關(guān)于聯(lián)邦政府資助的研究的聲明

本發(fā)明是通過nih1r43ar061902-01和1p20rr20152-01以及國(guó)防部oc073102和oc110218在美國(guó)政府支持下進(jìn)行的。政府對(duì)本發(fā)明享有一定的權(quán)利。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了新型干細(xì)胞培養(yǎng)和治療方法以及培養(yǎng)基組合物，其目的在于誘導(dǎo)、激活或引發(fā)分立、均勻的細(xì)胞表型，以選擇性地促進(jìn)或抑制炎癥和免疫，從而提供在基于細(xì)胞的治療中使用的、與已知培養(yǎng)基和方法相比顯著的優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明可用來(lái)提供更均勻和可預(yù)測(cè)的離體擴(kuò)充的和誘導(dǎo)、引發(fā)或激活的間充質(zhì)干細(xì)胞(msc)群體，其可用于基于細(xì)胞的治療。本領(lǐng)域長(zhǎng)期以來(lái)一直需要一種提供基于細(xì)胞的治療所需的均勻且有效的大量干細(xì)胞的改進(jìn)方法。本發(fā)明的各個(gè)實(shí)施方案的優(yōu)點(diǎn)是它們可用來(lái)將間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)物誘導(dǎo)、激活或引發(fā)為均勻且分立的表型，這些表型在引入患者中時(shí)以可預(yù)測(cè)的方式表現(xiàn)。

在某些實(shí)施方案中，本文公開了一種用于由未受刺激的間充質(zhì)干細(xì)胞群體產(chǎn)生免疫極化的間充質(zhì)干細(xì)胞群體的誘導(dǎo)培養(yǎng)基，該誘導(dǎo)培養(yǎng)基包含：toll樣受體3(tlr3)配體、紅細(xì)胞生成素和0.5-2％氧或低氧模擬物(hypoxiamimetic)，其中該免疫極化的間充質(zhì)干細(xì)胞群體具有以抗炎或免疫抑制介質(zhì)的表達(dá)為標(biāo)志的抗炎特性。在某些實(shí)施方案中，該toll樣受體3(tlr3)配體為聚(i:c)。在某些實(shí)施方案中，該toll樣受體3(tlr3)配體為聚(a:u)。在某些實(shí)施方案中，紅細(xì)胞生成素以低于10ng/ml的濃度存在。在某些實(shí)施方案中，該低氧模擬物為氯化鈷。在某些實(shí)施方案中，該氯化鈷以5μm至500μm的濃度存在。在某些實(shí)施方案中，該誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)一步包含白介素4(il-4)。在某些實(shí)施方案中，該誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)一步包含白介素13(il-13)。在某些實(shí)施方案中，該誘導(dǎo)培養(yǎng)基不包含人或動(dòng)物來(lái)源的血清。在某些實(shí)施方案中，該誘導(dǎo)培養(yǎng)基為濃縮液。在某些實(shí)施方案中，本文公開了用該誘導(dǎo)培養(yǎng)基處理的間充質(zhì)干細(xì)胞群體。在某些實(shí)施方案中，本文公開了用該誘導(dǎo)培養(yǎng)基處理的人間充質(zhì)干細(xì)胞群體。在某些實(shí)施方案中，本文公開了用該誘導(dǎo)培養(yǎng)基處理的犬、貓或馬的間充質(zhì)干細(xì)胞群體。在某些實(shí)施方案中，本文公開了用該誘導(dǎo)培養(yǎng)基處理的間充質(zhì)干細(xì)胞群體。在某些實(shí)施方案中，本文公開了用該誘導(dǎo)培養(yǎng)基處理的間充質(zhì)干細(xì)胞群體，其中該細(xì)胞以與未受刺激的間充質(zhì)干細(xì)胞群體相比增加的cxcl9mrna表達(dá)為標(biāo)志。在某些實(shí)施方案中，本文公開了用該誘導(dǎo)培養(yǎng)基處理的間充質(zhì)干細(xì)胞群體，其中該細(xì)胞以與未受刺激的間充質(zhì)干細(xì)胞群體相比增加的oas1mrna表達(dá)為標(biāo)志。在某些實(shí)施方案中，本文公開了用該誘導(dǎo)培養(yǎng)基處理的間充質(zhì)干細(xì)胞群體，其中該細(xì)胞以與未受刺激的間充質(zhì)干細(xì)胞群體相比增加的isg15mrna表達(dá)為標(biāo)志。在某些實(shí)施方案中，本文公開了包含用該誘導(dǎo)培養(yǎng)基處理的間充質(zhì)干細(xì)胞群體的用于治療疾病的組合物，其中該疾病為炎性或自身免疫病癥。在某些實(shí)施方案中，該炎性或自身免疫病癥為類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。在某些實(shí)施方案中，該炎性或自身免疫病癥為炎性腸病。在某些實(shí)施方案中，該炎性或自身免疫病癥為急性視神經(jīng)炎。在某些實(shí)施方案中，該炎性或自身免疫病癥為克拉伯病(krabbedisease)。在某些實(shí)施方案中，該炎性或自身免疫病癥為糖尿病視網(wǎng)膜病變。在某些實(shí)施方案中，該炎性或自身免疫病癥為克羅恩病。在某些實(shí)施方案中，該炎性或自身免疫病癥為急性肺損傷。

在某些實(shí)施方案中，本文公開了一種用于由未受刺激的間充質(zhì)干細(xì)胞群體產(chǎn)生免疫極化的間充質(zhì)干細(xì)胞群體的誘導(dǎo)培養(yǎng)基，該誘導(dǎo)培養(yǎng)基包含：toll樣受體4(tlr4)配體、紅細(xì)胞生成素和0.5-2％氧或低氧模擬物，其中該免疫極化的間充質(zhì)干細(xì)胞群體具有以促炎介質(zhì)的表達(dá)為標(biāo)志的促炎特性。在某些實(shí)施方案中，該toll樣受體4(tlr4)配體為脂多糖(lps)。在某些實(shí)施方案中，該toll樣受體4(tlr4)配體為氨基烷基氨基葡糖苷4-磷酸酯。在某些實(shí)施方案中，紅細(xì)胞生成素以低于10ng/ml的濃度存在。在某些實(shí)施方案中，該低氧模擬物為氯化鈷。在某些實(shí)施方案中，該氯化鈷以5μm至500μm的濃度存在。在某些實(shí)施方案中，該誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)一步包含干擾素。在某些實(shí)施方案中，該誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)一步包含腫瘤壞死因子α(tnfα)。在某些實(shí)施方案中，該誘導(dǎo)培養(yǎng)基不包含人或動(dòng)物來(lái)源的血清。在某些實(shí)施方案中，該誘導(dǎo)培養(yǎng)基為濃縮液。在某些實(shí)施方案中，本文公開了用該誘導(dǎo)培養(yǎng)基處理的間充質(zhì)干細(xì)胞群體。在某些實(shí)施方案中，本文公開了用該誘導(dǎo)培養(yǎng)基處理的人間充質(zhì)干細(xì)胞群體。在某些實(shí)施方案中，本文公開了用該誘導(dǎo)培養(yǎng)基處理的犬、貓或馬的間充質(zhì)干細(xì)胞群體。在某些實(shí)施方案中，本文公開了用該誘導(dǎo)培養(yǎng)基處理的間充質(zhì)干細(xì)胞群體，其中該間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源于多能干細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，本文公開了用該誘導(dǎo)培養(yǎng)基處理的間充質(zhì)干細(xì)胞群體，其中該細(xì)胞以與未受刺激的間充質(zhì)干細(xì)胞群體相比增加的tnfsf10(trail)mrna表達(dá)為標(biāo)志。在某些實(shí)施方案中，本文公開了包含用該誘導(dǎo)培養(yǎng)基處理的間充質(zhì)干細(xì)胞群體的用于治療疾病的組合物，其中該疾病為癌癥。在某些實(shí)施方案中，該癌癥為卵巢癌。在某些實(shí)施方案中，該癌癥為葡萄膜黑色素瘤。在某些實(shí)施方案中，本文公開了包含用該誘導(dǎo)培養(yǎng)基處理的間充質(zhì)干細(xì)胞群體的用于治療疾病的組合物，其中該疾病為病毒性病況。在某些實(shí)施方案中，本文公開了包含用該誘導(dǎo)培養(yǎng)基處理的間充質(zhì)干細(xì)胞群體的用于治療疾病的組合物，其中該疾病為細(xì)菌感染。

在某些實(shí)施方案中，本文公開了一種用于由未受刺激的間充質(zhì)干細(xì)胞群體產(chǎn)生免疫極化的間充質(zhì)干細(xì)胞群體的誘導(dǎo)培養(yǎng)基，該誘導(dǎo)培養(yǎng)基包含：濃度為0.1μg/ml至100μg/ml的聚(i:c)、濃度低于10ng/ml的紅細(xì)胞生成素和濃度為5μm至500μm的氯化鈷，其中該免疫極化的間充質(zhì)干細(xì)胞群體具有抗炎特性，并且以與未受刺激的間充質(zhì)干細(xì)胞群體相比增加的cxcl9、oas1和isg15mrna表達(dá)為標(biāo)志。

在某些實(shí)施方案中，本文公開了一種用于由未受刺激的間充質(zhì)干細(xì)胞群體產(chǎn)生免疫極化的間充質(zhì)干細(xì)胞群體的誘導(dǎo)培養(yǎng)基，該誘導(dǎo)培養(yǎng)基包含：濃度為0.1ng/ml至1μg/ml的lps、濃度低于10ng/ml的紅細(xì)胞生成素和濃度為5μm至500μm的氯化鈷，其中該免疫極化的間充質(zhì)干細(xì)胞群體具有促炎特性，并且以與未受刺激的間充質(zhì)干細(xì)胞群體相比增加的tnfsf10(trail)表達(dá)為標(biāo)志。

在某些實(shí)施方案中，本文公開了一種用于由未受刺激的間充質(zhì)干細(xì)胞群體產(chǎn)生免疫極化的間充質(zhì)干細(xì)胞群體的方法，該方法包括使未受刺激的間充質(zhì)干細(xì)胞群體與組合物相接觸，該組合物包含：toll樣受體3(tlr3)配體、紅細(xì)胞生成素和低氧或低氧模擬物，其中該免疫極化的間充質(zhì)干細(xì)胞群體具有以抗炎或免疫抑制介質(zhì)的表達(dá)為標(biāo)志的抗炎特性。在某些實(shí)施方案中，該tlr3配體為聚(i:c)。在某些實(shí)施方案中，該tlr3配體為聚(a:u)。在某些實(shí)施方案中，紅細(xì)胞生成素以低于10ng/ml的濃度存在。在某些實(shí)施方案中，該低氧模擬物為氯化鈷。在某些實(shí)施方案中，該氯化鈷以5μm至500μm的濃度存在。在某些實(shí)施方案中，該組合物進(jìn)一步包含白介素4(il-4)。在某些實(shí)施方案中，該組合物進(jìn)一步包含白介素13(il-13)。在某些實(shí)施方案中，該組合物不包含人或動(dòng)物來(lái)源的血清。在某些實(shí)施方案中，該組合物為濃縮液。在某些實(shí)施方案中，該未受刺激的間充質(zhì)干細(xì)胞群體與toll樣受體3配體、紅細(xì)胞生成素和低氧或低氧模擬物同時(shí)接觸。在某些實(shí)施方案中，該組合物與該未受刺激的間充質(zhì)干細(xì)胞群體相接觸至少30分鐘但少于8小時(shí)。在某些實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括在rna或蛋白質(zhì)水平上監(jiān)測(cè)cxcl9的表達(dá)。在某些實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括在rna或蛋白質(zhì)水平上監(jiān)測(cè)oas1的表達(dá)。在某些實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括在rna或蛋白質(zhì)水平上監(jiān)測(cè)isg15的表達(dá)。在某些實(shí)施方案中，本文提供了通過該方法處理的間充質(zhì)干細(xì)胞群體。在某些實(shí)施方案中，本文提供了通過該方法處理的人間充質(zhì)干細(xì)胞群體。在某些實(shí)施方案中，本文提供了通過該方法處理的犬、貓或馬的間充質(zhì)干細(xì)胞群體。在某些實(shí)施方案中，本文提供了通過該方法處理的間充質(zhì)干細(xì)胞群體，其中該間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源于多能干細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，本文提供了通過該方法處理的間充質(zhì)干細(xì)胞群體，其中該細(xì)胞以與未受刺激的間充質(zhì)干細(xì)胞群體相比增加的cxcl9mrna表達(dá)為標(biāo)志。在某些實(shí)施方案中，本文提供了通過該方法處理的間充質(zhì)干細(xì)胞群體，其中該細(xì)胞以與未受刺激的間充質(zhì)干細(xì)胞群體相比增加的oas1mrna表達(dá)為標(biāo)志。在某些實(shí)施方案中，本文提供了通過該方法處理的間充質(zhì)干細(xì)胞群體，其中該細(xì)胞以與未受刺激的間充質(zhì)干細(xì)胞群體相比增加的isg15mrna表達(dá)為標(biāo)志。在某些實(shí)施方案中，本文提供了包含通過該方法處理的間充質(zhì)干細(xì)胞群體的用于治療疾病的組合物，其中該疾病為炎性或自身免疫病癥。在某些實(shí)施方案中，該炎性或自身免疫病癥為類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。在某些實(shí)施方案中，該炎性或自身免疫病癥為炎性腸病。在某些實(shí)施方案中，該炎性或自身免疫病癥為急性視神經(jīng)炎。在某些實(shí)施方案中，該炎性或自身免疫病癥為克拉伯病。在某些實(shí)施方案中，該炎性或自身免疫病癥為糖尿病視網(wǎng)膜病變。在某些實(shí)施方案中，該炎性或自身免疫病癥為克羅恩病。在某些實(shí)施方案中，該炎性或自身免疫病癥為急性肺損傷。

在某些實(shí)施方案中，本文公開了一種用于由未受刺激的間充質(zhì)干細(xì)胞群體產(chǎn)生免疫極化的間充質(zhì)干細(xì)胞群體的方法，該方法包括使未受刺激的間充質(zhì)干細(xì)胞群體與組合物相接觸，該組合物包含：toll樣受體4(tlr4)配體、紅細(xì)胞生成素和低氧或低氧模擬物，其中該免疫極化的間充質(zhì)干細(xì)胞群體具有以促炎或免疫抑制介質(zhì)的表達(dá)為標(biāo)志的促炎特性。在某些實(shí)施方案中，該tlr4配體為脂多糖(lps)。在某些實(shí)施方案中，tlr4配體為氨基烷基氨基葡糖苷4-磷酸酯。在某些實(shí)施方案中，紅細(xì)胞生成素以1ng/ml的濃度存在。在某些實(shí)施方案中，該低氧模擬物為氯化鈷。在某些實(shí)施方案中，該氯化鈷以5μm至500μm的濃度存在。在某些實(shí)施方案中，該組合物進(jìn)一步包含干擾素。在某些實(shí)施方案中，該組合物進(jìn)一步包含腫瘤壞死因子α(tnfα)。在某些實(shí)施方案中，該組合物不包含人或動(dòng)物來(lái)源的血清。在某些實(shí)施方案中，該組合物為濃縮液。在某些實(shí)施方案中，該未受刺激的間充質(zhì)干細(xì)胞群體與toll樣受體4配體、紅細(xì)胞生成素和低氧或低氧模擬物同時(shí)接觸。在某些實(shí)施方案中，該組合物與該未受刺激的間充質(zhì)干細(xì)胞群體相接觸至少30分鐘但少于8小時(shí)。在某些實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括在rna或蛋白質(zhì)水平上監(jiān)測(cè)tnfsf10(trail)的表達(dá)。在某些實(shí)施方案中，本文提供了通過該方法處理的間充質(zhì)干細(xì)胞群體。在某些實(shí)施方案中，本文提供了通過該方法處理的人間充質(zhì)干細(xì)胞群體。在某些實(shí)施方案中，本文提供了通過該方法處理的犬、貓或馬的間充質(zhì)干細(xì)胞群體。在某些實(shí)施方案中，本文提供了通過該方法處理的間充質(zhì)干細(xì)胞群體，其中該間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源于多能干細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，本文提供了通過該方法處理的間充質(zhì)干細(xì)胞群體，其中該細(xì)胞以與未受刺激的間充質(zhì)干細(xì)胞群體相比增加的tnfsf10(trail)mrna表達(dá)為標(biāo)志。在某些實(shí)施方案中，本文提供了包含通過該方法處理的間充質(zhì)干細(xì)胞群體的用于治療疾病的組合物，其中該疾病為癌癥。在某些實(shí)施方案中，該癌癥為卵巢癌。在某些實(shí)施方案中，該癌癥為葡萄膜黑色素瘤。在某些實(shí)施方案中，本文提供了包含通過該方法處理的間充質(zhì)干細(xì)胞群體的用于治療疾病的組合物，其中該疾病為病毒性病況。在某些實(shí)施方案中，本文提供了包含通過該方法處理的間充質(zhì)干細(xì)胞群體的用于治療疾病的組合物，其中該疾病為細(xì)菌感染。

發(fā)明的效用

對(duì)于用于誘導(dǎo)、激活或引發(fā)來(lái)源于多種成體組織的均勻msc群體——干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞、骨髓基質(zhì)細(xì)胞、多能基質(zhì)細(xì)胞、多能干細(xì)胞——的改進(jìn)的治療方法和改進(jìn)的細(xì)胞培養(yǎng)方法以及培養(yǎng)基存在需要。msc的臨床應(yīng)用需要可重現(xiàn)的細(xì)胞培養(yǎng)方法和細(xì)胞擴(kuò)充方法，該方法提供足夠數(shù)量的合適質(zhì)量且一致的治療益處的細(xì)胞。不同的培養(yǎng)基和方法已取得不同程度的成功。仍然需要進(jìn)一步改進(jìn)msc培養(yǎng)基和方法，以確保獲得在具有安全且一致可重現(xiàn)的治療效果的基于細(xì)胞的治療中使用的引發(fā)、激活或誘導(dǎo)的細(xì)胞的擴(kuò)大產(chǎn)量。

在疾病的臨床前模型中已證實(shí)了誘導(dǎo)、激活或引發(fā)的msc相對(duì)于未誘導(dǎo)的常規(guī)msc的效力或治療益處?？寡渍T導(dǎo)的msc治療以相對(duì)于傳統(tǒng)msc治療顯著改進(jìn)的方式減輕痛苦的糖尿病性周圍神經(jīng)病變、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、炎性腸病和急性肺損傷的模型中的疼痛和炎癥。此外，抗炎誘導(dǎo)的msc治療改善多發(fā)性硬化(eae)和克拉伯病的臨床前模型中的臨床評(píng)分、步態(tài)和運(yùn)動(dòng)功能。在鼠免疫活性的卵巢癌模型中，基于促免疫抗腫瘤誘導(dǎo)的msc細(xì)胞的免疫療法導(dǎo)致腫瘤生長(zhǎng)和擴(kuò)散的減弱，而常規(guī)msc治療則促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)和擴(kuò)散。

發(fā)明的科學(xué)依據(jù)

刺激特定的toll樣受體(tlr)影響msc的免疫調(diào)節(jié)反應(yīng)。toll樣受體識(shí)別“危險(xiǎn)”信號(hào)，并且它們的激活導(dǎo)致動(dòng)員先天性和適應(yīng)性宿主免疫細(xì)胞的有意義的細(xì)胞和系統(tǒng)響應(yīng)。觸發(fā)tlr的危險(xiǎn)信號(hào)在大多數(shù)組織病理之后釋放。因?yàn)槲ｋU(xiǎn)信號(hào)將免疫細(xì)胞募集至損傷部位，所以發(fā)明人推斷msc可能以類似的方式被募集。發(fā)明人觀察到，msc表達(dá)若干種tlr(例如，本領(lǐng)域已知的tlr3和tlr4)，并且它們的遷移、侵襲和免疫調(diào)節(jié)因子之分泌受特定的tlr-激動(dòng)劑參與的強(qiáng)烈影響。特別地，發(fā)明人觀察了在通過低水平、短期tlr引發(fā)方案刺激tlr3(當(dāng)與tlr4相比時(shí))之后的msc的多種后果?；谶@些發(fā)現(xiàn)，發(fā)明人提出了一種從單核細(xì)胞文獻(xiàn)中得到其線索的msc的新范例。具體地，該msc可通過下游tlr向分類為msc1和msc2的兩種同源作用的表型發(fā)信號(hào)而得以極化(誘導(dǎo)、激活或引發(fā))。tlr4引發(fā)的msc或msc1大部分表達(dá)促免疫炎性介質(zhì)，而tlr3引發(fā)的msc或msc2大部分表達(dá)抗炎或免疫抑制介質(zhì)。此外，發(fā)明人證實(shí)，tlr引發(fā)的msc與外周血單核細(xì)胞(pbmc)的同種異體(非自體)共培養(yǎng)可預(yù)測(cè)地導(dǎo)致在msc2共培養(yǎng)之后抑制t淋巴細(xì)胞激活以及在與msc1共培養(yǎng)時(shí)允許t淋巴細(xì)胞激活。msc通過tlr4激活而誘導(dǎo)為促免疫msc1表型或通過tlr3激活而誘導(dǎo)為抗炎msc2表型確保獲得一致且確定的細(xì)胞，這樣通過提供用于基于細(xì)胞的治療應(yīng)用的確定且可預(yù)測(cè)的細(xì)胞來(lái)解決行業(yè)難題。

紅細(xì)胞生成素也被稱為epo，是一種控制紅細(xì)胞生成或紅血細(xì)胞產(chǎn)生的糖蛋白激素。它是骨髓中紅細(xì)胞(紅血細(xì)胞)前體的細(xì)胞因子或細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)分子。人epo具有34kda的分子量，并且也被稱為促紅細(xì)胞生成素或促紅素。epo由腎臟中與小管周毛細(xì)血管和管狀上皮小管密切相關(guān)的間質(zhì)成纖維細(xì)胞產(chǎn)生，以及在肝臟的竇周細(xì)胞中產(chǎn)生。雖然肝臟產(chǎn)生在發(fā)育早期(胎兒和圍產(chǎn)期)占主導(dǎo)地位，但腎臟是成體中主要的epo產(chǎn)生部位。除了紅細(xì)胞生成之外，紅細(xì)胞生成素還具有其他已知的生物學(xué)功能。例如，它通過提供促存活抗凋亡(程序性細(xì)胞死亡)信號(hào)在腦對(duì)神經(jīng)元損傷的反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。epo還參與傷口愈合過程。合成的紅細(xì)胞生成素也通過重組dna技術(shù)在細(xì)胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生。此外，存在具有多種糖基化模式的若干種不同的藥物epo樣藥劑，并且被統(tǒng)稱為紅細(xì)胞生成刺激劑(esa)。epo在本發(fā)明中作為一種手段而用來(lái)防止過早細(xì)胞死亡和延長(zhǎng)在基于細(xì)胞的治療中使用的產(chǎn)生的引發(fā)、激活或誘導(dǎo)的細(xì)胞的存活。

始終如一的氧供應(yīng)是影響細(xì)胞生物學(xué)的所有主要方面(包括存活、增殖、分化和遷移)的重要因素。通常，哺乳動(dòng)物細(xì)胞(非干細(xì)胞)需要始終如一的氧供應(yīng)來(lái)維持強(qiáng)大的能量產(chǎn)生以及保持正常的細(xì)胞功能和細(xì)胞存活。相反，哺乳動(dòng)物干細(xì)胞顯示在骨髓的低氧環(huán)境(氧含量的范圍為0.5％至7％)中的生長(zhǎng)和存留。若干項(xiàng)研究已表明，低氧環(huán)境是維持骨髓中干細(xì)胞的增殖和自我更新能力所需的。特別地，即使在短期培養(yǎng)msc之后，降低氧含量的作用已被描述為改善其在基于細(xì)胞的治療中的移植能力的通用方法。低氧環(huán)境在本發(fā)明中作為一種手段而用來(lái)維持在基于細(xì)胞的治療中使用的產(chǎn)生的引發(fā)、激活或誘導(dǎo)的細(xì)胞的自我更新和增殖潛能。

定義和優(yōu)選值

為了清楚的理解，在此處以及必要時(shí)還在本文各處定義術(shù)語(yǔ)并強(qiáng)調(diào)優(yōu)選值。

術(shù)語(yǔ)“癌癥”意指由身體一部分中的細(xì)胞不受控制的分裂引起的任何疾病。癌癥包括但不限于白血病、淋巴瘤、黑色素瘤、癌、肉瘤、腺瘤或由遺傳、環(huán)境或隨機(jī)機(jī)制引起的任何其他惡性腫瘤或瘤。

術(shù)語(yǔ)“干細(xì)胞”意指能夠產(chǎn)生多種不同類型細(xì)胞的細(xì)胞。術(shù)語(yǔ)“間充質(zhì)干細(xì)胞”或“msc”意指最初來(lái)源于間充質(zhì)的干細(xì)胞。該術(shù)語(yǔ)是指能夠分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞或肌細(xì)胞中的至少兩種或更多種的細(xì)胞。msc可以從任何類型的成體組織中分離出。通常，msc從骨髓、脂肪組織、臍帶或外周血中分離出。在本發(fā)明的優(yōu)選方面，msc從骨髓或(本身從脂肪組織中得到的)脂肪抽吸物中獲得。

術(shù)語(yǔ)“多能”和供替代的術(shù)語(yǔ)“多潛能”意指能夠產(chǎn)生不同組織譜系的多種細(xì)胞類型的細(xì)胞。術(shù)語(yǔ)“多能”或“多潛能”還包括誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞或誘導(dǎo)的多潛能干細(xì)胞，或已使用任何化學(xué)或遺傳方法誘導(dǎo)為多能階段的細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容的多能或多潛能干細(xì)胞為間充質(zhì)干細(xì)胞。

本公開內(nèi)容的細(xì)胞來(lái)源于包括人、靈長(zhǎng)類、狗、貓、馬、牛、山羊、綿羊和豬在內(nèi)的任何哺乳動(dòng)物物種的任何細(xì)胞。該細(xì)胞可以是原代細(xì)胞或永生化細(xì)胞系。

術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞療法”或“基于細(xì)胞的治療”意指移植人或動(dòng)物細(xì)胞以預(yù)防、治療或改善與疾病或病癥相關(guān)的一種或多種癥狀，例如但不限于代替或修復(fù)受損的組織或器官，調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)以及減少炎癥癥狀和癌癥。

術(shù)語(yǔ)“受試者”是指動(dòng)物，優(yōu)選包括非靈長(zhǎng)類(例如，牛、豬、馬、貓、狗、大鼠或小鼠)或靈長(zhǎng)類(例如，猴子或人)的哺乳動(dòng)物。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，該受試者是人。

術(shù)語(yǔ)“治療”和“處理”在直接用于患者或受試者時(shí)意指改善與病癥相關(guān)的一種或多種癥狀，該病癥包括但不限于任何癌癥、任何腫瘤或瘤、炎性病癥、自身免疫病或免疫介導(dǎo)的疾病，包括移植器官和組織的排斥反應(yīng)，其中該改善因?qū)⒈景l(fā)明所產(chǎn)生的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞或包含本發(fā)明所產(chǎn)生的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞的藥物組合物施用于需要這種治療的受試者而得到。

術(shù)語(yǔ)“未受刺激的”是指未經(jīng)本公開內(nèi)容的方法處理、極化或誘導(dǎo)的細(xì)胞群體。新鮮或冷凍的原代分離的間充質(zhì)干細(xì)胞被認(rèn)為是未受刺激的。先前已用缺少toll樣受體配體、紅細(xì)胞生成素、低氧或低氧模擬物中至少一種的化合物或組合物處理的細(xì)胞被認(rèn)為是未受刺激的。

術(shù)語(yǔ)“修復(fù)”在直接用于受損的組織時(shí)意指通過直接機(jī)制如受損組織的再生，以及通過間接機(jī)制，例如，減少炎癥從而使組織能夠形成來(lái)改善這樣的損傷。

“同種異體的”意指來(lái)自相同物種的不同個(gè)體。當(dāng)個(gè)體在一個(gè)或多個(gè)基因座處具有不同的基因時(shí)，則認(rèn)為它們是同種異體的。相反，“自體的”意指來(lái)自同一個(gè)體。

術(shù)語(yǔ)“免疫疾病”是指以受試者的免疫反應(yīng)引起的細(xì)胞、組織和/或器官損傷為特征的受試者的病況。

術(shù)語(yǔ)“自身免疫病癥”是指以受試者對(duì)其自身的細(xì)胞、組織和/或器官的免疫反應(yīng)所引起的細(xì)胞、組織和/或器官損傷為特征的受試者的病況?？刹捎帽景l(fā)明所產(chǎn)生的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞來(lái)治療的自身免疫疾病的說(shuō)明性、非限制性實(shí)例包括斑禿、強(qiáng)直性脊柱炎、抗磷脂綜合征、自身免疫性艾迪生病、腎上腺自身免疫性疾病、自身免疫性溶血性貧血、自身免疫性肝炎、自身免疫性卵巢炎和睪丸炎、自身免疫性血小板減少癥、白塞氏病、大皰性類天皰瘡、心肌病、乳糜瀉-皮炎(celiacsprue-dermatitis)、慢性疲勞免疫功能障礙綜合征(cf1ds)、慢性炎癥性脫髓鞘性多發(fā)性神經(jīng)病、churg-strauss綜合征、瘢痕性類天皰瘡、crest綜合征、冷凝集素病、盤狀狼瘡、自發(fā)混合性冷球蛋白血癥、纖維肌痛-纖維肌炎、腎小球腎炎、格雷夫斯病、格林巴利綜合征、橋本甲狀腺炎、特發(fā)性肺纖維化、特發(fā)性血小板減少性紫癜(itp)、iga神經(jīng)病、幼年型關(guān)節(jié)炎、扁平苔蘚、梅尼埃病、混合性結(jié)締組織病、多發(fā)性硬化、1型或免疫介導(dǎo)的糖尿病、重癥肌無(wú)力、尋常型天皰瘡、惡性貧血、結(jié)節(jié)性多動(dòng)脈炎、多軟骨炎、多腺性綜合征、風(fēng)濕性多肌痛、多肌炎和皮肌炎、原發(fā)性無(wú)丙種球蛋白血癥、原發(fā)性膽汁性肝硬化、銀屑病、銀屑病關(guān)節(jié)炎、雷諾現(xiàn)象、賴特爾綜合征、結(jié)節(jié)病、硬皮病、進(jìn)行性系統(tǒng)性硬化病、舍格倫綜合征、古德帕斯丘綜合征、僵人綜合征、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、紅斑狼瘡、大動(dòng)脈炎、顳動(dòng)脈炎/巨細(xì)胞性動(dòng)脈炎、潰瘍性結(jié)腸炎、葡萄膜炎、血管炎如皰疹樣皮炎脈管炎、白癜風(fēng)、韋格納肉芽腫病、抗腎小球基膜疾病、抗磷脂綜合征、神經(jīng)系統(tǒng)自身免疫疾病、家族性地中海熱、蘭-伊肌無(wú)力綜合征、交感性眼炎、多內(nèi)分泌腺病、銀屑病等。

“免疫病癥”包括自身免疫疾病和免疫介導(dǎo)的炎性疾病。

“免疫介導(dǎo)的炎性疾病”意指以正常免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)異常導(dǎo)致、相關(guān)或引發(fā)的慢性或急性炎癥為特征的任何疾病：例如，克羅恩病、1型糖尿病、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、炎性腸病、銀屑病、銀屑病關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性脊柱炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、橋本病、移植物抗宿主病、舍格倫綜合征、惡性貧血、艾迪生病、硬皮病、古德帕斯丘綜合征、潰瘍性結(jié)腸炎、自身免疫性溶血性貧血、不育、重癥肌無(wú)力、多發(fā)性硬化、巴澤多病、血小板減少性紫癜、格林巴利綜合征、變態(tài)反應(yīng)、哮喘、特應(yīng)性疾病、動(dòng)脈硬化、心肌炎、心肌病、腎小球腎炎、發(fā)育不良性貧血和器官移植后的排斥反應(yīng)。

術(shù)語(yǔ)“免疫調(diào)節(jié)的”是指免疫系統(tǒng)的一種或多種生物活性的改變、加強(qiáng)、抑制或減少，它包括但不限于免疫應(yīng)答的下調(diào)、免疫應(yīng)答的增加以及由細(xì)胞因子譜、細(xì)胞毒素活性和抗體產(chǎn)生量的變化及其對(duì)免疫和免疫相關(guān)細(xì)胞的影響介導(dǎo)的炎性狀態(tài)的變化。

術(shù)語(yǔ)“炎性病癥”是指以炎癥為特征的受試者的病況，例如，慢性炎癥。炎性病癥的說(shuō)明性、非限制性實(shí)例包括但不限于，急性視神經(jīng)炎、糖尿病神經(jīng)病、克拉伯病、急性肺損傷、克羅恩病、乳糜瀉、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(ra)、炎性腸病(ibd)、哮喘、腦炎、慢性阻塞性肺疾病(copd)、炎性骨質(zhì)溶解、變態(tài)反應(yīng)性病癥、感染性休克、肺纖維化(例如，特發(fā)性肺纖維化)、血管炎(vacultides)(例如，結(jié)節(jié)性多動(dòng)脈炎、韋格納肉芽腫病、高安動(dòng)脈炎、顳動(dòng)脈炎和淋巴瘤樣肉芽腫病)、創(chuàng)傷后血管成形術(shù)(例如，血管成形術(shù)后的再狹窄)、未分化脊柱關(guān)節(jié)病、未分化關(guān)節(jié)病、關(guān)節(jié)炎、炎性骨質(zhì)溶解、慢性肝炎和由慢性病毒或細(xì)菌感染導(dǎo)致的慢性炎癥。

術(shù)語(yǔ)“病毒性病況”是指由病毒引起的任何疾病。合適的疾病包括但不限于：流感、腺病毒感染、呼吸道合胞體疾病、鼻病毒感染、單純皰疹、水痘(水痘(varicella))、麻疹(麻疹(rubeola))、德國(guó)麻疹(風(fēng)疹(rubella))、流行性腮腺炎(流行性腮腺炎(epidemicparotitis))、天花(天花(variola))、川崎病、黃熱病、登革熱、甲型肝炎、乙型肝炎、非甲非乙型肝炎、病毒性胃腸炎、病毒性發(fā)熱、巨細(xì)胞病毒病、艾滋病(hiv)、狂犬病、脊髓灰質(zhì)炎、埃博拉病毒、出血熱、eb病毒以及包括由引起任何前述疾病的病毒所引起的癌癥的疾病。

術(shù)語(yǔ)“細(xì)菌感染”是指由醫(yī)學(xué)相關(guān)細(xì)菌引起的任何感染，其包括但不限于百日咳、麻風(fēng)、結(jié)核病、中毒性休克綜合征、食物中毒、沙門氏菌屬、大腸桿菌中毒、金黃色葡萄球菌、艱難梭菌、敗血癥、萊姆病、霍亂、痢疾等等。

“分離的細(xì)胞群體”意指從人體或動(dòng)物體中分離出的細(xì)胞群體，它基本上不含通常在體內(nèi)或體外與該細(xì)胞群體相關(guān)的一種或多種其他細(xì)胞群體。

術(shù)語(yǔ)“配體誘導(dǎo)物”意指導(dǎo)致這種配體的產(chǎn)生量增加的一種藥劑或多種藥劑。toll樣受體(tlr)配體的配體誘導(dǎo)物將產(chǎn)生增加的tlr配體，并且因此實(shí)質(zhì)上等同于tlr配體本身。

術(shù)語(yǔ)“mhc”(主要組織相容性復(fù)合物)是指編碼細(xì)胞表面抗原呈遞蛋白的基因的子集。在人體中，這些基因被稱為人白細(xì)胞抗原(hla)基因?？s寫mhc或hla可互換使用。

術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞的群體”意指大于1但至少為1x10³個(gè)細(xì)胞、至少1x10⁴個(gè)細(xì)胞、至少1x10⁵個(gè)細(xì)胞、至少1x10⁶個(gè)細(xì)胞、至少1x10⁷個(gè)細(xì)胞、至少1x10⁸個(gè)細(xì)胞或至少1x10⁹個(gè)或更多個(gè)細(xì)胞的任何數(shù)目的細(xì)胞。細(xì)胞的群體還指采用旨在培養(yǎng)大量細(xì)胞的生物反應(yīng)器或其他工業(yè)方法生長(zhǎng)的批量形成的細(xì)胞。

在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，在原始細(xì)胞群體中至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％或至少95％的干細(xì)胞(細(xì)胞數(shù)目％)將會(huì)是未分化的msc。

術(shù)語(yǔ)“顯著表達(dá)”或其等同術(shù)語(yǔ)“陽(yáng)性”和“+”當(dāng)針對(duì)細(xì)胞表面標(biāo)志物使用時(shí)意指在細(xì)胞群體中超過20％，優(yōu)選超過30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％，或甚至100％的細(xì)胞表達(dá)該細(xì)胞表面標(biāo)志物。

例如，細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá)可使用常規(guī)方法和裝置(例如，與商購(gòu)可得抗體和本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方案一起使用的beckmancoulterepicsxlfacs系統(tǒng))通過針對(duì)特定細(xì)胞表面標(biāo)志物的流式細(xì)胞術(shù)來(lái)測(cè)定，其顯示比使用常規(guī)方法和裝置的背景信號(hào)更高的流式細(xì)胞術(shù)中特定細(xì)胞表面標(biāo)志物的信號(hào)。將該背景信號(hào)定義為通過與用來(lái)在常規(guī)facs分析中檢測(cè)每一種表面標(biāo)志物的特異性抗體相同的同種型的非特異性抗體給出的信號(hào)強(qiáng)度。對(duì)于被認(rèn)為是陽(yáng)性的標(biāo)志物，所觀察到的特定信號(hào)比使用常規(guī)方法和裝置的背景信號(hào)強(qiáng)度要強(qiáng)20％，優(yōu)選強(qiáng)30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、500％、1000％、5000％、10000％或以上。此外，針對(duì)所述細(xì)胞表面標(biāo)志物的商購(gòu)可得和已知的單克隆抗體(例如，細(xì)胞受體和跨膜蛋白質(zhì))可用來(lái)鑒定相關(guān)細(xì)胞。

mrna的表達(dá)通過任何合適的技術(shù)來(lái)測(cè)定，該技術(shù)包括但不限于基因表達(dá)陣列(基因芯片)、mrna-seq、northern印跡法或聚合酶鏈反應(yīng)(pcr)，包括定量pcr(qpcr)方法，它包括逆轉(zhuǎn)錄酶的使用。qpcr方法包括但不限于：基于探針的定量，例如基于染料的定量，例如sybrgreen；數(shù)字pcr。qpcr方法可以是利用絕對(duì)定量方法的一種方法，或是需要相對(duì)于管家基因如肌動(dòng)蛋白、gapdh或核糖體亞基來(lái)歸一化的相對(duì)定量方法。

援引并入

本說(shuō)明書中提及的所有出版物、專利和專利申請(qǐng)均通過引用并入本文，其程度如同特別且單獨(dú)地指出每一個(gè)單獨(dú)的出版物、專利或?qū)＠暾?qǐng)均通過引用并入。

附圖說(shuō)明

圖1示出了利用pcr陣列由采用tlr3配體聚(i:c)極化為具有抗炎特性的msc所生成的基因表達(dá)數(shù)據(jù)?；疑甘净虮磉_(dá)的至少兩倍誘導(dǎo)；黑色指示基因表達(dá)減少為二分之一；粗框指示上調(diào)超過兩倍且選擇用于在圖2中進(jìn)一步驗(yàn)證的基因(除了至少減少為二分之一的pias2以外)。

圖2示出了利用qpcr驗(yàn)證來(lái)自圖1的實(shí)驗(yàn)的所選基因(a和b)。誤差條指示sem。

圖3示出了在用tlr4配體(msc1)或tlr4配體加上epo和氯化鈷(msc1*)處理之后msc細(xì)胞中il-6和il-8分泌的誘導(dǎo)。

圖4示出了在用tlr3配體(msc2)或tlr3配體加上epo和氯化鈷(msc2*)處理之后，msc細(xì)胞中ccl5和cxcl10分泌的誘導(dǎo)。

圖5示出了在用tlr4配體(無(wú)*)或tlr4配體加上epo和氯化鈷(有*)處理之后，根據(jù)來(lái)自不同的人供體的msc細(xì)胞中tnfsf10(trail)的表達(dá)，msc1表型的誘導(dǎo)。

圖6示出了在用tlr3配體(無(wú)*)或tlr3配體加上epo和氯化鈷(有*)處理之后，根據(jù)來(lái)自不同的人供體的msc細(xì)胞中cxcl9的表達(dá)，msc2表型的誘導(dǎo)。

圖7示出了在用tlr4配體(msc1)或tlr4配體加上epo和氯化鈷(msc1*)處理之后，來(lái)自msc的msc細(xì)胞中tnfsf10(trail)表達(dá)誘導(dǎo)的時(shí)間進(jìn)程。

圖8示出了在用tlr3配體(msc2)或tlr3配體加上epo和氯化鈷(msc2*)處理之后，來(lái)自msc的msc細(xì)胞中cxcl9表達(dá)誘導(dǎo)的時(shí)間進(jìn)程。

圖9示出了與已用tlr4配體(msc1)、tlr4配體加上epo和氯化鈷(msc1*)、tlr3配體(msc2)以及tlr3配體加上epo和氯化鈷(msc2*)刺激的msc相比，未受刺激的msc(陰性對(duì)照)的transwell遷移測(cè)定。誤差條指示sem。

圖10示出了與已用tlr4配體(msc1)、tlr4配體加上epo和氯化鈷(msc1*)、tlr3配體(msc2)以及tlr3配體加上epo和氯化鈷(msc2*)刺激的msc相比，未受刺激的msc(陰性對(duì)照)的細(xì)胞增殖/活力測(cè)定。誤差條指示sem。

圖11示出了測(cè)量tnfsf10(trail)表達(dá)的qpcr測(cè)定的驗(yàn)證，其示出了tnfsf10(trail)引物pcr擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠。

圖12(a)示出了在極化為msc2的msc中cxcl9表達(dá)的時(shí)間進(jìn)程；(b)示出了cxcl9引物pcr擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明的實(shí)施采用——除了本發(fā)明自身以外——細(xì)胞培養(yǎng)、分子生物學(xué)和微生物學(xué)的常規(guī)技術(shù)，它們?cè)诒绢I(lǐng)域技術(shù)人員的技能范圍內(nèi)。

本發(fā)明提供了用于間充質(zhì)干細(xì)胞群體的誘導(dǎo)、激活、極化或引發(fā)培養(yǎng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基，其包含與紅細(xì)胞生成素(epo)以及低氧或低氧模擬物暴露組合的toll樣受體(tlr)配體或tlr配體誘導(dǎo)物，加上本領(lǐng)域已知和本文描述的細(xì)胞培養(yǎng)基的附加標(biāo)準(zhǔn)組分。

本發(fā)明還提供了包含與紅細(xì)胞生成素(epo)以及低氧或低氧模擬物暴露組合的toll樣受體(tlr)配體或tlr配體誘導(dǎo)物的培養(yǎng)基誘導(dǎo)補(bǔ)充物，它可添加至其他現(xiàn)有的培養(yǎng)基中。當(dāng)異常組分或異常濃度的其他組分適于特定情況時(shí)，這種補(bǔ)充物可能是合適的。

本發(fā)明還提供了含有本發(fā)明的培養(yǎng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基或培養(yǎng)基誘導(dǎo)補(bǔ)充物的氣密培養(yǎng)容器。

本發(fā)明還提供了用于制備本文公開的培養(yǎng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基的方法，其包括步驟：(a)獲得培養(yǎng)基；和(b)向該培養(yǎng)基中添加與紅細(xì)胞生成素(epo)以及低氧或低氧模擬物暴露組合的toll樣受體(tlr)配體或tlr配體誘導(dǎo)物。

本發(fā)明還提供了包含(a)根據(jù)本發(fā)明的培養(yǎng)基和(b)干細(xì)胞的組合物。

本發(fā)明還提供了含有(a)根據(jù)本發(fā)明的培養(yǎng)基和(b)固體表面的組合物。在某些實(shí)施方案中，固體表面是任何組織培養(yǎng)相容性表面，其包括用于2d細(xì)胞培養(yǎng)的任何大小的組織培養(yǎng)板、燒瓶和瓶子。在某些實(shí)施方案中，固體表面是用于3d培養(yǎng)的細(xì)胞的微載體或任何其他支持基質(zhì)。

本發(fā)明還提供了本發(fā)明的培養(yǎng)基對(duì)于誘導(dǎo)、激活或引發(fā)間充質(zhì)干細(xì)胞群體的用途。

本發(fā)明還提供了用于誘導(dǎo)、激活或引發(fā)間充質(zhì)干細(xì)胞群體的離體方法，其包括：(a)提供間充質(zhì)干細(xì)胞群體；(b)提供本發(fā)明的培養(yǎng)基；(c)使該干細(xì)胞與該培養(yǎng)基相接觸；以及(d)在適當(dāng)?shù)臈l件下培養(yǎng)該細(xì)胞。

本發(fā)明的一方面提供了與紅細(xì)胞生成素以及低氧或低氧模擬物暴露組合的toll樣受體(tlr)配體或tlr配體誘導(dǎo)物在制備細(xì)胞治療藥物中的用途。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明還提供了細(xì)胞治療藥物的制備方法，其包括：(a)提供間充質(zhì)干細(xì)胞群體；(b)提供本發(fā)明的培養(yǎng)基；(c)使該干細(xì)胞與該培養(yǎng)基相接觸；以及(d)在適當(dāng)?shù)臈l件下培養(yǎng)該細(xì)胞。本發(fā)明還提供了包含(a)根據(jù)本發(fā)明的培養(yǎng)基和(b)干細(xì)胞的組合物用于制備細(xì)胞治療藥物的用途。本發(fā)明還提供了包含(a)根據(jù)本發(fā)明的培養(yǎng)基和(b)固體表面的組合物用于制備細(xì)胞治療藥物的用途。

所述藥物用于治療、修復(fù)、預(yù)防和/或改善受損組織，或一種或多種癥狀，該癥狀與炎性和/或免疫病癥例如但不限于自身免疫疾病、炎性病癥和免疫介導(dǎo)的疾病(包括移植器官和組織的排斥反應(yīng)，以及癌癥)相關(guān)。本發(fā)明的細(xì)胞治療藥物包含預(yù)防上或治療上有效量的干細(xì)胞和藥物載體。特別優(yōu)選間充質(zhì)來(lái)源的干細(xì)胞。這些細(xì)胞類型中的每一種的劑量和劑量方案的實(shí)例是本領(lǐng)域已知的。合適的藥物載體是本領(lǐng)域已知的，并且優(yōu)選由美國(guó)聯(lián)邦或州政府的管理機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)，或在美國(guó)藥典或歐洲藥典或其他公認(rèn)藥典中列出的用于動(dòng)物且特別用于人的那些藥物載體。術(shù)語(yǔ)“載體”是指與治療劑一起施用的稀釋劑、佐劑、賦形劑或媒介物。如果需要的話，該組合物還可以含有少量的ph緩沖劑。合適的藥物載體的實(shí)例由ewmartin在“remington’spharmaceuticalsciences”中描述。此類組合物將含有預(yù)防上或治療上有效量的優(yōu)選純化形式的預(yù)防劑或治療劑以及合適量的載體，以便提供適于施用于受試者的形式。該制劑應(yīng)適合于施用方式。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，該藥物是無(wú)菌的且為適合于施用于受試者的形式，該受試者優(yōu)選動(dòng)物受試者，更優(yōu)選哺乳動(dòng)物受試者，最優(yōu)選人類受試者。

在某些實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容的方法、細(xì)胞和誘導(dǎo)培養(yǎng)基用于治療急性疼痛或慢性疼痛。在某些實(shí)施方案中，該疼痛與特定的診斷無(wú)關(guān)。在某些實(shí)施方案中，該疼痛與創(chuàng)傷相關(guān)。在某些實(shí)施方案中，該疼痛為背痛。在某些實(shí)施方案中，該疼痛與椎間盤突出或退行性椎間盤病相關(guān)。在某些實(shí)施方案中，該疼痛為神經(jīng)性的。在某些實(shí)施方案中，該疼痛由坐骨神經(jīng)痛引起。

在某些實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容的方法、細(xì)胞和誘導(dǎo)培養(yǎng)基用于治療癌癥。在某些實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容的方法、細(xì)胞和誘導(dǎo)培養(yǎng)基用于治療腫瘤。在某些實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容的方法、細(xì)胞和誘導(dǎo)培養(yǎng)基用于加強(qiáng)癌癥的治療。在某些實(shí)施方案中，該癌癥為成年急性成淋巴細(xì)胞白血?。粌和毙猿闪馨图?xì)胞白血?。怀赡昙毙运铇影籽。粌和毙运铇影籽?；腎上腺皮質(zhì)癌；與艾滋病有關(guān)的癌癥；與艾滋病有關(guān)的淋巴瘤；肛門癌；闌尾癌；星形細(xì)胞瘤；非典型畸胎瘤/桿狀瘤；基底細(xì)胞癌；膽管癌，肝外；膀胱癌；骨癌、骨肉瘤和惡性纖維組織細(xì)胞瘤；腦干膠質(zhì)瘤；腦瘤；中樞神經(jīng)系統(tǒng)胚胎瘤；星形細(xì)胞瘤；顱咽管瘤；室管膜母細(xì)胞瘤；腦瘤、室管膜瘤；髓母細(xì)胞瘤；髓上皮瘤；中間分化的松果體瘤；幕上原始神經(jīng)外胚層瘤和松果體母細(xì)胞瘤；腦和脊髓腫瘤；乳腺癌；男性乳腺癌；支氣管腫瘤；伯基特淋巴瘤；類癌瘤；中樞神經(jīng)系統(tǒng)非典型畸胎瘤/桿狀瘤；中樞神經(jīng)系統(tǒng)胚胎瘤；中樞神經(jīng)系統(tǒng)(cns)淋巴瘤；原發(fā)性宮頸癌；宮頸癌；兒童癌癥；脊索瘤；慢性淋巴細(xì)胞白血??；慢性髓細(xì)胞源性白血??；慢性骨髓增生性疾病；結(jié)腸癌；結(jié)直腸癌；顱咽管瘤；皮膚t細(xì)胞淋巴瘤；胚胎瘤，中樞神經(jīng)系統(tǒng)；子宮內(nèi)膜癌；室管膜母細(xì)胞瘤；室管膜瘤；食管癌；成感覺神經(jīng)細(xì)胞瘤；尤因肉瘤家族腫瘤；顱外胚細(xì)胞瘤；性腺外生殖細(xì)胞瘤；肝外膽管癌；眼癌，眼內(nèi)黑素瘤；眼癌，視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤；膽囊癌；胃(胃)癌；胃腸道類癌瘤；胃腸道間質(zhì)瘤(gist)；胚細(xì)胞瘤，顱外；生殖細(xì)胞瘤，性腺外；生殖細(xì)胞瘤，卵巢；妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞瘤；膠質(zhì)瘤；多毛細(xì)胞白血病；頭頸癌；心臟癌；成年肝細(xì)胞(肝)癌(原發(fā)性)；肝細(xì)胞(肝)癌；組織細(xì)胞增生癥，朗格漢斯細(xì)胞；成年霍奇金淋巴瘤；兒童霍奇金淋巴瘤；下咽癌；眼內(nèi)黑色素瘤；胰島細(xì)胞瘤(內(nèi)分泌胰腺)；卡波西肉瘤；腎(腎細(xì)胞)癌；腎癌；朗格漢斯細(xì)胞組織細(xì)胞增多癥；喉癌；兒童喉癌；白血病，急性成淋巴細(xì)胞，成年；白血病，急性成淋巴細(xì)胞，兒童；白血病，急性髓樣，成年；白血病，急性髓樣，兒童；慢性淋巴細(xì)胞白血??；慢性髓性白血??；多毛細(xì)胞白血病；唇和口腔癌；成年肝癌(原發(fā)性)；肝癌；非小細(xì)胞肺癌；小細(xì)胞肺癌；與艾滋病有關(guān)的淋巴瘤；伯基特淋巴瘤；皮膚t細(xì)胞淋巴瘤；成年霍奇金淋巴瘤；兒童霍奇金淋巴瘤；成年非霍奇金淋巴瘤；兒童非霍奇金淋巴瘤；原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)(cns)淋巴瘤；瓦爾登斯特倫巨球蛋白血癥；骨的惡性纖維組織細(xì)胞瘤和骨肉瘤；髓母細(xì)胞瘤；髓上皮瘤；黑色素瘤；眼內(nèi)(眼)黑色素瘤；梅克爾細(xì)胞癌；成年惡性間皮瘤；間皮瘤；隱性原發(fā)性的轉(zhuǎn)移性鱗狀頸癌；口腔癌；多發(fā)性內(nèi)分泌瘤形成綜合征；多發(fā)性骨髓瘤/血漿細(xì)胞瘤；真菌??；骨髓增生異常綜合征；骨髓增生異常/骨髓增生性腫瘤；慢性髓性白血病；成年急性髓樣白血?。粌和毙运铇影籽。欢喟l(fā)性骨髓瘤；慢性骨髓增生性疾病；鼻腔和鼻旁竇癌；鼻咽癌；成神經(jīng)細(xì)胞瘤；非霍奇金淋巴瘤，成年；非霍奇金淋巴瘤，兒童；非小細(xì)胞肺癌；口癌；口腔癌，唇和口咽癌；骨肉瘤和骨的惡性纖維組織細(xì)胞瘤；卵巢癌；卵巢上皮癌；卵巢生殖細(xì)胞腫瘤；卵巢低度惡性潛在腫瘤；胰腺癌；胰島細(xì)胞胰腺癌腫瘤；乳頭狀瘤??；鼻旁竇和鼻腔癌；甲狀旁腺癌；陰莖癌；咽癌；中間分化的松果體瘤；垂體瘤；漿細(xì)胞瘤/多發(fā)性骨髓瘤；胸膜肺母細(xì)胞瘤；妊娠和乳腺癌；原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)(cns)淋巴瘤；前列腺癌；直腸癌；腎細(xì)胞(腎)癌；腎盂和輸尿管移行細(xì)胞癌；染色體15變化的呼吸道癌；視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤；橫紋肌肉瘤；唾液腺癌；唾液腺癌；尤因肉瘤家族肉瘤；卡波西肉瘤；成年軟組織肉瘤；兒童軟組織肉瘤；子宮肉瘤；塞澤里綜合征；皮膚癌(非黑色素瘤)；皮膚癌；皮膚癌(黑色素瘤)；梅克爾細(xì)胞皮膚癌；小細(xì)胞肺癌；小腸癌；軟組織肉瘤，成年；軟組織肉瘤，兒童；鱗狀細(xì)胞癌；轉(zhuǎn)移性隱性原發(fā)性的鱗狀頸癌；胃(胃)癌；幕上原始神經(jīng)外胚層瘤；t細(xì)胞淋巴瘤，皮膚；睪丸癌；喉癌；胸腺瘤和胸腺癌；甲狀腺癌；腎盂和輸尿管的移行細(xì)胞癌；妊娠期滋養(yǎng)細(xì)胞瘤；原發(fā)性部位未知的癌；輸尿管和腎盂移行細(xì)胞癌；尿道癌；子宮癌，子宮內(nèi)膜；子宮肉瘤；葡萄膜黑色素瘤；陰道癌；外陰癌；瓦爾登斯特倫巨球蛋白血癥或腎母細(xì)胞瘤。

在某些實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容的方法、細(xì)胞和誘導(dǎo)培養(yǎng)基用于向需要治療癌癥、自身免疫病癥或炎性病癥的受試者施用。在某些實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容的方法、細(xì)胞和誘導(dǎo)培養(yǎng)基包括不同的施用途徑。在某些實(shí)施方案中，該施用途徑為皮下、壁內(nèi)、肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)、瘤內(nèi)、眼內(nèi)、視網(wǎng)膜內(nèi)、玻璃體內(nèi)或顱內(nèi)。

在某些實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容的方法、細(xì)胞和誘導(dǎo)培養(yǎng)基用于向需要治療癌癥、自身免疫病癥或免疫介導(dǎo)的炎性疾病的受試者施用。在某些實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容的方法、細(xì)胞和誘導(dǎo)培養(yǎng)基包括不同的劑量頻率。在某些實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容的細(xì)胞和藥物每日施用一次、每周施用一次、每月施用一次或每年施用一次。在某些實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容的細(xì)胞和方法每日施用兩次、每周施用兩次、每月施用兩次或每年施用兩次。在某些實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容的細(xì)胞和方法每日施用三次、每周施用三次、每月施用三次或每年施用三次。在某些實(shí)施方案中，本公開內(nèi)容的細(xì)胞和方法每日施用四次、每周施用四次、每月施用四次或每年施用四次。在某些實(shí)施方案中，首次治療之后是一年1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12次的維持劑量。在某些實(shí)施方案中，該維持劑量持續(xù)至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10年或更多年。在某些實(shí)施方案中，每劑施用至少1x10⁶個(gè)細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，每劑施用至少2x10⁶個(gè)細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，每劑施用至少3x10⁶個(gè)細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，每劑施用至少4x10⁶個(gè)細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，每劑施用至少5x10⁶個(gè)細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，每劑施用至少6x10⁶個(gè)細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，施用細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，每劑施用至少7x10⁶個(gè)細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，每劑施用至少8x10⁶個(gè)細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，每劑施用至少9x10⁶個(gè)細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，每劑施用至少1x10⁷個(gè)細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，每劑施用至少2x10⁷個(gè)細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，每劑施用至少3x10⁷個(gè)細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，每劑施用至少4x10⁷個(gè)細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，每劑施用至少5x10⁷個(gè)細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，每劑施用至少6x10⁷個(gè)細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，每劑施用至少7x10⁷個(gè)細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，每劑施用至少8x10⁷個(gè)細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，每劑施用至少9x10⁷個(gè)細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，每劑施用至少1x10⁸個(gè)細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，每劑施用至少2x10⁸個(gè)細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，每劑施用至少3x10⁸個(gè)細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，每劑施用至少4x10⁸個(gè)細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，每劑施用至少5x10⁸個(gè)細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，每劑施用至少6x10⁸個(gè)細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，每劑施用至少7x10⁸個(gè)細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，每劑施用至少8x10⁸個(gè)細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，每劑施用至少9x10⁸個(gè)細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，每劑施用至少1x10⁹個(gè)細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，每劑施用至少2x10⁹個(gè)細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，每劑施用至少3x10⁹個(gè)細(xì)胞。

本發(fā)明的藥物可以是各種形式。這些形式包括例如，半固體和液體劑型，如凍干制劑、液體溶液或懸浮液，可注射和可輸注溶液等，該藥物優(yōu)選為可注射的。

在某些實(shí)施方案中，藥物用于治療或修復(fù)受損組織(優(yōu)選間充質(zhì)組織)，和/或用于治療、調(diào)節(jié)、預(yù)防和/或改善與炎性和/或免疫病癥相關(guān)的一種或多種癥狀。因此，本發(fā)明的方法和細(xì)胞用于治療以所述癥狀中的任一種或全部為特征的任何病癥。此類病癥的代表性而非窮盡的清單提供于定義部分。特別優(yōu)選用于治療免疫介導(dǎo)的炎性疾病的藥物。進(jìn)一步優(yōu)選用于治療糖尿病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(ra)、炎性腸病(ibd，包括克羅恩病和/或潰瘍性結(jié)腸炎)和多發(fā)性硬化(ms)的藥物。本發(fā)明還提供與紅細(xì)胞生成素以及暴露于用于間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)的低氧或低氧模擬物組合的toll樣受體(tlr)配體或tlr配體誘導(dǎo)物的用途。

本發(fā)明的培養(yǎng)基、補(bǔ)充物和組合物的特定成分以及成分的比例可根據(jù)特定需要和應(yīng)用而變化。同樣地，本發(fā)明的方法的精確步驟可根據(jù)特定需要和應(yīng)用而變化。根據(jù)本發(fā)明的培養(yǎng)基、補(bǔ)充物、方法、組合物和用途可通過常規(guī)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化。例如，如果所需結(jié)果為抗炎性治療效果，則培養(yǎng)基、補(bǔ)充物或組合物將具體地含有與紅細(xì)胞生成素以及低氧或低氧模擬物(氯化鈷或去鐵胺)暴露組合的tlr3配體或tlr配體誘導(dǎo)物，相反，如果所需結(jié)果為促免疫治療效果，則培養(yǎng)基、補(bǔ)充物或組合物將具體地含有與紅細(xì)胞生成素以及低氧或低氧模擬物暴露組合的tlr4配體或tlr配體誘導(dǎo)物。本文所述成分中每一種的量可獨(dú)立于其他成分通過常規(guī)優(yōu)化進(jìn)行優(yōu)化，或可添加或去除一種或多種成分?？赏ㄟ^將培養(yǎng)基與已知的培養(yǎng)基或方法一起或代替其進(jìn)行測(cè)試來(lái)測(cè)試該培養(yǎng)基支持誘導(dǎo)、激活或引發(fā)間充質(zhì)干細(xì)胞的能力。以下更詳細(xì)地描述了本發(fā)明的培養(yǎng)基、補(bǔ)充物、方法、組合物和用途。

本發(fā)明的誘導(dǎo)培養(yǎng)基包含與紅細(xì)胞生成素以及低氧或低氧模擬物暴露組合的toll樣受體(tlr)配體或tlr配體誘導(dǎo)物。在一方面，本發(fā)明的誘導(dǎo)培養(yǎng)基包含toll樣受體(tlr)配體或tlr配體誘導(dǎo)物。在備選方面，本發(fā)明的誘導(dǎo)培養(yǎng)基包含紅細(xì)胞生成素以及低氧或低氧模擬物暴露。在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明的誘導(dǎo)培養(yǎng)基包含與紅細(xì)胞生成素以及低氧或低氧模擬物暴露組合的toll樣受體(tlr)配體或tlr配體誘導(dǎo)物。在某些實(shí)施方案中，tlr配體為tlr4配體。在某些實(shí)施方案中，tlr配體為tlr3配體。

本發(fā)明的誘導(dǎo)培養(yǎng)基可包含toll樣受體(tlr)配體或tlr配體誘導(dǎo)物與紅細(xì)胞生成素(epo)以及低氧或低氧模擬物暴露組合的兩種或更多種、三種或更多種、4、5、6、7、8、9、10種或更多種組合。

本發(fā)明的誘導(dǎo)培養(yǎng)基可包含與約0.5mu/ml至約100mu/ml紅細(xì)胞生成素(epo)以及暴露于約0.5％至約2％氧條件(低氧)或濃度為約10微摩爾至約1mm的低氧模擬物如氯化鈷或去鐵胺組合的約0.10皮摩爾(pm)至約100毫摩爾(mm)的tlr配體或tlr配體誘導(dǎo)物，或上述tlr配體或tlr配體誘導(dǎo)物、紅細(xì)胞生成素和低氧的任何其他組合。

所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基中所用的tlr3配體可以是il4、il13、聚(a:u)、聚(i:c)及其組合，并且可通過溫育、轉(zhuǎn)染、由載體分子轉(zhuǎn)導(dǎo)或通過其組合來(lái)遞送。優(yōu)選地，tlr3配體或激動(dòng)劑為聚(i:c)。

所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基中所用的tlr4配體可以是氨基烷基氨基葡糖苷4-磷酸酯、干擾素、tnf-α、gm-csf、脂多糖(lps)及其組合，并且可通過溫育、轉(zhuǎn)染、由載體分子轉(zhuǎn)導(dǎo)或通過其組合來(lái)遞送。優(yōu)選地，tlr4配體或激動(dòng)劑為lps。

tlr3配體或激動(dòng)劑可以以在如上所述的培養(yǎng)基或補(bǔ)充劑中約10pg/ml至約100μg/ml、約100pg/ml至約100μg/ml、約1ng/ml至約100μg/ml、約5ng/ml至約100μg/ml、約10ng/ml至約100μg/ml、約100ng/ml至約100μg/ml、約0.1μg/ml至約50μg/ml、約0.1μg/ml至約10μg/ml、約0.25μg/ml至約7.5μg/ml、約0.5μg/ml至約5μg/ml、約1μg/ml至約2.5μg/ml，且優(yōu)選約1μg/ml至約1.5μg/ml的量來(lái)提供。

在某些實(shí)施方案中，tlr3配體為聚(i:c)，且以約10pg/ml至約100μg/ml、約100pg/ml至約100μg/ml、約1ng/ml至約100μg/ml、約5ng/ml至約100μg/ml、約10ng/ml至約100μg/ml、約100ng/ml至約100μg/ml、約0.1μg/ml至約50μg/ml、約0.1μg/ml至約10μg/ml、約0.25μg/ml至約7.5μg/ml、約0.5μg/ml至約5μg/ml、約1μg/ml至約5μg/ml和約1μg/ml至約2.5μg/ml的量提供。在某些實(shí)施方案中，聚(i:c)以約1μg/ml的量提供。在某些實(shí)施方案中，聚(i:c)以約2μg/ml的量提供。在某些實(shí)施方案中，聚(i:c)以約3μg/ml的量提供。在某些實(shí)施方案中，聚(i:c)以約4μg/ml的量提供。在某些實(shí)施方案中，聚(i:c)以約5μg/ml的量提供。在某些實(shí)施方案中，聚(i:c)以約6μg/ml的量提供。在某些實(shí)施方案中，聚(i:c)以約7μg/ml的量提供。在某些實(shí)施方案中，聚(i:c)以約8μg/ml的量提供。在某些實(shí)施方案中，聚(i:c)以約9μg/ml的量提供。在某些實(shí)施方案中，聚(i:c)以約10μg/ml的量提供。在某些實(shí)施方案中，聚(i:c)以低于約100ng/ml的量提供。在某些實(shí)施方案中，聚(i:c)以低于約50ng/ml的量提供。在某些實(shí)施方案中，聚(i:c)以低于約20ng/ml的量提供。在某些實(shí)施方案中，聚(i:c)以低于約10ng/ml的量提供。在某些實(shí)施方案中，聚(i:c)以低于約50ng/ml的量提供。

tlr4配體或激動(dòng)劑可以以在如上所述的培養(yǎng)基或補(bǔ)充劑中約10pg/ml至約10μg/ml、約100pg/ml至約10μg/ml、約1ng/ml至約1μg/ml、約5ng/ml至約1μg/ml、約10ng/ml至約1μg/ml、約100ng/ml至約1μg/ml，優(yōu)選約5ng/ml至約50ng/ml，以及還優(yōu)選約5ng/ml至約25ng/ml的量提供。

在某些實(shí)施方案中，tlr4配體為lps。在某些實(shí)施方案中，lps以約10pg/ml至約10μg/ml、約100pg/ml至約10μg/ml、約1ng/ml至約1μg/ml、約5ng/ml至約1μg/ml、約10ng/ml至約1μg/ml、約100ng/ml至約1μg/ml，優(yōu)選約5ng/ml至約50ng/ml，以及還優(yōu)選約5ng/ml至約25ng/ml的量存在。在某些實(shí)施方案中，lps以約5ng/ml的濃度存在。在某些實(shí)施方案中，lps以約10ng/ml的濃度存在。在某些實(shí)施方案中，lps以約15ng/ml的濃度存在。在某些實(shí)施方案中，lps以約20ng/ml的濃度存在。在某些實(shí)施方案中，lps以約25ng/ml的濃度存在。在某些實(shí)施方案中，lps以約30ng/ml的濃度存在。在某些實(shí)施方案中，lps以約35ng/ml的濃度存在。在某些實(shí)施方案中，lps以約40ng/ml的濃度存在。在某些實(shí)施方案中，lps以約45ng/ml的濃度存在。在某些實(shí)施方案中，lps以約50ng/ml的濃度存在。在某些實(shí)施方案中，lps以低于約100ng/ml的濃度存在。在某些實(shí)施方案中，lps以低于約50ng/ml的濃度存在。在某些實(shí)施方案中，lps以低于約20ng/ml的濃度存在。在某些實(shí)施方案中，lps以低于約10ng/ml的濃度存在。

在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的誘導(dǎo)培養(yǎng)基包括在低氧或氧耗盡的環(huán)境中溫育。在某些實(shí)施方案中，低氧環(huán)境具有低于2％的氧。在某些實(shí)施方案中，低氧環(huán)境具有低于1.5％的氧。在某些實(shí)施方案中，低氧環(huán)境具有低于1.0％的氧。在某些實(shí)施方案中，低氧環(huán)境具有低于0.5％的氧。在某些實(shí)施方案中，低氧環(huán)境具有實(shí)際上0％的氧。在某些實(shí)施方案中，低氧環(huán)境具有0.5％至2.0％的氧。在某些實(shí)施方案中，低氧環(huán)境具有0.5％至1.5％的氧。在某些實(shí)施方案中，低氧環(huán)境具有0.5％至1.0％的氧。在某些實(shí)施方案中，低氧環(huán)境具有1.0％至2.0％的氧。在某些實(shí)施方案中，低氧環(huán)境具有1.5％至2.0％的氧。

在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的誘導(dǎo)培養(yǎng)基包含氯化鈷。在某些實(shí)施方案中，氯化鈷以約50μm的濃度存在。在某些實(shí)施方案中，氯化鈷以約100μm的濃度存在。在某些實(shí)施方案中，氯化鈷以約200μm的濃度存在。在某些實(shí)施方案中，氯化鈷以約300μm的濃度存在。在某些實(shí)施方案中，氯化鈷以約400μm的濃度存在。在某些實(shí)施方案中，氯化鈷以約500μm的濃度存在。在某些實(shí)施方案中，氯化鈷以約600μm的濃度存在。在某些實(shí)施方案中，氯化鈷以約700μm的濃度存在。在某些實(shí)施方案中，氯化鈷以約800μm的濃度存在。在某些實(shí)施方案中，氯化鈷以約900μm的濃度存在。在某些實(shí)施方案中，氯化鈷以約1mm的濃度存在。在某些實(shí)施方案中，氯化鈷以約10μm至約1mm的濃度存在。在某些實(shí)施方案中，氯化鈷以約10μm至約800μm的濃度存在。在某些實(shí)施方案中，氯化鈷以約10μm至約500μm的濃度存在。在某些實(shí)施方案中，氯化鈷以約10μm至約400μm的濃度存在。在某些實(shí)施方案中，氯化鈷以約10μm至約300μm的濃度存在。在某些實(shí)施方案中，氯化鈷以約50μm至約300μm的濃度存在。在某些實(shí)施方案中，氯化鈷以約100μm至約300μm的濃度存在。在某些實(shí)施方案中，氯化鈷以約150μm至約300μm的濃度存在。

在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的誘導(dǎo)培養(yǎng)基包含去鐵胺。在某些實(shí)施方案中，去鐵胺以約50μm的濃度存在。在某些實(shí)施方案中，去鐵胺以約200μm的濃度存在。在某些實(shí)施方案中，去鐵胺以約300μm的濃度存在。在某些實(shí)施方案中，去鐵胺以約400μm的濃度存在。在某些實(shí)施方案中，去鐵胺以約500μm的濃度存在。在某些實(shí)施方案中，去鐵胺以約600μm的濃度存在。在某些實(shí)施方案中，去鐵胺以約700μm的濃度存在。在某些實(shí)施方案中，去鐵胺以約800μm的濃度存在。在某些實(shí)施方案中，去鐵胺以約900μm的濃度存在。在某些實(shí)施方案中，去鐵胺以約1mm的濃度存在。在某些實(shí)施方案中，去鐵胺以約10μm至約1mm的濃度存在。在某些實(shí)施方案中，去鐵胺以約10μm至約800μm的濃度存在。在某些實(shí)施方案中，去鐵胺以約10μm至約500μm的濃度存在。在某些實(shí)施方案中，去鐵胺以約10μm至約400μm的濃度存在。在某些實(shí)施方案中，去鐵胺以約10μm至約300μm的濃度存在。在某些實(shí)施方案中，去鐵胺以約50μm至約300μm的濃度存在。在某些實(shí)施方案中，去鐵胺以約100μm至約300μm的濃度存在。在某些實(shí)施方案中，去鐵胺以約150μm至約300μm的濃度存在。

在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的誘導(dǎo)培養(yǎng)基包含紅細(xì)胞生成素。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的誘導(dǎo)培養(yǎng)基包含重組紅細(xì)胞生成素。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的誘導(dǎo)培養(yǎng)基包含人重組紅細(xì)胞生成素。在某些實(shí)施方案中，紅細(xì)胞生成素的量為約0.1ng/ml至約1.0mg/ml。在某些實(shí)施方案中，紅細(xì)胞生成素的量為約0.1ng/ml至約100ng/ml。在某些實(shí)施方案中，紅細(xì)胞生成素的量為約0.1ng/ml至約50ng/ml。在某些實(shí)施方案中，紅細(xì)胞生成素的量為約0.1ng/ml至約10ng/ml。在某些實(shí)施方案中，紅細(xì)胞生成素的量為約0.1ng/ml至約1.0ng/ml。在某些實(shí)施方案中，紅細(xì)胞生成素的量為約0.2ng/ml至約0.8ng/ml。在某些實(shí)施方案中，紅細(xì)胞生成素的量為約0.3ng/ml至約0.6ng/ml。在某些實(shí)施方案中，紅細(xì)胞生成素的量為低于10mg/ml。在某些實(shí)施方案中，紅細(xì)胞生成素的量為低于5mg/ml。在某些實(shí)施方案中，紅細(xì)胞生成素的量為低于1mg/ml。在某些實(shí)施方案中，紅細(xì)胞生成素的量為低于100ng/ml。在某些實(shí)施方案中，紅細(xì)胞生成素的量為低于30ng/ml。在某些實(shí)施方案中，紅細(xì)胞生成素的量為低于10ng/ml。在某些實(shí)施方案中，紅細(xì)胞生成素的量為低于5ng/ml。在某些實(shí)施方案中，紅細(xì)胞生成素的量為低于4ng/ml。在某些實(shí)施方案中，紅細(xì)胞生成素的量為低于1ng/ml。在某些實(shí)施方案中，紅細(xì)胞生成素的量為低于0.8ng/ml。在某些實(shí)施方案中，紅細(xì)胞生成素的量為低于1ng/ml。在某些實(shí)施方案中，紅細(xì)胞生成素的量為低于5u/ml。在某些實(shí)施方案中，紅細(xì)胞生成素的量為低于1u/ml。在某些實(shí)施方案中，紅細(xì)胞生成素的量為低于0.5u/ml。在某些實(shí)施方案中，紅細(xì)胞生成素的量為低于0.1u/ml。在某些實(shí)施方案中，紅細(xì)胞生成素的量為低于0.05u/ml。

細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基通常含有支持維持培養(yǎng)細(xì)胞所必需的大量成分。因此，除了與紅細(xì)胞生成素及低氧或低氧模擬物(氯化鈷或去鐵胺)暴露組合的toll樣受體(tlr)配體或tlr配體誘導(dǎo)物之外，本發(fā)明的誘導(dǎo)培養(yǎng)基將通常含有許多其他成分?？紤]到下面的公開內(nèi)容，技術(shù)人員可以容易地配制合適的成分組合。根據(jù)本發(fā)明的誘導(dǎo)培養(yǎng)基將通常為包含以下更詳細(xì)描述的標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)成分，如氨基酸、維生素、痕量金屬、無(wú)機(jī)鹽、碳源和緩沖液的營(yíng)養(yǎng)液。

本發(fā)明的誘導(dǎo)培養(yǎng)基可含有血清。血清含有活力和擴(kuò)充可能所必需的細(xì)胞和非細(xì)胞因子以及組分?？梢允褂脧娜魏魏线m來(lái)源獲得的血清，其包括胎牛血清(fbs)、牛血清(bs)、小牛血清(cs)、胎牛血清(fcs)、新生小牛血清(ncs)、山羊血清(gs)、馬血清(hs)、豬血清、綿羊血清、兔血清、大鼠血清(rs)等。同樣在本發(fā)明的范圍內(nèi)的是，如果所述msc為人源的，則該細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基用人血清來(lái)補(bǔ)充，優(yōu)選自體來(lái)源?？梢岳斫猓绻J(rèn)為有必要滅活補(bǔ)體級(jí)聯(lián)的組分，則血清可在55-65℃下熱滅活。在采用血清替代物的情況下，根據(jù)常規(guī)技術(shù)它可以以該培養(yǎng)基體積的約2％至約40％予以使用。

在其他的實(shí)施方案中，本發(fā)明的誘導(dǎo)培養(yǎng)基可含有血清替代物。多種不同的血清替代物制劑是商購(gòu)可得的且為技術(shù)人員已知的，例如但不限于血清白蛋白、血清轉(zhuǎn)鐵蛋白、硒和重組蛋白，該重組蛋白包括但不限于胰島素、血小板衍生生長(zhǎng)因子(pdgf)和堿性成纖維生長(zhǎng)因子(bfgf)。在使用血清替代物的情況下，根據(jù)常規(guī)技術(shù)它可以以該培養(yǎng)基體積的約2％至約40％予以使用。在其他的實(shí)施方案中，本發(fā)明的誘導(dǎo)培養(yǎng)基可以是無(wú)血清和/或無(wú)血清替代物的。無(wú)血清培養(yǎng)基是不含有任何類型的動(dòng)物血清的培養(yǎng)基。可以優(yōu)選無(wú)血清培養(yǎng)基以避免干細(xì)胞可能的異種污染。無(wú)血清替代物培養(yǎng)基是未用任何商業(yè)血清替代物制劑補(bǔ)充的培養(yǎng)基。

本發(fā)明的誘導(dǎo)培養(yǎng)基通常在去離子蒸餾水中配制。本發(fā)明的誘導(dǎo)培養(yǎng)基通常在使用前例如通過紫外線、加熱、輻照或過濾來(lái)滅菌以防止污染。該誘導(dǎo)培養(yǎng)基可以(例如，在-20℃或-80℃下)冷凍以供儲(chǔ)存或運(yùn)輸?？刮⑸飫┩ǔＴ谂囵B(yǎng)基中使用以減輕細(xì)菌、支原體和真菌污染。該培養(yǎng)基可含有一種或多種抗微生物劑或抗生素以防止污染。通常，所用的抗生素或抗霉菌化合物是青霉素/鏈霉素的混合物，但還可以包括但不限于兩性霉素氨芐青霉素、慶大霉素、博來(lái)霉素、潮霉素(hygromacin)、卡那霉素、絲裂霉素等。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基是已通過添加與紅細(xì)胞生成素以及低氧或低氧模擬物(氯化鈷或去鐵胺)暴露組合的toll樣受體(tlr)配體或tlr配體誘導(dǎo)物誘導(dǎo)的細(xì)胞而調(diào)整的培養(yǎng)基。條件培養(yǎng)基的產(chǎn)生是通過在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中將所述細(xì)胞的群體培養(yǎng)足以調(diào)整該培養(yǎng)基的時(shí)間，隨后收獲該條件培養(yǎng)基。在采用條件培養(yǎng)基的情況下，該培養(yǎng)基可針對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞，例如，小鼠細(xì)胞或人細(xì)胞來(lái)調(diào)整?？墒褂枚喾N不同類型的哺乳動(dòng)物細(xì)胞來(lái)產(chǎn)生適于間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)的條件培養(yǎng)基。

誘導(dǎo)培養(yǎng)基可以是1x制劑或濃縮制劑，例如，2x至250x濃縮培養(yǎng)基制劑。在1x制劑中，該培養(yǎng)基中的每種成分都在用于細(xì)胞誘導(dǎo)的濃度下。在濃縮制劑中，一種或多種該成分以比用于細(xì)胞誘導(dǎo)高的濃度存在。誘導(dǎo)培養(yǎng)基可利用已知方法例如鹽沉淀或選擇性過濾予以濃縮。濃縮培養(yǎng)基可以用水(優(yōu)選去離子水和蒸餾水)或任何合適的溶液，例如，水性鹽溶液、水性緩沖液或培養(yǎng)基來(lái)稀釋以供使用。

在適當(dāng)?shù)臈l件下，如本文所公開的誘導(dǎo)培養(yǎng)基可以能夠誘導(dǎo)、激活或引發(fā)在多能、未分化和增殖狀態(tài)下的干細(xì)胞群體達(dá)到僅單次傳代或群體倍增。如果干細(xì)胞表現(xiàn)出如本文別處更詳細(xì)描述的某些特性，則它們被認(rèn)為是在多能、未分化和增殖狀態(tài)下。適當(dāng)?shù)臈l件可由技術(shù)人員從通常用于間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)的那些條件中選擇。

如本文別處所述，本發(fā)明還提供含有本發(fā)明的誘導(dǎo)培養(yǎng)基的氣密容器。氣密容器可優(yōu)選用于運(yùn)輸或儲(chǔ)存該誘導(dǎo)培養(yǎng)基以防止污染。該容器可以是任何合適的容器，如生物反應(yīng)器、燒瓶、培養(yǎng)板、瓶子、罐子、小瓶或袋子。如本文別處所述，本發(fā)明還提供用于制備誘導(dǎo)培養(yǎng)基的方法，其包括步驟：(a)獲得培養(yǎng)基；和(b)向該培養(yǎng)基中添加與紅細(xì)胞生成素(epo)以及低氧或低氧模擬物(氯化鈷或去鐵胺)暴露組合的toll樣受體(tlr)配體或tlr配體誘導(dǎo)物。根據(jù)該誘導(dǎo)培養(yǎng)基中包含的具體成分，可以想到用于制備誘導(dǎo)培養(yǎng)基的多種不同方法。例如，用于制備誘導(dǎo)培養(yǎng)基的方法可包括步驟：(a)獲得培養(yǎng)基；和(b)向該培養(yǎng)基中添加與紅細(xì)胞生成素(epo)以及低氧或低氧模擬物(氯化鈷或去鐵胺)暴露組合的tlr配體或tlr配體誘導(dǎo)物。在一個(gè)實(shí)施方案中，用于制備誘導(dǎo)培養(yǎng)基的方法可包括步驟：(a)獲得培養(yǎng)基；和(b)向該培養(yǎng)基中添加tlr配體、epo和氯化鈷。

本發(fā)明的誘導(dǎo)培養(yǎng)基可用來(lái)誘導(dǎo)、激活或引發(fā)間充質(zhì)干細(xì)胞的群體。因此，本發(fā)明提供如本文所公開的任何誘導(dǎo)培養(yǎng)基對(duì)于將間充質(zhì)干細(xì)胞群體誘導(dǎo)、激活或引發(fā)為用于基于細(xì)胞的治療的分立、均勻的表型的用途。

在某些實(shí)施方案中，本文公開的誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)或減少某些基因的表達(dá)，其可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法來(lái)測(cè)量，包括但不限于pcr、qpcr、qrt-pcr、半定量rt-pcr、數(shù)字pcr、northern印跡法、mrna-seq、微陣列等。在某些實(shí)施方案中，本文公開的誘導(dǎo)培養(yǎng)基提高或降低蛋白質(zhì)水平，其可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法來(lái)測(cè)量，包括但不限于基于抗體的測(cè)定、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(elisa)、免疫或western印跡法、流式細(xì)胞術(shù)、質(zhì)譜法等。在某些實(shí)施方案中，本文公開的誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)途徑的激活或衰減，其可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法來(lái)測(cè)量，包括但不限于激酶測(cè)定、蛋白質(zhì)磷酸化/去磷酸化測(cè)量、蛋白質(zhì)泛素化/去泛素化測(cè)量、蛋白質(zhì)乙?；?脫乙酰測(cè)量、蛋白質(zhì)降解/穩(wěn)定性測(cè)量、第二信使如鈣或二酰甘油的測(cè)量或由非活性形式裂解為活性形式的監(jiān)測(cè)。

在某些實(shí)施方案中，本文公開的誘導(dǎo)培養(yǎng)基導(dǎo)致細(xì)胞群體的基因表達(dá)、蛋白質(zhì)水平或細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)途徑的可測(cè)量的變化。在某些實(shí)施方案中，該變化為基因表達(dá)、蛋白質(zhì)水平或細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)的增加。在某些實(shí)施方案中，該變化為所測(cè)得的未受刺激或?qū)φ諛悠放c刺激的或測(cè)試樣品之間的任何統(tǒng)計(jì)顯著性變化。在某些實(shí)施方案中，未受刺激的或?qū)φ諛悠放c刺激的或測(cè)試樣品之間的變化為增加至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更多倍。在某些實(shí)施方案中，未受刺激的或?qū)φ諛悠放c刺激的或測(cè)試樣品之間的變化為增加至少100倍或更多倍。在某些實(shí)施方案中，未受刺激的或?qū)φ諛悠放c刺激的或測(cè)試樣品之間的變化為減少為至多1/2、1/3、1/4、1/5、1/6、1/7、1/8、1/9、1/10或更低。在某些實(shí)施方案中，未受刺激的或?qū)φ諛悠放c刺激的或測(cè)試樣品之間的變化為減少為至多1/100或更低。

在某些實(shí)施方案中，當(dāng)與未受刺激的細(xì)胞群體相比時(shí)，包含tlr3配體的誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)任何以下基因的mrna表達(dá)至少2倍：cxcl9、egfr、irf1、a2m、fas、il2rg、mmp3、gbp1、isg15、fcgr1、nfkb1、nos2a、usf1、yy1、jak2、sta2、stat4、stat5、socs1或irf1。在某些實(shí)施方案中，當(dāng)與未受刺激的細(xì)胞群體相比時(shí)，包含tlr3配體的誘導(dǎo)培養(yǎng)基使任何以下基因的mrna表達(dá)減少為至多1/2：epor、f2r、stam、pdgfra、pias2、myc、sh2b1或csf2rb。在某些實(shí)施方案中，當(dāng)與未受刺激的細(xì)胞群體相比時(shí)，包含tlr3配體的誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)任何以下基因的mrna表達(dá)至少10倍：cxcl9、gbp1、isg15、socs1、mmp3、jak2或irf1。在某些實(shí)施方案中，當(dāng)與未受刺激的細(xì)胞群體相比時(shí)，包含tlr3配體的誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)任何以下基因的mrna表達(dá)至少20倍：cxcl9、gbp1、isg15或socs1。在某些實(shí)施方案中，當(dāng)與未受刺激的細(xì)胞群體相比時(shí)，包含tlr3配體的誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)cxcl9的mrna表達(dá)至少100倍。

在某些實(shí)施方案中，當(dāng)與未受刺激的細(xì)胞群體相比時(shí)，包含tlr4配體的誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)tnfsf10(trail)的mrna表達(dá)至少2倍、10倍、100倍或1000倍。

本發(fā)明還提供了用于誘導(dǎo)、激活或引發(fā)間充質(zhì)干細(xì)胞群體的離體方法，其包括：(a)提供間充質(zhì)干細(xì)胞群體；(b)提供如本文所公開的誘導(dǎo)培養(yǎng)基；(c)使該干細(xì)胞與該誘導(dǎo)培養(yǎng)基相接觸；以及(d)在適當(dāng)?shù)臈l件下培養(yǎng)該干細(xì)胞。

在某些實(shí)施方案中，本文公開的用于誘導(dǎo)、激活或引發(fā)間充質(zhì)干細(xì)胞群體的離體方法誘導(dǎo)或減少某些基因的表達(dá)，其可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法來(lái)測(cè)量，包括但不限于pcr、qpcr、qrt-pcr、半定量rt-pcr、數(shù)字pcr、northern印跡法、mrna-seq、微陣列等。在某些實(shí)施方案中，本文公開的誘導(dǎo)培養(yǎng)基提高或降低蛋白質(zhì)水平，其可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法來(lái)測(cè)量，包括但不限于基于抗體的測(cè)定、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(elisa)、免疫或western印跡法、流式細(xì)胞術(shù)、質(zhì)譜法等。在某些實(shí)施方案中，本文公開的用于誘導(dǎo)、激活或引發(fā)間充質(zhì)干細(xì)胞群體的離體方法誘導(dǎo)細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)途徑的激活或衰減，其可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法來(lái)測(cè)量，包括但不限于激酶測(cè)定、蛋白質(zhì)磷酸化/去磷酸化測(cè)量、蛋白質(zhì)泛素化/去泛素化測(cè)量、蛋白質(zhì)乙酰化/脫乙酰測(cè)量、蛋白質(zhì)降解/穩(wěn)定性測(cè)量、第二信使如鈣或二酰甘油的測(cè)量或由非活性形式裂解為活性形式的監(jiān)測(cè)。

在某些實(shí)施方案中，本文公開的用于誘導(dǎo)、激活或引發(fā)間充質(zhì)干細(xì)胞群體的離體方法導(dǎo)致干細(xì)胞群體的基因表達(dá)、蛋白質(zhì)水平或細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)途徑的可測(cè)量的變化。在某些實(shí)施方案中，該變化為基因表達(dá)、蛋白質(zhì)水平或細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)的增加。在某些實(shí)施方案中，該變化為所測(cè)得的未受刺激的或?qū)φ諛悠放c刺激的或測(cè)試樣品之間的任何統(tǒng)計(jì)顯著性變化。在某些實(shí)施方案中，未受刺激的或?qū)φ諛悠放c刺激的或測(cè)試樣品之間的變化為增加至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更多倍。在某些實(shí)施方案中，未受刺激的或?qū)φ諛悠放c刺激的或測(cè)試樣品之間的變化為增加至少100倍或更多倍。在某些實(shí)施方案中，未受刺激的或?qū)φ諛悠放c刺激的或測(cè)試樣品之間的變化為減少為至多1/2、1/3、1/4、1/5、1/6、1/7、1/8、1/9、1/10或更低。在某些實(shí)施方案中，未受刺激的或?qū)φ諛悠放c刺激的或測(cè)試樣品之間的變化為減少為至多1/100或更低。

在某些實(shí)施方案中，當(dāng)與未受刺激的細(xì)胞群體相比時(shí)，包括tlr3配體的本文公開的用于誘導(dǎo)、激活或引發(fā)間充質(zhì)干細(xì)胞群體的離體方法誘導(dǎo)任何以下基因的mrna表達(dá)至少2倍：cxcl9、egfr、irf1、a2m、fas、il2rg、mmp3、gbp1、isg15、fcgr1、nfkb1、nos2a、usf1、yy1、jak2、sta2、stat4、stat5、socs1或irf1。在某些實(shí)施方案中，當(dāng)與未受刺激的細(xì)胞群體相比時(shí)，包括tlr3配體的本文公開的用于誘導(dǎo)、激活或引發(fā)間充質(zhì)干細(xì)胞群體的離體方法使任何以下基因的mrna表達(dá)減少為至多1/2：epor、f2r、stam、pdgfra、pias2、myc、sh2b1或csf2rb。在某些實(shí)施方案中，當(dāng)與未受刺激的細(xì)胞群體相比時(shí)，包括tlr3配體的本文公開的用于誘導(dǎo)、激活或引發(fā)間充質(zhì)干細(xì)胞群體的離體方法誘導(dǎo)任何以下基因的mrna表達(dá)至少10倍：cxcl9、gbp1、isg15、socs1、mmp3、jak2或irf1。在某些實(shí)施方案中，當(dāng)與未受刺激的細(xì)胞群體相比時(shí)，包括tlr3配體的本文公開的用于誘導(dǎo)、激活或引發(fā)間充質(zhì)干細(xì)胞群體的離體方法誘導(dǎo)任何以下基因的mrna表達(dá)至少20倍：cxcl9、gbp1、isg15或socs1。在某些實(shí)施方案中，當(dāng)與未受刺激的細(xì)胞群體相比時(shí)，包括tlr3配體的本文公開的用于誘導(dǎo)、激活或引發(fā)間充質(zhì)干細(xì)胞群體的離體方法誘導(dǎo)cxcl9的mrna表達(dá)至少100倍。

在某些實(shí)施方案中，當(dāng)與未受刺激的細(xì)胞群體相比時(shí)，包括tlr4配體的本文公開的用于誘導(dǎo)、激活或引發(fā)間充質(zhì)干細(xì)胞群體的離體方法誘導(dǎo)tnfsf10(trail)的mrna表達(dá)至少2倍、10倍、100倍或1000倍。

本發(fā)明還提供了細(xì)胞治療方法，其包括：(a)提供間充質(zhì)干細(xì)胞群體；(b)提供本發(fā)明的誘導(dǎo)培養(yǎng)基；(c)使該干細(xì)胞群體與該誘導(dǎo)培養(yǎng)基相接觸；以及(d)在適當(dāng)?shù)臈l件下培養(yǎng)該細(xì)胞。

本發(fā)明的方法可包括培養(yǎng)與如本文別處所述的固體表面相接觸的該細(xì)胞。例如，本發(fā)明提供了一種方法，其包括：(a)提供間充質(zhì)干細(xì)胞群體；(b)提供如本文所公開的誘導(dǎo)培養(yǎng)基；(c)使該干細(xì)胞與該誘導(dǎo)培養(yǎng)基相接觸；以及(d)在適當(dāng)?shù)臈l件下培養(yǎng)該細(xì)胞并使之與固體表面相接觸。本發(fā)明還提供如本文所公開的誘導(dǎo)培養(yǎng)基和固體表面對(duì)于擴(kuò)充間充質(zhì)干細(xì)胞群體的用途。間充質(zhì)干細(xì)胞可以粘附、附著或接種在所述支持物上。通常，在誘導(dǎo)、激活或引發(fā)該干細(xì)胞之前以所需的密度來(lái)接種細(xì)胞，如約100個(gè)細(xì)胞/cm²至約100,000個(gè)細(xì)胞/cm²(如約500個(gè)細(xì)胞/cm²至約50,000個(gè)細(xì)胞/cm²，或更特別地，約1,000個(gè)細(xì)胞/cm²至約20,000個(gè)細(xì)胞/cm²)。在特定的實(shí)施方案中，該細(xì)胞密度為200-10,000個(gè)細(xì)胞/cm²。

可以理解，本文公開的方法的步驟在適當(dāng)時(shí)可以以任何順序執(zhí)行或在同一時(shí)間內(nèi)執(zhí)行，并且不必以它們所列出的順序執(zhí)行。例如，在上述方法中，提供間充質(zhì)干細(xì)胞群體的步驟可以在提供誘導(dǎo)培養(yǎng)基的步驟之前、之后或同時(shí)執(zhí)行。

本發(fā)明的方法及用途可包括如本文所述的任何誘導(dǎo)培養(yǎng)基或補(bǔ)充物。因此，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法可以是不存在血清和/或血清替代物的方法。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法可以在不存在與飼養(yǎng)細(xì)胞層接觸的情況下用來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞。

本發(fā)明的優(yōu)選方法及用途用于在該細(xì)胞已擴(kuò)充時(shí)以及在冷藏保存并在基于細(xì)胞的治療中使用之前進(jìn)行間充質(zhì)干細(xì)胞群體的誘導(dǎo)、激活或引發(fā)。

優(yōu)選所述干細(xì)胞群體為成體來(lái)源的，且進(jìn)一步優(yōu)選所述細(xì)胞為(如在骨髓衍生或脂肪組織衍生的細(xì)胞中的)間充質(zhì)干細(xì)胞群體。

用于干細(xì)胞培養(yǎng)的條件是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。優(yōu)選在適合于粘附間充質(zhì)干細(xì)胞的固體支持物的存在下進(jìn)行所述培養(yǎng)。

所述制備方法可任選進(jìn)一步包括步驟：(a)將該細(xì)胞傳代至如本文所公開的培養(yǎng)基中；(b)在適當(dāng)?shù)臈l件下進(jìn)一步培養(yǎng)該細(xì)胞，以及(c)誘導(dǎo)、激活或引發(fā)該細(xì)胞。

已證明在沒有誘導(dǎo)分化的情況下msc的離體擴(kuò)充可例如通過采用特別篩選的大量合適的血清(如胎牛血清或人血清)長(zhǎng)期進(jìn)行。用于測(cè)量活力和產(chǎn)量的方法是本領(lǐng)域已知的(例如，臺(tái)盼藍(lán)排除法)。

必要時(shí)，可手動(dòng)執(zhí)行用于分離本發(fā)明的細(xì)胞群體的細(xì)胞的任何步驟和程序?；蛘?，分離此類細(xì)胞的過程可以通過一種或多種合適的設(shè)備來(lái)促進(jìn)和/或自動(dòng)化，該設(shè)備的實(shí)例是本領(lǐng)域已知的。

本發(fā)明的實(shí)施可利用任何合適的細(xì)胞培養(yǎng)容器作為支持物來(lái)執(zhí)行。由多種不同的材料(例如，塑料、玻璃)構(gòu)成的具有多種形狀和大小的細(xì)胞培養(yǎng)容器(例如，燒瓶、單孔或多孔培養(yǎng)板、單孔或多孔盤、瓶子、罐子、小瓶、袋子、生物反應(yīng)器)是本領(lǐng)域已知的。技術(shù)人員可以容易地選擇合適的細(xì)胞培養(yǎng)容器。

本發(fā)明還提供可用來(lái)產(chǎn)生如本文所公開的培養(yǎng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基的培養(yǎng)基誘導(dǎo)補(bǔ)充物。“培養(yǎng)基誘導(dǎo)補(bǔ)充物”是多種成分的混合物，該混合物不能自身支持間充質(zhì)干細(xì)胞，但當(dāng)與其他細(xì)胞培養(yǎng)基成分組合時(shí)能實(shí)現(xiàn)或改善間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)。因此，該補(bǔ)充物可用來(lái)通過使其與其他細(xì)胞培養(yǎng)成分組合而產(chǎn)生合適的培養(yǎng)基制劑，從而產(chǎn)生本發(fā)明的功能性細(xì)胞培養(yǎng)基。培養(yǎng)基補(bǔ)充物的用途是本領(lǐng)域公知的。本發(fā)明提供了一種培養(yǎng)基誘導(dǎo)補(bǔ)充物，其包括添加與紅細(xì)胞生成素(epo)以及低氧或低氧模擬物(氯化鈷或去鐵胺)暴露組合的tlr配體或tlr配體誘導(dǎo)物。該補(bǔ)充物可含有本文公開的任何配體。該補(bǔ)充物還可以含有一種或多種附加的細(xì)胞培養(yǎng)成分，例如，選自氨基酸、維生素、無(wú)機(jī)鹽、痕量元素、碳源和緩沖液的一種或多種細(xì)胞培養(yǎng)成分。

培養(yǎng)基誘導(dǎo)補(bǔ)充物可以是濃縮的液體補(bǔ)充物(例如，2x至250x濃縮的液體補(bǔ)充物)或可以是干燥的補(bǔ)充物。液體類型和干燥類型的補(bǔ)充物均是本領(lǐng)域公知的。補(bǔ)充物可以凍干。

本發(fā)明的培養(yǎng)基誘導(dǎo)補(bǔ)充物通常在使用前例如通過紫外線、加熱、輻照或過濾來(lái)滅菌以防止污染。培養(yǎng)基誘導(dǎo)補(bǔ)充物可以(例如，在-20℃或-80℃下)冷凍以供儲(chǔ)存或運(yùn)輸。

本發(fā)明還提供了含有本發(fā)明的培養(yǎng)基補(bǔ)充物的氣密容器。氣密容器可優(yōu)選用于運(yùn)輸或儲(chǔ)存本文公開的培養(yǎng)基補(bǔ)充物以防止污染。該容器可以是任何合適的容器，如生物反應(yīng)器、燒瓶、培養(yǎng)板、瓶子、罐子、小瓶或袋子。

已使用多種物質(zhì)作為粘附干細(xì)胞培養(yǎng)物的表面，并且技術(shù)人員可以容易地選擇合適的材料。優(yōu)選地，該固體表面包括塑料但可以替代地包括玻璃、細(xì)胞外基質(zhì)。該表面可以是平面的、管狀的或是支架、珠子或纖維的形式。

如本文別處所述，本發(fā)明的組合物可包含血清，或可以是無(wú)血清和/或無(wú)血清替代物的。

本發(fā)明中采用的間充質(zhì)干細(xì)胞可利用公知的方法(參見下文)獲得?？梢韵氲剑喾N類型的間充質(zhì)干細(xì)胞可結(jié)合本發(fā)明使用，無(wú)論是從胚胎、胎兒或是從成體組織中獲得，但優(yōu)選來(lái)源于成體組織來(lái)源。

本文公開的誘導(dǎo)培養(yǎng)基可用來(lái)培養(yǎng)哺乳動(dòng)物干細(xì)胞，特別是人成體干細(xì)胞?？山Y(jié)合本發(fā)明使用的人成體干細(xì)胞優(yōu)選間充質(zhì)干細(xì)胞。還可以采用小鼠或靈長(zhǎng)類干細(xì)胞。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，該干細(xì)胞為人骨髓衍生干細(xì)胞(msc)。

間充質(zhì)干細(xì)胞可通過其分化為所有三種胚層的細(xì)胞的能力來(lái)鑒定，例如通過測(cè)定該間充質(zhì)干細(xì)胞分化為顯示特異于所有三種胚層的標(biāo)志物的可檢測(cè)表達(dá)的細(xì)胞的能力。除非上下文另有要求，否則提及單數(shù)(例如，提及“一個(gè)細(xì)胞”和等效引用)包括復(fù)數(shù)(例如“多個(gè)細(xì)胞”)。

本發(fā)明的誘導(dǎo)培養(yǎng)基可用來(lái)誘導(dǎo)、激活或引發(fā)間充質(zhì)干細(xì)胞的群體。因此，本發(fā)明提供如本文所公開的任何誘導(dǎo)培養(yǎng)基對(duì)于將間充質(zhì)干細(xì)胞群體誘導(dǎo)、激活或引發(fā)為用于基于細(xì)胞的治療的分立、均勻的表型的用途。這些分立且均勻的表型可以是抗炎msc表型(msc2)和均勻且分立的促免疫抗腫瘤msc表型(msc1)。

均勻且分立的抗炎msc表型(msc2)的優(yōu)選誘導(dǎo)方法是在70-90％匯合生長(zhǎng)時(shí)將msc和含有與紅細(xì)胞生成素(1mu/ml或5ng/ml)以及低氧(1％氧)或低氧模擬物(氯化鈷或去鐵胺，均為200μm)暴露組合的toll樣受體3(tlr3)配體如聚肌苷：聚胞苷酸(或聚(i:c)；1μg/ml)的培養(yǎng)基一起溫育1小時(shí)。

均勻且分立的促免疫抗腫瘤msc表型(msc1)的優(yōu)選誘導(dǎo)方法是在70-90％匯合生長(zhǎng)時(shí)將msc和含有與紅細(xì)胞生成素(1mu/ml或5ng/ml)以及低氧(1％氧)或低氧模擬物(氯化鈷或去鐵胺，均為200μm)暴露組合的toll樣受體4(tlr4)配體如脂多糖(10ng/ml的lps，內(nèi)毒素)的培養(yǎng)基一起溫育1小時(shí)。

向新鮮培養(yǎng)基中添加與紅細(xì)胞生成素以及低氧或低氧模擬物(氯化鈷或去鐵胺)暴露組合的tlr配體，或?qū)⑺鳛榕囵B(yǎng)補(bǔ)充物與該細(xì)胞一起溫育1hr。在該誘導(dǎo)步驟之后，將該msc在不含tlr配體的培養(yǎng)基或合適的緩沖鹽溶液中洗滌兩次，以去除細(xì)胞和培養(yǎng)物碎片。不希望受到理論的束縛，在上述(或更低)濃度下的短溫育時(shí)間(<1hr)和最少的tlr配體暴露對(duì)于得到所需表型是重要的，并且進(jìn)一步地，該方案模擬了內(nèi)源性msc在與損傷部位相距一定距離處遇到并響應(yīng)的危險(xiǎn)信號(hào)的梯度。一經(jīng)洗滌，被誘導(dǎo)、激活或引發(fā)的msc可通過傳統(tǒng)方法例如胰蛋白酶和edta在37℃下收獲5秒至15分鐘，或采用胰蛋白酶替代物(例如，來(lái)自invitrogen的tryple)、膠原酶、分散酶、細(xì)胞消化酶(accutase)或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他試劑。在細(xì)胞收獲之后，被引發(fā)、激活或誘導(dǎo)的msc可通過標(biāo)準(zhǔn)方法予以冷藏保存。

tlr3激動(dòng)劑或tlr4激動(dòng)劑可通過溫育、轉(zhuǎn)染、由載體分子轉(zhuǎn)導(dǎo)或通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他技術(shù)予以遞送。

可將該細(xì)胞與tlr配體或激動(dòng)劑配體(與紅細(xì)胞生成素(epo)以及低氧或低氧模擬物(氯化鈷或去鐵胺)暴露組合)一起溫育約1分鐘至約480分鐘、約5分鐘至約475分鐘、約10分鐘至約470分鐘、約15分鐘至約400分鐘、約20分鐘至約120分鐘、約25分鐘至約90分鐘、約30分鐘至約80分鐘、約35分鐘至約70分鐘、約40分鐘至約65分鐘、約45分鐘至約60分鐘、約55分鐘至約60分鐘，且優(yōu)選約60分鐘。

實(shí)施例

實(shí)施例1-來(lái)自人原代msc的msc2基因表達(dá)標(biāo)記的誘導(dǎo)

針對(duì)本實(shí)驗(yàn)，將原代人msc在含2μg/ml聚(i:c)的無(wú)血清培養(yǎng)基中在37℃和5％co2下溫育6小時(shí)。隨后，將細(xì)胞洗滌兩次，用rneasymini試劑盒(qiagen,valencia,ca)提取rna，隨后用turbo無(wú)dna試劑盒(ambion,austin,tx)處理。將rna逆轉(zhuǎn)錄并將得到的cdna在icycleriq5實(shí)時(shí)pcr檢測(cè)系統(tǒng)(bio-rad,hercules,ca)上根據(jù)制造商的說(shuō)明書在jak/stat信號(hào)途徑rt2profilertmpcr陣列(superarraybioscience,frederick,md)中使用。來(lái)自未處理組和處理組的原始數(shù)據(jù)均利用gearrayanalyzer軟件(superarrayinc.,bethesda,md)進(jìn)行分析。該陣列測(cè)量了jak/stat信號(hào)途徑中84種不同基因的rna表達(dá)水平。結(jié)果示于圖1中，顯示2倍或更多倍誘導(dǎo)的基因在灰色框中，顯示減少為1/2或更低的基因在黑色框中，而誘導(dǎo)超過兩倍且選擇用于進(jìn)一步驗(yàn)證的基因(除了減少為低于1/2的pias2以外)描繪在粗框中。圖2顯示了選自圖1的基因的進(jìn)一步qpcr驗(yàn)證。利用具有基因特異性引物的sybrgreenmastermix通過qpcr對(duì)圖1中分析的相同樣品進(jìn)行驗(yàn)證。

實(shí)施例2-來(lái)自原代人msc的msc1和msc2極化

將原代人msc供體極化為msc1或msc2。在不存在(msc1)或存在0.5ng/ml人重組紅細(xì)胞生成素和200μm氯化鈷(msc1*)的情況下，利用含10ng/mllps的培養(yǎng)基來(lái)極化人msc。在不存在(msc2)或存在0.5ng/ml人重組紅細(xì)胞生成素和200μm氯化鈷(msc2*)的情況下，利用含2μg/ml聚(i:c)的培養(yǎng)基來(lái)極化人msc2細(xì)胞。收獲培養(yǎng)的上清液，隨后通過如前所述的bio-plex分析趨化因子/細(xì)胞因子表達(dá)。簡(jiǎn)而言之，將msc以50,000個(gè)細(xì)胞的密度接種在24孔培養(yǎng)板中，允許其粘附過夜，隨后根據(jù)指示用tlr激動(dòng)劑引發(fā)1hr。48hr后收集條件培養(yǎng)基，并按照制造商的說(shuō)明書利用bio-plex細(xì)胞因子測(cè)定(humangroupi&ii；bio-rad,hercules,ca)進(jìn)行分析。對(duì)三個(gè)單獨(dú)msc供體庫(kù)進(jìn)行這些實(shí)驗(yàn)至少三次。與配方無(wú)關(guān)的msc1誘導(dǎo)導(dǎo)致包括il6和il8在內(nèi)的細(xì)胞因子的顯著分泌(圖3)，而與配方無(wú)關(guān)的msc2誘導(dǎo)導(dǎo)致ip10(cxcl10)和rantes(ccl5)的顯著分泌(圖4)。誤差條指示+/-sem。

實(shí)施例3-msc1和msc2極化在msc的多種來(lái)源中是一致的

將來(lái)自3種不同商業(yè)來(lái)源和多達(dá)六種不同供體的人msc供體極化為msc1。在不存在(msc1)或存在0.5ng/ml人重組紅細(xì)胞生成素和200μm氯化鈷(msc1*)的情況下，利用含10ng/mllps的培養(yǎng)基來(lái)極化人msc。將總rna分離、純化并逆轉(zhuǎn)錄為cdna。利用sybrgreenmastermix進(jìn)行定量實(shí)時(shí)pcr。利用定量比較ct方法來(lái)分析數(shù)據(jù)，以將靶基因表達(dá)相對(duì)于18srrna管家基因進(jìn)行歸一化，并顯示為相對(duì)于未處理的對(duì)照的倍數(shù)增加。在包括混合供體在內(nèi)的所有供體中，msc1誘導(dǎo)后trail基因表達(dá)顯著增加(圖5)。誤差條表示+/-平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差(sem)。人cdna引物使用：cxcl9正向-ctttcctggctactccatgtt反向-gttggtcactggctgatctataa；trail正向-cttcacagtgctcctgcagt反向-ttagccaactaaaaaggcccc；18srrna正向-gagggagcctgagaaacgg，反向-gtcgggagtgggtaatttgc，其中方案為：1：95.0℃持續(xù)0:30，2：95.0℃持續(xù)0:10，3：68.0℃持續(xù)0:30，讀板，4：去往2，39次以上。

將來(lái)自3種不同商業(yè)來(lái)源和多達(dá)六種不同供體的人msc供體極化為msc2。在不存在(msc2)或存在0.5ng/ml人重組紅細(xì)胞生成素和200μm氯化鈷(msc2*)的情況下，利用含2μg/ml聚(i:c)的培養(yǎng)基來(lái)極化人msc。將總rna分離、純化并逆轉(zhuǎn)錄為cdna。利用sybrgreenmastermix進(jìn)行定量實(shí)時(shí)pcr。利用定量比較ct方法來(lái)分析數(shù)據(jù)，以將靶基因表達(dá)相對(duì)于18srrna管家基因進(jìn)行歸一化，并顯示為相對(duì)于未處理的對(duì)照的倍數(shù)增加。在包括混合供體在內(nèi)的所有供體中，msc2誘導(dǎo)后cxcl9基因表達(dá)顯著增加(圖6)。誤差條表示+/-平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差(sem)。

實(shí)施例4-msc1和msc2極化的時(shí)間進(jìn)程。

將人msc供體極化為msc1。在不存在(msc1)或存在0.5ng/ml人重組紅細(xì)胞生成素和200μm氯化鈷(msc1*)的情況下，利用含10ng/mllps的培養(yǎng)基來(lái)極化人msc。根據(jù)指示在不同時(shí)間收獲細(xì)胞。將總rna分離、純化并逆轉(zhuǎn)錄為cdna。利用sybrgreenmastermix來(lái)進(jìn)行定量實(shí)時(shí)pcr。利用定量比較ct方法來(lái)分析數(shù)據(jù)，以將靶基因表達(dá)相對(duì)于18srrna管家基因進(jìn)行歸一化，并顯示為相對(duì)于未處理的對(duì)照的倍數(shù)增加。msc1誘導(dǎo)后4小時(shí)，trail基因表達(dá)顯著增加(圖7)。誤差條表示+/-平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差(sem)。

將人msc供體極化為msc2。在不存在(msc2)或存在0.5ng/ml人重組紅細(xì)胞生成素和200μm氯化鈷(msc2*)的情況下，利用含2μg/ml聚(i:c)的培養(yǎng)基來(lái)極化人msc。根據(jù)指示在不同時(shí)間收獲細(xì)胞。將總rna分離、純化并逆轉(zhuǎn)錄為cdna。利用sybrgreenmastermix進(jìn)行定量實(shí)時(shí)pcr。利用定量比較ct方法來(lái)分析數(shù)據(jù)，以將靶基因表達(dá)相對(duì)于18srrna管家基因進(jìn)行歸一化，并顯示為相對(duì)于未處理的對(duì)照的倍數(shù)增加。msc2誘導(dǎo)后4小時(shí)，cxcl9基因表達(dá)顯著增加(圖8)。誤差條表示+/-平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差(sem)。

實(shí)施例5-msc1和msc2細(xì)胞的生物分布

進(jìn)行了測(cè)定極化msc與幼稚msc相比的體內(nèi)功效的實(shí)驗(yàn)。針對(duì)本實(shí)驗(yàn)，通過腹膜內(nèi)注射入野生型小鼠中來(lái)施用人幼稚msc、msc1和msc2(100萬(wàn)個(gè)細(xì)胞)并在4小時(shí)后收獲所有器官。隨后，針對(duì)人gapdh測(cè)定所提取的rna，并與小鼠gapdhdna進(jìn)行比較以確定組織溯源(tissuehoming)。結(jié)果示于以下表1中。

實(shí)施例6-在msc極化過程中與紅細(xì)胞生成素和氯化鈷一起溫育增加了msc1和msc2細(xì)胞的遷移、增殖/活力

為了測(cè)定在有或沒有紅細(xì)胞生成素和低氧的情況下所培養(yǎng)的msc的遷移能力，將人幼稚msc細(xì)胞和msc1或msc2極化細(xì)胞添加至單獨(dú)的transwell插入物(8um孔，50,000個(gè)細(xì)胞/插入物)中。在不存在(msc1)或存在0.5ng/ml人重組紅細(xì)胞生成素和200μm氯化鈷(msc1*)的情況下，利用含10ng/mllps的培養(yǎng)基來(lái)極化msc1細(xì)胞。在不存在(msc2)或存在0.5ng/ml人重組紅細(xì)胞生成素和200μm氯化鈷(msc2*)的情況下，利用含2μg/ml聚(i:c)的培養(yǎng)基來(lái)極化人msc2細(xì)胞。將膜降低至含有陰性對(duì)照無(wú)血清培養(yǎng)基(sfm)或陽(yáng)性對(duì)照含血清的生長(zhǎng)培養(yǎng)基(ccm)或所指相應(yīng)的誘導(dǎo)培養(yǎng)基的24孔伴侶培養(yǎng)板中。溫育16小時(shí)后用nikoneclipsete300倒置熒光顯微鏡拍攝顯微照片。圖9顯示從來(lái)自超過三個(gè)獨(dú)立進(jìn)行的三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)(n＝3)的4個(gè)代表性圖像象限中計(jì)數(shù)的遷移msc的代表性數(shù)據(jù)。誤差條指示sem。

利用增殖試驗(yàn)來(lái)測(cè)定在有或沒有紅細(xì)胞生成素和低氧的情況下所培養(yǎng)的msc的增殖能力和活力。在不存在(msc1)或存在0.5ng/ml人重組紅細(xì)胞生成素和200μm氯化鈷(msc1*)的情況下，利用含10ng/mllps的培養(yǎng)基來(lái)極化人msc。在不存在(msc2)或存在0.5ng/ml人重組紅細(xì)胞生成素和200μm氯化鈷(msc2*)的情況下，利用含2μg/ml聚(i:c)的培養(yǎng)基來(lái)極化人msc2細(xì)胞。將細(xì)胞與特定培養(yǎng)基一起溫育48小時(shí)。來(lái)自每個(gè)樣品的細(xì)胞增殖和活力分別通過cyquant測(cè)定(lifetechnologies,ca)和臺(tái)盼藍(lán)測(cè)定來(lái)測(cè)量。對(duì)于細(xì)胞增殖，將細(xì)胞一式三份以每孔50μl中1×10³個(gè)細(xì)胞接種在96孔培養(yǎng)板中，并在37℃，5％co2下培養(yǎng)。在處理后第0小時(shí)、第24小時(shí)、第48小時(shí)、第72小時(shí)和第96小時(shí)收獲樣品，并根據(jù)制造商(cyquant測(cè)定,lifetechnologies,ca)的描述進(jìn)行加工。顯示的數(shù)據(jù)相對(duì)于未處理對(duì)照來(lái)表示。在至少三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行細(xì)胞增殖試驗(yàn)，其中每個(gè)樣品沿著96孔培養(yǎng)板的8個(gè)孔重復(fù)(n＝3)。誤差條指示sem。結(jié)果示于圖10中。

實(shí)施例7-針對(duì)cxcl9和tnfsf10的qpcr測(cè)定的驗(yàn)證

將人msc誘導(dǎo)為msc1。將總rna分離、純化并逆轉(zhuǎn)錄為cdna。利用sybrgreenmastermix進(jìn)行定量實(shí)時(shí)pcr。利用定量比較ct方法來(lái)分析數(shù)據(jù)，以將靶基因表達(dá)相對(duì)于18srrna管家基因進(jìn)行歸一化，并顯示為相對(duì)于未處理的對(duì)照的倍數(shù)增加。msc1誘導(dǎo)后，trail基因表達(dá)顯著增加。誤差條表示+/-平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差(sem)。確定引物效率和產(chǎn)物特異性(圖11)。

將人msc誘導(dǎo)為msc2。將總rna分離、純化并逆轉(zhuǎn)錄為cdna。利用sybrgreenmastermix進(jìn)行定量實(shí)時(shí)pcr。利用定量比較ct方法來(lái)分析數(shù)據(jù)，以將靶基因表達(dá)相對(duì)于18srrna管家基因進(jìn)行歸一化，并顯示為相對(duì)于未處理的對(duì)照的倍數(shù)增加。msc2誘導(dǎo)后，cxcl9基因表達(dá)顯著增加。誤差條表示+/-平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差(sem)。確定基因表達(dá)的時(shí)間進(jìn)程(圖12a)和產(chǎn)物特異性(圖12b)。

雖然特別提及其優(yōu)選實(shí)施方案而詳細(xì)描述了本發(fā)明，但是本說(shuō)明書中還描述了本發(fā)明的原理和工作模式。本發(fā)明不應(yīng)被解釋為限于所公開的具體形式，這些形式是說(shuō)明性的而不是限制性的。在不脫離如所附權(quán)利要求所述的本發(fā)明的精神和范圍的情況下，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以作出修改、變形和改變。

雖然本文已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，但是對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，此類實(shí)施方案僅以示例的方式提供。在不脫離本發(fā)明的情況下，本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)想到許多變形、改變和替換。應(yīng)當(dāng)理解，本文所述的本發(fā)明的實(shí)施方案的各種替代方案可用于實(shí)施本發(fā)明。旨在由以下權(quán)利要求限定本發(fā)明的范圍，并且旨在由此涵蓋這些權(quán)利要求范圍內(nèi)的方法和結(jié)構(gòu)及其等同物。