本發(fā)明涉及一種預(yù)測肝癌患者對血管內(nèi)皮生長因子受體抑制劑治療的敏感性的方法，以確定患者是否能夠從治療中接受治療效果。

背景技術(shù)：

癌癥是對人類健康構(gòu)成威脅的最致命的疾病之一。僅在美國，癌癥每年影響近130萬新患者，是在心臟疾病之后的第二主要的死亡原因，在4例死亡中約占1例。雖然某些癌癥的醫(yī)學治療已經(jīng)取得了重大進展，但在過去20年中，所有癌癥的總體5年生存率僅改善了約10％。此外，癌癥或惡性腫瘤以不受控制的方式轉(zhuǎn)移和快速生長，使得及時的檢測和治療非常困難。

根據(jù)癌癥類型，通常患者具有幾種對他們可用的治療選擇，包括化療、放射和基于抗體的藥物，但是這些治療選擇的治療效果根據(jù)患者和癌癥的性質(zhì)而不同。

特別地，肝癌是一種對抗癌治療具有高抗性的癌癥，多種分子靶向的藥物已被研究用作化療劑，但只有這些藥物中的一些已被fda等批準并銷售。此外，根據(jù)癌癥患者的癌癥的性質(zhì)和癌癥的病變，甚至經(jīng)批準和市售的針對于肝癌的抗癌藥物顯示出非常低的治療效果。例如，為治療肝細胞癌的目的而被批準的新藥多吉美(索拉非尼)顯示出約2-3％的低治療率，其副作用也很高。也就是說，現(xiàn)行的肝細胞癌治療指南不是基于腫瘤的分子特征，因此存在這樣一種限制，即不能保證指南的治療效果。此外，雖然存在一些稱為生物標記物的基因，但是尚未適當?shù)卦u估用于預(yù)測這些基因的抗性或敏感性的閾值和診斷性能，因此需要通過額外的研究來證明這些基因的臨床有用性。

因此，需要對特定生物標記物進行研究和開發(fā)，使得可以確定個體患者是否對任意治療響應(yīng)，以及通過使用生物標記物來預(yù)測抗性或敏感性的閾值和診斷性能。此外，需要開發(fā)一種能夠選擇抗癌治療的方法，以及可以通過有效地將合適的抗癌藥物引入患者來實現(xiàn)抗癌治療的方法。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

技術(shù)問題

本發(fā)明旨在提供一種用于預(yù)測對血管內(nèi)皮生長因子受體(vegfr)抑制劑的敏感性的方法，所述方法包括以下步驟：測量從肝癌患者分離的樣本中mtor的表達水平；并將mtor的表達水平與mtor表達的參照水平進行比較，并選擇具有等于或高于參照水平的mtor表達水平的樣本。

本發(fā)明還旨在提供一種用于預(yù)測對血管內(nèi)皮生長因子受體(vegfr)抑制劑的敏感性的組合物，該組合物含有用于測量mtor的mrna表達水平的試劑。

本發(fā)明還旨在提供一種用于預(yù)測對血管內(nèi)皮生長因子受體(vegfr)抑制劑的敏感性的試劑盒，該試劑盒包含所述組合物。

本發(fā)明還旨在提供使用血管內(nèi)皮生長因子受體(vegfr)抑制劑治療肝癌的方法，所述方法包括以下步驟：(a)測量從肝癌患者分離的樣本中mtor的表達水平；(b)比較mtor的表達水平與mtor表達的參照水平，(b)選擇具有等于或高于參照水平的mtor表達水平的樣本；和(c)向顯示mtor表達水平等于或高于參照水平的肝癌患者施用治療有效量的血管內(nèi)皮生長因子受體(vegfr)抑制劑。

技術(shù)方案

本發(fā)明人做出了大量的工作來選擇對血管內(nèi)皮生長因子受體(vegfr)抑制劑具有高敏感性的患者，從而使抗癌治療的效果最大化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當測量mtor、vegfr2、pdgfrβ、fgfr1、ckit、egfr或craf的表達水平時，可以基于表達水平和治療效益評分預(yù)測對血管內(nèi)皮生長因子受體(vegfr)抑制劑的敏感性，從而完成本發(fā)明。

本發(fā)明提供了一種用于預(yù)測對血管內(nèi)皮生長因子受體(vegfr)抑制劑的敏感性的方法，所述方法包括以下步驟：測量從肝癌患者分離的樣本中mtor的表達水平；并將mtor的表達水平與mtor表達的參照水平進行比較，并選擇具有等于或高于參照水平的mtor表達水平的樣本。

在本發(fā)明中，血管內(nèi)皮生長因子受體(vegfr)抑制劑是通過抑制血管內(nèi)皮生長因子受體(vegfr)表現(xiàn)出抗癌效果的治療劑，其可以是例如抗癌劑，比如布立尼布、舒尼替尼，例尼法尼瑞格拉非尼，索拉非尼等。根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，血管內(nèi)皮生長因子受體(vegfr)抑制劑是索拉非尼。

如本文所用，術(shù)語“敏感性”是指能夠用血管內(nèi)皮生長因子受體(vegfr)抑制劑(一種靶向抗癌藥物)治療而獲益或提供治療效果的性質(zhì)。例如，該術(shù)語是指在抗癌治療后腫瘤尺寸減少5％、10％、15％、20％、25％、30％或更多。優(yōu)選地，該術(shù)語是指腫瘤尺寸減少30％或更多(根據(jù)recist(實體腫瘤中的響應(yīng)評價標準)的完全響應(yīng)和部分響應(yīng)率，該標準用于評估實體瘤對抗癌劑的響應(yīng))。

也就是說，根據(jù)本發(fā)明，預(yù)測對血管內(nèi)皮生長因子受體(vegfr)抑制劑的敏感性，從而預(yù)測用血管內(nèi)皮生長因子受體(vegfr)抑制劑治療的可能性和治療的預(yù)后，以及選擇有效的手段和抗癌治療用于抗癌治療，從而增加治療效果并最小化癌癥治療的副作用。

特別地，本發(fā)明具有優(yōu)于常規(guī)發(fā)明的優(yōu)勢在于，它可以顯示索拉非尼治療的效果，僅通過測量的mtor的生物標記物的表達水平顯示出高準確度，還在于mtor的mrna水平的增加顯示對索拉非尼治療的高敏感性。此外，本發(fā)明顯示通過直接在患者樣本中而不是在細胞系中檢測的預(yù)測高水平敏感性的結(jié)果。

根據(jù)本發(fā)明的用于預(yù)測對血管內(nèi)皮生長因子受體(vegfr)抑制劑的敏感性的方法包括測量，測量從肝癌患者分離的樣本中mtor表達水平的步驟。

如本文所用，術(shù)語“肝癌患者”是指具有在肝臟中發(fā)生的惡性腫瘤的原發(fā)性肝癌的患者。優(yōu)選地，該術(shù)語是指患有肝細胞癌和肝內(nèi)膽管癌中的肝細胞癌患者，其為原發(fā)性肝癌。此外，樣本包括從肝癌患者分離的全血、血漿、血清、組織等。根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，使用肝腫瘤組織?？梢愿鶕?jù)本領(lǐng)域已知的方法適當?shù)靥幚磉@些樣本以測量表達水平。

在本發(fā)明中，“測量表達水平”包括測量mrna表達水平。在本發(fā)明中，“測量mrna表達水平”是檢測樣本中基因的mrna的存在和表達水平的過程，以便預(yù)測對血管內(nèi)皮生長因子受體(vegfr)抑制劑的敏感性，并且可以通過測量mrna水平進行。用于這種測量的測定方法包括但不限于rt-pcr、競爭性rt-pcr、實時rt-pcr、rna酶保護測定(rpa)、northern印跡、dna芯片測定等。

根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，通過實時rt-pcr測量mrna表達水平。此外，通過測量每種基因的(達到閾值所需的循環(huán)數(shù))的ct值并計算δct值(每種標記物的ct減去參照基因平均ct值)，可以將mrna表達水平定量為2^-δct。在本發(fā)明中，測量mtor表達水平以預(yù)測對血管內(nèi)皮生長因子受體(vegfr)抑制劑的敏感性。mtor(雷帕霉素的哺乳動物靶標)是雷帕霉素在哺乳動物中靶向的絲氨酸/蘇氨酸激酶基因，并且具有seqidno：1所示的核苷酸序列。

如本文所用，術(shù)語“參照水平”是指與通過本文所述的方法從參照樣本檢測和鑒定的能夠顯示高診斷可預(yù)測性基因的表達水平相同的水平。參照水平可以涉及來自人口研究的數(shù)量或值，包括具有相同癌癥的受試者、具有相同或相似年齡范圍的受試者、相同或相似的族群中的受試者、具有癌癥家族史的受試者，或者涉及進行癌癥治療的受試者的起始樣本。這樣的參照水平可以從數(shù)學算法和計算的指數(shù)獲得的人口的統(tǒng)計分析和/或風險預(yù)測數(shù)據(jù)中得出。也可以使用統(tǒng)計和結(jié)構(gòu)分類的算法和其他方法來構(gòu)建和使用參照指數(shù)。

在某些實施方案中，術(shù)語“參照水平”在本文中是指預(yù)定值。例如，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，參照水平是預(yù)定的，并且被設(shè)定為滿足在特異性、敏感性和/或準確度方面的常規(guī)要求。例如，分別地，敏感性或特異性必須被設(shè)定為某些限制，例如分別為80％、90％或95％。這些要求也可以以正的或負的預(yù)測值來定義。參照水平可以以來自健康個體的參照樣本預(yù)定，或者以來自患者所屬疾病實體來預(yù)定。

在本發(fā)明中，可以使用比如平均值計算或roc曲線分析的統(tǒng)計分析方法來確定表達的參照水平。

根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案進行roc曲線分析，在敏感性、特異性和精確度方面，使用顯示診斷性能的曲線。在本發(fā)明中，敏感性是真陽性與對血管內(nèi)皮生長因子受體(vegfr)抑制劑具有敏感性的人之和的比例；特異性是真陰性與對血管內(nèi)皮生長因子受體(vegfr)抑制劑不具敏感性的人之和的比例；以及準確度是擊中與所有案例的比例。當特異性和敏感性都高時，測試結(jié)果的準確度提高。因此，roc曲線中的x軸為1-特異性，y軸為敏感性，表示準確度的auc(曲線下面積)表示曲線下面積。

根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，“參照水平”是對血管內(nèi)皮生長因子受體(vegfr)抑制劑的敏感性預(yù)測顯示高預(yù)測效果的閾值。對于敏感性的預(yù)測，mtor的表達水平被選擇作為最佳閾值(標準)，該mtor的表達水平對應(yīng)于在mtor的roc曲線分析中高于平均水平(約0.6)的auc值，優(yōu)選最高auc值，并且預(yù)測具有等于或高于參照水平的mtor表達水平的樣本對血管內(nèi)皮生長因子受體(vegfr)抑制劑具有高敏感性。例如，根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，對于mrna表達水平的參照水平可以為0.0007(標準)，優(yōu)選為0.0004。

如本文所用，術(shù)語“超過”或“高于”是指高于參照水平的水平，或者是指與參照樣本中的表達水平相比，在通過本文所述的方法檢測的表達水平中總體增加1％、2％、5％、10％、20％、25％、30％、40％，50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多。如本文所用，術(shù)語“少于”或“低于”是指低于參照水平的水平，或者是指與參照樣本中的表達水平相比，在通過本文所述的方法檢測的表達水平中總體降低1％、2％、5％、10％、20％、25％、30％、40％，50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多。

根據(jù)本發(fā)明的方法還可以包括以下步驟：測量選自vegfr2和pdgfrβ中的一種或多種生物標記物的表達水平，以及測量mtor的表達水平；將每種生物標記物的表達水平與生物標記物的參照水平進行比較，以及將mtor表達水平與參照水平進行比較，并選擇具有等于或高于生物標記物的參照水平的表達水平的樣本。

在本發(fā)明中，vegfr2(血管內(nèi)皮生長因子受體2)是作為血管內(nèi)皮生長因子(vegf)a、c、d和e的受體的酪氨酸激酶編碼基因，具有seqidno：2的核苷酸序列。

在本發(fā)明中，pdgfrβ(血小板衍生生長因子受體β)是作為血小板衍生生長因子(pdgf)受體的酪氨酸激酶編碼基因，具有seqidno：3的核苷酸序列。

優(yōu)選地，在預(yù)測敏感性的方法中與mtor一起使用的生物標記物是vegfr2和pdgfrβ。

在預(yù)測敏感性的方法中，可以從mtor的表達水平計算治療效益評分(tbs)，并且可以從其預(yù)測對血管內(nèi)皮生長因子受體(vegfr)抑制劑的敏感性。優(yōu)選地，可以通過測量mtor和選自vegfr2和pdgfrβ中的一種或多種的表達水平并計算表達水平之和所獲得的治療效益評分(tbs)來預(yù)測對血管內(nèi)皮生長因子受體(vegfr)抑制劑的敏感性。在本發(fā)明中，“治療效益評分”是指示患者能夠從血管內(nèi)皮生長因子受體(vegfr)抑制劑獲得治療效果的信息獲得的值。如果患者的治療效益分數(shù)等于或高于基于參照水平確定的某一分數(shù)，則患者對索拉非尼具有敏感性。根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，可以通過將定量為2^-δct的mrna表達水平之和乘以100來計算治療效益評分。本文中，為了確定參照水平，等于高于平均水平(約0.6)的治療效益評分的roc曲線分析中的auc值，優(yōu)選最高auc值，作為最佳閾值(標準)。

本發(fā)明還提供了用于預(yù)測對血管內(nèi)皮生長因子受體(vegfr)抑制劑的敏感性的組合物，該組合物含有用于測量mtor的mrna表達水平的試劑。

用于預(yù)測對血管內(nèi)皮生長因子受體(vegfr)抑制劑的敏感性的組合物使得可以通過測量mtor的mrna表達水平來預(yù)測對血管內(nèi)皮生長因子受體(vegfr)抑制劑的敏感性。

優(yōu)選地，用于預(yù)測對血管內(nèi)皮生長因子受體(vegfr)抑制劑的敏感性的組合物還可以含有用于測量選自vegfr2和pdgfrβ中的至少一種生物標記物的mrna表達水平的試劑。更優(yōu)選地，用于預(yù)測對血管內(nèi)皮生長因子受體(vegfr)抑制劑的敏感性的組合物還含有用于測量vegfr2和pdgfrβ的mrna表達水平的試劑。

優(yōu)選地，用于預(yù)測對血管內(nèi)皮生長因子受體(vegfr)抑制劑的敏感性的組合物可以含有引物對、探針和反義核苷酸中的任意一種或多種，其是用于測量mrna表達水平并特異性結(jié)合基因的試劑。上述引物對、探針或反義核苷酸的序列可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明提供的核苷酸序列容易地設(shè)計。根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，用于測量mrna表達水平的試劑包含引物對和探針，并且可以具有下表1所示的mtor、vegfr2和/或pdgfrβ的引物對和探針序列。

本發(fā)明還提供了一種用于預(yù)測對血管內(nèi)皮生長因子受體(vegfr)抑制劑的敏感性的試劑盒，該試劑盒含有用于預(yù)測對血管內(nèi)皮生長因子受體(vegfr)抑制劑的敏感性的組合物。

用于預(yù)測對血管內(nèi)皮生長因子受體(vegfr)抑制劑的敏感性的試劑盒可以進一步含有用于測量選自vegfr2和pdgfrβ中的至少一種生物標記物的mrna表達水平的試劑。更優(yōu)選地，為了預(yù)測對血管內(nèi)皮生長因子受體(vegfr)抑制劑的敏感性，還含有用于測量vegfr2和pdgfrβ的mrna表達水平的試劑。

該試劑盒可以通過測量任意一種或多種編碼蛋白的多核苷酸的表達水平來預(yù)測對血管內(nèi)皮生長因子受體(vegfr)抑制劑的敏感性。根據(jù)本發(fā)明，用于預(yù)測血管內(nèi)皮生長因子受體(vegfr)抑制劑的敏感性的試劑盒不僅可以含有用于測量表達水平的引物對或探針，還可以含有適用于多核苷酸分析的一種或多種其他組成成分或裝置。優(yōu)選地，用于定量檢測根據(jù)本發(fā)明的上述多核苷酸或基因的診斷試劑盒可以含有一種或多種與編碼四種蛋白的多核苷酸特異性結(jié)合的寡核苷酸。具體地，診斷試劑盒可以含有對應(yīng)于寡核苷酸的引物、逆轉(zhuǎn)錄酶、taq聚合酶、用于pcr的引物和dntp。為了測量多核苷酸表達水平，可以使用利用關(guān)于“mrna表達水平的測量”所描述的分析方法的試劑盒。例如，試劑盒可以選自rt-pcr試劑盒、競爭性rt-pcr試劑盒、實時rt-pcr試劑盒、實時rt-pcr試劑盒和dna芯片試劑盒。

本發(fā)明還提供了使用血管內(nèi)皮生長因子受體(vegfr)抑制劑治療肝癌的方法，所述方法包括以下步驟：(a)測量從肝癌患者分離的樣本中mtor的表達水平；(b)比較mtor的表達水平與mtor表達的參照水平，并選擇具有等于或高于參照水平的mtor表達水平的樣本；以及(c)向顯示mtor表達水平等于或高于參照水平的肝癌患者施用治療有效量的血管內(nèi)皮生長因子受體(vegfr)抑制劑。

此外，用于治療肝癌的方法還可以包括：測量mtor和選自vegfr2和pdgfrβ中的至少一種的表達水平；并計算表達水平之和，并選擇其中表達水平之和等于或高于表達水平之和的參照水平的樣本。更優(yōu)選地，與mtor的水平一起測量、并與參照水平比較其水平的生物標記物是vegfr2和pdgfrβ。

基于表達水平之和(優(yōu)選mtor和生物標記物的mrna表達水平)，選擇具有等于或高于參照水平的治療效益評分的樣本。在選擇樣本后，治療有效量的血管內(nèi)皮生長因子受體(vegfr)抑制劑可以施用于顯示治療效益評分等于或高于參照水平的肝癌患者。

血管內(nèi)皮生長因子受體(vegfr)抑制劑選自布立尼布、舒尼替尼、例尼法尼瑞格拉非尼和索拉非尼中的任意一種或多種。此外，該方法還可以包括施用治療有效量的治療劑的步驟，所述治療劑選自細胞毒劑、化療劑、生長抑制劑、抗血管生成劑及其組合。

本發(fā)明還提供了用于測量mtor表達水平的試劑在用于預(yù)測對血管內(nèi)皮生長因子受體(vegfr)抑制劑的敏感性的用途。除了用于測量mtor表達水平的試劑的用途以外，根據(jù)本發(fā)明的用途可以進一步包括至少一種選自vegfr2和pdgfrβ的生物標記物的用途。優(yōu)選地，該試劑包含用于測量vegfr2和pdgfrβ的表達水平的試劑。

本發(fā)明還提供了一種用于預(yù)測血管內(nèi)皮生長因子受體(vegfr)抑制劑的方法，所述方法包括以下步驟：測量從肝癌患者分離的樣本中fgfr1、ckit、egfr(表皮生長因子受體)或craf的表達水平；以及將fgfr1、ckit、egfr或craf的表達水平與這些生物標記物的每一種的參照水平進行比較，并選擇具有高于參照水平的表達水平的樣本。

本發(fā)明還提供了用于預(yù)測血管內(nèi)皮生長因子受體(vegfr)抑制劑的組合物，該組合物含有用于測量fgfr1、ckit、egfr或craf的mrna表達水平的試劑。

本發(fā)明還提供了一種用于預(yù)測血管內(nèi)皮生長因子受體(vegfr)抑制劑的試劑盒，該試劑盒含有用于預(yù)測血管內(nèi)皮生長因子受體(vegfr)抑制劑的組合物。

本發(fā)明還提供了使用血管內(nèi)皮生長因子受體(vegfr)抑制劑治療肝癌的方法，所述方法包括以下步驟：(a)測量從肝癌患者分離的樣本中fgfr1、ckit、egfr或craf的表達水平；(b)將fgfr1、ckit、egfr或craf的表達水平與這些生物標記物中的每一種的參照水平進行比較，并選擇具有高于參照水平的表達水平的樣本；和(c)向選擇的肝癌患者施用治療有效量的血管內(nèi)皮生長因子受體(vegfr)抑制劑。

本發(fā)明還提供了用于測量fgfr1、ckit、egfr或craf的表達水平的試劑在用于預(yù)測對血管內(nèi)皮生長因子受體(vegfr)抑制劑的敏感性的用途。

在本發(fā)明中，fgfr1(成纖維細胞生長因子受體1)是作為成纖維細胞生長因子(fgf)受體發(fā)揮作用的酪氨酸激酶編碼基因，具有seqidno：4的核苷酸序列。

在本發(fā)明中，ckit是作為干細胞因子(scf)受體發(fā)揮作用的酪氨酸激酶編碼基因，具有seqidno：5的核苷酸序列。

在本發(fā)明中，egfr(表皮生長因子受體)是作為表皮生長因子(egf)受體發(fā)揮作用的酪氨酸激酶編碼基因，具有seqidno：6的核苷酸序列。

在本發(fā)明中，craf是屬于已知為致癌基因的raf絲氨酸/蘇氨酸激酶家族的激酶編碼基因，具有seqidno：7的核苷酸序列。

本發(fā)明的預(yù)測方法、組合物、試劑盒、治療方法和用途中提到的事項以相同的方式應(yīng)用，除非它們彼此不矛盾。

有益效果

根據(jù)本發(fā)明，預(yù)測了采用血管內(nèi)皮生長因子受體(vegfr)抑制劑對肝癌患者的治療效果。基于預(yù)測，選擇治療肝癌的有效手段和抗癌療法，從而增加治療效果，最小化肝癌治療的副作用。

附圖說明

圖1顯示了在索拉非尼的響應(yīng)者和不響應(yīng)者中分析mtor、vegfr2、pdgfrβ、fgfr1、ckit、egfr或craf的表達水平分布的結(jié)果。

圖2顯示了通過使用mtor、mtor和vegfr2的組合、mtor和pdgfrβ的組合，或mtor、vegfr2和pdgfrβ的組合來分析索拉非尼響應(yīng)者和索拉非尼不響應(yīng)者的治療效益評分分布的結(jié)果。

圖3顯示了進行受試者工作特征(roc)分析以確認治療效益評分預(yù)測和分類索拉非尼響應(yīng)者和索拉非尼不響應(yīng)者的能力的結(jié)果。

具體實施方式

參照下述實施例，本發(fā)明的優(yōu)點和特征以及實現(xiàn)本發(fā)明的方法將變得顯而易見。然而，本發(fā)明不限于以下公開的實施例，并且可以以各種不同的形式實施；而且，提供這些實施例，使得本公開將是徹底和完整的，并且將向本領(lǐng)域技術(shù)人員充分地傳達本發(fā)明的范圍。本發(fā)明的范圍將由所附權(quán)利要求限定。

實施例1：rna提取和cdna合成

31例被診斷患有肝癌的肝癌患者，接受肝切除術(shù)或肝移植，顯示肝癌復(fù)發(fā)，并在亞洲大學醫(yī)學中心、韓國大學安南醫(yī)院和和啟明大學東山醫(yī)療中心接受多吉美(索拉非尼)治療，在知情同意的情況下獲得肝癌組織。以以下方式從各組織中提取rna，由其合成cdna。

根據(jù)制造商的說明書，使用rneasymini試劑盒(qiagen，德國)從肝癌組織和周圍正常組織中提取總rna。使用bioanalyzer2100(agilenttechnologies，usa)對提取的總rna進行定量。在提取步驟中，用dna酶i處理rna提取物以去除基因組dna。將包含4μg總rna的每個樣本與2μl的1μmoligod(t)18引物(genotech,韓國)在70℃孵育7分鐘，并在冰上冷卻5分鐘。單獨制備總共11μl酶混合物[2μl的0.1mdtt(duchefa，荷蘭)，2μl的10x逆轉(zhuǎn)錄緩沖液，5μl的2mmdntp，1μl的200u/μlmmlv逆轉(zhuǎn)錄酶和1μl的40u/μlrna酶抑制劑(enzynomics，韓國)]。將酶混合物加入到含有rna的混合物中，并在42℃孵育90分鐘，然后在80℃孵育10分鐘以使逆轉(zhuǎn)錄酶失活。將焦碳酸二乙酯(depc)處理的水加入到混合物中至終體積為400μl。

實施例2：定量實時pcr

為了測量實施例1中獲得的每個cdna樣本的mtor、vegfr2、pdgfrβ、fgfr1、ckit、egfr或craf的mrna表達水平，根據(jù)制造商的說明書，使用prism7900ht(appliedbiosystems，usa)通過實時pcr擴增了下表1所示的基因標記物。

使用總共10μl的體積進行實時pcr分析，所述10μl的體積由5μl的2xtaqman基因表達主混合物(appliedbiosystems，usa)，5μm正向和反向引物每種1μl，1μl的1μm探針(genotech，韓國)和2μl的cdna(相同量的水作為對照)組成。通過在95℃變性10分鐘，隨后循環(huán)反應(yīng)由95℃變性15秒和在60℃合成1分鐘組成進行pcr擴增。引物和探針序列使用primerexpress3.0(appliedbiosystems，usa)進行設(shè)計，所有探針序列用5'末端的fam和3'末端的tamra標記。對于每種標記物，使用下表1所示的引物和探針序列。

表1：標記物基因的引物和探針序列的信息

每種標記物基因的表達重復(fù)測量三次，并以五種參照基因(b2m、gapdh、hmbs、hprt1和sdha)的平均表達歸一化。對于參照基因，使用下表2所示的引物和探針序列。

表2：參照基因的引物和探針序列的信息

測量每種標記物的ct值(達到閾值所需的循環(huán)數(shù))，并計算δct值(每種標記物的ct值減去參照基因的平均ct值)，由此將每種標記物的mrna表達水平表示為2^-δct。

實施例3：統(tǒng)計學分析

使用實施例2中獲得的標記物的表達水平(2^-δct)，以以下方式進行總共四項統(tǒng)計分析(即個體基因表達分布分析、roc曲線分析、治療效益評分分析和治療效益評分的roc曲線分析)。

(1)個體基因表達分布的分析

為了檢測索拉非尼的治療效果與單個標記物的表達水平(2^-δct)之間的相關(guān)性，分別對索拉非尼響應(yīng)者和索拉非尼不響應(yīng)者分析了七種單個標記物的表達水平及其分布，分析結(jié)果示于圖1。

圖1顯示了響應(yīng)者和不響應(yīng)者的七種基因(即mtor、vegfr2、pdgfrβ、fgfr1、ckit、egfr和craf)的mrna表達水平的分析結(jié)果。

當這些標記物中的每一種表達顯示：mtor的表達水平與不響應(yīng)者相比(2^-δct平均值：0.0003)，在響應(yīng)者中上調(diào)(2^-δct的平均值：0.0026)，具有統(tǒng)計顯著性(p＝0.0092)。此外，顯示vegfr2的表達水平與不響應(yīng)者(2^-δct平均值：0.0001)的相比，在響應(yīng)者中上調(diào)(2^-δct平均值：0.0034)，具有統(tǒng)計顯著性(p＝0.0181)。還顯示pdgfrβ的表達水平與不響應(yīng)者(2^-δct平均值：0.0001)相比，在響應(yīng)者中上調(diào)(2^-δct平均值：0.0043)，具有統(tǒng)計顯著性(p＝0.0043)。此外，顯示fgfr1的表達水平與不響應(yīng)者相比(2^-δct平均值：0.0002)，在響應(yīng)者中上調(diào)(2^-δct平均值：0.0053)。

此外，顯示ckit的表達水平與不響應(yīng)者(2^-δct平均值：0.0005)相比，在響應(yīng)者中上調(diào)(2^-δct平均值：0.0192)，具有統(tǒng)計顯著性(p＝0.0408)。此外，顯示egfr的表達水平與不響應(yīng)者(2^-δct平均值：0.0022)相比，在響應(yīng)者中上調(diào)(2^-δct平均值：0.0302)，具有統(tǒng)計顯著性p＝0.0495)。還顯示craf的表達水平與不響應(yīng)者(2^-δct平均值：0.0310)相比，在響應(yīng)者中下調(diào)(2^-δct平均值：0.0276)，具有統(tǒng)計顯著性(p＝0.8089)。

(2)roc曲線分析

為了確認如上所述計算的31名患者中個體標記物的表達水平是否具有預(yù)測和分類索拉非尼響應(yīng)者和索拉菲尼不響應(yīng)者的能力，使用各種截止值進行roc(受試者工作特征)曲線分析。

此外，基于對應(yīng)于roc曲線中平均auc值(約0.6)或最高auc值的基因表達水平，獲得最佳閾值(標準)，并且獲得對應(yīng)于每個分類器和標準的敏感性、特異性、auc值和p值。分析結(jié)果示于下表3中。

表3：預(yù)測每種基因?qū)λ骼悄嶂委煹捻憫?yīng)的敏感性、特異性和準確度

上表3顯示了基于每種標記物基因的mrna表達水平預(yù)測對索拉非尼的響應(yīng)所進行的roc曲線分析的結(jié)果。roc曲線分析結(jié)果表明，mtor最高auc為0.860(p<0.0001)。特別地，顯示mtor、vegrf2和pdgfrβ的auc值高于其他標記物。

(3)治療效益評分的計算

為了檢測索拉非尼的治療效果與基于mtor、vegfr2和/或pdgfrβ的表達水平的治療效益評分之間的相關(guān)性，計算治療效益評分。

通過如上所述選擇和組合具有高auc值的標記物，計算所選擇的標記物的表達水平之和并將和乘以100來計算治療效益評分。

基于顯示高auc值的mtor、vegrf2和pdgfrβ的組合計算響應(yīng)者和不響應(yīng)者的治療效益評分的結(jié)果于圖2。

如圖2所示，在mtor的情況下的治療效益評分，與不響應(yīng)者相比(治療效益評分(tbs)平均值為0.26)，在響應(yīng)者中上調(diào)(治療效益評分(tbs)平均值：0.03)，具有統(tǒng)計顯著性(p＝0.0092)。此外，顯示使用mtor和vegrf2組合獲得的治療效益評分，與不響應(yīng)者相比(治療效益評分(tbs)平均值為0.04)，在響應(yīng)者中上調(diào)(治療效益評分(tbs)平均值：0.61))，具有統(tǒng)計顯著性(p＝0.0130)。還顯示使用mtor和pdgfrβ組合獲得的治療效益評分，與不響應(yīng)者相比(治療效益評分(tbs)平均值為0.05)，在響應(yīng)者中上調(diào)(治療效益評分(tbs)平均值：0.69)，具有統(tǒng)計顯著性(p＝0.0048)。此外顯示使用mtor、vegrf2和pdgfrβ組合獲得的治療效益評分，與不響應(yīng)者相比(治療效益評分(tbs)平均值為0.05)，在響應(yīng)者中上調(diào)(治療效益評分(tbs)平均值：1.04)，具有統(tǒng)計顯著性(p＝0.0074)。

(4)治療效益評分roc曲線分析

為了評估上述治療效益評分預(yù)測索拉非尼治療效果的能力，使用各種截止值進行roc(受試者工作特征)分析。此外，基于對應(yīng)于roc曲線中平均auc值(約0.6)或最高auc值的基因表達水平，獲得最佳閾值(標準)，并且獲得對應(yīng)于每個分類器和標準的敏感性、特異性、auc值和p值。分析結(jié)果示于圖3和下表4。

表4：基于治療效益評分獲得的預(yù)測索拉非尼治療響應(yīng)的敏感性、特異性和準確度

圖3和上表4顯示了基于單獨使用mtor或與vegrf2和/或pdgfrβ組合獲得的治療效益評分的roc曲線。在基于單獨使用mtor或與vegrf2和/或pdgfrβ組合獲得的治療效益評分的roc分析結(jié)果中，當單獨使用mtor時，auc值為0.860，當mtor與vegrf2組合使用時，auc值為0.820，當mtor與pdgfrβ組合使用時為0.773，當mtor與vegfr2和pdgfrβ組合使用時為0.807。

從上述可以看出，本發(fā)明的標記物和預(yù)測方法對索拉非尼治療效果的預(yù)測顯示顯著效果。特別地，從mtor和mtor和其他標記物的組合獲得的治療效益評分可以更準確地預(yù)測索拉非尼的治療效果。

序列表

<110>cbs生物科學

(醫(yī)療)吉醫(yī)療財團

<120>預(yù)測對血管內(nèi)皮生長因子受體抑制劑的敏感性的方法

<130>p15025-cbs

<150>kr2014-0144762

<151>2014-10-24

<160>43

<170>kopatentin2.0

<210>1

<211>8733

<212>rna

<213>人類

<220>

<221>mrna

<222>(1)..(8733)

<223>雷帕霉素的機械靶標(絲氨酸/蘇氨酸激酶)(mtor)

<400>1

gctcccggcttagaggacagcggggaaggcgggcggtggggcagggggcctgaagcggcg60

gtaccggtgctggcggcggcagctgaggccttggccgaagccgcgcgaacctcagggcaa120

gatgcttggaaccggacctgccgccgccaccaccgctgccaccacatctagcaatgtgag180

cgtcctgcagcagtttgccagtggcctaaagagccggaatgaggaaaccagggccaaagc240

cgccaaggagctccagcactatgtcaccatggaactccgagagatgagtcaagaggagtc300

tactcgcttctatgaccaactgaaccatcacatttttgaattggtttccagctcagatgc360

caatgagaggaaaggtggcatcttggccatagctagcctcataggagtggaaggtgggaa420

tgccacccgaattggcagatttgccaactatcttcggaacctcctcccctccaatgaccc480

agttgtcatggaaatggcatccaaggccattggccgtcttgccatggcaggggacacttt540

taccgctgagtacgtggaatttgaggtgaagcgagccctggaatggctgggtgctgaccg600

caatgagggccggagacatgcagctgtcctggttctccgtgagctggccatcagcgtccc660

taccttcttcttccagcaagtgcaacccttctttgacaacatttttgtggccgtgtggga720

ccccaaacaggccatccgtgagggagctgtagccgcccttcgtgcctgtctgattctcac780

aacccagcgtgagccgaaggagatgcagaagcctcagtggtacaggcacacatttgaaga840

agcagagaagggatttgatgagaccttggccaaagagaagggcatgaatcgggatgatcg900

gatccatggagccttgttgatccttaacgagctggtccgaatcagcagcatggagggaga960

gcgtctgagagaagaaatggaagaaatcacacagcagcagctggtacacgacaagtactg1020

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ggctgtacagccccagcagtcaaatgccttggtggggctgctggggtacagctctcacca1140

aggcctcatgggatttgggacctcccccagtccagctaagtccaccctggtggagagccg1200

gtgttgcagagacttgatggaggagaaatttgatcaggtgtgccagtgggtgctgaaatg1260

caggaatagcaagaactcgctgatccaaatgacaatccttaatttgttgccccgcttggc1320

tgcattccgaccttctgccttcacagatacccagtatctccaagataccatgaaccatgt1380

cctaagctgtgtcaagaaggagaaggaacgtacagcggccttccaagccctggggctact1440

ttctgtggctgtgaggtctgagtttaaggtctatttgcctcgcgtgctggacatcatccg1500

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cacagtcttcacttgcatcagcatgctggctcgagcaatggggccaggcatccagcagga1620

tatcaaggagctgctggagcccatgctggcagtgggactaagccctgccctcactgcagt1680

gctctacgacctgagccgtcagattccacagctaaagaaggacattcaagatgggctact1740

gaaaatgctgtccctggtccttatgcacaaaccccttcgccacccaggcatgcccaaggg1800

cctggcccatcagctggcctctcctggcctcacgaccctccctgaggccagcgatgtggg1860

cagcatcactcttgccctccgaacgcttggcagctttgaatttgaaggccactctctgac1920

ccaatttgttcgccactgtgcggatcatttcctgaacagtgagcacaaggagatccgcat1980

ggaggctgcccgcacctgctcccgcctgctcacaccctccatccacctcatcagtggcca2040

tgctcatgtggttagccagaccgcagtgcaagtggtggcagatgtgcttagcaaactgct2100

cgtagttgggataacagatcctgaccctgacattcgctactgtgtcttggcgtccctgga2160

cgagcgctttgatgcacacctggcccaggcggagaacttgcaggccttgtttgtggctct2220

gaatgaccaggtgtttgagatccgggagctggccatctgcactgtgggccgactcagtag2280

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tttgaaactgaaagatccagaccctgatccaaacccaggtgtgatcaataatgtcctggc2520

aacaataggagaattggcacaggttagtggcctggaaatgaggaaatgggttgatgaact2580

ttttattatcatcatggacatgctccaggattcctctttgttggccaaaaggcaggtggc2640

tctgtggaccctgggacagttggtggccagcactggctatgtagtagagccctacaggaa2700

gtaccctactttgcttgaggtgctactgaattttctgaagactgagcagaaccagggtac2760

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agaccagtcactctctcatcatcacaccatggttgtccaggccatcaccttcatcttcaa3060

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gtcctttgtgaagagccacatcagaccttatatggatgaaatagtcaccctcatgagaga3240

attctgggtcatgaacacctcaattcagagcacgatcattcttctcattgagcaaattgt3300

ggtagctcttgggggtgaatttaagctctacctgccccagctgatcccacacatgctgcg3360

tgtcttcatgcatgacaacagcccaggccgcattgtctctatcaagttactggctgcaat3420

ccagctgtttggcgccaacctggatgactacctgcatttactgctgcctcctattgttaa3480

gttgtttgatgcccctgaagctccactgccatctcgaaaggcagcgctagagactgtgga3540

ccgcctgacggagtccctggatttcactgactatgcctcccggatcattcaccctattgt3600

tcgaacactggaccagagcccagaactgcgctccacagccatggacacgctgtcttcact3660

tgtttttcagctggggaagaagtaccaaattttcattccaatggtgaataaagttctggt3720

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cagcaccatcaacctccaaaaggcctggggcgctgccaggagggtctccaaagatgactg3960

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catcgagttggccctcacctcacaagacatcgctgaagtcacacagaccctcttaaactt4200

ggctgaattcatggaacacagtgacaagggccccctgccactgagagatgacaatggcat4260

tgttctgctgggtgagagagctgccaagtgccgagcatatgccaaagcactacactacaa4320

agaactggagttccagaaaggccccacccctgccattctagaatctctcatcagcattaa4380

taataagctacagcagccggaggcagcggccggagtgttagaatatgccatgaaacactt4440

tggagagctggagatccaggctacctggtatgagaaactgcacgagtgggaggatgccct4500

tgtggcctatgacaagaaaatggacaccaacaaggacgacccagagctgatgctgggccg4560

catgcgctgcctcgaggccttgggggaatggggtcaactccaccagcagtgctgtgaaaa4620

gtggaccctggttaatgatgagacccaagccaagatggcccggatggctgctgcagctgc4680

atggggtttaggtcagtgggacagcatggaagaatacacctgtatgatccctcgggacac4740

ccatgatggggcattttatagagctgtgctggcactgcatcaggacctcttctccttggc4800

acaacagtgcattgacaaggccagggacctgctggatgctgaattaactgcgatggcagg4860

agagagttacagtcgggcatatggggccatggtttcttgccacatgctgtccgagctgga4920

ggaggttatccagtacaaacttgtccccgagcgacgagagatcatccgccagatctggtg4980

ggagagactgcagggctgccagcgtatcgtagaggactggcagaaaatccttatggtgcg5040

gtcccttgtggtcagccctcatgaagacatgagaacctggctcaagtatgcaagcctgtg5100

cggcaagagtggcaggctggctcttgctcataaaactttagtgttgctcctgggagttga5160

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tgtgctacactacaaacatcagaaccaagcccgcgatgagaagaagaaactgcgtcatgc5580

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cactgccagcaccgagggcagcaacagtgagagcgaggccgagagcaccgagaacagccc5700

caccccatcgccgctgcagaagaaggtcactgaggatctgtccaaaaccctcctgatgta5760

cacggtgcctgccgtccagggcttcttccgttccatctccttgtcacgaggcaacaacct5820

ccaggatacactcagagttctcaccttatggtttgattatggtcactggccagatgtcaa5880

tgaggccttagtggagggggtgaaagccatccagattgatacctggctacaggttatacc5940

tcagctcattgcaagaattgatacgcccagacccttggtgggacgtctcattcaccagct6000

tctcacagacattggtcggtaccacccccaggccctcatctacccactgacagtggcttc6060

taagtctaccacgacagcccggcacaatgcagccaacaagattctgaagaacatgtgtga6120

gcacagcaacaccctggtccagcaggccatgatggtgagcgaggagctgatccgagtggc6180

catcctctggcatgagatgtggcatgaaggcctggaagaggcatctcgtttgtactttgg6240

ggaaaggaacgtgaaaggcatgtttgaggtgctggagcccttgcatgctatgatggaacg6300

gggcccccagactctgaaggaaacatcctttaatcaggcctatggtcgagatttaatgga6360

ggcccaagagtggtgcaggaagtacatgaaatcagggaatgtcaaggacctcacccaagc6420

ctgggacctctattatcatgtgttccgacgaatctcaaagcagctgcctcagctcacatc6480

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gcaagtcatcacatccaagcagaggccccggaaattgacacttatgggcagcaacggaca6660

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tctcaacatcgagcatcgcatcatgttgcggatggctccggactatgaccacttgactct6960

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ctgctttgaggttgctatgacccgagagaagtttccagagaagattccatttagactaac7260

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ataaagtgtagccatgtctagacaccatgttgtatcagaataatttttgtgccaataaat8700

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<210>2

<211>6055

<212>rna

<213>人類

<220>

<221>mrna

<222>(1)..(6055)

<223>激酶插入結(jié)構(gòu)域受體(iii型受體酪氨酸激酶)

<400>2

actgagtcccgggaccccgggagagcggtcaatgtgtggtcgctgcgtttcctctgcctg60

cgccgggcatcacttgcgcgccgcagaaagtccgtctggcagcctggatatcctctccta120

ccggcacccgcagacgcccctgcagccgcggtcggcgcccgggctccctagccctgtgcg180

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cactttgtgcaagatacccagaaaagagatttgttcctgatggtaacagaatttcctggg840

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catttgtcagggtccatgaaaaaccttttgttgcttttggaagtggcatggaatctctgg1320

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<223>表皮生長因子受體(egfr)

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ctccctccccacattccccatgctcaaggcccagccttctgtagatgcgcaagtggatgt2640

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<213>人工序列

<220>

<223>pdgfr-b反向引物

<400>12

ttcacgcgaaccagtgtca19

<210>13

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>pdgfr-b探針

<400>13

ctgtccacgcgcaacgtgtcg21

<210>14

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>c-kit正向引物

<400>14

cagatttcagagagcaccaatca23

<210>15

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>c-kit反向引物

<400>15

aatggtctaccacgggcttct21

<210>16

<211>30

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>c-kit探針

<400>16

ttactccaacttagcaaactgcagccccaa30

<210>17

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>c-raf正向引物

<400>17

gaggtcgacatccacacctaatg23

<210>18

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>c-raf反向引物

<400>18

tcgaattgcatcctcaatcatc22

<210>19

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>c-raf探針

<400>19

ccacatggtcagcaccaccctgc23

<210>20

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>egfr正向引物

<400>20

gaaggagctgcccatgagaa20

<210>21

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>egfr反向引物

<400>21

gactatgtcccgccactggat21

<210>22

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>egfr探針

<400>22

aaatcctgcatggcgccgtgc21

<210>23

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>mtor正向引物

<400>23

aggccgcattgtctctatcaa21

<210>24

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>mtor反向引物

<400>24

gcagtaaatgcaggtagtcatcca24

<210>25

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>mtor探針

<400>25

tgcaatccagctgtttggcgcc22

<210>26

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>fgfr1正向引物

<400>26

cacgggacattcaccacatc20

<210>27

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>fgfr1反向引物

<400>27

gggtgccatccacttcaca19

<210>28

<211>30

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>fgfr1探針

<400>28

actataaaaagacaaccaacggccgactgc30

<210>29

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>b2m正向引物

<400>29

cattcgggccgagatgtct19

<210>30

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>b2m反向引物

<400>30

ctccaggccagaaagagagagtag24

<210>31

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>b2m探針

<400>31

ccgtggccttagctgtgctcgc22

<210>32

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>gapdh正向引物

<400>32

cacatggcctccaaggagtaa21

<210>33

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>gapdh反向引物

<400>33

tgagggtctctctcttcctcttgt24

<210>34

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>gapdh探針

<400>34

ctggaccaccagccccagcaag22

<210>35

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>hmbs正向引物

<400>35

ccagggatttgcctcacctt20

<210>36

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>hmbs反向引物

<400>36

aaagagatgaagcccccacat21

<210>37

<211>26

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>hmbs探針

<400>37

ccttgatgactgccttgcctcctcag26

<210>38

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>hprt1正向引物

<400>38

gctcgagatgtgatgaaggagat23

<210>39

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>hprt1反向引物

<400>39

ccagcaggtcagcaaagaatt21

<210>40

<211>28

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>hprt1探針

<400>40

ccatcacattgtagccctctgtgtgctc28

<210>41

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>sdha正向引物

<400>41

cacctagtggctgggagctt20

<210>42

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>sdha反向引物

<400>42

gcccagttttatcatctcacaaga24

<210>43

<211>27

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>sdha探針

<400>43

tggcacttacctttgtcccttgcttca27