相關(guān)申請的交叉引用本發(fā)明要求于2014年12月12日提交的美國臨時專利申請62/091,053的優(yōu)先權(quán)益，所述申請以引用方式整體并入。發(fā)明領(lǐng)域本文提供了涉及進行甲基化測定的技術(shù)。特別地，所述技術(shù)涉及用于甲基化測定的內(nèi)部對照。背景已經(jīng)研究了甲基化dna作為大多數(shù)腫瘤類型的組織中的一類潛在生物標(biāo)記。在許多情況下，dna甲基轉(zhuǎn)移酶在胞嘧啶-磷酸-鳥嘌呤(cpg)島位點處向dna添加甲基作為對基因表達的表觀遺傳控制。在生物學(xué)上引人注目的機制中，腫瘤抑制基因啟動子區(qū)中獲得的甲基化事件被認(rèn)為使表達沉默，從而有助于瘤形成。dna甲基化可能是比rna或蛋白質(zhì)表達在化學(xué)上和生物學(xué)上更穩(wěn)定的診斷工具(laird(2010)“principlesandchallengesofgenome-widednamethylationanalysis”natrevgenet11:191–203)。此外，在其它癌癥如散發(fā)性結(jié)腸癌中，甲基化標(biāo)記提供優(yōu)異的特異性，并且比作為個體dna突變更具廣泛的信息性和敏感性(zou等(2007)“highlymethylatedgenesincolorectalneoplasia:implicationsforscreening”cancerepidemiolbiomarkersprev16:2686–96)。被分析與疾病或疾病風(fēng)險相關(guān)的突變存在和/或甲基化狀態(tài)的來自糞便樣品的核酸通常在分析期間通過許多處理步驟。這些步驟可包括例如過濾、沉淀、捕獲、洗滌、洗脫和/或化學(xué)修飾。為了分析dna以確定甲基化狀態(tài)(例如測試dna的甲基化百分比)，處理通常包括用亞硫酸氫鹽處理以將未甲基化的dc堿基轉(zhuǎn)化為du殘基，使得它們更容易與被保護免于亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化的甲基-c殘基區(qū)分開來。測試dna的精確定量(例如確定甲基化百分比、攜帶突變的dna的存在和量等)通常需要歸一化成對照核酸，例如具有已知特征的內(nèi)源性不變基因(例如，已知序列、已知的每細(xì)胞拷貝數(shù))。歸一化可能在例如樣品處理、測定效率等中發(fā)生的樣品-樣品(sample-to-sample)變化的控制，并允許精確的樣品-樣品數(shù)據(jù)比較。概述本文提供了涉及進行甲基化測定的技術(shù)。特別地，所述技術(shù)涉及用于甲基化測定的內(nèi)部對照。在一些實施方案中，所述技術(shù)提供可用于測定樣品中總?cè)薲na輸入的參考dna，作為測定樣品中測試核酸的相對量(例如癌癥標(biāo)記基因的甲基化百分比)的手段。在某些優(yōu)選的實施方案中，所述技術(shù)提供了具有類似于與其比較的標(biāo)記dna的甲基化特征的參考dna，使得參考dna可與標(biāo)記dna暴露于相同的制備步驟，并且將表現(xiàn)得像標(biāo)記dna一樣。在一些實施方案中，所述技術(shù)提供對組織細(xì)胞(例如上皮細(xì)胞)特異性的對照或標(biāo)記dna。在具體實施方案中，所述技術(shù)提供例如在組織細(xì)胞—例如正常和癌上皮細(xì)胞中被高度甲基化但在血液中例如在淋巴細(xì)胞中未被甲基化的標(biāo)記dna。這些標(biāo)記dna具有許多應(yīng)用。例如，在一些實施方案中，這些標(biāo)記在定量可能還含有血細(xì)胞例如淋巴細(xì)胞的樣品中的組織來源的dna方面用作對照或參考dna，其將在檢測其它對照dna中產(chǎn)生本底，例如β-肌動蛋白。這些組織細(xì)胞特異性標(biāo)記還可用于檢測通常不存在組織細(xì)胞或組織dna的樣品中(例如，血液中)的組織細(xì)胞，其中組織細(xì)胞或組織dna的存在可指示疾病(例如癌癥轉(zhuǎn)移)的存在。例如，在一些實施方案中，所述技術(shù)提供了進行定量核酸檢測測定的方法，包括測定來自受試者的樣品的至少一種標(biāo)記基因的量；測定相同樣品的zdhhc1dna的量，并將樣品中所述至少一個標(biāo)記基因的量與zdhhc1dna的量進行比較，以確定所述樣品中相對于zdhhc1dna的量的所述至少一種標(biāo)記基因的量。在一些實施方案中，外部對照，例如校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)可用來確定標(biāo)記基因和/或zdhhc1dna的絕對定量。在一些實施方案中，所述技術(shù)包括用亞硫酸氫鹽試劑處理來自樣品的dna，以產(chǎn)生轉(zhuǎn)化的zdhhc1dna和至少一個轉(zhuǎn)化的標(biāo)記基因，使得測定標(biāo)記基因和zdhhc1dna的量包括測定轉(zhuǎn)化標(biāo)記基因和轉(zhuǎn)化zdhhc1dna的量。上述測定核酸的方法不限于任何特定的方法。在一些實施方案中，測定包括使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、核酸測序、質(zhì)譜、甲基化特異性核酸酶、基于質(zhì)量的分離或靶捕獲中的一種或多種。在一些優(yōu)選的實施方案中，標(biāo)記dna的測定和zdhhc1dna的測定在單個反應(yīng)中進行。在特別優(yōu)選的實施方案中，測定是側(cè)翼內(nèi)切核酸酶測定，例如quarts測定。在一些實施方案中，相對于轉(zhuǎn)化的zdhhc1dna的量的轉(zhuǎn)化的標(biāo)記基因的量指示例如測試樣品中標(biāo)記的甲基化狀態(tài)，并且甲基化狀態(tài)包括相對于正常的所述標(biāo)記基因的甲基化狀態(tài)的增加或減少的所述標(biāo)記基因的甲基化。在某些優(yōu)選的實施方案中，增加的甲基化百分比指示疾病狀態(tài)。另外的實施方案提供了檢測血液或血液制品中的組織細(xì)胞的方法，包括：檢測來自受試者的血液或血液制品樣品中甲基化zdhhc1的存在，其中甲基化zdhhc1的存在指示血液中組織細(xì)胞例如上皮細(xì)胞的存在。在一些實施方案中，樣品中組織細(xì)胞的存在指示受試者的轉(zhuǎn)移性癌癥。在一些實施方案中，血液制品是血漿。在一些實施方案中，測定包括使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、核酸測序、質(zhì)譜、甲基化特異性核酸酶、基于質(zhì)量的分離或靶捕獲。在一些實施方案中，測定是側(cè)翼內(nèi)切核酸酶測定，例如quarts測定。在一些實施方案中，癌癥是結(jié)腸直腸癌。另外的實施方案提供了檢測來自受試者的血液或血液制品中的轉(zhuǎn)移性癌癥的方法，包括：檢測來自受試者的血液或血液制品樣品中甲基化zdhhc1的存在，其中甲基化zdhhc1的存在指示受試者的轉(zhuǎn)移性癌癥的存在。另一些實施方案提供試劑盒，所述試劑盒包含：a)至少一種寡核苷酸，其中所述寡核苷酸的至少一部分與zdhhc1特異性雜交；以及b)亞硫酸氫鹽。在一些實施方案中，寡核苷酸選自例如捕獲寡核苷酸、一對核酸引物、核酸探針或invader寡核苷酸中的一種或多種。在一些實施方案中，試劑盒還包含與一種或多種靶基因特異性雜交的一種或多種核酸。在一些實施方案中，試劑盒還包含固體支持物(例如磁珠)。在一些實施方案中，固體支持物包含一種或多種捕獲試劑(例如，與zdhhc1和/或另外的靶基因互補的寡核苷酸)。另外的實施方案提供組合物，所述組合物包含：zdhhc1核酸和至少一種寡核苷酸的復(fù)合物，其中所述寡核苷酸的至少一部分與所述zdhhc1核酸雜交。在一些實施方案中，組合物還包含一種或多種另外的反應(yīng)混合物，所述一種或多種另外的反應(yīng)混合物包含靶核酸和與一種或多種靶基因特異性雜交的一種或多種寡核苷酸的復(fù)合物。另外的實施方案提供了篩選從受試者獲得的樣品中的瘤的方法，所述方法包括：a)測定來自受試者的樣品的至少一種甲基化標(biāo)記基因的量，所述至少一種甲基化標(biāo)記基因選自由以下組成的組：從受試者獲得的樣品中的波形蛋白(vimentin)、胞裂蛋白9(septin9)、ndrg4、bmp3、vav3、sfmbt2_897和tfpi2a；測定樣品的甲基化zdhhc1dna的量，并將樣品中所述至少一種甲基化標(biāo)記基因的量與甲基化zdhhc1dna的量進行比較，以確定樣品中至少一種標(biāo)記基因的甲基化狀態(tài)。在一些實施方案中，至少一種標(biāo)記是至少兩種、三種、四種或所有標(biāo)記。在一些實施方案中，測定還包括鑒定樣品中的kras突變評分的步驟。在一些實施方案中，k-ras突變評分的測量通過定量等位基因特異性pcr來測量。在一些實施方案中，測定包括檢測zdhhc1、bmp3、ndrg4的甲基化狀態(tài)，并鑒定樣品中的kras突變評分。在一些實施方案中，所述方法還包括確定樣品中血紅蛋白的存在的步驟。在一些實施方案中，患者患有炎性腸病。一些實施方案提供試劑盒，所述試劑盒包含：a)至少一種寡核苷酸，其中寡核苷酸的至少一部分與zdhhc1特異性雜交；以及b)至少一種另外的寡核苷酸，其中寡核苷酸的至少一部分與選自波形蛋白、胞裂蛋白9、ndrg4、bmp3、vav3、sfmbt2_897或tfpi2a的標(biāo)記特異性雜交。在一些實施方案中，試劑盒包含至少兩種另外的寡核苷酸。在一些實施方案中，試劑盒還包含亞硫酸氫鹽。在一些實施方案中，試劑盒還包含至少一種寡核苷酸，其中寡核苷酸的至少一部分與kras特異性雜交。在一些實施方案中，試劑盒還包含用于檢測糞便樣品中血紅蛋白的存在的試劑。某些實施方案提供組合物，所述組合物包含：a)zdhhc1核酸和至少一種寡核苷酸的復(fù)合物，其中寡核苷酸的至少一部分與zdhhc1核酸雜交；以及b)選自由波形蛋白、胞裂蛋白9、ndrg4、bmp3、vav3、sfmbt2_897和tfpi2a組成的組的靶核酸和與靶核酸特異性雜交的一種或多種寡核苷酸的一種或多種另外的復(fù)合物。另一個實施方案提供了測量患有炎性腸病的受試者的炎癥嚴(yán)重性的方法，包括測定來自受試者的糞便樣品以確定甲基化zdhhc1dna和β-肌動蛋白dna的存在；比較β-肌動蛋白dna與甲基化zdhhc1dna的比率與與ibd的已知炎癥嚴(yán)重性相關(guān)的β-肌動蛋白dna與甲基化zdhhc1dna的比率，其中高于與已知炎癥嚴(yán)重性相關(guān)的比率的所述受試者體內(nèi)β-肌動蛋白dna與甲基化zdhhc1dna的比率指示比所述已知嚴(yán)重性嚴(yán)重的所述受試者的炎癥；并且其中低于與已知炎癥嚴(yán)重性相關(guān)的比率的所述受試者體內(nèi)β-肌動蛋白dna與甲基化zdhhc1dna的比率指示所述受試者的炎癥不太嚴(yán)重。在某些實施方案中，與已知炎癥嚴(yán)重性相關(guān)的比率先前通過測定來自相同受試者的糞便樣品來確定，并且在一些實施方案中，通過測定來自正常受試者的樣品來確定。在某些優(yōu)選的實施方案中，測定包括對所述zdhhc1dna和所述β-肌動蛋白dna進行亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化。測定可包括使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、核酸測序、質(zhì)譜、甲基化特異性核酸酶、基于質(zhì)量的分離或靶捕獲中的一種或多種。在優(yōu)選的實施方案中，測定包括使用側(cè)翼內(nèi)切核酸酶測定，例如quarts測定。在一些實施方案中，所述技術(shù)包括一種組合物，組合物包含以下dna鏈：于反應(yīng)混合物中的包含seqidno.27的核苷酸序列的dna鏈；包含seqidno:54的核苷酸序列的dna鏈；包含seqidno:61的核苷酸序列的dna鏈；以及包含seqidno:68的核苷酸序列的dna鏈，所述反應(yīng)混合物具有選自由以下組成的組的一種或多種核酸：seqidnos:3-10、33、59、60、56-58和63-65的寡核苷酸。在某些實施方案中，組合物還包含檢測探針寡核苷酸，其中所述檢測探針寡核苷酸包含與所述dna鏈的一部分互補的區(qū)，所述dna鏈包含seqidno:27的核苷酸序列。在某些優(yōu)選的實施方案中，檢測探針寡核苷酸包含與seqidno27的一部分互補的區(qū)。在一些實施方案中，檢測探針寡核苷酸報道分子，包括但不限于熒光團。在優(yōu)選的實施方案中，檢測探針包含側(cè)翼序列。在一些實施方案中，組合物還包含fret盒；fen-1內(nèi)切核酸酶和熱穩(wěn)定性dna聚合酶(例如，細(xì)菌dna聚合酶)中的一種或多種。所述技術(shù)還提供包含本文以上所述的任何組合物的反應(yīng)混合物。在一些實施方案中，所述技術(shù)提供反應(yīng)混合物集合，所述反應(yīng)混合物集合包含：包含seqidno.27的核苷酸序列和選自由以下組成的組的一種或多種核酸的dna鏈：seqidnos:3-10、33、59、60、56-58和63-65的寡核苷酸；包含seqidno:54的核苷酸序列的dna鏈；包含seqidno:61的核苷酸序列的dna鏈；以及包含seqidno:68的核苷酸序列的dna鏈。在某些優(yōu)選的實施方案中，包含seqidno.27的核苷酸序列的dna鏈不處于具有所述一種或多種核酸中的任一種的反應(yīng)混合物中。附圖簡述參考以下附圖，本發(fā)明技術(shù)的這些和其它特征、方面和優(yōu)點將變得更加容易理解：圖1a-2e提供了比較來自糞便、血液、細(xì)胞系和組織樣品的β-肌動蛋白(btact)和亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化的dna中的甲基化基因zdhhc1的存在的圖。圖2a-2c提供比較如通過與糞便樣品(2a)、細(xì)胞系(2b)和結(jié)腸直腸癌組織樣品(2c)中所測量的對照基因btact或zdhhc1比較所確定的標(biāo)記基因ndrg4的甲基化％的圖。圖3a-3c提供比較通過與糞便樣品(3a)、細(xì)胞系(3b)和結(jié)腸直腸癌組織樣品(3c)中的對照基因btact或zdhhc1比較所確定的標(biāo)記基因bmp3的甲基化％的圖。圖4示出相對于來自炎性腸病患者的糞便樣品中的炎癥嚴(yán)重性的btact/zdhhc1比率。定義為了有助于理解本發(fā)明技術(shù)，以下定義了許多術(shù)語和短語。另外的定義在整個詳細(xì)描述中闡述。如本文所用，“一個/種(a)”或“一個/種(an)”或“所述(the)”可意指一個/種或多于一個/種。例如，“一個/種”小部件可意指一個/種小部件或多個/種小部件。如本文所用，術(shù)語“受試者”和“患者”是指任何動物，諸如狗、貓、鳥、家畜，并且特別是哺乳動物，優(yōu)選為人。在某些情況下，受試者還是“用戶”(并且因此用戶還是受試者或患者)。如本文所用，術(shù)語“樣品”和“試樣”可互換使用，并且在最廣泛的意義上使用。在一定意義上，樣品意在包括獲自任何來源的試樣或培養(yǎng)物，以及生物和環(huán)境樣品。生物樣品可獲自動物(包括人)，并且涵蓋流體、固體、組織和氣體。生物樣品包括血液制品，諸如血漿、血清、糞便、尿液等。環(huán)境樣品包括環(huán)境材料，諸如地表物質(zhì)、土壤、水、泥、泥漿、生物膜、水、晶體和工業(yè)樣品。然而，這些實例不能理解為限制適用于本發(fā)明的樣品類型。如本文所用，如在一些上下文中使用的“遠程樣品”涉及從樣品的非細(xì)胞、組織或器官來源的位置間接收集的樣品。例如，當(dāng)在糞便樣品(例如，不是從胰腺直接取得的樣品)中評估源自胰腺的樣品材料時，所述樣品是遠程樣品。當(dāng)用于提及核酸捕獲、檢測或分析方法時，術(shù)語“靶”通常是指例如在疑似含有靶核酸的樣品中具有特征(例如待檢測或分析的特定核苷酸序列的核酸)的核酸。在一些實施方案中，靶是具有期望確定甲基化狀態(tài)的特定序列的核酸。當(dāng)用于提及聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)時，“靶”通常是指由用于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的引物所結(jié)合的核酸區(qū)。因此，尋求從可能存在于樣品中的其它核酸序列中挑選出“靶”?！皡^(qū)段”被定義為靶序列內(nèi)的核酸區(qū)。術(shù)語“樣品模板”是指對于靶的存在而分析的源自樣品的核酸。如本文所用，術(shù)語“位點”是指核酸的限定區(qū)或區(qū)段內(nèi)例如具有cpg二核苷酸的突變、多態(tài)性或c殘基的特定位置，諸如染色體上的基因或任何其它表征的序列或rna分子。位點不限于任何特定的大小或長度，并且可以指染色體、基因、功能遺傳元件的一部分或單核苷酸或堿基對。如本文在對可被甲基化的cpg位點的提及中所用，位點是指cpg二核苷酸中的c殘基。如本文所用，“捕獲試劑”是指能夠結(jié)合到分析物(例如靶)的任何藥劑。優(yōu)選地，“捕獲試劑”是指能夠特異性結(jié)合到分析物的任何藥劑(例如與分析物具有比與任何其它部分更高的結(jié)合親和性和/或特異性)。如果與分析物具有必要的結(jié)合親和性和/或特異性，則任何部分諸如細(xì)胞、細(xì)胞器、無機分子、有機分子及其混合物或復(fù)合物均可用作捕獲試劑。捕獲試劑可以是肽、蛋白質(zhì)(例如抗體或受體)、寡核苷酸、核酸、維生素、寡糖、碳水化合物、脂質(zhì)、小分子或其復(fù)合物。包含核酸(例如寡核苷酸)的捕獲試劑可以通過序列特異性雜交(例如，通過形成常規(guī)的沃森-克里克堿基對)或通過其它結(jié)合相互作用捕獲核酸靶標(biāo)。當(dāng)捕獲寡核苷酸與靶核酸雜交時，雜交可能涉及寡核苷酸的一部分或完整寡核苷酸序列，并且寡核苷酸可與完整靶核酸序列的一部分或完整靶核酸序列結(jié)合。在核酸的上下文中，術(shù)語“擴增(amplifying)”或“擴增(amplification)”是指通常從少量的多核苷酸(例如單個多核苷酸分子)開始的多核苷酸或多核苷酸的一部分的多個拷貝的產(chǎn)生，其中擴增產(chǎn)物或擴增子通常是可檢測的。多核苷酸的擴增涵蓋各種化學(xué)和酶過程。在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)或連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(lcr；參見，例如美國專利號5,494,810；其以引用方式整體并入本文)過程中，由靶或模板dna分子的一個或幾個拷貝產(chǎn)生多個dna拷貝是擴增形式。另外類型的擴增包括但不限于等位基因特異性pcr(參見，例如美國專利號5,639,611；其以引用方式整體并入本文)、組裝pcr(參見，例如美國專利號5,965,408；其以引用方式整體并入本文)、解旋酶依賴性擴增(參見，例如美國專利號7,662,594；其以引用方式整體并入本文)、熱啟動pcr(參見，例如美國專利號5,773,258和5,338,671；每個所述專利均以引用方式整體并入本文)、序列間特異性pcr、反向pcr(參見，例如triglia,等(1988)nucleicacidsres.,16:8186；其以引用方式整體并入本文)、連接介導(dǎo)的pcr(參見，例如guilfoyle,r.等,nucleicacidsresearch,25:1854-1858(1997)；美國專利號5,508,169；每個所述文獻均以引用方式整體并入本文)、甲基化特異性pcr(參見，例如herman,等,(1996)pnas93(13)9821-9826；其以引用方式整體并入本文)、微引物pcr、多重連接依賴性探針擴增(參見，例如schouten,等,(2002)nucleicacidsresearch30(12):e57；其以引用方式整體并入本文)、多重pcr(參見，例如chamberlain,等,(1988)nucleicacidsresearch16(23)11141-11156；ballabio,等,(1990)humangenetics84(6)571-573；hayden,等,(2008)bmcgenetics9:80；每個所述文獻均以引用方式整體并入本文)、嵌套式pcr、重疊延伸pcr(參見，例如higuchi,等,(1988)nucleicacidsresearch16(15)7351-7367)；其以引用方式整體并入本文)、實時pcr(參見，例如，higuchi,等,(1992)biotechnology10:413-417；higuchi,等,(1993)biotechnology11:1026-1030；每個所述文獻均以引用方式整體并入本文)、逆轉(zhuǎn)錄pcr(參見，例如bustin,s.a.(2000)j.molecularendocrinology25:169-193；其以引用方式整體并入本文)、固相pcr、熱不對稱交錯pcr和touchdownpcr(參見，例如don,等,nucleicacidsresearch(1991)19(14)4008；roux,k.(1994)biotechniques16(5)812-814；hecker,等,(1996)biotechniques20(3)478-485；每個所述文獻均以引用方式整體并入本文)。多核苷酸擴增還可以使用數(shù)字pcr來實現(xiàn)(參見，例如kalinina,等,nucleicacidsresearch.25；1999-2004,(1997)；vogelstein和kinzler,procnatlacadsciusa.96；9236-41,(1999)；國際專利公布號wo05023091a2；美國專利申請公布號20070202525；每個所述文獻均以引用方式整體并入本文)。5′術(shù)語“聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)”(“pcr”)是指描述了用于增加基因組或其它dna或rna的混合物中的靶序列的區(qū)段濃度而不進行克隆或純化的方法的k.b.mullis美國專利號4,683,195、4,683,202和4,965,188的方法。用于擴增靶序列的這種方法包括將大量過量的兩種寡核苷酸引物引入至含有所需靶序列的dna混合物，隨后在dna聚合酶存在下進行精確的熱循環(huán)序列。兩種引物與其雙鏈靶序列的相應(yīng)鏈互補。為了實現(xiàn)擴增，將混合物變性，并且然后將引物退火至其靶分子內(nèi)的互補序列。退火后，用聚合酶延伸引物，以便形成一對新的互補鏈。變性、引物退火和聚合酶延伸的步驟可以重復(fù)許多次(即，變性、退火和延伸構(gòu)成一個“循環(huán)”；可存在許多“循環(huán)”)以獲得高濃度的所需靶序列的擴增區(qū)段。所需靶序列的擴增區(qū)段的長度由引物相對于彼此的相對位置確定，并且因此此長度是可控參數(shù)。由于所述過程的重復(fù)方面，所述方法被稱為“聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)”(“pcr”)。因為靶序列的所需擴增區(qū)段成為混合物中的主要序列(就濃度而言)，所以它們據(jù)稱是“pcr擴增的”，并且是“pcr產(chǎn)物”或“擴增子”。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解術(shù)語“pcr”涵蓋使用例如實時pcr、嵌套式pcr、逆轉(zhuǎn)錄pcr(rt-pcr)、單引物和任意引物pcr(arbitrarilyprimedpcr)等的最初描述的方法的許多變型。如本文所用，術(shù)語“核酸檢測測定”是指確定目標(biāo)核酸的核苷酸組成的任何方法。核酸檢測測定包括但不限于dna測序方法、探針雜交方法、結(jié)構(gòu)特異性切割測定(例如，invader測定(hologic,inc.)，并且描述于例如美國專利號5,846,717、5,985,557、5,994,069、6,001,567、6,090,543和6,872,816；lyamichev等,nat.biotech.,17:292(1999)、hall等,pnas,usa,97:8272(2000)以及us2009/0253142中，每個所述文獻均出于所有目的以引用方式整體并入本文)；酶錯配切割方法(例如，variagenics，美國專利號6,110,684、5,958,692、5,851,770，其以引用方式整體并入本文)；以上所述的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)；分支雜交方法(例如，chiron，美國專利號5,849,481、5,710,264、5,124,246和5,624,802，其以引用方式整體并入本文)；滾環(huán)式復(fù)制(例如，美國專利號6,210,884、6,183,960和6,235,502，其以引用方式整體并入本文)；nasba(例如，美國專利號5,409,818，其以引用方式整體并入本文)；分子信標(biāo)技術(shù)(例如，美國專利號6,150,097，其以引用方式整體并入本文)；電子傳感器技術(shù)(motorola，美國專利號6,248,229、6,221,583、6,013,170和6,063,573，其以引用方式整體并入本文)；循環(huán)探針技術(shù)(例如美國專利號5,403,711、5,011,769和5,660,988，其以引用方式整體并入本文)；dadebehring信號擴增方法(例如，美國專利號6,121,001、6,110,677、5,914,230、5,882,867和5,792,614，其以引用方式整體并入本文)；連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(例如，baranayproc.natl.acad.sciusa88,189-93(1991))；以及夾心雜交方法(例如，美國專利號5,288,609，其以引用方式整體并入本文)。在一些實施方案中，擴增靶核酸(例如通過pcr)，并使用侵入性切割測定同時檢測擴增的核酸。被配置用于與擴增測定組合進行檢測測定(例如侵入性切割測定)的測定在美國專利公布us20090253142a1(申請序列號12/404,240)中有所描述，所述申請出于所有目的以引用方式整體并入本文。稱為quarts方法的另外的擴增加侵入性切割檢測配置在美國專利號8,361,720；美國專利號8,715,937；以及美國專利申請序列號12/946,745；以及13/594,674中有所描述，所述專利出于所有目的以引用方式整體并入本文。如本文所用的術(shù)語“侵入性切割結(jié)構(gòu)”是指包含以下的切割結(jié)構(gòu)：i)靶核酸；ii)上游核酸(例如侵入性或“invader”寡核苷酸)；以及iii)下游核酸(例如，探針)，其中上游和下游核酸退火至靶核酸的連續(xù)區(qū)，并且其中重疊在上游核酸的3′部分與下游核酸與靶核酸之間形成的雙鏈體之間形成。重疊在來自上游和下游核酸的一個或多個堿基相對于靶核酸堿基占據(jù)相同位置的情況下發(fā)生，無論上游核酸的重疊堿基是否與靶核酸互補，并且無論那些堿基是天然堿基還是非天然堿基。在一些實施方案中，例如如例如在美國專利號6,090,543中所公開的，與下游雙鏈體重疊的上游核酸的3′部分是非堿性化學(xué)部分，諸如芳族環(huán)結(jié)構(gòu)，所述專利以引用方式整體并入本文。在一些實施方案中，一個或多個核酸可例如通過共價鍵諸如核酸莖環(huán)或通過非核酸化學(xué)鍵(例如，多碳鏈)彼此附接。如本文所用，術(shù)語“瓣狀內(nèi)切核酸酶測定”包括如上所述的“invader”侵入性切割測定和quarts測定。本文所用，用于提及多核苷酸(即，核苷酸序列)的術(shù)語“互補”或“互補性”是指與堿基配對規(guī)則有關(guān)的多核苷酸。例如，序列“5′-a-g-t-3′”與序列“3′-t-c-a-5′”互補?；パa性可以是“部分的”，其中僅一些核酸堿基根據(jù)堿基配對規(guī)則來匹配?；蛘?，在核酸之間可能存在“完全”或“總”互補性。核酸鏈之間的互補性程度對核酸鏈之間雜交的效率和強度具有顯著影響。這在擴增反應(yīng)以及依賴核酸間結(jié)合的檢測方法中特別重要。如本文所用，術(shù)語“引物”是指在置于誘導(dǎo)與核酸鏈互補的引物延伸產(chǎn)物合成的條件下時(例如，在核苷酸和誘導(dǎo)劑諸如生物催化劑(例如，dna聚合酶等)的存在下)能夠充當(dāng)合成的起始點的寡核苷酸(無論是當(dāng)在純化的限制性消化中時天然存在還是以合成方式產(chǎn)生)。為了擴增的最大效率，引物通常是單鏈的，但可以可替代地為部分或完全雙鏈的。與模板核酸雜交的引物部分足夠長以在誘導(dǎo)劑存在下引發(fā)延伸產(chǎn)物的合成。引物的確切長度將取決于很多因素，包括溫度、引物來源和使用方法。引物可包括標(biāo)記、標(biāo)簽、捕獲部分等。如本文所用，術(shù)語“核酸分子”是指含有核酸的分子，包括但不限于dna或rna。這個術(shù)語涵蓋包含任何具有已知的dna和rna堿基類似物的序列，包括但不限于：4-乙酰胞嘧啶、8-羥基-n6-甲基腺苷、氮丙啶胞嘧啶、假異胞嘧啶、5-(羧羥基-甲基)尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羧甲基胺甲基-2-硫尿嘧啶、5-羧甲基-胺甲基尿嘧啶、二氫尿嘧啶、肌苷、n6-異戊烯基腺嘌呤、1-甲基腺嘌呤、1-甲基假尿嘧啶、1-甲基鳥嘌呤、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鳥嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鳥嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、n6-甲基腺嘌呤、7-甲基鳥嘌呤、5-甲氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基-氨基-甲基-2-硫尿嘧啶、β-d-甘露糖基q核苷(beta-d-mannosylqueosine)、5′-甲氧羰基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-n-異戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧基醋酸甲酯、尿嘧啶-5-氧基醋酸、氧基丁氧核苷(oxybutoxosine)、假尿嘧啶、q核苷、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、n-尿嘧啶-5-氧基醋酸甲酯、尿嘧啶-5-氧基醋酸、假尿嘧啶、q核苷、2-硫胞嘧啶以及2,6-二氨基嘌呤。如本文所用，術(shù)語“核堿基”與本領(lǐng)域中使用的其它術(shù)語同義，包括“核苷酸”、“脫氧核苷酸”、“核苷酸殘基”、“脫氧核苷酸殘基”、“核苷三磷酸(ntp)”或脫氧核苷酸三磷酸(dntp)。“寡核苷酸”是指包含至少兩個核酸單體單元(例如核苷酸)，通常多于三個單體單元，并且更通常大于十個單體單元的核酸。寡核苷酸的確切大小通常取決于各種因素，包括寡核苷酸的最終功能或用途。為了進一步說明，寡核苷酸通常小于200個殘基長(例如，介于15個與100個之間)，然而，如本文所用，所述術(shù)語還旨在涵蓋更長的多核苷酸鏈。寡核苷酸常常以其長度來提及。例如，24個殘基寡核苷酸被稱為“24聚體”。通常，核苷單體通過磷酸二酯鍵或其類似物(包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、硫代磷酰苯胺(phosphoroanilothioate)、?；桨妨姿狨?phosphoranilidate)、氨基磷酸酯等，包括相關(guān)的抗衡離子例如h+、nh4+、na+等(如果此類抗衡離子存在))連接。此外，寡核苷酸通常是單鏈的。寡核苷酸任選地通過任何合適方法制備，所述任何合適方法包括但不限于由諸如以下的方法進行的現(xiàn)有或天然序列的分離、dna復(fù)制或擴增、逆轉(zhuǎn)錄、適當(dāng)序列的克隆和限制性消化或直接化學(xué)合成：narang等(1979)methenzymol.68:90-99的磷酸三酯法；brown等(1979)methenzymol.68:109-151的磷酸二酯法；beaucage等(1981)tetrahedronlett.22:1859-1862的二乙基亞磷酰胺法；matteucci等(1981)jamchemsoc.103:3185-3191的三酯法；自動化合成法；或1984年7月3日授予caruthers等的題為“用于制備多核苷酸的方法”的美國專利號4,458,066的固體支持物法；或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它方法。所有這些參考文獻均以引用方式并入。生物聚合物的“序列”是指生物聚合物中單體單元(例如核苷酸、氨基酸等)的順序和特性。通常在5′至3′方向上讀取核酸的序列(例如，堿基序列)。如本文所用，術(shù)語“基因”是指包含產(chǎn)生多肽、前體或rna(例如，非編碼rna諸如核糖體rna、轉(zhuǎn)移rna、剪接體rna、微小rna)所需的編碼序列的核酸(例如dna)序列。多肽或非編碼rna可由全長編碼序列或編碼序列的任何部分來編碼，只要全長或片段多肽的所需活性或功能性質(zhì)(例如，酶活性、配體結(jié)合、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、免疫原性等)得以保留。此術(shù)語也涵蓋結(jié)構(gòu)基因的編碼區(qū)以及與編碼區(qū)相鄰位于5′和3′末端上、在任一個末端上達約1kb或更長的距離的序列，以使得基因?qū)?yīng)于全長mrna的長度。位于編碼區(qū)的5′并且存在于mrna上的序列被稱為5′非翻譯序列。位于編碼區(qū)的3′或下游并且存在于mrna上的序列被稱為3′非翻譯序列。術(shù)語“基因”涵蓋基因的cdna和基因組形式?；虻幕蚪M形式或克隆含有以被稱為“內(nèi)含子”或“插入?yún)^(qū)”或“插入序列”的非編碼序列間斷的編碼區(qū)。內(nèi)含子是轉(zhuǎn)錄至核rna(例如，hnrna)中的基因區(qū)段；內(nèi)含子可含有調(diào)控元件(例如增強子)。內(nèi)含子從核或初級轉(zhuǎn)錄物中去除或“剪除”；因此，內(nèi)含子不存在于信使rna(mrna)轉(zhuǎn)錄物中。mrna在翻譯期間起作用以指定新生多肽中的氨基酸的序列或順序。除了含有內(nèi)含子以外，基因的基因組形式還可包括位于rna轉(zhuǎn)錄物上存在的5′和3′末端序列上的序列。這些序列被稱為“旁側(cè)”序列或區(qū)(這些側(cè)接序列位于存在于mrna轉(zhuǎn)錄物上的非翻譯序列5′或3′)。5′旁側(cè)區(qū)可含有控制或影響基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控序列，諸如啟動子和增強子。3′旁側(cè)區(qū)可含有引導(dǎo)轉(zhuǎn)錄終止、轉(zhuǎn)錄后切割和聚腺苷酸化的序列。當(dāng)提及基因時，術(shù)語“野生型”是指具有從天然存在的來源分離的基因特征的基因。當(dāng)提及基因產(chǎn)物時，術(shù)語“野生型”是指具有從天然存在的來源分離的基因產(chǎn)物特征的基因產(chǎn)物。如用于對象的術(shù)語“天然存在的”是指對象可在自然界中被發(fā)現(xiàn)的事實。例如，可從自然中的來源分離并且不通過人在實驗室中有意修飾的存在于生物(包括病毒)中的多肽或多核苷酸序列為天然存在的。野生型基因常常是在群體中最頻繁觀察到的基因或等位基因，并且因此任意設(shè)計成基因的“正常”或“野生型”形式。相比之下，術(shù)語“修飾的”或“突變體”在提及基因或基因產(chǎn)物時分別指在與野生型基因或基因產(chǎn)物相比時顯示序列和/或功能性質(zhì)的修飾(例如，改變的特征)的基因或基因產(chǎn)物。應(yīng)注意，天然存在的突變體可被分離；這些突變體通過以下事實來鑒定：在與野生型基因或基因產(chǎn)物相比時，它們具有改變的特征。術(shù)語“等位基因”是指基因的變化；變化包括但不限于變體和突變體、多態(tài)性基因座和單核苷酸多態(tài)性基因座、移碼和剪接突變。等位基因可天然存在于群體中，或者可能在群體的任何特定個體的生命期期間出現(xiàn)。因此，當(dāng)用于提及核苷酸序列時，術(shù)語“變體”和“突變體”是指與另一個通常相關(guān)的核苷酸酸序列不同之處在于的一個或多個核苷酸的核酸序列?！白兓笔莾蓚€不同核苷酸序列之間的差異；通常，一個序列是參考序列。如本文所用的術(shù)語“固體支持物”包括其上可固定靶(例如dna)的所有材料?？梢曰蚩梢圆槐换瘜W(xué)修飾的天然或合成材料可用作固體支持物，特別是聚合物諸如聚氯乙烯、聚乙烯、聚苯乙烯、聚丙烯酸酯或聚酰胺，或基于乙烯基芳族單體的共聚物、不飽和羧酸的酯、偏二氯乙烯、二烯或具有腈官能團的化合物(丙烯腈)；氯乙烯和丙烯的聚合物、氯乙烯和乙酸乙烯酯的聚合物；基于苯乙烯或苯乙烯的取代衍生物的共聚物；合成纖維，諸如尼龍；無機材料，諸如二氧化硅、玻璃、陶瓷或石英；乳膠、磁性顆粒；金屬衍生物。另外的實例包括但不限于微量滴定板、片、錐體、管、孔、珠子(例如，磁珠)、顆粒等，或平坦支撐物諸如二氧化硅或硅晶片。如本文所用，術(shù)語“磁性顆粒”和“磁珠”可互換使用，并且是指響應(yīng)于磁場的顆粒或珠子。通常，磁性顆粒包含沒有磁場但是當(dāng)暴露于磁場時形成磁偶極子的材料，例如在存在磁場的情況下能夠被磁化但是在不存在這種場的情況下本身不是磁性的材料。如在此上下文中所用的術(shù)語“磁性”包括作為順磁性材料或超順磁性材料的材料。如本文所用，術(shù)語“磁性”還涵蓋臨時磁性材料，諸如具有低居里溫度的鐵磁性或亞鐵磁性材料，條件是所述暫時磁性材料在根據(jù)本發(fā)明方法使用含有所述材料的二氧化硅磁性顆粒來分離生物材料的溫度范圍內(nèi)是順磁性的。如在對顆粒或珠子的提及中所用的術(shù)語“可混合的”是指例如在柱中呈游離形式(即不固定)但可添加至樣品并通過混合作用(例如渦旋、攪拌、振蕩、反復(fù)移液等)分布于樣品液中的顆粒。術(shù)語“探針”是指能夠與另一種目標(biāo)寡核苷酸雜交的無論是當(dāng)在純化的限制性消化中時天然存在還是以合成方式、以重組方式或通過pcr擴增產(chǎn)生的寡核苷酸(例如，核苷酸序列)。探針可以是單鏈或雙鏈的。探針可用于特定基因序列的檢測、鑒定和分離(例如，“捕獲探針”)。預(yù)期了在一些實施方案中，本發(fā)明中使用的任何探針可以用任何“報道分子”標(biāo)記，使得可在任何檢測系統(tǒng)中檢測到，所述任何檢測系統(tǒng)包括但不限于酶(例如，elisa以及基于酶的組織化學(xué)測定)、熒光、放射性和發(fā)光系統(tǒng)。不希望本發(fā)明限于任何特定的檢測系統(tǒng)或標(biāo)記。如本文所用，“甲基化”是指胞嘧啶的位置c5或n4處的胞嘧啶甲基化、腺嘌呤的n6位置或其它類型的核酸甲基化。體外擴增的dna通常是未甲基化的，因為典型的體外dna擴增方法未保留擴增模板的甲基化模式。然而，“未甲基化dna”或“甲基化dna”還可指原始模板分別為未甲基化或甲基化的擴增dna。因此，如本文所用，“甲基化核苷酸”或“甲基化核苷酸堿基”是指在核苷酸堿基上存在甲基部分，其中甲基部分不存在于公認(rèn)的典型核苷酸堿基中。例如，胞嘧啶在其嘧啶環(huán)上不含有甲基部分，但是5-甲基胞嘧啶在其嘧啶環(huán)的位置5處含有甲基部分。因此，胞嘧啶不是甲基化核苷酸，并且5-甲基胞嘧啶是甲基化核苷酸。在另一個實例中，胸腺嘧啶在其嘧啶環(huán)的位置5處含有甲基部分；然而，出于本文的目的，當(dāng)存在于dna中時胸腺嘧啶被認(rèn)為不是甲基化核苷酸，因為胸腺嘧啶是dna的典型核苷酸堿基。如本文所用，“甲基化核酸分子”是指含有一個或多個甲基化核苷酸的核酸分子。如本文所用，核酸分子的“甲基化狀態(tài)”、“甲基化譜”和“甲基化狀態(tài)”是指核酸分子中一個或多個甲基化核苷酸堿基的存在或不存在。例如，含有甲基化胞嘧啶的核酸分子被認(rèn)為是甲基化的(例如，核酸分子的甲基化狀態(tài)是甲基化的)。不含任何甲基化核苷酸的核酸分子被認(rèn)為是未甲基化的。特定核酸序列(例如，如本文所述的基因標(biāo)記或dna區(qū))的甲基化狀態(tài)可指示序列中每個堿基的甲基化狀態(tài)，或者可指示序列內(nèi)堿基的(例如，一個或多個胞嘧啶的)子集的甲基化狀態(tài)，或者可指示關(guān)于序列內(nèi)的區(qū)甲基化密度的信息，而提供或不提供序列內(nèi)發(fā)生甲基化的位置的精確信息。核酸分子中核苷酸位點的甲基化狀態(tài)是指核酸分子中特定位點處甲基化核苷酸的存在或不存在。例如，當(dāng)核酸分子中第7個核苷酸處存在的核苷酸是5-甲基胞嘧啶時，核酸分子中第7個核苷酸處的胞嘧啶的甲基化狀態(tài)是甲基化的。類似地，當(dāng)核酸分子中第7個核苷酸處存在的核苷酸是胞嘧啶(且非5-甲基胞嘧啶)時，核酸分子中第7個核苷酸處的胞嘧啶的甲基化狀態(tài)是未甲基化的。甲基化狀態(tài)可任選地由“甲基化值”表示或指示(例如，表示甲基化頻率、分?jǐn)?shù)、比率、百分比等)。甲基化值可例如通過在用甲基化依賴性限制酶進行限制性消化之后定量存在的完整核酸的量或通過在亞硫酸氫鹽反應(yīng)后比較擴增譜或通過比較亞硫酸氫鹽處理的核酸和未處理核酸的序列來產(chǎn)生。因此，值(例如甲基化值)代表甲基化狀態(tài)，并且因此可用作位點的多個拷貝內(nèi)的甲基化狀態(tài)的定量指標(biāo)。當(dāng)希望將樣品中序列的甲基化狀態(tài)與閾值或參考值進行比較時，這是特別有用的。如本文所用，“甲基化頻率”或“甲基化百分比(％)”是指相對于分子或基因座未被甲基化的情況的數(shù)目的分子或位點被甲基化的情況的數(shù)目。因此，甲基化狀態(tài)描述了核酸(例如，基因組序列)的甲基化狀態(tài)。此外，甲基化狀態(tài)是指與甲基化相關(guān)的特定基因組基因座處的核酸區(qū)段的特征。無論此dna序列內(nèi)的任何胞嘧啶(c)殘基是否被甲基化，所述特征包括但不限于：甲基化c殘基的位置、整個核酸的任何特定區(qū)內(nèi)的甲基化c的頻率或百分比，以及由于例如等位基因起源的差異所引起的等位基因的甲基化差異。術(shù)語“甲基化狀態(tài)”、“甲基化譜”和“甲基化狀態(tài)”還指生物樣品中整個核酸的任何特定區(qū)內(nèi)的甲基化c或未甲基化c的相對濃度、絕對濃度或模式。例如，如果核酸序列內(nèi)的胞嘧啶(c)殘基被甲基化，則其可被稱為“超甲基化的”或具有“增加的甲基化”，而如果dna序列內(nèi)的胞嘧啶(c)殘基序列未被甲基化，則其可被稱為“低甲基化的”或具有“減少的甲基化”。同樣地，如果與另一個核酸序列(例如，來自不同區(qū)或不同個體等)相比，核酸序列內(nèi)的胞嘧啶(c)殘基被甲基化，則與另一個核酸序列相比，所述序列被認(rèn)為是超甲基化的或具有增加的甲基化?？商娲?，如果與另一個核酸序列(例如，來自不同區(qū)或不同個體等)相比，dna序列內(nèi)的胞嘧啶(c)殘基被甲基化，則與另一個核酸序列相比，所述序列被認(rèn)為是低甲基化的或具有減少的甲基化。另外，如本文所用的術(shù)語“甲基化模式”是指核酸區(qū)上的甲基化和未甲基化核苷酸的集合位點。當(dāng)甲基化和未甲基化核苷酸的數(shù)目在整個區(qū)內(nèi)相同或相似，但是甲基化和未甲基化核苷酸的位置不同時，兩個核酸可具有相同或相似的甲基化頻率或甲基化百分比，但是具有不同的甲基化模式。序列在它們的甲基化的程度(例如，相對于另一個序列，一個序列具有增加或減少的甲基化)、頻率或模式不同時據(jù)稱是“差異甲基化的”或具有“甲基化差異”或“不同甲基化狀態(tài)”。術(shù)語“差異甲基化”是指癌癥陽性樣品中核酸甲基化的水平或模式與癌癥陰性樣品中核酸甲基化的水平或模式相比的差異。它還可指手術(shù)后癌癥復(fù)發(fā)的患者與沒有復(fù)發(fā)的患者之間的水平或模式的差異。差異甲基化和dna甲基化的特定水平或模式是預(yù)后和預(yù)測性生物標(biāo)記，例如一旦界定了正確的截止或預(yù)測性特征。甲基化狀態(tài)頻率可用于描述個體群體或來自單個個體的樣品。例如，甲基化狀態(tài)頻率為50％的核苷酸位點在50％情況下是甲基化的，并且在50％情況下是未甲基化的。這種頻率可用于例如描述個體群體或核酸集合中核苷酸位點或核酸區(qū)被甲基化的程度。因此，當(dāng)?shù)谝蝗后w或核酸分子匯集物中的甲基化與第二群體或核酸分子匯集物中的甲基化不同時，第一群體或匯集物的甲基化狀態(tài)頻率將與第二群體或匯集物的甲基化狀態(tài)頻率不同。這種頻率還可用于例如描述單個個體中核苷酸位點或核酸區(qū)被甲基化的程度。例如，這種頻率可用于描述來自組織樣品的一組細(xì)胞在核苷酸位點或核酸區(qū)處被甲基化或未被甲基化的程度。術(shù)語“高度甲基化的”是指特定位點(例如，cpg二核苷酸或一組二核苷酸或富含cpg的區(qū))以一定速率以特定樣品類型或組織類型甲基化的核酸，所述速率在可測量程度上大于對于另一種組織或樣品類型中同一dna中的可比較位點所觀察到的速率?！案叨燃谆摹笨梢灾竼蝹€特定c殘基或區(qū)中多個c內(nèi)的平均甲基化速率，作為所測定樣品中所述位點的拷貝的分?jǐn)?shù)。在一些實施方案中，在不使所述術(shù)語限于任何特定的甲基化水平的情況下，超甲基化位點可>10％甲基化，優(yōu)選地>20％至40％，更優(yōu)選地>50％至75％，仍更優(yōu)選地介于75％與100％之間。如本文所用，“核苷酸位點”是指核酸分子中核苷酸的位置。甲基化核苷酸的核苷酸位點是指核酸分子中甲基化核苷酸的位置。通常，人dna的甲基化發(fā)生在包含相鄰的鳥嘌呤和胞嘧啶的二核苷酸序列(也稱為cpg二核苷酸序列)上，在所述二核苷酸序列中胞嘧啶位于鳥嘌呤的5′處。cpg二核苷酸內(nèi)的大多數(shù)胞嘧啶在人基因組中是甲基化的，然而一些在特定的cpg二核苷酸富集基因組區(qū)(稱為cpg島)中保持未甲基化(參見，例如antequera等(1990)cell62:503–514)。如本文所用，“cpg島”是指相對于總基因組dna含有的cpg二核苷酸數(shù)目增加的基因組dna的富含g:c的區(qū)。cpg島的長度可為至少100個、200個或更多個堿基對，其中所述區(qū)的g:c含量為至少50％，并且觀察到的cpg頻率相對于預(yù)期頻率的比率為0.6；在一些情況下，cpg島的長度可為至少500個堿基對，其中所述區(qū)的g:c含量為至少55％)，并且觀察到的cpg頻率相對于預(yù)期頻率的比率為0.65。相對于預(yù)期頻率的觀察到的cpg頻率可根據(jù)gardiner-garden等(1987)j.mol.biol.196:261–281中提供的方法來計算。例如，相對于預(yù)期頻率的觀察到的cpg頻率可根據(jù)式r＝(a×b)/(c×d)來計算，其中r是觀察到的cpg頻率相對于預(yù)期頻率的比率，a是分析序列中cpg二核苷酸的數(shù)目，b是分析序列中核苷酸的總數(shù)，c是分析序列中c核苷酸的總數(shù)，d是分析序列中g(shù)核苷酸的總數(shù)。甲基化狀態(tài)通常在cpg島中(例如在啟動子區(qū)處)確定。將理解，人基因組中的其它序列傾向于dna甲基化，諸如cpa和cpt(參見，ramsahoye(2000)proc.natl.acad.sci.usa97:5237–5242；salmon和kaye(1970)biochim.biophys.acta.204:340–351；grafstrom(1985)nucleicacidsres.13:2827–2842；nyce(1986)nucleicacidsres.14:4353–4367；woodcock(1987)biochem.biophys.res.commun.145:888-894)。如本文所用，術(shù)語“組織細(xì)胞”是指身體(例如人或動物身體)中的任何組織細(xì)胞，包括例如上皮細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞和骨細(xì)胞。組織細(xì)胞不包括血細(xì)胞。如本文所用，血液通常包含血漿、紅細(xì)胞、白細(xì)胞(包括白血球和淋巴細(xì)胞)和血小板。白細(xì)胞包括嗜中性粒細(xì)胞(neutophil)、單核細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞，并且淋巴細(xì)胞包括t細(xì)胞、b細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞?！敖M織細(xì)胞特異性dna”和“組織細(xì)胞特異性對照dna”是指可檢測組織或來自組織的無細(xì)胞dna的存在，并且在血液或正常的血液組分(例如，如上所列的血漿、白細(xì)胞等)中可最低限度地檢測或不可檢測的dna。如本文所用，僅在組織中甲基化并且在血液中未被類似地甲基化的dna(或反之亦然)可以是關(guān)于甲基化狀態(tài)的組織細(xì)胞特異性dna，即使dna的一級序列在兩種細(xì)胞類型中是相同的?！吧掀ぬ禺愋詫φ誨na”是指檢測上皮細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的dna的組織特異性對照dna。如本文所用，根據(jù)核酸分子的甲基化狀態(tài)修飾核酸分子的核苷酸的試劑或甲基化特異性試劑是指可以反映核酸分子的甲基化狀態(tài)的方式改變核酸分子的核苷酸序列的化合物或組合物或其它藥劑。用這種試劑處理核酸分子的方法可包括使核酸分子與試劑接觸，用另外的步驟偶聯(lián)(如果需要)，以實現(xiàn)所需的核苷酸序列變化。核酸分子的核苷酸序列的這種變化可產(chǎn)生每個甲基化核苷酸被修飾成不同核苷酸的核酸分子。核酸核苷酸序列的這種變化可產(chǎn)生每個未甲基化核苷酸被修飾成不同核苷酸的核酸分子。核酸核苷酸序列的這種變化可產(chǎn)生未甲基化的所選核苷酸中的每個(例如，每個未甲基化胞嘧啶)被修飾成不同核苷酸的核酸分子。使用這種試劑來改變核酸核苷酸序列可產(chǎn)生作為甲基化核苷酸的每個核苷酸(例如，每個甲基化胞嘧啶)被修飾成不同核苷酸的核酸分子。如本文所用，修飾所選核苷酸的試劑的使用是指修飾核酸分子中的四種通常存在的核苷酸(對于dna，c、g、t和a；并且對于rna，c、g、u和a)中的一種核苷酸的試劑，使得試劑修飾一種核苷酸而不修飾其它三種核苷酸。在一個示例性實施方案中，這種試劑修飾未甲基化的所選核苷酸以產(chǎn)生不同的核苷酸。在另一個示例性實施方案中，這種試劑可使未甲基化胞嘧啶核苷酸脫氨基。示例性試劑是亞硫酸氫鹽。如本文所用，術(shù)語“亞硫酸氫鹽試劑”是指在一些實施方案中包含亞硫酸氫鹽(bisulfite)、亞硫酸氫鹽(disulfite)、亞硫酸氫鹽(hydrogensulfite)或其組合以區(qū)分例如cpg二核苷酸序列中的甲基化胞苷和未甲基化胞苷的試劑。術(shù)語“甲基化測定”是指用于測定核酸序列內(nèi)的一個或多個cpg二核苷酸序列的甲基化狀態(tài)的任何測定。術(shù)語“msap-pcr”(甲基化敏感性任意引物聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))是指允許使用富含cg的引物進行基因組的全局掃描以集中于最可能含有cpg二核苷酸的區(qū)的本領(lǐng)域公認(rèn)的技術(shù)，并且所述本領(lǐng)域公認(rèn)的技術(shù)由gonzalgo等(1997)cancerresearch57:594–599加以描述。術(shù)語“methylighttm”是指由eads等(1999)cancerres.59:2302–2306描述的本領(lǐng)域公認(rèn)的基于熒光的實時pcr技術(shù)。術(shù)語“heavymethyltm”是指覆蓋擴增引物之間或由擴增引物覆蓋的cpg位置的甲基化特異性阻斷探針(在本文中還被稱為阻斷劑)使得能夠進行核酸樣品的甲基化特異性選擇性擴增的測定。術(shù)語“heavymethyltmmethylighttm”測定是指heavymethyltmmethylighttm測定，其為methylighttm測定的變化，其中methylighttm測定與覆蓋擴增引物之間的cpg位置的甲基化特異性阻斷探針組合。術(shù)語“ms-snupe”(甲基化敏感性單核苷酸引物延伸)是指由gonzalgo和jones(1997)nucleicacidsres.25:2529–2531描述的本領(lǐng)域公認(rèn)的測定。術(shù)語“msp”(甲基化特異性pcr)是指由herman等(1996)proc.natl.acad.sci.usa93:9821–9826以及由美國專利號5,786,146描述的本領(lǐng)域公認(rèn)的甲基化測定。術(shù)語“cobra”(組合亞硫酸氫鹽限制性分析)是指由xiong和laird(1997)nucleicacidsres.25:2532–2534描述的本領(lǐng)域公認(rèn)的甲基化測定。術(shù)語“mca”(甲基化cpg島擴增)是指由toyota等(1999)cancerres.59:2307–12以及wo00/26401a1中描述的甲基化測定。如本文所用，術(shù)語“試劑盒”是指遞送材料的任何遞送系統(tǒng)。在核酸純化系統(tǒng)和反應(yīng)測定的上下文中，所述遞送系統(tǒng)包括允許將試劑和裝置(例如適當(dāng)容器中的抑制劑吸附劑、顆粒、變性劑、寡核苷酸、旋轉(zhuǎn)過濾器等)和/或支持材料(例如，緩沖液、用于執(zhí)行程序的書面說明書等)從一個位置存儲、運輸或遞送至另一個位置的系統(tǒng)。例如，試劑盒包括一個或多個套罩(例如，盒)，其含有相關(guān)反應(yīng)試劑和/或支持材料。如本文所用，術(shù)語“分段試劑盒”是指包括各自含有總試劑盒組分的子部分的兩個或更多個單獨容器的遞送系統(tǒng)。所述容器可共同或單獨輸送至預(yù)定接受者。例如，第一容器可含有用于樣品收集的材料和緩沖液，而第二容器含有捕獲寡核苷酸和變性劑。術(shù)語“分段試劑盒”旨在涵蓋含有根據(jù)聯(lián)邦食品、藥物和化妝品法(federalfood,drug,andcosmeticact)的第520節(jié)(e)款來管理的分析物特異性試劑(asr)的試劑盒，但不限于此。事實上，包含各自含有總試劑盒組分的子部分的兩個或更多個單獨容器的任何遞送系統(tǒng)包括于術(shù)語“分段試劑盒”中。相比之下，“組合試劑盒”是指含有單一容器(例如，容納每個所需組分的單一盒)中的反應(yīng)測定的所有組分的遞送系統(tǒng)。術(shù)語“試劑盒”包括分段試劑盒和組合試劑盒。如本文所用的術(shù)語“系統(tǒng)”是指用于出于特定目的使用的物品的集合。在一些實施方案中，所述物品包括作為例如物品上、紙上或可記錄介質(zhì)(例如，磁盤、cd、閃存驅(qū)動器等)上提供的信息的使用說明書。在一些實施方案中，說明書將用戶引導(dǎo)至在線位置，例如網(wǎng)站。如本文所用，術(shù)語“信息”是指任何事實或數(shù)據(jù)的集合。在對使用計算機系統(tǒng)(包括但不限于互聯(lián)網(wǎng))存儲或處理的信息的提及中，所述術(shù)語是指以任何格式(例如，模擬、數(shù)字、光學(xué)等)存儲的任何數(shù)據(jù)。如本文所用，術(shù)語“與受試者有關(guān)的信息”是指關(guān)于受試者(例如人、植物或動物)的事實或數(shù)據(jù)。術(shù)語“基因組信息”是指關(guān)于基因組的信息，包括但不限于核酸序列、基因、甲基化百分比、等位基因頻率、rna表達水平、蛋白質(zhì)表達、與基因型相關(guān)的表型等?！暗任换蝾l率信息“是指關(guān)于等位基因頻率的事實或數(shù)據(jù)，包括但不限于等位基因特性、等位基因的存在與受試者(例如，人受試者)的特征之間的統(tǒng)計學(xué)相關(guān)性、個體或群體中等位基因的存在或不存在、等位基因存在于具有一個或多個特定特征的個體中的可能性百分比等。詳述本文提供涉及進行用于檢測和定量dna(例如，甲基化dna)的測定的技術(shù)。特別地，所述技術(shù)涉及用于所述甲基化測定的內(nèi)部對照。本公開的實施方案提供用作甲基化標(biāo)記和內(nèi)部對照的稱為“zdhhc1”的標(biāo)記。在本公開實施方案的開發(fā)期間進行的實驗證實，在正常血液樣品(例如，獲自無病個體)中發(fā)現(xiàn)很少或沒有甲基化zdhhc1。與通常使用的內(nèi)部對照dna(例如β-肌動蛋白)相反，zdhhc1產(chǎn)生例如來自存在于組織或糞便樣品中的血液的非常低的本底信號。在本發(fā)明技術(shù)的開發(fā)期間，發(fā)現(xiàn)在示例性甲基化測定(例如側(cè)翼內(nèi)切核酸酶測定，諸如quarts測定)中用zdhhc1替代actb內(nèi)部對照增加了測定的靈敏度和特異性。另外的實驗證實，zdhhc1用作可用于檢測血液中的上皮組織細(xì)胞的標(biāo)記(例如，作為轉(zhuǎn)移性癌癥的標(biāo)記)。本文描述了示例性實施方案。盡管本文的公開內(nèi)容是指某些說明的實施方案，但是應(yīng)理解，這些實施方案通過舉例而不是通過限制的方式呈現(xiàn)。i.組織細(xì)胞特異性標(biāo)記在檢測和定量已經(jīng)進行亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化的甲基化富含cpg的dna的測定中，典型的是還檢測存在于相同樣品中的對照基因，所述對照基因驗證測定中的dna輸入，不管來源(例如，癌癥、正常、糞便、組織)如何。這種對照基因用于例如歸一化跨越不同樣品的測定中獲得的dna拷貝數(shù)數(shù)據(jù)，以精確地顯示樣品-樣品的較高或較低的疾病相關(guān)的標(biāo)記水平。對于歸一化基因以最佳地運作的甲基化測定，其應(yīng)滿足若干標(biāo)準(zhǔn)。理想的歸一化基因，例如：1)應(yīng)相等地存在于正常組織和患病組織中；2)應(yīng)與被測定的測試基因/標(biāo)記(例如超甲基化是疾病狀態(tài)的指標(biāo)的dna標(biāo)記)具有大約相同的gc含量；3)應(yīng)與測試基因/標(biāo)記以相同的方式反應(yīng)，以進行預(yù)定量(pre-pcr)樣品處理，諸如亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化；以及4)應(yīng)具有與所測定的測試基因/標(biāo)記的pcr擴增效率類似的pcr擴增效率。β-肌動蛋白基因(通常用作用于檢測甲基化標(biāo)記dna的歸一化基因的基因)不與疾病諸如癌癥和腺瘤等相關(guān)的甲基化標(biāo)記(例如，波形蛋白、胞裂蛋白9、ndrg4、bmp3、vav3、sfmbt2_897或tfpi2a)具有相同的gc含量和cpg甲基化，因此其在pre-pcr亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化或pcr擴增中表現(xiàn)得不像所述標(biāo)記dna一樣。在本技術(shù)的發(fā)展中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)使用滿足上述標(biāo)準(zhǔn)的歸一化基因代替actb提高了測定靈敏度和特異性。在本技術(shù)的開發(fā)中，進一步發(fā)現(xiàn)使用在正常組織和患病組織中被高度甲基化但在血液中未被甲基化的標(biāo)記基因提供了對組織細(xì)胞(例如上皮細(xì)胞)特異性并且在血液中的存在低的標(biāo)記。所述對照dna的使用減少來自樣品(例如糞便或組織樣品)中存在的任何血液的本底，并且還可用于檢測可能例如在腫瘤轉(zhuǎn)移期間發(fā)生的血液中的所述組織細(xì)胞的異常存在。參見，例如于2015年12月11日提交的pct申請序列號pct/us2015/065272，所述申請以引用方式整體并入本文。在本文中描述的實驗鑒定了在正常和癌組織中高度甲基化的基因(例如，zdhhc1)。這些基因在血液中未高度甲基化，并且除了如實施例6所述，與轉(zhuǎn)移性癌癥相關(guān)聯(lián)之外，它們在血液中被甲基化的程度未根據(jù)疾病狀態(tài)而變化。這允許僅反映組織且不依賴于樣品中血液含量的更好和更精確的甲基化計算。本文描述的基因用于歸一化患者與樣品之間的標(biāo)記水平。zdhhc1、zfand3、zmym4、odz2和trio被鑒定為候選甲基化標(biāo)記。選擇在血沉棕黃層中具有低甲基化的歸一化基因允許更敏感地檢測目標(biāo)標(biāo)記的甲基化(例如，用于歸一化信號的分母低，并且因此目標(biāo)標(biāo)記的甲基化％變得更大并且更易于區(qū)分)。本文所述的歸一化基因在組織(癌癥和正常)中被高度甲基化，并且在血液中未被高度甲基化，并且提供優(yōu)于現(xiàn)有標(biāo)記的若干優(yōu)點：1-gc含量和cpg甲基化和亞硫酸氫鹽反應(yīng)性與所研究的dna標(biāo)記更類似。2-它們顯示與所測量的標(biāo)記dna的pcr擴增效率更類似的pcr擴增效率。3-血沉棕黃層中的低甲基化狀態(tài)允許在血液中或在血液存在下的目標(biāo)標(biāo)記的更高甲基化百分比檢測。ii.甲基化檢測測定本文所述的標(biāo)記(例如，特別是zdhhc1)可在各種甲基化檢測測定用作歸一化試劑和疾病狀態(tài)的指標(biāo)。用于分析核酸的5-甲基胞嘧啶存在的最常用方法是基于由frommer等描述用于檢測dna中的5-甲基胞嘧啶的亞硫酸氫鹽法(frommer等(1992)proc.natl.acad.sci.usa89:1827–31，其出于所有目的以引用方式整體明確地并入本文)或其變化。映射5-甲基胞嘧啶的亞硫酸氫鹽法是基于觀察到的胞嘧啶而非5-甲基胞嘧啶與亞硫酸氫鹽離子(也稱為亞硫酸氫鹽)的反應(yīng)。所述反應(yīng)通常根據(jù)以下步驟進行：首先，胞嘧啶與亞硫酸氫鹽反應(yīng)形成磺化胞嘧啶。接著，磺化反應(yīng)中間體的自發(fā)脫氨基產(chǎn)生磺化尿嘧啶。最后，磺化尿嘧啶在堿性條件下脫磺酸化形成尿嘧啶。檢測是可能的，因為尿嘧啶堿基與腺嘌呤配對(因此表現(xiàn)得像胸腺嘧啶一樣)，而5-甲基胞嘧啶堿基與鳥嘌呤配對(因此表現(xiàn)得像胞嘧啶一樣)。這使得可以通過例如亞硫酸氫鹽基因組測序(griggg和clarks,bioessays(1994)16:431–36；griggg,dnaseq.(1996)6:189–98)、例如美國專利號5,786,146所公開的甲基化特異性pcr(msp)或使用比較序列特異性探針切割的測定(例如quarts側(cè)翼內(nèi)切核酸酶測定)(參見，例如zou等(2010)“sensitivequantificationofmethylatedmarkerswithanovelmethylationspecifictechnology”clinchem56:a199；美國專利8,361,720以及美國專利申請序列號；12/946,745；12/946,752和61/705,603)來將甲基化胞嘧啶與非甲基化胞嘧啶鑒別開來。一些常規(guī)技術(shù)涉及包括以下的方法：在瓊脂糖基質(zhì)中封閉待分析的dna，從而防止dna的擴散和復(fù)性(亞硫酸氫鹽僅與單鏈dna反應(yīng))，以及用快速透析替代沉淀和純化步驟(oleka,等(1996)“amodifiedandimprovedmethodforbisulfitebasedcytosinemethylationanalysis”nucleicacidsres.24:5064-6)。因此，可以分析單個細(xì)胞的甲基化狀態(tài)，從而說明所述方法的效用和靈敏度。用于檢測5-甲基胞嘧啶的常規(guī)方法的綜述由rein,t.,等(1998)nucleicacidsres.26:2255提供。亞硫酸氫鹽技術(shù)通常包括在亞硫酸氫鹽處理之后擴增已知核酸的短的特異性片段，然后通過測序(olek和walter(1997)nat.genet.17:275–6)或引物延伸反應(yīng)(gonzalgo和jones(1997)nucleicacidsres.25:2529–31；wo95/00669；美國專利號6,251,594)測定產(chǎn)物以分析單個胞嘧啶位置。一些方法使用酶消化(xiong和laird(1997)nucleicacidsres.25:2532–4)。通過雜交進行的檢測也已經(jīng)在本領(lǐng)域中有所描述(olek等,wo99/28498)。另外，已經(jīng)描述了使用亞硫酸氫鹽技術(shù)以進行關(guān)于單個基因的甲基化檢測(grigg和clark(1994)bioessays16:431–6；zeschnigk等(1997)hummolgenet.6:387–95；feil等(1994)nucleicacidsres.22:695；martin等(1995)gene157:261–4；wo9746705；wo9515373)。各種甲基化測定程序可根據(jù)本發(fā)明技術(shù)與亞硫酸氫鹽處理聯(lián)合使用。這些測定允許測定核酸序列內(nèi)一個或多個cpg二核苷酸(例如，cpg島)的甲基化狀態(tài)。除了其它技術(shù)之外，所述測定還涉及亞硫酸氫鹽處理的核酸的測序、pcr(用于序列特異性擴增)、southern印跡分析和甲基化敏感性限制酶的使用。例如，已經(jīng)通過使用亞硫酸氫鹽處理來簡化基因組測序以分析甲基化模式和5-甲基胞嘧啶分布(frommer等(1992)proc.natl.acad.sci.usa89:1827–1831)。另外，例如如由sadri和hornsby(1997)nucl.acidsres.24:5058–5059所述或如被稱為cobra(組合亞硫酸氫鹽限制性分析)(xiong和laird(1997)nucleicacidsres.25:2532–2534)的方法所體現(xiàn)，由亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化的dna擴增的pcr產(chǎn)物的限制酶消化可用于評估甲基化狀態(tài)。cobratm分析是用于確定少量基因組dna中特定基因座處的dna甲基化水平的定量甲基化測定(xiong和laird,nucleicacidsres.25:2532-2534,1997)。簡言之，限制酶消化用于揭示亞硫酸氫鈉處理的dna的pcr產(chǎn)物的甲基化依賴性序列差異。首先通過根據(jù)由frommer等(proc.natl.acad.sci.usa89:1827-1831,1992)所述的程序通過標(biāo)準(zhǔn)亞硫酸氫鹽處理將甲基化依賴性序列差異引入基因組dna中。然后使用對目標(biāo)cpg島特異性的引物進行亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化的dna的pcr擴增，隨后進行限制性內(nèi)切酶消化、凝膠電泳以及使用特異性標(biāo)記的雜交探針進行的檢測。原始dna樣品中的甲基化水平以跨廣譜的dna甲基化水平的線性定量方式由消化和未消化pcr產(chǎn)物的相對量表示。此外，此技術(shù)可以可靠地應(yīng)用于獲自顯微切割石蠟包埋組織樣品的dna。用于cobratm分析的典型試劑(例如，其可在典型的基于cobratm的試劑盒中發(fā)現(xiàn))可包括但不限于：用于特定基因座(例如特異性基因、標(biāo)記、基因區(qū)、標(biāo)記區(qū)、亞硫酸氫鹽處理的dna序列、cpg島等)的pcr引物；限制酶和適當(dāng)?shù)木彌_液；基因雜交寡核苷酸；對照雜交寡核苷酸；用于寡核苷酸探針的激酶標(biāo)記試劑盒；以及標(biāo)記的核苷酸。另外，亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化試劑可包括：dna變性緩沖液；磺化緩沖液；dna回收試劑或試劑盒(例如沉淀、超濾、親和柱)；脫磺酸化緩沖液；以及dna回收組分。諸如“methylighttm”(基于熒光的實時pcr技術(shù))(eads等,cancerres.59:2302-2306,1999)、ms-snupetm(甲基化敏感性單核苷酸引物延伸)反應(yīng)(gonzalgo和jones,nucleicacidsres.25:2529-2531,1997)、甲基化特異性pcr(“msp”；herman等,proc.natl.acad.sci.usa93:9821-9826,1996；美國專利號5,786,146)和甲基化cpg島擴增(“mca”；toyota等,cancerres.59:2307-12,1999)的測定被單獨使用或與這些方法中的一種或多種組合使用?！癶eavymethyltm”測定、技術(shù)是用于基于亞硫酸氫鹽處理的dna的甲基化特異性擴增來評估甲基化差異的定量方法。覆蓋擴增引物之間或由擴增引物覆蓋的cpg位置的甲基化特異性阻斷探針(“阻斷劑”)使得能夠進行核酸樣品的甲基化特異性選擇性擴增。術(shù)語“heavymethyltmmethylighttm”測定是指heavymethyltmmethylighttm測定，其為methylighttm測定的變化，其中methylighttm測定與覆蓋擴增引物之間的cpg位置的甲基化特異性阻斷探針組合。heavymethyltm測定還可與甲基化特異性擴增引物組合使用。用于heavymethyltm分析的典型試劑(例如，其可在典型的基于methylighttm的試劑盒中發(fā)現(xiàn))可包括但不限于：用于特定基因座(例如特異性基因、標(biāo)記、基因區(qū)、標(biāo)記區(qū)、亞硫酸氫鹽處理的dna序列、cpg島，或亞硫酸氫鹽處理的dna序列或cpg島等)的pcr引物；阻斷寡核苷酸；優(yōu)化的pcr緩沖液和脫氧核苷酸；以及taq聚合酶。msp(甲基化特異性pcr)允許評估cpg島內(nèi)幾乎任何一組cpg位點的甲基化狀態(tài)，而不依賴于使用甲基化敏感性限制酶無關(guān)(herman等proc.natl.acad.sci.usa93:9821-9826,1996；美國專利號5,786,146)。簡言之，dna由亞硫酸氫鈉修飾，所述亞硫酸氫鈉將未甲基化胞嘧啶而非甲基化胞嘧啶轉(zhuǎn)化成尿嘧啶，并且隨后用對甲基化dna與未甲基化dna特異性的引物擴增產(chǎn)物。msp僅需要少量dna，對給定cpg島位點的0.1％甲基化等位基因敏感，并且可對提取自石蠟包埋樣品的dna進行。用于msp分析的典型試劑(例如，其可在典型的基于msp的試劑盒中發(fā)現(xiàn))可包括但不限于：用于特定基因座(例如特異性基因、標(biāo)記、基因區(qū)、標(biāo)記區(qū)、亞硫酸氫鹽處理的dna序列、cpg島等)的甲基化和未甲基化pcr引物；優(yōu)化的pcr緩沖液和脫氧核苷酸以及特異性探針。methylighttm測定是利用基于熒光的實時pcr(例如)的高通量定量甲基化測定，其不需要在pcr步驟后進行進一步操作(eads等,cancerres.59:2302-2306,1999)。簡言之，methylighttm方法以混合的基因組dna樣品開始，所述混合的基因組dna樣品根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)程序(亞硫酸氫鹽方法將未甲基化胞嘧啶殘基轉(zhuǎn)化成尿嘧啶)在亞硫酸氫鈉反應(yīng)中轉(zhuǎn)化成混合的甲基化依賴性序列差異匯集物。然后在“偏倚”反應(yīng)中例如用與已知cpg二核苷酸重疊的pcr引物進行基于熒光的pcr。序列鑒別在擴增過程水平上和熒光檢測過程水平上發(fā)生。methylighttm測定用作用于核酸例如基因組dna樣品中的甲基化模式的定量測試，其中序列鑒別在探針雜交水平上發(fā)生。在定量版本中，pcr反應(yīng)在與特定推定的甲基化位點重疊的熒光探針存在下提供甲基化特異性擴增。對于輸入dna量的無偏倚控制通過引物和探針都不覆蓋任何cpg二核苷酸的反應(yīng)來提供。可替代地，通過用不覆蓋已知甲基化位點的對照寡核苷酸(例如，heavymethyltm的基于熒光的版本和msp技術(shù))或用覆蓋潛在甲基化位點的寡核苷酸探測偏倚pcr匯集物來實現(xiàn)基因組甲基化的定性測試。methylighttm方法與任何合適的探針(例如探針、探針等)一起使用。例如，在一些應(yīng)用中，將雙鏈基因組dna用亞硫酸氫鈉處理，并使用探針(例如用msp引物和/或heavymethyl阻斷劑寡核苷酸和探針)進行兩組pcr反應(yīng)中的一組。探針用熒光“報道”和“猝滅”分子來進行雙標(biāo)記，并被設(shè)計成對相對高的gc含量區(qū)特異性的，使得其與正向引物或反向引物相比在pcr循環(huán)中在約高10℃的溫度下解鏈。這允許探針在pcr退火/延伸步驟期間保持完全雜交。隨著taq聚合酶在pcr期間酶促地合成新鏈，其將最終將到達退火的探針。taq聚合酶5′至3′內(nèi)切核酸酶活性將通過消化探針來將其置換以釋放熒光報道分子，以便使用實時熒光檢測系統(tǒng)對其現(xiàn)在未淬滅的信號進行定量檢測。用于methylighttm分析的典型試劑(例如，其可在典型的基于methylighttm的試劑盒中發(fā)現(xiàn))可包括但不限于：用于特定基因座(例如特異性基因、標(biāo)記、基因區(qū)、標(biāo)記區(qū)、亞硫酸氫鹽處理的dna序列、cpg島等)的pcr引物；或探針；優(yōu)化的pcr緩沖液和脫氧核苷酸；以及taq聚合酶。qmtm(定量甲基化)測定是用于基因組dna樣品中的甲基化模式的替代性定量測試，其中序列鑒別在探針雜交水平上發(fā)生。在此定量版本中，pcr反應(yīng)在與特定推定的甲基化位點重疊的熒光探針存在下提供無偏倚擴增。對于輸入dna量的無偏倚控制通過引物和探針都不覆蓋任何cpg二核苷酸的反應(yīng)來提供?？商娲兀ㄟ^用不覆蓋已知甲基化位點的對照寡核苷酸(heavymethyltm的基于熒光的版本和msp技術(shù))或用覆蓋潛在甲基化位點的寡核苷酸探測偏倚pcr匯集物來實現(xiàn)基因組甲基化的定性測試。在擴增過程中，qmtm方法可與任何合適的探針例如探針、探針一起使用。例如，將雙鏈基因組dna用亞硫酸氫鈉處理，并進行無偏倚引物和探針。探針用熒光“報道”和“猝滅”分子來進行雙標(biāo)記，并被設(shè)計成對相對高的gc含量區(qū)特異性的，使得其與正向引物或反向引物相比在pcr循環(huán)中在約高10℃的溫度下解鏈。這允許探針在pcr退火/延伸步驟期間保持完全雜交。隨著taq聚合酶在pcr期間酶促地合成新鏈，其將最終將到達退火的探針。taq聚合酶5′至3′內(nèi)切核酸酶活性將通過消化探針來將其置換以釋放熒光報道分子，以便使用實時熒光檢測系統(tǒng)對其現(xiàn)在未淬滅的信號進行定量檢測。用于qmtm分析的典型試劑(例如，其可在典型的基于qmtm的試劑盒中發(fā)現(xiàn))可包括但不限于：用于特定基因座(例如特異性基因、標(biāo)記、基因區(qū)、標(biāo)記區(qū)、亞硫酸氫鹽處理的dna序列、cpg島等)的pcr引物；或探針；優(yōu)化的pcr緩沖液和脫氧核苷酸；以及taq聚合酶。ms-snupetm技術(shù)是用于基于亞硫酸氫鹽處理dna評估特定cpg位點處的甲基化差異，隨后進行單核苷酸引物延伸的定量方法(gonzalgo和jones,nucleicacidsres.25:2529-2531,1997)。簡言之，基因組dna與亞硫酸氫鈉反應(yīng)以將未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)化成尿嘧啶，同時使5-甲基胞嘧啶不變。然后使用對亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化的dna特異性的pcr引物進行所需靶序列的擴增，并且將所得產(chǎn)物分離并用作用于目標(biāo)cpg位點處的甲基化分析的模板?？蓪ι倭康膁na(例如，顯微切割的病理切片)進行分析，并其避免利用限制酶以確定cpg位點處的甲基化狀態(tài)。用于ms-snupetm分析的典型試劑(例如，其可在典型的基于ms-snupetm的試劑盒中發(fā)現(xiàn))可包括但不限于：用于特定基因座(例如特異性基因、標(biāo)記、基因區(qū)、標(biāo)記區(qū)、亞硫酸氫鹽處理的dna序列、cpg島等)的pcr引物；優(yōu)化的pcr緩沖液和脫氧核苷酸；凝膠提取試劑盒；陽性對照引物；用于特定位點的ms-snupetm引物；反應(yīng)緩沖液(用于ms-snupe反應(yīng))；以及標(biāo)記的核苷酸。另外，亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化試劑可包括：dna變性緩沖液；磺化緩沖液；dna回收試劑或試劑盒(例如沉淀、超濾、親和柱)；脫磺酸化緩沖液；以及dna回收組分。約化表示亞硫酸氫鹽測序(rrbs)以對核酸的亞硫酸氫鹽處理開始，以將所有未甲基化胞嘧啶轉(zhuǎn)化成尿嘧啶，隨后進行限制酶消化(例如，通過識別包括cg序列的位點的酶，諸如mspi)，并且偶聯(lián)至銜接子配體之后進行片段的完整測序。限制酶的選擇豐富了cpg致密區(qū)的片段，減少了可能在分析過程中映射到多基因位置的冗余序列的數(shù)目。因此，rrbs通過選擇用于測序的限制性片段的子集(例如，通過使用制備性凝膠電泳的大小選擇)來降低核酸樣品的復(fù)雜性。與全基因組亞硫酸氫鹽測序相反，由限制酶消化產(chǎn)生的每個片段均含有至少一個cpg二核苷酸的dna甲基化信息。因此，rrbs豐富了在這些區(qū)中具有高頻限制酶切位點的啟動子、cpg島和其它基因組特征的樣品，并且因此提供了評估一個或多個基因組基因座的甲基化狀態(tài)的測定。用于rrbs的典型方案包括以下步驟：用限制酶諸如mspi消化核酸樣品、補齊突出端和a加尾、連接銜接子、亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化以及pcr。參見，例如等(2005)“genome-scalednamethylationmappingofclinicalsamplesatsingle-nucleotideresolution”natmethods7:133–6；meissner等(2005)“reducedrepresentationbisulfitesequencingforcomparativehigh-resolutiondnamethylationanalysis”nucleicacidsres.33:5868–77。在一些實施方案中，定量等位基因特異性實時靶標(biāo)和信號擴增(quarts)測定用于評估甲基化狀態(tài)。在每個quarts測定中依次發(fā)生三種反應(yīng)，包括在初級反應(yīng)中的擴增(反應(yīng)1)和靶探針切割(反應(yīng)2)；以及次級反應(yīng)中的fret切割和熒光信號產(chǎn)生(反應(yīng)3)。當(dāng)用特異性引物擴增靶核酸時，具有側(cè)翼序列的特異性檢測探針與擴增子松散結(jié)合。靶結(jié)合位點處的特異性侵入性寡核苷酸的存在致使5′核酸酶例如fen-1內(nèi)切核酸酶通過在檢測探針與側(cè)翼序列之間切割來釋放側(cè)翼序列。側(cè)翼序列與對應(yīng)的fret盒的非發(fā)夾部分互補。因此，側(cè)翼序列在fret盒上用作侵入性寡核苷酸，并且實現(xiàn)fret盒熒光團與猝滅劑之間的切割，這產(chǎn)生了熒光信號。切割反應(yīng)可切割每個靶點的多個探針，并且因此釋放每個側(cè)翼的多個熒光團，從而提供指數(shù)信號擴增。quarts可通過使用fret盒用不同的染料來檢測單個反應(yīng)孔中的多個靶。參見，例如zou等(2010)“sensitivequantificationofmethylatedmarkerswithanovelmethylationspecifictechnology”clinchem56:a199)中。術(shù)語“亞硫酸氫鹽試劑”是指如本文所公開用于區(qū)分甲基化cpg二核苷酸序列和未甲基化cpg二核苷酸序列的包含亞硫酸氫鹽、亞硫酸氫鹽、亞硫酸氫鹽(hydrogensulfite)或其組合的試劑。所述處理的方法是本領(lǐng)域已知的(例如，pct/ep2004/011715和wo2013/116375，每個所述專利均以引用方式整體并入)。在一些實施方案中，亞硫酸氫鹽處理在諸如但不限于正烷撐二醇(n-alkylenglycol)或二乙二醇二甲醚(dme)的變性溶劑存在下或在二氧雜環(huán)己烷或二氧雜環(huán)己烷衍生物存在下進行。在一些實施方案中，變性溶劑以1％與35％(v/v)之間的濃度使用。在一些實施方案中，亞硫酸氫鹽反應(yīng)在諸如但不限于苯并二氫吡喃衍生物(例如6-羥-2,5,7,8,-四甲基苯并二氫吡喃2-羧酸)或三羥基苯甲酸(trihydroxybenzoneacid)及其衍生物(例如沒食子酸)的清除劑存在下進行(參見：pct/ep2004/011715，其以引用方式整體并入)。在某些優(yōu)選的實施方案中，亞硫酸氫鹽反應(yīng)包括例如如wo2013/116375所述的用亞硫酸氫銨進行的處理。在一些實施方案中，在定量之前純化亞硫酸氫鹽處理的dna。這可通過本領(lǐng)域已知的任何手段進行，所述任何手段諸如但不限于例如通過microcontm柱(由milliporetm制造)進行的超濾。純化根據(jù)改進的制造商方案來進行(參見，例如pct/ep2004/011715，其以引用方式整體并入)。在一些實施方案中，亞硫酸氫鹽處理的dna與固體支持物(例如磁珠)結(jié)合，并且在dna與支持物結(jié)合時發(fā)生脫磺酸化和洗滌。例如在wo2013/116375中提供了所述實施方案的實例。在某些優(yōu)選的實施方案中，在于支持物上脫磺酸化和洗滌之后，支持物結(jié)合的dna立即準(zhǔn)備用于甲基化測定。在一些實施方案中，脫磺酸化dna在測定之前從支持物上洗脫。在一些實施方案中，使用根據(jù)本發(fā)明的多組引物寡核苷酸(例如，參見表2)和擴增酶來擴增處理的dna的片段。若干dna區(qū)段的擴增可在同一個反應(yīng)容器中同時進行。通常，使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)進行擴增。在所述方法的另一個實施方案中，通過使用甲基化特異性引物寡核苷酸來檢測標(biāo)記內(nèi)或附近的cpg位置的甲基化狀態(tài)。此技術(shù)(msp)已在授予herman的美國專利號6,265,171中有所描述。用于擴增亞硫酸氫鹽處理的dna的甲基化狀態(tài)特異性引物的使用允許甲基化核酸與未甲基化核酸之間的分化。msp引物對含有至少一種與亞硫酸氫鹽處理的cpg二核苷酸雜交的引物。因此，所述引物的序列包含至少一個cpg二核苷酸。對未甲基化dna特異性的msp引物在cpg中的c位置的位置處含有“t”。通過擴增獲得的片段可攜帶可直接或間接檢測的標(biāo)記。在一些實施方案中，標(biāo)記是熒光標(biāo)記、放射性核素或可在質(zhì)譜儀中檢測到的具有典型質(zhì)量的可拆分分子片段。當(dāng)所述標(biāo)記是質(zhì)量標(biāo)記時，一些實施方案提供了具有單個正或負(fù)凈電荷的標(biāo)記擴增子，從而允許在質(zhì)譜儀中具有更好的可檢測性(delectability)。檢測可通過例如基質(zhì)輔助激光解吸/電離質(zhì)譜(maldi)或使用電子噴霧質(zhì)譜(esi)來進行和可視化。適于這些測定技術(shù)的分離dna的方法是本領(lǐng)域已知的。特別地，一些實施方案包括如美國專利申請序列號13/470,251(“核酸分離”，以us2012/0288868出版)所述的核酸分離，所述專利以引用方式整體并入本文。在一些實施方案中，本文所述的標(biāo)記用于對糞便樣品進行的quarts測定。在一些實施方案中，提供了用于生產(chǎn)dna樣品的方法，特別是用于生產(chǎn)以下dna樣品的方法，所述dna樣品包含小體積(例如小于100、小于60微升)的高度純化的低豐度核酸，并且基本上和/或?qū)嶋H上不含抑制用于測試dna樣品的測定(例如，pcr、invader、quarts測定等)的物質(zhì)。所述dna樣品可用于診斷測定中，所述診斷測定定性地檢測存在于取自患者的樣品中的基因、基因變體(例如，等位基因)或基因修飾(例如，甲基化)的存在或定量地測量其活性、表達或量。例如，一些癌癥與特定突變等位基因或特定甲基化狀態(tài)的存在相關(guān)，因此檢測和/或定量所述突變等位基因或甲基化狀態(tài)在癌癥的診斷和治療中具有預(yù)測價值。許多有價值的遺傳標(biāo)記以極低的量存在于樣品中，并且產(chǎn)生所述標(biāo)記的許多事件是罕見的。因此，甚至靈敏的檢測方法諸如pcr也需要大量的dna來提供足夠的低豐度靶以滿足或取代測定的檢測閾值。此外，甚至低量抑制性物質(zhì)的存在也損害了涉及檢測所述低量靶的這些測定的精確度和精密度。因此，本文提供了提供體積和濃度的必要管理以產(chǎn)生所述dna樣品的方法。一些生物樣品，諸如糞便樣品，含有多種對pcr抑制性的多種多樣的不同化合物。因此，dna提取程序包括去除和/或滅活pcr抑制劑的方法。因此，在一些實施方案中，在實施例1中描述了處理和制備樣品，以及特別地但不排他地用于從包含核酸的樣品中去除測定抑制劑的方法、系統(tǒng)和試劑盒。在一些實施方案中，樣品包括血液、血清、血漿、胃分泌物、胰液、胃腸道活檢樣品、來自胃腸道活檢的顯微切割細(xì)胞、脫落到腸胃道腔中的胃腸道細(xì)胞和/或從糞便中回收的胃腸道細(xì)胞。在一些實施方案中，受試者是人。這些樣品可源自上消化道、下胃腸道，或者包括來自上胃腸道和下胃腸道的細(xì)胞、組織和/或分泌物。樣品可包括來自肝、膽管、胰腺、胃、結(jié)腸、直腸、食道、小腸、闌尾、十二指腸、息肉、膽囊、肛門和/或腹膜的細(xì)胞、分泌物或組織。在一些實施方案中，樣品包括細(xì)胞液、腹水、尿液、排泄物、胰液、內(nèi)窺鏡檢查期間獲得的液體、血液、粘液或唾液。在一些實施方案中，樣品是糞便樣品。所述樣品可通過本領(lǐng)域已知(諸如對技術(shù)人員將是顯而易見)的任何數(shù)目的手段獲得。例如，可以容易地獲得尿液和糞便樣品，而例如可通過使用針頭和注射器來以腸胃外方式獲得血液、腹水、血清或胰液樣品?？赏ㄟ^使樣品經(jīng)受本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的各種技術(shù)來獲得無細(xì)胞或基本上無細(xì)胞的樣品，所述各種技術(shù)包括但不限于離心和過濾。雖然通常優(yōu)選不使用侵入性技術(shù)來獲得樣品，但是仍可優(yōu)選獲得諸如組織勻漿、組織切片和活檢試樣的樣品。所述技術(shù)不限于用于制備樣品并提供用于測試的核酸的方法。例如，在一些實施方案中，例如如美國專利號8,808,990和9,169,511以及wo2012/155072所詳述或通過相關(guān)方法使用直接基因捕獲來從糞便樣品或從血液或從血漿樣品中分離dna。標(biāo)記的分析可單獨進行或與一個測試樣品內(nèi)的另外標(biāo)記同時進行。例如，若干標(biāo)記可組合成用于有效處理多個樣品并且潛在地提供更大的診斷和/或預(yù)后精確度的一個測試。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到測試來自相同受試者的多個樣品的值(例如，在連續(xù)的時間點時)。序列樣品的所述測試可允許鑒定標(biāo)記甲基化狀態(tài)隨時間推移的變化。甲基化狀態(tài)的變化以及甲基化狀態(tài)變化的不存在可提供關(guān)于疾病狀態(tài)的有用信息，所述有用信息包括但不限于確定事件開始的大約時間、可救治組織的存在和量、藥物療法的適當(dāng)性、各種療法的有效性以及確定受試者結(jié)果(包括未來事件的風(fēng)險)。生物標(biāo)記的分析可以各種物理形式進行。例如，微量滴定板或自動化的使用可用來促進大量測試樣品的處理?？商娲?，可開發(fā)單一樣品格式來例如在流動運輸或急診室環(huán)境中及時地促進即時治療和診斷。預(yù)期所述技術(shù)的實施方案以試劑盒的形式提供。試劑盒包含本文所述的組合物、裝置、儀器等的實施方案以及試劑盒的使用說明書。所述說明書描述了用于由樣品制備分析物(例如用于收集樣品并由樣品制備核酸)的適當(dāng)方法。試劑盒的單獨組分包裝在適當(dāng)容器和包裝(例如，小瓶、盒子、泡罩包裝、安瓿、罐子、瓶子、管子等)中，并且組分在適當(dāng)容器(例如，一個盒子或多個盒子)中包裝在一起，以便試劑盒的用戶方便地存儲、運送和/或使用。應(yīng)當(dāng)理解，液體組分(例如，緩沖液)可以凍干形式提供以由使用者重構(gòu)。試劑盒可包括用于評估、驗證和/或確保試劑盒性能的對照或參考。例如，用于測定村子存在于樣品中的核酸的量的試劑盒可包括包含用于比較的已知濃度的相同或另一種核酸的對照，并且在一些實施方案中包括對于對照核酸特異性的檢測試劑(例如，引物)。所述試劑盒適于在臨床環(huán)境中使用，并且在一些實施方案中適于在用戶的家中使用。在一些實施方案中，試劑盒的組分提供用于由樣品制備核酸溶液的系統(tǒng)的功能性。在一些實施方案中，系統(tǒng)的某些組分由用戶提供。iii.應(yīng)用在一些實施方案中，診斷測定鑒定個體中疾病或病狀的存在。在一些實施方案中，所述疾病是癌癥(例如，胃腸道系統(tǒng)的癌癥)。在一些實施方案中，測定鑒定患者的炎性腸病(ibd)或ibd的嚴(yán)重性。在一些實施方案中，測定鑒定先前診斷為ibd的受試者體內(nèi)胃腸道系統(tǒng)的癌癥的存在。例如，所述技術(shù)的方面可應(yīng)用于ibd測定中，所述ibd測定諸如wo2015/153284al和wo2015/153283al中所公開的那些ibd測定，所述專利兩者均出于所用目的以引用方式整體并入本文。本公開不限于特定標(biāo)記。在一些實施方案中，利用異常甲基化與胃腸道瘤相關(guān)的標(biāo)記(例如，波形蛋白、胞裂蛋白9、ndrg4、bmp3、vav3、sfmbt2_897或tfpi2a中的一種或多種)。在一些實施方案中，測定還包括檢測突變的kras基因(參見，例如實施例1)。在一些實施方案中，測定還包括檢測糞便樣品中的血紅蛋白(參見，例如實施例1)。在一些實施方案中，所述技術(shù)涉及用于治療患者(例如，患有胃腸道癌的患者、患有早期胃腸道癌的患者或可能發(fā)展胃腸道癌的患者)的方法，所述方法包括測定如本文所提供的一種或多種標(biāo)記的甲基化狀態(tài)，以及基于測定甲基化狀態(tài)的結(jié)果向患者施用治療。治療可以是施用藥物化合物、疫苗、進行手術(shù)、對患者進行成像、進行另一個測試。優(yōu)選地，所述用途是臨床篩選的方法、預(yù)后評估的方法、監(jiān)測療法結(jié)果的方法、鑒定最可能響應(yīng)于特定治療性治療的患者的方法、對患者或受試者進行成像的方法，以及用于藥物篩選和開發(fā)的方法。在所述技術(shù)的一些實施方案中，提供了用于診斷受試者體內(nèi)的胃腸道癌的方法。如本文所用的術(shù)語“診斷(diagnosing)”和“診斷(diagnosis)”是指技術(shù)人員可估計并且甚至確定受試者是否患有給定疾病或病狀或可能在將來發(fā)展給定疾病或病狀的方法。技術(shù)人員常?；谝环N或多種診斷指標(biāo)例如像生物標(biāo)記(例如本文所述的那些生物標(biāo)記)進行診斷，所述生物標(biāo)記的甲基化狀態(tài)指示病狀的存在、嚴(yán)重性或不存在。臨床癌癥預(yù)后連同診斷涉及確定癌癥的侵襲性和腫瘤復(fù)發(fā)的可能性以規(guī)劃最有效的療法。如果可進行更精確的預(yù)后，或者甚至可評估發(fā)展癌癥的潛在風(fēng)險，則可為患者選擇適當(dāng)?shù)寞煼?，并且在一些情況下選擇不太苛刻的療法。癌癥生物標(biāo)記的評估(例如，確定甲基化狀態(tài))可用于分離具有良好預(yù)后和/或低的發(fā)展癌癥風(fēng)險的受試者，與可能受益于更密集的治療的更可能發(fā)展癌癥或遭受癌癥復(fù)發(fā)的那些受試者相比，所述受試者將不需要療法或需要有限療法。因此，如本文所用，“進行診斷”或“診斷”還包括確定發(fā)展癌癥的風(fēng)險或確定預(yù)后，其可基于本文所公開的診斷生物標(biāo)記(例如，本文所述的那些生物標(biāo)記)的測量來提供預(yù)測臨床結(jié)果(具有或沒有醫(yī)學(xué)治療)、選擇適當(dāng)?shù)闹委?或治療是否將有效)或監(jiān)測當(dāng)前治療以及潛在地改變治療。此外，在目前公開的主題的一些實施方案中，可隨時間推移進行生物標(biāo)記的多次測定以促進診斷和/或預(yù)后。生物標(biāo)記的暫時變化可用來預(yù)測臨床結(jié)果、監(jiān)測胃腸道癌的進展和/或監(jiān)測針對癌癥的適當(dāng)療法的功效。在這種實施方案中，例如，可能期望在有效療法過程期間隨時間推移在生物樣品中看到本文公開的一種或多種生物標(biāo)記(以及潛在的一種或多種另外生物標(biāo)記(如果被監(jiān)測))的甲基化狀態(tài)的變化。目前公開的主題在一些實施方案中還提供了用于確定是否啟動或繼續(xù)預(yù)防或治療受試者的癌癥的方法。在一些實施方案中，所述方法包括在一段時間周期內(nèi)由受試者提供一系列生物樣品；分析所述系列生物樣品以確定每種生物樣品中的本文公開的至少一種生物標(biāo)記的甲基化狀態(tài)；以及比較每種生物樣品中的一種或多種生物標(biāo)記的甲基化狀態(tài)的任何可測量的變化。所述時間周期內(nèi)生物標(biāo)記甲基化狀態(tài)的任何變化均可用于預(yù)測發(fā)展癌癥的風(fēng)險、預(yù)測臨床結(jié)果、確定是否啟動或繼續(xù)預(yù)防或治療癌癥以及當(dāng)前療法是否有效地治療癌癥。例如，可在啟動治療之前選擇第一時間點，并且可在啟動治療之后的一段時間時選擇第二時間點。甲基化狀態(tài)可在取自不同時間點的每個樣品中測量，并記錄定性和/或定量差異。來自不同樣品的生物標(biāo)記水平的甲基化狀態(tài)的變化可與胃腸道癌風(fēng)險、預(yù)后、確定治療功效和/或受試者的癌癥進展相關(guān)。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的方法和組合物用于治療或診斷早期例如疾病癥狀出現(xiàn)之前的疾病。在一些實施方案中，本發(fā)明的方法和組合物用于治療或診斷臨床期疾病。如上所述，在一些實施方案中，可進行一種或多種診斷或預(yù)后生物標(biāo)記的多種測定，并且可使用標(biāo)記的暫時變化來確定診斷或預(yù)后。例如，診斷標(biāo)記可在初始時間時測定，并且在第二時間時再次測定。在此類實施方案中，初始時間至第二時間的標(biāo)記增加可以是癌癥的特定類型或嚴(yán)重性或給定預(yù)后的診斷。同樣地，初始時間至第二時間的標(biāo)記減少可指示癌癥的特定類型或嚴(yán)重性或給定預(yù)后。此外，一個或多個標(biāo)記的變化程度可與癌癥的嚴(yán)重性和未來的不良事件有關(guān)。技術(shù)人員將理解，雖然在某些實施方案中，可在多個時間點進行相同生物標(biāo)記的比較測量，但是還可在一個時間點時測量給定生物標(biāo)記，并且在第二時間點時測量第二生物標(biāo)記，并且這些標(biāo)記的比較可提供診斷信息。如本文所用，短語“確定預(yù)后”是指技術(shù)人員可預(yù)測受試者體內(nèi)的病狀的過程或結(jié)果的方法。術(shù)語“預(yù)后”不是指以100％精確度預(yù)測病狀的過程或結(jié)果的能力，或者甚至給定過程或結(jié)果可預(yù)測地或多或少可能基于生物標(biāo)記的甲基化狀態(tài)發(fā)生。相反，技術(shù)人員將理解，術(shù)語“預(yù)后”是指將發(fā)生某種過程或結(jié)果的可能性增加；也就是說，當(dāng)與未展現(xiàn)病狀的那些個體相比時，過程或結(jié)果更可能在展現(xiàn)給定病狀的受試者中發(fā)生。例如，在未展現(xiàn)病狀的個體(例如，具有一個或多個靶基因的正常甲基化狀態(tài))的個體中，給定結(jié)果(例如，患有胃腸道癌)的機會可能非常低。在一些實施方案中，統(tǒng)計學(xué)分析將預(yù)后指標(biāo)與不利結(jié)果的傾向相關(guān)聯(lián)。例如，在一些實施方案中，如由統(tǒng)計學(xué)顯著性水平所確定，與獲自未患有癌癥的患者的正常對照樣品中甲基化狀態(tài)不同的甲基化狀態(tài)可表明，受試者比具有更類似于對照樣品中甲基化狀態(tài)的水平的受試者更可能患有癌癥。此外，甲基化狀態(tài)從基線(例如“正?！?水平的變化可反映患者預(yù)后，并且甲基化狀態(tài)的變化程度可與不良事件的嚴(yán)重性有關(guān)。統(tǒng)計學(xué)顯著性常常通過比較兩個或更多個群體并確定置信區(qū)間和/或p值來確定。參見，例如dowdy和wearden,statisticsforresearch,johnwiley&sons,newyork,1983，其以引用方式整體并入本文。本主題的示例性置信區(qū)間為90％、95％、97.5％、98％、99％、99.5％、99.9％和99.99％，而示例性p值為0.1、0.05、0.025、0.02、0.01、0.005、0.001和0.0001。在其它實施方案中，可建立本文公開的預(yù)后性或診斷性生物標(biāo)記的甲基化狀態(tài)的閾值變化程度，并將生物樣品中生物標(biāo)記的甲基化狀態(tài)的變化程度簡單地與甲基化狀態(tài)的閾值變化程度相比較。本文提供的生物標(biāo)記的甲基化狀態(tài)的優(yōu)選閾值變化為約5％、約10％、約15％、約20％、約25％、約30％、約50％、約75％、約100％和約150％。在另一些實施方案中，可建立“諾模圖”，通過所述“諾模圖”，預(yù)測性或診斷性指標(biāo)(生物標(biāo)記或生物標(biāo)記組合)的甲基化狀態(tài)直接與給定結(jié)果的相關(guān)處置有關(guān)。技術(shù)人員熟悉所述諾模圖的使用以使兩個數(shù)值相關(guān)聯(lián)，認(rèn)識到此測量值的不確定性與標(biāo)記濃度的不確定性相同，因為引用了單獨樣品測量值，而不是群體平均值。在一些實施方案中，對照樣品與生物樣品同時分析，使得獲自生物樣品的結(jié)果可與獲自對照樣品的結(jié)果相比較。另外，預(yù)期可提供標(biāo)準(zhǔn)曲線，生物樣品的測定結(jié)果可與所述標(biāo)準(zhǔn)曲線相比較。如果使用熒光標(biāo)記，則此類標(biāo)準(zhǔn)曲線呈現(xiàn)作為測定單位(例如熒光信號強度)的函數(shù)的生物標(biāo)記甲基化狀態(tài)。使用取自多個供體的樣品，可提供正常組織中一種或多種生物標(biāo)記的對照甲基化狀態(tài)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，以及取自患有化生的供體或患有胃腸道癌的供體的組織中的一種或多種生物標(biāo)記的“處于風(fēng)險中”水平的標(biāo)準(zhǔn)曲線。在所述方法的某些實施方案中，在鑒定獲自受試者的生物樣品中的本文提供的一種或多種標(biāo)記的異常甲基化狀態(tài)時，將受試者鑒定為患有化生。在所述方法的其它實施方案中，獲自受試者的生物樣品中一種或多種所述生物標(biāo)記的異常甲基化狀態(tài)的檢測致使可將受試者鑒定為患有癌癥。在一些實施方案中，如果當(dāng)與對照甲基化狀態(tài)相比時，存在樣品中至少一種生物標(biāo)記的甲基化狀態(tài)的可測量差異，則將所述受試者診斷為患有胃腸道癌。相反，當(dāng)在生物樣品中未鑒定到甲基化狀態(tài)的變化時，則可將受試者鑒定為不患有胃腸道癌、不處于癌癥風(fēng)險中或具有低的癌癥風(fēng)險。在此方面，患有癌癥或具有其風(fēng)險的受試者可與患有低至基本上無癌癥或具有其風(fēng)險的受試者區(qū)分開來。具有發(fā)展胃腸道癌風(fēng)險的那些受試者可置于更密集和/或定期篩選方案(包括內(nèi)窺鏡監(jiān)視)中。另一方面，具有低至基本上無風(fēng)險的那些受試者可避免進行內(nèi)窺鏡檢查直至未來篩選的時間，例如根據(jù)本發(fā)明技術(shù)進行的篩選指示胃腸道癌的風(fēng)險已經(jīng)出現(xiàn)在那些受試者中。如上所述，根據(jù)本發(fā)明技術(shù)方法的實施方案，檢測一種或多種生物標(biāo)記的甲基化狀態(tài)的變化可以是定性測定，或者可以是定量測定。因此，將受試者診斷為患有胃腸道癌或處于發(fā)展胃腸道癌風(fēng)險中的步驟指示，進行某些閾值測量，例如生物樣品中的一種或多種生物標(biāo)記的甲基化狀態(tài)不同于預(yù)定的對照甲基化變化。在所述方法的一些實施方案中，對照甲基化狀態(tài)是任何可檢測的生物標(biāo)記甲基化狀態(tài)。在與生物樣品同時測試對照樣品的方法的其它實施方案中，預(yù)定甲基化狀態(tài)是對照樣品的甲基化狀態(tài)。在所述方法的其它實施方案中，預(yù)定甲基化狀態(tài)基于標(biāo)準(zhǔn)曲線和/或通過標(biāo)準(zhǔn)曲線來鑒定。在所述方法的其它實施方案中，預(yù)定甲基化狀態(tài)具體地是狀態(tài)或狀態(tài)范圍。因此，預(yù)定甲基化狀態(tài)可部分基于所實踐的方法的實施方案和所需特異性等在將對本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的容許極限內(nèi)來選擇。此外，關(guān)于診斷方法，優(yōu)選的受試者是脊椎動物受試者。優(yōu)選的脊椎動物是溫血的；優(yōu)選的溫血脊椎動物是哺乳動物。優(yōu)選的哺乳動物最優(yōu)選地是人。如本文所用，術(shù)語“受試者”包括人和動物受試者。因此，本文提供了獸醫(yī)治療性用途。因此，本發(fā)明技術(shù)提供了對哺乳動物的診斷，所述哺乳動物諸如人以及由于瀕危而具有重要性的那些哺乳動物，諸如西伯利亞虎；具有經(jīng)濟重要性的那些哺乳動物，諸如在養(yǎng)殖場養(yǎng)殖以供人消費的動物；和/或?qū)θ司哂猩鐣匾缘膭游?，諸如作為寵物或在動物園飼養(yǎng)的動物。此類動物的實例包括但不限于：食肉動物諸如貓和狗；豬，包括家豬、閹豬(hog)和野豬；反芻動物和/或有蹄類動物，諸如家牛、公牛、綿羊、長頸鹿、鹿、山羊、野牛和駱駝；鰭足類；和馬。因此，還提供了家畜的診斷和治療，所述家畜包括但不限于馴養(yǎng)的豬、反芻動物、有蹄類動物、馬(包括賽馬)等。目前公開的主題還包括用于診斷受試者的胃腸道癌的系統(tǒng)。所述系統(tǒng)可例如作為商業(yè)試劑盒提供，所述商業(yè)試劑盒可用來在生物樣品已經(jīng)收集自的受試者中篩選胃腸道癌的風(fēng)險或診斷胃腸道癌。根據(jù)本發(fā)明技術(shù)提供的示例性系統(tǒng)包括評估本文所述標(biāo)記的甲基化狀態(tài)。近年來，已經(jīng)顯而易見的是，可在許多癌癥患者的血液中檢測到代表轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞的循環(huán)上皮細(xì)胞。稀有細(xì)胞的分子譜在生物和臨床研究中是重要的。應(yīng)用的范圍為用于疾病預(yù)后的癌癥患者外周血中循環(huán)上皮細(xì)胞(cepc)的表征以及個性化治療(參見，例如，cristofanillim,等(2004)nengljmed351:781–791；hayesdf,等(2006)clincancerres12:4218–4224；buddgt,等(2006)clincancerres12:6403–6409；morenojg,等(2005)urology65:713–718；pantel等,(2008)natrev8:329–340；以及cohensj,等(2008)jclinoncol26:3213–3221)。在本公開的實施方案的發(fā)展過程中進行的實驗確定了以下意外的結(jié)果：血液或血漿中甲基化zdhhc1在的存在與轉(zhuǎn)移性癌癥患者中的血液中上皮細(xì)胞的存在相關(guān)。因此，本公開的實施方案提供了用于通過鑒定血漿或全血中甲基化zdhhc1的存在來檢測受試者體內(nèi)的轉(zhuǎn)移性癌癥的存在的組合物和方法。使用任何合適的方法(例如本文所述的那些方法)鑒定甲基化zdhhc1的存在。實驗實施例實施例1dna分離方法和quarts測定以下提供了諸如可根據(jù)所述技術(shù)的實施方案使用的分析之前的dna分離的示例性方法以及示例性quarts測定。在此實施例中描述了將quarts技術(shù)應(yīng)用于來自糞便和各種組織樣品的dna，但是所述技術(shù)容易地應(yīng)用于如其它實施例所示的其它核酸樣品。從糞便樣品中收集靶dna.將全部糞便收集在塑料桶中。例如以每克糞便約4ml，將防腐緩沖液例如150mmedta、500mmtris-cl和10mmnacl(ph9.0)添加至糞便中，并且可將緩沖的糞便直接使用或在–80℃下保存。從糞便樣品中分離靶核酸的示例性程序：1.例如用緩沖液將糞便樣品勻化，以形成糞便勻漿。例如通過離心或過濾處理勻漿以將殘留固體與液體分離，以產(chǎn)生“糞便上清液”。2.將糞便上清液處理以去除測定抑制劑(例如，如美國專利號8,993,341所述用聚乙烯吡咯烷酮，所述專利以引用方式整體并入本文)，產(chǎn)生“澄清上清液”。3.將十毫升澄清上清液(代表約4克糞便的當(dāng)量)與硫氰酸胍(gtc)混合至2.4m的終濃度；4.然后將混合物在90℃水浴中加熱10分鐘以使存在于糞便中的dna(和蛋白質(zhì))變性。5.將含有與目標(biāo)靶序列(“目標(biāo)特異性捕獲探針”)互補的共價附接(偶聯(lián))寡核苷酸的順磁性顆粒添加至樣品中。然后將樣品孵育(例如，在約22℃-25℃的環(huán)境溫度下)一個小時，以使靶dna與磁性顆粒上的捕獲探針雜交。6.將澄清上清液、gtc和顆粒的混合物暴露于磁場以將顆粒(現(xiàn)在含有與捕獲探針雜交的靶dna)與糞便上清液/gtc混合物分離，將所述糞便上清液/gtc混合物轉(zhuǎn)移至新管中。參見，例如美國專利申請序列號13/089,116，其以引用方式并入本文。可將變性/雜交/分離循環(huán)(步驟4-6)重復(fù)例如至少四次或更多次，以從相同糞便上清液樣品中連續(xù)提取不同的靶dna。ffpe組織dna使用qiaampdnaffpe組織試劑盒(qiagensciences,germantown,md)分離來自福爾馬林固定石蠟包埋(ffpe)組織的dna。從細(xì)胞和血漿中分離dna對于細(xì)胞系，可使用例如“rscccfdna血漿試劑盒(promegacorp.,madison,wi)從細(xì)胞條件培養(yǎng)基中分離基因組dna。按照試劑盒方案，使用1ml細(xì)胞條件培養(yǎng)基(ccm)代替血漿，并根據(jù)試劑盒程序進行處理。用于從4ml血漿樣品中分離dna的示例性程序如下：·向4ml血漿樣品中添加300μl蛋白酶k(20mg/ml)并混合?！?μl的1μg/μl魚dna添加至血漿蛋白酶k混合物中?！?ml血漿裂解緩沖液添加至血漿中。血漿裂解緩沖液為：-4.3m硫氰酸胍-10％igepalca-630(支鏈的辛基苯氧基聚(乙烯氧基)乙醇)(與45ml的4.8m硫氰酸胍合并的5.3g的igepalca-630)·在以500rpm振蕩的情況下將混合物在55℃下孵育1小時?！ぬ砑?ml血漿裂解緩沖液并混合?！ぬ砑?00μl磁性二氧化硅結(jié)合珠[16μg珠子/μl]，并再次混合?！ぬ砑?ml100％異丙醇并混合?！ぴ谝?00rpm振蕩的情況下在30℃下孵育30分鐘?！⒐苤糜诖朋w上，并使珠子收集。將上清液抽出并丟棄?！?50μlguhcl-etoh添加至含有結(jié)合珠的容器中并混合。guhcl-etoh洗滌緩沖液為：-3mguhcl-57％etoh?！ひ?00rpm振蕩1分鐘?！悠忿D(zhuǎn)移至深孔板或2ml微量離心管中?！⒐苤糜诖朋w上，并使珠子收集10分鐘。將上清液抽出并丟棄?！?000μl洗滌緩沖液(10mmtrishcl、80％etoh)添加至珠子，并在振蕩的情況下在30℃下孵育3分鐘?！⒐苤糜诖朋w上，并使珠子收集。將上清液抽出并丟棄?！?00μl洗滌緩沖液添加至珠子，并在振蕩的情況下在30℃下孵育3分鐘?！⒐苤糜诖朋w上，并使珠子收集。將上清液抽出并丟棄?！ぬ砑?50μl洗滌緩沖液，并在振蕩的情況下在30℃下孵育3分鐘?！⒐苤糜诖朋w上，并使珠子收集。將剩余緩沖液抽出并丟棄?！ぬ砑?50μl洗滌緩沖液，并在振蕩的情況下在30℃下孵育3分鐘?！⒐苤糜诖朋w上，并使珠子收集。將剩余緩沖液抽出并丟棄?！ぴ谡袷幍那闆r下在70℃下將珠子干燥15分鐘?！?25μl洗脫緩沖液(10mmtrishcl，ph8.0，0.1mmedta)添加至珠子，并在振蕩的情況下在65℃下孵育25分鐘?！⒐苤糜诖朋w上，并使珠子收集10分鐘。·將含有dna的上清液抽出并轉(zhuǎn)移至新的容器或管中。quarts測定quarts技術(shù)將基于聚合酶的靶dna擴增過程與基于侵入性切割的信號擴增過程組合。所述技術(shù)例如在美國專利8,361,720、美國專利號8,715,937；以及美國專利申請序列號；12/946,745；以及61/705,603中有所描述，每個所述專利均以引用方式并入本文。以類似于實時pcr的方式監(jiān)測由quarts反應(yīng)產(chǎn)生的熒光信號，并允許定量樣品中靶核酸的量。示例性quarts反應(yīng)通常包括約400-600nmol/l(例如，500nmol/l)的每種引物和檢測探針、約100nmol/l的侵入性寡核苷酸、約600-700nmol/l的每種fret盒(fam，例如由hologic,inc.商業(yè)提供；hex，例如由biosearchtechnologies,idt商業(yè)提供；以及quasar670，例如由biosearchtechnologies商業(yè)提供)、6.675ng/μlfen-1內(nèi)切核酸酶(例如，2.0，hologic,inc.)、30μl反應(yīng)體積中的1單位taqdna聚合酶(例如，dna聚合酶，promegacorp.,madison,wi)、10mmol/l3-(正嗎啉代)丙烷磺酸(mops)、7.5mmol/lmgcl2和250μmol/l的每種dntp。示例性quarts循環(huán)條件由以下組成：在95℃下進行初始孵育3分鐘，隨后進行10個以下循環(huán)：95℃持續(xù)20秒、67℃持續(xù)30秒，以及70℃持續(xù)30秒。在10個循環(huán)完成后，通常進行以下另外37個循環(huán)：95℃持續(xù)20秒、53℃持續(xù)1分鐘、70℃持續(xù)30秒，以及40℃持續(xù)30秒。在一些應(yīng)用中，對定量循環(huán)(cq)的分析提供了樣品中靶dna鏈的初始數(shù)目(例如拷貝數(shù))的度量。對于糞便dna測試，如上所述，通常如上所述使用捕獲探針以從澄清上清液中捕獲靶核酸片段。捕獲探針的實例如下所示，且通常包含5′-6碳氨基修飾的鍵(integrateddnatechnology,coralville,ia)：對于ndrg4：/5ammc6/tccctcgcgcgtggcttccgccttctgcgcggctggggtgcccggtgg-3′(seqidno:1)對于bmp3：/5ammc6/gcgggacactccgaaggcgcaaggag-3′(seqidno:2)對于kras：/5ammc6/ggcctgctgaaaatgactgaatataaacttgtggtagttggagc-3′(seqidno:3)以及/5ammc6/ctctattgttggatcatattcgtccacaaaatgattctgaattagc-3′(seqidno:4)用亞硫酸氫鹽使用例如ez-96dna甲基化試劑盒(zymoresearch,irvineca)或使用亞硫酸氫銨如wo2013/116375中所述處理用于甲基化測試的捕獲dna，所述專利以引用方式并入本文。通常將轉(zhuǎn)化的樣品在50微升10mmtris、0.1mmedtaph8.0中以20納克/微升trna(sigma)洗脫；將10微升亞硫酸氫鹽處理的dna用quarts方法以30微升反應(yīng)體積在96孔pcr板上測定。將pcr板在lightcycler480(roche)中循環(huán)。quarts測定可涉及單獨標(biāo)記或標(biāo)記的復(fù)用組合，并且通常另外包含用于檢測參考核酸例如β-肌動蛋白的寡核苷酸，或以下本發(fā)明的實施方案中討論的標(biāo)記。在此實施方案中，對于以下每種靶標(biāo)，引物和探針(integrateddnatechnology,coralville,ia)如下：對于ndrg4：引物5′-cggttttcgttcgttttttcg-3′，(seqidno:5)引物5′-gtaacttccgccttctacgc-3′，(seqidno:6)探針5′-cgccgagggttcgtttatcg/3′c6/(seqidno:7)對于bmp3：引物5′-gtttaattttcggtttcgtcgtc-3′(seqidno:8)引物5′-ctcccgacgtcgctacg-3′(seqidno:9)探針5′-cgccgaggcggttttttgcg/3′c6/(seqidno:10)對于亞硫酸氫鹽處理的β-肌動蛋白：引物5′-tttgtttttttgattaggtgtttaaga-3′(seqidno:52)引物5′-caccaacctcataaccttatc-3′(seqidno:59)探針5′-ccacggacgatagtgttgtgg/3′c6/(seqidno:60)例如測定板中的每次測定均包括亞硫酸氫鹽處理的dna樣品、標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品、陽性對照和陰性對照?？墒褂美缫?00至1000個鏈從工程化質(zhì)粒切割的靶鏈制成標(biāo)準(zhǔn)曲線。將亞硫酸氫鹽處理的cpgenome通用甲基化dna(millipore,billerica,ma)和人基因組dna(merck,germany)用作陽性對照和陰性對照。通過將靶基因的cp與相關(guān)測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線比較來確定dna鏈數(shù)。通過將甲基化基因的鏈數(shù)除以對照dna(例如，β-肌動蛋白或本文提供的候選對照標(biāo)記)鏈數(shù)并乘以100來確定每種標(biāo)記的甲基化百分比。kras突變使用quarts測定來評價kras基因的密碼子12/13處的7個突變。將每個突變測定設(shè)計為單重測定。kras突變特異性正向引物和探針為：對于g12s突變：引物5′-cttgtggtagttggagcaa-3′(seqidno:11)探針5′-gcgcgtccagtggcgtaggc/3′c6/(seqidno:12)；對于g12c突變引物5′-aaacttgtggtagttggacctt-3′(seqidno:13)探針5′-gcgcgtcctgtggcgtaggc/3′c6/(seqidno:14)；對于g12r突變引物5′-tataaacttgtggtagttggacctc-3′(seqidno:15)探針5′-gcgcgtcccgtggcgtaggc/3′c6/(seqidno:16)；對于g12d突變引物5′-acttgtggtagttggagctca-3′(seqidno:17)探針5′-gcgcgtccatggcgtaggca/3′c6/(seqidno:18)；對于g12v突變引物5′-acttgtggtagttggagctct-3′(seqidno:19)探針5′-gcgcgtccttggcgtaggca/3′c6/(seqidno:20)；對于g12a突變引物5′-aacttgtggtagttggagatgc-3′(seqidno:21)探針5′-gcgcgtccctggcgtaggca/3′c6/(seqidno:22)；對于g13d突變引物5′-ggtagttggagctggtca-3′(seqidno:23)探針5′-gcgcgtccacgtaggcaaga/3′c6/(seqidno:24)對于所有kras突變體，所用的反向引物為5′-ctattgttggatcatattcgtc-3′(seqidno:25)kras的quarts循環(huán)條件和試劑濃度與甲基化測定中的那些相同。每個板含有由工程化質(zhì)粒、陽性對照和陰性對照以及水空白制成的標(biāo)準(zhǔn)物，并在lightcycler480(roche))或abi7500(thermoscientific)中運行。通過將靶基因的cp或ct與此測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線比較來確定dna鏈數(shù)。基于500倍稀釋因子和1.95的擴增效率計算50微升kras中每種突變標(biāo)記的濃度。將此值除以甲基化測定中的β-肌動蛋白濃度或zdhh，然后乘以100以確定突變百分比。在以下所討論的測定中，“btact”是指甲基化測定中β-肌動蛋白的表征，并且“act”或“actb”是指突變測定中β-肌動蛋白的表征。實施例2候選對照基因的鑒定和測試如上所述，在某些實施方案中，根據(jù)甲基化狀態(tài)選擇所述技術(shù)的對照基因。在第一步中，選擇在正常和癌癥上皮組織細(xì)胞兩者中被高度甲基化的基因作為候選對照基因。作為第二步，篩選所選候選基因以鑒定以下基因，在所述基因中基因的甲基化形式在血液和血液級分中最低限度地存在。在優(yōu)選的實施方案中，可進一步分析候選基因以選擇與待分析的一種或多種標(biāo)記基因具有相似gc含量和cpg甲基化含量的基因，使得亞硫酸氫鹽反應(yīng)性和pcr擴增行為類似于待分析的標(biāo)記基因。zdhhc1、zfand3、zmym4、odz2和trio被鑒定為可能適于用作對照的甲基化基因。這些候選標(biāo)記具有以下基因座(參考grch37/hg19組裝)：zdhhc1足跡：chr16，67428559-67428628zmym4足跡：chr1，35877002-35877078zfand3足跡：chr6，37841985-37842061odz2足跡：chr5，167285650-167285775trio足跡：chr5，14461291-14461417將zdhhc1、zfand3和zmym4基因選擇用于進一步分析，并使用quarts技術(shù)來測定以比較正常樣品和癌癥樣品中基因的甲基化，并評估血液(例如血清)中標(biāo)記的存在。測定中所用的寡核苷酸如下以圖解方式所示。術(shù)語“野生型”用于指不存在亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化情況下的基因序列，所述基因序列不受甲基化狀態(tài)影響。zdhhc1-鋅指，含dhhc型的1未處理靶序列：5′-ggggccggggccgacagcccacgctggcgcggcaggcgcgtgcgcccgccgttttcgtgagcccgagcag-3′(seqidno:26)亞硫酸氫鹽處理的靶序列：5′-ggggucggggucgauaguuuacgutggcgcgguaggcgcgtgcguucgucgttttcgtgaguucgaguag-3′(seqidno:33)亞硫酸氫鹽處理的復(fù)制靶序列：5′-ggggtcggggtcgatagtttacgttggcgcggtaggcgcgtgcgttcgtcgttttcgtgagttcgagtag-3′(seqidno：27)quarts測定設(shè)計1：(seqidno：28)quarts測定設(shè)計2(v3)：quarts測定寡核苷酸(所有示出5′至3′)：zfand3-鋅指，an1型結(jié)構(gòu)域3未處理靶序列：5′-tctctgtgtactaatttccctttttggccggacgtggtggctcacgcctgtaatcccagcactttgggaggccaaag-3′(seqidno：37)亞硫酸氫鹽處理的靶序列：5′-tttttgtgtattaatttttttttttggtcggacgtggtggtttacgtttgtaattttagtattttgggaggttaaag-3′(seqidno：38)quarts測定寡核苷酸(所有示出5′至3′):_________________________________zmym4-鋅指，mym型4未處理靶序列：5′-ccatctatagaaaaatggattagggccgggcacagtggctcacgcctgtaatcccagcactttgggaggccgaggca-3′(seqidno:44)亞硫酸氫鹽處理的靶序列：5′-ttatttatagaaaaatggattagggtcgggtatagtggtttacgtttgtaattttagtattttgggaggtcgaggta-3′(seqidno:45)quarts測定寡核苷酸(所有示出5′至3′):quasar670a3fret盒：5'dq670-tct(i-bhq2)agccggttttccggctgagactccgcgtc-c63′(seqidno:51)[fp＝正向引物；rp＝反向引物；3′c6＝3′己烷；5amm6＝5′氨基；cp＝捕獲探針；670染料；bhq2＝黑洞猝滅劑2]使用上述寡核苷酸組合，使用β-肌動蛋白(btact)(用于歸一化)或使用三種候選對照基因(zdhhc1、zmym和zfand)中的一種對各種不同樣品類型(血液、血漿和兩種人結(jié)腸直腸癌細(xì)胞系ht29和ht116)進行癌癥標(biāo)記ndrg4和bmp3的甲基化分析。如實施例1所述一式兩份進行測定。表1示出重復(fù)的平均值：表1從這些數(shù)據(jù)可以看出，所有三種候選標(biāo)記均如btact一樣在癌細(xì)胞系ht29和ht116中顯示出強陽性信號。然而，zfand3和zmym4v2兩者均如btact一樣在血液樣品中顯示顯著信號，諸如可在具有存在的一定量血液的樣品(例如組織或糞便樣品)中產(chǎn)生不期望的本底。此實施例顯示，zdhhc1在血液和血漿中具有較低的本底信號，并且容易在上皮細(xì)胞系中檢測到。選擇zdhhc1以進行進一步分析。實施例3比較β-肌動蛋白和zdhhc1以歸一化癌癥標(biāo)記測定與btact平行測試zdhhc1標(biāo)記，以比較作為對照的這些dna以確定ndrg4和bmp3標(biāo)記基因的甲基化％。將從福爾馬林固定石蠟包埋的組織樣品中分離的dna表征，將測定信號歸一化為β-肌動蛋白或zdhhc1。結(jié)果示于下表3中。這些數(shù)據(jù)顯示，ndrg4和bmp3標(biāo)記相對于zdhhc1的甲基化％與相同標(biāo)記相對于β-肌動蛋白的甲基化％相當(dāng)，顯示出可使用zdhhc1代替β-肌動蛋白以進行歸一化。表3如表3所示，使用zdhhc1測定的甲基化％值與使用btact測定的甲基化％值的比較顯示，這些對照在這些組織樣品上的表現(xiàn)相當(dāng)，并且可在測量癌癥標(biāo)記基因的甲基化中使用zdhhc1代替btact。實施例4正常組織樣品和癌組織樣品中的zdhhc1和β-肌動蛋白dna此實施例描述了不同的癌組織樣品和正常組織樣品的延伸取樣中的zdhhc1和β-肌動蛋白鏈的數(shù)目的比較。測試來自正常和異常組織類型(包括膽管、結(jié)腸、食管、頭、肺、胰腺、小腸和胃)的dna。將從福爾馬林固定石蠟包埋的組織樣品中分離的dna用下表4所示的β-肌動蛋白(actb)和zdhhc1的中值測定信號來表征。表4這些數(shù)據(jù)證實，在所測試的所有組織類型、以及正常組織類型和非正常(例如，腺瘤、癌、化生)組織類型中均檢測到甲基化zdhhc1對照。結(jié)果顯示癌組織與正常組織之間的zdhhc1甲基化水平相等。實施例5zdhhc1對在復(fù)雜樣品中歸一化癌癥標(biāo)記測定的影響對使用zdhhc1作為測定中的歸一化標(biāo)記進行進一步的實驗來檢測更復(fù)雜樣品(例如糞便，血液等)以及正常組織樣品和結(jié)腸直腸癌組織樣品中的癌癥。表5a示出了ndrg4甲基化標(biāo)記和兩個對照dna的檢測到的鏈，并示出了如使用各對照dna所測定的ndrg4的甲基化％。相同測定反應(yīng)中檢測到的bmp3標(biāo)記的數(shù)據(jù)示于表5b中。表5a表5b這些數(shù)據(jù)顯示甲基化的zdhhc1對照dna存在在來自正常和結(jié)腸直腸癌陽性受試者的糞便樣品中是基本上均勻的，并證實在血液樣品中基本上不存在標(biāo)記。這些數(shù)據(jù)還證實zdhhc1存在基本上等同于不含血液(例如細(xì)胞系)的β-肌動蛋白dna樣品。實施例6患有癌癥的受試者的血漿樣品中的zdhhc1此實施例描述了轉(zhuǎn)移性癌癥患者的血漿樣品中zdhhc1的檢測。將1至2毫升的正常、晚期腺瘤(aa)和腺癌(aca)、患者血漿樣品用于quarts測定。使用qiagen循環(huán)核酸試劑盒處理來自結(jié)腸癌受試者和正常受試者的血漿樣品。血漿的起始體積的范圍為0.75-2.0ml。對dna進行亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化，并用zdhhc1和btact寡核苷酸混合物測試。結(jié)果顯示，具有肝轉(zhuǎn)移的iv期癌癥樣品中的zdhhc1鏈水平較高。除了一個之外，所有樣品均沒有zdhhc1標(biāo)記鏈。在血漿中顯示大量的zdhhc1標(biāo)記鏈的一個樣品是iv期轉(zhuǎn)移。這些數(shù)據(jù)支持使用zdhhc1作為轉(zhuǎn)移的一般標(biāo)記來檢測血液/血漿中的上皮細(xì)胞。結(jié)果匯總于表6中：表6*包括一個為由階段表征的樣品。在比較兩個aa樣品的另外研究中，8個aca樣品中的兩個被分類為具有觀察到的轉(zhuǎn)移的iv期，并且34個正常樣品，在血漿中檢測到iv期樣品中的一個，顯示zdhhc1/btact比率顯著升高(41％)，并且一個樣品似乎正常(zdhhc1/btact為4.3％)。其它樣品均未顯示升高的zdhhc1/btact比率。實施例7使用zdhhc1對歸一化不同癌癥標(biāo)記測定的影響對使用zdhhc1作為測定中的歸一化標(biāo)記進行進一步的實驗來檢測糞便樣品中的癌癥。所分析的癌癥標(biāo)記包括vav3和sfmbt2，測定設(shè)計如下所示：vav3_877c/trs345269mafc＝38％未處理靶序列：5′-gggaccggagccgagcctagcgcggcgcccgcgacccgtcagccgcggctcctgctccctcgatcccgcgcg-3′(seqidno:53)亞硫酸氫鹽處理的靶序列：5′-gggatcggagtcgagtttagcgcggcgttcgcgattcgttagtcgcggtttttgttttttcgatttcgcgcg-3′(seqidno:54)ouarts測定設(shè)計:quarts測定寡核苷酸(所有示出5′至3′):sfmbt2(897)未處理靶序列：5′-gtcgccgcccgggagggcaccggcctcgctcgcttgctcgctcgcccgcccttgcccgctcgctccccgcc-3′(seqidno:70)亞硫酸氫鹽處理的靶序列：5′-gtcgtcgttcgggagggtatcggtttcgttcgtttgttcgttcgttcgtttttgttcgttcgtttttcgtt-3′(seqidno:61)quarts測定設(shè)計：quarts測定寡核苷酸(所有示出5′至3′):對腺瘤和癌的標(biāo)記靈敏度對來自散發(fā)性結(jié)腸癌患者的糞便樣品進行標(biāo)記靈敏度測試。使用328個樣品測定靈敏度：·46個晚期腺瘤(aa)·28個腺癌(aca)·254個正常所測試標(biāo)記的組合和結(jié)果示于表7中。表7結(jié)果顯示，zdhhc1代替β-肌動蛋白增加了腺癌和晚期腺瘤檢測的靈敏度。實施例8對來自ibd患者的樣品中的癌癥和hgd的標(biāo)記靈敏度對使用zdhhc1作為測定中的歸一化標(biāo)記進行了進一步的實驗來檢測來自炎性腸病患者的糞便樣品中的癌癥和高度異型增生。如以上實施例1所述對來自ibd患者的糞便樣品的dna進行甲基化檢測。使用160個樣品測定靈敏度：5個癌癥樣品5個hgd樣品150個正常ibd和低度異型增生結(jié)果示于表8中。表8標(biāo)記靈敏度特異性歸一化為zdhhc1的vav3、ndrg4100％90％歸一化為β-肌動蛋白的vav3、bmp3、ndrg470％90％結(jié)果顯示使用歸一化為zdhhc1的vav3和ndrg4，對腺癌和高度異型增生(hgd)的靈敏度為100％，特異性為90％。相比之下，使用歸一化為β-肌動蛋白的vav3、bmp3和ndrg4標(biāo)記的組合測定的相同樣品僅顯示70％靈敏度，即使使用另外一種標(biāo)記bmp3。這些結(jié)果顯示，包括zdhhc1作為歸一化對照代替β-肌動蛋白提高了來自炎性腸病患者的樣品中癌癥和高度異型增生的檢測靈敏度。實施例9使用β-肌動蛋白與zdhhc1鏈的比率作為炎癥嚴(yán)重性的指標(biāo)此實施例描述了使用亞硫酸氫鹽處理的β-肌動蛋白鏈(btact)與亞硫酸氫鹽處理的zdhhc1鏈的比率來預(yù)測ibd患者的炎癥嚴(yán)重性。糞便樣品來自患有先前由表9所示的嚴(yán)重性在1至3的上升標(biāo)度上表征的炎癥的患者，其它樣品被表征為沒有炎癥、不活躍或未知(分別為5、7和9)。表9如上所述，使用quarts測定測量btact和zdhhc1dna。顯示比率的圖表在圖4中。對類別1、2和3中包括的樣品的數(shù)據(jù)集的檢查顯示，btact/zdhhc1比率升高與ibd受試者體內(nèi)的炎癥嚴(yán)重性增加相關(guān)。以上說明書中所提及的所有出版物和專利均出于所有目的以引用方式整體并入本文。本技術(shù)的所描述的組合物、方法和用途的各種修改和變化對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易知的，而不背離所描述的技術(shù)的范圍和精神。雖然已結(jié)合具體的示例性實施方案描述了本技術(shù)，但應(yīng)理解的是，要求保護的本發(fā)明不應(yīng)不適當(dāng)?shù)鼐窒抻谶@些具體的實施方案。事實上，對藥理學(xué)、生物化學(xué)、醫(yī)學(xué)科學(xué)或相關(guān)領(lǐng)域技術(shù)人員來說顯而易見的用于進行本發(fā)明的所述模式的各種修改旨在處于以下權(quán)利要求的范圍內(nèi)。序列表<110>精密科學(xué)公司梅奧醫(yī)療教育與研究基金會<120>用于進行甲基化檢測測定的組合物和方法<130>exct-34695/wo-1/ord<150>us62/091,053<151>2014-12-12<160>70<170>patentin3.5版<210>1<211>48<212>dna<213>人工序列<220><223>dna引物/探針<400>1tccctcgcgcgtggcttccgccttctgcgcggctggggtgcccggtgg48<210>2<211>26<212>dna<213>人工序列<220><223>dna引物/探針<400>2gcgggacactccgaaggcgcaaggag26<210>3<211>44<212>dna<213>人工序列<220><223>dna引物/探針<400>3ggcctgctgaaaatgactgaatataaacttgtggtagttggagc44<210>4<211>46<212>dna<213>人工序列<220><223>dna引物/探針<400>4ctctattgttggatcatattcgtccacaaaatgattctgaattagc46<210>5<211>21<212>dna<213>人工序列<220><223>dna引物/探針<400>5cggttttcgttcgttttttcg21<210>6<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>dna引物/探針<400>6gtaacttccgccttctacgc20<210>7<211>18<212>dna<213>人工序列<220><223>dna引物/探針<400>7cgccgagggttcgtttat18<210>8<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>dna引物/探針<400>8gtttaattttcggtttcgtcgtc23<210>9<211>17<212>dna<213>人工序列<220><223>dna引物/探針<400>9ctcccgacgtcgctacg17<210>10<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>dna引物/探針<400>10cgccgaggcggttttttgcg20<210>11<211>18<212>dna<213>人工序列<220><223>dna引物/探針<400>11cttgtggtagttggagca18<210>12<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>dna引物/探針<400>12gcgcgtccagtggcgtaggc20<210>13<211>22<212>dna<213>人工序列<220><223>dna引物/探針<400>13aaacttgtggtagttggacctt22<210>14<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>dna引物/探針<400>14gcgcgtcctgtggcgtaggc20<210>15<211>25<212>dna<213>人工序列<220><223>dna引物/探針<400>15tataaacttgtggtagttggacctc25<210>16<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>dna引物/探針<400>16gcgcgtcccgtggcgtaggc20<210>17<211>21<212>dna<213>人工序列<220><223>dna引物/探針<400>17acttgtggtagttggagctca21<210>18<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>dna引物/探針<400>18gcgcgtccatggcgtaggca20<210>19<211>21<212>dna<213>人工序列<220><223>dna引物/探針<400>19acttgtggtagttggagctct21<210>20<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>dna引物/探針<400>20gcgcgtccttggcgtaggca20<210>21<211>22<212>dna<213>人工序列<220><223>dna引物/探針<400>21aacttgtggtagttggagatgc22<210>22<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>dna引物/探針<400>22gcgcgtccctggcgtaggca20<210>23<211>18<212>dna<213>人工序列<220><223>dna引物/探針<400>23ggtagttggagctggtca18<210>24<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>dna引物/探針<400>24gcgcgtccacgtaggcaaga20<210>25<211>22<212>dna<213>人工序列<220><223>dna引物/探針<400>25ctattgttggatcatattcgtc22<210>26<211>70<212>dna<213>智人<400>26ggggccggggccgacagcccacgctggcgcggcaggcgcgtgcgcccgccgttttcgtga60gcccgagcag70<210>27<211>70<212>dna<213>智人<400>27ggggtcggggtcgatagtttacgttggcgcggtaggcgcgtgcgttcgtcgttttcgtga60gttcgagtag70<210>28<211>12<212>dna<213>智人<400>28gttggcgcggta12<210>29<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>dna引物/探針<400>29gtcggggtcgatagtttacg20<210>30<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>dna引物/探針<400>30cgaactcacgaaaacgacga20<210>31<211>12<212>dna<213>人工序列<220><223>dna引物/探針<400>31gacgaacgcacg12<210>32<211>19<212>dna<213>人工序列<220><223>dna引物/探針<400>32actcgaactcacgaaaacg19<210>33<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>dna引物/探針<400>33cgaactcacgaaaacgacga20<210>34<211>21<212>dna<213>人工序列<220><223>dna引物/探針<400>34gacgcggaggttggcgcggta21<210>35<211>21<212>dna<213>人工序列<220><223>dna引物/探針<400>35gacgcggaggacgaacgcacg21<210>36<211>28<212>dna<213>人工序列<220><223>dna引物/探針<400>36ctcgggctcacgaaaacggcgggcgcac28<210>37<211>77<212>dna<213>智人<400>37tctctgtgtactaatttccctttttggccggacgtggtggctcacgcctgtaatcccagc60actttgggaggccaaag77<210>38<211>77<212>dna<213>智人<400>38tttttgtgtattaatttttttttttggtcggacgtggtggtttacgtttgtaattttagt60attttgggaggttaaag77<210>39<211>12<212>dna<213>人工序列<220><223>dna引物/探針<400>39acgtggtggttt12<210>40<211>28<212>dna<213>人工序列<220><223>dna引物/探針<400>40tgtgtattaatttttttttttggtcgga28<210>41<211>28<212>dna<213>人工序列<220><223>dna引物/探針<400>41cctcccaaaatactaaaattacaaacgt28<210>42<211>21<212>dna<213>人工序列<220><223>dna引物/探針<400>42gacgcggagacgtggtggttt21<210>43<211>35<212>dna<213>人工序列<220><223>dna引物/探針<400>43gtgctgggattacaggcgtgagccaccacgtccgg35<210>44<211>77<212>dna<213>智人<400>44ccatctatagaaaaatggattagggccgggcacagtggctcacgcctgtaatcccagcac60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