本發(fā)明涉及一種陽離子脂質(zhì)的制造方法。

背景技術(shù)：

核酸藥物作為新一代藥物而引人注目，但是為了將核酸有效地引入細(xì)胞，需要載體。載體粗略地分為病毒載體和非病毒載體。相比非病毒載體，病毒載體具有高核酸引入率，但是不能解決毒性的問題。因此，非病毒載體雖然引入率低于病毒載體，但由于其高安全性而引人注意。

作為非病毒載體，已經(jīng)報(bào)道了使用由陽離子脂質(zhì)、peg脂質(zhì)等構(gòu)成的脂質(zhì)膜的載體和使用由陽離子聚合物構(gòu)成的膠束的載體，并且已經(jīng)積極地進(jìn)行了對使用能夠通過脂質(zhì)的組成來控制功能的脂質(zhì)膜的載體的研究。在脂質(zhì)膜中使用的脂質(zhì)中，最影響核酸引入率的脂質(zhì)是陽離子脂質(zhì)。

陽離子脂質(zhì)通常具有一個(gè)季銨基和兩個(gè)疏水基團(tuán)。典型的陽離子脂質(zhì)包括n-[1-(2,3-二油酰氧基)丙基]-n,n,n-三甲基氯化銨(n-[1-(2,3-dioleoyloxy)propyl]-n,n,n-trimethylammoniumchloride)(以下稱為dotap-cl)和n-[1-(2,3-二油基氧基)丙基]-n,n,n-三甲基氯化銨(n-[1-(2,3-dioleyloxy)propyl]-n,n,n-trimethylammoniumchloride)(以下稱為dotma-cl)。這些脂質(zhì)由于相比于其他已知的陽離子脂質(zhì)具有高核酸引入率，是最廣泛地使用的陽離子脂質(zhì)。

通過將油?；蛘哂突攵装坊疾⑶译S后利用氯甲烷進(jìn)行季銨化反應(yīng)(quaternization)而獲得dotap-cl和dotma-cl(非專利文獻(xiàn)1)。然而，由于氯甲烷在常溫常壓下是氣體，因此其必須使用高壓反應(yīng)容器，例如高壓釜。此外，由于氯甲烷是劇毒性的，所以存在在處理其和使用裝置時(shí)需要特別注意安全性的缺陷。

為了上述理由，已經(jīng)研發(fā)并報(bào)道了不使用氯甲烷的dotap-cl或者dotma-cl的制造方法。在非專利文獻(xiàn)2中，將油?；攵装坊?，通過使用碘甲烷合成n-[1-(2,3-二油酰氧基)丙基]-n,n,n-三甲基碘化銨(以下稱為dotap-i)，并且隨后通過裝有離子交換樹脂的色譜柱使用氯離子置換dotap-i的碘離子。

然而，非專利文獻(xiàn)2描述的方法對于獲得的脂質(zhì)需要大量的離子交換樹脂。另外，為了執(zhí)行有效的陰離子交換，由于溶液中dotap-i的濃度必須稀釋，所以需要將dotap-i溶解在大量溶劑中，使得生產(chǎn)規(guī)模非常大。此外，由于在離子交換柱中的陰離子交換后必須移除大量溶劑，所以該方法效率低并且工業(yè)上不優(yōu)選。

因此，在專利文獻(xiàn)1中，通過重復(fù)四次將1n鹽酸的甲醇溶液加入n-[1-(2,3-二亞油酰氧基)丙基]-n,n,n-三甲基碘化銨或者n-[1-(2,3-二亞油基氧基)丙基]-n,n,n-三甲基碘化銨的二氯甲烷溶液，攪拌并用氯化鈉溶液洗滌的操作而進(jìn)行陰離子交換。然而，該方法不僅具有低的陰離子交換率，并且由于在如dotap-cl的分子中具有酯鍵的情況下，由于與酸水解產(chǎn)生例如脂肪酸的雜質(zhì)，所以，為了獲得具有藥用所需的純度的產(chǎn)物，還需要效率低的純化步驟，例如，柱純化。

現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)

非專利文獻(xiàn)

非專利文獻(xiàn)1：biochem.，84，7413(1987)

非專利文獻(xiàn)2：biochim.biophys.acta，1299，281(1998)

專利文獻(xiàn)

專利文獻(xiàn)1：jp-a-2014-132014

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的問題

如上所述，如今已經(jīng)報(bào)道的陽離子脂質(zhì)的制造方法是需要特殊生產(chǎn)設(shè)備的制造方法或者包括離子交換柱的效率極低的制造方法，并且尚未建立高純度陽離子脂質(zhì)的高效工業(yè)制造方法。

本發(fā)明的目的是提供一種陽離子脂質(zhì)的工業(yè)制造方法，其不需要特殊的設(shè)備，并且通過該方法能夠有效率地獲得高純度的陽離子脂質(zhì)。

解決問題的手段

在常見的平衡反應(yīng)中，平衡能夠通過將產(chǎn)物從反應(yīng)系統(tǒng)中排出而向一個(gè)方向傾斜。例如，在用于從各種鹵代烷獲得烷基碘化物的芬克爾斯坦(finkelstein)反應(yīng)中，反應(yīng)由于副產(chǎn)物鈉鹽的析出而進(jìn)行。

因此，作為針對陰離子交換是平衡反應(yīng)的事實(shí)的集中研究的結(jié)果，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，當(dāng)式(1)表示的陽離子脂質(zhì)與具有任意陰離子的四烷基銨鹽在有機(jī)溶劑中反應(yīng)時(shí)，通過陰離子交換形成的四烷基碘化銨析出使得反應(yīng)有效率地進(jìn)行，并且其后通過過濾去除四烷基碘化銨并且濃縮濾液以增加陰離子交換率，從而完成本發(fā)明。

根據(jù)本發(fā)明的一種陽離子脂質(zhì)的制造方法的特征在于，式(1)表示的陽離子脂質(zhì)與具有x^-的四烷基銨鹽在有機(jī)溶劑中混合，并且在通過過濾分離析出的四烷基碘化銨后，濃縮濾液以至少析出四烷基碘化銨，從而獲得式(2)表示的陽離子脂質(zhì)：

其中，在式(1)中，r¹、r²、和r³各自表示具有1～6個(gè)碳原子的烴基，并且r⁴和r⁵各自表示具有10～22個(gè)碳原子的?；蛘呔哂?0～22個(gè)碳原子的烴基；

其中，在式(2)中，r¹、r²、和r³各自表示具有1～6個(gè)碳原子的烴基，r⁴和r⁵各自表示具有10～22個(gè)碳原子的?；蛘呔哂?0～22個(gè)碳原子的烴基，并且x^-表示氯離子、溴離子、氟離子、醋酸根離子、甲基磺酸根離子、或者對甲苯磺酸根離子。

本發(fā)明的效果

因?yàn)槟軌蛴行实孬@得高純度陽離子脂質(zhì)而不需要特殊設(shè)備，本發(fā)明作為陽離子脂質(zhì)的工業(yè)制造方法是非常有用的。

附圖說明

圖1示出實(shí)施例1獲得的dotap-cl的滴定結(jié)果。

圖2示出實(shí)施例2獲得的dotma-cl的滴定結(jié)果。

圖3示出比較例1獲得的dotap-cl的滴定結(jié)果。

具體實(shí)施方式

式(1)或者式(2)中的r¹至r³各自代表具有1～6個(gè)碳原子的烴基。r¹至r³中的每個(gè)可以是直鏈的、分支的或環(huán)狀的，或者r¹和r²可以相互成鍵以形成環(huán)。r¹至r³可以是相互相同或不同的。烴基中碳原子的數(shù)量優(yōu)選為1～3，并且更優(yōu)選為1。

構(gòu)成r¹至r³中的每個(gè)的具有1～6個(gè)碳原子的烴基包括，例如，甲基、乙基、丙基、異丙基、正丁基、仲丁基、異丁基、叔丁基、戊基、異戊基、新戊基、叔戊基、1,2-二甲基丙基、2-甲基丁基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、2,2-二甲基丁基、2,3-二甲基丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基和苯基。在r¹和r²相互成鍵以形成環(huán)的情況下，示例了四亞甲基、五亞甲基等。r¹至r³中的每個(gè)優(yōu)選為甲基、乙基、丙基或者異丙基，并且更優(yōu)選為甲基。

式(1)或者式(2)中的r⁴和r⁵各自表示具有10～22個(gè)碳原子的?；蛘呔哂?0～22個(gè)碳原子的烴基，可以是直鏈的或者分支的，可以是飽和或者不飽和的，并且可以是相互相同或不同的。?；蛘邿N基中碳原子的數(shù)量優(yōu)選地為14以上，優(yōu)選為18以下，并且更優(yōu)選為18。

構(gòu)成r⁴至r⁵中的每個(gè)的具有10～22個(gè)碳原子的酰基包括，例如，癸酰基、十一烷酰基、十二烷?；?、十三烷?；?、十四烷酰基、十五烷?；⑹轷；?、十七烷酰基、十八烷?；?、十九烷?；?、二十烷?；?、二十一烷?；?、二十二烷?；?、癸烯?；?、十一碳烯?；?、十二碳烯酰基、十三碳烯?；?、十四碳烯酰基、十五碳烯酰基、十六碳烯?；⑹咛枷；?、十八碳烯酰基、十九碳烯?；?、二十碳烯?；?、二十一碳烯酰基、二十二碳烯酰基、癸二烯酰基、十一碳二烯?；?、十二碳二烯?；?、十三碳二烯酰基、十四碳二烯酰基、十五碳二烯?；⑹级；⑹咛级；⑹颂级；⑹盘级；?、二十碳二烯?；?、二十一碳二烯?；⒍级；?、十八碳三烯?；?、二十碳三烯?；⒍妓南；?、二十碳五烯?；⒍剂；?、異硬酯醇基和四甲基十六碳烯基(葉綠醇?xì)埢?，并且優(yōu)選地為十四烷?；⑹奶枷；⑹轷；?、十六碳烯?；?、十八烷酰基、十八碳烯酰基或者十八碳二烯?；⑶腋鼉?yōu)選為十八烷?；?、十八碳烯?；蛘呤颂级；?。

構(gòu)成r⁴至r⁵中每個(gè)的具有10～22個(gè)碳原子的烴基包括，例如，癸基、十一烷基、十二烷基、十三烷基、十四烷基、十五烷基、十六烷基、十七烷基、十八烷基、十九烷基、二十烷基、二十一烷基、二十二烷基、癸烯基、十一碳烯基、十二碳烯基、十三碳烯基、十四碳烯基、十五碳烯基、十六碳烯基、十七碳烯基、十八碳烯基、十九碳烯基、二十碳烯基、二十一碳烯基、二十二碳烯基、癸二烯基、十一碳二烯基、十二碳二烯基、十三碳二烯基、十四碳二烯基、十五碳二烯基、十六碳二烯基、十七碳二烯基、十八碳二烯基、十九碳二烯基、二十碳二烯基、二十一碳二烯基、二十二碳二烯基、十八碳三烯基、二十碳三烯基、二十碳四烯基、二十碳五烯基、二十二碳六烯基、異硬酯醇基和四甲基十六碳烯基(葉綠醇?xì)埢?，并且優(yōu)選為十四烷基、十四碳烯基、十六烷基、十六碳烯基、十八烷基、十八碳烯基或者十八碳二烯基，并且更優(yōu)選為十八烷基、十八碳烯基或者十八碳二烯基。

式(2)中的x^-表示除碘離子以外的鹵離子、羧酸根離子或者有機(jī)磺酸根離子。x^-具體地包括氯離子、溴離子、氟離子、醋酸根離子、甲基磺酸根離子和對甲苯磺酸根離子，并且優(yōu)選為氯離子或者甲基磺酸根離子，并且更優(yōu)選為氯離子。

通過在有機(jī)溶劑中混合式(1)表示的陽離子脂質(zhì)和具有x^-的四烷基銨鹽以進(jìn)行陰離子交換而獲得式(2)表示的陽離子脂質(zhì)。陰離子交換是平衡反應(yīng)，并且通過析出幾乎不溶的陰離子交換副產(chǎn)物四烷基碘化銨，該系統(tǒng)的平衡向產(chǎn)生式(2)表示的陽離子脂質(zhì)的一側(cè)傾斜。具有x^-的四烷基銨鹽的x^-與式(2)表示的陽離子脂質(zhì)的x^-相同。

關(guān)于本發(fā)明的制造方法的陰離子交換步驟中使用的具有x^-的四烷基銨鹽，當(dāng)成鍵的烷基的碳原子數(shù)量太大時(shí)，副產(chǎn)物四烷基碘化銨容易溶解在反應(yīng)中使用的有機(jī)溶劑中，并且平衡幾乎不傾斜，使得式(2)表示的陽離子脂質(zhì)的產(chǎn)量減小。因此，四烷基銨鹽的烷基的碳原子數(shù)量為1～4，優(yōu)選為1～2，并且更優(yōu)選為1。

具有x^-的四烷基銨鹽包括，例如，四甲基氯化銨、四甲基溴化銨、四甲基氟化銨、四甲基醋酸銨、四甲基甲磺酸銨、四甲基對甲苯磺酸銨、四乙基氯化銨、四乙基溴化銨、四乙基氟化銨、四乙基醋酸銨、四乙基甲磺酸銨、四乙基對甲苯磺酸銨、四丙基氯化銨、四丙基溴化銨、四丙基氟化銨、四丙基醋酸銨、四丙基甲磺酸銨、四丙基對甲苯磺酸銨、四丁基氯化銨、四丁基溴化銨、四丁基氟化銨、四丁基醋酸銨、四丁基甲磺酸銨和四丁基對甲苯磺酸銨，并且優(yōu)選為四甲基氯化銨、四甲基溴化銨、四甲基氟化銨、四甲基醋酸銨、四甲基甲磺酸銨、四甲基對甲苯磺酸銨、四乙基氯化銨、四乙基溴化銨、四乙基氟化銨、四乙基醋酸銨、四乙基甲磺酸銨或者四乙基對甲苯磺酸銨，并且更優(yōu)選為四甲基氯化銨、四甲基溴化銨、四甲基氟化銨、四甲基甲磺酸銨或者四甲基對甲苯磺酸銨。

關(guān)于具有x^-的四烷基銨鹽的用量，當(dāng)其太小時(shí)，式(2)表示的陽離子脂質(zhì)的收率降低。當(dāng)其太大時(shí)，用于溶解具有x^-的四烷基銨鹽的溶劑的量增加，由于生產(chǎn)率降低從而其是不優(yōu)選的。因此，具有x^-的四烷基銨鹽的用量優(yōu)選為相對于式(1)表示的陽離子脂質(zhì)的1.5～10.0當(dāng)量，更優(yōu)選為2.0～5.0當(dāng)量。

出于提高式(1)表示的陽離子脂質(zhì)和四烷基銨鹽的離子的離解度的目的，本發(fā)明的制造方法的陰離子交換步驟中使用的有機(jī)溶劑優(yōu)選為質(zhì)子極性溶劑。具體地，低級(jí)醇，例如，甲醇、乙醇、正丙醇、異丙醇、正丁醇、仲丁醇、異丁醇或者叔丁醇是優(yōu)選的，并且乙醇是更優(yōu)選的。

關(guān)于本發(fā)明的制造方法的陰離子交換步驟中使用的有機(jī)溶劑的用量，當(dāng)其太小時(shí)，攪拌困難，并且當(dāng)其太大時(shí)，由于生產(chǎn)率降低而不優(yōu)選。具體地，有機(jī)溶劑的用量優(yōu)選為相對于式(1)表示的陽離子脂質(zhì)的5～30倍重量，更優(yōu)選為10～20倍重量。

本發(fā)明的制造方法的反應(yīng)溫度不特別限定，只要其為式(1)表示的陽離子脂質(zhì)和具有x^-的四烷基銨鹽能夠在有機(jī)溶劑溶解的溫度即可，并且其通常為0～120℃，并且優(yōu)選為10～60℃。

根據(jù)本發(fā)明的制造方法，在使式(1)表示的陽離子脂質(zhì)與具有x^-的四烷基銨鹽在有機(jī)溶劑中反應(yīng)之后，析出的四烷基碘化銨通過過濾分離，并且通過蒸發(fā)器濃縮濾液，以析出溶解在濾液中的四烷基碘化銨，從而使平衡向產(chǎn)生式(2)表示的陽離子脂質(zhì)的系統(tǒng)傾斜，使得式(1)表示的陽離子脂質(zhì)的殘余量能夠進(jìn)一步減少。當(dāng)濾液的濃度不足并且濃縮物中殘留大量溶劑時(shí)，式(1)表示的陽離子脂質(zhì)殘留并且式(2)表示的陽離子脂質(zhì)的純度降低。因此，濃縮物的重量優(yōu)選為式(1)表示的陽離子脂質(zhì)的投料量的2倍重量以下，更優(yōu)選為1.6倍重量以下。

除了式(2)表示的陽離子脂質(zhì)以外，濾液的濃縮物包含過量使用的具有x^-的四烷基銨鹽。為了除去具有x^-的四烷基銨鹽，濃縮物在難以溶解具有x^-的四烷基銨鹽的非質(zhì)子溶劑中分散，并且通過過濾分離不溶物。通過過濾分離的不溶物包含具有x^-的四烷基銨鹽和四烷基碘化銨。然后，對濾液進(jìn)行脫溶劑從而能夠容易地獲得高純度的式(2)表示的陽離子脂質(zhì)。能夠使用的非質(zhì)子溶劑包括，例如，丙酮、乙腈、甲基叔丁基酯、乙酸乙酯、氯仿和己烷，并且優(yōu)選為丙酮或者乙酸乙酯。

關(guān)于非質(zhì)子溶劑的用量，當(dāng)其太小時(shí)，攪拌困難，并且當(dāng)其太大時(shí)，由于生產(chǎn)率降低而不優(yōu)選。具體地，非質(zhì)子溶劑的用量優(yōu)選為相對于式(1)表示的陽離子脂質(zhì)5～30倍重量，更優(yōu)選為10～20倍重量。

通過式(3)表示的化合物和烷基碘化物的季銨化反應(yīng)獲得式(1)表示的陽離子脂質(zhì)。

在式(3)中，r¹、r²、r⁴和r⁵各自具有與式(1)或者式(2)中限定的相同的含義。

關(guān)于烷基碘化物的用量，當(dāng)其太小時(shí)，反應(yīng)不完全，并且當(dāng)其太大時(shí)，由于生產(chǎn)率降低而不優(yōu)選。因此，烷基碘化物的用量優(yōu)選為相對于式(3)表示的化合物的1.1～3.0當(dāng)量，更優(yōu)選為1.2～2.0當(dāng)量。

在季銨化反應(yīng)中，能夠使用溶劑。使用的溶劑不特別限定，只要其溶解式(3)表示的化合物和烷基碘化物并且不抑制所述反應(yīng)即可。

關(guān)于季銨化反應(yīng)中溶劑的用量，當(dāng)其太小時(shí)，攪拌困難，并且當(dāng)其太大時(shí)，由于生產(chǎn)率降低而不優(yōu)選。因此，溶劑的用量優(yōu)選為相對于式(3)表示的化合物的5～30倍重量，更優(yōu)選為8～20倍重量。

關(guān)于季銨化反應(yīng)的反應(yīng)溫度，當(dāng)其太低時(shí)，反應(yīng)無法進(jìn)行，并且當(dāng)其太高時(shí)，由于發(fā)生副反應(yīng)并且期望產(chǎn)物的產(chǎn)量降低而不優(yōu)選。因此，季銨化反應(yīng)的反應(yīng)溫度優(yōu)選為0～100℃，并且更優(yōu)選為20～70℃。

通過3-(二烷氨基)-1,2-丙二醇與脂肪酸的酯化或者3-(二烷氨基)-1,2-丙二醇與具有離去基團(tuán)的烴的醚化而獲得式(3)表示的化合物。3-(二烷氨基)-1,2-丙二醇可以適當(dāng)?shù)睾铣苫蛘呖梢允褂每缮藤彽幕衔?。可商?-(二烷氨基)-1,2-丙二醇包括，例如，3-(二甲氨基)-1,2-丙二醇、3-(二乙氨基)-1,2-丙二醇、3-(二丁氨基)-1,2-丙二醇、3-吡咯烷基-1,2-丙二醇、3-哌啶基-1,2-丙二醇和3-(二戊氨基)-1,2-丙二醇，并且優(yōu)選為3-(二甲氨基)-1,2-丙二醇、3-(二乙氨基)-1,2-丙二醇或3-(二丁氨基)-1,2-丙二醇，并且更優(yōu)選為3-(二甲氨基)-1,2-丙二醇。

關(guān)于酯化中使用的脂肪酸的量，當(dāng)其太大時(shí)，脂肪酸殘留導(dǎo)致期望產(chǎn)物的純度降低。當(dāng)其太小時(shí)，反應(yīng)在單酯體階段停止導(dǎo)致期望產(chǎn)物的純度降低。因此，脂肪酸的用量優(yōu)選為相對于3(二烷氨基)-1,2-丙二醇的1.9～2.5當(dāng)量，更優(yōu)選為2.0～2.4當(dāng)量。

在酯化中，可以使用縮合劑。關(guān)于縮合劑，能夠使用碳二亞胺縮合劑、脲陽離子縮合劑、鏻離子縮合劑等，并且從高反應(yīng)性和高可用性的角度，碳二亞胺縮合劑是優(yōu)選的。碳二亞胺縮合劑包括，例如，n,n’-二環(huán)己基碳二亞胺、n,n’-二異丙基碳二亞胺和1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽，并且從反應(yīng)后移除的簡易性的角度，1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽是優(yōu)選的。

關(guān)于酯化中使用的縮合劑的量，當(dāng)其太大時(shí)，作為中間產(chǎn)物的酸酐的形成受阻。當(dāng)其太小時(shí)，原材料殘留并且產(chǎn)量減少。因此，縮合劑的用量優(yōu)選為相對于3-(二烷氨基)-1,2-丙二醇的2.0～3.0當(dāng)量，更優(yōu)選為2.2～2.6當(dāng)量。

關(guān)于酯化中使用的溶劑，從提高反應(yīng)效率和抑制副產(chǎn)物的形成的角度，具有高原材料可溶性的溶劑是優(yōu)選的。此外，在使用1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽作為縮合劑的情況下，由于作為副產(chǎn)物的一種的尿素能夠通過用水洗滌而去除，所以與水不相容的溶劑是優(yōu)選的。具體地，氯仿或者二氯甲烷是優(yōu)選的。

關(guān)于酯化中使用的溶劑的量，當(dāng)其太大時(shí)，生產(chǎn)率降低。當(dāng)其太小時(shí)，反應(yīng)溶液粘性增加而導(dǎo)致攪拌困難。因此，溶劑的量優(yōu)選為相對于3-(二烷氨基)-1,2-丙二醇的30～120倍重量，更優(yōu)選為50～100倍重量。

關(guān)于酯化的反應(yīng)溫度，當(dāng)其太低時(shí)，反應(yīng)無法進(jìn)行，并且當(dāng)其太高時(shí)，產(chǎn)生副產(chǎn)物n-?；迨沟卯a(chǎn)量降低。具體地，酯化的反應(yīng)溫度優(yōu)選為0～40℃，并且更優(yōu)選為10～30℃。

關(guān)于醚化中使用的具有離去基團(tuán)的烴的用量，當(dāng)其太大時(shí)，具有離去基團(tuán)的烴殘留導(dǎo)致期望產(chǎn)物的純度降低。當(dāng)其太小時(shí)，反應(yīng)在單酯體階段停止導(dǎo)致期望產(chǎn)物的純度降低。因此，具有離去基團(tuán)的烴的用量優(yōu)選為相對于3-(二烷氨基)-1,2-丙二醇的1.9～3.0當(dāng)量，更優(yōu)選為2.0～2.5當(dāng)量。

在醚化中，堿用作催化劑。關(guān)于堿，能夠使用例如氫氧化鉀、氫氧化鈉、氫化鈉或者叔丁醇鉀。關(guān)于催化劑的用量，當(dāng)其太小時(shí)，反應(yīng)無法進(jìn)行，并且當(dāng)其太大時(shí)，由于生產(chǎn)率降低而不優(yōu)選。因此，堿的用量優(yōu)選為相對于3-(二烷氨基)-1,2-丙二醇的2.0～15.0當(dāng)量，更優(yōu)選為5.0～10.0當(dāng)量。

關(guān)于醚化中使用的溶劑，對堿穩(wěn)定并且與水不相容的溶劑是優(yōu)選的。具體地，己烷或者甲苯是優(yōu)選的，并且己烷是更優(yōu)選的。

關(guān)于醚化的反應(yīng)溫度，當(dāng)其太低時(shí)，反應(yīng)無法進(jìn)行，并且當(dāng)其太高時(shí)，由于進(jìn)行副反應(yīng)并且期望產(chǎn)物的產(chǎn)量降低而不優(yōu)選。具體地，的反應(yīng)溫度優(yōu)選為40～120℃，并且更優(yōu)選為60～100℃。

實(shí)施例

(碘離子含量和氯離子含量的分析方法)

通過本發(fā)明的制造方法獲得的式(2)表示的陽離子脂質(zhì)中的碘離子含量和氯離子含量能夠通過電勢滴方法而確定，使用例如銀/氯化銀電極作為電極并且硝酸銀作為滴定劑。具體地，約1g式(2)表示的陽離子脂質(zhì)溶解在100ml乙醇中。銀/氯化銀電極浸入溶液中，并且通過添加硝酸銀水溶液(n/100，n/10)同時(shí)用攪拌器攪拌而進(jìn)行滴定以測量電勢差。以滴定量標(biāo)繪電勢差，并且能由首先出現(xiàn)的拐點(diǎn)(拐點(diǎn)1)處的滴定量確定碘離子含量，并且能夠由第二拐點(diǎn)(拐點(diǎn)2)處的滴定量和拐點(diǎn)1處的滴定量之間的差確定氯離子含量。

(制造例1)

n-[1-(2,3-二油酰氧基)丙基]-n,n-二甲胺(以下稱為dodap)的制造

在120g氯仿中溶解2.00g(16.78mmol)3-(二甲氨基)-1,2-丙二醇(tokyochemicalindustryco.,ltd.的產(chǎn)品)、9.48g(33.56mmol)油酸(extraolein99，nofcorp.的產(chǎn)品)和0.41g(3.36mmol)4-二甲氨基吡啶(koeichemicalco.,ltd.的產(chǎn)品)。向溶液中添加7.72g(40.27mmol)1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(tokyochemicalindustryco.,ltd.的產(chǎn)品)，隨后在20～30℃攪拌。一小時(shí)后，用120g離子交換水和120g25重量％的氯化鈉水溶液洗滌混合物，向有機(jī)層添加3.0g無水硫酸鎂，隨后攪拌。通過過濾分離硫酸鎂，并且利用蒸發(fā)器對濾液進(jìn)行脫溶劑，從而獲得dodap(產(chǎn)量：11.12g，17.16mmol)。

(制造例2)

n-[1-(2,3-二油酰氧基)丙基]-n,n,n-三甲基碘化銨(以下稱為dotap-i)的制造

在30g丙酮中溶解3.00g(4.63mmol)dodap，并且向溶液中添加0.99g(6.94mmol)碘甲烷(kantochemicalco.,inc.的產(chǎn)品)，隨后在20～30℃攪拌。5小時(shí)后，通過過濾分離析出的晶體并且干燥，從而獲得dotap-i(產(chǎn)量：2.94g，3.72mmol)。

(制造例3)

油基甲磺酸酯(oleylmethanesulfonate)(以下稱為ole-ms)的制造

在1,450g脫水甲苯中溶解290g(1.08mol)油醇(nofable(注冊商標(biāo))ao-99，nofcorp.的產(chǎn)品)，并且將溶液冷卻至5～10℃。向溶液添加131g(1.30mol)三乙胺(kantochemicalco.,inc.的產(chǎn)品)，隨后在5～10℃攪拌10分鐘，并且然后逐滴緩慢加入136g(1.19mol)甲磺酰氯(kantochemicalco.,inc.的產(chǎn)品)。在5～15℃攪拌一小時(shí)后，通過過濾分離析出的鹽酸三乙胺，并且濾液用580g離子交換水洗滌兩次。向有機(jī)層添加87g無水硫酸鎂，隨后攪拌，并且然后過濾。利用蒸發(fā)器對濾液進(jìn)行脫溶劑，從而獲得ole-ms(產(chǎn)量：335g，0.97mol)。

(制造例4)

n-[1-(2,3-二油基氧基)丙基]-n,n-二甲胺(以下稱為dodma)的制造

向1168g己烷添加233g(4.15mol)氫氧化鉀(kantochemicalco.,inc.的產(chǎn)品)，隨后邊攪拌邊添加55g(0.46mol)1,2-丙二醇(tokyochemicalco.,ltd的產(chǎn)品)。然后，向其中加入320g(0.92mol)ole-ms，隨后在38～42℃攪拌。7小時(shí)后，反應(yīng)溶液冷卻至15℃，并且用640g蒸餾水和256g乙腈洗滌3次。在用768g乙腈進(jìn)一步萃取和洗滌4次后，通過蒸發(fā)器對上層進(jìn)行脫溶劑，從而獲得黃色液體。通過柱色譜法(己烷/乙酸乙酯＝95/5～70/30(v/v)))使用硅膠來純化黃色液體，從而獲得dodma(產(chǎn)量：157g，0.25mol)。

(制造例5)

n-[1-(2,3-二油基氧基)丙基]-n,n,n-三甲基碘化銨(以下稱為dotma-i)的制造

在30g丙酮中溶解3.00g(4.84mmol)dodma，并且向溶液中添加1.03g(7.26mmol)碘甲烷，隨后在20～30℃攪拌。3小時(shí)后，利用蒸發(fā)器對反應(yīng)溶液進(jìn)行脫溶劑，從而獲得dotma-i(產(chǎn)量：3.70g，4.86mmol)。

(實(shí)施例1)

n-[1-(2,3-二油酰氧基)丙基]-n,n,n-三甲基氯化銨(dotap-cl)的制造

在20g甲醇中溶解1.39g(12.66mmol)四甲基氯化銨(kantochemicalco.,inc.的產(chǎn)品)，并且向溶液中添加2.0g(2.53mmol)dotap-i，隨后在20～30℃攪拌。一小時(shí)后，通過過濾分離析出的晶體，并且通過蒸發(fā)器濃縮濾液。向濃縮物中添加20g乙酸乙酯，隨后在20～30℃攪拌。一小時(shí)后，通過過濾分離不溶物，并且對濾液進(jìn)行脫溶劑，從而獲得dotap-cl(產(chǎn)量：1.65g，2.36mmol)。

(實(shí)施例2)

n-[1-(2,3-二油基氧基)丙基]-n,n,n-三甲基氯化銨(dotma-cl)的制造

在20g甲醇中溶解1.44g(13.12mmol)四甲基氯化銨，并且向溶液中添加2.0g(2.63mmol)dotma-i，隨后在20～30℃攪拌。一小時(shí)后，通過過濾分離析出的晶體，并且通過蒸發(fā)器濃縮濾液。向濃縮物中添加20g乙酸乙酯，隨后在20～30℃攪拌。一小時(shí)后，通過過濾分離不溶物，并且對濾液進(jìn)行脫溶劑，從而獲得dotma-cl(產(chǎn)量：1.65g，2.36mmol)。

(比較例1)

在35ml二氯甲烷中溶解1.50g(1.90mmol)dotap-i。向溶液中添加8ml1n鹽酸的甲醇溶液，隨后在20～30℃攪拌。此外，向其中添加12ml25重量％的氯化鈉水溶液，隨后在20～30℃攪拌，并且然后分離和收集有機(jī)層。向剩下的水層添加4ml二氯甲烷，隨后攪拌，并且收集有機(jī)層并且和之前收集的有機(jī)層混合。在重復(fù)從添加1n鹽酸的甲醇溶液起的一系列操作4次后，用18ml25重量％的氯化鈉水溶液洗滌收集的有機(jī)層，向其中添加5.0g無水硫酸鈉，隨后攪拌，并且然后過濾。對濾液進(jìn)行脫溶劑，從而獲得dotap-cl的粗產(chǎn)物。通過柱色譜法(氯仿/甲醇＝100/0～75/25(v/v)))使用硅膠來純化粗產(chǎn)物以去除副產(chǎn)物，例如，脂肪酸，從而獲得dotap-cl(產(chǎn)量：1.26g，1.80mmol)。

(dotap-cl或者dotma-cl中碘離子含量和氯離子含量的分析)

將實(shí)施例和比較例中獲得的約一克dotap-cl或者dotma-cl溶解在100ml乙醇中。將銀/氯化銀電極浸入溶液中，并且通過添加硝酸銀水溶液(n/100，n/10)同時(shí)用攪拌器攪拌而進(jìn)行滴定以測量電勢差。以滴定量標(biāo)繪電勢差，并且由出現(xiàn)的拐點(diǎn)1處的滴定量確定碘離子含量，并且由拐點(diǎn)2處的滴定量和拐點(diǎn)1處的滴定量之間的差確定氯離子含量。

標(biāo)繪了dotap-cl的分析結(jié)果(圖1、2和3)。圖1示出實(shí)施例1獲得的dotap-cl的滴定結(jié)果。圖2示出實(shí)施例2獲得的dotma-cl的滴定結(jié)果。圖3示出比較例1獲得的dotap-cl的滴定結(jié)果。

分別對于實(shí)施例1和2獲得的dotap-cl和dotma-cl，能夠根據(jù)滴定開始后即刻出現(xiàn)的拐點(diǎn)1處的滴定量(小于0.001mmol)看到碘離子含量極小。此外，能夠看到包含的氯離子含量幾乎與拐點(diǎn)2處的滴定量和拐點(diǎn)1處的滴定量之間的差的理論值相同，并且確認(rèn)離子交換定量地進(jìn)行并且能夠獲得dotap-cl或者dotma-cl。氯離子純度(氯離子與碘離子和氯離子總量的比率)為99摩爾％以上。

另一方面，對于比較例1中獲得的dotap-cl，包含0.181mmol碘離子，并且氯離子純度為90摩爾％(表1)。根據(jù)上述結(jié)果，確認(rèn)本發(fā)明的制造方法作為式(2)表示的陽離子脂質(zhì)的制造方法是有用的。

表1

*氯離子含量/(碘離子含量+氯離子含量)×100

雖然已經(jīng)參考其具體實(shí)施例詳細(xì)地描述了本發(fā)明，但對本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，能夠在不背離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，對本發(fā)明進(jìn)行各種變化或修改。

本申請基于2014年12月8日提交的日本專利申請(日本專利申請?zhí)?014-247723)，并且其全文作為參考并入本申請。另外，本文引用的所有文獻(xiàn)作為整體并入本文。