相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用

本申請(qǐng)要求于2014年10月6日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)62/060,416和2015年3月30日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)62/140,285的優(yōu)先權(quán)，將其全部公開內(nèi)容通過引用并入本文。

背景技術(shù)：

將新藥推向市場(chǎng)的全部成本-從發(fā)現(xiàn)到臨床試驗(yàn)到批準(zhǔn)-通常是數(shù)億甚至數(shù)十億美元。這部分是因?yàn)檠芯康?5％的實(shí)驗(yàn)藥物在人類中不能有效和安全。腎毒性是臨床試驗(yàn)階段藥物消耗的主要原因，該毒性的主要部位在近端小管內(nèi)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

目前的體外腎毒性模型如單層上皮細(xì)胞和體內(nèi)模型如活的嚙齒動(dòng)物(liverodents)，不能有效預(yù)測(cè)藥物在人體中的作用、毒性或代謝。例如，常規(guī)的腎細(xì)胞培養(yǎng)模型缺乏天然組織的復(fù)雜性，因此具有有限的預(yù)測(cè)組織水平反應(yīng)的能力。此外，臨床前動(dòng)物試驗(yàn)的預(yù)測(cè)潛力受限于人與動(dòng)物腎功能之間的物種特異性差異，包括對(duì)損傷的敏感性差異。需要的是具有天然樣組織結(jié)構(gòu)的工程化腎組織模型；具體為，具有空間組織的細(xì)胞以重現(xiàn)小管間質(zhì)組織界面的層狀結(jié)構(gòu)的組織模型。這種工程化的腎組織模型將更能預(yù)測(cè)人的體內(nèi)反應(yīng)，并且可用于建模腎毒性，建模腎臟疾病(例如多囊腎病、感染性疾病、自身免疫性疾病、纖維化和由高血壓或糖尿病引起的慢性腎臟疾病)，和建模運(yùn)輸(例如，大分子的分泌和/或攝取)。

本文描述的工程化組織代表腎小管間質(zhì)界面的模型，其中人腎間質(zhì)組織支持人腎近端小管上皮細(xì)胞以促進(jìn)其最佳形態(tài)和功能。創(chuàng)建三維小管間質(zhì)界面有助于代謝所需的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和受體的正確定位，以便準(zhǔn)確地研究小分子、化學(xué)物質(zhì)、污染物或生物制劑是如何影響腎近端小管的。這代表二維單層的人或犬腎上皮細(xì)胞的更生理學(xué)相關(guān)的替代物，并且用作(或在某些情況下)替代其中腎功能的物種差異阻礙結(jié)果的解釋的動(dòng)物研究的輔助物。

本文所述的工程化組織提供了精確研究化合物如何影響腎近端小管的機(jī)會(huì)，以及建模涉及小管運(yùn)輸，細(xì)胞-細(xì)胞相互作用，和例如可能發(fā)生在慢性腎臟疾病、多囊性腎臟疾病或ii型糖尿病的腎小管間質(zhì)纖維化發(fā)展的致病過程。

本文提供三維工程化生物學(xué)腎小管模型，其包括：腎間質(zhì)組織層，所述腎間質(zhì)組織包含腎成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞；和腎上皮組織層，所述腎上皮組織包含腎小管上皮細(xì)胞，所述腎上皮組織與所述腎間質(zhì)組織層接觸形成三維工程化生物學(xué)腎小管模型；條件是所述間質(zhì)組織包含間質(zhì)生物墨(bio-ink)，所述上皮組織包含上皮生物墨，并形成三維工程化生物學(xué)腎小管模型。在某些實(shí)施方案中，所述腎間質(zhì)組織層具有頂端表面和基底外側(cè)表面。在某些實(shí)施方案中，所述腎上皮組織層與所述腎間質(zhì)組織層的頂端表面接觸。在某些實(shí)施方案中，所述腎上皮組織層基本上由腎小管上皮細(xì)胞組成。在某些實(shí)施方案中，所述腎上皮組織層基本上由原代腎小管上皮細(xì)胞組成。在某些實(shí)施方案中，所述原代腎小管上皮細(xì)胞分離自患有影響腎功能的疾病的受試者。在某些實(shí)施方案中，所述原代腎小管上皮細(xì)胞分離自患有多囊性腎病的受試者。在某些實(shí)施方案中，所述原代腎小管細(xì)胞分離自患有ii型糖尿病的受試者。在某些實(shí)施方案中，所述腎上皮組織層包含腎細(xì)胞癌細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，所述腎上皮組織層實(shí)質(zhì)上是單層。在某些實(shí)施方案中，所述腎間質(zhì)組織層實(shí)質(zhì)上是單層。在某些實(shí)施方案中，所述腎上皮組織層與所述腎間質(zhì)組織層連續(xù)接觸。在某些實(shí)施方案中，所述腎上皮組織層與所述腎間質(zhì)組織層的頂端表面接觸并覆蓋50％以上。在某些實(shí)施方案中，所述腎上皮組織層與所述腎間質(zhì)組織層的頂端表面接觸并覆蓋70％以上。在某些實(shí)施方案中，所述腎上皮組織層與所述腎間質(zhì)組織層的頂端表面接觸并覆蓋90％以上。在某些實(shí)施方案中，所述腎上皮組織層中細(xì)胞的至少50％與所述腎上皮組織層的另一個(gè)細(xì)胞形成緊密連接。在某些實(shí)施方案中，所述腎上皮組織層中細(xì)胞的至少70％與所述腎上皮組織層的另一個(gè)細(xì)胞形成緊密連接。在某些實(shí)施方案中，所述腎上皮組織層中細(xì)胞的至少90％與所述腎上皮組織層的另一個(gè)細(xì)胞形成緊密連接。在某些實(shí)施方案中，所述腎小管模型的厚度在50和500μm之間。在某些實(shí)施方案中，所述腎小管模型為約100μm厚。在某些實(shí)施方案中，所述腎上皮組織層還包含擠出化合物。在某些實(shí)施方案中，所述成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞以約95:5至約5:95的成纖維細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞之比存在于所述腎間質(zhì)組織層中。在某些實(shí)施方案中，所述成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞以約75:25至約25:75的成纖維細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞之比存在于所述腎間質(zhì)組織層中。在某些實(shí)施方案中，所述成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞以約60:40至約40:60的成纖維細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞之比存在于所述腎間質(zhì)組織層中。在某些實(shí)施方案中，所述成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞以約50:50的成纖維細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞之比存在于所述腎間質(zhì)組織層中。在某些實(shí)施方案中，所述腎間質(zhì)組織層還包含分泌細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，所述腎間質(zhì)組織層還包含免疫細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，所述腎間質(zhì)組織層還包含擠出化合物。在某些實(shí)施方案中，所述腎間質(zhì)組織層包含腎小球細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，所述模型在使用時(shí)基本上不含預(yù)先形成的支架。在某些實(shí)施方案中，所述腎成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，所述腎間質(zhì)組織層或腎上皮組織層中的任一者為至少30體積％的活細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，所述腎間質(zhì)組織層或腎上皮組織層中的任一者為至少70體積％的活細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，所述腎間質(zhì)組織層或腎上皮組織層中的任一者為至少90體積％的活細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，所述腎小管模型實(shí)質(zhì)上是平面的。在某些實(shí)施方案中，所述腎小管模型具有基本上均勻的厚度。在某些實(shí)施方案中，所述腎小管模型包括至少一種生物打印的組分。在某些實(shí)施方案中，所述腎小管模型包括至少一種通過擠出生物打印的組分。在某些實(shí)施方案中，所述腎小管模型還包括生物相容性膜。在某些實(shí)施方案中，所述腎小管模型還包括孔徑大于約0.4μm的生物相容性膜。在某些實(shí)施方案中，所述腎小管模型還包括孔徑為約1μm的生物相容性膜。在某些實(shí)施方案中，多個(gè)腎小管模型被配置為形成陣列。在某些實(shí)施方案中，多個(gè)腎小管模型被配置為允許每個(gè)腎小管模型之間的間隔在約20μm和約100μm之間。在某些實(shí)施方案中，間質(zhì)或上皮生物墨還包含治療性分子或物質(zhì)。

本文還提供了制造三維工程化化生物學(xué)腎小管模型的方法，所述方法包括：制備腎間質(zhì)生物墨，所述間質(zhì)生物墨包含多種間質(zhì)細(xì)胞類型，所述間質(zhì)細(xì)胞類型包含腎成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞；制備腎上皮生物墨，所述上皮生物墨包含腎小管上皮細(xì)胞；沉積所述腎間質(zhì)生物墨和所述腎上皮生物墨，使得所述腎上皮生物墨在所述腎間質(zhì)生物墨的層的至少一個(gè)表面上形成層；和使沉積的生物墨在細(xì)胞培養(yǎng)基中成熟以使細(xì)胞粘附來形成三維工程化生物學(xué)腎小管模型。在某些實(shí)施方案中，沉積所述腎間質(zhì)組織生物墨形成具有頂端表面和基底外側(cè)表面的腎間質(zhì)組織層。在某些實(shí)施方案中，所述腎上皮生物墨與所述腎間質(zhì)組織層的頂端表面接觸沉積。在某些實(shí)施方案中，所述腎上皮生物墨基本上由腎小管上皮細(xì)胞組成。在某些實(shí)施方案中，所述腎上皮生物墨基本上由原代腎小管上皮細(xì)胞組成。在某些實(shí)施方案中，所述原代腎小管上皮細(xì)胞分離自患有影響腎功能的疾病的受試者。在某些實(shí)施方案中，所述原代腎小管上皮細(xì)胞分離自患有多囊性腎病的受試者。在某些實(shí)施方案中，所述原代腎小管上皮細(xì)胞分離自患有ii型糖尿病的受試者。在某些實(shí)施方案中，所述腎上皮生物墨包含腎細(xì)胞癌細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，所述腎上皮生物墨以單層沉積。在某些實(shí)施方案中，所述腎間質(zhì)組織生物墨以單層沉積。在某些實(shí)施方案中，所述腎上皮組織層與腎間質(zhì)組織層連續(xù)接觸沉積。在某些實(shí)施方案中，所述腎上皮生物墨形成覆蓋所述腎間質(zhì)組織層的頂端表面的50％以上的層。在某些實(shí)施方案中，所述腎上皮生物墨形成覆蓋所述腎間質(zhì)組織層的頂端表面的70％以上的層。在某些實(shí)施方案中，所述腎上皮生物墨形成覆蓋所述腎間質(zhì)組織層的頂端表面的90％以上的層。在某些實(shí)施方案中，腎上皮層的腎上皮細(xì)胞的至少50％與其它腎上皮細(xì)胞形成緊密連接。在某些實(shí)施方案中，腎上皮層的腎上皮細(xì)胞的至少70％與其它腎上皮細(xì)胞形成緊密連接。在某些實(shí)施方案中，腎上皮層的腎上皮細(xì)胞的至少90％與其它腎上皮細(xì)胞形成緊密連接。在某些實(shí)施方案中，所述腎小管模型的厚度在50和500μm之間。在某些實(shí)施方案中，所述腎小管模型為約100μm厚。在某些實(shí)施方案中，所述腎上皮生物墨還包含擠出化合物。在某些實(shí)施方案中，所述成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞以約95:5至約5:95的成纖維細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞之比存在于所述腎間質(zhì)生物墨中。在某些實(shí)施方案中，所述成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞以約75:25至約25:75的成纖維細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞之比存在于所述腎間質(zhì)生物墨中。在某些實(shí)施方案中，所述成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞以約60:40至約40:60的成纖維細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞之比存在于所述腎間質(zhì)生物墨中。在某些實(shí)施方案中，成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞以約50:50的成纖維細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞之比存在于所述腎間質(zhì)生物墨中。在某些實(shí)施方案中，所述腎間質(zhì)生物墨還包含分泌細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，所述腎間質(zhì)生物墨還包含免疫細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，所述腎間質(zhì)生物墨還包含擠出化合物。在某些實(shí)施方案中，所述腎間質(zhì)生物墨包含腎小球細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，所述模型被制造為基本上不含預(yù)先形成的支架。在某些實(shí)施方案中，所述腎成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，所述腎間質(zhì)生物墨或腎上皮生物墨中任一者在沉積后形成平面層。在某些實(shí)施方案中，所述腎小管模型具有基本上均勻的厚度。在某些實(shí)施方案中，所述方法還包括將所述腎間質(zhì)生物墨沉積到生物相容性膜上。在某些實(shí)施方案中，所述方法還包括將所述腎間質(zhì)生物墨沉積到孔徑大于0.4μm的生物相容性膜上。在某些實(shí)施方案中，所述方法還包括將所述腎間質(zhì)生物墨沉積到孔徑為約1μm的生物相容性膜上。在某些實(shí)施方案中，所述方法包括三維工程化生物學(xué)腎小管模型沉積以形成陣列。在某些實(shí)施方案中，所述方法包括三維工程化生物學(xué)腎小管模型沉積以形成陣列，所述陣列被配置為允許每個(gè)腎小管模型之間的間隔在約20μm和約100μm之間。在某些實(shí)施方案中，所述腎間質(zhì)生物墨為至少30體積％的活細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，所述腎間質(zhì)生物墨為至少70體積％的活細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，所述腎間質(zhì)生物墨為至少90體積％的活細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，所述腎間質(zhì)生物墨通過擠出生物打印來沉積。在某些實(shí)施方案中，所述腎上皮生物墨通過噴墨生物打印來沉積。在某些實(shí)施方案中，所述腎小管模型的任何層在體外培養(yǎng)3天后的培養(yǎng)物中是具有活力的。在某些實(shí)施方案中，所述腎小管模型的任何層在體外培養(yǎng)10天后的培養(yǎng)物中是具有活力的。在某些實(shí)施方案中，間質(zhì)或上皮生物墨還包含治療性分子或物質(zhì)。

本文還提供了評(píng)估治療劑的腎毒性的方法，所述方法包括：制備腎間質(zhì)生物墨，所述間質(zhì)生物墨包含多種間質(zhì)細(xì)胞類型，所述間質(zhì)細(xì)胞類型包括腎成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞；制備腎上皮生物墨，所述上皮生物墨包含腎小管上皮細(xì)胞；沉積所述間質(zhì)生物墨和所述上皮生物墨，使得所述上皮生物墨在所述間質(zhì)生物墨的至少一個(gè)表面上形成層；和使沉積的生物墨在細(xì)胞培養(yǎng)基中成熟以使細(xì)胞粘附來形成三維工程化生物學(xué)腎小管模型；使治療劑與構(gòu)建體接觸；測(cè)量腎小管上皮細(xì)胞的活力或功能；和基于測(cè)量的腎小管上皮細(xì)胞的活力或功能評(píng)估治療劑的腎毒性。在某些實(shí)施方案中，所述間質(zhì)生物墨通過擠出生物打印來沉積。在某些實(shí)施方案中，所述上皮生物墨通過噴墨生物打印來沉積。在某些實(shí)施方案中，間質(zhì)或上皮生物墨還包含治療性分子或物質(zhì)。

附圖說明

圖1示出了示意性概念圖的非限制性實(shí)例；在這種情況下，為示出了頂部為極化上皮單層的間質(zhì)層的示意性概念圖。

圖2a和2b示出了示意性結(jié)構(gòu)圖的非限制性實(shí)例；在這種情況下，示出了實(shí)施例1的結(jié)構(gòu)1的構(gòu)造的示意性結(jié)構(gòu)圖(圖2a)；以及組織融合后48小時(shí)生物打印的腎小管模型的非限制性實(shí)例(圖2b)。

圖3a和3b示出了描述實(shí)施例1的結(jié)構(gòu)1的顯微照片的非限制性實(shí)例；在這種情況下，h&e染色(圖3a：100x總放大倍率；圖3b：200x總放大倍率)。

圖4示出了實(shí)施例1的結(jié)構(gòu)1的顯微照片的非限制性實(shí)例；在這種情況下，用抗cd31(410)的抗體和顯示huvec網(wǎng)絡(luò)(430)的te7(420)染色。

圖5示出了實(shí)施例1的結(jié)構(gòu)1的低放大倍率下的顯微照片的非限制性實(shí)例；染色是用針對(duì)圍繞小管結(jié)構(gòu)的e-鈣粘蛋白(540)的抗體；和te7(520)。

圖6a和6b示出了示意性結(jié)構(gòu)圖的非限制性實(shí)例；在這種情況下，示出了實(shí)施例2的結(jié)構(gòu)2的構(gòu)造的示意性結(jié)構(gòu)圖。

圖7a和7b示出了描述實(shí)施例2的結(jié)構(gòu)2的顯微照片的非限制性實(shí)例；在這種情況下，h&e染色(黑色箭頭表示上皮細(xì)胞)。

圖8a和8b示出了描述實(shí)施例2的結(jié)構(gòu)2的顯微照片的非限制性實(shí)例；在這種情況下，顯示內(nèi)皮細(xì)胞的組織的顯微照片(圖8a)。顯示了810，huvecs的cd31染色；和820，成纖維細(xì)胞的te7染色。在該實(shí)施例中，通過e-鈣粘蛋白染色的組織的表面上檢測(cè)到上皮細(xì)胞(圖8b，840)。

圖9顯示了來自實(shí)施例3的構(gòu)建體的顯微照片，并描繪了呈現(xiàn)極化特征的3d腎組織中的近端小管上皮細(xì)胞(rptec)。在rptec之間的側(cè)膜上觀察到e-鈣粘蛋白(940和亮染色)，其對(duì)應(yīng)于在緊密連接處的定位。還顯示針對(duì)成纖維細(xì)胞的te7920染色。顯示為低(圖9a)、中(圖9b)和高(圖9c)放大倍數(shù)。

圖10a和10b示出了來自實(shí)施例3的生物打印的腎組織構(gòu)建體的h&e(圖10a)和三色(圖10b)染色。

圖11a和11b示出了具有刷狀緣(圖11a，箭頭)的圖11的構(gòu)建體，并且突出顯示了膠原沉積(圖11b，箭頭)。

圖12示出了來自實(shí)施例3的3d生物打印腎組織構(gòu)建體中觀察到廣泛的內(nèi)皮細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)。顯示了cd31(內(nèi)皮細(xì)胞，亮染色)和te7(成纖維細(xì)胞，1220)的染色。兩旁是內(nèi)皮細(xì)胞的假想內(nèi)腔用(*)標(biāo)記。

圖13示出了與2dhtert-rptec和間質(zhì)細(xì)胞單獨(dú)相比，實(shí)施例3的3d生物打印腎組織中的ggt活性。圖13顯示與2d共培養(yǎng)物相比，培養(yǎng)中的3d腎小管模型的持續(xù)活力。

圖14a、14b和14c示出了用包含不同比例的成纖維細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的間質(zhì)層生物打印的腎小管模型的宏觀視圖。圖14a顯示90:10成纖維細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞之比。圖14b顯示75:25成纖維細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞之比。圖14c顯示50:50成纖維細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞之比。

圖15a，15b和15c示出了用包含不同比例的成纖維細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的間質(zhì)層生物打印的腎小管模型的組織學(xué)。圖15a顯示90:10成纖維細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞之比。圖15b顯示75:25成纖維細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的比例。圖15c顯示50:50成纖維細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞之比。

圖16a和16b示出了生物打印的腎小管模型的表面積和厚度均勻度數(shù)據(jù)。圖16a示出了生物打印的腎小管模型的宏觀視圖。圖16b顯示了keyence表面映射數(shù)據(jù)。

圖17a，17b，17c和17d顯示了用不同量的內(nèi)皮細(xì)胞和不同血清濃度生物打印的腎小管模型的組織學(xué)。圖17a顯示在無血清培養(yǎng)基中濃度為1.25×10⁵個(gè)細(xì)胞/孔的上皮細(xì)胞。圖17b顯示在2％血清中濃度為1.25×10⁵個(gè)細(xì)胞/孔的上皮細(xì)胞。圖17c顯示在2％血清中濃度為2.5×10⁵個(gè)細(xì)胞/孔的上皮細(xì)胞。圖17d顯示在2％血清中濃度為5.0×10⁵個(gè)細(xì)胞/孔的上皮細(xì)胞。

圖18示出了使用兩性霉素b的毒性試驗(yàn)比較了3d腎小管模型與標(biāo)準(zhǔn)2d共培養(yǎng)物模型的反應(yīng)。

圖19a和19b示出了使用3d腎小管模型的兩性霉素b(ampb)毒性試驗(yàn)的實(shí)例。圖19a顯示了乳酸脫氫酶(ldh)釋放測(cè)定。圖19b顯示了γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(ggt)活性。

圖20a，20b和20c描繪了對(duì)應(yīng)于圖19的來自用載體(圖20a)、10μmampb(圖20b)或50μmampb(圖20c)處理的3d腎小管模型的組織學(xué)。箭頭表示上皮層。

圖21a，21b和21c示出了使用3d腎小管模型的順鉑毒性試驗(yàn)的實(shí)例。圖。21a顯示了活力的alamarblue測(cè)定。圖21b顯示γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(ggt)活性。圖21c顯示乳酸脫氫酶(ldh)釋放測(cè)定。

圖22a，22b，22c和22d示出了對(duì)應(yīng)于圖21的來自用載體(圖22a)、10μm順鉑(圖22b)、50μm順鉑(圖22c)和50ng/mltgfβ(圖22d)處理的腎小管模型的masson的三色染色組織學(xué)。

圖23a，23b和23c示出了使用3d腎小管模型比較原代和永生化內(nèi)皮細(xì)胞的順鉑毒性試驗(yàn)的實(shí)例。圖23a顯示了活力的alamarblue測(cè)定。圖23b顯示γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(ggt)活性。圖23c顯示乳酸脫氫酶(ldh)釋放測(cè)定。

圖24a和24b示出了孔徑對(duì)生物打印的間質(zhì)組織的影響。圖24a示出了以0.4μm的孔徑打印的間質(zhì)組織。圖24b示出了以1.0μm的孔徑打印的間質(zhì)組織。

圖25a，25b和25c示出了組織學(xué)h&e染色培養(yǎng)中的3d腎小管模型的長(zhǎng)期活力。圖25a顯示培養(yǎng)6天后的腎小管模型。圖25b顯示培養(yǎng)10天后的腎小管模型。圖25c24b顯示培養(yǎng)27天后的腎小管模型。

具體實(shí)施方式

本文提供三維工程化生物學(xué)腎小管模型，其包括：腎間質(zhì)組織層，所述腎間質(zhì)組織包含腎成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞；和腎上皮組織層，所述腎上皮組織包含腎小管上皮細(xì)胞，所述腎上皮組織與所述腎間質(zhì)組織層接觸形成三維工程化生物學(xué)腎小管模型；條件是所述間質(zhì)組織包含間質(zhì)生物墨，所述上皮組織包含上皮生物墨，并形成三維工程化生物學(xué)腎小管模型。

本文還提供了制造三維工程化化生物學(xué)腎小管模型的方法，所述方法包括：制備腎間質(zhì)生物墨，所述間質(zhì)生物墨包含多種間質(zhì)細(xì)胞類型，所述間質(zhì)細(xì)胞類型包含腎成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞；制備腎上皮生物墨，所述上皮生物墨包含腎小管上皮細(xì)胞；沉積所述腎間質(zhì)生物墨和所述腎上皮生物墨，使得所述腎上皮生物墨在所述腎間質(zhì)生物墨的層的至少一個(gè)表面上形成層；和使沉積的生物墨在細(xì)胞培養(yǎng)基中成熟以使細(xì)胞粘附來形成三維工程化生物學(xué)腎小管模型。

本文還提供了評(píng)估治療劑的腎毒性的方法，所述方法包括：制備腎間質(zhì)生物墨，所述間質(zhì)生物墨包含多種間質(zhì)細(xì)胞類型，所述間質(zhì)細(xì)胞類型包括腎成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞；制備腎上皮生物墨，所述上皮生物墨包含腎小管上皮細(xì)胞；沉積所述間質(zhì)生物墨和所述上皮生物墨，使得所述上皮生物墨在所述間質(zhì)生物墨的至少一個(gè)表面上形成層；和使沉積的生物墨在細(xì)胞培養(yǎng)基中成熟以使細(xì)胞粘附來形成三維工程化生物學(xué)腎小管模型；使治療劑與構(gòu)建體接觸；測(cè)量腎小管上皮細(xì)胞的活力或功能；和基于測(cè)量的腎小管上皮細(xì)胞的活力或功能評(píng)估治療劑的腎毒性。

某些定義

除非另有定義，本文使用的所有技術(shù)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同的含義。如在本說明書和所附權(quán)利要求中所使用的，單數(shù)形式“一個(gè)”、“一種”和“所述”包括復(fù)數(shù)形式，除非上下文另有明確規(guī)定。本文中任何所涉及的“或”旨在包括“和/或”，除非另有說明。

如本文所使用的，“陣列”意指包括空間排列以允許對(duì)一個(gè)樣本進(jìn)行多個(gè)測(cè)試、對(duì)多個(gè)樣本執(zhí)行一個(gè)或多個(gè)測(cè)試、或二者的多個(gè)元件的關(guān)聯(lián)的科學(xué)工具。

如本文所使用的，“測(cè)定”意指用于測(cè)試或測(cè)量有機(jī)或生物樣品(例如，細(xì)胞聚集體、組織、器官、生物體等)中物質(zhì)(例如化學(xué)品、分子、生物化學(xué)品、蛋白質(zhì)、激素或藥物等)的存在或活性的程序。

如本文所使用的，“層”意指x和y平面中的細(xì)胞以一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞厚度的締合。在一些實(shí)施方案中，本文所述的腎小管包括一層。在其它實(shí)施方案中，本文所述的腎小管包括多層。在各種實(shí)施方案中，層形成連續(xù)的、基本上連續(xù)的、或不連續(xù)的細(xì)胞片。在一些實(shí)施方案中，本文所述的每層腎小管包含x、y和z軸中的多個(gè)細(xì)胞。

如本文所使用的，“組織”意指細(xì)胞的聚集體。

如本文所使用的，“生物墨”意指用于生物打印的液體、半固體或固體組合物。在一些實(shí)施方案中，生物墨包含細(xì)胞溶液、細(xì)胞聚集體、含細(xì)胞的凝膠、多細(xì)胞體或組織。在一些實(shí)施方案中，生物墨還包括提供能夠進(jìn)行生物打印的特定生物力學(xué)性質(zhì)的非細(xì)胞材料。在一些實(shí)施方案中，生物墨包含擠出化合物。在一些情況下，將擠出化合物工程化為在生物打印過程之后被去除。在其它實(shí)施方案中，擠出化合物的至少一些部分保持夾帶有打印后的細(xì)胞并且不被去除。間質(zhì)生物墨包含至少一種間質(zhì)來源的細(xì)胞，例如成纖維細(xì)胞、間充質(zhì)細(xì)胞或被誘導(dǎo)具有間質(zhì)特征的多能細(xì)胞。上皮生物墨包括至少一種上皮細(xì)胞類型，包括近端小管的細(xì)胞。

如本文所使用的，“生物打印”意指通過與自動(dòng)化或半自動(dòng)化的計(jì)算機(jī)輔助三維原型設(shè)計(jì)設(shè)備(如生物打印機(jī))相兼容的方法來利用細(xì)胞(例如，細(xì)胞溶液、含細(xì)胞的凝膠、細(xì)胞懸浮液、細(xì)胞濃縮液、多細(xì)胞聚集體、多細(xì)胞體等)的三維精確沉積。合適的生物打印機(jī)包括來自organovo,inc.(sandiego,ca)的novogen

如本文所使用的，“支架”意指合成支架，例如聚合物支架和多孔水凝膠，非合成支架如預(yù)先形成的細(xì)胞外基質(zhì)層、死細(xì)胞層和脫細(xì)胞組織，以及任何其它類型的預(yù)先形成的支架，其與工程化組織的物理結(jié)構(gòu)一體化，并且不能在不損壞/破壞組織下從所述組織移除。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，脫細(xì)胞組織支架包括脫細(xì)胞化的天然組織或由培養(yǎng)細(xì)胞以任何方式產(chǎn)生的脫細(xì)胞化細(xì)胞材料；例如，允許死亡或脫細(xì)胞化的細(xì)胞層，留下他們存活時(shí)產(chǎn)生的ecm。因此，術(shù)語“無支架”意在意味著預(yù)先形成的支架不是使用時(shí)的工程化組織的不可分割的部分，或已被去除或作為工程化組織的惰性組分保留?！盁o支架”與“不含支架”和“不含預(yù)先形成的支架”互換使用。

如本文所使用的，“受試者”是任何哺乳動(dòng)物物種的生物體，包括但不限于人，靈長(zhǎng)類動(dòng)物，猿，猴，狗，貓，小鼠，大鼠，兔，豬，馬等。受試者可以是活的或死亡的任何哺乳動(dòng)物物種。受試者包括最近死亡的受試者或取自活受試者的活檢樣本。

本文所用的“治療性物質(zhì)”意指被批準(zhǔn)用于治療疾病(根據(jù)對(duì)治療疾病的調(diào)查)或者引起生物反應(yīng)如dna、rna、肽、多肽或蛋白質(zhì)變化的任何分子、生物學(xué)、化合物或組合物。

如本文所使用的，“活力”意指由至少一種活力試驗(yàn)確定的生物墨或組織層中的至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％以上的細(xì)胞是活的?；盍υ囼?yàn)是本領(lǐng)域已知的，并且包括但不限于活體染料，凋亡標(biāo)記染色，tunel染色，dna斷裂分析，alamarblue染色，功能測(cè)定等。

腎小管模型的組成

在一些實(shí)施方案中，組織內(nèi)的細(xì)胞在空間上組織以重現(xiàn)小管-間質(zhì)組織界面的層狀結(jié)構(gòu)；在包括基于內(nèi)皮細(xì)胞的微血管網(wǎng)絡(luò)的腎間質(zhì)組織層的頂部上存在極化的小管上皮。特化的細(xì)胞，如epo產(chǎn)生細(xì)胞，任選地包括在管周間隙內(nèi)。在一些實(shí)施方案中，上皮具有或產(chǎn)生刷狀緣。

在特定的非限制性實(shí)施方案中，本文所述的工程化腎組織包括兩個(gè)主要部分：1)由成年腎成纖維細(xì)胞和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(huvec)組成的間質(zhì)層；和2)由正常人腎近端小管上皮細(xì)胞(rptec)、madin-darby犬腎細(xì)胞(mdck)、大鼠原代rptec細(xì)胞和/或永生化rptec細(xì)胞組成的極化上皮單層，其中永生化任選地通過遺傳操縱htert以形成htert永生化的rptec細(xì)胞來實(shí)現(xiàn)。使用novogenmmxbioprinter以使得上皮層在間質(zhì)層頂部的方式沉積細(xì)胞(參見圖1)。結(jié)構(gòu)是通過與隨時(shí)間降解的熱響應(yīng)性水凝膠(2.0)混合的細(xì)胞的空間控制沉積與通過壓縮氣體推進(jìn)(噴墨噴涂)沉積霧化的細(xì)胞材料相結(jié)合來建立。

參考圖1，在特定實(shí)施方案中，三維工程化腎小管模型包括間質(zhì)層和上皮層。在該實(shí)施方案中，兩層共同建模腎遠(yuǎn)端小管的壁。這種配置對(duì)于體內(nèi)組織的建模和預(yù)測(cè)天然組織反應(yīng)至關(guān)重要。上皮層的反應(yīng)是天然組織對(duì)藥物、化學(xué)品或生物制劑的反應(yīng)的前兆，并且可以提供與毒性或效力有關(guān)的信息。間質(zhì)層對(duì)于上皮的正常運(yùn)行至關(guān)重要，并且用作天然組織纖維化的模型，特別是腎小管間質(zhì)性纖維化。

參考圖2a，在特定實(shí)施方案中，使用連續(xù)沉積技術(shù)對(duì)間質(zhì)層進(jìn)行生物打印。在該實(shí)施方案中，生物打印間質(zhì)片，隨后是間質(zhì)的邊緣以形成三側(cè)容器。然后將一層上皮再次使用連續(xù)沉積技術(shù)生物打印到間質(zhì)的容器中。該實(shí)施方案提供了間質(zhì)層和上皮層之間的必要接觸。圖2b描繪了在組織聚結(jié)(coalesce)后48小時(shí)顯示的實(shí)際生物打印的腎小管模型。在一些實(shí)施方案中，組織在4、6、8、12或24小時(shí)內(nèi)聚結(jié)。

參考圖6a和6b，在特定實(shí)施方案中，使用連續(xù)沉積技術(shù)對(duì)間質(zhì)層進(jìn)行生物打印。在該實(shí)施方案中，使用噴墨沉積技術(shù)將上皮層生物打印到間質(zhì)層上?；旧线B續(xù)的上皮層與體內(nèi)組織一致，并且對(duì)復(fù)制生理學(xué)相關(guān)的結(jié)構(gòu)至關(guān)重要。噴墨沉積技術(shù)提供將一個(gè)或多個(gè)上層細(xì)胞薄層沉積到間質(zhì)層的潛在不規(guī)則表面上的能力。在這樣的實(shí)施方案中，任選地在間質(zhì)層的生物打印之后或在已經(jīng)允許間質(zhì)層成熟后立即進(jìn)行上皮層的噴墨沉積。

在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞被生物打印。在另外的實(shí)施方案中，生物打印的細(xì)胞粘附以形成工程化的腎小管模型。還在另外的實(shí)施方案中，工程化的腎小管模型在制造時(shí)或使用時(shí)沒有或基本上沒有預(yù)先形成的支架。在某些情況下，生物打印允許制造模擬天然組織的適當(dāng)細(xì)胞性的組織。

在一些實(shí)施方案中，本文描述的三維工程化腎小管模型與通過現(xiàn)有技術(shù)制造的組織的區(qū)別在于：它們是三維的，不含預(yù)先形成的支架，基本上由細(xì)胞組成，和/或具有高細(xì)胞密度(例如，大于30％細(xì)胞，大于40％細(xì)胞，大于50％細(xì)胞，大于60％細(xì)胞，大于70％細(xì)胞，大于80％細(xì)胞，大于90％細(xì)胞，或大于95％細(xì)胞)。

在一些實(shí)施方案中，本文所述的三維工程化腎小管模型與天然(例如非工程化)組織的區(qū)別在于：它們是非神經(jīng)支配的(例如，基本上不含神經(jīng)組織)，基本上不含成熟脈管系統(tǒng)，和/或基本上不含血液成分。例如，在各種實(shí)施方案中，三維工程化腎小管模型不含血漿、紅細(xì)胞、血小板等，和/或內(nèi)源產(chǎn)生的血漿、紅細(xì)胞、血小板等。在某些實(shí)施方案中，工程化的腎小管模型缺乏免疫細(xì)胞，例如t細(xì)胞、b細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞或嗜酸性粒細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，模型不像天然存在的腎近端小管呈管狀，而是呈平面或片狀的，這有利地允許體外測(cè)定和分析。在一些實(shí)施方案中，成纖維細(xì)胞不是腎源性的。在一些實(shí)施方案中，內(nèi)皮細(xì)胞不是腎源性的。在一些實(shí)施方案中，上皮細(xì)胞不是人源性的。在某些實(shí)施方案中，工程化的腎小管模型缺乏未分化的細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，工程化的腎小管模型缺乏未分化的腎細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，本文所述的三維工程化腎小管模型與天然腎小管組織的區(qū)別在于它們是平坦的或基本上平坦的。在某些實(shí)施方案中，本文所述的三維工程化腎小管模型具有超過天然腎小管組織的功能改進(jìn)；一個(gè)例子是培養(yǎng)至少7、10或27天的持續(xù)培養(yǎng)時(shí)間后的高活力。在一些實(shí)施方案中，用于腎小管模型中的細(xì)胞是轉(zhuǎn)化的或永生化的。在一些實(shí)施方案中，在腎小管模型中使用的細(xì)胞是轉(zhuǎn)基因的，并且含有與熒光蛋白如egfp、gfp、rfp、yfp或cfp的蛋白質(zhì)融合。在一些實(shí)施方案中，在腎小管模型中使用的細(xì)胞是轉(zhuǎn)基因的，并含有具有熒光蛋白如egfp、gfp、rfp、yfp、gfp的報(bào)道子構(gòu)建體；或熒光蛋白如螢火蟲或海腎熒光素酶。在某些實(shí)施方案中，任何細(xì)胞含有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個(gè)或更多個(gè)基因的缺失或插入。在一些實(shí)施方案中，3d腎小管模型是嵌合體，其中至少一種細(xì)胞來自與3d腎小管模型的任何其它細(xì)胞不同的哺乳動(dòng)物物種。在一些實(shí)施方案中，3d腎小管模型是嵌合體，其中至少一種細(xì)胞來自與3d腎小管模型的任何其它細(xì)胞不同的人供體(donar)。

細(xì)胞輸入

在一些實(shí)施方案中，本文所述的工程化組織、陣列和方法包括多種細(xì)胞類型。在一些實(shí)施方案中，腎小管模型包括包含哺乳動(dòng)物成纖維細(xì)胞和哺乳動(dòng)物內(nèi)皮細(xì)胞的間質(zhì)組織層。在各種實(shí)施方案中，合適的內(nèi)皮細(xì)胞衍生自人臍靜脈(huvec)、人原代、人腎、或衍生自誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(ips)或人胚胎干細(xì)胞(hes)的定向分化。在一些實(shí)施方案中，成纖維細(xì)胞是腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞。在各種實(shí)施方案中，合適的腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞衍生自從人腎分離的原代細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，成纖維細(xì)胞起源于真皮或血管。在一些實(shí)施方案中，一種或多種細(xì)胞組分衍生自非人哺乳動(dòng)物。在一些實(shí)施方案中，間質(zhì)組織包含腫瘤細(xì)胞或癌細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，間質(zhì)組織層基本上是單層。在一些實(shí)施方案中，間質(zhì)組織層包含其表面積的95％以上的單層。在一些實(shí)施方案中，間質(zhì)組織層包含其表面積的90％以上的單層。在一些實(shí)施方案中，間質(zhì)組織層包含其表面積的80％以上的單層。在一些實(shí)施方案中，間質(zhì)組織層大于1個(gè)細(xì)胞厚度。在一些實(shí)施方案中，間質(zhì)組織層大于2個(gè)細(xì)胞厚度。在一些實(shí)施方案中，間質(zhì)組織層大于3個(gè)細(xì)胞厚度。在一些實(shí)施方案中，間質(zhì)組織層大于4個(gè)細(xì)胞厚度。在一些實(shí)施方案中，間質(zhì)組織層大于5個(gè)細(xì)胞厚度。在一些實(shí)施方案中，間質(zhì)組織層大于10個(gè)細(xì)胞厚度。在一些實(shí)施方案中，間質(zhì)組織層大于20個(gè)細(xì)胞厚度。在一些實(shí)施方案中，間質(zhì)組織層大于50細(xì)胞厚度。在一些實(shí)施方案中，間質(zhì)組織層大于100個(gè)細(xì)胞厚度。在一些實(shí)施方案中，間質(zhì)組織層大于20μm厚。在一些實(shí)施方案中，間質(zhì)組織層大于30μm厚。在一些實(shí)施方案中，間質(zhì)組織層大于40μm厚。在一些實(shí)施方案中，間質(zhì)組織層大于50μm厚。在一些實(shí)施方案中，間質(zhì)組織層大于100μm厚。在一些實(shí)施方案中，間質(zhì)組織層大于200μm厚。在一些實(shí)施方案中，間質(zhì)組織層大于500μm厚。在一些實(shí)施方案中，間質(zhì)組織層大于600μm厚。在一些實(shí)施方案中，間隙組織層大于1000μm厚。在一些實(shí)施方案中，間質(zhì)組織層小于20μm厚。在一些實(shí)施方案中，間質(zhì)組織層小于30μm厚。在一些實(shí)施方案中，間質(zhì)組織層小于40μm厚。在一些實(shí)施方案中，間質(zhì)組織層小于50μm厚。在一些實(shí)施方案中，間質(zhì)組織層小于100μm厚。在一些實(shí)施方案中，間質(zhì)組織層小于200μm厚。在一些實(shí)施方案中，間質(zhì)組織層小于500μm厚。在一些實(shí)施方案中，間質(zhì)組織層小于600μm厚。在一些實(shí)施方案中，間質(zhì)組織層小于1000μm厚。

在一些實(shí)施方案中，腎小管模型包括包含哺乳動(dòng)物上皮細(xì)胞的上皮組織層。在另外的實(shí)施方案中，上皮細(xì)胞是腎小管上皮細(xì)胞(例如近端小管上皮細(xì)胞)。在另外的實(shí)施方案中，合適的腎小管上皮細(xì)胞是衍生自干細(xì)胞(誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞(ips)衍生的和/或人胚胎干細(xì)胞(hes)衍生的)的定向分化衍生的的原代分離物或細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，腎小管上皮細(xì)胞是madin-darby犬腎(mdck)細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，腎小管上皮細(xì)胞是永生化的人細(xì)胞。在其他實(shí)施方案中，腎小管上皮細(xì)胞是永生化細(xì)胞，例如htert-rptec細(xì)胞、hk-2細(xì)胞、llc-pk1細(xì)胞或ok細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，上皮細(xì)胞衍生自非人哺乳動(dòng)物，例如大鼠、小鼠、豬或靈長(zhǎng)類動(dòng)物。在一些實(shí)施方案中，上皮組織層基本上由腎小管上皮細(xì)胞組成。在一些實(shí)施方案中，上皮組織層基本上由原代腎小管上皮細(xì)胞組成。在一些實(shí)施方案中，上皮組織層基本上由腎近端小管上皮細(xì)胞組成。在一些實(shí)施方案中，上皮組織層基本上由原代腎近端小管上皮細(xì)胞組成。在一些實(shí)施方案中，上皮組織層基本上是單層。在一些實(shí)施方案中，上皮組織層包含腫瘤細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，上皮組織層包含腎細(xì)胞癌細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，上皮組織層包含其表面積的95％以上的單層。在一些實(shí)施方案中，上皮組織層包含其表面積的90％以上的單層。在一些實(shí)施方案中，上皮組織層包含其表面積的80％以上的單層。在一些實(shí)施方案中，上皮組織層大于1個(gè)細(xì)胞厚度。在一些實(shí)施方案中，上皮組織層大于2個(gè)細(xì)胞厚度。在一些實(shí)施方案中，上皮組織層大于3個(gè)細(xì)胞厚度。在一些實(shí)施方案中，上皮組織層大于4個(gè)細(xì)胞厚度。在一些實(shí)施方案中，上皮組織層大于5個(gè)細(xì)胞厚度。在一些實(shí)施方案中，上皮組織層大于10個(gè)細(xì)胞厚度。在一些實(shí)施方案中，上皮組織層大于20個(gè)細(xì)胞厚度。在一些實(shí)施方案中，上皮組織層大于50個(gè)細(xì)胞厚度。在一些實(shí)施方案中，上皮組織層大于100個(gè)細(xì)胞厚度。在一些實(shí)施方案中，上皮組織層大于20μm厚。在一些實(shí)施方案中，上皮組織層大于30μm厚。在一些實(shí)施方案中，上皮組織層大于40μm厚。在一些實(shí)施方案中，上皮組織層大于50μm厚。在一些實(shí)施方案中，上皮組織層大于100μm厚。在一些實(shí)施方案中，上皮組織層大于200μm厚。在一些實(shí)施方案中，上皮組織層大于500μm厚。在一些實(shí)施方案中，間質(zhì)組織層大于600μm厚。在一些實(shí)施方案中，上皮組織層大于1000μm厚。在一些實(shí)施方案中，上皮組織層小于1000μm厚。在一些實(shí)施方案中，間質(zhì)組織層小于600μm厚。在一些實(shí)施方案中，上皮組織層小于500μm厚。在一些實(shí)施方案中，上皮組織層小于200μm厚。在一些實(shí)施方案中，上皮組織層小于100μm厚。在一些實(shí)施方案中，上皮組織層小于50μm厚。在一些實(shí)施方案中，上皮組織層小于40μm厚。在一些實(shí)施方案中，上皮組織層小于30μm厚。在一些實(shí)施方案中，上皮組織層小于20μm厚。

任選地，腎小管模型包含其他細(xì)胞類型(例如，epo產(chǎn)生細(xì)胞、免疫細(xì)胞等)。在一些實(shí)施方案中，免疫細(xì)胞是t細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，免疫細(xì)胞是b細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，免疫細(xì)胞是nk細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，免疫細(xì)胞是樹突細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，免疫細(xì)胞是巨噬細(xì)胞。

范圍廣泛的細(xì)胞比例是合適的。在一些實(shí)施方案中，上皮層包括近端小管上皮細(xì)胞，由其組成，或基本上由其組成。在一些實(shí)施方案中，間質(zhì)層包含特定比例的成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，由其組成，或基本上由其組成。作為非限制性實(shí)例，成纖維細(xì)胞的合適比例包括約5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90和95％的成纖維細(xì)胞，包括其中的增量。作為非限制性實(shí)例，內(nèi)皮細(xì)胞的合適比例包括約5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90和95％的內(nèi)皮細(xì)胞，包括其中的增量。在某些實(shí)施方案中，間質(zhì)層包括特定比的成纖維細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞，由其組成，或基本上由其組成。在某些實(shí)施方案中，成纖維細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞之比為至少5:95、10:90、15:85、20:80、25:75、30:70、35:65、40:60、45:65，50:50、55:45、60:40、65:35、70:30、75:25、80:20、85:15、90:10或95:5，包括其中的增量。在某些實(shí)施方案中，成纖維細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞之比不超過5:95、10:90、15:85、20:80、25:75、30:70、35:65、40:60、45:65、50:50、55:45、60:40、65:35、70:30、75:25、80:20、85:15、90:10或95:5，包括其中的增量。在某些實(shí)施方案中，成纖維細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞之比為約50:50。在某些實(shí)施方案中，成纖維細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞之比為約60:40至約40:60。

范圍廣泛的細(xì)胞濃度適用于生物墨。生物墨適合為連續(xù)沉積生物打印技術(shù)制備，其中作為非限制性實(shí)例，細(xì)胞的濃度包括約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、225、250、275、300或更多百萬個(gè)細(xì)胞/毫升生物墨。在一個(gè)特定實(shí)施方案中，為連續(xù)沉積生物打印制備的生物墨包含約1-2億個(gè)細(xì)胞/ml。生物墨適合為噴墨沉積生物打印技術(shù)制備，其中作為非限制性實(shí)例，細(xì)胞的濃度包括約0.25、0.5、1、2、3、5、10、15或更多百萬個(gè)細(xì)胞/毫升生物墨。在一個(gè)特定實(shí)施方案中，為噴墨沉積生物打印制備的生物墨包含約1-5百萬個(gè)細(xì)胞/ml。在一個(gè)特定實(shí)施方案中，為噴墨沉積生物打印制備的生物墨包含約1-4百萬個(gè)細(xì)胞/ml。在一個(gè)特定實(shí)施方案中，為噴墨沉積生物打印制備的生物墨包含約1-3百萬個(gè)細(xì)胞/ml。在一個(gè)特定實(shí)施方案中，為噴墨沉積生物打印制備的生物墨包含約1-2百萬個(gè)細(xì)胞/ml。

在某些實(shí)施方案中，腎間質(zhì)生物墨包含5000萬至10億個(gè)細(xì)胞/毫升。在某些實(shí)施方案中，腎間質(zhì)生物墨包含5000萬至9億個(gè)細(xì)胞/毫升。在某些實(shí)施方案中，腎間質(zhì)生物墨包含5000萬至8億個(gè)細(xì)胞/毫升。在某些實(shí)施方案中，腎間質(zhì)生物墨包含5000萬至7億個(gè)細(xì)胞/毫升。在某些實(shí)施方案中，腎間質(zhì)生物墨包含5000萬至6億個(gè)細(xì)胞/毫升。在某些實(shí)施方案中，腎間質(zhì)生物墨包含5000萬至5億個(gè)細(xì)胞/毫升。在某些實(shí)施方案中，腎間質(zhì)生物墨包含5000萬至4億個(gè)細(xì)胞/毫升。在某些實(shí)施方案中，腎間質(zhì)生物墨包含5000萬至3億個(gè)細(xì)胞/毫升。在某些實(shí)施方案中，腎間質(zhì)生物墨包含5000萬至2億個(gè)細(xì)胞/毫升。在某些實(shí)施方案中，腎間質(zhì)生物墨包含7500萬至6億個(gè)細(xì)胞/毫升。在某些實(shí)施方案中，腎間質(zhì)生物墨包含1億至6億個(gè)細(xì)胞/毫升。在某些實(shí)施方案中，腎間質(zhì)生物墨包含1億至5億個(gè)細(xì)胞/毫升。在某些實(shí)施方案中，腎間質(zhì)生物墨包含1億至4億個(gè)細(xì)胞/毫升。在某些實(shí)施方案中，腎間質(zhì)生物墨包含1億至3億個(gè)細(xì)胞/毫升。在某些實(shí)施方案中，腎間質(zhì)生物墨包含1億至2億個(gè)細(xì)胞/毫升。在某些實(shí)施方案中，腎間質(zhì)生物墨包含1億至1.5億個(gè)細(xì)胞/毫升。

在某些實(shí)施方案中，腎上皮生物墨包含25萬至500萬個(gè)細(xì)胞/毫升。在某些實(shí)施方案中，腎上皮生物墨包含25萬至400萬個(gè)細(xì)胞/毫升。在某些實(shí)施方案中，腎上皮生物墨包含25萬至300萬個(gè)細(xì)胞/毫升。在某些實(shí)施方案中，腎上皮生物墨包含25萬至200萬個(gè)細(xì)胞/毫升。在某些實(shí)施方案中，腎上皮生物墨包含25萬至100萬個(gè)細(xì)胞/毫升。在某些實(shí)施方案中，腎上皮生物墨包含50萬至500萬個(gè)細(xì)胞/毫升。在某些實(shí)施方案中，腎上皮生物墨包含50萬至400萬個(gè)細(xì)胞/毫升。在某些實(shí)施方案中，腎上皮生物墨包含50萬至300萬個(gè)細(xì)胞/毫升。在某些實(shí)施方案中，腎上皮生物墨包含50萬至200萬個(gè)細(xì)胞/毫升。在某些實(shí)施方案中，腎上皮生物墨包含50萬至100萬個(gè)細(xì)胞/毫升。在某些實(shí)施方案中，腎上皮生物墨包含100萬至500萬個(gè)細(xì)胞/毫升。在某些實(shí)施方案中，腎上皮生物墨包含100萬至400萬個(gè)細(xì)胞/毫升。在某些實(shí)施方案中，腎上皮生物墨包含100萬至300萬個(gè)細(xì)胞/毫升。在某些實(shí)施方案中，腎上皮生物墨包含100萬至200萬個(gè)細(xì)胞/毫升。

在某些實(shí)施方案中，上皮生物墨的密度小于間質(zhì)生物墨的密度。在某些實(shí)施方案中，間質(zhì)生物墨的密度與上皮生物墨的密度之比為約300:1；約275：1；約250：1；約225：1；約200：1；約175：1；約150：1，約125：1；約100:1，約75:1或約50:1。在某些實(shí)施方案中，間質(zhì)生物墨的密度與上皮生物墨的密度的比值為約300:1至約50:1。在某些實(shí)施方案中，間質(zhì)生物墨的密度與上皮生物墨的密度的比率為約250:1至約75:1。在某些實(shí)施方案中，間質(zhì)生物墨的密度與上皮生物墨的密度的比率為約200:1至約75:1。在某些實(shí)施方案中，間質(zhì)生物墨的密度與上皮生物墨的密度的比值為約150:1至約75:1。在某些實(shí)施方案中，間質(zhì)生物墨的密度與上皮生物墨的密度的比值為約125:1至約75:1。

在某些實(shí)施方案中，生物墨是粘性液體。在某些實(shí)施方案中，生物墨是半固體。在某些實(shí)施方案中，生物墨是固體。在某些實(shí)施方案中，生物墨的粘度大于100厘泊。在某些實(shí)施方案中，生物墨的粘度大于200厘泊。在某些實(shí)施方案中，生物墨的粘度大于500厘泊。在某些實(shí)施方案中，生物墨的粘度大于1,000厘泊。在某些實(shí)施方案中，生物墨的粘度大于2,000厘泊。在某些實(shí)施方案中，生物墨的粘度大于5,000厘泊。在某些實(shí)施方案中，生物墨的粘度大于10,000厘泊。在某些實(shí)施方案中，生物墨的粘度大于20,000厘泊。在某些實(shí)施方案中，生物墨的粘度大于50,000厘泊。在某些實(shí)施方案中，生物墨的粘度大于100,000厘泊。在某些實(shí)施方案中，生物墨的粘度小于100厘泊。在某些實(shí)施方案中，生物墨的粘度小于200厘泊。在某些實(shí)施方案中，生物墨的粘度小于500厘泊。在某些實(shí)施方案中，生物墨的粘度小于1,000厘泊。在某些實(shí)施方案中，生物墨的粘度小于2,000厘泊。在某些實(shí)施方案中，生物墨的粘度小于5,000厘泊。在某些實(shí)施方案中，生物墨的粘度小于10,000厘泊。在某些實(shí)施方案中，生物墨的粘度小于20,000厘泊。在某些實(shí)施方案中，生物墨的粘度小于50,000厘泊。在某些實(shí)施方案中，生物墨的粘度小于100,000厘泊。

在一些實(shí)施方案中，腎小管模型的平均厚度為至少50μm。在一些實(shí)施方案中，腎小管模型的平均厚度為至少100μm。在一些實(shí)施方案中，腎小管模型的平均厚度為至少200μm。在一些實(shí)施方案中，腎小管模型的平均厚度為至少300μm。在一些實(shí)施方案中，腎小管模型的平均厚度為至少400μm。在一些實(shí)施方案中，腎小管模型的平均厚度為至少500μm。在一些實(shí)施方案中，腎小管模型的平均厚度為至少600μm。在一些實(shí)施方案中，腎小管模型的平均厚度為至少700μm。在一些實(shí)施方案中，腎小管模型的平均厚度為至少800μm。在一些實(shí)施方案中，腎小管模型的平均厚度為至少900μm。在一些實(shí)施方案中，腎小管模型的平均厚度為至少1000μm。在一些實(shí)施方案中，腎小管模型的平均厚度在50μm和1000μm之間。在一些實(shí)施方案中，腎小管模型的平均厚度在75μm和1000μm之間。在一些實(shí)施方案中，腎小管模型的平均厚度在100μm和1000μm之間。在一些實(shí)施方案中，腎小管模型的平均厚度在200μm和1000μm之間。在一些實(shí)施方案中，腎小管模型的平均厚度在500μm和1000μm之間。在一些實(shí)施方案中，腎小管模型的平均厚度在50μm和500μm之間。在一些實(shí)施方案中，腎小管模型的平均厚度在50μm和300μm之間。在一些實(shí)施方案中，腎小管模型的平均厚度在50μm和200μm之間。在一些實(shí)施方案中，腎小管模型的平均厚度在50μm和150μm之間。在一些實(shí)施方案中，腎小管模型的平均厚度在50μm和125μm之間。在一些實(shí)施方案中，腎小管模型的平均厚度在75μm和100μm之間。

在一些實(shí)施方案中，腎小管模型的表面積至少為0.01cm²。在一些實(shí)施方案中，腎小管模型的表面積至少為0.02cm²。在一些實(shí)施方案中，腎小管模型的表面積至少為0.03cm²。在一些實(shí)施方案中，腎小管模型的表面積至少為0.04cm²。在一些實(shí)施方案中，腎小管模型的表面積至少為0.05cm²。在一些實(shí)施方案中，腎小管模型的表面積至少為0.06cm²。在一些實(shí)施方案中，腎小管模型的表面積至少為0.07cm²。在一些實(shí)施方案中，腎小管模型的表面積至少為0.08cm²。在一些實(shí)施方案中，腎小管模型的表面積至少為0.09cm²。在一些實(shí)施方案中，腎小管模型的表面積至少為0.10cm²。在一些實(shí)施方案中，腎小管模型的表面積至少為0.11cm²。在一些實(shí)施方案中，腎小管模型的表面積至少為0.12cm²。在一些實(shí)施方案中，腎小管模型的表面積小于0.5cm²。在一些實(shí)施方案中，腎小管模型的表面積小于0.4cm²。在一些實(shí)施方案中，腎小管模型的表面積小于0.3cm²。在一些實(shí)施方案中，腎小管模型的表面積小于0.2cm²。在一些實(shí)施方案中，腎小管模型的表面積小于0.1cm²。

腎小管模型的結(jié)構(gòu)特征

本公開的腎小管模型可以以許多配置進(jìn)行結(jié)構(gòu)安排。在某些實(shí)施方案中，上皮組織層和間質(zhì)組織層是獨(dú)立的結(jié)構(gòu)上不同的層，二者直接接觸或間隔1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20μm或更多，包括其中的增量。在某些實(shí)施方案中，間隔是由于在兩層之間的細(xì)胞外基質(zhì)的分泌和沉積，為了本公開的目的將其視為接觸。在正常生理組織細(xì)胞和細(xì)胞層被極化以具有面向其他細(xì)胞或組織基質(zhì)的頂端(面朝內(nèi)腔)表面和基底外側(cè)表面。為了本文公開的腎小管模型的目的，基底外側(cè)表面是指面向另一細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)或生物相容性膜或培養(yǎng)容器表面的表面。為了本文公開的腎小管模型的目的，頂端表面是指遠(yuǎn)離生物相容性膜或培養(yǎng)容器表面的表面。在某些實(shí)施方案中，間質(zhì)組織層的基底外側(cè)表面是連接到生物相容性膜或培養(yǎng)容器的表面；并且間質(zhì)組織層的頂端表面是未連接到生物相容性膜或培養(yǎng)容器的表面。在某些實(shí)施方案中，上皮組織層沉積在間質(zhì)組織層的頂端表面上并形成層，從而形成兩個(gè)結(jié)構(gòu)不同的層。在某些實(shí)施方案中，上皮組織層和間質(zhì)組織層是連續(xù)接觸的。在某些實(shí)施方案中，至少99％的上皮組織層與間質(zhì)組織層連續(xù)接觸。在某些實(shí)施方案中，至少95％的上皮組織層與間質(zhì)組織層連續(xù)接觸。在某些實(shí)施方案中，至少90％的上皮組織層與間質(zhì)組織層連續(xù)接觸。在某些實(shí)施方案中，至少80％的上皮組織層與間質(zhì)組織層連續(xù)接觸。在某些實(shí)施方案中，至少70％的上皮組織層與間質(zhì)組織層連續(xù)接觸。在某些實(shí)施方案中，至少60％的上皮組織層與間質(zhì)組織層連續(xù)接觸。在某些實(shí)施方案中，至少50％的上皮組織層與間質(zhì)組織層連續(xù)接觸。在某些實(shí)施方案中，小于99％的上皮組織層與間質(zhì)組織層連續(xù)接觸。在某些實(shí)施方案中，少于98％的上皮組織層與間質(zhì)組織層連續(xù)接觸。在某些實(shí)施方案中，小于97％的上皮組織層與間質(zhì)組織層連續(xù)接觸。在某些實(shí)施方案中，小于95％的上皮組織層與間質(zhì)組織層連續(xù)接觸。在某些實(shí)施方案中，少于90％的上皮組織層與間質(zhì)組織層連續(xù)接觸。在某些實(shí)施方案中，小于80％的上皮組織層與間質(zhì)組織層連續(xù)接觸。在某些實(shí)施方案中，上皮組織層完全覆蓋間質(zhì)組織層的頂端表面。在某些實(shí)施方案中，上皮組織層覆蓋間質(zhì)組織層的頂端表面的至少99％。在某些實(shí)施方案中，上皮組織層覆蓋間質(zhì)組織層的頂端表面的至少95％。在某些實(shí)施方案中，上皮組織層覆蓋間隙組織層頂端表面的至少90％。在某些實(shí)施方案中，上皮組織層覆蓋間質(zhì)組織層的頂端表面的至少80％。在某些實(shí)施方案中，上皮組織層覆蓋間質(zhì)組織層的頂端表面的至少70％。在某些實(shí)施方案中，上皮組織層覆蓋間質(zhì)組織層的頂端表面的至少60％。在某些實(shí)施方案中，上皮組織層覆蓋間質(zhì)組織層的頂端表面的至少50％。在某些實(shí)施方案中，上皮組織層覆蓋間質(zhì)組織層的頂端表面的小于99％。在某些實(shí)施方案中，上皮組織層覆蓋間質(zhì)組織層的頂端表面的小于98％。在某些實(shí)施方案中，上皮組織層覆蓋了間質(zhì)組織層的頂端表面的小于97％。在某些實(shí)施方案中，上皮組織層覆蓋間質(zhì)組織層的頂端表面的小于95％。在某些實(shí)施方案中，上皮組織層覆蓋間質(zhì)組織層頂端表面的小于90％。在某些實(shí)施方案中，上皮組織層覆蓋間質(zhì)組織層的頂端表面的小于80％。在某些實(shí)施方案中，上皮組織層覆蓋間隙組織層的頂端表面的小于70％。

上皮組織層的結(jié)構(gòu)

通常，上皮組織細(xì)胞與相鄰細(xì)胞形成緊密連接。緊密連接的標(biāo)志是跨膜蛋白家族鈣粘蛋白。其中之一，e-鈣粘蛋白，在腎組織的緊密連接處特別突出，并標(biāo)志著其形成。在某些實(shí)施方案中，上皮組織層由形成緊密連接的細(xì)胞組成。在某些實(shí)施方案中，上皮組織層中的基本上所有細(xì)胞與至少一個(gè)相鄰細(xì)胞形成緊密連接。在某些實(shí)施方案中，上皮組織層中至少99％的細(xì)胞與至少一個(gè)其它細(xì)胞形成緊密連接。在某些實(shí)施方案中，上皮組織層中至少95％的細(xì)胞與至少一個(gè)其它細(xì)胞形成緊密連接。在某些實(shí)施方案中，上皮組織層中至少90％的細(xì)胞與至少一個(gè)其它細(xì)胞形成緊密連接。在某些實(shí)施方案中，上皮組織層中至少80％的細(xì)胞與至少一個(gè)其它細(xì)胞形成緊密連接。在某些實(shí)施方案中，上皮組織層中至少70％的細(xì)胞與至少一個(gè)其它細(xì)胞形成緊密連接。在某些實(shí)施方案中，上皮組織層中至少60％的細(xì)胞與至少一個(gè)其它細(xì)胞形成緊密連接。在某些實(shí)施方案中，上皮組織層中至少50％的細(xì)胞與至少一個(gè)其它細(xì)胞形成緊密連接。

細(xì)胞層的活力和密度

通過本公開的方法生物打印的優(yōu)點(diǎn)在于細(xì)胞可以以高密度和高活力打印。在某些實(shí)施方案中，間質(zhì)細(xì)胞層的密度為至少1×10⁶個(gè)細(xì)胞/ml。在某些實(shí)施方案中，間質(zhì)細(xì)胞層的密度為至少5×10⁶個(gè)細(xì)胞/ml。在某些實(shí)施方案中，間質(zhì)細(xì)胞層的密度為至少10×10⁶個(gè)細(xì)胞/ml。在某些實(shí)施方案中，間質(zhì)細(xì)胞層的密度為至少20×10⁶個(gè)細(xì)胞/ml。在某些實(shí)施方案中，間質(zhì)細(xì)胞層的密度為至少50×10⁶個(gè)細(xì)胞/ml。在某些實(shí)施方案中，間質(zhì)細(xì)胞層的密度為至少100×10⁶個(gè)細(xì)胞/ml。在某些實(shí)施方案中，間質(zhì)細(xì)胞層的密度為至少200×10⁶個(gè)細(xì)胞/ml。在某些實(shí)施方案中，間質(zhì)細(xì)胞層的密度為至少500×10⁶個(gè)細(xì)胞/ml。在某些實(shí)施方案中，間質(zhì)細(xì)胞層的密度在約100×10⁶個(gè)細(xì)胞/ml和約900×10⁶個(gè)細(xì)胞之間。在某些實(shí)施方案中，間質(zhì)細(xì)胞層的密度在約100×10⁶個(gè)細(xì)胞/ml和約700×10⁶個(gè)細(xì)胞之間。在某些實(shí)施方案中，間質(zhì)細(xì)胞層的密度在約100×10⁶個(gè)細(xì)胞/ml和約600×10⁶個(gè)細(xì)胞之間。在某些實(shí)施方案中，間質(zhì)細(xì)胞層的密度在約100×10⁶個(gè)細(xì)胞/ml和約500×10⁶個(gè)細(xì)胞之間。在某些實(shí)施方案中，間質(zhì)細(xì)胞層的密度在約100×10⁶個(gè)細(xì)胞/ml和約300×10⁶個(gè)細(xì)胞之間。在某些實(shí)施方案中，間質(zhì)細(xì)胞層的密度在約100×10⁶個(gè)細(xì)胞/ml和約200×10⁶個(gè)細(xì)胞之間。在某些實(shí)施方案中，間質(zhì)組織層的活力大于99體積％的活細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，間質(zhì)組織層的活力大于體積的95體積％的活細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，間質(zhì)組織層的活力大于90體積％的活細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，間質(zhì)組織層的活力大于80體積％活細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，間質(zhì)組織層的活力大于70體積％活細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，間質(zhì)組織層的活力大于60體積％活細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，間質(zhì)組織層的活力大于50體積％活細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，這種活力在打印后保持至少8、12、24、48、72、96或更多個(gè)小時(shí)。在某些實(shí)施方案中，該活力在打印后保持至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、21或更多天。在某些實(shí)施方案中，上皮細(xì)胞層的密度至少為1×10⁵個(gè)細(xì)胞/ml。在某些實(shí)施方案中，上皮細(xì)胞層的密度至少為2×10⁵個(gè)細(xì)胞/ml。在某些實(shí)施方案中，上皮細(xì)胞層的密度為至少5×10⁵個(gè)細(xì)胞/ml。在某些實(shí)施方案中，上皮細(xì)胞層的密度至少為1×10⁶個(gè)細(xì)胞/ml。在某些實(shí)施方案中，上皮細(xì)胞層的密度為至少5×10⁶個(gè)細(xì)胞/ml。在某些實(shí)施方案中，上皮細(xì)胞層的密度為至少10×10⁶個(gè)細(xì)胞/ml。在某些實(shí)施方案中，上皮細(xì)胞層的密度為至少20×10⁶個(gè)細(xì)胞/ml。在某些實(shí)施方案中，上皮細(xì)胞層的密度為至少50×10⁶個(gè)細(xì)胞/ml。在某些實(shí)施方案中，上皮細(xì)胞層的密度為至少100×10⁶個(gè)細(xì)胞/ml。在某些實(shí)施方案中，上皮細(xì)胞層的密度至少為200×10⁶個(gè)細(xì)胞/ml。在某些實(shí)施方案中，上皮細(xì)胞層的密度為至少500×10⁶個(gè)細(xì)胞/ml。在某些實(shí)施方案中，上皮細(xì)胞層的密度小于1×10⁵個(gè)細(xì)胞/ml。在某些實(shí)施方案中，上皮細(xì)胞層的密度小于2×10⁵個(gè)細(xì)胞/ml。在某些實(shí)施方案中，上皮細(xì)胞層的密度小于5×10⁵個(gè)細(xì)胞/ml。在某些實(shí)施方案中，上皮細(xì)胞層的密度小于1×10⁶個(gè)細(xì)胞/ml。在某些實(shí)施方案中，上皮細(xì)胞層的密度小于5×10⁶個(gè)細(xì)胞/ml。在某些實(shí)施方案中，上皮細(xì)胞層的密度小于10×10⁶個(gè)細(xì)胞/ml。在某些實(shí)施方案中，上皮組織層的活力大于99體積％的活細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，上皮組織層的活力大于95體積％活細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，上皮組織層的活力大于90體積％活細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，上皮組織層的活力大于80體積％活細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，上皮組織層的活力大于70體積％活細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，上皮組織層的活力大于60體積％活細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，上皮組織層的活力大于50體積％活細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，該活力在打印后保持至少8、12、24、48、72或96小時(shí)。在某些實(shí)施方案中，該活力在打印后保持至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天。

組織結(jié)構(gòu)的均勻性

使用本公開的方法生物打印的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是通過反映在相應(yīng)組織中的工藝獲得高度的均勻性。在某些實(shí)施方案中，腎小管模型的厚度基本上是均勻的。在某些實(shí)施方案中，大于99％的腎小管模型在腎小管模型的總體平均厚度的+/-10％內(nèi)。在某些實(shí)施方案中，大于95％的腎小管模型在腎小管模型的總體平均厚度的+/-10％內(nèi)。在某些實(shí)施方案中，大于90％的腎小管模型在腎小管模型的總體平均厚度的+/-10％內(nèi)。在某些實(shí)施方案中，大于80％的腎小管模型在腎小管模型的總體平均厚度的+/-10％內(nèi)。在某些實(shí)施方案中，大于70％的腎小管模型在腎小管模型的總體平均厚度的+/-10％內(nèi)。在某些實(shí)施方案中，大于99％的腎小管模型在腎小管模型的總體平均厚度的+/-20％內(nèi)。在某些實(shí)施方案中，大于95％的腎小管模型在腎小管模型的總體平均厚度的+/-20％內(nèi)。在某些實(shí)施方案中，大于90％的腎小管模型在腎小管模型的總體平均厚度的+/-20％內(nèi)。在某些實(shí)施方案中，大于80％的腎小管模型在腎小管模型的總體平均厚度的+/-20％內(nèi)。在某些實(shí)施方案中，大于70％的腎小管模型在腎小管模型的總體平均厚度的+/-20％內(nèi)。

生物墨和細(xì)胞層的非細(xì)胞組分

通常，生物打印的細(xì)胞或生物墨含有改善其對(duì)于生物打印的適用性的賦形劑或擠出化合物。擠出化合物的實(shí)例包括但不限于凝膠，水凝膠，肽水凝膠，基于氨基酸的凝膠，表面活性劑多元醇(例如，pluronicf-127或pf-127)，熱響應(yīng)性聚合物，透明質(zhì)酸鹽，藻酸鹽，細(xì)胞外基質(zhì)組分(及其衍生物)，膠原，明膠，其他生物相容性天然或合成聚合物，納米纖維，和自組裝納米纖維。在一些實(shí)施方案中，擠出化合物含有合成聚合物。在一些實(shí)施方案中，擠出化合物含有通常不與哺乳動(dòng)物組織結(jié)合的非合成聚合物，其通常與哺乳動(dòng)物組織不相關(guān)。在一些實(shí)施方案中，通過物理，化學(xué)或酶學(xué)手段在生物打印之后除去擠出化合物。在一些實(shí)施方案中，本公開的生物墨含有按重量計(jì)超過1％的擠出化合物。在一些實(shí)施方案中，本公開的腎小管模型包含按重量計(jì)超過1％的擠出化合物。在一些實(shí)施方案中，本公開的生物墨含有按重量計(jì)小于5％的擠出化合物。在一些實(shí)施方案中，本公開的生物墨含有按重量計(jì)小于2％的擠出化合物。在一些實(shí)施方案中，本公開的生物墨含有按重量計(jì)小于1％的擠出化合物。在一些實(shí)施方案中，本公開的腎小管模型包含按重量計(jì)小于5％的擠出化合物。在一些實(shí)施方案中，本公開的腎小管模型包含按重量計(jì)小于2％的擠出化合物。在一些實(shí)施方案中，本公開的腎小管模型包含按重量計(jì)小于1％的擠出化合物。在一些實(shí)施方案中，上皮生物墨不含水凝膠。在一些實(shí)施方案中，上皮生物墨不含擠出化合物。在一些實(shí)施方案中，上皮生物墨不含用作化合物中的賦形劑或擠出化合物(estrus)的合成聚合物。在一些實(shí)施方案中，腎小管模型不含用作賦形劑或擠出化合物的合成聚合物。在一些實(shí)施方案中，上皮細(xì)胞層不含用作賦形劑或擠出化合物的合成聚合物。在一些實(shí)施方案中，間質(zhì)細(xì)胞層不含用作賦形劑或擠出化合物的合成聚合物。

打印曲面

本文提供了連接到生物相容表面的腎小管模型。在某些實(shí)施方案中，將間質(zhì)組織層打印到生物相容性表面上。在某些實(shí)施方案中，生物相容性表面是孔徑大于0.4μm的膜。在某些實(shí)施方案中，生物相容性表面的孔徑為約1μm。在某些實(shí)施方案中，生物相容性表面涂覆有組合物以改善細(xì)胞粘附或活力。在某些實(shí)施方案中，將腎小管模塊(modules)打印到6孔、12孔、24孔、48孔，96孔或384孔板中。在某些實(shí)施方案中，將腎小管模塊打印到直徑為60、100或150mm或更大的組織培養(yǎng)板中。在某些實(shí)施方案中，將腎小管模塊打印到組織培養(yǎng)瓶中或微流體芯片上。在某些實(shí)施方案中，腎小管模塊打印到transwell插入物中/上。

腎小管模型的生產(chǎn)工藝

本公開支持用于制造腎小管模型的方法和工藝。在某些實(shí)施方案中，三維工程化生物學(xué)腎小管模型的產(chǎn)品通過生物打印的工藝產(chǎn)生。在某些實(shí)施方案中，三維工程化生物學(xué)腎小管模型的產(chǎn)品的至少一種成分通過生物打印的工藝產(chǎn)生。在某些實(shí)施方案中，三維工程化生物學(xué)腎小管模型的制造工藝包括：制備腎間質(zhì)生物墨，所述間質(zhì)生物墨包含多種間質(zhì)細(xì)胞類型，所述間質(zhì)細(xì)胞類型包含腎成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞；制備腎上皮生物墨，所述上皮生物墨包含腎小管上皮細(xì)胞；沉積所述腎間質(zhì)生物墨和所述腎上皮生物墨，使得所述腎上皮生物墨在所述腎間質(zhì)生物墨的層的至少一個(gè)表面上形成層；和使沉積的生物墨在細(xì)胞培養(yǎng)基中成熟以使細(xì)胞粘附來形成三維工程化生物學(xué)腎小管模型。在某些實(shí)施方案中，所述腎間質(zhì)組織生物墨形成具有頂端和基底外側(cè)表面的腎間質(zhì)組織層。在某些實(shí)施方案中，所述腎上皮生物墨與所述腎間質(zhì)組織層的頂端表面接觸沉積。在某些實(shí)施方案中，所述腎上皮生物墨基本上由腎小管上皮細(xì)胞組成。在某些實(shí)施方案中，所述腎上皮生物墨基本上由原代腎小管上皮細(xì)胞組成。在某些實(shí)施方案中，所述原代腎小管上皮細(xì)胞分離自患有影響腎功能的疾病的受試者。在某些實(shí)施方案中，所述原代腎小管上皮細(xì)胞分離自患有多囊性腎病的受試者。在某些實(shí)施方案中，所述原代腎小管上皮細(xì)胞分離自患有ii型糖尿病的受試者。在某些實(shí)施方案中，所述腎上皮生物墨包含腎細(xì)胞癌細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，所述腎上皮生物墨以單層沉積。在某些實(shí)施方案中，所述腎間質(zhì)組織生物墨以單層沉積。在某些實(shí)施方案中，所述腎上皮組織層與腎間質(zhì)組織層連續(xù)接觸沉積。在某些實(shí)施方案中，所述腎上皮生物墨形成覆蓋所述腎間質(zhì)組織層的頂端表面的50％以上的層。在某些實(shí)施方案中，所述腎上皮生物墨形成覆蓋所述腎間質(zhì)組織層的頂端表面的70％以上的層。在某些實(shí)施方案中，所述腎上皮生物墨形成覆蓋所述腎間質(zhì)組織層的頂端表面的90％以上的層。在某些實(shí)施方案中，腎上皮層的腎上皮細(xì)胞的至少50％與其它腎上皮細(xì)胞形成緊密連接。在某些實(shí)施方案中，腎上皮層的腎上皮細(xì)胞的至少70％與其它腎上皮細(xì)胞形成緊密連接。在某些實(shí)施方案中，腎上皮層的腎上皮細(xì)胞的至少90％與其它腎上皮細(xì)胞形成緊密連接。在某些實(shí)施方案中，所述腎小管模型的厚度在50和500μm之間。在某些實(shí)施方案中，所述腎小管模型為約100μm厚。在某些實(shí)施方案中，所述腎上皮生物墨還包含擠出化合物。在某些實(shí)施方案中，所述成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞以約95:5至約5:95的成纖維細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞之比存在于所述腎間質(zhì)生物墨中。在某些實(shí)施方案中，所述成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞以約75:25至約25:75的成纖維細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞之比存在于所述腎間質(zhì)生物墨中。在某些實(shí)施方案中，所述成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞以約60:40至約40:60的成纖維細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞之比存在于所述腎間質(zhì)生物墨中。在某些實(shí)施方案中，成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞以約50:50的成纖維細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞之比存在于所述腎間質(zhì)生物墨中。在某些實(shí)施方案中，所述腎間質(zhì)生物墨還包含分泌細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，所述腎間質(zhì)生物墨還包含免疫細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，所述腎間質(zhì)生物墨還包含擠出化合物。在某些實(shí)施方案中，所述腎間質(zhì)生物墨包含腎小球細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，所述模型基本上不含預(yù)先形成的支架。在某些實(shí)施方案中，所述腎成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，所述腎間質(zhì)生物墨或腎上皮生物墨中任一者在沉積后形成平面層。在某些實(shí)施方案中，所述腎小管模型具有均勻的厚度。在某些實(shí)施方案中，所述腎間質(zhì)生物墨沉積到生物相容性膜上。在某些實(shí)施方案中，所述腎間質(zhì)生物墨沉積到孔徑大于0.4μm的生物相容性膜上。在某些實(shí)施方案中，所述腎間質(zhì)生物墨沉積到孔徑為約1μm的生物相容性膜上。在某些實(shí)施方案中，所述三維工程化生物學(xué)腎小管模型沉積以形成陣列。在某些實(shí)施方案中，所述三維工程化生物學(xué)腎小管模型沉積以形成這樣的陣列，所述陣列被配置為允許每個(gè)腎小管模型之間的間隔在約20μm和約100μm之間。在某些實(shí)施方案中，所述腎間質(zhì)生物墨為至少30體積％的活細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，所述腎間質(zhì)生物墨為至少70體積％的活細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，所述腎間質(zhì)生物墨為至少90體積％的活細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，所述腎間質(zhì)生物墨通過擠出生物打印來沉積。在某些實(shí)施方案中，所述腎上皮生物墨通過噴墨生物打印來沉積。在某些實(shí)施方案中，所述腎小管模型的任何層在體外培養(yǎng)3天后的培養(yǎng)物中是具有活力的。在某些實(shí)施方案中，所述腎小管模型的任何層在體外培養(yǎng)10天后的培養(yǎng)物中是具有活力的。

在某些實(shí)施方案中，本文公開的3d腎小管模型通過附加制造工藝(additivemanufacturingprocess)生產(chǎn)。用于本文的3d腎小管模型的附加制造工藝允許定制制造用于體外目的的3d腎小管模型。其重要性在于組織是由于用戶指定的設(shè)計(jì)制造的。在某些實(shí)施方案中，3d腎小管模型僅包含用戶指定的細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，3d腎小管模型僅包含用戶指定的細(xì)胞類型。在某些實(shí)施方案中，3d腎小管模型僅包含用戶指定的細(xì)胞數(shù)量或細(xì)胞濃度。在某些實(shí)施方案中，3d腎小管模型包含在制造之前或期間用小分子、治療性分子或治療性物質(zhì)處理的細(xì)胞。治療性分子或物質(zhì)是旨在治療疾病或引發(fā)生物反應(yīng)的任何分子。在某些實(shí)施方案中，3d腎小管模型包含生物相容性或組織培養(yǎng)塑料、生物相容性合成聚合物、可交聯(lián)凝膠、可逆交聯(lián)凝膠和其它非細(xì)胞成分。

腎小管模型的成熟

在某些實(shí)施方案中，本公開的腎小管模型在生物打印后成熟一定量的時(shí)間。在某些實(shí)施方案中，模型在使用前成熟至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、16、18、24小時(shí)或更長(zhǎng)時(shí)間。在某些實(shí)施方案中，模型在使用前成熟至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、30天或更久。在一些實(shí)施方案中，組織的運(yùn)輸或轉(zhuǎn)運(yùn)是一種使用。在某些實(shí)施方案中，本公開的腎小管模型的間質(zhì)層在加入上皮層之前生物打印之后成熟一定量的時(shí)間。在某些實(shí)施方案中，間質(zhì)層在使用前成熟至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、16、18、24小時(shí)或更久。在某些實(shí)施方案中，間質(zhì)層在使用前成熟至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30天或更久。在一些實(shí)施方案中，組織的運(yùn)輸或轉(zhuǎn)運(yùn)是一種使用。在一些實(shí)施方案中，在間質(zhì)層的生物打印之后的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、16、18、24小時(shí)內(nèi)將上皮層生物打印到間質(zhì)層上。在一些實(shí)施方案中，組織的運(yùn)輸或轉(zhuǎn)運(yùn)是一種使用。在一些實(shí)施方案中，在間質(zhì)層的生物打印后的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30天內(nèi)將上皮層生物打印到間質(zhì)層上。

體外測(cè)定

在一些實(shí)施方案中，本文公開的腎小管和陣列用于體外測(cè)定。在一些實(shí)施方案中，“測(cè)定”是用于測(cè)試或測(cè)量有機(jī)或生物樣品(例如，細(xì)胞聚集體、組織、器官、生物體等)中物質(zhì)(例如化學(xué)品、分子、生物化學(xué)品、藥物等)的存在或活性的程序。在另外的實(shí)施方案中，測(cè)定包括定性測(cè)定和定量測(cè)定。還在另外的實(shí)施方案中，定量測(cè)定測(cè)量樣品中的物質(zhì)例如化學(xué)或生物分子的量。

在各種實(shí)施方案中，作為非限制性實(shí)例，腎小管和陣列用于基于圖像的測(cè)定、分泌蛋白質(zhì)的測(cè)量、標(biāo)志物的表達(dá)以及蛋白質(zhì)或mrna的產(chǎn)生。在各種其它實(shí)施方案中，腎小管和陣列用于測(cè)定以檢測(cè)或測(cè)量以下中的一種或多種：分子結(jié)合(包括放射性配體結(jié)合)，分子攝取，活性(例如酶活性和受體活性等)，基因表達(dá)，蛋白質(zhì)表達(dá)，蛋白質(zhì)修飾(非限制性實(shí)例包括：磷酸化，泛素化，乙酰化，糖基化，脂化等)，受體激動(dòng)作用，受體拮抗作用，細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)，凋亡，化學(xué)敏感性，轉(zhuǎn)染，細(xì)胞遷移，趨化性，細(xì)胞活力，細(xì)胞增殖，安全性，功效，代謝，毒性，感染性和濫用傾向。在各種實(shí)施方案中，腎小管用于毒理學(xué)、藥物或毒性測(cè)試。

在一些實(shí)施方案中，腎小管和陣列用于免疫測(cè)定。免疫測(cè)定包括例如流式細(xì)胞術(shù)，高通量或低通量圖像分析，免疫沉淀，放射免疫測(cè)定(ria)，酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(elisa)，蛋白質(zhì)印跡，同源測(cè)定，例如alphalisatm和依賴于時(shí)間分辨熒光或熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fret)的相關(guān)技術(shù)。在另外的實(shí)施方案中，免疫測(cè)定是競(jìng)爭(zhēng)性免疫測(cè)定或非競(jìng)爭(zhēng)性免疫測(cè)定。在競(jìng)爭(zhēng)性免疫測(cè)定中，例如，樣品中的抗原與標(biāo)記的抗原競(jìng)爭(zhēng)與抗體結(jié)合，然后測(cè)量與抗體位點(diǎn)結(jié)合的標(biāo)記抗原的量。在非競(jìng)爭(zhēng)性免疫測(cè)定(也稱為“夾心測(cè)定”)中，例如，樣品中的抗原與抗體位點(diǎn)結(jié)合；隨后，標(biāo)記的抗體與抗原結(jié)合，然后測(cè)量該位點(diǎn)上的標(biāo)記抗體的量。

在一些實(shí)施方案中，腎小管和陣列用于elisa。在另外的實(shí)施方案中，elisa是用于檢測(cè)樣品中抗體或抗原存在的生物化學(xué)技術(shù)。在elisa中，例如，使用至少一種對(duì)特定抗原具有特異性的抗體。作為進(jìn)一步的實(shí)例，將具有未知量抗原的樣品非特異性地(通過吸附到表面)或特異性地(通過由“夾心”elisa中另一種特異于該抗原的抗體捕獲)固定在固體支持物(例如，聚苯乙烯微量滴定板)上。還作為另一個(gè)實(shí)例，在抗原固定化之后，加入檢測(cè)抗體，與抗原形成復(fù)合物。檢測(cè)抗體例如與酶共價(jià)連接，或者本身由通過生物綴合與酶連接的第二抗體檢測(cè)。

例如，在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞、多細(xì)胞聚集體或組織的陣列、微陣列或芯片用于藥物篩選或藥物發(fā)現(xiàn)。在另外的實(shí)施方案中，組織的陣列、微陣列或芯片被用作用于藥物篩選或藥物發(fā)現(xiàn)的試劑盒的一部分。在一些實(shí)施方案中，每個(gè)腎小管存在于生物相容性多孔容器的孔內(nèi)，其中所述容器與一種或多種自動(dòng)化藥物篩選程序和/或裝置兼容。在另外的實(shí)施方案中，自動(dòng)化藥物篩選程序和/或裝置包括計(jì)算機(jī)或機(jī)器人輔助的任何合適的程序或裝置。

在另外的實(shí)施方案中，用于藥物篩選測(cè)定或藥物發(fā)現(xiàn)測(cè)定的陣列用于研究或開發(fā)潛在地在任何治療領(lǐng)域中有用的藥物。還在另外的實(shí)施方案中，作為非限制性實(shí)例，合適的治療領(lǐng)域包括感染性疾病，血液學(xué)，腫瘤學(xué)，兒科，心臟病學(xué)，中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，神經(jīng)病學(xué)，胃腸病學(xué)，肝臟病學(xué)，泌尿?qū)W，不育癥，眼科學(xué)，腎臟學(xué)，矯形外科學(xué)，疼痛控制，精神病學(xué)，肺學(xué)，疫苗，傷口愈合，生理學(xué)，藥理學(xué)，皮膚病學(xué)，基因治療，毒理學(xué)，毒性和免疫學(xué)。

在一些實(shí)施方案中，腎小管和陣列用于基于細(xì)胞的篩選。在另外的實(shí)施方案中，基于細(xì)胞的篩選用于一種或多種感染性疾病，例如病毒、真菌、細(xì)菌或寄生蟲感染。在另外的實(shí)施方案中，基于細(xì)胞的篩選用于腎癌，包括腎細(xì)胞癌，近腎小球細(xì)胞腫瘤(腎素瘤)，血管平滑肌脂肪瘤，腎大嗜酸粒細(xì)胞瘤，貝利尼導(dǎo)管癌，腎臟透明細(xì)胞肉瘤，中胚層腎瘤，威爾姆斯氏腫瘤，混合上皮間質(zhì)腫瘤和腎盂移行細(xì)胞癌。在另外的實(shí)施方案中，基于細(xì)胞的篩選是用于腎炎，包括腎小球性腎炎，間質(zhì)性腎炎或腎小管間質(zhì)性腎炎，腎盂腎炎，狼瘡性腎炎和運(yùn)動(dòng)性腎炎。在另外的實(shí)施方案中，基于細(xì)胞的篩選用于高血壓。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，基于細(xì)胞的篩選用于糖尿病，i型、ii型和mody。在另外的實(shí)施方案中，基于細(xì)胞的篩選用于腎病，包括iga腎病、鎮(zhèn)痛藥性腎病(analgesicnephropathy)或腫瘤腎病(onconephropathy)。在一些實(shí)施方案中，基于細(xì)胞的篩選用于多囊腎病或黃嘌呤氧化酶缺陷。在其他實(shí)施方案中，腎小管和陣列用于研究癌癥起始、進(jìn)展或轉(zhuǎn)移。在另外的實(shí)施方案中，腎小管和陣列用于研究其他細(xì)胞類型，例如癌細(xì)胞、病原體攜帶細(xì)胞、致病細(xì)胞、免疫細(xì)胞、血源細(xì)胞或干/祖細(xì)胞的相互作用。

在一些實(shí)施方案中，其構(gòu)建體或其陣列用于評(píng)估包括抗體、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、細(xì)菌、生物活性蛋白質(zhì)、激素等生物制品的性能。在其他實(shí)施方案中，腎小管或其陣列可用于研究包含構(gòu)建體和一種或多種另外的細(xì)胞類型的哺乳動(dòng)物腎小管之間的細(xì)胞-細(xì)胞和細(xì)胞-組織相互作用，所述另外的細(xì)胞類型包括但不限于病原體攜帶細(xì)胞、活的致病細(xì)胞、癌細(xì)胞、免疫細(xì)胞、血細(xì)胞、干/祖細(xì)胞或遺傳操縱細(xì)胞。

在一些實(shí)施方案中，陣列包括腎小管和另外的組織構(gòu)建體。在另外的實(shí)施方案中，腎小管構(gòu)建體與一個(gè)或多個(gè)表面上的另外的組織構(gòu)建體直接接觸。在另外的實(shí)施方案中，腎小管經(jīng)由流路或共同的儲(chǔ)液器連接到一個(gè)或多個(gè)另外的組織構(gòu)建體或細(xì)胞。還在另外的實(shí)施方案中，與工程化的腎小管構(gòu)建體接觸的液體培養(yǎng)基含有活的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，例如免疫細(xì)胞、血源細(xì)胞或腫瘤來源的細(xì)胞。在其它實(shí)施方案中，接觸腎小管的液體培養(yǎng)基含有細(xì)菌、真菌、病毒、寄生蟲或其它病原體。

本公開包括商業(yè)方法。在一些實(shí)施方案中，本文公開的技術(shù)和方法的速度和可擴(kuò)展性用于設(shè)計(jì)、構(gòu)建和操作用于生產(chǎn)用于移植或用于生成基于細(xì)胞的工具的腎小管和/或器官的工業(yè)和/或商業(yè)設(shè)施用于研究和開發(fā)，如體外測(cè)定。在另外的實(shí)施方案中，腎小管和/或其器官及其陣列生產(chǎn)、儲(chǔ)存、分布、銷售、廣告和出售為例如用于生物測(cè)定和高通量藥物篩選的細(xì)胞陣列(例如微陣列或芯片)、組織陣列(例如，微陣列或芯片)和試劑盒。在其它實(shí)施方案中，制備并利用工程化的腎小管和/或其器官和陣列進(jìn)行生物測(cè)定和/或藥物篩選作為服務(wù)。

驗(yàn)證

理想的工程腎組織完全是人和多細(xì)胞的，包括腎小管上皮細(xì)胞、腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞。此外，理想的工程化腎組織顯示出特定功能，包括但不限于cyp1a2、cyp2c9和cyp3a4活性，白蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)，和維生素d羥基化，γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶活性。此外，理想的工程化腎臟組織的特征在于緊密連接，鈣粘蛋白，轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白極性和cd31表達(dá)，并通過包括白蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)，cyp450活性，組織學(xué)和活力等特異性測(cè)定來驗(yàn)證。在一些實(shí)施方案中，本公開的腎小管模型與維持在培養(yǎng)物中長(zhǎng)于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多天的2d共培養(yǎng)物或組織外植體相比，顯示了特定功能增加。在一些實(shí)施方案中，本公開的腎小管模型與維持在培養(yǎng)物中長(zhǎng)于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多天的2d共培養(yǎng)物或組織外植體相比，顯示2倍增加的特定功能。在一些實(shí)施方案中，本公開的腎小管模型與維持在培養(yǎng)物中長(zhǎng)于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多天的2d共培養(yǎng)物或組織外植體相比，顯示5倍增加的特定功能。在一些實(shí)施方案中，本公開的腎小管模型與維持在培養(yǎng)物中長(zhǎng)于21天以上的2d共培養(yǎng)物或組織外植體相比，顯示出2倍以上增加的特定功能。在一些實(shí)施方案中，本公開的腎小管模型與維持在培養(yǎng)物中長(zhǎng)于27天以上的2d共培養(yǎng)物或組織外植體相比，顯示出5倍以上增加的特定功能。在一些實(shí)施方案中，本公開的腎小管模型與維持在培養(yǎng)物中長(zhǎng)于27天以上的培養(yǎng)物相比，顯示出2倍以上增加的特定功能。在一些實(shí)施方案中，本公開的腎小管模型與維持在培養(yǎng)物中長(zhǎng)于21天以上的2d共培養(yǎng)物或組織外植體相比，顯示出5倍以上增加的特定功能。在某些實(shí)施方案中，特定功能是γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶活性。在某些實(shí)施方案中，特定功能是維生素d羥基化。

在一些實(shí)施方案中，本文所述的工程化的組織具有與體內(nèi)人腎組織相關(guān)的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)和功能屬性，包括組織學(xué)特征和腎小管特異性功能，包括但不限于：

●腎小管上皮細(xì)胞的極化w/細(xì)胞內(nèi)緊密連接(e-cad，zo-1和密蛋白)的形成和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(頂端：oat4，urat1)和整合素(基底外側(cè))的正確的細(xì)胞內(nèi)定位。

●在小管細(xì)胞層和下面的間質(zhì)之間形成基底層。

●在間質(zhì)內(nèi)建立廣泛的微血管網(wǎng)絡(luò)，包括形成組織樣小管細(xì)胞：微血管空間關(guān)系。

●表達(dá)區(qū)室特異性標(biāo)志物，包括小管上皮轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(cubilin，megalin，水通道蛋白)，oat，urat)，血管標(biāo)志物(cd31，vwf)，證實(shí)epo蛋白產(chǎn)生(如適用)。

●通過25-(oh)1羥化酶(1ohase)的維生素d合成。

●生產(chǎn)血管緊張素ii。

●白蛋白從管狀腔經(jīng)由cubilin主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)。

●西咪替丁自基底外側(cè)表面的運(yùn)輸/積累。

●參與代謝的cyp450和ugt表達(dá)(例如分別為cyp2b6,3a5,4a11和ugt1a9,2b7)。

實(shí)施例

以下說明性示例是本文所述的軟件應(yīng)用、系統(tǒng)和方法的實(shí)施方案的代表，并不意味著以任何方式進(jìn)行限制。

實(shí)施例1-生物打印的三維腎小管細(xì)胞模型

將尺寸為3mm×3mm×0.75mm的3層杯形狀打印在12孔組織培養(yǎng)板中的transwell膜上(圖2a和2b)。底片和兩層化的壁由75％的成年腎成纖維細(xì)胞(arf)和25％的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(huvec)組成。在2.0中將細(xì)胞以1.5億細(xì)胞/ml重懸。在2％明膠(“結(jié)構(gòu)1”)中，以1-5百萬個(gè)細(xì)胞/ml的100％上皮細(xì)胞(mdck)的稀釋懸浮液填充杯子。緊接著生物打印后，將結(jié)構(gòu)用熔融的1.0包圍，然后在腎成纖維細(xì)胞培養(yǎng)基、huvec培養(yǎng)基和mdck培養(yǎng)基的混合物中培養(yǎng)。

通過組織學(xué)染色對(duì)細(xì)胞類型特異性標(biāo)志物進(jìn)行結(jié)構(gòu)1的評(píng)估。結(jié)構(gòu)1的代表性h&e染色如圖3a和3b所示。針對(duì)cd31410和te7420進(jìn)行構(gòu)建體染色，以分別評(píng)估huvec細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的相對(duì)位置(圖4)。兩種細(xì)胞類型分布在整個(gè)間質(zhì)層中，其表現(xiàn)出高細(xì)胞密度。在所有分析的構(gòu)建體中發(fā)現(xiàn)了cd31+細(xì)胞的粗網(wǎng)絡(luò)，其中一些區(qū)域可能表現(xiàn)出微血管形成的證據(jù)(圖4，430)。為了可視化上皮細(xì)胞，將組織用抗e-鈣粘蛋白的抗體(圖5，540)和te7(圖5，520)染色。上皮細(xì)胞集中在間質(zhì)層附近并形成小管樣結(jié)構(gòu)。該結(jié)構(gòu)具有與人類腎近端小管模型相關(guān)的許多有吸引力的特征，包括支持極化上皮細(xì)胞生長(zhǎng)和組織的血管化間質(zhì)層。

實(shí)施例2-生物打印的三維腎小管細(xì)胞模型

將尺寸為3mm×3mm×250μm的片材生物打印在12孔板中的transwell膜上。組織片由75％成年腎成纖維細(xì)胞和25％huvec組成，所述細(xì)胞在2.0中以1.5億個(gè)細(xì)胞/ml重懸。片材的邊緣由500μm厚的由3.0組成的生物打印的僅含水凝膠的壁界定。在緊接著生物打印之后，邊界壁用50mm氯化鈣交聯(lián)2分鐘。然后吸出該溶液，并用熔融的1.0.包圍構(gòu)建體。然后使用設(shè)置為100ms閥開時(shí)間的噴墨模塊(“結(jié)構(gòu)2”)通過沉積將上皮細(xì)胞(mdck或htert-rptec)的1百萬個(gè)細(xì)胞/ml的稀釋懸浮液加入到結(jié)構(gòu)的頂部表面。圖6a和6b中示出了結(jié)構(gòu)2的示意圖。噴墨模塊的使用允許在打印之后立即沉積上皮細(xì)胞，或者可以在沉積上皮細(xì)胞之前將間質(zhì)組織打印并成熟數(shù)天，促進(jìn)形成微血管和細(xì)胞外基質(zhì)，這可有助于支持上皮細(xì)胞的正確形態(tài)。

通過組織學(xué)染色細(xì)胞類型特異性標(biāo)志物進(jìn)行結(jié)構(gòu)2的評(píng)估。結(jié)構(gòu)2的代表性h&e染色示于圖7a和7b。組織表現(xiàn)出高細(xì)胞密度，并且可以觀察到上皮細(xì)胞薄層(圖7a和7b中的黑色箭頭)。令人驚奇的是，噴墨模塊促進(jìn)上皮細(xì)胞附著到間質(zhì)層的表面并導(dǎo)致組織表面上的細(xì)胞密度低得多，這是形成極化單層所必需的。噴墨噴涂后，細(xì)胞保留高活力：如通過臺(tái)盼藍(lán)排除法所測(cè)量的，mdck細(xì)胞大于97％，htert-rptec細(xì)胞大于94％。通過cd31染色810檢測(cè)到微血管組織的證據(jù)，并通過e-鈣粘蛋白染色840驗(yàn)證了上皮細(xì)胞的組織(圖8a和8b)。

實(shí)施例3-生物打印的三維腎小管細(xì)胞模型

為了減少間質(zhì)層的厚度和細(xì)胞性，細(xì)胞比例變?yōu)?0％成纖維細(xì)胞/50％huvec，細(xì)胞濃度為1.25×10⁸個(gè)細(xì)胞/ml。腎近端小管模型的間質(zhì)層由2.0中的腎成纖維細(xì)胞和huvec組成。在該實(shí)施例中產(chǎn)生的構(gòu)建體顯示出表現(xiàn)出極化特征的3d腎組織中的近端小管上皮細(xì)胞(rptec)。rptec之間的側(cè)膜上的e-鈣粘蛋白(亮染色和940)對(duì)應(yīng)于緊密連接(圖9a，b和c)。此外，對(duì)應(yīng)于間質(zhì)層的基底膜產(chǎn)生膠原蛋白(圖9a和b；920)。顯示h&e染色(圖10a)，并標(biāo)識(shí)刷狀緣(圖11a，箭頭)。三色染色表明膠原分泌(圖10b和11b，箭頭)，cd31(圖12，亮染色)染色顯示huvec網(wǎng)絡(luò)的存在(圖12，星號(hào))。生物打印組織顯示了在培養(yǎng)中隨時(shí)間增加的γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(ggt)活性，其指示功能上皮層(圖13)。為了評(píng)估3d生物打印小管模型的上皮組分的成熟度和功能，將組織勻漿并測(cè)定γ谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(ggt)活性。ggt是上皮細(xì)胞的頂端表面上表達(dá)的酶，參與谷胱甘肽穩(wěn)態(tài)和異生物質(zhì)代謝。作為陽性對(duì)照，評(píng)估在2d中作為單層培養(yǎng)的htert-rptec細(xì)胞。作為陰性對(duì)照，還測(cè)定了沒有上皮的生物打印腎間質(zhì)組織，以驗(yàn)證檢測(cè)到的ggt活性是上皮特異性的。在培養(yǎng)第3、10、14、21或28天時(shí)，將2dhtert-rptec、3d間質(zhì)組織或3d生物打印的小管組織勻漿并使用可從sigma-aldrich獲得的比色測(cè)定法評(píng)估功能性ggt酶活性。生物打印的小管組織從培養(yǎng)第10-28天顯示出穩(wěn)定的ggt活性，在生物打印的僅間質(zhì)性組織中檢測(cè)到可忽略的ggt活性。2dhtert-rptec單層培養(yǎng)物顯示出與3d生物打印小管組織中觀察到的相對(duì)相當(dāng)?shù)膅gt活性，但2d單層在第21天顯示出降低的功能，并且在第28天不可存活。

實(shí)施例4-以不同比例的腎成纖維細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞生物打印的三維腎小管模型

進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以確定成纖維細(xì)胞對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞比例對(duì)組織形態(tài)的影響。使用以90:10；75:25；和50:50(成纖維細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞)的比例包含腎成纖維細(xì)胞和huvec細(xì)胞的生物墨生物打印腎小管模型。圖14和15顯示了該實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。圖14顯示了打印的腎小管模型的宏觀視圖；而圖15顯示了用masson三色染色的相應(yīng)組織學(xué)。在打印后6天，包含50:50比例的腎小管模型基本上是平面或平坦的(圖14c和15c)。以90:10(圖14a和15a)和72:25(圖14b和15b)打印的腎小管模型在打印后6天表現(xiàn)出卷曲。

實(shí)施例5-三維腎小管模型的均勻厚度

進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以確定腎小管模型的厚度的均勻性和表面拓?fù)?。將腎小管模型生物打印到12孔板的孔中(圖16a)，并使用keyence技術(shù)進(jìn)行分析(圖16b)。將生物打印的腎小管模型培養(yǎng)14天，并使用keyencevhx-700數(shù)字顯微鏡分析其表面積和厚度。novogel3.0邊緣內(nèi)的區(qū)域(見實(shí)施例3)估計(jì)為0.068cm²?？缭竭吘墐?nèi)的組織，發(fā)現(xiàn)平均厚度約為106.8um，厚度相對(duì)均勻度如示出的熱圖所示(極薄區(qū)域?yàn)?650)。將組織用甲基藍(lán)染色以增加顏色對(duì)比度并且促進(jìn)組織表面的映射。兩個(gè)不連續(xù)的區(qū)域處于熱圖1650的藍(lán)色范圍內(nèi)，表明這些區(qū)域?yàn)榉浅１〉摹鞍枷?dimple)”，大約為20μm厚。該構(gòu)建體平均100μm厚。依據(jù)小凹陷，數(shù)據(jù)顯示出高度均勻、平坦和平滑的表面形態(tài)。

實(shí)施例6-用不同濃度的原代腎上皮細(xì)胞制備的三維腎小管模型

將包含50:50比例的成纖維細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的間質(zhì)層生物打印到24孔板的每個(gè)孔中。在存在(圖17b，c和d)或不存在(圖17a)含有2％fbs的培養(yǎng)基的情況下，將構(gòu)建體與1.25×10⁵(圖17a和b)、2.5×10⁵(圖17c)或5.0×10⁵(圖17d)個(gè)rptec細(xì)胞一起孵育。組織學(xué)在第11天進(jìn)行并h&e染色。

實(shí)施例7-使用腎小管模型的毒性測(cè)定

為了確定腎小管模型在體外毒性測(cè)定中的適用性，使用常見的細(xì)胞毒性劑兩性霉素b、順鉑和tgfβ進(jìn)行實(shí)驗(yàn)(圖18-圖23)。根據(jù)前述實(shí)施例的方法打印腎小管模型。

圖18顯示了通過alamarblue測(cè)定在包含間質(zhì)組織和上皮組織層的生物打印的3d腎小管模型中(圓圈)、htertrptec的標(biāo)準(zhǔn)2d共培養(yǎng)物(正方形)中；和單獨(dú)的間質(zhì)組織(三角形)中的兩性霉素b(ampb)毒性。單獨(dú)的間質(zhì)組織對(duì)ampb處理具有抗性，而3d腎小管模型顯示劑量依賴性細(xì)胞毒性。

3d腎小管模型顯示ampb對(duì)上皮細(xì)胞功能的劑量抑制。圖19a顯示作為來自用不同濃度的ampb處理的3d腎小管模型的細(xì)胞毒性指標(biāo)的乳酸脫氫酶(ldh)釋放的時(shí)間過程。低劑量的ampb導(dǎo)致在第3天ldh釋放升高，而高劑量導(dǎo)致在第1天釋放高水平的ampb。圖19b顯示響應(yīng)于ampb處理的ggt活性的劑量依賴性降低。圖20描繪了來自圖19b的3d腎小管模型的組織學(xué)，其示出與未處理的對(duì)照相比(圖20a)，10μm(圖20b)和50μm(圖20c)的ampb的上皮特異性細(xì)胞死亡。

3d腎小管模型顯示順鉑對(duì)上皮細(xì)胞功能的劑量依賴性抑制。圖21a顯示通過alamarblue測(cè)定在3d腎管模型中增加的細(xì)胞毒性。圖21b顯示ggt活性的劑量依賴性降低。圖21c顯示在第3天用50μm順鉑處理的腎小管模型和在第5天用10μm順鉑處理的腎小管模型的ldh釋放增加。圖22顯示用載體(圖22a)、10μm順鉑(圖22b)、50μm順鉑(圖22c)和50ng/mltgfp(圖22d)處理的腎小管模型的masson三色染色。特別是，用tgfp處理顯示纖維化增加而沒有順鉑處理組織的明顯細(xì)胞死亡。

圖23顯示了匯集自比較包含原代細(xì)胞(070615-rptec)的上皮層與包含永生化細(xì)胞系(htert-rptec)的上皮層的作用的實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)。通過alamarblue測(cè)定(圖23a)、ggt活性(圖23b)和ldh釋放(圖23c)，兩種類型的細(xì)胞表現(xiàn)出用順鉑處理后的毒性劑量依賴性增加。值得注意的是，原代細(xì)胞在ggt測(cè)定中顯示對(duì)順鉑的敏感性增加。

實(shí)施例8-打印表面對(duì)組織形態(tài)的影響

實(shí)施例8描述了僅用水凝膠邊緣novogel3.0生成的生物打印小管組織；當(dāng)使用0.4μm孔徑的transwell插入物作為培養(yǎng)表面時(shí)，需要該邊緣或novogel1.0塹(moat)以促進(jìn)組織附著到transwell膜。在不同的表面上制備50:50腎成纖維細(xì)胞比huvec的小管模型的生物打印腎間質(zhì)部分，并評(píng)估其與transwell膜的附著。圖24a顯示生物打印組織在沒有邊緣或塹的情況下在培養(yǎng)3天后漂浮。為了評(píng)估完整的屏障和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白功能，需要覆蓋整個(gè)培養(yǎng)物表面的組織。為了促進(jìn)生物打印的小管組織的附著和長(zhǎng)出(outgrowth)并且改善生物打印小管模型的表面積覆蓋率，期望使用在沒有邊緣或塹的情況下激勵(lì)組織附著的培養(yǎng)表面。如圖24b所示，優(yōu)選實(shí)施方案的生物打印腎間質(zhì)組織(50:50腎成纖維細(xì)胞比huvec)在沒有任何塹或水凝膠邊緣的情況下在1μm孔徑的膜上附著和鋪展。

實(shí)施例9-培養(yǎng)中腎小管模型的長(zhǎng)期活力

本公開的3d腎小管模型的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是在培養(yǎng)中是持續(xù)存活的。在許多情況下，活力比正常的2d培養(yǎng)物或組織外植體的活力持續(xù)長(zhǎng)得多的時(shí)間。圖25顯示在培養(yǎng)6天(圖25a)、10天(圖25b)和27天(圖25c)的3d腎小管模型。

雖然本文已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，但是對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，這些實(shí)施方案僅以示例的方式提供。在不脫離本發(fā)明的情況下，本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)想到許多變化、更改和替換。應(yīng)當(dāng)理解的是，本文所述的本發(fā)明的實(shí)施方案的各種替代方案可用于實(shí)施本發(fā)明。