本發(fā)明涉及一種細胞的培養(yǎng)技術，特別涉及用于使淋巴細胞活化的培養(yǎng)容器及其制造方法。

背景技術：

近年來，在醫(yī)藥品的生產(chǎn)、基因治療、再生醫(yī)療、免疫療法等領域中，要求在人工環(huán)境下高效地大量培養(yǎng)細胞或組織、微生物等。

在這樣的狀況下，向由透氣性膜形成的培養(yǎng)容器中封入細胞和培養(yǎng)液，在封閉系統(tǒng)中自動地大量培養(yǎng)細胞。

特別是在培養(yǎng)淋巴細胞的情況下，在用于增加細胞數(shù)的培養(yǎng)之前，首先需要使用抗cd3抗體進行用于使淋巴細胞活化的培養(yǎng)。為此，向加入了抗cd3抗體的培養(yǎng)容器中加入淋巴細胞和培養(yǎng)液，進行其活化。

但是，在向培養(yǎng)容器中僅加入了少量的溶液狀的抗cd3抗體的情況下，對淋巴細胞的刺激就會不充分，無法充分地進行活化。另一方面，在向培養(yǎng)容器中大量地加入了溶液狀的抗cd3抗體的情況下，會因細胞的防御機理而使存在于細胞膜中的cd3抗原脫落，淋巴細胞的活化受到阻礙。

以抗cd3抗體作為主成分的免疫抑制劑是著眼于這樣的淋巴細胞的性質而創(chuàng)造的物質，當將其對在內臟器官·組織移植后產(chǎn)生排斥反應的患者施用時，大量的抗cd3抗體與抗原結合而集聚，該集聚物被引入細胞內后向細胞外排出。或者，集聚物由酶切斷，從細胞表面除去抗原。其結果是，刺激不會被傳遞到細胞內，淋巴細胞的活化受到抑制。

如此所述，很難使用游離在溶液中的抗體恰當?shù)乜刂屏馨图毎幕罨?，以往，一般廣泛進行的是，將抗cd3抗體固相化在培養(yǎng)容器的底內面，使用這樣的培養(yǎng)容器適度地刺激淋巴細胞，由此將淋巴細胞活化。

另外，在制造淋巴細胞的活化用培養(yǎng)袋(以下有時簡稱為活化培養(yǎng)袋)時，在向培養(yǎng)袋內封入含有抗cd3抗體的抗體溶液而使抗cd3抗體固相化在培養(yǎng)袋內面后，清洗培養(yǎng)袋內而除去游離抗體，其后封入淋巴細胞和培養(yǎng)液而進行活化培養(yǎng)。通過像這樣清洗培養(yǎng)袋內而除去游離抗體，就可以更加有效地進行淋巴細胞的活化。

現(xiàn)有技術文獻

特許文獻1：日本特開2007－175028號公報

技術實現(xiàn)要素：

發(fā)明所要解決的問題

因而，本發(fā)明人等為了調查在活化培養(yǎng)袋中殘存有抗體溶液時的游離抗體對活化的不良影響，使用各種濃度的抗體溶液，進行了淋巴細胞的活化。

其結果是發(fā)現(xiàn)，令人驚奇的是，雖然在抗體濃度是活化培養(yǎng)袋的制造中所用的程度的較高濃度的情況下，淋巴細胞的活化受到抑制，然而在某個一定范圍的低濃度的情況下，淋巴細胞的活化反而得到促進。

即，通過將抗cd3抗體固相化在活化培養(yǎng)袋中，并且封入低濃度的游離抗體，可以促進由活化培養(yǎng)袋造成的淋巴細胞的活化，其結果是，判明可以進一步提高淋巴細胞的增殖效率。

此處，專利文獻1的實施例1中記載，為了制造淋巴細胞的活化培養(yǎng)袋，向培養(yǎng)袋內封入含有抗cd3抗體的抗體溶液而使抗cd3抗體固相化在培養(yǎng)袋內面后，在保持封入抗體溶液不變的狀態(tài)下進行活化。另外，在專利文獻1的實施例2中記載，在使抗cd3抗體固相化在培養(yǎng)袋內面后，清洗培養(yǎng)袋內而除去游離抗體，其后封入淋巴細胞和培養(yǎng)液而進行活化。此后，其結果是顯示，在保持封入抗體溶液不變的狀態(tài)下進行活化的實施例1與清洗培養(yǎng)袋內而除去游離抗體的實施例2相比，淋巴細胞的增殖效率低。

即可以認為，實施例1中由于在培養(yǎng)袋內殘留有大量的游離抗體，因此淋巴細胞的活化受到抑制，與實施例2相比淋巴細胞的增殖效率變低。

另一方面，專利文獻1中，對于為了進一步提高淋巴細胞的活化效率而向使抗cd3抗體固相化了的活化培養(yǎng)袋中封入一定范圍的低濃度的游離抗體的做法，既沒有記載也沒有啟示。

本發(fā)明是鑒于上述事情而完成的，其目的在于，提供能夠以高于以往的效率使淋巴細胞活化的培養(yǎng)容器及其制造方法。

用于解決問題的方法

為了達成上述目的，本發(fā)明的培養(yǎng)容器采用了如下的構成，即，是用于使淋巴細胞活化的由軟包裝材料制成的袋狀的培養(yǎng)容器，在相面對的容器內面的一面以10～300ng/cm²的密度(以下有時將每單位面積的抗體固相化量簡稱為密度)固相化有抗cd3抗體，并且以每1cm²由所述一面構成的培養(yǎng)面中0.25～400ng且0.1～800μl的量封入了溶液狀的抗cd3抗體。

另外，本發(fā)明的培養(yǎng)容器的制造方法采用了如下的方法，即，是用于使淋巴細胞活化的由軟包裝材料制成的袋狀的培養(yǎng)容器的制造方法，在相面對的容器內面的一面以10～300ng/cm²的密度固相化抗cd3抗體，以每1cm²由所述一面構成的培養(yǎng)面中0.25～400ng且0.1～800μl的量封入溶液狀的抗cd3抗體。

發(fā)明效果

根據(jù)本發(fā)明，可以提供能夠以高于以往的效率使淋巴細胞活化的培養(yǎng)容器及其制造方法。

附圖說明

圖1是顯示出本發(fā)明的實施方式的培養(yǎng)容器的概略的正面示意圖。

圖2是顯示出本發(fā)明的實施方式的培養(yǎng)容器的概略的俯視示意圖。

圖3是顯示出向本發(fā)明的實施方式的培養(yǎng)容器中封入淋巴細胞和培養(yǎng)液而進行活化培養(yǎng)的樣子的正面示意圖。

圖4是顯示出本發(fā)明的實施方式的培養(yǎng)容器的應用例的概略的正面示意圖。

圖5是顯示出表示借助本發(fā)明的實施方式的培養(yǎng)容器的各種游離抗體濃度(10ng/ml～500ng/ml)的細胞增殖倍率的實驗1(僅為活化培養(yǎng)工序)的結果的圖。

圖6是顯示出表示借助本發(fā)明的實施方式的培養(yǎng)容器的各種游離抗體濃度(5ng/ml，10ng/ml)的細胞增殖倍率的實驗2(活化培養(yǎng)工序+擴增培養(yǎng)工序)的結果的圖。

具體實施方式

以下，對本發(fā)明的培養(yǎng)容器、以及培養(yǎng)容器的制造方法的實施方式，使用圖1～4進行詳細說明。圖1是顯示出本實施方式的培養(yǎng)容器的概略的正面示意圖，圖2是同一培養(yǎng)容器的俯視示意圖，圖3是顯示出向該培養(yǎng)容器中封入淋巴細胞和培養(yǎng)液而進行活化培養(yǎng)的樣子的正面示意圖。另外，圖4是顯示出該培養(yǎng)容器的應用例的概略的正面示意圖。

[培養(yǎng)容器]

如圖1、2所示，本發(fā)明的實施方式的培養(yǎng)容器10具有在上下方向相面對的容器壁。此外，容器內面的一方成為將抗體12固相化了的固相化面11(圖1、2的容器內的底面)，該固相化面11被作為培養(yǎng)面使用。另外，在培養(yǎng)容器10內，封入了抗體12游離的抗體溶液13。

而且，在培養(yǎng)容器10中，具備可以連接管道14的端口，利用該端口進行向培養(yǎng)容器10內的淋巴細胞和培養(yǎng)液的封入、以及培養(yǎng)后的淋巴細胞和培養(yǎng)液的回收。雖然圖1、2的例子中在培養(yǎng)容器10上連接有一條管道14，然而也可以連接2條以上。

培養(yǎng)容器10被使用具有細胞培養(yǎng)所必需的透氣性的膜制成袋狀(bag型)。作為這樣的培養(yǎng)容器10的材料，可以合適地使用聚乙烯、聚丙烯等聚烯烴系樹脂。

作為固相化在固相化面11的抗體12，使用抗cd3抗體。利用抗cd3抗體將淋巴細胞活化，可以使之增殖。

固相化面11中的抗體12的固相化的密度優(yōu)選設為10～300ng/cm²，更優(yōu)選設為10～40ng/cm²。

如果將抗體12的固相化的密度設為10ng/cm²以上，則可以高效地使淋巴細胞活化。另外，由于固相化面11中的抗cd3抗體的最密填充密度為300ng/cm²，因此通過將抗體12固相化至該密度范圍，可以使淋巴細胞恰當?shù)鼗罨?。此外，如果將抗體12的固相化的密度設為10～40ng/cm²，則可以特別大地提高淋巴細胞的增殖效率。

在培養(yǎng)容器10中，優(yōu)選在作為培養(yǎng)面使用的固相化面11中，以每1cm²中0.25～400ng且0.1～800μl的量封入溶液狀的抗體12。這是因為，通過向培養(yǎng)容器10中以這樣的量封入溶液狀的抗體12，可以進一步提高淋巴細胞的活化，其結果是，可以進一步提高增殖效率。

從這樣的觀點考慮，更優(yōu)選以每1cm²培養(yǎng)面中0.5～300ng且0.1～600μl的量封入溶液狀的抗體12，進一步優(yōu)選以1～200ng且0.1～400μl的量封入，更進一步優(yōu)選以1～200ng且0.1～200μl的量封入。

另外，優(yōu)選將培養(yǎng)容器10中的游離的抗cd3抗體的濃度(以下有時簡稱為游離抗體濃度)設為5～100ng/ml。這是因為，通過使游離抗體濃度在這樣的范圍中，可以進一步提高淋巴細胞的活化，其結果是，可以進一步提高增殖效率。

此處，對于使用了由軟包裝材料制成的培養(yǎng)容器的細胞培養(yǎng)，為了獲得優(yōu)異的培養(yǎng)效率，一般多將培養(yǎng)液的液厚設為0.2～2cm而進行。在游離抗體濃度為5ng/ml的情況下，如果將液厚設為0.2cm，則每1cm²中的抗體量為1ng。另外，在游離抗體濃度為100ng/ml的情況下，如果將液厚設為2cm，則每1cm²中的抗體量為200ng。因而，如果將游離抗體濃度設為5～100ng/ml、將培養(yǎng)液的液厚設為0.2～2cm，則會向培養(yǎng)容器10中以每1cm²培養(yǎng)面中1～200ng的量封入溶液狀的抗體12。

另外，有時基于調整細胞密度等理由而從0.05～4cm的范圍中選擇培養(yǎng)液的液厚。如果將該情況下的游離抗體濃度設為5～100ng/ml并進行培養(yǎng)，則在游離抗體濃度為5ng/ml的情況下，將液厚設為0.05cm時，則每1cm²中的抗體量為0.25ng。另外，在游離抗體濃度為100ng/ml的情況下，將液厚設為4cm時，則每1cm²中的抗體量為400ng。因而，向培養(yǎng)容器10中以每1cm²培養(yǎng)面中0.25～400ng的量封入溶液狀的抗體12。

此外，由于很難向培養(yǎng)容器中以每1cm²培養(yǎng)面積中少于0.1μl的量封入溶液狀的抗cd3抗體，因此優(yōu)選以0.1μl以上的量封入。另外，從由軟包裝材料制成的培養(yǎng)容器的處置等觀點考慮，通常所用的培養(yǎng)容器的容量多為每1cm²培養(yǎng)面積中4000μl以下，對于相對于培養(yǎng)液量而言的抗體溶液量的比例，為了獲得優(yōu)異的培養(yǎng)效率，優(yōu)選設為2成以下，更優(yōu)選設為1成以下，進一步優(yōu)選設為0.5成以下。由此，優(yōu)選向培養(yǎng)容器中以每1cm²培養(yǎng)面積中800μl以下的量封入溶液狀的抗cd3抗體，更優(yōu)選以400μl以下的量封入，進一步優(yōu)選以200μl以下的量封入。

通過向這樣的培養(yǎng)容器10中經(jīng)由管道14注入淋巴細胞和培養(yǎng)液、進行淋巴細胞的活化，與使用僅進行抗體12的固相化的培養(yǎng)容器的情況相比，可以使淋巴細胞恰當?shù)亟佑|抗cd3抗體，可以進一步提高淋巴細胞的活化效率。

圖3是示意性地顯示出這樣的活化培養(yǎng)的樣子的圖，抗體12被固相化在培養(yǎng)容器10的底內面，并且抗體12在培養(yǎng)液30中以低濃度游離。這樣，淋巴細胞20就會由經(jīng)過固相化的抗體12和游離著的抗體12活化。

另外，也優(yōu)選將本發(fā)明的實施方式的培養(yǎng)容器作為如下的培養(yǎng)容器10a來構成，即，如圖4所示，在與固相化面11相面對的容器內面(以下有時稱作對置面)以小于固相化面11中的密度的密度固相化抗cd3抗體。

即，在對置面是沒有固相化有抗體12的非固相化面的情況下，例如如果在保管時或運輸時溶液中的游離抗體吸附于非固相化面，則培養(yǎng)容器中的游離抗體的濃度降低，因此其濃度控制變得困難。

因而，本實施方式的培養(yǎng)容器10a中，通過將抗cd3抗體固相化在對置面，而可以抑制培養(yǎng)容器中的游離抗體的濃度降低。固相化在對置面的抗cd3抗體的濃度沒有特別限定，然而優(yōu)選使之為固相化面11的0.01～0.9倍左右的密度。

[培養(yǎng)容器的制造方法]

本實施方式的培養(yǎng)容器10例如可以如下所示地制造。

首先，使用塑料擠出成型裝置將低密度聚乙烯擠出成型，形成膜。此后，使用脈沖熱封機，由該膜制造培養(yǎng)袋型的培養(yǎng)容器10。另外，將管道14經(jīng)由端口與培養(yǎng)容器10連接。

然后，將培養(yǎng)容器10載放于裝載臺，封入給定的量的氣體，并且繼續(xù)封入溶解有抗體12的緩沖液。此后，通過對培養(yǎng)容器10進行搖動等，而在培養(yǎng)容器10內的底面上使緩沖液的液滴移動，使緩沖液中所含的抗體12附著于培養(yǎng)容器10內的底面上。

此時，作為固相化在固相化面11的抗體12使用抗cd3抗體，如前所述，優(yōu)選將固相化面11中的抗體12的固相化的密度設為10～300ng/cm²，更優(yōu)選設為10～40ng/cm²。

另外，通過將抗cd3抗體也固相化在與固相化面11相面對的容器內面，就可以制造圖4所示的培養(yǎng)容器10a。

此時，優(yōu)選以固相化面11的0.01～0.9倍左右的密度將抗cd3抗體固相化。

繼而，向如此所述地固相化有抗體12的培養(yǎng)容器10(或培養(yǎng)容器10a)內，以每1cm²培養(yǎng)面(固相化面11)中0.25～400ng且0.1～800μl的量封入溶液狀的抗cd3抗體。另外，如前所述，更優(yōu)選以每1cm²培養(yǎng)面中0.5～300ng且0.1～600μl的量封入溶液狀的抗cd3抗體，進一步優(yōu)選以1～200ng且0.1～400μl的量封入，更進一步優(yōu)選以1～200ng且0.1～200μl的量封入。

如上說明所示，根據(jù)本實施方式，可以獲得具備固相化有抗體12的固相化面11、并且以上述最佳的量封入了溶液狀的抗cd3抗體的培養(yǎng)容器。這樣，利用這樣的培養(yǎng)容器，可以以高于以往的效率將淋巴細胞活化，可以進一步提高淋巴細胞的增殖效率。

[實施例]

制造封入了各種濃度的抗體溶液的培養(yǎng)容器而進行淋巴細胞的活化，確認了借助各個培養(yǎng)容器得到的淋巴細胞的增殖效率。具體而言，如下所示地進行。

＜實驗1＞

[培養(yǎng)容器的制作]

使用laboplastomill(東洋精機制作所制)將低密度聚乙烯擠出成型而成形為厚100μm的膜，用脈沖熱封機制作出11cm×20.5cm(約225cm²)的培養(yǎng)袋。

[抗體的固相化]

向該培養(yǎng)袋中封入空氣約250ml，封入溶解有20μg的抗cd3抗體(takarabio株式會社制)的磷酸緩沖液(抗體溶液，lifetechnologyjapan株式會社制)2ml。此后，搖動培養(yǎng)袋，使液滴以10m/分鐘的速度在培養(yǎng)袋內面上移動2.5分鐘。然后，排出抗體溶液后，封入磷酸緩沖液2ml，以10m/分鐘的速度使之在培養(yǎng)袋內面上移動2.5分鐘，將其排出，由此進行清洗，從培養(yǎng)袋內面除去游離抗體。利用bca法測定出被固相化了的抗體量，其結果為37ng/cm²的固相化量。

[活化培養(yǎng)試驗用培養(yǎng)袋的制作]

將固相化有抗體的培養(yǎng)袋用脈沖熱封機調整為5cm×5cm，制作出用于在活化培養(yǎng)試驗中使用的培養(yǎng)袋。然后，以使培養(yǎng)時的游離抗體的濃度分別為10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、500ng/ml的方式，將溶解有抗cd3抗體的磷酸緩沖液(分別為1μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、50μg/ml)50μl封入活化試驗用培養(yǎng)袋中。另外，作為對照實驗，準備了沒有封入溶解有抗cd3抗體的磷酸緩沖液的培養(yǎng)袋。

[淋巴細胞的活化工序]

將作為淋巴細胞的一種的人末梢血單核細胞(cellapplications，inc.制)8.2×10⁵個懸浮于加入了2％胎牛血清(lifetechnologiesjapan株式會社制)的alys505n－7(株式會社細胞科學研究所)培養(yǎng)基中，準備了細胞懸浮液。此后，分別向活化培養(yǎng)試驗用培養(yǎng)袋中封入細胞懸浮液5ml。

通過將這些培養(yǎng)袋在37℃靜置培養(yǎng)116小時，而進行了淋巴細胞的活化(活化培養(yǎng)工序)。此后，活化培養(yǎng)結束時計數(shù)培養(yǎng)袋中的細胞數(shù)，算出增殖倍率。將其結果表示于圖5中。

如圖5所示，對于淋巴細胞的增殖倍率，對照實驗(僅固相化)為4.30倍，游離抗體濃度10ng/ml時為5.24倍，游離抗體濃度50ng/ml時為5.20倍，游離抗體濃度100ng/ml時為4.88倍，游離抗體濃度200ng/ml時為3.77倍，游離抗體濃度500ng/ml時為3.18倍。

即，可知在游離抗體濃度為10ng/ml～100ng/ml的情況下，與僅利用經(jīng)過固相化的抗體進行活化的情況相比，增殖效率提高。

與之不同，可知在游離抗體濃度為200ng/ml以上的情況下，與僅利用經(jīng)過固相化的抗體進行活化的情況相比，增殖效率降低。

如此所述，可以認為，在游離抗體濃度為上述一定范圍的低濃度的情況下，可以進一步提高淋巴細胞的增殖效率。另一方面，在游離抗體濃度更大的情況下，淋巴細胞的活化受到阻礙，增殖效率降低。

＜實驗2＞

進行了用于確認培養(yǎng)容器中的游離抗體濃度小于10ng/ml時的淋巴細胞的增殖效率的實驗。對于培養(yǎng)容器的制作、以及抗體的固相化，與實驗1相同地進行。

[活化培養(yǎng)試驗用培養(yǎng)袋的制作]

將固相化有抗體的培養(yǎng)袋用脈沖熱封機調整為5cm×5cm，制作出用于在活化培養(yǎng)試驗中使用的培養(yǎng)袋。然后，以使培養(yǎng)時的游離抗體的濃度分別為5ng/ml、10ng/ml的方式，將溶解有抗cd3抗體的磷酸緩沖液(分別為0.5μg/ml、1μg/ml)50μl封入活化試驗用培養(yǎng)袋。另外，作為對照實驗，準備了沒有封入溶解有抗cd3抗體的磷酸緩沖液的培養(yǎng)袋。

[淋巴細胞的活化工序]

將作為淋巴細胞的一種的人末梢血單核細胞(cellapplications，inc.制)8.6×10⁵個懸浮于加入了2％胎牛血清(lifetechnologiesjapan株式會社制)的alys505n－7(株式會社細胞科學研究所)培養(yǎng)基中，準備了細胞懸浮液。此后，分別向活化培養(yǎng)試驗用培養(yǎng)袋中封入細胞懸浮液5ml。

此后，通過將這些培養(yǎng)袋在37℃靜置培養(yǎng)122小時，而進行了淋巴細胞的活化。

然后，將活化了的淋巴細胞轉移到?jīng)]有固相化抗體的盤(corning制)中，恰當?shù)剡M行稀釋操作，培養(yǎng)192小時(擴增培養(yǎng)工序)。此后，在擴增培養(yǎng)結束時計數(shù)培養(yǎng)袋中的細胞數(shù)，算出增殖倍率。將其結果表示于圖6中。

如圖6所示，對于淋巴細胞的增殖倍率，對照實驗(僅固相化)為73倍，游離抗體濃度5ng/ml時為125倍，游離抗體濃度10ng/ml時為103倍。

即，可知在游離抗體濃度為5ng/ml及10ng/ml的情況下，與僅利用經(jīng)過固相化的抗體進行活化的情況相比，增殖效率均大幅度提高。

如上所述，根據(jù)實驗1及實驗2的結果可以確認，在培養(yǎng)容器中的游離抗體濃度為5～100ng/ml的情況下，與僅利用經(jīng)過固相化的抗體進行活化的情況相比，增殖效率提高。

本發(fā)明并不限定于以上的實施方式或實施例，當然可以在本發(fā)明的范圍內中實施各種變更。

例如，可以使培養(yǎng)容器的大小、淋巴細胞的種類、以及培養(yǎng)基與實施例不同等，適當?shù)剡M行變更。

產(chǎn)業(yè)上的可利用性

本發(fā)明可以適用于大量培養(yǎng)淋巴細胞的情況。

將該說明書中記載的文獻及成為本申請的巴黎優(yōu)先權的基礎的日本申請說明書的內容全都引用到本文中。

符號的說明

10、10a培養(yǎng)容器，

11固相化面，

12抗體，

13抗體溶液，

14管道，

20淋巴細胞，

30培養(yǎng)液。