本發(fā)明涉及使用不同檢測(cè)溫度及基準(zhǔn)值的靶核酸序列檢測(cè)。

背景技術(shù)：

為了檢測(cè)靶核酸序列，作為實(shí)時(shí)檢測(cè)方式廣泛利用以一邊監(jiān)控靶擴(kuò)增，一邊可檢測(cè)靶核酸序列的實(shí)時(shí)檢測(cè)方法。通常，在實(shí)時(shí)檢測(cè)方法中使用與靶核酸序列特異性雜交的已標(biāo)志的探針或引物。作為使用已標(biāo)志的探針及靶核酸序列之間的雜交的方法的例，包括使用具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的雙重標(biāo)志的探針的分子信標(biāo)(molecularbeacon)方法(tyagietal,naturebiotechnologyv.14march1996)、hybeacon方法(frenchdjetal.,mol.cellprobes,15(6):363-374(2001))、利用分別標(biāo)志成供體及受體的2個(gè)探針的雜交探針?lè)椒?bernadetal,147-148clinchem2000；46)及使用單一標(biāo)志的寡核苷酸的lux方法(美國(guó)專利第7537886號(hào))。在本技術(shù)領(lǐng)域中廣泛利用taqman方法(美國(guó)專利第5210015號(hào)及第5538848號(hào))，上述taqman方法(美國(guó)專利第5210015號(hào)及第5538848號(hào))利用借助雙重標(biāo)志的探針及脫氧核糖核酸(dna)聚合酶的5’-核酸酶活性的上述探針的切割。

作為使用標(biāo)志的引物的方法的例，包括日出(sunrise)引物方法(nazarenkoetal,2516-2521nucleicacidsresearch,1997,v.25no.12及美國(guó)專利第6117635號(hào))、蝎形(scorpion)引物方法(whitcombeetal,804-807,naturebiotechnologyv.17august1999及美國(guó)專利第6326145號(hào))及tsg引物方法(wo第2011-078441號(hào))。

作為代替接近法，提出使用以依賴于靶核酸序列的存在的方式形成的二聚體的實(shí)時(shí)檢測(cè)方法，例如，侵入物(invader)分析(美國(guó)專利第5691142號(hào)、美國(guó)專利第6358691號(hào)及美國(guó)專利第6194149號(hào))、探測(cè)和標(biāo)標(biāo)記寡核苷酸切割及延伸(ptocleavageandextension)方法(wo第2012/096523號(hào))、探測(cè)和標(biāo)標(biāo)記寡核苷酸切割及延伸-依賴性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)寡核苷酸雜交(ptocleavageandextension-dependentsignalingoligonucleotidehybridization)方法(wo第2013/115442號(hào))及探測(cè)和標(biāo)標(biāo)記寡核苷酸切割及延伸-依賴性非雜交(ptocleavageandextension-dependentnon-hybridization)方法(第pct/kr2013/012312號(hào))。

如上所述的現(xiàn)有實(shí)時(shí)檢測(cè)技術(shù)在與靶擴(kuò)增相相關(guān)或無(wú)關(guān)的信號(hào)擴(kuò)增過(guò)程中，在一個(gè)所選擇的檢測(cè)溫度下檢測(cè)從熒光標(biāo)志產(chǎn)生的信號(hào)。根據(jù)現(xiàn)有實(shí)時(shí)檢測(cè)技術(shù)，在一個(gè)反應(yīng)管中利用單一類型的標(biāo)志來(lái)檢測(cè)多個(gè)靶核酸序列時(shí)，互不分辨針對(duì)靶核酸序列產(chǎn)生的多個(gè)信號(hào)。因此，為了檢測(cè)多個(gè)靶核酸序列，在現(xiàn)有實(shí)時(shí)檢測(cè)技術(shù)中一般利用不同類型的標(biāo)志。在利用單一類型的標(biāo)志的情況下，利用tm差異的解鏈分析可檢測(cè)多個(gè)靶核酸序列，但是，解鏈分析具有如下缺點(diǎn)：解鏈分析的進(jìn)行時(shí)間長(zhǎng)于實(shí)時(shí)技術(shù)進(jìn)行時(shí)間，且隨著靶核酸序列的增加，使具有不同的tm值的探針的設(shè)計(jì)變得越來(lái)越難。

如上所述的現(xiàn)有實(shí)時(shí)檢測(cè)技術(shù)在與靶擴(kuò)增相相關(guān)或無(wú)關(guān)的信號(hào)擴(kuò)增過(guò)程中，在一個(gè)所選擇的檢測(cè)溫度下檢測(cè)從熒光標(biāo)志產(chǎn)生的信號(hào)。根據(jù)現(xiàn)有實(shí)時(shí)檢測(cè)技術(shù)，在單一反應(yīng)管中使用單一類型的標(biāo)志來(lái)檢測(cè)多個(gè)靶核酸序列時(shí)，互不分辨針對(duì)靶核酸序列產(chǎn)生的多個(gè)信號(hào)。因此，為了檢測(cè)多個(gè)靶核酸序列，在現(xiàn)有實(shí)時(shí)檢測(cè)技術(shù)中一般利用不同類型的標(biāo)志。在使用單一類型的標(biāo)志的情況下，利用tm差異的解鏈分析可檢測(cè)多個(gè)靶核酸序列，但是，解鏈分析具有如下缺點(diǎn)：解鏈分析的進(jìn)行時(shí)間長(zhǎng)于實(shí)時(shí)技術(shù)進(jìn)行時(shí)間，且隨著靶核酸序列的增加，使具有不同的tm值的探針的設(shè)計(jì)變得越來(lái)越難。

因此，若開(kāi)發(fā)不依賴于解鏈分析且在一個(gè)反應(yīng)容器中使用單一類型的標(biāo)志及單一類型的檢測(cè)器來(lái)檢測(cè)靶核酸序列的新方法或接近法，則能夠以便利性、費(fèi)用效果及效率性大大提高的方式檢測(cè)多個(gè)靶核酸序列。并且，若結(jié)合上述新方法與其他檢測(cè)方法(例如，解鏈分析)，則能夠以效率大大提高的方式在一個(gè)反應(yīng)容器中使用單一類型的標(biāo)志檢測(cè)多個(gè)靶核酸序列。

在本說(shuō)明書(shū)全文中，參照了多篇專利及文獻(xiàn)，并用括號(hào)表示了其引用。為了更加明確地說(shuō)明本發(fā)明及本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的水平，這種專利及文獻(xiàn)的公開(kāi)內(nèi)容全插入于本說(shuō)明書(shū)作為參照。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明人為了開(kāi)發(fā)檢測(cè)靶核酸序列的方法，尤其為了開(kāi)發(fā)以更準(zhǔn)確且簡(jiǎn)單的方式定性或定量地檢測(cè)的方法而進(jìn)行了努力研究。其結(jié)果，本發(fā)明人在調(diào)節(jié)的檢測(cè)溫度下與靶核酸序列有關(guān)的信號(hào)后，通過(guò)使用基準(zhǔn)值，來(lái)合適地分析檢測(cè)結(jié)果確認(rèn)到能夠以便利性、費(fèi)用效果及效率性大大提高的方式在一個(gè)反應(yīng)容器中利用單一類型的標(biāo)志及單一類型的檢測(cè)器檢測(cè)多個(gè)靶核酸序列。

因此，本發(fā)明的目的在于，提供用于使用不同檢測(cè)溫度及基準(zhǔn)值，來(lái)檢測(cè)樣品內(nèi)2個(gè)靶核酸序列中的至少一個(gè)核酸序列的方法及試劑盒。

本發(fā)明的再一目的在于，提供使用不同檢測(cè)溫度及基準(zhǔn)值來(lái)對(duì)樣品內(nèi)核酸序列的單核苷酸多態(tài)性基因型進(jìn)行分析的方法及試劑盒。

本發(fā)明的另一目的在于，提供計(jì)算機(jī)可讀存儲(chǔ)介質(zhì)，包含用于運(yùn)行處理器的指示，上述處理器執(zhí)行使用不同檢測(cè)溫度及基準(zhǔn)值確定樣品內(nèi)2個(gè)靶核酸序列中的至少一個(gè)靶核酸序列的存在的方法。

本發(fā)明的另一目的在于，提供計(jì)算機(jī)可讀存儲(chǔ)介質(zhì)，包含用于運(yùn)行處理器的指示，上述處理器用于執(zhí)行使用不同檢測(cè)溫度及基準(zhǔn)值分析樣品內(nèi)靶核酸序列的單核苷酸多態(tài)性基因型方法。

本發(fā)明的還一目的在于，提供用于使用不同檢測(cè)溫度及基準(zhǔn)值確定樣品內(nèi)2個(gè)靶核酸序列中的至少一個(gè)靶核酸序列的存在的裝置。

本發(fā)明的又一目的在于，提供使用不同檢測(cè)溫度及基準(zhǔn)值來(lái)分析樣品內(nèi)核酸序列的單核苷酸多態(tài)性基因型的裝置。

本發(fā)明的又一目的在于，提供計(jì)算機(jī)程序，運(yùn)行用于執(zhí)行使用不同檢測(cè)溫度及基準(zhǔn)值確定樣品內(nèi)2個(gè)核酸序列中的至少一個(gè)靶核酸序列的存在的方法的處理器且存儲(chǔ)于計(jì)算機(jī)可讀存儲(chǔ)介質(zhì)。

本發(fā)明的又一目的在于，提供計(jì)算機(jī)程序，運(yùn)行用于執(zhí)行使用不同檢測(cè)溫度及基準(zhǔn)值分析核酸序列的單核苷酸多態(tài)性的基因型的方法的處理器且存儲(chǔ)于計(jì)算機(jī)可讀存儲(chǔ)介質(zhì)。

與所附的發(fā)明要求保護(hù)范圍及附圖一同，通過(guò)以下詳細(xì)說(shuō)明可使本發(fā)明的其他目的及優(yōu)點(diǎn)更加明確。

附圖說(shuō)明

圖1a表示在相對(duì)較高檢測(cè)溫度(72℃)及相對(duì)較低檢測(cè)溫度(60℃)下，靶核酸序列(沙眼衣原體的基因組脫氧核糖核酸、沙眼衣原體(ct))、靶核酸序列(淋球菌基因組脫氧核糖核酸、淋球菌(ng))及它們的組合的檢測(cè)結(jié)果。通過(guò)taqman探針?lè)椒óa(chǎn)生與沙眼衣原體及淋球菌有關(guān)的信號(hào)。

圖1b表示基于圖1a的檢測(cè)結(jié)果獲取基準(zhǔn)值。作為基準(zhǔn)值使用相對(duì)于在相對(duì)較低檢測(cè)溫度下檢測(cè)出的信號(hào)在相對(duì)較高檢測(cè)溫度下檢測(cè)出的信號(hào)的比率。

圖1c以圖示化的方式表示通過(guò)使用在圖1b中獲取的沙眼衣原體的基準(zhǔn)值及在圖1a中檢測(cè)出的信號(hào)，來(lái)確定靶核酸序列(淋球菌基因組的脫氧核糖核酸、淋球菌)的存在。虛線表示閾值。

圖1d以圖示化的方式表示通過(guò)使用在圖1b中獲取的淋球菌的基準(zhǔn)值及在圖1a中檢測(cè)出的信號(hào)，來(lái)確定靶核酸序列(淋球菌基因組脫氧核糖核酸、沙眼衣原體)的存在。虛線表示閾值。

圖2a為表示在相對(duì)較高檢測(cè)溫度(67.8℃)及相對(duì)較低檢測(cè)溫度(60℃)下，靶核酸序列(沙眼衣原體的基因組脫氧核糖核酸、沙眼衣原體)、靶核酸序列(淋球菌基因組脫氧核糖核酸、淋球菌)及它們的組合的檢測(cè)結(jié)果。通過(guò)探測(cè)和標(biāo)標(biāo)記寡核苷酸切割及延伸方法產(chǎn)生與沙眼衣原體及淋球菌有關(guān)的信號(hào)。

圖2b表示基于圖2a的檢測(cè)結(jié)果獲取基準(zhǔn)值。作為基準(zhǔn)值使用相對(duì)于在相對(duì)較低檢測(cè)溫度下檢測(cè)出的信號(hào)在相對(duì)較高檢測(cè)溫度下檢測(cè)出的信號(hào)的比率。

圖2c以圖示化的方式表示通過(guò)使用在圖2b中獲取的沙眼衣原體的基準(zhǔn)值及在圖2a中檢測(cè)出的信號(hào)，來(lái)確定靶核酸序列(淋球菌基因組的脫氧核糖核酸、淋球菌)的存在。虛線表示閾值。

圖2d以圖示化的方式表示通過(guò)使用在圖2b中獲取的淋球菌的基準(zhǔn)值及在圖2a中檢測(cè)出的信號(hào)，來(lái)確定靶核酸序列(淋球菌基因組脫氧核糖核酸、沙眼衣原體)的存在。虛線表示閾值。

圖3b為表示在相對(duì)較高檢測(cè)溫度(64℃)及相對(duì)較低檢測(cè)溫度(60℃)下，靶各個(gè)單核苷酸多態(tài)性基因型(野生型純合子、突變純合子及雜合子)的檢測(cè)結(jié)果。通過(guò)探測(cè)和標(biāo)標(biāo)記寡核苷酸切割及延伸方法產(chǎn)生信號(hào)。

圖3b表示基于圖3a的檢測(cè)結(jié)果獲取基準(zhǔn)值。作為基準(zhǔn)值使用相對(duì)于在相對(duì)較低檢測(cè)溫度下檢測(cè)出的信號(hào)在相對(duì)較高檢測(cè)溫度下檢測(cè)出的信號(hào)的比率。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明的最大的特征是在一個(gè)反應(yīng)容器中使用單一類型的標(biāo)志及單一類型的檢測(cè)器檢測(cè)多個(gè)靶核酸序列。在利用不同檢測(cè)溫度及基準(zhǔn)值的本發(fā)明中，在一個(gè)反應(yīng)容器中利用單一類型的標(biāo)志的情況下也可檢測(cè)多個(gè)靶核酸序列。在本發(fā)明中，在各個(gè)靶核酸序列在不同檢測(cè)溫度均產(chǎn)生信號(hào)的情況下可檢測(cè)多個(gè)靶核酸序列。根據(jù)本發(fā)明的特征選擇本發(fā)明的結(jié)構(gòu)，并成為用于檢測(cè)靶核酸序列的驚人的工藝。

在現(xiàn)有的實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法中，為了在一個(gè)反應(yīng)容器中檢測(cè)2個(gè)靶核酸序列而需要2種類型的熒光標(biāo)志或解鏈分析。

本發(fā)明可實(shí)現(xiàn)在一個(gè)反應(yīng)容器中使用單一類型的熒光標(biāo)志來(lái)檢測(cè)2個(gè)靶核酸序列的實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方案。

在本發(fā)明中利用如下有趣地發(fā)現(xiàn)：針對(duì)于在2個(gè)靶核酸序列中的一個(gè)，可在檢測(cè)其他靶核酸序列的存在中使用在相對(duì)較高檢測(cè)溫度及相對(duì)較低檢測(cè)溫度下檢測(cè)出的反映信號(hào)之間的差異的基準(zhǔn)值。在本發(fā)明中所使用的與靶核酸序列有關(guān)的基準(zhǔn)值是在相對(duì)較高檢測(cè)溫度及相對(duì)較低檢測(cè)溫度下從信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)產(chǎn)生信號(hào)并檢測(cè)，來(lái)以實(shí)驗(yàn)的方式獲取的規(guī)定的值。在檢測(cè)靶核酸序列中可直接使用基準(zhǔn)值。選擇性地，為了證明靶核酸序列的存在及不在，基準(zhǔn)值可多樣地適用于處理信號(hào)的式。

尤其，在本發(fā)明中用于檢測(cè)多個(gè)靶核酸序列的信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)在不同檢測(cè)溫度下均產(chǎn)生信號(hào)時(shí)還可檢測(cè)多個(gè)靶核酸序列。

本發(fā)明可實(shí)現(xiàn)為如下的多種實(shí)施方式：

(a)使用不同檢測(cè)溫度及基準(zhǔn)值的樣品內(nèi)2個(gè)靶核酸序列中的至少一個(gè)靶核酸序列的檢測(cè)；以及

(b)使用不同檢測(cè)溫度及基準(zhǔn)值的樣品內(nèi)核酸序列的核苷酸多態(tài)性基因型分析。

i.使用不同檢測(cè)溫度及基準(zhǔn)值的樣品內(nèi)至少一個(gè)靶核酸序列的檢測(cè)

在本發(fā)明的一實(shí)施方式中，提供使用不同檢測(cè)溫度及基準(zhǔn)值檢測(cè)樣品內(nèi)包含第一靶核酸序列及第二靶核酸序列的2個(gè)靶核酸序列中的至少一個(gè)靶核酸序列的方法，包括：步驟(a)，提供如下：(i)借助第一信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)表示在相對(duì)較高檢測(cè)溫度及相對(duì)較低檢測(cè)溫度下所提供的信號(hào)的變化關(guān)系的、與第一靶核酸序列有關(guān)的第一基準(zhǔn)值和/或(ii)借助第二信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)表示在相對(duì)較高檢測(cè)溫度及相對(duì)較低檢測(cè)溫度下所提供的信號(hào)的變化關(guān)系的、與第二靶核酸序列有關(guān)的第二基準(zhǔn)值；上述第一基準(zhǔn)值與上述第二基準(zhǔn)值不同；步驟(b)，與用于檢測(cè)2個(gè)靶核酸序列的第一信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)及第二信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)一同培養(yǎng)樣品，并在相對(duì)較高檢測(cè)溫度及相對(duì)較低檢測(cè)溫度下檢測(cè)來(lái)自上述第一信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)及第二信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)的信號(hào)；上述第一信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)及第二信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)在相對(duì)較高檢測(cè)溫度及相對(duì)較低檢測(cè)溫度下產(chǎn)生信號(hào)；由上述第一信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)及第二信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)產(chǎn)生的信號(hào)不被單一類型的檢測(cè)器分辨；以及步驟(c)，根據(jù)在上述基準(zhǔn)值中的至少一種及在上述步驟(a)中檢測(cè)出的信號(hào)確定2個(gè)靶核酸序列中的至少一個(gè)靶核酸序列的存在。

根據(jù)使用擴(kuò)增曲線的現(xiàn)有的實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法，使用提供不被分辨的相同信號(hào)的信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)來(lái)分辨多個(gè)靶核酸序列，從而無(wú)法進(jìn)行檢測(cè)，這是本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通常識(shí)。

本發(fā)明克服與本技術(shù)領(lǐng)域的普通常識(shí)相關(guān)的局限，帶來(lái)以非常得到改善的方式檢測(cè)靶核酸序列的未期待的結(jié)果。

如下詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明。

步驟(a)：基準(zhǔn)值的提供

提供與第一靶核酸序列有關(guān)的第一基準(zhǔn)值及與第二靶核酸序列有關(guān)的第二基準(zhǔn)值。

有趣地是本發(fā)明人確認(rèn)在一個(gè)反應(yīng)容器中，在表示預(yù)先確定單一靶核酸序列的存在的的2個(gè)檢測(cè)溫度下檢測(cè)出的情況下，以特定圖案(圖案或者規(guī)則)存在信號(hào)變化。例如，針對(duì)靶核酸序列，，在相對(duì)較高檢測(cè)溫度下檢測(cè)出的信號(hào)及在相對(duì)較低檢測(cè)溫度下檢測(cè)出的信號(hào)之間的信號(hào)變化呈特定圖案(圖案或者規(guī)則)。例如，上述信號(hào)的強(qiáng)度可相同或者實(shí)質(zhì)上相同，或上述信號(hào)的強(qiáng)度在2個(gè)檢測(cè)溫度下，在特定范圍中可互不相同。。

本發(fā)明的特征在于，將上述結(jié)果適用于取得基準(zhǔn)值，且檢測(cè)靶核酸序列。在一個(gè)反應(yīng)容器中，與靶核酸序列有關(guān)的信號(hào)僅以檢測(cè)溫度不同的方式(例如，無(wú)靶含量的變化或者無(wú)緩沖液條件的變化)檢測(cè)出，因而在2個(gè)檢測(cè)溫度之間的信號(hào)變化中存在特定圖案(圖案或者規(guī)則)?；谛盘?hào)變化中的特定關(guān)系(圖案或者規(guī)則)，在相對(duì)較高檢測(cè)溫度下檢測(cè)出的信號(hào)可使用在用于分析在相對(duì)較低檢測(cè)溫度下檢測(cè)出的信號(hào)，與此相反也相同。根據(jù)一實(shí)例，在針對(duì)2個(gè)檢測(cè)溫度之間的與靶核酸序列有關(guān)的信號(hào)變化允許特定關(guān)系(圖案或者規(guī)則)的條件洗實(shí)施本發(fā)明的方法。

靶核酸序列的“基準(zhǔn)值(referencevalue，rv)”表示在2個(gè)檢測(cè)溫度下借助用于檢測(cè)靶核酸序列的信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)提供的信號(hào)變化的關(guān)系。

根據(jù)一實(shí)例，培養(yǎng)與靶核酸序列相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)，在相對(duì)較高檢測(cè)溫度及相對(duì)較低檢測(cè)溫度下檢測(cè)信號(hào)后，取得在相對(duì)較高檢測(cè)溫度及相對(duì)較低檢測(cè)溫度下檢測(cè)出的信號(hào)之間的差異來(lái)獲取各個(gè)基準(zhǔn)值。

根據(jù)一實(shí)例，(i)通過(guò)(i-1)與用于檢測(cè)第一靶核酸序列的第一信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)進(jìn)行培養(yǎng)，(i-2)檢測(cè)在相對(duì)較高檢測(cè)溫度及相對(duì)較低檢測(cè)溫度下的信號(hào)，(i-3)取得在相對(duì)較高檢測(cè)溫度及相對(duì)較低檢測(cè)溫度下檢測(cè)出的信號(hào)之間的差異，來(lái)獲取與第一靶核酸序列有關(guān)的第一基準(zhǔn)值；(ii)通過(guò)與用于檢測(cè)第二靶核酸序列的第二信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)進(jìn)行培養(yǎng)，(ii-2)檢測(cè)在相對(duì)較高檢測(cè)溫度及相對(duì)較低檢測(cè)溫度下的信號(hào)，(ii-3)取得在相對(duì)較高檢測(cè)溫度及相對(duì)較低檢測(cè)溫度下檢測(cè)出的信號(hào)之間的差異，來(lái)獲取與第二靶核酸序列有關(guān)的第二基準(zhǔn)值；上述第一基準(zhǔn)值與第二基準(zhǔn)值不同。

可根據(jù)多種方式提供各個(gè)基準(zhǔn)值。

根據(jù)一實(shí)例，通過(guò)實(shí)施本發(fā)明的方法的人員的實(shí)驗(yàn)提供各個(gè)基準(zhǔn)值。

選擇性地，通過(guò)本發(fā)明的試劑盒、計(jì)算機(jī)可讀存儲(chǔ)介質(zhì)、裝置或計(jì)算機(jī)程序的制作公司提供各個(gè)基準(zhǔn)值?？砂瑢?duì)包裝在上述試劑盒、計(jì)算機(jī)可讀存儲(chǔ)介質(zhì)、產(chǎn)品、裝置或計(jì)算機(jī)程序的說(shuō)明書(shū)具有關(guān)心的與靶核酸序列有關(guān)的基準(zhǔn)值。

根據(jù)一實(shí)例，通過(guò)對(duì)相對(duì)較高檢測(cè)溫度及相對(duì)較低檢測(cè)溫度下檢測(cè)出的信號(hào)進(jìn)行數(shù)學(xué)處理來(lái)獲取基準(zhǔn)值。

這種數(shù)學(xué)處理為信號(hào)的函數(shù)。為了獲取基準(zhǔn)值而使用的函數(shù)在提供相對(duì)較高檢測(cè)溫度及相對(duì)較低檢測(cè)溫度下，借助信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)提供的信號(hào)變化的關(guān)系下包括任意函數(shù)。例如，函數(shù)能夠以信號(hào)的加法、乘法、減法及除法等數(shù)學(xué)處理來(lái)提出。

可在獲取相對(duì)較高檢測(cè)溫度及相對(duì)較低檢測(cè)溫度下的信號(hào)變化的關(guān)系中，以本身使用在相對(duì)較高檢測(cè)溫度及相對(duì)較低檢測(cè)溫度下所提供的信號(hào)的特征?？赏ㄟ^(guò)對(duì)上述信號(hào)的特征進(jìn)行數(shù)學(xué)處理，來(lái)使在相對(duì)較高檢測(cè)溫度及相對(duì)較低檢測(cè)溫度下的信號(hào)變形，并可在獲取在相對(duì)較高檢測(cè)溫度及相對(duì)較低檢測(cè)溫度下的信號(hào)變化的關(guān)系中，使用在相對(duì)較高檢測(cè)溫度及相對(duì)較低檢測(cè)溫度下的信號(hào)。

選擇性地，可使初始獲取的基準(zhǔn)值變形，并可用作基準(zhǔn)值。

根據(jù)一實(shí)例，與基準(zhǔn)值相關(guān)的術(shù)語(yǔ)“信號(hào)”不僅包含在檢測(cè)溫度下獲得的信號(hào)本身，還包含通過(guò)對(duì)信號(hào)進(jìn)行數(shù)學(xué)處理來(lái)提供的變形的信號(hào)。

能夠以多種方式獲取在本發(fā)明中所用的基準(zhǔn)值。例如，能夠以預(yù)測(cè)的值提供基準(zhǔn)值?？紤]靶序列、信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)及檢測(cè)溫度，來(lái)可預(yù)測(cè)表示在相對(duì)較高檢測(cè)溫度及相對(duì)較低檢測(cè)溫度下的信號(hào)變化的關(guān)系的基準(zhǔn)值。

當(dāng)獲取基準(zhǔn)值時(shí)，術(shù)語(yǔ)“在第一檢測(cè)溫度及第二檢測(cè)溫度下檢測(cè)出的信號(hào)之間的差異”為在第一檢測(cè)溫度及第二檢測(cè)溫度下的信號(hào)變化關(guān)系的一實(shí)例。

根據(jù)一實(shí)例，在相對(duì)較高檢測(cè)溫度及相對(duì)較低檢測(cè)溫度下檢測(cè)出的信號(hào)之間的差異包含對(duì)在相對(duì)較高檢測(cè)溫度下檢測(cè)出的信號(hào)及在相對(duì)較低檢測(cè)溫度下檢測(cè)出的信號(hào)進(jìn)行數(shù)學(xué)處理來(lái)獲取的差異。

根據(jù)一實(shí)例，在進(jìn)行數(shù)學(xué)處理的情況下，作為信號(hào)的特征應(yīng)該容易進(jìn)行數(shù)學(xué)處理。在特定實(shí)例中，數(shù)學(xué)處理包括使用信號(hào)的計(jì)算(例如，加法、乘法、減法及除法)或者獲取來(lái)源于信號(hào)的其他值的處理。

能夠以多種實(shí)施方式表述在相對(duì)較高檢測(cè)溫度及相對(duì)較低檢測(cè)溫度下的信號(hào)之間的差異。例如，可通過(guò)具有數(shù)值、信號(hào)的存在/不存在或信號(hào)特性的繪制表示上述差異。

可通過(guò)多種計(jì)算方法及他們的變形來(lái)進(jìn)行用于獲取差異的信號(hào)的數(shù)學(xué)處理。

尤其，通過(guò)計(jì)算在相對(duì)較高檢測(cè)溫度及相對(duì)較低檢測(cè)溫度下的信號(hào)之間的比率，來(lái)可進(jìn)行用于獲取差異的信號(hào)的數(shù)學(xué)處理。

例如，作為基準(zhǔn)值可使用相對(duì)于在第二檢測(cè)溫度下檢測(cè)出的信號(hào)的端點(diǎn)(end-point)，在第一檢測(cè)溫度下檢測(cè)出的信號(hào)的端點(diǎn)強(qiáng)度的比率。

根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，用于獲取信號(hào)之間的差異的信號(hào)的數(shù)學(xué)處理為相對(duì)于在相對(duì)較低檢測(cè)溫度下檢測(cè)出的信號(hào)，在相對(duì)較高檢測(cè)溫度下檢測(cè)出的信號(hào)的比率的計(jì)算。

根據(jù)一實(shí)例，可通過(guò)計(jì)算在相對(duì)較高檢測(cè)溫度下檢測(cè)出的信號(hào)及在相對(duì)較低檢測(cè)溫度下檢測(cè)出的信號(hào)之間的減法來(lái)獲取基準(zhǔn)值。

可利用多種方式進(jìn)行用于獲取差異的數(shù)學(xué)處理。可通過(guò)使用機(jī)器來(lái)來(lái)進(jìn)行數(shù)學(xué)處理。例如，可借助檢測(cè)器或?qū)崟r(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)裝置內(nèi)的處理器以數(shù)學(xué)方式處理信號(hào)。選擇性地，尤其，可根據(jù)預(yù)選確定的算法以手工、數(shù)學(xué)方式處理信號(hào)。

根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，第一基準(zhǔn)值與第二基準(zhǔn)值不同。根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，以第一基準(zhǔn)值與第二基準(zhǔn)值不同的方式設(shè)計(jì)第一信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)及第二信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)。

在rv值相互不同的情況下，可根據(jù)計(jì)算rv值的接近法技術(shù)差異程度的定量性表述不同。

根據(jù)一實(shí)例，根據(jù)共同的計(jì)算方法處理用于獲取基準(zhǔn)值的信號(hào)來(lái)可提供用于比較的基準(zhǔn)值，之后使用用于比較的上述基準(zhǔn)值，來(lái)可獲取2個(gè)基準(zhǔn)值之間的差異程度。根據(jù)一實(shí)例，共同計(jì)算方法為2個(gè)信號(hào)的除法。

例如，根據(jù)本發(fā)明的方法為了獲取在分析信號(hào)中所使用的基準(zhǔn)值，在根據(jù)減法進(jìn)行處理的情況下，為了獲取用于比較上述2個(gè)信號(hào)的基準(zhǔn)指可根據(jù)除法進(jìn)行處理。

根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，與第二基準(zhǔn)值相比，第一基準(zhǔn)值至少還大1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.5倍、1.7倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、5倍或10倍。根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，與第一基準(zhǔn)值相比，第二基準(zhǔn)值至少還大1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.5倍、1.7倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、5倍或10倍。

根據(jù)一實(shí)例，在為了確定第一基準(zhǔn)值與第二基準(zhǔn)值是否相同，進(jìn)行比較的情況下，根據(jù)除法計(jì)算上述基準(zhǔn)值。根據(jù)一實(shí)例，為了確定第一基準(zhǔn)值與第二基準(zhǔn)值是否相同，計(jì)算基準(zhǔn)值的方法可與為了檢測(cè)靶核酸序列，計(jì)算基準(zhǔn)值的方法相同或不同。

根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，用于基準(zhǔn)值的信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)可與用于檢測(cè)靶核酸序列的信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)相同。

根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，用于獲取基準(zhǔn)值的培養(yǎng)條件與用于分析樣品的培養(yǎng)條件相同。

針對(duì)靶核酸序列，可在包括成分(例如，靶核酸序列、信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)、酶或三磷酸脫氧核苷酸(dntp))的量、緩沖液ph或反應(yīng)時(shí)間的多種反應(yīng)條件下獲得基準(zhǔn)值。根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，可在反應(yīng)結(jié)束時(shí)提供飽和信號(hào)，因此在充分的反應(yīng)條件下獲得基準(zhǔn)值。根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，在計(jì)算基準(zhǔn)值獲得的信號(hào)之間的差異具有特定范圍，在上述特定范圍內(nèi)或者參照上述特定范圍來(lái)選擇基準(zhǔn)值。根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，可選擇上述特定范圍的最大值或最小值作為基準(zhǔn)值或者參照上述特定范圍的最大值或最小值來(lái)選擇基準(zhǔn)值、尤其，考慮到在多種條件下獲得的上述基準(zhǔn)值的標(biāo)準(zhǔn)變化、允許誤差范圍、特異度或敏感度，可使基準(zhǔn)值變形。

本發(fā)明為了提供與靶核酸序列有關(guān)的信號(hào)而利用信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)。借助相應(yīng)的信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)檢測(cè)各個(gè)靶核酸序列。

在本申請(qǐng)中所使用的術(shù)語(yǔ)“信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)”意味著在產(chǎn)生用于表示靶核酸序列存在的信號(hào)的過(guò)程中所使用的任何物質(zhì)，例如，其包括寡核苷酸、標(biāo)志及酶。選擇性地，在本申請(qǐng)中所使用的術(shù)語(yǔ)“信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)”意味著利用用于產(chǎn)生信號(hào)的物質(zhì)的任何方法。

根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，培養(yǎng)是在基于信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)可產(chǎn)生信號(hào)的條件下進(jìn)行的。這種條件包括溶液的溫度、鹽濃度及ph。

作為信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)使用的寡核苷酸的例包括與靶核酸序列特異性雜交的寡核苷酸(例如，探針及引物)，在與靶核酸序列雜交的探針或引物被切割而放出片段的情況下，作為信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)使用的寡核苷酸包含與上述片段特異性雜交的捕捉寡核苷酸，在與上述捕捉寡核苷酸雜交的片段延伸而形成延伸鏈的情況下，作為信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)使用的寡核苷酸包含與上述延伸鏈特異性雜交的寡核苷酸；作為信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)使用的寡核苷酸包含與上述捕捉寡核苷酸特異性雜交的寡核苷酸；以及作為信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)使用的寡核苷酸包含它們的組合。

即使信號(hào)產(chǎn)生原理相同，也可將包含不同序列的寡核苷酸的信號(hào)發(fā)生機(jī)構(gòu)視為互不相同的。

標(biāo)志可與寡核苷酸相連接或者可以為自由形態(tài)。在延伸反應(yīng)期間標(biāo)志可插入于延伸產(chǎn)物。

在信號(hào)產(chǎn)生中使用上述寡核苷酸的切割的情況下，作為酶的例包括5’-核酸酶、3’-核酸酶、尤其包括具有5’-核酸酶活性的核酸聚合酶、具有3’-核酸酶活性的核酸聚合酶或fen核酸酶。

在本發(fā)明中，可使用上述記載的多種物質(zhì)以多種方式產(chǎn)生信號(hào)。

根據(jù)一實(shí)例，在2個(gè)信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)中的至少一個(gè)為以依賴于二聚體形成的方式產(chǎn)生信號(hào)的信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)。

根據(jù)一實(shí)例，各個(gè)與靶核酸序列有關(guān)的信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)為以依賴于二聚體形成的方式產(chǎn)生信號(hào)的信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)。

根據(jù)一實(shí)例，上述二聚體包含雙鏈靶核酸序列。

在本申請(qǐng)中，與信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)相關(guān)使用的表達(dá)“以依賴于二聚體形成的方式產(chǎn)生信號(hào)”意味著以依賴于2個(gè)核酸分子的結(jié)合或解離的方式提供被檢測(cè)出的信號(hào)。上述表達(dá)包括根據(jù)以依賴于靶核酸序列存在的方式形成的二聚體(例如，包含標(biāo)志的檢測(cè)寡核苷酸及核酸序列)提供信號(hào)。并且，上述表達(dá)包括通過(guò)抑制二聚體(例如，具有標(biāo)志的檢測(cè)寡核苷酸及核酸序列)的雜交來(lái)提供信號(hào)，上述抑制隨著其他二聚體的形成產(chǎn)生。

尤其，通過(guò)與靶核酸序列及上述靶核酸序列特異性雜交的檢測(cè)寡核苷酸之間的二聚體的形成產(chǎn)生上述信號(hào)。

在本申請(qǐng)中所使用的術(shù)語(yǔ)“檢測(cè)寡核苷酸”是參與產(chǎn)生被檢測(cè)的信號(hào)的寡核苷酸。根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，檢測(cè)寡核苷酸包含參與產(chǎn)生實(shí)質(zhì)信號(hào)的寡核苷酸。例如，其他寡核苷酸(例如，包含與靶核酸序列或檢測(cè)寡核苷酸互補(bǔ)的核苷酸序列的寡核苷酸)和檢測(cè)寡核苷酸的雜交或非雜交確定信號(hào)產(chǎn)生。

根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，檢測(cè)寡核苷酸包含至少一個(gè)標(biāo)志。

基于靶核酸序列及檢測(cè)寡核苷酸之間的二聚體形成的信號(hào)可通過(guò)包括蝎形方法(whitcombeetal,naturebiotechnology17:804-807(1999))、日出(或amplifluor)方法(nazarenkoetal,nucleicacidsresearch,25(12):2516-2521(1997)及美國(guó)專利第6117635號(hào))、lux方法(美國(guó)專利第7537886號(hào))、叩診槌(plexor)方法(sherrillcb,etal.,journaloftheamericanchemicalsociety,126:4550-45569(2004))、分子信標(biāo)方法(tyagietal,naturebiotechnologyv.14march1996)、hybeacon方法(frenchdjetal.,mol.cellprobes,15(6):363-374(2001))、相鄰的雜交探針?lè)椒?bernard,p.s.etal.,anal.biochem.,273:221(1999))及l(fā)na方法(美國(guó)專利第6977295號(hào))的多種方法產(chǎn)生。

尤其，通過(guò)以依賴于與靶核酸序列特異性雜交的介導(dǎo)寡核苷酸(mediationoligonucleotide)的切割的方式形成的二聚體產(chǎn)生信號(hào)。

在本申請(qǐng)中所使用的術(shù)語(yǔ)“介導(dǎo)寡核苷酸”為介導(dǎo)生成不包含靶核酸序列的二聚體的寡核苷酸。

根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，介導(dǎo)寡核苷酸的切割本身不產(chǎn)生信號(hào)，在進(jìn)行介導(dǎo)寡核苷酸的雜交及切割之后，通過(guò)上述切割形成的片段參與用于產(chǎn)生信號(hào)的連續(xù)反應(yīng)。

根據(jù)一實(shí)例，介導(dǎo)寡核苷酸的雜交或切割本身不產(chǎn)生信號(hào)。

根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，介導(dǎo)寡核苷酸以與靶核酸序列雜交且被切割的方式放出片段，從而包含介導(dǎo)二聚體生成的寡核苷酸。尤其，上述片段在捕捉寡核苷酸中介導(dǎo)基于上述片段的延伸的二聚體的生成。

根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，介導(dǎo)寡核苷酸包含：(i)3’-靶向部位，包含與靶核酸序列互補(bǔ)的雜交核苷酸序列；以及(ii)5’-標(biāo)記部位，包含與靶核酸序列非-互補(bǔ)的核苷酸序列。

根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，介導(dǎo)寡核苷酸的切割放出片段，上述片段與捕捉寡核苷酸特異性雜交，并在上述捕捉寡核苷酸中延伸。

根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，與靶核酸序列雜交的介導(dǎo)寡核苷酸被切割而放出片段，上述片段與捕捉寡核苷酸特異性雜交，上述片段以延伸的方式形成延伸鏈，這導(dǎo)致形成上述延伸鏈及捕捉寡核苷酸之間的延伸二聚體，從而提供表示靶核酸序列存在的信號(hào)。

根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，在使用包含與上述延伸鏈互補(bǔ)的雜交核苷酸序列的第三寡核苷酸的情況下，上述第三寡核苷酸及延伸鏈的雜交通過(guò)形成其他類型的二聚體，來(lái)提供表示靶核酸序列存在的信號(hào)。

根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，在使用包含與捕捉寡核苷酸互補(bǔ)的雜交核苷酸序列的第三寡核苷酸的情況下，第三寡核苷酸及上述捕捉寡核苷酸之間的二聚體形成受到上述延伸鏈及上述捕捉寡核苷酸之間的二聚體形成的抑制，從而提供表示靶核酸序列存在的信號(hào)。

根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，上述片段、上述延伸鏈、上述捕捉寡核苷酸、上述第三寡核苷酸或它們的組合可起到檢測(cè)寡核苷酸的作用。

基于以依賴于介導(dǎo)寡核苷酸的切割的方式形成的二聚體的信號(hào)可通過(guò)包括探測(cè)和標(biāo)標(biāo)記寡核苷酸切割及延伸(ptocleavageandextension)方法(wo2012/096523)、探測(cè)和標(biāo)標(biāo)記寡核苷酸切割及延伸-依賴性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)寡核苷酸雜交(ptocleavageandextension-dependentsignalingoligonucleotidehybridization)方法(wo2013/115442)及探測(cè)和標(biāo)標(biāo)記寡核苷酸切割及延伸-依賴性非雜交(ptocleavageandextension-dependentnon-hybridization)方法(pct/kr2013/012312)的多種方法產(chǎn)生。

與在上述的參考文獻(xiàn)中公開(kāi)的術(shù)語(yǔ)相關(guān)地，與寡核苷酸的相應(yīng)的例如下：介導(dǎo)寡核苷酸與探測(cè)和標(biāo)標(biāo)記寡核苷酸(pto)相應(yīng)，捕捉寡核苷酸與捕捉和模板化寡核苷酸(cto)相應(yīng)，第三寡核苷酸分別與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)寡核苷酸(signalingoligonucleotide；so)或雜交寡核苷酸(ho)相應(yīng)。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)寡核苷酸、雜交寡核苷酸、捕捉和模板化寡核苷酸、延伸鏈或它們的組合可起到檢測(cè)寡核苷酸的作用。

以依賴于介導(dǎo)寡核苷酸的切割的方式形成的二聚體的信號(hào)包含以由以依賴于介導(dǎo)寡核苷酸的切割的方式形成的二聚體抑制其他二聚體的形成的方式提供的信號(hào)(例如，探測(cè)和標(biāo)標(biāo)記寡核苷酸切割及延伸-依賴性非雜交)。

例如，當(dāng)通過(guò)探測(cè)和標(biāo)標(biāo)記寡核苷酸切割及延伸方法產(chǎn)生基于以依賴于介導(dǎo)寡核苷酸的切割的方式形成的二聚體的信號(hào)時(shí)，信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)包含：上游寡核苷酸，包含與靶核酸序列互補(bǔ)的雜交核苷酸序列；探測(cè)和標(biāo)標(biāo)記寡核苷酸(pto)；捕捉和模板化寡核苷酸(capturingandtemplatingoligonucleotide；cto)；適合的標(biāo)志以及模板-依賴性核酸聚合酶，具有5’-核酸酶活性。探測(cè)和標(biāo)標(biāo)記寡核苷酸包含：(i)3’-靶向部位，包含與靶核酸序列互補(bǔ)的雜交核苷酸序列；以及(ii)5’-標(biāo)記部位，包含與靶核酸序列非互補(bǔ)的核苷酸序列。捕捉和模板化寡核苷酸沿著3’→5’方向包含捕捉部位(i)及模板化部位(ii)，上述捕捉部位(i)包含與上述探測(cè)和標(biāo)標(biāo)記寡核苷酸的5’-標(biāo)記部位或5’-標(biāo)記部位的一部分互補(bǔ)的核苷酸序列，上述模板化部位(ii)包含與探測(cè)和標(biāo)標(biāo)記寡核苷酸的5’-標(biāo)記部位及3’-靶向部位非-互補(bǔ)的核苷酸序列。

基于探測(cè)和標(biāo)標(biāo)記寡核苷酸切割及延伸方法的產(chǎn)生信號(hào)的特定實(shí)施例包括如下步驟。

包括：步驟(a)，使靶核酸序列與上游引物及探測(cè)和標(biāo)標(biāo)記寡核苷酸雜交；步驟(b)，在用于切割上述探測(cè)和標(biāo)標(biāo)記寡核苷酸的條件下，使步驟(a)的結(jié)果物與具有5’核酸酶活性的酶相接觸；上述上游寡核苷酸或其延伸鏈誘導(dǎo)基于具有5’核酸酶活性的酶的探測(cè)和標(biāo)標(biāo)記寡核苷酸的切割，上述切割放出包含上述探測(cè)和標(biāo)標(biāo)記寡核苷酸的5’-標(biāo)記部位或5’-標(biāo)記部位的一部分的片段；步驟(c)，使從上述探測(cè)和標(biāo)標(biāo)記寡核苷酸放出的片段與捕捉和模板化寡核苷酸雜交；從上述捕捉和模板化寡核苷酸放出的片段與捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位雜交；步驟(d)，利用上述步驟(c)的結(jié)果物及模板-依賴性核酸聚合酶進(jìn)行延伸反應(yīng)；通過(guò)使與上述捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位雜交的片段延伸來(lái)形成延伸二聚體，上述延伸二聚體具有可通過(guò)(i)上述片段的序列和/或長(zhǎng)度、(ii)上述捕捉和模板化寡核苷酸的序列和/或長(zhǎng)度或、(ⅲ)上述片段的序列和/或長(zhǎng)度及上述捕捉和模板化寡核苷酸的序列和/或長(zhǎng)度調(diào)節(jié)的tm值，上述延伸二聚體根據(jù)(i)與上述片段和/或上述捕捉和模板化寡核苷酸相連接的至少一個(gè)標(biāo)志、(ii)在延伸反應(yīng)期間插入于延伸二聚體內(nèi)的標(biāo)志、(ⅲ)在延伸反應(yīng)期間插入于延伸二聚體內(nèi)的標(biāo)志及與片段和/或捕捉和模板化寡核苷酸相連接的標(biāo)志或(ⅳ)插入標(biāo)志提供靶信號(hào)；以及步驟(e)，上述延伸二聚體在維持其雙鏈形態(tài)的預(yù)先確定的溫度下測(cè)定靶信號(hào)，由此檢測(cè)上述延伸二聚體，上述延伸二聚體的存在表示靶核酸序列的存在。在這種情況下，在上述探測(cè)和標(biāo)標(biāo)記寡核苷酸切割及延伸的方法中，在反復(fù)循環(huán)之間還包括變性，來(lái)反復(fù)實(shí)施上述步驟(a)～步驟(e)的全部或一部分。

在語(yǔ)句“在反復(fù)循環(huán)之間變性”中，術(shù)語(yǔ)“變性”意味著將雙鏈核酸分子解離成單鏈核酸分子。

在探測(cè)和標(biāo)標(biāo)記寡核苷酸切割及延伸方法的步驟(a)中，替代上游寡核苷酸可使用用于擴(kuò)增靶核酸序列的引物組。在這種情況下，在上述探測(cè)和標(biāo)標(biāo)記寡核苷酸切割及延伸方法中，在反復(fù)循環(huán)之間還包括變性，來(lái)反復(fù)上述步驟(a)～步驟(e)的全部或一部分。

在使與捕捉和模板化寡核苷酸雜交的探測(cè)和標(biāo)標(biāo)記寡核苷酸片段延伸而形成延伸鏈后，探測(cè)和標(biāo)標(biāo)記寡核苷酸切割及延伸方法可分類為檢測(cè)上述延伸的過(guò)程。探測(cè)和標(biāo)標(biāo)記寡核苷酸切割及延伸方法的特征在于，使用延伸鏈及上述捕捉和模板化寡核苷酸之間的二聚體檢測(cè)延伸鏈的形成。

還存在檢測(cè)延伸鏈形成的其他接近法。例如，可利用與上述延伸鏈特異性雜交的寡核苷酸，來(lái)檢測(cè)延伸鏈的形成(例如，探測(cè)和標(biāo)標(biāo)記寡核苷酸切割及延伸-依賴性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)寡核苷酸雜交方法)。在這種方法中，信號(hào)可從(i)連接在與延伸鏈特異性雜交的寡核苷酸的標(biāo)志、(ii)連接在與延伸鏈特異性雜交的寡核苷酸的標(biāo)志及與探測(cè)和標(biāo)標(biāo)記寡核苷酸片段相連接的標(biāo)志、(iii)連接在與延伸鏈特異性雜交的寡核苷酸的標(biāo)志及在延伸反應(yīng)期間插入于延伸鏈的標(biāo)志或(iv)連接在與延伸鏈特異性雜交的寡核苷酸的標(biāo)志及嵌入染料提供。選擇性性地，信號(hào)可從(i)與延伸鏈相連接的標(biāo)志或(ii)嵌入染料提供。

選擇性地，通過(guò)檢測(cè)用于抑制與捕捉和模板化寡核苷酸及上述捕捉和模板化寡核苷酸特異性雜交的寡核苷酸之間的雜交的其他方法(例如，探測(cè)和標(biāo)標(biāo)記寡核苷酸切割及延伸-依賴性非雜交方法)檢測(cè)延伸鏈形成。將這種抑制視為用于表現(xiàn)靶核酸序列的存在。信號(hào)可從(i)連接在可與捕捉和模板化寡核苷酸雜交的寡核苷酸的標(biāo)志、(ii)與捕捉和模板化寡核苷酸相連接的標(biāo)志、(iii)連接在可與捕捉和模板化寡核苷酸雜交的寡核苷酸的標(biāo)志及與捕捉和模板化寡核苷酸相連接的標(biāo)志或(iv)嵌入染料提供。

根據(jù)一實(shí)例，可與捕捉和模板化寡核苷酸特異性雜交的寡核苷酸具有與探測(cè)和標(biāo)標(biāo)記寡核苷酸片段重疊的序列。

根據(jù)一實(shí)例，檢測(cè)寡核苷酸包含：可與延伸鏈特異性雜交的寡核苷酸(例如，探測(cè)和標(biāo)標(biāo)記寡核苷酸切割及延伸-依賴性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)寡核苷酸雜交方法)及可與捕捉和模板化寡核苷酸特異性雜交的寡核苷酸(例如，探測(cè)和標(biāo)標(biāo)記寡核苷酸切割及延伸-依賴性非雜交方法)。根據(jù)一實(shí)例，檢測(cè)寡核苷酸包含在反應(yīng)期間生成的延伸鏈或捕捉和模板化寡核苷酸。

通常，基于探測(cè)和標(biāo)標(biāo)記寡核苷酸切割及延伸的方法伴隨依賴于靶核酸序列的存在的延伸鏈的形成。在本發(fā)明中為了包括用于提供信號(hào)的多種方法使用術(shù)語(yǔ)“基于探測(cè)和標(biāo)標(biāo)記寡核苷酸切割及延伸的方法”，上述多種方法包括通過(guò)探測(cè)和標(biāo)標(biāo)記寡核苷酸的切割及延伸形成延伸鏈的步驟。

基于探測(cè)和標(biāo)標(biāo)記寡核苷酸切割及延伸的方法產(chǎn)生信號(hào)的例包括如下的步驟，即，包括：步驟(a)，使上述靶核酸序列與上游引物及探測(cè)和標(biāo)標(biāo)記寡核苷酸雜交；步驟(b)，在用于上述探測(cè)和標(biāo)標(biāo)記寡核苷酸的切割的條件下，使上述步驟(a)的結(jié)果物與具有5’核酸酶活性的酶與相接觸，上述上游寡核苷酸或其延伸鏈誘導(dǎo)基于具有5’核酸酶活性的上述酶的探測(cè)和標(biāo)標(biāo)記寡核苷酸的切割，上述切割放出包含探測(cè)和標(biāo)標(biāo)記寡核苷酸的5’-標(biāo)記部位或5’-標(biāo)記部位的一部分的片段；步驟(c)，使從上述探測(cè)和標(biāo)標(biāo)記寡核苷酸放出的片段與捕捉和模板化寡核苷酸雜交，從上述捕捉和模板化寡核苷酸放出的上述片段與上述捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位雜交；步驟(d)，使用步驟(c)的結(jié)果物及模板-依賴性核酸聚合酶進(jìn)行延伸反應(yīng)，與上述捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位雜交的片段被延伸，來(lái)形成延伸鏈；步驟(e)，通過(guò)檢測(cè)與延伸鏈的存在依賴性地產(chǎn)生的信號(hào)來(lái)檢測(cè)上述延伸鏈的形成。在步驟(a)中，替代上述上游寡核苷酸可使用用于擴(kuò)增靶核酸序列的引物組。在這種情況下，在上述基于探測(cè)和標(biāo)標(biāo)記寡核苷酸切割及延伸的方法中，在反復(fù)循環(huán)之間還包括變性，來(lái)反復(fù)實(shí)施上述步驟(a)～步驟(e)的全部或一部分。

根據(jù)一實(shí)例，基于二聚體的形成產(chǎn)生的上述信號(hào)包括基于上述二聚體雜交(例如，二聚體本身的雜交或第三寡核苷酸的雜交)被誘導(dǎo)的信號(hào)或基于抑制因二聚體形成而引起的第三寡核苷酸的雜交而被誘導(dǎo)的信號(hào)。

根據(jù)一實(shí)例，各個(gè)與靶核酸序列有關(guān)的信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)是基于以依賴于與靶核酸序列特異性雜交的介導(dǎo)寡核苷酸的切割的方式形成二聚體的信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)。

根據(jù)一實(shí)例，在2個(gè)信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)中的至少一個(gè)信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)為以依賴于檢測(cè)寡核苷酸的切割的方式產(chǎn)生信號(hào)的信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)。

根據(jù)一實(shí)例，2個(gè)信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)均是以依賴于檢測(cè)寡核苷酸的切割的方式產(chǎn)生信號(hào)的信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)。

尤其，在使檢測(cè)寡核苷酸和靶核酸序列雜交后，基于檢測(cè)寡核苷酸的切割產(chǎn)生信號(hào)。

在使檢測(cè)寡核苷酸與靶核酸序列雜交后，基于上述檢測(cè)寡核苷酸的切割的信號(hào)可通過(guò)包括taqman探針?lè)椒?美國(guó)專利第5210015號(hào)及美國(guó)專利第5538848號(hào))的多種方法產(chǎn)生。

在通過(guò)taqman探針?lè)椒óa(chǎn)生上述信號(hào)的情況下，信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)包含用于擴(kuò)增靶核酸序列的引物組、具有適當(dāng)?shù)臉?biāo)志(例如，相互作用性雙重標(biāo)志)的taqman探針及具有5’-核酸酶活性的核酸聚合酶。在靶擴(kuò)增期間，與靶核酸序列雜交的taqman探針被切割，并產(chǎn)生表示上述靶核酸序列存在的信號(hào)。

通過(guò)taqman探針?lè)椒óa(chǎn)生信號(hào)的特定例包括如下的步驟，即，包括：步驟(a)，使引物組及具有適當(dāng)?shù)臉?biāo)志(例如，相互作用性雙重標(biāo)志)的taqman探針與靶核酸序列雜交的步驟；步驟(b)，使用上述步驟(a)的結(jié)果物及具有5’-核酸酶活性的核酸聚合酶，來(lái)擴(kuò)增靶核酸序列，上述taqman探針被切割而放出標(biāo)志；以及步驟(c)，從所放出的上述標(biāo)志檢測(cè)信號(hào)產(chǎn)生。

尤其，信號(hào)以依賴于與靶核酸序列特異性雜交的介導(dǎo)寡核苷酸的切割的方式借助檢測(cè)寡核苷酸的切割產(chǎn)生。

根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，在與靶核酸序列雜交的介導(dǎo)寡核苷酸被切割而放出片段的情況下，上述片段與檢測(cè)寡核苷酸特異性雜交，上述片段誘導(dǎo)檢測(cè)寡核苷酸的切割。

根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，在與靶核酸序列雜交的介導(dǎo)寡核苷酸被切割而放出片段的情況下，上述片段被延伸而切割包含與捕捉寡核苷酸互補(bǔ)的雜交核苷酸序列的檢測(cè)寡核苷酸。

基于以依賴于介導(dǎo)寡核苷酸的切割的方式的檢測(cè)寡核苷酸的切割的信號(hào)可通過(guò)包括invader分析(美國(guó)專利第5691142號(hào))、探測(cè)和標(biāo)標(biāo)記寡核苷酸切割及延伸-依賴性切割(ptocleavageandextension-dependentcleavage)方法(wo2012/134195)及在美國(guó)專利第7309573號(hào)中記載的方法等多種方法產(chǎn)生。尤其，在美國(guó)專利第7309573號(hào)中記載的方法可被視為使用基于切割的產(chǎn)生信號(hào)的基于探測(cè)和標(biāo)標(biāo)記寡核苷酸切割及延伸的方法中的一種。在上述探測(cè)和標(biāo)標(biāo)記寡核苷酸切割及延伸的方法中，檢測(cè)基于延伸鏈的形成的與捕捉和模板化寡核苷酸特異性雜交的寡核苷酸的切割，從而可檢測(cè)上述延伸鏈的形成。在invader分析中，借助介導(dǎo)寡核苷酸的切割形成片段，并且以無(wú)片段的延伸的方式誘導(dǎo)連續(xù)的切割反應(yīng)。

根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，在以依賴于檢測(cè)寡核苷酸的切割的方式產(chǎn)生信號(hào)的情況下，檢測(cè)寡核苷酸的切割誘導(dǎo)信號(hào)變化或者放出所要檢測(cè)的已標(biāo)志的片段。

在信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)不僅基于檢測(cè)寡核苷酸的切割產(chǎn)生信號(hào)，而且基于二聚體的形成而產(chǎn)生信號(hào)的情況下，只要上述信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)基于切割產(chǎn)生信號(hào)，就可被視為基于切割提供信號(hào)的信號(hào)發(fā)生機(jī)構(gòu)。

當(dāng)切割檢測(cè)寡核苷酸時(shí)，以依賴于檢測(cè)寡核苷酸的切割的方式產(chǎn)生信號(hào)的信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)產(chǎn)生信號(hào)，但是在相對(duì)較高檢測(cè)溫度及相對(duì)較低檢測(cè)溫度下檢測(cè)出的信號(hào)互不相同。檢測(cè)出的上述信號(hào)的差異(例如信號(hào)強(qiáng)度的差異)可以是與檢測(cè)寡核苷酸和靶核酸序列的雜交和/或標(biāo)志(例如，染料)的信號(hào)產(chǎn)生有關(guān)的基于溫度的影響的信號(hào)。在使用taqman探針?lè)椒ǖ膶?shí)施例中使用這種差異。

有趣地，在本發(fā)明中使用以依賴于不同的檢測(cè)溫度及檢測(cè)寡核苷酸的切割的方式產(chǎn)生信號(hào)的信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)(例如，taqman探針?lè)椒?，來(lái)可檢測(cè)2個(gè)靶序列。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)例，與靶核酸序列有關(guān)的信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)是基于檢測(cè)寡核苷酸的切割的信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)及基于二聚體的形成的信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)的組合。

根據(jù)一實(shí)例，檢測(cè)寡核苷酸包含至少一個(gè)標(biāo)志。

根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，檢測(cè)寡核苷酸可包含至少一個(gè)寡核苷酸。根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，當(dāng)檢測(cè)寡核苷酸包含多個(gè)寡核苷酸形成時(shí)，上述檢測(cè)寡核苷酸能夠以多種方式具有標(biāo)志。例如，多個(gè)寡核苷酸中的一個(gè)寡核苷酸可具有至少一個(gè)標(biāo)志、多個(gè)寡核苷酸均可具有至少一個(gè)標(biāo)志或者寡核苷酸的一個(gè)部位可具有至少一個(gè)標(biāo)志而其它部位能夠不具有標(biāo)志。

借助2個(gè)信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)產(chǎn)生的信號(hào)不被單一類型的檢測(cè)器分辨。術(shù)語(yǔ)“不被單一類型的檢測(cè)器分辨的信號(hào)”意味著因它們的相同或?qū)嵸|(zhì)上相同的信號(hào)特性(例如，光學(xué)特性、放出波長(zhǎng)及電信號(hào))不被單一類型的檢測(cè)器相互分辨。例如，針對(duì)2個(gè)靶核酸序列使用相同的標(biāo)志(例如，fam)且為了檢測(cè)從fam的放出波長(zhǎng)使用單一類型的檢測(cè)器時(shí)，則無(wú)法以分辨的方式檢測(cè)信號(hào)。

在本申請(qǐng)中所使用的術(shù)語(yǔ)“單一類型的信號(hào)”意味著提供相同或?qū)嵸|(zhì)相同的信號(hào)特性(例如，光學(xué)特性、放出波長(zhǎng)及電信號(hào))的信號(hào)。例如，fam及calfluor610提供不同類型的信號(hào)。

在本申請(qǐng)中所使用的術(shù)語(yǔ)“單一類型的檢測(cè)器”意味著用于單一類型的信號(hào)的檢測(cè)機(jī)構(gòu)。在包括用于多個(gè)不同類型的信號(hào)的多個(gè)通道(例如，光電二極管)的檢測(cè)器中，各個(gè)通道(例如，光電二極管)相當(dāng)于“單一類型的檢測(cè)器”。

根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，2個(gè)信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)包含相同的標(biāo)志，來(lái)自上述標(biāo)志的信號(hào)不被上述單一類型的檢測(cè)器分辨。

在本發(fā)明中，有用的標(biāo)志包括在本技術(shù)領(lǐng)域中公知的多種標(biāo)志。例如，在本發(fā)明中，有用的標(biāo)志包括單一標(biāo)志、相互作用性雙重標(biāo)志、嵌入染料及插入標(biāo)志(incorporatinglabel)。

例如，單一標(biāo)志包括熒光標(biāo)志、發(fā)光標(biāo)志、化學(xué)發(fā)光標(biāo)志、電化學(xué)標(biāo)志及金屬標(biāo)志。根據(jù)一實(shí)例，單一標(biāo)志根據(jù)是否存在于雙鏈或者是否存在于單鏈來(lái)提供不同的信號(hào)(例如，不同的信號(hào)強(qiáng)度)。根據(jù)一實(shí)例，上述單一標(biāo)志為熒光標(biāo)志。在本發(fā)明中所使用的單一熒光標(biāo)志的優(yōu)選種類及結(jié)合位點(diǎn)公開(kāi)在美國(guó)專利號(hào)第7537886號(hào)及美國(guó)專利號(hào)第7348141號(hào)中，且其相關(guān)教導(dǎo)事項(xiàng)包含在本說(shuō)明書(shū)中作為參照。例如，上述單一熒光標(biāo)志包含joe、fam、tamra、rox及基于熒光素的標(biāo)志。單一熒光標(biāo)志可通過(guò)多種方法與寡核苷酸相連接。例如，上述標(biāo)志可通過(guò)包含碳原子的隔區(qū)(例如，3-碳間隔區(qū)、6-碳間隔區(qū)或12-碳間隔區(qū))與探針相連接。

作為屬于大靶的相互作用性標(biāo)志系統(tǒng)，熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fret，fluorescenceresonanceenergytransfer)標(biāo)志系統(tǒng)包含熒光報(bào)道分子(供體分子)及猝滅分子(受體分子)。在熒光共振能量轉(zhuǎn)移中，能量供體可以為熒光性，能量受體可以為熒光性或非-熒光性。在相互作用性標(biāo)志系統(tǒng)的再一形態(tài)中，能量供體為非-熒光性，例如，發(fā)色團(tuán)(chromophore)，能量受體為熒光性。在相互作用性標(biāo)志系統(tǒng)的另一形態(tài)中，能量受體為發(fā)光性，例如為生物發(fā)光性、化學(xué)發(fā)光性或電化學(xué)反光性，受體為熒光性。相互作用性標(biāo)志系統(tǒng)包含基于“接觸-介導(dǎo)猝滅(oncontact-mediatedquenching)”的雙重標(biāo)志(salvatore等.,nucleicacidsresearch,2002(30)no.21e122及johansson等.,j.am.chem.soc2002(124)pp6950-6956)。相互作用性標(biāo)志系統(tǒng)包含基于至少2個(gè)分子(例如，染料)之間的相互作用誘導(dǎo)信號(hào)變化的任何標(biāo)志系統(tǒng)。

在本發(fā)明中，有用的報(bào)道分子及猝滅分子可包括在本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域中公知的任何分子。上述的具體例如下：cy2^tm(506)、yo-pro^tm-1(509)、yoyo^tm-1(509)、calcein(517)、fitc(518)、fluorx^tm(519)、alexa^tm(520)、rhodamine110(520)、oregongreen^tm500(522)、oregongreen^tm488(524)、ribogreen^tm(525)、rhodaminegreen^tm(527)、rhodamine123(529)、magnesiumgreen^tm(531)、calciumgreen^tm(533)、to-pro^tm-1(533)、toto1(533)、joe(548)、bodipy530/550(550)、dil(565)、bodipytmr(568)、bodipy558/568(568)、bodipy564/570(570)、cy3^tm(570)、alexa^tm546(570)、tritc(572)、magnesiumorange^tm(575)、phycoerythrinr&b(575)、rhodaminephalloidin(575)、calciumorange^tm(576)、pyroniny(580)、rhodamineb(580)、tamra(582)、rhodaminered^tm(590)、cy3.5^tm(596)、rox(608)、calciumcrimson^tm(615)、alexa^tm594(615)、texasred(615)、nilered(628)、yo-pro^tm-3(631)、yoyo^tm-3(631)、r-phycocyanin(642)、c-phycocyanin(648)、to-pro^tm-3(660)、toto3(660)、diddilc(5)(665)、cy5^tm(670)、thiadicarbocyanine(671)、cy5.5(694)、hex(556)、tet(536)、biosearchblue(447)、calfluorgold540(544)、calfluororange560(559)、calfluorred590(591)、calfluorred610(610)、calfluorred635(637)、fam(520)、fluorescein(520)、fluorescein-c3(520)、pulsar650(566)、quasar570(667)、quasar670(705)及quasar705(610)。括號(hào)內(nèi)的數(shù)字為納米單位的最大發(fā)光波長(zhǎng)。優(yōu)選地，報(bào)道分子-猝滅分子包含joe、fam、tamra、rox及基于熒光素的標(biāo)志。

在如下多種文獻(xiàn)中公開(kāi)適合的熒光分子及適合的報(bào)道-猝滅對(duì)：pesceetal.,editors,fluorescencespectroscopy(marceldekker,newyork,1971)；whiteetal.,fluorescenceanalysis:apracticalapproach(marceldekker,newyork,1970)；berlman,handbookoffluorescencespectraofaromaticmolecules,2^ndedition(academicpress,newyork,1971)；griffiths,colorandconstitutionoforganicmolecules(academicpress,newyork,1976)；bishop,editor,indicators(pergamonpress,oxford,1972)；haugland,handbookoffluorescentprobesandresearchchemicals(molecularprobes,eugene,1992)；pringsheim,fluorescenceandphosphorescence(intersciencepublishers,newyork,1949)；haugland,r.p.,handbookoffluorescentprobesandresearchchemicals,6thedition(molecularprobes,eugene,oreg.,1996)美國(guó)專利第3996345號(hào)及第4351760號(hào)。

留意如下：在本發(fā)明中，可使用能夠?qū)Χ喾N范圍的波長(zhǎng)或特定波長(zhǎng)的熒光進(jìn)行猝滅的非-熒光猝滅分子(例如，黑猝滅分子或黑暗猝滅劑)。

在包含報(bào)道分子及猝滅分子的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)中，報(bào)道分子包含熒光共振能量轉(zhuǎn)移的供體，猝滅分子包含熒光共振能量轉(zhuǎn)移的另一伙伴(受體)。例如，將熒光素染料(fluoresceindye)作為報(bào)道分子使用，將羅丹明染料(rhodaminedye)作為猝滅分子使用。

相互作用性雙重標(biāo)志可與二聚體中的一條鏈相連接。當(dāng)包含上述相互作用性雙重標(biāo)志的鏈以單鏈狀態(tài)存在時(shí)，上述鏈通過(guò)形成發(fā)夾或無(wú)規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)來(lái)誘導(dǎo)相互作用性雙重標(biāo)志之間的猝滅。當(dāng)上述鏈形成二聚體時(shí)，上述猝滅減少。擇一性地，當(dāng)上述相互作用性雙重標(biāo)志與位于鄰近鏈的位置的核苷酸相連接時(shí)，產(chǎn)生相互作用性雙重標(biāo)志之間的猝滅。在上述鏈形成二聚體并被切割的情況下，上述猝滅減少。

各個(gè)相互作用性雙重標(biāo)志可分別與二聚體的兩條鏈相連接。上述二聚體的形成誘導(dǎo)猝滅，二聚體的變形誘導(dǎo)進(jìn)行猝滅。選擇性地，在兩條鏈中的一條鏈被切割的情況下，可誘導(dǎo)進(jìn)行猝滅。

在本發(fā)明中作為有用的例示的嵌入染料包含sybr^tmgreeni、po-pro^tm-1、bo-pro^tm-1、syto^tm43、syto^tm44、syto^tm45、sytox^tmblue、popo^tm-1、popo^tm-3、bobo^tm-1、bobo^tm-3、lo-pro^tm-1、jo-pro^tm-1、yo-pro^tm1、to-pro^tm1、syto^tm11、syto^tm13、syto^tm15、syto^tm16、syto^tm20、syto^tm23、toto^tm-3、yoyo^tm3、gelstar^tm及噻唑橙。嵌入染料特異性地插入于雙鏈核酸分子內(nèi)來(lái)產(chǎn)生信號(hào)。

在產(chǎn)生信號(hào)過(guò)程中能夠以在延伸期間插入標(biāo)志的方式使用插入標(biāo)志(例如，plexor方法，sherrillcb,etal.,journaloftheamericanchemicalsociety,126:4550-45569(2004))。并且，在基于以依賴于與靶核酸序列雜交的介導(dǎo)寡核苷酸的切割的方式形成的二聚體的信號(hào)產(chǎn)生過(guò)程也可使用上述插入標(biāo)志。

通常，插入標(biāo)志可與核苷酸相結(jié)合。并且，還可使用具有非-天然堿基核苷酸。

在本申請(qǐng)中所使用的術(shù)語(yǔ)“非-天然堿基(non-naturalbase)”意味著如腺嘌呤(a)、鳥(niǎo)嘌呤(g)、胸腺嘧啶(t)、胞嘧啶(c)及尿嘧啶(u)等的天然堿基的衍生物，它們可形成氫鍵堿基對(duì)。在本申請(qǐng)中所使用的術(shù)語(yǔ)“非-天然堿基”作為母體化合物(mothercompound)包含具有與天然堿基不同的堿基對(duì)模式的堿基，例如，公開(kāi)于美國(guó)專利第5432272號(hào)、美國(guó)專利第5965364號(hào)、美國(guó)專利第6001983號(hào)及美國(guó)專利第6037120號(hào)中。非-天然堿基之間的堿基對(duì)與天然堿基相同，具有2個(gè)或3個(gè)氫鍵。并且，非-天然堿基之間的堿基對(duì)還以特定方式形成。在非-天然堿基的特定例中，在堿基對(duì)組合中包含如下堿基。iso-c/iso-g、iso-dc/iso-dg、k/x、h/j及m/n(參照美國(guó)專利第7422850號(hào))。

在通過(guò)探測(cè)和標(biāo)標(biāo)記寡核苷酸切割及延伸方法產(chǎn)生信號(hào)的情況下，在進(jìn)行延伸反應(yīng)期間插入的上述核苷酸可具有第一非-天然堿基，捕捉和模板化寡核苷酸可具有核苷酸，上述核苷酸具有對(duì)上述第一非-天然堿基產(chǎn)生特異性結(jié)合親和性的第二非-天然堿基。

在本申請(qǐng)中所使用的術(shù)語(yǔ)“靶核酸”、“靶核酸序列”或“靶序列”意味著所要檢測(cè)或定量的核酸序列。靶核酸序列不僅包含單鏈序列，還包含雙鏈序列。靶核酸序列不僅包含起初存在于核酸試樣內(nèi)的的序列，還包含在反應(yīng)中新生成的序列。

靶核酸序列可包含任意脫氧核糖核酸(基因組脫氧核糖核酸(gdna)及互補(bǔ)脫氧核糖核酸(cdna))及核糖核酸分子及它們的雜化體(嵌合核酸)。上述序列可以為雙鏈或單鏈形態(tài)。在作為初始物質(zhì)的核酸為雙鏈的情況下，優(yōu)選地，將上述兩條鏈制備成單鏈或部分單鏈形態(tài)。作為用于鏈分離的公知的方法包含加熱、堿、甲酰胺、尿素及乙二醛處理、酶方法(如解旋酶作用)及結(jié)合蛋白質(zhì)，但并不局限于此。例如，鏈分離可在80℃～105℃的溫度范圍下進(jìn)行加熱來(lái)實(shí)現(xiàn)。在文獻(xiàn)[josephsambrook,等,molecularcloning,alaboratorymanual,coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,n.y.(2001)]中公開(kāi)了用于實(shí)現(xiàn)這種處理的常規(guī)方法。

當(dāng)將信使核糖核酸(mrna)用作初始物質(zhì)時(shí)，在進(jìn)行退火步驟之前必需進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄步驟，在文獻(xiàn)[josephsambrook,etal.,molecularcloning,alaboratorymanual,coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,n.y.(2001)；及noonan,k.f.etal.,nucleicacidsres.16:10366(1988)]中確認(rèn)其相關(guān)詳細(xì)內(nèi)容。為了實(shí)現(xiàn)反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，可利用能夠與信使核糖核酸的聚腺苷酸尾雜交的寡核苷酸dt引物、隨機(jī)引物或靶特異性引物。

靶核酸序列包含任何天然原核細(xì)胞核酸、真核細(xì)胞核酸(例如，原生動(dòng)物和寄生蟲(chóng)、真菌類、酵母、高等植物、低等動(dòng)物及包含哺乳動(dòng)物和人類的高等動(dòng)物)、病毒(例如，皰疹病毒、人類免疫缺陷病毒(hiv)、流感病毒、eb病毒、肝炎病毒以及脊髓灰質(zhì)炎病毒等)核酸或類病毒核酸。并且，核酸分子可以為通過(guò)重組生產(chǎn)的或可生產(chǎn)的任何核酸分子或化學(xué)合成或可化學(xué)合成的任何核酸分子。因此，可自然發(fā)現(xiàn)或無(wú)法發(fā)現(xiàn)核酸分子。靶核酸序列可包含已知或未知的序列。

步驟(b):樣品和信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)的培養(yǎng)及信號(hào)檢測(cè)

與用于檢測(cè)2個(gè)靶核酸序列的第一信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)及第二信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)一同培養(yǎng)所要分析的樣品，在相對(duì)較高檢測(cè)溫度及相對(duì)較低檢測(cè)溫度下檢測(cè)來(lái)自上述第一信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)及第二信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)的信號(hào)。

根據(jù)一實(shí)例，設(shè)計(jì)各個(gè)相應(yīng)的用于檢測(cè)靶核酸序列的各個(gè)信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)，從而在存在相應(yīng)的靶核酸序列的相對(duì)較高檢測(cè)溫度及相對(duì)較低檢測(cè)溫度下均產(chǎn)生信號(hào)。

上述第一信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)及第二信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)在相對(duì)較高檢測(cè)溫度及相對(duì)較低檢測(cè)溫度下產(chǎn)生信號(hào)，由上述第一信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)及第二信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)產(chǎn)生的信號(hào)不被單一類型的檢測(cè)器分辨。

根據(jù)一實(shí)例，用于分析樣品的培養(yǎng)條件與用于獲取第一基準(zhǔn)值及第二基準(zhǔn)值的培養(yǎng)條件相同。

在進(jìn)行從信號(hào)檢測(cè)的多種信號(hào)特征，例如信號(hào)強(qiáng)度(例如，rfu(相對(duì)熒光單位)值或進(jìn)行擴(kuò)增的情況下，特定循環(huán)、被選擇的循環(huán)或在端點(diǎn)中的rfu值)、信號(hào)變化形狀(或圖案)或ct值或?qū)ι鲜鎏匦赃M(jìn)行數(shù)學(xué)處理來(lái)獲得的值。

根據(jù)一實(shí)例，與基準(zhǔn)值或樣品分析相關(guān)的術(shù)語(yǔ)“信號(hào)”不僅包含在檢測(cè)溫度下獲取的信號(hào)本省，而且包含通過(guò)對(duì)上述信號(hào)進(jìn)行數(shù)學(xué)處理，來(lái)提供的變形的信號(hào)。

根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，在通過(guò)實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)獲取擴(kuò)增曲線的情況下，為了確定靶的存在可選擇并使用從擴(kuò)增曲線的多種信號(hào)值(或特征)(強(qiáng)度ct值或擴(kuò)增曲線數(shù)據(jù))。

根據(jù)一實(shí)例，使用于靶核酸序列的存在的信號(hào)是顯著的信號(hào)。即，上述信號(hào)是以依賴于靶核酸序列的存在的方式產(chǎn)生的信號(hào)。根據(jù)一實(shí)例，可使用閾值來(lái)確定所檢測(cè)的信號(hào)的顯著性。例如，可考慮檢測(cè)器的背景信號(hào)、敏感度或所使用的標(biāo)志，來(lái)從陰性對(duì)照組預(yù)先確定閾值后，可確定信號(hào)的顯著性。

根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，可在伴隨核酸擴(kuò)增的信號(hào)擴(kuò)增過(guò)程中進(jìn)行步驟步驟(b)。根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，以無(wú)核酸擴(kuò)增的方式，在信號(hào)擴(kuò)增過(guò)程中進(jìn)行步驟(b)。

在本發(fā)明中，由信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)產(chǎn)生的信號(hào)可與靶擴(kuò)增一同進(jìn)行擴(kuò)增。選擇性地，信號(hào)可無(wú)靶擴(kuò)增地進(jìn)行擴(kuò)增。

根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，信號(hào)產(chǎn)生與靶擴(kuò)增一同在包含信號(hào)擴(kuò)增的過(guò)程中實(shí)施。

根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，根據(jù)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)實(shí)施靶擴(kuò)增。為了靶擴(kuò)增，在本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域中廣泛利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)包括靶序列的變性、靶序列和引物之間的退火(雜交)及引物延伸的循環(huán)(mullisetal.美國(guó)專利第4683195號(hào)、第4683202號(hào)及第4800159號(hào)；saikietal.,(1985)science230,1350-1354)。可通過(guò)在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的過(guò)程中適用上述的信號(hào)產(chǎn)生方法(例如，taqman方法及基于探測(cè)和標(biāo)標(biāo)記寡核苷酸切割及延伸的方法)來(lái)擴(kuò)增信號(hào)。根據(jù)一實(shí)例，本發(fā)明通過(guò)實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法提供信號(hào)。根據(jù)一實(shí)例，靶核酸序列的擴(kuò)增通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))、連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(lcr，參照wiedmannm,etal.,“l(fā)igasechainreaction(lcr)-overviewandapplications.”聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)methodsandapplications1994feb；3(4):s51-64)、缺口填補(bǔ)連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(glcr，參照wo第90/01069號(hào)、ep第439182號(hào)及wo第93/00447號(hào))、q-β復(fù)制酶擴(kuò)增(q-beta，cahillp,etal.,clinchem.,37(9):1482-5(1991)，美國(guó)專利第5556751號(hào))、鏈置換擴(kuò)增(sda，參照gtwalkeretal.,nucleicacidsres.20(7):1691-1696(1992)，ep第497272號(hào))、基于核酸序列的擴(kuò)增(nasba，參照compton,j.nature350(6313):912(1991))，轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增(tma，參照hofmannwpetal.,jclinvirol.32(4):289-93(2005)；美國(guó)專利第5888779號(hào))或滾環(huán)擴(kuò)增(rca，參照hutchisonc.a.etal.,proc.natlacad.sci.usa.102:17332-17336(2005))實(shí)施。

上述記載的擴(kuò)增方法可通過(guò)改變溫度或者重復(fù)未改變溫度的一序列反應(yīng)來(lái)擴(kuò)增靶序列。以“循環(huán)”表示包括重復(fù)一序列反應(yīng)的擴(kuò)增的單位。根據(jù)擴(kuò)增方法循環(huán)的單位能夠以重復(fù)次數(shù)或時(shí)間表示。

例如，可在擴(kuò)增的各循環(huán)、選擇的多個(gè)循環(huán)或反應(yīng)的端點(diǎn)中進(jìn)行信號(hào)檢測(cè)。根據(jù)一實(shí)例，在至少2個(gè)循環(huán)中檢測(cè)出信號(hào)的情況下，可在所有檢測(cè)溫度下或者在選擇一部分的檢測(cè)溫度下實(shí)施各個(gè)循環(huán)中的信號(hào)檢測(cè)。根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，在奇數(shù)的循環(huán)中，在相對(duì)較高檢測(cè)溫度下進(jìn)行檢測(cè)，在偶數(shù)的循環(huán)中，在相對(duì)較高檢測(cè)溫度下進(jìn)行檢測(cè)。

根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，在不僅可產(chǎn)生基于信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)的信號(hào)，而且可實(shí)現(xiàn)靶擴(kuò)增的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。

借助包含用于擴(kuò)增的引物組及核酸聚合酶的靶擴(kuò)增機(jī)構(gòu)實(shí)現(xiàn)靶核酸序列的擴(kuò)增。

根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，可使用具有核酸酶活性(例如，5’核酸酶活性或3’核酸酶活性)的核酸聚合酶。根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，可使用不具有核酸酶活性的核酸聚合酶。

本發(fā)明中，有用的核酸聚合酶為從各種細(xì)菌種得到的熱穩(wěn)定性脫氧核糖核酸聚合酶，上述脫氧核糖核酸聚合酶包含棲熱水生菌(thermusaquaticus(taq))、極端嗜熱菌(thermusthermophilus(tth))、絲狀棲熱菌(thermusfiliformis)、黃棲熱菌(thermisflavus)、超好熱性古細(xì)菌(thermocusliteralis)、典型嗜熱菌(thermusantranikianii)、卡德菲勒斯嗜熱菌(thermuscaldophilus)、切拉羅菲勒斯嗜熱菌(thermuschliarophilus)、黃棲熱菌(thermusflavus)、火地棲熱菌(thermusigniterrae)、嗜齒菌(thermuslacteus)、死亡嗜熱菌(thermusoshimai)、紅棲熱菌(thermusruber)、魯本斯棲熱菌(thermusrubens)、水生棲熱菌(thermusscotoductus)、西凡納斯熱袍(thermussilvanus)、棲熱菌種z05(thermusspeciesz05)、棲熱菌種sps17(thermusspeciessps17)、嗜熱菌(thermusthermophilus)、海棲熱袍菌(thermotogamaritima)、那不勒斯棲熱袍菌(thermotoganeapolitana)、非洲棲熱腔菌(thermosiphoafricanus)、嗜熱球菌(thermococuslitoralis)、巴羅西熱袍菌(thermococusbarossi)、嗜熱古細(xì)菌(thermococusgorgonarius)、海棲熱袍菌(thermotogamaritima)、那不勒斯棲熱袍菌(thermotoganeapolitana)、非洲棲熱腔菌(thermosiphoafricanus)、沃氏熱球菌(pyrococuswoesei)、掘越氏熱球菌(pyrococushorikoshii)、深海熱球菌(pyrococusabyssi)、隱蔽熱網(wǎng)菌(pyrodictiumoccultum)、嗜火產(chǎn)液菌(aquifexpyrophilus)以及菌屬超嗜熱菌(aquifexaeolieus)。尤其，熱穩(wěn)定性脫氧核糖核酸聚合酶為taq聚合酶。

根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，通過(guò)非對(duì)稱性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)實(shí)現(xiàn)靶核酸序列的擴(kuò)增?？赏ㄟ^(guò)考慮下游寡核苷酸的切割或雜交來(lái)選擇引物的比率。

根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，在無(wú)核酸擴(kuò)增的信號(hào)擴(kuò)增工序中進(jìn)行步驟(a)和/或步驟(b)。

在通過(guò)包括寡核苷酸的切割的方法產(chǎn)生信號(hào)的情況下，信號(hào)能夠以無(wú)靶擴(kuò)增的方式被擴(kuò)增。例如，雖然可通過(guò)cpt方法(duckp,etal.,biotechniques,9:142-148(1990)))，invader分析(美國(guó)專利第6358691號(hào)及第6194149號(hào))，基于探測(cè)和標(biāo)標(biāo)記寡核苷酸切割及延伸的方法(例如，探測(cè)和標(biāo)標(biāo)記寡核苷酸切割及延伸-依賴性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)寡核苷酸雜交方法、探測(cè)和標(biāo)標(biāo)記寡核苷酸切割及延伸-依賴性非雜交方法及pcec方法)或根據(jù)cer方法(wo2011/037306)使信號(hào)擴(kuò)增，但以不擴(kuò)增靶核酸序列的方式進(jìn)行上述步驟(a)。

上述的信號(hào)擴(kuò)增方法可通過(guò)改變溫度或者重復(fù)未改變溫度的一序列反應(yīng)來(lái)擴(kuò)增靶序列。以“循環(huán)”表示包括重復(fù)一序列反應(yīng)的信號(hào)擴(kuò)增的單位。根據(jù)擴(kuò)增方法，循環(huán)的單位能夠以重復(fù)次數(shù)或時(shí)間表示。

例如，可在擴(kuò)增的各循環(huán)、選擇的多個(gè)循環(huán)或反應(yīng)的端點(diǎn)中進(jìn)行信號(hào)的產(chǎn)生及檢測(cè)。

為了產(chǎn)生信號(hào)，針對(duì)樣品，在與兩個(gè)信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)進(jìn)行培養(yǎng)(反應(yīng))期間或反應(yīng)之后，可通過(guò)使用單一類型的檢測(cè)器，來(lái)檢測(cè)產(chǎn)生的信號(hào)。

根據(jù)一實(shí)例，考慮可借助信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)產(chǎn)生信號(hào)的溫度范圍來(lái)預(yù)先確定針對(duì)靶核酸序列的檢測(cè)溫度。

在本發(fā)明中，利用存在能夠以依賴于信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)的方式產(chǎn)生信號(hào)的特定溫度范圍。

例如，當(dāng)2個(gè)核酸分子雜交(或結(jié)合)時(shí)，信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)產(chǎn)生信號(hào)，當(dāng)它們之間非-雜交(或解離)時(shí)，在不產(chǎn)生信號(hào)的情況下，雖然在可實(shí)現(xiàn)2個(gè)核酸分子的雜交的溫度下產(chǎn)生信號(hào)，但在2個(gè)核酸分子未進(jìn)行雜交的溫度下不產(chǎn)生信號(hào)。如上所述地，存在可產(chǎn)生信號(hào)(即，信號(hào)檢測(cè))的特定溫度范圍及不產(chǎn)生信號(hào)的其他溫度范圍。上述溫度范圍受在信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)所使用的2個(gè)核酸分子的雜交物的tm值的影響。

在利用信號(hào)產(chǎn)生方法的情況下，上述信號(hào)產(chǎn)生方法使用切割后具有標(biāo)志的所放出的片段，在理論上，可在任何溫度(例如，30～99℃)下檢測(cè)信號(hào)。

檢測(cè)溫度選自可由信號(hào)發(fā)生機(jī)構(gòu)產(chǎn)生信號(hào)的溫度范圍。

根據(jù)一實(shí)例，用于檢測(cè)靶核酸序列的信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)可以為在2個(gè)檢測(cè)溫度下提供互不相同的信號(hào)(例如，信號(hào)強(qiáng)度)的信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)。

根據(jù)一實(shí)例，在利用以依賴于檢測(cè)寡核苷酸的切割的方式產(chǎn)生信號(hào)的信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)(例如，taqman探針?lè)椒?情況下，在從信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)的信號(hào)中，從檢測(cè)寡核苷酸和靶核酸序列的雜交及染料的信號(hào)的產(chǎn)生可受到溫度的影響的問(wèn)題上，可根據(jù)檢測(cè)溫度不同。例如，利用熒光報(bào)道分子及猝滅分子標(biāo)志的探針可根據(jù)檢測(cè)溫度產(chǎn)生不同的信號(hào)，與相對(duì)較高檢測(cè)溫度相比，可在相對(duì)較低檢測(cè)溫度下產(chǎn)生更高的信號(hào)。

與此相關(guān)地，本發(fā)明通過(guò)使用以依賴于不同的檢測(cè)溫度及檢測(cè)寡核苷酸的切割的方式產(chǎn)生信號(hào)的信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)，來(lái)可檢測(cè)2個(gè)靶序列。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)例，2個(gè)信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)均是基于檢測(cè)寡核苷酸的切割的信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)。

檢測(cè)溫度選自可由上述信號(hào)發(fā)生機(jī)構(gòu)產(chǎn)生信號(hào)的溫度范圍。術(shù)語(yǔ)“檢測(cè)溫度范圍”是為了特別記述可實(shí)現(xiàn)信號(hào)產(chǎn)生(即，信號(hào)檢測(cè))的溫度范圍而使用。

根據(jù)本發(fā)明，可通過(guò)考慮信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)來(lái)分配用于檢測(cè)各個(gè)靶核酸序列的存在的溫度。

根據(jù)一實(shí)例，可預(yù)先確定進(jìn)行檢測(cè)的相對(duì)較高檢測(cè)溫度及相對(duì)較低檢測(cè)溫度。例如，作為相對(duì)較高檢測(cè)溫度及相對(duì)較低檢測(cè)溫度分別預(yù)先確定為72℃及60℃后，制作適合上述檢測(cè)溫度的信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)。

根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，在信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)以依賴于二聚體形成的方式產(chǎn)生信號(hào)的情況下，基于二聚體的tm選擇上述檢測(cè)溫度。

根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，在信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)以依賴于二聚體形成的方式產(chǎn)生信號(hào)的情況下，可通過(guò)調(diào)節(jié)二聚體的tm值來(lái)控制檢測(cè)溫度。

例如，在基于與靶核酸序列特異性雜交的檢測(cè)寡核苷酸(例如，lux探針、分子信標(biāo)探針、hybecon探針及相鄰的雜交探針)產(chǎn)生信號(hào)的情況下，通過(guò)調(diào)節(jié)寡核苷酸的二聚體的tm值，來(lái)在預(yù)先確定的溫度下成功地實(shí)現(xiàn)信號(hào)的檢測(cè)。在使用蝎形引物的情況下，通過(guò)調(diào)節(jié)與延伸鏈雜交的部位的tm值，來(lái)在預(yù)先確定的溫度下成功地實(shí)現(xiàn)上述信號(hào)的檢測(cè)。

在基于根據(jù)靶核酸序列的存在形成的二聚體來(lái)產(chǎn)生信號(hào)的情況下，通過(guò)調(diào)節(jié)二聚體的tm值，來(lái)在預(yù)先確定的溫度下成功地實(shí)現(xiàn)信號(hào)的檢測(cè)。例如，在通過(guò)探測(cè)和標(biāo)標(biāo)記寡核苷酸切割及延伸方法產(chǎn)生信號(hào)的情況下，在捕捉和模板化寡核苷酸上通過(guò)調(diào)節(jié)通過(guò)探測(cè)和標(biāo)標(biāo)記寡核苷酸片段的延伸形成的延伸二聚體的tm值，來(lái)在預(yù)先確定的溫度下成功地實(shí)現(xiàn)信號(hào)的檢測(cè)。

基于探測(cè)和標(biāo)標(biāo)記寡核苷酸切割及延伸的方法具有可容易調(diào)節(jié)二聚體及通過(guò)上述二聚體對(duì)雜交起到影響的第三雜化體的tm值的優(yōu)點(diǎn)。

根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，在信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)以依賴于檢測(cè)寡核苷酸的切割的方式產(chǎn)生信號(hào)的情況下，雖然通過(guò)切割放出的標(biāo)志放出信號(hào)，但是，由于檢測(cè)寡核苷酸和靶核酸序列的雜交，因此可基于檢測(cè)寡核苷酸的tm值來(lái)選擇。

在本發(fā)明中所使用的檢測(cè)器包括可檢測(cè)信號(hào)的任何機(jī)構(gòu)。例如，在使用熒光信號(hào)的情況下，可將適合于檢測(cè)熒光信號(hào)的的光電二極管作為檢測(cè)器使用。使用單一類型的檢測(cè)器的檢測(cè)意味著可檢測(cè)單一類型的信號(hào)的檢測(cè)器或使用包含括多種通道(即，光電二極管)的檢測(cè)器的各通道(即，光電二極管)來(lái)進(jìn)行檢測(cè)。

根據(jù)一實(shí)例，信號(hào)的產(chǎn)生包括從標(biāo)志“產(chǎn)生或消滅信號(hào)”以及“增加或減少信號(hào)”

在本申請(qǐng)中所使用的術(shù)語(yǔ)“試樣”包括生物學(xué)樣品(例如，從生物學(xué)供給源的細(xì)胞、組織及流體)及非-生物學(xué)樣品(例如，食品、水及土壤)。生物學(xué)樣品包含病毒、細(xì)菌、組織、細(xì)胞、血液、血清、血漿、淋巴、痰、swap、吸入物、支氣管肺泡清洗液、牛奶、小便、糞便、眼內(nèi)液、唾液、精液、腦提取物、脊髓液(scf)、闌尾、脾臟及扁桃組織提取物、羊水及腹水，但并不限定于此。并且，樣品包含從生物學(xué)供給源絕緣的核酸分子及合成的核酸分子。

在進(jìn)行步驟(a)之間，可進(jìn)行步驟(b)，這對(duì)于本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的。因此，那種變化及變形屬于附加的發(fā)明要求保護(hù)范圍及其的等同范圍確定的本發(fā)明的范圍。

步驟(c):基于基準(zhǔn)值及信號(hào)的靶核酸序列的存在的確定

最后，根據(jù)在基準(zhǔn)值中的至少一個(gè)及在步驟(b)中檢測(cè)出的信號(hào)確定2個(gè)靶核酸序列中的至少一個(gè)靶核酸序列的存在。

根據(jù)一實(shí)例，在根據(jù)2個(gè)基準(zhǔn)值(即，第一基準(zhǔn)值及第二基準(zhǔn)值)檢測(cè)2個(gè)靶核酸序列中使用本發(fā)明的方法。

與靶核酸序列的存在的確定相關(guān)，在本申請(qǐng)中所使用的術(shù)語(yǔ)“根據(jù)基準(zhǔn)值及信號(hào)”意味著通過(guò)直接或間接使用在步驟(a)中提供的基準(zhǔn)值及從信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)產(chǎn)生的信號(hào)或進(jìn)行變形或進(jìn)行數(shù)學(xué)處理(包括使用基準(zhǔn)值及信號(hào)的數(shù)值或它們的變形，使用基準(zhǔn)值的范圍、對(duì)基準(zhǔn)值及信號(hào)進(jìn)行繪制以及使用信號(hào)的存在/不存在)，來(lái)確定靶核酸序列的存在。在術(shù)語(yǔ)“根據(jù)基準(zhǔn)值及信號(hào)”及“使用基準(zhǔn)值及信號(hào)“之間無(wú)任何意圖的差異，這些術(shù)語(yǔ)可相互交換使用。

可通過(guò)使用在步驟(a)中提供的基準(zhǔn)值中的至少一個(gè)及在步驟(b)中檢測(cè)出的信號(hào)，來(lái)確定在2個(gè)靶核酸序列中的至少一個(gè)靶核酸序列的存在，由此如下形成進(jìn)一步準(zhǔn)確地確定。

根據(jù)一實(shí)例，根據(jù)第二基準(zhǔn)值及在相對(duì)較高檢測(cè)溫度及相對(duì)較低檢測(cè)溫度下，在步驟(b)中檢測(cè)出的信號(hào)確定樣品內(nèi)第一靶核酸序列的存在，根據(jù)第一基準(zhǔn)值及在相對(duì)較高檢測(cè)溫度及相對(duì)較低檢測(cè)溫度下，在步驟(b)中檢測(cè)出的信號(hào)確定樣品內(nèi)第二靶核酸序列的存在。

根據(jù)一實(shí)例，根據(jù)第二基準(zhǔn)值及利用在步驟(b)中檢測(cè)出的信號(hào)計(jì)算的差異確定樣品內(nèi)第一靶核酸序列的存在，根據(jù)第一基準(zhǔn)值及在相對(duì)較高檢測(cè)溫度及利用在步驟(b)中檢測(cè)出的信號(hào)計(jì)算的差異確定樣品內(nèi)第二靶核酸序列的存在。

更尤其，確定第一靶核酸序列的存在的步驟包括如下的步驟：通過(guò)在第二基準(zhǔn)值及步驟(b)中檢測(cè)出的信號(hào)進(jìn)行處理，來(lái)去除由第二信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)產(chǎn)生的信號(hào)，并確定基于第一信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)的信號(hào)的產(chǎn)生；確定第二靶核酸序列的存在的步驟包括如下的步驟：通過(guò)在第一基準(zhǔn)值及步驟(b)中檢測(cè)出的信號(hào)進(jìn)行處理，來(lái)去除由第一信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)產(chǎn)生的信號(hào)，并確定基于第二信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)的信號(hào)的產(chǎn)生。

更尤其，在去除由第二信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)產(chǎn)生的信號(hào)的步驟中，以數(shù)學(xué)方式從在步驟(b)中檢測(cè)出的信號(hào)去除由第二信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)產(chǎn)生的信號(hào)，在去除由第一信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)產(chǎn)生的信號(hào)的步驟中，以數(shù)學(xué)方式從在步驟(b)中檢測(cè)出的信號(hào)去除由第一信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)產(chǎn)生的信號(hào)。

更尤其，根據(jù)第一基準(zhǔn)值及在相對(duì)較高檢測(cè)溫度下檢測(cè)出的信號(hào)，從在相對(duì)較低檢測(cè)溫度下檢測(cè)出的信號(hào)去除由第二信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)在相對(duì)較低檢測(cè)溫度下產(chǎn)生的信號(hào)，由此確定第一信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)在相對(duì)較低檢測(cè)溫度下是否產(chǎn)生信號(hào)，這是證明第一靶核酸序列的存在或不存在。

例如，在2個(gè)檢測(cè)溫度下，通過(guò)計(jì)算借助第二信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)所提供的信號(hào)之間的比率，來(lái)獲取第二基準(zhǔn)值的情況下，可在相對(duì)較低檢測(cè)溫度下檢測(cè)出的信號(hào)中減去值，來(lái)確定基于第一信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)的在相對(duì)較低檢測(cè)溫度下的產(chǎn)生的信號(hào)；通過(guò)在相對(duì)較高檢測(cè)溫度下檢測(cè)出的信號(hào)乘以第二基準(zhǔn)值或在相對(duì)較高檢測(cè)溫度下檢測(cè)出的信號(hào)除以第二基準(zhǔn)值來(lái)獲取上述值。

根據(jù)一實(shí)例，根據(jù)基準(zhǔn)值“乘以”或“除以”在檢測(cè)溫度下檢測(cè)出的信號(hào)是根據(jù)計(jì)算上述比率的方法不同。

更尤其，根據(jù)第二基準(zhǔn)值及在相對(duì)較低檢測(cè)溫度下檢測(cè)出的信號(hào)，從在相對(duì)較檢測(cè)溫度下檢測(cè)出的信號(hào)去除由第二信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)在相對(duì)較低檢測(cè)溫度下產(chǎn)生的信號(hào)，由此確定第一信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)在相對(duì)較低檢測(cè)溫度下是否產(chǎn)生信號(hào)，這是證明第一靶核酸序列的存在或不存在。

例如，在2個(gè)檢測(cè)溫度下，通過(guò)計(jì)算借助第二信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)所提供的信號(hào)之間的比率，來(lái)獲取第二基準(zhǔn)值的情況下，可從在相對(duì)較高檢測(cè)溫度下檢測(cè)出的信號(hào)減去值，來(lái)確定基于第一信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)的在相對(duì)較高檢測(cè)溫度下的產(chǎn)生的信號(hào)；通過(guò)在相對(duì)較低檢測(cè)溫度下檢測(cè)出的信號(hào)乘以第二基準(zhǔn)值或在相對(duì)較低檢測(cè)溫度下檢測(cè)出的信號(hào)除以第二基準(zhǔn)值來(lái)獲取上述值。

更尤其，根據(jù)第以基準(zhǔn)值及在相對(duì)較高檢測(cè)溫度下檢測(cè)出的信號(hào)，從在相對(duì)較低檢測(cè)溫度下檢測(cè)出的信號(hào)去除由第一信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)在相對(duì)較低檢測(cè)溫度下產(chǎn)生的信號(hào)，由此確定第二信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)在相對(duì)較低檢測(cè)溫度下是否產(chǎn)生信號(hào)，

例如，在2個(gè)檢測(cè)溫度下，通過(guò)計(jì)算借助第一信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)所提供的信號(hào)之間的比率，來(lái)獲取第一基準(zhǔn)值的情況下，可從在相對(duì)較低檢測(cè)溫度下檢測(cè)出的信號(hào)減去值，來(lái)確定基于第二信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)的在相對(duì)較低檢測(cè)溫度下的產(chǎn)生的信號(hào)；通過(guò)在相對(duì)較高檢測(cè)溫度下檢測(cè)出的信號(hào)乘以第一基準(zhǔn)值或在相對(duì)較高檢測(cè)溫度下檢測(cè)出的信號(hào)除以第一基準(zhǔn)值來(lái)獲取上述值。

更尤其，根據(jù)第一基準(zhǔn)值及在相對(duì)較低檢測(cè)溫度下檢測(cè)出的信號(hào)，從在相對(duì)較高檢測(cè)溫度下檢測(cè)出的信號(hào)去除借助第一信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)在相對(duì)較高檢測(cè)溫度下產(chǎn)生的信號(hào)，由此確定第二信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)在相對(duì)較高檢測(cè)溫度下是否產(chǎn)生信號(hào)。

例如，在2個(gè)檢測(cè)溫度下，通過(guò)計(jì)算借助第一信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)所提供的信號(hào)之間的比率，來(lái)獲取第一基準(zhǔn)值的情況下，可從在相對(duì)較高檢測(cè)溫度下檢測(cè)出的信號(hào)減去值，來(lái)確定基于第二信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)的在相對(duì)較高檢測(cè)溫度下的產(chǎn)生的信號(hào)；通過(guò)在相對(duì)較低檢測(cè)溫度下檢測(cè)出的信號(hào)乘以第一基準(zhǔn)值或在相對(duì)較低檢測(cè)溫度下檢測(cè)出的信號(hào)除以第一基準(zhǔn)值來(lái)獲取上述值。

如下，參照實(shí)施例1對(duì)成為本發(fā)明的基本的實(shí)施原理進(jìn)行說(shuō)明。

在實(shí)施例1中，培養(yǎng)第一靶核酸序列(淋球菌)及第一信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)后，在相對(duì)較低檢測(cè)溫度(l)及相對(duì)較高檢測(cè)溫度(h)下測(cè)定信號(hào)。計(jì)算相對(duì)于借助第一信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)所提供的在相對(duì)較低檢測(cè)溫度下的檢測(cè)出的信號(hào)(ftl)的、借助第一信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)所提供的在相對(duì)較高檢測(cè)溫度下的檢測(cè)出的信號(hào)(fth)的比率，最終，將上述用作與第一靶核酸序列有關(guān)的第一基準(zhǔn)值(淋球菌的rv＝rvf＝(ftl)÷(fth)＝1.8)。

培養(yǎng)第二靶核酸序列(沙眼衣原體)及第二信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)后，在相對(duì)較低檢測(cè)溫度(l)及相對(duì)較高檢測(cè)溫度(h)下測(cè)定信號(hào)。計(jì)算相對(duì)于借助第二信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)所提供的在相對(duì)較低檢測(cè)溫度下的檢測(cè)出的信號(hào)(stl)的借助第二信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)所提供的在相對(duì)較高檢測(cè)溫度下的檢測(cè)出的信號(hào)(sth)的比率，最終，將上述用作與第二靶核酸序列有關(guān)的第二基準(zhǔn)值(沙眼衣原體的rv＝rvs＝(stl)÷(sth)＝5.8)。

在與第一信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)及第二信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)培養(yǎng)樣品的情況下，分別以fh及fl表示在相對(duì)較高檢測(cè)溫度及相對(duì)較低檢測(cè)溫度下檢測(cè)出的熒光信號(hào)。

如實(shí)施例1，在根據(jù)比率提供與靶核酸序列有關(guān)的基準(zhǔn)值的情況下，為了確定第一信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)在相對(duì)較低檢測(cè)溫度下是否產(chǎn)生信號(hào)，可提供如下式(參照?qǐng)D1c及(ii)：fl－(fh×rvs)。

能夠以在相對(duì)較高檢測(cè)溫度下從第一靶核酸序列的信號(hào)(fth)及從第二靶核酸序列的信號(hào)(sth)之和表示樣品內(nèi)的fh，能夠以在相對(duì)較低檢測(cè)溫度下從第一靶核酸序列的信號(hào)(ftl)及從第二靶核酸序列的信號(hào)(stl)之和表示樣品內(nèi)的fl：fh＝fth+sth及fl＝ftl+stl。

可如下表示fl－(fh×rvs)：

fl–(fh×rvs)＝(ftl+stl)–((fth+sth)×rvs)

＝ftl－rvs×fth+stl－rvs×sth

＝ftl－5.8×fth+stl－5.8×sth。

在樣品包含第二靶核酸序列的情況下，實(shí)際上(stl－5.8×sth)可顯示0的值，這是因?yàn)閞vs＝stl/sth＝5.8。

在樣品中不存在第二靶核酸序列的情況下，實(shí)際上(stl－5.8×sth)可顯示0的值，這是因?yàn)閷?shí)際上stl及sth的值為0。

在樣品包含第一靶核酸序列的情況下，(ftl－5.8×fth)可顯示負(fù)值，這是因?yàn)樵?ftl－5.8×fth)中使用5.8的基準(zhǔn)值，相反地，第一靶核酸的第一基準(zhǔn)值為1.8。

因此，在(ftl－5.8×fth)顯示負(fù)值的情況下，確定為樣品包含第一靶核酸序列(參照?qǐng)D1c)。

在樣品內(nèi)不存在第一靶核酸序列的情況下，實(shí)際上(ftl－5.8×fth)可顯示0的值(參照?qǐng)D1c)。

選擇性地，為了確定樣品內(nèi)第二靶核酸序列的存在，即，為了確定第二信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)在相對(duì)較低檢測(cè)溫度下是否產(chǎn)生信號(hào)，可提供如下式(參照?qǐng)D1d及(i)：fl－(fh×rvf)。

可如下表示fl－(fh×rvf)：

fl－(fh×rvf)＝(ftl+stl)－((fth+sth)×rvf)

＝ftl－rvf×fth+stl－rvf×sth

＝ftl－1.8×fth+stl－1.8×sth。

在樣品包含第二靶核酸序列的情況下，實(shí)際上ftl－1.8×fth可顯示0的值，這是因?yàn)閞vf＝ftl/fth＝1.8。

在樣品中不存在第一靶核酸序列的情況下，實(shí)際上(ftl－1.8×fth)可顯示0的值，這是因?yàn)閷?shí)際上ftl及fth的值為0。

在樣品包含第二靶核酸序列的情況下，(stl－1.8×sth)可顯示正值，這是因?yàn)樵?stl－1.8×sth)中使用1.8的基準(zhǔn)值，相反地，與第二靶核酸有關(guān)的基準(zhǔn)值為5.8。

因此，在(stl－1.8×sth)顯示正值的情況下，確定為樣品包含第二靶核酸序列(參照?qǐng)D1d)。

在樣品內(nèi)不存在第二靶核酸序列的情況下，實(shí)際上(stl－1.8×sth)可顯示0的值(參照?qǐng)D1d)。

通過(guò)在上述的相對(duì)較低檢測(cè)溫度下分析信號(hào)，來(lái)當(dāng)考慮檢測(cè)靶核酸序列的原理時(shí)，如下通過(guò)分析在相對(duì)較高檢測(cè)溫度下的信號(hào)，來(lái)可實(shí)現(xiàn)靶核酸序列的檢測(cè)。

例如，為了確定第一信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)在相對(duì)較高檢測(cè)溫度下是否產(chǎn)生信號(hào)，提供以下式(參照?qǐng)D1c及(i))：fh－(fl÷rvs)。

選擇性地，為了確定樣品內(nèi)第二靶核酸序列的存在，即，為了確定第二信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)在相對(duì)較高檢測(cè)溫度下是否產(chǎn)生信號(hào)，可提供如下式(參照?qǐng)D1d及(ii)：fh–(fl÷rvf)。

當(dāng)考慮上述的實(shí)例時(shí)，本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可理解如下：計(jì)算相對(duì)于借助信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)所提供的在相對(duì)較高檢測(cè)溫度下的檢測(cè)出的信號(hào)(fth)的、借助信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)所提供的在相對(duì)較低檢測(cè)溫度下的檢測(cè)出的信號(hào)(ftl)的比率，并且將此用作基準(zhǔn)值(即，rv＝(fth)÷(ftl))，來(lái)根據(jù)本發(fā)明的方法確定核酸序列的存在或不存在。

根據(jù)一實(shí)例，本發(fā)明為了確定基于上述式的計(jì)算結(jié)果的顯著性，還使用閾值。根據(jù)所選擇的式可適用不同的閾值。根據(jù)一實(shí)例，為了相互補(bǔ)充基準(zhǔn)值可選擇閾值。

根據(jù)一實(shí)例，與基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的靶擴(kuò)增相關(guān)，在以實(shí)時(shí)方式產(chǎn)生信號(hào)的情況下，利用基準(zhǔn)值處理在各個(gè)擴(kuò)增循環(huán)或一部分已選擇的循環(huán)中的信號(hào)，并針對(duì)循環(huán)繪制計(jì)算結(jié)果，來(lái)使用于確定靶核酸序列的存在。

根據(jù)一實(shí)例，一個(gè)反應(yīng)容器還包括至少一個(gè)附加裝置，上述至少一個(gè)附加裝置分別包括用于檢測(cè)除了上述2個(gè)靶核酸序列之外的靶核酸序列的額外的2個(gè)信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)；由容器內(nèi)的2個(gè)信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)中的各個(gè)裝置產(chǎn)生的信號(hào)被區(qū)分，并借助不同類型的檢測(cè)器分別檢測(cè)上述信號(hào)。例如，當(dāng)以fam標(biāo)志上述步驟(b)中的兩個(gè)信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)且以quasar570標(biāo)志額外的2個(gè)信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)時(shí)，在上述容器中由被fam-標(biāo)志的信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)產(chǎn)生的信號(hào)與由quasar570-標(biāo)志的信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)產(chǎn)生的信號(hào)相互分辨，因此為了檢測(cè)2個(gè)不同的放出光需要2種類型的檢測(cè)器。

根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，上述2個(gè)靶核酸序列包含核苷酸變異，上述2個(gè)靶核酸序列中的一個(gè)包含一種類型的核苷酸變異，另一個(gè)包含另一類型的核苷酸變異。

在本說(shuō)明書(shū)中所使用的術(shù)語(yǔ)“核苷酸變異”意味著在類似的連續(xù)的脫氧核糖核酸片段中特定位置的脫氧核糖核酸序列中的任意單一或多個(gè)核苷酸置換、缺失或插入。這種連續(xù)的脫氧核糖核酸片段包含一個(gè)基因或一個(gè)基因或染色體的任意其他部位。這種核苷酸變異可以為突變或多態(tài)性等位基因變異。例如，在本發(fā)明中檢測(cè)的核苷酸變異包括單核苷酸多態(tài)性(snp)、突變、缺失、插入、置換以及移位。例示的核苷酸變異的例包括人類基因組內(nèi)的各種變異(例如，在亞甲基四氫葉酸還原酶(mthfr)基因中的變異)、與病原體的藥劑耐性相關(guān)的變異以及腫瘤形成誘發(fā)變異。在本申請(qǐng)中所使用的術(shù)語(yǔ)核苷酸變異包含核酸序列的特定位置的任意變異。即，術(shù)語(yǔ)核苷酸變異包含核酸序列的特定位置的野生型及其任意突變型。

根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，通過(guò)本發(fā)明檢測(cè)出的核苷酸變異是單核苷酸多態(tài)性(snp)。

根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，通過(guò)使用第一信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)，來(lái)檢測(cè)由第一單核苷酸多態(tài)性等位基因構(gòu)成的純合子，通過(guò)使用第二信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)，來(lái)檢測(cè)由第二單核苷酸多態(tài)性等位基因構(gòu)成的純合子，通過(guò)使用第一信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)及第二信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)，來(lái)檢測(cè)由第一單核苷酸多態(tài)性等位基因及第二單核苷酸多態(tài)性等位基因構(gòu)成的雜合子。

在成為本發(fā)明的基礎(chǔ)的實(shí)施原理下，本發(fā)明的方法可適用于在3個(gè)靶核酸序列中的至少一個(gè)靶核酸序列的檢測(cè)。

例如，3個(gè)靶核酸序列包含第一靶核酸序列、第二靶核酸序列及第3靶核酸序列。其中，可如下檢測(cè)第一靶核酸序列。

在綜合性的作為單一靶考慮第二靶核酸序列及第三靶核酸序列的情況下，可通過(guò)與第二信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)及第三信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)一同培養(yǎng)第二靶核酸序列及第三靶核酸序列，來(lái)獲取與上述單一靶有關(guān)的綜合性基準(zhǔn)值。選擇性地，與第二靶核酸序列有關(guān)的第二基準(zhǔn)值或與第三靶核酸序列有關(guān)的第三基準(zhǔn)值中的一種可用作綜合性基準(zhǔn)值。

然后，可根據(jù)上述綜合性基準(zhǔn)值及在2個(gè)檢測(cè)溫度下檢測(cè)出的信號(hào)確定第一靶核酸序列的存在或不存在。

并且，可根據(jù)與第一靶核酸序列有關(guān)的檢測(cè)接近法確定各個(gè)第二靶核酸序及第三靶核酸序列的存在或不存在。

ii.使用不同檢測(cè)溫度及基準(zhǔn)值來(lái)分析樣品內(nèi)核酸序列的單核苷酸多態(tài)性基因型分析

在本發(fā)明的另一實(shí)施方式中，提供包括以下步驟的使用不同檢測(cè)溫度及基準(zhǔn)值來(lái)分析樣品內(nèi)核酸序列的單核苷酸多態(tài)性(snp)基因型分析方法。

步驟(a)，提供如下：(i)與純合子有關(guān)的第一基準(zhǔn)值，上述純合子由借助第一信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)表示在相對(duì)較高檢測(cè)溫度及相對(duì)較低檢測(cè)溫度下所提供的信號(hào)變化的關(guān)系的第一單核苷酸多態(tài)性等位基因構(gòu)成；(ii)與純合子有關(guān)的第二基準(zhǔn)值，上述純合子由借助第二信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)表示在相對(duì)較高檢測(cè)溫度及相對(duì)較低檢測(cè)溫度下所提供的信號(hào)變化的關(guān)系的第二單核苷酸多態(tài)性等位基因構(gòu)成；以及(iii)與雜合子有關(guān)的第三基準(zhǔn)值，上述雜合子由借助第一信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)及第二信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)表示在相對(duì)較高檢測(cè)溫度及相對(duì)較低檢測(cè)溫度下所提供的信號(hào)變化的關(guān)系的第一單核苷酸多態(tài)性等位基因及第二單核苷酸多態(tài)性等位基因構(gòu)成；上述第一基準(zhǔn)值、上述第二基準(zhǔn)值及上述第三基準(zhǔn)值互不相同；步驟(b)，與用于上述單核苷酸多態(tài)性等位基因的第一信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)及第二信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)一同培養(yǎng)樣品，并在相對(duì)較高檢測(cè)溫度及相對(duì)較低檢測(cè)溫度下檢測(cè)來(lái)自2個(gè)信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)的信號(hào)；上述第一信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)及第二信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)在相對(duì)較高檢測(cè)溫度及相對(duì)較低檢測(cè)溫度下產(chǎn)生信號(hào)；由上述第一信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)及第二信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)產(chǎn)生的信號(hào)不被單一類型的檢測(cè)器分辨；以及步驟(c)，根據(jù)上述基準(zhǔn)值及在上述步驟(b)中在相對(duì)較高檢測(cè)溫度及相對(duì)較低檢測(cè)溫度下檢測(cè)出的信號(hào)之間的差異，來(lái)確定單核苷酸多態(tài)性基因型。

在原則上本發(fā)明基于上述的本發(fā)明的第一實(shí)施方式，因此，為了避免導(dǎo)致本說(shuō)明書(shū)的復(fù)雜性的過(guò)多的重復(fù)，省略它們之間的共同內(nèi)容。在為了說(shuō)明本實(shí)施方式，提起與第一實(shí)施方式有關(guān)的說(shuō)明的情況下，需要留意本實(shí)施方式與第一實(shí)施方式一部分不同。本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員需要理解與第一實(shí)施方式有關(guān)的一部分說(shuō)明直接可適用于與實(shí)施方式有關(guān)的說(shuō)明，變形的其他說(shuō)明可適用于與本實(shí)施方式有關(guān)的說(shuō)明。

步驟(a)：基準(zhǔn)值的提供

提供如下：與由第一單核苷酸多態(tài)性等位基因構(gòu)成的純合子有關(guān)的第一基準(zhǔn)值；與由第二單核苷酸多態(tài)性等位基因構(gòu)成的純合子有關(guān)的第二基準(zhǔn)值；以及與由第一單核苷酸多態(tài)性等位基因及第二單核苷酸多態(tài)性等位基因構(gòu)成的雜合子有關(guān)的第三基準(zhǔn)值。

本發(fā)明具有利用與3個(gè)基因型有關(guān)的基準(zhǔn)值的特征。

通過(guò)培養(yǎng)相應(yīng)的單核苷酸多態(tài)性類型及信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)，并在相對(duì)較高檢測(cè)溫度及相對(duì)較低檢測(cè)溫度下檢測(cè)信號(hào)后，取得在相對(duì)較高檢測(cè)溫度及相對(duì)較低檢測(cè)溫度下檢測(cè)出的信號(hào)之間的差異，來(lái)獲取各個(gè)基準(zhǔn)值。

根據(jù)一實(shí)例，以三個(gè)基準(zhǔn)值相互不同的方式設(shè)計(jì)信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)。

根據(jù)一實(shí)例，(i)通過(guò)如下步驟獲取與第一單核苷酸多態(tài)性等位基因構(gòu)成的純合子有關(guān)的第一基準(zhǔn)值，即，步驟(i-1)，與用于檢測(cè)第一單核苷酸多態(tài)性等位基因的第一信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)一同培養(yǎng)由第一單核苷酸多態(tài)性等位基因構(gòu)成的純合子；步驟(i-2)，在相對(duì)較高檢測(cè)溫度及相對(duì)較低檢測(cè)溫度下檢測(cè)信號(hào)；以及步驟(i-3)，之后，獲取在相對(duì)較高檢測(cè)溫度及相對(duì)較低檢測(cè)溫度下檢測(cè)出的信號(hào)之間的差異；(ii)通過(guò)如下步驟獲取與由第二單核苷酸多態(tài)性等位基因構(gòu)成的純合子有關(guān)的第二基準(zhǔn)值，即，步驟(ii-1)，與用于檢測(cè)第二單核苷酸多態(tài)性等位基因的第二信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)一同培養(yǎng)由第二單核苷酸多態(tài)性等位基因構(gòu)成的純合子；步驟(ii-2)，在相對(duì)較高檢測(cè)溫度及相對(duì)較低檢測(cè)溫度下檢測(cè)信號(hào)；以及步驟(ii-3)，之后，獲取在相對(duì)較高檢測(cè)溫度及相對(duì)較低檢測(cè)溫度下檢測(cè)出的信號(hào)之間的差異；以及(iii)通過(guò)如下步驟獲取與由第一單核苷酸多態(tài)性等位基因及第二單核苷酸多態(tài)性等位基因構(gòu)成的雜合子有關(guān)的第三基準(zhǔn)值，即，(iii-1)，與用于檢測(cè)第一單核苷酸多態(tài)性等位基因的第一信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)及用于檢測(cè)第二單核苷酸多態(tài)性等位基因的第二信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)一同培養(yǎng)由第一單核苷酸多態(tài)性等位基因及第二單核苷酸多態(tài)性等位基因構(gòu)成的雜合子；步驟(iii-2)，在相對(duì)較高檢測(cè)溫度及相對(duì)較低檢測(cè)溫度下檢測(cè)信號(hào)；以及步驟(iii-3)，之后，獲取在相對(duì)較高檢測(cè)溫度及相對(duì)較低檢測(cè)溫度下檢測(cè)出的信號(hào)之間的差異。

根據(jù)一實(shí)例，信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)設(shè)置成與第一單核苷酸多態(tài)性等位基因有關(guān)的基準(zhǔn)值與第二單核苷酸多態(tài)性等位基因有關(guān)的基準(zhǔn)值不同。

含有單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的核酸序列可包含人類的染色體對(duì)

根據(jù)一實(shí)例，當(dāng)獲取基準(zhǔn)值時(shí)，檢測(cè)出的信號(hào)之間的差異表示在相對(duì)較高檢測(cè)溫度及相對(duì)較低檢測(cè)溫度下所提供的信號(hào)變化的關(guān)系。

根據(jù)一實(shí)例，當(dāng)獲取基準(zhǔn)值時(shí)，檢測(cè)出的信號(hào)之間的差異為信號(hào)之間的比率。

根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，當(dāng)獲取基準(zhǔn)值時(shí)，檢測(cè)出的信號(hào)之間的差異具有特定范圍，在上述特定范圍內(nèi)參照上述特定范圍來(lái)選擇上述基準(zhǔn)值。根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，可利用上述特定范圍的最大值或最小值或參照上述特定范圍的最大值或最小值來(lái)選擇基準(zhǔn)值。

根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，可在反應(yīng)結(jié)束時(shí)提供飽和信號(hào)的充分的反應(yīng)條件下獲取基準(zhǔn)值。例如，為了獲得與由第一核苷酸多態(tài)性等位基因及第二核苷酸多態(tài)性等位基因均構(gòu)成的雜合子有關(guān)的基準(zhǔn)值，選擇與各個(gè)核苷酸多態(tài)性等位基因的含量相同的反應(yīng)條件，以在反應(yīng)結(jié)束時(shí)提供與各個(gè)核苷酸多態(tài)性等位基因有關(guān)的飽和信號(hào)。根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，當(dāng)計(jì)算基準(zhǔn)值時(shí)獲取的信號(hào)之間的差異具有特定范圍，在上述特定范圍內(nèi)選擇上述基準(zhǔn)值或者參照上述特定范圍來(lái)選擇上述基準(zhǔn)值。根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，可利用上述特定范圍的最大值或最小值或參照上述特定范圍的最大值或最小值來(lái)選擇基準(zhǔn)值。

步驟(b):樣品和信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)及與檢測(cè)信號(hào)的培養(yǎng)

與用于分析核酸序列的單核苷酸多態(tài)性基因型的第一信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)及第二信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)一同培養(yǎng)包含含有單核苷酸多態(tài)性(單一核苷酸多態(tài)性)位點(diǎn)的核酸序列，在相對(duì)較高檢測(cè)溫度及相對(duì)較低檢測(cè)溫度下，檢測(cè)來(lái)自上述第一信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)及第二信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)的信號(hào)。在相對(duì)較高檢測(cè)溫度及相對(duì)較低檢測(cè)溫度下，上述第一信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)及第二信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)產(chǎn)生信號(hào)，由上述第一信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)及第二信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)產(chǎn)生的信號(hào)不被單一類型的檢測(cè)器分辨。

根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，在伴隨核酸擴(kuò)增的信號(hào)擴(kuò)增過(guò)程中進(jìn)行步驟(b)。

根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，在無(wú)核酸擴(kuò)增的信號(hào)擴(kuò)增過(guò)程中進(jìn)行步驟(b)。

步驟(c)：?jiǎn)魏塑账岫鄳B(tài)性基因型的確定

最后，根據(jù)基準(zhǔn)值及在步驟(b)中在相對(duì)較高檢測(cè)溫度及相對(duì)較低檢測(cè)溫度下檢測(cè)出的信號(hào)之間的差異確定單核苷酸多態(tài)性基因型。

在本發(fā)明中不確定在樣品內(nèi)存在哪一個(gè)單核苷酸多態(tài)性等位基因，只是可根據(jù)相應(yīng)的單核苷酸多態(tài)性基因型的基準(zhǔn)值及在相對(duì)較高檢測(cè)溫度及相對(duì)較低檢測(cè)溫度下檢測(cè)出的信號(hào)之間的差異分析單核苷酸多態(tài)性基因型。

無(wú)需確定個(gè)別的單核苷酸多態(tài)性等位基因的存在的理由在于，存在3個(gè)單核苷酸多態(tài)性基因型，雜合子以1：1的比率包含野生型等位基因及突變等位基因。并且，上述理由在于在樣品培養(yǎng)中可容易調(diào)節(jié)核酸分子的量。

根據(jù)一實(shí)例，在步驟(b)中檢測(cè)出的信號(hào)之間的差異包含通過(guò)對(duì)在相對(duì)較高檢測(cè)溫度下檢測(cè)出的信號(hào)及在相對(duì)較低檢測(cè)溫度下檢測(cè)出的信號(hào)進(jìn)行數(shù)學(xué)處理，來(lái)獲取的差異。

根據(jù)一實(shí)例，通過(guò)計(jì)算上述信號(hào)之間的比率，來(lái)可獲取在步驟(b)中檢測(cè)出的信號(hào)之間的差異

根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，含有第一單核苷酸多態(tài)性等位基因的純合子樣品表示特定范圍內(nèi)的差異(例如比率)，雜合子樣品表示另一范圍內(nèi)的差異(例如比率)，含有第二單核苷酸多態(tài)性等位基因的純合子樣品表示另一特定分為內(nèi)的差異(例如比率)。

根據(jù)一實(shí)例，通過(guò)與基準(zhǔn)值比較信號(hào)之間的差異來(lái)確定單核苷酸多態(tài)性基因型。例如，與由第一單核苷酸多態(tài)性等位基因構(gòu)成的純合子有關(guān)的第一基準(zhǔn)值為1.0，與由第二單核苷酸多態(tài)性等位基因構(gòu)成的純合子構(gòu)成的第二基準(zhǔn)值為5.2，與由第一單核苷酸多態(tài)性等位基因及第二單核苷酸多態(tài)性等位基因構(gòu)成的雜合子有關(guān)的第三基準(zhǔn)值為3.2，實(shí)際上，在步驟(b)中信號(hào)之間的差異為1.0的情況下，確定為樣品是第一單核苷酸多態(tài)性等位基因的純合子。

根據(jù)一實(shí)例，考慮與各個(gè)基因型有關(guān)的基準(zhǔn)值的范圍，來(lái)確立2個(gè)cut-off值，并可使用于基因分析。

iv.用于檢測(cè)靶核酸序列的試劑盒

在本發(fā)明的追加實(shí)施方式中提供用于使用不同檢測(cè)溫度及基準(zhǔn)值分析樣品內(nèi)2個(gè)靶核酸序列中的至少一個(gè)靶核酸序列的試劑盒，上述用于使用不同檢測(cè)溫度及基準(zhǔn)值分析樣品內(nèi)2個(gè)靶核酸序列中的至少一個(gè)靶核酸序列的試劑盒包括：(a)2個(gè)信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)，用于檢測(cè)2個(gè)靶核酸序列；以及(b)說(shuō)明書(shū)，記載標(biāo)題為使用不同檢測(cè)溫度及基準(zhǔn)值檢測(cè)樣品內(nèi)2個(gè)靶核酸序列中的至少一個(gè)靶核酸序列的檢測(cè)的實(shí)施方式i的本發(fā)明的方法。

在本發(fā)明的追加實(shí)施方式中提供使用不同檢測(cè)溫度及基準(zhǔn)值檢測(cè)樣品內(nèi)2個(gè)靶核酸序列中的至少一個(gè)靶核酸序列的試劑盒，上述使用不同檢測(cè)溫度及基準(zhǔn)值檢測(cè)樣品內(nèi)2個(gè)靶核酸序列中的至少一個(gè)靶核酸序列的試劑盒包括：(a)2個(gè)信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)，用于檢測(cè)2個(gè)靶核酸序列中的至少一個(gè)；以及(b)說(shuō)明書(shū)，記載標(biāo)題為使用不同檢測(cè)溫度及基準(zhǔn)值檢測(cè)樣品內(nèi)至少一個(gè)靶核酸序列的實(shí)施方式ii的本發(fā)明的方法。

在本發(fā)明的另一實(shí)施方式中提供使用不同檢測(cè)溫度及基準(zhǔn)值分析樣品內(nèi)核酸序列的單核苷酸多態(tài)性基因型的試劑盒，上述供使用不同檢測(cè)溫度及基準(zhǔn)值分析樣品內(nèi)核酸序列的單核苷酸多態(tài)性基因型的試劑盒包括：(a)信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)，用于第一單核苷酸多態(tài)性等位基因；(b)信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)，用于第二單核苷酸多態(tài)性等位基因；以及(c)說(shuō)明書(shū)，記載標(biāo)題為利用不同檢測(cè)溫度及基準(zhǔn)值分析樣品內(nèi)核酸序列的單核苷酸多態(tài)性基因型的實(shí)施方式iii的本發(fā)明的方法。

為了實(shí)施本發(fā)明而制備本發(fā)明的試劑盒，因此，為了避免導(dǎo)致本說(shuō)明書(shū)的復(fù)雜性的過(guò)多的重復(fù)，省略它們之間的共同內(nèi)容。

上述的本發(fā)明的所有試劑盒可選擇性地包含緩沖液、脫氧核糖核酸聚合酶輔助因子及脫氧核糖核苷酸-5-三磷酸等的用于進(jìn)行靶擴(kuò)增聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(例如，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))所需的試劑。選擇性地，試劑盒還可包含多種多核苷酸分子、反轉(zhuǎn)錄酶、多種緩沖液、試劑及用于抑制脫氧核糖核酸聚合酶活性的抗體。并且，上述試劑盒可包含實(shí)施陽(yáng)性對(duì)照組及陰性對(duì)照組時(shí)所需的試劑。在特定反應(yīng)中所使用的試劑的最佳量可由知道本公開(kāi)事項(xiàng)的優(yōu)點(diǎn)的本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員容易地確定。試劑盒的組成成分可存在于獨(dú)立的容器或者多個(gè)組成成分可存在于一個(gè)容器內(nèi)。

用于記述或?qū)嵤┍景l(fā)明的方法的說(shuō)明書(shū)可存儲(chǔ)于適合的存儲(chǔ)介質(zhì)。例如，說(shuō)明書(shū)可印刷于紙及塑料等的基板。在再一實(shí)例中，說(shuō)明書(shū)能夠以存在于只讀儲(chǔ)存器(cd-rom)及軟盤(pán)等的適合的計(jì)算機(jī)可讀存儲(chǔ)介質(zhì)的電子存儲(chǔ)數(shù)據(jù)文件方式存在。在另一實(shí)例中，可在試劑盒內(nèi)不包括實(shí)質(zhì)的說(shuō)明書(shū)，只是提供從遠(yuǎn)程數(shù)據(jù)源通過(guò)互聯(lián)網(wǎng)獲得說(shuō)明書(shū)的機(jī)構(gòu)。上述實(shí)例中的一例是包含可瀏覽說(shuō)明書(shū)的網(wǎng)址和/或可下載說(shuō)明書(shū)的網(wǎng)址的試劑盒。

v.用于檢測(cè)靶核酸序列的存儲(chǔ)介質(zhì)及裝置

在以下記述的存儲(chǔ)介質(zhì)、裝置及計(jì)算機(jī)程序用于在計(jì)算機(jī)中實(shí)施本發(fā)明，為了避免導(dǎo)致本說(shuō)明書(shū)的復(fù)雜性的過(guò)多的重復(fù)，省略它們之間的共同內(nèi)容。

在本發(fā)明的另一實(shí)施方式中，提供一種計(jì)算機(jī)可讀存儲(chǔ)介質(zhì)，包含用于運(yùn)行處理器的指令，上述處理器執(zhí)行使用不同檢測(cè)溫度及基準(zhǔn)值確定樣品內(nèi)包含第一靶核酸序列及第二靶核酸序列的2個(gè)靶核酸序列中的至少一個(gè)靶核酸序列的存在的方法，上述使用不同檢測(cè)溫度及基準(zhǔn)值確定樣品內(nèi)包含第一靶核酸序列及第二靶核酸序列的2個(gè)靶核酸序列中的至少一個(gè)靶核酸序列的存在的方法包括：步驟(a)，在相對(duì)較高檢測(cè)溫度及相對(duì)較低檢測(cè)溫度下，接收從用于第一靶核酸序列的第一信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)及用于第二靶核酸序列的第二信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)產(chǎn)生的樣品內(nèi)信號(hào)；上述第一信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)及第二信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)在相對(duì)較高檢測(cè)溫度及相對(duì)較低檢測(cè)溫度下產(chǎn)生信號(hào)；由上述第一信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)及第二信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)產(chǎn)生的信號(hào)不被單一類型的檢測(cè)器分辨；以及步驟(b)，根據(jù)在步驟(a)中所接收的信號(hào)、與第一靶核酸序列有關(guān)的第一基準(zhǔn)值和/或與第二靶核酸序列有關(guān)的第二基準(zhǔn)值確定至少一個(gè)靶核酸序列的存在；上述第一基準(zhǔn)值表示借助第一信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)在相對(duì)較高檢測(cè)溫度及相對(duì)較低檢測(cè)溫度下所提供的信號(hào)變化的關(guān)系，上述第二基準(zhǔn)值表示借助第二信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)在相對(duì)較高檢測(cè)溫度及相對(duì)較低檢測(cè)溫度下所提供的信號(hào)變化的關(guān)系；上述第一基準(zhǔn)值與上述第二基準(zhǔn)值不同。

根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，第一基準(zhǔn)值和/或第二基準(zhǔn)值存儲(chǔ)于計(jì)算機(jī)可讀存儲(chǔ)介質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，當(dāng)運(yùn)行本方法時(shí)，計(jì)算機(jī)可讀存儲(chǔ)介質(zhì)包含輸入第一基準(zhǔn)值和/或第二基準(zhǔn)值的指令。根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，計(jì)算機(jī)可讀存儲(chǔ)介質(zhì)還可包含用于運(yùn)行處理器的指令，上述處理器執(zhí)行用于獲取第一基準(zhǔn)值和/或第二基準(zhǔn)值的方法，在本發(fā)明的另一實(shí)施方式中，提供一種計(jì)算機(jī)程序，運(yùn)行用于執(zhí)行使用不同檢測(cè)溫度及基準(zhǔn)值確定樣品內(nèi)包含第一靶核酸序列及第二靶核酸序列的2個(gè)靶核酸序列中的至少一個(gè)靶核酸序列的存在的方法的處理器且存儲(chǔ)于計(jì)算機(jī)可讀存儲(chǔ)介質(zhì)，上述使用不同檢測(cè)溫度及基準(zhǔn)值確定樣品內(nèi)包含第一靶核酸序列及第二靶核酸序列的2個(gè)靶核酸序列中的至少一個(gè)靶核酸序列的存在的方法包括：步驟(a)，在相對(duì)較高檢測(cè)溫度及相對(duì)較低檢測(cè)溫度下，接收從用于第一靶核酸序列的第一信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)及用于第二靶核酸序列的第二信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)產(chǎn)生的樣品內(nèi)信號(hào)；上述第一信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)及第二信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)在相對(duì)較高檢測(cè)溫度及相對(duì)較低檢測(cè)溫度下產(chǎn)生信號(hào)；由上述第一信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)及第二信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)產(chǎn)生的信號(hào)不被單一類型的檢測(cè)器分辨；以及步驟(b)，根據(jù)在步驟(a)中所接收的信號(hào)、與第一靶核酸序列有關(guān)的第一基準(zhǔn)值和/或與第二靶核酸序列有關(guān)的第二基準(zhǔn)值確定至少一個(gè)靶核酸序列的存在；上述第一基準(zhǔn)值表示借助第一信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)在相對(duì)較高檢測(cè)溫度及相對(duì)較低檢測(cè)溫度下所提供的信號(hào)變化的關(guān)系，上述第二基準(zhǔn)值表示借助第二信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)在相對(duì)較高檢測(cè)溫度及相對(duì)較低檢測(cè)溫度下所提供的信號(hào)變化的關(guān)系；上述第一基準(zhǔn)值與上述第二基準(zhǔn)值不同。

根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，計(jì)算機(jī)程序包含第一基準(zhǔn)值和/或第二基準(zhǔn)值。根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，計(jì)算機(jī)程序包含當(dāng)運(yùn)行本方法時(shí)輸入第一基準(zhǔn)值和/或第二基準(zhǔn)值的指示。根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，計(jì)算機(jī)程序還包含指示，上述指示運(yùn)行用于獲得上述基第一基準(zhǔn)值和/或第二基準(zhǔn)值的處理器。

在借助上述處理器運(yùn)行的情況下，通過(guò)啟動(dòng)上述程序指示來(lái)使處理器運(yùn)行上述的本發(fā)明的方法。程序指示可包含用于接收第一信號(hào)及第二信號(hào)的指示，并且可包含利用所接收的上述信號(hào)來(lái)確定上述2個(gè)靶核酸序列的存在的指示。

可在處理器實(shí)施上述的本發(fā)明的方法，例如，可在位于獨(dú)立計(jì)算機(jī)(stand-alonecomputer)、與網(wǎng)絡(luò)相連接的計(jì)算機(jī)(networkattachedcomputer)或?qū)崟r(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)設(shè)備等數(shù)據(jù)收集裝置(dataacquisitiondevice)的處理器中執(zhí)行上述的本發(fā)明的方法。

計(jì)算機(jī)可讀存儲(chǔ)介質(zhì)包括刻錄光盤(pán)(cd-r)、只讀儲(chǔ)存器(cd-rom)、數(shù)字多功能光盤(pán)(dvd)、閃存存儲(chǔ)器、軟盤(pán)、硬盤(pán)驅(qū)動(dòng)器、便攜式硬盤(pán)、通用串行總線(usb)、磁帶、迷你光碟(minidisc)、非易失性存儲(chǔ)卡、電可擦只讀存儲(chǔ)器(eeprom)、光盤(pán)(cd)、光存儲(chǔ)介質(zhì)、隨機(jī)存取存儲(chǔ)器(ram)、只讀存儲(chǔ)器(rom)、系統(tǒng)存儲(chǔ)器及web服務(wù)器等多種存儲(chǔ)介質(zhì)。

與信號(hào)相關(guān)的數(shù)據(jù)(例如，強(qiáng)度、擴(kuò)增循環(huán)數(shù)及檢測(cè)溫度)可通過(guò)幾個(gè)設(shè)備來(lái)接收。例如，數(shù)據(jù)可借助位于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)數(shù)據(jù)收集裝置的處理器收集。在進(jìn)行收集期間可實(shí)時(shí)提供數(shù)據(jù)或者可儲(chǔ)存于存儲(chǔ)器單元或緩沖區(qū)，在完成實(shí)驗(yàn)后可在處理器提供數(shù)據(jù)。類似地，通過(guò)與上述收集裝置的網(wǎng)絡(luò)連接(例如，局域網(wǎng)(lan)，虛擬專用網(wǎng)絡(luò)(vpn)、互聯(lián)網(wǎng)及內(nèi)聯(lián)網(wǎng))或直接連接(例如，通用串行總線、其它直接有線連接或無(wú)線連接)向獨(dú)立計(jì)算機(jī)系統(tǒng)等額外的系統(tǒng)提供上述數(shù)據(jù)集或者可向光盤(pán)、數(shù)字多功能光盤(pán)、軟盤(pán)、便攜式硬盤(pán)或獨(dú)立計(jì)算機(jī)系統(tǒng)等便攜式介質(zhì)提供上述數(shù)據(jù)集。類似地，可通過(guò)與筆記本電腦或臺(tái)式計(jì)算機(jī)系統(tǒng)等客戶端的網(wǎng)絡(luò)連接(例如，局域網(wǎng)、虛擬專用網(wǎng)絡(luò)、互聯(lián)網(wǎng)，內(nèi)聯(lián)網(wǎng)及無(wú)線通信網(wǎng)絡(luò))向服務(wù)器系統(tǒng)提供上述數(shù)據(jù)集。在相對(duì)較高檢測(cè)溫度下檢測(cè)出信號(hào)的情況下，在接收或收集上述數(shù)據(jù)后，在上述數(shù)據(jù)分析過(guò)程中提供從用于確定靶核酸序列的存在的信號(hào)之間的差異獲得的加工信號(hào)。上述處理器通過(guò)處理與信號(hào)相關(guān)的接收的數(shù)據(jù)，來(lái)提供反應(yīng)在上述2個(gè)檢測(cè)溫度下的信號(hào)之間的差異的加工信號(hào)。例如，處理器通過(guò)處理所接收的數(shù)據(jù)來(lái)獲得針對(duì)在相對(duì)較高檢測(cè)溫度下檢測(cè)出的信號(hào)的在在上述相對(duì)較低檢測(cè)溫度下檢測(cè)出的信號(hào)的比率。

用于實(shí)現(xiàn)運(yùn)行本發(fā)明的處理器的指示可包含在邏輯系統(tǒng)。雖然可向便攜式硬盤(pán)、通用串行總線、軟盤(pán)、光盤(pán)及數(shù)字多功能光盤(pán)等的任何軟件存儲(chǔ)介質(zhì)提供上述指示，但是可進(jìn)行下載且可存儲(chǔ)于存儲(chǔ)器模塊(例如，硬盤(pán)驅(qū)動(dòng)器、本地或附著隨機(jī)存取存儲(chǔ)器、只讀存儲(chǔ)器等其他存儲(chǔ)器)。用于運(yùn)行本發(fā)明的計(jì)算機(jī)代碼可運(yùn)行為如c、c++、java、visualbasic、vbscript、javascript、perl及xml等多種代碼語(yǔ)言。并且，多種語(yǔ)言及協(xié)議可利用于基于本發(fā)明的數(shù)據(jù)和命令的外部及內(nèi)部存儲(chǔ)和傳送。

在本發(fā)明的另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供用于使用不同檢測(cè)溫度及基準(zhǔn)值檢測(cè)試樣內(nèi)包含第一靶核酸序列及第二靶核酸序列的2個(gè)靶核酸序列中的至少一個(gè)靶核酸序列的存在的裝置，上述用于使用不同檢測(cè)溫度及基準(zhǔn)值檢測(cè)試樣內(nèi)包含第一靶核酸序列及第二靶核酸序列的2個(gè)靶核酸序列中的至少一個(gè)靶核酸序列的存在的裝置包括：(a)計(jì)算機(jī)處理器；以及(b)與上述計(jì)算機(jī)處理器耦合的計(jì)算機(jī)可讀存儲(chǔ)介質(zhì)。

根據(jù)一實(shí)例，上述裝置還包括：反應(yīng)容器，可收容試樣及信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)；溫度調(diào)節(jié)機(jī)構(gòu)，用于調(diào)節(jié)上述反應(yīng)容器的溫度；和/或單一類型的檢測(cè)器，用于檢測(cè)借助上述信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)產(chǎn)生的信號(hào)。

根據(jù)一實(shí)例，計(jì)算機(jī)處理器不僅使單一類型的檢測(cè)器檢測(cè)在相對(duì)較高檢測(cè)溫度及相對(duì)較低檢測(cè)溫度下由信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)產(chǎn)生的信號(hào)，而且還可計(jì)算在相對(duì)較高檢測(cè)溫度下檢測(cè)出的信號(hào)及在相對(duì)較低檢測(cè)溫度下檢測(cè)出的信號(hào)之間的差異。上述處理器可被制作成一個(gè)處理器進(jìn)行兩種行為的結(jié)構(gòu)，即，可進(jìn)行在2個(gè)檢測(cè)溫度下的檢測(cè)及計(jì)算差異的命令。選擇性地，處理器單元可被制作成2個(gè)處理器分別進(jìn)行兩種行為的結(jié)構(gòu)。

上述裝置的第一個(gè)必要的特征為上述裝置具有處理器，上述處理器用于可檢測(cè)在上述2個(gè)檢測(cè)溫度下產(chǎn)生的信號(hào)。根據(jù)一實(shí)例，在信號(hào)與靶核酸序列的擴(kuò)增一同產(chǎn)生的情況下，上述裝置包括處理器，上述處理器用于能夠在每次擴(kuò)增循環(huán)中檢測(cè)在上述2個(gè)檢測(cè)溫度下產(chǎn)生的信號(hào)。

上述裝置的第二個(gè)必要的特征為上述裝置具有處理器，上述處理器通過(guò)對(duì)在上述2個(gè)檢測(cè)溫度下檢測(cè)的信號(hào)進(jìn)行處理來(lái)取得上述信號(hào)之間的差異。根據(jù)一實(shí)例，上述信號(hào)之間的差異通過(guò)數(shù)學(xué)處理表示為數(shù)字。

根據(jù)一實(shí)例，上述處理器能夠以在用于檢測(cè)靶核酸序列的現(xiàn)有裝置(例如，實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)裝置)設(shè)置軟件的方式實(shí)現(xiàn)。根據(jù)一實(shí)例，上述裝置可在至少2個(gè)檢測(cè)溫度下檢測(cè)信號(hào)，并且包括對(duì)至少2個(gè)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行數(shù)學(xué)處理的處理器。

在本發(fā)明的另一實(shí)施方式中，提供一種計(jì)算機(jī)可讀存儲(chǔ)介質(zhì)，包含用于運(yùn)行處理器的指令，上述處理器執(zhí)行使用不同檢測(cè)溫度及基準(zhǔn)值分析樣品內(nèi)核酸序列的單核苷酸多態(tài)性的基因型的方法，上述使用不同檢測(cè)溫度及基準(zhǔn)值分析樣品內(nèi)核酸序列的單核苷酸多態(tài)性的基因型的方法包括：步驟(a)，在相對(duì)較高檢測(cè)溫度及相對(duì)較低檢測(cè)溫度下，接收從用于單核苷酸多態(tài)性等位基因的第一信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)及第二信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)產(chǎn)生的樣品內(nèi)信號(hào)；上述第一信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)及第二信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)在相對(duì)較高檢測(cè)溫度及相對(duì)較低檢測(cè)溫度下產(chǎn)生信號(hào)；由上述第一信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)及第二信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)產(chǎn)生的信號(hào)不被單一類型的檢測(cè)器分辨；以及步驟(b)，根據(jù)在步驟(a)中所接收的信號(hào)之間的差異、與由第一單核苷酸多態(tài)性等位基因構(gòu)成的純合子有關(guān)的第一基準(zhǔn)值、與由第二單核苷酸多態(tài)性等位基因構(gòu)成的純合子有關(guān)的第二基準(zhǔn)值以及與由第一單核苷酸多態(tài)性等位基因及第二單核苷酸多態(tài)性等位基因構(gòu)成的雜合子有關(guān)的第三基準(zhǔn)值來(lái)確定單核苷酸多態(tài)性基因型；上述第一基準(zhǔn)值表示借助第一信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)在相對(duì)較高檢測(cè)溫度及相對(duì)較低檢測(cè)溫度下所提供的信號(hào)變化的關(guān)系，第二基準(zhǔn)值表示借助第二信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)在相對(duì)較高檢測(cè)溫度及相對(duì)較低檢測(cè)溫度下所提供的信號(hào)變化的關(guān)系；第三基準(zhǔn)值表示借助第一信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)及第二信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)在相對(duì)較高檢測(cè)溫度及相對(duì)較低檢測(cè)溫度下所提供的信號(hào)變化的關(guān)系；上述第一基準(zhǔn)值、上述第二基準(zhǔn)值及上述第三基準(zhǔn)值互不相同。

根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，在計(jì)算機(jī)可讀存儲(chǔ)介質(zhì)存儲(chǔ)第一基準(zhǔn)值和/或第二基準(zhǔn)值和/或第三基準(zhǔn)值。根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，當(dāng)執(zhí)行本方法時(shí)，計(jì)算機(jī)可讀存儲(chǔ)介質(zhì)包含輸入第一基準(zhǔn)值和/或第二基準(zhǔn)值和/或第三基準(zhǔn)值的指令。根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，計(jì)算機(jī)可讀存儲(chǔ)介質(zhì)還包含用于運(yùn)行處理器的指令，上述處理器執(zhí)行用于獲取第一基準(zhǔn)值和/或第二基準(zhǔn)值和/或第三基準(zhǔn)值方法。

在本發(fā)明的另一實(shí)施方式中，提供一種計(jì)算機(jī)程序，運(yùn)行用于使用執(zhí)行不同檢測(cè)溫度及基準(zhǔn)值分核酸序列的單核苷酸多態(tài)性的基因型的方法的處理器且存儲(chǔ)于計(jì)算機(jī)可讀存儲(chǔ)介質(zhì)，上述計(jì)算機(jī)程序的特征在于，上述使用不同檢測(cè)溫度及基準(zhǔn)值分析樣品內(nèi)核酸序列的單核苷酸多態(tài)性的基因型的方法包括：步驟(a)，在相對(duì)較高檢測(cè)溫度及相對(duì)較低檢測(cè)溫度下，接收從用于單核苷酸多態(tài)性等位基因的第一信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)及第二信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)產(chǎn)生的樣品內(nèi)信號(hào)；上述第一信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)及第二信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)在相對(duì)較高檢測(cè)溫度及相對(duì)較低檢測(cè)溫度下產(chǎn)生信號(hào)；由上述第一信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)及第二信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)產(chǎn)生的信號(hào)不被單一類型的檢測(cè)器分辨；以及步驟(b)，根據(jù)在步驟(a)中所接收的信號(hào)之間的差異、與由第一單核苷酸多態(tài)性等位基因構(gòu)成的純合子有關(guān)的第一基準(zhǔn)值、與由第二單核苷酸多態(tài)性等位基因構(gòu)成的純合子有關(guān)的第二基準(zhǔn)值以及與由第一單核苷酸多態(tài)性等位基因及第二單核苷酸多態(tài)性等位基因構(gòu)成的雜合子有關(guān)的第三基準(zhǔn)值來(lái)確定單核苷酸多態(tài)性基因型；上述第一基準(zhǔn)值表示借助第一信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)在相對(duì)較高檢測(cè)溫度及相對(duì)較低檢測(cè)溫度下所提供的信號(hào)變化的關(guān)系，第二基準(zhǔn)值表示借助第二信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)在相對(duì)較高檢測(cè)溫度及相對(duì)較低檢測(cè)溫度下所提供的信號(hào)變化的關(guān)系；第三基準(zhǔn)值表示借助第一信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)及第二信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)在相對(duì)較高檢測(cè)溫度及相對(duì)較低檢測(cè)溫度下所提供的信號(hào)變化的關(guān)系；上述第一基準(zhǔn)值、上述第二基準(zhǔn)值及上述第三基準(zhǔn)值互不相同。

根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，計(jì)算機(jī)程序包含第一基準(zhǔn)值和/或第二基準(zhǔn)值和/或第三基準(zhǔn)值。根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，當(dāng)執(zhí)行本方法時(shí)，計(jì)算機(jī)程序包含輸入第一基準(zhǔn)值和/或第二基準(zhǔn)值和/或第三基準(zhǔn)值的指令。根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)例，計(jì)算機(jī)可讀存儲(chǔ)介質(zhì)還包含用于運(yùn)行處理器的指令，上述處理器執(zhí)行用于獲取第一基準(zhǔn)值和/或第二基準(zhǔn)值和/或第三基準(zhǔn)值方法。

在本發(fā)明的另一實(shí)施方式中，提供用于分析樣品內(nèi)核酸序列的單核苷酸多態(tài)性(單一核苷酸多態(tài)性)基因型的裝置，上述用于分析樣品內(nèi)核酸序列的單核苷酸多態(tài)性(單一核苷酸多態(tài)性)基因型的裝置包括：(a)計(jì)算機(jī)處理器；以及(b)與上述計(jì)算機(jī)處理器耦合的計(jì)算機(jī)可讀存儲(chǔ)介質(zhì)。

對(duì)本發(fā)明的特征及優(yōu)點(diǎn)進(jìn)行歸納如下：

(a)在利用不同檢測(cè)溫度的本發(fā)明中，在一個(gè)反應(yīng)容器中僅用單一類型的標(biāo)志，也能夠以現(xiàn)有的實(shí)時(shí)方式檢測(cè)多個(gè)靶核酸序列。在現(xiàn)有技術(shù)中，在完成靶擴(kuò)增后，通過(guò)解鏈分析檢測(cè)多個(gè)靶核酸序列。與此不同地，由于本發(fā)明在靶擴(kuò)增后無(wú)需解鏈分析，從而大大縮短分析時(shí)間。

(b)在2個(gè)檢測(cè)溫度中產(chǎn)生2個(gè)與靶核酸序列有關(guān)的信號(hào)的情況下，本發(fā)明可檢測(cè)出各個(gè)靶核酸序列。這種優(yōu)點(diǎn)針對(duì)于各個(gè)靶核酸序列可使用基于切割產(chǎn)生信號(hào)的信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)。

(c)在使用不同檢測(cè)溫度的本發(fā)明中，針對(duì)各個(gè)靶核酸序列的借助以依賴于與靶核酸序列特異性雜交的介導(dǎo)寡核苷酸的切割的方式形成的二聚體提供信號(hào)的信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)(例如，基于探測(cè)和標(biāo)標(biāo)記寡核苷酸切割及延伸的方法)可誘導(dǎo)意外的效果。第一、如基于探測(cè)和標(biāo)標(biāo)記寡核苷酸切割及延伸的方法在使用介導(dǎo)寡核苷酸的方法中通過(guò)容易調(diào)節(jié)二聚體的tm值來(lái)可簡(jiǎn)單地選擇檢測(cè)溫度。根據(jù)上述特征能夠更簡(jiǎn)單地進(jìn)行調(diào)節(jié)，從而具有所需的基準(zhǔn)值(或基準(zhǔn)值的差異)。進(jìn)一步，如基于探測(cè)和標(biāo)標(biāo)記寡核苷酸切割及延伸的方法在使用介導(dǎo)寡核苷酸的方法中，可形成具有特定tm值的二聚體，這是因?yàn)樯鲜龆垠w具有與靶核酸序列無(wú)關(guān)的序列。與此不同地，在適用與靶核酸序列直接雜交的探針的方法中，在所形成的二聚體中至少一個(gè)鏈包含與靶核酸序列互補(bǔ)的序列，因此在靶核酸序列上存在變形的情況下，可形成具有未意圖的tm值的二聚體。

通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更加詳細(xì)的說(shuō)明。這些實(shí)施例僅用于對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更具體的說(shuō)明，在所附的發(fā)明要求保護(hù)范圍中所公開(kāi)的本發(fā)明的范圍并不局限于這些實(shí)施例，這對(duì)于本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的

實(shí)施例

實(shí)施例1：基于使用不同的檢測(cè)溫度及基準(zhǔn)值的taqman實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的多個(gè)靶檢測(cè)

本發(fā)明人對(duì)使用單一檢測(cè)通道在一個(gè)反應(yīng)容器中可否檢測(cè)2個(gè)靶核酸進(jìn)行了調(diào)查。通過(guò)使用不同檢測(cè)溫度及基準(zhǔn)值，來(lái)執(zhí)行檢測(cè)過(guò)程，并且將taqman實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)適用為信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)。

為了上游引物和下游引物的延伸及taqman探針的切割，而使用了具有5’核酸酶活性的taq脫氧核糖核酸聚合酶。將淋球菌(ng)的基因組脫氧核糖核酸及沙眼衣原體(ct)的基因組脫氧核糖核酸用作靶核酸序列。準(zhǔn)備4種類型的樣品(淋球菌、沙眼衣原體、淋球菌+沙眼衣原體及無(wú)靶的對(duì)照組)并進(jìn)行了分析。

利用taqman實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，來(lái)檢測(cè)了淋球菌及沙眼衣原體。在靶核酸存在的情況下，taqman探針被切割，并放出標(biāo)志的片段。可通過(guò)從標(biāo)志的片段測(cè)定信號(hào)，來(lái)獲取擴(kuò)增曲線。

與淋球菌有關(guān)的taqman探針在其的5’-末端由熒光報(bào)道分子(quasar670)標(biāo)志以及在其的3’-末端由猝滅分子標(biāo)志(序列：3)，與沙眼衣原體有關(guān)的taqman探針在其的5’-末端由熒光報(bào)道分子(quasar670)標(biāo)志以及內(nèi)部部分由猝滅分子(bhq-2)標(biāo)志(序列：6)

在上述實(shí)施例中，雖然來(lái)自taqman探針的信號(hào)未被相互分辨，但是使用與各個(gè)靶序列有關(guān)的基準(zhǔn)值以及來(lái)自2個(gè)檢測(cè)溫度(72℃及60℃)的信號(hào)的繪制方法提供表示各個(gè)靶核酸序列的存在的擴(kuò)增曲線。

用于獲取與基準(zhǔn)值有關(guān)的計(jì)算式及與各個(gè)與靶核酸序列有關(guān)的擴(kuò)增曲線的繪制式如下：

(1)淋球菌或沙眼衣原體的基準(zhǔn)值(rv)

在端點(diǎn)下，在60℃溫度下的rfu÷在72℃溫度下的rfu

(2)與淋球菌靶有關(guān)的繪制式：

(i)在72℃溫度下的rfu－(在60℃溫度下的rfu÷沙眼衣原體靶的rv)

或(ii)在60℃溫度下的rfu－(在72℃溫度下的rfu×沙眼衣原體靶的rv)

(3)與沙眼衣原體靶有關(guān)的繪制式：

(i)在72℃溫度下的rfu－(在60℃溫度下的rfu÷淋球菌靶的rv)

或(ii)在60℃溫度下的rfu－(在72℃溫度下的rfu×淋球菌靶的rv)。

在上述式中，rfu(相對(duì)熒光單位)值為在實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的各個(gè)循環(huán)中測(cè)定的值，rv表示基準(zhǔn)值。

在本實(shí)施例中使用的上游引物、下游引物及探針的序列如下。

ng-f5’-tacgcctgctactttcacgctiiiiigtaatcagatg-3’(序列：1)

ng-r5’-caatggatcggtatcactcgciiiiicgagcaagaac-3’(序列：2)

ng-p5’-[quasar670]tgcccctcattggcgtgtttcg[bhq-2]-3’(序列：3)

ct-f15’-tccgaatggataaagcgtgaciiiiiatgaactcac-3’(序列：4)

ct-r15’-aacaatgaatcctgagcaaaggiiiiicgttagagtc-3’(序列：5)

ct-p5’-[quasar670]cattgtaaaga[t(bhq-2)]atggtctgcttcgaccg[c3spacer]-3’(序列：6)

(i：脫氧肌苷)

利用包含靶核酸(1pg的淋球菌的基因組脫氧核糖核酸、10pg的沙眼衣原體的基因組脫氧核糖核酸或1pg的淋球菌的基因組脫氧核糖核酸及10pg的沙眼衣原體的基因組脫氧核糖核酸的混合物)、5pmole的用于淋球菌的靶擴(kuò)增的上游引物(序列1)及10pmole的下游引物(序列2)、1.5pmole的taqman探針(序列3)、5pmole的用于沙眼衣原體的靶擴(kuò)增的上游引物(序列4)，10pmole的下游引物(序列5)、3pmole的taqman探針(序列6)以及5μl的4×主混合液(最終，200μm的三磷酸脫氧核苷酸(dntps)、2mm的mgcl2及2u的taq脫氧核糖核酸聚合酶)的20μl的最終體積進(jìn)行了實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。在50℃的溫度下在實(shí)時(shí)熱循環(huán)儀(cfx96，伯樂(lè)公司(bio-rad))中將含有上述反應(yīng)混合物的管放入5分鐘，在95℃的溫度下變性15分鐘，并且以在95℃的溫度下30秒鐘、在60℃的溫度下60秒鐘、在72℃的溫度下30秒鐘的方式反復(fù)實(shí)施50次。在每個(gè)循環(huán)的60℃及72℃的溫度下進(jìn)行了信號(hào)的檢測(cè)。

如圖1a所示，當(dāng)淋球菌、沙眼衣原體或淋球菌+沙眼衣原體存在時(shí)，在60℃及72℃溫度下均檢測(cè)出了信號(hào)。當(dāng)靶核酸不存在時(shí)，未檢測(cè)出信號(hào)。通過(guò)使用淋球菌獨(dú)立樣品或沙眼衣原體獨(dú)立樣品的信號(hào)來(lái)計(jì)算了與各個(gè)靶序列有關(guān)的基準(zhǔn)值。如圖1b所示，與淋球菌及沙眼衣原體靶有關(guān)的基準(zhǔn)值分別為1.8及5.8。

之后，為了確認(rèn)靶序列，將相應(yīng)的基準(zhǔn)值、在72℃及60℃溫度下的rfu適用于繪制式(在圖1c及圖1d)中的(i)式或(ii)式)，并獲取了各個(gè)靶序列的擴(kuò)增曲線。為了確保獲取的上述擴(kuò)增曲線的顯著性，參照淋球菌獨(dú)立樣品及沙眼衣原體獨(dú)立樣品的結(jié)果，來(lái)選擇了適當(dāng)?shù)拈撝怠?/p>

如圖1c及圖1d所示，來(lái)源于繪制方法的擴(kuò)增曲線可確認(rèn)各個(gè)樣品內(nèi)淋球菌或沙眼衣原體的存在或不存在。

因此，可理解如下：通過(guò)使用不同檢測(cè)溫度及基準(zhǔn)值的taqman實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，在使用單一檢測(cè)通道的情況下在一個(gè)反應(yīng)容器中可檢測(cè)出2個(gè)靶核酸。

實(shí)施例2：基于包括使用不同檢測(cè)溫度及基準(zhǔn)值的探測(cè)和標(biāo)標(biāo)記寡核苷酸切割及延伸實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的多個(gè)靶檢測(cè)

本發(fā)明人對(duì)使用單一檢測(cè)通道在一個(gè)反應(yīng)容器中可否檢測(cè)2個(gè)靶核酸進(jìn)行了調(diào)查。通過(guò)使用不同檢測(cè)溫度及基準(zhǔn)值，來(lái)執(zhí)行以下檢測(cè)過(guò)程，并且將探測(cè)和標(biāo)標(biāo)記寡核苷酸切割及延伸實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)適用為信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)。

為了上游引物和下游引物的延伸、探測(cè)和標(biāo)標(biāo)記寡核苷酸的切割及探測(cè)和標(biāo)標(biāo)記寡核苷酸片段的延伸，而使用了具有5’核酸酶活性的taq脫氧核糖核酸聚合酶。將淋球菌的基因組脫氧核糖核酸及沙眼衣原體的基因組脫氧核糖核酸用作靶核酸序列。準(zhǔn)備4種類型的樣品(淋球菌、沙眼衣原體、淋球菌+沙眼衣原體及無(wú)模板的對(duì)照組)并進(jìn)行了分析。

通過(guò)使用探測(cè)和標(biāo)標(biāo)記寡核苷酸切割及延伸實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，來(lái)檢測(cè)了沙眼衣原體及淋球菌。在靶存在的情況下，探測(cè)和標(biāo)標(biāo)記寡核苷酸被切割，并生成探測(cè)和標(biāo)標(biāo)記寡核苷酸片段。上述探測(cè)和標(biāo)標(biāo)記寡核苷酸片段在捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位被退火，在捕捉和模板化寡核苷酸的模板化部位上延伸，而形成捕捉和模板化寡核苷酸和延伸二聚體(二聚的捕捉和模板化寡核苷酸)。延伸二聚體的形成提供信號(hào)，并通過(guò)在延伸二聚體形成溫度下測(cè)定信號(hào)，來(lái)可獲取擴(kuò)增曲線。

探測(cè)和標(biāo)標(biāo)記寡核苷酸及捕捉和模板化寡核苷酸的其的3’-末端以防止其延伸的方式被碳間隔區(qū)阻斷。捕捉和模板化寡核苷酸在其的模板部位由猝滅分子(bhq-2)標(biāo)志以及熒光報(bào)道分子(calfluorred610)標(biāo)志(序列8及序列12)。

在本實(shí)施例中選擇67.8℃及60℃作為信號(hào)檢測(cè)溫度。以依賴于靶核酸序列的存在的方式生成的延伸二聚體具有通過(guò)它們的序列及長(zhǎng)度調(diào)節(jié)的能夠控制的tm值。在本實(shí)施例中以在67.8℃及60℃溫度下均提供信號(hào)的方式設(shè)計(jì)與淋球菌及沙眼衣原體有關(guān)的延伸二聚體的序列及長(zhǎng)度。雖然來(lái)自信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)的信號(hào)未被相互分辨，但是使用與各個(gè)靶序列有關(guān)的基準(zhǔn)值以及來(lái)自2個(gè)檢測(cè)溫度(67.8℃及60℃)的信號(hào)的繪制方法提供表示各個(gè)靶核酸序列的存在的擴(kuò)增曲線。

用于獲取與基準(zhǔn)值有關(guān)的計(jì)算式及與各個(gè)與靶核酸序列有關(guān)的擴(kuò)增曲線的繪制式如下：

(1)淋球菌或沙眼衣原體的基準(zhǔn)值(rv)

在端點(diǎn)下，在60℃溫度下的rfu÷在67.8℃溫度下的rfu

(2)與淋球菌靶有關(guān)的繪制式：

(i)在67.8℃溫度下的rfu－(在60℃溫度下的rfu÷沙眼衣原體靶的rv)

或(ii)在60℃溫度下的rfu－(在67.8℃溫度下的rfu×沙眼衣原體靶的rv)

(3)與沙眼衣原體靶有關(guān)的繪制式：

(i)在67.8℃溫度下的rfu－(在60℃溫度下的rfu÷淋球菌靶的rv)

或(ii)在60℃溫度下的rfu－(在67.8℃溫度下的rfu×淋球菌靶的rv)。

在上述式中，rfu(相對(duì)熒光單位)值為在實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的各個(gè)循環(huán)中測(cè)定的值，rv表示基準(zhǔn)值。

在本實(shí)施例中使用的上游引物、下游引物、探測(cè)和標(biāo)標(biāo)記寡核苷酸及捕捉和模板化寡核苷酸的序列如下。

ng-f5’-tacgcctgctactttcacgctiiiiigtaatcagatg-3’(序列：1)

ng-r5’-caatggatcggtatcactcgciiiiicgagcaagaac-3’(序列：2)

ng-pto5’-gtacgcgatacgggcccctcattggcgtgtttcg[c3spacer]-3’(序列：7)

ng-cto5’-[bhq-2]tttttttttttttttttttg[t(calfluorred610)]actgcccgtatcgcgtac[c3spacer]-3’(序列：8)

ct-f25’-gagttttaaaatgggaaattctggtiiiiitttgtataac-3’(序列：9)

ct-r25’-ccaattgtaatagaagcattggttgiiiiittattggaga-3’(序列：10)

ct-pto5’-gattacgcgaccgcatcagaagctgtcattttggctgcg[c3spacer]-3’(序列：11)

ct-cto5’-[bhq-2]gcgctggataccctggacga[t(calfluorred610)]atgtgcggtcgcgtaatc[c3spacer]-3’(序列：12)

(i：脫氧肌苷)

(下劃線文字表示探測(cè)和標(biāo)標(biāo)記寡核苷酸的5’-標(biāo)記部位)

利用包含靶核酸(10pg的淋球菌的基因組脫氧核糖核酸、10pg的沙眼衣原體的基因組脫氧核糖核酸或10pg的淋球菌的基因組脫氧核糖核酸及10pg的沙眼衣原體的基因組脫氧核糖核酸的混合物)、5pmole的用于淋球菌的靶擴(kuò)增的上游引物(序列1)及5pmole的下游引物(序列2)、3pmole的探測(cè)和標(biāo)標(biāo)記寡核苷酸(序列7)、1pmole的捕捉和模板化寡核苷酸(序列8)，5pmole的用于沙眼衣原體的靶擴(kuò)增的上游引物(序列9)、5pmole的下游引物(序列10)、3pmole的探測(cè)和標(biāo)標(biāo)記寡核苷酸(序列10)、1pmole的捕捉和模板化寡核苷酸(序列12)以及5μl的4×主混合液(最終，200μm的三磷酸脫氧核苷酸、2mm的mgcl2及2u的taq脫氧核糖核酸聚合酶)的20μl的最終體積進(jìn)行了實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。在50℃的溫度下在實(shí)時(shí)熱循環(huán)儀(cfx96，伯樂(lè)公司(bio-rad))中將含有上述反應(yīng)混合物的管放入5分鐘，在95℃的溫度下變性30秒，并且以在95℃的溫度下30秒鐘、在60℃的溫度下60秒鐘、在72℃的溫度下30秒鐘，在67.8℃下5秒鐘的方式實(shí)施50次。在每個(gè)循環(huán)的60℃及67.8℃的溫度下進(jìn)行了信號(hào)的檢測(cè)。

如圖2a所示，當(dāng)淋球菌、沙眼衣原體或淋球菌+沙眼衣原體存在時(shí)，在60℃及67.8℃溫度下均檢測(cè)出了信號(hào)。當(dāng)靶核酸不存在時(shí)，未檢測(cè)出信號(hào)。通過(guò)使用淋球菌獨(dú)立樣品或沙眼衣原體獨(dú)立樣品的信號(hào)來(lái)計(jì)算了各個(gè)靶的基準(zhǔn)值。如圖2b所示，與淋球菌及沙眼衣原體靶有關(guān)的基準(zhǔn)值分別為6.1及1.0。

之后，為了確認(rèn)各個(gè)樣品，將相應(yīng)的基準(zhǔn)值、在67.8℃及60℃溫度下的rfu適用于繪制式(在圖2c及圖2d)中的(i)式或(ii)式)，并獲取了各個(gè)靶序列的擴(kuò)增曲線。為了確保獲取的擴(kuò)增曲線的顯著性，參照淋球菌獨(dú)立樣品及沙眼衣原體獨(dú)立樣品的結(jié)果，來(lái)選擇了適當(dāng)?shù)拈撝怠?/p>

如圖2c及圖2d所示，來(lái)源于繪制方法的擴(kuò)增曲線可確認(rèn)各個(gè)樣品內(nèi)淋球菌或沙眼衣原體的存在或不存在。

因此，通過(guò)包含在不同溫度下的信號(hào)檢測(cè)的探測(cè)和標(biāo)標(biāo)記寡核苷酸切割及延伸實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，使用單一檢測(cè)通道，來(lái)在一個(gè)反應(yīng)容器中可檢測(cè)出2個(gè)靶核酸。

因此，可理解如下：通過(guò)使用探測(cè)和標(biāo)標(biāo)記寡核苷酸切割及延伸實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，使用單一檢測(cè)通道，來(lái)在一個(gè)反應(yīng)容器中可檢測(cè)出2個(gè)靶核酸。

實(shí)施例3：使用不同檢測(cè)溫度及基準(zhǔn)值的單核苷酸多態(tài)性基因型分析

本發(fā)明人對(duì)本發(fā)明的方法可否適用于使用單一檢測(cè)通道在一個(gè)反應(yīng)容器中分析單核苷酸多態(tài)性基因型進(jìn)行了調(diào)查。將探測(cè)和標(biāo)標(biāo)記寡核苷酸切割及延伸實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)適用為信號(hào)產(chǎn)生機(jī)構(gòu)。

為了上游引物、下游引物、探測(cè)和標(biāo)標(biāo)記寡核苷酸的切割及探測(cè)和標(biāo)標(biāo)記寡核苷酸片段的延伸，而使用了具有5’核酸酶活性的taq脫氧核糖核酸聚合酶。將mthfr(c677t)人類基因組脫氧核糖核酸的野生型(c)純合子、突變型(t)純合子及雜合子用作靶核酸序列。

通過(guò)使用探測(cè)和標(biāo)標(biāo)記寡核苷酸切割及延伸實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，來(lái)檢測(cè)了mthfr(c677t)人類基因組脫氧核糖核酸的野生型(c)等位基因及突變型(t)等位基因。在靶等位基因存在的情況下，探測(cè)和標(biāo)標(biāo)記寡核苷酸被放出，并生成探測(cè)和標(biāo)標(biāo)記寡核苷酸片段。上述探測(cè)和標(biāo)標(biāo)記寡核苷酸片段在捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位被退火，在捕捉和模板化寡核苷酸的模板化部位上延伸，而形成捕捉和模板化寡核苷酸和延伸二聚體(二聚的捕捉和模板化寡核苷酸)。上述延伸二聚體的形成提供信號(hào)，并通過(guò)在延伸二聚體形成溫度下測(cè)定信號(hào)，來(lái)可獲取擴(kuò)增曲線。

探測(cè)和標(biāo)標(biāo)記寡核苷酸及捕捉和模板化寡核苷酸的其的3’-末端以防止其延伸的方式被碳間隔區(qū)阻斷。利用猝滅分子(bhq-2)標(biāo)志于與野生型(c)等位基因或突變型(t)等位基因有關(guān)的捕捉和模板化寡核苷酸的其的5’-末端以及利用熒光報(bào)道分子(calfluorred610)標(biāo)志于其的模板部位(序列16及序列18)。

在本實(shí)施例中選擇64℃及60℃作為信號(hào)檢測(cè)溫度。以依賴于野生型(c)等位基因或突變型(t)等位基因的存在的方式生成的延伸二聚體具有通過(guò)它們的序列及長(zhǎng)度調(diào)節(jié)的能夠控制的tm值。在本實(shí)施例中以在64℃及60℃溫度下均提供信號(hào)的方式設(shè)計(jì)與野生型(c)等位基因及突變型(t)等位基因有關(guān)的延伸二聚體的序列及長(zhǎng)度。以野生型(c)等位基因的基準(zhǔn)值與突變型(t)等位基因的基準(zhǔn)值不同的方式設(shè)計(jì)及選擇包含延伸二聚體及2個(gè)檢測(cè)溫度的反應(yīng)條件。

通過(guò)與上述3個(gè)基因型有關(guān)的基準(zhǔn)值比較在2個(gè)檢測(cè)溫度下檢測(cè)出的信號(hào)之間的差異，來(lái)可確定包含mthfr(c677t)基因的未公知的樣品的基因型。

為了確認(rèn)mthfr(c677t)基因的單核苷酸多態(tài)性基因型，計(jì)算了于各個(gè)基因型有關(guān)的基準(zhǔn)值。由于可分辨于各個(gè)基因型有關(guān)的基準(zhǔn)值，因此本發(fā)明人利用2個(gè)cut-off值來(lái)可劃分與各個(gè)基因型有關(guān)的基準(zhǔn)值的范圍。如下計(jì)算在本實(shí)施例中使用的與各個(gè)基因型有關(guān)的基準(zhǔn)值。

與野生型純合子、突變純合子及雜合子有關(guān)的基準(zhǔn)值

在端點(diǎn)下，在60℃溫度下的rfu÷在64℃溫度下的rfu

在上述式中，rfu(相對(duì)熒光單位)值為在實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的端點(diǎn)下測(cè)定的值。

在本實(shí)施例中使用的上游引物、下游引物、探測(cè)和標(biāo)標(biāo)記寡核苷酸及捕捉和模板化寡核苷酸的序列如下。

m677-f5’-ccaccccgaagcagggaiiiiigaggctgacc-3’(序列：13)

m677-r5’-caagtgatgcccatgtcggiiiiigccttcacaa-3’(序列：14)

m677-w-pto5’-ggtcccgacgttagctcccgcagacaccttctccttc[c3spacer]-3’(序列：15)

m677-w-cto5’-[bhq-2]cctcggtgccacgccatcgg[t(calfluorred610)]tcttctaacgtcgggacc[c3spacer]-3’(序列：16)

m677-m-pto5’-acgtcgattcgcactcccgcagacaccttctccttcaa[c3spacer]-3’(序列：17)

m677-m-cto5’-[bhq-2]tttttttttttttttttttt[t(calfluorred610)]attctgcgaatcgacgt[c3spacer]-3’(序列：18)

(i：脫氧肌苷)

(下劃線文字表示探測(cè)和標(biāo)標(biāo)記寡核苷酸的5’-標(biāo)記部位)

利用包含靶核酸(10ng的野生型(c)同源二聚體mthfr(c677t)人類基因組脫氧核糖核酸、10ng的突變(t)同源二聚體mthfr(c677t)人類基因組脫氧核糖核酸或10ng的異源二聚體mthfr(c677t)人類基因組脫氧核糖核酸)、5pmole的上游引物(序列13)及5pmole的下游引物(序列14)、3pmole的各個(gè)探測(cè)和標(biāo)標(biāo)記寡核苷酸(序列15及序列17)、1pmole的各個(gè)捕捉和模板化寡核苷酸(序列16及序列18)以及5μl的4×主混合液(最終，200μm的三磷酸脫氧核苷酸、2mm的mgcl2及2u的taq脫氧核糖核酸聚合酶)的20μl的最終體積進(jìn)行了實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。在50℃的溫度下在實(shí)時(shí)熱循環(huán)儀(cfx96，伯樂(lè)公司)中將含有上述反應(yīng)混合物的管放入5分鐘，在95℃的溫度下變性15分鐘，并且以在95℃的溫度下30秒鐘、在60℃的溫度下60秒鐘、在72℃的溫度下30秒鐘，在64℃溫度下5秒鐘的方式進(jìn)行了50次。在每個(gè)循環(huán)的60℃及64℃的溫度下進(jìn)行了信號(hào)的檢測(cè)。

如圖3a所示，當(dāng)野生型(c)純合子、突變(t)純合子或雜合子存在時(shí)，在60℃及64℃溫度下均檢測(cè)出了熒光信號(hào)。當(dāng)靶核酸不存在時(shí)，未檢測(cè)出信號(hào)。確認(rèn)計(jì)算與3個(gè)基因型有關(guān)的基準(zhǔn)值，并根據(jù)cut-off值可進(jìn)行分辨。

如圖3b所示，與野生型(c)純合子、雜合子及突變(t)純合子有關(guān)的基準(zhǔn)值分別為1.0、1.3及2.7。確認(rèn)了與各個(gè)基因型有關(guān)的基準(zhǔn)值表示可分辨各個(gè)基因型。

這些結(jié)果示出如下：在使用單一檢測(cè)通道在一個(gè)反應(yīng)容器中分析單核苷酸多態(tài)性基因型中可適用本發(fā)明的方法。有趣地是，無(wú)法相互分辨來(lái)自等位基因的信號(hào)，但是在本發(fā)明的方法中使用單一檢測(cè)通道可準(zhǔn)確地分析單核苷酸多態(tài)性基因型來(lái)實(shí)施。

詳細(xì)記述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)例，可進(jìn)行根據(jù)本發(fā)明的原理的變形及修改，這對(duì)本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的，本發(fā)明的范圍可根據(jù)所附的發(fā)明要求保護(hù)范圍和其的等同技術(shù)方案定義。

?序列表

<110>seegene,inc.

<120>使用不同檢測(cè)溫度及基準(zhǔn)值的靶核酸序列檢測(cè)

<130>pp150135

<150>us62/089723

<151>2014-12-09

<160>18

<170>kopatentin2.0

<210>1

<211>37

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>ng-f

<220>

<221>misc_feature

<222>(22)..(26)

<223>n表示脫氧肌酐

<400>1

tacgcctgctactttcacgctnnnnngtaatcagatg37

<210>2

<211>37

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>ng-r

<220>

<221>misc_feature

<222>(22)..(26)

<223>n表示脫氧肌酐

<400>2

caatggatcggtatcactcgcnnnnncgagcaagaac37

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<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>ng-p

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tgcccctcattggcgtgtttcg22

<210>4

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<212>dna

<213>人工序列

<220>

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<220>

<221>misc_feature

<222>(22)..(26)

<223>n表示脫氧肌酐

<400>4

tccgaatggataaagcgtgacnnnnnatgaactcac36

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<212>dna

<213>人工序列

<220>

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<221>misc_feature

<222>(23)..(27)

<223>n表示脫氧肌酐

<400>5

aacaatgaatcctgagcaaaggnnnnncgttagagtc37

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<212>dna

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gtacgcgatacgggcccctcattggcgtgtttcg34

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<220>

<223>ng-cto

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<212>dna

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<222>(26)..(30)

<223>n表示脫氧肌酐

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gagttttaaaatgggaaattctggtnnnnntttgtataac40

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<222>(26)..(30)

<223>n表示脫氧肌酐

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ccaattgtaatagaagcattggttgnnnnnttattggaga40

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<223>n表示脫氧肌酐

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<213>人工序列

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<221>misc_feature

<222>(20)..(24)

<223>n表示脫氧肌酐

<400>14

caagtgatgcccatgtcggnnnnngccttcacaa34

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<212>dna

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<400>15

ggtcccgacgttagctcccgcagacaccttctccttc37

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<212>dna

<213>人工序列

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<400>16

cctcggtgccacgccatcggttcttctaacgtcgggacc39

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<213>人工序列

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<400>17

acgtcgattcgcactcccgcagacaccttctccttcaa38

<210>18

<211>38

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>m677-m-cto

<400>18

tttttttttttttttttttttattctgcgaatcgacgt38