序(pam)序列以紅色著色。顯示了來(lái)自兩個(gè)胚胎的突變等位基因，并且突變的堿基以藍(lán)色著色。圖1b顯示了在tet2基因座被靶向的胚胎的基因分型。圖2a-2d顯示了使用本發(fā)明方法在活體小鼠中的crispr介導(dǎo)的基因破壞。具體地，在圖2a中：分別以400ng/μl和200ng/μl使用的靶向tet2基因座的cas9mrna和sgrna(單指導(dǎo)rna)通過(guò)電穿孔遞送至小鼠胚胎。然后將電穿孔的胚胎轉(zhuǎn)移到假孕雌性小鼠中。從新生小鼠采集尾部活檢樣品，并使用使用ecorv酶的rflp方法進(jìn)行基因分型。來(lái)自小鼠85c3的pcr產(chǎn)物對(duì)ecorv消化具有抗性，并且來(lái)自小鼠85c10的pcr產(chǎn)物對(duì)ecorv消化具有部分抗性。在圖2b中：分別以600ng/μl和300ng/μl使用靶向tet2基因座的cas9mrna和sgrna。來(lái)自小鼠86c3和86c9的pcr產(chǎn)物對(duì)ecorv消化具有抗性，并且來(lái)自86c5、86c7和86c8的那些對(duì)ecorv消化具有部分抗性。在圖2c中：來(lái)自小鼠85c3、85c10、86c3、86c5、86c7、86c8和86c9的pcr產(chǎn)物通過(guò)sanger測(cè)序處理，并且顯示與來(lái)自野生型樣品的譜圖相比的譜圖。圖2d：將來(lái)自小鼠85c3、86c3和86c9的pcr產(chǎn)物克隆到pcr2.1-topo載體中，并對(duì)個(gè)體克隆體進(jìn)行測(cè)序。在來(lái)自所有3只首建者(founder)小鼠的等位基因中容易地檢測(cè)到indel突變。圖3a顯示了來(lái)自實(shí)驗(yàn)15的11只首建者小鼠的基因分型結(jié)果。上方小圖顯示無(wú)rflp分析的pcr產(chǎn)物。中間小圖顯示使用ecorv的rflp分析。下方小圖顯示使用ecori的rflp分析。圖3b顯示了所選首建者小鼠與對(duì)照小鼠的sanger測(cè)序結(jié)果。已經(jīng)對(duì)相對(duì)于對(duì)照小鼠中的野生型序列改變的序列(通過(guò)crispr/cas介導(dǎo)的hdr)加上下劃線。具體實(shí)施方式1.概述為了克服在產(chǎn)生遺傳修飾動(dòng)物(例如轉(zhuǎn)基因或其他遺傳修飾哺乳動(dòng)物)的背景下與顯微注射有關(guān)的固有局限性，申請(qǐng)人已經(jīng)開(kāi)發(fā)了基于電穿孔的方法，以在使該方法可以高效率、高通量產(chǎn)生高存活率的遺傳修飾動(dòng)物的特定條件下，將生物/遺傳材料遞送到動(dòng)物(例如哺乳動(dòng)物)配子或植入前胚胎中，包括合子。所得遺傳修飾可以容易地通過(guò)種系傳遞。具體地，在示例性實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法用于將crispr/cas系統(tǒng)遞送至小鼠胚胎(例如合子)，從而在所得遺傳修飾/轉(zhuǎn)基因小鼠的基因組中實(shí)現(xiàn)靶向遺傳修飾。本發(fā)明的方法，包括本文優(yōu)化的實(shí)施方式或方案，可以使用市售的電穿孔機(jī)進(jìn)行，同時(shí)需要很少的訓(xùn)練或以往經(jīng)驗(yàn)，并且因此能夠在一個(gè)步驟中并行處理大量的胚胎和多個(gè)基因靶向項(xiàng)目。使用本文所述的本發(fā)明的方法，可以將多種生物、遺傳或其他材料(包括但不限于crispr/cas、talen和zfn或其組合等)中的任一種遞送至配子和早期胚胎(例如哺乳動(dòng)物植入前胚胎，包括合子)。因此本文描述的技術(shù)使得具有前所未有的容易和規(guī)模的動(dòng)物基因組工程成為可能。本文所述的發(fā)明部分基于以下發(fā)現(xiàn)：電穿孔可用于將相對(duì)高濃度(例如先前認(rèn)為是毒性水平)的生物/遺傳材料遞送至配子和植入前胚胎(包括合子)中，該高濃度可以是在電穿孔的配子和早期胚胎的核中實(shí)現(xiàn)期望最終結(jié)果(例如配子或胚胎的基因組的遺傳修飾，該修飾可以通過(guò)種系傳遞而傳遞)所需要的。具體地說(shuō)，基于先前的顯微注射實(shí)驗(yàn)，其中較低濃度的cas9mrna(50或100ng/μl)和sgrna(25或50ng/μl)成功地用于原核或細(xì)胞質(zhì)顯微注射實(shí)驗(yàn)，申請(qǐng)人嘗試使用報(bào)告的基因編碼質(zhì)粒對(duì)合子進(jìn)行電穿孔(參見(jiàn)實(shí)施例1)。令人驚訝的是，在從電穿孔的合子發(fā)育的3.5天胚胎中沒(méi)有觀察到熒光。使用其他濃度的dna的類似實(shí)驗(yàn)(其預(yù)處理透明帶以使之弱化；或使用其他報(bào)道體或熒光素標(biāo)記寡核苷酸)也遭到失敗。參見(jiàn)實(shí)施例1中提到的實(shí)驗(yàn)2-6。廣泛認(rèn)為用于電穿孔實(shí)驗(yàn)的試劑，包括cas9mrna和指導(dǎo)rna，在以較高濃度使用時(shí)可能對(duì)胚胎有毒。申請(qǐng)人已經(jīng)在本文中證明早期胚胎(如合子)可以使用相對(duì)高濃度的生物材料(例如包含crispr/casmrna和指導(dǎo)rna的多核苷酸)進(jìn)行電穿孔，以實(shí)現(xiàn)從電穿孔的胚胎發(fā)育的胚胎或動(dòng)物中的期望遺傳修飾。參見(jiàn)實(shí)施例2。本文所述的發(fā)明還部分基于以下發(fā)現(xiàn)：電穿孔的配子和植入前胚胎(包括合子)通常表現(xiàn)出延遲或停止發(fā)育，或以其他方式未存活成活胎產(chǎn)的動(dòng)物，除非電穿孔的配子和植入前胚胎(包括合子)被釋放到生理溶液或培養(yǎng)基。例如，溶液或培養(yǎng)基尤其是等滲的。此外，通過(guò)將電穿孔的配子和植入前胚胎(包括合子)釋放到生理溶液或培養(yǎng)基中，除去了通常的電穿孔培養(yǎng)基(例如，用于溶解多核苷酸如te的緩沖液)，從而進(jìn)一步減少其中的任何有害物質(zhì)可以延緩后續(xù)胚胎發(fā)育的可能性。例如，在用于電穿孔的緩沖液或培養(yǎng)基不是生理溶液或培養(yǎng)基時(shí)，例如含有用于溶解待電穿孔的材料的過(guò)量(例如多于40％或50％)緩沖液，在電穿孔后很快就除去這樣的緩沖液可能是有幫助的。在某些實(shí)施方式中，在常用于溶解核酸試劑的te或其他類似緩沖液在電穿孔介質(zhì)中以顯著量(例如＞40％或50％)存在時(shí)，可以使用多種方法以減輕任何潛在的有害影響。例如，在一個(gè)實(shí)施方式中，通過(guò)在電穿孔后立即在生理溶液中洗滌電穿孔的配子或胚胎可以使配子或胚胎在te緩沖液中洗浴的時(shí)間最小化。在其他實(shí)施方式中，溶解在te緩沖液中的核酸試劑(例如crispr/cas試劑)可以與生理溶液以適當(dāng)比例混合，使得整體滲量(osmolarity)更接近生理。在又一個(gè)實(shí)施方式中，核酸試劑(例如crispr/cas試劑)可以在生理溶液中直接復(fù)原，以避免或最小化任何復(fù)雜化。也就是說(shuō)，配子和植入前胚胎(包括合子)可以在生理溶液或培養(yǎng)基(例如等滲的溶液或培養(yǎng)基)中進(jìn)行電穿孔。生理溶液或培養(yǎng)基可以是鹽組成和滲透壓類似于血漿的人工制備溶液。雖然電穿孔確實(shí)可以在本文所述的條件下將生物材料引入合子，但產(chǎn)生活胎產(chǎn)的動(dòng)物需要合子在后續(xù)發(fā)育中生存。培養(yǎng)電穿孔的合子的初步失敗似乎表明不管期望遺傳修飾是否在電穿孔的合子中發(fā)生，合子可能無(wú)法幸存于電穿孔過(guò)程并繼續(xù)發(fā)育成活胎產(chǎn)的動(dòng)物。認(rèn)識(shí)到at處理可能過(guò)度損傷合子以減緩胚胎發(fā)育，并且所遞送的試劑如cas9mrna和指導(dǎo)rna可能對(duì)合子及其后續(xù)發(fā)育有毒，進(jìn)一步教導(dǎo)遠(yuǎn)離使用電穿孔作為在動(dòng)物中永久引入種系可傳遞的遺傳修飾的可行手段。申請(qǐng)人已經(jīng)在本文中證明，使用本發(fā)明的方法可以將電穿孔的合子的存活率，例如，如通過(guò)成功發(fā)育成胚泡期胚胎所測(cè)量的，顯著地提高到出人意料的高水平(例如接近或甚至達(dá)到100％)。因此，本發(fā)明的一個(gè)方面提供了一種產(chǎn)生遺傳修飾動(dòng)物(例如哺乳動(dòng)物)的方法，所述方法包括通過(guò)電穿孔將材料引入到動(dòng)物(例如哺乳動(dòng)物)的配子或植入前期胚胎中以修飾動(dòng)物(例如哺乳動(dòng)物)的基因組。在相關(guān)方面，本發(fā)明還提供了一種產(chǎn)生遺傳修飾動(dòng)物(例如哺乳動(dòng)物)的方法，所述方法包括通過(guò)電穿孔將材料引入到動(dòng)物(例如哺乳動(dòng)物)的去核卵母細(xì)胞中以修飾動(dòng)物(例如哺乳動(dòng)物)的基因組，其中體細(xì)胞同時(shí)通過(guò)電穿孔休克與所述去核卵母細(xì)胞融合。用去核卵母細(xì)胞融合體細(xì)胞是用于豬克隆的方法。在某些實(shí)施方式中，將材料引入到配子中。例如，配子可以是精子(例如成熟精子)、極體、或者卵子或卵。如果使用成熟精子，可以首先誘導(dǎo)精子以經(jīng)歷解凝。用于精子解凝的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的。參見(jiàn)例如mahi等.,j.reprod.fert.,44:293-296(1975)；hendricks等.,exptl.cellres.,40:402-412(1965)和wagner等.,archivesofandrology,1:31-41(1978)(均通過(guò)引用并入)。通過(guò)使用二硫化物還原劑的解凝是優(yōu)選的。如果使用卵，卵可以處于通過(guò)例如孤雌生殖產(chǎn)生的受精或活化狀態(tài)。也可以使用電穿孔的極體使單倍體卵二倍體化。在使用配子時(shí)，本發(fā)明的方法還包括將電穿孔的配子與另一個(gè)配子例如相反性別的配子融合(例如將電穿孔的卵與精子融合)，并允許融合的配子發(fā)育成活胎產(chǎn)的遺傳修飾動(dòng)物(例如哺乳動(dòng)物)。例如，如果精子被電穿孔，則將在其中實(shí)現(xiàn)遺傳修飾的精子細(xì)胞在之后置于卵中以使合子能夠形成。反之亦然。精子和卵可以在合子形成之前進(jìn)行電穿孔。電穿孔之后，與相反性別的配子或植入前胚胎融合之后，電穿孔的配子可以移植到假孕宿主動(dòng)物/哺乳動(dòng)物中，優(yōu)選具有相同物種或品系，該動(dòng)物(例如哺乳動(dòng)物)能夠承載胚胎到分娩期。在某些實(shí)施方式中，植入到假孕宿主動(dòng)物/哺乳動(dòng)物中在發(fā)育的桑椹胚或胚泡期發(fā)生。在其他實(shí)施方式中，植入在胚胎電穿孔后立即發(fā)生，或在電穿孔的配子與另一個(gè)配子融合后立即發(fā)生。在其他實(shí)施方式中，材料被引入早期胚胎，例如植入前期胚胎。植入前期胚胎可以是1-細(xì)胞胚胎(即，合子)、2-細(xì)胞胚胎、4-細(xì)胞胚胎、8-細(xì)胞胚胎、早期桑椹胚或晚期桑椹胚。由于胚胎發(fā)育有時(shí)可能涉及非對(duì)稱分裂，至少短暫地，早期胚胎是3-、5-、6-、7-細(xì)胞胚胎或其他不是對(duì)稱胚胎分裂的結(jié)果的胚胎是可能的。本發(fā)明的方法也適用于這樣的早期胚胎。在某些實(shí)施方式中，所述方法還包括允許(電穿孔的)植入前期胚胎發(fā)育成活胎產(chǎn)的遺傳修飾動(dòng)物(例如哺乳動(dòng)物)。例如，植入前胚胎在電穿孔之后可以移植到假孕宿主動(dòng)物(例如哺乳動(dòng)物)中，優(yōu)選具有相同物種或品系，該動(dòng)物(例如哺乳動(dòng)物)能夠承載胚胎到分娩期。在某些實(shí)施方式中，配子(在與相反性別的配子融合之后)或植入前胚胎在移植到假孕宿主動(dòng)物(例如哺乳動(dòng)物)之前先從在其中進(jìn)行電穿孔的培養(yǎng)基中移除。例如，電穿孔的配子或植入前胚胎可以在適合或相容于胚胎發(fā)育的培養(yǎng)基(例如等滲生理溶液或培養(yǎng)基)中洗滌一次或多次。這樣的洗滌還除去電穿孔培養(yǎng)基或緩沖液中可能有害或以其他方式不利于體外或體內(nèi)進(jìn)一步胚胎發(fā)育的任何物質(zhì)。用于該目的的適合的培養(yǎng)基包括但不限于m2培養(yǎng)基或或任何其他生理溶液(具有適當(dāng)?shù)碾x子強(qiáng)度和ph)。在某些實(shí)施方式中，用于洗滌的培養(yǎng)基或緩沖液預(yù)熱至動(dòng)物(例如哺乳動(dòng)物)胚胎發(fā)育的最佳溫度(例如約37℃)，以減少或最小化任何潛在的溫度沖擊。在某些實(shí)施方式中，電穿孔培養(yǎng)基是等滲的。在某些實(shí)施方式中，洗滌電穿孔的配子或植入前胚胎以除去用于溶解多核苷酸的一種或多種緩沖液，例如te緩沖液或含有金屬螯合劑例如edta的等效緩沖液。在某些實(shí)施方式中，洗滌電穿孔的配子或植入前胚胎以除去可以用作電穿孔培養(yǎng)基的基礎(chǔ)或低血清培養(yǎng)基，例如培養(yǎng)基(invitrogen,carlsbad,ca)、siporttm(am8990或am8990g；ambion,austin,tx)、或其混合物或等同物。使用本發(fā)明的方法可以將許多試劑或材料引入配子或植入前胚胎，以產(chǎn)生可通過(guò)種系傳遞的遺傳修飾。在某些實(shí)施方式中，材料可以包含多核苷酸、多肽或兩者。在其他實(shí)施方式中，還可以通過(guò)電穿孔引入另外的材料，例如那些天然或合成的化學(xué)品，使得它們促進(jìn)或抑制nhej、hdr或hr過(guò)程。例如，可以包括某些化學(xué)試劑以促進(jìn)或增強(qiáng)crispr/cas系統(tǒng)的功能(見(jiàn)下文)。在某些實(shí)施方式中，多聚核苷酸包含ii型cas9蛋白的編碼序列。在示例性實(shí)施方式中，cas9蛋白的編碼序列是mrna，例如適于在真核細(xì)胞中表達(dá)的密碼子優(yōu)化的mrna。在某些實(shí)施方式中，多核苷酸可以包含規(guī)律成簇的間隔短回文重復(fù)(crispr)-crispr相關(guān)(cas)系統(tǒng)指導(dǎo)rna，其能夠與哺乳動(dòng)物的基因組中的靶序列雜交。指導(dǎo)rna僅需要序列與靶序列足夠相似，使得它們可以在細(xì)胞內(nèi)生理?xiàng)l件下雜交。然而，在某些實(shí)施方式中，指導(dǎo)rna與靶序列完全互補(bǔ)(或100％相同)。在某些實(shí)施方式中，指導(dǎo)rna可以是與反式激活cr(tracr)序列融合的指導(dǎo)序列。在某些實(shí)施方式中，ii型cas9蛋白與crispr-cas系統(tǒng)指導(dǎo)rna的編碼序列的濃度比可以變化。例如，適合的比率可以是至少約1:1、至少約1.5:1、至少約2:1、至少約2.5:1、至少約3:1或更高。在其他實(shí)施方式中，ii型cas9蛋白與crispr-cas系統(tǒng)指導(dǎo)rna的編碼序列的濃度比可以是至多約1:1、至多約1:2、至多約1:4、至多約1:5、至多約1:10或更低。在某些實(shí)施方式中，ii型cas9蛋白的編碼序列的濃度是至少約40ng/μl、至少50ng/μl、至少100ng/μl、至少150ng/μl、至少200ng/μl、至少300ng/μl、至少400ng/μl、至少500ng/μl、至少600ng/μl、至少800ng/μl、或至少1000ng/μl或更高。在某些實(shí)施方式中，材料還包含供體多核苷酸(例如促進(jìn)crispr介導(dǎo)的nhej、hdr或hr)。例如，供體多核苷酸可以是線性或環(huán)狀雙鏈或單鏈dna分子?？梢园ㄟ@樣的供體多核苷酸以促進(jìn)可以是引入的crispr-cas系統(tǒng)的靶標(biāo)的靶序列的位點(diǎn)特異性修飾或其周圍的位點(diǎn)特異性修飾。除了crispr/cas系統(tǒng)，其他材料也可以使用本發(fā)明的方法引入配子或植入前胚胎。例如，在某些實(shí)施方式中，多核苷酸可以包含對(duì)動(dòng)物(例如哺乳動(dòng)物)的基因組中的靶序列具有特異性的轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)子核酸酶(talen)的編碼序列。在其他實(shí)施方式中，多核苷酸可以包含對(duì)動(dòng)物(例如哺乳動(dòng)物)的基因組中的靶序列具有特異性的鋅指核酸酶(zfn)的編碼序列。在又一些實(shí)施方式中，多核苷酸可以包含對(duì)動(dòng)物(例如哺乳動(dòng)物)的基因組中的靶序列具有特異性的bud衍生核酸酶(budn)、或模塊化堿基-每-堿基特異性核酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域(modularbase-per-basespecificnucleicacidbindingdomains,mbbbd)衍生核酸酶的編碼序列。在又一個(gè)實(shí)施方式中，多核苷酸包含隨機(jī)整合到動(dòng)物(例如哺乳動(dòng)物)的基因組中的dna。多核酸酶可以包含dna載體或rna(例如mrna和/或crispr指導(dǎo)rna)。在某些實(shí)施方式中，多核苷酸包含將dna片段隨機(jī)或特定整合到哺乳動(dòng)物的基因組中的轉(zhuǎn)座酶。本發(fā)明在進(jìn)行配子配合(即通過(guò)配子細(xì)胞的結(jié)合的有性生殖)的多細(xì)胞真核動(dòng)物的遺傳修飾中具有應(yīng)用。這樣的動(dòng)物的實(shí)例包括兩棲動(dòng)物、爬行動(dòng)物、鳥(niǎo)類、哺乳動(dòng)物、硬骨魚(yú)類、軟骨魚(yú)類、圓口綱動(dòng)物、節(jié)肢動(dòng)物、昆蟲(chóng)、軟體動(dòng)物和葉狀植物。示例性動(dòng)物包括哺乳動(dòng)物、鳥(niǎo)類和魚(yú)類。在某些實(shí)施方式中，動(dòng)物是哺乳動(dòng)物(見(jiàn)下文)。例如，哺乳動(dòng)物可以是人、非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物(例如狨、獼猴、黑猩猩)、嚙齒動(dòng)物(例如小鼠、大鼠、沙鼠、豚鼠、倉(cāng)鼠、棉鼠、裸鼴鼠)、兔、家畜哺乳動(dòng)物(例如山羊、綿羊、豬、奶牛、牛、馬、駱駝)、寵物哺乳動(dòng)物(例如狗、貓)、動(dòng)物園哺乳動(dòng)物、有袋類動(dòng)物、瀕危哺乳動(dòng)物或來(lái)自其遠(yuǎn)系繁殖或隨機(jī)繁殖群體的個(gè)體。本發(fā)明的方法可用于將許多可種系傳遞修飾引入到相關(guān)動(dòng)物物種的基因組，包括但不限于：小插入或缺失(例如一個(gè)或多個(gè)堿基對(duì)的那些)、異源dna片段的插入、內(nèi)源dna片段的缺失、內(nèi)源dna片段的倒位或易位，或其組合。同樣，在產(chǎn)生修飾方面可能涉及許多不同機(jī)制，包括但不限于非同源末端連接(nhej)、同源定向修復(fù)(hdr)或同源重組(hr)。同源定向修復(fù)(hdr)是細(xì)胞中修復(fù)雙鏈dna損傷的機(jī)制。這種修復(fù)機(jī)制只有在dna同源物片段存在于細(xì)胞核中時(shí)才可以被細(xì)胞使用，主要在細(xì)胞周期的g2和s期。在同源dna片段不存在時(shí)，可以發(fā)生另一個(gè)過(guò)程，稱為非同源末端連接(nhej)。非同源末端連接(nhej)是修復(fù)dna中的雙鏈斷裂的另一個(gè)途徑。nhej稱為是“非同源的”，是因?yàn)榕c需要同源序列指導(dǎo)修復(fù)的同源重組相反，斷裂末端直接連接而不需要同源模板。nhej通常利用短的同源dna序列(例如微同源)以指導(dǎo)修復(fù)。這些微同源通常存在于雙鏈斷裂的末端的單鏈突出端上。在突出端完全相容時(shí)，nhej通常精確地修復(fù)斷裂。導(dǎo)致核苷酸損失的不精確修復(fù)也可能發(fā)生，但是是在突出端不相容時(shí)更為常見(jiàn)。不適當(dāng)?shù)膎hej可以導(dǎo)致易位和端粒融合。nhej在所有生命界都在進(jìn)化上保守，并且在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中是主要的雙鏈斷裂修復(fù)途徑。在nhej途徑失活時(shí)，雙鏈斷裂可以被稱為微同源介導(dǎo)末端連接(mmej)的更容易出錯(cuò)的途徑修復(fù)。在這個(gè)途徑中，末端切除顯示在斷裂的任一側(cè)的短微同源，其然后與指導(dǎo)修復(fù)對(duì)齊。這與通常使用已經(jīng)暴露在dsb末端上的單鏈突出端中的微同源的經(jīng)典nhej形成對(duì)比。因此，mmej進(jìn)行的修復(fù)導(dǎo)致微同源之間的dna序列的缺失。同源重組是基因重組的一種類型，其中核酸序列在同源dna的兩個(gè)相似或相同分子之間交換。它被細(xì)胞最廣泛地用于精確地修復(fù)發(fā)生在dna雙鏈兩者上的有害斷裂，稱為雙鏈斷裂(dsb)。同源重組也是在減數(shù)分裂期間產(chǎn)生dna序列的新組合的過(guò)程，真核生物通過(guò)該過(guò)程產(chǎn)生配子細(xì)胞，如動(dòng)物中的精子和卵。同源重組在生命的所有三個(gè)域以及病毒中都是保守的。本發(fā)明的方法適用于單個(gè)配子或植入前胚胎，并且也適用于約2、3、5、10、20、30、40、50、100、125、150、200、250、300或更多個(gè)配子或植入前期胚胎的多重使用和同時(shí)使用，例如均可以在相同或不同的條件下，在同一電擊杯中或者在多個(gè)相似或相同電擊杯中同時(shí)電穿孔。本發(fā)明的方法在許多方面優(yōu)于顯微注射。與顯微注射相比，本發(fā)明的方法不僅效率高得多且技術(shù)要求低很多并且適合標(biāo)準(zhǔn)化，而且胚胎存活率和種系傳遞率兩者都高很多。例如，顯微注射通?？梢詫?shí)現(xiàn)注射的小鼠胚胎約20-25％的存活率(例如，約20-25％的注射的小鼠胚胎存活以產(chǎn)生活胎產(chǎn)的小鼠幼仔)。相比之下，電穿孔的植入前期胚胎(或電穿孔的、然后融合的配子)中的至少約50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或更多，優(yōu)選以與匹配對(duì)照類似的速率，例如在合子電穿孔后約3.5天，發(fā)育成胚泡期胚胎，或者發(fā)育成活胎產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物。例如，匹配對(duì)照可以是偽電穿孔的配子或胚胎，其可以通過(guò)空載體、crispr/cas的加擾mrna和/或指導(dǎo)序列、或僅緩沖液電穿孔。在某些實(shí)施方式中，電穿孔的植入前期胚胎(或電穿孔的、然后融合的配子)中的至少約70％、75％、80％、85％、90％或更多發(fā)育成活胎產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物。在某些實(shí)施方式中，如通過(guò)含有設(shè)計(jì)的遺傳修飾的活胎產(chǎn)的哺乳動(dòng)物的百分比所測(cè)量的，宿主基因組的靶向效率為至少約80％、85％、90％、95％、97％、99％或接近100％。雖然不希望受到任何特定理論的約束，但是本發(fā)明方法的高靶向效率可能是由于胚胎浸沒(méi)在同質(zhì)crispr/cas溶液中并且在電穿孔時(shí)類似地暴露于crispr/cas試劑。這與相應(yīng)顯微注射實(shí)驗(yàn)形成直接對(duì)比，在顯微注射實(shí)驗(yàn)中技術(shù)能力水平和特定實(shí)驗(yàn)周圍的因素都可能有助于靶向效率相對(duì)大的變化。在某些實(shí)施方式中，配子或植入前期胚胎在電穿孔之前預(yù)處理以弱化透明帶。例如，為此目的，配子或植入前期胚胎可以在酸性臺(tái)氏液(at)中預(yù)處理。臺(tái)氏液由美國(guó)藥理學(xué)家mauricevejuxtyrode發(fā)明，是林格-洛克氏溶液的改良。它與間質(zhì)液大致等滲，并且主要用于生理實(shí)驗(yàn)和組織培養(yǎng)。它含有鎂、糖(通常是葡萄糖)作為能量來(lái)源，并使用碳酸氫鹽和/或hepes作為緩沖液。一些變化還包括磷酸根和硫酸根離子。在用于細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)用和生理實(shí)驗(yàn)時(shí)，其通常用95％的氧5％二氧化碳進(jìn)行氣體處理。酸性臺(tái)氏液通常可以通過(guò)在室溫下在100ml水中溶解nacl0.8g、kcl0.02g、cacl2·2h2o0.024g、mgcl2·6h2o0.01g、葡萄糖0.1g、聚乙烯吡咯烷酮(pvp)0.4g，并用analarhcl(bdh)調(diào)節(jié)至ph2.5而制備。添加pvp以增加粘度并降低胚胎粘性。溶液可以過(guò)濾滅菌并以等分試樣儲(chǔ)存在-20℃。at可以從例如sigma-aldrich的供應(yīng)商商購(gòu)獲得(例如100ml包裝的skut1788)。在某些實(shí)施方式中，配子或植入前胚胎在at中預(yù)處理約5-30秒、約5-20秒或約5-10秒。如果at被稀釋，也可以使用更長(zhǎng)的處理時(shí)間?？梢酝ㄟ^(guò)在不同時(shí)間段內(nèi)處理配子或植入前胚胎，然后測(cè)量活力、處理后受損或凋亡配子/胚胎的百分比或在后續(xù)發(fā)育期間胚胎的存活率，以實(shí)驗(yàn)為依據(jù)確定適合的at處理時(shí)間。雖然可以使用稍微不同的電穿孔條件，但在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明中的電穿孔在1mm電擊杯中進(jìn)行，使用以下設(shè)置：20-30伏(例如25、26或27伏)、脈沖持續(xù)時(shí)間為1-2ms(例如1.5ms)、1-3個(gè)脈沖、脈沖間隔為100-1000ms(例如約125-130ms)。在某些實(shí)施方式中，也可以使用適當(dāng)調(diào)整的參數(shù)相似的2mm電擊杯。在某些實(shí)施方式中，電穿孔的配子或胚胎可以在電穿孔后立即使用，例如分別與另一個(gè)配子融合或移植到假孕雌性中。在其他實(shí)施方式中，電穿孔后，配子或植入前期胚胎冷凍儲(chǔ)存，然后解凍進(jìn)行下一步驟，例如分別與另一個(gè)配子融合或移植到假孕雌性中。在又一個(gè)實(shí)施方式中，可以使電穿孔的配子或胚胎在冷凍保存之前先發(fā)育成后期胚胎，例如早期或晚期桑椹胚，或胚泡期胚胎(在電穿孔的配子的情況下，在先與另一個(gè)配子融合之后)。使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，例如玻璃化或慢速程序化冷凍(spf)，可以進(jìn)行冷凍保存。在某些實(shí)施方式中，用于電穿孔的植入前胚胎、合子或配子通過(guò)體外受精(ivf)獲得、從冷凍保存恢復(fù)。本發(fā)明的另一方面提供了通過(guò)本發(fā)明的任一種方法產(chǎn)生的遺傳修飾動(dòng)物(例如哺乳動(dòng)物)。盡管有上文概述的發(fā)明，下文部分還提供了關(guān)于本發(fā)明的具體方面的額外細(xì)節(jié)，其應(yīng)結(jié)合概述并在其背景下閱讀。本文所描述的具體實(shí)施方式中的任一個(gè)均設(shè)想可與本發(fā)明的其他實(shí)施方式中的任一個(gè)或多個(gè)組合，包括僅在實(shí)施例部分中描述的那些。2.電穿孔和電穿孔器電穿孔是一種動(dòng)態(tài)現(xiàn)象，其取決于細(xì)胞膜上每個(gè)點(diǎn)處的局部跨膜電壓。對(duì)于給定的脈沖持續(xù)時(shí)間和形狀，存在針對(duì)電穿孔現(xiàn)象的表現(xiàn)的特定跨膜電壓閾值(例如0.5v至1v)。這導(dǎo)致定義電穿孔的電場(chǎng)大小閾值(eth)。只有在e≧eth的區(qū)域內(nèi)的細(xì)胞才被電穿孔。如果達(dá)到或超過(guò)第二閾值(eir)，電穿孔將損害細(xì)胞活力，導(dǎo)致不可逆的電穿孔(ire)。電穿孔允許細(xì)胞引入大的、高度帶電的分子，例如dna、rna或蛋白，其可能不被動(dòng)擴(kuò)散穿過(guò)疏水雙層核。雖然不希望受到任何特定理論的約束，但是據(jù)信電穿孔的機(jī)制涉及在細(xì)胞膜中產(chǎn)生nm級(jí)充水孔。據(jù)信在電穿孔過(guò)程中，膜中的脂質(zhì)分子未化學(xué)改變，而僅僅是移動(dòng)位置，打開(kāi)在其充滿水時(shí)充當(dāng)穿過(guò)雙層的導(dǎo)電通路的孔。電穿孔通常是具有幾個(gè)不同階段的多步驟過(guò)程。首先，必須施加短的電脈沖。典型的參數(shù)會(huì)是300-400mv對(duì)于＜1ms跨膜。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中使用的電壓通常大得多，因?yàn)樗鼈儽皇┘涌缭介L(zhǎng)距離到主體溶液，所以跨越實(shí)際膜的所得場(chǎng)僅僅是施加的偏壓的一小部分。在施加該電位時(shí)，膜通過(guò)來(lái)自周圍溶液的離子的遷移像電容器一樣充電。一旦達(dá)到臨界場(chǎng)，脂質(zhì)形態(tài)快速局部重排。所得結(jié)構(gòu)據(jù)信是“前孔(pre-pore)”，因?yàn)樗粚?dǎo)電，但迅速導(dǎo)致產(chǎn)生導(dǎo)電孔。這樣的前孔存在的證據(jù)主要來(lái)自孔的“閃爍”，其啟示導(dǎo)電和絕緣狀態(tài)之間的轉(zhuǎn)變。已經(jīng)提出這些前孔是小的疏水性缺陷。如果這個(gè)理論是正確的，則轉(zhuǎn)變到導(dǎo)電狀態(tài)可以通過(guò)在孔邊緣處的重排解釋，其中脂質(zhì)頭部折疊以產(chǎn)生親水界面。最后，這些導(dǎo)電孔可以愈合、再密封雙層，或者膨脹，最終使其破裂。作為結(jié)果發(fā)生的命運(yùn)取決于是否超過(guò)臨界缺陷尺寸，其進(jìn)而取決于所施加的場(chǎng)、局部機(jī)械應(yīng)力和雙層邊緣能量。根據(jù)本發(fā)明，配子和植入前胚胎的電穿孔可以用市售的電穿孔器(在細(xì)胞溶液中產(chǎn)生電磁場(chǎng)的裝置)進(jìn)行。電穿孔器的示例性但非限制的商業(yè)型號(hào)包括：來(lái)自btx(sandiego,ca)的ecmtm830squarewaveelectroporator或2001electrocellmanipulator(ecm2001)。在典型設(shè)置中，將配子或植入前胚胎懸浮液移液到玻璃或塑料電擊杯中，其在其側(cè)面具有兩個(gè)鋁電極。在電穿孔之前，將配子或植入前胚胎與要引入至配子或植入前胚胎中的(生物)材料(例如dna、rna或蛋白或其混合物)輕輕混合?；旌衔锟梢栽谄湟埔旱诫姄舯?例如，1mm或2mm寬的電擊杯)之前制成，或在電擊杯中制成。通常，使用約20μl總體積的懸浮液混合物，雖然也可以使用10-200μl、20-100μl、25-75μl總體積。然后設(shè)置電壓和電容(見(jiàn)下文)，并將電擊杯插入電穿孔器中。在電穿孔后立即將對(duì)胚胎存活最優(yōu)的給定量(例如，與整個(gè)電擊杯容量等體積、約20-200μl或約100μl)的液體培養(yǎng)基加入到電擊杯中以洗出電穿孔混合物，并將整個(gè)內(nèi)容物收集在適合的容器中(例如組織培養(yǎng)皿)。電穿孔的配子或植入前胚胎的存活及其發(fā)育成培養(yǎng)物或活胎產(chǎn)的動(dòng)物在一定程度上取決于仔細(xì)洗滌和除去電穿孔培養(yǎng)基，如果電穿孔培養(yǎng)基不是生理溶液的話。生理溶液不僅為胚胎發(fā)育提供了適當(dāng)?shù)牡葷B環(huán)境，而且還可以除去可能不利于胚胎發(fā)育/存活的任何潛在有害物質(zhì)。在發(fā)育中的胚胎，例如3.5天的胚泡期胚胎，轉(zhuǎn)移到代孕母親/假孕雌性以發(fā)育至足月并作為活的動(dòng)物出生之前，配子或植入前胚胎，優(yōu)選地在洗滌后，在最佳溫度和/或大氣條件(例如在37℃、5％co2或5％o2/5％co2/氮?dú)庀?下轉(zhuǎn)移到假孕雌性或者孵育所需時(shí)間段。如可以在ecm830或ecm2001型中使用的典型電穿孔條件可以包括在1mm電擊杯進(jìn)行電穿孔，使用以下設(shè)置：20-30伏(例如25、26或27伏)、脈沖持續(xù)時(shí)間為1-2ms(例如1.5ms)、1-3個(gè)脈沖、脈沖間隔為100-1000ms(例如約125-130ms)。然而，應(yīng)理解本文公開(kāi)的條件是出于說(shuō)明目的而不是限制性的。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以基于例如要引入的分子的大小和量、配子或胚胎的類型等容易地調(diào)整參數(shù)。電穿孔可以在市售的臺(tái)式電穿孔器中進(jìn)行，例如來(lái)自btx的ecm830或ecm2001型以及devices(lonzagroupltd.)。一些裝置用適合多孔細(xì)胞培養(yǎng)皿的特殊電極組件提供同時(shí)電穿孔多個(gè)樣品的可能性。臺(tái)式電穿孔器也可以設(shè)置為不同的操作參數(shù)，允許操作員探索或優(yōu)化特定參數(shù)，例如場(chǎng)強(qiáng)。3.哺乳動(dòng)物除了上述進(jìn)行有性生殖的多細(xì)胞真核動(dòng)物之外，本發(fā)明的方法特別適用于任何哺乳動(dòng)物，包括人、非人靈長(zhǎng)類(例如狨、獼猴、黑猩猩)、嚙齒動(dòng)物(例如小鼠、大鼠、沙鼠、豚鼠、倉(cāng)鼠、棉鼠、裸鼴鼠)、兔、家畜哺乳動(dòng)物(例如山羊、綿羊、豬、奶牛、牛、馬、駱駝)、寵物哺乳動(dòng)物(例如狗、貓)、動(dòng)物園哺乳動(dòng)物、有袋類動(dòng)物、瀕危哺乳動(dòng)物及其所有遠(yuǎn)親繁殖或隨機(jī)繁殖群體。在某些實(shí)施方式中，哺乳動(dòng)物是小鼠，例如近交小鼠。示例性近交小鼠系包括但不限于近交小鼠系c3h，例如cba、dba、fvb、nob、balb/c、129、c57bl，并且c57bl小鼠包括c57bl/6j、c57bl/6ntac、c57bl/6ncrl、c57bl/10等。包括重組近交系的其他近交小鼠系包括(但不限于)：129s1/svimj、129t2/svemsj、129x1/svj、129p3/j、a/j、akr/j、balb/cby、balb/cbyj、balb/cbalb/cj、c3h/hej、c3h/heouj、c3heb/fej、c57bl/10j、c58、cba/cahn-btkxid/j、cba/j、dba/1j、dba/1lacj、dba/2j、fvb/nj、mrl/mpj、nod/ltj、sjl/j、swr/j、nor/ltj、nzb/blnj、nzw/lacj、rbf/dnj、129s6/svevtac、ajtac、balb/canntac、balb/cjbomtac、balb/cabomtac、c57bl/6ntac、c57bl/6jbomtac、c57bl/10sgaitac、c3h/hentac、cba/jbomtac、dba/1jbomtac、dba/2ntac、dba/2jbomtac、fvb/ntac、nod/mrktac、nzm/aegtac、sjl/jcrntac、balb/canncrlbr、c3h/hencrlbr、c57bl/6ncrlbr、dba/2ncrlbr、fvb/ncrlbr、c.b-17/icrcrlbr、129/svpasicocrlbr、sjl/jorlicocrlbr、a/jolahsd、balb/cannhsd、c3h/henhsd、c57bl/10scnhsd、c57bl/6nhsd、cba/jcrhsd、dba/2nhsd、fvb/nhsd、samp1/kahsd、samp6/tahsd、samp8/tahsd、samp10/tahsd、sjl/jcrhsd、akr/olahsd、biozziabh/rijhsd、c57bl/6jolahsd、fvb/nhanhsd、mrl/mpolahsd、nzb/olahsd、nzw/olahsd、swr/olahsd、129p2/olahsd、and129s2/svhsd、b6.129p2-apoetm1unc/j、nod.cb17-prkdcscid/j、129s1/svimj、129x1/svj、b10.a-h2ah2-t18a/sgsnj、b10.d2-hc0h2dh2-t18c/osnj、b10.d2-hc1h2dh2-t18c/nsnj、b10.riii-h2rh2-t18b/(71ns)snj、b6(c)-h2-ab1bm12/khegj、b6.129p2-il10tm1cgn/j、b6.129p2-nos2tm1lau/j、b6.129p2-nos3tm1unc/j、b6.129s2-cd8atm1mak/j、b6.129s2-igh-6tm1cgn/j、b6.129s7-ifngtm1ts/j、b6.129s7-rag1tm1mom/j、b6.cb17-prkdcscid/szj、b6.mrl-faslpr/j、b6.v-lepob/j、bks.cg-m+/+leprdb/j、c3heb/fej、c57bl/10jc57bl/10snj、c57bl/6-tg(apoa1)1rub/j、c57bl/6j-tyrc-2j/j、cba/cahn-btkxid/j、cba/caj、cbysmn.cb17-prkdcscid/j、fvb/n-tg(mmtvneu)202mul/j、kk.cg-ay/j、mrl/mpj、mrl/mpj-faslpr/j、sjl/j、swr/j、b10.pl-h2uh2-t18a/(73ns)snj、noncnzo5/ltj、wr、bph/2、bpl/1、fs、p/j、p/a和pro。在某些實(shí)施方式中，小鼠也包括具有所有遺傳工程化(例如轉(zhuǎn)基因的、敲除、敲入、敲低、逆轉(zhuǎn)錄病毒的、病毒的)或化學(xué)誘導(dǎo)突變(例如enu、ems，還包括突變體存檔)；輻射誘導(dǎo)突變；小鼠系上保持的自發(fā)突變/修飾的變體，特別是衍生自例如c57bl/6、129、fvb、c3h、nod、dba/2、balb/c和cd-1的突變體，包括同類系和重組同類系。具體實(shí)例包括：b6.129p2-apoetm1unc/j、b6.129s4-pdyntm1ute/j、b6；129p2-pemttm1j/j、nod.cgprkdcscid-b2mb/dvs等。在某些實(shí)施方式中，小鼠是通過(guò)雜交兩個(gè)近交系(包括混合的近交系)產(chǎn)生的小鼠雜交系。示例性雜交系包括：nzbwf1/j、b6cbaf1/j、b6sjlf1/j、cb6f1/j、cbyb6f1/j、plsjlf1/j、wbb6f1/j-kitw/kitw-v、b6129pf1/j、caf1/j、b6129pf2/j、b6129sf1/j、b6129sf2/j、b6af1/j、b6c3f1/j、b6cbaf1/j和b6sjlf1/j。在任一雜交系中，比例可以在50:50f1至99:1f1之間變化。在某些實(shí)施方式中，小鼠是遠(yuǎn)交系小鼠，例如cd-1、icr、blackswiss、swisswebster、nihswiss、cf-1和nude小鼠。在某些實(shí)施方式中，大鼠是近交系大鼠，例如aci、brownnorway(bn)、bcix、copenhagen(cop)、mwf、dagouti(da)、goto-kakizaki(gk)、lewis、fischer344(f344)、wistarfurth(wf)、wistarkyoto(wky；wkyn1)或zdf。在某些實(shí)施方式中，大鼠也包括具有所有遺傳工程化(例如轉(zhuǎn)基因的、敲除、敲入、敲低、逆轉(zhuǎn)錄病毒的、病毒的)或化學(xué)誘導(dǎo)突變(例如enu，還包括突變體存檔)；輻射誘導(dǎo)突變；包括同類系的大鼠系上保持的自發(fā)突變/修飾的變體。具體實(shí)例包括：f344/ntac-tg(hla-b27)-tg(2m)33-3trg；hsdamc:tr-abcc2；hsdhlr:zucker-leprfa和nihnude。在某些實(shí)施方式中，大鼠是通過(guò)雜交兩個(gè)近交系產(chǎn)生的大鼠雜交系。示例性雜交系包括：bhr、fbnf1/hsd和lbnf1/hsd。在某些實(shí)施方式中，大鼠是遠(yuǎn)交系大鼠，例如holtzman、spraguedawley、longevans、wistar、wistarhan、wh、wky、zucker、jcr(russelrat)和ofa。4.使用crispr/cas、talen、zfn或bud進(jìn)行基因組修飾或編輯本文所述的發(fā)明提供了一種修飾或“編輯”感興趣的動(dòng)物基因組的強(qiáng)大工具，使得修飾或編輯的動(dòng)物基因組可以通過(guò)種系傳遞來(lái)傳遞。更具體地，基因組修飾或編輯可以用于通過(guò)例如引入異源轉(zhuǎn)基因或通過(guò)抑制靶標(biāo)內(nèi)源基因的表達(dá)改變感興趣的動(dòng)物(例如哺乳動(dòng)物)的基因組序列。這樣的遺傳修飾動(dòng)物可用于例如建立與特定遺傳疾病或失調(diào)相對(duì)應(yīng)的相關(guān)動(dòng)物模型。這樣的動(dòng)物模型可用于探索或研究疾病機(jī)制、進(jìn)程、預(yù)防和治療(例如藥物篩選和臨床前測(cè)試)。可以在動(dòng)物模型中表現(xiàn)的說(shuō)明性(非限制性)人類疾病或失調(diào)包括：各種類型的癌癥、心臟病、高血壓、代謝和激素失調(diào)、糖尿病、肥胖癥、骨質(zhì)疏松癥、青光眼、皮膚色素沉著疾病、失明、耳聾、神經(jīng)退行性失調(diào)(例如亨廷頓舞蹈癥或阿爾茲海默病)、精神紊亂(包括焦慮和抑郁)和出生缺陷(例如腭裂和無(wú)腦兒)。大多數(shù)目前可用的動(dòng)物模型都是在小鼠中形成，它們重新產(chǎn)生任何特定人類疾病的一些但可能不是全部方面。對(duì)于可能難以使用小鼠模型模擬的某些疾病，例如許多神經(jīng)退行性疾病(其中大部分涉及認(rèn)知缺陷)，本發(fā)明的方法可用于在非人靈長(zhǎng)類中產(chǎn)生動(dòng)物模型。例如，最近開(kāi)發(fā)了使用恒河猴的亨廷頓舞蹈病轉(zhuǎn)基因模型，該模型復(fù)制了該失調(diào)的特征性病理中的一些，就像該失調(diào)在人類中發(fā)生一樣(yang等.,2008)?？梢允褂萌魏伪绢I(lǐng)域公認(rèn)的技術(shù)進(jìn)行基因組編輯，例如zfn/talen或crispr技術(shù)(參見(jiàn)gaj等人的綜述,trendsinbiotech.,31(7):397-405(2013)，整個(gè)文本和其中所有引用的參考文獻(xiàn)都通過(guò)引用并入本文)。這樣的技術(shù)使得人們幾乎能夠操縱廣泛的細(xì)胞類型和生物體中的任何基因，從而使得能夠通過(guò)誘導(dǎo)在特定基因組位置刺激易錯(cuò)非同源末端連接(nhej)或同源定向修復(fù)(hdr)的dna雙鏈斷裂(dsb)而進(jìn)行廣泛的遺傳修飾。鋅指核酸酶(zfn)和轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)子核酸酶(talen)是由與非特異性dna切割區(qū)域連接的可編程的、序列特異性dna結(jié)合模塊組成的嵌合核酸酶。它們是通過(guò)將鋅指或tal效應(yīng)子dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合到dna切割結(jié)構(gòu)域而產(chǎn)生的人造限制性酶(re)?？梢怨こ袒\指(zf)或轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)子(tale)以結(jié)合任何期望靶dna序列，并融合到re的dna切割結(jié)構(gòu)域，從而產(chǎn)生對(duì)期望靶dna序列具有特異性的工程限制性酶(zfn或talen)。在將zfn/talen引入到細(xì)胞中時(shí)，例如植入前胚胎的細(xì)胞(例如合子)，它可以用于原位基因組編輯。實(shí)際上，zfn和talen的多功能性可以擴(kuò)展到除核酸酶以外的效應(yīng)子結(jié)構(gòu)域，例如轉(zhuǎn)錄激活子和抑制子、重組酶、轉(zhuǎn)座酶、dna和組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶以及組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶，以影響基因組結(jié)構(gòu)和功能。cys2-his2鋅指結(jié)構(gòu)域是真核生物中發(fā)現(xiàn)的dna結(jié)合基序的最常見(jiàn)類型之一，代表人類基因組中第二經(jīng)常編碼的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域。個(gè)體鋅指具有保守ββα構(gòu)型的約30個(gè)氨基酸。用于特異性dna識(shí)別的鋅指蛋白的應(yīng)用的關(guān)鍵是含有多于三個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域的非天然陣列的開(kāi)發(fā)。這一進(jìn)步通過(guò)基于結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)高度保守的接頭序列而得以促進(jìn)，該接頭序列使得能夠構(gòu)建識(shí)別長(zhǎng)度為9-18bp的dna序列的合成鋅指蛋白。這種設(shè)計(jì)已經(jīng)被證明是構(gòu)建識(shí)別在復(fù)雜基因組中具有特異性的連續(xù)dna序列的鋅指蛋白的最佳策略。適合的鋅指可以通過(guò)模塊化裝配方法獲得(例如使用通過(guò)選擇大型組合文庫(kù)或通過(guò)合理設(shè)計(jì)產(chǎn)生的鋅指模塊的預(yù)選文庫(kù))。已經(jīng)開(kāi)發(fā)了識(shí)別幾乎所有64種可能的核苷酸三聯(lián)體的鋅指結(jié)構(gòu)域，預(yù)選的鋅指模塊可以串聯(lián)在一起以靶向含有一系列這些dna三聯(lián)體的dna序列。或者，基于選擇的方法，例如寡聚體庫(kù)工程(open)，可用于從考慮到相鄰指之間的上下文依賴性相互作用的隨機(jī)文庫(kù)中選擇新的鋅指陣列。還使用了兩種方法的組合。工程化鋅指是可商購(gòu)的。sangamobiosciences(richmond,ca,usa)與sigma-aldrich(st.louis,mo,usa)合作開(kāi)發(fā)了一種用于鋅指構(gòu)建的適合平臺(tái)(compozr)，該平臺(tái)允許研究人員完全避開(kāi)鋅指構(gòu)建和驗(yàn)證，并且已經(jīng)有數(shù)千種蛋白可用。廣泛地，鋅指蛋白技術(shù)使得能夠靶向幾乎任何序列。tal效應(yīng)子是由植物致病性黃單胞菌屬細(xì)菌分泌的蛋白，具有含有重復(fù)的高度保守的33-34氨基酸序列的dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域，第12和第13位氨基酸除外。這兩個(gè)位置是高度可變的(重復(fù)可變雙殘基或rvd)并且顯示與特異性核苷酸識(shí)別的強(qiáng)相關(guān)性。氨基酸序列與dna識(shí)別之間的這種簡(jiǎn)單關(guān)系已經(jīng)允許通過(guò)選擇含有適合rvd的重復(fù)區(qū)段的組合對(duì)特定dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域進(jìn)行工程化。像鋅指那樣，模塊化tale重復(fù)連接在一起以識(shí)別連續(xù)dna序列。已經(jīng)使眾多效應(yīng)子結(jié)構(gòu)域可用于針對(duì)所靶向的遺傳修飾融合到tale重復(fù)，包括核酸酶、轉(zhuǎn)錄激活子和位點(diǎn)特異性重組酶。定制的tale陣列的快速組裝可以通過(guò)使用包括“金門(mén)”分子克隆、高通量固相組裝和連接非依賴性克隆技術(shù)的策略實(shí)現(xiàn)，均可用于本發(fā)明中對(duì)克隆干細(xì)胞進(jìn)行基因組編輯。tale重復(fù)可以使用本領(lǐng)域中可用的眾多工具容易地組裝，例如靶向18,740個(gè)人類蛋白編碼基因的talen文庫(kù)(kim等.,nat.biotechnol.,31:251–258(2013))。定制設(shè)計(jì)的tale陣列也可通過(guò)例如cellectisbioresearch(paris,france)、transposagenbiopharmaceuticals(lexington,ky,usa)和lifetechnologies(grandisland,ny,usa)商購(gòu)。來(lái)自re(例如foki內(nèi)切核酸酶(或foki切割結(jié)構(gòu)域變體，例如sharkey，具有旨在改善切割特異性和/或切割活性的突變))的末端的非特異性dna切割結(jié)構(gòu)域可用于構(gòu)建在酵母試驗(yàn)中有活性(在植物細(xì)胞和動(dòng)物細(xì)胞中也有活性)的雜交核酸酶。為了提高zfn活性，可以使用瞬時(shí)低溫培養(yǎng)條件以增加核酸酶表達(dá)水平；也可以使用位點(diǎn)特異性核酸酶與dna末端加工酶的共遞送，和允許zfn和talen修飾細(xì)胞富集的熒光替代報(bào)告體載體的使用。zfn介導(dǎo)的基因組編輯的特異性也可以通過(guò)使用鋅指切口酶(zfnickase)改善，這利用切口dna的誘導(dǎo)刺激hdr而不激活易錯(cuò)nhej修復(fù)途徑的發(fā)現(xiàn)。氨基酸序列與tale結(jié)合結(jié)構(gòu)域的dna識(shí)別之間的簡(jiǎn)單關(guān)系允許可設(shè)計(jì)的蛋白?？梢允褂每晒_(kāi)獲得的軟件程序(dnaworks)計(jì)算適合在兩步pcr中組裝的寡核苷酸。本領(lǐng)域還已經(jīng)報(bào)道和已知用于產(chǎn)生工程化tale構(gòu)造體的許多模塊化組裝方案。這兩種方法都提供了對(duì)dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域進(jìn)行工程化的系統(tǒng)途徑，其在概念上類似于用于產(chǎn)生鋅指dna識(shí)別結(jié)構(gòu)域的模塊化組裝方法。一旦已經(jīng)組裝了talen基因，使用任何本領(lǐng)域公認(rèn)的方法，例如使用陽(yáng)離子脂質(zhì)基試劑，使用質(zhì)粒載體，各種病毒載體如腺病毒、aav以及整合酶缺陷型慢病毒載體(idlv)的電穿孔或轉(zhuǎn)染，將它們引入至載體上的靶細(xì)胞中。或者，talen可以作為mrna遞送至細(xì)胞，這消除了talen表達(dá)蛋白的基因組整合的可能性。它也可以顯著增加基因編輯過(guò)程中同源定向修復(fù)(hdr)的水平和基因滲入的成功。最后，還可以使用純化的zfn/talen蛋白直接遞送到細(xì)胞中。該方法不具有插入誘變的風(fēng)險(xiǎn)，并且導(dǎo)致比依賴從核酸表達(dá)的遞送系統(tǒng)更少的脫靶效應(yīng)，并且因此可以最佳地用于需要細(xì)胞中的精確基因組工程的研究，例如即時(shí)干細(xì)胞。在本文所述實(shí)施方式中的任一項(xiàng)中，根據(jù)本發(fā)明的電穿孔方法可以將talen基因、mrna或蛋白引入至配子和植入前胚胎。talen可用于通過(guò)誘導(dǎo)雙鏈斷裂(dsb)而編輯基因組，其細(xì)胞響應(yīng)于修復(fù)機(jī)制。非同源末端連接(nhej)重新連接來(lái)自雙鏈斷裂的任一側(cè)的dna，在那里很少有或沒(méi)有序列重疊用于退火?？梢赃\(yùn)行簡(jiǎn)單的異源雙鏈核酸分子斷裂試驗(yàn)，其檢測(cè)通過(guò)pcr擴(kuò)增的兩個(gè)等位基因之間的任何差異。切割產(chǎn)物可以在簡(jiǎn)單的瓊脂糖凝膠或平板凝膠系統(tǒng)上顯現(xiàn)。或者，可以通過(guò)nhej在外源雙鏈dna片段的存在下將dna引入基因組。同源定向修復(fù)也可以在dsb處引入外源dna，因?yàn)檗D(zhuǎn)染的雙鏈序列可用作修復(fù)酶的模板。已經(jīng)使用talen以產(chǎn)生穩(wěn)定修飾的人胚胎干細(xì)胞和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(ipsc)克隆以產(chǎn)生敲除的秀麗隱桿線蟲(chóng)、大鼠和斑馬魚(yú)。zfn和talen能夠糾正疾病的根本原因，從而用精準(zhǔn)的基因組修飾永久地消除癥狀。例如，zfn誘導(dǎo)的hdr已經(jīng)用于通過(guò)修復(fù)缺陷靶基因或通過(guò)敲除靶基因，直接糾正與x連鎖重度聯(lián)合免疫缺陷(scid)、血友病b、鐮狀細(xì)胞病、α1-抗胰蛋白酶缺陷和許多其他遺傳疾病相關(guān)的致病突變。此外，這些位點(diǎn)特異性核酸酶還可用于在靶動(dòng)物基因組中的特定“安全港”位置處將治療性轉(zhuǎn)基因安全地插入受試者配子或植入前胚胎。這樣的技術(shù)可用于基因療法以“糾正”給定動(dòng)物基因組中的特定遺傳缺陷?；蛘撸琧rispr/csa系統(tǒng)也可用于有效地將靶向遺傳改變誘導(dǎo)到受試者配子和植入前胚胎中。crispr/cas(crispr相關(guān))系統(tǒng)或“規(guī)律成簇的間隔短回文重復(fù)“是包含多個(gè)短的直接重復(fù)的基因座，并為細(xì)菌和古菌提供獲得性免疫。crispr系統(tǒng)依賴crrna和tracrrna對(duì)入侵的外源dna進(jìn)行序列特異性沉默。術(shù)語(yǔ)“tracrrna”表示反式激活嵌合rna，其是促進(jìn)crrna加工的非編碼rna，并且是激活通過(guò)cas9進(jìn)行rna指導(dǎo)切割所需要的。crisprrna或crrna與tracrrna堿基配對(duì)以形成引導(dǎo)cas9內(nèi)切酶至互補(bǔ)dna位點(diǎn)進(jìn)行切割的雙rna結(jié)構(gòu)。存在三種類型的crispr/cas系統(tǒng)：在ii型系統(tǒng)中，cas9作為rna指導(dǎo)的dna核酸內(nèi)切酶，其在crrna-tracrrna靶標(biāo)識(shí)別時(shí)切割dna。在細(xì)菌中，crispr系統(tǒng)通過(guò)rna指導(dǎo)的dna切割提供對(duì)抗侵入的外源dna的獲得性免疫。可以通過(guò)重新設(shè)計(jì)crrna而使crispr/cas系統(tǒng)重新靶向以切割幾乎任何dna序列。實(shí)際上，已經(jīng)顯示crispr/cas系統(tǒng)可以通過(guò)共遞送表達(dá)cas9核酸內(nèi)切酶和必需crrna組分的質(zhì)粒直接移動(dòng)到人細(xì)胞。這些可編程的rna指導(dǎo)的dna核酸內(nèi)切酶已經(jīng)展示了多重基因破壞能力和在ips細(xì)胞中靶向整合，因此可以在本發(fā)明方法中類似地使用。任何crispr/cas系統(tǒng)，包括相關(guān)cas蛋白和rna指導(dǎo)序列，以及它們的編碼序列(例如cas9的mrna或指導(dǎo)rna的編碼序列)或包含這樣的編碼序列的載體可與本發(fā)明的方法一起使用。參見(jiàn)美國(guó)2014-0068797a1和美國(guó)專利no.8,697,359中描述的那些(均通過(guò)引用并入本文)。在下面的描述中，rna指導(dǎo)序列也稱為“dna靶向rna”，其包含靶向序列，并與修飾多肽(例如cas9)一起提供靶dna和/或與靶dna相關(guān)的多肽的位點(diǎn)特異性修飾。在下面的描述中，crispr/cas系統(tǒng)中的cas9型蛋白也稱為“位點(diǎn)特異性修飾多肽”。dna靶向rna將相關(guān)多肽(例如定點(diǎn)修飾多肽)的活性引導(dǎo)至靶dna內(nèi)的特異性靶序列。本發(fā)明的dna靶向rna包含：第一區(qū)段(本文中也稱為“dna靶向區(qū)段”或“dna靶向序列”)和第二區(qū)段(本文中也稱為“蛋白結(jié)合區(qū)段”或“蛋白結(jié)合序列”)。dna靶向rna的dna靶向區(qū)段包含與靶dna中的序列互補(bǔ)的核苷酸序列。本發(fā)明的dna靶向rna的dna靶向區(qū)段通過(guò)雜交(例如堿基配對(duì))以序列特異性方式與靶dna相互作用。因此，dna靶向區(qū)段的核苷酸序列可以變化并且確定在靶dna內(nèi)dna靶向rna將與靶dna相互作用的位置。可以修改dna靶向rna的dna靶向區(qū)段(例如通過(guò)基因工程)以與靶dna內(nèi)的任何期望序列雜交。dna靶向區(qū)段可以具有約12個(gè)核苷酸至約100個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度。例如，dna靶向區(qū)段可以具有約12個(gè)核苷酸(nt)至約80nt、約12nt至約50nt、約12nt至約40nt、約12nt至約30nt、約12nt至25nt、約12nt至約20nt或約12nt至約19nt的長(zhǎng)度。例如，dna靶向區(qū)段可以具有約19nt至約20nt、約19nt至約25nt、約19nt至約30nt、約19nt至約35nt、約19nt至約40nt、約19nt至約45nt、約19nt至約50nt、約19nt至約60nt、約19nt至約70nt、約19nt至約80nt、約19nt至約90nt、約19nt至約100nt、約20nt至約25nt、約20nt至約30nt、約20nt至約35nt、約20nt至約40nt、約20nt至約45nt、約20nt至約50nt、約20nt至約60nt、約20nt至約70nt、約20nt至約80nt、約20nt至約90nt或約20nt至約100nt的長(zhǎng)度。與靶dna的核苷酸序列(靶序列)互補(bǔ)的dna靶向區(qū)段的核苷酸序列(dna靶向序列)可以具有至少約12nt的長(zhǎng)度。例如，與靶dna的靶序列互補(bǔ)的dna靶向區(qū)段的dna靶向序列可以具有至少約12nt、至少約15nt、至少約18nt、至少約19nt、至少約20nt、至少約25nt、至少約30nt、至少約35nt或至少約40nt的長(zhǎng)度。例如，與靶dna的靶序列互補(bǔ)的dna靶向區(qū)段的dna靶向序列可以具有約12個(gè)核苷酸(nt)至約80nt、約12nt至約50nt、約12nt至約45nt、約12nt至約40nt、約12nt至約35nt、約12nt至約30nt、約12nt至約25nt、約12nt至約20nt、約12nt至約19nt、約19nt至約20nt、約19nt至約25nt、約19nt至約30nt、約19nt至約35nt、約19nt至約40nt、約19nt至約45nt、約19nt至約50nt、約19nt至約60nt、約20nt至約25nt、約20nt至約30nt、約20nt至約35nt、約20nt至約40nt、約20nt至約45nt、約20nt至約50nt或約20nt至約60nt的長(zhǎng)度。與靶dna的核苷酸序列(靶序列)互補(bǔ)的dna靶向區(qū)段的核苷酸序列(dna靶向序列)可以具有至少約12nt的長(zhǎng)度。在一些實(shí)施方式中，與靶dna的靶序列互補(bǔ)的dna靶向區(qū)段的dna靶向序列長(zhǎng)度為20個(gè)核苷酸。在一些實(shí)施方式中，與靶dna的靶序列互補(bǔ)的dna靶向區(qū)段的dna靶向序列長(zhǎng)度為19個(gè)核苷酸。dna靶向區(qū)段的dna靶向序列與靶dna的靶序列之間的互補(bǔ)性百分比可以為至少60％(例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)。在一些實(shí)施方式中，dna靶向區(qū)段的dna靶向序列與靶dna的靶序列之間的互補(bǔ)性百分比在靶dna的互補(bǔ)鏈的靶序列的七個(gè)連續(xù)最多5個(gè)(contiguous5’-most)核苷酸上為100％。在一些實(shí)施方式中，dna靶向區(qū)段的dna靶向序列與靶dna的靶序列之間的互補(bǔ)性百分比在約20個(gè)連續(xù)核苷酸上為至少60％。在一些實(shí)施方式中，dna靶向區(qū)段的dna靶向序列與靶dna的靶序列之間的互補(bǔ)性百分比在靶dna的互補(bǔ)鏈的靶序列的十四個(gè)連續(xù)最多5個(gè)核苷酸上為100％，并且在其余部分上為低至0％。在這樣的實(shí)施方式中，dna靶向序列可以認(rèn)為是長(zhǎng)度為14個(gè)核苷酸。在一些實(shí)施方式中，dna靶向區(qū)段的dna靶向序列與靶dna的靶序列之間的互補(bǔ)性百分比在靶dna的互補(bǔ)鏈的靶序列的七個(gè)連續(xù)最多5個(gè)核苷酸上為100％，并且在其余部分上為低至0％。在這種情況下，dna靶向序列可以認(rèn)為是長(zhǎng)度為7個(gè)核苷酸。本發(fā)明的dna靶向rna的蛋白結(jié)合區(qū)段與定點(diǎn)修飾多肽相互作用。本發(fā)明的dna靶向rna通過(guò)上述dna靶向區(qū)段將結(jié)合的多肽引導(dǎo)到靶dna內(nèi)的特定核苷酸序列。本發(fā)明的dna靶向rna的蛋白結(jié)合區(qū)段包含彼此互補(bǔ)的兩段核苷酸。蛋白結(jié)合區(qū)段的互補(bǔ)核苷酸雜交以形成雙鏈rna雙鏈體(dsrna)。本發(fā)明的雙分子dna靶向rna包含兩個(gè)單獨(dú)的rna分子。本發(fā)明的雙分子dna靶向rna的兩個(gè)rna分子中的每一個(gè)包含彼此互補(bǔ)的核苷酸段，使得兩個(gè)rna分子的互補(bǔ)核苷酸雜交以形成蛋白結(jié)合區(qū)段的雙鏈rna雙鏈體。在一些實(shí)施方式中，激活子-rna的雙鏈體形成區(qū)段與激活子-rna(tracrrna)分子(例如美國(guó)2014-0068797a1的seqidno:431-562所述，通過(guò)引用并入)之一或其補(bǔ)體在至少8個(gè)連續(xù)核苷酸段上至少約60％相同。例如，激活子-rna的雙鏈體形成區(qū)段(或編碼激活子-rna的雙鏈體形成區(qū)段的dna)與美國(guó)2014-0068797a1的seqidno:431-562所述的tracrrna序列之一或其補(bǔ)體在至少8個(gè)連續(xù)核苷酸段上至少約60％相同、至少約65％相同、至少約70％相同、至少約75％相同、至少約80％相同、至少約85％相同、至少約90％相同、至少約95％相同、至少約98％相同、至少約99％相同或100％相同。在一些實(shí)施方式中，靶向體-rna的雙鏈體形成區(qū)段與美國(guó)2014-0068797a1的seqidno:563-679(通過(guò)引用并入)所述的靶向體-rna(crrna)序列之一或其補(bǔ)體在至少8個(gè)連續(xù)核苷酸段上至少約60％相同。例如，靶向體-rna的雙鏈體形成區(qū)段(或編碼靶向體-rna的雙鏈體形成區(qū)段的dna)與美國(guó)2014-0068797a1的seqidno:563-679所述的crrna序列之一或其補(bǔ)體在至少8個(gè)連續(xù)核苷酸段上至少約65％相同、至少約70％相同、至少約75％相同、至少約80％相同、至少約85％相同、至少約90％相同、至少約95％相同、至少約98％相同、至少約99％相同或100％相同。可以設(shè)計(jì)兩分子dna靶向rna以允許靶向體-rna與激活子-rna受控(即，有條件)結(jié)合。因?yàn)閮煞肿觗na靶向rna除非激活子-rna和靶向體-rna兩者與dcas9結(jié)合成功能性復(fù)合物，否則不起作用，所以可以通過(guò)使激活子-rna與靶向體-rna之間的結(jié)合可誘導(dǎo)而使兩分子dna靶向rna可誘導(dǎo)(例如，可藥物誘導(dǎo))。作為一個(gè)非限制性實(shí)例，rna適體可用于調(diào)節(jié)(即控制)激活子-rna與靶向體-rna的結(jié)合。因此，激活子-rna和/或靶向體-rna可以包含rna適體序列。rna適體是本領(lǐng)域已知的并且通常是核糖開(kāi)關(guān)的合成版本。術(shù)語(yǔ)“rna適體”和“核糖開(kāi)關(guān)”在本文中可互換使用以涵蓋合成和天然核酸序列，其提供它們所屬的rna分子的結(jié)構(gòu)的可誘導(dǎo)性調(diào)節(jié)(并因此提供特定序列的可利用性)。rna適體通常包含折疊成特定結(jié)構(gòu)(例如發(fā)夾)的序列，其特異性結(jié)合特定藥物(例如小分子)。藥物的結(jié)合導(dǎo)致rna折疊的結(jié)構(gòu)變化，其改變適體所屬核酸的特征。作為非限制性實(shí)例：(i)具有適體的激活子-rna可能不能結(jié)合到關(guān)聯(lián)靶向體-rna，除非適體被適合的藥物結(jié)合；(ii)具有適體的靶向體-rna可能不能結(jié)合到關(guān)聯(lián)激活子-rna，除非適體被適合的藥物結(jié)合；和(iii)各自包含結(jié)合不同藥物的不同適體的靶向體-rna和激活子-rna可能不能彼此結(jié)合，除非這兩種藥物都存在。如這些實(shí)例所說(shuō)明的，可以將兩分子dna靶向rna設(shè)計(jì)為可誘導(dǎo)的?？梢岳缭趎akamura等.,genescells,2012年5月,17(5):344-364；vavalle等.,futurecardiol.,2012年5月,8(3):371-382；citartan等.,biosens.bioelectron.,2012年4月15日,34(1):1-11以及l(fā)iberman等.,wileyinterdiscip.rev.rna,2012年5月至6月,3(3):369-384中發(fā)現(xiàn)適體和核糖開(kāi)關(guān)的實(shí)例；其均通過(guò)引用全文并入本文。可以包含在兩分子dna靶向rna中的核苷酸序列的非限制性實(shí)例包括與美國(guó)2014-0068797a1的seqidno:563-679所述的任何序列或其補(bǔ)體配對(duì)的美國(guó)2014-0068797a1的seqidno:431-562所述的序列或其補(bǔ)體中的任一個(gè)，其可以雜交以形成蛋白結(jié)合區(qū)段。單分子dna靶向rna包含兩段核苷酸(靶向體-rna和激活子-rna)，其彼此互補(bǔ)、通過(guò)中間核苷酸(“接頭”或“接頭核苷酸”)共價(jià)連接、并且雜交以形成蛋白結(jié)合區(qū)段的雙鏈rna雙鏈體(dsrna雙鏈體)，從而產(chǎn)生莖環(huán)結(jié)構(gòu)。靶向體-rna和激活子-rna可以經(jīng)由靶向體-rna的3’端和激活子-rna的5’端共價(jià)連接。或者，靶向體-rna和激活子-rna可以經(jīng)由靶向體-rna的5’端和激活子-rna的3’端共價(jià)連接。單分子dna靶向rna的接頭可以具有約3個(gè)核苷酸至約100個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度。例如，接頭可以具有約3個(gè)核苷酸(nt)至約90nt、約3個(gè)核苷酸(nt)至約80nt、約3個(gè)核苷酸(nt)至約70nt、約3個(gè)核苷酸(nt)至約60nt、約3個(gè)核苷酸(nt)至約50nt、約3個(gè)核苷酸(nt)至約40nt、約3個(gè)核苷酸(nt)至約30nt、約3個(gè)核苷酸(nt)至約20nt或約3個(gè)核苷酸(nt)至約10nt的長(zhǎng)度。例如，接頭可以具有約3nt至約5nt、約5nt至約10nt、約10nt至約15nt、約15nt至約20nt、約20nt至約25nt、約25nt至約30nt、約30nt至約35nt、約35nt至約40nt、約40nt至約50nt、約50nt至約60nt、約60nt至約70nt、約70nt至約80nt、約80nt至約90nt或約90nt至約100nt的長(zhǎng)度。在一些實(shí)施方式中，單分子dna靶向rna的接頭是4nt。示例性單分子dna靶向rna包含雜交以形成dsrna雙鏈體的兩個(gè)互補(bǔ)核苷酸段。在一些實(shí)施方式中，單分子dna靶向rna的兩個(gè)互補(bǔ)核苷酸段之一(或編碼該段的dna)與美國(guó)2014-0068797a1的seqidno:431-562所述的激活子-rna(tracrrna)分子之一或其補(bǔ)體在至少8個(gè)連續(xù)核苷酸段上至少約60％相同。例如，單分子dna靶向rna的兩個(gè)互補(bǔ)核苷酸段之一(或編碼該段的dna)與美國(guó)2014-0068797a1的seqidno:431-562所述的tracrrna序列之一或其補(bǔ)體在至少8個(gè)連續(xù)核苷酸段上至少約65％相同、至少約70％相同、至少約75％相同、至少約80％相同、至少約85％相同、至少約90％相同、至少約95％相同、至少約98％相同、至少約99％相同或100％相同。在一些實(shí)施方式中，單分子dna靶向rna的兩個(gè)互補(bǔ)核苷酸段之一(或編碼該段的dna)與seqidno:563-679所述的靶向體-rna(crrna)序列之一或其補(bǔ)體在至少8個(gè)連續(xù)核苷酸段上至少約60％相同。例如，單分子dna靶向rna的兩個(gè)互補(bǔ)核苷酸段之一(或編碼該段的dna)與美國(guó)2014-0068797a1的seqidno:563-679所述的crrna序列之一或其補(bǔ)體在至少8個(gè)連續(xù)核苷酸段上至少約65％相同、至少約70％相同、至少約75％相同、至少約80％相同、至少約85％相同、至少約90％相同、至少約95％相同、至少約98％相同、至少約99％相同或100％相同。在確定適當(dāng)?shù)年P(guān)聯(lián)對(duì)時(shí)，通過(guò)考慮到物種名稱和堿基配對(duì)(對(duì)于蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域的dsrna雙鏈體)，對(duì)于美國(guó)2014-0068797a1的seqidno:431-679可以常規(guī)地確定crrna和tracrrna的適當(dāng)?shù)奶烊淮嬖诘年P(guān)聯(lián)對(duì)。關(guān)于單分子dna靶向rna和雙分子dna靶向rna兩者，與天然存在的tracrrna和crrna很少共有(約50％同一性)的人工序列可以與cas9起作用以切割靶dna，只要dna靶向rna的蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)是保守的。因此，為了設(shè)計(jì)人工蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域(雙分子或單分子版本)，可以將dna靶向rna的天然存在的蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域的rna折疊結(jié)構(gòu)納入考慮。作為非限制性實(shí)例，可以基于天然存在dna靶向rna的蛋白結(jié)合區(qū)段的結(jié)構(gòu)(例如包括相同數(shù)目的沿著rna雙鏈體的堿基對(duì)，并且包括與天然存在的rna中存在的相同的“凸起”區(qū)域)，設(shè)計(jì)功能性人工dna靶向rna。由于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以容易地為來(lái)自任何物種的任何天然存在的crrna:tracrrna對(duì)(參見(jiàn)美國(guó)2014-0068797a1的seqidno:431-679，來(lái)自廣泛物種的crrna和tracrrna序列)產(chǎn)生結(jié)構(gòu)，在使用來(lái)自那些物種的cas9(或相關(guān)的cas9)時(shí)，可以設(shè)計(jì)人工dna靶向rna以模擬給定物種的天然結(jié)構(gòu)。因此，適合的dna靶向rna可以是人工設(shè)計(jì)的rna(非天然存在的)，其包含設(shè)計(jì)為模擬天然存在的dna靶向rna(參見(jiàn)美國(guó)2014-0068797a1的seqidno:431-679，在確定適當(dāng)?shù)年P(guān)聯(lián)對(duì)時(shí)考慮到物種名稱)的蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)的蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域。蛋白結(jié)合區(qū)段可以具有約10個(gè)核苷酸至約100個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度。例如，蛋白結(jié)合區(qū)段可以具有約15個(gè)核苷酸(nt)至約80nt、約15nt至約50nt、約15nt至約40nt、約15nt至約30nt或約15nt至約25nt的長(zhǎng)度。同樣關(guān)于單分子dna靶向rna和雙分子dna靶向rna兩者，蛋白結(jié)合區(qū)段的dsrna雙鏈體可以具有6個(gè)堿基對(duì)(bp)至約50bp的長(zhǎng)度。例如，蛋白結(jié)合區(qū)段的dsrna雙鏈體可以具有約6bp至約40bp、約6bp至約30bp、約6bp至約25bp、約6bp至約20bp、約6bp至約15bp、約8bp至約40bp、約8bp中約30bp、約8bp中約25bp、約8bp至約20bp或約8bp至約15bp的長(zhǎng)度。例如，蛋白結(jié)合區(qū)段的dsrna雙鏈體可以具有約8bp至約10bp、約10bp至約15bp、約15bp至約18bp、約18bp至約20bp、約20bp至約25bp、約25bp至約30bp、約30bp至約35bp、35bp至約40bp或40bp至約50bp的長(zhǎng)度。在一些實(shí)施方式中，蛋白結(jié)合區(qū)段的dsrna雙鏈體具有36個(gè)堿基對(duì)的長(zhǎng)度。雜交以形成蛋白結(jié)合區(qū)段的dsrna雙鏈體的核苷酸序列之間的互補(bǔ)性百分比可以為至少約60％。例如，雜交以形成蛋白結(jié)合區(qū)段的dsrna雙鏈體的核苷酸序列之間的互補(bǔ)性百分比可以為至少約65％、至少約70％、至少約75％、至少約80％、至少約85％、至少約90％、至少約95％、至少約98％或至少約99％。在一些情況下，雜交以形成蛋白結(jié)合區(qū)段的dsrna雙鏈體的核苷酸序列之間的互補(bǔ)性百分比為100％。dna靶向rna和定點(diǎn)修飾多肽形成復(fù)合物。dna靶向rna通過(guò)包含與靶dna的序列(如上所述)互補(bǔ)的核苷酸序列為復(fù)合物提供靶特異性。復(fù)合物的定點(diǎn)修飾多肽提供位點(diǎn)特異性活性。換句話說(shuō)，通過(guò)定點(diǎn)修飾多肽與dna靶向rna的至少蛋白結(jié)合區(qū)段的關(guān)聯(lián)，將定點(diǎn)修飾多肽引導(dǎo)到dna序列(例如染色體序列或染色體外序列，例如附加體序列、微環(huán)序列、線粒體序列、葉綠體序列等)。定點(diǎn)修飾多肽修飾靶dna(例如靶dna的切割或甲基化)和/或與靶dna相關(guān)的多肽(例如組蛋白尾的甲基化或乙?；?。定點(diǎn)修飾多肽在本文中也稱為“定點(diǎn)多肽”或“rna結(jié)合定點(diǎn)修飾多肽”。在一些實(shí)施方式中，定點(diǎn)修飾多肽是天然存在的修飾多肽。在其他情況下，定點(diǎn)修飾多肽不是天然存在的多肽(例如，如下所述的嵌合多肽，或者經(jīng)例如突變、缺失、插入修飾的天然存在的多肽)。示例性天然存在的定點(diǎn)修飾多肽在美國(guó)2014-0068797a1的seqidno:1-255中(通過(guò)引用并入)作為天然存在的cas9/csn1內(nèi)切核酸酶的非限制性和非窮盡性列表列出。如本文公開(kāi)的這些天然存在的多肽與dna靶向rna結(jié)合，從而指向靶dna內(nèi)的特定序列，并切割靶dna以產(chǎn)生雙鏈斷裂。定點(diǎn)修飾多肽包含兩部分：rna結(jié)合部分和活性部分。在一些實(shí)施方式中，定點(diǎn)修飾多肽包含：(i)與dna靶向rna相互作用的rna結(jié)合部分，其中dna靶向rna包含與靶dna中的序列互補(bǔ)的核苷酸序列；和(ii)顯示定點(diǎn)酶活性(例如用于dna甲基化的活性、用于dna切割的活性、用于組蛋白乙酰化的活性、用于組蛋白甲基化的活性等)的活性部分，其中酶活性的位點(diǎn)由dna靶向rna確定。在其他實(shí)施方式中，定點(diǎn)修飾多肽包含：(i)與dna靶向rna相互作用的rna結(jié)合部分，其中dna靶向rna包含與靶dna中的序列互補(bǔ)的核苷酸序列；和(ii)調(diào)節(jié)靶dna內(nèi)的轉(zhuǎn)錄(例如增加或減少轉(zhuǎn)錄)的活性部分，其中靶dna內(nèi)調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄的位點(diǎn)由dna靶向rna確定。在一些實(shí)施方式中，定點(diǎn)修飾多肽具有修飾靶dna的酶活性(例如核酸酶活性、甲基轉(zhuǎn)移酶活性、脫甲基酶活性、dna修復(fù)活性、dna損傷活性、脫氨基活性、歧化酶活性、烷基化活性、脫嘌呤活性、氧化活性、嘧啶二聚體形成活性、整合酶活性、轉(zhuǎn)座酶活性、重組酶活性、聚合酶活性、連接酶活性、解旋酶活性、光解酶活性或糖基化酶活性)。在其他情況下，本發(fā)明定點(diǎn)修飾多肽具有修飾與靶dna相關(guān)的多肽(例如組蛋白)的酶活性(例如甲基轉(zhuǎn)移酶活性、脫甲基酶活性、乙酰轉(zhuǎn)移酶活性、脫乙酰酶活性、激酶活性、磷酸酶活性、泛素連接酶活性、去泛素化活性、腺苷酸化活性、脫腺苷化活性、sumo化活性、去sumo化活性、核糖基化活性、脫核糖基活性、豆蔻?；钚曰蛎摱罐Ⅴ；钚?。下文進(jìn)一步提供示例性定點(diǎn)修飾多肽。具體地，在一些實(shí)施方式中，定點(diǎn)修飾多肽包含氨基酸序列，其與美國(guó)2014-0068797a1的圖3中所示的cas9/csn1氨基酸序列的氨基酸7-166或731-1003，或與美國(guó)2014-0068797a1的seqidno:1-256和795-1346所述的氨基酸序列中的任一個(gè)的相應(yīng)部分(均通過(guò)引用并入本文)具有至少約75％、至少約80％、至少約85％、至少約90％、至少約95％、至少約99％或100％的氨基酸序列同一性。在一些實(shí)施方式中，核酸(例如dna靶向rna)包含一個(gè)或多個(gè)修飾，例如堿基修飾、主鏈修飾等，以為核酸提供新的或增強(qiáng)的特征(例如改進(jìn)的穩(wěn)定性)。如本領(lǐng)域已知的，核苷是堿基-糖組合。核苷的堿基部分通常是雜環(huán)堿基。這樣的雜環(huán)堿基的兩個(gè)最常見(jiàn)的類別是嘌呤和嘧啶。核苷酸是進(jìn)一步包含與核苷的糖部分共價(jià)連接的磷酸基團(tuán)的核苷。對(duì)于包含戊呋喃糖的那些核苷，磷酸基團(tuán)可以連接到糖的2’、3’或5’羥基部分。在形成寡核苷酸時(shí)，磷酸基團(tuán)將相鄰的核苷酸彼此共價(jià)連接以形成線性聚合化合物。進(jìn)而，該線性聚合化合物的各自末端可以進(jìn)一步連接形成環(huán)狀化合物，然而，線性化合物通常是適合的。此外，線性化合物可以具有內(nèi)部核苷酸堿基互補(bǔ)性，并且因此可以以產(chǎn)生完整或部分雙鏈化合物的方式折疊。在寡核苷酸內(nèi)，磷酸基團(tuán)通常涉及形成寡核苷酸的核苷間主鏈。rna和dna的正常連接或主鏈?zhǔn)?’至5’磷酸二酯鍵。含有修飾的適合核酸的實(shí)例包括含有修飾主鏈或非天然核苷間鍵的核酸。具有修飾主鏈的核酸包括在主鏈中保留磷原子的那些和在主鏈中不具有磷原子的那些。其中含有磷原子的適合的修飾寡核苷酸主鏈包括例如硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基和其他烷基膦酸酯(包括3’-亞烷基膦酸酯、5'-亞烷基膦酸酯和手性膦酸酯)、次膦酸酯、氨基磷酸酯(包括3’-氨基氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酰酯)、二氨基磷酸酯、硫羰基氨基磷酸酯、硫羰基烷基膦酸酯、硫羰基烷基磷酸三酯、具有正3’-5’鍵的硒代磷酸酯和硼代三磷酸酯、這些的2’-5’連接的類似物、以及具有反向極性的那些，其中一個(gè)或多個(gè)核苷酸間鍵是3’至3’、5’至5’或2’至2’鍵。具有反向極性的適合的寡核苷酸包含在最3’-端核苷酸間鍵處的單個(gè)3’至3’鍵，例如單個(gè)倒置核苷殘基，其可以是基本單元(核堿基缺失或具有代替其的羥基)。還包括各種鹽(例如鉀或鈉)、混合鹽和游離酸形式。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明核酸包含一個(gè)或多個(gè)硫代磷酸酯和/或雜原子核苷間鍵，特別是-ch2-nh-o-ch2-、-ch2-n(ch3)-o-ch2-(稱為亞甲基(甲基亞氨基)或mmi主鏈)、-ch2-o-n(ch3)-ch2-、-ch2-n(ch3)-n(ch3)-ch2-和-o-n(ch3)-ch2-ch2-(其中天然磷酸二酯核苷酸間鍵表示為-o-p(＝o)(oh)-o-ch2-)。mmi型核苷間鍵在上述美國(guó)專利號(hào)5,489,677中公開(kāi)。適合的酰胺核苷間鍵在美國(guó)專利號(hào)5,602,240中公開(kāi)。兩者均通過(guò)引用并入。還適合的是具有嗎啉主鏈結(jié)構(gòu)的核酸，如例如美國(guó)專利號(hào)5,034,506中所述(通過(guò)引用并入)。例如，在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明核酸包含代替核糖環(huán)的6元嗎啉環(huán)。在這些實(shí)施方式的一些中，二氨基磷酸酯或其他非磷酸二酯核苷間鍵代替磷酸二酯鍵。其中不含磷原子的適合的修飾聚核苷酸主鏈具有由短鏈烷基或環(huán)烷基核苷間鍵、混合雜原子和烷基或環(huán)烷基核苷間鍵、或一個(gè)或多個(gè)短鏈雜原子或雜環(huán)核苷間鍵形成的主鏈。這些包括具有嗎啉鍵(部分由核苷的糖部分形成)；硅氧烷主鏈；硫化物、亞砜和砜主鏈；甲酰乙酰和硫代甲酰乙酰主鏈；亞甲基甲酰乙酰和硫代甲酰乙酰主鏈；核糖乙酰主鏈；含烯烴的主鏈；氨基磺酸鹽主鏈；亞甲基亞氨基和亞甲基肼基主鏈；磺酸酯和磺酰胺主鏈；酰胺主鏈的那些；和具有混合的n、o、s和ch2組分部分的其他。本發(fā)明的核酸也可以是核酸模擬物。術(shù)語(yǔ)“模擬物”在其應(yīng)用于聚核苷酸時(shí)旨在包括其中僅呋喃糖環(huán)或呋喃糖環(huán)和核苷酸間鍵兩者均被非呋喃糖基團(tuán)替換的聚核苷酸，僅替換呋喃糖環(huán)在本領(lǐng)域也稱為糖代替。雜環(huán)堿基部分或修飾的雜環(huán)堿基部分保持與適合的靶核酸雜交。一種這樣的核酸，已經(jīng)顯示具有優(yōu)異雜交性質(zhì)的聚核苷酸模擬物，稱為肽核酸(pna)。pna化合物中的主鏈?zhǔn)莾蓚€(gè)或更多個(gè)連接的氨基乙基甘氨酸單元，其給予pna含酰胺的主鏈。雜環(huán)堿基部分直接或間接地結(jié)合到主鏈的酰胺部分的氮雜氮原子上。描述pna化合物制備的代表性美國(guó)專利包括但不限于美國(guó)專利號(hào)5,539,082、5,714,331和5,719,262。全部通過(guò)引用并入。已經(jīng)研究的另一類聚核苷酸模擬物是基于具有連接到嗎啉環(huán)的雜環(huán)堿基的連接的嗎啉單元(嗎啉核酸)。已經(jīng)報(bào)道了連接嗎啉核酸中的嗎啉單體單元的許多連接基團(tuán)。已經(jīng)選擇一類連接基團(tuán)以提供非離子低聚化合物。非離子嗎啉基低聚化合物不太可能具有與細(xì)胞蛋白質(zhì)不期望的相互作用。嗎啉基聚核苷酸是寡核苷酸的非離子模擬物，其不太可能與細(xì)胞蛋白質(zhì)形成不期望的相互作用(dwainea.braasch和davidr.corey,biochemistry,41(14):4503-4510(2002))。嗎啉基聚核苷酸在美國(guó)專利號(hào)5,034,506(通過(guò)引用并入)中公開(kāi)。已經(jīng)制備了嗎啉類的聚核苷酸中的各種化合物，其具有連接單體亞基的多種不同連接基團(tuán)。另一類聚核苷酸模擬物稱為環(huán)己烯基核酸(cena)。通常存在于dna/rna分子中的呋喃糖環(huán)被環(huán)己烯基環(huán)代替。已經(jīng)制備了cenadmt保護(hù)的亞磷酰胺單體，其用于根據(jù)經(jīng)典亞磷酰胺化學(xué)的低聚化合物合成。已經(jīng)制備并研究了完全修飾的cena低聚化合物和具有由cena修飾的特定位置的寡核苷酸(參見(jiàn)wang等,j.am.chem.soc.,122:8595-8602(2000)，通過(guò)引用并入)。通常將cena單體引入dna鏈增加其dna/rna雜交體的穩(wěn)定性。cena寡腺苷酸化物與rna和dna互補(bǔ)物形成復(fù)合物，具有與天然復(fù)合物相似的穩(wěn)定性。通過(guò)nmr和圓二色性顯示將cena結(jié)構(gòu)引入天然核酸結(jié)構(gòu)的研究，以繼續(xù)進(jìn)行容易的構(gòu)象適應(yīng)。另外的修飾包括鎖核酸(lan)，其中2’-羥基基團(tuán)連接到糖環(huán)的4’碳原子上，從而形成2’-c,4’-c-氧亞甲基連接，從而形成雙環(huán)糖部分。連接可以是橋連2’氧原子和4’碳原子的亞甲基(-ch2-)基團(tuán)，其中n是1或2(singh等,chem.commun.,4:455-456(1998))。lna和lna類似物顯示出與互補(bǔ)dna和rna非常高的雙鏈體熱穩(wěn)定性(tm＝+3至+10℃)、對(duì)于3’-外切核酸酶降解的穩(wěn)定性和良好的溶解性。已經(jīng)描述了含有l(wèi)na的有效且無(wú)毒的反義寡核苷酸(wahlestedt等,proc.natl.acad.sci.u.s.a.,97:5633-5638(2000)，通過(guò)引用并入)。已經(jīng)描述了lna單體腺嘌呤、胞嘧啶、鳥(niǎo)嘌呤、5-甲基-胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶的合成和制備，及其低聚以及核酸識(shí)別性質(zhì)(koshkin等,tetrahedron,54:3607-3630(1998)，通過(guò)引用并入)。lna及其制備也在wo98/39352和wo99/14226中描述，均通過(guò)引用并入本文。核酸也可以包含一個(gè)或多個(gè)取代的糖部分。適合的聚核苷酸包含選自以下的糖取代基團(tuán)：oh；f；o-、s-或n-烷基；o-、s-或n-烯基；o-、s-或n-炔基；或o-烷基-o烷基，其中烷基、烯基和炔基可以是取代或未取代的c1-10烷基或c2-10烯基和炔基。特別適合的是o((ch2)no)mch3、o(ch2)noch3、o(ch2)nnh2、o(ch2)nch3、o(ch2)nonh2和o(ch2)non((ch2)nch3)2，其中n和m為1至約10。其他適合的聚核苷酸包含選自以下的糖取代基團(tuán)：c1-10低級(jí)烷基、取代的低級(jí)烷基、烯基、炔基、烷芳基、芳烷基、o-烷芳基或o-芳烷基、sh、sch3、ocn、cl、br、cn、cf3、ocf3、soch3、so2ch3、ono2、no2、n3、nh2、雜環(huán)烷基、雜環(huán)烷芳基、氨基烷基氨基、多烷基氨基、取代的甲硅烷基、rna切割基團(tuán)、報(bào)道體基團(tuán)、嵌入體、用于改善寡核苷酸的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)的基團(tuán)或用于改善寡核苷酸的藥效學(xué)的基團(tuán)、以及具有相似性質(zhì)的其他取代基。適合的修飾包括2'-甲氧基乙氧基(2’-o--ch2ch2och3，也稱為2'-o-(2-甲氧基乙基)或2'-moe)(martin等,helv.chim.acta,78:486-504(1995))，即烷氧基烷氧基基團(tuán)。另外的適合修飾包括2’-二甲基氨基氧乙氧基，即o(ch2)2on(ch3)2基團(tuán)，也稱為2’-dmaoe，如在下文實(shí)施例中所述，以及2’-二甲基氨基乙氧基乙氧基(本領(lǐng)域中也稱為2’-o-二甲基-氨基-乙氧基-乙基或2’-dmaeoe)，即2’-o-ch2-o-ch2-n(ch3)2。其他適合的糖取代基團(tuán)包括甲氧基(-o-ch3)、氨基丙氧基(-och2ch2ch2nh2)、烯丙基(-ch2-ch＝ch2)、-o-烯丙基(-o-ch2ch＝ch2)和氟(f)。2’-糖取代基團(tuán)可以在阿拉伯糖(上)位置或核糖(下)位置。適合的2’-阿拉伯糖修飾是2’-f。也可以在低聚化合物的其他位置，特別是3’端核苷上或在2’-5’連接的寡核苷酸中的糖的3’位和5’端核苷酸的5’位進(jìn)行類似的修飾。低聚化合物也可以具有代替戊呋喃糖的糖模擬物，例如環(huán)丁基部分。本發(fā)明的核酸還可以包含核堿基(在本領(lǐng)域中通常簡(jiǎn)稱為“堿基”)修飾或置換。如本文所用，“未修飾的”或“天然的”核堿基包括嘌呤堿基：腺嘌呤(a)和鳥(niǎo)嘌呤(g)，和嘧啶堿基：胸腺嘧啶(t)、胞嘧啶(c)和尿嘧啶(u)。修飾的核堿基包括其他合成和天然核堿基，例如5-甲基胞嘧啶(5-me-c)、5-羥甲基胞嘧啶、黃嘌呤、次黃嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鳥(niǎo)嘌呤的6-甲基和其他烷基衍生物、腺嘌呤和鳥(niǎo)嘌呤的2-丙基和其他烷基衍生物、2-硫尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶和2-硫代胞嘧啶、5-鹵代尿嘧啶和胞嘧啶、嘧啶堿基的5-丙炔基(-c＝c-ch3)尿嘧啶和胞嘧啶和其他炔基衍生物、6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫尿嘧啶；8-鹵代、8-氨基、8-硫醇、8-硫代烷基、8-羥基和其他8-取代腺嘌呤和鳥(niǎo)嘌呤；5-鹵代特別是5-溴代、5-三氟甲基和其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶；7-甲基鳥(niǎo)嘌呤和7-甲基腺嘌呤、2-f-腺嘌呤、2-氨基腺嘌呤、8-氮雜鳥(niǎo)嘌呤和8-氮雜腺嘌呤、7-脫氮雜鳥(niǎo)嘌呤和7-脫氮雜腺嘌呤和3-脫氮雜鳥(niǎo)嘌呤和3-脫氮雜腺嘌呤。另外的修飾核堿基包括三環(huán)嘧啶，例如酚噁嗪胞苷(1h-嘧啶并(5,4-b)(1,4)苯并噁嗪-2(3h)-酮)、吩噻嗪胞苷(1h-嘧啶并(5,4-b)(1,4)苯并噻嗪-2(3h)-酮)；g-clamps，如取代的吩噁嗪胞苷(例如，9-(2-氨基乙氧基)-h-嘧啶并(5,4-(b)(1,4)苯并噁嗪-2(3h)-酮)、咔唑胞苷(2h-嘧啶并(4,5-b)吲哚-2-酮)、吡啶并吲哚胞苷(h-吡啶并(3’,’:4,5)吡咯并[2,3-d]嘧啶-2-酮)。雜環(huán)堿基部分還可以包括其中嘌呤或嘧啶堿基被其他雜環(huán)代替的那些，例如7-脫氮雜-腺嘌呤、7-脫氮雜-鳥(niǎo)苷、2-氨基吡啶和2-吡啶酮。另外的核堿基包括在美國(guó)專利號(hào)3,687,808(通過(guò)引用并入)中公開(kāi)的那些，在theconciseencyclopediaofpolymerscienceandengineering,第858-859頁(yè),kroschwitz,j.i.,ed.johnwiley&sons,1990中公開(kāi)的那些；由englisch等,angewandtechemie,國(guó)際版,1991,30:613公開(kāi)的那些；以及由sanghvi,y.s.,第15章,antisenseresearchandapplications,第289-302頁(yè),crooke,s.t.和lebleu,b.,ed.,crcpress,1993中公開(kāi)的那些。這些核堿基中的某些可用于增加低聚化合物的結(jié)合親和力。這些包括5-取代的嘧啶、6-氮雜嘧啶和n-2、n-6和o-6取代的嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。已經(jīng)顯示5-甲基胞嘧啶置換使核酸雙鏈體穩(wěn)定性增加0.6-1.2℃(sanghvi等,eds.,antisenseresearchandapplications,crcpress,bocaraton,1993,第276-278頁(yè))，并且是適合的堿基置換，例如在與2’-o-甲氧基乙基糖修飾組合時(shí)。本發(fā)明的核酸的另一個(gè)可能修飾涉及使增強(qiáng)寡核苷酸的活性、細(xì)胞分布或細(xì)胞攝取的一個(gè)或多個(gè)部分或綴合物化學(xué)連接至聚核苷酸。這些部分或綴合物可以包括與官能團(tuán)如伯或仲羥基共價(jià)結(jié)合的綴合物基團(tuán)。綴合物基團(tuán)包括但不限于嵌入體、報(bào)告分子、聚胺、聚酰胺、聚乙二醇、聚醚、增強(qiáng)低聚物的藥效學(xué)性質(zhì)的基團(tuán)、以及增強(qiáng)低聚物的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)的基團(tuán)。適合的綴合物基團(tuán)包括但不限于膽固醇、脂質(zhì)、磷脂、生物素、吩嗪、葉酸、菲啶、蒽醌、吖啶、熒光素、羅丹明、香豆素和染料。增強(qiáng)藥效學(xué)性質(zhì)的基團(tuán)包括改善攝取、增強(qiáng)抗降解性和/或加強(qiáng)與靶核酸的序列特異性雜交的基團(tuán)。增強(qiáng)藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)的基團(tuán)包括改善本發(fā)明的核酸的攝取、分布、代謝或排泄的基團(tuán)。綴合物部分包括但不限于脂質(zhì)部分，例如膽固醇部分(letsinger等,proc.natl.acad.sci.usa,86:6553-6556(1989))；膽酸(manoharan等,bioorg.med.chem.let.,4:1053-1060(1994))；硫醚，例如己基-5-三苯甲基硫醇(manoharan等,ann.n.y.acad.sci.,660:306-309(1992)；manoharan等,bioorg.med.chem.let.,3:2765-2770(1993))；硫代膽固醇(oberhauser等,nucl.acidsres.,20:533-538(1992))；脂肪鏈，例如十二烷二醇或十一烷基殘基(saison-behmoaras等,emboj.,10:1111-1118(1991)；kabanov等,febslett.,259:327-330(1990)；svinarchuk等,biochimie,75:49-54(1993))；磷脂，例如二十六烷基-外消旋-甘油或三乙銨1,2-二-o-十六烷基-外消旋-甘油基-3-h-膦酸酯(manoharan等,tetrahedronlett.,36:3651-3654(1995)；shea等,nucl.acidsres.,18:3777-3783(1990))；聚胺或聚乙二醇鏈(manoharan等,nucleosides&nucleotides,14:969-973(1995))；或金剛烷乙酸(manoharan等,tetrahedronlett.,36:3651-3654(1995))；棕櫚基部分(mishra等,biochim.biophys.acta,1264:229-237(1995))；或者十八胺或己基氨基-羰基-氧膽固醇部分(crooke等,j.pharmacol.exp.ther.,277:923-937(1996))；全部通過(guò)引用并入。綴合物可以包括“蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域”或ptd(也稱為cpp細(xì)胞穿透肽)，其可以指促進(jìn)穿過(guò)脂質(zhì)雙層、膠束、細(xì)胞膜、細(xì)胞器膜或囊泡膜的多肽、聚核苷酸、碳水化合物或者有機(jī)或無(wú)機(jī)化合物。連接到范圍可以從小極性分子到大的大分子和/或納米顆粒的另一個(gè)分子的ptd促進(jìn)分子穿過(guò)膜，例如從細(xì)胞外空間到細(xì)胞內(nèi)空間，或從細(xì)胞質(zhì)到細(xì)胞器內(nèi)。在一些實(shí)施方式中，ptd共價(jià)地連接至外源多肽(例如定點(diǎn)修飾多肽)的氨基末端。在一些實(shí)施方式中，ptd共價(jià)地連接至外源多肽(例如定點(diǎn)修飾多肽)的羧基末端。在一些實(shí)施方式中，ptd共價(jià)地連接至核酸(例如dna靶向rna、編碼dna靶向rna的聚核苷酸、編碼定點(diǎn)修飾多肽的聚核苷酸等)。示例性ptd包括但不限于最小十一肽的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(對(duì)應(yīng)于包含ygrkkrrqrrr的hiv-1tat的殘基47-57)；包含足以引導(dǎo)進(jìn)入細(xì)胞的大量精氨酸的聚精氨酸序列(例如3、4、5、6、7、8、9、10、或10-50個(gè)精氨酸)；vp22結(jié)構(gòu)域(zender等,cancergenether.,9(6):489-496(2002))；果蠅觸角足(antennapedia)蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(noguchi等,diabetes,52(7):1732-1737(2003))；截短的人降鈣素肽(trehin等,pharm.research,21:1248-1256(2004))；聚賴氨酸(wender等,proc.natl.acad.sci.usa,97:13003-13008(2000))rrqrrtsklmkr；轉(zhuǎn)運(yùn)素(transportan)gwtlnsagyllgkinlkalaalakkil；kalaweaklakalakalakhlakalakalkcea；和rqikiwfqnrrmkwkk。示例性ptd包括但不限于ygrkkrrqrrr、rkkrrqrrr；從3個(gè)精氨酸殘基到50個(gè)精氨酸殘基的精氨酸均聚物；示例性ptd結(jié)構(gòu)域氨基酸序列包括但不限于以下中的任一種：ygrkkrrqrrr；rkkrrqrr；yaraaarqara；thrlprrrrrr和ggrrarrrrrr。在一些實(shí)施方式中，ptd是可激活的cpp(acpp)(aguilera等,integr.biol.(camb),1(5-6):371-381(2009年6月))。acpp包含通過(guò)可切割接頭連接至匹配的聚陰離子(例如，glu9或“e9”)的聚陽(yáng)離子cpp(例如，arg9或“r9”)，其使凈電荷減少至接近零，從而抑制粘附和攝取到細(xì)胞中。在切割接頭時(shí)，聚陰離子被釋放，局部地暴露聚精氨酸及其固有粘性，從而“激活”acpp以穿過(guò)膜。示例性dna靶向rna在下文中進(jìn)一步描述。在一些實(shí)施方式中，適合的dna靶向rna包含兩個(gè)單獨(dú)的rna聚核苷酸分子。兩個(gè)單獨(dú)rna聚核苷酸分子中的第一個(gè)(激活子-rna)包含核苷酸序列，其與seqidno:431-562所述核苷酸序列中的任一個(gè)或其補(bǔ)體在至少8個(gè)連續(xù)核苷酸段上具有至少約60％、至少約65％、至少約70％、至少約75％、至少約80％、至少約85％、至少約90％、至少約95％、至少約98％、至少約99％或100％的核苷序列同一性。兩個(gè)單獨(dú)rna聚核苷酸分子中的第二個(gè)(靶向體-rna)包含核苷酸序列，其與美國(guó)2014-0068797的seqidno:563-679所述核苷酸序列中的任一個(gè)或其補(bǔ)體在至少8個(gè)連續(xù)核苷酸段上具有至少約60％、至少約65％、至少約70％、至少約75％、至少約80％、至少約85％、至少約90％、至少約95％、至少約98％、至少約99％或100％的核苷酸序列同一性。在一些實(shí)施方式中，適合的dna靶向rna是單rna聚核苷酸并且包含第一核苷酸序列，其與美國(guó)2014-0068797的seqidno:431-562所述核苷酸序列中的任一個(gè)在至少8個(gè)連續(xù)核苷酸段上具有至少約60％、至少約65％、至少約70％、至少約75％、至少約80％、至少約85％、至少約90％、至少約95％、至少約98％、至少約99％或100％的核苷酸序列同一性，和第二核苷酸序列，其與美國(guó)2014-0068797的seqidno:463-679所述核苷酸序列中的任一個(gè)在至少8個(gè)連續(xù)核苷酸段上具有至少約60％、至少約65％、至少約70％、至少約75％、至少約80％、至少約85％、至少約90％、至少約95％、至少約98％、至少約99％或100％的核苷酸序列同一性。在一些實(shí)施方式中，dna靶向rna是雙分子dna靶向rna并且靶向體-rna包含在其5'端連接到與靶dna互補(bǔ)的核苷酸段的序列5’guuuuagagcua-3’。在一些實(shí)施方式中，dna靶向rna是雙分子dna靶向rna并且激活子-rna包含序列5’uagcaaguuaaaauaaggcuaguccg-3’。在一些實(shí)施方式中，dna靶向rna是單分子dna靶向rna并且包含在其5'端連接到與靶dna互補(bǔ)的核苷酸段的序列5’-guuuuagagcua-接頭-uagcaaguuaaaauaaggcuaguccg-3’(其中“接頭”表示可以包含任何核苷酸序列的任何接頭核苷酸序列)。其他示例性單分子dna靶向rna包括美國(guó)2014-0068797的seqidno:680-682所述的那些(通過(guò)引用并入)。在某些實(shí)施方式中，定點(diǎn)修飾多肽(例如cas9)可以組成地或有條件地(例如組織或細(xì)胞型特異性地或可誘導(dǎo)地)表達(dá)為感興趣的動(dòng)物(如小鼠或大鼠)中的轉(zhuǎn)基因，使得只有dna靶向rna或指導(dǎo)序列需要被引入至從這樣的動(dòng)物獲得的配子或植入前胚胎中，以在配子或植入前胚胎中提供功能性crispr/cas系統(tǒng)。例如，參見(jiàn)platt等,rispr-cas9knockinmiceforgenomeeditingandcancermodeling,cellhttp://dxdotdoidotorgslash10.1016slashjdotcelldot2014.09.014(通過(guò)引用并入)中描述的cre依賴型cas9敲入小鼠，其中使用由腺相關(guān)病毒(aab)、慢病毒或顆粒介導(dǎo)的遞送方法遞送的指導(dǎo)rna，在神經(jīng)元、免疫細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞中展示了成功的基因組編輯。cas9型轉(zhuǎn)基因可以由例如普遍存在的啟動(dòng)子(例如cag啟動(dòng)子)驅(qū)動(dòng)，并且可以通過(guò)使用cre-loxp系統(tǒng)(例如，具有細(xì)胞型或組織特異性cre驅(qū)動(dòng)子)或其本領(lǐng)域公知的等同物或變體使得可誘導(dǎo)。在某些實(shí)施方式中，cas9表達(dá)動(dòng)物是可生育的，具有正常產(chǎn)仔數(shù)，未表現(xiàn)出形態(tài)異常，和/或能夠繁殖到純合性。這樣的位點(diǎn)特異性修飾多肽表達(dá)動(dòng)物(例如小鼠或大鼠)結(jié)合本發(fā)明的高效率、高通量電穿孔方法可用于體內(nèi)高通量遺傳篩選，以例如鑒定涉及眾多重要生理過(guò)程(例如腫瘤抑制、干細(xì)胞更新、病毒復(fù)制的宿主決定因素和致癌生長(zhǎng)的調(diào)節(jié)子)中的任一個(gè)的基因，并且可以直接結(jié)合全基因組或靶向的sgrna文庫(kù)以發(fā)現(xiàn)新的生物學(xué)。實(shí)施例文本描述的實(shí)施例僅出于說(shuō)明目的，而不是限制性的。然而，實(shí)施例中描述的條件可以具有一般適用性，并構(gòu)成所述發(fā)明的具體實(shí)施方式，其設(shè)想為可與本文所述發(fā)明的任何一個(gè)或多個(gè)其他實(shí)施方式組合。遺傳修飾小鼠用作研究基因功能和人類疾病的重要模型，并已經(jīng)主要使用常規(guī)基因靶向或轉(zhuǎn)基因技術(shù)產(chǎn)生。在典型的常規(guī)基因靶向?qū)嶒?yàn)中，首先通過(guò)同源重組將期望遺傳修飾引入小鼠胚胎干(es)細(xì)胞，并分離攜帶預(yù)期突變的克隆衍生的es細(xì)胞克隆體(capecchi,2005)。隨后將靶向的es細(xì)胞注射入野生型囊胚中。靶向的es細(xì)胞中的一些可以對(duì)所得嵌合動(dòng)物的種系作出貢獻(xiàn)，從而產(chǎn)生含有靶向的基因修飾的小鼠(capecchi,2005)。雖然有效，但基因靶向是昂貴且耗時(shí)的，并且嚴(yán)重依賴于種系感受態(tài)es細(xì)胞系的可用性和性能。為了規(guī)避對(duì)種系感受態(tài)es細(xì)胞系的需要，已經(jīng)開(kāi)發(fā)了使用位點(diǎn)特異性dna內(nèi)切核酸酶，包括鋅指核酸酶(zfn)(urnov等,2010)和轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)子核酸酶(talen)(bogdanove和voytas,2011)的替代方法，其可以直接注射到單細(xì)胞胚胎中以產(chǎn)生具有特定基因破壞的動(dòng)物(carbery等,2010；geurts等,2009；sung等,2013；tesson等,2011)。在提供單鏈dna(ssdna)或在雙鏈斷裂位點(diǎn)(dsb)側(cè)翼具有同源性的質(zhì)粒時(shí)，可以通過(guò)同源重組(hr)將限定修飾引入基因組中(brown等,2013；cui等,2011；meyer等,2010)。最近，使用rna指導(dǎo)的規(guī)律成簇的間隔短回文重復(fù)(crispr)/crispr相關(guān)(cas)核酸酶系統(tǒng)(hsu等,2014)，已經(jīng)建立了在一個(gè)步驟中產(chǎn)生在單個(gè)或多個(gè)基因中攜帶突變的小鼠，以及攜帶報(bào)告體和有條件等位基因的小鼠的方法(wang等.,2013；yang等,2013)。使用類似的方法，已經(jīng)從各種物種產(chǎn)生了遺傳修飾動(dòng)物(chang等,2013；hai等,2014；hwang等,2013；li等,2013a；li等,2013b；niu等,2014)。與傳統(tǒng)的產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因小鼠的方法類似，這些研究都使用顯微注射以將核酸組分遞送到單細(xì)胞合子中。本文描述的方法使用電穿孔將生物/遺傳材料例如crispr/cas系統(tǒng)遞送至哺乳動(dòng)物(例如小鼠)合子，并且成功產(chǎn)生攜帶靶向的基因修飾的活的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(例如小鼠)。實(shí)施例1用報(bào)告體-編碼多核苷酸對(duì)小鼠合子和假定合子進(jìn)行電穿孔該實(shí)驗(yàn)描述了用報(bào)告體-基因編碼質(zhì)粒對(duì)小鼠合子或假定合子(簡(jiǎn)稱“合子”)進(jìn)行電穿孔的結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)選擇pmaxgfp載體(lonza，usa)，其攜帶cmv啟動(dòng)子和支持普遍存在的表達(dá)的sv40聚腺苷酸化信號(hào)。收集b6d2f2小鼠胚胎并在酸性臺(tái)氏溶液(at)(p/nt1788，sigmaaldrich)中處理5秒，在kosmaa/bsa(p/nzeks-050,zenithbiotech)中洗滌兩次，并放入25μl的opti-mem(p/n31985,lifetechnologies)中。然后將25μl中的胚胎在te緩沖液(10mmtris,0.1mmedta,ph7.5)中與80ng/μl的等體積(25μl)pmaxgfp混合，達(dá)到約40ng/μl的最終dna濃度，并將該混合物裝入1-mm電擊杯中，并使用以下設(shè)置進(jìn)行電穿孔：30伏、脈沖持續(xù)時(shí)間1毫秒、兩個(gè)脈沖、脈沖間隔100毫秒(ecm830,btx)。電穿孔后，用100μl的預(yù)平衡的kosmaa/bsa回收胚胎，隨后在組織培養(yǎng)箱(37℃，5％co2)中培養(yǎng)3.5天。培養(yǎng)3.5天后，在熒光顯微鏡下觀察胚胎的gfp表達(dá)。在所檢測(cè)的3個(gè)胚胎中未觀察到熒光(實(shí)驗(yàn)1)。由于透明帶層在實(shí)驗(yàn)2和3中可能作為質(zhì)粒進(jìn)入合子的物理屏障，申請(qǐng)人尋求通過(guò)在帶上戳洞、通過(guò)除去帶或通過(guò)在at中處理胚胎10秒，同時(shí)將pmaxgfp的濃度從20ng/μl變?yōu)?0ng/μl、變?yōu)?00ng/μl而弱化或破壞透明帶層。再次，所檢測(cè)的胚胎中未觀察到熒光。其他報(bào)道體系統(tǒng)，包括用6-fluoresceinamidite(6-fam)(40、100和500ng/μl)、turbogfpmrna(40ng/μl)、egfpmrna(25ng/μl)或mcherrymrna(40和100ng/μl)標(biāo)記的寡核苷酸，在所檢測(cè)的胚胎中沒(méi)有觀察到熒光(實(shí)驗(yàn)4、5和6)。僅在一例中觀察到具有g(shù)fp信號(hào)的僅一個(gè)胚胎，但該胚胎死亡或發(fā)育遲緩。實(shí)施例2用crispr/cas系統(tǒng)對(duì)小鼠合子和假定合子進(jìn)行電穿孔該實(shí)驗(yàn)展示使用本發(fā)明的方法將crispr/cas系統(tǒng)遞送至小鼠合子或假定合子(簡(jiǎn)稱“合子”)用于crispr/cas介導(dǎo)的靶向的基因破壞。為此，使用前述的指導(dǎo)rna(wang等,2013，通過(guò)引用并入本文)，選擇tet1外顯子4和tet2外顯子3作為靶標(biāo)。tet1和tet2系統(tǒng)的便利之處是sac1(tet1)或ecorv(tet2)限制性位點(diǎn)與pam(原間隔序列鄰近基序)近端序列重疊。因此，使用從包含靶位點(diǎn)的胚胎擴(kuò)增的pcr產(chǎn)物(wang等,2013)，限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(rflp)分析可以用于檢測(cè)突變等位基因。在實(shí)驗(yàn)6中，小鼠b6d2f2合子首先使用at處理10秒，與40/20ng/μl或100/50ng/μl的cas9mrna/tet1sgrna混合，并如上所述進(jìn)行電穿孔。然后將胚胎培養(yǎng)3.5天直至它們發(fā)育成囊胚。然后收獲胚胎進(jìn)行全基因組擴(kuò)增和pcr分析。使用sac1限制酶通過(guò)rflp分析包含靶位點(diǎn)的pcr產(chǎn)物。在使用cas9mrna(40ng/μl)和tet1sgrna(20ng/μl)的混合物時(shí)，在從電穿孔的合子發(fā)育的胚胎中沒(méi)有檢測(cè)到突變。在使用cas9mrna(100ng/μl)和tet1sgrna(50ng/μl)的混合物時(shí)，根據(jù)rflp分析，發(fā)現(xiàn)16個(gè)at處理的胚胎中的3個(gè)以及16個(gè)未經(jīng)at處理的胚胎中的1個(gè)在tet1基因座處攜帶突變等位基因(圖1a)。通過(guò)sanger測(cè)序進(jìn)一步證實(shí)突變(圖1a)。接下來(lái)，在實(shí)驗(yàn)7中，將甚至更高濃度的cas9mrna(400ng/μl)+tet2sgrna(200ng/μl)電穿孔到小鼠合子中，并且發(fā)現(xiàn)9個(gè)at處理的胚胎中有4個(gè)在tet2基因座處攜帶雙等位基因突變(圖1b)。因此，tet1和tet2基因兩者都可以使用電穿孔遞送的crispr/cas系統(tǒng)(例如cas9mrna+sgrna)有效地靶向到小鼠合子中。同時(shí)，使用不同的質(zhì)粒濃度，即200ng/μl、400ng/μl和800ng/μl質(zhì)粒dna，嘗試crispr/cas編碼質(zhì)粒的電穿孔(作為以casmrna和指導(dǎo)rna形式遞送crispr試劑的替代方法)。在200ng/μl組中，確定了12個(gè)總篩選中的一個(gè)突變胚胎。因此，也可以實(shí)現(xiàn)dna電穿孔到合子中，雖然在crispr/cas系統(tǒng)的情況下，mrna/指導(dǎo)rna組合似乎比dna更有效。在本實(shí)驗(yàn)和使用crispr/cas系統(tǒng)的其他實(shí)驗(yàn)中，使用以下程序制備cas9mrna和sgrna。簡(jiǎn)而言之，攜帶野生型cas9基因的px330質(zhì)粒(cong等,2013)用作在聚合酶鏈反應(yīng)(pcr)中擴(kuò)增cas9編碼序列的dna模板。將t7啟動(dòng)子序列加入在cas9野生型基因的編碼序列側(cè)翼的正向引物中并與反向引物配對(duì)。使用qiagen柱(qiagen)純化pcr產(chǎn)物，并使用mmessagemmachinet7ultra轉(zhuǎn)錄試劑盒(lifetechnologies)進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄(ivt)。對(duì)于sgrna合成，將t7啟動(dòng)子序列加入到sgrna模板/正向引物中，并通過(guò)pcr擴(kuò)增產(chǎn)生ivt模板。將t7-sgrnapcr產(chǎn)物進(jìn)行柱純化，并用作使用megashortscriptt7試劑盒(lifetechnologies)的ivt的模板。使用megaclear試劑盒(lifetechnologies)對(duì)cas9mrna和sgrna兩者進(jìn)行純化，并在試劑盒提供的洗脫緩沖液中洗脫。在瓊脂糖凝膠上分離來(lái)自ivt反應(yīng)的等分試樣以評(píng)估反應(yīng)質(zhì)量。如所描述的進(jìn)行surveyor試驗(yàn)(guschin等,2010)。從小鼠或胚胎提取基因組dna，并在以下條件下使用基因特異性引物進(jìn)行pcr：95℃5分鐘；35×(95℃30秒，60℃30秒，68℃40秒)；68℃2分鐘；保持在4℃。然后將pcr產(chǎn)物變性，退火，用surveyor核酸酶(transgenomic)處理。然后將產(chǎn)物在10％丙烯酰胺criteriontbe凝膠(biorad)上分離，用溴化乙錠染色并顯影。對(duì)于rflp分析，用sac1(tet1)或ecorv(tet2)消化10μl的tet1或tet2pcr產(chǎn)物，并在gelred(biotium)染色的瓊脂糖凝膠(2％)上分離。對(duì)于測(cè)序，將pcr產(chǎn)物直接測(cè)序或克隆到topo克隆試劑盒(invitrogen)中，并通過(guò)sanger測(cè)序測(cè)序個(gè)體克隆體。實(shí)施例3電穿孔的小鼠合子的發(fā)育合子的體外培養(yǎng)和分析是一個(gè)重要的方法，可以基于此以快速的周轉(zhuǎn)時(shí)間和優(yōu)選地較低操作成本測(cè)試和分析與基因編輯技術(shù)相關(guān)的大量參數(shù)。然而，在使用常規(guī)體外培養(yǎng)系統(tǒng)培養(yǎng)電穿孔的合子時(shí)，后續(xù)胚胎發(fā)育似乎被阻滯或中止。通常，在不同濃度范圍(例如50/25ng/μl至1000/500ng/μl)的cas9mrna/sgrna的電穿孔后，在3.5天培養(yǎng)期結(jié)束時(shí)，胚胎進(jìn)展到不同的發(fā)育階段，包括1-細(xì)胞、2-細(xì)胞或4-細(xì)胞期、桑椹胚期和偶爾的胚泡期(實(shí)驗(yàn)8)的那些。相反，未經(jīng)電穿孔的對(duì)照胚胎在相同時(shí)間段結(jié)束時(shí)達(dá)到胚泡期，無(wú)論對(duì)照胚胎是否用at進(jìn)行預(yù)處理。在一些實(shí)驗(yàn)中(實(shí)驗(yàn)10和11)，實(shí)驗(yàn)中的所有組中的胚胎均未能達(dá)到囊胚期。在培養(yǎng)電穿孔的合子中這樣的最初失敗似乎表明合子可能不在電穿孔過(guò)程中存活并繼續(xù)發(fā)育成活胎產(chǎn)的動(dòng)物，無(wú)論在電穿孔的合子中是否發(fā)生期望遺傳修飾。對(duì)于at指導(dǎo)可能過(guò)度損傷合子以減緩胚胎發(fā)育，以及對(duì)于所遞送的試劑(例如cas9mrna和指導(dǎo)rna)可能對(duì)合子及其后續(xù)發(fā)育具有毒性的認(rèn)識(shí)，使得對(duì)使用電穿孔作為在動(dòng)物中永久引入種系可傳遞的遺傳修飾的可行手段進(jìn)一步產(chǎn)生懷疑。在試圖解決電穿孔的合子的體外發(fā)育不良問(wèn)題時(shí)，申請(qǐng)人驚奇地通過(guò)改變體外培養(yǎng)條件(表1)，更具體地，通過(guò)洗掉電穿孔培養(yǎng)基中的任何潛在有害物質(zhì)，其通常包含多核苷酸緩沖液(例如te緩沖液)和低血清培養(yǎng)基(例如培養(yǎng)基)，確定了解決方案。這對(duì)于電穿孔的合子的生存和發(fā)育的顯著效果在本文描述的實(shí)驗(yàn)中證明。特別是，使b6d2f1/j供體雌性小鼠超量排卵以使胚胎產(chǎn)量最大化。每只供體雌性接受5iu(腹腔注射)孕馬血清促性腺激素(pmsg)，并在約47小時(shí)后接受5iu(腹腔注射)人絨毛膜促性腺激素(hcg)。在施用hcg后，使雌性立即與b6d2f1/j種畜雄性1:1交配。約24小時(shí)后，檢查雌性是否存在交配塞(copulationplug)。使顯示交配塞的雌性安樂(lè)死，并將其輸卵管切除并置于m2培養(yǎng)基中。然后將輸卵管置于含有以約0.3mg/ml濃度加入的透明質(zhì)酸酶的m2培養(yǎng)基中。通過(guò)裂解壺腹而移除卵母細(xì)胞窩(clutch)，允許其在含有透明質(zhì)酸酶的m2培養(yǎng)基中孵育，直到卵丘細(xì)胞脫落。收集合子并將其通過(guò)新鮮m2培養(yǎng)基洗滌兩次，然后放入已經(jīng)在cookminc臺(tái)式培養(yǎng)箱中在油下平衡24小時(shí)的rcvl培養(yǎng)基的微滴中。將酸性臺(tái)氏溶液解凍，并將100μl液滴置于皮氏培養(yǎng)皿中，每50個(gè)待處理的合子1滴。從rcvl培養(yǎng)基中移出確定進(jìn)行ep(電穿孔)的合子，并將其放入(預(yù)加溫的)m2培養(yǎng)基的100μl液滴中。以50個(gè)為一組，將合子置于酸性臺(tái)氏溶液中10秒，然后移出并通過(guò)預(yù)加溫的m2培養(yǎng)基的三個(gè)100μl液滴洗滌。然后將經(jīng)處理的合子放入培養(yǎng)基的5-10μl液滴中準(zhǔn)備電穿孔。每個(gè)培養(yǎng)基液滴中的合子數(shù)量和液滴數(shù)量隨進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)的參數(shù)變化。對(duì)于實(shí)驗(yàn)14和15兩者，使用含有200/100、400/200和600/300ng/μl的cas9mrna/tet2sgrna的crispr混合物。此外，對(duì)于實(shí)驗(yàn)15，攜帶用于將ecorv位點(diǎn)(gatatc)轉(zhuǎn)化成ecori位點(diǎn)(gaattc)的突變的供體寡核苷酸也以200、400或200ng/μl提供。使混合物在te緩沖液(10mmtris，0.1mmedta，ph7.5)中達(dá)到每個(gè)實(shí)驗(yàn)組10μl，并加入到10μl中的胚胎中。然后將20μl的總含量加載到1-mm電擊杯中并進(jìn)行電穿孔(30伏，脈沖持續(xù)時(shí)間1ms，2個(gè)脈沖，脈沖間隔100-1000ms)。在電穿孔完成后，如果期望在下面的步驟(例如體外培養(yǎng)和/或轉(zhuǎn)移到假孕雌性中)之前洗滌電穿孔的配子或植入前胚胎，則將胚胎從電擊杯回收到100μl的預(yù)加溫的ksomaa/bsa培養(yǎng)基中，并連續(xù)通過(guò)預(yù)加溫的m2培養(yǎng)基的三個(gè)100μl液滴以洗掉任何剩余電穿孔溶液(1:1的te緩沖液與培養(yǎng)基)。然后評(píng)估合子的生活力。將判斷為健康的那些轉(zhuǎn)移到含有950μl預(yù)加溫的m2培養(yǎng)基的冷凍小瓶中以運(yùn)送到無(wú)特定病原(spf)的手術(shù)間。在spf設(shè)施中，使用p1000移液管將合子從冷凍小瓶中移出，并置于已經(jīng)在cookminc臺(tái)式培養(yǎng)箱中在油下平衡24小時(shí)的rcvl培養(yǎng)基的培養(yǎng)滴液中。在轉(zhuǎn)移時(shí)，將胚胎從rcvl微滴中移出并置于m2培養(yǎng)基的預(yù)加溫100μl液滴中，并按照標(biāo)準(zhǔn)方案(例如jacksonlaboratorieslah(實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物健康)常規(guī)程序94-09)轉(zhuǎn)移到cbyb6f1/j假孕雌性中。在出生時(shí)分析小鼠的子集。對(duì)于這些，在小鼠出生時(shí)采集尾部活檢樣品，并通過(guò)使用ecorv消化的rflp進(jìn)行分析(圖2a和2b)。篩選自cas9mrna400ng/μl和sgrna200ng/μl的組的13只小鼠中的兩只小鼠的pcr產(chǎn)物對(duì)ecorv消化具有抗性(首建者85c3)或部分抗性(85c10)(圖2，小圖a)。在分別使用600ng/μl和300ng/μl的更高濃度的cas9mrna和sgrna時(shí)，如通過(guò)rflp試驗(yàn)分析的，5只小鼠是陽(yáng)性的(首建者86c3、86c5、86c7、86c8和86c9)，其中兩只(86c3和86c9)對(duì)ecorv消化具有完全的抗性，而3只(86c5、86c7和86c8)對(duì)ecorv消化具有部分的抗性。pcr產(chǎn)物的sanger測(cè)序確認(rèn)了7只小鼠中的6只存在突變等位基因(圖2c，85c3、85c10、86c3、86c7、86c8和86c9)，而一只可以攜帶低豐度的突變等位基因(86c5)。此外，在將來(lái)自首建者85c3、86c3和86c9的pcr產(chǎn)物克隆到pcr2.1-topo載體中并測(cè)序個(gè)體克隆體時(shí)，檢測(cè)到如所預(yù)期的精確地位于tet2靶位點(diǎn)的pam近端區(qū)域的indel突變(圖2d)。在來(lái)自這兩個(gè)實(shí)驗(yàn)的其余小鼠為一周齡時(shí)，對(duì)它們進(jìn)行了分析。如前所述采集并通過(guò)rflp分析尾部活檢樣品，并通過(guò)對(duì)從這些小鼠擴(kuò)增的pcr產(chǎn)物進(jìn)行sanger測(cè)序而確認(rèn)結(jié)果。如表1所總結(jié)的，觀察到這兩個(gè)實(shí)驗(yàn)之間的首建者效率的濃度依賴性改善。在使用200ng/μl的cas9mrna和100ng/μl的sgrna時(shí)，在34個(gè)篩選中鑒定出1個(gè)首建者(3.2％)。在濃度增加到cas9mrna為400ng/μl和sgrna為200ng/μl時(shí)，首建者效率增加到48.3％(29個(gè)篩選中14只首建者小鼠)。在濃度進(jìn)一步增加到cas9mrna為600ng/μl和sgrna為300ng/μl時(shí)，效率是45.4％(33個(gè)篩選中15只首建者小鼠)。值得注意的是，對(duì)于實(shí)驗(yàn)15，實(shí)現(xiàn)了100％的首建者效率，發(fā)現(xiàn)所有11只篩選小鼠都攜帶突變等位基因(圖3)。還在實(shí)驗(yàn)15中測(cè)試了crispr介導(dǎo)的hdr，其中將供體寡核苷酸引入實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中。具體來(lái)說(shuō)，對(duì)合子進(jìn)行電穿孔，并且使小鼠出生并基因分型。擴(kuò)增466bps的pcr產(chǎn)物，該擴(kuò)增產(chǎn)物包含靶位點(diǎn)，暴露于ecorv消化以檢測(cè)攜帶nhej突變的等位基因并暴露于ecori消化以檢測(cè)hdr等位基因。雖然其他實(shí)驗(yàn)組未檢測(cè)到成功的hdr等位基因，檢測(cè)到攜帶由ecori切割的等位基因的兩個(gè)首建者小鼠(圖3，小圖a，87ep11和86ep14)，并從使用400ng/μl的cas9mrna、200ng/μl的靶向tet2基因座的3’utr的sgrna和400ng/μl的ssdna供體進(jìn)行電穿孔的組獲得它們。在該組中，所有11只小鼠都攜帶耐ecorv消化的等位基因。首建者86ep11至86ep15似乎沒(méi)有攜帶可檢測(cè)水平的可以由ecorv切割的等位基因，表明來(lái)自所有11只首建者小鼠的nhej突變的存在。在11個(gè)樣品暴露于ecor1時(shí)，顯示來(lái)自樣品86ep11和86ep14的等位基因中的一些被ecori部分消化，表明來(lái)自這兩個(gè)樣品的hdr等位基因的存在。然后將pcr產(chǎn)物從首建者86ep11和86ep14克隆到pcr2.1-topo載體中，并對(duì)個(gè)體克隆體進(jìn)行測(cè)序。如圖3，小圖b所示，樣品86ep11-4和86ep14-4攜帶ecori位點(diǎn)，表明通過(guò)crispr/cas介導(dǎo)從供體ssdna成功引入該位點(diǎn)。在一系列實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步測(cè)試了大量不同電穿孔設(shè)置參數(shù)，其結(jié)果總結(jié)如下：1.20v、2個(gè)脈沖、100ms間隔、0次洗滌a.cas9mrna200ng/ul+tet2sgrna100ng/μlb.結(jié)果：12％達(dá)到囊胚期(2/17)，未觀察到基因靶向2.20v、2個(gè)脈沖、100ms間隔、3次洗滌a.cas9/tet2:500/250、400/200、200/100ng/μlb.結(jié)果：平均91％的囊胚(50/55)3.20v、2個(gè)脈沖、1s間隔、3次洗滌a.cas9/tet2:800、600、400、300、200、100ng/μlb.200ng/μl的結(jié)果(批次1)：100％囊胚(16/16)，14.3％靶向(1/7)c.200、300、400ng/μl的結(jié)果(批次2)：95.8％囊胚(46/48)，結(jié)果未定d.結(jié)果(批次3)：多次洗滌，胚胎轉(zhuǎn)移到假孕雌性小鼠，出生未定4.20v、3個(gè)脈沖、1s間隔、1次洗滌a.cas9/tet2:400、200ng/μlb.200ng/μl的結(jié)果(批次1)：82.3％囊胚(14/17)，無(wú)靶向c.400和200ng/μl的結(jié)果(批次2)：93.8％囊胚(30/32)，結(jié)果未定5.20v、3個(gè)脈沖、1s間隔、3次洗滌a.cas9/tet2:200ng/μlb.結(jié)果：88.9％囊胚(16/18)，無(wú)靶向6.30v、2個(gè)脈沖、1s間隔、3次洗滌a.cas9/tet2:400、300、200ng/μlb.200ng/μl結(jié)果：94％囊胚(15/18)，無(wú)靶向c.300ng/μl結(jié)果：84％囊胚(16/19)，16％靶向(3/19)，400ng/μl無(wú)靶向總之，結(jié)果表明使用電穿孔的crispr/cas系統(tǒng)的成功遺傳修飾取決于所用crispr/cas試劑的濃度。在電穿孔實(shí)驗(yàn)中，與傳統(tǒng)顯微注射實(shí)驗(yàn)相比，試劑濃度停止作為限制因素，并且發(fā)現(xiàn)使用較高濃度的試劑(例如，對(duì)于cas9mrna為400ng/μl以上，且對(duì)于sgrna為200ng/μl以上)產(chǎn)生基因編輯小鼠。數(shù)據(jù)還表明，例如通過(guò)at處理，弱化透明帶可以有益于合子電穿孔。然而，應(yīng)避免長(zhǎng)時(shí)間處理。最后，使用本發(fā)明方法的crispr介導(dǎo)的基因靶向可以成功進(jìn)行，并且在實(shí)驗(yàn)設(shè)置具有某些參數(shù)變化。為了確保電穿孔的合子的成功發(fā)育，可以需要在電穿孔完成時(shí)用對(duì)胚胎發(fā)育而言最佳的生理溶液或培養(yǎng)基沖洗電穿孔的合子一次或多次(例如2、3、4次)。例如，電穿孔的合子可以連續(xù)通過(guò)預(yù)加溫的m2培養(yǎng)基的(100μl)液滴，以在合子置入培養(yǎng)或轉(zhuǎn)移到子宮環(huán)境之前洗掉任何剩余電穿孔溶液(例如1:1的te緩沖液與)。下文提供了本發(fā)明方法的詳細(xì)說(shuō)明(但非限制性)實(shí)施方式：1.將補(bǔ)充有1mg/ml的bsa(p/na2153,sigma-aldrich)的100μlksomaaevolve(p/nzeks-050,zenithbiotech)的等分試樣沉積在96孔平底組織培養(yǎng)板上并在heracell培養(yǎng)箱中在37℃/5％co2下平衡，之后接受單細(xì)胞合子。2.對(duì)b6d2f1雌性小鼠腹腔(i.p.)注射5個(gè)國(guó)際單位(iu)的孕馬血清促性腺激素(pmsg，p/nhor-272，prospec，rehovot，israel)，隨后在48小時(shí)后腹腔(i.p.)注射人絨毛膜促性腺激素(hcg，p/nhor-250，prospec，rehovot，israel)。然后使雌性小鼠與b6d2f1雄性小鼠交配。使交配塞陽(yáng)性的那些通過(guò)頸椎脫位(cd)進(jìn)行安樂(lè)死。從切除的生殖系統(tǒng)沖出受精胚胎。3.收集來(lái)自b6d2f2小鼠的單細(xì)胞合子，在酸性臺(tái)氏溶液中處理10秒(例如，sigma-aldrich,cat.no.t1788；或等同物，如p/nmr-004-d,emdmillipore)，用ksomaaevolve洗滌兩次，并置入組織培養(yǎng)皿或板(35mm，p60，96孔)中的預(yù)加溫的培養(yǎng)基(p/n31985,gibco)的10μl液滴中。4.用10mmtris(ph7.5)和0.1mmedta將“生物材料”(對(duì)于crispr，其基本上由cas9mrna、sgrna和任選的供體寡核苷酸組成；或者作為替代方案，由編碼它們的dna組成)重構(gòu)成10μl體積，并加入到培養(yǎng)基中合子的10μl液滴中。.5.將浸入在“生物材料”中的合子移出并沉積到用于btx610型(p/n450124,harvardapparatus)的2-mm電擊杯的室中。輕敲電擊杯以確保聚核苷酸/合子溶液或懸浮液移動(dòng)到電擊杯的兩根導(dǎo)體之間，且沒(méi)有氣泡滯留在混合物中。6.將電擊杯放入btx電擊杯室(ecm830)中，并使用以下設(shè)置(或其變化，例如本文公開(kāi)的那些)進(jìn)行電穿孔：a.電壓：30vb.脈沖間隔：125-130msc.脈沖持續(xù)時(shí)間：1msd.#脈沖:27.使用從電擊杯包裝提供的塑料移液器，從96孔板的相應(yīng)孔中移出80-100μl預(yù)加溫的培養(yǎng)基(例如ksomaa/bsa培養(yǎng)基)，并將培養(yǎng)基輕輕加入到電擊杯中。從電擊杯中移出所有的內(nèi)容物，并將混合物排到孔中。8.使電穿孔的合子連續(xù)通過(guò)預(yù)加溫的m2培養(yǎng)基的兩至三個(gè)100μl液滴以洗掉任何剩余電穿孔溶液。9.立即將攜帶洗滌的合子的96孔板放回培養(yǎng)箱中。10.將胚胎在37℃/5％co2下培養(yǎng)3.5天以達(dá)到發(fā)育的囊胚期，然后收獲用于分析。11.使用單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增試劑盒(p/nga4,sigma-aldrich)擴(kuò)增胚胎的基因組。然后將擴(kuò)增的基因組用作使用包含靶位點(diǎn)的引物對(duì)的pcr反應(yīng)的模板(accuprimetmtaqdnapolymerasesystem,p/n12339-016,lifetechnologies；或primestargxl,p/nr050b,clontech)。清潔pcr產(chǎn)物，并通過(guò)sanger測(cè)序分析核苷酸序列。12.合成cas9mrna、sgrna和任選的dna供體，并如前所述制備注射混合物(wang等,2013；yang等,2013)。參考文獻(xiàn)bogdanove,a.j.和voytas,d.f.,"taleffectors:customizableproteinsfordnatargeting,"science,333:1843-1846(2011).brown,a.j.,fisher,d.a.,kouranova,e.,mccoy,a.,forbes,k.,wu,y.,henry,r.,ji,d.,chambers,a.,warren,j.等,"whole-ratconditionalgeneknockoutviagenomeediting,"nat.methods,10:638-640(2013).capecchi,m.r.,"genetargetinginmice:functionalanalysisofthemammaliangenomeforthetwenty-firstcentury,"nat.rev.genet.,6:507-512(2005).carbery,i.d.,ji,d.,harrington,a.,brown,v.,weinstein,e.j.,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