本發(fā)明涉及具有改善皮膚狀態(tài)的活性的肽及其用途。
背景技術(shù)：
：基質(zhì)金屬蛋白酶(matrixmetalloproteinase，mmp)為可以分解如膠原蛋白、蛋白聚糖及明膠等的生物大分子的肽鏈內(nèi)切酶種類的酶，大致分為膠原酶、明膠酶、基質(zhì)降解酶及膜型基質(zhì)金屬蛋白酶?；|(zhì)金屬蛋白酶均以酶原的形態(tài)來(lái)表達(dá)之后，通過(guò)一部分被切割，來(lái)被活性化(bond，j.s.，etal.，int.j.biochem.，75，565-574(1985)；chen，j.m.，chen，w.t.，cell，48，193-203(1987)；harris，e.d.etal.，collrelres，4，493-512(1984))。膠原酶作用于三螺旋間質(zhì)性膠原蛋白和明膠等，已知的有成纖維細(xì)胞膠原酶、嗜中性膠原酶及膠原酶-3等3種類，據(jù)報(bào)道這些切割第i型、第ⅱ型及第ⅲ型的膠原纖維(collagenfibrils)(goldberg，g.i.，etal，j.biol.chem.，261，6600-6605(1986)；fini，m.e.，etal.，biochemistry，26，6155-6165(1987))。并且據(jù)了解這種三種膠原酶在序列上相互具有約50％以上的同一性。(borkakoti，etal.，naturestruct.biol.，1，106-110(1994)；embo，j.，13，1263-1269(1994))?；|(zhì)金屬蛋白酶區(qū)分為前肽部位、催化性部位及c-末端部位等的三個(gè)部位?；|(zhì)金屬蛋白酶生成分泌成均無(wú)活性的潛伏型之后，斷裂成n-末端的前肽部位的80個(gè)氨基酸，進(jìn)而除去具有這些prcgvpd序列的部位的半胱氨酸，來(lái)被活性化(vanwart，h.e.etal.，proc.natl.acad.sci.usa，87，5578-5582(1990))。據(jù)了解被活性化的基質(zhì)金屬蛋白酶與作為天然抑制劑的基質(zhì)金屬蛋白酶的組織抑制劑(tissueinhibitorofmatrixmetalloproteinase)相結(jié)合，來(lái)抑制活性，該結(jié)合根據(jù)催化性部位來(lái)得到調(diào)節(jié)(murphy，etal.，j.niol.chem.，267，9612-9618(1992))。多種形態(tài)的基質(zhì)金屬蛋白酶具有基質(zhì)特異性，即使對(duì)于正常的細(xì)胞也在需要分解細(xì)胞外的矩陣(extracellularmatrix)或其他膠原蛋白的結(jié)構(gòu)時(shí)，在代謝過(guò)程中被表達(dá)。借助基質(zhì)金屬蛋白酶介導(dǎo)的疾病包含動(dòng)脈硬化癥、中樞神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥疾病、阿爾茨海默氏病、皮膚老化、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)、角膜潰瘍、骨疾病、蛋白尿、腹主動(dòng)脈瘤、根據(jù)外傷性關(guān)節(jié)損傷的退行性軟骨損失、神經(jīng)系統(tǒng)的脫髓鞘疾病、肝硬變、腎小球疾病，妊娠膜過(guò)早破裂，炎性腸病，齒根膜病、與老化相關(guān)的黃斑變性、糖尿病性視網(wǎng)膜病、增殖性玻璃體視網(wǎng)膜病變、未成熟視網(wǎng)膜病癥、圓錐角膜、干燥綜合征、近視、眼科腫瘤、角膜移植排斥、血管新生及癌的浸潤(rùn)與轉(zhuǎn)移等。風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和骨關(guān)節(jié)炎的原因在于自身免疫異常，但是隨著病情的發(fā)展而關(guān)節(jié)軟骨的細(xì)胞外矩陣得到破壞。據(jù)了解在這些關(guān)節(jié)炎及關(guān)節(jié)外傷中基質(zhì)降解酶被認(rèn)知為主要的酶，而且在使膠原酶轉(zhuǎn)換成活性膠原酶的過(guò)程中起到重要的作用。據(jù)報(bào)道通過(guò)抑制基質(zhì)金屬蛋白酶活性可阻止關(guān)節(jié)炎的發(fā)展，如上所述的基質(zhì)金屬蛋白酶源于滲透性白血球或成纖維細(xì)胞或外在的微生物。并且，由炎癥介導(dǎo)體的刺激而分泌成的膠原酶及從細(xì)菌中分泌成的膠原酶通過(guò)分解作為牙周組織的基質(zhì)的膠原蛋白，來(lái)產(chǎn)生牙齦萎縮，進(jìn)而發(fā)展導(dǎo)致牙周疾病。已確認(rèn)出有關(guān)從引起炎癥的牙齦中被分離的成纖維細(xì)胞膠原酶及基質(zhì)降解酶的活性，并已確認(rèn)出，酶的水平與所觀察到的牙齦炎的程度相關(guān)(overall，c.m.etal.，j.periodontalres.22，81-88(1987))?；|(zhì)金屬蛋白酶與多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)(centralnervoussystem，cns)的發(fā)病相關(guān)?；|(zhì)金屬蛋白酶使炎癥性單核細(xì)胞流入于中樞神經(jīng)中，來(lái)破壞髓鞘或破壞血-腦屏障(blood-brainbarrier)，在阿耳茨海默氏病中被估計(jì)參與β-淀粉樣蛋白的累積(yong，vw，etal.，trendsneurosci21(2)，75-80(1998))。并且，據(jù)報(bào)道基質(zhì)金屬蛋白酶在阿爾茨海默氏病的腦中其濃度高于正常人的腦中的濃度，(leakea，morriscm，&whateleyj.neuroscilett291(3)，201-3(2000)，據(jù)報(bào)道腦脊液中的明膠酶b的水平與多發(fā)性硬化癥及其他神經(jīng)性疾病相關(guān)(miyazaki，k，etal.，nature362，839～841(1993))，并有助于分解β-淀粉樣蛋白并累積(backstromjr，etal.，jneurosci16(24)，7910-9(1996))。并且，基質(zhì)金屬蛋白酶導(dǎo)致皮膚老化，若抑制這些則可以期待皺紋治療及預(yù)防作用，基質(zhì)金屬蛋白酶還可以通過(guò)基底膜的分解作用，來(lái)促進(jìn)血管新生、癌的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。因此，基質(zhì)金屬蛋白酶通過(guò)基底膜的分解，來(lái)不僅對(duì)癌的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移進(jìn)行非常重要的作用，而且通過(guò)這些來(lái)介導(dǎo)的疾病是多種多樣的，由此需要可以抑制這些的藥劑的開(kāi)發(fā)。但是這些抑制劑能夠在長(zhǎng)期使用時(shí)可以安全地被使用的情況下，用作理想的治療劑來(lái)所使用，因此作為基質(zhì)金屬蛋白酶活性抑制劑需要開(kāi)發(fā)毒性低的試劑。為了由基質(zhì)金屬蛋白酶介導(dǎo)的各種疾病的有效治療，而積極地進(jìn)行對(duì)于基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑的研究，并且基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑的開(kāi)發(fā)有效用于各種疾病的治療中。本說(shuō)明書(shū)全文中，參照了多篇論文及專利文獻(xiàn)，并表示了其引用。所引用的論文及專利文獻(xiàn)的公開(kāi)內(nèi)容全部插入于本說(shuō)明書(shū)作為參照，由此可以更加明確說(shuō)明本發(fā)明所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的水平及本發(fā)明的內(nèi)容。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：技術(shù)問(wèn)題本發(fā)明人努力開(kāi)發(fā)在生物學(xué)上具有有效的活性的優(yōu)秀的肽，其結(jié)果，通過(guò)具有序列表中序列1或序列表中序列2的氨基酸序列的肽表示基質(zhì)金屬蛋白酶2抑制活性及膠原蛋白分解抑制活性等，來(lái)查明了可以有效地利用于皮膚狀態(tài)的改善的事實(shí)，從而完成了本發(fā)明。因此，本發(fā)明目的在于提供具有改善皮膚狀態(tài)的活性的肽。本發(fā)明的再一目的在于提供皮膚狀態(tài)改善用組合物。本發(fā)明另一目的在于提供與基質(zhì)金屬蛋白酶-活性相關(guān)的疾病的預(yù)防或治療用藥劑學(xué)組合物。本發(fā)明的還有一目的在于提供炎癥疾病的預(yù)防或治療用藥劑學(xué)組合物。本發(fā)明的又一目的在于提供皮膚狀態(tài)改善方法。本發(fā)明又一目的在于提供炎癥性疾病的預(yù)防或治療方法。本發(fā)明的目的及優(yōu)點(diǎn)可根據(jù)如下所述的發(fā)明的詳細(xì)說(shuō)明、發(fā)明要求保護(hù)范圍及附圖得到更加明確的說(shuō)明。解決問(wèn)題的手段根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)施方式，本發(fā)明提供一種肽，具有改善皮膚狀態(tài)的活性，由序列表中序列1或序列表中序列2的氨基酸序列形成。本發(fā)明人努力開(kāi)發(fā)在生物學(xué)上具有有效的活性的優(yōu)秀的肽，其結(jié)果，通過(guò)具有序列表中序列1或序列表中序列2的氨基酸序列的肽表示基質(zhì)金屬蛋白酶2抑制活性及膠原蛋白分解抑制活性等，來(lái)查明了可以有效地利用于皮膚狀態(tài)改善的事實(shí)。根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的肽包含序列表中序列1或序列表中序列2的氨基酸序列。具體地，本發(fā)明的肽必須由序列表中序列1或序列表中序列2的氨基酸序列構(gòu)成。在本發(fā)明的說(shuō)明書(shū)中所使用的術(shù)語(yǔ)“肽”是指通過(guò)肽鍵來(lái)由氨基酸殘基相互結(jié)合而成的線性分子。本發(fā)明的肽可通過(guò)本發(fā)明所屬領(lǐng)域中公知的化學(xué)合成方法，尤其固相合成技術(shù)(solid-phasesynthesistechniques；merrifield，j.amer.chem.soc.85：2149-54(1963)；stewart，etal.，solidphasepeptidesynthesis，2nd.ed.，piercechem.co.：rockford，111(1984))或液相合成技術(shù)(美國(guó)登陸專利第5,516,891號(hào))來(lái)制備而成。本發(fā)明的肽為了選擇氨基酸序列的一部分部位之后增加該活性，而可以在n-末端或c-末端上引導(dǎo)變形。通過(guò)這些變形本發(fā)明的肽可獲得增加在生物體內(nèi)注射時(shí)的半衰期的高半衰期。并且，本發(fā)明的肽的c-末端被轉(zhuǎn)換成羥基(-oh)、氨基(-nh2)及疊氮化物(-nhnh2)等，肽的n-末端可以與選自由乙?；?、芴甲氧羰基、甲酰基、棕櫚?；?、肉豆蔻基、硬脂?；熬垡叶?polyethyleneglycol，peg)組成的組中的保護(hù)基相結(jié)合。上述氨基酸的變形起到大大改善本發(fā)明的肽的穩(wěn)定性的作用。本發(fā)明的說(shuō)明書(shū)中術(shù)語(yǔ)“穩(wěn)定性”不僅指體內(nèi)穩(wěn)定性，而且指儲(chǔ)存穩(wěn)定性(例如，常溫儲(chǔ)存穩(wěn)定性)。上述保護(hù)基起到從生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)切割酶的攻擊保護(hù)本發(fā)明的肽的作用。根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)施方式，本發(fā)明的肽不僅具有直接抑制基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrixmetalloproteinase-2，mmp2)的活性的功能，而且具有抑制根據(jù)基質(zhì)金屬蛋白酶2的膠原蛋白分解的功能。并且，本發(fā)明的肽對(duì)與皮膚美白相關(guān)的黑素體轉(zhuǎn)移(melanosometransfer)具有顯著的抑制效果。這些結(jié)果指本發(fā)明的肽在改善皮膚狀態(tài)的方面上具有非常優(yōu)秀的功效。根據(jù)本發(fā)明的再一實(shí)施方式，提供將本發(fā)明的肽作為有效成分來(lái)包含的皮膚狀態(tài)(skinconditions)改善用化妝品組合物。本發(fā)明的組合物包含上述的本發(fā)明的肽作為有效成分，因此為了避免本發(fā)明的說(shuō)明書(shū)過(guò)于復(fù)雜，省略這些兩者之間的共同的內(nèi)容。根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)施方式，在本發(fā)明中的皮膚狀態(tài)的改善指皺紋改善、皮膚彈性的改善、皮膚老化的防止、皮膚保濕的改善、傷口的除去、痤瘡的改善、皮膚再生或美白。本發(fā)明的肽與其他蛋白質(zhì)相比分子量顯著小，因此皮膚滲透率非常優(yōu)秀。因此當(dāng)將本發(fā)明的組合物涂敷于皮膚的局部時(shí)，可以有效地改善皮膚狀態(tài)。根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)施方式，本發(fā)明的組合物為化妝品組合物，上述化妝品組合物包含：(a)上述的本發(fā)明的肽的化妝品學(xué)有效量(cosmeticallyeffectiveamount)；以及(b)化妝品上所接受的載體。在本發(fā)明的說(shuō)明書(shū)中術(shù)語(yǔ)“化妝品學(xué)有效量”指在有效達(dá)成上述的本發(fā)明的組合物的皮膚改善功能方面上所需的充分的量。本發(fā)明的化妝品組合物可制備成本發(fā)明的所屬領(lǐng)域中通常所制備的任何劑型，例如可劑型為溶液、懸浮液、乳濁液、糊劑、凝膠、乳霜、乳液、散粉、肥皂、含有表面活性劑的清潔劑、油、粉狀粉底、乳濁液粉底、蠟粉及噴霧劑等，但不局限于此。更具體地，可以制備成柔膚化妝水、營(yíng)養(yǎng)化妝水、營(yíng)養(yǎng)霜、按摩霜、精華素、眼霜、潔面霜、洗面奶、卸妝、面膜、噴霧及散粉的劑型。在本發(fā)明的劑型為糊劑、乳霜或凝膠的情況下，作為載體成分可以利用動(dòng)物性油、植物性油、蠟、石蠟、淀粉、胺黃樹(shù)膠、纖維素衍生物、聚乙二醇、硅、膨潤(rùn)土、二氧化硅、滑石及氧化鋅等。在本發(fā)明的劑型為粉或噴霧劑的情況下，作為載體成分可利用乳糖、滑石、二氧化硅、氫氧化鋁、硅酸鈣或聚酰胺粉，尤其，在噴霧劑的情況下，還可包含如氯氟烴、丙烷/丁烷或二甲醚等的推進(jìn)劑。在本發(fā)明的劑型為溶液或乳濁液的情況下，作為載體成分利用溶劑、增溶劑或乳化劑，例如有水、乙醇、異丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸芐酯、丙二醇、1，3-丁基乙二醇油、甘油脂肪酸酯、聚乙二醇或山梨糖醇的脂肪酸酯。在本發(fā)明的劑型為懸浮液的情況下，作為載體成分可利用水、乙醇或丙二醇等的液態(tài)稀釋劑、乙氧基化異硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇酯及聚氧乙烯脫水山梨醇酯等的懸浮劑、微晶纖維素、甲基氫氧化鋁、膨潤(rùn)土、瓊脂或胺黃樹(shù)膠等。在本發(fā)明的劑型為含有表面活性劑的潔面劑的情況下，作為載體成分可利用脂肪醇硫酸鹽、脂肪醇醚硫酸鹽、磺基琥珀酸單酯、羥乙基磺酸鹽、咪唑啉衍生物、甲基?；撬猁}、肌氨酸鹽、脂肪酸酰胺醚硫酸鹽、烷基酰胺甜菜堿、脂肪醇、脂肪酸甘油酯、脂肪酸二乙醇酰胺、植物性油、羊毛脂衍生物或乙氧基化甘油脂肪酸酯等。包含于本發(fā)明的化妝品組合物的成分除了作為有效成分的肽類和載體成分之外，包含通常利用于化妝品組合物的多種成分，例如，可包含如抗氧化劑、穩(wěn)定劑、增溶劑、維生素、顏料及香料等的通常的助劑。根據(jù)本發(fā)明另一實(shí)施方式，本發(fā)明提供與基質(zhì)金屬蛋白酶-活性相關(guān)疾病的預(yù)防或治療用藥劑學(xué)組合物，包含本發(fā)明的肽作為有效成分，其特征在于，上述與基質(zhì)金屬蛋白酶-活性相關(guān)的疾病為關(guān)節(jié)炎、糖尿病性視網(wǎng)膜病、增生性瘢痕、牛皮癬、粘膜及上皮組織的潰瘍、由自身免疫引起的炎癥、與基底膜的分解相關(guān)的疾病的狼瘡、自身免疫性神經(jīng)精神障礙、肌細(xì)胞的破壞、青光眼或過(guò)多的血管新生。本發(fā)明的肽表示基質(zhì)金屬蛋白酶2的活性抑制、膠原蛋白分解抑制及黑素體轉(zhuǎn)移抑制等得各種生理活性，從而可有效地利用于與此相關(guān)的疾病治療。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方式，本發(fā)明的組合物為藥劑學(xué)組合物，上述藥劑學(xué)組合物包括：(a)上述的本發(fā)明的肽的藥劑學(xué)有效量；以及(b)藥劑學(xué)上可接受的載體。在本發(fā)明的說(shuō)明書(shū)中，術(shù)語(yǔ)“藥劑學(xué)有效量”指在達(dá)成上述的肽的功效或活性的方面上所需的充分的量。包含于本發(fā)明的藥劑學(xué)組合物的藥劑學(xué)上可接受的載體通常在制劑時(shí)所利用，上述載體包含：乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、淀粉、阿拉伯膠、磷酸鈣、藻酸鹽、明膠、硅酸鈣、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、纖維素、水、糖漿、甲基纖維素、羥基苯甲酸甲酯、羥基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸鎂及礦物油等，但不局限于此。本發(fā)明的藥劑學(xué)組合物除了上述成分之外，還可包含潤(rùn)滑劑、潤(rùn)濕劑、甜味劑、調(diào)味劑、乳化劑、懸浮劑及保鮮劑等。適當(dāng)?shù)乃巹W(xué)上可接受的載體及制劑詳細(xì)地記載于remington’pharmaceuticalsciences(19thed.，1995)中。本發(fā)明的藥劑學(xué)組合物能夠以口服或非口服的方式進(jìn)行給藥，在以非口服的方式給藥的情況下，可通過(guò)靜脈內(nèi)注射、皮下注射、肌肉注射、腹腔注射、局部給藥及經(jīng)皮給藥等的方式進(jìn)行給藥。本發(fā)明的藥劑學(xué)組合物的適當(dāng)?shù)慕o藥量可根據(jù)如制劑化方法、給藥方式、患者的年齡、體重、性別、病態(tài)、飲食、給藥時(shí)間、給藥途徑、排泄速度及反應(yīng)靈敏度等的因素以多種形式被處方。另一方面，優(yōu)選地，本發(fā)明的藥劑學(xué)組合物的每1天的給藥量為0.0001-1000μg。并且，本發(fā)明的藥劑學(xué)組合物可根據(jù)本發(fā)明所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員可容易實(shí)施的方法，利用藥劑學(xué)上可接受的載體和/或賦形劑來(lái)進(jìn)行制劑化，從而可制備成單位容量形態(tài)或裝入多容量容器內(nèi)來(lái)制備。此時(shí)，劑型還可以為油性或水性介質(zhì)中的溶液、懸浮液或乳化液形態(tài)或浸膏劑、粉劑、顆粒劑、片劑、膠囊劑或凝膠(例如，水凝膠)形態(tài)，還可包含分散劑或穩(wěn)定劑。根據(jù)本發(fā)明還有一實(shí)施方式，本發(fā)明提供炎癥性疾病的預(yù)防或治療用藥劑學(xué)組合物，其包含本發(fā)明的肽作為有效成分。根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)施方式，可適用本發(fā)明的組合物的炎癥性疾病為牙周炎、哮喘、濕疹、牛皮癬、過(guò)敏、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、銀屑病關(guān)節(jié)炎(psoriaticarthritis，psa)、過(guò)敏性皮炎、痤瘡、過(guò)敏性鼻炎(花粉熱)、過(guò)敏性皮膚炎(濕疹)、慢性鼻竇炎及脂溢性皮炎(seborrheicdermatitis，sd)。本發(fā)明的肽通過(guò)抑制作為與炎癥反應(yīng)相關(guān)的促炎(pro-inflammatory)細(xì)胞因子的蛋白酶激活受體(protease-activatedreceptor2，par2)及白細(xì)胞介素-1β的表達(dá)，來(lái)減少炎癥反應(yīng)，由此可有效地利用于與此相關(guān)的炎癥疾病的預(yù)防及治療中。根據(jù)本發(fā)明的又一實(shí)施方式，本發(fā)明提供包括將本發(fā)明的肽給藥到對(duì)象(subject)的步驟的皮膚狀態(tài)改善方法。根據(jù)本發(fā)明的又一實(shí)施方式，本發(fā)明提供包括將本發(fā)明的肽給藥到對(duì)象的步驟的炎癥性疾病的預(yù)防或治療方法。發(fā)明的效果概括本發(fā)明的特征及優(yōu)點(diǎn)，如下。(a)本發(fā)明提供具有改善皮膚狀態(tài)的活性的肽。(b)本發(fā)明的肽在抑制基質(zhì)金屬蛋白酶2活性來(lái)改善皮膚狀態(tài)的方面上發(fā)揮非常優(yōu)秀的功效，包含本發(fā)明的肽的組合物示出抑制膠原蛋白分解、抑制黑素體轉(zhuǎn)移等的優(yōu)秀的生理活性，由此可利用于皺紋改善、皮膚再生、皮膚彈性的改善、皮膚老化的抑制、傷口再生、痤瘡的改善、皮膚再生或皮膚美白。(c)包含本發(fā)明的肽的組合物可利用于與基質(zhì)金屬蛋白酶-活性相關(guān)的疾病及炎癥疾病的預(yù)防或治療用藥劑學(xué)組合物。附圖說(shuō)明圖1a、圖1b為對(duì)于本發(fā)明的肽的高效液相色譜法(highperformanceliquidchromatography，hplc)分析結(jié)果。(a)cg-renuin，(b)cg-noverin)圖2a、圖2b為評(píng)價(jià)根據(jù)本發(fā)明的肽的第一次人真皮成纖維細(xì)胞(humanprimarydermalfibroblastcells)的增殖促進(jìn)功效的結(jié)果。(a)cg-renuin，(b)cg-noverin)圖3a、圖3b為在第一次人真皮成纖維細(xì)胞中確認(rèn)根據(jù)本發(fā)明的肽的信號(hào)傳輸變化的結(jié)果。(a)cg-renuin，(b)cg-noverin)圖4a、圖4b為評(píng)價(jià)根據(jù)本發(fā)明的肽的基質(zhì)金屬蛋白酶2活性抑制效果的結(jié)果。(a)cg-renuin，(b)cg-noverin)圖5a、圖5b為評(píng)價(jià)在成纖維細(xì)胞中根據(jù)本發(fā)明的肽的基質(zhì)金屬蛋白酶2活性抑制效果的結(jié)果。(a)cg-renuin，(b)cg-noverin).圖6a、圖6b及圖7a、圖7b為評(píng)價(jià)根據(jù)本發(fā)明的肽的膠原蛋白分解抑制效果的結(jié)果。(a)cg-renuin，(b)cg-noverin)圖8a、圖8b為評(píng)價(jià)根據(jù)cg-renuin的黑素體轉(zhuǎn)移(melanosometransfer)抑制效果的結(jié)果。圖9為從牙髓干細(xì)胞(dentalpulpstemcells)中評(píng)價(jià)根據(jù)cg-noverin的抗炎癥效果的結(jié)果。具體實(shí)施方式以下，通過(guò)實(shí)施例更加詳細(xì)地說(shuō)明本發(fā)明。這種實(shí)施例僅用于更加詳細(xì)地說(shuō)明本發(fā)明，根據(jù)本發(fā)明的要旨，本發(fā)明的范圍不局限于這些實(shí)施例，這對(duì)于本發(fā)明所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的。實(shí)施例合成例1：肽的合成將700mg的氯三苯甲基氯樹(shù)脂(chlorotritylchlorideresin；ctlresin，novabiochemcatno.01-64-0021)放入反應(yīng)容器中，并加入10ml的二氯甲烷(mc)之后攪拌了3分鐘。去除溶液，并放入10ml的二甲基甲酰胺(dmf)來(lái)攪拌3分鐘后，重新去除了溶劑。將10ml的二氯甲烷溶液放入反應(yīng)器中，并放入200mmole的fmoc-l-his(trt)-oh(bachem，swiss)及400mmole的二異丙基乙胺(diea)后，攪拌并均勻溶解，攪拌1小時(shí)并進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)后清洗，將甲醇和二異丙基乙胺(2:1)溶解于二氯甲烷(dichloromethane，dcm)中，反應(yīng)10分鐘，并用過(guò)量的二氯甲烷/二甲基甲酰胺(1:1)進(jìn)行清洗。去除溶液，并放入10ml的二甲基甲酰胺(dmf)來(lái)攪拌3分鐘后，重新去除了溶劑。將10ml的脫保護(hù)溶液(20％的哌啶(piperidine)/二甲基甲酰胺)放入反應(yīng)容器中，并在常溫條件下攪拌10分鐘后，去除了溶液。放入同量的脫保護(hù)溶液，并重新維持10分鐘反應(yīng)后，去除溶液，并分別以3分鐘的方式用二甲基甲酰胺清洗2次、用二氯甲烷清洗1次、用二甲基甲酰胺清洗1次，來(lái)制備了his(trt)-ctl樹(shù)脂。在新的反應(yīng)器中放入10ml的二甲基甲酰胺溶液，并加入200mmole的fmoc-thr(tbu)-oh(bachem，swiss)、200mmole的羥基苯并三唑(hobt)及200mmole的苯并三氮唑-1-基氧基三(二甲基氨基)磷鎓六氟磷酸鹽(bop)后，攪拌來(lái)均勻溶解。在反應(yīng)器中，經(jīng)過(guò)2次以分餾的方式放入400mmole的n，n-二異丙基乙胺(diea，n，n-diisopropylethylamine)后，攪拌至所有固體溶解為止至少5分鐘。將溶解的氨基酸混合溶液放入具有脫保護(hù)的樹(shù)脂的反應(yīng)容器中，在常溫條件下攪拌1小時(shí)并進(jìn)行反應(yīng)。去除反應(yīng)液，并用二甲基甲酰胺溶液以每次攪拌5分鐘的方式攪拌3次后去除。取少量的反應(yīng)樹(shù)脂，并利用茚三酮測(cè)試(nihydrintest)檢查了反應(yīng)程度。使用脫保護(hù)溶液，以與上述方法相同的方法進(jìn)行2次脫保護(hù)反應(yīng)，來(lái)制備了thr(tbu)-his(trt)-ctl樹(shù)脂。使用二甲基甲酰胺和二氯甲烷充分清洗，并重新進(jìn)行一次茚三酮測(cè)試，接著以與上述方法相同的方法進(jìn)行了以下氨基酸附著實(shí)驗(yàn)。根據(jù)選定的氨基酸序列，按fmoc-ile、fmoc-trp、fmoc-lys(boc)、fmoc-glu(otbu)、fmoc-ser(tbu)、fmoc-ser(tbu)及fmoc-glu(otbu)的順序進(jìn)行連鎖反應(yīng)。利用脫保護(hù)溶液使fmoc-保護(hù)基以每次10分鐘的方式反應(yīng)2次后，清洗干凈并去除。利用二甲基甲酰胺、二氯甲烷及甲醇，分別將放入乙酸酐和n，n-二異丙基乙胺、羥基苯并三唑(hobt，hydroxybenzotriazole)乙?；?小時(shí)后所制備的肽基樹(shù)脂清洗3次，使氮?dú)饴魅雭?lái)干燥后，在五氧化二磷(phosphoruspentoxide，p2o5)條件下，減壓成真空狀態(tài)，來(lái)完全干燥后，放入30ml的泄漏溶液[81.5％的三氟乙酸(tfa，trifluroaceticacid)、5％的蒸餾水、5％的苯甲硫醚(thioanisole)、5％的苯酚(phenol)、2.5％的edt及1％的tis]，接著，在常溫條件下偶爾搖動(dòng)一下，并維持2小時(shí)反應(yīng)。通過(guò)過(guò)濾對(duì)樹(shù)脂進(jìn)行過(guò)濾，并利用少量的溶液清洗樹(shù)脂后，與母液進(jìn)行混合。利用減壓蒸餾至剩有總?cè)莘e的一半左右的容積，并加入50ml的涼的醚誘導(dǎo)沉淀后，進(jìn)行離心分離來(lái)收集沉淀，并利用更涼的醚清洗2次。去除母液，并在氮條件下充分干燥，來(lái)合成了0.5g的純化前nh2-cys-thr-lys-ile-tyr-asp-pro-val-cys-cooh的序列表中序列1的肽(收率：95％)、0.7g的nh2-cys-pro-arg-his-phe-asn-pro-val-cys-cooh的序列表中序列2的肽(收率：95％)。當(dāng)利用分子量測(cè)定儀測(cè)定時(shí)，可得到的序列目錄為第一序列的肽的分子量為1041.2(理論值：1041.25)，序列目錄為第二序列的肽的分子量為1072.2(理論值：1072.27)。表1實(shí)施例1：人真皮成纖維細(xì)胞的增殖促進(jìn)在第一次人真皮成纖維細(xì)胞(humanprimarydermalfibroblastcells)上按濃度(1ng/ml-1μg/ml)處理cg-renuin(序列號(hào)1的肽)或cg-noverin(2序列號(hào)的肽)，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72小時(shí)之后，將根據(jù)肽處理的細(xì)胞增殖變化通過(guò)srb實(shí)驗(yàn)(od590nm)來(lái)進(jìn)行了分析。以依賴于cg-renuin或cg-noverin的處理量的方式第一次人真皮成纖維細(xì)胞的增殖得到了增加。(圖2a-2b)。實(shí)施例2：在成纖維細(xì)胞中的renuin或cg-noverin的信號(hào)傳輸以2×105細(xì)胞/孔的細(xì)胞密度在6-孔板上種植nih3t3(表皮細(xì)胞株)，并培養(yǎng)一晚上之后，將cg-renuin或cg-noverin肽按濃度(1-10μg/ml)處理，并在37℃溫度下的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30分鐘后，照射uva(8j)，培養(yǎng)了24小時(shí)。通過(guò)處理細(xì)胞溶解緩沖來(lái)確保溶解物后，定量了蛋白質(zhì)。為了確認(rèn)細(xì)胞活性因子的表達(dá)，利用anti-perk(santacruzbiotechnology，usa)，p38(santacruzbiotechnology，usa)抗體，來(lái)實(shí)施了免疫印跡。在處理cg-renuin或cg-noverin的情況下，可以確認(rèn)出細(xì)胞的增殖、移動(dòng)及與生存相關(guān)的erk及p38的磷酸化的增加(圖3a-3b)。實(shí)施例3：根據(jù)cg-renuin或cg-noverin的rhmmp2的抑制按濃度(0.1μg/ml，1μg/ml)混合rhmmp2和肽，并在常溫下培養(yǎng)1小時(shí)后，為了執(zhí)行明膠酶譜(gelatinzymography)來(lái)確認(rèn)該表達(dá)，將明膠(2mg/ml)作為基質(zhì)執(zhí)行了蛋白質(zhì)電泳(sds-page)。電泳之后將凝膠在2.5％的tritonx-100中浸漬30分鐘之后，再次在組合50mmtris-hcl，0.2mnacl，5mmcacl2，1％tritonx-100的緩沖劑中，在37℃溫度下培養(yǎng)了24小時(shí)。培養(yǎng)之后利用coo-massiebrilliantbluer250(sigma)對(duì)凝膠進(jìn)行了染色，并利用由5％的甲醇和7.5％乙酸、蒸餾水來(lái)組成的溶液進(jìn)行了脫色。并且觀察了根據(jù)明膠水解而出現(xiàn)的波段，活性(active)基質(zhì)金屬蛋白酶-2是找出66kda波段來(lái)觀察的，pro-基質(zhì)金屬蛋白酶-2是找出72kda波段來(lái)觀察的。通過(guò)明膠酶譜確認(rèn)了根據(jù)cg-renuin及cg-noverin基質(zhì)金屬蛋白酶2的活性直接被抑制的事實(shí)(圖4a-4b)。實(shí)施例4：在成纖維細(xì)胞中根據(jù)cg-renuin或cg-noverin的rhmmp2的抑制按3×104細(xì)胞/孔的細(xì)胞密度在24孔板上種植成纖維細(xì)胞(nih3t3)。第二天利用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時(shí)，并利用tnf-α引導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶2的表達(dá)及活性化之后，將cg-renuin或cg-noverin分別按濃度(10ng/ml，100ng/ml，1000ng/ml)處理之后培養(yǎng)了24小時(shí)。將利用14000xg進(jìn)行10分的離心分離，來(lái)獲得的上清液培養(yǎng)之后，執(zhí)行明膠酶譜，為了確認(rèn)該表達(dá)以明膠(2mg/ml)作為基質(zhì)，執(zhí)行了蛋白質(zhì)電泳(sds-page)。電泳之后，將凝膠在2.5％的tritonx-100中浸漬30分鐘，再次在組合50mmtris-hcl，0.2mnacl，5mmcacl2，1％tritonx-100的緩沖劑中，在37℃溫度下培養(yǎng)了24小時(shí)。培養(yǎng)之后，利用coo-massiebrilliantbluer250(sigma)對(duì)凝膠進(jìn)行了染色，利用由5％的甲醇和7.5％的乙酸、蒸餾水來(lái)組成的溶液進(jìn)行了脫色。并且，觀察了根據(jù)明膠水解而出現(xiàn)的波段，活性基質(zhì)金屬蛋白酶-2是找出66kda來(lái)觀察的，pro-基質(zhì)金屬蛋白酶-2是找出72kda波段來(lái)觀察的。觀察了基質(zhì)金屬蛋白酶2的活性的結(jié)果，確認(rèn)了根據(jù)cg-renuin及cg-noverin抑制基質(zhì)金屬蛋白酶2的活性的事實(shí)(圖5a-5b)。實(shí)施例5：根據(jù)cg-renuin或cg-noverin的膠原蛋白分解抑制在24孔板種植hdf(humandermalfibroblast)細(xì)胞(3×104細(xì)胞)第二天利用5％的血清培養(yǎng)基培養(yǎng)了42小時(shí)之后，分別處理基質(zhì)金屬蛋白酶2(20ng/ml)(sigma/usa)和cg-noverin，cg-renuin之后，培養(yǎng)了6小時(shí)。將利用14000xg進(jìn)行10分鐘的離心分離，來(lái)獲得的上清液，利用pro-collagentypeikit(rndsystem/usa)進(jìn)行了分析。在24孔板種植hdf(humandermalfibroblast)細(xì)胞(3×104細(xì)胞)，第二天用5％的血清培養(yǎng)基交替之后，處理igf-1(100ng/ml)(sigma/usa)，并培養(yǎng)44小時(shí)之后，處理基質(zhì)金屬蛋白酶2(20ng/ml)和cg-noverin，cg-renuin之后，培養(yǎng)了4小時(shí)。將利用14000xg進(jìn)行10分鐘的離心分離，來(lái)獲得的上清液，利用pro-collagentypeikit進(jìn)行了分析。對(duì)于cg-renuin及cg-noverin是否具有抑制根據(jù)基質(zhì)金屬蛋白酶2引導(dǎo)的膠原蛋白分解，進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，確認(rèn)出，當(dāng)處理基質(zhì)金屬蛋白酶2時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的膠原蛋白分解與對(duì)照組相比增加，當(dāng)與cg-renuin或cg-noverin同時(shí)處理時(shí)，膠原蛋白分解的引導(dǎo)被抑制(圖6a-6b及圖7a-7b)。實(shí)施例6：根據(jù)cg-noverin、cg-renuin的黑素體轉(zhuǎn)移(melanosometransfer)抑制為了觀察黑素體轉(zhuǎn)移利用hacat角質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行了吞噬作用實(shí)驗(yàn)(phagocytosisassay)。作為用于吞噬作用的物質(zhì)利用了粘合有熒光(fluoroscence)物質(zhì)的生物粒子(bioparticle)。在96-孔組織培養(yǎng)用平板上培養(yǎng)24小時(shí)，使得每個(gè)孔具有3×103細(xì)胞，之后利用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)了6小時(shí)。之后，為了引導(dǎo)吞噬作用而處理1μg/ml的胰蛋白酶，并利用48小時(shí)處理了1μg/ml的肽。其結(jié)果，通過(guò)熒光顯微鏡來(lái)確認(rèn)了生物粒子向角質(zhì)細(xì)胞內(nèi)形成吞噬作用。當(dāng)將吞噬作用引導(dǎo)組，即胰蛋白酶處理組作為100％來(lái)進(jìn)行數(shù)據(jù)觀察時(shí)，已確認(rèn)在cg-noverin和cg-renuin的處理組中吞噬作用被抑制的事實(shí)。實(shí)施例7：cg-noverin的抗牙周病(anti-periodontal)功能在根據(jù)合成肽的牙周炎細(xì)胞中的抗炎癥效果為了觀察從上述合成例中合成的肽在牙周炎細(xì)胞中的抗炎癥效果，利用人齒根膜成纖維細(xì)胞(humanperiodontalligamentfibroblastcell)(atcc，usa)進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)。將人齒根膜成纖維細(xì)胞在6-孔組織培養(yǎng)用平板中培養(yǎng)了24小時(shí)，使得各個(gè)孔均具有5×101細(xì)胞。為了在牙周細(xì)胞引發(fā)炎癥，按10μg/ml的濃度處理胰蛋白酶(希格瑪(sigma)公司，美國(guó))之后，同樣以1μg/ml的濃度處理本發(fā)明的肽，并培養(yǎng)4小時(shí)之后，從對(duì)對(duì)照組與引發(fā)物質(zhì)且引發(fā)物質(zhì)與肽進(jìn)行處理的培養(yǎng)細(xì)胞中，提取mrna之后，利用par-2、白細(xì)胞介素-1β的引物進(jìn)行了逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。所使用的各個(gè)引物的核苷酸序列，如表2所示。表2白細(xì)胞介素-1β正向5’-ccgtggaccttccaggatca-3’白細(xì)胞介素-1β反向5’-gatccacactctccagctgc-3’par2正向5’-gggtttgccaagtaacggc-3’par2反向5’-gggaaccagatgacagagagg-3’如圖9所示，在人齒根膜成纖維細(xì)胞中處理胰蛋白酶來(lái)引發(fā)炎癥時(shí)，可以觀察到作為炎性細(xì)胞因子的par-2、白細(xì)胞介素-1β的表達(dá)得到增加，在同時(shí)處理本發(fā)明的肽時(shí)，可確認(rèn)出上述兩種炎性細(xì)胞因子的表達(dá)顯著得到抑制(圖9)。以上，詳細(xì)地說(shuō)明了本發(fā)明的特定部分，但可以明確的是，對(duì)于本發(fā)明所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，這些具體的說(shuō)明只屬于一個(gè)實(shí)例，本發(fā)明的范圍不局限于此。因此本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性范圍由所附加的發(fā)明要求保護(hù)范圍和其等同技術(shù)方案來(lái)定義。?序列表<110>caregenco,.ltd.<120>具有改善皮膚狀態(tài)的活性的肽及其用途<130>pp150080<150>kr14/0173957<151>2014-12-05<160>6<170>kopatentin2.0<210>1<211>9<212>prt<213>人工序列<220><223>cg-renuin<400>1cysthrlysiletyraspprovalcys15<210>2<211>9<212>prt<213>人工序列<220><223>cg-noverin<400>2cysproarghispheasnprovalcys15<210>3<211>20<212>dna<213>il-1β正向引物<400>3ccgtggaccttccaggatca20<210>4<211>20<212>dna<213>il-1β反向引物<400>4gatccacactctccagctgc20<210>5<211>18<212>dna<213>par2正向引物<400>5gggtttgccaagtaacgg18<210>6<211>21<212>dna<213>par2反向引物<400>6gggaaccagatgacagagagg21當(dāng)前第1頁(yè)12