本申請要求于2014年12月15日提交的美國臨時專利申請no.62/092,171的權(quán)益，其在此通過引用完整并入用于所有目的。

發(fā)明領(lǐng)域

本公開涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，更具體地涉及用于將單一靶分子置于圖案化基底上的組合物和方法。

發(fā)明背景

單分子放置在諸如生物分子動力學(xué)研究、藥物發(fā)現(xiàn)和核酸測序等領(lǐng)域中具有有用的應(yīng)用。例如，已經(jīng)通過將單個聚合酶置于具有納米大小的波導(dǎo)中實現(xiàn)了單分子dna測序。使用納米孔結(jié)構(gòu)已經(jīng)實現(xiàn)了單分子dna測序，所述納米孔結(jié)構(gòu)將單個納米孔形成蛋白質(zhì)加載到脂質(zhì)雙層中。

目前，主要通過經(jīng)由將錨定空間限制到單分子大小的水平的分子大小排阻效應(yīng)來實現(xiàn)單分子放置。這種方法需要利用高分辨率光刻法(lithography)，并且由于目標(biāo)面積小而導(dǎo)致相對較低的加載效率。將單個納米孔加載到脂質(zhì)雙層中主要通過監(jiān)測加載過程期間的離子電流變化來實現(xiàn)，所述其與大規(guī)模生產(chǎn)缺乏相容性。

因此，存在對將單分子置于靶區(qū)域上的有效方法的需要。本發(fā)明也滿足了此需要并且提供了相關(guān)的優(yōu)點。

發(fā)明概述

本文中特別提供了可用于將單分子置于靶區(qū)域上的基底和方法。在第一方面中是基底，其包含固定化到所述基底上的特征(feature)的多個第一和第二捕捉引物。至少一個靶多核苷酸，一個末端附著到所述捕捉引物之一而另一個末端與靶分子連接，其中所述靶多核苷酸包含側(cè)翼有與所述第一和第二捕捉引物互補的第一和第二捕捉引物結(jié)合區(qū)的靶區(qū)域，所述第二捕捉引物結(jié)合區(qū)包含與所述第二捕捉引物的堿基對錯配，和與固定化到所述特征的所述靶多核苷酸互補的多個克隆擴增子。在一些實施方案中，堿基對錯配是1,2,3,4,5,6,7,8,9或10個堿基對錯配。在一些實施方案中，堿基對錯配是3個堿基對錯配。

在一些實施方案中，基底還包含多個特征。在一些實施方案中，特征包含單一靶分子。在一些實施方案中，用所述多個克隆擴增子填滿所述特征。用所述多個克隆擴增子填滿所述特征(thefeatureisfilledtocapacitywiththepluralityofclonalamplicons)。在一些實施方案中，多個特征包含單一靶分子。在一些實施方案中，所述特征中的兩個或更多個包含不同單一靶分子。在一些實施方案中，用所述多個克隆擴增子填滿所述特征。

在一些實施方案中，所述靶多核苷酸包含一種或多種選自下組的多核苷酸：rna、dna和pna。在一些實施方案中，所述靶多核苷酸包含雙鏈dna(dsdna)。在一些實施方案中，所述靶多核苷酸包含小于1,000個核苷酸。在一些實施方案中，所述靶多核苷酸包含10-25、26-50、51-100、101-200、201-300、301-400、401-500、501-600、601-700、701-800、801-900、或901-1000個核苷酸。

在一些實施方案中，靶分子包括多肽、多核苷酸、碳水化合物、氨基酸、核苷酸、單糖、半抗原、配體、抗原、分析物、小分子有機化合物或無機化合物。在一些實施方案中，靶分子包含多肽。在一些實施方案中，多肽選自納米孔、結(jié)合多肽和酶。在一些實施方案中，納米孔選自mspa、ompf、ompg、nalp、wza、clya毒素、α-溶血素、炭疽毒素、殺白細(xì)胞素、離子通道、蛋白質(zhì)納米孔和dna折紙納米孔(origaminanopore)。

在一些實施方案中，結(jié)合多肽選自：抗體、fab、fab'、f(ab')2、scfv、雙抗體(diabody)、三抗體(triabody)、微型抗體和單域抗體(sdab)、t細(xì)胞受體、小菌素(microcin)、神經(jīng)肽、g蛋白偶聯(lián)受體、抗體、表皮生長因子受體和her2。在一些實施方案中，酶選自：重組酶、聚合酶、解旋酶、轉(zhuǎn)座酶、連接酶、脫氨酶、氧化酶和激酶。

在一些實施方案中，基底包含一種或多種選自玻璃、硅、塑料和生物聚合物的材料。在一些實施方案中，所述特征由缺少靶多核苷酸的間隙區(qū)域分開。在一些實施方案中，特征包括珠、孔、通道、脊(ridge)、突起(projection)或其組合。在一些實施方案中，孔是微孔或納米孔。在一些實施方案中，基底還包含水凝膠或共價連接的凝膠。

本文中還提供了將單一靶分子置于基底的特征上的方法。在一方面，方法是將單一靶分子置于基底的特征上的方法，通過雜交固定化到基底上的特征的多個第一和第二捕捉引物與至少一個靶多核苷酸進行，其中所述靶多核苷酸包含側(cè)翼有與所述第一和第二捕捉引物互補的第一和第二捕捉引物結(jié)合區(qū)的靶區(qū)域，其中所述第二捕捉引物結(jié)合區(qū)包含與所述第二捕捉引物的堿基對錯配并且與靶分子連接。方法進一步包括以平均擴增速率擴增所述至少一種靶多核苷酸以產(chǎn)生與所述靶多核苷酸互補的多個克隆擴增子，所述平均擴增速率超過靶多核苷酸至特征的平均轉(zhuǎn)運速率。方法還包括以平均擴增速率擴增所述至少一種靶多核苷酸以產(chǎn)生與所述靶多核苷酸互補的多個克隆擴增子，所述平均擴增速率超過靶多核苷酸至特征的平均轉(zhuǎn)運速率。

在本文中所述的方法的一些實施方案中，堿基對錯配是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個堿基對錯配。在本文中所述的方法的一些實施方案中，堿基對錯配是三堿基對錯配。在本文中所述的方法的一些實施方案中，基底包括多個特征。在本文中所述的方法的一些實施方案中，特征包括單一靶分子。在本文中所述的方法的一些實施方案中，用所述多個克隆擴增子填滿所述特征。在本文中所述的方法的一些實施方案中，多個特征包含單一靶分子。在本文中所述的方法的一些實施方案中，特征中的兩個或更多個包含不同的單一靶分子。在本文中所述的方法的一些實施方案中，用所述多個克隆擴增子填滿所述特征。

在本文中所述的方法的一些實施方案中，擴增包括等溫擴增。在本文中所述的方法的一些實施方案中，等溫擴增還包含單鏈結(jié)合多肽。在本文中所述的方法的一些實施方案中，等溫擴增包括動力學(xué)排除擴增。在本文中所述的方法的一些實施方案中，等溫擴增還包括動力學(xué)排除擴增。

在本文中所述的方法的一些實施方案中，在所述特征處產(chǎn)生的隨后擴增子的平均擴增速率超過第一擴增子的平均擴增速率。在本文中所述的方法的一些實施方案中，所述靶多核苷酸包含一種或多種選自rna、dna和pna的多核苷酸。在本文中所述的方法的一些實施方案中，所述靶多核苷酸包括雙鏈dna(dsdna)。在一些實施方案中，所述靶多核苷酸包含少于1,000個核苷酸。在本文中所述的方法的一些實施方案中，所述靶多核苷酸的長度包括10至25、26至50、51至100、101至200、201至300、301至400、401至500、501至600、601至700、701至800、801至900、或901至1000個堿基對。

在本文中所述的方法的一些實施方案中，靶分子包括多肽、多核苷酸、碳水化合物、氨基酸、核苷酸、單糖、半抗原、配體、抗原、分析物、小分子有機化合物或無機化合物。在本文中所述的方法的一些實施方案中，靶分子包括多肽。在本文中所述的方法的一些實施方案中，多肽選自納米孔、結(jié)合多肽和酶。在本文中所述的方法的一些實施方案中，納米孔選自mspa、ompf、ompg、nalp、wza、clya毒素、α-溶血素、炭疽毒素、殺白細(xì)胞素和dna折紙納米孔。在本文中所述的方法的一些實施方案中，結(jié)合多肽選自：抗體、fab、fab'、f(ab')2、scfv、雙抗體、三抗體、微型抗體和單域抗體(sdab)、t細(xì)胞受體、小菌素、神經(jīng)肽、g蛋白偶聯(lián)受體、抗體、表皮生長因子受體和her2。

在本文中所述的方法的一些實施方案中，酶選自：重組酶、聚合酶、解旋酶、轉(zhuǎn)座酶、連接酶、脫氨酶、氧化酶和激酶。在本文中所述的方法的一些實施方案中，基底包含一種或多種選自玻璃、硅、塑料和生物聚合物的材料。在本文中所述的方法的一些實施方案中，特征由缺少靶多核苷酸的間隙區(qū)域分開。在本文中所述的方法的一些實施方案中，特征包括珠、孔、通道、脊、突起或其組合。在本文中所述的方法的一些實施方案中，孔是微孔或納米線。在本文中所述的方法的一些實施方案中，基底還包含水凝膠或共價連接的凝膠。

附圖簡述

圖1顯示了使用附著到靶分子的靶多核苷酸的動力學(xué)排除擴增(kea)，在多個特征中的每個中放置單一靶分子。

圖2顯示了例示性基底。

圖3a-d顯示了例示性靶多核苷酸。

圖4顯示了靶多核苷酸上的捕捉引物結(jié)合區(qū)的設(shè)計，所述捕捉引物結(jié)合區(qū)可以用于在遠(yuǎn)端從捕捉引物結(jié)合區(qū)擴增附著到靶分子的鏈，同時指數(shù)擴增由其產(chǎn)生的擴增子。

圖5顯示了包含至少兩個特征的例示性基底。

圖6顯示了在雙鏈靶多核苷酸中使用錯配捕捉引物區(qū)的第一和第二輪等溫擴增。

圖7顯示了用于生成基底的例示性工作流程。

圖8顯示了例示性試劑盒。

圖9顯示了使用匹配和錯配的捕捉引物/捕捉引物結(jié)合區(qū)的動力學(xué)排除擴增(kea)反應(yīng)中使用的靶多核苷酸和捕捉引物結(jié)合區(qū)設(shè)計。

圖10顯示了圖9所示的靶多核苷酸的擴增子產(chǎn)物。

發(fā)明詳述

本公開涉及用于將單分子置于選定的基底區(qū)域上的組合物和方法。單分子的放置或單分子放置可用于多種應(yīng)用中，其中與群體之間的平均測量相反期望測定單分子相互作用。當(dāng)期望使用單分子詢問單分子水平的另一個分子實體時，單分子的放置也可以是有用的。

在圖1所示的一個例示性實施方案中，本公開涉及使用動力學(xué)排除測定(kea)將單分子置于基底的靶區(qū)域上。在該實施方案中，首先用kea引物官能化基底的靶區(qū)域，并將靶分子與通過kea快速擴增的雙鏈核酸連接。當(dāng)靶分子落在基底上時，連接的核酸快速擴增以填充整個墊，并防止不同分子的進一步著陸。該例示性方法是不太受目標(biāo)區(qū)域的臨界維度(criticaldimension,cd)限制的，并且加載通量將高于基于大小排阻效應(yīng)的方法。此外，kea是自限制的過程，因此與大規(guī)模生產(chǎn)相容。

如本文所用，術(shù)語“基底”旨在表示固體支持物。該術(shù)語包括可用作產(chǎn)生特征的固體或半固體基礎(chǔ)的任何材料，如沉積生物聚合物，包括核酸，多肽和/或其它聚合物的孔。本發(fā)明的基底可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的各種方法進行改性，或者可以進行修飾以適應(yīng)生物聚合物的附著。基底材料的例示性類型包括玻璃，改性玻璃，官能化玻璃，無機玻璃，微球，包括惰性和/或磁性顆粒，塑料，多糖，尼龍，硝化纖維素，陶瓷，樹脂，二氧化硅，基于二氧化硅的材料，碳，金屬，光纖或光纖束，除上述例示的物質(zhì)以外的各種聚合物和多孔微量滴定板。具體類型的例示性塑料包括丙烯酸樹脂，聚苯乙烯，苯乙烯和其它材料的共聚物，聚丙烯，聚乙烯，聚丁烯，聚氨酯和teflon^tm(例如聚四氟乙烯，全氟烷氧基，氟化乙烯丙烯及其衍生物)。例示性基于二氧化硅的材料的具體類型包括硅和各種形式的改性硅。

在本文呈現(xiàn)的方法和組合物中，可以將多核苷酸固定化到本文所述的基底。在一些實施方案中，多核苷酸共價固定化到基底。當(dāng)提及將分子(例如核酸)固定化到基底時，術(shù)語“固定化”和“附著”在本文中可互換使用，并且兩個術(shù)語旨在包括直接或間接，共價或非共價附著，除非明確或根據(jù)上文另有指示。在本發(fā)明的某些實施方案中，共價連接可以是優(yōu)選的，但通常所需要的是分子(例如核酸)在其旨在使用基底的條件下保持固定化或附著到支持物。

本發(fā)明的某些實施方案可以使用包括惰性基底或基質(zhì)(例如玻璃載片，聚合物珠等)的基底，所述惰性基底或基質(zhì)已被官能化，例如通過施加中間材料的層或涂層，所述中間材料包括允許共價附著到生物分子，如多核苷酸的反應(yīng)性基團。這種支持物的實例包括但不限于在惰性基底如玻璃上支持的聚丙烯酰胺水凝膠，特別是如wo2005/065814和us2008/0280773中所述的聚丙烯酰胺水凝膠，其內(nèi)容通過引用方式整體并入本文。在此類實施方案中，生物分子(例如多核苷酸)可以直接共價附著到中間材料(例如水凝膠)，但中間材料本身可以非共價附著到基底或基質(zhì)(例如玻璃基底)上。術(shù)語“共價附著到固體支持物”和“共價附著到基底”可互換使用，并且相應(yīng)解釋為包括這種類型的布置。

例示性的共價連接包括例如由使用點擊化學(xué)技術(shù)產(chǎn)生的那些。例示性非共價連接包括但不限于非特異性相互作用(例如氫鍵鍵合，離子鍵鍵合，范德華相互作用等)或特異性相互作用(例如親和力相互作用，受體-配體相互作用，抗體-表位相互作用，親合素-生物素相互作用，鏈霉親合素-生物素相互作用，凝集素-碳水化合物相互作用等)。例示性的連接在美國專利no.6,737,236；7,259,258；7,375,234和7,427,678；和美國專利公開no.2011/0059865a1，其各自通過引用并入本文。共價連接可以包括使用如本文所述的綴合化學(xué)形成的那些。

術(shù)語“固體表面”，“固體支持物”和本文中的其它語法等同物是指適合于或可以修飾為適合于附著多核苷酸的任何材料。如本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，可能的基底數(shù)目非常大?？赡艿幕装ǖ幌抻诓ＡШ透男曰蚬倌芑牟ＡВ芰?包括丙烯酸類，聚苯乙烯和苯乙烯和其它材料的共聚物，聚丙烯，聚乙烯，聚丁烯，聚氨酯，teflon^tm等)，多糖，尼龍或硝基纖維素，陶瓷，樹脂，二氧化硅或基于二氧化硅的材料，包括硅和改性硅，碳，金屬，無機玻璃，塑料，光纖束和各種其它聚合物。對于一些實施方案特別有用的固體支持物和固體表面位于流動池裝置內(nèi)。例示性的流動池在下面進一步詳細(xì)闡述。

本領(lǐng)域技術(shù)人員將知道或理解本發(fā)明的基底的組成和幾何形狀可以根據(jù)用戶的預(yù)期用途和偏好而變化。因此，盡管平面基底如載玻片，芯片或晶片在本文中參照用于說明的微陣列例示，但是鑒于本文提供的教導(dǎo)和指導(dǎo)，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，本文中例示或本領(lǐng)域中公知的極其多種其它基底也可以用于本發(fā)明的方法和/或組合物中。

在一些實施方案中，固體支持物包含流動池的一個或多個表面。如本文所用，術(shù)語“流動池”是指包含一個或多個流體試劑可以流過的固體表面的室。例如在bentleyetal.，nature456：53-59(2008)，wo04/018497中描述了可容易地用于本公開的方法中的流動池和相關(guān)流體系統(tǒng)和檢測平臺的實例。us7,057,026；wo91/06678；wo07/123744；us7,329,492；us7,211,414；us7,315,019；us7,405,281和us2008/0108082，其各自通過引用并入本文。

在一些實施方案中，固體支持物或其表面是非平面的，如管或容器的內(nèi)表面或外表面。在一些實施方案中，固體支持物包含微球或珠。本文中的“微球”或“珠”或“顆粒”或語法等同物是指小的離散顆粒。合適的珠組合物包括但不限于塑料，陶瓷，玻璃，聚苯乙烯，甲基苯乙烯，丙烯酸聚合物，順磁材料，氧化釷溶膠，碳石墨，二氧化鈦，膠乳或交聯(lián)葡聚糖如瓊脂糖凝膠，纖維素，尼龍，交聯(lián)膠束和teflon，以及本文概述的固體支持物的任何其它材料都可以使用。來自bangslaboratories，fishersind.的“microspheredetectionguide”是一個有用的指南。在某些實施方案中，微球是磁性微球或珠。珠不需要是球形的；可以使用不規(guī)則的顆粒?；蛘呋蛄硗?，珠可以是多孔的。珠的大小范圍從納米，即100nm到毫米，即1mm，優(yōu)選約0.2微米至約200微米的珠，特別優(yōu)選約0.5至約5微米，盡管在一些實施方案中，可以使用更小或更大的珠。

在一些實施方案中，固體支持物包括圖案化表面?！皥D案化表面”是指在固體支持體的暴露層中或其上的不同區(qū)域的布置。例如，一個或多個區(qū)域可以是其中存在一個或多個擴增引物的特征。特征可以通過不存在擴增引物的間隙區(qū)分開。在一些實施方案中，圖案可以是行和列中的特征的x-y格式。在一些實施方案中，圖案可以是特征和/或間隙區(qū)域的重復(fù)排列。在一些實施方案中，圖案可以是特征和/或間隙區(qū)域的隨機排列?？捎糜诒疚奶岢龅姆椒ê徒M合物中的例示性圖案化表面描述于usser.no.13/661,524或美國專利申請公開no.2012/0316086a1，其各自通過引用并入本文。

在一些實施方案中，固體支持物包括表面中的孔或凹陷的陣列。這可以如本領(lǐng)域中通常已知使用各種技術(shù)制造，包括但不限于光刻法、沖壓技術(shù)、模制技術(shù)和微蝕刻技術(shù)。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，所使用的技術(shù)將取決于陣列基底的組成和形狀。

圖案化表面中的特征可以是在玻璃，硅，塑料或具有圖案化共價連接的凝膠如聚(n-(5-疊氮基乙酰胺基戊基)丙烯酰胺-共-丙烯酰胺)(pazam，參見例如美國臨時專利申請序列號61/753,833，其通過引用并入本文)的其它合適的固體載體上的孔(例如，微孔或納米孔)陣列中的孔。該過程產(chǎn)生用于測序的凝膠墊，其可以在具有大量循環(huán)的測序運行中穩(wěn)定。在各種用途期間，聚合物與孔的共價連接有助于在結(jié)構(gòu)化基底的整個壽命期間將凝膠維持在結(jié)構(gòu)化特征中。然而，在許多實施方案中，凝膠不需要與孔共價連接。例如，在某些條件下，無硅烷的丙烯酰胺(sfa，參見例如美國專利申請公開號2011/0059865a1，其通過引用并入本文)(其不共價附著到結(jié)構(gòu)化基底的任何部分)可用作凝膠材料。

在具體的實施方案中，結(jié)構(gòu)化基底可以如下制備：用孔(例如微孔或納米孔)圖案化固體支持材料，用凝膠材料(例如，pazam，sfa或其化學(xué)修飾的變體，如sfa(疊氮-sfa)的疊氮化形式)包被圖案化的支持物，并且例如通過化學(xué)或機械拋光來研磨凝膠包被的載體，從而將凝膠保留在孔中，但是從孔間結(jié)構(gòu)化基底表面上的間隙區(qū)域中除去或滅活基本上所有的凝膠。引物核酸可以附著到凝膠材料。然后，可以將靶多核苷酸(例如，片段化的人基因組)的溶液與拋光的基底接觸，使得通過與附著到凝膠材料的引物的相互作用，各個靶多核苷酸接種單個孔；然而，由于凝膠材料的不存在或不活動，靶多核苷酸不會占據(jù)間隙區(qū)域。靶多核苷酸的擴增將被限制在孔中，因為間隙區(qū)域中凝膠的不存在或不活動阻止了生長核酸菌落的向外遷移。該方法可方便地制造，可擴展并利用常規(guī)的微米或納米制造方法。

圖案化基底可以包括例如刻蝕成載玻片或芯片的孔。只要這種特征在物理上或功能上可彼此分離，孔的蝕刻和幾何形狀的圖案可以采用各種不同的形狀和大小。具有這種結(jié)構(gòu)特征的特別有用的基底是可以選擇固體支持物顆粒如微球的大小的圖案化基底。具有這些特征的例示化基底是與beadarray技術(shù)(illumina，inc.，sandiego，calif)結(jié)合使用的蝕刻基底。其它實例描述于美國專利no.6,770,441，其通過引用并入本文。

陣列是指可以根據(jù)相對位置彼此區(qū)分的位點群體。位于陣列不同位點的不同分子可以根據(jù)陣列中位點的位置彼此區(qū)分。陣列的單個位點可以包括一種或多種特定類型的分子。例如，位點可以包括具有特定序列的單靶多核苷酸分子，或者位點可以包括具有相同序列(和/或其互補序列)的幾個核酸分子。陣列的位置可以是位于同一基底上的不同特征。例示性特征包括但不限于基底中的孔，基底中或基底上的珠(或其它顆粒)、從基底的突起、在基底上的脊或基底中的通道。陣列的位點可以是分別的基底，每個都帶有不同的分子?？梢愿鶕?jù)與基底結(jié)合的表面上的基底位置或根據(jù)在液體或凝膠中的基底位置來鑒定附著到分離基底的不同分子。分離的基底位于表面上的例示性陣列包括但不限于在孔中具有珠的那些。

如本文所用，術(shù)語“微球”或“珠”或“顆?！被虮疚闹械恼Z法等同物是指小的離散顆粒。合適的珠組合物包括但不限于塑料，陶瓷，玻璃，聚苯乙烯，甲基苯乙烯，丙烯酸聚合物，順磁材料，氧化釷溶膠，碳石墨，二氧化鈦，膠乳或交聯(lián)葡聚糖如sepharose，纖維素，尼龍，交聯(lián)膠束和teflon，以及本文概述的固體支持物的任何其它材料都可以使用。來自bangslaboratories，fishersind.的“microspheredetectionguide”是一個有用的指南。在某些實施方案中，微球是磁性微球或珠。

如本文所用，術(shù)語“多個”旨在表示兩個或更多個不同成員的群體。多個的大小范圍可以從小、中等、大到非常大。較小大小的多個的范圍可以是例如從幾個成員到數(shù)十個成員。中等大小的多個的范圍可以例如從數(shù)十個成員到大約100個成員或數(shù)百個成員。例如，較大的多個可以從大約數(shù)百個成員到約1000個成員，至數(shù)千個成員且直至幾萬個成員。非常大的多個的范圍可以從數(shù)萬個成員到幾十萬，一百萬，數(shù)百萬，數(shù)千萬，甚至大于數(shù)億個成員。因此，多個的大小范圍可以在兩個到完全超過1億個成員以及在上述例示性范圍之間和大于上述例示性范圍的所有大小，如通過成員的數(shù)目測量。微陣列中的特征的例示性數(shù)目包括在1.28cm²內(nèi)多個約500,000或更多個離散特征。例示性核酸多個包括例如約1×10⁵，5×10⁵和1×10⁶或更多不同核酸種類的群體。因此，術(shù)語的定義旨在包括大于2的所有整數(shù)值。本發(fā)明的多個上限可以例如通過本發(fā)明的核酸樣品中的核苷酸序列的理論多樣性來設(shè)定。

如本文所用，當(dāng)涉及多核苷酸使用時，術(shù)語“固定化”旨在表示通過共價或非共價鍵直接或間接附著至固體支持物。在本發(fā)明的某些實施方案中，可以使用共價連接，但是所需要的全部是多核苷酸在期望使用載體的條件下保持靜止或附著到支持物，例如在需要核酸擴增和/或測序的應(yīng)用中。用作捕捉引物或擴增引物的寡核苷酸可以是固定化的，使得3'-末端可用于酶促延伸，并且該序列的至少一部分能夠與互補序列雜交。固定化可以通過與表面附著的寡核苷酸的雜交發(fā)生，在這種情況下，固定化的寡核苷酸或多核苷酸可以是3'-5'取向?；蛘?，固定化可以通過除堿基配對雜交以外的方法發(fā)生，例如上述共價附著。

如本文所用，術(shù)語“多核苷酸”旨在表示核糖核酸或脫氧核糖核酸或其類似物，包括在任何上下文中呈現(xiàn)的多核苷酸分析物；例如探針，靶物或引物。本發(fā)明的多核苷酸的特定形式包括在生物體中發(fā)現(xiàn)的所有類型的核酸，以及合成核酸，例如通過化學(xué)合成產(chǎn)生的多核苷酸。適用于通過摻入通過本發(fā)明方法產(chǎn)生的微陣列進行分析的核酸的特定實例包括基因組dna(gdna)，dna復(fù)制的信使rna(cdna)，rna復(fù)制的信使rna(crna)，線粒體dna或基因組，rna，信使rna(mrna)和/或其它rna群體。多核苷酸的另外的實例包括雙鏈dna(dsdna)，單鏈dna(ssdna)，基因或基因片段(例如，探針，引物，表達(dá)序列標(biāo)簽(est)或基因表達(dá)連續(xù)分析(sage)標(biāo)簽)，基因組dna，外顯子，內(nèi)含子，轉(zhuǎn)移rna(trna)，核糖體rna(rrna)，核酶，重組多核苷酸，合成多核苷酸，支鏈多核苷酸，質(zhì)粒，載體，任何序列的分離的dna，任何序列的分離的rna或任何前述物質(zhì)的擴增拷貝。上述例示性核酸的片段和/或部分也包括在該術(shù)語的含義內(nèi)，如其在本文中使用。

術(shù)語“核酸”，“多核苷酸”和“寡核苷酸”在本文中可互換使用。除非另有特別說明，否則不同的術(shù)語并不旨在表示大小，序列或其它特性中的任何特定差異。為了描述的清楚，當(dāng)描述包括幾種核酸種類的特定方法或組合物時，術(shù)語可用于區(qū)分一種核酸與另一種。

如本文所用，當(dāng)涉及多核苷酸使用時，術(shù)語“雙鏈”是指多核苷酸的互補鏈之間的一些或全部核苷酸是氫鍵鍵合在一起的，以形成部分或完全雙螺旋。部分雙鏈多核苷酸可具有與互補核苷酸鍵合鍵合的至少10％，25％，50％，60％，70％，80％，90％或95％的其核苷酸。

單鏈多核苷酸是指與另一多核苷酸幾乎沒有或沒有氫鍵的多核苷酸，使得雙螺旋未形成或在給定的一組雜交條件下不穩(wěn)定。

如本文所用，術(shù)語“靶多核苷酸”旨在表示作為分析，作用，詢問或使用的對象的多核苷酸。分析，作用或詢問包括對靶多核苷酸進行例如用于核酸詢問的復(fù)制，擴增，測序和/或其它程序。分析或使用還可以包括使用靶多核苷酸作為系統(tǒng)中的組分來分析，執(zhí)行動作或詢問其它分子實體。組件可以是結(jié)構(gòu)或功能的。靶多核苷酸可以包括待分析或使用的靶序列額外的核苷酸序列。例如，靶多核苷酸可以包括一個或多個銜接頭，包括用作引物結(jié)合位點的銜接頭，其在待在系統(tǒng)中分析或使用的靶多核苷酸序列的側(cè)翼。與捕獲寡核苷酸或捕捉引物雜交的靶多核苷酸可以含有以下述方式延伸超過捕獲寡核苷酸的5'或3'末端，使得不是所有的靶多核苷酸都適合于延伸的核苷酸。在具體實施方案中，如下文更詳細(xì)地闡述的，多個靶多核苷酸包括其靶多核苷酸序列不同，但具有對于兩種或更多種不同種類相同的銜接頭的不同種類?？梢晕挥谔囟ò卸嗪塑账嵝蛄袀?cè)翼的兩個銜接頭可以具有相同的序列，或者兩個銜接頭可以具有不同的序列。因此，多個不同的靶多核苷酸可以在靶多核苷酸序列的每個末端具有相同的銜接頭序列或兩個不同的銜接頭序列。因此，多個靶多核苷酸中的種類可以包括將通過例如測序來評估的未知序列的區(qū)域側(cè)翼的已知序列區(qū)域。此外，多個靶多核苷酸可以是相同的種類或不同種類，并且可以包括將被用作系統(tǒng)中的組分的已知序列的區(qū)域側(cè)翼的已知序列區(qū)域。在靶多核苷酸在單一末端處攜帶銜接頭的情況下，銜接頭可以位于靶多核苷酸的3'末端或5'末端。靶多核苷酸可以在沒有任何銜接頭的情況下使用，在這種情況下，引物結(jié)合序列可以直接來自靶多核苷酸中發(fā)現(xiàn)的序列。

如本文所用，術(shù)語“靶分子”旨在表示作為分析，作用，詢問或使用的對象的任何分子。分析，作用或詢問包括使分子進行例如測序，結(jié)合測定，親和力測量，催化測量，底物或產(chǎn)物特異性和其它分子測定。分析或使用還可以包括使用靶分子作為系統(tǒng)中的組分來分析，執(zhí)行動作或詢問其它分子實體。組分可以是結(jié)構(gòu)或功能的。例如，靶分子可以是用于核酸的納米孔測序的納米孔。適用于納米孔測序的其它靶分子包括例如解旋酶和聚合酶。靶分子的其它例示性分析或用途包括例如分子結(jié)合親和篩選，酶篩選，化合物篩選和其中期望確定或測量分子相互作用的所有其它測定。因此，靶分子可以是分析，作用或詢問的主題，或者可以用于分析，執(zhí)行動作或詢問其它分子。例示性的靶分子包括例如生物聚合物，包括多肽，多核苷酸或多糖，氨基酸，核苷酸，單糖，二糖，其它碳水化合物，受體，半抗原，配體，抗原，分析物，小分子有機化合物或無機化合物，維生素，代謝物，抗氧化劑，免疫抑制劑，抗癌藥物或其任何組合。

另外，應(yīng)當(dāng)理解，靶分子可以以任何數(shù)目的方式附著到多肽(靶多肽)上。例如，靶分子可以使用本領(lǐng)域已知并在此描述的綴合化學(xué)技術(shù)進行附著。有利的綴合化學(xué)種類包括在相對溫和的條件下進行的化學(xué)反應(yīng)。這些包括但不限于親核取代(例如，胺和醇與?；u化物，活性酯的反應(yīng))，親電取代(例如烯胺反應(yīng))和對碳-碳和碳-雜原子多鍵的添加(例如，邁克爾(michael)反應(yīng)，diels-alder加成)。這些和其它有用的反應(yīng)在例如march,advancedorganicchemistry,3rded.,johnwiley&sons,newyork,1985；hermanson,bioconjugatetechniques,academicpress,sandiego,1996；以及feeneyetal.,modificationofproteins；advancesinchemistryseries,vol.198,americanchemicalsociety,washington,d.c.,1982中討論。

可用于綴合化學(xué)技術(shù)的例示性反應(yīng)性官能團包括羧基(例如，n-羥基琥珀酰亞胺酯，n-羥基苯并三唑酯，酸鹵化物，?；溥?，硫酯，對硝基苯基酯，烷基，烯基，炔基和芳族酯)；羥基(即轉(zhuǎn)化為例如酯，醚或醛)；鹵代烷基；親雙烯體(例如diels-alder反應(yīng))；醛基；酮基；磺?；话坊?；烯烴(即環(huán)加成和邁克爾加成)；環(huán)氧化物；亞磷酰胺基團；膦基；疊氮基(即用于點擊化學(xué))；和硫醇基團。此類反應(yīng)性基團可以在靶分子或多肽上進行官能化。

在一個說明性實施方案中，半胱氨酸殘基的還原硫醇(-sh)基團(即巰基)可以與具有硫醇-反應(yīng)性基團的系鏈反應(yīng)。這些基團的實例包括馬來酰亞胺和碘乙酰胺。初級硫醇反應(yīng)試劑，包括碘乙酰胺，馬來酰亞胺，芐基鹵化物和溴甲基酮可以通過硫醇的s-烷基化反應(yīng)，以產(chǎn)生穩(wěn)定的硫醚產(chǎn)物；芳基化試劑如7-硝基苯并-2,1,3-氧代二唑(7-nitrobenz-2,1,3-oxadiazole，nbd)鹵化物可以與硫醇或胺反應(yīng)，通過親核試劑對芳族鹵化物的類似取代進行；并且由于硫醇鹽陰離子是比中性硫醇更好的親核試劑，半胱氨酸在其pka以上更具反應(yīng)性。另外的巰基反應(yīng)性化學(xué)基團包括鹵代乙?；?，馬來酰亞胺，氮丙啶(zairidines)，丙烯酰基，芳基化劑，乙烯基砜，吡啶基二硫化物，tnb-硫醇(2-硝基-5-硫代苯甲酸)和二硫化物還原劑。此類基團可以通過烷基化(例如通過形成硫醚鍵)或二硫鍵交換(例如形成二硫鍵)與巰基偶聯(lián)。也可以適當(dāng)使用巰基交換反應(yīng)。

或者，胺(-nh2)可以是靶向的。例如，賴氨酸殘基的伯胺和多肽n-末端是相對反應(yīng)的。胺殘基可以用可形成穩(wěn)定酰胺鍵的n-羥基琥珀酰亞胺酯(nhs酯)或可與伯胺反應(yīng)形成脒鍵的亞氨酸酯(imidoester)交聯(lián)劑進行靶向。有許多其它胺反應(yīng)性化合物。例如，可以與伯胺形成化學(xué)鍵的合成化學(xué)基團包括異硫氰酸酯，異氰酸酯，?；B氮化物，nhs酯，磺酰氯，醛，乙二醛，環(huán)氧化物，環(huán)氧乙烷，碳酸酯，芳基鹵化物，亞氨酸酯，碳二亞胺，酸酐和氟代苯酯；此類基團可以與胺結(jié)合，例如通過?；蛲榛?。

在其它實施方案中，修飾的靶分子可以用于引入與點擊化學(xué)一起使用的新型官能性，如疊氮化物或炔烴。例如，如上所述的硫醇或胺反應(yīng)性可以與允許添加疊氮化物或炔屬官能團的接頭一起使用，以進一步用于點擊化學(xué)反應(yīng)。

創(chuàng)建在圖案化表面上間隔開的單分子陣列的能力包括許多特征以及用于化學(xué)和生物傳感的應(yīng)用。單分子陣列的一個特征包括受到檢測約束的填充密度的優(yōu)化。可以使用標(biāo)準(zhǔn)光學(xué)檢測進行檢測。對于標(biāo)準(zhǔn)光學(xué)檢測，分子間間隔可以為約500nm(例如，檢測光的波長的順序)。可以使用諸如例如cmos芯片上的電子讀出的電子讀出來執(zhí)行檢測。

電子讀出(例如在cmos芯片上)的單分子的間隔可以使得單分子占據(jù)約1至約15um的大小。電子讀出(例如在cmos芯片上)的單分子的間隔可以使得單分子占據(jù)約1至約12um的大小。電子讀出(例如在cmos芯片上)的單分子的間隔可以使得單分子占據(jù)約1至約10um的大小。電子讀出(例如在cmos芯片上)的單分子的間隔可以使得單分子占據(jù)約1至約9um的大小。電子讀出(例如在cmos芯片上)的單分子的間隔可以使得單分子占據(jù)約1至約8um的大小。電子讀出(例如在cmos芯片上)的單分子的間隔可以使得單分子占據(jù)約1至約7um的大小。電子讀出(例如在cmos芯片上)的單分子的間隔可以使得單分子占據(jù)約1至約6um的大小。電子讀出(例如在cmos芯片上)的單分子的間隔可以使得單分子占據(jù)約1至約5um的大小。電子讀出(例如在cmos芯片上)的單分子的間隔可以使得單分子占據(jù)約1至約4um的大小。電子讀出(例如在cmos芯片上)的單分子的間隔可以使得單分子占據(jù)約1至約3um的大小。電子讀出(例如在cmos芯片上)的單分子的間隔可以使得單分子占據(jù)約1um的大小。電子讀出(例如在cmos芯片上)的單分子的間隔可以使得單分子占據(jù)約2um的大小。電子讀出(例如在cmos芯片上)的單分子的間隔可以使得單分子占據(jù)約3um的大小。電子讀出(例如在cmos芯片上)的單分子的間隔可以使得單分子占據(jù)約4um的大小。電子讀出(例如在cmos芯片上)的單分子的間隔可以使得單分子占據(jù)約5um的大小。電子讀出(例如在cmos芯片上)的單分子的間隔可以使得單分子占據(jù)約6um的大小。電子讀出(例如在cmos芯片上)的單分子的間隔可以使得單分子占據(jù)約7um的大小。電子讀出(例如在cmos芯片上)的單分子的間隔可以使得單分子占據(jù)約8um的大小。電子讀出(例如在cmos芯片上)的單分子的間隔可以使得單分子占據(jù)約9um的大小。電子讀出(例如在cmos芯片上)的單分子的間隔可以使得單分子占據(jù)約10um的大小。電子讀出(例如在cmos芯片上)的單分子的間隔可以使得單分子占據(jù)約11um的大小。電子讀出(例如在cmos芯片上)的單分子的間隔可以使得單分子占據(jù)約12um的大小。電子讀出(例如在cmos芯片上)的單分子的間隔可以使得單分子占據(jù)約13um的大小。電子讀出(例如在cmos芯片上)的單分子的間隔可以使得單分子占據(jù)約14um的大小。電子讀出(例如在cmos芯片上)的單分子的間隔可以使得單分子占據(jù)約15um的大小。在實施方案中，單分子占據(jù)約單個像素(例如1-10um的大小)。

單分子傳感器可以用于多種應(yīng)用，包括但不限于使用抗體等的dna測序，化學(xué)感測和蛋白質(zhì)/抗原測定等。在實施方案中，單個聚合酶分子可用于在dna序列中實時測序dna。在其它實施方案中，可以使用基于納米孔的dna測序，其中雙層中單個納米孔的放置可用于產(chǎn)生可解釋數(shù)據(jù)。

如本文所用，術(shù)語“擴增子”當(dāng)用于提及核酸時，意指將核酸復(fù)制的產(chǎn)物，其中產(chǎn)物具有與復(fù)制核酸的核苷酸序列的至少一部分相同或互補的核苷酸序列。可以通過使用核酸或其擴增子作為模板的各種擴增方法中的任一種來產(chǎn)生擴增子，包括例如重組酶聚合酶擴增，動力學(xué)排除擴增，聚合酶延伸，聚合酶鏈反應(yīng)(pcr)，滾環(huán)擴增(rca)，連接延伸或連接鏈反應(yīng)。擴增子可以是具有特定核苷酸序列(例如pcr產(chǎn)物)的單拷貝或核苷酸序列的多個拷貝(例如rca的連環(huán)化產(chǎn)物)的核酸分子。靶核酸的第一擴增子可以是互補拷貝。隨后的擴增子是在靶多核苷酸或第一擴增子產(chǎn)生第一擴增子后產(chǎn)生的拷貝。隨后的擴增子可以具有與靶多核苷酸基本上互補的或與靶多核苷酸基本上相同的序列。

可以通過適當(dāng)修飾擴增反應(yīng)來調(diào)節(jié)可產(chǎn)生的模板拷貝或擴增子的數(shù)目，包括例如改變擴增循環(huán)運行的次數(shù)，在擴增反應(yīng)中使用不同可持續(xù)性的聚合酶和/或變化擴增反應(yīng)運行的時間長度以及本領(lǐng)域已知的影響擴增產(chǎn)率的其它條件的修飾。核酸模板的拷貝數(shù)可以是至少1,10,100,200,500,1000,2000,3000,4000,5000,6000,7000,8000,9000和10,000個拷貝，并且可以根據(jù)具體應(yīng)用變化。

當(dāng)用于提及擴增子或多個擴增子時，術(shù)語“克隆”旨在表示就特定核苷酸序列而言同質(zhì)的核酸群體。同質(zhì)的序列可以是至少10個核苷酸長，或更長，例如至少50,100,250,500或1000個核苷酸長。克隆群體可以衍生自單個靶多核苷酸或模板核酸。克隆群體中的基本上所有核酸都具有相同的核苷酸序列。應(yīng)當(dāng)理解，克隆群體中可以發(fā)生少量突變(例如由于擴增偽影)而不脫離克隆性。

如本文所用，術(shù)語“捕捉引物”旨在表示具有核苷酸序列的寡核苷酸，該核苷酸序列能夠特異性退火到待分析或經(jīng)受在例如擴增或測序反應(yīng)的引物退火步驟中遇到的條件下的核酸詢問的單鏈多核苷酸序列。該術(shù)語還旨在表示具有能夠?qū)τ糜诜治?，詢問另一分子實體或?qū)α硪环肿訉嶓w進行作用的單鏈多核苷酸序列特異性退火的核苷酸序列的寡核苷酸。

如本文所用，當(dāng)提及捕捉引物或其它寡核苷酸使用時，術(shù)語“靶物特異性”旨在表示捕捉引物或其它寡核苷酸，其包括對靶多核苷酸序列特異性的核苷酸序列，即能夠選擇性退火到靶多核苷酸的鑒定區(qū)的核苷酸序列。靶物特異性捕捉引物可以具有單種寡核苷酸，或者它可以包括具有不同序列的兩種或更多種。因此，靶物特異性捕捉引物可以是兩個或更多個序列，包括3,4,5,6,7,8,9或10個或更多個不同的序列。靶物特異性捕獲寡核苷酸可以包括靶物特異性捕捉引物序列和通用捕捉引物序列。其它序列如測序引物序列等也可以包括在靶物特異性捕捉引物中。

相比之下，當(dāng)提及捕捉引物或其它寡核苷酸序列使用時，術(shù)語“通用”旨在表示捕捉引物或在多個捕捉引物中具有共同核苷酸序列的其它寡核苷酸。共同序列可以是例如與相同銜接頭序列互補的序列。通用捕捉引物適用于詢問多個不同的多核苷酸，而不必區(qū)分不同的種類，而靶物特異性捕捉引物適用于區(qū)分不同的種類。

本公開提供了基底，包括：(a)固定化到所述基底上的特征的多個第一和第二捕捉引物；(b)至少一個靶多核苷酸，一個末端附著到所述捕捉引物之一而另一個末端與靶分子連接，其中所述靶多核苷酸包含側(cè)翼有與所述第一和第二捕捉引物互補的第一和第二捕捉引物結(jié)合區(qū)的靶區(qū)域，所述第二捕捉引物結(jié)合區(qū)包含與所述第二捕捉引物的堿基對錯配，并且(c)與固定化到所述特征的所述靶多核苷酸互補的多個克隆擴增子。

在一個實施方案中，本公開的基底可以包含定位于基底上的位點的至少一個單分子。用于單分子分析和/或詢問的實施方案，本公開的基底將具有定位到基底上的位點的單一靶分子。單一靶分子可以使用例如本文所述的方法和分子成分定位于基底上的一個或多個位點。

用于定位單一靶分子的基底可以包括先前描述的那些材料和形式，以及本領(lǐng)域公知的其它材料和形式。例如，在一些實施方案中，基底可以是可以附著生物分子(包括例如多核苷酸)的任何不溶性固體支持物，半固體支持物或基質(zhì)。例示性固體支持物包括玻璃，改性玻璃，官能化玻璃，無機玻璃，微球(例如惰性和/或磁性顆粒)，塑料，多糖，尼龍，硝化纖維素，陶瓷，樹脂，二氧化硅，基于二氧化硅的材料，碳，金屬，光纖或光纖束，聚合物和多孔(例如微量滴定板)。例示性塑料包括丙烯酸樹脂，聚苯乙烯，苯乙烯和其它材料的共聚物，聚丙烯，聚乙烯，聚丁烯，聚氨酯和teflon^tm。例示性的基于二氧化硅的材料包括硅，包括硅晶片和各種形式的改性硅?？捎米骰椎钠渌腆w支持物包括例如乳膠珠，葡聚糖珠，聚丙烯酰胺凝膠，金表面，氮化硅表面或金屬氧化物表面。

在一些實施方案中，表面可以是任何期望的形狀，包括例如適用于如本文所述的單分子放置的平面，球形或多孔材料。例如，固體支持體可以是平面玻璃表面。

在具體的實施方案中，基底可以在諸如孔，管，通道，比色皿，培養(yǎng)皿，瓶等的容器內(nèi)或容器的部分內(nèi)，以允許與各種試劑的溶液相互作用。特別有用的容器是流動池，例如如us2010/01111768a1或bentleyetal，nature456:53-59(2008)中所述。例示性流動池包括可從illumina，inc.(sandiego，ca)商購的那些。另一個特別有用的容器是在多孔板或微量滴定板中的孔。

在一些實施方案中，用于定位至少一種靶分子的基底上的位點可以是特征。如上所述和下文所述，特征可以以各種期望的格式的任何一種存在。例如，特征可以是孔，坑(pit)，通道，脊，隆起區(qū)域，釘(peg)，柱等。如前所述，特征可以是珠或可以含有珠。

在具體的實施方案中，特征不需要包含珠或顆粒。例示性特征包括存在于基底中的孔，所述基底用于例如由454lifesciences(roche子公司，baselswitzerland)或iontorrent(lifetechnologies子公司，carlsbadcalifornia)出售的商業(yè)測序平臺中使用。具有孔的其它基底包括例如us6,266,459；us6,355,431；us6,770,441；us6,859,570；us6,210,891；us6,258,568；us6,274,320；us2009/0026082a1；us2009/0127589a1；us2010/0137143a1；us2011/0282617a1或pct公開號wo00/63437中描述的蝕刻光纖和其它基底。在幾種情況下，對于使用孔中的珠的應(yīng)用，在這些參考文獻中例示了基底。在本公開的組合物中，可以與或不與珠一起使用含有孔的基底。

在一些實施方案中，基底的孔可以包括如美國臨時申請no61/769,289中列出的凝膠材料，其通過引用并入本文。

在一個實施方案中，特征可以是非金屬表面上的金屬特征，例如上面例示的玻璃，塑料或其它材料。金屬層可以使用本領(lǐng)域已知的方法沉積在表面上，例如濕等離子體蝕刻，干等離子體蝕刻，原子層沉積，離子束蝕刻，化學(xué)氣相沉積，真空濺射等?？梢赃m當(dāng)?shù)厥褂酶鞣N商業(yè)儀器中的任何一種，包括例如或系統(tǒng)(oxfordinstruments，uk)。金屬層也可以通過電子束蒸發(fā)或濺射沉積，如thornton,ann.rev.mater.sci.7:239-60(1977)中列出。金屬層沉積技術(shù)(如上面例示的那些)可以例如與光刻技術(shù)組合以在表面上產(chǎn)生金屬區(qū)域或貼片。用于組合金屬層沉積技術(shù)和光刻技術(shù)的例示性方法在美國序列號us13/492,661中描述。

本公開的基底可以固定化到在基底上的特征上的第一和第二捕捉引物。第一和第二捕捉引物可以是多個第一捕捉引物和多個第二捕捉引物。在一些實施方案中，第一和第二捕捉引物可以針對靶多核苷酸的不同序列，因此對靶多核苷酸的不同區(qū)域表現(xiàn)出特異性。在其它實施方案中，第一和第二捕捉引物可以針對不同的靶多核苷酸。

圖2中描繪了例示性的基底。如圖2中所示，基底(201)可以包含多個第一捕捉引物(202,203,204)和多個第二捕捉引物(205,206，207)?；?201)還可以包含靶多核苷酸(208)，其在一端附著到捕捉引物(202)?；?201)還可以包含靶多核苷酸(208)的擴增子(210,211,212,213和214)。另外，基底(201)可以包含附著于靶多核苷酸(208)的靶分子(209)。

在一個實施方案中，本公開提供了包括第一特征的基底，其中第一特征包括(a)多個第一捕捉引物；(b)多個第二捕捉引物；和(c)靶多核苷酸，其中：(i)靶多核苷酸是雙鏈的；(ii)靶多核苷酸包括第二捕捉引物結(jié)合區(qū)；(iii)第二捕捉引物結(jié)合區(qū)包含至少一個核苷酸錯配；和(iv)第二捕捉引物結(jié)合區(qū)的一條鏈?zhǔn)堑诙蹲揭Y(jié)物的反向互補物，而第二捕捉引物結(jié)合區(qū)的另一條鏈與第二捕捉引物小于100％相同。第二捕捉引物結(jié)合區(qū)可以含有兩個以上的核苷酸錯配。第二捕捉引物結(jié)合區(qū)可以含有三個以上的核苷酸錯配。第二捕捉引物結(jié)合區(qū)可能含有四個以上的核苷酸錯配。靶多核苷酸可以進一步包含一個或多個另外的捕捉引物結(jié)合區(qū)。靶多核苷酸還可以包括可以與第一捕捉引物雜交的第一捕捉引物結(jié)合區(qū)。第一個捕捉引物結(jié)合區(qū)可以以100％的互補性與第一個捕捉引物雜交。例如，第一捕捉引物結(jié)合區(qū)可以包含與第一捕捉引物的100％核苷酸匹配。第一特征可以進一步包含多個擴增子。多個擴增子可以包含靶多核苷酸的擴增子。第一特征可以進一步包括靶分子。靶分子可以附著到靶多核苷酸。第一特征可以進一步包含一個或多個另外的靶分子。一個或多個另外的靶分子可以懸浮于特征內(nèi)的捕捉引物，靶多核苷酸或擴增子?；蛘呋蛄硗?，一個或多個另外的靶分子不附著或固定到特征上。一個或多個另外的靶分子可以在特征中的溶液中。基底可以進一步包括一個或多個另外的特征。一個或多個另外的特征可以包括多個第一捕捉引物，多個第二捕捉引物，靶多核苷酸，靶分子，多個擴增子或其組合。

兩個或更多個捕捉引物可以任何比率存在于特征中。例如，多個第一捕捉引物和多個第二捕捉引物可以以相等的量或以任何其它比率，例如摩爾比存在。特征可以具有相對于第二捕捉引物過量大于1.1x，大于1.2x，大于1.3x，大于1.4x，大于1.5x，大于2.0x，大于2.5x，大于3.0x，大于5.0x，大于10x，大于15x，大于20x，大于20x，大于25x，大于30x，大于50x，大于100x，大于300x，大于500x，或大于1,000x的第一捕捉引物。在使用多個特征的實施方案中，如例如在微陣列中，不同的特征可以具有兩個或更多個捕捉引物的相同比率或不同的比率。

捕捉引物可以包括一個或多個捕捉區(qū)域。捕捉引物區(qū)可以包括例如通用捕獲區(qū)，測序引物結(jié)合位點(sbs)，靶物特異性捕獲區(qū)，預(yù)定的切割位點，如限制性位點和接頭區(qū)，例如，分離捕捉引物的兩個或更多個區(qū)域的接頭區(qū)域。一些捕捉引物可以包括例如通用捕捉區(qū)域和sbs。其它捕捉引物可以包括通用捕捉區(qū)域和靶物特異性捕捉區(qū)域。其它捕捉引物可以包括例如通用捕捉區(qū)域，sbs和靶物特異性區(qū)域。捕捉引物可以在3'末端處封閉(3'封閉)或在3'末端處未封閉(3’未封閉)。具有封閉的3'-末端的引物例如可以在酶或化學(xué)反應(yīng)中解封閉。捕捉引物也可以包括預(yù)定(非隨機)切割位點。例示性的預(yù)定切割位點例如在美國專利號8,715,966b2中描述。在預(yù)定位點處的切割可以發(fā)生，例如，作為酶切割或非酶切割，如使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法的化學(xué)切割。鑒于本文提供的教導(dǎo)和指導(dǎo)，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，捕捉引物可以包含在一個或多個應(yīng)用中有用的任何數(shù)目的不同區(qū)域。

通用捕獲區(qū)可以是在多個捕捉引物中作為共同序列包括的任何已知或預(yù)定的核苷酸序列。通常，通用捕捉區(qū)域?qū)⒆銐蜷L以在不同序列的群體中具有獨特的核苷酸序列，如基因組中包含的不同核苷酸序列的數(shù)目。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，鑒于靶群體的序列多樣性，通用捕捉區(qū)域的何種長度足以是獨特的。

通用捕捉區(qū)域可以從頭設(shè)計，或者可以從本領(lǐng)域熟知的來源獲得。例如，通用捕捉引物或與這種通用捕捉引物特異性雜交的區(qū)域可從商業(yè)來源獲得。兩個典型的通用捕捉引物包括例如核苷酸序列5'-aatgatacggcgaccaccga-3'和5'-caagcagaagacggcatacga-3'(分別為p5和p7,illumina，sandiego，ca)。與上述捕獲引物特異性雜交的區(qū)域可以包括例如對應(yīng)于5'-tcggtggtcgccgtatcatt-3'或5'-tcgtatgccgtcttctgcttg-3'的反向互補序列(分別為p5'和p7'，illumina，sandiego，ca)。

與通用捕獲區(qū)一樣，sbs可以是足夠長度以與互補測序引物進行特異性退火的任何已知或設(shè)計的序列。例示性的sbs包括例如核苷酸序列5'-acactctttccctacacgacgctcttccgatct-3'和5'-cggtctcggcattcctgctgaaccgctcttccgatct-3'(分別為sbs3和sbs8，illumina，sandiego，ca)。與上述sbs特異性雜交的區(qū)域可以包括例如對應(yīng)于5'-agatcggaagagcgtcgtgtagggaaagagtgt-3'和5'-agatcggaagagcggttcagcaggaatgccgagaccg-3'(分別為“sbs3”和“sbs81”的方向互補序列，illumina，sandiego，ca)。

如前所述，捕捉引物可以具有區(qū)域的任何組合，例如上述例示的p5，p7，sbs3或sbs8引物區(qū)或其互補序列(例如，p5'，p7'sbs3'或sbs8')的任何組合。上述特定序列的例示性組合包括例如組合，例如p5-sbs3，p5-sbs8，p7-sbs8和p7-sbs3，其互補序列或其組合。

固定化到特征的第一和第二捕捉引物可以包括任何捕捉區(qū)域或捕捉區(qū)域的任何組合。例如，第一捕捉引物可以包括第一通用捕捉區(qū)域，并且第二捕捉引物可以包括相同的通用捕捉區(qū)域或第二通用捕捉區(qū)域。第一和第二捕捉引物可進一步包括相同或不同的sbs。例如，第一捕捉引物可以包括第一通用捕捉引物區(qū)域和第一sbs，而第二捕捉引物可以包括第二通用捕捉區(qū)域和第二sbs。

例如，在一些實施方案中，第一捕捉引物包括p5引物核苷酸序列，而第二捕捉引物包括p7引物核苷酸序列。

在其它實施方案中，第一捕捉引物包括p5引物核苷酸序列和sbs3引物核苷酸序列，而第二捕捉引物包括p7引物核苷酸序列和sbs8引物核苷酸序列。在其它實施方案中，第一捕捉引物包括p5引物核苷酸序列和sbs8引物核苷酸，而第二捕捉引物包括p7引物核苷酸序列和sbs3引物核苷酸序列。

固定化到基底上的特征的捕捉引物可以是多個捕捉引物。在一些實施方案中，特征可以具有單一多個捕捉引物，如當(dāng)需要引物延伸反應(yīng)時或當(dāng)多核苷酸的擴增在兩端使用相同的捕捉引物結(jié)合區(qū)時。在其它實施方案中，特征可以具有多個第一捕捉引物和多個第二捕捉引物。另外，除了多個第一和第二捕捉引物之外，基底上的特征也可以具有多個捕捉引物。例如，在某些實施方案中，基底上的特征可以包括多個第三，第四，第五和/或第六或更多捕捉引物。包括多個捕捉引物的數(shù)目將取決于應(yīng)用。例如，在某些實施方案中，可以期望使用多個第一和第二捕捉引物執(zhí)行第一橋接擴增，然后使用多個第三和第四捕捉引物執(zhí)行第二橋接擴增。在此類實施方案中，靶多核苷酸對于第一，第二，第三和第四捕捉引物中的每個將具有捕捉引物結(jié)合區(qū)。鑒于本文提供的教導(dǎo)和指導(dǎo)，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解使用給定特定應(yīng)用或期望構(gòu)造的多個捕捉引物和相應(yīng)的捕捉引物結(jié)合區(qū)域的數(shù)目。

多個可以是兩個或更多個成員的群體。在一些實施方案中，多個是兩個或多個不同多核苷酸或其它參考分子，例如捕捉引物或靶分子的群體。在其它實施方案中，多個是兩個或更多個相同成員(例如多核苷酸或其它參考分子，如捕捉引物，靶多核苷酸或靶分子)的群體?；蛘呋蛄硗猓鄠€可以是兩個或更多個相似成員(例如，多核苷酸或其它參考分子，例如捕捉引物，靶多核苷酸或靶分子)的群體。因此，除非另有明確說明，否則術(shù)語“多個”與群體同義使用。

在一些實施方案中，多個是群體的2,3,4,5,6,7,8,9,10,20,30,40,50,60,70,80,90或100或更多不同成員。在其它實施方案中，多個是200,300,400,500,1000,5000,10000,50000,1x10⁵,2x10⁵,3x10⁵,4x10⁵,5x10⁵,6x10⁵,7x10⁵,8x10⁵,9x10⁵,1x10⁶,2x10⁶,3x10⁶,4x10⁶,5x10⁶,6x10⁶,7x10⁶,8x10⁶,9x10⁶或1x10⁷或更多不同成員。

在一些實施方案中，多個是群體的2,3,4,5,6,7,8,9,10,20,30,40,50,60,70,80,90或100或更多相似的成員。在其它實施方案中，多個是200,300,400,500,1000,5000,10000,50000,1x10⁵,2x10⁵,3x10⁵,4x10⁵,5x10⁵,6x10⁵,7x10⁵,8x10⁵,9x10⁵,1x10⁶,2x10⁶,3x10⁶,4x10⁶,5x10⁶,6x10⁶,7x10⁶,8x10⁶,9x10⁶或1x10⁷或更多相似的成員。

在一些實施方案中，多個是群體的2,3,4,5,6,7,8,9,10,20,30,40,50,60,70,80,90或100或更多相同的成員。在其它實施方案中，多個是200,300,400,500,1000,5000,10000,50000,1x10⁵,2x10⁵,3x10⁵,4x10⁵,5x10⁵,6x10⁵,7x10⁵,8x10⁵,9x10⁵,1x10⁶,2x10⁶,3x10⁶,4x10⁶,5x10⁶,6x10⁶,7x10⁶,8x10⁶,9x10⁶或1x10⁷或更多相同的成員。

在一些實施方案中，多個是群體的不同和相似成員的混合物。在其它實施方案中，多個是群體的不同和相同成員的混合物。在一些實施方案中，多個中的群體的至少1％,2％,3％,4％,5％,6％,7％,8％,9％,10％,15％,20％,25％,30％,35％,40％,45％,50％,55％,60％,65％,70％,75％,80％,85％,90％或95％或更多的成員是相同的。在一些實施方案中，多個中的群體的至少10％成員是相同的。在一些實施方案中，多個中的群體的至少20％成員是相同的。在一些實施方案中，多個中的群體的至少30％成員是相同的。

在一些實施方案中，多個中的群體的至少1％,2％,3％,4％,5％,6％,7％,8％,9％,10％,15％,20％,25％,30％,35％,40％,45％,50％,55％,60％,65％,70％,75％,80％,85％,90％或95％或更多個成員是不同的。在一些實施方案中，在一些實施方案中，多個中的群體的至少10％成員是不同的。在一些實施方案中，多個中的群體的至少20％成員是不同的。在一些實施方案中，多個中的群體的至少30％成員是不同的。

在一些實施方案中，多個中的群體的至少2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,20,25,30,35,40,45,50,55,60,65,70,75,80,85,90,95或100或更多成員是至少約1％,2％,3％,4％,5％,6％,7％,8％,9％,10％,15％,20％,25％,30％,35％,40％,45％,50％,55％,60％,65％,70％,75％,80％,85％,90％或95％或更多同源的。在一些實施方案中，多個中的群體的至少兩個或更多個成員是至少約1％,2％,3％,4％,5％,6％,7％,8％,9％,10％,15％,20％,25％,30％,35％,40％,45％,50％,55％,60％,65％,70％,75％,80％,85％,90％或95％或更多同源的。在一些實施方案中，多個中的群體的至少三個或更多個成員是至少約1％,2％,3％,4％,5％,6％,7％,8％,9％,10％,15％,20％,25％,30％,35％,40％,45％,50％,55％,60％,65％,70％,75％,80％,85％,90％或95％或更多同源的。在一些實施方案中，多個中的群體的至少四個或更多個成員是至少約1％,2％,3％,4％,5％,6％,7％,8％,9％,10％,15％,20％,25％,30％,35％,40％,45％,50％,55％,60％,65％,70％,75％,80％,85％,90％或95％或更多同源的。在一些實施方案中，多個中的群體的至少五個或更多個成員是至少約1％,2％,3％,4％,5％,6％,7％,8％,9％,10％,15％,20％,25％,30％,35％,40％,45％,50％,55％,60％,65％,70％,75％,80％,85％,90％或95％或更多同源的。在一些實施方案中，在一些實施方案中，多個中的群體的至少十個或更多個成員是至少約1％,2％,3％,4％,5％,6％,7％,8％,9％,10％,15％,20％,25％,30％,35％,40％,45％,50％,55％,60％,65％,70％,75％,80％,85％,90％或95％或更多同源的。

在一些實施方案中，多個中的群體的至少2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,20,25,30,35,40,45,50，55,60,65,70,75,80,85,90,95或100個或更多個成員是相同的。在一些實施方案中，多個中的群體的至少2個成員是相同的。在一些實施方案中，多個中的群體的至少3個成員是相同的。在一些實施方案中，多個中的群體的至少5個成員是相同的。在一些實施方案中，多個中的群體的至少10個成員是相同的。在一些實施方案中，多個中的群體的至少20個成員是相同的。

在一些實施方案中，多個中的群體的至少2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,20,25,30,35,40,45,50，55,60,65,70,75,80,85,90,95或100個或更多個成員是相似的。在一些實施方案中，多個中的群體的至少2個成員是相似的。在一些實施方案中，多個中的群體的至少3個成員是相似的。在一些實施方案中，多個中的群體的至少5個成員是相似的。在一些實施方案中，多個中的群體的至少10個成員是相似的。在一些實施方案中，多個中的群體的至少20個成員是相似的。

在一些實施方案中，多個中的群體的至少2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,20,25,30,35,40,45,50，55,60,65,70,75,80,85,90,95或100個或更多個成員是不同的。在一些實施方案中，多個中的群體的至少2個成員是不同的。在一些實施方案中，多個中的群體的至少3個成員是不同的。在一些實施方案中，多個中的群體的至少5個成員是不同的。在一些實施方案中，多個中的群體的至少10個成員是不同的。在一些實施方案中，多個中的群體的至少20個成員是不同的。

本公開的基底可包含至少一個靶多核苷酸，其一端附著于固定化到特征的捕捉引物。在一些實施方案中，本公開的基底將包含一個靶多核苷酸，其一端附著于固定化到特征的捕捉引物。雖然本文參考至少一種靶多核苷酸的附著或參照一端附著到固定化到特征的捕捉引物的靶多核苷酸描述，但理解的是在其它實施方案中，基底可以含有兩個或更多的靶多核苷酸，其在一端附著到固定化到特征的捕捉引物。在這些其它實施方案中，靶多核苷酸的數(shù)目可以是例如2,3,4,5,6,7,8,9,10,15,20,25,30,35,40,45，50,55,60,65,70,75,80,85,90,95或100或更多不同的靶多核苷酸。或者，靶多核苷酸的數(shù)目可以是例如2,3,4,5,6,7,8,9,10,15,20,25,30,35,40,45,50,50，55，60，65，70，75，80，85，90，95或100或更多相同的靶多核苷酸。在其它實施方案中，靶多核苷酸的數(shù)目為例如2,3,4,5,6,7,8,9,10,15,20,25,30,35,40,45,50，55,60,65,70,75,80,85,90,95或100或更多相似的靶多核苷酸。

參考在一端附著至固定化到特征的捕捉引物的至少一種靶多核苷酸，靶多核苷酸可以是能夠以拷貝數(shù)擴增的任何多核苷酸，包括例如dna，rna或蛋白質(zhì)核酸(pna)。靶多核苷酸可以包含兩個或更多個核苷酸。兩個或多個核苷酸可以包含核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，鎖定核酸(lna)，肽核酸(pna)或其任何組合。靶多核苷酸可以包含嘌呤堿基，嘧啶堿基或兩者。靶多核苷酸可以包含天然的，化學(xué)修飾的，生物化學(xué)修飾的，非天然的或衍生化的核苷酸堿基。靶多核苷酸可以包含一個或多個配對核苷酸堿基。靶多核苷酸可以是雙鏈核酸。在一些實施方案中，靶多核苷酸可以是雙鏈核酸，例如雙鏈dna(dsdna)。靶多核苷酸可以是雙鏈rna(dsrna)。靶多核苷酸可以是雙鏈dna/rna雜交體。靶多核苷酸可以包含一個或多個未配對核苷酸堿基。靶多核苷酸可以是單鏈的。在其它實施方案中，靶多核苷酸可以是單鏈核酸，如單鏈dna(ssdna)。靶多核苷酸可以是單鏈rna。靶多核苷酸可以包含配對和未配對核苷酸堿基的混合物。

為了在特征上放置單分子，靶多核苷酸作用為靶分子到特征的系鏈或錨。因此，靶多核苷酸可以是期望長度的任何序列。在一些實施方案中，在多個靶分子各自錨定到多個不同的特征的情況下，多個靶多核苷酸可以具有相同的序列或不同的序列。在其它實施方案中，各自錨定多個靶分子到不同的特征的多個靶多核苷酸的一些或全部可以具有不同的序列。因此，靶多核苷酸可以是任何期望的序列或序列混合物。鑒于本文提供的教導(dǎo)和指導(dǎo)，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解在將多個靶分子固定化到多個不同特征的情況下是否使用相同的靶多核苷酸序列或不同靶多核苷酸序列。

靶多核苷酸可以包含一個或多個靶多核苷酸區(qū)。靶多核苷酸區(qū)可以包含捕捉引物結(jié)合區(qū)、靶區(qū)域、引物結(jié)合區(qū)、條形碼區(qū)、接頭區(qū)或銜接頭區(qū)域。例如，靶多核苷酸可以含有包含捕捉引物結(jié)合區(qū)的靶多核苷酸區(qū)。靶多核苷酸可以含有包含第一捕捉引物結(jié)合區(qū)的靶多核苷酸區(qū)。靶多核苷酸可以含有包含第二捕捉引物結(jié)合區(qū)的靶多核苷酸區(qū)。或者或另外，靶多核苷酸可以含有包含靶區(qū)域的靶多核苷酸區(qū)。靶多核苷酸可以含有包含引物結(jié)合區(qū)的靶多核苷酸區(qū)。靶多核苷酸可以含有包含條形碼區(qū)的靶多核苷酸區(qū)。靶多核苷酸可以含有包含接頭區(qū)的靶多核苷酸區(qū)。或者或另外，靶多核苷酸可以包含含有銜接頭區(qū)域的靶多核苷酸區(qū)。

靶多核苷酸可以包含多個靶多核苷酸區(qū)。靶多核苷酸可以包含1,2,3,4,5,6,7,8,9或10或更多個靶多核苷酸區(qū)。靶多核苷酸可以包含2或更多個靶多核苷酸區(qū)。靶多核苷酸可以包含3或更多個靶多核苷酸區(qū)。靶多核苷酸可以包含4或更多個靶多核苷酸區(qū)。靶多核苷酸可以包含5或更多個靶多核苷酸區(qū)。靶多核苷酸可以包含6或更多個靶多核苷酸區(qū)。靶多核苷酸可以包含多個靶多核苷酸區(qū)，其包含一個或多個第一捕捉引物結(jié)合區(qū)、第二捕捉引物結(jié)合區(qū)、靶區(qū)域、引物結(jié)合區(qū)、條形碼區(qū)、接頭區(qū)、銜接頭區(qū)域、或其任何組合。靶多核苷酸可以包含多個靶多核苷酸區(qū)，其包含兩個或更多個第一捕捉引物結(jié)合區(qū)、第二捕捉引物結(jié)合區(qū)、靶區(qū)域、引物結(jié)合區(qū)、條形碼區(qū)、接頭區(qū)、銜接頭區(qū)域、或其任何組合。靶多核苷酸可以包含多個靶多核苷酸區(qū)，其包含三個或更多個第一捕捉引物結(jié)合區(qū)、第二捕捉引物結(jié)合區(qū)、靶區(qū)域、引物結(jié)合區(qū)、條形碼區(qū)、接頭區(qū)、銜接頭區(qū)域、或其任何組合。

圖3a-d中描繪了包含兩個或更多個靶多核苷酸區(qū)的例示性靶多核苷酸。如圖3a中所示，靶多核苷酸可以包含兩個或多個靶多核苷酸區(qū)(301,302)。第一靶多核苷酸區(qū)(301)可以是第一捕捉引物結(jié)合區(qū)。第二靶多核苷酸區(qū)(302)可以是第二捕捉引物結(jié)合區(qū)。如圖3b中所示，靶多核苷酸可以包含三個或更多個靶多核苷酸區(qū)(301,302,303)。第一靶多核苷酸區(qū)(301)可以是第一捕捉引物結(jié)合區(qū)。第二靶多核苷酸區(qū)(302)可以是第二捕捉引物結(jié)合區(qū)。第三靶多核苷酸區(qū)(303)可以是靶區(qū)域。如圖3c中所示，靶多核苷酸可以包含四個或更多個靶多核苷酸區(qū)(301,302,303,304)。第一靶多核苷酸區(qū)(301)可以是第一捕捉引物結(jié)合區(qū)。第二靶多核苷酸區(qū)(302)可以是第二捕捉引物結(jié)合區(qū)。第三靶多核苷酸區(qū)(303)可以是靶區(qū)域。第四靶多核苷酸區(qū)(304)可以是引物結(jié)合區(qū)。如圖3d中所示，靶多核苷酸可以包含五個或更多個靶多核苷酸區(qū)(301,302,303,304,305)。第一靶多核苷酸區(qū)(301)可以是第一捕捉引物結(jié)合區(qū)。第二靶多核苷酸區(qū)(302)可以是第二捕捉引物結(jié)合區(qū)。第三靶多核苷酸區(qū)(303)可以是靶區(qū)域。第四靶多核苷酸區(qū)(304)可以是引物結(jié)合區(qū)。第五靶多核苷酸區(qū)(305)可以是條形碼區(qū)。或者或另外，一個靶多核苷酸區(qū)可以是接頭區(qū)?；蛘呋蛄硗?，一個靶多核苷酸區(qū)可以是一個銜接頭區(qū)域。

包含例如，靶區(qū)域、捕捉引物結(jié)合區(qū)和/或本文中描述或本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的其它區(qū)域的靶多核苷酸或靶多核苷酸區(qū)(靶多核苷酸或其區(qū)域)可以包含兩個或更多個核苷酸。靶多核苷酸或其區(qū)域可以包含2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19或20或更多個核苷酸。靶多核苷酸可以包含25,30,35,40,45,50,55,70,65,70,75,80,85,90,95,100或更多個核苷酸。靶多核苷酸或其區(qū)域可以包含150,200,250,300,350,400,450,500,550,700,650,700,750,800,850,900,950,1000或更多個核苷酸。靶多核苷酸或其區(qū)域可以包含1100,1200,1300,1400,1500,2000,2500,3000,3500,4000,4500,5000,5500,7000,6500,7000,7500,8000,8500,9000,9500,10000或更多個核苷酸。靶多核苷酸或其區(qū)域可以包含100或更多個核苷酸。靶多核苷酸或其區(qū)域可以包含300或更多個核苷酸。靶多核苷酸或其區(qū)域可以包含400或更多個核苷酸。靶多核苷酸或其區(qū)域可以包含500或更多個核苷酸。靶多核苷酸或其區(qū)域可以包含600或更多個核苷酸。

靶多核苷酸或其區(qū)域可以包含10至25,26至50,51至100,101至200,201至300,301至400,401至500,501至600,601至700,701至800,801至900或901至1000個核苷酸。靶多核苷酸或其區(qū)域可以包含約5至2000,5至1500,5至1000,5至800,5至600,5至400,5至200,5至100或5至50個核苷酸。靶多核苷酸或其區(qū)域可以包含約10至2000,10至1500,10至1000,10至800,10至600,10至400,10至200,10至100或10至50個核苷酸。靶多核苷酸或其區(qū)域可以包含約20至2000,20至1500,20至1000,20至800,20至600,20至400,20至200,20至100或20至50個核苷酸。

靶多核苷酸或其區(qū)域可以包含小于約5000,4500,4000,3500,3000,2500,2000,1500或1000或更少個核苷酸。靶多核苷酸或其區(qū)域可以包含小于約950,900,850,800,750,700,650,600,550,500,450,400,350,300,250,200,150或100或更少個核苷酸。靶多核苷酸或其區(qū)域可以包含小于約95,90,85,80,75,70,65,60,55,50,45,40,35,30,25,20,15或10或更少個核苷酸。

靶多核苷酸或其區(qū)域可以包含雙鏈多核苷酸。靶多核苷酸或其區(qū)域可以包含一個或多個堿基對。靶多核苷酸可以包含2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19或20或更多個堿基對。靶多核苷酸或其區(qū)域可以包含25,30,35,40,45,50,55,70,65,70,75,80,85,90,95,100或更多個堿基對。靶多核苷酸或其區(qū)域可以包含150,200,250,300,350,400,450,500,550,700,650,700,750,800,850,900,950,1000或更多個堿基對。靶多核苷酸或其區(qū)域可以包含1100,1200,1300,1400,1500,2000,2500,3000,3500,4000,4500,5000,5500,7000,6500,7000,7500,8000,8500,9000,9500,10000或更多個堿基對。靶多核苷酸或其區(qū)域可以包含100或更多個堿基對。靶多核苷酸或其區(qū)域可以包含300或更多個堿基對。靶多核苷酸或其區(qū)域可以包含400或更多個堿基對。靶多核苷酸或其區(qū)域可以包含500或更多個堿基對。靶多核苷酸可以包含600或更多個堿基對。

靶多核苷酸或其區(qū)域可以包含10至25,26至50,51至100,101至200,201至300,301至400,401至500,501至600,601至700,701至800,801至900或901至1000個堿基對。靶多核苷酸或其區(qū)域可以包含約5至2000,5至1500,5至1000,5至800,5至600,5至400,5至200,5至100或5至50個堿基對。靶多核苷酸或其區(qū)域可以包含約10至2000,10至1500,10至1000,10至800,10至600,10至400,10至200,10至100或10至50個堿基對。靶多核苷酸或其區(qū)域可以包含約20至2000,20至1500,20至1000,20至800,20至600,20至400,20至200,20至100或20至50個堿基對

靶多核苷酸或其區(qū)域可以包含小于約5000,4500,4000,3500,3000,2500,2000,1500或1000或更少個堿基對。靶多核苷酸或其區(qū)域可以包含小于約950,900,850,800,750,700,650,600,550,500,450,400,350,300,250,200,150或100或更少個堿基對。靶多核苷酸或其區(qū)域可以包含小于約95,90,85,80,75,70,65,60,55,50,45,40,35,30,25,20,15或10或更少個堿基對。

雙鏈靶多核苷酸或其區(qū)域可以包含1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19或20或更多個錯配。作為雙鏈的靶多核苷酸或其區(qū)域可以包含一個或多個錯配。雙鏈靶多核苷酸或其區(qū)域可以包含兩個或更多個錯配。雙鏈靶多核苷酸或其區(qū)域可以包含三個或更多個錯配.雙鏈靶多核苷酸或其區(qū)域可以包含四個或更多個錯配。雙鏈靶多核苷酸或其區(qū)域可以包含五個或更多個錯配。

雙鏈靶多核苷酸或其區(qū)域可以包含小于10,9,8,7,6,5,4,3,2或1個錯配。雙鏈靶多核苷酸或其區(qū)域可以包含五個或更少個錯配。雙鏈靶多核苷酸或其區(qū)域可以包含四個或更少個錯配。雙鏈靶多核苷酸或其區(qū)域可以包含三個或更少個錯配。雙鏈靶多核苷酸或其區(qū)域可以包含兩個或更少個錯配。雙鏈靶多核苷酸或其區(qū)域可以包含一個或更少個錯配。

如先前例示，靶多核苷酸可以包含一個或多個區(qū)域，其包含一個或多個捕捉引物結(jié)合區(qū)。一般地，捕捉引物結(jié)合區(qū)與捕捉引物互補。靶多核苷酸區(qū)可以包含5’端的捕捉引物結(jié)合區(qū)。靶多核苷酸區(qū)可以包含3’端的捕捉引物結(jié)合區(qū)。靶多核苷酸區(qū)可以包含靶區(qū)域的5’端的第一捕捉引物結(jié)合區(qū)和靶區(qū)域3’端的第二捕捉引物結(jié)合區(qū)?；蛘呋蛄硗?，包含捕捉引物結(jié)合區(qū)的靶多核苷酸區(qū)可以位于靶多核苷酸的內(nèi)部區(qū)域。

靶多核苷酸可以包含兩個或更多個捕捉引物結(jié)合區(qū)。靶多核苷酸可以包含三個或更多個捕捉引物結(jié)合區(qū)。靶多核苷酸可以包含四個或更多個捕捉引物結(jié)合區(qū)。兩個或更多個捕捉引物結(jié)合區(qū)可以是相同的?；蛘呋蛄硗猓瑑蓚€或更多個捕捉引物結(jié)合區(qū)可以是不同的。兩個或更多個捕捉引物結(jié)合區(qū)在靶多核苷酸上可以彼此接近。或者或另外，兩個或更多個捕捉引物結(jié)合區(qū)在多核苷酸上可以彼此不接近。

與相應(yīng)的捕捉引物一樣，捕捉引物結(jié)合區(qū)可以包含一個或多個捕捉引物結(jié)合區(qū)。捕捉引物結(jié)合區(qū)可以包含例如通用捕捉引物結(jié)合區(qū)、測序引物結(jié)合區(qū)(sbs)、靶物特異性捕捉引物結(jié)合區(qū)、預(yù)定的切割位點，如限制性位點，和接頭區(qū)，例如，分開捕捉引物結(jié)合區(qū)的兩個或更多個區(qū)域的接頭區(qū)。一些捕捉引物結(jié)合區(qū)可以包含例如，通用捕捉引物結(jié)合區(qū)和sbs。其它捕捉引物結(jié)合區(qū)可以包含通用捕捉引物結(jié)合區(qū)和靶物特異性捕捉引物結(jié)合區(qū)。其它捕捉引物結(jié)合區(qū)可以包含例如，通用捕捉引物結(jié)合區(qū)、sbs和靶物特異性捕捉引物結(jié)合區(qū)。捕捉引物結(jié)合區(qū)可以在3'或5'端封閉或未封閉的。鑒于本文提供的教導(dǎo)和指導(dǎo)，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，捕捉引物結(jié)合區(qū)可以包含在一個或多個應(yīng)用中有用的任何數(shù)量的不同區(qū)域。

例如，先前例示的通用捕捉引物也可以用作通用捕捉引物結(jié)合區(qū)，本文所示或本領(lǐng)域公知的其它捕捉引物區(qū)也可以。參考前述的通用捕捉引物，例示的p5，p7，p5'和/或p7'序列可以用作通用捕捉引物結(jié)合區(qū)域以與互補捕捉引物(例如，分別為p5'，p7'p5和/或p7)退火。類似地，先前列出的sbs序列或本領(lǐng)域中設(shè)計或已知的其它序列可以被包括在捕捉引物區(qū)域中的區(qū)域中。在一個實施方案中，例如可以包括例示性sbs序列sbs3，sbs8，sbs3'和/或sbs8'。

例如，多個靶多核苷酸結(jié)合區(qū)可以具有捕捉引物結(jié)合區(qū)的任意組合，例如，上述例示的p5，p7，sbs3或sbs8引物區(qū)或其互補序列的任何組合(例如，p5'，p7'，sbs3'或sbs8')的任意組合。上述具體序列的例示性組合包括例如組合，如p5-sbs3，p5-sbs8，p7-sbs8和p7-sbs3，其互補序列或其組合。

如圖4所示，側(cè)翼有捕捉引物結(jié)合區(qū)域的靶區(qū)域的一個例示性組合是靶多核苷酸的第一端的p5-sbs3捕捉引物結(jié)合區(qū)和第二端的p7'-sbs8'捕捉引物結(jié)合區(qū)。相應(yīng)的互補鏈包括第一端的p5'-sbs3'捕捉引物結(jié)合區(qū)和第二端的p7-sbs8捕捉引物結(jié)合區(qū)。

捕捉引物結(jié)合區(qū)可以包含5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29或30或更多個核苷酸。捕捉引物結(jié)合區(qū)可以包含35,40,45,50,55,60,65,70,75,80,85,90,95或100或更多個核苷酸。捕捉引物結(jié)合區(qū)可以包含5或更多個核苷酸。捕捉引物結(jié)合區(qū)可以包含10或更多個核苷酸。捕捉引物結(jié)合區(qū)可以包含15或更多個核苷酸。捕捉引物結(jié)合區(qū)可以包含20或更多個核苷酸。捕捉引物結(jié)合區(qū)可以包含25或更多個核苷酸。

捕捉引物結(jié)合區(qū)可以包含400,375,350,325,300,275,250,225,200,190,180,170,160,150,140,130,120,110,100或更少個核苷酸。捕捉引物結(jié)合區(qū)可以包含300或更少個核苷酸。捕捉引物結(jié)合區(qū)可以包含200或更少個核苷酸。捕捉引物結(jié)合區(qū)可以包含100或更少個核苷酸。捕捉引物結(jié)合區(qū)可以包含50或更少個核苷酸。捕捉引物結(jié)合區(qū)可以包含40或更少個核苷酸。捕捉引物結(jié)合區(qū)可以包含30或更少個核苷酸。

靶多核苷酸的捕捉引物結(jié)合區(qū)可以與捕捉引物是100％互補的。靶多核苷酸的捕捉引物結(jié)合區(qū)可以與捕捉引物是至少60％,65％,70％,75％,77％,80％,82％,85％,87％,90％,92％,95％或97％或更多個互補的。靶多核苷酸的捕捉引物結(jié)合區(qū)可以與捕捉引物是80％互補的。引靶多核苷酸的捕捉引物結(jié)合區(qū)可以與捕捉引物是85互補的。靶多核苷酸的捕捉引物結(jié)合區(qū)可以與捕捉引物是9％互補的。靶多核苷酸的捕捉引物結(jié)合區(qū)可以與捕捉引物是95互補的。

靶多核苷酸的引物結(jié)合區(qū)可以包含與捕捉引物的1,2,3,4,5,6,7,8,9或10或更多個核苷酸錯配。靶多核苷酸的捕捉引物結(jié)合區(qū)可以包含與捕捉引物的一個或多個核苷酸錯配。靶多核苷酸的捕捉引物結(jié)合區(qū)可以包含與捕捉引物的兩個或多個核苷酸錯配。靶多核苷酸的捕捉引物結(jié)合區(qū)可以包含與捕捉引物的三個或多個核苷酸錯配。靶多核苷酸的捕捉引物結(jié)合區(qū)可以包含與捕捉引物的四個或多個核苷酸錯配。

靶多核苷酸可以包含一個或多個靶區(qū)域。靶多核苷酸可以具有位于靶多核苷酸的內(nèi)部區(qū)域的靶區(qū)域。例如，靶區(qū)域可以在其5'和3'端側(cè)翼有捕捉引物結(jié)合區(qū)或其它區(qū)域。或者或另外，靶區(qū)域可以位于例如靶多核苷酸的5'端。靶多核苷酸可以包含靶多核苷酸的3'端、5'端或這兩端的捕捉引物結(jié)合區(qū)，如上文例示的。靶多核苷酸可以包含靶多核苷酸的5'端的第一靶區(qū)域和靶多核苷酸的3'端的第二靶區(qū)域。靶區(qū)域可以在任一端或兩端側(cè)翼有一個或多個捕捉引物結(jié)合區(qū)。

靶多核苷酸可以包含兩個或更多個靶區(qū)域。靶多核苷酸可以包含三個或更多個靶區(qū)域。靶多核苷酸可以包含四個或更多個靶區(qū)域。兩個或更多個靶區(qū)域可以是相同的?；蛘呋蛄硗猓瑑蓚€或更多個靶區(qū)域可以是不同的。兩個或更多個靶區(qū)域在靶多核苷酸上可以彼此接近?；蛘呋蛄硗猓瑑蓚€或更多個靶區(qū)域在靶多核苷酸上可以彼此不接近。

靶區(qū)域的大小或長度可以是上文就靶多核苷酸或靶多核苷酸區(qū)而言例示的任何長度。例示性的長度包括5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29或30或更多個核苷酸。靶區(qū)域可以包含35,40,45,50,55,60,65,70,75,80,85,90,95或100或更多個核苷酸。靶區(qū)域可以包含150,200,250,300,350,400,450,500,550,600,650,700,750,800,850,900,950或100或更多個核苷酸。靶區(qū)域可以包含5或更多個核苷酸。靶區(qū)域可以包含10或更多,20或更多,50或更多,100或更多,200或更多或400或更多個核苷酸。其它例示性長度包括例如，1000,950,900,850,800,750,700,650,600,550,500,450,400,375,350,325,300,275,250,225,200,190,180,170,160,150,140,130,120,110,100或更少個核苷酸。其它例示性的長度包括例如，700或更少,500或更少,300或更少,200或更少,100或更少或50或更少個核苷酸。

本公開的基底可以包含至少一個靶分子。至少一個靶分子可以附著到靶多核苷酸。至少一個靶分子可以附著到靶多核苷酸，其附著于捕捉引物。至少一個靶分子可以附著于固定化到捕捉引物的靶多核苷酸，所述捕捉引物固定化到特征。盡管本文參照至少一個靶分子，參考附著于靶多核苷酸的至少一個靶分子，參考附著于與捕捉引物附著的靶多核苷酸的至少一個靶分子，或參照附著于與固定化到特征的捕捉引物附著的靶多核苷酸的至少一個靶分子描述，應(yīng)當(dāng)理解，在其他實施方案中，基底可以在每個參考情況下包含多個的兩種或更多種靶分子。如下面進一步例示的，多個靶分子可以單獨固定化到基底上的不同特征?；蛘?，多個靶分子可以固定化到基底上的相同特征。在多個靶分子被單獨固定化到不同特征的實施方案中，多個靶分子可以是與上述和下文中例示的相同的靶分子或不同類型或種類的靶分子。在這些實施例中，多個中的靶分子的數(shù)目可以是例如2,3,4,5,6,7,8,9,10,15,20,25,30,35,40,45,50,55,60,65,70,75,80,85,90,95,100,250,500,1,000,5,000,10,000或更多不同，相同和/或相似的靶分子。

例如，多個靶分子可以包含兩個或更多個相同靶分子。在此實施方案中，第一和第二或更多種靶分子都可以是例如特定多肽，如mspa納米孔?；蛘呋蛄硗猓鄠€靶分子可以包含兩個或更多個不同靶分子。例如，多個靶分子的第一靶分子可以是酶，并且多個靶分子的第二靶分子可以是多核苷酸。多個靶分子可以包含三個或更多不同的靶分子。例如，多個靶分子的第一靶分子可以是酶，多個靶分子的第二靶分子可以是多核苷酸，而多個靶分子的第三靶分子可以是小的有機物化合物?；蛘呋蛄硗?，多個靶分子可以包含兩個或更多相似的靶分子。兩個或更多個相似的靶分子可以是相同類型的分子。例如，第一靶分子可以是mspa納米孔，第二靶分子可以是naip納米孔。在這種情況下，第一和第二靶分子具有相同類型的分子(例如納米孔)。兩個或更多個相似的靶分子可以是同源物或變體。例如，第一靶分子可以是多肽的人形式，第二靶分子可以是多肽的小鼠形式。變體可以包含不同等位基因編碼的多肽或通過位點特異性誘變，定向進化等獲得的多肽。兩個或更多個相似的靶分子可以是相同蛋白質(zhì)的可變剪接變體。例如，第一靶分子可以是多肽的全長形式，并且第二靶分子可以是多肽的截短形式。兩個或更多個相似的靶分子可以是化學(xué)類似物或衍生物。例如，第一靶分子可以是化合物x，第二靶分子可以是化合物x的衍生物。在一個例示性實施方案中，多個相似靶分子可以是酶變體的文庫。例示性靶分子在下面進一步描述。

在一些實施方案中，至少一個靶分子或多個靶分子可以附著到基底和/或附著到基底上的特征。至少一個靶分子或多個靶分子可以附著到捕捉引物或多個捕捉引物，其分別固定化到基底上的特征。至少一個靶分子或多個靶分子可以附著到靶多核苷酸，所述靶多核苷酸附著到捕捉引物或其多個，其分別固定化到基底上的特征。附著可以是靶分子與上文所述的任何區(qū)域或組分的共價或非共價附著。參考至少一個靶分子，例如，至少一個靶分子可以共價附著到基底和/或基底上的特征。至少一個靶分子可以共價附著到捕捉引物，所述捕捉引物固定化到基底上的特征。至少一個靶分子可以共價附著到靶多核苷酸，所述靶多核苷酸共價附著到捕捉引物，所述捕捉引物固定化到基底上的特征。下文參考將至少一個靶分子置于基底的特征上的方法進一步描述了經(jīng)由共價磷酸二酯鍵將靶多核苷酸共價附著到捕捉引物的例示性實施方案。另外，例如，至少一個靶分子可以非共價附著到基底和/或基底上的特征。至少一個靶分子可以非共價附著到捕捉引物，其固定化到基底上的特征。至少一個靶分子可以非共價附著到靶多核苷酸，所述靶多核苷酸非共價附著到固定化到基底上的特征的捕捉引物。用于多核苷酸和靶分子與基底以及彼此的共價和非共價附著的方法是本領(lǐng)域中公知的。

除了通過上述構(gòu)造固定化的至少一個靶分子外，基底上的特征或多個特征還可以包含靶多核苷酸的多個擴增子。擴增子可以與靶多核苷酸互補。在靶多核苷酸或靶多核苷酸區(qū)包含一個或多個核苷酸錯配的實施方案中，除了一個或多個核苷酸錯配之外，擴增子可以與靶多核苷酸互補。類似地，在該實施方案中，靶多核苷酸的雙鏈擴增子可以具有與靶多核苷酸互補(除了一個或多個核苷酸錯配)的一條鏈和與靶多核苷酸在序列上相同(除了一個或多個核苷酸錯配)的另一條鏈。在其他實施方案中，擴增子可以是上文例示的多個不同的擴增子種類。多個擴增子可以最小化填充特征，部分填充特征或填滿基底上的特征。因此，擴增子密度可以是低，中等或高。靶多核苷酸設(shè)計，生成這種擴增子的方法和控制密度的方法在下文中進一步參考在基底的特征上放置至少一個靶分子的方法描述。擴增子的密度在大小約為100nm的特征中可以為約10至100)，或者在大小約為100nm至1μm的特征中約100至10000。

擴增子的密度可以是約10至100，在具有小于約100nm的大小的特征中。擴增子的密度可以是約10至95，在具有小于約100nm的大小的特征中。擴增子的密度可以是約10至90，在具有小于約100nm的大小的特征中。擴增子的密度可以是約10至85，在具有小于約100nm的大小的特征中。擴增子的密度可以是約10至80，在具有小于約100nm的大小的特征中。擴增子的密度可以是約10至75，在具有小于約100nm的大小的特征中。擴增子的密度可以是約10至70，在具有小于約100nm的大小的特征中。擴增子的密度可以是約10至65，在具有小于約100nm的大小的特征中。擴增子的密度可以是約10至60，在具有小于約100nm的大小的特征中。擴增子的密度可以是約10至55，在具有小于約100nm的大小的特征中。擴增子的密度可以是約10至50，在具有小于約100nm的大小的特征中。擴增子的密度可以是約10至45，在具有小于約100nm的大小的特征中。擴增子的密度可以是約10至40，在具有小于約100nm的大小的特征中。擴增子的密度可以是約10至35，在具有小于約100nm的大小的特征中。擴增子的密度可以是約10至30，在具有小于約100nm的大小的特征中。擴增子的密度可以是約10至25，在具有小于約100nm的大小的特征中。擴增子的密度可以是約10至20在具有小于約100nm的大小的特征中。擴增子的密度可以是約10至15，在具有小于約100nm的大小的特征中。

在具有小于約100nm的大小的特征中，擴增子的密度可以大于約10，20，30，40，50，60，70，80，90，或100。

擴增子的密度可以是約100至10000，在具有約100nm至1μm的大小的特征中。擴增子的密度可以是約100至9000，在具有約100nm至1μm的大小的特征中。擴增子的密度可以是約100至8000，在具有約100nm至1μm的大小的特征中。擴增子的密度可以是約100至7000，在具有約100nm至1μm的大小的特征中，擴增子的密度可以是約100至6000，在具有約100nm至1μm的大小的特征中，擴增子的密度可以是約100至5000，在具有約100nm至1μm的大小的特征中，擴增子的密度可以是約100至4000，在具有約100nm至1μm的大小的特征中，擴增子的密度可以是約100至3000，在具有約100nm至1μm的大小的特征中，擴增子的密度可以是約100至2000，在具有約100nm至1μm的大小的特征中，擴增子的密度可以是約100至1000，在具有約100nm至1μm的大小的特征中，擴增子的密度可以是約100至900，在具有約100nm至1μm的大小的特征中，擴增子的密度可以是約100至800，在具有約100nm至1μm的大小的特征中，擴增子的密度可以是約100至700，在具有約100nm至1μm的大小的特征中，擴增子的密度可以是約100至600，在具有約100nm至1μm的大小的特征中，擴增子的密度可以是約100至500，在具有約100nm至1μm的大小的特征中，擴增子的密度可以是約100至400，在具有約100nm至1μm的大小的特征中，擴增子的密度可以是約100至300，在具有約100nm至1μm的大小的特征中，擴增子的密度可以是約100至200，在具有約100nm至1μm的大小的特征中。

適用于本公開的基底上的單分子放置并用于本公開的方法的靶分子可以是任何期望的分子。靶分子的例示性類別包括例如多肽，多核苷酸，碳水化合物，氨基酸，核苷酸，單糖，半抗原，配體，抗原，分析物，離子通道，小分子有機化合物或無機化合物。下文進一步描述上述類別中的每個的例示性種類。

本公開的靶分子可以包含多肽。多肽可以包含一個或多個氨基酸。多肽可包含2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19或20個或更多個氨基酸。多肽可以包含20,30,40,50,60,70,80,90,100,110,120,130,140,150,160,170,180,190或200個或更多個氨基酸。多肽可包含200,300,400,500,600,700,800,900,1000,1100,1200,1300,1400,1500,1600,1700,1800,1900或2000個或更多個氨基酸。氨基酸可以是天然氨基酸。氨基酸可以是非天然氨基酸。氨基酸可以是d-氨基酸。氨基酸可以是l-氨基酸。一個或多個氨基酸可以包含一個或多個天然氨基酸，非天然氨基酸，d-氨基酸，l-氨基酸或其組合。氨基酸的實例包括但不限于對乙酰基苯丙氨酸，間乙酰基苯丙氨酸，丙氨酸，β-丙氨酸，γ-氨基丁酸(gaba)，氨基異丁酸，δ-氨基乙酰丙酸，4-氨基苯甲酸(paba)，精氨酸，天冬酰胺，天門氨酸，對苯氧基-1-苯丙氨酸，瓜氨酸，胱硫醚，半胱氨酸，胱氨酸，二氨基庚二酸，今可豆氨酸(djenkolicacid)，谷氨酸，谷氨酰胺，甘氨酸，組氨酸，異亮氨酸，羊毛硫氨酸，亮氨酸，賴氨酸，甲硫氨酸，鳥氨酸，苯丙氨酸，苯基硒基丙氨酸(phenylselenidylalanine)，脯氨酸，硒代半胱氨酸，絲氨酸，蘇氨酸，色氨酸，酪氨酸和纈氨酸。多肽的實例包括但不限于核糖體肽，非核糖體肽，蛋白胨，肽片段或其任何組合。本公開的多肽可以是重組的，合成的或天然存在的。

本公開的靶分子可以包含核糖體多肽。通常，核糖體肽可以是通過翻譯mrna合成的肽。核糖體蛋白可以經(jīng)歷一個或多個翻譯后修飾。翻譯后修飾的實例包括但不限于磷酸化，羥基化，磺化，棕櫚?；?，糖基化，泛素化，sumo化(sumoylation)和二硫鍵形成。核糖體肽的實例包括但不限于酶，受體，抗體，轉(zhuǎn)錄因子，激素，配體，抗原和半抗原。

本公開的靶分子可以包含非核糖體肽。通常，非核糖體肽可以是由每種肽特異的酶而不是由核糖體組裝的肽。非核糖體肽可以具有環(huán)狀和/或支鏈結(jié)構(gòu)。非核糖體肽可以含有一種或多種非蛋白質(zhì)氨基酸，如d-氨基酸。非核糖體多肽可以包括修飾如n-甲基和n-甲?；?n-formal)。非核糖體多肽可以被糖基化，?；?，脫水或羥基化。非核糖體多肽可以經(jīng)歷一個或多個絲氨酸的脫水，導(dǎo)致脫氫丙氨酸。非核糖體肽可以是多聚體。非核糖體肽可以是二聚體或三聚體。非核糖體肽的實例包括但不限于毒素，鐵載體，顏料，抗生素，抗生素前體，細(xì)胞抑制劑和免疫抑制劑。

本公開的靶分子可以包含組裝成納米孔的一種或多種多肽。納米孔可選自恥垢分枝桿菌(mycobacteriumsmegmatis)孔蛋白a(mspa)，外膜磷脂酶a(ompa)，ompc，ompf，ompg，奈瑟氏球菌(neisseria)自身轉(zhuǎn)運蛋白(nalp)，wza，clya毒素，α-溶血素，炭疽毒素，短桿菌肽a，麥芽糖孔蛋白，phoe，tsx，f-pilus，sp1，線粒體孔蛋白(vdac)，tom40，殺白細(xì)胞素和dna折紙納米孔。

本公開的靶分子可以包含抗生素?？股乜梢允乔嗝顾?，頭孢菌素，多粘菌素，利福霉素，閏年霉素(lipiarmycin)，喹諾酮，磺酰胺，大環(huán)內(nèi)酯，氨基糖苷，環(huán)狀脂肽，甘氨酰環(huán)素(glycylcycline)，惡唑烷酮(oxazolidinone)或小菌素(microcin)?？股氐膶嵗ǖ幌抻诜啪€菌素，桿菌肽，鈣依賴性抗生素，達(dá)托霉素，短桿菌肽，短桿菌酪肽(tyrocidine)，萬古霉素，兩性霉素a，普拉佐米星(plazomicin)，eravacycline，brilacidin，阿維巴坦(avibactam)，阿奇霉素，克拉霉素，紅霉素，卡波霉素(carbomycin)，交沙霉素，吉他霉素(kitasamycin)，麥迪霉素(midecamycin)，竹桃霉素(oleandomycin)，solithromycin，螺旋霉素，醋竹桃霉素，泰樂菌素，羅紅霉素，塞紅霉素(cethromycin)，利福布汀(ansamycin)，卡波霉素(carbomycin)，泰樂菌素和泰利霉素。

本公開的靶分子可以包含毒素。毒素可以是血毒素。血紅蛋白會引起紅細(xì)胞的破壞。毒素可以是光毒素。光毒素可引起光敏性。毒素可以是外毒素。外毒素可以被生物或細(xì)胞排泄。毒素可以是內(nèi)毒素。內(nèi)毒素可以是當(dāng)細(xì)胞或生物被裂解時釋放的毒素。毒素可以是生物毒素。生物毒素可以是具有生物起源的毒素。例如，由真菌產(chǎn)生的毒素可以稱為生物毒素。毒素可以是壞死毒素。壞死蛋白會導(dǎo)致壞死。毒素可以是神經(jīng)毒素。神經(jīng)毒素可以影響動物的神經(jīng)系統(tǒng)。毒素可以是細(xì)胞毒素。細(xì)胞毒素在個別細(xì)胞水平上可以是有毒的。毒素可以是真菌毒素。真菌毒素的實例包括黃曲霉毒素，赭曲霉毒素，桔霉素，麥角類生物堿，棒曲霉素和鐮孢菌。毒素的實例包括但不限于微囊藻毒素，節(jié)球藻素，變性毒素(anatoxin)-a，變性毒素-a(s)，柱孢藻毒素(cylindrospermopsins)，鞘絲藻毒素a，蛤蚌毒素，海兔毒素，藍(lán)藻毒素，hc-毒素，am毒素，維生素，蓖麻毒素，蜂毒素，串珠鐮孢菌素(fumonisins)，單端孢霉烯類(trichothecenes)，玉米赤霉烯酮，白僵菌毒素(beauvercin)，恩鐮孢菌素(enniatins)，丁烯羥酸內(nèi)酯(butenolide)，伊快霉素(equisetin)，破傷風(fēng)毒素，肉毒桿菌毒素，河豚毒素和鐮菌素(fusarins)。

本公開的靶分子可以包含激素。激素可以是胺激素，肽激素，蛋白激素，類固醇激素或其組合。胺激素可以包含一個或多個具有一個或多個修飾基團的氨基酸。例如，可以用諸如苯環(huán)等化學(xué)基團代替氨基酸的羧基。肽激素可以包含連接的氨基酸的短鏈。蛋白質(zhì)激素可以包含連接的氨基酸的長鏈。類固醇激素可以衍生自脂質(zhì)膽固醇。激素的實例包括但不限于褪黑激素，三碘甲腺原氨酸，甲狀腺素，前列腺素，白細(xì)胞三烯，前列環(huán)素，thrombaxane，淀粉素(amylin)，抗穆勒激素(anti-mullerianhormone)，adinopectin，促腎上腺皮質(zhì)激素，促皮質(zhì)激素(corticotrophin)，血管緊張素原，血管緊張素，抗利尿激素，加壓素，心房-利鈉肽，心房肽，腦利鈉肽，降鈣素，膽囊收縮素，促皮質(zhì)素釋放激素，皮質(zhì)抑素(cortistatin)，腦啡肽，內(nèi)皮縮血管肽，促紅細(xì)胞生成素，促卵泡激素，加蘭肽(galanin)，胃抑制多肽，胃泌素，饑餓激素(ghrelin)，胰高血糖素，胰高血糖素樣肽-1，促性腺激素釋放激素，生長激素釋放激素，hepcidin，人絨毛膜促性腺激素，人胎盤催乳激素，生長激素，抑制素，胰島素，胰島素樣生長因子，生長調(diào)節(jié)素，瘦蛋白，促脂解素，黃體生成素，黑素細(xì)胞刺激素，促胃動素，阿立新(orexin)，催產(chǎn)素，胰腺多肽，甲狀旁腺激素，垂體腺苷酸環(huán)化酶活化肽，促乳素，促乳素釋放激素，松弛素，腎素，分泌素，促生長素抑制素，血小板生成素，促甲狀腺激素，促甲狀腺激素，血管活性腸肽，雄激素，鹽皮質(zhì)激素，雌激素，糖皮質(zhì)激素，孕激素和開環(huán)甾類化合物(secosteroid)。

本公開的靶分子可以包含半抗原。通常，半抗原可以是當(dāng)附著到大載體如蛋白質(zhì)時可以引發(fā)免疫應(yīng)答的小分子。半抗原的實例包括但不限于苯胺，鄰氨基苯甲酸，間氨基苯甲酸，對氨基苯甲酸，uroshiol，奎寧，肼苯噠嗪，熒光素，生物素，地高辛配基(digoxigenin)和二硝基苯酚。

本公開的靶分子可以包括離子通道(即，孔蛋白)或受體。受體可以來自免疫細(xì)胞。免疫細(xì)胞可以是t細(xì)胞，b細(xì)胞，k細(xì)胞或吞噬細(xì)胞。吞噬細(xì)胞可以是單核細(xì)胞，嗜酸性粒細(xì)胞，巨噬細(xì)胞，嗜中性粒細(xì)胞，肥大細(xì)胞或嗜堿性粒細(xì)胞。受體可以來自非免疫細(xì)胞。例如，非免疫細(xì)胞可以是器官或組織。非免疫細(xì)胞可以是皮膚細(xì)胞，肺細(xì)胞，心臟細(xì)胞，乳腺細(xì)胞，肌肉細(xì)胞，腎細(xì)胞，神經(jīng)膠質(zhì)瘤和卵巢細(xì)胞。受體可以是細(xì)胞表面受體。受體可以是內(nèi)部受體。受體可以是離子通道受體，g蛋白受體或酶聯(lián)蛋白受體。受體可以是跨膜受體。受體可以包含外部配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(例如細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域)，跨疏水跨膜的結(jié)構(gòu)域，細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域或其任何組合。受體的實例包括但不限于煙堿乙酰膽堿受體，甘氨酸受體，gaba受體，谷氨酸受體，5-ht3受體，p2x受體，環(huán)核苷酸門控離子通道，ip3受體，細(xì)胞內(nèi)atp受體，蘭尼堿(ryanodine)受體，t細(xì)胞受體(tcr)，b細(xì)胞受體(bcr)，模式識別受體(prr)，toll樣受體(tlr)，殺傷活化受體(kar)，殺傷抑制因子受體(kir)，補體受體，fc受體，趨化因子受體，干擾素受體，生長因子受體，包括例如表皮生長因子受體(egfr)和人表皮生長因子受體2(her2)。受體可以是細(xì)胞因子受體，絲氨酸/蘇氨酸激酶受體，酪氨酸激酶受體，ifn-α/β受體(ifnar)，ifngr，il10r2，ifnlr1或腫瘤壞死因子受體(tnf-r)。

本公開的靶分子可以包含細(xì)胞因子。細(xì)胞因子包括但不限于趨化因子，干擾素，白介素，淋巴因子和腫瘤壞死因子(tnf)。趨化因子可以來自cxc，cc，cx3c或xc亞族。趨化因子可以是ccl2,ccl3,ccl5,ccl7,ccl8,ccl13,ccl17和ccl22。趨化因子可以是ccr1,ccr2,ccr3,ccr4,ccr5,cxcr2和cxcr4。趨化因子可以是ccll1,ccl24,ccl26,ccl5,ccl7,ccl13和ccl3。趨化因子可以是ccl2,ccll,ccl22和ccl17。趨化因子可以是cxc趨化因子。趨化因子可以是cxc8。干擾素可以是i型干擾素，ii型干擾素，或iii型干擾素。干擾素可以是ifn-a,ifn-β,ifn-ε,ifn-κ,ifn-co,ifn-γ。白介素(il)可以是il-1,il-2,il-3,il-4,il-5,il-6,il-7,il-8,il-9,il-10,il-11,il-12,il-13,il-15,或il-17。淋巴因子可以是粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子或干擾素-gamma。腫瘤壞死因子可以是tnf,淋巴因子-alpha,cd40l,cd27l,cd30l,fasl,4-1bbl,ox40l,和tnf相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(trail)。本公開的靶分子也可以是神經(jīng)肽。

本公開的靶分子可以包含酶。酶可以分為氧化還原酶，轉(zhuǎn)移酶，水解酶，裂合酶，異構(gòu)酶和連接酶。氧化還原酶可以催化氧化/還原反應(yīng)。轉(zhuǎn)移酶可以轉(zhuǎn)移官能團(例如甲基或磷酸基團)。水解酶可以催化各種鍵的水解。裂合酶可以通過除水解和氧化以外的手段切割各種鍵。異構(gòu)酶可以催化單分子內(nèi)的異構(gòu)化變化。連接酶可以用共價鍵連接兩個分子。酶可以是乳糖酶，還原酶，脫氫酶和聚合酶。該酶可以是醇脫氫酶，醇脫氫酶，高絲氨酸脫氫酶，氨基丙醇氧化還原酶，二乙酰還原酶，甘油脫氫酶，丙二醇-磷酸脫氫酶，甘油-3-磷酸脫氫酶，d-木酮糖還原酶，l-木酮糖還原酶，乳酸脫氫酶，蘋果酸脫氫酶，異檸檬酸脫氫酶，hmg-coa還原酶，脫羧酶，脫水酶，醛裂合酶，含氧酸裂合酶，碳-碳裂合酶，碳-氮裂合酶，碳-硫裂合酶，碳-鹵化物裂合酶，磷-氧裂合酶，亞鐵螯合酶，腺苷酸環(huán)化酶，脫氨酶，氧化酶，激酶或細(xì)菌自身誘導(dǎo)劑的酶。

本公開的靶分子可以包含聚合酶。聚合酶可以是dna聚合酶，rna聚合酶或dna/rna聚合酶。聚合酶可以是真核聚合酶。聚合酶可以是原核聚合酶。dna聚合酶可以是poli，polii，poliii，poliv或polv。dna聚合酶可以是聚合酶beta，聚合酶lambda，聚合酶sigma，聚合酶mu，聚合酶alpha，聚合酶δ，聚合酶epsilon，聚合酶eta，聚合酶iota，聚合酶kappa，聚合酶rev1，聚合酶zata，端粒末端轉(zhuǎn)移酶，聚合酶gamma和聚合酶theta。rna聚合酶可以是rna聚合酶i，rna聚合酶ii，rna聚合酶iii，rna聚合酶iv或rna聚合酶v。rna聚合酶可以是rnap。rna聚合酶可以包含rnap的亞基。rnap的亞基可以是β'，β，α'，a”和ω，聚合酶可以是rna依賴型dna聚合酶(rddp)，rddp可以是逆轉(zhuǎn)錄酶。聚合酶可以是dna聚合酶，ventr^tm(外切)dna聚合酶，dna聚合酶，taqdna聚合酶，t4dna聚合酶，高保真dna聚合酶，taqdna聚合酶，熱啟動dna聚合酶，dna聚合酶i，大(klenow)片段，高保真dna聚合酶，sp6rna聚合酶，t7rna聚合酶，大腸桿菌rna聚合酶，全酶，大腸桿菌rna聚合酶，核心酶，聚(u)聚合酶和大腸桿菌聚(a)聚合酶。

本公開的靶分子可以包含連接酶。連接酶可以是真核連接酶。連接酶可以是原核連接酶。連接酶可以是單鏈連接酶。連接酶可以是雙鏈連接酶。連接酶可以是dna連接酶。dna連接酶可以是t4dna連接酶，taqdna連接酶，t7dna連接酶，t3dna連接酶，9°n^tmdna連接酶和大腸桿菌dna連接酶。連接酶可以是rna連接酶。rna連接酶可以是t4rna連接酶1，t4rna連接酶2，t4rna連接酶截短，t4rna連接酶2截短k227q，t4rna連接酶2截短kq和熱穩(wěn)定性5'appdna/rna連接酶。連接酶可以是熱穩(wěn)定連接酶。連接酶可以是dna/rna連接酶。連接酶可以是連接酶，平端(blunt)/ta連接酶和粘端連接酶。連接酶可以是circligasetm，circligasetmii。

本公開的靶分子可以包含逆轉(zhuǎn)錄酶。逆轉(zhuǎn)錄酶可以是病毒逆轉(zhuǎn)錄酶。病毒逆轉(zhuǎn)錄酶可以是逆轉(zhuǎn)錄病毒逆轉(zhuǎn)錄酶。逆轉(zhuǎn)錄酶可以是真核逆轉(zhuǎn)錄酶。逆轉(zhuǎn)錄酶可以是amv逆轉(zhuǎn)錄酶，ii逆轉(zhuǎn)錄酶，m-mulv逆轉(zhuǎn)錄酶，逆轉(zhuǎn)錄酶，ii逆轉(zhuǎn)錄酶，iii逆轉(zhuǎn)錄酶，hiv-1逆轉(zhuǎn)錄酶或端粒末端轉(zhuǎn)移酶逆轉(zhuǎn)錄酶。

本公開的靶分子可以包含核酸酶。核酸酶可以是dna酶。核酸酶可以是rna酶。核酸酶可以是外切核酸酶。外切核酸酶可以是λ外切核酸酶，外切核酸酶vii，t5外切核酸酶，t7外切核酸酶，外切核酸酶t，外切核酸酶i(大腸桿菌)，外切核酸酶v(recbcd)或外切核酸酶iii(大腸桿菌)。核酸酶可以是內(nèi)切核酸酶。內(nèi)切核酸酶可以是內(nèi)切核酸酶iv，t7內(nèi)切核酸酶i，內(nèi)切核酸酶v，內(nèi)切核酸酶viii，tma內(nèi)切核酸酶iii，內(nèi)切核酸酶iii(nth)，t4pdg(t4內(nèi)切核酸酶v)或tth內(nèi)切核酸酶iv。rna酶可以是rna酶h，rna酶hii，rna酶if，rna酶iii，xrn-1。核酸酶的實例包括但不限于afu尿嘧啶-dna糖基化酶(udg)，tma內(nèi)切核酸酶iii，tth內(nèi)切核酸酶iv，南極熱不穩(wěn)定udg，ape1，cas9核酸酶，化膿性鏈球菌(s.pyogenes)，dna酶i，內(nèi)切核酸酶iii(nth)，內(nèi)切核酸酶iv，內(nèi)切核酸酶v，內(nèi)切核酸酶viii，外切核酸酶i(大腸桿菌)，外切核酸酶iii(大腸桿菌)，外切核酸酶t，外切核酸酶v(recbcd)，外切核酸酶vii，fpg，haag，hogg1，hsmug1，lambda外切核酸酶，lambda外切核酸酶反應(yīng)緩沖液，微球菌核酸酶，綠豆核酸酶，核酸酶bal-31，recaf，recjf，t4pdg(t4內(nèi)切核酸酶v)，t5外切核酸酶，t7內(nèi)切核酸酶i，t7外切核酸酶，尿嘧啶糖基化酶抑制劑(ugi)和尿嘧啶-dna糖基化酶(udg)。

本公開的靶分子可以包括解旋酶。解旋酶可以是真核解旋酶。解旋酶可以是原核解旋酶。解旋酶可以是dna解旋酶。解旋酶可以是rna解旋酶。解旋酶可以是dna/rna解旋酶。解旋酶可以是atp依賴性解旋酶。解旋酶可以是單鏈解旋酶。解旋酶可以是雙鏈解旋酶。解旋酶可以是色結(jié)構(gòu)域解旋酶dna結(jié)合蛋白。解旋酶可能是dead盒/dead/deah盒解旋酶。解旋酶的實例包括但不限于atxr，xpd，recq，ascc3，blm，brip1，dna2，fbx018，fbxo30，helb，hells，helq，helz，hfm1，hltf，ifih1，nav2，pif1，recql，rtel1，shprh，smarca4，smarcal1，wrn，wrnip1，ddx3x，ddx5，ddx6，ddx10，ddx11，ddx12，ddx58，dhx8，dhx9，dhx37，dhx40，dhx58，chd1，chd1l，chd2，chd3，chd4，chd5，chd6，chd7，chd8和chd9。

本公開的靶分子可以包含轉(zhuǎn)座酶。轉(zhuǎn)座酶可以是dna轉(zhuǎn)座酶。轉(zhuǎn)座酶可以是tn5轉(zhuǎn)座酶或mosldna轉(zhuǎn)座酶。轉(zhuǎn)座酶可以是整合酶。整合酶可以是病毒整合酶。轉(zhuǎn)座酶可以是hiv-1in，asvin和mua轉(zhuǎn)座酶。

本公開的靶分子可以包含抗體或抗體片段?？贵w可以包含免疫球蛋白(ig)。免疫球蛋白可以是igg，igm，iga，igd，ige?？贵w可以包含抗體輕鏈。抗體輕鏈可以是κ或λ輕鏈?？贵w可以包含抗體重鏈?？贵w重鏈可以包含α，γ，δ，ε或μ重鏈?？贵w可以包含抗體片段?？贵w可以包含片段抗原結(jié)合(fab)，fab2，可結(jié)晶片段(fc)，可變片段(fv)，可變單鏈片段(scfv)，二聚單鏈可變片段(di-scfv)，單結(jié)構(gòu)域抗體sdab)，scfv-fc，微型抗體，雙抗體，重鏈可變結(jié)構(gòu)域(vh結(jié)構(gòu)域)，輕鏈可變域(vl結(jié)構(gòu)域)，重鏈恒定結(jié)構(gòu)域(ch結(jié)構(gòu)域)，輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域(cl結(jié)構(gòu)域)，互補決定區(qū)(cdr)。抗體可以是單體?？贵w可以是二聚體。二聚體可以是同二聚體。二聚體可以是異二聚體?？贵w可以是多聚體。抗體可以是五聚體?？贵w可以是雙特異性抗體?？贵w可以是駱駝科的(camelid)。抗體可以是三功能抗體。抗體可以是雙特異性t細(xì)胞結(jié)合劑(bite)?？贵w可以是單克隆抗體?？贵w可以是多克隆抗體?？贵w可以是嵌合抗體。嵌合抗體可以指包含衍生自兩個或更多個來源的區(qū)域的抗體。兩個或更多來源可以來自不同的物種。或者，兩個或更多個來源可以來自不同的細(xì)胞。細(xì)胞可以是相同的細(xì)胞類型的?；蛘?，細(xì)胞可以是不同細(xì)胞類型的?？贵w可以是人抗體。抗體可以是人源化抗體。抗體可以來自哺乳動物、爬行動物、飛禽和魚。哺乳動物可以是人，非人靈長類，狗，貓，牛，綿羊，兔，山羊，大鼠，小鼠，熊，馬，駱駝和豬?？贵w的實例包括但不限于阿巴伏單抗(abagovomab),阿昔單抗(abciximab),actoxumab,阿達(dá)木單抗(adalimumab),adecatumumab,aducanumab,阿非莫單抗(afelimomab),afutuzumab,培化阿珠單抗(alacizumabpegol),ald518,阿倫單抗(alemtuzumab),alirocumab,altumomabpentetate,amatuximab,馬安莫單抗anatumomabmafenatox,阿尼法魯單抗anifrolumab,安非他珠單抗(anrukinzumab)，阿泊珠單抗(apolizumab)，奧美珠單抗(arcitumomab)，阿曲珠單抗(aselizumab)，阿沙單抗(atinumab)，阿托木單抗(atorolimumab),bapineuzumab,巴利昔單抗basiliximab,巴維昔單抗(bavituximab),貝妥莫單抗bectumomab,貝利單抗belimumab,benralizumab,柏替木單抗(bertilimumab),besilesomab,貝伐單抗(bevacizumab),bezlotoxumab,比西單抗(biciromab),bimagrumab,bivatuzumabmertansine,blinatumomabblosozumab,布妥昔單抗(brentuximabvedotin),briakinumab,brodalumab,康納單抗(canakinumab),cantuzumabmertansine,cantuzumabravtansine,caplacizumab,capromabpendetide,carlumab,卡妥索單抗(catumaxomab),cc49,cbr96-多柔比星免疫綴合物,西利珠單抗(cedelizumab),聚乙二醇化塞妥珠單抗(certolizumabpegol),西妥昔單抗(cetuximab),citatuzumabbogatox,西妥木單抗(cixutumumab),clazakizumab,克立昔單抗(clenoliximab),clivatuzumabtetraxetan,conatumumab,concizumab,克雷內(nèi)治單抗(crenezumab),cr6261,達(dá)西珠單抗(dacetuzumab),達(dá)利珠單抗(daclizumab),dalotuzumab,daratumumab,demcizumab,德尼單抗(denosumab),地莫單抗(detumomab),阿托度單抗(dorlimomabaritox),drozitumab,duligotumab,dupilumab,dusigitumab,ecromeximab,艾庫組單抗(eculizumab),埃巴單抗(edobacomab),依決洛單抗(edrecolomab),依法利珠單抗(efalizumab),依芬古單抗(efungumab),eldelumab,埃羅妥珠單抗(elotuzumab),elsilimomab,enavatuzumab,培恩莫單抗enlimomabpegol,enokizumab,enoticumab,ensituximab,epitumomabcituxetan,依帕珠單抗(epratuzumab),厄立珠單抗(erlizumab),ertumaxomab,伊瑞西珠(etaracizumab),etrolizumab,evolocumab,艾韋單抗(exbivirumab),fanolesomab,faralimomab,farletuzumab,fasinumab,fbta05,泛維珠單抗(felvizumab),fezakinumab,ficlatuzumab,figitumumab,flanvotumab,fontolizumab,foralumab,foravirumab,fresolimumab,fulranumab,futuximab,加利昔單抗(galiximab),蓋尼塔單抗(ganitumab),gantenerumab,gavilimomab,吉妥珠單抗奧唑米星(gemtuzumabozogamicin),gevokizumab,girentuximab,glembatumumabvedotin,戈利木單抗(golimumab),gomiliximab,guselkumab,ibalizumab,替伊莫單抗(ibritumomabtiuxetan),icrucumab,伊戈伏單抗(igovomab),imab362,英西單抗(imciromab,imgatuzumab,inclacumab,indatuximabravtansine,英夫利昔單抗(infliximab),intetumumab,伊諾莫單抗(inolimomab),inotuzumabozogamicin,普利姆瑪(ipilimumab),iratumumab,itolizumab,ixekizumab,keliximab,labetuzumab,lambrolizumab,lampalizumab,lebrikizumab,lemalesomab,lerdelimumab,lexatumumab,libivirumab,ligelizumab,林妥珠單抗(lintuzumab),linlumab,lodelcizumab,lorvotuzumabmertansine,魯卡木單抗(lucatumumab),魯昔單抗(lumiliximab),mapatumumab,margetuximab,maslimomab,mavrilimumab,馬妥珠單抗(matuzumab),美泊利單抗(mepolizumab),metelimumab,milatuzumab,明瑞莫單抗(minretumomab),mitumomab,mogamulizumab,morolimumab,motavizumab,moxetumomabpasudotox,muromonab-cd3,nacolomabtafenatox,namilumab,naptumomabestafenatox,narnatumab,natalizumab,nebacumab,necitumumab,nerelimomab,nesvacumab,nimotuzumab,nivolumab,nofetumomabmerpentan,ocaratuzumab,ocrelizumab,odulimomab,ofatumumab,olaratumab,olokizumab,omalizumab,onartuzumab,ontuxizumab,oportuzumabmonatox,oregovomab,orticumab,otelixizumab,otlertuzumab,oxelumab,ozanezumab,ozoralizumab,pagibaximab,palivizumab,panitumumab,pankomab,panobacumab,parsatuzumab,pascolizumab,pateclizumab,patritumab,pemtumomab,perakizumab,pertuzumabpexelizumab,pidilizumab,pinatuzumabvedotin,pintumomab,placulumab,polatuzumabvedotin,ponezumab,pnliximab,pritoxaximab,pritumumab,pro140,quilizumab,racotumomab,radretumab,rafivirumab,ramucirumab,ranibizumab,raxibacumab,regavirumab,reslizumab,rilotumumab,rituximab,robatumumab,roledumab,romosozumab,rontalizumab,rovelizumabruplizumab,samalizumab,sarilumab,satumomabpendetide,secukinumab,seribantumab,setoxaximab,sevirumab,sibrotuzumab,sgn-cdl9a,sgn-cd33a,sifalimumab,siltuximab,simtuzumab,siplizumab,sirukumab,solanezumab,solitomab,sonepcizumab,sontuzumab,stamulumab,sulesomab,suvizumab,tabalumab,tacatuzumabtetraxetan,tadocizumab,talizumab,tanezumab,taplitumomabpaptox,tefibazumab,telimomabaritox,tenatumomab,teneliximab,teplizumab,teprotumumab,tgnl412,ticilimumab,tremelimumab,tildrakizumab,tigatuzumab,tnx-650,tocilizumab,atlizumab,toralizumab,tositumomab,tovetumab,tralokinumab,trastuzumab,trbs07,tregalizumab,tremelimumab,tucotuzumabcelmoleukin,tuvirumab,ublituximab,urelumab,urtoxazumab,ustekinumab,vantictumab,vapaliximab,vatelizumab,vedolizumab,veltuzumab,維帕莫單抗(vepalimomab),vesencumab,visilizumab,volociximab,vorsetuzumabmafodotin,伏妥莫單抗(votumumab),zalutumumab,zanolimumab,zatuximab,ziralimumab和阿佐莫單抗(zolimomabaritox)。

本公開的靶分子可以包含多核苷酸。多核苷酸可以包含一個或多個核苷酸。多核苷酸可以包含2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,或20個或更多個核酸。多核苷酸可以包含20,30,40,50,60,70,80,90,100,110,120,130,140,150,160,170,180,190或200個或更多個核酸。多核苷酸可以包含200,300,400,500,600,700,800,900,1000,1100,1200,1300,1400,1500,1600,1700,1800,1900或2000或更多個核酸。一個或多個核苷酸可以包含核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，鎖定核酸(lna)，肽核酸(pna)或其任何組合。多核苷酸可以包含嘌呤堿基，嘧啶堿基或兩者。多核苷酸可以包含或天然的，化學(xué)修飾的，生物化學(xué)修飾的，非天然的或衍生的核苷酸堿基。多核苷酸可以包含一個或多個未配對的核苷酸堿基。多核苷酸可以是單鏈的。多核苷酸可以包含一個或多個配對核苷酸堿基。多核苷酸可以是雙鏈的。多核苷酸可以包含雙鏈dna，雙鏈rna或雙鏈dna/rna雜合體。多核苷酸可以是合成的多核苷酸。在某些情況下，多核苷酸的序列是已知的。例如，多核苷酸可以包含多聚腺苷酸化的序列。在某些情況下，多核苷酸的序列是未知的。例如，隨機序列的多核苷酸可以包含簡并序列。在某些情況下，僅多核苷酸序列的一部分是已知的。例如，多核苷酸可以包含多聚腺苷酸化序列，但序列的其余部分是未知的。

本公開的靶分子可以包含寡核苷酸引物。寡核苷酸引物可以是擴增或測序引物。擴增或測序引物可用于另一多核苷酸的擴增或測序。例如，擴增或測序引物可以包含與基因部分互補的序列。擴增或測序引物可以與基因雜交，并能夠擴增或測序基因。擴增或測序引物可以是特異性引物。通常，特異性引物與多核苷酸(例如，基因，外顯子區(qū)等)的序列互補。多核苷酸的序列可以對于多核苷酸是獨特的。例如，特異性引物可以與抗體基因的至少一部分雜交。擴增或測序引物可以是通用引物。通常，通用引物與兩種或更多種類型的多核苷酸共有的序列互補。例如，通用引物可以包含可以與兩個或多個多核苷酸(例如mrna)的多聚腺苷酸化序列雜交的oligodt序列。擴增或測序引物可以與多核苷酸天然的序列(例如，mrna的polya序列，限制性位點，外顯子區(qū))雜交。擴增或測序引物可以與多核苷酸非天然的序列(例如，銜接子序列或條形碼序列)雜交。擴增或測序引物可以包含隨機或簡并序列。例如，擴增或測序引物可以包含隨機六聚體序列。擴增或測序引物的實例包括但不限于oligodt，隨機引物，基因特異性引物和啟動子引物。oligodt引物可以是寡聚(dt)20，寡聚(dt)18或寡聚(dt)12-18引物。隨機引物可以是隨機的9聚體引物或隨機6聚體引物。隨機引物可以包含寡脫氧核糖核苷酸?；蛘?，隨機引物包括寡脫氧核苷酸?；蛱禺愋砸锏膶嵗ǖ幌抻诩?xì)胞因子基因引物和持家基因引物。啟動子引物可以是例如sp6引物，t7啟動子引物，runx2啟動子引物，gapdh啟動子引物，u6啟動子引物，t3啟動子引物和camv35s啟動子引物。靶分子可以包含選自下組的寡核苷酸引物：3’οx1(用于具有aox1終止子的序列，反向引物)，5’aοx1(用于具有aox1啟動子的序列，正向引物)，35s啟動子(camv35s啟動子，正向引物)，ac5(果蠅(drosophila)肌動蛋白5c啟動子，正向引物)，alpha-因子(alpha因子信號序列，正向引物)，amp-r(氨芐青霉素抗性基因的5'端，反向引物)，aug1正向(用于具有aug1啟動子的序列，正向引物)，aug1反向(用于具有aug1啟動子的序列，反向引物)，bgh反向(牛生長激素終止子，反向引物)，bglob-intron-f(兔beta-珠蛋白內(nèi)含子，正向引物)，bglob-intron-r(兔beta-珠蛋白內(nèi)含子，反向引物)，bglob-pa-r(兔beta-珠蛋白polya區(qū)，反向引物)，cat-r(氯霉素抗性基因的5'端，反向引物)，cmv正向(人cmv立即早期啟動子，正向引物)，cre-r(cre重組酶的5'端，反向引物)，cyc1(cyc1轉(zhuǎn)錄終止信號，反向引物)，dsred1-c(dsred1的3'端，正向引物)，dsred1-n(dsred1的5'端，反向引物)，ebv反向(sv40polya終止子，反向引物)，蛻皮激素正向(果蠅熱休克啟動子，正向引物)，ef-1a正向(人延長因子-1a啟動子，正向引物)，egfp-c(egfp的3'端，正向引物)，egfp-n(egfp的5’端，反向引物)，exfp-r(用于區(qū)分egfp與ecfp與eyfp，反向引物)，f1ori-f(f1起源，正向引物)，gal1(釀酒酵母gal1啟動子，正向引物)，gal10pro-f(釀酒酵母gal10啟動子，正向引物)，gal4n-term(gal4dna結(jié)合端的3'端，正向引物)，gal4-ad(gal4活化域的3’端，正向引物)，gfp-f(gfp的3'端，正向引物)，gfp-r(gfp的5’端，反向引物)，gpdpro-f(釀酒酵母gpd啟動子，正向引物)，gw-3'(gatewaycassette的3’端，正向引物)，gw-5'(gateway盒的5’端，反向引物)，h1(人h1啟動子，正向引物)，ha-f(ha標(biāo)簽，正向引物)，ha-r(ha標(biāo)簽，反向引物)，hat(組氨酸親和標(biāo)簽，正向引物)，hgh-pa-r(人生長激素終止子，反向引物)，hrgfp-r(hrgfp(人源化renillagfp)，正向引物)，hubcpro-f(人泛素c(ubc)啟動子，正向引物)，ires-f(ires的3’端，正向引物)，ires-r(ires的5’端，反向引物)，l4440(l4440載體中的mcs的5'，正向引物)，laci-r(laci的5’端，反向引物)，lacz-r(lacz的5’端，反向引物)，lexa(lexadna結(jié)合域的3’端，正向引物)，lko.15'(人u6啟動子，正向引物)，lncx(人cmv啟動子，正向引物)，luc-f(螢光素酶的3’端，正向引物)，lucnrev(螢光素酶的5’端，反向引物)，m13(-21)正向(在lacz基因中)，m13(-40)(在lacz基因中)，m13反向(在lacz基因中)，m13/puc正向(在lacz基因中)，m13/puc反向(在lacz基因中)，mbp-f(麥芽糖結(jié)合蛋白的3’端，正向引物)，mcherry-f(mcherry的3’端，正向引物)，mcherry-r(mcherry的5’端，反向引物)，mt正向(果蠅金屬硫蛋白啟動子，正向引物)，mmlv-f(moloney鼠白血病病毒ltr(momulv)，正向引物)，mpgk-f(小鼠pgk啟動子，正向引物)，mscv(鼠干細(xì)胞病毒，正向引物)，mscv-rev(鼠干細(xì)胞病毒，反向引物)，mt1-f(小鼠金屬硫蛋白1啟動子，正向引物)，mu6-f(小鼠u6啟動子，正向引物)，myc(myc標(biāo)簽，正向引物)，neo-f(新霉素抗性基因的3’端，正向引物)，neo-r(新霉素抗性基因的5’端，反向引物)，nos-f(nopaline合酶啟動子，正向引物)，nmtl-f(裂殖酵母(s.pombe)nmt1啟動子，正向引物)，opie2正向(opie2啟動子，正向引物)，pacyc-f(p15a起源，正向引物)，pad-cmv(用于pad-cmv載體中sali后的克隆位點)，pbabe3'(sv40增強子，pbabe載體中mcs的3’，反向引物)，pbabe5'(psi包裝信號，pbabe載體中的mcs的5'，正向引物)，pbad正向(用于具有大腸桿菌arabad啟動子的序列，正向引物)，pbad反向(用于具有大腸桿菌arabad啟動子的序列，反向引物)，pbluescriptks(用于pbluescript載體序列)，pbluescriptsk(用于pbluescript載體序列)，pbmn5'(mmlv序列，用于pbmn逆轉(zhuǎn)錄病毒中的插入物)，pbr322ori-f(pbrs322起源，正向引物)，pbrforbam(在pbr322tet區(qū)中，bamhi上游，正向引物)，pbrforeco(在pbr322中，在ecori位點上游，正向引物)，pbrrevbam(在pbr322tet區(qū)中，在bamhi下游，反向引物)，pcag-f(兔beta-珠蛋白內(nèi)含子，用于pcag質(zhì)粒，正向引物)，pcasper-f(果蠅mini-white基因的5’端，反向引物)，pcasper-hs(果蠅hsp70啟動子，正向引物)，pcdl-f(pcdl載體中的ecori位點的5'，正向引物)，pentr-f(pentr載體中的attll的5'，正向引物)，pentr-r(pentr載體中的attl2的3'，反向引物)，pgex3'(pgex載體中的mcs的3'，反向引物)，pgex5'(谷胱甘肽-s-轉(zhuǎn)移酶的3’端，正向引物)，pgp704-r(r6kgamma起源，pgp704載體中的mcs的3'，反向引物)，phyblex反向(adh終止子，反向引物)，pltet-f(lambda噬菌體早期左邊(pl)啟動子，正向引物)，p1xsn5'(鼠干細(xì)胞病毒，與mscv相同，正向引物)，pmrb10l-f(hcmv主要立即早期蛋白(ie)，正向引物)，pmt2-f(合成內(nèi)含子的3’端，正向引物)，pmx-s1811(mmlv序列，pmx載體中的mcs的5'，正向引物)，多角體蛋白(polyhedrin)正向(多角體蛋白啟動子，正向引物)，多角體蛋白反向(具有多角體蛋白啟動子的對于桿狀病毒載體，反向引物)，pqe啟動子(在pqe載體中的mcs的5'，正向引物)，prep正向(勞斯肉瘤病毒(rsv)啟動子，正向引物)，prs-標(biāo)志物(以對prs載體中的酵母選擇標(biāo)志物測序)，pry1(pzp-元件，反向引物)，ptrchis正向(在ptrchis載體中的mcs的5'，正向引物)，ptrchis反向(在ptrchis載體中的mcs的3'，與pbad-r相同，反向引物)，puro-f(嘌呤霉素抗性基因的3'端，正向引物)，pzip(鼠白血病病毒(mulv)，反向引物)，rcas-f(勞斯肉瘤病毒(rsv)env基因的3'，正向引物)，rluc-f(renilla螢光素酶的3’端，正向引物)，rvprimer3(在pgl3載體中的mcs的5'，正向引物)，sffv-f(脾焦點形成病毒(spleenfocusformingvirus)5'ltr，正向引物)，sp6(sp6啟動子，正向引物)，sv40pa-r(sv40polya，反向引物)，sv40pro-f(sv40啟動子/起點，正向引物)，sv40-splicer(sv40剪接序列，反向引物)，t3(t3啟動子，正向引物)，t7(t7啟動子，正向引物)，t7terminal(t7終止子，反向引物)，tac啟動子(tac啟動子，正向引物)，tdtomato-fwd(tdtomato的3’端，正向引物)，tdtomato-rev(tdtomato的5’端，反向引物)，tet-r(四環(huán)素抗性基因的5’端，反向引物)，tk-pa-r(胸苷激酶polya，反向引物)，tn7-end(細(xì)菌轉(zhuǎn)座子tn7)，trc-f(人u6啟動子，正向引物)，ubx-f(果蠅ultrabithorax基因，正向引物)，v5反向(v5表位，反向引物)，wpre-r(wpre的5’端，反向引物)，xbg-r(爪蟾beta-珠蛋白3'utr，反向引物)，xef1a(爪蟾ef1alpha增強子/啟動子，正向引物)，和xpress正向(xpress表位，正向引物)。

本公開的靶分子可以包含rna分子。rna可以是蛋白質(zhì)編碼性rna。蛋白質(zhì)編碼性rna可以是mrna。rna可以是非編碼rna(ncrna)。ncrna可以是核糖體rna(rrna)，轉(zhuǎn)移rna(trna)，小干擾rna(sirna)，微小rna(mirna)，小核rna(snrna)，小核仁rna(snorna)，長非編碼rna(incrna)和piwi相互作用的rna(pirna)。rna可以是合成的rna。合成rna的實例包括但不限于反義rna，短發(fā)夾rna(shrna)，互補rna(crna)。rna可以從外顯子衍生。rna可以從內(nèi)含子衍生。rna可以在非翻譯區(qū)(utr)上衍生。rna可以是聚腺苷酸化的。在某些情況下，rna不是聚腺苷酸化的。

本公開的靶分子可以包含dna分子。dna可以是基因組dna(gdna)或互補dna(cdna)。dna可以是b-dna。dna可以是a-dna。dna可以是z-dna。dna可以包含蛋白質(zhì)編碼區(qū)的至少一部分。dna可以包含基因的至少一部分。dna可以包含外顯子。dna可以包含內(nèi)含子。dna可以包含非翻譯區(qū)(utr)。dna可以包含非編碼dna的至少一部分。非編碼dna可以包含轉(zhuǎn)錄成非編碼rna的序列。非編碼dna可以包含調(diào)節(jié)元件。調(diào)節(jié)元件可以是順式調(diào)節(jié)元件。調(diào)節(jié)元件可以是反式調(diào)節(jié)元件。調(diào)節(jié)元件可以是啟動子。啟動子可以促進基因的轉(zhuǎn)錄。該啟動子可以位于編碼區(qū)的上游。調(diào)節(jié)元件可以是增強子。增強子可以對基因的轉(zhuǎn)錄水平發(fā)揮遠(yuǎn)距離的作用。非編碼dna可以包含假基因。非編碼dna可以包含轉(zhuǎn)座子或反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子。非編碼dna可以包含重復(fù)序列，例如長散在核元件(lines)和短散在核元件(sines)。sine可以包含alu序列。非編碼dna可以包含病毒元件。非編碼dna可以包含端粒。

本公開的靶分子可以包含碳水化合物。碳水化合物可以是單糖，二糖，寡糖或多糖。單糖的實例包括但不限于甘油醛，半乳糖胺，葡糖胺，唾液酸，n-乙酰葡糖胺，磺基金雞納糖(sulfoquinovose)，吡喃糖，吡喃葡萄糖，呋喃糖，葡萄糖，果糖和半乳糖。二糖可以是蔗糖，乳糖，海藻糖，纖維二糖或麥芽糖。寡糖可以是低聚果糖(fructo-oligosaccharide)，低聚半乳糖(galactooligosaccharide)和甘露聚糖寡糖。多糖可以是儲存多糖。多糖可以是結(jié)構(gòu)多糖。多糖的實例包括但不限于淀粉，糖原，甲殼質(zhì)，淀粉酶，支鏈淀粉，愈創(chuàng)葡聚糖(callose)或昆布多糖，金藻昆布多糖(chrysolaminarin)，木聚糖，阿拉伯木聚糖，甘露聚糖，巖藻依聚糖半乳甘露聚糖和纖維素。

本公開的靶分子可以包含有機化合物。通常，有機化合物是其分子含有碳的化合物。有機化合物可以是天然化合物。通常天然有機化合物是指由植物或動物產(chǎn)生的化合物。天然有機化合物的實例包括大多數(shù)糖，一些生物堿和萜類化合物，某些營養(yǎng)物質(zhì)如維生素b12。有機化合物可以是合成化合物。通常，合成有機化合物可以通過其它化合物的反應(yīng)制備，稱為“合成的”。聚合物，包括塑料和橡膠，可以是有機合成或半合成化合物。一些有機化合物可以使用細(xì)菌和酵母等生物體的生物化學(xué)制造。有機化合物可以是小分子，醇，脂肪酸，聚酮，激素或碳水化合物。

本公開的靶分子可以包含無機化合物。通常，不稱為有機化合物的化合物是無機化合物。含碳無機化合物的實例包括但不限于碳化物，碳酸鹽，碳的簡單氧化物(例如co和co2)和氰化物。無機化合物可以包括量子點，金屬納米粒子，金屬氧化物納米顆粒等。無機化合物還可以包括礦物質(zhì)，硫化物，有機金屬化合物和生物有機化合物。礦物質(zhì)可以是滑石，石膏，方解石，螢石，磷灰石，正長石，石英，黃玉，剛玉或金剛石。

本公開的靶分子可以包含小分子。小分子可以包含肽。肽包含一個或多個氨基酸。氨基酸可以是天然氨基酸。氨基酸可以是非天然氨基酸。氨基酸可以是d-氨基酸。氨基酸可以是l-氨基酸。氨基酸的實例包括但不限于對乙?；奖彼幔g乙?；奖彼?，丙氨酸，β-丙氨酸，γ-氨基丁酸(gaba)，氨基異丁酸，δ-氨基乙酰丙酸，4-氨基苯甲酸(paba)，精氨酸，天冬酰胺，天門氨酸，對苯氧基-1-苯丙氨酸，瓜氨酸，胱硫醚，半胱氨酸，胱氨酸，二氨基庚二酸，今可豆氨酸(djenkolicacid)，谷氨酸，谷氨酰胺，甘氨酸，組氨酸，異亮氨酸，羊毛硫氨酸，亮氨酸，賴氨酸，甲硫氨酸，鳥氨酸，苯丙氨酸，苯基硒基丙氨酸(phenylselenidylalanine)，脯氨酸，硒代半胱氨酸，絲氨酸，蘇氨酸，色氨酸，酪氨酸和纈氨酸。小分子可以包含治療劑。

本公開的靶分子可以包含代謝物。代謝物的實例包括但不限于生物堿，糖苷，脂質(zhì)，非核糖體肽，如放線菌素d，吩嗪，天然酚(包括類黃酮)，聚酮化合物，萜烯，包括類固醇和四吡咯。

本公開的靶分子可以包含治療劑。治療劑可以包含有機化合物，無機化合物，肽，激素，小分子，抗體，抗原，半抗原或其任何組合。治療劑可以是解熱藥，鎮(zhèn)痛藥，抗瘧藥，抗生素，防腐劑，情緒穩(wěn)定劑，激素替換，口服避孕藥，興奮劑，安定藥，抗病毒藥，抗癌藥，免疫抑制劑和他汀類。安定藥可以是甲丙氨酯，氯丙嗪，利血平，氯氮卓，安定和阿普唑侖。他汀可以是洛伐他汀，普伐他汀或辛伐他汀。

在一些實施方案中，本文提供的基礎(chǔ)包含多個特征?；咨系亩鄠€特征在這里也稱為特征陣列或陣列。

圖5中描繪了包含兩個或更多個特征的例示性基底。如圖5中所示，基底(501)可以包含兩個或更多個特征(502,503)。第一特征(502)可以包含多個第一捕捉引物(504,505,506)和多個第二捕捉引物(507,508,509)。第一特征(502)可以進一步包含第一靶多核苷酸(510)。第一靶多核苷酸(510)可以通過將第一靶多核苷酸(510)附著于第一捕捉引物(504)而附于第一特征(502)。第一特征(502)可以進一步包含多個擴增子(512,513,514,515,516)。多個擴增子(512,513,514,515,516)可以包含第一靶多核苷酸(510)的擴增子。第一特征(502)可以進一步包含第一靶分子(511)?？梢詫⒌谝话蟹肿?511)附著于第一靶多核苷酸(510)。第二特征(503)可以包含多個第一捕捉引物(520,521,522)和多個第二捕捉引物(523,524,525)。第二特征(503)可以進一步包含第二靶多核苷酸(526)。第二靶多核苷酸(526)可以通過將第二靶多核苷酸(526)附著于第二捕捉引物(520)而附于第二特征(503)。第二特征(503)可以進一步包含多個擴增子(528,529,530,531,532)。多個擴增子(528,529,530,531,532)可以包含第二靶多核苷酸(526)的擴增子。第二特征(503)可以進一步包含第二靶分子(527)?？梢詫⒌诙蟹肿?527)附著于第二靶多核苷酸(526)?；卓梢园瑑蓚€或更多個相同特征。例如，第一特征(502)和第二特征(503)可以是相同的?；卓梢园瑑蓚€或更多個不同特征。例如，第一特征(502)和第二特征(503)可以是不同的。第一特征(502)和第二特征(503)可以相差與每個特征結(jié)合的第一捕捉引物。例如，第一特征(502)的多個第一捕捉引物(504,505,506)可以不同于第二特征(503)的多個第一捕捉引物(520,521,522)。第一特征(502)和第二特征(503)可以相差與每個特征結(jié)合的第二捕捉引物。例如，第一特征(502)的多個第二捕捉引物(507,508,509)可以不同于第二特征(503)的多個第二捕捉引物(523,524,525)。第一特征(502)和第二特征(503)可以相差與每個特征結(jié)合的靶多核苷酸。例如，第一特征(502)的第一靶多核苷酸(510)可以不同于第二特征(503)的第二靶多核苷酸(526)。隨后，第一特征(502)的多個擴增子(512,513,514,515,516)可以不同于第二特征(503)的多個擴增子(528,529,530,531,532)。第一特征(502)和第二特征(503)可以相差與每個特征結(jié)合的靶分子。例如，第一特征(502)的第一靶分子(511)可以不同于第二特征(503)的第二靶分子(527)。第一特征可以進一步包含一個或多個另外的靶分子。第二特征可進一步包含一個或多個另外的靶分子。來自第一特征的一個或多個另外的靶分子可以與第二特征中的一個或多個另外的靶分子相同。或者或另外，來自第一特征的一個或多個另外的靶分子可以不同于來自第二特征的一個或多個另外的靶分子。

具有多個特征的基底可以表現(xiàn)為點或斑塊的網(wǎng)格。特征可以以重復(fù)圖案定位?；蛘呋蛄硗?，特征可以以不規(guī)則的非重復(fù)圖案定位。在一些實施方案中，圖案是六邊形圖案，直線圖案，網(wǎng)格圖案，具有反射對稱性的圖案，具有旋轉(zhuǎn)對稱性的圖案等。非對稱圖案也可以是有用的。間距(pitch)在最近鄰近特征的不同對之間可以是相同的，或者間距在最近鄰近特征的不同對之間可以變化。

具有多個特征的基底以及使用這種陣列的本文所闡述的方法可以具有各種密度中的任一種的特征，包括例如至少約10個特征/cm²，100個特征/cm²，500個特征/cm²，1,000個特征/cm²，5,000個特征/cm²，10,000個特征/cm²，50,000個特征/cm²，100,000個特征/cm²，1,000,000個特征/cm²，5,000,000個特征/cm²或更高。

在具體實施方案中，陣列的特征可以各自具有大于約100nm²，250nm²，500nm²，1μm²，2.5μm²，5μm²，10μm²，100μm²，或500μm²的面積?；蛘呋蛄硗猓嚵械奶卣骺梢愿髯跃哂行∮诩s1mm²，500μm²，100μm²，25μm²，10μm²，5μm²，1μm²，500nm²或100nm²的面積。實際上，區(qū)域可以具有例如從上面例示的那些選擇的上限和下限之間的范圍內(nèi)的大小。

在一些實施方案中，陣列基底的表面上的特征是不連續(xù)的，由表面的間隙區(qū)域分開。與陣列的特征相比具有基本上更低的量或濃度的捕捉引物或其它捕獲劑的間隙區(qū)域可以是有用的。缺乏捕捉引物或其它捕獲劑的間隙區(qū)是特別有用的。例如，在間隙區(qū)域處相對少量或不存在捕獲劑有利于至少一種靶多核苷酸的定位，并隨后對期望的特征產(chǎn)生擴增子簇。

在具體的實施方案中，特征是表面(例如孔)中的凹特征，并且特征可以含有凝膠材料。含凝膠的特征在表面上彼此以間隙區(qū)域分開，在那里基本上不存在凝膠，或者如果存在的話，則凝膠基本上不能支持包含例如捕捉引物的多核苷酸的定位。

在一些實施方案中，孔是微孔或納米孔。用于制備和使用具有含有特征(如孔)的凝膠的基底的方法和組合物列于例如us2014/0243224中，其通過引用并入本文。

在一些實施方案中，陣列上的特征大小(例如，面積，直徑等)在有利于動力學(xué)排除擴增(kea)和特征中形成單分子放置的范圍內(nèi)選擇。通過參考采用孔作為特征的實施方案例示，孔的大小(例如，直徑)可以在約30nm和約1μm之間，在約50nm和約800nm之間，在約70nm和約600nm之間，或在100nm和約400nm之間變化。在一些實施方案中，孔具有約400nm的直徑。在一些實施方案中，孔具有小于約1μm的直徑。例示性的微陣列包括在hiseq-x10圖案化的流動池上的微陣列。

在包括表面上的特征陣列的一些實施方案中，特征可以是離散的，由間隙區(qū)域分開。特征的大小和/或區(qū)域之間的間隔可以變化，使得陣列可以是高密度，中密度或較低密度。

在一些實施方案中，陣列是高密度，中密度或低密度陣列。高密度陣列的特征在于具有以小于約15μm分開的區(qū)域。中密度陣列具有以約15至30μm分開的區(qū)域，而低密度陣列具有以大于30μm分開的區(qū)域?？捎糜诒景l(fā)明的陣列可以具有分開小于100μm，50μm，10μm，5μm，1μm或0.5μm的區(qū)域。

在一些實施方案中，陣列含有珠。在一些實施方案中，珠位于表面上，包括下述那些，其中珠位于孔中，諸如beadchip陣列(illuminainc.，sandiegoca)或者來自454lifesciences(roche子公司，baselswitzerland)或iontorrent(lifetechnologies子公司,carlsbadcalifornia)的測序平臺中使用的基底。具有位于表面上的珠的其它陣列記載于us6,266,459；us6,355,431；us6,770,441；us6,859,570；us6,210,891；us6,258,568；us6,274,320；us2009/0026082a1；us2009/0127589a1；us2010/0137143a1；us2010/0282617a1或pct公開no.wo00/63437，其各自通過引用并入本文。幾個上述參考文獻描述了在陣列基底之中或之上加載珠前將靶多核苷酸(或捕捉引物)附著于珠的方法。然而，應(yīng)當(dāng)理解，珠可以制成包括捕捉引物，然后可以將珠用于加載陣列，從而形成用于本文所述方法的擴增位點。如本文中先前列出，可以在沒有珠的情況下使用基底。

在一些實施方案中，例示性珠組合物包括但不限于塑料，陶瓷，玻璃，聚苯乙烯，甲基苯乙烯，丙烯酸聚合物，順磁材料，氧化釷溶膠，碳石墨，二氧化鈦，膠乳或交聯(lián)葡聚糖例如sepharose，纖維素，尼龍，交聯(lián)膠束和teflon，以及本文概述的固體支持物的任何其它材料都可以使用。來自bangslaboratories，fishersind.的“microspheredetectionguide”是一個有用的指南。在某些實施方案中，微球是磁性微球或珠。

因此，本公開提供了基底，其具有(a)固定化到特征的多個第一和第二捕捉引物；(b)至少一個靶多核苷酸，一個末端附著到所述捕捉引物之一而另一個末端與靶分子連接，其中所述靶多核苷酸包含側(cè)翼有與所述第一和第二捕捉引物互補的第一和第二捕捉引物結(jié)合區(qū)的靶區(qū)域，所述第二捕捉引物結(jié)合區(qū)包含與所述第二捕捉引物的堿基對錯配，并且(c)與固定化到所述特征的所述靶多核苷酸互補的多個克隆擴增子。基底可以具有一個特征或多個特征。一個或多個特征可以是珠，孔，包括微孔或納米孔，通道，脊，突起或其組合。一個或多個特征包含單一靶分子?？梢杂冒卸嗪塑账岬亩鄠€克隆擴增子填滿一個或多個特征。多個特征之間的間隙區(qū)域可以缺乏靶多核苷酸。具有多個特征，包括兩個或更多個特征的基底在多個內(nèi)的每個不同特征中可以具有不同單一靶分子。特征上的靶多核苷酸包含一個或多個選自下組的多核苷酸：rna,dna,pna或雙鏈dna(dsdna)。特征上的靶多核苷酸的長度可以小于1,000個核苷酸。特征上的靶多核苷酸長度可以是10至25,26至50,51至100,101至200,201至300,301至400,401至500,501至600,601至700,701至800,801至900,或901至1000個核苷酸。靶分子可以是多肽、多核苷酸、碳水化合物、氨基酸、核苷酸、單糖、半抗原、配體、抗原、分析物、小分子有機化合物或無機化合物。多肽靶分子可以是納米孔、結(jié)合多肽和酶。納米孔可以是mspa、ompf、ompg、nalp、wza、clya毒素、α-溶血素、炭疽毒素、殺白細(xì)胞素和dna折紙納米孔。結(jié)合多肽可以是抗體、fab、fab'、f(ab')2、scfv、雙抗體、三抗體、微型抗體和單域抗體(sdab)或t細(xì)胞受體。酶可以是聚合酶、解旋酶、重組酶、轉(zhuǎn)座酶或連接酶?；卓梢允沁x自下組的一個或多個材料：玻璃、硅、塑料或生物聚合物?；卓梢赃M一步包含水凝膠或共價連接的凝膠。

本公開進一步提供了將單一靶分子置于基底的特征上的方法。方法包括(a)雜交固定化到基底上的特征的多個第一和第二捕捉引物與(b)至少一個靶多核苷酸，所述靶多核苷酸包含側(cè)翼有與所述第一和第二捕捉引物互補的第一和第二捕捉引物結(jié)合區(qū)的靶區(qū)域，其中所述第二捕捉引物結(jié)合區(qū)包含與所述第二捕捉引物的堿基對錯配并且與靶分子連接，并且(c)以平均擴增速率擴增所述至少一種靶多核苷酸以產(chǎn)生與所述靶多核苷酸互補的多個克隆擴增子，所述平均擴增速率超過靶多核苷酸至特征的平均轉(zhuǎn)運速率。

動力學(xué)排除擴增(kea)允許在包括例如具有孔的圖案化流動池的基底上單個特征擴增單一靶多核苷酸，以及在一個或多個孔中產(chǎn)生單克隆靶多核苷酸群體。實施kea的方法在本領(lǐng)域中是公知的，并且描述于例如us2013/0338042a1中。在kea中，特征中第一捕獲靶多核苷酸的擴增速率相對于靶多核苷酸轉(zhuǎn)運和捕獲的慢得多的速率快得多。特征中捕獲的第一靶多核苷酸可以快速擴增，并且填充整個特征，防止在同一特征中捕獲另外的靶多核苷酸。

本公開部分地基于以下認(rèn)識：關(guān)于在特征(如圖案化流動池的納米孔)中產(chǎn)生單克隆靶多核苷酸群體的kea有效性隨著特征或納米孔的大小增加而降低。第一次捕獲的靶多核苷酸的擴增以及用靶多核苷酸的單克隆群體填充特征在較大特征中比在較小的特征中更高，而第二靶多核苷酸的捕獲在較大特征中比在較小的特征中更快。因此，在特征中捕獲和擴增多于一種靶多核苷酸的可能性隨著特征的大小而增加。來自特征的分子詢問的數(shù)據(jù)質(zhì)量對于靶多核苷酸的單克隆群體是最佳的。來自特征的數(shù)據(jù)質(zhì)量隨著除了第一固定化靶多核苷酸以外的靶多核苷酸的份額增加而降低。

在圖1中顯示了使用kea用于在多個特征中的每個中放置單一靶分子的具體實例。簡言之，用固定化的捕捉引物圖案化基底的特征，例如植入有p5和p7捕捉引物對的納米孔內(nèi)的pazam。靶分子，如聚合酶或納米孔多肽(圖1中顯示為星)通過化學(xué)綴合連接到雙鏈靶多核苷酸的末端。靶多核苷酸能夠用例如商業(yè)化的twistdx試劑盒使用kea(也稱為重組酶聚合酶擴增(rpa))擴增。rpa是一類主要用于自由溶液的擴增方法。但是，kea是一類局部化rpa反應(yīng)，其中擴增可以在半封閉的空間如固體基底或珠表面中進行，以產(chǎn)生靶向核苷酸的單克隆簇。擴增快速消耗特征中的引物，預(yù)防和/或顯著減少來自不同靶多核苷酸的接種和擴增，因此消除或降低了其它靶分子的加載的可能性。

在一些實施方案中，可以使用動力學(xué)排除擴增(kea)，也稱為排除擴增(examp)進行等溫擴增。本公開的核酸文庫可以使用方法制備，所述方法包括使擴增試劑反應(yīng)以產(chǎn)生多個擴增位點的步驟，所述多個擴增位點各自包含來自已經(jīng)接種該位點的單個靶核酸的擴增子的基本上克隆的群體。在一些實施方案中，進行擴增反應(yīng)直到產(chǎn)生足夠數(shù)目的擴增子以填充相應(yīng)擴增位點的容量。以這種方式填滿已經(jīng)接種的位點抑制靶核酸在所述位點處著陸和擴增，從而在該位點產(chǎn)生擴增子的克隆群體。在一些實施方案中，即使在第二靶核酸到達(dá)位點前沒有填滿擴增位點，也可以實現(xiàn)表觀克隆性。在一些條件下，第一靶核酸的擴增可以進行到下述的點，即產(chǎn)生足夠數(shù)目的拷貝以有效地勝過或壓倒從被運送到該位點的第二靶核酸產(chǎn)生拷貝。例如在對直徑小于500nm的圓形特征使用橋接擴增方法的實施方案中，已經(jīng)確定在第一靶核酸的指數(shù)擴增的14個循環(huán)后，來自在同一個位點處第二靶核酸的污染將產(chǎn)生不足以對illumina測序平臺上的合成測序分析產(chǎn)生不利影響的污染擴增子的數(shù)目。

如上述實例所證明的，在具體的實施方案中，陣列中的擴增位點可以是但不一定完全克隆的。相反，對于一些應(yīng)用，個別擴增位點可以主要地使用來自第一靶核酸的擴增子定殖，并且還可以具有來自第二靶核酸的低水平的污染擴增子。陣列可以具有一個或多個具有低水平的污染擴增子的擴增位點，因此污染水平對隨后的陣列使用沒有不可接受的影響。例如，當(dāng)陣列用于檢測應(yīng)用中時，可接受的污染水平將是不會以不可接受的方式影響信號與噪聲或檢測技術(shù)的分辨率的水平。因此，表觀克隆性通常與通過本文所闡述的方法制成的陣列的特定用途或應(yīng)用相關(guān)。在特定應(yīng)用的個別擴增位點可接受的例示性污染水平包括但不限于至多0.1％，0.5％，1％，5％，10％或25％的污染擴增子。陣列可以包括具有這些例示性水平的污染擴增子的一個或多個擴增位點。例如，陣列中的多達(dá)5％，10％，25％，50％，75％或甚至100％的擴增位點可以具有一些污染擴增子。應(yīng)當(dāng)理解，在陣列或其它的位點集合中，至少50％，75％，80％，85％，90％，95％或99％或更多的位點可以是克隆的或表觀克隆的。

在一些實施方案中，當(dāng)過程以足夠快的速率發(fā)生以有效地排除另一事件或過程發(fā)生時，可以發(fā)生動力學(xué)排除。例如，制備核酸陣列，其中陣列的位點用溶液中的靶核酸隨機接種，并且在擴增過程中產(chǎn)生靶核酸的拷貝以將每個接種的位點填滿。根據(jù)本公開的動力學(xué)排除方法，接種和擴增過程可以在擴增率超過接種速率的條件下同時進行。因此，在由第一靶核酸接種的位點產(chǎn)生拷貝的相對較快的速率將有效地排除第二核酸接種該位點進行擴增。動力學(xué)排除擴增方法可以如美國申請公開no.2013/0338042的公開內(nèi)容中詳細(xì)討論的那樣實施，其全部內(nèi)容通過引用并入本文。

動力學(xué)排除可以利用相對較慢的速率啟動擴增(例如，制備靶核酸的第一拷貝的慢速率)對用于制備靶核酸的后續(xù)拷貝(或靶核酸的第一拷貝)的相對較快的速率。在前一段的實例中，由于靶核酸接種的相對緩慢速率(例如相對慢的擴散或轉(zhuǎn)運)對發(fā)生擴增以用核酸種子拷貝填充位點的相對快速的速率而發(fā)生動力學(xué)排除。在另一個例示性實施方案中，由于形成已經(jīng)接種了位點的靶核酸的第一拷貝的延遲(例如延遲或慢激活)對制備后續(xù)拷貝以填充位點的相對較快的速率，可發(fā)生動力學(xué)排除。在該實例中，單獨的位點可以已經(jīng)接種了幾種不同的靶核酸(例如，幾個靶核酸可以在擴增之前存在于每個位點)。然而，對于任何給定的靶核酸的第一拷貝形成可以隨機激活，使得與產(chǎn)生后續(xù)拷貝的速率相比，第一拷貝形成的平均速率是相對較慢的。在這種情況下，盡管單獨位點可以已經(jīng)接種了幾種不同的靶核酸，但是動力學(xué)排除將允許僅擴增那些靶核酸之一。更具體地，一旦第一靶核酸已被激活用于擴增，則該位點將迅速用其拷貝填滿，從而防止在該位點產(chǎn)生第二靶核酸的拷貝。

擴增試劑可以包括促進擴增子形成，并且在一些情況下增加擴增子形成的速率的其它成分。一個實例是重組酶。重組酶可以通過允許重復(fù)侵入/延伸促進擴增子形成。更具體地，重組酶可以促進通過聚合酶對靶核酸的侵入和使用靶核酸作為擴增子形成的模板通過聚合酶延伸引物。該過程可以作為鏈?zhǔn)椒磻?yīng)重復(fù)，其中從每輪侵入/延伸產(chǎn)生的擴增子在隨后的輪次中充當(dāng)模板。由于不需要變性循環(huán)(例如通過加熱或化學(xué)變性)，該方法可以比標(biāo)準(zhǔn)pcr更快地發(fā)生。因此，重組酶促進的擴增可以等溫進行。通常期望在重組酶促進的擴增試劑中包括atp或其它核苷酸(或在一些情況下不可水解的其類似物)以促進擴增。重組酶和單鏈結(jié)合(ssb)蛋白的混合物特別有用，因為ssb可進一步促進擴增。用于重組酶促進擴增的例示性制劑包括由twistdx(cambridge，uk)以twistamp試劑盒商業(yè)銷售的那些。在us5,223,414和us7,399,590中列出了重組酶促進擴增試劑的有用組分和反應(yīng)條件，其各自通過引用并入本文。

可以包含在擴增試劑中以促進擴增子形成和在一些情況下增加擴增子形成速率的組分的另一個實例是解旋酶。螺旋酶可以通過允許擴增子形成的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)促進擴增子的形成。因為不需要變性循環(huán)(例如通過加熱或化學(xué)變性)，所以該方法可以比標(biāo)準(zhǔn)pcr更快地發(fā)生。因此，解旋酶促進的擴增可以等溫進行。解旋酶和單鏈結(jié)合(ssb)蛋白的混合物特別有用，因為ssb可進一步促進擴增。用于解旋酶促進擴增的例示性制劑包括以biohelix(beverly，ma)作為isoamp試劑盒商業(yè)出售的那些。此外，us7,399,590和us7,829,284中描述了包括解旋酶蛋白的有用制劑的實例，其各自通過引用并入本文。

可以包含在擴增試劑中以促進擴增子形成并且在一些情況下增加擴增子形成速率的組分的另一個實例是起點結(jié)合蛋白。

可以在橋式擴增方案中使用kea或其它等溫擴增方法，以將具有單個靶分子的單個靶多核苷酸錨定到特征。盡管可以從兩端進行靶多核苷酸的擴增，但是有用的是從遠(yuǎn)離附著的靶分子的末端線性擴增，以避免或減少從一些特征損失靶多核苷酸(和附著的靶分子)。靶多核苷酸的線性擴增可以通過將一個或多個堿基對錯配摻入在附著靶分子近端的靶多核苷酸的捕捉引物結(jié)合區(qū)中來實現(xiàn)。不附著于靶分子的互補鏈的捕捉引物結(jié)合區(qū)可以與基底上其相應(yīng)的捕捉引物互補。根據(jù)該例示性構(gòu)造，第一輪kea將線性擴增靶多核苷酸的兩條鏈。然而，隨后的擴增輪次將線性擴增與靶分子附著的靶多核苷酸鏈，并以指數(shù)方式擴增由互補鏈產(chǎn)生的擴增子。

可以在任何位置放置捕捉引物結(jié)合區(qū)內(nèi)的錯配，只要它抑制或延緩關(guān)聯(lián)捕捉引物的侵入和/或用聚合酶延伸引物。如圖4和6中例示的在與關(guān)聯(lián)捕捉引物互補的結(jié)合區(qū)的末端處放置錯配是特別有用的，因為它創(chuàng)建使用重組酶的鏈侵入的低可能性和/或減少通過聚合酶的延伸，因為捕捉引物在3'端不與靶多核苷酸雜交。

在圖4中顯示了通過kea在特征中放置至少一個靶分子或在多個特征中每個中放置至少一個靶分子的上述例示性設(shè)計。簡言之，由于在kea置換與靶分子接合的多核苷酸鏈時靶多核苷酸可以擴散開來，因此靶多核苷酸可以在捕捉引物區(qū)中用一個或多個錯配的堿基對構(gòu)建。圖4顯示了由側(cè)翼有捕捉引物區(qū)域的phix靶區(qū)域組成的靶多核苷酸。ds靶多核苷酸的3'末端(下鏈)顯示包含測序引物結(jié)合區(qū)(sbs3’)的捕捉引物結(jié)合區(qū)(p5')。5'末端(下鏈)表示包含測序引物結(jié)合區(qū)(sbs8)的捕捉引物結(jié)合區(qū)(p7)?；パa鏈構(gòu)造示于靶多核苷酸的上鏈中。雖然可以利用任何堿基對配配，但是在該說明性實施方案中，p7/p7'捕捉引物結(jié)合區(qū)包含與在p7序列的3'端引入的ccc/cta錯配序列對應(yīng)的三堿基對錯配。在突變或錯配的p7鏈的5'末端，化學(xué)綴合可用于將靶多核苷酸連接到靶分子，其由圖4中的星顯示。或者，無堿基位點或聚-8氧代-g(7,8-二氫-8-氧代-鳥嘌呤)可用于保留一級模板分子(p7序列)。

圖6描繪了使用上面例示的靶多核苷酸設(shè)計的第一和第二輪kea。特征通過靶多核苷酸的右端和左端的影線平面標(biāo)記顯示。附著于特征的是捕捉引物，表示為p5和p7。裝飾捕捉引物的橢圓形表示包含ssb蛋白質(zhì)。這些捕捉引物與靶多核苷酸的靶區(qū)域側(cè)翼的p5'和p7'捕捉引物結(jié)合區(qū)互補。與附著的靶分子相鄰或接近的p7捕捉引物結(jié)合區(qū)不與p7相同或互補，從而防止或減少kea期間的鏈侵入。如圖6所示，與p7捕捉引物互補的p5-sbs3-phix-sbs8'-p7'的規(guī)則或標(biāo)準(zhǔn)鏈將在kea期間進行指數(shù)擴增，以消耗特征，如納米孔上的p5/p7引物。相比之下，從突變或錯配的鏈的p7端將會抑制鏈侵入。因此，附著于靶多核苷酸的靶分子將與基底結(jié)合的擴增子保持雜交。

因此，使用如上文例示的第一對捕捉引物，本文提供的方法可以采用圖案化基底，如流動池的每個特征或孔的單一靶多核苷酸的初始捕捉和固定化。初始靶多核苷酸捕獲可以繼之以單一靶多核苷酸的初步擴增來產(chǎn)生特征內(nèi)靶多核苷酸擴增子的單克隆群體，例如通過kea產(chǎn)生。具有附著靶分子的初始靶多核苷酸將通過例如與靶分子遠(yuǎn)端的末端固定化的捕捉引物雜交而保持固定化到特征。

此外，本文提供的方法可以采用先前所述的任何組分，例如捕捉引物，捕捉引物結(jié)合區(qū)，靶多核苷酸，靶分子等，參考本文提供的基底，或其任何組合。例如，這些組分可以與例示的錯配捕捉引物結(jié)合區(qū)設(shè)計和等溫擴增方法一起采用，該等溫擴增方法以超過靶多核苷酸到特征的平均轉(zhuǎn)運速率的平均擴增速率擴增至少一種靶多核苷酸，以產(chǎn)生本文所述的基底的任何構(gòu)造，其至少具有附著于固定化到特征的靶分子的靶多核苷酸。

因此，本文提供的方法可以使用上述任何例示性基底進行，包括例如可以附著生物分子(包括例如多核苷酸)的任何形狀的任何不溶性固體支持物，半固體支持物或基質(zhì)。例示性的固體支持物包括如前所述的玻璃，改性玻璃，官能化玻璃，無機玻璃，微球(例如惰性和/或磁性顆粒)，塑料，尼龍，基于二氧化硅的材料等。

另外，例如，本文提供的方法可以使用包括流動池的基底進行，例如，如us2010/0111768a1或bentleyetal，nature456：53-59(2008)中所述以及先前例示的。

這里提供的方法可以在基底上的一個或多個特征上進行，包括例如孔，坑，通道，脊，凸起區(qū)域，釘，柱，珠，金屬等，如先前參考本文提供的基底所述。在一些實施方案中，將至少一種靶分子置于特征上的方法可以利用孔作為特征，并且可以包括如us2014-0243224中所述并且先前描述的凝膠材料。

本文提供的方法可以利用具有固定化到基底上的特征的第一和第二捕捉引物的基底。第一和第二捕捉引物可以是多個第一捕捉引物和多個第二捕捉引物。在一些實施方案中，第一和第二捕捉引物可以針對靶多核苷酸的不同序列，因此對靶多核苷酸的不同區(qū)域表現(xiàn)出特異性。在其它實施方案中，第一和第二捕捉引物可以針對不同的靶多核苷酸。圖2中描述了可以在用于在特征上放置至少一個靶分子的方法中的例示性基底，如先前所述。

在本文提供的方法中使用的兩種或更多種捕捉引物可以以任何比率存在于特征中。例如，多個第一捕捉引物和多個第二捕捉引物可以以大約相同的量或以任何其它比率，例如摩爾比存在，包括例如相對于第二捕捉引物，大于1.1x至大于1,000x過量的第一捕捉引物，如先前例示的。類似地，采用多個特征的本文提供的方法，不同特征可以具有兩個或更多個捕捉引物的相同比率或不同比率。

簡言之，例如，在特征上放置至少一個靶分子的方法中使用的捕捉引物可以包括一個或多個捕捉區(qū)域，包括例如通用捕捉區(qū)域，測序引物結(jié)合位點(sbs)，靶物特異性捕獲區(qū)，預(yù)定的切割位點，如限制性位點，以及接頭區(qū)，例如分離捕捉引物的兩個或更多個區(qū)域的接頭區(qū)域。捕捉引物可以使用先前例舉的任何設(shè)計，如通用捕捉區(qū)域和sbs，包括p5，p5'，p7，p7'，sbs3，sbs3'，sbs8和sbs8'的任何組合和/或任何其它序列，其是足夠獨特的以發(fā)揮通用引物，測序引物或任何其它序列如銜接頭的功能。

因此，本文提供的方法可以采用第一和第二捕捉引物，其固定化到可以包括任何捕捉區(qū)域或捕捉區(qū)域的任何組合的特征。例如，第一捕捉引物可以包括第一通用捕捉區(qū)域，并且第二捕捉引物可以包括相同的通用捕捉區(qū)域或第二通用捕捉區(qū)域。第一和第二捕捉引物可進一步包括相同或不同的sbs。例如，第一捕捉引物可以包括第一通用捕捉引物區(qū)域和第一sbs，第二捕捉引物可以包括第二通用捕捉區(qū)域和第二sbs。

本文提供的方法可以利用固定化到特征的多個捕捉引物，如先前參考由本文提供的方法制成的基底所述。多個可以是單一多個(singleplurality)、多個第一捕捉引物和多個第二捕捉引物?；蛘呋蛄硗猓疚奶峁┑姆椒梢允褂枚鄠€第三，第四，第五和/或第六或更多捕捉引物。包括的多個捕捉引物的數(shù)目將取決于如先前例示的應(yīng)用。多個可以是兩個或更多個成員的群體，包括例如多個是2,3,4,5,6,7,8,9,10,20,30,40,50,60,70,80，90或100或更多不同的群體成員的。在其它實施方案中，多個是200,300,400,500,1000,5000,100,000,50000,1x10⁵，2x10⁵，5x10⁵，4x10⁵，5x10⁵，6x10⁵，7x10⁵，8x10⁵，9x10⁵，1x10⁶，2x10⁶，3x10⁶，5x10⁶，6x10⁶，7x10⁶，8x10⁶，9x10⁶或1x10⁷，或更多不同的成員以及之前例示的多個的其它成員之任一。多個可以包含不同的成員，類似的成員和/或相同的成員，包括例如來自至少1％直至并且包括99％或更多的成員的不同的，相似的和/或相同的成員的任何組合的混合物。

本文提供的方法可用于在特征上固定化至少一種靶多核苷酸，其在一端附著至捕捉引物。本文提供的方法還可用于在特征上固定化單一靶多核苷酸，其在一端附著于捕捉引物。雖然本文中參考至少一個靶多核苷酸的附著或參照一端附著到固定化到特征的捕捉引物的單一靶多核苷酸描述，但是應(yīng)當(dāng)理解在其它實施方案中，本文提供的方法可以用于固定化兩個或更多個靶多核苷酸，其一端附著于固定化到特征的捕捉引物。在這些其它實施方案中，靶多核苷酸的數(shù)目可以是例如2,3,4,5,6,7,8,9,10,15,20,25,30,35,40,45，50,55,60,65,70,75,80,85,90,95或100或更多不同的靶多核苷酸?；蛘呋蛄硗?，本文提供的方法可用于固定例如2至100個或更多相同，相似或不同的靶多核苷酸，包括其混合物，如先前例示的。

先前例示的靶多核苷酸中的任何一種可以在將至少一種靶分子置于特征上或本文提供的多個特征中的每個上的方法中采用。因此，本文提供的方法中的靶多核苷酸可以包含兩個或更多個核苷酸，包括例如核糖核苷酸，脫氧核糖核苷酸，鎖定核酸(lna)，肽核酸(pna)或其任何組合。靶多核苷酸可以包含嘌呤堿基，嘧啶堿基，嘌呤和嘧啶堿基兩者，天然的，化學(xué)修飾的，生物化學(xué)修飾的，非天然的或衍生化的核苷酸堿基，一個或多個配對核苷酸堿基。本文提供的方法中采用的靶多核苷酸可以是雙鏈核酸，如dsdna，dsrna，雙鏈dna/rna雜合物，并且還可以包括或更多未配對的核苷酸堿基。單鏈靶多核苷酸也可以在本文提供的方法中采用，如先前所例示的。因此，靶多核苷酸可以是任何期望類型的多核苷酸，序列或多核苷酸和/或序列的類型的混合物。

類似地，本文提供的方法中采用的靶多核苷酸可以包含一個或多個如前列出的靶多核苷酸酸區(qū)，包括例如捕捉引物結(jié)合區(qū)，靶區(qū)域，引物結(jié)合區(qū)，條形碼區(qū)域，接頭區(qū)域和/或銜接頭區(qū)域。一個或多個靶多核苷酸酸區(qū)可以是多個靶多核苷酸酸區(qū)域，包括例如1,2,3,4,5,6,7,8,9或10個或更多個靶多核苷酸區(qū)域。包含兩個或更多個靶多核苷酸酸區(qū)的例示性靶多核苷酸在圖3a-d中描述，如前所述。

本文提供的方法可以采用靶多核苷酸或靶多核苷酸區(qū)(靶多核苷酸或其區(qū)域)，其包括例如靶區(qū)域，捕捉引物結(jié)合區(qū)和/或具有兩個或更多個核苷酸的本文中描述或本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的其它區(qū)域。其它長度包括2至100個或更多個核苷酸以及直至10000個或更多個核苷酸以及先前所例示的各種大小中的任何一種。

在特征上放置至少一種靶多核苷酸的方法可以采用靶多核苷酸或其區(qū)域，其包含前面列出和/或例示的各種長度中任何一種的雙鏈多核苷酸，包括例如，2，25，150，1100，10000或更多的堿基對以及其間的所有整數(shù)。

本文提供的方法可以采用雙鏈靶多核苷酸或其區(qū)域，其包含其捕捉引物區(qū)的區(qū)域，可以包含任何數(shù)目的錯配。特別有用數(shù)目的錯配包括例如1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19或20或更多個與其互補序列或者例如捕捉引物或其它捕獲劑的錯配。這種錯配在圖4和6中例示，并且就通過本文提供的方法產(chǎn)生的基底而言描述。

如先前關(guān)于本文提供的基底例示的，本公開的方法可以采用包含具有一個或多個捕捉引物結(jié)合區(qū)的一個或多個區(qū)域的靶多核苷酸。捕捉引物結(jié)合區(qū)可以位于靶多核苷酸酸區(qū)域的5'端，3'末端或5'和3'末端，或者備選或另外它可以位于在靶多核苷酸的內(nèi)部區(qū)域。靶多核苷酸可以包含兩個或多個捕捉引物結(jié)合區(qū)，直到任何數(shù)目的捕捉引物區(qū)域適用于任何期望的目的。類似地，與相應(yīng)的捕捉引物一樣，捕捉引物結(jié)合區(qū)可以包括一個或多個捕捉引物結(jié)合區(qū)，包括例如通用捕捉引物結(jié)合區(qū)，測序引物結(jié)合位點(sbs)，靶物特異性捕捉引物結(jié)合區(qū)，預(yù)定的切割位點，如限制性位點，以及接頭區(qū)域，例如分離捕捉引物結(jié)合區(qū)域的兩個或更多個區(qū)域的接頭區(qū)域。任何和所有可能的組合和排列可以在本文提供的如先前例示的方法中采用。例如，本文提供的方法可以采用先前例示的任何捕捉引物結(jié)合區(qū)域設(shè)計，如通用捕捉區(qū)域和sbs，包括p5，p5'，p7，p7'，sbs3，sbs3'，sbs8'和/或任何其它序列的任何組合，所述任何其它序列是足夠獨特的以發(fā)揮通用引物，測序引物或任何其它序列如銜接頭的功能。捕捉引物結(jié)合區(qū)的長度可包括5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24，25,26,27,28,29,30,35,40,45,50,55,60,65,70,75,80,85,90,95或100個或更多個核苷酸，以及400下至100或更少個核苷酸，如關(guān)于通過本文提供的方法產(chǎn)生的基底所例示的。

靶多核苷酸的捕捉引物結(jié)合區(qū)可以與捕捉引物為100％互補。本文提供的方法中采用的靶多核苷酸的捕捉引物結(jié)合區(qū)可以例如與捕捉引物是至少60％，65％，70％，75％，77％，80％，82％，85％，87％，90％，92％，95％或97％或更多互補，包括例如包含與捕捉引物的1,2,3,4,5,6,7,8,9或10個或更多個核苷酸錯配。除了一個或多個捕捉引物結(jié)合區(qū)之外，靶多核苷酸可以包括一個或多個靶區(qū)域，包括兩個或更多個靶區(qū)域，如先前所例示。靶區(qū)域的大小或長度可以是上文關(guān)于靶多核苷酸或靶多核苷酸區(qū)域所例示的任何長度。

本文提供的方法可以通過例如附著到靶多核苷酸將至少一個靶分子置于基底的特征上，所述靶多核苷酸可以例如附著于捕捉引物。本文提供的方法還可以將多個兩個或更多個靶分子置于如前面例示的每個參考情況中，包括例如2,3,4,5,6,7,8,9,10,15,20，25，30，35，40，45，50，55，60，65，70，75，80，85，90，95，100，250，500，1,000，5,000，10,000或更多不同，相同和/相似的靶分子，如前例示。靶分子與靶多核苷酸，捕捉引物，特征和/或基底的附著可以是共價或非共價的。

除通過上述構(gòu)造固定化的至少一種靶分子之外，本文提供的方法還可以在基底上的特征或多個特征上產(chǎn)生靶多核苷酸的多個擴增子，如圖4和6中例示。多個擴增子可以最小程度地填充特征，部分填充特征或填滿基底上的特征。因此，擴增子密度可以是低，中等或高。靶多核苷酸設(shè)計，生成這種擴增子的方法和控制密度的方法下文參考在基底的特征上放置至少一個靶分子的方法進一步描述。擴增子的密度如本文所述。

本文提供的用于在基底或特征上單分子放置靶分子的方法可以利用任何期望的分子。靶分子的例示性類別包括例如多肽，多核苷酸，碳水化合物，氨基酸，核苷酸，單糖，半抗原，配體，抗原，分析物，小分子有機化合物或無機化合物。下文進一步描述了對于上述類別中的每個的例示性種類。先前已經(jīng)描述了這些類別中的每個的例示性種類，其中每一種可以在本文提供的方法中同樣地采用以生成本文中提供的基底，如先前描述。

作為例示，本文提供的方法中采用的靶分子可以包括例如任何大小或活性并且含有任何天然或非天然氨基酸的多肽；核糖體多肽，包括但不限于酶，受體，抗體，轉(zhuǎn)錄因子，激素，配體，抗原和半抗原；非核糖體肽，包括但不限于毒素，鐵載體，色素，抗生素，抗生素前體，細(xì)胞抑制劑和免疫抑制劑；包括mspa，外膜磷脂酶a(ompa)，ompc，ompf，ompg，奈瑟氏球菌(neisseria)自身轉(zhuǎn)運蛋白(nalp)，wza，clya毒素，α-溶血素，炭疽毒素，短桿菌肽a，麥芽糖孔蛋白，phoe，tsx，f-pilus，sp1，線粒體孔蛋白(vdac)，tom40，殺白細(xì)胞素和dna折紙納米孔；如先前例示的抗生素；如先前例示的毒素；激素，如先前例示的激素；半抗原，包括但不限于苯胺，鄰氨基苯甲酸，間氨基苯甲酸，對氨基苯甲酸，uroshiol，奎寧，肼苯噠嗪，熒光素，生物素，地高辛配基(digoxigenin)和二硝基苯酚；受體，包括例如受體可以來自免疫細(xì)胞或非免疫細(xì)胞，如先前所例示的；細(xì)胞因子如先前例示的趨化因子，干擾素，白細(xì)胞介素，淋巴因子，腫瘤壞死因子(tnf)和神經(jīng)肽；任何類型的酶，包括例如先前例示的代謝酶，聚合酶，連接酶，逆轉(zhuǎn)錄酶，核酸酶，解旋酶和轉(zhuǎn)座酶；如先前所例示的抗體或抗體片段；多核苷酸或寡核苷酸，包括例如先前例示的任何長度或序列的dna或rna；無機化合物，包括但不限于碳化物，碳酸鹽，碳的簡單氧化物(例如co和co2)，氰化物量子點，金屬納米顆粒，金屬氧化物納米顆粒等，礦物質(zhì)，硫化物，有機金屬化合物和生物有機物化合物和礦物質(zhì)，如先前例示；如先前例示的小分子；代謝物，包括但不限于生物堿，糖苷，脂質(zhì)，非核糖體肽，例如放線菌素d，吩嗪，天然酚(包括類黃酮)，聚酮化合物，萜烯，包括類固醇和四吡咯；治療劑，包括例如有機化合物，無機化合物，肽，激素，小分子，抗體，抗原，半抗原或其任何組合。如前所述，治療劑可以是解熱藥，鎮(zhèn)痛藥，抗瘧藥，抗生素，防腐劑，情緒穩(wěn)定劑，激素替換，口服避孕藥，興奮劑，安定藥，抗病毒藥，抗癌藥，免疫抑制劑和他汀類。

在一些實施方案中，本文提供的方法可用于將至少一個靶分子放置在基底上的多個特征中的每個中或(本文中也稱為陣列或特征陣列)，如圖5中所示的多個特征。例如，本文提供的方法可以與具有多個特征的基底一起使用，該特征以任何特殊圖案排列，如先前例示的，包括例如點或斑塊的網(wǎng)格，重復(fù)圖案，不規(guī)則非重復(fù)圖案，六邊形圖案，直線圖案，網(wǎng)格圖案，具有反射對稱性的圖案，具有旋轉(zhuǎn)對稱性的圖案等。特征可以是先前例示的各種密度中的任何一種，例如從至少約10個特征/cm²至約5,000,000個特征/cm²或更高。在本文提供的方法中采用的陣列的特征面積可以各自具有大于約100nm²至約500μm²的面積以及其間的任何面積。陣列基底表面上的特征可以是不連續(xù)的，由表面的間隙區(qū)域分隔開。在具體實施方案中，所述方法與在包括例如微孔或納米孔的表面(例如孔)中為凹特征的特征一起使用，并且特征可以包含如先前所例示的凝膠材料。制備和使用含有特征(如孔)的凝膠的基底的方法和組合物列于例如us2014/0243224中，其通過引用并入本文。方法可以用具有高密度，中等密度或低密度的特征的陣列進行，如前所述。本文描述的方法可以用作為珠或在孔中的珠的特征進行。珠可以由將多核苷酸固定化到表面的任何材料組成，包括但不限于塑料，陶瓷，玻璃，聚苯乙烯，碳石墨等，以及本文概述的用于固體支持物的任何其它材料都可以使用。

在一些實施方案中，提供的方法用于在特征上或在多個特征中的每個中放置至少一個靶分子，其中特征大小選自有利于動力學(xué)排除擴增(kea)和特征中形成單分子放置的范圍。如先前通過參考納米孔所例示，孔直徑可以在約30nm至約1μm之間，約50nm至約800nm之間，約70nm至約600nm之間或在約100μm和約400nm之間變化。在一些實施方案中，該孔具有約400nm的直徑。在一些實施方案中，孔具有小于約1μm的直徑。

作為例示，在一個具體的實施方案中，本文中公開的方法可以包含(a)將多個第一捕捉引物附著于表面；(b)將多個第二捕捉引物附著于表面；并且(c)將雙鏈靶多核苷酸附著于第二捕捉引物的第二捕捉引物，其中(i)雙鏈靶多核苷酸包含第一親本鏈和第二親本鏈；(ii)雙鏈靶多核苷酸包含第一和第二親本鏈中的第二捕捉引物結(jié)合區(qū)；(iii)第一親本鏈的第二捕捉引物結(jié)合區(qū)與多個第二捕捉引物的第二捕捉引物是100％互補的；并且(iv)第二親本鏈的第二捕捉引物結(jié)合區(qū)與多個第二捕捉引物的第二捕捉引物是至少100％相同的。方法可以進一步包括將靶分子附著于靶多核苷酸。可以將靶分子附著于靶多核苷酸，之后將靶多核苷酸附著于第二捕捉引物?？梢栽趯⒍鄠€第二捕捉引物附著于表面前發(fā)生將多個第一捕捉引物附著于表面?；蛘?，可以與將多個第二捕捉引物附著于表面同時發(fā)生將多個第一捕捉引物附著于表面。靶多核苷酸可以進一步包含第一捕捉結(jié)合區(qū)。第一捕捉結(jié)合區(qū)的至少一條鏈可以與多個第一捕捉引物的第一捕捉引物雜交。方法可以進一步包括生成多個擴增子。多個擴增子可以包含靶多核苷酸的拷貝。可以通過進行擴增反應(yīng)生成多個擴增子。擴增反應(yīng)可以包含第一重組酶聚合酶擴增(rpa)。第一rpa可以包含延伸與靶多核苷酸雜交的第一捕捉引物和第二捕捉引物以生成靶多核苷酸的多個第一擴增子?？梢酝ㄟ^進行多個一個或多個另外的擴增反應(yīng)生成擴增子。一個或多個另外的擴增反應(yīng)可以包含一個或多個另外的重組酶聚合酶擴增(rpa)。一個或多個另外的rpas可以包含(a)將多個捕捉引物的一個或多個第一捕捉引物附著于多個第一擴增子的一個或多個擴增子；并且(b)延伸一個或多個第一捕捉引物以生成多個另外的擴增子。一個或多個另外的rpa可以包含(a)延伸多個第二捕捉引物的一個或多個第二捕捉引物；并且(b)延伸一個或多個第二捕捉引物以生成多個另外的擴增子。在一些實例中，第二捕捉引物不與含有第二親本鏈的互補物的擴增子雜交。在一些實例中，第二捕捉引物不與擴增子的第二捕捉引物結(jié)合區(qū)雜交，所述擴增子是第二親本鏈的第二捕捉引物結(jié)合區(qū)的互補物。

圖7中描繪了生成基底的例示性方法。如圖7的步驟1中所示，使包含多個第一捕捉引物(707,711,714)和多個第二捕捉引物(708,713,715)的表面(706)與靶多核苷酸(701)接觸。靶多核苷酸(701)包含第一親本鏈(703)和第二親本鏈(702)。第一親本鏈(703)和第二親本鏈(702)含有第一捕捉引物結(jié)合區(qū)(717)和第二捕捉引物結(jié)合區(qū)(718)。在第二捕捉引物結(jié)合區(qū)(718)內(nèi)，存在有第一親本鏈(703)和第二親本鏈(702)之間的錯配區(qū)。第二親本鏈(702)的第二捕捉引物結(jié)合區(qū)(718)含有與多個第二捕捉引物(708,713,715)的第二捕捉引物的至少一個核苷酸差異(704)。第一親本鏈(703)的第二捕捉引物結(jié)合區(qū)(718)與多個第二捕捉引物(708,713,715)的第二捕捉引物是100％互補的。如步驟2中所示，多個第一捕捉引物(707,711,714)的第一捕捉引物(707)與第二親本鏈(702)的第一捕捉引物結(jié)合區(qū)(717)雜交。多個第二捕捉引物(708,713,715)的第二捕捉引物(708)與第一親本鏈(703)的第二捕捉結(jié)合區(qū)(718)雜交。如步驟3中所示，擴增第一和第二親本鏈以生成第一多個擴增子。第一捕捉引物(707)置換第一親本鏈(703)，并且延伸以生成第二親本鏈(709)的擴增子。第二親本鏈(709)的擴增子含有第二親本鏈的互補物。因此，第二親本鏈(709)的擴增子含有第二親本鏈(702)的第二捕捉引物結(jié)合區(qū)(718)的互補物。如也在步驟3中所示，第二捕捉引物(708)置換第二親本鏈(702)，并且延伸以生成第一親本鏈(710)的擴增子。如步驟4中所示，進行一個或多個另外的擴增反應(yīng)以生成第二多個擴增子。在步驟4a中，第一捕捉引物(711)與第二親本鏈的第一捕捉引物結(jié)合區(qū)雜交，并且置換第一捕捉引物(707)。在步驟4b中，第二捕捉引物(713)試圖與第二親本鏈(709)的擴增子的第二捕捉引物結(jié)合區(qū)雜交。

然而，由于第二親本鏈(709)的擴增子的第二捕捉引物結(jié)合區(qū)是第二親本鏈的第二捕捉引物結(jié)合區(qū)的互補物，第二親本鏈(709)的擴增子的第二捕捉引物結(jié)合區(qū)不與第二捕捉引物(711)是100％互補的。第二捕捉引物(711)不能從第二親本鏈置換第二親本鏈(709)的擴增子。因此，含有與第二親本鏈的第二捕捉結(jié)合區(qū)互補的第二捕捉引物結(jié)合區(qū)的第二親本鏈的擴增子不能起模板作用以延伸第二捕捉引物。如步驟4c中所示，由于第一親本鏈(710)的擴增子的第一捕捉引物結(jié)合區(qū)與第一捕捉引物(714)是100％互補的，第一捕捉引物(714)可以置換第一親本鏈(703)，并且與第一親本鏈(710)的擴增子的第一捕捉引物結(jié)合區(qū)雜交。第一親本鏈(710)的擴增子可以充當(dāng)模板以延伸第一捕捉引物(714)。如步驟4d中所示，第二捕捉引物，第二捕捉引物(715)可以與第一親本鏈(703)的第二捕捉引物結(jié)合區(qū)雜交，從而置換第二捕捉引物(708)。如步驟5中所示，可以延伸第一捕捉引物(711)以生成第一親本鏈(716)的擴增子。也在步驟5中顯示，可以延伸第一捕捉引物(714)以生成第一親本鏈(717)擴增子的擴增子。也在步驟5中顯示，可以延伸第二捕捉引物(715)以生成第一親本鏈(718)的擴增子。

因而，本公開提供了將單一靶分子置于基底的特征上的方法。方法包括：(a)雜交固定化到基底上的特征的多個第一和第二捕捉引物與至少一個靶多核苷酸，所述靶多核苷酸包含側(cè)翼有與所述第一和第二捕捉引物互補的第一和第二捕捉引物結(jié)合區(qū)的靶區(qū)域，其中所述第二捕捉引物結(jié)合區(qū)包含與所述第二捕捉引物的堿基對錯配并且與靶分子連接，(c)以平均擴增速率擴增所述至少一種靶多核苷酸以產(chǎn)生與所述靶多核苷酸互補的多個克隆擴增子，所述平均擴增速率超過靶多核苷酸至特征的平均轉(zhuǎn)運速率。方法可以利用具有一個特征或多個特征的基底。一個或多個特征可以是珠，孔，包括微孔或納米孔，通道，脊，突起或其組合。方法可以在特征或多個特征的每個中放置至少一個靶分子，包括單一靶分子。方法可以用靶多核苷酸的多個克隆擴增子填滿一個或多個特征。多個特征之間的間隙區(qū)可以缺乏靶多核苷酸。方法可以與具有多個特征，包括兩個或更多個特征的基底一起使用，并且可以在多個內(nèi)的不同特征之每個中放置不同單一靶分子。方法可以與選自下組的靶多核苷酸一起使用：rna,dna,pna或雙鏈dna(dsdna)。由本文中提供的方法的靶多核苷酸使用的長度可以小于1,000個核苷酸和/或它可以是10至25,26至50,51至100,101至200,201至300,301至400,401至500,501至600,601至700,701至800,801至900,或901至1000個核苷酸。通過方法置于一個或多個特征上的靶分子可以是多肽、多核苷酸、碳水化合物、氨基酸、核苷酸、單糖、半抗原、配體、抗原、分析物、小分子有機化合物或無機化合物。多肽靶分子可以是納米孔、結(jié)合多肽和酶。納米孔可以是mspa、ompf、ompg、nalp、wza、clya毒素、α-溶血素、炭疽毒素、殺白細(xì)胞素和dna折紙納米孔。結(jié)合多肽可以是抗體、fab、fab'、f(ab')2、scfv、雙抗體、三抗體、微型抗體和單域抗體(sdab)或t細(xì)胞受體。酶可以是聚合酶、解旋酶、重組酶、轉(zhuǎn)座酶或連接酶。方法可以與選自下組的一個或多個材料的基底一起使用：玻璃、硅、塑料或生物聚合物?；卓梢赃M一步包含水凝膠或共價連接的凝膠。

具有特征中的單一靶分子或在多個特征中的每個中具有單個靶分子的本公開的基底可用于詢問單分子實體。待詢問的一個或多個分子可以在溶液中，并且固定化的靶分子可以用于確定待詢問的一個或多個分子的特征。例如，單個多核苷酸或多個單個多核苷酸的序列可以通過納米孔測序確定，其中納米孔對應(yīng)于固定化的靶分子。或者，待詢問的一個或多個分子可以是固定化的靶分子，并且溶液中的一個或多個分子可用于探測或確定每個固定的靶分子的特征。例如，固定化的靶分子可以是不同酶變體的文庫，并且溶液中的探針可以是基底或多個不同的基底，以確定每種不同酶變體的催化特性。也可以使用相反的方向，其中基底例如對應(yīng)于特征上的固定化的靶分子，并與不同的酶變體接觸以測量催化特性。鑒于本文提供的教導(dǎo)和指導(dǎo)，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，在本文提供的基底中可以使用大量不同的靶分子來詢問或被詢問以確定一種或多種分子特征。例示性特征包括例如確定多核苷酸序列，多肽序列，結(jié)合活性，催化活性等。

作為關(guān)于測序的進一步的例示，一些實施方案可以利用納米孔測序(deamer,d.w.&akeson,m."nanoporesandnucleicacids:prospectsforultrarapidsequencing."trendsbiotechnol.18,147-151(2000)；deamer,d.andd.branton,"characterizationofnucleicacidsbynanoporeanalysis".acc.chem.res.35:817-825(2002)；li,j.,m.gershow,d.stein,e.brandin,andj.a.golovchenko,"dnamoleculesandconfigurationsinasolid-statenanoporemicroscope"nat.mater.2:611-615(2003)，其公開內(nèi)容通過引用整體并入本文)。在此類實施方案中，待測序的多核苷酸通過納米孔。納米孔可以是合成孔或生物膜蛋白，如α-溶血素。當(dāng)靶核酸通過納米孔時，可以通過測量孔的電導(dǎo)率的波動來鑒定每個堿基對。(u.s.pat.no.7,001,792；soni,g.v.&meller,"a.progresstowardultrafastdnasequencingusingsolid-statenanopores."clin.chem.53,1996-2001(2007)；healy,k."nanopore-basedsingle-moleculednaanalysis."nanomed.2,459-481(2007)；cockroft,s.l.,chu,j.,amorin,m.&ghadiri,m.r."asingle-moleculenanoporedevicedetectsdnapolymeraseactivitywithsingle-nucleotideresolution."j.am.chem.soc.130,818-820(2008)，其公開內(nèi)容通過引用整體并入本文)。從納米孔測序獲得的數(shù)據(jù)可以如本文所述進行存儲，處理和分析。特別地，可以根據(jù)本文所闡述的光學(xué)圖像和其它圖像的例示性處理將數(shù)據(jù)作為圖像處理。

這里的方法也可用于分子結(jié)合親和力篩選。在實施方案中，單分子抗體可以錨定在本文所述的基底上。單抗原結(jié)合事件可以通過熒光染色檢測。熒光染色技術(shù)包括本領(lǐng)域公知的技術(shù)，包括例如illuminainfinium測定或elisa(酶聯(lián)免疫吸附測定)技術(shù)。在某些實施方案中，可以通過計數(shù)單分子熒光點(本領(lǐng)域中已知的此類技術(shù))來定量分析溶液中抗原的濃度。(t.blicharz,etal."fiber-opticmicrospherebeadantibodyarrayfortheanalysisofinflammatorycytokinesinsaliva"anal.chem.2009,81,2106.)。在實施方案中，本文所述的方法適用于體外診斷。

本文中列出的方法的優(yōu)點在于它們提供并行地快速且有效地檢測多個靶核酸。因此，本公開提供了能夠使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)，例如上面例示的那些技術(shù)制備和檢測核酸的集成系統(tǒng)。因此，本公開的集成系統(tǒng)可以包括能夠?qū)U增試劑和/或測序試劑遞送到一個或多個固定化靶分子的流體組件，所述系統(tǒng)包括諸如泵，閥，儲存器，流體管線等的組件?？梢栽诩上到y(tǒng)中配置和/或使用流動池進行詢問。例示性的流動池描述于例如us2010/0111768a1和usser.no.13/273,666，其各自通過引用并入本文。如對流動池所例示的，集成系統(tǒng)的一個或多個流體組件可用于詢問中的不同步驟。以結(jié)合反應(yīng)實施方案為例，集成系統(tǒng)的一種或多種流體組件可用于結(jié)合步驟和用于檢測的試劑的遞送?；蛘?，集成系統(tǒng)可以包括單獨的流體系統(tǒng)以執(zhí)行結(jié)合步驟并實施檢測方法。能夠產(chǎn)生擴增核酸并也確定核酸序列的集成測序系統(tǒng)的實例包括但不限于miseqtm平臺(illumina，inc.，sandiego，ca)和usser.no.13/273,666，其通過引用并入本文。

本文中進一步公開了試劑盒，其包含本文中公開的任何基底。試劑盒可以包含(a)包含特征的基底，其中特征包含(i)多個第一捕捉引物；和(ii)多個第二捕捉引物；和(b)包含第一雙鏈靶多核苷酸區(qū)的靶多核苷酸，其中(i)第一雙鏈靶多核苷酸區(qū)包含第二捕捉引物結(jié)合區(qū)；(ii)第二捕捉引物結(jié)合區(qū)的第一鏈與第二捕捉引物的第二捕捉引物是100％互補的；并且(iii)第二捕捉引物結(jié)合區(qū)包含第一鏈和第二鏈之間的至少一個核苷酸錯配。

試劑盒可以包含含有特征的基底，其中特征包含(a)多個第一捕捉引物；(b)多個第二捕捉引物；和(c)靶多核苷酸，其包含第一雙鏈靶多核苷酸區(qū)，其中(i)第一雙鏈靶多核苷酸區(qū)包含第二捕捉引物結(jié)合區(qū)；(ii)第二捕捉引物結(jié)合區(qū)的第一鏈與第二捕捉引物的第二捕捉引物是100％互補的；并且(iii)第二捕捉引物結(jié)合區(qū)包含第一鏈和第二鏈之間的至少一個核苷酸錯配。

試劑盒可以包含(a)包含特征的基底，其中所述特征包括(i)多個第一捕捉引物；和(ii)多個第二捕捉引物；和(b)靶多核苷酸，其包含第一雙鏈靶多核苷酸區(qū)和第二雙鏈靶多核苷酸區(qū)，其中(i)第一雙鏈靶多核苷酸區(qū)包含第二捕捉引物結(jié)合區(qū)；(ii)第二捕捉引物結(jié)合區(qū)的第一鏈與第二捕捉引物的第二捕捉引物100％互補；以及(iii)第二捕捉引物結(jié)合區(qū)包括第一鏈和第二鏈之間的至少一個核苷酸錯配。第二雙鏈靶多核苷酸區(qū)可以包含第一捕捉引物結(jié)合區(qū)。

試劑盒可以包含(a)包含特征的基底，其中所述特征包括(i)多個第一捕捉引物；和(ii)多個第二捕捉引物；和(b)第一靶多核苷酸，其包含第一雙鏈靶多核苷酸區(qū)，其中(i)第一雙鏈靶多核苷酸區(qū)包含第二捕捉引物結(jié)合區(qū)；(ii)第二捕捉引物結(jié)合區(qū)的第一鏈與第二捕捉引物的第二捕捉引物100％互補；以及(iii)第二捕捉引物結(jié)合區(qū)包括第一鏈和第二鏈之間的至少一個核苷酸錯配；和(c)包含第二雙鏈靶多核苷酸區(qū)的第二靶多核苷酸區(qū)。第二雙鏈靶多核苷酸區(qū)可以包含第一捕捉引物結(jié)合區(qū)。

本文中公開的試劑盒可以包含基底，如圖2中描繪。如圖2中所示，試劑盒可以包含基底(201)，其包含(a)多個第一捕捉引物(202,203,204)；(b)多個第二捕捉引物(205,206,207)；(c)靶多核苷酸(208)；(d)靶分子(209)；和(e)多個擴增子(210,211,212,213,214)。

本文中公開的試劑盒可以包含基底，如圖5中描繪。如圖5中所示，試劑盒可以包含基底(501)，其包含(a)第一特征(502)，所述第一特征包含(i)第一多個第一捕捉引物(504,505,506)；(ii)第一多個第二捕捉引物(507,508,509)；(iii)第一靶多核苷酸(510)；(iv)第一靶分子(511)；和(v)第一多個擴增子(512,513,514,515,516)；和(b)第二特征(503)，所述第二特征包含(i)第二多個第一捕捉引物(520,521,522)；(ii)第二多個第二捕捉引物(523,524,525)；(iii)第二靶多核苷酸(526)；(iv)第二靶分子(527)；和(v)第二多個擴增子(528,529,530,531,532)。

圖8a-b中例示了本文中公開的試劑盒的例示性組分。如圖8a中所示，試劑盒可以包含(a)基底(801)，其包含(i)多個第一捕捉引物(802,803,804)；和(ii)多個第二捕捉引物(805,806,807)；和(b)靶多核苷酸(808)。如圖8b中所示，試劑盒可以進一步包含一個或多個另外的靶多核苷酸(809)、擴增子(810)、靶分子(811)或其組合。

本文中公開的任何試劑盒的靶多核苷酸可以進一步包含一個或多個本文中公開的靶多核苷酸區(qū)。例如，靶多核苷酸可以進一步包含第二靶多核苷酸區(qū)，其包含第一捕捉引物結(jié)合域。第一捕捉引物結(jié)合區(qū)可以與多個第一捕捉引物的第一捕捉引物雜交。在另一個實例中，靶多核苷酸可以進一步包含另外的靶多核苷酸區(qū)，其包含靶區(qū)域。靶多核苷酸可以包含一個或多個另外的靶多核苷酸區(qū)，其包含條形碼、引物結(jié)合區(qū)、接頭區(qū)、銜接頭區(qū)域或其組合。

本文中公開的任何試劑盒的靶多核苷酸可以是基底的部分。例如，靶多核苷酸可以附著于基底的第二捕捉引物?；蛘?，本文中公開的任何試劑盒的靶多核苷酸可以與基底分開。例如，試劑盒可以包含含有基底的第一容器和含有靶多核苷酸的第二容器。

本文中公開的試劑盒可以進一步包含靶分子。靶分子可以是本文中公開的任何靶分子。例如，靶分子可以是納米孔。靶分子可以附著于靶多核苷酸。靶分子可以是基底的部分。例如，靶分子可以附著于靶多核苷酸，其附著于基底的第一捕捉引物或第二捕捉引物?；蛘呋蛄硗?，靶分子不附著于靶多核苷酸.例如，試劑盒可以包含含有靶多核苷酸的第一容器和含有靶分子的第二容器?？梢越o靶分子提供基底。例如，試劑盒可以包含含有基底和靶分子的第一容器和包含靶多核苷酸的第二容器。或者，試劑盒可以包含含有基底、靶多核苷酸和靶分子的第一容器。

試劑盒可以進一步包含多個擴增子。多個擴增子可以是基底的部分。例如，多個擴增子可以附著于多個第一引物、多個第二引物、或其組合。擴增子可以是靶多核苷酸的拷貝。

本文中公開的任何試劑盒的基底可以包含兩個或更多個特征。

應(yīng)當(dāng)理解，本文提供的本發(fā)明的定義中也包括實質(zhì)上不影響本發(fā)明的各種實施方案的活性的修飾。因此，以下實施例旨在說明而不是限制本發(fā)明。

實施例

使用錯配的捕捉引物結(jié)合區(qū)的動力學(xué)排除擴增

該實施例顯示錯配的捕捉引物結(jié)合區(qū)防止在錯配的靶多核苷酸末端的重組酶聚合酶擴增(rpa)。

為了證實捕捉引物結(jié)合區(qū)和捕捉引物之間的錯配堿基對可以阻止rpa反應(yīng)，使用商業(yè)試劑盒twistdx根據(jù)制造商的用法說明，在rpa反應(yīng)中采用圖9所示的靶多核苷酸和捕捉引物。簡言之，靶多核苷酸采用側(cè)翼有稱為標(biāo)準(zhǔn)(std)或錯配(msm)的捕捉引物區(qū)的約500bpphix靶區(qū)域。通過設(shè)計，引物組p5-std/p7-std與靶多核苷酸phix-std中的捕捉引物結(jié)合區(qū)互補，并且p5-msm/p7-msm與靶多核苷酸phix-msm中的捕捉引物結(jié)合區(qū)互補。p5-std/p7-std具有與模板phix-msm錯配的3bp，而p5-msm/p7-msm與模板phix-std具有3bp錯配。

將含有phix靶分子5e-16mol的phix靶物(13.2ul)與2.4μl10μm匹配或錯配引物混合，然后用twistdx再水合(rehybdration)緩沖液29.5μl添加。將上述溶液轉(zhuǎn)移到twistdx反應(yīng)團粒并通過移液管混合。通過添加2.5μl280mm乙酸鎂開始反應(yīng)，并使其反應(yīng)8至10分鐘。通過pcr產(chǎn)物純化過程停止反應(yīng)進行凝膠分析。

通過kea反應(yīng)，通過凝膠電泳(2％e-gel電泳，lifetechnologies)分離擴增子，并且結(jié)果示于圖10中。簡言之，與互補捕捉引物-捕捉引物結(jié)合區(qū)組合，例如p5-msm/p7-msm加上phix-msm的rpa反應(yīng)導(dǎo)致擴增子形成的良好產(chǎn)率。然而，在rpa反應(yīng)中錯配的捕捉引物-捕捉引物結(jié)合區(qū)組合沒有產(chǎn)生或?qū)е?00bp擴增子產(chǎn)物的低產(chǎn)率。

這些結(jié)果證實，錯配設(shè)計可以有效地停止靶多核苷酸錯配末端的rpa反應(yīng)。

在本申請中，各種出版物已經(jīng)在括號內(nèi)提及。這些出版物的全部內(nèi)容(包括genbank和gi號出版物)在此通過引用并入本申請中，以便更充分地描述本發(fā)明所屬領(lǐng)域的狀態(tài)。

雖然已經(jīng)參照所公開的實施方案描述了本發(fā)明，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將容易地理解，上面詳述的具體實施例和研究僅僅是對本發(fā)明的說明。應(yīng)當(dāng)理解，在不脫離本發(fā)明的精神的情況下，可以進行各種修改。因此，本發(fā)明僅由權(quán)利要求書限定。