本發(fā)明涉及病毒載體、細(xì)胞及構(gòu)建體。

背景技術(shù)：

由于在采取以及投藥時(shí)的侵襲性低，血液細(xì)胞作為再生醫(yī)療等的治療用細(xì)胞，最常被臨床應(yīng)用。尤其是造血干細(xì)胞以及造血前體細(xì)胞在過(guò)去大約30年中，被用于以造血器官為中心的惡性腫瘤的治療方法中，現(xiàn)在也作為最為常用的治療方法而使用。除此之外，淋巴球、nk細(xì)胞、nkt細(xì)胞以及樹(shù)狀細(xì)胞等血液細(xì)胞，作為對(duì)于惡性腫瘤細(xì)胞的免疫細(xì)胞療法，臨床試驗(yàn)正在進(jìn)行。

進(jìn)一步，近年來(lái)，關(guān)于使用了改變遺傳基因的血液細(xì)胞的遺傳基因治療，對(duì)于重癥先天性疾病或惡性腫瘤在進(jìn)行臨床試驗(yàn)。尤其是導(dǎo)入t細(xì)胞受體或?qū)肭逗峡乖荏w遺傳基因的遺傳基因改變t細(xì)胞療法，作為能夠預(yù)期對(duì)惡性腫瘤具有顯著的治療效果的新治療法而受到矚目。

現(xiàn)在，對(duì)t細(xì)胞的遺傳基因?qū)胧褂寐《据d體或轉(zhuǎn)錄病毒載體。但是，在慢病毒載體以及轉(zhuǎn)錄病毒載體的情況下，由對(duì)dna基因的插入引起的基因毒性是個(gè)問(wèn)題。

對(duì)此，作為對(duì)dna基因的插入的可能性較低的遺傳基因?qū)敕?，已知有使用腺病毒載體的方法，進(jìn)而使用mrna以及質(zhì)粒等非病毒載體的方法。但是，腺病毒載體以及非病毒載體，導(dǎo)入效率極低，能夠使用的細(xì)胞種類有限。

作為對(duì)dna基因的插入的可能性低的遺傳基因?qū)敕?，還已知有仙臺(tái)病毒載體。例如，專利文獻(xiàn)1中公開(kāi)了，使f遺傳基因缺損，以使得不會(huì)放出2次性感染性病毒粒子的改變了的仙臺(tái)病毒載體。另外，在專利文獻(xiàn)2中公開(kāi)了，搭載有與細(xì)胞的重新編碼相關(guān)的遺傳基因的仙臺(tái)病毒載體。

與仙臺(tái)病毒同屬于副粘病毒科(paramyxoviridae)的麻疹病毒，是對(duì)免疫細(xì)胞以及上皮細(xì)胞保持極高感染力的病毒。在專利文獻(xiàn)3中公開(kāi)了一種麻疹病毒，其保持被分段為多段的基因組，至少1段分段基因組含有在宿主內(nèi)可表達(dá)的外來(lái)遺傳基因。

現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)

專利文獻(xiàn)

專利文獻(xiàn)1:日本專利第3602058號(hào)公報(bào)

專利文獻(xiàn)2:國(guó)際公開(kāi)第2010/008054號(hào)

專利文獻(xiàn)3:國(guó)際公開(kāi)第2007/007921號(hào)

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

發(fā)明所要解決的問(wèn)題

在t細(xì)胞導(dǎo)入遺傳基因的情況下，上述專利文獻(xiàn)1以及專利文獻(xiàn)2所公開(kāi)的仙臺(tái)病毒載體，不僅仙臺(tái)病毒載體的制備比較困難，且存在仙臺(tái)病毒易于殘留、難以去除的不良情況。另外，對(duì)于非仙臺(tái)病毒本身的宿主的人而言，仙臺(tái)病毒載體產(chǎn)生怎樣的影響這一方面的見(jiàn)解少，在安全性方面對(duì)于實(shí)際的臨床應(yīng)用還不得不猶豫不決。

另外，與腺病毒載體同樣的，上述專利文獻(xiàn)1以及專利文獻(xiàn)2所公開(kāi)的仙臺(tái)病毒載體以及上述專利文獻(xiàn)3所公開(kāi)的麻疹病毒，為了提高遺傳基因的導(dǎo)入效率，有必要在遺傳基因?qū)胫按碳細(xì)胞以使其活化。因此，存在由于t細(xì)胞的活化誘導(dǎo)出t細(xì)胞的分化的懸疑，對(duì)初始t細(xì)胞以及未分化b細(xì)胞等的遺傳基因?qū)胧抢щy的。

如上所述的現(xiàn)有的病毒載體，在對(duì)人使用時(shí)不能充分保證安全性，能夠有效地導(dǎo)入遺傳基因的細(xì)胞是有限的。

本發(fā)明是鑒于上述情況而完成的，其目的在于提供安全性高、且對(duì)于廣范圍內(nèi)的細(xì)胞能夠有效地導(dǎo)入遺傳基因的病毒載體、細(xì)胞以及構(gòu)建體。

解決問(wèn)題的手段

根據(jù)本發(fā)明第1方面的病毒載體，具有來(lái)自屬于副粘病毒科的病毒的基因組，所述基因組中對(duì)h蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼的遺傳基因以及對(duì)f蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼的遺傳基因的兩者均被改變，所述基因組包含外來(lái)遺傳基因。

該情況下，可選地，所述基因組被分段為多個(gè)，各分段基因組具有前導(dǎo)序列和尾隨序列。

另外，可選地，所述基因組被分段為2段。

另外，可選地，所述改變?yōu)椋?/p>

對(duì)所述h蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼的遺傳基因的缺損、或所述h蛋白質(zhì)的1個(gè)或多個(gè)氨基酸被置換、缺失或被附加的變異，以及

對(duì)所述f蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼的遺傳基因的缺損、或所述f蛋白質(zhì)的1個(gè)或多個(gè)氨基酸被置換、缺失或被附加的變異。

另外，可選地，在所述基因組中對(duì)m蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼的遺傳基因具有，所述m蛋白質(zhì)的1個(gè)或多個(gè)氨基酸被置換、缺失、或被附加的變異。

另外，可選地，屬于所述副粘病毒科的病毒是麻疹病毒。

另外，可選地，所述外來(lái)遺傳基因包含oct3/4、sox2以及klf4。

根據(jù)本發(fā)明第2方面的細(xì)胞，是通過(guò)上述根據(jù)本發(fā)明第1方面的病毒載體導(dǎo)入所述外來(lái)遺傳基因的細(xì)胞。

在此情況下，可選地，上述根據(jù)本發(fā)明第2方面的細(xì)胞，是含有造血干細(xì)胞的血液細(xì)胞。

需要說(shuō)明的是，可選地，所述血液細(xì)胞為初始t細(xì)胞、干細(xì)胞樣記憶t細(xì)胞或未分化b細(xì)胞。

另外，可選地，所述外來(lái)遺傳基因?yàn)榘琽ct3/4、sox2以及klf4的基底狀態(tài)的多能性干細(xì)胞。

根據(jù)本發(fā)明第3方面的構(gòu)建體，包含核酸，所述核酸成為來(lái)自于所述副粘病毒科的病毒的、在3’末端配置前導(dǎo)序列、5’末端配置尾隨序列的分段為多段的基因組的模型，所述分段基因組中，對(duì)h蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼的遺傳基因以及對(duì)f蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼的遺傳基因這兩者都被改變。

發(fā)明效果

根據(jù)本發(fā)明，能夠以高安全性且對(duì)于廣范圍的細(xì)胞有效地進(jìn)行遺傳基因的導(dǎo)入。

附圖說(shuō)明

圖1是顯示搭載有6遺傳基因的非傳播型麻疹病毒載體的分段基因組的結(jié)構(gòu)的圖。

圖2是顯示圖1所示麻疹病毒載體質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)的圖。

圖3是顯示導(dǎo)入有麻疹病毒載體的bj細(xì)胞以及活化t細(xì)胞的熒光圖像的圖。

圖4是顯示搭載有麻疹病毒載體的遺傳基因的發(fā)現(xiàn)解析的結(jié)果的圖。

圖5是顯示麻疹病毒載體以及仙臺(tái)病毒載體對(duì)各血球系細(xì)胞的導(dǎo)入效率的圖。

圖6是顯示麻疹病毒載體以及仙臺(tái)病毒載體對(duì)來(lái)源于臍帶血t細(xì)胞的導(dǎo)入效率的圖。

圖7是顯示麻疹病毒載體以及仙臺(tái)病毒載體對(duì)于來(lái)源于末梢血t細(xì)胞的各分化的導(dǎo)入效率的圖。

圖8是顯示由bj細(xì)胞建立的多能性干細(xì)胞(ips細(xì)胞)的群體的相位差圖以及熒光圖像的圖。

圖9是顯示由t細(xì)胞建立的ips細(xì)胞的初代群體的相位差圖以及熒光圖像的圖。

圖10是顯示來(lái)源于bj細(xì)胞的ips細(xì)胞的未分化標(biāo)記的表達(dá)的圖。

圖11是通過(guò)rt-pcr法對(duì)未分化標(biāo)記以及來(lái)源于病毒的遺傳基因的表達(dá)的解析結(jié)果的圖。

圖12是顯示體外中三胚層類分化誘導(dǎo)的解析結(jié)果的圖。

圖13是顯示畸胎瘤形成試驗(yàn)中三胚層類分化能的解析結(jié)果的圖。

圖14是顯示來(lái)源于bj細(xì)胞的ips細(xì)胞的核型解析結(jié)果的圖。

圖15是顯示基底狀態(tài)的ips細(xì)胞的形態(tài)的圖。

具體實(shí)施方式

對(duì)于根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方式進(jìn)行說(shuō)明。

(實(shí)施方式1)

首先，對(duì)于實(shí)施方式1進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。根據(jù)本實(shí)施方式的病毒載體，包含來(lái)源于屬于副粘病毒科的病毒的基因組。

屬于副粘病毒科的病毒(以下僅稱作「病毒」)，是具有(－)鏈rna基因組的rna病毒。作為病毒，可以例舉麻疹病毒(measlesvirus)、仙臺(tái)病毒(sendaivirus)、新城疫病毒(newcastlediseasevirus)、腮腺炎病毒(mumpsvirus)、1型副流感病毒(parainfluenzavirus1)、2型副流感病毒(parainfluenzavirus2)、3型副流感病毒(parainfluenzavirus3)、5型副流感病毒(parainfluenzavirus5、simianvirus5)、偏肺病毒(metapneumovirus)、rs病毒(respiratorysyncytialvirus)、牛疫病毒(rinderpestvirus)、以及犬瘟熱病毒(distempervirus)。上述屬于副粘病毒科的病毒，優(yōu)選為麻疹病毒。

屬于副粘病毒科的病毒的基因組，在未分段的單鏈rna中，在3’末端具有前導(dǎo)序列(le),在5’末端具有尾隨序列(tr)。在前導(dǎo)序列與尾隨序列之間配置有對(duì)構(gòu)成病毒的功能性蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼的各種遺傳基因。前導(dǎo)序列具有啟動(dòng)子活性。尾隨序列，在反基因組的情況下，具有啟動(dòng)子活性。

對(duì)功能性蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼的主要的遺傳基因，有對(duì)n蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼的遺傳基因(n遺傳基因)、對(duì)p蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼的遺傳基因(p遺傳基因)、對(duì)m蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼的遺傳基因(m遺傳基因)、對(duì)f蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼的遺傳基因(f遺傳基因)、對(duì)h蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼的遺傳基因(h遺傳基因)以及對(duì)l蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼的遺傳基因(l遺傳基因)?；蚪M中的6個(gè)遺傳基因的各自的兩末端存在稱作轉(zhuǎn)錄開(kāi)始序列以及轉(zhuǎn)錄結(jié)束序列的轉(zhuǎn)錄的控制序列。

n蛋白質(zhì)，對(duì)于病毒的基因組從5’末端開(kāi)始依次有秩序地排列結(jié)合，包裝基因組rna。p蛋白質(zhì)，作為rna依賴性rna聚合酶的小亞單位而發(fā)揮功能，與病毒的基因組的轉(zhuǎn)錄復(fù)制有關(guān)。需要說(shuō)明的是，從p遺傳基因，通過(guò)rna編集(rnaediting)機(jī)構(gòu)等可以合成v蛋白質(zhì)以及c蛋白質(zhì)等的輔助蛋白質(zhì)。l蛋白質(zhì)，作為rna依賴性rna聚合酶的大亞單位而發(fā)揮功能，與p蛋白質(zhì)一起與病毒的基因組的轉(zhuǎn)錄復(fù)制有關(guān)。

m蛋白質(zhì)，是從內(nèi)側(cè)支撐病毒粒子的結(jié)構(gòu)的基質(zhì)蛋白質(zhì)。f蛋白質(zhì)，與細(xì)胞融合相關(guān)，對(duì)病毒具有病原性。h蛋白質(zhì)是病毒受體結(jié)合蛋白質(zhì)。h蛋白質(zhì)，結(jié)合在作為野生型病毒用于感染的受體的slam(signalinglymphocyteactivationmodule,淋巴細(xì)胞活化信號(hào)分子)或結(jié)合素4(nectin4)。slam以及結(jié)合素4，由于僅在有限的細(xì)胞種類上表達(dá)，限制了病毒的宿主域。

所述來(lái)源于屬于副粘病毒科的病毒的基因組，意味著具有對(duì)上述功能性蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼的遺傳基因，在感染細(xì)胞中可以被增殖的基因組。

在根據(jù)本實(shí)施方式的病毒載體中所包含的上述基因組中，h遺傳基因以及f蛋白質(zhì)這兩者被改變。h遺傳基因的改變，例如是h遺傳基因的缺損。通過(guò)使h遺傳基因發(fā)生缺損，可以使得h蛋白質(zhì)的表達(dá)消失。另外，h遺傳基因的改變，還可以是h蛋白質(zhì)的1個(gè)或多個(gè)氨基酸發(fā)生置換、缺失、或被附加的變異。

更具體而言，h遺傳基因的改變，例如為h蛋白質(zhì)的第390號(hào)的天冬酰胺置換為異亮氨酸(n390i)、第416號(hào)的天冬酰胺置換為天冬酰胺酸(n416d)、第446號(hào)的蘇氨酸置換為絲氨酸(t446s)、第481號(hào)的天冬酰胺置換為酪氨酸(n481y)以及第492號(hào)的谷氨酸置換為谷氨酰胺(e492g)。通過(guò)這些置換，h蛋白質(zhì)，除了slam以及nectin4之外，可以結(jié)合于幾乎在所有的細(xì)胞中能夠確認(rèn)其表達(dá)的膜輔助蛋白(membraneco-factorprotein，cd46)。

通過(guò)改變h遺傳基因，對(duì)于野生型的h蛋白質(zhì)，能夠改變h蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)或功能。如上所述，h蛋白質(zhì)是病毒受體結(jié)合蛋白質(zhì)，因此，該病毒載體，通過(guò)h遺傳基因的改變，可以將slam以及nectin4以外的分子作為受體進(jìn)行利用。也就是說(shuō)，通過(guò)改變h遺傳基因，能夠增加可以感染病毒載體的細(xì)胞種類。

f遺傳基因的改變，例如為f遺傳基因的缺損。通過(guò)使f遺傳基因缺損，能夠使得f蛋白質(zhì)的表達(dá)消失。例如，在使用麻疹病毒的基因組的情況下，使得f蛋白質(zhì)缺損的病毒載體，除了特殊的細(xì)胞株(vero/slam/f細(xì)胞)之外，在其他細(xì)胞內(nèi)不產(chǎn)生具有病原性的病毒。因此，只要不被上述特殊的細(xì)胞株感染，能夠使得該病毒載體的傳播性消失。

f遺傳基因的改變，也可以是f蛋白質(zhì)的1個(gè)或多個(gè)氨基酸被置換、缺失或被附加的變異。通過(guò)該變異，對(duì)于野生型的f蛋白質(zhì)，可以改變f蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)或功能。

另外，上述基因組中對(duì)m蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼的遺傳基因，可以具有m蛋白質(zhì)的1個(gè)或多個(gè)氨基酸被置換、缺失或被附加的變異。作為變異的例，可以例舉m蛋白質(zhì)的第64號(hào)的脯氨酸被置換為絲氨酸(p64s)以及第89號(hào)的谷氨酸被置換為谷氨酰胺(e89g)。m蛋白質(zhì)是從內(nèi)側(cè)支撐病毒粒子結(jié)構(gòu)的基質(zhì)蛋白質(zhì)，因此，通過(guò)在m蛋白質(zhì)中導(dǎo)入變異，能夠增加病毒粒子形成能，進(jìn)而降低細(xì)胞融合能。

根據(jù)本實(shí)施方式的病毒載體中所含的上述基因組，具有外來(lái)遺傳基因。因此，該病毒載體，能夠使得外來(lái)遺傳基因進(jìn)行表達(dá)。外來(lái)遺傳基因，不限于此，可以例舉對(duì)引起病毒、細(xì)菌以及寄生蟲(chóng)等的病原性的各種蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼的遺傳基因、對(duì)各種細(xì)胞因子進(jìn)行編碼的遺傳基因、對(duì)各種肽類激素進(jìn)行編碼的遺傳基因、以及對(duì)細(xì)胞的重新編碼因子進(jìn)行編碼的遺傳基因等。另外，作為外來(lái)遺傳基因，可以插入對(duì)gfp(greenfluorescentprotein，綠色熒光蛋白)或egfp(enhancedgreenfluorescentprotein，增強(qiáng)型綠色熒光蛋白)進(jìn)行編碼的遺傳基因等報(bào)告基因。

外來(lái)遺傳基因的個(gè)數(shù)沒(méi)有特殊限定，優(yōu)選為2-6個(gè)。作為具體的示例性的外來(lái)遺傳基因，可以舉出重新編碼因子的oct3/4、sox2以及klf4等。當(dāng)然，其他的重新編碼因子l－myc以及pin1等作為外來(lái)遺傳基因，也可以在基因組中進(jìn)一步插入。

對(duì)上述功能性蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼的遺傳基因以及外來(lái)遺傳基因，在基因組中的配置，只要是在前導(dǎo)序列與尾隨序列之間即可，沒(méi)有特殊限制。在基因組中對(duì)上述功能性蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼的遺傳基因的相互位置關(guān)系，與野生型的病毒的基因組中的排列順序等的位置無(wú)關(guān)，可以任意確定。

根據(jù)本實(shí)施方式的病毒載體中所含的上述基因組，可以被分段為多段。所謂分段是指，基因組rna被斷片化為多個(gè)rna。也就是說(shuō)，被分段為多個(gè)的分段基因組，是作為1個(gè)基因組發(fā)揮功能的一組rna群。分段基因組的個(gè)數(shù)，沒(méi)有特殊限定，優(yōu)選為最多6個(gè)，尤其優(yōu)選為2個(gè)。

在此情況下，各個(gè)分段基因組具有前導(dǎo)序列和尾隨序列。優(yōu)選地，分段基因組的各個(gè)的一端配置有前導(dǎo)序列，另一端配置有尾隨序列。在此情況下，被分段的各基因組的前導(dǎo)序列與尾隨序列之間，配置有對(duì)上述功能性蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼的遺傳基因的任一個(gè)、以及外來(lái)遺傳基因。

對(duì)功能性蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼的遺傳基因以及外來(lái)遺傳基因，可以插入被分段為多個(gè)的基因組的1個(gè)之中，也可以插入至2個(gè)以上。在使多個(gè)外來(lái)遺傳基因表達(dá)的情況下，即可以在被分段為多個(gè)的基因組的1個(gè)中插入全部的多個(gè)外來(lái)遺傳基因，也可以在被分段為多個(gè)的基因組的2個(gè)以上中，分別插入1個(gè)以上的外來(lái)遺傳基因，作為整體而插入多個(gè)外來(lái)遺傳基因。在被分段為多個(gè)的基因組的1個(gè)之中插入多個(gè)外來(lái)遺傳基因的情況下，其個(gè)數(shù)，只要在對(duì)上述功能性蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼的遺傳基因的表達(dá)效率不顯著降低的范圍內(nèi)，沒(méi)有特殊限制。

在被分段為多個(gè)的基因組中外來(lái)遺傳基因的配置沒(méi)有特殊的限制。例如，將麻疹病毒的基因組分段為2個(gè)，使f遺傳基因缺損，將重新編碼因子作為外來(lái)遺傳基因而插入的情況下，在第1分段基因組中，從3’末端向著5’末端，依次配置前導(dǎo)序列、oct3/4、n遺傳基因、p遺傳基因、被改變的m遺傳基因、sox2、尾隨序列，在第2分段基因組中，從3’末端向著5’末端，依次配置前導(dǎo)序列、klf4、被改變的h遺傳基因、l遺傳基因、尾隨序列。作為外來(lái)遺傳基因而插入l-myc以及pin1的情況下，優(yōu)選地，在sox2與尾隨序列之間插入l－myc，在h遺傳基因與l遺傳基因之間插入pin1。

除了h遺傳基因、f遺傳基因以及m遺傳基因之外對(duì)上述功能性蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼的遺傳基因，與野生型病毒的基因組中所含的各遺傳基因的堿基序列可以不完全相同，只要在轉(zhuǎn)錄以及復(fù)制時(shí)的活性與野生型的活性同等或其之上即可，可以是導(dǎo)入有變異的遺傳基因。對(duì)功能性蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼的遺傳基因，在轉(zhuǎn)錄以及復(fù)制時(shí)的活性只要是與天然型的各蛋白質(zhì)同等或其之上，可以有1個(gè)或數(shù)個(gè)，例如1-15個(gè)，優(yōu)選為1-8個(gè)，更優(yōu)選為1-5個(gè)氨基酸的缺失、置換、或被附加的由氨基酸形成的對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼的堿基序列。該變異性的蛋白質(zhì)與天然型蛋白質(zhì)的氨基酸序列的相同性，例如優(yōu)選為90-100％，但只要保持在轉(zhuǎn)錄及復(fù)制時(shí)的活性，氨基酸的相同性例如可以為40-90％。

圖1示出了作為外來(lái)遺傳基因而具有對(duì)上述重新編碼因子進(jìn)行編碼的遺傳基因以及對(duì)egfp進(jìn)行編碼的遺傳基因的分段基因組的優(yōu)選示例。在2個(gè)該分段基因組中，在h蛋白質(zhì)實(shí)施n390i、n416d、t446s、n481y以及e492g的變異來(lái)改變h遺傳基因(h8)，進(jìn)一步，使f遺傳基因缺損。另外，對(duì)m蛋白質(zhì)實(shí)施p64s以及e89g的變異來(lái)改變m遺傳基因(m6489)。需要說(shuō)明的是，p遺傳基因作為p/v/c而示出。

該病毒載體，具有細(xì)胞感染能以及傳播力。所謂細(xì)胞感染能是指，通過(guò)保持對(duì)成為宿主的細(xì)胞的結(jié)合能以及膜融合能，從而能夠在細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入病毒內(nèi)部的基因組等的能力。另外，所謂傳播力是指，將導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)的基因組進(jìn)行復(fù)制，形成感染性粒子或根據(jù)其的復(fù)合體，從而將該基因組傳播給別的細(xì)胞的能力。

根據(jù)本實(shí)施方式的病毒載體，可以通過(guò)公知的病毒載體的制備方法來(lái)制備。例如，該病毒載體可以通過(guò)如下方法來(lái)制備，即使用與病毒的基因組相對(duì)應(yīng)的cdna,或使用病毒的基因組，進(jìn)行病毒粒子的重建再造。此處，所謂病毒粒子的重建是指，人工制備病毒的基因組，在試管內(nèi)或細(xì)胞內(nèi)，制備原病毒或重組病毒。

在任一方法中，通常，從病毒分離出基因組，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)等來(lái)制備基因組的cdna。接著，在對(duì)基因組進(jìn)行分段的情況下，通過(guò)公知的轉(zhuǎn)基因技術(shù)以及核酸増幅法等，將該cdna斷片化成多個(gè)cdna，繼而進(jìn)行外來(lái)遺傳基因的插入等操作。斷片化的方法，只要能夠基于從基因組制備的cdna堿基序列等結(jié)果能夠調(diào)制出多個(gè)cdna斷片的方法即可，沒(méi)有特殊的限制。

作為基于從基因組制備的cdna堿基序列的調(diào)制方法，可例舉，將從基因組制備的cdna中的預(yù)定區(qū)域作為模型通過(guò)pcr法等獲得增幅斷片的方法。預(yù)定的區(qū)域，可以考慮要表達(dá)的基因組的結(jié)構(gòu)進(jìn)行適當(dāng)設(shè)定，沒(méi)有特殊限制。預(yù)定的區(qū)域，優(yōu)選設(shè)定為可以將對(duì)病毒的功能性蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼的各遺傳基因斷片分別進(jìn)行增殖。在設(shè)定這樣的區(qū)域的情況下，可以通過(guò)將所得的各遺傳基因的增殖斷片，以預(yù)定的種類、個(gè)數(shù)、排列順序(位置)進(jìn)行結(jié)合，來(lái)調(diào)制cdna斷片。

在分段基因組插入外來(lái)遺傳基因時(shí)，可以將通過(guò)另行調(diào)制的包含外來(lái)遺傳基因的dna斷片,使用公知的轉(zhuǎn)基因技術(shù)插入上述分段化的cdna中。圖1中所示的與包含n遺傳基因的第1分段基因組對(duì)應(yīng)的cdna的堿基序列以及與包含h遺傳基因的第2分段基因組對(duì)應(yīng)的cdna的堿基序列，分別示作序列號(hào)1與序列號(hào)2。

病毒粒子的重建，可以使用包含所調(diào)制的cdna斷片的dna，優(yōu)選為質(zhì)粒dna，或?qū)dna預(yù)先在體外中轉(zhuǎn)錄的rna。

通常，即使將屬于副粘病毒科的病毒的基因組或其反基因組以裸rna直接導(dǎo)入至宿主細(xì)胞內(nèi)，也不會(huì)成為rna依賴性rna聚合酶的模型。為了成為模型，在由該rna依賴性rna聚合酶引起的rna合成反應(yīng)的初期階段，必須存在n蛋白質(zhì)、p蛋白質(zhì)以及l(fā)蛋白質(zhì)，形成這些蛋白質(zhì)與基因組rna的復(fù)合體(rnp復(fù)合體)。因此，在重建病毒載體時(shí)，希望使得n蛋白質(zhì)、p蛋白質(zhì)以及l(fā)蛋白質(zhì)同時(shí)表達(dá)，或者使用能夠使n蛋白質(zhì)、p蛋白質(zhì)以及l(fā)蛋白質(zhì)表達(dá)的宿主。除此之外，在使上述病毒載體中所含的rna的f遺傳基因缺損的情況下，優(yōu)選使用f蛋白質(zhì)也可以表達(dá)的宿主。

上述病毒載體，例如在病毒的n蛋白質(zhì)、p蛋白質(zhì)以及l(fā)蛋白質(zhì)表達(dá)的宿主內(nèi)，可以通過(guò)導(dǎo)入上述基因組或其crna來(lái)制備。另外，在病毒的n蛋白質(zhì)、p蛋白質(zhì)以及l(fā)蛋白質(zhì)表達(dá)的宿主內(nèi)，還可以導(dǎo)入含有成為上述基因組或其crna的模型的cdna的dna，和該dna的轉(zhuǎn)錄單元。另外，還可以在宿主內(nèi)導(dǎo)入含有成為上述基因組或其crna的模型的cdna的dna、含有病毒的n遺傳基因的dna、含有病毒的p遺傳基因的dna、含有病毒的l遺傳基因的dna、以及這些dna的轉(zhuǎn)錄單元。

作為上述宿主表達(dá)的n蛋白質(zhì)、p蛋白質(zhì)以及l(fā)蛋白質(zhì)，只要具有與這些的天然型蛋白質(zhì)的活性同等或以上，可以使用非完全相同的蛋白質(zhì)，例如，可以使用有1個(gè)或數(shù)個(gè)，例如1-15個(gè)，優(yōu)選為1-8個(gè)，更優(yōu)選為1-5個(gè)氨基酸缺失、被置換或被附加的氨基酸所形成的蛋白質(zhì)，或來(lái)源于其他病毒或氨基酸序列很大不同的完全另外的蛋白質(zhì)。

上述宿主，只要是上述功能性蛋白質(zhì)以及外來(lái)遺傳基因能夠表達(dá)的細(xì)胞即可，沒(méi)有特殊限制。例如，可以例舉培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物或鳥(niǎo)類的細(xì)胞、雞蛋等。具體而言，作為培養(yǎng)細(xì)胞，例如可以使用bhk－t7/9細(xì)胞、cho、293細(xì)胞、b95a、猴子細(xì)胞cos－7、vero、小鼠l細(xì)胞、大鼠gh3、人fl細(xì)胞、llcmk2、mdck、mdbk、cv－1、hela、hepg2、p19、f9、pciz、baf3、jurkat、人pbmcn、mt－4、molt－4、nih3t3、l929、vero/hslam、cho/hslam、a549/hslam、hela/hslam、293t、bhk以及雞胚纖維芽細(xì)胞等。另外，還可以使用sf9細(xì)胞、sf21細(xì)胞等昆蟲(chóng)細(xì)胞。

作為上述轉(zhuǎn)錄單元，例如，優(yōu)選為預(yù)定的dna依賴性rna聚合酶表達(dá)的重組痘苗病毒、包含預(yù)定的dna依賴性rna聚合酶遺傳基因的dna等。

另外，由上述制造方法得到的病毒載體，可以通過(guò)與其他細(xì)胞共同培養(yǎng)等使其選擇性且有效地增殖。例如，在使用麻疹病毒的病毒載體的情況下，將含有通過(guò)上述制造方法所得的重建的病毒載體的培養(yǎng)細(xì)胞，播種在預(yù)先培養(yǎng)的vero/slam/f細(xì)胞上,通過(guò)共同培養(yǎng)，可以得到病毒載體感染以及増殖的vero/slam/f細(xì)胞的巨細(xì)胞。

更具體而言，例如，在制備麻疹病毒載體的情況下，將與圖1所示分段基因組對(duì)應(yīng)的2個(gè)質(zhì)粒，根據(jù)需要與包含對(duì)功能性蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼的遺傳基因的其他質(zhì)粒同時(shí)，導(dǎo)入適當(dāng)?shù)募?xì)胞。此后，回收細(xì)胞，播種至vero/slam/f細(xì)胞上,采取所出現(xiàn)的巨細(xì)胞，則能夠獲得麻疹病毒載體。使麻疹病毒載體感染新的vero/slam/f細(xì)胞，在增殖后可以釋放麻疹病毒載體。該情況下，通過(guò)離心分離可以將包含病毒的上清作為病毒液進(jìn)行回收。

如以上詳細(xì)說(shuō)明的，根據(jù)本實(shí)施方式的病毒載體，由于h遺傳基因被改變，可以感染多種細(xì)胞種類，即能夠擴(kuò)大宿主域。另外，該病毒載體由于f遺傳基因被改變，能夠防止產(chǎn)生具有細(xì)胞感染能的病毒，使其傳播性消失，從而能夠提高安全性。另外，上述病毒載體，復(fù)制過(guò)程的全程在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)進(jìn)行，不伴隨dna合成，因此沒(méi)有基因毒性的懸念，安全性極高。

需要說(shuō)明的是，根據(jù)本實(shí)施方式的病毒載體所含有的基因組，可以被分段為多個(gè)。由此，可以搭載多個(gè)外來(lái)遺傳基因或尺寸大的遺傳基因。另外，各個(gè)分段基因組可以具有前導(dǎo)序列和尾隨序列。在屬于副粘病毒科的病毒中，已知有越是下游(5’側(cè))的遺傳基因其表達(dá)越降低的特殊性遺傳基因的表達(dá)模式，通過(guò)使分段基因組的各自具有前導(dǎo)序列和尾隨序列，使得聚合酶能夠?qū)Ω鱾€(gè)分段基因組發(fā)生作用，從而能夠提高各遺傳基因的表達(dá)量。另外，在宿主中能夠同時(shí)使得多個(gè)外來(lái)遺傳基因同時(shí)表達(dá)。進(jìn)一步，通過(guò)將基因組分段為2個(gè)，為了較高地維持蛋白質(zhì)的表達(dá)效率，使基因組成為適當(dāng)尺寸。當(dāng)然，即使未分段的1個(gè)基因組也能夠發(fā)揮相同的功能。

需要說(shuō)明的是，在本實(shí)施方式中，對(duì)分段基因組上的m蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼的遺傳基因可以具有，m蛋白質(zhì)的1個(gè)或多個(gè)氨基酸被置換、缺失、或被附加的變異。由此，可以進(jìn)一步提高對(duì)于該病毒載體的細(xì)胞的遺傳基因?qū)胄室约鞍踩浴?/p>

另外，本實(shí)施方式中，病毒可以是麻疹病毒。麻疹病毒，由于對(duì)免疫細(xì)胞具有強(qiáng)的指向性，通過(guò)上述病毒載體，對(duì)于b細(xì)胞、t細(xì)胞以及顆粒球可以高效地導(dǎo)入遺傳基因。進(jìn)一步，上述病毒載體，如下述實(shí)施例所示，對(duì)于未活化的初始t細(xì)胞、中央記憶性t細(xì)胞、效應(yīng)記憶性t細(xì)胞以及b細(xì)胞進(jìn)一步含有造血干細(xì)胞的血液細(xì)胞，也可以極高效率導(dǎo)入遺傳基因。另外，麻疹病毒，本身即是以人為宿主，對(duì)人的影響方面的見(jiàn)解有所積累，在考慮安全方面的同時(shí)能夠適當(dāng)?shù)厥褂谩?/p>

需要說(shuō)明的是，在本實(shí)施方式中，作為外來(lái)遺傳基因的例子，例舉了oct3/4、sox2以及klf4。作為根據(jù)本實(shí)施方式的病毒載體的基因組使用麻疹病毒的基因組的情況下，通過(guò)搭載有對(duì)重新編碼因子進(jìn)行編碼的遺傳基因的該病毒載體，能夠制備現(xiàn)有的方法非常難以制備的基底狀態(tài)的ips細(xì)胞。

需要說(shuō)明的是，根據(jù)本實(shí)施方式的病毒載體所含有的rna，除了與病毒本身具有的基因組相同的(－)鏈rna之外，根據(jù)需要，也可以是(+)鏈rna。

根據(jù)其他實(shí)施方式，提供了適于制備上述病毒載體中所含有的基因組的構(gòu)建體。該構(gòu)建體，含有核酸，所述核酸成為來(lái)源于屬于副粘病毒科的病毒的、3’末端配置有前導(dǎo)序列、5’末端配置有尾隨序列的多個(gè)分段基因組的模型，該分段基因組中對(duì)h蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼的遺傳基因以及對(duì)f蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼的遺傳基因這兩者被改變。

上述核酸，可以為基于上述分段基因組而制備的cdna或crna。例如，該核酸可以為與被分段的各基因組對(duì)應(yīng)的多個(gè)cdna或質(zhì)粒dna。

例如，將麻疹病毒的基因組分段為2個(gè)，在使f遺傳基因缺損的情況下，上述構(gòu)建體含有與從3’末端向著5’末端依次配置有前導(dǎo)序列、n遺傳基因、p遺傳基因、m遺傳基因以及尾隨序列的基因組相對(duì)應(yīng)的cdna，和含有與從3’末端向著5’末端依次配置有前導(dǎo)序列、h遺傳基因、l遺傳基因以及尾隨序列的基因組相對(duì)應(yīng)的cdna。

該構(gòu)建體，可以使用現(xiàn)有基因工程中的轉(zhuǎn)基因技術(shù)，容易地插入外來(lái)遺傳基因。通過(guò)將該構(gòu)建體用于如上所述的病毒粒子的重建，能夠有效地制備含有上述分段基因組的病毒載體。

該構(gòu)建體，通過(guò)現(xiàn)有的轉(zhuǎn)型或感染技術(shù)，能夠?qū)胫猎思?xì)胞或真核細(xì)胞。例如，可以將該表達(dá)構(gòu)建體以質(zhì)粒的形態(tài)導(dǎo)入各種細(xì)胞中。

需要說(shuō)明的是，上述構(gòu)建體所含有的核酸，可以是來(lái)源于屬于副粘病毒科的病毒的基因組的、3’末端配置有前導(dǎo)序列、5’末端配置有尾隨序列的多個(gè)分段基因組的crna。另外，上述構(gòu)建體還可以含有成為來(lái)源于屬于副粘病毒科的病毒的基因組的、在3’末端配置有前導(dǎo)序列、在5’末端配置有尾隨序列的基因組的模型的核酸，在該基因組中對(duì)h蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼的遺傳基因以及對(duì)f蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼的遺傳基因這兩者均被改變。

(實(shí)施方式2)

接下來(lái)，對(duì)實(shí)施方式2進(jìn)行說(shuō)明。根據(jù)本實(shí)施方式的細(xì)胞，是通過(guò)根據(jù)上述實(shí)施方式1的病毒載體導(dǎo)入有外來(lái)遺傳基因的細(xì)胞。

病毒載體，可以通過(guò)公知的方法使細(xì)胞感染。例如，將含有細(xì)胞的培養(yǎng)液中添加病毒載體，在室溫下以1200×g離心分離45分鐘。其他，作為使細(xì)胞感染病毒載體的方法，可以例舉電穿孔法、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法、熱休克法、peg法、磷酸鈣法、以及deae葡聚糖法等各種使細(xì)胞感染病毒的方法。

細(xì)胞，沒(méi)有特殊的限制，除了人的體細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、血液細(xì)胞之外，還可以為猴子的體細(xì)胞等。作為細(xì)胞，優(yōu)選為b細(xì)胞、活化或未活化的t細(xì)胞、顆粒球、含有造血干細(xì)胞的血液細(xì)胞等。尤其優(yōu)選的細(xì)胞為初始t細(xì)胞、干細(xì)胞樣記憶性t細(xì)胞或未分化b細(xì)胞。在細(xì)胞中導(dǎo)入外來(lái)遺傳基因時(shí)，該病毒載體效價(jià)沒(méi)有特殊的限制，但moi(multiplicityofinfection，感染復(fù)數(shù))為1-100，優(yōu)選為3-20，更優(yōu)選為5-10。

通過(guò)作為外來(lái)遺傳基因而至少含有oct3/4、sox2以及klf4的上述病毒載體兒導(dǎo)入有外來(lái)遺傳基因的細(xì)胞，未分化標(biāo)記表達(dá)，誘導(dǎo)為具有三胚層類分化能的ips細(xì)胞。通過(guò)上述病毒載體導(dǎo)入遺傳基因，由此還能夠誘導(dǎo)基底狀態(tài)的ips細(xì)胞。

如上詳細(xì)說(shuō)明，根據(jù)本實(shí)施方式的細(xì)胞，通過(guò)上述病毒載體導(dǎo)入有遺傳基因，從而可以是所希望的多個(gè)外來(lái)遺傳基因，同時(shí)長(zhǎng)期地表達(dá)。另外，作為遺傳基因?qū)氲膶?duì)象可以選擇初始t細(xì)胞、干細(xì)胞樣記憶性t細(xì)胞或未分化b細(xì)胞、進(jìn)而造血干細(xì)胞，因此，根據(jù)本實(shí)施方式的細(xì)胞，對(duì)于使用改變了遺傳基因的血液細(xì)胞的遺傳基因治療，尤其是遺傳基因改變t細(xì)胞療法是極為有用的。

另外，該細(xì)胞通過(guò)含有oct3/4、sox2以及klf4的上述病毒載體導(dǎo)入外來(lái)遺傳基因，誘導(dǎo)成基底狀態(tài)的ips細(xì)胞。基底狀態(tài)的ips細(xì)胞，増殖效率高、即使以單細(xì)胞進(jìn)行播種也能夠增殖，因此能夠大量制備并易于保存。另外，由于為基底狀態(tài)，能夠在廣范圍的細(xì)胞種類中進(jìn)行分化。

需要說(shuō)明的是，根據(jù)本實(shí)施方式的細(xì)胞的用途，根據(jù)外來(lái)遺傳基因可以為各種各樣。通過(guò)使導(dǎo)入至細(xì)胞的外來(lái)遺傳基因?yàn)閠細(xì)胞受體遺傳基因或嵌合抗原受體遺傳基因，可以用于對(duì)惡性腫瘤的t細(xì)胞療法。另外，通過(guò)作為外來(lái)遺傳基因在t細(xì)胞中導(dǎo)入鋅指糖核酸酶等破壞ccr5遺傳基因(基因組編輯)，由此可以對(duì)hiv/aids進(jìn)行治療。通過(guò)在腺苷脫氨酶(ada)等酶缺乏癥患者的細(xì)胞中導(dǎo)入對(duì)酶進(jìn)行編碼的遺傳基因，可以對(duì)酶缺乏癥進(jìn)行治療。

需要說(shuō)明的是，在其他實(shí)施方式中，提供了ips細(xì)胞的制備方法。該ips細(xì)胞的制備方法包含使細(xì)胞感染根據(jù)上述實(shí)施方式2的病毒載體的感染步驟。該細(xì)胞可以是血液細(xì)胞，為未活化(刺激)的免疫細(xì)胞，優(yōu)選為初始t細(xì)胞。該ips細(xì)胞的制備方法包含基底狀態(tài)的ips細(xì)胞的制備方法。

實(shí)施例

通過(guò)以下的實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步具體的說(shuō)明，但本發(fā)明不限于實(shí)施例。

(細(xì)胞培養(yǎng))

下述實(shí)施例中的細(xì)胞培養(yǎng)如下進(jìn)行。小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(mef細(xì)胞)、vero/slam細(xì)胞、成纖維細(xì)胞株的bj細(xì)胞，通過(guò)在達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(dmem，dulbecco’smodifiedeagle’smedium)(nacalaitesque公司制備)中含有10％的胎牛血清(fbs)(hyclone公司制備)的培養(yǎng)液來(lái)培養(yǎng)。vero/slam/f細(xì)胞由在dmem中含有0.5mg/ml的g418(nacalaitesque公司制備)以及7.5％的fbs的培養(yǎng)液來(lái)進(jìn)行培養(yǎng)。

bhk－t7/9細(xì)胞，通過(guò)α改變最小基本伊格爾培養(yǎng)基(α－memminimumessentialmediumeagle)(lifetechnologies公司制備)中含有600μg/ml的潮霉素b(hygromycinb)(nacalaitesque公司制備)以及10％fbs的培養(yǎng)液來(lái)培養(yǎng)。源于健康人末梢血的血液細(xì)胞，通過(guò)在rpmi1640(nacalaitesque公司制備)中含有10％fbs的培養(yǎng)液來(lái)培養(yǎng)。源于臍帶血或源于健康人的t細(xì)胞，通過(guò)rpmi1640中含有10％fbs的培養(yǎng)液、在該培養(yǎng)液中進(jìn)一步添加有175iu/ml的人重組il-2(peprotech公司制備)的培養(yǎng)液、或kbm502培養(yǎng)液(kohjinbio公司制備)來(lái)培養(yǎng)。源于臍帶血的造血干細(xì)胞，通過(guò)在stemspan(注冊(cè)商標(biāo))培養(yǎng)液(veritas公司制備)中添加有人重組scf、人重組flt－3l以及人重組tpo(全部為peprotech公司制備)的培養(yǎng)液來(lái)培養(yǎng)。

所有的primed型ips細(xì)胞，通過(guò)人es細(xì)胞維持培養(yǎng)液在mef細(xì)胞上進(jìn)行培養(yǎng)。人es細(xì)胞維持培養(yǎng)液的組成為，在dmem/f12(nacalaitesque公司制備)中含有20％ksr(lifetechnologeis公司制備)、2-巰基乙醇(2－mercaptoethanol,sigma公司制備)、2mm的l-谷氨酰胺(l-glutamine，nacalaitesque公司制備)、1％的非必要氨基酸(non-essentialaminoacids，nacalaitesque公司制備)、4ng/ml的堿性成纖維成長(zhǎng)因子(basicfgf,peprotech公司制備)。

基底狀態(tài)的ips細(xì)胞，通過(guò)混合培養(yǎng)液在mef細(xì)胞上進(jìn)行培養(yǎng)。該混合培養(yǎng)液的組成為，在dmem/f12中含有20％ksr、2-巰基乙醇、2mm的l-谷氨酰胺、1％的非必要氨基酸、1μm的chir99021(militenyibiotec公司制備)、1μmpd0325901(militenyibiotec公司制備)、1000單位/ml的人重組lif(nacalaitesque公司制備)。

(實(shí)施例1：非傳播型遺傳基因改變麻疹病毒載體的構(gòu)建)

通過(guò)如下產(chǎn)生非傳播型遺傳基因改變麻疹病毒載體，即，將含有對(duì)構(gòu)成麻疹病毒的功能性蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼的遺傳基因的2個(gè)質(zhì)粒(mv－h(huán)l－k－pin1－egfp以及mv－npm－osm)和有助于病毒合成的4個(gè)質(zhì)粒(pcite－ic－n、pcite－ic－pδc、pciteko－9301b－l、pca7－ic－f)，如下，與作為包裝細(xì)胞在bhk－t7/9細(xì)胞中導(dǎo)入slam遺傳基因以及麻疹病毒的f遺傳基因的vero/slam/f細(xì)胞通過(guò)共培養(yǎng)而產(chǎn)生的。作為外來(lái)遺傳基因，插入在ips細(xì)胞的制備中使用的oct3/4遺傳基因、sox2遺傳基因、l－myc遺傳基因、klf4遺傳基因以及pin1遺傳基因、以及作為報(bào)告遺傳基因的egfp遺傳基因。

首先，對(duì)于麻疹病毒株mv－ic323－egfp中的野生型的h遺傳基因以及m遺傳基因通過(guò)轉(zhuǎn)基因進(jìn)行改變，以使得在h蛋白質(zhì)上插入n390i、n416d、n481y、e492g的變異，以及在m蛋白質(zhì)上插入p64s、e89k的變異。

接著，如圖2所示，通過(guò)如下的重組制備mv－npm－osm質(zhì)粒，即將插入有上述變異的mv－ic323－egfp的egfp遺傳基因重組為oct3/4遺傳基因，將f遺傳基因重組為sox2遺傳基因，將h遺傳基因以及l(fā)遺傳基因重組為l－myc遺傳基因。另一方面，通過(guò)如下制備mv－h(huán)l－k－pin1－egfp質(zhì)粒，即將插入有上述變異的mv－ic323－egfp的n遺傳基因、p遺傳基因、m遺傳基因以及f遺傳基因重組為klf4遺傳基因，在l遺傳基因與h遺傳基因之間插入pin1遺傳基因。

使用mv－npm－osm質(zhì)粒以及mv－h(huán)l－k－pin1－egfp質(zhì)粒和4個(gè)質(zhì)粒(pcag－t7－ic－f、pcite－ic－n、pcite－ic－pδc、pcite－ko－9301b－l)，在bhk－t7/9細(xì)胞中導(dǎo)入遺傳基因。2天后通過(guò)培養(yǎng)皿回收細(xì)胞，播種至vero/slam/f細(xì)胞上，2天后采取巨細(xì)胞，回收麻疹病毒載體。使新的vero/slam/f細(xì)胞感染回收的麻疹病毒載體，增殖后回收細(xì)胞。將回收的細(xì)胞再懸濁于dmem中，通過(guò)反復(fù)凍結(jié)-融化，從細(xì)胞內(nèi)向培養(yǎng)液中釋放麻疹病毒載體(mvv)。此后，通過(guò)離心分離，作為病毒液僅回收上清，分配后，在－80℃下保存。在vero/slam細(xì)胞中添加該病毒液，2天后，通過(guò)流失細(xì)胞法解析gfp陽(yáng)性細(xì)胞的比例，來(lái)確定效價(jià)。

(實(shí)施例2：非傳播型遺傳基因改變麻疹病毒載體的評(píng)價(jià))

對(duì)實(shí)施例1制備的mvv使用活化t細(xì)胞或bj細(xì)胞進(jìn)行評(píng)價(jià)。活化t細(xì)胞如下制備，即將來(lái)源于健康人的末梢血在kbm502培養(yǎng)液中使用dynabeads(注冊(cè)商標(biāo))的人t細(xì)胞激活劑cd3/cd28(humant-activatorcd3/cd28，lifetechnologies公司制備)，刺激5天來(lái)制備。更具體而言，將5×10⁴個(gè)各細(xì)胞播種至12孔板，添加與效價(jià)相對(duì)應(yīng)的量的病毒液。接著，通過(guò)離心法(室溫、1200×g、45分鐘)導(dǎo)入遺傳基因后，通過(guò)pbs清洗，交換培養(yǎng)液。2天后，通過(guò)流式細(xì)胞法對(duì)活化t細(xì)胞的gfp陽(yáng)性細(xì)胞中的5個(gè)遺傳基因(oct3/4、sox2、klf4、l－myc以及pin1的表達(dá)進(jìn)行解析。使用bdcytofix/cytoperm(商標(biāo))固定/透化試劑盒(fixation/permeabilizationkit,bd公司制備)對(duì)源于外來(lái)遺傳基因的蛋白質(zhì)表達(dá)進(jìn)行解析。使用的抗體為抗oct3/4抗體、抗sox2抗體、抗klf4抗體(以上均由santacruz公司制備)、抗myc抗體以及抗pin1抗體(以上均由r&d公式制備)。

(結(jié)果)

圖3示出了bj細(xì)胞以及活化t細(xì)胞的熒光圖像。兩細(xì)胞均確認(rèn)了熒光。因此，可以確認(rèn)，mvv在bj細(xì)胞以及活化t細(xì)胞中導(dǎo)入了遺傳基因。

圖4示出了活化t細(xì)胞的gfp表達(dá)的解析結(jié)果。使用mvv，對(duì)活化t細(xì)胞導(dǎo)入遺傳基因，對(duì)導(dǎo)入后第3天的gfp陽(yáng)性細(xì)胞中的上述5個(gè)遺傳基因的表達(dá)進(jìn)行解析。從其結(jié)果可以確認(rèn)，除了egfp遺傳基因之外，5個(gè)遺傳基因均同時(shí)表達(dá)。

(實(shí)施例3：通過(guò)非傳播型遺傳基因改變麻疹病毒載體導(dǎo)入遺傳基因及其解析)

從征得同意的健康人采取末梢血或臍帶血10ml左右，使用淋巴球分離液(nacalaitesque公司制備)分離出單核球。同時(shí)，通過(guò)由nh4cl、khco3以及edta(均為nacalaitesque公司制備)調(diào)制的溶血?jiǎng)?duì)1ml左右的末梢血或臍帶血進(jìn)行溶血。將由這些方法回收的血液細(xì)胞，通過(guò)離心法(室溫、1200×g、45分鐘)使用mvv進(jìn)行遺傳基因?qū)?moi＝5)。遺傳基因?qū)牒螅胮bs(－)(將pbs片劑(タカラバイオ公司制備)用純水進(jìn)行溶解，實(shí)施高壓釜滅菌來(lái)調(diào)制)進(jìn)行清洗，交換培養(yǎng)液。2天后，回收細(xì)胞，通過(guò)流式細(xì)胞法以gfp的表達(dá)為指標(biāo)，對(duì)各血球系譜的遺傳基因?qū)肼室约案骷?xì)胞系譜中麻疹病毒受體的表達(dá)進(jìn)行解析。

作為對(duì)照組，對(duì)于搭載了gfp遺傳基因的仙臺(tái)病毒載體(sev)(plasmex(注冊(cè)商標(biāo))－ag；從醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所獲得)，以與mvv同樣的方法進(jìn)行遺傳基因?qū)搿８餮蛳底V解析中所使用的抗體為，單球：apc－cy7標(biāo)識(shí)抗cd14抗體(biolegend公司制備)、pe標(biāo)識(shí)抗cd11b抗體(bd公司制備)；好中球：percp－cy5.5標(biāo)識(shí)抗cd15抗體(biolegend公司制備)；b細(xì)胞：apc－cy7標(biāo)識(shí)抗cd19抗體(biolegend公司制備)；t細(xì)胞：apc標(biāo)識(shí)抗cd3抗體(biolegend公司制備)、apc－cy7標(biāo)識(shí)抗cd4抗體(biolegend公司制備)、pe－cy7標(biāo)識(shí)抗cd8抗體(biolegend公司制備)、apc標(biāo)識(shí)抗cd45ra(biolegend公司制備)、pe標(biāo)識(shí)抗cd197抗體(biolegend公司制備)；nk細(xì)胞：pe－cy7標(biāo)識(shí)抗cd56抗體(biolegend公司制備)。對(duì)所使用的病毒受體的抗體，為pe標(biāo)識(shí)抗cd46抗體(ebioscience公司制備)、pe標(biāo)識(shí)抗cd150抗體(biolegend公司制備)、以及pe標(biāo)識(shí)抗nectin4抗體(r&d公司制備)。需要說(shuō)明的是，單球定義為cd14⁺且cd11b⁺。b細(xì)胞定義為cd19⁺且cd3^－。t細(xì)胞定義為cd3⁺且cd19^－。好中球定義為cd15⁺。nk細(xì)胞定義為cd3^－且cd19^－且cd56⁺。

(結(jié)果)

圖5示出了來(lái)源于末梢血的各血球系細(xì)胞的gfp陽(yáng)性率。在單球情況下，兩帶菌者均確認(rèn)了高遺傳基因?qū)肼?，但b細(xì)胞、t細(xì)胞以及好中球中，mvv與sev相比較，具有較高的遺傳基因?qū)肼省?/p>

圖6示出了來(lái)源于臍帶血的未活化的t細(xì)胞的gfp陽(yáng)性率。sev即使在moi＝10下也未能導(dǎo)入遺傳基因，相對(duì)于此，mvv在moi＝5時(shí)顯示了高的遺傳基因?qū)肼省?/p>

將t細(xì)胞分化為cd45ra以及ccr7(cd197)，研究各分化中的遺傳基因?qū)肼?。如圖7所示，在暴露至抗原之前的初始t細(xì)胞以及干細(xì)胞樣記憶性t細(xì)胞分化(cd45ra高且cd197高)、以及通過(guò)抗原的再暴露増殖的中央記憶性t細(xì)胞(cd45ra低且cd197高)以及效應(yīng)記憶性t細(xì)胞分化(cd45ra低且cd197低)中，確認(rèn)了通過(guò)mvv產(chǎn)生高效率的遺傳基因?qū)?。另一方面，從cd8⁺細(xì)胞的結(jié)果可知，在效應(yīng)t細(xì)胞分化(cd45ra高且cd197低)中，未能確認(rèn)由mvv產(chǎn)生遺傳基因?qū)氲男驶?/p>

上述結(jié)果表明，對(duì)于包含仙臺(tái)病毒載體的現(xiàn)有方法難以進(jìn)行遺傳基因?qū)氲某跏紅細(xì)胞以及干細(xì)胞樣記憶性t細(xì)胞，可以通過(guò)mvv產(chǎn)生高效地遺傳基因?qū)?。因此，根?jù)本實(shí)施例的mvv，預(yù)示了在使用遺傳基因改變t細(xì)胞的遺傳基因治療、特別是遺傳基因改變t細(xì)胞療法中可以成為創(chuàng)新性治療用菌群。另外，mvv即使對(duì)于初代培養(yǎng)b細(xì)胞也能夠高效地導(dǎo)入遺傳基因。

(實(shí)施例4：使用非傳播型遺傳基因改變麻疹病毒載體建立ips細(xì)胞)

對(duì)bj細(xì)胞，使用mvv通過(guò)離心法(室溫、1200×g、45分鐘)進(jìn)行遺傳基因?qū)?moi＝5)，用pbs清洗后交換培養(yǎng)液。在遺傳基因?qū)牒蟮?天，將bj細(xì)胞播種至mef細(xì)胞上，在37℃、5％co2恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)1天，次日，培養(yǎng)基換成人es細(xì)胞維持培養(yǎng)液。此后，隔1日交換培養(yǎng)液，并在37℃、5％co2恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)，在遺傳基因?qū)牒蟮?7天，收集人es細(xì)胞樣菌落(參考圖8)。

另外，將來(lái)源于健康人的末梢血的單核球在kbm502培養(yǎng)液中，使用dynabeads(注冊(cè)商標(biāo))人t刺激活化劑(humant-activatior)cd3/cd28進(jìn)行刺激，在37℃、5％co2恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)。在培養(yǎng)后第5天回收細(xì)胞，使用mvv將重新編碼因子通過(guò)離心法(室溫、1200×g、45分鐘)導(dǎo)入遺傳基因，將細(xì)胞在次日播種至mef細(xì)胞上，在37℃、5％co2恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)。培養(yǎng)開(kāi)始后第20天回收es細(xì)胞樣菌落(參考圖9)，播種至新鮮的mef細(xì)胞上。

對(duì)于從bj細(xì)胞建立的上述ips細(xì)胞，實(shí)施免疫抗體染色法以及rt－pcr法，確認(rèn)了未分化標(biāo)記的表達(dá)。免疫抗體染色法，對(duì)人ips細(xì)胞使用4％多聚甲醛-磷酸緩沖溶液(nacalaitesque公司制備)在4℃下固定30分鐘，通過(guò)0.1％triton(注冊(cè)商標(biāo))x－100(nacalaitesque公司制備)處理后，使用5％脫脂奶(nacalaitesque公司制備)封閉。作為一次抗體使用抗nanog抗體(r&d公司制備)、抗oct3/4抗體、抗ssea－4抗體、抗tra－1－60抗體以及抗tra－1－81抗體(均為santacruz公司制備)在4℃下染色1晚，通過(guò)二次抗體(抗羊ing，anti－goating(lifetechnologies公司制備))在室溫下染色30分鐘。堿性磷酸酶染色使用堿性磷酸檢測(cè)試劑盒(alkalinephospatasedetectionkit(merckmillipore公司制備)。

在rt－pcr法中，從由bj細(xì)胞建立的上述ips細(xì)胞，使用rna小量提取試劑盒(rneasyminikit,quiagen公司制備)提取rna，使用用于rt-pcr的上鏈iii第一鏈合成系統(tǒng)(superscriptiiifirst-strandsynthesissystemforrt-pcr,lifetechnologies公司制備)來(lái)合成互補(bǔ)鏈dna(cdna)。此后，使用takaraextaq(注冊(cè)商標(biāo))聚合酶(takarabio公司制備)進(jìn)行増幅反應(yīng)，使用1.5％瓊脂糖凝膠(nacalaitesque公司制備)進(jìn)行電泳。在rt－pcr法中所使用的引物的堿基序列是，對(duì)endooct3/4為序列號(hào)3以及序列號(hào)4、對(duì)endosox2為序列號(hào)5以及序列號(hào)6、對(duì)endoklf4為序列號(hào)7以及序列號(hào)8、對(duì)endomyc為序列號(hào)9以及序列號(hào)10、對(duì)nanog為序列號(hào)11以及序列號(hào)12、對(duì)tert為序列號(hào)13以及序列號(hào)14、對(duì)dnmt3b為序列號(hào)15以及序列號(hào)16、對(duì)mv－n蛋白質(zhì)為序列號(hào)17以及序列號(hào)18、對(duì)mv－l蛋白質(zhì)為序列號(hào)19以及序列號(hào)20、以及，對(duì)β－肌動(dòng)蛋白為序列號(hào)21以及序列號(hào)22。

通過(guò)體外胚狀體形成法研究三胚層分化誘導(dǎo)。從bj細(xì)胞建立的上述ips細(xì)胞由mef使用es細(xì)胞解離液(膠原酶iv(lifetechnologies公司制備)、0.25％胰蛋白酶(lifetechnologies公司制備)以及ksr的混合液)進(jìn)行解離，再懸濁于人es細(xì)胞維持培養(yǎng)液中，播種至非粘結(jié)性6孔板中，在37℃、5％co2恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)。次日，回收浮游細(xì)胞，并懸濁至未添加堿性成纖維成長(zhǎng)因子的人es細(xì)胞維持培養(yǎng)液中，在37℃、5％co2恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)。培養(yǎng)開(kāi)始后第14天回收細(xì)胞，使用0.25％胰蛋白酶/edta混合液(nacalaitesque公司制備)解離細(xì)胞，播種至使用0.1％明膠溶液(nacalaitesque公司制備)涂覆的培養(yǎng)皿中，在37℃、5％co2恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)7天。

使用免疫抗體染色法確認(rèn)了從bj細(xì)胞建立的上述ips細(xì)胞的三胚層分化。所使用的抗體為抗甲種胎兒球蛋白(alpha－fetoprotein)抗體(r&d公司制備)、抗波形蛋白(vimentin)抗體(santacruz公司制備)以及抗結(jié)合素(nectin)抗體(santacruz公司制備)。

對(duì)從bj細(xì)胞建立的上述ips細(xì)胞，進(jìn)行畸胎瘤形成試驗(yàn)。將1×10⁶個(gè)ips細(xì)胞注入免疫缺陷小鼠(從試驗(yàn)動(dòng)物中央研究所獲得)的睪丸內(nèi)，在9～13星期后，取出畸胎瘤。此后，用20％的福爾馬林(和光純藥工業(yè)會(huì)社制)固定畸胎瘤組織，進(jìn)行蘇木-碘染色。另外，對(duì)從bj細(xì)胞建立的上述ips細(xì)胞的核型進(jìn)行解析(chromocenter公司)。

(結(jié)果)

如圖10所示，在未分化的細(xì)胞表達(dá)的堿性磷酸酶、nanog、oct3/4、ssea－4、tra－1－60以及tra－1－81的表達(dá)，在ips細(xì)胞得到確認(rèn)。rt－pcr法的結(jié)果示于圖11。ips細(xì)胞的各試樣確認(rèn)了遺傳基因?qū)肓说膐ct3/4、sox2、klf4以及l(fā)－myc的表達(dá)。另外，還確認(rèn)了未分化標(biāo)記的nanog、tert以及dnmt3b的表達(dá)。需要說(shuō)明的是，未見(jiàn)來(lái)源于麻疹病毒的n蛋白質(zhì)以及l(fā)蛋白質(zhì)的表達(dá)。進(jìn)而，確認(rèn)了上述ips細(xì)胞的三胚層分化(參考圖12)。

如圖13所示畸胎瘤形成試驗(yàn)的結(jié)果確認(rèn)了三胚層分化能。由此表明了從bj細(xì)胞建立的上述ips細(xì)胞的多分化能。如圖14所示該ips細(xì)胞具有46根染色體，核型正常。

(實(shí)施例5：基底狀態(tài)(groundstate)的ips細(xì)胞的建立和分化誘導(dǎo)以及解析)

將由理化學(xué)研究所獲得的源于臍帶血的cd34陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行解凍，使用在stemspan中添加了scf、tpo、flt3l的培養(yǎng)液在37℃、5％co2恒溫箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。次日，使用mvv通過(guò)離心法(室溫、1200×g、45分鐘)進(jìn)行遺傳基因?qū)耄ㄟ^(guò)上述培養(yǎng)液培養(yǎng)2天。在第3天播種于mef細(xì)胞上，在第4天將培養(yǎng)液換成人es細(xì)胞維持培養(yǎng)液。此后，隔1天交換培養(yǎng)液并繼續(xù)在37℃、5％co2恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)。采取在遺傳基因?qū)牒蟮?4天出現(xiàn)的菌落(參考圖15)，通過(guò)0.25％胰蛋白酶/edta混合溶液解離成單細(xì)胞，播種至mef細(xì)胞上，并在37℃、5％co2恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)。

(結(jié)果)

如圖15所示，建立了基底狀態(tài)的ips細(xì)胞?；谞顟B(tài)的ips細(xì)胞，隔4天用0.25％胰蛋白酶/edta混合溶液進(jìn)行解離至單細(xì)胞以作為傳代，其結(jié)果，不使用y－27632進(jìn)行10次傳代以上也能夠維持菌落形態(tài)。另外，將培養(yǎng)液換成人es細(xì)胞維持培養(yǎng)液，將mef細(xì)胞的播種濃度變薄，由此也能夠確認(rèn)人es細(xì)胞樣菌落的出現(xiàn)。

在不脫離本發(fā)明的廣義的精神及范圍內(nèi)，本發(fā)明能夠進(jìn)行各種實(shí)施方式以及變形。另外，上述實(shí)施方式僅僅是用于說(shuō)明本發(fā)明，不能夠限定本發(fā)明的范圍。即，本發(fā)明的范圍，不是通過(guò)實(shí)施方式，而是通過(guò)權(quán)利要求書(shū)所示。并且，權(quán)利要求書(shū)以及與其同等的發(fā)明的意義范圍內(nèi)實(shí)施的各種變形，均屬于本發(fā)明范圍內(nèi)。

工業(yè)上的利用可能性

本發(fā)明適用于用于對(duì)血液細(xì)胞導(dǎo)入遺傳基因的病毒載體以及構(gòu)建體。因此，期待本發(fā)明在免疫療法、尤其是對(duì)t細(xì)胞療法的應(yīng)用。另外，由于本發(fā)明也適用于功能性干細(xì)胞的制備，除了使用通過(guò)分化誘導(dǎo)得到的組織細(xì)胞的再生醫(yī)療之外，還能夠應(yīng)用于從來(lái)源于疑難雜癥患者的細(xì)胞所建立的ips細(xì)胞的疾病解析以及創(chuàng)新藥研究。進(jìn)一步，還可能應(yīng)用于以血液細(xì)胞為對(duì)象的基因組編輯技術(shù)。

sequencelisting

<110>國(guó)立大學(xué)法人九州大學(xué)

<120>病毒載體、細(xì)胞及構(gòu)建體

<130>15f079-pct

<150>jp2014-225642

<151>2014-11-05

<160>22

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>8975

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>segment1ofmodifiedmeaslesvirusgenome

<400>1

accaaacaaagttgggtaaggatagatcaatcaatgatcatattctagtacacttaggat60

tcaagatcctattatcagggacaagagcaggattagggatatccgagggcgcgccatggc120

gggacacctggcttcggatttcgccttctcgccccctccaggtggtggaggtgatgggcc180

aggggggccggagccgggctgggttgatcctcggacctggctaagcttccaaggccctcc240

tggagggccaggaatcgggccgggggttgggccaggctctgaggtgtgggggattccccc300

atgccccccgccgtatgagttctgtggggggatggcgtactgtgggccccaggttggagt360

ggggctagtgccccaaggcggcttggagacctctcagcctgagggcgaagcaggagtcgg420

ggtggagagcaactccgatggggcctccccggagccctgcaccgtcacccctggtgccgt480

gaagctggagaaggagaagctggagcaaaacccggaggagtcccaggacatcaaagctct540

gcagaaagaactcgagcaatttgccaagctcctgaagcagaagaggatcaccctgggata600

tacacaggccgatgtggggctcaccctgggggttctatttgggaaggtattcagccaaac660

gaccatctgccgctttgaggctctgcagcttagcttcaagaacatgtgtaagctgcggcc720

cttgctgcagaagtgggtggaggaagctgacaacaatgaaaatcttcaggagatatgcaa780

agcagaaaccctcgtgcaggcccgaaagagaaagcgaaccagtatcgagaaccgagtgag840

aggcaacctggagaatttgttcctgcagtgcccgaaacccacactgcagcagatcagcca900

cattgcccagcagcttgggctcgagaaggatgtggtccgagtgtggttctgtaaccggcg960

ccagaagggcaagcgatcaagcagcgactatgcacaacgagaggattttgaggctgctgg1020

gtctcctttctcagggggaccagtgtcctttcctctggccccagggccccattttggtac1080

cccaggctatgggagccctcacttcactgcactgtactcctcggtccctttccctgaggg1140

ggaagcctttccccctgtctctgtcaccactctgggctctcccatgcattcaaactgata1200

agacgtcgagaggccgaggaccagaacaacatccgcctaccctccatcattgttataaaa1260

aacttaggaaccaggtccacacagccgccagccaaccaaccatccactcccacgactgga1320

gttcgaacgagatggccacacttttgaggagcttagcattgttcaaaagaaacaaggaca1380

aaccacccattacatcaggatccggtggagccatcagaggaatcaaacacattattatag1440

taccaattcctggagattcctcaattaccactcgatccagactactggaccggttggtca1500

ggttaattggaaacccggatgtgagcgggcccaaactaacaggggcactaataggtatat1560

tatccttatttgtggagtctccaggtcaattgattcagaggatcaccgatgaccctgacg1620

ttagcatcaggctgttagaggttgttcagagtgaccagtcacaatctggccttaccttcg1680

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gcagtagtgatcaatccaggtccggatggttcgagaacaaggaaatctcagatattgaag1800

tgcaagaccctgagggattcaacatgattctgggtaccattctagcccagatctgggtct1860

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taaagtacacccaacaaagaagggtagttggtgaatttagattggagagaaaatggttgg1980

atgtggtgaggaacaggattgccgaggacctctctttacgccgattcatggtggctctaa2040

tcctggatatcaagaggacacccgggaacaaacctaggattgctgaaatgatatgtgaca2100

ttgatacatatatcgtagaggcaggattagccagttttatcctgactattaagtttggga2160

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agtccttgatgaatctttaccagcaaatgggagaaactgcaccctacatggtaatcctag2280

agaactcaattcagaacaagttcagtgcaggatcataccctctgctctggagctatgcca2340

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ttgatccagcatattttagattagggcaagagatggtgaggaggtcagctggaaaggtca2460

gttccacattggcatccgaactcggtatcactgccgaggatgcaaggcttgtttcagaga2520

ttgcaatgcatactactgaggacaggatcagtagagcggtcggacccagacaagcccaag2580

tgtcatttctacacggtgatcaaagtgagaatgagctaccaggattggggggcaaggaag2640

ataggagggtcaaacagggtcggggagaagccagggagagctacagagaaaccgggtcca2700

gcagagcaagtgatgcgagagctgcccatcctccaaccagcatgcccctagacattgaca2760

ctgcatcggagtcaggccaagatccgcaggacagtcgaaggtcagctgacgccctgctca2820

ggctgcaagccatggcaggaatcttggaagaacaaggctcagacacggacacccctaggg2880

tatacaatgacagagatcttctagactaggtgcgagaggccgaggaccagaacaacatcc2940

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accaaccatccactcccacgactggagccgatggcagaagagcaggcacgccatgtcaaa3060

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