呈現(xiàn)通過發(fā)酵路徑的增大的通量的重組微生物的制作方法
相關(guān)申請案的交叉引用
本申請案要求2014年12月8日提交的美國專利申請案62/089,053和2015年6月1日提交的美國專利申請案62/168,969的權(quán)益，所述申請案的全部內(nèi)容以引用的方式并入本文中。
背景技術(shù)：
一氧化碳營養(yǎng)型微生物可經(jīng)工程化以通過氣態(tài)底物的發(fā)酵來生產(chǎn)產(chǎn)物，如燃料和化學品。改善產(chǎn)物濃度和底物利用的努力歷史上專注于菌株選擇和發(fā)酵條件的最佳化(abubackar,《生物資源學技術(shù)(bioresourtechnol),114:518-522,2012)。然而，天然微生物的代謝并不進化以實現(xiàn)高產(chǎn)率、速率和滴度的商業(yè)目標，使得某些商業(yè)目標不可通過僅僅菌株選擇和發(fā)酵條件的最佳化來實現(xiàn)。因此，仍然需要改善的微生物和用于生產(chǎn)有用的產(chǎn)物(如燃料和化學品)的方法。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明提供一種重組、一氧化碳營養(yǎng)型梭菌屬(clostridium)細菌，其包含選自由以下各項組成的群組的一種或多種酶：丙酮酸:鐵氧還蛋白氧化還原酶(ec1.2.7.1)、乙酰乳酸合酶(ec2.2.1.6)和乙酰乳酸脫羧酶(ec4.1.1.5)，其中每種酶為過度表達內(nèi)源性酶、突變內(nèi)源性酶或外源性酶。重組細菌可表達這些酶中的一種、兩種或所有三種。
重組細菌可衍生自任何梭菌屬微生物。在一個實施例中，重組細菌衍生自自產(chǎn)乙醇梭菌(c.autoethanogenum)、揚氏梭菌(c.ljungdahlii)或拉氏梭菌(c.ragsdalei)。在優(yōu)選實施例中，重組細菌衍生自以dsmz登錄號dsm23693保藏的自產(chǎn)乙醇梭菌(自產(chǎn)乙醇梭菌lz1561)。
本發(fā)明進一步提供一種生產(chǎn)發(fā)酵產(chǎn)物的方法，包含在包含co的氣態(tài)底物存在下發(fā)酵重組細菌以生產(chǎn)乙醇、丁醇、異丙醇、異丁醇、高級醇、丁二醇、2,3-丁二醇、丁二酸酯、類異戊二烯、脂肪酸、生物聚合物及其混合物中的一種或多種。
附圖說明
圖1為詳述經(jīng)由乙?；?coa通過用于乙醇形成的一氧化碳營養(yǎng)型微生物的所測量的酶活性和通量的乙醇生物合成路徑的通量圖，其允許識別速率限制路徑反應(yīng)。箭頭的厚度與具體路徑反應(yīng)的活性成比例。
圖2為詳述經(jīng)由丙酮酸酯通過用于2,3-丁二醇形成的一氧化碳營養(yǎng)型微生物的所測量的酶活性和通量的通量圖，其允許識別速率限制路徑反應(yīng)。
圖3為示出2,3-丁二醇路徑和相關(guān)聯(lián)的支鏈氨基酸生物合成路徑的圖。丙酮酸酯轉(zhuǎn)化成α-乙酰乳酸酯，其為用于2,3-丁二醇和支鏈氨基酸生物合成路徑兩者的中間體。執(zhí)行實驗以過度表達pfor、alss和alsd。
圖4為pmtl83159質(zhì)粒的示意性表示。質(zhì)粒含有革蘭氏陰性復(fù)制起點(cole1)基因、革蘭氏陽性復(fù)制起點(reph)基因、轉(zhuǎn)移基因traj、編碼氯霉素/甲砜霉素抗性的catp基因、位于laczα編碼序列內(nèi)的多克隆位點以及鐵氧還蛋白基因啟動子(pfdx)。
圖5為示出五種在肖特瓶中生長的菌株的生長和代謝物特征曲線(生物質(zhì)、2,3-丁二醇(bdo)、乙酸和乙醇)對時間的一組曲線。
圖6為示出合并的pfor、alss和alsd過度表達菌株與質(zhì)粒對照菌株在4mol/l/dco吸收率下在20天的過程內(nèi)的代謝物特征曲線(頂部曲線)和氣體特征曲線(底部曲線)的一組曲線。
圖7為示出過度表達培養(yǎng)物在8mol/l/dco吸收率下在11天的過程內(nèi)的代謝物和氣體特征曲線的一組曲線。
圖8為示出表達嗜水氣單胞菌(a.hydrophila)alsd(空心正方形)、乳酸球菌(l.lactis)alsd(閉合正方形)和空質(zhì)粒對照組(三角形)的培養(yǎng)物的生物質(zhì)和丁二醇生產(chǎn)的一組曲線。值為一式三份的平均值并且誤差條表示一個標準偏差。
具體實施方式
發(fā)酵路徑為生化反應(yīng)(路徑反應(yīng))的級聯(lián)，通過所述發(fā)酵路徑底物，優(yōu)選地氣態(tài)底物，轉(zhuǎn)化成發(fā)酵產(chǎn)物。路徑反應(yīng)通常涉及催化或增大路徑反應(yīng)的速率的酶。
“通量”是指在發(fā)酵路徑中通過一種或多種反應(yīng)的代謝物流。通過單獨路徑反應(yīng)的通量具有上限和下限。因此，通量可通過調(diào)節(jié)影響酶活性的條件或因素來改變。通過一種路徑反應(yīng)的通量的調(diào)節(jié)可改變發(fā)酵路徑的總體通量。通量可根據(jù)本領(lǐng)域中已知的任何方法來測量。借助于實例，通量可使用通量-平衡分析(fba)(gianchandani,《系統(tǒng)生物學醫(yī)學(systemsbiolmedicine)》,2:372-382,2010)來測量。通過路徑的通量還可通過代謝物和產(chǎn)物的含量(代謝組學)(patti,《自然綜述分子細胞生物學(natrevmoleccellbiol)》,13:263-269,2012)和/或作為c13的標記實驗(通量組學)(niittylae,《分子生物學方法(methodsmolbiol)》,553:355-372,2009；tang,《質(zhì)譜綜述(massspectromrev)》,28:362-375,2009)來測量。
發(fā)酵路徑的效率可通過增大通過路徑的反應(yīng)通量而增大。增大的通量引起以下各項中的一者或多者：執(zhí)行發(fā)酵的微生物的生長速率增大、在升高的產(chǎn)物濃度下生長速率和/或產(chǎn)物生產(chǎn)速率增大、在發(fā)酵培養(yǎng)液中發(fā)酵產(chǎn)物濃度增大、每消耗的底物體積生產(chǎn)的發(fā)酵產(chǎn)物的體積增大、生產(chǎn)發(fā)酵產(chǎn)物的生產(chǎn)速率或含量增大。優(yōu)選地，增大的效率引起發(fā)酵產(chǎn)物生產(chǎn)速率增大。
一種識別速率限制反應(yīng)(瓶頸)的方法為對于參與發(fā)酵路徑的所有反應(yīng)從底物到產(chǎn)物測量酶活性。這可通過分析在工藝條件下生長的細胞中的反應(yīng)的酶活性以識別具有最低速率的反應(yīng)來進行。這些然后可調(diào)節(jié)以便不為速率限制的，由此增大在整個系統(tǒng)中的通量。酶活性可通過本領(lǐng)域中已知的任何方法來測量，如huang,《細菌學雜志(jbacteriol)》,194:3689-3699,2012中所描述的方法。
本發(fā)明人已分析參與發(fā)酵路徑的酶的活性并且發(fā)現(xiàn)一些路徑反應(yīng)呈現(xiàn)實質(zhì)上比相同路徑中的其它反應(yīng)低的酶活性。本文所述的重組微生物和方法對于其中親本微生物的產(chǎn)物產(chǎn)率可缺乏為切實可行商業(yè)目標的產(chǎn)物產(chǎn)率的路徑具有特別效用。
適合于分析酶活性的發(fā)酵路徑的實例包括伍德-永達爾(wood-ljungdahl)路徑、生產(chǎn)乙醇、2,3-丁二醇或其前體如乙?；?coa和丙酮酸酯的發(fā)酵路徑以及用于發(fā)酵路徑中可需要的輔因子四氫葉酸和鈷胺素(b12)的生物合成路徑。伍德-永達爾路徑由通過酶催化的多種反應(yīng)構(gòu)成，如圖1和圖2中所述。在引起需要的發(fā)酵產(chǎn)物的生產(chǎn)的伍德-永達爾路徑之后的步驟也被認為是發(fā)酵路徑的一部分。在具體實施例中，發(fā)酵路徑引起選自由以下各項組成的群組的發(fā)酵產(chǎn)物的生產(chǎn)：乙醇、丁醇、異丙醇、異丁醇、高級醇、丁二醇、2,3-丁二醇、丁二酸酯、類異戊二烯、脂肪酸、生物聚合物及其混合物。
本發(fā)明提供一種重組、一氧化碳營養(yǎng)型梭菌屬細菌，其包含選自由以下各項組成的群組的一種或多種酶：丙酮酸:鐵氧還蛋白氧化還原酶(ec1.2.7.1)、乙酰乳酸合酶(ec2.2.1.6)和乙酰乳酸脫羧酶(ec4.1.1.5)，其中每種酶為過度表達內(nèi)源性酶、突變內(nèi)源性酶或外源性酶。
“親本微生物”為用于生成本發(fā)明的重組微生物的微生物。親本微生物可為在自然界中存在的一種微生物(即，野生型微生物)或先前已修飾的一種微生物(即重組微生物)。本發(fā)明的重組微生物可經(jīng)修飾以表達或過度表達在親本微生物中表達或過度表達或者未表達或未過度表達的一種或多種酶，或可經(jīng)修飾以呈現(xiàn)一種或多種輔因子的增大的可用性。在一個實施例中，親本生物可為自產(chǎn)乙醇梭菌、揚氏梭菌或拉氏梭菌。在特別優(yōu)選的實施例中，親本生物為以dsmz登錄號dsm23693保藏的自產(chǎn)乙醇梭菌lz1561。
“重組微生物”為當相比于親本微生物時已進行基因修飾的微生物。舉例來說，基因修飾包括核酸的插入、缺失或取代。
一般來說，術(shù)語“衍生自”表示核酸、蛋白質(zhì)或微生物分別從不同的(即，親本或野生型)核酸、蛋白質(zhì)或微生物經(jīng)修飾或調(diào)適，從而產(chǎn)生新的重組微生物。
親本微生物的基因修飾的法包括分子方法，如異源基因表達、基因組插入或缺失、改變的基因表達或基因的失活，或酶工程方法。此類技術(shù)描述于例如sambrook,《分子克隆實驗指南(molecularcloning:alaboratorymanual)》,冷泉港實驗室出版社(coldspringharborlaboratorypress),紐約州冷泉港(coldspringharbor,ny),2001；pleiss,《生物技術(shù)新見(curropinbiotechnol)》,22:611-617,2011；park,《蛋白質(zhì)工程與設(shè)計(proteinengineeringanddesign)》,crc出版社(crcpress),2010中。表達構(gòu)筑體/載體可含有例如一種或多種啟動子或核糖體結(jié)合位點。本文所述的核酸和構(gòu)筑體/載體序列還可含有標準連接核苷酸，如核糖體結(jié)合位點和/或限制位點所需的那些。
包括本發(fā)明的表達構(gòu)筑體/載體的核酸和核酸構(gòu)筑體可使用本領(lǐng)域中已知的任何方法構(gòu)筑。舉例來說，可使用化學合成或重組技術(shù)。此類技術(shù)描述于例如sambrook,《分子克隆實驗指南》,冷泉港實驗室出版社,紐約州冷泉港,1989)中?；旧希瑐€別基因和調(diào)控元件將可操作地彼此連接使得基因可表達以形成所需蛋白質(zhì)。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將理解合適的載體。然而，借助于實例，以下載體可為合適的：pmtl80000載體、pimp1、pjir750和其它質(zhì)粒。
核酸可使用本領(lǐng)域中已知的任何方法遞送到微生物。舉例來說，核酸可作為裸露核酸遞送到微生物或可用一種或多種試劑(例如，脂質(zhì)體)調(diào)配以促進到微生物的轉(zhuǎn)化過程。核酸可視情況為dna、rna、cdna或其組合。在某些實施例中，可使用限制抑制劑(murray,《微生物學與分子生物學綜述(microbiolmolecbiolrev)》,64:412-434,2000)。附加載體包括包括質(zhì)粒、病毒(包括噬菌體)、粘粒和人工染色體。在優(yōu)選實施例中，核酸使用質(zhì)粒遞送到微生物。僅借助于實例，轉(zhuǎn)化(包括轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)染)可通過電穿孔、超聲波處理、聚乙二醇介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、化學或天然感受態(tài)、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化、前噬菌體誘導(dǎo)或結(jié)合來實現(xiàn)。合適的轉(zhuǎn)化技術(shù)描述于例如sambrook,《分子克隆實驗指南》,冷泉港實驗室出版社,紐約州冷泉港,1989中。
電穿孔的使用已報告用于若干一氧化碳營養(yǎng)型產(chǎn)乙酸菌(acetogens)，所述一氧化碳營養(yǎng)型產(chǎn)乙酸菌包括揚氏梭菌(koepke,《美國國家科學院院刊(pnas)》,107:13087-13092,2010；wo/2012/053905)、自產(chǎn)乙醇梭菌(wo/2012/053905)、醋酸梭菌(c.aceticum)(schiel-bengelsdorf,《合成生物學(syntheticbiol)》,15:2191-2198,2012)和伍氏醋酸桿菌(a.woodii)(
本發(fā)明提供一種被調(diào)適用于呈現(xiàn)相對于親本微生物通過發(fā)酵路徑的增大的通量的重組一氧化碳營養(yǎng)型梭菌屬細菌。在本發(fā)明的一個具體實施例中，親本微生物選自一氧化碳營養(yǎng)型梭菌屬的群組，所述一氧化碳營養(yǎng)型梭菌屬包含自產(chǎn)乙醇梭菌、揚氏梭菌、拉氏梭菌、食一氧化碳梭菌(c.carboxidivorans)、德氏梭菌(c.drakei)、糞味梭菌、醋酸梭菌、甲酰乙酸梭菌(c.formicoaceticum)和大梭菌(c.magnum)。
重組細菌可衍生自包含物種自產(chǎn)乙醇梭菌、揚氏梭菌、拉氏梭菌和相關(guān)分離株的一氧化碳營養(yǎng)型梭菌屬的簇。這些細菌包括但不限于菌株自產(chǎn)乙醇梭菌jai-1t(dsm10061)(abrini,《微生物學文獻集(archmicrobiol)》,161:345-351,1994)、自產(chǎn)乙醇梭菌lbs1560(dsm19630)(wo2009/064200)、自產(chǎn)乙醇梭菌lz1561(dsm23693)、揚氏梭菌petct(dsm13528＝atcc55383)(tanner,《國際系統(tǒng)細菌學雜志(intjsystbacteriol)》,43:232-236,1993)、揚氏梭菌eri-2(atcc55380)(美國專利5,593,886)、揚氏梭菌c-01(atcc55988)(美國專利6,368,819)、揚氏梭菌o-52(atcc55989)(美國專利6,368,819)、拉氏梭菌p11t(atccbaa-622)(wo2008/028055)、相關(guān)分離株如“科斯卡塔梭菌(c.coskatii)”(美國公開案2011/0229947)或突變菌株如揚氏梭菌ota-1(tirado-acevedo,《使用揚氏梭菌從合成氣生產(chǎn)生物乙醇(productionofbioethanolfromsynthesisgasusingclostridiumljungdahlii)》,博士論文(phdthesis),北卡羅來納州大學(northcarolinastateuniversity),2010)。這些菌株在梭菌rrna簇i內(nèi)形成子簇，并且其16srrna基因超過99％一致，具有約30％的類似低gc含量。然而，dna-dna重締合和dna指紋識別實驗顯示，這些菌株屬于不同種(wo2008/028055)。此簇菌株由共同特征定義，具有類似的基因型和表現(xiàn)型兩者，并且它們?nèi)抗蚕硐嗤哪芰渴睾愫桶l(fā)酵代謝模式。此簇菌株缺乏細胞色素并且經(jīng)由rnf絡(luò)合物保存能量。
以上所提及簇中的所有物種都具有類似的形態(tài)和大小(對數(shù)生長細胞在0.5-0.7×3-5μm之間)，嗜中溫(最佳生長溫度在30℃至37℃之間)，并且絕對厭氧(abrini,《微生物學文獻集》,161:345-351,1994；tanner,《國際系統(tǒng)細菌學雜志》,43:232-236,1993；以及wo2008/028055)。此外，它們?nèi)抗蚕硐嗤闹饕到y(tǒng)發(fā)育特點，如相同ph范圍(ph4至7.5，最佳初始ph為5.5至6)，基于含co的氣體的自營生長強，生長速率類似，并且代謝概況類似，以乙醇和乙酸作為主要發(fā)酵最終產(chǎn)物，并且在某些條件下形成少量2,3-丁二醇和乳酸(abrini,《微生物學文獻集》,161:345-351,1994；
在一個實施例中，親本微生物為自產(chǎn)乙醇梭菌、揚氏梭菌或拉氏梭菌。優(yōu)選地，親本微生物為野生型自產(chǎn)乙醇梭菌或以dsmz登錄號dsm10061或dsm23693保藏的自產(chǎn)乙醇梭菌(自產(chǎn)乙醇梭菌lz1561)。在一個實施例中，重組細菌衍生自自產(chǎn)乙醇梭菌、揚氏梭菌或拉氏梭菌。優(yōu)選地，重組細菌衍生自野生型自產(chǎn)乙醇梭菌或以dsmz登錄號dsm23693保藏的自產(chǎn)乙醇梭菌(自產(chǎn)乙醇梭菌lz1561)。
本發(fā)明的酶和基因可為過度表達內(nèi)源性酶和基因、突變內(nèi)源性酶和基因或外源性酶和基因。
“內(nèi)源性”是指存在于衍生本發(fā)明的重組細菌的野生型或親本細菌中的核酸或蛋白質(zhì)。在一個實施例中，內(nèi)源性基因的表達可通過如外源性啟動子的外源性調(diào)控元件控制。
“外源性”是指不存在于衍生本發(fā)明的重組細菌的野生型或親本細菌中的核酸或蛋白質(zhì)。在一個實施例中，外源性基因或酶可衍生自異源菌株或物種并且被引入重組細菌或在重組細菌中表達。在另一個實施例中，外源性基因或酶可人工地或以重組方式產(chǎn)生。外源性核酸可被調(diào)適以整合到細菌的基因組中，或者在細菌中例如在質(zhì)粒中保持染色體外狀態(tài)。
“酶活性”廣泛地指酶促活性，包括但不限于酶的活性、酶的量或用于催化反應(yīng)的酶的可用性。因此，“增大”酶活性包括酶的活性的增大、酶的量的增大或用于催化反應(yīng)的酶的可用性的增大。
本發(fā)明的基因和酶可使用本領(lǐng)域中已知的任何方法開發(fā)或工程化，包括例如定向進化、知識類設(shè)計、隨機誘變方法、基因改組、密碼子優(yōu)化、使用位點特異性庫以及使用位點評估庫。
“突變”是指相較于衍生本發(fā)明的重組細菌的野生型或親本細菌，在本發(fā)明的重組細菌中已經(jīng)修飾的核酸或蛋白質(zhì)。在一個實施例中，突變可為編碼酶的基因的缺失、插入或取代。在另一個實施例中，突變可為酶中的一種或多種氨基酸的缺失、插入或取代。
“密碼子優(yōu)化”是指用于在具體菌株或物種中核酸的經(jīng)優(yōu)化或改善的轉(zhuǎn)譯的核酸如基因的突變。密碼子優(yōu)化可引起更快轉(zhuǎn)譯速率或更高轉(zhuǎn)譯準確度。在優(yōu)選實施例中，編碼本發(fā)明的酶的基因為針對在梭菌屬，具體地說自產(chǎn)乙醇梭菌、揚氏梭菌和/或拉氏梭菌中的表達而優(yōu)化的密碼子。在另一優(yōu)選實施例中，編碼本發(fā)明的酶的基因為針對在自產(chǎn)乙醇梭菌lz1561中表達而優(yōu)化的密碼子。
“過度表達”是指相較于衍生本發(fā)明的重組細菌的野生型或親本細菌，在本發(fā)明的重組細菌中核酸或蛋白質(zhì)的表達的任何增大。過度表達可通過本領(lǐng)域中已知的任何手段實現(xiàn)，包括改變基因拷貝數(shù)、基因轉(zhuǎn)錄速率、基因轉(zhuǎn)譯速率或酶降解速率。
“過度表達內(nèi)源性酶”是指相較于衍生本發(fā)明的重組細菌的野生型或親本細菌，在本發(fā)明的重組細菌中以較高含量存在的內(nèi)源性酶。過度表達內(nèi)源性酶可同樣地由內(nèi)源性基因編碼，所述內(nèi)源性基因可經(jīng)修飾，例如以由強或組成性啟動子控制。類似地，“過度表達內(nèi)源性基因”是指相較于衍生本發(fā)明的重組細菌的野生型或親本細菌，在本發(fā)明的重組細菌中以較高速率或含量存在或轉(zhuǎn)錄的內(nèi)源性基因。
“突變內(nèi)源性酶”是指相較于衍生本發(fā)明的重組細菌的野生型或親本細菌，在本發(fā)明的重組細菌中突變或經(jīng)修飾的內(nèi)源性酶。類似地，“突變內(nèi)源性基因”是指相較于衍生本發(fā)明的重組細菌的野生型或親本細菌，在本發(fā)明的重組細菌中突變或經(jīng)修飾的內(nèi)源性基因。
“外源性酶”是指不存在于衍生本發(fā)明的重組細菌的野生型或親本細菌中的酶。類似地，“外源性基因”是指不存在于衍生本發(fā)明的重組細菌的野生型或親本細菌中的基因。通常，外源性酶或基因衍生自異源菌株或物種并且被引入重組細菌或在重組細菌中表達。
本發(fā)明可使用序列不同于本文具體示例的序列的變異體核酸或蛋白質(zhì)實施，限制條件為其執(zhí)行實質(zhì)上相同的功能。對于編碼蛋白質(zhì)或肽的核酸序列，這意味著所編碼的蛋白質(zhì)或肽具有實質(zhì)上相同的功能。對于表示啟動子序列的核酸序列，變異體序列將具有類似的促進一種或多種基因的表達的能力。此類核酸或蛋白質(zhì)在本文中可被稱為“功能上等效的變異體”。借助于實例，核酸的功能上等效的變異體包括等位基因變異體、基因片段、包括突變(缺失、插入、核苷酸取代等)和/或多態(tài)性的基因等。來自其它微生物的同源基因也可被視為是本文具體示例的序列的功能上等效的變異體的實例。這些基因包括在如丙酮丁醇梭菌、拜氏梭菌(c.beijerinckii)或揚氏梭菌的種中的同源基因，其詳情在如genbank或ncbi的網(wǎng)站上可公開獲得。功能上等效的變異體也包括序列由于對于具體生物體的密碼子優(yōu)化而變化的核酸。核酸的功能上等效的變異體將優(yōu)選地與所指定的核酸具有至少約70％、約80％、約85％、約90％、約95％、約98％或更大的核酸序列一致性。蛋白質(zhì)的功能上等效的變異體將優(yōu)選地與所指定的蛋白質(zhì)具有至少約70％、約80％、約85％、約90％、約95％、約98％或更大的氨基酸一致性。此類變異體包括蛋白質(zhì)或肽的片段，其中所述片段包含截短形式的蛋白質(zhì)或肽，其中缺失可為1到5個、到10個、到15個、到20個、到25個氨基酸，并可在多肽的任一末端延伸1到25個殘基，并且其中缺失可為所述區(qū)域內(nèi)的任何長度或可位于內(nèi)部位置。變異體核酸或蛋白質(zhì)的功能等效性可使用本領(lǐng)域中已知的任何方法評估。然而，借助于實例，測試某些酶的活性的分析描述于huang,《細菌學雜志(jbacteriol)》,194:3689-3699,2012中。
在具有活性限制酶系統(tǒng)的某些實施例中，可能有必要在將核酸引入到微生物中之前使所述核酸甲基化。
一般來說，使用促進構(gòu)成表達構(gòu)筑體/載體的核酸序列的甲基化的穿梭微生物，優(yōu)選地限制陰性穿梭微生物如大腸桿菌(e.coli)、枯草芽孢桿菌(b.subtillis)或乳酸球菌執(zhí)行甲基化。甲基化構(gòu)筑體/載體包含編碼甲基轉(zhuǎn)移酶的核酸序列。一旦表達構(gòu)筑體/載體和甲基化構(gòu)筑體/載體被引入到穿梭微生物中，存在于甲基化構(gòu)筑體/載體上的甲基轉(zhuǎn)移酶基因即被誘導(dǎo)。誘導(dǎo)可通過任何合適的啟動子系統(tǒng)進行，不過在本發(fā)明的一個具體實施例中，甲基化構(gòu)筑體/載體包含誘導(dǎo)型lac啟動子并且通過加入乳糖或其類似物、更優(yōu)選地異丙基-β-d-硫基-半乳糖苷(iptg)來誘導(dǎo)。其它合適的啟動子包括ara、tet或t7系統(tǒng)。在另一實施例中，甲基化構(gòu)筑體/載體啟動子為組成性啟動子。
在一個具體實施例中，甲基化構(gòu)筑體/載體具有對穿梭微生物的身份具有特異性的復(fù)制起點，使得存在于甲基化構(gòu)筑體/載體上的任何基因都在穿梭微生物中表達。優(yōu)選地，表達構(gòu)筑體/載體具有對目標微生物的身份具有特異性的復(fù)制起點，使得存在于表達構(gòu)筑體/載體上的任何基因都在目標微生物中表達。
甲基轉(zhuǎn)移酶的表達引起存在于表達構(gòu)筑體/載體上的基因的甲基化。表達構(gòu)筑體/載體可接著根據(jù)本領(lǐng)域中已知的任何方法從穿梭微生物中分離。在一個實施例中，構(gòu)筑體/載體兩者同時分離。表達構(gòu)筑體/載體可使用本領(lǐng)域中已知的任何方法被引入到目標微生物中。由于表達構(gòu)筑體/載體被甲基化，所以存在于表達構(gòu)筑體/載體上的核酸序列能夠并入到目標微生物中并且成功地表達。
甲基轉(zhuǎn)移酶基因可被引入到穿梭微生物中并且過度表達。因此，在一個實施例中，所得甲基轉(zhuǎn)移酶可使用已知方法收集并且體外用于甲基化表達質(zhì)粒。表達構(gòu)筑體/載體可接著被引入到目標微生物中以便表達。在另一個實施例中，甲基轉(zhuǎn)移酶基因被引入到穿梭微生物的基因組中，隨后將表達構(gòu)筑體/載體引入到穿梭微生物中，從穿梭微生物分離一種或多種構(gòu)筑體/載體，并且接著將表達構(gòu)筑體/載體引入到目標微生物中。
表達構(gòu)筑體/載體和甲基化構(gòu)筑體/載體可合并以提供物質(zhì)的組合物。此類組合物在避開限制屏障機制中具有特別效用，從而產(chǎn)生本發(fā)明的重組微生物。在一個具體實施例中，表達構(gòu)筑體/載體和/或甲基化構(gòu)筑體/載體為質(zhì)粒?？墒褂枚喾N合適的甲基轉(zhuǎn)移酶，包括例如枯草芽孢桿菌(b.subtilis)噬菌體φt1甲基轉(zhuǎn)移酶或描述于wo2012/053905中的甲基轉(zhuǎn)移酶。類似地，多種被調(diào)適以允許表達甲基轉(zhuǎn)移酶基因的構(gòu)筑體/載體均可用于生成甲基化構(gòu)筑體/載體。
借助于實例，在一個實施例中，本發(fā)明的重組微生物可通過包含以下的方法產(chǎn)生：(a)將(i)包含如本文所述的核酸的表達構(gòu)筑體/載體和(ii)包含甲基轉(zhuǎn)移酶基因的甲基化構(gòu)筑體/載體引入到穿梭微生物中；和(b)表達甲基轉(zhuǎn)移酶基因；從穿梭微生物中分離一種或多種構(gòu)筑體/載體；以及將一種或多種構(gòu)筑體/載體引入到目標微生物中。在一個實施例中，步驟(b)的甲基轉(zhuǎn)移酶基因組成性地表達。在另一個實施例中，步驟(b)的甲基轉(zhuǎn)移酶基因的表達是被誘導(dǎo)的。
本發(fā)明的重組細菌包含丙酮酸:鐵氧還蛋白氧化還原酶、乙酰乳酸合酶和乙酰乳酸脫羧酶中的一種或多種。
丙酮酸:鐵氧還蛋白氧化還原酶(pfor或por)(ec1.2.7.1)為屬于氧化還原酶族的酶，其催化電子從一個分子(還原劑或電子供體)轉(zhuǎn)移到另一個分子(氧化劑或電子接受體)。具體來說，丙酮酸:鐵氧還蛋白氧化還原酶催化丙酮酸酯和
本發(fā)明的丙酮酸:鐵氧還蛋白氧化還原酶可為過度表達內(nèi)源性酶、突變內(nèi)源性酶或外源性酶。類似地，本發(fā)明的丙酮酸:鐵氧還蛋白氧化還原酶可由已經(jīng)工程化用于過度表達的內(nèi)源性丙酮酸:鐵氧還蛋白氧化還原酶基因編碼、可由突變內(nèi)源性丙酮酸:鐵氧還蛋白氧化還原酶基因編碼，或可由外源性丙酮酸:鐵氧還蛋白氧化還原酶基因編碼。在優(yōu)選實施例中，丙酮酸:鐵氧還蛋白氧化還原酶為過度表達內(nèi)源性丙酮酸:鐵氧還蛋白氧化還原酶，如過度表達內(nèi)源性自產(chǎn)乙醇梭菌、揚氏梭菌，或拉氏梭菌丙酮酸:鐵氧還蛋白氧化還原酶。丙酮酸:鐵氧還蛋白氧化還原酶在氧存在下通常不穩(wěn)定。在優(yōu)選實施例中，丙酮酸:鐵氧還蛋白氧化還原酶為氧穩(wěn)定的或展現(xiàn)至少一定程度的氧不敏感性。在另一優(yōu)選實施例中，丙酮酸:鐵氧還蛋白氧化還原酶為外源性非洲脫硫弧菌(desulfovibrioafricanus)丙酮酸:鐵氧還蛋白氧化還原酶或由此衍生的酶。已證實，非洲脫硫弧菌(d.africanus)丙酮酸:鐵氧還蛋白氧化還原酶的表達在大腸桿菌中(pieulle,《細菌學雜志》,179：5684-5692,1997)，但不在梭菌屬微生物中。
乙酰乳酸合酶(als)(ec2.2.1.6)為催化在合成支鏈氨基酸如纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸中的第一步驟的酶。具體來說，乙酰乳酸合酶為轉(zhuǎn)酮醇酶，其具有分解代謝和合成代謝形式兩者并且催化兩個丙酮酸酯分子轉(zhuǎn)化成乙酰乳酸酯分子和二氧化碳：
本發(fā)明的乙酰乳酸合酶可為過度表達內(nèi)源性酶、突變內(nèi)源性酶或外源性酶。類似地，本發(fā)明的乙酰乳酸合酶可由已經(jīng)工程化用于過度表達的內(nèi)源性乙酰乳酸合酶基因編碼、可由突變內(nèi)源性乙酰乳酸合酶基因編碼，或可由外源性乙酰乳酸合酶基因編碼。乙酰乳酸合酶可為合成代謝或分解代謝的。在優(yōu)選實施例中，乙酰乳酸合酶為過度表達內(nèi)源性乙酰乳酸合酶，如過度表達內(nèi)源性自產(chǎn)乙醇梭菌、揚氏梭菌或拉氏梭菌乙酰乳酸合酶。具體來說，乙酰乳酸合酶可為過度表達內(nèi)源性ilvb、ilvborf2059、ilvborf2336、ilvc、ilvn、ilvbn或alss乙酰乳酸合酶。在優(yōu)選實施例中，乙酰乳酸合酶為突變內(nèi)源性乙酰乳酸合酶，如衍生自任何內(nèi)源性自產(chǎn)乙醇梭菌、揚氏梭菌或拉氏梭菌乙酰乳酸合酶的突變乙酰乳酸合酶。具體來說，突變內(nèi)源性乙酰乳酸合酶可為反饋不敏感的ilvn乙酰乳酸合酶。在優(yōu)選實施例中，乙酰乳酸合酶為外源性乙酰乳酸合酶，如枯草芽孢桿菌乙酰乳酸酯合成，具體地說反饋不敏感的枯草芽孢桿菌(b.subtilis)alss乙酰乳酸合酶。已顯示，枯草芽孢桿菌alss的表達在細長聚球藻(synechococcuselongatus)種菌株pcc7942中(oliver,《代謝工程(metaboleng)》,22:76-82,2014)，但不在梭菌屬微生物中。
乙酰乳酸脫羧酶(ec4.1.1.5)為屬于裂解酶具體地說羧基-裂解酶族的酶，其分解碳-碳鍵。乙酰乳酸脫羧酶催化(s)-2-羥基-2-甲基-3-側(cè)氧基丁酸酯到(r)-2-乙偶姻和co2的反應(yīng)：
本發(fā)明的乙酰乳酸脫羧酶可為過度表達內(nèi)源性酶、突變內(nèi)源性酶或外源性酶。類似地，本發(fā)明的乙酰乳酸脫羧酶可由已經(jīng)工程化用于過度表達的內(nèi)源性乙酰乳酸脫羧酶基因編碼、可由突變內(nèi)源性乙酰乳酸脫羧酶基因編碼，或可由外源性乙酰乳酸脫羧酶基因編碼。在優(yōu)選實施例中，乙酰乳酸脫羧酶為過度表達內(nèi)源性乙酰乳酸脫羧酶，如過度表達內(nèi)源性自產(chǎn)乙醇梭菌、揚氏梭菌或拉氏梭菌乙酰乳酸脫羧酶。過度表達內(nèi)源性乙酰乳酸脫羧酶可為buda乙酰乳酸脫羧酶或alsd乙酰乳酸脫羧酶。在優(yōu)選實施例中，乙酰乳酸脫羧酶為外源性乙酰乳酸脫羧酶，如嗜水氣單胞菌(aeromonashydrophila)乙酰乳酸脫羧酶或乳明串珠菌(leuconostoclactis)乙酰乳酸脫羧酶。已顯示，枯草芽孢桿菌alsd的表達在細長聚球藻種菌株pcc7942中(oliver,《代謝工程》,22:76-82,2014)，但不在梭菌屬微生物中。
丙酮酸:鐵氧還蛋白氧化還原酶、乙酰乳酸合酶和乙酰乳酸脫氫酶可包含或可衍生自下表中的任何氨基酸序列。類似地，編碼丙酮酸:鐵氧還蛋白氧化還原酶、乙酰乳酸合酶和乙酰乳酸脫氫酶的基因可包含或可衍生自下表中的任何核酸序列。此外，任何酶或基因可為下表中的序列的變異體。舉例來說，酶或基因與下表中的序列可具有約80％、約90％、約95％或約99％序列一致性。
本發(fā)明的重組細菌還可包含丙酮酸:鐵氧還蛋白氧化還原酶、乙酰乳酸合酶和乙酰乳酸脫羧酶的任何組合。細菌可包含丙酮酸:鐵氧還蛋白氧化還原酶和乙酰乳酸合酶，但不包含乙酰乳酸脫羧酶。細菌可包含丙酮酸:鐵氧還蛋白氧化還原酶和乙酰乳酸脫羧酶，但不包含乙酰乳酸合酶。細菌可包含乙酰乳酸合酶和乙酰乳酸脫羧酶，但不包含丙酮酸:鐵氧還蛋白氧化還原酶。最后，細菌可包含丙酮酸:鐵氧還蛋白氧化還原酶、乙酰乳酸合酶和乙酰乳酸脫羧酶中的每一種。
本發(fā)明的重組細菌可進一步表達或經(jīng)工程化以表達或過度表達以下各項中的一種或多種：醇脫氫酶(ec1.1.1.1)、醛脫氫酶(?；?(ec1.2.1.10)、甲酸脫氫酶(ec1.2.1.2)、甲酰基-thf合成酶(ec6.3.2.17)、亞甲基-thf脫氫酶/甲?；?thf環(huán)水解酶(ec:6.3.4.3)、亞甲基-thf還原酶(ec1.1,1.58)、co脫氫酶/乙酰基-coa合酶(ec2.3.1.169)、醛鐵氧還蛋白氧化還原酶(ec1.2.7.5)、磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶(ec2.3.1.8)、乙酸激酶(ec2.7.2.1)、co脫氫酶(ec1.2.99.2)、氫化酶(ec1.12.7.2)、丙酮酸:甲酸裂解酶(ec2.3.1.54)、2,3-丁二醇脫氫酶(ec1.1.1.4)、伯醇:仲醇脫氫酶(ec1.1.1.1)、甲酸脫氫酶(ec1.2.1.2)、甲?；?thf合成酶(ec6.3.2.17)、亞甲基-thf脫氫酶/甲?；?thf環(huán)水解酶(ec:6.3.4.3)、亞甲基-thf還原酶(ec1.1,1.58)、co脫氫酶/乙酰基-coa合酶(ec2.3.1.169)、co脫氫酶(ec1.2.99.2)以及氫化酶(ec1.12.7.2)。
“酶輔因子”或僅“輔因子”為結(jié)合到酶以促進酶的生物功能以及由此催化反應(yīng)的非蛋白質(zhì)化合物。輔因子的非限制性實例包括nad+、nadp+、鈷胺素、四氫葉酸和鐵氧還蛋白?！盁燉０废汆堰识塑账帷?nadh)是指nad+(氧化形式)、nadh+h+(還原形式)或nad+和nadh+h+兩者的氧化還原對?！盁燉０废汆堰识塑账崃姿帷?nadph)是指nadp+(氧化形式)、nadph+h+(還原形式)或nadp+和nadph+h+兩者的氧化還原對。輔因子的總體可用性的增大可增大路徑反應(yīng)的速率?？捎绊戄o因子的生產(chǎn)的因素包括可改變以實現(xiàn)增大輔因子的可用性的輔因子生物合成基因的表達。本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的其它因素還可用于實現(xiàn)增大輔因子的可用性。輔因子的可用性缺乏可對路徑反應(yīng)具有速率限制效應(yīng)。用于確定輔因子的可用性的方法是本領(lǐng)域中已知的。
本發(fā)明的重組細菌可進一步表達或經(jīng)工程化以表達或過度表達參與輔因子的生物合成的酶。在具體實施例中，輔因子包含四氫葉酸。參與四氫葉酸的生物合成的酶在下文詳述。因此，在具體實施例中，重組微生物呈現(xiàn)以下各項的增大的表達：gtp環(huán)水解酶i(ec3.5.4.16)、堿性磷酸酶(ec3.1.3.1)、二氫新蝶呤醛縮酶(ec4.1.2.25)、2-氨基-4-羥基-6-羥基甲基二氫蝶啶二磷酸激酶(ec2.7.6.3)、二氫蝶酸合酶(2.5.1.15)、二氫蝶酸合酶(2.5.1.15)、二氫葉酸合酶(ec6.3.2.12)、葉酰多谷氨酸合酶(6.3.2.17)、二氫葉酸還原酶(ec1.5.1.3)、胸苷酸合酶(ec2.1.1.45)、二氫氨甲喋呤還原酶(ec1.5.1.-)。在具體實施例中，輔因子包含鈷胺素(b12)。參與鈷胺素的生物合成的酶在下文詳述。因此，在具體實施例中，重組微生物呈現(xiàn)以下各項的增大的表達：5-氨基乙酰丙酸酯合酶(ec2.3.1.37)、5-氨基乙酰丙酸:丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶(ec2.6.1.43)、腺苷鈷啉醇酰胺激酶/腺苷鈷啉醇酰胺-磷酸鳥苷酸轉(zhuǎn)移酶(ec2.7.1.156/2.7.7.62)、腺苷鈷啉醇酰胺-gdp三氮唑核苷轉(zhuǎn)移酶(ec2.7.8.26)、腺苷鈷啉醇酰胺-磷酸合酶(ec6.3.1.10)、腺苷鈷啉酸合酶(ec6.3.5.10)、α-三氮唑核苷磷酸酶(ec3.1.3.73)、鈷(i)胺素腺苷轉(zhuǎn)移酶(ec2.5.1.17)、鈷(ii)啉酸a,c-二酰胺還原酶(ec1.16.8.1)、鈷-前咕啉5a水解酶(ec3.7.1.12)、鈷-前咕啉-5b(c1)-甲基轉(zhuǎn)移酶(ec2.1.1.195)、鈷-前咕啉-7(c15)-甲基轉(zhuǎn)移酶(ec2.1.1.196)、鈷螯合酶cobn(ec6.6.1.2)、鈷啉酸a,c-二酰胺合酶(ec6.3.5.9/6.3.5.11)、鐵蛋白(ec1.16.3.1)、谷氨酸-1-半醛2,1-氨基變位酶(ec5.4.3.8)、谷氨?；?trna還原酶(ec1.2.1.70)、谷氨?；?trna合成酶(ec6.1.1.17)、羥甲基膽素合酶(ec2.5.1.61)、煙堿酸-核苷酸-二甲基苯并咪唑磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(ec2.4.2.21)、氧-獨立糞卟啉原iii氧化酶(ec1.3.99.22)、膽色素原合酶(ec4.2.1.24)、前咕啉-2脫氫酶/西羅葉綠三酸(sirohydrochlorin)亞鐵螯合酶(ec1.3.1.76/4.99.1.4)、前咕啉-2/鈷-因子-2c20-甲基轉(zhuǎn)移酶(ec2.1.1.130/2.1.1.151)、前咕啉-3b合酶(ec1.14.13.83)、前咕啉-3bc17-甲基轉(zhuǎn)移酶(ec2.1.1.131)、前咕啉-4c11-甲基轉(zhuǎn)移酶(ec2.1.1.133)、前咕啉-6x還原酶(ec1.3.1.54)、前咕啉-6yc5,15-甲基轉(zhuǎn)移酶(ec2.1.1.132)、前咕啉-8w脫羧酶(ec1.-.-.-)、前咕啉-8x甲基變位酶(ec5.4.1.2)、西羅葉綠三酸鈷螯合酶(ec4.99.1.3)、蘇氨酸-磷酸脫羧酶(ec4.1.1.81)、尿卟啉原脫羧酶(ec4.1.1.37)、尿卟啉原iii甲基轉(zhuǎn)移酶/合酶(ec2.1.1.107/4.2.1.75)。不希望受理論所束縛，據(jù)相信，輔因子的可用性的增大通過參與所述輔因子的生物合成路徑的酶或基因的過度表達來實現(xiàn)。因此，取決于此輔因子的反應(yīng)不再為限制性的。
本發(fā)明還提供通過發(fā)酵包含co的底物生產(chǎn)一種或多種產(chǎn)物的方法。優(yōu)選地，產(chǎn)物為乙醇、丁醇、異丙醇、異丁醇、高級醇、丁二醇、2,3-丁二醇、丁二酸酯、類異戊二烯、脂肪酸、生物聚合物及其混合物中的一種或多種。
在一個實施例中，包含co的底物為包含co的氣態(tài)底物。在一個實施例中，底物將通常含有較大比例的co，如約20體積％到約100體積％co、20體積％到70體積％co、30體積％到60體積％co，或40體積％到55體積％co。在具體實施例中，底物包含約25體積％、約30體積％、約35體積％、約40體積％、約45體積％、約50體積％、約55體積％或約60體積％co。
雖然底物未必含有任何氫氣，但氫氣的存在不應(yīng)對根據(jù)本發(fā)明的方法的產(chǎn)物形成是不利的。在具體實施例中，氫氣的存在引起醇產(chǎn)生的總效率的改善。舉例來說，在具體實施例中，底物可以包含約2:1、或1:1或1:2比率的h2:co。在一個實施例中，底物包含約30體積％或更少h2、20體積％或更少h2、約15體積％或更少h2或約10體積％或更少h2。在其它實施例中，底物流包含低濃度的h2，例如小于5％、小于4％、小于3％、小于2％或小于1％h2。在另外的實施例中，底物流實質(zhì)上不含氫氣。底物還可含有一些co2，例如約1體積％到約80體積％co2，或1體積％到約30體積％co2。在一個實施例中，底物包含小于或等于約20體積％co2。在具體實施例中，底物包含小于或等于約15體積％co2、小于或等于約10體積％co2、小于或等于約5體積％co2或?qū)嵸|(zhì)上無co2。
就遞送和發(fā)酵“含有co的氣態(tài)底物”來說描述本發(fā)明的實施例。然而，應(yīng)了解氣態(tài)底物可以替代形式提供。舉例來說，含有co的氣態(tài)底物可溶解于液體中而提供?；旧?，液體經(jīng)含有一氧化碳的氣體飽和，并且然后將所述液體添加到生物反應(yīng)器中。這可使用標準方法實現(xiàn)。借助于實例，可使用微泡分布發(fā)生器(hensirisak,《應(yīng)用生物化學生物技術(shù)學刊(applbiochembiotechnol)》,101:211-227,2002)。借助于另一實例，含有co的氣態(tài)底物可吸附到固體支撐物上。此類替代方法通過使用術(shù)語“包含co的底物”等涵蓋。
氣態(tài)底物可為作為工業(yè)工藝的副產(chǎn)物或從一些其它來源(如從汽車廢氣或生物質(zhì)氣化)獲得的含co的廢氣。在某些實施例中，工業(yè)工藝選自由以下組成的群組：含鐵金屬產(chǎn)物制造(如鋼鐵廠制造)、非鐵產(chǎn)物制造、石油精煉工藝、煤氣化、電力生產(chǎn)、碳黑生產(chǎn)、氨生產(chǎn)、甲醇生產(chǎn)以及焦炭制造。在這些實施例中，含co的氣體可使用任何方便的方法在其排到大氣中之前從工業(yè)工藝捕獲。co可為合成氣(包含一氧化碳和氫氣的氣體)的組分。由工業(yè)工藝產(chǎn)生的co通常被燃燒掉以產(chǎn)生co2，并且因此本發(fā)明在減少co2溫室氣體排放以及產(chǎn)生生物燃料方面具有特別效用。取決于氣態(tài)含co的底物的組成，還可需要在將其引入到發(fā)酵之前對其進行處理以除去任何非所需雜質(zhì)，如塵粒。舉例來說，氣態(tài)底物可使用已知方法過濾或洗滌。
通常，發(fā)酵在生物反應(yīng)器中執(zhí)行。術(shù)語“生物反應(yīng)器”包括由一個或多個容器和/或塔或管道布置組成的發(fā)酵裝置，如連續(xù)攪拌槽反應(yīng)器(cstr)、固定化細胞反應(yīng)器(icr)、滴流床反應(yīng)器(tbr)、氣泡柱、氣升式發(fā)酵槽、靜態(tài)混合器或適合氣-液接觸的其它容器或其它裝置。在一些實施例中，生物反應(yīng)器可包含第一生長反應(yīng)器和第二發(fā)酵反應(yīng)器。因此，在提及將底物添加到生物反應(yīng)器或發(fā)酵反應(yīng)中時，適當時，應(yīng)理解包括添加到這些反應(yīng)器中的任一者或兩者中。如本文所用，術(shù)語“發(fā)酵”、“發(fā)酵工藝”、“發(fā)酵反應(yīng)”等涵蓋發(fā)酵工藝的生長期和產(chǎn)物生物合成期兩者。
在某些實施例中，本發(fā)明的細菌的培養(yǎng)物維持在含有足以準許微生物的生長的營養(yǎng)物、維生素和/或礦物質(zhì)的水性培養(yǎng)基中。優(yōu)選地，水性培養(yǎng)基為基本厭氧微生物生長培養(yǎng)基。合適的培養(yǎng)基是本領(lǐng)域中已知的并且描述于例如美國專利5,173,429、美國專利5,593,886和wo2002/008438中。
發(fā)酵應(yīng)理想地在用于發(fā)生發(fā)酵產(chǎn)物的生產(chǎn)的適當發(fā)酵條件下進行。應(yīng)考慮到的反應(yīng)條件包括壓力、溫度、氣體流速、液體流速、培養(yǎng)基ph、培養(yǎng)基氧化還原電勢、攪拌速率(如果使用連續(xù)攪拌槽反應(yīng)器)、接種物含量、確保液相中的co不變成限制性的最大氣體底物濃度以及避免產(chǎn)物抑制的最大產(chǎn)物濃度。
另外，通常需要增大底物流的co濃度(或氣態(tài)底物中的co分壓)并且由此增大其中co為底物的發(fā)酵反應(yīng)的效率。在增大的壓力下操作允許co從氣相向液相的轉(zhuǎn)移速率顯著增大，在液相中其可被微生物作為碳源吸收以便產(chǎn)生發(fā)酵。這又意味著當生物反應(yīng)器維持在高壓而非大氣壓下時可縮短滯留時間(被定義為生物反應(yīng)器中的液體體積除以輸入氣體流速)。最佳反應(yīng)條件將部分取決于所用的本發(fā)明的具體微生物。然而，一般來說，優(yōu)選的是發(fā)酵在比環(huán)境壓力高的壓力下執(zhí)行。此外，由于給定的co轉(zhuǎn)化速率在某種程度上是底物滯留時間的函數(shù)，并且實現(xiàn)所需滯留時間又指示生物反應(yīng)器的所需體積，所以使用加壓系統(tǒng)可大大減小所需生物反應(yīng)器的體積，并且因此降低發(fā)酵設(shè)備的資金成本。根據(jù)美國專利5,593,886中給出的實例，反應(yīng)器體積可與反應(yīng)器操作壓力增大成線性比例減小，即，在10個大氣壓的壓力下操作的生物反應(yīng)器僅需要在1個大氣壓的壓力下操作的生物反應(yīng)器的體積的十分之一。
借助于實例，已描述了在高壓下進行氣體到乙醇發(fā)酵的益處。舉例來說，wo2002/008438描述了在30psig和75psig的壓力下執(zhí)行的氣體到乙醇發(fā)酵，分別得到150g/l/天和369g/l/天的乙醇生產(chǎn)率。然而，發(fā)現(xiàn)使用類似培養(yǎng)基和輸入氣體組成在大氣壓下執(zhí)行的例示性發(fā)酵每天每升產(chǎn)生少10與20倍之間的乙醇。
還需要的是，控制含co的氣態(tài)底物的引入速率來確保液相中的co的濃度不變成限制性的，因為在co限制條件下培養(yǎng)可消耗產(chǎn)物。
用于進料發(fā)酵反應(yīng)的氣流的組成可對反應(yīng)的效率和/或成本具有顯著影響。舉例來說，o2可降低厭氧發(fā)酵工藝的效率。在發(fā)酵之前或在發(fā)酵之后在發(fā)酵工藝的階段中處理不想要的或不必要的氣體可增大此類階段的負荷。舉例來說，在氣流進入生物反應(yīng)器之前被壓縮的情況下，不必要的能量可用于壓縮在發(fā)酵中不需要的氣體。因此，可需要處理底物流，尤其是衍生自工業(yè)來源的底物流，以除去不想要的組分并且增大所需組分的濃度。
實例
以下實例進一步說明本發(fā)明，但當然不應(yīng)解釋為以任何方式限制其范圍。
實例1
此實例描述了用于在乙醇和2,3-丁二醇的生產(chǎn)中的瓶頸的一氧化碳營養(yǎng)型細菌如自產(chǎn)乙醇梭菌、揚氏梭菌或拉氏梭菌的發(fā)酵路徑的分析。
測定伍德-永達爾路徑和發(fā)酵路徑到乙醇和2,3-丁二醇的氧化還原酶步驟以確定其活性。氧化還原酶反應(yīng)是特別合適的，因為其伴隨著可測量還原或氧化的一種或多種輔因子。合成氧化還原染料如甲基紫精或芐基紫精也可用于此目的。在這些路徑中的酶參與包括co、co2和h2氣體的吸收和利用的自養(yǎng)生長以及產(chǎn)物形成。
所測定的酶和其活性詳述于圖1中。使用合成氧化還原染料作為對照組(甲基紫精(mv)或芐基紫精(bv))執(zhí)行所有分析。接著測試輔因子鐵氧還蛋白(fd)、nadh和nadph或其組合。使用來自在co和氫上自養(yǎng)地生長的發(fā)酵的粗提取物執(zhí)行酶分析。
在1.5l生物反應(yīng)器中，在37℃下，使用含co的鋼鐵廠氣體作為唯一的能源和碳源，用自產(chǎn)乙醇梭菌進行發(fā)酵。發(fā)酵培養(yǎng)基每升含有mgcl、cacl2(0.5mm)、kcl(2mm)、h3po4(5mm)、fe(100μm)、ni、zn(5μm)、mn、b、w、mo和se(2μm)。將培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到生物反應(yīng)器中并且在121℃下高壓滅菌45分鐘。在高壓滅菌之后，給培養(yǎng)基補充硫胺、泛酸鹽(0.05mg)和生物素(0.02mg)并且用3mm半胱氨酸-hcl還原。為了實現(xiàn)厭氧條件，通過0.2μm過濾器，用氮氣噴射反應(yīng)器容器。在接種之前，將氣體切換為含co的鋼鐵廠氣體，連續(xù)地進料到反應(yīng)器中。進料氣體組成為2％h2、42％co、20％co2和36％n2。培養(yǎng)物的ph維持在5和5.2之間。
在收獲細胞(3.9g細胞/l發(fā)酵培養(yǎng)液的生物質(zhì))時，氣體消耗為5摩爾col-1天-1和10毫摩爾h2l-1天-1，產(chǎn)生以下代謝物：14gl-1天-1乙酸酯和19.5gl-1天-1乙醇。用k2co3將培養(yǎng)物的ph調(diào)節(jié)到ph6并且反應(yīng)器冷藏在冰水浴中。在冰上收集約1.2l的培養(yǎng)物。將培養(yǎng)物分配在兩個1-l離心瓶之間(此步驟和所有后續(xù)步驟在厭氧室中進行以確保缺氧條件從而避免酶的失活)并且以5000rpm?；毎?0min。傾析上清液并除去殘余的液體。將每個球粒再懸浮于約30ml的具有10mmdtt的50mmkpo4ph7.0中。將再懸浮液轉(zhuǎn)移到預(yù)稱重的50-ml-法爾康-管并且以最大速度(5000g)再粒化細胞15min。將管從厭氧室中取出并且在測定之前立即凍結(jié)在液體n2上。
在缺氧條件下從連續(xù)反應(yīng)器中收獲細胞。細胞通過三次穿過french壓機來破碎。通過以20,000×g和在4℃下離心30min來除去未斷裂的細胞和細胞碎片。上清液用于酶分析。除在指示的情況下外，在37℃下在用橡膠塞封閉的填充有0.8ml反應(yīng)混合物和0.7mln2或h2或co的1.5-ml厭氧比色杯中在1.2×105pa下執(zhí)行所有分析。如下或通過huang,《細菌學雜志》,194:3689-3699,2012所述測定酶。在用酶開始反應(yīng)之后，在340nm(ε＝6.2mm-1cm-1)下或在380nm(ε＝1.2mm-1cm-1)下以分光光度法監(jiān)測nad(p)+或nad+的還原，在430nm(εδox-紅≈13.1mm-1cm-1)下以分光光度法監(jiān)測巴氏梭菌(c.pasteurianum)鐵氧還蛋白還原，在578nm(ε＝9.8mm-1cm-1)下以分光光度法監(jiān)測甲基紫精還原和在578nm(ε＝8.6mm-1cm-1)下以分光光度法監(jiān)測芐基紫精還原。
使用含有100mmtris/hcl(ph7.5)、2mmdtt和約30μm鐵氧還蛋白和/或1mmnad+或1mmnadp+的分析混合物測量co脫氫酶。氣相為100％co。
使用100mmtris/hcl(ph7.5)或100mm磷酸鉀、2mmdtt和25μm鐵氧還蛋白和/或1mmnadp+和/或10mm甲基紫精的分析混合物測量氫化酶活性。氣相為100％h2。
用含有100mm磷酸鉀、2mmdtt和30mm[14c]k2co3(24,000dpm/μmol)的分析混合物測量用h2將co2還原成甲酸酯的甲酸-氫裂解酶活性。氣相為100％h2。以200rpm連續(xù)振蕩血清瓶以確保氣相與液相的平衡。在用酶開始反應(yīng)之后，每1.5min抽取100μl液體樣品并添加到1.5-ml含有100μl的150mm乙酸的安全密封微管中以通過酸化停止反應(yīng)。接著伴隨以1,400rpm振蕩在熱混合器中將200μl混合物溫育在40℃下持續(xù)10min以除去在14c-甲酸酯形成后留下的所有14co2。隨后，將100μl的混合物添加到5ml的quicksavea閃爍流體(德國法蘭克福的津塞分析(zinsseranalytic,frankfurt,germany))中并在beckmanls6500液體閃爍計數(shù)器(加利福尼亞州富樂敦(fullerton,ca))中分析14c放射性。
用含有100mmtris/hcl(ph7.5)或100mm磷酸鉀、2mmdtt、20mm甲酸酯以及在指示的情況下25μm鐵氧還蛋白、1mmnadp+、1mmnad+和/或10mm甲基紫精的分析混合物進行甲酸脫氫酶測量。氣相為100％n2。
使用含有100mmmops/koh(ph6.5)、50mm2-巰基乙醇、0.4mm四氫葉酸、10mm甲醛和0.5mmnadp+或0.5mmnad+的分析混合物測量亞甲基-h4f脫氫酶。氣相為100％n2。
在以下條件下測定亞甲基-h4f還原酶。分析混合物含有100mmtris/hcl(ph7.5)、20mm抗壞血酸鹽、10μmfad。20mm芐基紫精和1mm甲基-h4f。在用酶開始反應(yīng)之前，用連二亞硫酸鈉將芐基紫精還原成0.3的δa555。
使用含有100mmtris/hcl(ph7.5)、2mmdtt、1.1mm乙醛和約25μm鐵氧還蛋白的混合物測定醛:鐵氧還蛋白氧化還原酶。氣相為100％n2。
使用含有100mmtris/hcl(ph7.5)、2mmdtt、1.1mm乙醛、1mm輔酶a和1mmnadp+或1mmnad+的混合物測量coa乙?；胰┟摎涿浮庀酁?00％n2。
在分析中分別用100mm磷酸鉀(ph6)、2mmdtt、1.1mm乙醛或乙偶姻和1mmnadph或1mmnadh測量醇和丁二醇脫氫酶。氣相為100％n2。
如
測定并成功地檢測到一氧化碳營養(yǎng)型細菌自產(chǎn)乙醇梭菌的在路徑中到乙醇和2,3-丁二醇的所有氧化還原酶反應(yīng)，除亞甲基-thf還原酶之外，本發(fā)明人認為所述亞甲基-thf還原酶需要迄今未知的偶合位點(
實例2
此實例展現(xiàn)增大通過發(fā)酵路徑的通量。
描述于pct/us2014/041188的實例3中的一般方法也可用于將丙酮酸:鐵氧還蛋白氧化還原酶、乙酰乳酸合酶和/或乙酰乳酸脫羧酶基因引入到本發(fā)明的重組梭菌屬微生物中。
實例3
此實例識別通過丙酮酸:鐵氧還蛋白氧化還原酶乙?；鵦oa到丙酮酸的轉(zhuǎn)化作為在2,3-丁二醇的生產(chǎn)中的瓶頸。
如圖2中所見，2,3-丁二醇生產(chǎn)的瓶頸為通過丙酮酸:鐵氧還蛋白氧化還原酶催化的從乙?；鵦oa到丙酮酸的反應(yīng)。雖然所有其它測量的反應(yīng)顯示至少1.1u/mg的活性，但是在鐵氧還蛋白存在下此速率限制反應(yīng)顯現(xiàn)僅0.11u/mg(10％)的酶活性。在路徑中這比所有其它反應(yīng)小90％。為了至少對解決此瓶頸有些用處并增大發(fā)酵的產(chǎn)物產(chǎn)率，內(nèi)源性丙酮酸:鐵氧還蛋白氧化還原酶可過度表達或外源性丙酮酸:鐵氧還蛋白氧化還原酶可被引入并表達。
實例4
此實例展現(xiàn)通過除去瓶頸增大通過2,3-丁二醇生產(chǎn)路徑的通量。
在圖2中催化乙?；?coa到丙酮酸的轉(zhuǎn)化的反應(yīng)已被識別為在自產(chǎn)乙醇梭菌、揚氏梭菌或拉氏梭菌中2,3-丁二醇形成中的速率限制步驟。這可通過在自產(chǎn)乙醇梭菌中過度表達編碼丙酮酸:鐵氧還蛋白氧化還原酶的基因來解決。
基因經(jīng)密碼子優(yōu)化以使表達的問題減到最少并且被設(shè)計成降低與天然基因的同源性從而阻止非所需整合事件?；蛲ㄟ^限制酶切割位點xbai(3'-端)和nhei(5'-端)側(cè)接用于亞克隆到pmtl83155中。合成的構(gòu)筑體和pmtl83155用xbai和nhei(fermentas)消化，并且用t4dna接合酶(fermentas)將pfor基因接合到pmtl83155中。接合混合物用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌top10(invitrogen，生命技術(shù)公司)并且通過質(zhì)粒小規(guī)模純化(zymoresearch)和限制分解(fermentas)識別含有所需質(zhì)粒的集落。在自產(chǎn)乙醇梭菌中甲基化并轉(zhuǎn)化所需質(zhì)粒。通過甲砜霉素抗性和pcr分析用引物rephf和catr識別成功的轉(zhuǎn)化體，當質(zhì)粒存在時所述引物rephf和catr將產(chǎn)生1584個堿基對產(chǎn)物。
被識別為含有所需質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化體在含有petc-mes培養(yǎng)基的血清瓶中在磨機氣體存在下生長，并且通過hplc分析測量的其代謝物生產(chǎn)與未攜帶質(zhì)粒的親本微生物的代謝物生產(chǎn)進行比較。在粗提取物中還測量在經(jīng)轉(zhuǎn)化的菌株中丙酮酸:鐵氧還蛋白氧化還原酶活性以確認在親本菌株中觀測到的瓶頸緩解。丙酮酸:鐵氧還蛋白氧化還原酶的過度表達增大在細胞內(nèi)的總體活性，緩解路徑中的瓶頸，并且引起通過丙酮酸的通量的增大和2,3-丁二醇產(chǎn)量的增大。
實例5
此實例展現(xiàn)經(jīng)由天然分解代謝乙酰乳酸合酶的過度表達從丙酮酸到2-羥基-2-甲基-3-酮丁酸(乙酰乳酸酯)的通量的增大。
將自產(chǎn)乙醇梭菌的天然分解代謝乙酰乳酸合酶基因(alss)克隆到pmtl83155的ndei和nhei位點中(wo2013/185123)以生成過度表達質(zhì)粒，在磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶-乙酸激酶操縱子的啟動子區(qū)的控制下表達alss。
可使用來自另一種微生物的分解代謝乙酰乳酸合酶、來自另一種微生物的天然合成代謝乙酰乳酸合酶或合成代謝乙酰乳酸合酶類似地產(chǎn)生過度表達質(zhì)粒。
使用來自另一種微生物的分解代謝乙酰乳酸合酶或來自另一種微生物的合成代謝乙酰乳酸合酶可具有朝向丙酮酸的更高親和力和更快反應(yīng)動力。來自另一種微生物的合成代謝乙酰乳酸合酶可為被識別為對反饋抑制不敏感的酶。少量的次單位的對反饋抑制不敏感的合成代謝乙酰乳酸合酶突變體也可過度表達。
可將過度表達質(zhì)粒引入到自產(chǎn)乙醇梭菌中。這產(chǎn)生被調(diào)適以增大從丙酮酸酯到乙酰乳酸酯的通量的自產(chǎn)乙醇梭菌菌株。
實例6
此實例描述丙酮酸:鐵氧還蛋白氧化還原酶、乙酰乳酸合酶和/或乙酰乳酸脫羧酶的過度表達的代謝工程方法。
為了提高2,3-丁二醇產(chǎn)量，增大丙酮酸酯，2,3-丁二醇的前體分子的集合體。第一目標是編碼pfor酶的pfor基因，所述pfor酶催化乙?；?coa到丙酮酸酯的轉(zhuǎn)化。在自產(chǎn)乙醇梭菌基因組中，存在兩種pfor基因的拷貝。眾所周知pfor基因(caethg0928)以高水平組成性地表達，而其它基因(caethg3029)僅在分批培養(yǎng)物中生長結(jié)束時上調(diào)(
提出連接兩個丙酮酸酯分子以形成α-乙酰乳酸酯的乙酰乳酸合酶以由三個不同基因編碼的三種形式存在于自產(chǎn)乙醇梭菌中和緊密地相關(guān)微生物中(
α-乙酰乳酸酯經(jīng)由由alsd基因(caethg2932)編碼的乙酰乳酸脫羧酶的活性脫羧成乙偶姻。在其它微生物中，已發(fā)現(xiàn)alsd基因轉(zhuǎn)錄物含量和酶活性通過存在于細胞中的支鏈氨基酸的濃度調(diào)控。仍未知在自產(chǎn)乙醇梭菌中的支鏈氨基酸是否產(chǎn)生alsd基因轉(zhuǎn)錄或?qū)?yīng)的酶的活性任何反饋抑制。
通過2,3-丁二醇脫氫酶(ec1.1.1.4)的作用從乙偶姻到2,3-丁二醇的還原步驟不是速率限制步驟。在自產(chǎn)乙醇梭菌的分批和連續(xù)培養(yǎng)物中這已通過將乙偶姻添加到發(fā)酵培養(yǎng)基中來證實。在分批培養(yǎng)物中，添加高至40g/l的乙偶姻并且在24小時的溫育之后定量轉(zhuǎn)化成2,3-丁二醇。實際上，發(fā)現(xiàn)在分批培養(yǎng)物中在生長期和生長停滯期兩者期間假定的2,3-丁二醇脫氫酶基因組成性地表達(
三種天然基因pfor、alss和alsd單獨地和以alss-alsd的組合以及以所有三種基因的組合過度表達。為了將基因引入到自產(chǎn)乙醇梭菌中，將基因克隆到攜帶抗生素抗性基因作為選擇標記的重組質(zhì)粒中。出于此原因，用于此組實驗的對照組菌株攜帶具有抗生素抗性基因但無任何活性2,3-丁二醇基因插入的質(zhì)粒，如此其可暴露于抗生素應(yīng)激并且與過度表達菌株的性能進行比較。過度表達的一個重要方面為啟動子選擇以調(diào)控插入的基因的表達。在此研究中，選擇鐵氧還蛋白基因啟動子(pfdx)，因為其眾所周知為梭菌屬中最強啟動子之一。此外，為避免基因組中的天然基因和存在于質(zhì)粒中的基因之間的同源重組，根據(jù)dna合成公司(基因技術(shù)(geneart))的有產(chǎn)權(quán)的優(yōu)化方法(geneoptimizer)改變所添加的基因。
四種異源基因也為目標。從非洲脫硫弧菌中分離的pfor基因已顯示產(chǎn)生在氧存在下高度穩(wěn)定的pfor酶，其在商業(yè)厭氧菌發(fā)酵中可為有利的(pieulle,《細菌學雜志》,179:5684-5692,1997)。還測試了從枯草芽孢桿菌中分離的alss基因和從乳明串珠菌和從嗜水氣單胞菌中分離的兩種異源alsd基因。從枯草芽孢桿菌中分離的alss基因用于在多種異源宿主中構(gòu)筑2,3-丁二醇路徑(ng,《微生物細胞工廠(microbcellfactories)》,11:68,2012；oliver,《美國國家科學院院刊》,110:1249-1254,2013)。從嗜水氣單胞菌中分離的alsd顯示在當前研究中在從其它微生物中分離的若干種其它異源alsd之中具有最高酶活性(oliver,《美國國家科學院院刊》,110:1249-1254,2013)。這些特性使這些基因為基因操縱實驗的理想候選對象。
實例7
此實例描述過度表達丙酮酸:鐵氧還蛋白氧化還原酶、乙酰乳酸合酶和/或乙酰乳酸脫羧酶的菌株的克隆、結(jié)合和表征。
自產(chǎn)乙醇梭菌菌株lz1561(dsm23693)用于此研究中。兩種大腸桿菌供體菌株用作用于基因操縱的工具；top10(invitrogen)菌株用于質(zhì)粒克隆并且ca434菌株用于與自產(chǎn)乙醇梭菌結(jié)合。
選擇梭菌屬-大腸桿菌穿梭質(zhì)粒系列pmtl83159(4600個堿基對)以過度表達pfor、alss和alsd基因(heap,《微生物學方法雜志(jmicrobiolmeth)》,78:79-85,2009)。質(zhì)粒被設(shè)計成含有革蘭氏陽性復(fù)制子、革蘭氏陰性復(fù)制子、traj基因、抗生素抗性基因、位于laczα編碼序列內(nèi)的多克隆位點和鐵氧還蛋白基因啟動子(pfdx)。革蘭氏陽性復(fù)制子(reph基因)來源于丁酸梭菌(c.butylicum)pcb102質(zhì)粒。為了在大腸桿菌中克隆質(zhì)粒，由于革蘭氏陰性復(fù)制子cole1產(chǎn)生的高拷貝數(shù)的質(zhì)粒，所以選擇革蘭氏陰性復(fù)制子cole1。traj或轉(zhuǎn)移基因允許基因材料在供體和受體細胞之間轉(zhuǎn)移。針對氯霉素/甲砜霉素抗性編碼的catp基因為選擇標記。
通過dna合成公司(基因技術(shù))合成三種基因，pfor、alss和alsd。為了將其克隆到pmtl83159質(zhì)粒中，將一對限制酶識別序列和核糖體結(jié)合位點序列添加到每個基因序列中并且與所述基因一起合成。攜載所述基因的初始質(zhì)粒首先轉(zhuǎn)化成大腸桿菌top10菌株。zyppytm質(zhì)粒小規(guī)模純化試劑盒(zymoresearch)用于提取質(zhì)粒。為了將目標基因從其初始質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到pmtl83159質(zhì)粒，質(zhì)粒均用相同對的限制酶切割。所消化的dna通過凝膠電泳在0.6％瓊脂糖凝膠上分離，其在75伏特下運行一小時。在從凝膠回收每種基因的質(zhì)粒pmtl83159(載體)和dna序列(插入片段)之后，它們通過使用t4dna接合酶(invitrogen)接合在一起。經(jīng)接合的質(zhì)粒接著轉(zhuǎn)化成大腸桿菌top10培養(yǎng)物。為了確保所提取的質(zhì)粒含有插入片段，用適當?shù)南拗泼赶?μl的質(zhì)粒并且經(jīng)消化的質(zhì)粒接著通過凝膠電泳在0.8％瓊脂糖凝膠上分離。
質(zhì)粒轉(zhuǎn)化成大腸桿菌ca434供體細胞，并且接著與自產(chǎn)乙醇梭菌結(jié)合。為了確認在自產(chǎn)乙醇梭菌轉(zhuǎn)化體中目標質(zhì)粒的存在，使用從在血清瓶中的培養(yǎng)物獲取的樣品執(zhí)行pcr。
首先在1l-肖特瓶中執(zhí)行所有基因過度表達和基因破碎菌株的初始表征以篩選哪種菌株已產(chǎn)生最高濃度的2,3-丁二醇。這些菌株接著進一步在cstr連續(xù)培養(yǎng)物中測試，其允許發(fā)酵參數(shù)的準確控制使得可計算代謝物和生物質(zhì)選擇性。
過度表達實驗的目標為單獨地以及以兩種和三種基因的組合過度表達在2,3-丁二醇路徑中的三種天然基因。
在肖特瓶實驗中，在八天的過程內(nèi)通過每天分析樣品監(jiān)測od、培養(yǎng)基中的代謝物濃度、培養(yǎng)基的ph和頂部空間壓力。在未觀測到另外的生長或顯著代謝活動時，所有培養(yǎng)物的ph已下降到在3.8和4之間，并且測量不到另外的氣體消耗。五種菌株的生長和代謝物特征曲線對時間的圖形表示在圖5中示出。具有肖特瓶數(shù)據(jù)可用性的所有五種菌株在溫育的前兩天期間快速生長。其后，生長速率顯著降低并且接著在第4天時停止。最大光密度值為約0.75。類似于生物質(zhì)，在所有培養(yǎng)物中在前兩天期間乙酸濃度急劇增大。在第3天和第4天之間，質(zhì)粒對照組和alss過度表達菌株似乎已停止所有代謝活動，因為未觀測到代謝物濃度的另外變化。其它三種菌株顯示活動直到實驗結(jié)束。
在生長減緩之后在三種菌株中仍可觀測到乙酸酯到乙醇的轉(zhuǎn)化(aor活性)。在alsd過度表達菌株中觀測到乙酸酯的最顯著的下降，并且因此，通過此菌株達到約7g/l的最高乙醇濃度。兩種菌株，alsd和合并的alss-alsd過度表達菌株，相較于其它菌株產(chǎn)生較高量的2,3-丁二醇，在活性生長期期間產(chǎn)生大部分的2,3-丁二醇。其后，在從第4天生長停滯期期間，它們繼續(xù)以較慢速率產(chǎn)生2,3-丁二醇直到在第8天時實驗結(jié)束。pfor過度表達菌株為相較于質(zhì)粒對照組菌株產(chǎn)生2,3-丁二醇到較高濃度的其它菌株。與前兩種菌株相反，pfor過度表達菌株在生長停滯期的開始期間開始產(chǎn)生大部分的2,3-丁二醇。在生長停滯期期間生產(chǎn)速率類似于其它兩種菌株的速率。
單獨alss基因的過度表達似乎不增大2,3-丁二醇的量。這些結(jié)果表明觀測的2,3-丁二醇增大主要與alsd基因的過度表達有關(guān)。過度表達alss和alsd基因兩者引起相較于單獨剛好過度表達alsd基因略微較高的2,3-丁二醇濃度。alss的陽性附加效應(yīng)可是可實行的。pfor基因過度表達似乎有助于在生長停滯期期間較高2,3-丁二醇產(chǎn)量，在生長停滯期中不再觀測到生長。由于在這些菌株中已觀測到所有這些陽性結(jié)果和無不利效應(yīng)的事實，所以攜載所有三種基因的過度表達菌株進一步在cstr中在連續(xù)培養(yǎng)物中進行測試。
為了探究使用含co的氣態(tài)底物的微生物的全部可能性，攜載所有三種天然基因的過度表達菌株和質(zhì)粒對照組菌株進一步在cstr類連續(xù)培養(yǎng)物中表征。在整個發(fā)酵期間通過添加堿(5mnh4oh-溶液)來控制培養(yǎng)基ph以補償酸產(chǎn)生和補充培養(yǎng)基氮氣含量。通過將含co的氣體混合物噴射通過攪拌的發(fā)酵培養(yǎng)液來連續(xù)供應(yīng)底物。通過氣相色譜每小時監(jiān)測新鮮進入的氣體和使用過的流出的氣體的氣體組成?；诹魅牒土鞒龅臍怏w之間的氣體組成的差異、進入的氣體的流動速率和發(fā)酵的液體體積；計算在取樣時氣體利用率和產(chǎn)物合成的速率。值以mol/l/d為單位表示。
一天三次測量od和代謝物濃度并且每天測量和計算稀釋速率和比生長速率以確定每種代謝物的生產(chǎn)率。使用co消耗量、co2產(chǎn)量和代謝物生產(chǎn)率計算每種代謝物的產(chǎn)物選擇性。建立4mol/l/d和8mol/l/d的co吸收速率以確定產(chǎn)物選擇性是否取決于體積生產(chǎn)率。在4mol/l/d的co吸收率下，系統(tǒng)的稀釋速率維持在1d-1并且比生長速率維持在0.5d-1。在8mol/l/d的較高co吸收率和相對應(yīng)地較高代謝物生產(chǎn)速率下，培養(yǎng)物的稀釋速率增大到1.7d-1以降低代謝物濃度到與4mol/l/d實驗中類似的范圍。比生長速率也增大到0.75d-1。
在4mol/l/dco吸收率下在20天的過程內(nèi)監(jiān)測合并的pfor、alss和alsd過度表達菌株與質(zhì)粒對照組菌株的代謝物和氣體特征曲線(圖6)。盡管每種菌株的接種物的制備通過以規(guī)則的間隔若干回合的血清瓶亞-培養(yǎng)良好地進行，但cstr培養(yǎng)物呈現(xiàn)不尋常的、幾乎相同長的五天的遲滯期。在約第5.5天，cstr培養(yǎng)物均開始正常指數(shù)生長(在彼此數(shù)小時內(nèi))。
盡管兩種培養(yǎng)物的長遲滯期和在第8天和第10天之間的過度表達菌株的生長模式的波動，但兩種培養(yǎng)物在4mol/l/d的穩(wěn)定氣體吸收率下維持10天。在1d-1的稀釋速率和0.5d-1的比生長速率的情況下，花費約六天來替代發(fā)酵槽中的95％的細菌負荷。借助在此時段期間測量的恒定氣體吸收率，最新值用于分析。最終結(jié)果顯示，相比于質(zhì)粒對照組菌株，過度表達菌株始終產(chǎn)生較高的2,3-丁二醇含量。
在8mol/l/dco吸收率下在11天的過程內(nèi)監(jiān)測過度表達培養(yǎng)物的代謝物和氣體特征曲線(圖7)。從4mol/l/dco吸收率培養(yǎng)物接種培養(yǎng)物。在此培養(yǎng)物中未觀測到遲滯期，并且在指數(shù)生長期間應(yīng)用適當?shù)谋萩o供應(yīng)和稀釋速率以保持培養(yǎng)物在最佳生長條件下。因此，在溫育的第三天之后達到乙酸的穩(wěn)定生產(chǎn)，而其它代謝物繼續(xù)累積。co吸收率的目標從4mol/l/d加倍到8mol/l/d。
為了避免產(chǎn)物抑制，培養(yǎng)物的總體稀釋速率從1d-1增大到1.7d-1，并且比生長速率按比例增大。代謝物濃度緩慢增大并且在七天之后達到穩(wěn)定的生產(chǎn)速率。氫氣吸收率和co吸收率兩者以穩(wěn)定方式維持六天，指示過度表達菌株的發(fā)酵具有穩(wěn)定操作持續(xù)很長一段時間的可能性。
在液體產(chǎn)物之中，乙醇以最高速率產(chǎn)生，隨后是乙酸酯。比co供應(yīng)策略旨在維持允許發(fā)酵穩(wěn)定操作持續(xù)很長一段時間的乙酸酯與乙醇的某一比率。lz1561菌株和質(zhì)粒對照組呈現(xiàn)類似2,3-丁二醇和生物質(zhì)特征曲線。在這些培養(yǎng)物中，2,3-丁二醇與生物質(zhì)的生產(chǎn)速率比率在1.26到1.47之間。然而，在過度表達菌株中，此比率在4mol/l/dco吸收率下為2.45并且在8mol/l/dco吸收率培養(yǎng)物下為2.24。
針對過度表達，對于2,3-丁二醇、生物質(zhì)、乙醇和乙酸酯的產(chǎn)物選擇性，以4mol/l/d和8mol/l/d的氣體吸收率測量對照組和lz1561菌株。借助經(jīng)優(yōu)化的發(fā)酵參數(shù)，超過50％的碳被引導(dǎo)到乙醇形成。數(shù)據(jù)顯示，過度表達菌株的2,3-丁二醇選擇性從在lz1561和質(zhì)粒對照組培養(yǎng)物中的平均15％增大到22.5％。過度表達菌株的升高的2,3-丁二醇選擇性似乎維持在不同co吸收速率下。2,3-丁二醇選擇性的增大有助于在4mol/l/d下乙醇選擇性的降低或在8mol/l/d下乙酸酯選擇性的降低。乙醇和乙酸酯的確切貢獻不可分離，因為它們的選擇性可容易受比氣體供應(yīng)影響，其繼而容易受運行參數(shù)之間的小差異影響。舉例來說，除了別的以外，ph、葉輪位置、探針位置均可影響這些結(jié)果。
實例8
此實例展現(xiàn)外源性乙酰乳酸脫羧酶的表達以增大朝向2,3-丁二醇的通量。
用經(jīng)選擇用于在自產(chǎn)乙醇梭菌中表達的密碼子合成來自嗜水氣單胞菌和乳酸球菌的乙酰乳酸脫羧酶基因(基因技術(shù))并將其克隆到pmtl83159中，如上所述。將所得質(zhì)粒和作為對照組的pmtl83159轉(zhuǎn)化成自產(chǎn)乙醇梭菌菌株lz1561，如上所述。
菌株在含有40ml的petc-mes培養(yǎng)基不具有酵母提取物的1-l肖特瓶中生長，并且用1.5巴(規(guī)格)合成磨機氣體(50％co、29％n2、18％co2和3％h2)作為碳源和能源置換頂部空間。為了維持質(zhì)粒，添加15mgl-1甲砜霉素。通過培養(yǎng)物的生長記錄生物質(zhì)和代謝物濃度。
相較于作為對照組的含有空質(zhì)粒的菌株，在生長期間在合成磨機氣體上任一外源性乙酰乳酸脫羧酶的表達引起2,3-丁二醇產(chǎn)量的增大。相比于通過空-質(zhì)粒-對照組-菌株的0.3±0.12gl-1產(chǎn)量，來自嗜水氣單胞菌和乳酸球菌的alsd的表達分別引起2.3±0.08gl-1和1.6±0.16gl-1的2,3-丁二醇產(chǎn)量(圖8)。
本文所引用的所有參考文獻，包括公開案、專利申請案和專利特此以引用的方式并入，其引用程度就如同每一參考文獻單獨地并且特定地指示為以引用的方式并入并且全文闡述于本文中一般。在本說明書中提到任何現(xiàn)有技術(shù)時不承認并且不應(yīng)該認為承認現(xiàn)有技術(shù)形成任何國家所致力領(lǐng)域中的公共常識的一部分。
除非本文另外指示或明顯與上下文相矛盾，在描述本發(fā)明的上下文中(尤其是在以下權(quán)利要求書的上下文中)使用術(shù)語“一種/個(a/an)”和“所述”以及類似指代物應(yīng)被解釋為既覆蓋單數(shù)也覆蓋復(fù)數(shù)。除非另外指出，否則術(shù)語“包含”、“具有”、“包括”和“含有”應(yīng)被解釋為開放式術(shù)語(即，意指“包括但不限于”)。除非本文另外指示，否則本文引述值的范圍僅旨在用作單獨地提及每個單獨的值落在所述范圍內(nèi)的速記的方法，并且每個單獨的值被結(jié)合到本說明書中就像它被單獨地在本文中敘述一樣。除非本文另外指示或另外明顯與上下文相矛盾，否則本文所述的所有方法可以任何適合順序執(zhí)行。除非另外要求，否則本文所提供的任何和所有實例或示例性語言(例如，“如”)的使用僅旨在更好地闡明本發(fā)明并且不對本發(fā)明的范圍造成限制。本說明書中的任何語言均不應(yīng)被解釋為指示實施本發(fā)明所必需的任何未要求要素。
在本文中描述本發(fā)明的優(yōu)選實施例，包括本發(fā)明人已知的進行本發(fā)明的最佳模式。在閱讀前文描述之后，那些優(yōu)選實施例的變化對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可變得顯而易見。本發(fā)明人期望熟練的業(yè)內(nèi)人士適當時采用這些變化，并且本發(fā)明人打算以不同于本文中具體描述的其它方式來實施本發(fā)明。因此，本發(fā)明包括適用法律所允許的隨附權(quán)利要求書中所引述的主題的所有修改和等效物。此外，除非本文另外指示或另外明顯與上下文相矛盾，否則本發(fā)明涵蓋上述要素以其所有可能的變化形式的任何組合。
序列表
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