產生類諾斯卡品的微生物以及其制備和使用方法與流程
相關申請的交叉引用
本申請要求以下各個申請的優(yōu)先權：在2014年11月17日提交的美國臨時申請?zhí)?2/080,610；在2015年1月23日提交的美國臨時申請?zhí)?2/107,238；在2015年5月4日提交的美國臨時申請?zhí)?2/156,701；在2015年5月8日提交的美國臨時申請?zhí)?2/159,122；和在2015年6月11日提交的美國臨時申請?zhí)?2/174,475，所述案件的公開內容以引用方式整體并入本文中。
政府權利
本發(fā)明是由美國國家衛(wèi)生研究院根據(jù)合同號at007886頒發(fā)的。政府對發(fā)明有一定的權利。
概要
本公開提供在工程化的宿主細胞中產生多種芐基異喹啉生物堿(bia)(例如類諾斯卡品(noscapinoid))的方法。本公開進一步提供在工程化的宿主細胞中產生的多種類諾斯卡品的組合物。
本發(fā)明的一個方面提供工程化的非植物細胞，其產生類諾斯卡品、類諾斯卡品的前體、類諾斯卡品的代謝物、類諾斯卡品的類似物、類諾斯卡品的中間體和/或類諾斯卡品的衍生物。在實例中，工程化的宿主細胞可以利用坎那丁(canadine)作為起始化合物，所述起始化合物可以添加到工程化的宿主細胞中。在其他實例中，工程化的宿主細胞可以利用由細胞從諸如全去甲勞丹堿(norlaudanosoline)或酪氨酸等前體產生的坎那丁。在其他實例中，工程化的宿主細胞從工程化成從酪氨酸產生類諾斯卡品的酵母細胞可以重新產生類諾斯卡品、類諾斯卡品的前體、類諾斯卡品的代謝物、類諾斯卡品的類似物、類諾斯卡品的中間體和/或類諾斯卡品的衍生物，其中酪氨酸在酵母細胞中自然產生。在其他實例中，工程化的宿主細胞可以產生類諾斯卡品、類諾斯卡品的前體、類諾斯卡品的代謝物、類諾斯卡品的類似物、類諾斯卡品的中間體、類諾斯卡品的功能化衍生物和/或類諾斯卡品的衍生物，所述化合物是使用前體化合物(例如酪氨酸)的類似物形成的。
在實例中，本發(fā)明的一個方面提供工程化的非植物細胞，所述工程化的非植物細胞沿著將坎那丁或坎那丁的類似物轉化為類諾斯卡品產物的代謝路徑產生作為坎那丁衍生物的芐基異喹啉生物堿產物，所述類諾斯卡品產物包含至少一種選自由類諾斯卡品、類諾斯卡品的前體、類諾斯卡品的代謝物、類諾斯卡品的類似物、類諾斯卡品的中間體和類諾斯卡品的衍生物組成的組的化合物，其中在工程化的非植物細胞中產生的芐基異喹啉生物堿產物的量大于在非植物細胞中產生的芐基異喹啉生物堿產物的量。
在一些實施方案中，工程化的非植物細胞包含一個或多個用于編碼參與代謝路徑的至少一種酶的異源編碼序列，所述代謝路徑將坎那丁或坎那丁的類似物轉化為類諾斯卡品產物。在一些實施方案中，工程化的非植物細胞包含編碼參與代謝路徑的多于一種酶的異源編碼序列，所述代謝路徑將坎那丁或坎那丁的類似物轉化為類諾斯卡品產物。另外，在一些實施方案中，工程化的非植物細胞包含編碼參與代謝路徑的兩種不同酶的異源編碼序列，所述代謝路徑將坎那丁或坎那丁的類似物轉化為類諾斯卡品產物。在一些實施方案中，工程化的非植物細胞包含編碼參與代謝路徑的多于三種不同酶的異源編碼序列，所述代謝路徑將坎那丁或坎那丁的類似物轉化為類諾斯卡品產物。在一些實施方案中，至少一種酶將工程化的非植物細胞內的化合物轉化為芐基異喹啉生物堿產物。在一些實施方案中，所述化合物是在工程化的非植物細胞內產生的。在一些實施方案中，參與將坎那丁轉化為類諾斯卡品產物的代謝路徑的至少一種酶選自由以下組成的組：tnmt、cyp82x2、cyp82y1、cpy82x1、at1、6omt、cxe1、cxe2、sdr1、mt2和mt3。
在一些實施方案中，芐基異喹啉生物堿產物是苯酞異喹啉生物堿。在一些實施方案中，苯酞異喹啉生物堿產物是罌粟殼堿半縮醛，且在其他實施方案中，參與代謝路徑的至少一種酶包含cxe1，且其中cxe1將4’-o-去甲基-3-o-乙?；浰趭W辛(papaveroxine)轉化為罌粟殼堿半縮醛。在一些實施方案中，苯酞異喹啉生物堿產物是那可汀半縮醛(narcotinehemiacetal)，且在其他實施方案中，參與代謝路徑的至少一種酶包含mt2和mt3，且其中mt2和mt3將罌粟殼堿半縮醛轉化為那可汀半縮醛。在一些實施方案中，參與代謝路徑的至少一種酶包含mt2和6omt，且其中mt2和6omt將罌粟殼堿半縮醛轉化為那可汀半縮醛。在一些實施方案中，參與代謝路徑的至少一種酶包含4’omt，且其中4’omt將罌粟殼堿半縮醛轉化為那可汀半縮醛。
在一些實施方案中，苯酞異喹啉生物堿產物是罌粟殼堿，且在其他實施方案中，參與代謝路徑的至少一種酶包含sdr1，且其中sdr1將罌粟殼堿半縮醛轉化為罌粟殼堿。在一些實施方案中，苯酞異喹啉生物堿產物是諾斯卡品(noscapine)，且在其他實施方案中，參與代謝路徑的至少一種酶包含mt2和mt3，且其中mt2和mt3將罌粟殼堿轉化為諾斯卡品。在一些實施方案中，參與代謝路徑的至少一種酶包含mt2和6omt，且其中mt2和6omt將罌粟殼堿轉化為諾斯卡品。在一些實施方案中，參與代謝路徑的至少一種酶包含4’omt，且其中4’omt將罌粟殼堿轉化為諾斯卡品。在一些實施方案中，參與代謝路徑的至少一種酶包含sdr1，且其中sdr1將那可汀半縮醛轉化為諾斯卡品。
在一些實施方案中，芐基異喹啉生物堿產物是原小檗堿產物。在一些實施方案中，原小檗堿產物選自由以下組成的組：1-羥基坎那丁、n-甲基坎那丁、n-甲基-左旋蛇果黃堇堿、1-羥基-n-甲基-坎那丁、那可托林(narcotolinal)、1,13-二羥基-n-甲基坎那丁和1-羥基-13-o-乙?；?n-甲基坎那丁。在一些實施方案中，原小檗堿產物是1-羥基坎那丁，其中參與代謝路徑的至少一種酶包含cyp82y1，且其中cyp82y1將坎那丁轉化為1-羥基坎那丁。在一些實施方案中，原小檗堿產物是n-甲基坎那丁，其中參與代謝路徑的至少一種酶包含tnmt，且其中tnmt將坎那丁轉化為n-甲基坎那丁。在一些實施方案中，原小檗堿產物是n-甲基-左旋蛇果黃堇堿，其中參與代謝路徑的至少一種酶包含cyp82x2，且其中cyp82x2將n-甲基坎那丁轉化為n-甲基-左旋蛇果黃堇堿。在一些實施方案中，原小檗堿產物是1-羥基-n-甲基-坎那丁，其中參與代謝路徑的至少一種酶包含cyp82y1，且其中cyp82y1將n-甲基坎那丁轉化為1-羥基-n-甲基-坎那丁。
在一些實施方案中，原小檗堿產物是那可托林，其中參與代謝路徑的至少一種酶包含cyp82x1，且其中cyp82x1將1-羥基-n-甲基-坎那丁轉化為那可托林。在一些實施方案中，原小檗堿產物是1,13-二羥基-n-甲基坎那丁，其中參與代謝路徑的至少一種酶包含cyp82x2，且其中cyp82x2將1-羥基-n-甲基-坎那丁轉化為1,13-二羥基-n-甲基坎那丁。在一些實施方案中，原小檗堿產物是1-羥基-13-o-乙酰基-n-甲基坎那丁，其中參與代謝路徑的至少一種酶包含at1，且其中at1將1,13-二羥基-n-甲基坎那丁轉化為1-羥基-13-o-乙?；?n-甲基坎那丁。
在一些實施方案中，芐基異喹啉生物堿產物選自由那可托林吉地(narcotolinogendial)、4’-o-去甲基-3-o-乙?；浰趭W辛和3-o-乙酰基罌粟奧辛組成的組。在一些實施方案中，原小檗堿產物是那可托林吉地，其中參與代謝路徑的至少一種酶包含cyp82x1，且其中cyp82x1將1,13-二羥基-n-甲基坎那丁轉化為那可托林吉地。在一些實施方案中，原小檗堿產物是4’-o-去甲基-3-o-乙?；浰趭W辛，其中參與代謝路徑的至少一種酶包含cyp82x1，且其中cyp82x1將1-羥基-13-o-乙酰基-n-甲基坎那丁轉化為4’-o-去甲基-3-o-乙?；浰趭W辛。在一些實施方案中，原小檗堿產物是3-o-乙?；浰趭W辛，其中參與代謝路徑的至少一種酶包含mt2和mt3，且其中mt2和mt3將4’-o-去甲基-3-o-乙?；浰趭W辛轉化為3-o-乙酰基罌粟奧辛。在一些實施方案中，原小檗堿產物是3-o-乙?；浰趭W辛，其中參與代謝路徑的至少一種酶mt2和6omt，且其中mt2和6omt將4’-o-去甲基-3-o-乙?；浰趭W辛轉化為3-o-乙酰基罌粟奧辛。在一些實施方案中，原小檗堿產物是3-o-乙?；浰趭W辛，其中參與代謝路徑的至少一種酶包含4’omt，且其中4’omt將4’-o-去甲基-3-o-乙?；浰趭W辛轉化為3-o-乙?；浰趭W辛。
在一些實施方案中，工程化的非植物細胞選自由微生物細胞、昆蟲細胞、哺乳動物細胞、細菌細胞和酵母細胞組成的組。在一些實施方案中，工程化的非植物細胞是酵母細胞。在一些實施方案中，工程化的非植物細胞是產生牛心果堿的細胞。在一些實施方案中，產生牛心果堿的細胞包含用于產生ptps、sepr、pcd、qdhpr、dhfr、tyrh、ncs、dodc、cyp80b1、cpr、6omt、4’omt、cnmt、aro4、aro7、aro10和tkl1的編碼序列，其中每一編碼序列是通過染色體整合到產生牛心果堿的細胞中。在一些實施方案中，產生tyrh、4’omt和ncs中的至少一種的編碼序列的至少一個額外拷貝是通過染色體整合到產生牛心果堿的細胞中，從而增加產生牛心果堿的細胞內牛心果堿的產生。在一些實施方案中，產生牛心果堿的細胞包含至少一個用于產生bbe、s90mt、mt1、cas、tnmt、cyp82y1、cyp82x2、at1、cyp82x1、cxe1、sdr1、mt2和mt3中的至少一種的異源編碼序列，其中每一編碼序列是通過染色體整合到產生牛心果堿的細胞中。在一些實施方案中，產生tyrh、4’omt和ncs中的至少一種的編碼序列的至少一個額外拷貝是通過染色體整合到產生牛心果堿的細胞中，從而增加產生牛心果堿的細胞內牛心果堿的產生。在一些實施方案中，產生cyp82x2和mt1中的至少一種的編碼序列的至少一個額外拷貝是通過染色體整合到產生牛心果堿的細胞中，從而增加產生牛心果堿的細胞內諾斯卡品的產生。
在一些實施方案中，工程化的非植物細胞包含至少一個用于編碼至少一種突變酶的異源序列。在一些實施方案中，至少一種突變酶選自由cyp82y1n-端突變體、cyp82x2突變體、cyp82x1突變體組成的組。在一些實施方案中，工程化的非植物細胞包含至少一個用于編碼至少一種啟動子的異源序列。在一些實施方案中，所述至少一種啟動子選自由hxt7、adh1、pgk1、tpi1、pyk1、tef1、gal1、cyc1、put1、cit2和gpd組成的組。
在一些實施方案中，工程化的非植物細胞包含一種或多種選自由以下組成的組的植物蛋白伴侶：結合性免疫球蛋白(bip)、dnaj蛋白、葡萄糖調節(jié)蛋白(grp)94、結合蛋白(bip)、蛋白二硫化物異構酶(pdi)、親環(huán)素和鈣聯(lián)蛋白。在一些實施方案中，酶中的一種或多種在空間上定位于工程化的非植物細胞中的區(qū)室，其中區(qū)室選自由線粒體、內質網(er)、高爾基體(golgi)、液泡、細胞核、質膜、過氧化物酶體和周質組成的組。在一些實施方案中，一種或多種酶在空間上定位于工程化的非植物細胞中的區(qū)室的外部。在一些實施方案中，一種或多種酶在空間上定位于工程化的非植物細胞中的區(qū)室的內部。在一些實施方案中，工程化的非植物細胞包含至少一個用于編碼至少一種裁剪酶的異源編碼序列。在一些實施方案中，至少一種裁剪酶選自由鹵化酶、異戊烯轉移酶、糖基化酶、甲基化酶、去甲基化酶和氧化還原酶組成的組。
本發(fā)明的另一方面提供形成具有芐基異喹啉生物堿產物的產物流的方法，所述芐基異喹啉生物堿產物為坎那丁的下游產物(downstream)。所述方法包含培養(yǎng)工程化的非植物細胞，所述工程化的非植物細胞沿著將坎那丁或坎那丁的類似物轉化為類諾斯卡品產物的代謝路徑產生作為坎那丁衍生物的芐基異喹啉生物堿產物，所述類諾斯卡品產物包含至少一種選自由類諾斯卡品、類諾斯卡品的前體、類諾斯卡品的代謝物、類諾斯卡品的類似物、類諾斯卡品的中間體和類諾斯卡品的衍生物組成的組的化合物，其中工程化的非植物細胞包含至少一個用于編碼至少一種參與將坎那丁或坎那丁類似物轉化為類諾斯卡品產物的代謝路徑的酶的異源序列。所述方法還包含從細胞材料中分離出芐基異喹啉生物堿產物以提供具有芐基異喹啉生物堿產物的產物流。
在一些實施方案中，工程化的非植物細胞中的至少一種酶的量多于未工程化的非植物細胞中的至少一種酶的量。在一些實施方案中，至少一種參與將坎那丁轉化為類諾斯卡品產物的代謝路徑的酶選自由tnmt、cyp82x2、cyp82y1、cpy82x1、at1、6omt、cxe1、cxe1、sdr1、mt2和mt3組成的組。
在一些實施方案中，芐基異喹啉生物堿產物是苯酞異喹啉生物堿。在一些實施方案中，苯酞異喹啉生物堿產物選自由罌粟殼堿半縮醛、那可汀半縮醛、罌粟殼堿和諾斯卡品組成的組。在一些實施方案中，苯酞異喹啉生物堿產物是罌粟殼堿半縮醛，且其中工程化的非植物細胞包含cyp82x1和cxe1中的至少一種。在一些實施方案中，苯酞異喹啉生物堿產物是那可汀半縮醛，且其中工程化的非植物細胞包含mt2、mt3、6omt和cxe1中的至少一種。在一些實施方案中，苯酞異喹啉生物堿產物是罌粟殼堿，且其中工程化的非植物細胞包含cxe1和sdr1中的至少一種。在一些實施方案中，苯酞異喹啉生物堿產物是諾斯卡品，且其中工程化的非植物細胞包含mt3、6omt、cxe1和sdr1中的至少一種。
在一些實施方案中，芐基異喹啉生物堿產物是原小檗堿產物。在一些實施方案中，原小檗堿產物選自由以下組成的組：1-羥基坎那丁、n-甲基坎那丁、n-甲基-左旋蛇果黃堇堿、1-羥基-n-甲基坎那丁、那可托林、1,13-二羥基-n-甲基坎那丁和1-羥基-13-o-乙?；?n-甲基坎那丁。在一些實施方案中，原小檗堿產物是1-羥基坎那丁，且其中工程化的非植物細胞包含cyp82y1。在一些實施方案中，原小檗堿產物是n-甲基坎那丁，且其中工程化的非植物細胞包含tnmt。在一些實施方案中，原小檗堿產物是n-甲基-左旋蛇果黃堇堿，且其中工程化的非植物細胞包含tnmt和cyp82x2中的至少一種。在一些實施方案中，原小檗堿產物是1-羥基-n-甲基-坎那丁，且其中工程化的非植物細胞包含tnmt和cyp82y1中的至少一種。在一些實施方案中，原小檗堿產物是那可托林，且其中工程化的非植物細胞包含tnmt、cyp82y1和cyp82x1中的至少一種。在一些實施方案中，原小檗堿產物是1,13-二羥基-n-甲基坎那丁，且其中工程化的非植物細胞包含tnmt、cyp82y1和cyp82x2中的至少一種。在一些實施方案中，原小檗堿產物是1-羥基-13-o-乙?；?n-甲基坎那丁，且其中工程化的非植物細胞包含cyp82y1、cyp82x2和at1中的至少一種。
在一些實施方案中，芐基異喹啉生物堿產物選自由諾可托林吉地(norcotolinogendial)、4’-o-去甲基-3-o-乙?；浰趭W辛和3-o-乙酰基罌粟奧辛組成的組。在一些實施方案中，原小檗堿產物是諾可托林吉地，且其中工程化的非植物細胞包含cyp82y1、cyp82x2和cyp82x1中的至少一種。在一些實施方案中，原小檗堿產物是4’-o-去甲基-3-o-乙酰基罌粟奧辛，且其中工程化的非植物細胞包含cyp82x2、at1和cyp82x1中的至少一種。在一些實施方案中，原小檗堿產物是3-o-乙?；浰趭W辛，且其中工程化的非植物細胞包含at1、cyp82x1、mt3和6omt中的至少一種。
在一些實施方案中，工程化的非植物細胞是產生牛心果堿的細胞。在一些實施方案中，產生牛心果堿的細胞包含用于產生ptps、sepr、pcd、qdhpr、dhfr、tyrh、ncs、dodc、cyp80b1、cpr、6omt、4’omt、cnmt、aro4、aro7、aro10和tkl1的編碼序列，其中每一編碼序列是通過染色體整合到產生牛心果堿的細胞中。在一些實施方案中，產生tyrh、4’omt和ncs中的至少一種的編碼序列的至少一個額外拷貝是通過染色體整合到產生牛心果堿的細胞中，從而增加產生牛心果堿的細胞內牛心果堿的產生。在一些實施方案中，產生牛心果堿的細胞包含至少一個用于產生bbe、s90mt、mt1、cas、tnmt、cyp82y1、cyp82x2、at、cyp82x1、cxe1、sdr1、mt2和mt3中的至少一種的異源編碼序列，其中每一編碼序列是通過染色體整合到產生牛心果堿的細胞中。在一些實施方案中，產生tyrh、4’omt和ncs中的至少一種的編碼序列的至少一個額外拷貝是通過染色體整合到產生牛心果堿的細胞中，從而增加產生牛心果堿的細胞內牛心果堿的產生。
在一些實施方案中，工程化的非植物細胞包含至少一個編碼至少一種突變酶的異源序列。在一些實施方案中，至少一種突變酶選自由cyp82y1n-端突變體、cyp82x2突變體、cyp82x1突變體組成的組。在一些實施方案中，工程化的非植物細胞包含至少一個編碼至少一種啟動子的異源序列。在一些實施方案中，所述至少一種啟動子選自由hxt7、adh1、pgk1、tpi1、pyk1、tef1、gal1、cyc1、put1、cit2和gpd組成的組。
在一些實施方案中，工程化的非植物細胞包含一種或多種選自由以下組成的組的植物蛋白伴侶：結合性免疫球蛋白(bip)、dnaj蛋白、葡萄糖調節(jié)蛋白(grp)94、結合蛋白(bip)、蛋白二硫化物異構酶(pdi)、親環(huán)素和鈣聯(lián)蛋白。在一些實施方案中，酶中的一種或多種在空間上定位于工程化的非植物細胞中的區(qū)室，其中區(qū)室選自由線粒體、內質網(er)、高爾基體、液泡、細胞核、質膜、過氧化物酶體和周質組成的組。在一些實施方案中，一種或多種酶在空間上定位于工程化的非植物細胞中的區(qū)室的外部。在一些實施方案中，一種或多種酶在空間上定位于工程化的非植物細胞中的區(qū)室的內部。
在一些實施方案中，工程化的非植物細胞包含至少一個用于編碼至少一種裁剪酶的異源編碼序列。在一些實施方案中，所述至少一種裁剪酶選自由鹵化酶、異戊烯轉移酶、糖基化酶、甲基化酶、去甲基化酶和氧化還原酶組成的組。在一些實施方案中，工程化的非植物細胞選自微生物細胞、昆蟲細胞、哺乳動物細胞、細菌細胞和酵母細胞的組。在一些實施方案中，工程化的非植物細胞是酵母細胞。在一些實施方案中，工程化的非植物細胞是在體外條件下培養(yǎng)。在一些實施方案中，工程化的非植物細胞是在體內條件下培養(yǎng)。
在一些實施方案中，產物流不含有超過5ppm的選自以下各項的組的分子：木質素、類黃酮、類菲(phenanthreoid)、乳膠、核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶、袂康酸、假嗎啡(pseudomorphine)、那碎因(narceine)、蒂巴酚(thebaol)和花粉。在一些實施方案中，產物流不含可檢測量的殺蟲劑。在一些實施方案中，產物流含有非植物細胞的至少一部分。在一些實施方案中，非植物細胞是工程化的非植物細胞。在一些實施方案中，非植物細胞的至少一部分以可檢測量存在于產物流中。在一些實施方案中，非植物細胞的至少一部分使用液相色譜-質譜法可檢測。在一些實施方案中，非植物細胞的至少一部分使用質譜法可檢測。在一些實施方案中，非植物細胞的至少一部分使用光譜法可檢測。在一些實施方案中，芐基異喹啉生物堿產物是使用至少液-液萃取從所述產物流中回收。在一些實施方案中，芐基異喹啉生物堿產物是在完成發(fā)酵過程之后立即回收。
本發(fā)明的另一方面提供包含芐基異喹啉生物堿產物的藥物組合物，所述芐基異喹啉生物堿產物為沿著將坎那丁或坎那丁類似物轉化為類諾斯卡品產物的代謝路徑的坎那丁衍生物，所述類諾斯卡品產物包含至少一種選自由類諾斯卡品、類諾斯卡品的前體、類諾斯卡品的代謝物、類諾斯卡品的類似物、類諾斯卡品的中間體和類諾斯卡品的衍生物組成的組的化合物。所述藥物組合物還包含非植物細胞的至少一部分。在一些實施方案中，非植物細胞是工程化的非植物細胞。在一些實施方案中，非植物細胞的至少一部分以可檢測量存在于產物流中。在一些實施方案中，非植物細胞的部分使用液相色譜-質譜法可檢測。在一些實施方案中，非植物細胞的至少一部分使用質譜法可檢測。
在一些實施方案中，非植物細胞的至少一部分使用光譜法可檢測。在一些實施方案中，所述組合物不含有超過5ppm的選自以下各項的組的分子：木質素、類黃酮、類菲、乳膠、核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶、袂康酸、假嗎啡、那碎因、蒂巴酚和花粉。在一些實施方案中，所述組合物不含可檢測量的殺蟲劑。在一些實施方案中，芐基異喹啉生物堿產物包含諾斯卡品。在一些實施方案中，芐基異喹啉生物堿產物包含罌粟殼堿。在一些實施方案中，芐基異喹啉生物堿產物包含那可汀半縮醛。在一些實施方案中，芐基異喹啉生物堿產物包含罌粟殼堿半縮醛。在一些實施方案中，芐基異喹啉生物堿產物包含3-o-乙酰基罌粟奧辛。在一些實施方案中，芐基異喹啉生物堿產物包含4’-o-去甲基-3-o-乙?；浰趭W辛。
工程化的宿主細胞可以包括參與從起始化合物到所關注類諾斯卡品或其前體的合成路徑的各種酶的異源編碼序列。還提供產生類諾斯卡品、其衍生物和/或其前體的方法，所述方法是通過在促進由宿主細胞的異源編碼序列編碼的酶的活性的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)工程化宿主細胞進行。本發(fā)明的方面進一步包括組合物(例如宿主細胞)、起始化合物和試劑盒等，其可以用于本發(fā)明的方法中。
以引用方式并入
此說明書中所提及的所有出版物、專利和專利申請都以引用方式并入本文中，其并入程度與每一個別出版物、專利或專利申請?zhí)貏e且個別地指示以引用方式并入是一樣的。
附圖簡述
本發(fā)明的新穎特性具體地闡述于隨附權利要求書中。通過參考以下利用本發(fā)明的原理并且闡述闡釋性實施方案的詳細說明和附圖將更好地了解本發(fā)明的特性和優(yōu)點，其中：
圖1圖解說明基于植物中的生物化學鑒定將坎那丁轉化為諾斯卡品的生物合成方案。
圖2a圖解說明根據(jù)本發(fā)明的實施方案基于釀酒酵母(saccharomycescerevisiae)的生物化學表征將坎那丁轉化為諾斯卡品的生物合成方案。
圖2b圖解說明根據(jù)本發(fā)明的實施方案基于釀酒酵母的生物化學表征將坎那丁轉化為諾斯卡品并且產生副產物的另一生物合成方案。
圖3圖解說明根據(jù)本發(fā)明的實施方案來自由工程化的酵母菌株分泌到培養(yǎng)基中的化合物的液相色譜-質譜法(lc-ms)分析的eic(萃取離子色譜)跡線。
圖4圖解說明根據(jù)本發(fā)明的實施方案在圖3中描述的化合物的陽離子電噴霧電離(esi)質譜ms/ms片段化。
圖5圖解說明根據(jù)本發(fā)明的實施方案在表達來自罌粟(papaversomniferum)或花菱草(eschscholziacalifornica)的tnmt并且在坎那丁存在下生長的酵母體內n-甲基坎那丁的合成。
圖6圖解說明根據(jù)本發(fā)明的實施方案在具有或不具有pstnmt下在坎那丁存在下生長且在各種啟動子的下游表達不同形式的cyp82y1的酵母的體內測定結果。
圖7圖解說明根據(jù)本發(fā)明的實施方案在pstnmt和cyp82y1a存在下在坎那丁存在下生長且在各種啟動子(gal1、gpd、pgk1、hxt7)的下游表達cyp82x2的酵母的體內測定結果。
圖8圖解說明根據(jù)本發(fā)明的實施方案在具有或不具有cyp82x2和psat1的情況下在pstnmt和cyp82y1a存在下在坎那丁存在下生長且在各種啟動子(gal1、gpd、pgk1、cyc1、adh1、hxt7)的下游表達野生型(wt)的酵母的體內測定結果。
圖9圖解說明根據(jù)本發(fā)明的實施方案將全去甲勞丹堿轉化為諾斯卡品的生物合成方案。
圖10圖解說明根據(jù)本發(fā)明的實施方案來自由工程化的產生諾斯卡品的酵母菌株分泌到培養(yǎng)基中的化合物的lc-ms分析的eic(萃取離子色譜)跡線。
圖11圖解說明根據(jù)本發(fā)明的實施方案諾斯卡品從全去甲勞丹堿的生物合成。
圖12圖解說明根據(jù)本發(fā)明的實施方案諾斯卡品從酪氨酸的生物合成路徑。
圖13圖解說明根據(jù)本發(fā)明的實施方案來自酵母中諾斯卡品重新產生的lc-ms分析的eic(萃取離子色譜)跡線。
圖14圖解說明根據(jù)本發(fā)明的實施方案在酵母中類諾斯卡品的重新產生的例示性生物合成示意圖。
圖15圖解說明根據(jù)本發(fā)明的實施方案在酵母中類諾斯卡品的重新產生的另一例示性生物合成示意圖。
圖16圖解說明根據(jù)本發(fā)明的實施方案將葡萄糖轉化為4-hpa、多巴胺(dopamine)和3,4-dhpa的生物合成方案。
圖17圖解說明根據(jù)本發(fā)明的實施方案通過去甲烏藥堿將l-酪氨酸轉化為牛心果堿的生物合成方案。
圖18圖解說明根據(jù)本發(fā)明的實施方案通過全去甲勞丹堿將l-酪氨酸轉化為牛心果堿的生物合成方案。
圖19圖解說明根據(jù)本發(fā)明的實施方案四氫生物喋呤的合成、循環(huán)和再利用路徑的實例。
圖20圖解說明根據(jù)本發(fā)明的實施方案將l-酪氨酸轉化為原小檗堿、苯酞異喹啉和小檗堿生物堿產物的生物合成方案。
圖21圖解說明根據(jù)本發(fā)明的實施方案將l-酪氨酸轉化為諾斯卡品、類諾斯卡品和苯酞異喹啉生物堿產物的生物合成方案。
圖22圖解說明根據(jù)本發(fā)明的實施方案將l-酪氨酸轉化為血根堿和苯啡啶生物堿的生物合成方案。
詳述
本公開提供在工程化宿主細胞中產生多種芐基異喹啉生物堿(bia)(例如類諾斯卡品)的方法。本公開進一步提供在工程化宿主細胞中產生的多種類諾斯卡品的組合物。
類諾斯卡品是新興類型的具有高水溶解性的微管調節(jié)抗癌劑，其作為用于治療人癌癥的化學治療劑令人感興趣。類諾斯卡品屬于鴉片(opium)生物堿的種類，所述鴉片生物堿包括以苯酞異喹啉生物堿為特征的化合物。已經合成了多種類諾斯卡品，其顯示增強的腫瘤特異性和腫瘤消退并且對正常組織幾乎沒有或沒有毒性?；陬愔Z斯卡品的支架結構的不同點的接續(xù)合成修飾，輔以計算機設計和結構-活性關系研究，已基于修飾將類諾斯卡品分類為不同的“代”。諾斯卡品是類諾斯卡品化合物，50多年來其一直在世界各地被用作咳嗽遏抑劑并且是在植物中自然制得的。諾斯卡品是母體化合物，已從所述母體化合物衍生出許多類諾斯卡品化合物。諾斯卡品治療癌癥的能力在1998年就已得到證實。盡管治療癌癥所需要的劑量遠高于在其用作咳嗽遏抑劑時(癌癥治療的1,000-2,250mg/天比對咳嗽治療的45-200mg/天)，但諾斯卡品的副作用比傳統(tǒng)化學療法藥物更少。諾斯卡品以一個諾斯卡品分子/微管蛋白二聚體的化學計量結合到微管蛋白。然而，與結合解聚(諾考達唑(nocodazole)、秋水仙堿(colchicine)和長春花生物堿(vincaalkaloid))或過聚合微管蛋白(太平洋紫杉醇(paclitaxel))的其他微管蛋白化學治療劑不同的是，諾斯卡品的抗癌活性可能源于其通過造成細胞凋亡的獨特微管結合模式的微管的動力學穩(wěn)定。從藥理學角度來看，諾斯卡品作為微管結合藥物具有許多優(yōu)點：其可有效對抗耐多藥性癌細胞系，與正常分裂細胞不同地影響癌細胞，并且具有更好的藥物代謝動力學性質，沒有顯著副作用。
在詳細描述本發(fā)明的方面之前，應了解本發(fā)明不應限于所描述的具體實施方案，因此當然可以變化。還應了解本文所使用的術語是僅出于描述具體實施方案的目的并且并不意圖進行限制，因為本發(fā)明的范圍將僅由隨附權利要求限制。
除非上下文另外明確指示，否則在提供值的范圍時，在所述范圍的上限與下限之間的每個以下限單位的十分之一為基準的中間值和在所陳述范圍內的任何其他所陳述值或中間值也涵蓋在本發(fā)明內。這些較小范圍的上限和下限可以獨立地包括在所述較小范圍內并且也涵蓋在本發(fā)明內，在所陳述范圍內受到任何特別排除的限制。在所陳述范圍包括所述限值中的一個或兩個時，不包括那些限值中的任一個或兩個的范圍也包括在本發(fā)明內。
本文呈現(xiàn)某些在數(shù)值前具有術語“約”的范圍。術語“約”在本文中用于為其之前的確切數(shù)值以及接近或近似所述術語前的數(shù)值的數(shù)值提供文字支持。在確定數(shù)值是接近還是近似特別敘述數(shù)值時，接近或近似的未敘述數(shù)值可以是在呈現(xiàn)其的背景下提供特別敘述數(shù)值的實質等效物的數(shù)值。
除非另有定義，否則本文所使用的所有技術和科學術語都具有與本發(fā)明所屬領域技術人員通常理解相同的含義。盡管在本發(fā)明的實踐或測試中還可以使用類似或等效于本文所描述的那些方法和材料的任何方法和材料，但現(xiàn)在描述代表性闡釋性方法和材料。
本文所用術語“路徑衍生物”指的是具有衍生自母體或參考化合物的結構的化學結構的化合物(例如本文公開的化合物)，所述化學結構的不同之處在于至少一個結構差異，例如在于一個或多個取代基被添加、去除、修飾和/或進一步取代。結構差異可以通過(例如)環(huán)化或開環(huán)轉化而改變母體或參考化合物的核心。例如，牛心果堿的路徑衍生物包括多花罌粟堿(salutaridine)和蒂巴因(thebaine)。結構差異可通過任一方法(例如通過誘導的化學轉化、通過酶促催化和/或通過自發(fā)反應)而產生。除非明確指示相反的情形，否則路徑衍生物無需使用母體或參考化合物作為起始材料或作為中間體來合成，但在一些情形下，可以從母體或參考化合物合成衍生物。
本文所用術語“類似物”和“衍生物”指的是具有與母體或參考化合物的結構不同的化學結構的化合物(例如化合物本文公開的)，不同之處在于具有至少一個結構差異，例如從母體或參考化合物添加、去除、修飾和/或進一步取代一個或多個取代基。結構差異可以通過(例如)環(huán)化或開環(huán)轉化而改變母體或參考化合物的核心。例如，n-甲基坎那丁、9-甲基-n-甲基坎那丁和6-氯-坎那丁是坎那丁的類似物。酪氨酸的類似物包括(例如)α-氯-酪氨酸、α-甲基酪氨酸和3-硝基-酪氨酸。結構差異可通過任一方法(例如通過誘導的化學轉化、通過酶促催化和/或通過自發(fā)反應)產生。除非明確指示相反的情形，否則類似物無需使用母體或參考化合物作為起始材料或作為中間體來合成，但在一些情形下，可以從母體或參考化合物合成類似物。
本文所用術語“功能化衍生物”指的是具有與參考化合物有區(qū)別的結構特性的化合物，其中有區(qū)別的特性是存在于化合物的合成中所使用的起始材料中。例如，3-氯-牛心果堿可以從α-氯-l-酪氨酸產生并且在本文中被視為牛心果堿的功能化衍生物，因為區(qū)分所述兩種化合物的氯離子是所用起始材料的特性并且不是通過合成中的步驟引入的。其他實例包括宿主細胞可以從α-羥基-l-酪氨酸產生的坎那丁的功能化衍生物6-羥基-坎那丁和從3-硝基-l-酪氨酸產生的罌粟殼堿的功能化衍生物7-硝基-罌粟殼堿。
應注意，除非上下文另有明確指示，否則如本文和隨附權利要求中所使用的單數(shù)形式“一(a、an)”和“所述”包括復數(shù)個指示物。應進一步注意可以起草權利要求以排除任一可選要素。因此，這聲明旨在與要求保護的要素的敘述結合使用諸如“唯一”、“僅”等等排他性術語或使用“否定”限制的先行基礎。
所屬領域技術人員在閱讀此公開內容之后將明了，本文所描述和闡釋的個別實施方案中的每一個都具有離散組分和特性，所屬組分和特性可容易地與其他幾個實施方案中的任一個的特性分離或組合，而不背離本發(fā)明的范圍或精神。任一所敘述方法可按照所敘述事件的順序或按照在邏輯上可能的任何其他順序來實施。
類諾斯卡品
本發(fā)明提供產生類諾斯卡品產物的宿主細胞。類諾斯卡品產物包括類諾斯卡品、類諾斯卡品的前體、類諾斯卡品的代謝物、類諾斯卡品的類似物、類諾斯卡品的中間體和/或類諾斯卡品的衍生物。在一些實例中，宿主細胞的工程化菌株(例如本發(fā)明的工程化菌株)提供產生跨幾個結構類別的類諾斯卡品產物和其修飾的平臺，包括(但不限于)芐基異喹啉生物堿、原小檗堿、西庫柏賓(secoberbine)、苯酞異喹啉和其他。這些類別中的每一種都意在包括可以產生所述類別成員的工程化宿主細胞生物合成路徑的任一合宜成員的生物合成前體、中間體和其代謝物。在下文針對這些結構類別中的每一種給出化合物的非限制性實例。在一些情形下，所給實例的結構可以或可以不被自身描述為芐基異喹啉生物堿。本發(fā)明化學實體意在包括所有可能的異構體，包括單一對映異構體、外消旋混合物、光學純形式、非對映異構體的混合物和中間體混合物。
原小檗堿可以包括(但不限于)金黃紫堇堿、碎葉紫堇堿、刺罌粟堿、南天竹堿、藥根堿、光千金藤定堿、離生木瓣樹胺、順式-n-甲基刺罌粟堿、四氫非洲防己堿、掌葉防己堿、四氫掌葉防己堿、非洲防己堿、坎那丁、n-甲基坎那丁、1-羥基坎那丁、小檗堿、n-甲基-左旋蛇果黃堇堿、1,13-二羥基-n-甲基坎那丁和1-羥基-10-o-乙酰基-n-甲基坎那丁。
西庫柏賓可以包括(但不限于)4’-o-去甲基馬克蘭特醛(4’-o-desmethylmacrantaldehyde)、4’-o-去甲基罌粟奧辛、4’-o-去甲基-3-o-乙?；浰趭W辛、罌粟奧辛和3-o-乙?；浰趭W辛。
苯酞異喹啉可以包括(但不限于)罌粟殼堿半縮醛、那可汀半縮醛、罌粟殼堿、諾斯卡品、紫罌粟次堿、紫罌粟堿、(+)或(-)-荷苞牡丹堿(bicuculline)、咖諾定(capnoidine)、紫堇明(carlumine)、對葉延胡索堿(corledine)、紫堇米定堿(corlumidine)、夏無堿(decumbenine)、5’-o-去甲基那可汀、(+)或(-)-α或β-北美黃連堿和細果角茴香堿。
類諾斯卡品可以是諾斯卡品的衍生物或類似物并且因此還可以被表征為苯酞異喹啉生物堿。任何合宜的類諾斯卡品都可以被靶向以在本發(fā)明宿主細胞中產生。所關注諾斯卡品類似物包括(但不限于)包括以下的諾斯卡品化合物：在6′位、9′位、1位和7位的修飾、用(例如)n-乙基胺基羰基替代6′位的天然存在的n-甲基、在9′-位經(例如)鹵基、芳基、烷基、疊氮基或硝基取代、區(qū)域選擇性o-去甲基化以露出7位的游離酚和將內酯在1位還原成相應的環(huán)狀醚；例如化合物9-溴諾斯卡品、9-硝基諾斯卡品和9-疊氮基諾斯卡品和naik等人journalofmolecularmodeling,2012,18(1):307-318和lopus和naik,“takingaimatadynamictarget:noscapinoidsasmicrotubule-targetedcancertherapeutics”,pharmacologicalreports,67(1)2015,56-62(在線公布，2014)所描述的那些化合物，所述文獻的公開內容以引用方式整體并入本文中。
術語“類諾斯卡品產物”意在包括類諾斯卡品、類諾斯卡品的前體、類諾斯卡品的代謝物、類諾斯卡品的類似物、類諾斯卡品的中間體和/或類諾斯卡品的衍生物。在一些實例中，類諾斯卡品衍生物和/或類諾斯卡品的衍生物可以包含路徑衍生物。在一些實例中，類諾斯卡品衍生物和/或類諾斯卡品的衍生物可以包含功能化衍生物。在實例中，類諾斯卡品產物可以指代任何合宜的原小檗堿、斷裂小檗堿(secoberberine)或苯酞異喹啉生物堿，其可以是細胞合成路徑中的諾斯卡品前體或所關注類諾斯卡品，包括(但不限于)1-羥基-n-甲基坎那丁、諾斯卡品、罌粟殼堿、那可汀半縮醛、4’-o-去甲基-3-o-乙?；浰趭W辛、罌粟殼堿半縮醛、n-甲基左旋蛇果黃堇堿、1,13-二羥基-n-甲基坎那丁、1-羥基-13-o乙?；?n-甲基坎那丁、那可托林吉地(也就是4’-o-去甲基罌粟奧辛)、那可托林(也就是4’-o-去甲基馬克蘭特醛)和1-羥基坎那丁。在一些情況下，類諾斯卡品產物是所關注合成路徑中坎那丁的下游產物或坎那丁的類似物。
在一些實施方案中，細胞產生諾斯卡品。在某些情況下，細胞產生諾斯卡品的衍生物。在一些情形下，細胞產生圖2a和2b中所描述的諾斯卡品前體。在一些情況下，細胞產生1-羥基-n-甲基坎那丁。在某些實施方案中，細胞產生1-羥基坎那丁。在一些情形下，細胞產生1,13-二羥基-n-甲基坎那丁。在一些情況下，細胞產生n-甲基-左旋蛇果黃堇堿。在某些情形下，細胞產生4’-去甲基-3-o-乙?；浰趭W辛。在某些實施方案中，細胞產生那可托林和那可托林吉地。
類諾斯卡品或其前體的合成路徑可以在宿主細胞中生成并且可以始于任何合宜的起始化合物或材料。在宿主細胞中生成的合成路徑可以始于為所關注類諾斯卡品的前體的任何合宜化合物。本發(fā)明宿主細胞的合成路徑可以與任何合宜的上游或下游產物合成路徑連接以從期望起始化合物產生靶標生物堿。起始化合物可以是從靶標去除一個或多個生物合成步驟(例如去除兩個或更多個、三個或更多個或幾個生物合成步驟)的前體。在一些情形下，起始化合物本身由宿主細胞產生。細胞可以通過包括一種或多種諾斯卡品前體的合成路徑從坎那丁產生諾斯卡品或所關注類諾斯卡品，所述諾斯卡品前體選自由以下組成的組：(s)-n-甲基坎那丁、1-羥基-n-甲基坎那丁、1,13-二羥基-n-甲基坎那丁、1-羥基-13-o乙酰基-n-甲基坎那丁、4’-去甲基-3-o-乙?；浰趭W辛、罌粟殼堿半縮醛和罌粟殼堿。
產生所關注起始化合物的任何合宜的宿主細胞都可適用于本發(fā)明細胞中以產生類諾斯卡品或其前體。所關注起始化合物包括(但不限于)可以存在于內源性類諾斯卡品路徑中的全去甲勞丹堿、坎那丁、金黃紫堇堿、四氫小檗紅堿、刺罌粟堿、碎葉紫堇堿、四氫掌葉防己堿和靶標分子的任何其他合宜前體。在一些情形下，將起始化合物添加到宿主細胞中，所述宿主細胞將所述化合物轉化為所關注類諾斯卡品或其前體。在一些實施方案中，起始化合物是坎那丁。圖2a和2b圖解說明從(s)-坎那丁開始合成諾斯卡品和其前體的路徑。在某些實施方案中，起始化合物是全去甲勞丹堿。圖9圖解說明從全去甲勞丹堿開始合成諾斯卡品和其前體的路徑。在某些情況下，起始化合物可以由產生全去甲勞丹堿的細胞或產生坎那丁的細胞產生，所述細胞適于包括產生所關注類諾斯卡品或其前體的生物合成路徑。在某些實施方案中，起始化合物是酪氨酸。
因此，起始材料可以是非天然存在的或起始材料可以是天然存在的。基于宿主細胞中存在的合成路徑，還可以在所需合成路徑中使用其他化合物作為起始材料。起始材料的來源可以來自宿主細胞本身，例如酪氨酸，或可以從外部來源將起始材料添加或補充到宿主細胞。例如，如果宿主細胞在液體培養(yǎng)物(體內環(huán)境)中生長，那么可以用起始材料(例如酪氨酸或全去甲勞丹堿)補充細胞培養(yǎng)基，所述起始材料被運輸?shù)郊毎胁⑥D化為所需產物。
宿主細胞
如上文所匯總，本發(fā)明的一個方面是產生類諾斯卡品產物的宿主細胞。如本文所使用，術語“產生類諾斯卡品的細胞”意在包括工程化以通過合成路徑從起始化合物產生類諾斯卡品產物的細胞。本發(fā)明宿主細胞可以產生任何合宜的類諾斯卡品產物，包括(但不限于)1-羥基-n-甲基坎那丁、n-甲基坎那丁、諾斯卡品、罌粟殼堿、那可汀半縮醛、4’-o-去甲基-3-o-乙?；浰趭W辛、罌粟殼堿半縮醛、n-甲基左旋蛇果黃堇堿、1-羥基-13-o-乙?；?n-甲基坎那丁、1,13-二羥基-n-甲基坎那丁、那可托林吉地、3-o-乙酰基-罌粟奧辛、那可托林和1-羥基坎那丁。
在本發(fā)明宿主細胞和方法中可以利用任何合宜的細胞。在一些情形下，宿主細胞是非植物細胞。在一些情況下，宿主細胞可以被描述為微生物細胞。在某些情形下，宿主細胞是昆蟲細胞、哺乳動物細胞、細菌細胞或酵母細胞。在產生本發(fā)明細胞產生本發(fā)明產生類諾斯卡品的細胞中可以利用任何合宜類型的宿主細胞，參見(例如)us2008/0176754、wo/2012/039438、wo2013136057、us20140273109和在2014年11月3日提交的pct申請序列號us2014/063738，所述申請的公開內容以引用方式整體并入。
所關注宿主細胞包括(但不限于)細菌細胞，例如枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)、大腸桿菌(escherichiacoli)、鏈霉菌屬(streptomyces)和鼠傷寒沙氏桿菌(salmonellatyphimuium)細胞；昆蟲細胞，例如黑腹果蠅(drosophilamelanogaster)s2和草地貪夜蛾(spodopterafrugiperda)sf9細胞；和酵母細胞，例如釀酒酵母、栗酒裂殖酵母(schizosaccharomycespombe)和巴斯德畢赤酵母(pichiapastoris)細胞。在一些實例中，宿主細胞是酵母細胞或大腸桿菌(e.coli)細胞。在一些情形下，宿主細胞是酵母細胞。在一些情況下，宿主細胞來自工程化以產生的酵母菌株。在某些情況下，酵母細胞是可用于工業(yè)過程中的酵母細胞，例如來自畢赤酵母屬的酵母細胞，包括(但不限于)粉狀畢赤酵母(p.farinose)、異常畢赤酵母(p.anomala)、黑迪氏畢赤酵母(p.heedii)、季也蒙畢赤酵母(p.guilliermondii)、克魯弗畢赤酵母(p.kluyveri)、膜璞畢赤酵母(p.membranifaciens)、挪威畢赤酵母(p.norvegensis)、奧默畢赤酵母(p.ohmeri)、巴斯德畢赤酵母(p.pastoris)、甲醇畢赤酵母(pichiamethanolica)和亞膜畢赤酵母(p.subpelliculosa)。
在us2008/0176754、wo/2012/039438、wo2013136057、us20140273109和pct申請序列號us2014/063738中由smolke等人描述的宿主細胞中的任一種可以適用于本發(fā)明細胞和方法中。在某些實施方案中，酵母細胞可以是釀酒酵母(釀酒酵母(s.cerevisiae))物種。在某些實施方案中，酵母細胞可以是栗酒裂殖酵母物種。在某些實施方案中，酵母細胞可以是巴斯德畢赤酵母物種。酵母作為宿主細胞是令人關注的，因為細胞色素p450蛋白能適當?shù)卣郫B到內質網膜中從而維持其活性。在實例中，細胞色素p450蛋白參與一些所關注生物合成路徑。在其他實例中，細胞色素p450蛋白參與類諾斯卡品產物的產生。
可用于本發(fā)明中的所關注酵母菌株包括(但不限于)cen.pk(基因型：mata/αura3-52/ura3-52trp1-289/trp1-289leu2-3_112/leu2-3_112his3δ1/his3δ1mal2-8c/mal2-8csuc2/suc2)、s288c、w303、d273-10b、x2180、a364a、∑1278b、ab972、sk1和fl100。在某些情形下，酵母菌株是以下中的任一種：s288c(matα；suc2malmelgal2cup1flo1flo8-1hap1)、by4741(matα；his3δ1；leu2δ0；met15δ0；ura3δ0)、by4742(matα；his3δ1；leu2δ0；lys2δ0；ura3δ0)、by4743(mata/matα；his3δ1/his3δ1；leu2δ0/leu2δ0；met15δ0/met15；lys2/lys2δ0；ura3δ0/ura3δ0)和wat11或w(r)，w303-b菌株的衍生菌株(mata；ade2-1；his3-11,-15；leu2-3,-112；ura3-1；canr；cyr+)，所述菌株分別表達擬南芥(arabidopsisthaliana)nadph-p450還原酶atr1和酵母nadph-p450還原酶cpr1。在另一實施方案中，酵母細胞是w303α(matα；his3-11,15trp1-1leu2-3ura3-1ade2-1)。其他所關注酵母菌株的特性和基因型可以參見euroscarf(web.uni-frankfurt.de/fb15/mikro/euroscarf/col_index.html)。
宿主細胞的遺傳修飾
宿主細胞可以工程化以包括一種或多種產生類諾斯卡品產物的修飾(例如兩種或更多種、三種或更多種、四種或更多種、五種或更多種或甚至更多種修飾)。在一些情形下，修飾是遺傳修飾，例如基因或其片段的突變、添加或缺失或基因或其片段的轉錄調節(jié)。如本文所使用，術語“突變”指的是相對于參考序列或基序的氨基酸殘基或核苷酸殘基缺失、插入或取代。突變可以在原始基因座處作為定向突變并入天然存在基因中。在一些情形下，突變可以作為在單獨基因座處作為遺傳整合引入的基因的另一拷貝或作為附加型載體(如2μ或著絲粒質粒)上的另一拷貝并入。在某些情況下，酶的底物抑制拷貝是在天然細胞轉錄調節(jié)下進行。在一些情況下，酶的底物抑制拷貝是在蛋白質表達的工程化組成型或動態(tài)調節(jié)的情況下通過將其置于合成啟動子的控制之下引入。在一些實例中，一種或多種修飾的目標可以是天然存在基因。在一些實例中，一種或多種修飾的目標可以是非天然存在基因。在一些實例中，可以將非天然存在基因插入宿主細胞中。在其他實例中，可以通過一種或多種修飾改變非天然存在基因，之后將其插入宿主細胞中。
工程化的宿主細胞可能過度產生一種或多種類諾斯卡品產物。過度產生意味著相對于對照細胞(例如未修飾細胞)細胞具有改良的或增加的類諾斯卡品產物產生。改良的或增加的產生意味著在對照沒有產生類諾斯卡品產物時，產生一定量的類諾斯卡品產物，以及在對照產生一些類諾斯卡品產物的情況中，增加約10％或更多，例如約20％或更多、約30％或更多、約40％或更多、約50％或更多、約60％或更多、約80％或更多、約100％或更多，例如2倍或更多倍，例如5倍或更多倍(包括10倍或更多倍)。
在一些情形下，所述一種或多種(例如兩種或更多種、三種或更多種或四種或更多種)修飾可以選自：生物合成酶基因中的底物抑制緩解突變；生物合成酶基因中的產物抑制緩解突變；輔因子回收促進機制；生物合成酶基因中的反饋抑制緩解突變；和生物合成酶基因的轉錄調節(jié)修飾；酶基因中的失活突變。
底物抑制緩解突變
在一些情況下，工程化的宿主細胞是在細胞的一種或多種生物合成酶基因中包括一種或多種底物抑制緩解突變(例如兩種或更多種、三種或更多種、四種或更多種、五種或更多種或甚至更多種)的細胞。在一些實例中，所述一種或多種生物合成酶基因對于細胞是天然的(例如存在于未修飾細胞中)。在一些實例中，所述一種或多種生物合成酶基因對于細胞是非天然的。如本文所使用，術語“底物抑制緩解突變”指的是緩解細胞的底物抑制控制機制的突變。
緩解底物抑制的突變相對于對照細胞在所關注細胞中減少受調節(jié)酶的抑制并且增加受調節(jié)化合物或其下游生物合成產物的含量。在一些情形下，受調節(jié)酶的緩解抑制意味著抑制的ic50增加2倍或更多倍，例如增加3倍或更多倍、5倍或更多倍、10倍或更多倍、30倍或更多倍、100倍或更多倍、300倍或更多倍、1000倍或更多倍或甚至更多倍。增加的含量意味著工程化的宿主細胞中受調節(jié)化合物或其下游產物的含量為對照細胞中受調節(jié)化合物或其下游產物的含量的110％或更多、例如120％或更多、130％或更多、140％或更多、150％或更多、160％或更多、170％或更多、180％或更多、190％或更多或200％或更多，例如至少3倍或更多倍、至少5倍或更多倍、至少10倍或更多倍或甚至更多倍。
工程化的宿主細胞中針對諾斯卡品產物含量調節(jié)的各種底物抑制控制機制和生物合成酶可以被靶向用于底物抑制緩解。工程化的宿主細胞可以在一種或多種生物合成酶基因中包括一種或多種底物抑制緩解突變。所述一種或多種突變可以位于生物合成酶受到調節(jié)控制的任何合宜的生物合成酶基因中。在一些實施方案中，工程化的宿主細胞可以在一種或多種生物合成酶基因(例如表1中所描述的那些基因中的一個)中包括一種或多種底物抑制緩解突變。
可以利用任何合宜數(shù)量和類型的突變來緩解底物抑制控制機制。在某些實施方案中，本發(fā)明的工程化的宿主細胞可以在工程化的宿主細胞內的一種或多種生物合成酶基因中包括1種或多種、2種或更多種、3種或更多種、4種或更多種、5種或更多種、6種或更多種、7種或更多種、8種或更多種、9種或更多種、10種或更多種、11種或更多種、12種或更多種、13種或更多種、14種或更多種或甚至15種或更多種底物抑制緩解突變，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15種底物抑制緩解突變。
輔因子回收促進機制
在一些情況下，工程化的宿主細胞是在細胞的一種或多種生物合成酶基因中包括一種或多種輔因子回收促進機制(例如兩種或更多種、三種或更多種、四種或更多種、五種或更多種或甚至更多種)的細胞。在一些實例中，所述一種或多種生物合成酶基因對于細胞是天然的(例如存在于未修飾細胞中)。在一些實例中，所述一種或多種生物合成酶基因對于細胞是非天然的。如本文所使用，術語“輔因子回收促進機制”指的是促進細胞的輔因子回收控制機制的機制。在一些實例中，用于回收的所述一種或多種所關注輔因子包括(但不限于)s-腺苷甲硫氨酸、煙堿酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸、煙堿酰胺腺嘌呤二核苷酸、四氫生物喋呤和黃素腺嘌呤二核苷酸。
在工程化的宿主細胞中針對類諾斯卡品產物含量調節(jié)的各種輔因子回收控制機制和生物合成酶可以被靶向用于輔因子回收促進。工程化的宿主細胞可以在一種或多種生物合成酶基因中包括一種或多種輔因子回收促進機制。在一些實例中，工程化的宿主細胞可以在一種或多種生物合成酶基因(例如表1中所描述的那些基因中的一種)中包括一種或多種輔因子回收促進機制。
可以利用任何合宜數(shù)量和類型的機制來促進輔因子回收控制機制。在某些實施方案中，本發(fā)明的工程化的宿主細胞可以在工程化的宿主細胞內的一種或多種生物合成酶基因中包括1種或多種、2種或更多種、3種或更多種、4種或更多種、5種或更多種、6種或更多種、7種或更多種、8種或更多種、9種或更多種、10種或更多種、11種或更多種、12種或更多種、13種或更多種、14種或更多種或甚至15種或更多種輔因子回收促進機制，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15種輔因子回收促進機制。
產物抑制緩解突變
在一些情況下，工程化的宿主細胞是在細胞的一種或多種生物合成酶基因中包括一種或多種產物抑制緩解突變(例如兩種或更多種、三種或更多種、四種或更多種、五種或更多種或甚至更多種)的細胞。在一些實例中，所述一種或多種生物合成酶基因對于細胞是天然的(例如存在于未修飾細胞中)。在一些實例中，所述一種或多種生物合成酶基因對于細胞是非天然的。如本文所使用，術語“產物抑制緩解突變”指的是緩解工程化的宿主細胞的短期和/或長期產物抑制控制機制的突變。短期產物抑制是細胞中在輔底物結合位點處存在競爭結合的控制機制。長期產物抑制是細胞中遠離所需路徑存在不可逆結合的控制機制。
緩解產物抑制的突變相對于對照細胞可在所關注細胞中減少受調節(jié)酶的抑制并且增加受調節(jié)化合物或其下游生物合成產物的含量。在一些情形下，受調節(jié)酶的緩解抑制意味著抑制的ic50增加2倍或更多倍，例如增加3倍或更多倍、5倍或更多倍、10倍或更多倍、30倍或更多倍、100倍或更多倍、300倍或更多倍、1000倍或更多倍或甚至更多倍。增加的含量意味著的對照細胞中受調節(jié)化合物或其下游產物的含量為工程化的宿主細胞中受調節(jié)化合物或其下游產物的含量的110％或更多，例如120％或更多、130％或更多、140％或更多、150％或更多、160％或更多、170％或更多、180％或更多、190％或更多或200％或更多，例如至少3倍或更多倍、至少5倍或更多倍、至少10倍或更多倍或甚至更多倍。
工程化的宿主細胞中針對類諾斯卡品產物含量調節(jié)的各種產物抑制控制機制和生物合成酶可以被靶向用于產物抑制緩解。工程化的宿主細胞可以在一種或多種生物合成酶基因中包括一種或多種產物抑制緩解突變。突變可以位于生物合成酶受到調節(jié)控制的任何合宜的生物合成酶基因中。在一些實施方案中，工程化的宿主細胞在一種或多種生物合成酶基因(例如表1中所描述的那些基因中的一種)中包括一種或多種產物抑制緩解突變。
可以利用任何合宜數(shù)量和類型的突變來緩解產物抑制控制機制。在某些實施方案中，本發(fā)明的工程化的宿主細胞可以在工程化的宿主細胞內的一種或多種生物合成酶基因中包括1種或多種、2種或更多種、3種或更多種、4種或更多種、5種或更多種、6種或更多種、7種或更多種、8種或更多種、9種或更多種、10種或更多種、11種或更多種、12種或更多種、13種或更多種、14種或更多種或甚至15種或更多種產物抑制緩解突變，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15種產物抑制緩解突變。
反饋抑制緩解突變
在一些情況下，工程化的宿主細胞是在細胞的一種或多種生物合成酶基因中包括一種或多種反饋抑制緩解突變(例如兩種或更多種、三種或更多種、四種或更多種、五種或更多種或甚至更多種)的細胞。在一些情形下，所述一種或多種生物合成酶基因對于細胞是天然的(例如存在于未修飾細胞中)。另外或或者，在一些實例中，所述一種或多種生物合成酶基因對于細胞是非天然的。如本文所使用，術語“反饋抑制緩解突變”指的是緩解工程化的宿主細胞的反饋抑制控制機制的突變。反饋抑制是細胞中受調節(jié)化合物合成路徑中的酶在所述化合物積累到某一水平時被抑制從而平衡細胞中所述化合物的量的控制機制。緩解反饋抑制的突變相對于對照細胞在工程化的宿主細胞中減少受調節(jié)酶的抑制。以此方式，工程化的宿主細胞增加受調節(jié)化合物或其下游生物合成產物的含量。在一些情形下，受調節(jié)酶的緩解抑制意味著抑制的ic50增加2倍或更多倍，例如增加3倍或更多倍、5倍或更多倍、10倍或更多倍、30倍或更多倍、100倍或更多倍、300倍或更多倍、1000倍或更多倍或甚至更多倍。增加的含量意味著對照細胞中受調節(jié)化合物或其下游產物的含量為宿主細胞中受調節(jié)化合物或其下游產物的含量的110％或更多，例如120％或更多、130％或更多、140％或更多、150％或更多、160％或更多、170％或更多、180％或更多、190％或更多,或200％或更多，例如至少3倍或更多倍、至少5倍或更多倍、至少10倍或更多倍或甚至更多。
在宿主細胞中針對所關注bia的含量的調節(jié)的各種反饋抑制控制機制和生物合成酶可以被靶向用于緩解。宿主細胞可以在一種或多種對于細胞天然的生物合成酶基因中包括一種或多種反饋抑制緩解突變。所述一種或多種突變可以位于生物合成酶受到調節(jié)控制的任何合宜的生物合成酶基因中。在一些實施方案中，工程化的宿主細胞可以在一種或多種生物合成酶基因(例如表1中所描述的那些基因中的一種)中包括一種或多種反饋抑制緩解突變。
可以利用任何合宜數(shù)量和類型的突變來緩解反饋抑制控制機制。如本文所使用，術語“突變”指的是相對于參考序列或基序的氨基酸殘基或核苷酸殘基的缺失、插入或取代。突變可以在原始基因座處作為定向突變并入天然存在基因。在一些情形下，突變可以在單獨基因座處作為以遺傳整合引入的基因的另一拷貝或作為附加型載體(例如2μ或著絲粒質粒)上的另一拷貝并入。在某些情況下，酶的反饋抑制拷貝是在天然細胞轉錄調節(jié)下進行。在一些情況下，酶的反饋抑制拷貝是在蛋白質表達的工程化組成型或動態(tài)調節(jié)的情況下通過將其置于合成啟動子的控制之下引入。
在某些實施方案中，本發(fā)明的工程化的宿主細胞可以在工程化的宿主細胞內的一種或多種生物合成酶基因中包括1種或多種、2種或更多種、3種或更多種、4種或更多種、5種或更多種、6種或更多種、7種或更多種、8種或更多種、9種或更多種、10種或更多種、11種或更多種、12種或更多種、13種或更多種、14種或更多種或甚至15種或更多種反饋抑制緩解突變，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15種反饋抑制緩解突變。
轉錄調節(jié)修飾
宿主細胞可以包括細胞的一種或多種生物合成酶基因的一種或多種轉錄調節(jié)修飾(例如兩種或更多種、三種或更多種、四種或更多種、五種或更多種或甚至更多種修飾)。在一些實例中，所述一種或多種生物合成酶基因對于細胞是天然的。在一些實例中，所述一種或多種生物合成酶基因對于細胞是非天然的。細胞的任何合宜的生物合成酶基因都可以被靶向用于轉錄調節(jié)。轉錄調節(jié)意味著相對于對照細胞(例如未修飾細胞)在被修飾細胞中所關注基因的表達被調節(jié)，例如增加或減少、增強或抑制。在一些情形下，所關注基因的轉錄調節(jié)包括增加或增強表達。增加或增強表達意味著與對照(也就是在未修飾的相同細胞中的表達)相比，所關注基因的表達水平增加2倍或更多倍，例如增加5倍或更多倍并且有時增加25倍、50倍或100倍或更多倍，并且在某些實施方案中為300倍或更多倍或更高(例如通過使用任何合宜的基因表達測定)?；蛘?，在細胞中的所關注基因表達得如此低使得其檢測不到的情形下，如果表達增加到容易可檢測的水平，那么所關注基因的表達水平被視為有所增加。在某些情況下，所關注基因的轉錄調節(jié)包括減少或抑制表達。減少或抑制表達意味著與對照相比，所關注基因的表達水平減少2倍或更多倍，例如減少5倍或更多倍并且有時候減少25倍、50倍或100倍或更多倍并且在某些實施方案中為300倍或更多倍或更高。在一些情形下，表達減少到檢測不到的水平?？蛇m用于本發(fā)明宿主細胞中的所關注宿主細胞過程的修飾在美國公布號20140273109(14/211,611)中由smolke等人描述，所述公布的公開內容以引用方式整體并入本文中。
在一些實施方案中，轉錄調節(jié)修飾可以包括用強啟動子取代所述一種或多種生物合成酶基因的天然啟動子或使一種或多種基因的額外拷貝的表達處于強啟動子之下。所關注基因的啟動子驅動表達可以是組成型啟動子或可誘導型啟動子，前提是啟動子在宿主細胞中可具有活性。所關注基因可以從其天然啟動子來表達。另外或或者，所關注基因可以從非天然啟動子來表達。盡管不作要求，但此類啟動子在使用其的宿主中可以是中等強度到高強度的。啟動子可以是調節(jié)型或組成型的。在一些實施方案中，可以使用不受葡萄糖抑制或僅因培養(yǎng)基中葡萄糖的存在受輕微抑制的啟動子。存在眾多適宜啟動子，其實例包括糖酵解基因的啟動子，例如枯草芽孢桿菌(b.subtilis)tsr基因的啟動子(編碼果糖二磷酸醛縮酶)或來自酵母釀酒酵母的gapdh啟動子(編碼甘油醛-磷酸脫氫酶)(bitterg.a.,meth.enzymol.152:673684(1987))。其他所關注強啟動子包括(但不限于)面包酵母(baker'syeast)的adhi啟動子(ruohonenl.等人，j.biotechnol.39:193203(1995))、磷酸鹽饑餓誘導型啟動子(例如酵母的pho5啟動子(hinnen,a.等人，yeastgeneticengineering,barr,p.j.等人編輯,butterworths(1989))、來自地衣芽孢桿菌(b.licheniformis)的堿性磷酸酶啟動子(lee.j.w.k.等人，j.gen.microbiol.137:11271133(1991))、gpd1和tef1。所關注酵母啟動子包括(但不限于)可誘導型啟動子(例如gal1-10、gal1、gall、gals、可抑制啟動子met25、teto)和組成型啟動子(例如甘油醛3-磷酸脫氫酶啟動子(gpd)、醇脫氫酶啟動子(adh)、翻譯-延長因子-1-α啟動子(tef)、細胞色素c-氧化酶啟動子(cyc1)、mrp7啟動子等)。在一些情況下，強啟動子是gpd1。在某些情況下，強啟動子是tef1。含有可通過激素(例如糖皮質激素、類固醇和甲狀腺激素)誘導的啟動子的自主復制型酵母表達載體也為已知的且包括(但不限于)糖皮質激素應答元件(gre)和甲狀腺激素應答元件(tre)，例如參見在美國專利號7,045,290中描述的那些啟動子。可以使用含有組成型或可誘導啟動子(例如α因子、醇氧化酶和pgh)的載體。另外，還可以使用任一啟動子/增強子組合(根據(jù)真核啟動子數(shù)據(jù)庫epdb)來驅動所關注基因的表達。應了解可以選擇對宿主細胞特異的任何合宜啟動子，例如大腸桿菌。在一些情形下，可以使用啟動子選擇來優(yōu)化轉錄且因此優(yōu)化酶含量以最大化產量同時最小化能源。
使突變失活
工程化的宿主細胞可以包括針對細胞酶的一種或多種失活突變(例如兩種或更多種、三種或更多種、四種或更多種、五種或更多種或甚至更多種)。包含一種或多種失活突變可以改變工程化的宿主細胞的合成路徑的通量以增加所關注bia或產生所述bia的期望酶或前體的含量。在一些實例中，所述一種或多種失活突變是針對對于細胞天然的酶。另外或或者，所述一種或多種失活突變是針對對于細胞非天然的酶。如本文所使用，“失活突變”意思是針對細胞的基因或調節(jié)dna序列的一種或多種突變，其中所述突變使通過所述所關注基因表達的蛋白質的生物活性失活。在一些情形下，基因對于細胞是天然的。在一些情況下，基因所編碼的酶失活且為由宿主細胞產生的所關注bia的合成路徑的一部分或與之相連。在一些情況下，失活突變位于控制所關注基因的調節(jié)dna序列中。在某些情形下，失活突變是針對基因的啟動子?？梢岳萌魏魏弦说耐蛔?例如如本文所描述)使所關注基因或調節(jié)dna序列失活?！笆Щ?inactivated或inactivates)”意味著相對于由非突變對照基因表達的對照蛋白質，由突變基因表達的蛋白質的生物活性降低10％或更多，例如降低20％或更多、30％或更多、40％或更多、50％或更多、60％或更多、70％或更多、80％或更多、90％或更多、95％或更多、97％或更多或99％或更多。在一些情形下，蛋白質是酶并且失活突變降低所述酶的活性。
在一些實例中，工程化的宿主細胞包括對于細胞天然的酶中的失活突變。任何合宜的酶都可以被靶向用于失活。所關注酶可以包括(但不限于)表1中所描述的那些酶，其在工程化宿主細胞的合成路徑中的作用往往降低類諾斯卡品產物的含量。
異源編碼序列
在一些情況下，工程化的宿主細胞具有一個或多個用于編碼使得工程化的宿主細胞能夠產生所需類諾斯卡品產物的活性的異源編碼序列(例如兩個或更多個、三個或更多個、四個或更多個、五個或更多個)，例如如本文所描述。如本文所使用，術語“異源編碼序列”用于指示任一編碼或最后編碼肽或蛋白質或其等效氨基酸序列(例如酶)的多核苷酸，其通常不存在于宿主生物體中并且可以在適當條件下在宿主細胞中表達。因此，“異源編碼序列”包括通常存在于宿主細胞中的編碼序列的多個拷貝，使得細胞表達通常不存在于細胞中的編碼序列的額外拷貝。異源編碼序列可以是rna或其任一類型(例如mrna)、dna或其任一類型(例如cdna)或rna/dna的混合物。所關注編碼序列包括(但不限于)包括諸如編碼序列、內含子、啟動子區(qū)、3'-utr和增強子區(qū)等特性的全長轉錄單元。
工程化的宿主細胞還可以被修飾以具有一種或多種遺傳變化以納入異源編碼序列。天然宿主基因組的變化包括(但不限于)修飾基因組以減少或消除可以干擾所需路徑的特定蛋白質的表達。此類天然蛋白的存在可以將路徑的中間體或最終產物中的一種迅速轉化為不為所需路徑使用的代謝物或其他化合物。因此，如果天然酶的活性降低或完全不存在，那么所產生中間體可能更容易用于并入所需要產物中。在一些情況下，蛋白質表達的消除可能令人感興趣，如在參與多效性藥物響應的蛋白質(包括(但不限于)atp-結合盒(abc)運輸?shù)鞍?、耐多藥?mdr)泵和相關轉錄因子)中。
宿主細胞可以被修飾以包括各種提供期望活性或性質的植物蛋白。可以在工程化的宿主細胞中利用與所關注類諾斯卡品或其前體的合成相關的任何合宜的植物蛋白，例如酶、蛋白伴侶、輔因子等。在一些情形下，宿主細胞包括植物蛋白伴侶蛋白。植物蛋白伴侶可以促進所關注酶在宿主細胞中的作用，從而改良所關注類諾斯卡品或其前體的產生。所關注植物蛋白伴侶包括(但不限于)結合性免疫球蛋白(bip)、dnaj蛋白、葡萄糖調節(jié)蛋白(grp)94、結合蛋白(bip)、蛋白二硫化物異構酶(pdi)、親環(huán)素和鈣聯(lián)蛋白。
異源編碼序列包括(但不限于)編碼酶的序列(野生型或等效序列)，其在植物中通常負責產生類諾斯卡品產物。在一些情形下，異源序列所編碼的酶可以是1-bia路徑中的酶中的任一種并且可以來自任何合宜的來源?？梢曰谒璁a物來選擇用于具體合成路徑的由異源編碼序列編碼的酶的選擇和數(shù)量。在某些實施方案中，本發(fā)明的宿主細胞可以包括1種或多種、2個或更多個、3個或更多個、4個或更多個、5個或更多個、6個或更多個、7個或更多個、8個或更多個、9個或更多個、10個或更多個、11個或更多個、12個或更多個、13個或更多個、14個或更多個或甚至15個或更多個異源編碼序列，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個異源編碼序列。
如本文所使用，術語“異源編碼序列”還包括肽或酶的編碼部分(也就是肽或酶的cdna或mrna序列)以及全長轉錄單元(也就是包括內含子和外顯子的基因)的編碼部分，以及“密碼子經優(yōu)化”序列、截短序列或編碼酶或編碼其等效氨基酸序列的其他形式的變化序列，前提是所述等效氨基酸序列產生功能蛋白。此類等效氨基酸序列可以具有一種或多種氨基酸的缺失，其中缺失在n-端、c-端或在內部。設想截短的形式，只要其具有本文所指示的催化能力即可。還設想兩種或更多種酶的融合物以促進路徑中代謝物的轉移，前提是維持催化活性。
可以通過建模和/或篩選來鑒定可操作片段、突變或截短形式。在一些情形下，這是通過以下實現(xiàn)的：以逐步方式使(例如)蛋白質的n-端、c-端或內部區(qū)缺失，隨后與原始序列相比分析所得衍生物對所需要反應的活性。如果所述衍生物以此能力操作，那么其被視為構成酶本身的等效衍生物。任何合宜的所關注酶都可以突變或工程化以在工程化的宿主細胞中提供期望的生物活性。在一些情形下，突變酶工程化以促進酶的正確折疊。在某些情況下，突變酶工程化以相對于非突變酶增加酶的期望活性或性質。在某些情況下，突變酶工程化以相對于非突變酶減少酶的不期望活性或性質。在一些實施方案中，細胞包括一個或多個編碼一種或多種突變酶的異源編碼序列。在一些情況下，突變酶是cyp82y1n-端突變體。cyp82y1的n-端可以工程化以促進酶的正確折疊。圖6圖解說明使用各種cyp82y1酶突變的類諾斯卡品前體產生的增加。在一些情形下，第一酶的活性是通過將n-端標簽與第二酶的n-端標簽交換來改良的。
本發(fā)明的方面還涉及編碼與各種酶的天然氨基酸序列等效的氨基酸序列的異源編碼序列?！暗刃А卑被嵝蛄斜欢x為與特定氨基酸序列不同而是含有至少一些氨基酸變化(缺失、取代、倒置、插入等)的氨基酸序列，在用于所需目的時，與特定氨基酸序列的類似活性相比，所述“等效”氨基酸序列并不實質上影響蛋白質的生物活性。等效序列還意欲包括那些已工程化和/或進化成具有與原始氨基酸序列不同的性質的序列。所關注可變性質包括催化活性、底物特異性、選擇性、穩(wěn)定性、溶解性、定位等。在某些實施方案中，“等效”氨基酸序列含有在氨基酸水平上與特定氨基酸序列至少80％-99％同一性，在一些情形下至少約85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％和更多，在某些情形下，在氨基酸水平上至少95％、96％、97％、98％和99％同一性。在一些情形下，氨基酸序列可以相同但dna序列被改變以(例如)優(yōu)化(例如)宿主生物體的密碼子使用。
在一些情況下，每一類型酶的表達是通過額外基因拷貝(也就是多個拷貝)增加，從而增加類諾斯卡品產物的中間體的積累和/或產生。本發(fā)明的實施方案包括通過同時表達單一或多種酶的多種物種變體來增加宿主細胞中類諾斯卡品產物的產生。在一些情形下，在宿主細胞中包括單一或多種酶的額外基因拷貝。可以利用任何合宜的方法，在宿主細胞中包括用于酶的異源編碼序列的多個拷貝。
在一些實例中，工程化的宿主細胞包括用于酶的異源編碼序列的多個拷貝，例如2個或更多個、3個或更多個、4個或更多個、5個或更多個或甚至10個或更多個拷貝。在某些實施方案中，工程化的宿主細胞包括用于一種或多種酶的異源編碼序列的多個拷貝，例如兩個或更多個、三個或更多個、四個或更多個等的多個拷貝。在一些情形下，用于酶的異源編碼序列的多個拷貝源自兩種或更多種與宿主細胞相比不同來源生物體。例如，工程化的宿主細胞可以包括一個異源編碼序列的多個拷貝，而拷貝中的每一個源自不同的來源生物體。因此，基于由異源編碼序列編碼的所關注酶的種間差異，每一拷貝可以包括顯式序列的一些變化形式。
除非另外注明，否則異源編碼序列如genbank中所報道。所關注酶的列表在表1中顯示。本發(fā)明的宿主細胞可以包括來自任一來源的所列示酶的任一組合。除非另有指示，否則本文公開的登錄號指的是genbank。一些登錄號指的是酵母屬基因組數(shù)據(jù)庫(sgd)，其可在萬維網上在www.yeastgenome.org處獲得。
在一些實施方案中，細胞包括一個或多個用于編碼一種或多種所關注酶(例如如本文所描述)的異源編碼序列。所關注酶包括(但不限于)表1中所描述的那些酶。在某些實施方案中，細胞包括編碼四氫原小檗堿n-甲基轉移酶(tnmt)的異源編碼序列。在一些情況下，細胞包括編碼n-甲基坎那丁1-羥化酶(cyp82y1)的異源編碼序列。在一些情形下，細胞包括編碼1-羥基-n-甲基坎那丁13-羥化酶(cyp82x2)的異源編碼序列。在某些情況下，細胞包括編碼1,13-二羥基-n-甲基坎那丁3-o乙?；D移酶(psat1)的異源編碼序列。在一些實施方案中，細胞包括編碼4’-o-去甲基-3-o-乙?；浰趭W辛合成酶(cyp82x1)的異源編碼序列。在一些情況下，細胞包括編碼那可汀半縮醛合成酶(pscxe1)的異源編碼序列。在某些情況下，細胞包括編碼諾斯卡品合成酶(pssdr1)的異源編碼序列。在一些情形下，細胞包括一個或多個編碼一種或多種選自psmt3和ps6omt的酶的異源編碼序列(例如兩個或更多個)。在一些情形下，細胞包括一個或多個編碼一種或多種選自psmt3、ps6omt和psmt2的酶的異源編碼序列(例如兩個或更多個)。在某些情形下，細胞包括編碼酶psmt3和psmt2的異源編碼序列。在某些情形下，細胞包括編碼酶ps6omt和psmt2的異源編碼序列。在某些實施方案中，細胞包括編碼酶cyp82y1、cyp82x1和cyp82x2的異源編碼序列。異源編碼序列可以使用任何合宜的方法在宿主細胞中表達。在一些情況下，異源編碼序列從低拷貝構建體表達。在一些情形下，細胞包括源自選自罌粟(p.somniferum)和花菱草(e.californica)的源生物體的異源編碼序列。在一些實施方案中，細胞缺乏所關注酶(例如如本文所描述)。在某些實施方案中，細胞缺乏一種或多種選自以下的酶：psmt2、psmt3、ps6omt、cyp82x1、cyp82x2、pstnmt或ectnmt、pscxe1、pssdr1、psat1和cyp82y1。在某些實施方案中，細胞缺乏兩種或更多種(例如三種或更多種、四種或更多種、五種或更多種、六種或更多種、七種或更多種、八種或更多種或九種或更多種)選自以下的酶：psmt2、psmt3、ps6omt、cyp82x1、cyp82x2、tnmt、pscxe1、pssdr1、psat1和cyp82y1?？梢赃x擇本文所述酶的兩種或更多種的任一組合以從本發(fā)明細胞排除。
在一些實施方案中，細胞包括psmt3酶。在一些實施方案中，細胞包括ps6omt酶。在一些情況下，細胞包括為同二聚體或異二聚體的酶(例如任兩種本文所描述的合宜酶的二聚體)。在某些情況下，細胞包括psmt2+mt3的異二聚體酶。在某些情形下，細胞包括psmt2+6omt的異二聚體酶。
在一些情況下，宿主細胞包括用于cpr酶的異源編碼序列。在本發(fā)明宿主細胞中可以利用任何合宜的cpr酶。在某些情況下，cpr酶是擬南芥p450還原酶(atr)(例如atr1)或來自罌粟的cpr酶(pscpr)。細胞可以使用一種或多種在細胞中提供諾斯卡品的衍生化的酶產生所關注類諾斯卡品。在某些實施方案中，細胞包括一個或多個用于一種或多種選自以下的酶的異源編碼序列：p450、鹵化酶、糖基化酶、甲基轉移酶、乙酰基轉移酶、短鏈脫氫酶、羧基酯酶和異戊二烯基轉移酶。
細胞可以從全去甲勞丹堿產生類諾斯卡品或其前體。圖9圖解說明從全去甲勞丹堿開始合成諾斯卡品和其前體的路徑。在一些實施方案中，細胞包括一個或多個用于編碼一種或多種酶選自以下的異源編碼序列：tnmt、psat1、cyp82x1、pscxe1、pssdr1、psmt3、psmt2、cyp82y1、cyp82x1、s9omt、ps6omt、ps4’omt、pscnmt、psbbe、atatr1和cyp719a。異源編碼序列可以使用任何合宜的方法在細胞中被表達。所關注表達方法視各種因素(例如所關注酶和所關注細胞產物)而變化且包括(但不限于)染色體整合、從yac表達、從低拷貝質粒表達和從高拷貝質粒表達。在某些實施方案中，細胞從yac表達tnmt、psat1、cyp82x1、pscxe1、pssdr1、psmt2。在某些實施方案中，細胞從yac表達cyp82y1、cyp82x1、pscxe1、pssdr1、psmt3。在某些實施方案中，細胞從yac表達cyp82x2、cyp82x1、pscxe1、pssdr1、psmt2、psat1、tnmt。在某些情況下，細胞從低拷貝質粒表達cyp82y1和cyp82x1。在一些情況下，細胞從高拷貝質粒表達s9omt。在一些情形下，ps6omt、ps4’omt,pscnmt、psbbe、atatr1和cyp719a是通過染色體整合于細胞中。在一些情形下，tnmt、psat1、cyp82x1、pscxe1、pssdr1、psmt3、psmt2、cyp82y1、cyp82x1、s9omt、ps6omt、ps4’omt、pscnmt、psbbe、atatr1和cyp719a是通過染色體整合于細胞中。在一些情形下，rnptps、rnsepr、rnpcd、rnqdhpr、rndhfr、rntyrh、cjncs、ppdodc、eccyp80b1、pscpr、ps6omt、ps4’omt、pscnmt、aro4(q166k)、aro7(t226i)、aro10、tkl1、tnmt、psat1、cyp82x1、pscxe1、pssdr1、psmt3、psmt2、cyp82y1、cyp82x1、s9omt、psbbe和cyp719a是通過染色體整合于細胞中。
在一些實施方案中，宿主細胞(例如酵母菌株)工程化以通過將一種或多種酶定位到細胞中的區(qū)室選擇性產生所關注類諾斯卡品或其前體。細胞的任何合宜的區(qū)室或結構都可以被靶向用于定位所關注酶。在一些實施方案中，細胞包括在空間上定位到酵母細胞中的區(qū)室的酶，其中區(qū)室選自線粒體、內質網(er)、高爾基體、液泡、細胞核、質膜、過氧化物酶體和周質。在一些情況下，酶通過將er靶標序列融合到蛋白質的n-端而被定位到酵母內質網。在某些情形下，所關注酶在空間上定位到酵母細胞中的區(qū)室的外部。在一些情況下，所關注酶在空間上定位到酵母細胞中的區(qū)室的內部。
在一些情形下，酶可以位于宿主細胞中，使得由此酶產生的化合物在達到可以將所述化合物轉化為不期望代謝物的經定位酶之前以自發(fā)方式重排或通過另一酶轉化為期望代謝物。可以選擇兩種酶之間的空間距離以防止酶中的一種直接作用于化合物而產生不期望代謝物并且限制不期望終產物(例如不期望類鴉片副產物)的產生。在某些實施方案中，本文所述酶中的任一種可以單獨地或與第二種酶一起定位到宿主細胞中的任何合宜區(qū)室中，所述合宜區(qū)室包括(但不限于)細胞器、內質網、高爾基體、液泡、細胞核、質膜或周質。
在一些實施方案中，宿主細胞包括包含定位標簽的酶中的一種或多種。任何合宜的定位標簽都可以被利用。在一些情形下，定位標簽是附接在酶的n-端和或c-端的肽序列?？梢岳萌魏魏弦说姆椒▽撕灨浇拥矫?。在一些情形下，定位標簽源自內源性酵母蛋白。此類標簽可提供到各種酵母細胞器(包括(但不限于)內質網(er)、線粒體(mt)、質膜(pm)和液泡(v))的路徑選擇。在某些情況下，標簽包括或源自尾部錨定型類蛋白內的的跨膜結構域。在一些實施方案中，定位標簽將酶定位于細胞器的外部。在某些實施方案中，定位標簽將酶定位于細胞器的內部。
在一些情況下，每一類型酶的表達都可通過額外基因拷貝(也就是多個拷貝)而增加，這可增加中間體積累且最后增加類諾斯卡品和/或類諾斯卡品前體的產生。本發(fā)明的實施方案包括通過同時表達單一或多種酶的多種物種變體來增加宿主細胞中的類諾斯卡品產生。在一些情形下，在宿主細胞中包括單一或多種酶的額外基因拷貝?？梢岳萌魏魏弦说姆椒ǎ谒拗骷毎邪ㄓ糜诿傅漠愒淳幋a序列的多個拷貝。
在一些實施方案中，宿主細胞包括用于酶的異源編碼序列的多個拷貝，例如2個或更多個、3個或更多個、4個或更多個、5個或更多個或甚至10個或更多個拷貝。在某些實施方案中，宿主細胞包括用于一種或多種酶的異源編碼序列的多個拷貝，例如兩個或更多個、三個或更多個、四個或更多個等的多個拷貝。在一些情況下，宿主細胞包括編碼選自以下的酶的異源編碼序列的多個拷貝：cyp82y1、cyp82x1、cyp82x2、pscxe1、pssdr1、psmt2和psmt3。在某些情形下，在宿主細胞中包括編碼酶cyp82y1、cyp82x1、cyp82x2、pscxe1、pssdr1和psmt3的異源編碼序列中的每一個的多個拷貝。
在一些情形下，用于酶的異源編碼序列的多個拷貝源自兩種或更多種與宿主細胞不同的來源生物體。例如，宿主細胞可以包括一個異源編碼序列的多個拷貝，而拷貝中的每一個源自不同的來源生物體。在某些情形下，拷貝源自罌粟和花菱草來源生物體。因此，基于由異源編碼序列編碼的所關注酶的種間差異，每一拷貝可以包括顯式序列的一些變化形式。在一些情況下，宿主細胞包括多個異源編碼序列，所述異源編碼序列各自編碼酶并且各自源自與宿主細胞不同的來源生物體。在一些實施方案中，宿主細胞包括源自兩種或更多種與宿主細胞不同的來源生物體的酶的拷貝。在某些實施方案中，細胞包括兩個或更多個異源編碼序列，其各自編碼tnmt酶。在一些情況下，宿主細胞包括兩個或更多個異源編碼序列，其各自編碼tnmt并且源自不同的來源生物體。在某些情形下，tnmt酶的來源生物體選自罌粟和花菱草。
可以對工程化的宿主細胞培養(yǎng)基進行取樣并監(jiān)測類諾斯卡品產物的產生?？梢允褂萌魏魏弦说姆椒ㄓ^察和測量類諾斯卡品產物。所關注方法包括(但不限于)lc-ms方法(例如如本文所描述)，其中所關注樣品是通過與已知量的標準化合物相比較來分析。另外，還有其他方式可觀察和/或測量類諾斯卡品產物。觀察和/或測量bia的替代方式的實例尤其包括gc-ms、uv-vis光譜法、nmr、lc-nmr、lc-uv、tlc、毛細管電泳?？梢酝ㄟ^(例如)m/z和ms/ms片段化圖案證實一致性，并且可以通過已知滯留時間的lc跡線峰和/或eicms峰分析通過參考已知量的化合物標準物的相應lc-ms分析實現(xiàn)化合物的定量或測量。
方法
過程步驟
如上文所匯總，本發(fā)明的方面包括制備類諾斯卡品產物的方法。因此，本發(fā)明的方面包括在一或多種宿主細胞修飾(例如如本文所描述)功能性表達的條件下培養(yǎng)工程化的宿主細胞，使得所述細胞將所關注起始化合物轉化為類諾斯卡品產物。本發(fā)明的方面還提供方法，其包括在適于蛋白質產生的條件下培養(yǎng)工程化的宿主細胞，使得一個或多個異源編碼序列功能性表達并將所關注起始化合物轉化為類諾斯卡品產物。在實例中，所述方法是制備類諾斯卡品產物的方法，其包括培養(yǎng)工程化的宿主細胞(例如如本文所描述)；向細胞培養(yǎng)物中添加起始化合物；和從細胞培養(yǎng)物中回收類諾斯卡品產物。
在某些情形下，在細胞中產生的類諾斯卡品在細胞中用作中間體或起始材料，其本身隨后被轉化為所關注的下游芐基異喹啉生物堿(bia)。通過本文所描述的產生類諾斯卡品的細胞可以產生任何合宜的bia。可適用于本發(fā)明方法中的所關注的產生bia的細胞包括(但不限于)由smolke等人在us20140273109中描述的那些，所述案件的公開內容以引用方式整體并入本文中。因此，在一些實施方案中，所述方法進一步包括在足以從類諾斯卡品產生bia的條件下培養(yǎng)宿主細胞和從細胞培養(yǎng)物中回收bia。
發(fā)酵培養(yǎng)基可以含有適宜的碳底物。適于實施本公開的方法碳源可以涵蓋各種含碳底物。適宜底物可以包括(但不限于)單糖(例如葡萄糖、果糖、半乳糖、木糖)、寡糖(例如乳糖、蔗糖、棉子糖)、多糖(例如淀粉、纖維素)或其組合。在一些情形下，可以使用來自可再生原料的未純化混合物(例如玉米漿、甜菜糖蜜、大麥芽)。在一些情形下，碳底物可以是一碳底物(例如甲醇、二氧化碳)或二碳底物(例如乙醇)。在其他情形下，可以利用其他含碳化合物，例如，甲胺、葡萄胺糖和氨基酸。
可以用培養(yǎng)工程化的宿主細胞的任何合宜方法產生類諾斯卡品產物。所采用的具體方案可視(例如)工程化的宿主細胞、異源編碼序列、所關注酶、所關注bia等而變化。細胞可以存在于任何合宜的環(huán)境中，例如細胞能表達一種或多種功能異源酶的環(huán)境。在一些實施方案中，在有助于酶表達的條件下并利用可獲得的適當?shù)孜锱囵B(yǎng)細胞以容許在體內產生類諾斯卡品產物。在一些實施方案中，從工程化的宿主提取功能酶用于在體外條件下產生類諾斯卡品產物。在一些情況下，將工程化的宿主細胞放回到多細胞宿主生物體中。工程化的宿主細胞處于任一生長期，包括(但不限于)穩(wěn)定期和對數(shù)生長期等。另外，培養(yǎng)本身可以是連續(xù)培養(yǎng)或者其可以是分批培養(yǎng)。
細胞可以在適當發(fā)酵培養(yǎng)基中在14-40℃的溫度下生長。細胞可以在以任一合宜的速度(例如200rpm)振蕩下生長。細胞可以在適宜ph下生長。適于發(fā)酵的ph范圍可以在ph5到9之間?？梢栽诤醚酢捬趸蛭⒑醚鯒l件下實施發(fā)酵?？梢允褂萌魏芜m宜的生長培養(yǎng)基。適宜生長培養(yǎng)基可以包括(但不限于)常見的商業(yè)制備的培養(yǎng)基，例如合成限定型(sd)基礎培養(yǎng)基或富含酵母提取物蛋白胨葡萄糖(yepd)的培養(yǎng)基?？梢允褂眠m于微生物的任何其他富集型、限定型或合成型生長培養(yǎng)基。
細胞可以在基本上任一大小和形狀的容器中培養(yǎng)。適于實施本公開的方法的容器的實例可以包括(但不限于)多孔搖板、試管、燒瓶(有擋板和無擋板)和生物反應器。培養(yǎng)物的體積可以在10微升到大于10,000升的范圍內。
可以包括向生長培養(yǎng)基中添加已知可以產生生物堿所需的方式調節(jié)代謝的藥劑。在非限制性實例中，可以將2’3’-單磷酸環(huán)腺苷添加到生長培養(yǎng)基中以調節(jié)分解代謝物抑制。
對于具體細胞類型而言任何合宜的細胞培養(yǎng)條件都可以被利用。在某些實施方案中，包括一種或多種修飾的宿主細胞可在標準或容易優(yōu)化的條件下利用標準細胞培養(yǎng)基和補充劑來培養(yǎng)。作為一個實例，標準生長培養(yǎng)基在不需要用于質粒維持的選擇壓力時可以含有20g/l酵母提取物、10g/l蛋白胨和20g/l葡萄糖(ypd)。含有質粒的宿主細胞在含有1.7g/l酵母氮堿、5g/l硫酸銨和20g/l葡萄糖且補充有為生長和選擇所需要的適當氨基酸的合成型完全(sc)培養(yǎng)基中生長?？捎糜诳烧T導酶的表達的替代碳源包括(但不限于)蔗糖、棉子糖和半乳糖。細胞在實驗室中在體積在1-1000ml范圍內或更大的容器中(例如在試管或燒瓶中)在任何合宜的溫度(例如30℃)和以任一合宜速率(例如200rpm)振蕩下生長。
可以擴大培養(yǎng)體積以在更大的發(fā)酵容器中生長，例如，作為工業(yè)過程的一部分。工業(yè)發(fā)酵過程可以在封閉式分批、補料分批或連續(xù)恒化器條件或任一適宜的發(fā)酵模式下實施。在一些情形下，細胞可以作為整體細胞催化劑固定于底物上并且經受發(fā)酵條件用于生物堿產生。
分批發(fā)酵是封閉系統(tǒng)，其中培養(yǎng)基的組成在開始發(fā)酵時進行設定且在發(fā)酵過程期間不改變。在開始發(fā)酵時將所需生物體接種到培養(yǎng)基中。在一些情況下，在對系統(tǒng)作出改變以控制諸如ph和氧濃度(而非碳)等因素的情況下運行分批發(fā)酵。在此類發(fā)酵系統(tǒng)中，系統(tǒng)的生物質和代謝物組成在發(fā)酵的過程中連續(xù)發(fā)生變化。細胞通常繼續(xù)進行到延滯期，然后到對數(shù)期(高生長速率)，然后到穩(wěn)定期(生長速率降低或停止)且最后到死亡期(如果未處理)。
連續(xù)發(fā)酵是開放系統(tǒng)，其中將限定的發(fā)酵培養(yǎng)基連續(xù)添加到生物反應器中并且從容器連續(xù)移除等量的發(fā)酵培養(yǎng)基用于加工。連續(xù)發(fā)酵系統(tǒng)通常經操作以維持穩(wěn)態(tài)生長條件，使得必須通過發(fā)酵中的生長速率來平衡由移除培養(yǎng)基引起的細胞損失。連續(xù)發(fā)酵通常在細胞處于恒定的高細胞密度的條件下操作。連續(xù)發(fā)酵容許調節(jié)一種或多種影響靶標產物濃度和/或細胞生長的因素。
液體培養(yǎng)基可以包括(但不限于)添加本文所述組分的富集型或合成限定型培養(yǎng)基。可以將培養(yǎng)基組分溶解于水中并通過熱、壓力、過濾、輻射、化學或其任一組合進行滅菌?？梢苑珠_制備幾種培養(yǎng)基組分并進行滅菌且然后在發(fā)酵容器中進行合并?？梢跃彌_培養(yǎng)基以輔助在整個發(fā)酵中維持恒定ph。
在發(fā)酵的過程中可以監(jiān)測或控制過程參數(shù)(包括溫度、溶解氧、ph、攪拌、通氣速率和細胞密度)。例如，可以通過浸沒于培養(yǎng)基中的溫度探針監(jiān)測發(fā)酵過程的溫度?？梢酝ㄟ^調節(jié)夾套溫度將培養(yǎng)溫度控制在設定點。水可以在外部冷凍器中冷卻且然后流入生物反應器控制塔中并在容器中維持設定點溫度所需要的溫度下循環(huán)到夾套。
另外，在發(fā)酵過程中可以監(jiān)測氣體流參數(shù)。例如，氣體可以通過噴淋器流入培養(yǎng)基中。適于本公開的方法的氣體可以包括壓縮空氣、氧氣和氮氣。氣體流可以為固定速率或經調節(jié)以維持溶解氧設定點。
可還以監(jiān)測培養(yǎng)基的ph。在實例中，可以通過浸沒于容器內部的培養(yǎng)基中的ph探針來監(jiān)測ph。如果ph控制生效，那么可以通過酸和堿泵調節(jié)ph，所述泵將每一溶液以所需要的速率添加到培養(yǎng)基中。用于控制ph的酸溶液可以是硫酸或鹽酸。用于可控制ph的堿溶液可以是氫氧化鈉、氫化化鉀或氫氧化銨。
另外，可以通過浸沒于培養(yǎng)基中的溶解氧探針監(jiān)測培養(yǎng)基中的溶解氧。如果溶解氧調節(jié)生效，那么可以通過增加或減小攪拌速度調節(jié)氧含量。還可以通過增加或減小氣體流速調節(jié)溶解氧含量。氣體可以是壓縮空氣、氧氣或氮氣。
在發(fā)酵過程中還可以監(jiān)測攪拌速度。在實例中，攪拌器電動機可以驅動攪動器。攪拌器速度可以在整個發(fā)酵中設定為始終如一的rpm或者可以經動態(tài)調節(jié)以維持設定的溶解氧含量。
另外，在發(fā)酵過程中可以監(jiān)測濁度。在實例中，可以使用濁度探針測量細胞密度。或者，可以通過從生物反應器取出樣品測量細胞密度并在分光光度計中分析樣品。另外，可以時間間隔通過無菌取樣裝置從生物反應器移除樣品?？梢苑治鰳悠分杏伤拗骷毎a生的生物堿。還可以分析樣品的其他代謝物和糖、培養(yǎng)基組分消耗或細胞密度。
在另一實例中，在發(fā)酵過程期可以監(jiān)測原料參數(shù)。具體來說，可以使用外部泵將原料(包括糖和其他碳源)、營養(yǎng)素和輔因子添加到發(fā)酵中。在發(fā)酵期間還可以添加其他組分，包括(但不限于)止泡劑、鹽、螯合劑、表面活性劑和有機液體。
用于在宿主細胞中優(yōu)化異源多核苷酸的表達的任何合宜的密碼子優(yōu)化技術都可適用于本發(fā)明宿主細胞和方法中，例如參見gustafsson,c.等人(2004)trendsbiotechnol,22,346-353，所述文獻以引用方式整體并入。
本發(fā)明方法還可以包括向細胞培養(yǎng)物中添加起始化合物。任何合宜的添加方法都可適用于本發(fā)明方法中?？梢杂贸渥懔康乃P注起始材料(例如如本文所描述)(例如mm到μm量(例如介于約1mm到5mm之間)的起始化合物)補充細胞培養(yǎng)物。應了解所添加起始材料的量、添加時間和速率、所添加材料的形式等都可以根據(jù)各種因素而變化。起始材料可以純凈形式添加或者預先溶解于適宜溶劑(例如細胞培養(yǎng)基、水或有機溶劑)中。起始材料可以濃縮形式(例如所需濃度的10倍)添加以最小化添加時細胞培養(yǎng)基的稀釋。起始材料可以一個或多個批次或通過經延長的時間段(例如小時或天)連續(xù)添加來添加。
從發(fā)酵培養(yǎng)基離析產物的方法
本發(fā)明方法還可以包括從細胞培養(yǎng)物中回收類諾斯卡品產物。任何合宜的分離和離析方法(例如色譜法或沉淀法)都可以適用于本發(fā)明方法中以從細胞培養(yǎng)物中回收類諾斯卡品產物。可以使用過濾方法使可溶性部分與細胞培養(yǎng)物的不溶性部分分離。在一些情形下，可以使用液相色譜法(例如反相hplc、尺寸排阻、正相色譜法)使所關注類諾斯卡品產物與細胞培養(yǎng)物的其他可溶性組分分離。在一些情形下，可以使用萃取方法(例如液體萃取、基于ph的純化、固相萃取、親和色譜、離子交換等)使類諾斯卡品產物與細胞培養(yǎng)物的其他組分分離。
可以使用本領域已知的方法從發(fā)酵培養(yǎng)基離析所產生的生物堿?？梢栽诎l(fā)酵之后立即(或在一些情況下在發(fā)酵期間)實施多個回收步驟用于所需產物的初始回收。通過這些步驟，可以使生物堿(例如類諾斯卡品產物)與細胞、細胞碎片和廢物和其他營養(yǎng)素分離，糖和有機分子可留在廢培養(yǎng)基中。此過程可用于產生富含類諾斯卡品產物的產物。
在實例中，通過向分批反應器中提供工程化的酵母細胞和原料(包括營養(yǎng)素和水)形成具有類諾斯卡品產物的產物流。具體來說，可以通過將工程化的酵母細胞孵育至少約5分鐘的時間段以產生包含類諾斯卡品產物和細胞材料的溶液使工程化的酵母細胞經受發(fā)酵。在工程化的酵母細胞已經受發(fā)酵之后，可使用至少一個分離單元從細胞材料中分離出類諾斯卡品產物以得到包含類諾斯卡品產物的產物流。具體來說，產物流可以包括類諾斯卡品產物以及其他組分，例如澄清的酵母培養(yǎng)基。另外，類諾斯卡品產物可以包含一種或多種類諾斯卡品產物，例如一種或多種類諾斯卡品化合物。
可以使用不同的方法從生物反應器培養(yǎng)基移除包括類諾斯卡品產物的細胞。在實例中，可以通過隨時間沉降移除細胞。此沉降過程可以通過冷凍或通過添加澄清劑(例如二氧化硅)來加速。然后可以從反應器的頂部抽取廢培養(yǎng)基或者可以從反應器的基底倒出細胞?；蛘?，可以通過過濾器、膜或其他多孔材料過濾來移除細胞。還可以通過離心(例如，通過連續(xù)流動離心)或通過使用連續(xù)提取器移除細胞。
如果一些有價值的類諾斯卡品產物存在于細胞內部，那么可以滲透化或溶解細胞并且可以通過上文所描述方法中的任一種移除細胞碎片。用于滲透化細胞的試劑可以包括(但不限于)有機溶劑(例如dmso)或鹽(例如乙酸鋰)。溶解細胞的方法可以包括添加表面活性劑(例如十二烷基硫酸鈉)或通過珠粒研磨或超聲波處理進行機械破壞。
可以通過添加與水性培養(yǎng)基不混溶的有機液體通過液-液萃取從澄清的廢培養(yǎng)基提取類諾斯卡品產物。在實例中，除其他加工步驟以外，可以使用液-液萃取。適宜有機液體的實例包括(但不限于)肉豆蔻酸異丙基酯、乙酸乙酯、氯仿、乙酸丁酯、甲基異丁基酮、油酸甲酯、甲苯、油醇、丁酸乙酯?？梢詫⒂袡C液體添加到少到10％或多達100％體積的水性培養(yǎng)基中。
在一些情形下，可以在開始發(fā)酵時或在發(fā)酵期間的任一時間添加有機液體。此萃取發(fā)酵過程可以通過連續(xù)移除有機相的類諾斯卡品產物來增加來自宿主細胞的類諾斯卡品產物的產量。
攪動可使有機相與水性培養(yǎng)基一起形成乳液。促進兩個相分離成不同層的方法可以包括(但不限于)添加反乳化劑或成核劑，或調節(jié)ph。還可以通過(例如)連續(xù)圓錐板離心對乳液實施離心來分離兩個相。
或者，可以使有機相與水性培養(yǎng)基離析，使得其可在萃取之后以物理方式移除。例如，可以將溶劑囊封在膜中。
在實例中，可以使用吸附方法從發(fā)酵培養(yǎng)基提取類諾斯卡品產物。在實例中，可以通過添加樹脂(例如
還可以使用過濾從發(fā)酵培養(yǎng)基提取類諾斯卡品產物。在高ph下，類諾斯卡品產物可以在生物反應器中形成晶體樣沉淀物。此沉淀物可以通過過濾器、膜或其他多孔材料過濾來直接移除。還可以通過離心和/或傾析收集沉淀物。
上文所描述的萃取方法可以原位(在生物反應器中)或非原位(例如在培養(yǎng)基流出生物反應器并且與萃取劑接觸，然后再循環(huán)回到容器中的外部環(huán)路中)。或者，可以在結束發(fā)酵之后使用從生物反應器容器移除的澄清培養(yǎng)基實施萃取方法。
本發(fā)明方法還可以包括從細胞培養(yǎng)物中回收類諾斯卡品或其前體。任何合宜的分離和離析方法(例如在堿性條件下的有機溶劑萃取、固相萃取、色譜法或沉淀法)都可以適用于本發(fā)明方法中以從細胞培養(yǎng)物中回收所關注類諾斯卡品或其前體?？梢允褂眠^濾方法使可溶性部分與細胞培養(yǎng)物的不溶性部分分離。在一些情形下，使用液相色譜方法(例如反相hplc、尺寸排阻、正相色譜)使類諾斯卡品或前體與細胞培養(yǎng)物的其他可溶性組分分離。在某些情形下，產生類諾斯卡品的細胞(例如如本文所描述)將類諾斯卡品轉化為下游的所關注bia。因此，還可以應用上文所描述方法中的任一種來回收所產生的任何所關注bia。
還包括工程化宿主細胞用于產生所關注類諾斯卡品或其前體的目的的方法。將dna插入宿主細胞中可以使用任何合宜方法來實現(xiàn)。使用所述方法將異源編碼序列插入宿主細胞中，使得宿主細胞功能性地表達酶并將所關注起始化合物轉化為所關注產物類諾斯卡品或其前體。
在一些實施方案中，細胞包括一種或多種用于異源編碼序列中的一個或多個(例如如本文所描述)的啟動子。在本發(fā)明宿主細胞和方法中可以利用任何合宜的啟動子。驅動異源編碼序列的表達的啟動子可以是組成型啟動子或可誘導型啟動子，前提是所述啟動子在宿主細胞中可以具有活性。異源編碼序列可以從其天然啟動子表達，或可以使用非天然啟動子。此類啟動子在使用其的宿主中可以具有低到高的強度。在一些實施方案中，細胞包括一種或多種強啟動子。啟動子可以是調節(jié)型或組成型的。在某些實施方案中，使用不受葡萄糖抑制或僅受培養(yǎng)基中葡萄糖的存在輕微抑制的啟動子。所關注啟動子包括(但不限于)糖酵解基因的啟動子(例如枯草芽孢桿菌tsr基因的啟動子(編碼果糖雙磷酸鹽醛縮酶)或來自酵母釀酒酵母的gapdh啟動子(編碼甘油醛-磷酸脫氫酶))、面包酵母的adh1啟動子、磷酸鹽饑餓誘導型啟動子(例如酵母的pho5啟動子、來自地衣芽孢桿菌的堿性磷酸酶啟動子)、酵母可誘導型啟動子(例如gal1-10、gal1、gall、gals、可抑制啟動子met25、teto)和組成型啟動子(例如甘油醛3-磷酸脫氫酶啟動子(gpd)、醇脫氫酶啟動子(adh1)、翻譯-延長因子-1-α啟動子(tef)、細胞色素c-氧化酶啟動子(cyc1)、mrp7啟動子、gal1、hxt7、pgk1、tpi1、pyk1、tef1等)。含有可通過激素(例如糖皮質激素、類固醇和甲狀腺激素)誘導的啟動子的自主復制型酵母表達載體還可以被使用并且包括(但不限于)糖皮質激素應答元件(gre)和甲狀腺激素應答元件(tre)。這些和其他實例在美國專利號7,045,290中有描述，所述案件(包括其中所引用的參考文獻)以引用方式并入?？梢允褂煤薪M成型或可誘導啟動子(例如α因子、醇氧化酶和pgh)的其他載體。另外，還可以使用任一啟動子/增強子組合(根據(jù)真核啟動子數(shù)據(jù)庫epdb)來驅動基因的表達。任何合宜的適當啟動子都可以被選用于宿主細胞(例如大腸桿菌)。還可以使用啟動子選擇來優(yōu)化轉錄且因此優(yōu)化酶含量以最大化產量同時最小化能源。
在一些情況下，細胞包括一種或多種選自hxt7、adh1、pgk1、tpi1、pyk1和tef1的強啟動子。在某些實施方案中，細胞包括一個或多個用于編碼cyp82y1或cyp82y1突變的異源編碼序列且包括hxt7啟動子。在某些情形下，細胞產生1-羥基-n-甲基坎那丁。在某些情況下，細胞產生1-羥基坎那丁。在一些實施方案中，細胞包括一個或多個用于編碼cyp82x2或cyp82x2突變體的異源編碼序列且包括hxt7啟動子。在某些情況下，細胞產生1,13-二羥基-n-甲基坎那丁。在一些情況下，細胞包括一個或多個編碼cyp82x2或cyp82x2突變體的異源編碼序列且包括一種或多種選自pgk1和gpd的啟動子。在某些實施方案中，細胞產生n-甲基-左旋蛇果黃堇堿。在一些情況下，細胞包括一個或多個用于編碼cyp82x1或cyp82x1突變體的異源編碼序列且包括hxt7啟動子。在某些實施方案中，細胞產生4’-o-去甲基-3-o-乙?；浰趭W辛。
在本發(fā)明宿主細胞和方法中可以利用任何合宜的載體。所關注載體包括用于酵母和其他細胞的載體。酵母載體可以分為4個一般類別：整合型載體(yip)、自主復制型高拷貝數(shù)載體(yep)、自主復制型低拷貝數(shù)載體(ycp)和用于克隆大片段的載體(yac)?？梢酝ㄟ^任何合宜的轉化或轉染技術將載體dna引入原核或真核細胞中。
從富含生物堿的溶液純化產物的方法
后續(xù)純化步驟可涉及使用本領域已知的方法處理富含類諾斯卡品產物的發(fā)酵后溶液以高純度回收個別的所關注產物物質。
在一個實例中，可以將萃取在有機相中的類諾斯卡品產物轉移到水性溶液中。在一些情形下，可以通過熱和/或真空蒸發(fā)有機溶劑并且可以將所得粉末溶解于具有適宜ph的水性溶液中。在另一實例中，可以通過添加促進將類諾斯卡品產物萃取到水相的處于適宜ph下的水性溶液從有機相萃取類諾斯卡品產物。然后可以通過傾析、離心或另一方法移除水相。
可以通過(例如)利用適宜螯合劑處理進一步處理含有類諾斯卡品產物的溶液以移除金屬。可以通過沉淀進一步處理含有類諾斯卡品產物的溶液以移除其他雜質(例如蛋白質和dna)。在一個實例中，用適當沉淀劑(例如乙醇、甲醇、丙酮或異丙醇)處理含有類諾斯卡品產物的溶液。在替代實例中，可以通過透析或通過使較小生物堿與污染性生物巨分子分離的尺寸排阻的其他方法移除dna和蛋白質。
在其他實例中，可使用本領域已知的方法通過連續(xù)交叉流過濾以高純度提取含有類諾斯卡品產物的溶液。
如果溶液含有類諾斯卡品產物的混合物，那么可以使用本領域已知的方法使所述溶液經受酸-堿處理以產生個別類諾斯卡品產物物質。在此過程中，調節(jié)水性溶液的ph以沉淀個別類諾斯卡品產物。
為進行高純度小規(guī)模制備，可以通過液相色譜以單一步驟純化類諾斯卡品產物。
酵母衍生的生物堿api比對植物衍生的api
澄清的酵母培養(yǎng)基(cycm)可以含有多種雜質?？梢酝ㄟ^真空和/或熱對澄清的酵母培養(yǎng)基進行脫水以產生富含生物堿的粉末。此產物類似于罌粟稈的濃縮物(cps)，其通過種植罌粟的國家出口并且被api制造商購買。出于本發(fā)明的目的，cps是任一類型經純化植物提取物的代表性實例，可以從中最后進一步純化所需生物堿產物。表2和表3突出這兩種產物的雜質，所述雜質可以對cycm或cps具有特異性或可以存在于二者中。盡管一些類諾斯卡品產物所具有的色素可能為雜質，但其他類諾斯卡品產物本身可被分類為色素。因此，可以基于非色素雜質評估這些類諾斯卡品產物的雜質。另外，在一些實例中，使用發(fā)酵過程產生的類諾斯卡品產物可以含有在發(fā)酵過程中用于產生類諾斯卡品產物的一或多個細胞的部分。例如，當使用酵母產生類諾斯卡品產物時，酵母細胞的部分可以在類諾斯卡品產物內。通過分析起源不明的產物的這些雜質的子集，本領域技術人員可確定產物是起源于酵母產生宿主還是植物產生宿主。
api級藥物成分是高度被純化的分子。因此，可以指示api的植物源或酵母源的雜質(例如表2和表3中所列示的那些)可能不存在于產物的api階段。實際上，源自本發(fā)明酵母菌株的許多api產物可能很大程度上與傳統(tǒng)的植物衍生的api無法區(qū)分。然而在一些情形下，可以使用化學合成方法使常規(guī)生物堿化合物經受化學修飾，所述常規(guī)生物堿化合物可能在需要此類化學修飾的基于植物的產物中顯示為化學雜質。例如，化學衍生化通?？僧a生與化學合成過程相關的一組雜質。在某些情形中，這些修飾可以在酵母產生平臺中以生物方式實施，從而避免與化學衍生相關的一些雜質存在于酵母衍生的產物中。具體來說，來自化學衍生產物的這些雜質可能存在于使用化學合成過程產生的api產物中但使用酵母衍生的產物產生的api產物中可能不存在?；蛘?，如果將酵母衍生的產物與化學方式衍生的產物混合，那么所得雜質可以存在但其量小于可在僅含有或主要含有化學衍生的產物的api中所預期的量。在此實例中，通過分析api產物的這些雜質的子集，本領域技術人員可確定產物是源自酵母產生宿主還是傳統(tǒng)的化學衍生化途徑。
可能存在于生物合成的api中但不存在于化學衍生的api中的雜質的非限制性實例可以包括用于產生類諾斯卡品產物的非植物細胞的部分。在實例中，生物合成的api可以包括用于在酵母細胞內發(fā)酵類諾斯卡品產物的酵母細胞的部分。另外，在酵母衍生的化合物和植物衍生的化合物都通過化學合成方法經受化學修飾的情形下，預期在產物中可能存在與化學合成過程相關的相同雜質。在此一情形中，可以如上文所描述分析起始材料(例如cycm或cps)。
工程化宿主細胞的方法
本文還包括出于產生類諾斯卡品產物的目的工程化宿主細胞的方法。將dna插入宿主細胞中可以使用任何合宜的方法來實現(xiàn)。使用所述方法將異源編碼序列插入工程化的宿主細胞中，使得宿主細胞功能性表達酶并將所關注起始化合物轉化為類諾斯卡品產物。
在本發(fā)明工程化的宿主細胞和方法中可以利用任何合宜的啟動子。驅動異源編碼序列表達的啟動子可以是組成型啟動子或可誘導啟動子，前提是啟動子在工程化的宿主細胞中具有活性?？梢詮奶烊粏幼颖磉_異源編碼序列，或者可以使用非天然啟動子。此類啟動子在使用其的宿主中可以具有低到高的強度。啟動子可以是調節(jié)型或組成型的。在某些實施方案中，使用不受葡萄糖抑制或僅受培養(yǎng)基中葡萄糖的存在輕微抑制的啟動子。所關注啟動子包括(但不限于)糖酵解基因的啟動子(例如枯草芽孢桿菌tsr基因的啟動子(編碼果糖雙磷酸鹽醛縮酶基因的啟動子區(qū))或酵母釀酒酵母基因的啟動子(編碼甘油醛3-磷酸脫氫酶)(gpd、gapdh或tdh3))、面包酵母的adh1啟動子、磷酸鹽饑餓誘導型啟動子(例如酵母的pho5啟動子、來自地衣芽孢桿菌的堿性磷酸酶啟動子)、酵母可誘導啟動子(例如gal1-10、gal1、gall、gals、可抑制啟動子met25、teto)和組成型啟動子(例如甘油醛3-磷酸脫氫酶啟動子(gpd)、醇脫氫酶啟動子(adh)、翻譯-延長因子-1-α啟動子(tef)、細胞色素c-氧化酶啟動子(cyc1)、mrp7啟動子等)。含有可通過激素(例如糖皮質激素、類固醇和甲狀腺激素)誘導的啟動子的自主復制型酵母表達載體還可以被使用且包括(但不限于)糖皮質激素應答元件(gre)和甲狀腺激素應答元件(tre)。這些和其他實例在美國專利號7,045,290中有描述，所述案件(包括其中所引用的參考文獻)以引用方式并入?？梢允褂煤薪M成型或可誘導啟動子的(例如α因子、醇氧化酶和pgh)的其他載體。另外，還可以使用任一啟動子/增強子組合(根據(jù)真核啟動子數(shù)據(jù)庫epdb)來驅動基因的表達。宿主細胞(例如大腸桿菌)可以選擇任何合宜的適當啟動子。還可以使用啟動子選擇來優(yōu)化轉錄且因此優(yōu)化酶含量以最大化產量同時最小化能源。
在本發(fā)明工程化的宿主細胞和方法中可以利用任何合宜的載體。所關注載體包括用于酵母和其他細胞中的載體。酵母載體的類型可以分為4個一般類別：整合型載體(yip)、自主復制型高拷貝數(shù)載體(yep或2μ質粒)、自主復制型低拷貝數(shù)載體(ycp或著絲粒質粒)和用于克隆大片段的載體(yac)。可通過任何合宜的轉化或轉染技術將載體dna引入原核或真核細胞中。可以使用另一來源的dna(例如pcr生成的雙鏈dna產物，或合成的雙鏈或單鏈寡核苷酸)通過整合到基因組中來工程化酵母。任一單一轉化事件可以包括一種或幾種核酸(載體、雙鏈或單鏈dna片段)以在遺傳上修飾宿主細胞。
效用
例如如上文所描述的本發(fā)明工程化的宿主細胞和方法可用于各種應用中。所關注應用包括(但不限于)：研究應用和治療性應用。本發(fā)明的方法可用于各種不同的應用中，包括產生類諾斯卡品產物的任何合宜的應用。
本發(fā)明工程化的宿主細胞和方法可用于各種治療性應用中。所關注治療性應用包括那些制備包括類諾斯卡品產物的藥物產物的應用。本文所描述的工程化的宿主細胞產生類諾斯卡品產物。本發(fā)明宿主細胞可用于從可用于產生所關注bia的簡單且廉價的起始材料(包括坎那丁)產生所關注類諾斯卡品產物和類諾斯卡品終產物。因此，本發(fā)明宿主細胞可用于提供有治療活性的類諾斯卡品產物。
在一些情況下，工程化的宿主細胞和方法可用于產生商業(yè)規(guī)模量的其類諾斯卡品產物，其中這些化合物的化學合成具有低產率而不是用于大規(guī)模生產的可行方式。在某些情形下，所述宿主細胞和方法用于發(fā)酵設施中，所述發(fā)酵設施包括(例如)容許快速產生用于治療產物的類諾斯卡品產物的5,000-200,000升容量的生物反應器(發(fā)酵罐)。此類應用可以包括從可發(fā)酵碳源(例如纖維素、淀粉和游離糖)以工業(yè)規(guī)模產生類諾斯卡品產物。
本發(fā)明工程化的宿主細胞和方法可用于各種研究應用中。本發(fā)明宿主細胞和方法可用于分析各種酶對各種類諾斯卡品產物的生物合成路徑的效應。另外，工程化的宿主細胞可以工程化以產生可用于在尚未證實的治療功能方面測試所關注生物活性的類諾斯卡品產物。在一些情形下，包括各種編碼各種酶的異源編碼序列的宿主細胞工程化闡釋朝向類諾斯卡品產物的高產量生物合成路徑。在某些情形下，研究應用包括產生用于所關注治療分子的類諾斯卡品產物，然后可以將所述類諾斯卡品產物進一步化學修飾或衍生化為所需產物或針對增加的所關注治療活性進行篩選。在一些情形中，使用宿主細胞菌株來篩選在此類路徑中關注的酶活性，從而可以通過在這些菌株中產生的代謝物的轉化發(fā)現(xiàn)酶。本發(fā)明宿主細胞和方法可以用作植物專用代謝物的產生平臺。
本發(fā)明工程化的宿主細胞和方法可以用作植物專用代謝物的產生平臺。本發(fā)明宿主細胞和方法可以用作藥物庫研發(fā)以及植物酶發(fā)現(xiàn)的平臺。例如，本發(fā)明工程化的宿主細胞和方法可用于通過以下研發(fā)基于天然產物的藥物庫：采用產生感興趣的支架分子(例如原鴉片堿)的酵母菌株并且通過組合生物合成或通過化學方式進一步功能化化合物結構。通過以此方式產生藥物庫，任何潛在藥物攻擊已與適于大規(guī)模培養(yǎng)和產生的產生宿主相聯(lián)系。作為另一實例，這些本發(fā)明工程化的宿主細胞和方法可用于植物酶發(fā)現(xiàn)中。本發(fā)明宿主細胞提供所定義代謝物的整潔背景以表達植物est庫以鑒定新的酶活性。本發(fā)明宿主細胞和方法為酵母中植物酶的功能表達和增加的活性提供表達方法和培養(yǎng)條件。
試劑盒和系統(tǒng)
本發(fā)明的方面進一步包括試劑盒和系統(tǒng)，其中試劑盒和系統(tǒng)可以包括本發(fā)明方法中所采用的一種或多種組分，例如如本文所描述的工程化的宿主細胞、起始化合物、異源編碼序列、載體、培養(yǎng)基等。在一些實施方案中，本發(fā)明試劑盒包括工程化的宿主細胞(例如如本文所描述)和一種或多種選自以下的組分：起始化合物、異源編碼序列和/或包括其的載體、載體、生長原料、適用于表達系統(tǒng)中的組分(例如細胞、克隆載體、多個克隆位點(mcs)、雙向啟動子、內部核糖體進入位點(ires)等)和培養(yǎng)基。
可以在試劑盒中提供本文所描述組分中的任一種，例如包括一種或多種修飾的宿主細胞、起始化合物、培養(yǎng)基等。適用于制備和使用異源編碼序列、克隆載體和表達系統(tǒng)的各種組分可用于本發(fā)明試劑盒中。試劑盒還可以包括管、緩沖液等和使用說明書。試劑盒的各種試劑組分可以存在于分開的容器中，或如果所需可以在單個容器中將其中的一些或全部組分預先合并成試劑混合物。
還提供產生類諾斯卡品產物的系統(tǒng)，其中所述系統(tǒng)可以包括包括一種或多種修飾(例如如本文所描述)的工程化的宿主細胞、起始化合物、培養(yǎng)基、發(fā)酵罐和發(fā)酵設備，例如適于維持宿主細胞的生長條件、取樣和監(jiān)測設備和組分等的裝置。適用于大規(guī)模發(fā)酵酵母細胞的各種組分可用于本發(fā)明系統(tǒng)中。
在一些情形下，所述系統(tǒng)包括用于大規(guī)模發(fā)酵工程化的宿主細胞和監(jiān)測和純化由發(fā)酵的宿主細胞產生的類諾斯卡品產物的組分。在某些實施方案中，將一種或多種起始化合物(例如如本文所描述)添加到系統(tǒng)中，發(fā)酵罐中的工程化的宿主細胞通過所述條件產生一種或多種所需類諾斯卡品產物。在一些情況下，宿主細胞產生類諾斯卡品產物(例如如本文所描述)。
在一些情形下，系統(tǒng)包括監(jiān)測和/或分析一種或多種由本發(fā)明宿主細胞產生的類諾斯卡品產物化合物的過程。例如，如本文所描述的lc-ms分析系統(tǒng)、色譜系統(tǒng)或可以分析樣品并將其與標準相比較的任何合宜的系統(tǒng)，例如如本文所描述?？梢栽诎l(fā)酵之前和期間的任何合宜時間通過取樣和分析來監(jiān)測發(fā)酵培養(yǎng)基。當起始化合物完全轉化為類諾斯卡品產物時，可以終止發(fā)酵并可以純化類諾斯卡品產物。因此，在一些情形下，本發(fā)明系統(tǒng)包括適于從產生類諾斯卡品產物的宿主細胞培養(yǎng)基中純化類諾斯卡品產物的純化組分。純化組分可以包括可用于純化由發(fā)酵產生的類諾斯卡品產物的任何合宜方式，包括(但不限于)二氧化硅色譜法、反相色譜法、離子交換色譜法hic色譜法、尺寸排阻色譜法、液體萃取和ph萃取方法。在一些情形下，本發(fā)明系統(tǒng)提供在將一種或多種起始化合物輸入系統(tǒng)中之后所關注類諾斯卡品發(fā)酵產物的產生和離析。
提出以下實施例以便為本領域技術人員提供關于如何制備和使用本發(fā)明的完整公開內容和描述，且既不旨在限制發(fā)明人認為是其發(fā)明的范圍，他們也不旨在表示下文實驗是所實驗的全部或唯一的實驗。已努力確保數(shù)值(例如量、溫度等)的精確性，但應計及一些實驗誤差及偏差。除非另有指示，否則份數(shù)是重量份數(shù)，分子量是重量平均分子量，溫度是以攝氏度計，并且壓力是或接近大氣壓。
實驗
工程化酵母釀酒酵母用于產生諾斯卡品和合成中間體和各種類諾斯卡品。
酵母菌株能將實施向產生諾斯卡品和衍生物的轉化。這些菌株可以產生的化合物的實例是n-甲基坎那丁、1-羥基-n-甲基坎那丁、諾斯卡品、罌粟殼堿、那可汀半縮醛、4’-o-去甲基-3-o-乙?；浰趭W辛、3-o-乙?；浰趭W辛、罌粟殼堿半縮醛、n-甲基左旋蛇果黃堇堿、1,13-二羥基-n-甲基坎那丁、1-羥基-13-o-乙酰基-n-甲基坎那丁、那可托林吉地、1-羥基坎那丁和那可托林，其中1-羥基坎那丁、4’-o-去甲基-3-o-乙?；浰趭W辛、罌粟殼堿半縮醛、罌粟殼堿半縮醛、1,13-二羥基-n-甲基坎那丁、1-羥基-13-o-乙?；?n-甲基坎那丁、那可托林吉地、那可托林在之前從未被鑒定過。另外，通過以下工程化酵母細胞：校正諾斯卡品的生物合成路徑、表征酶促功能，和證實用于產生朝向植物天然產物生物合成的有效且精確的方法的異源路徑重構。
實施例1：從坎那丁合成諾斯卡品、合成中間體和衍生物的酵母菌株
研發(fā)產生原小檗堿和苯酞異喹啉生物堿的酵母菌株，例如1-羥基-n-甲基坎那丁、諾斯卡品、罌粟殼堿、那可汀半縮醛、4’-o-去甲基-3-o-乙?；浰趭W辛、3-o-乙?；浰趭W辛、罌粟殼堿半縮醛、n-甲基左旋蛇果黃堇堿、1,13-二羥基-n-甲基坎那丁、1-羥基-13-o-乙?；?n-甲基坎那丁、那可托林吉地、那可托林、1-羥基坎那丁。
圖2a和2b繪示從坎那丁到諾斯卡品的合成路徑。此路徑包括cyp82x1、cyp82x2、psat1、cyp82y1、pscxe1、pssdr1、n4’omt的酶活性。在酵母中工程化諾斯卡品生物合成路徑以產生各種諾斯卡品合成中間體和衍生物。
1.1)為了從坎那丁產生n-甲基坎那丁，從通過染色體整合atr1的酵母菌株中的低拷貝構建體(例如低拷貝質粒或通過染色體整合)表達來自罌粟(pstnmt)或花菱草(ectnmt)的四氫原小檗堿n-甲基轉移酶(tnmt)(圖3和4)。每一種酶的其他可能的變體都包括在表1內。
1.2)為了從坎那丁產生1-羥基-n-甲基坎那丁，在先前描述的產生n-甲基坎那丁的菌株中的低拷貝質粒上表達來自罌粟的cyp82y1(圖3和4)。每一種酶的其他可能的變體都包括在表1內。
1.3)為了產生1,13-二羥基-n-甲基坎那丁，從先前所描述的產生1-羥基-n-甲基坎那丁的菌株中的低拷貝構建(例如低拷貝質?；蛲ㄟ^染色體整合)表達來自罌粟的cyp82x2(圖3和4)。每一種酶的其他可能的變體都包括在表1內。
1.4)為了產生1-羥基-13-o-乙?；?n-甲基坎那丁，從先前所描述的產生1,13-二羥基-n-甲基坎那丁的菌株中的低拷貝構建體(例如低拷貝質粒、yac或通過染色體整合)表達來自罌粟的psat1(圖3和4)。每一種酶的其他可能的變體都包括在表1內。
1.5)為了產生4’-o-去甲基-3-o-乙酰基罌粟奧辛，從先前所描述的產生1-羥基-13-o-乙?；?n-甲基坎那丁的菌株中的低拷貝構建體(例如低拷貝質?；騳ac)表達來自罌粟的cyp82x1(圖3和4)。每一種酶的其他可能的變體都包括在表1內。
1.6)為了產生罌粟殼堿半縮醛，從先前所描述的產生4’-o-去甲基-3-o-乙?；浰趭W辛的菌株中的低拷貝構建體(例如低拷貝質粒或yac)表達來自罌粟的pscxe1(圖3和4)。每一種酶的其他可能的變體都包括在表1內。
1.7)為了產生罌粟殼堿，從先前所描述的產生罌粟殼堿半縮醛的菌株中的低拷貝構建體表達來自罌粟的pssdr1(例如低拷貝質粒或yac)(圖3和4)。每一種酶的其他可能的變體都包括在表1內。
1.8)為了產生諾斯卡品，從先前所描述的產生罌粟殼堿的菌株中的低拷貝構建體(例如低拷貝質粒或yac或染色體整合)共表達來自罌粟的psmt3或ps6omt和psmt2(圖10)。每一種酶的其他可能的變體都包括在表1內。tf6omt不將罌粟殼堿轉化為諾斯卡品。
1.9)為了產生1-羥基坎那丁，從通過染色體整合atr1的酵母菌株中的低拷貝質粒表達來自罌粟的cyp82y1(圖3和4)。每一種酶的其他可能的變體都包括在表1內。
1.10)為了產生n-甲基-左旋蛇果黃堇堿，從先前所描述的產生n-甲基坎那丁的菌株中的低拷貝構建體(例如低拷貝質粒或yac)表達來自罌粟的cyp82x2(圖3和4)。每一種酶的其他可能的變體都包括在表1內。
1.11)為了產生那可托林，從先前所描述的產生1-羥基-n-甲基坎那丁的菌株中的低拷貝構建體(例如低拷貝質粒或yac)表達來自罌粟的cyp82x1(圖3和4)。每一種酶的其他可能的變體都包括在表1內。
1.12)為了產生那可托林吉地，從先前所描述的產生的菌株中的1,13-二羥基-n-甲基坎那丁的低拷貝構建體(例如低拷貝質粒或yac)表達來自罌粟的cyp82x1(圖3和4)。每一種酶的其他可能的變體都包括在表1內。
1.13)為了產生3-o-乙?；浰趭W辛，從先前所描述的產生4’-o-去甲基-3-o-乙?；浰趭W辛的菌株中的低拷貝構建體(例如低拷貝質?；騳ac或染色體整合)共表達來自罌粟的psmt3或ps6omt和psmt2(圖10)。每一種酶的其他可能的變體都包括在表i內。
1.14)為了產生那可汀半縮醛，從先前所描述的產生罌粟殼堿半縮醛的菌株中的低拷貝構建體(例如低拷貝質?；騳ac或染色體整合)共表達來自罌粟的psmt3或ps6omt和psmt2(圖10)。每一種酶的其他可能的變體都包括在表1內。
1.15)為了產生更多的諾斯卡品類似物，從產生諾斯卡品的菌株移除某一酶或某一組酶。一個實例是合成北美黃連堿，從先前所描述的產生諾斯卡品的菌株排除psmt2、psmt3或ps6omt和cyp82y1。另外，將不同于坎那丁的不同底物進給到先前所描述的產生諾斯卡品的菌株以得到更多的諾斯卡品類似物。所述底物包括(但不限于)(s)-金黃紫堇堿、(s)-四氫小檗紅堿、(s)-刺罌粟堿、(s)-碎葉紫堇堿和(s)-四氫掌葉防己堿。
1.16)為了產生更多的類諾斯卡品，利用先前所描述的菌株共表達裁剪酶。引入產生諾斯卡品(或中間體)的菌株中的酶的實例包括(但不限于)p450、鹵化酶、糖基化酶、甲基轉移酶、異戊二烯基轉移酶。一個實例是哺乳動物肝臟p450cyp2d6可以斷裂坎那丁的亞甲基二氧雜環(huán)己基橋以得到9,10-二甲氧基-6,8,13,13a-四氫-5h-異喹啉并[3,2-a]異喹啉-2,3-二醇。
實施例2：用于在酵母中優(yōu)化諾斯卡品、合成中間體和衍生物的生物合成的策略
研發(fā)用于在工程化的酵母菌株內優(yōu)化原小檗堿和苯酞異喹啉生物堿的產生的工具和方法。優(yōu)化三種p450(也就是cyp82y1、cyp82x1和cyp82x2)的酶促活性以朝向諾斯卡品和中間體。利用細胞器路徑選擇工具盒來重定位和優(yōu)化以下類型酶(包括p450、甲基轉移酶、乙酰基轉移酶、短鏈脫氫酶和羧基酯酶)之間的相互作用，以便在工程化的酵母菌株中最優(yōu)產生靶標諾斯卡品或類諾斯卡品。
2.1)為了產生更多的n-甲基坎那丁，在酵母中表達來自不同物種的tnmt酶的變體。圖5繪示從在釀酒酵母中表達的不同tnmt變體產生的n-甲基坎那丁的測量。數(shù)據(jù)證實某些tnmt酶變體所產生的n-甲基坎那丁的含量高于其他tnmt酶變體。
2.2)為了從坎那丁產生更多1-羥基-n-甲基坎那丁，工程化cyp82y1的n-端以促進酶的正確折疊。圖6繪示在不同溫度(25℃和30℃)下使用不同的cyp82y1n-端突變體所產生的1-羥基-n-甲基坎那丁的測量。當在30℃下培養(yǎng)并通過相同啟動子(gal1啟動子)調節(jié)時，cyp82y1的活性可通過將n-端標簽與msh(cyp82y1a)的n-端標簽交換來改良。當在25℃下培養(yǎng)并通過gpd啟動子調節(jié)時，cyp82y1和cyp82y1a的活性是類似的。數(shù)據(jù)暗示msh的n-端標簽促進在釀酒酵母中形成可溶性cyp82y1。
2.3)為了從坎那丁產生更多的1-羥基-n-甲基坎那丁，通過測試cyp82y1基因上游的不同類型啟動子確定cyp82y1的最優(yōu)轉錄調節(jié)。圖6繪示在不同溫度(25℃和30℃)下使用通過不同啟動子調節(jié)的cyp82y1產生的1-羥基-n-甲基坎那丁的測量。在較高培養(yǎng)溫度下，當通過晚期hxt7(強)和adh1(比hxt7p相對更弱)啟動子調節(jié)時，cyp82y1的活性最高。當在30℃下培養(yǎng)時，在早期生長階段活化的強啟動子(例如pgk1、tpi1、pyk1、tef1啟動子)更不有效。相比之下，當在25℃下培養(yǎng)工程化的酵母菌株時，通過hxt7和強啟動子調節(jié)的cyp82y1的活性大約在相同水平。且相比之下，當通過adh1和弱cyc1啟動子調節(jié)cyp82y1時，14-羥基-n-甲基坎那丁的產生更低。
2.4)為了產生更多的1-羥基坎那丁，在25℃下在釀酒酵母中檢驗所有cyp82y1突變和各種啟動子-cyp82y1組合。將cyp82y1a上游的hxt7啟動子組合用于合成1-羥基坎那丁。對于1-羥基-n-甲基坎那丁的生物合成，在25℃下在通過hxt7啟動子調節(jié)時，cyp82y1和cyp82y1a展現(xiàn)類似的效率；相反，對于1-羥基坎那丁的生物合成，cyp82y1a的有效性為cyp82y1的兩倍(圖6)。
2.5)為了產生更多的1,13-二羥基-n-甲基坎那丁，通過測試cyp82x2基因上游的不同類型啟動子確定cyp82x2的最優(yōu)轉錄調節(jié)。圖7繪示在25℃下使用通過不同啟動子調節(jié)的cyp82x2所產生的1,13-二羥基-n-甲基坎那丁的測量。與cyp82y1類似，hxt7啟動子產生高含量的1,13-二羥基-n-甲基坎那丁。另外，在工程化的酵母菌株中表達cyp82x2的額外拷貝。由于cyp82x2在1-羥基-n-甲基坎那丁的量有限時可有效地將1-羥基-n-甲基坎那丁轉化為1,13-二羥基-n-甲基坎那丁，因此有人提出cyp82x2的轉化速率不如1-羥基-n-甲基坎那丁從酵母細胞出來的速率快。因此，在工程化的酵母菌株中重定位tnmt以延遲1-羥基-n-甲基坎那丁的合成。另外，將cyp82x2和cyp82y1進一步工程化為定位于內質網的同側，以增加cyp82x2與1-羥基-n-甲基坎那丁的接近。
2.6)為了產生更多的n-甲基-左旋蛇果黃堇堿，還在產生那可托林吉地的菌株中測試各種啟動子-cyp82x2組合。圖7繪示在25℃下使用通過不同啟動子調節(jié)的cyp82x2所產生的n-甲基-左旋蛇果黃堇堿的測量。與在cyp82x2作用于其天然底物1-羥基-n-甲基坎那丁時不同，在從pgk1和gpd啟動子表達時，此酶對n-甲基-左旋蛇果黃堇堿的合成展現(xiàn)更高的活性。
2.7)為了產生更多的4’-o-去甲基-3-o-乙酰基罌粟奧辛，通過測試cyp82x1基因上游的不同類型啟動子確定cyp82x1的最優(yōu)轉錄調節(jié)。在25℃下在不同啟動子的下游表達cyp82x1的不同酵母菌株中測量4’-o-去甲基-3-o-乙?；浰趭W辛的產生。hxt7、adh1和cyc1啟動子產生高合成含量的4’-o-去甲基-3-o-乙酰基罌粟奧辛(圖8)。
2.8)為了產生更多的那可托林和那可托林吉地，通過測試cyp82x1基因上游的不同類型啟動子確定cyp82x1的最優(yōu)轉錄調節(jié)。測量那可托林或那可托林吉地的產生并在每一對中進行比較。對于那可托林的合成，當cyp82x1通過pgk1來調節(jié)時，cyp82x1的活性更好(圖8)。
2.9)為了在產生諾斯卡品的菌株中減少酵母對于三種異源植物p450表達的表達應力，表達選擇性植物蛋白伴侶用于更好的酵母生長、可溶性植物p450的更高含量和諾斯卡品的更多產生。所利用的植物蛋白伴侶包括結合性免疫球蛋白(bip)、dnaj蛋白、葡萄糖調節(jié)蛋白(grp)94、結合蛋白(bip)、蛋白二硫化物異構酶(pdi)、親環(huán)素和鈣聯(lián)蛋白。
2.10)為了產生更多的諾斯卡品，在工程化的酵母菌株中表達下游酶(包括cyp82x2、cyp82y1、cyp82x1、pscxe1、pssdr1、psmt2和psmt3或ps6omt)的額外拷貝。另外，通過優(yōu)化諾斯卡品生物合成酶在酵母中的定位來增強工程化的酵母菌株中諾斯卡品的產量。植物生物合成酶的最優(yōu)定位模式模仿其天然環(huán)境。將限速步驟重定位到不同的細胞器，或重定位于先前步驟的酶附近。并且檢驗各種組合和數(shù)量的生物合成酶的共定位。
2.11)為了產生更多的諾斯卡品中間體，在工程化的酵母菌株中將來自其他植物物種(例如白毛茛(hydrastiscanadensis)、兜狀荷包牡丹(dicentracucullaria)和北美荷包藤(adlumiafungosa))的下游生物合成酶變體的效率與來自罌粟的下游生物合成酶變體的效率相比較。另外，還將一些下游酶工程化成展現(xiàn)更加靈活的底物特異性以便能有效地將非天然底物轉化為最終諾斯卡品類似物。
實施例3：從全去甲勞丹堿合成諾斯卡品的酵母菌株
工程化酵母以包括六個額外酶促步驟，特別是那些在從坎那丁產生諾斯卡品的工程化的酵母菌株內通過酶ps6omt、ps4’omt、pscnmt、psbbe、s9omt和cyp719a催化的酶促步驟。用于生物合成植物天然產物的工程化的酵母菌株包括多達15個異源酶促步驟工程化和引入酵母菌株中(圖9)。在實例中，可以工程化酵母中的另外8種酶以從全去甲勞丹堿產生牛心果堿。在其他實例中，可以酵母中的另外6種酶以從坎那丁產生諾斯卡品。
為了從全去甲勞丹堿產生諾斯卡品，從yac表達tnmt、psat1、cyp82x1、pscxe1、pssdr1、psmt2、psmt3，從低拷貝質粒表達cyp82y1和cyp82x1，在產生坎那丁的通過染色體整合ps6omt、ps4’omt、pscnmt、psbbe、atatr1和cyp719a的菌株中從高拷貝質粒表達s9omt。另外，通過染色體整合ps6omt、ps4’omt、pscnmt、psbbe、atatr1、cyp719a、tnmt、s9omt、cyp82y1、cyp82x1、cyp82x2、pscxe1、pssdr1、psmt2和psat1。每一種酶的其他可能的變體都包括在表i內。從低拷貝質粒表達cyp82x1和/或s9omt額外拷貝以更多的產生諾斯卡品(圖11)。
實施例4：重新合成諾斯卡品的酵母菌株
工程化酵母以包括十三個額外酶促步驟，特別使那些在從全去甲勞丹堿產生諾斯卡品的工程化的酵母菌株內通過酶rnptps、rnsepr、rnpcd、rnqdhpr、rndhfr、rntyrh、cjncs、ppdodc、eccyp80b1、aro4(q166k)、aro7(t226i)、aro10和tkl1催化的酶促步驟。用于生物合成植物天然產物的工程化的酵母菌株包括多達28個異源酶促步驟工程化和引入酵母菌株中(圖9)。
為了重新產生諾斯卡品，將psbbe、psmt1(pss9omt)、cjcas、tnmt、cyp82y1、cyp82x2、psat1、cyp82x1、pscxe1、pssdr1、psmt2和psmt3通過染色體整合到產生牛心果堿的具有或沒有zwf1缺失的酵母菌株的三個不同基因座(leu2、trp1和his3)中。并且將rnptps、rnsepr、rnpcd、rnqdhpr、rndhfr、rntyrh、cjncs、ppdodc、eccyp80b1、pscpr、ps6omt、ps4’omt、pscnmt、aro4(q166k)、aro7(t226i)、aro10和tkl1通過染色體整合到酵母菌株中用于重新合成牛心果堿，且將rntyrh、ps4’omt、cjncs的額外拷貝通過染色體整合到zwf1基因座或ypl250c基因座中以增強牛心果堿的產生。每一種酶的其他可能的變體都包括在表i內(圖13)。
實施例5：重新合成類諾斯卡品的酵母菌株
在酪氨酸被酪氨酸類似物中的一種或一個集合替代的限定培養(yǎng)基中培養(yǎng)產生諾斯卡品的酵母，以便合成芐基異喹啉、原小檗堿、斷裂小檗堿和苯酞異喹啉生物堿的功能化衍生物。如本文所使用的功能化衍生物指的是一種具有可將其與參考化合物區(qū)分開的結構特性的化合物，其中區(qū)分性特性存在于用于合成化合物的起始材料中。例如，3-氯-牛心果堿可以從α-氯-l-酪氨酸產生并且在本文中被視為牛心果堿的功能化衍生物，因為區(qū)分所述兩種化合物的氯離子是所用起始材料的特性而不是通過合成中的步驟引入的。其他實例包括6-羥基-坎那丁(可以通過宿主細胞從α-羥基-l-酪氨酸產生的坎那丁的功能化衍生物)和7-硝基-罌粟殼堿(從3-硝基-l-酪氨酸產生的罌粟殼堿的功能化衍生物)。類似地，芐基異喹啉、原小檗堿、斷裂小檗堿和苯酞異喹啉生物堿的功能化衍生物可以從諸如酪氨酸的類似物等起始材料產生。在其他實例中，取出一組或多組基因以積累某些組功能化衍生物。
為了重新產生類諾斯卡品，工程化酵母菌株以表達psbbe、psmt1(pss9omt)、cjcas、tnmt、cyp82y1、cyp82x2、psat1、cyp82x1、pscxe1、pssdr1、psmt2、psmt3、rnptps、rnsepr、rnpcd、rnqdhpr、rndhfr、rntyrh、cjncs、ppdodc、eccyp80b1、pscpr、ps6omt、ps4’omt、pscnmt、aro4(q166k)、aro7(t226i)、aro10和tkl1，其中rntyrh、ps4’omt和cjncs的額外拷貝是通過染色體整合到zwf1基因座或ypl250c基因座中，并且gapdh、cyp82x2、trp1和psmt1的額外拷貝是通過染色體整合到ura3基因座中。在沒有酪氨酸、但具有一種或一組酪氨酸類似物的限定培養(yǎng)基中培養(yǎng)工程化產生諾斯卡品的菌株，所述酪氨酸類似物包括(但不限于)α-取代的l-酪氨酸(例如α-甲基l-酪氨酸，方案1)和3-取代的l-酪氨酸(例如3-硝基-l-酪氨酸，方案2)。沿著諾斯卡品生物合成路徑積累芐基異喹啉、原小檗堿、斷裂小檗堿和苯酞異喹啉生物堿的功能化衍生物。在一些情形下，為積累更多的芐基異喹啉、原小檗堿或斷裂小檗堿生物堿的功能化衍生物，從產生諾斯卡品的菌株移除某些或某些組下游酶。
方案1.從α-取代的l-酪氨酸合成的功能化衍生物。
方案2.從3-取代的l-酪氨酸合成的功能化衍生物。
圖式說明
圖1圖解說明根據(jù)本發(fā)明的實施方案基于植物中的生物化學鑒定生物用于將坎那丁轉化為諾斯卡品的合成方案。虛線箭頭指示未證實的酶促步驟。實線箭頭指示通過酵母(psmt1、cyp82y1、pssdr1)中的異源表達或通過罌粟(psmt1、cyp719a21、cyp82x2、psmt2、pscxe1、pssdr1)中病毒誘導的基因沉默(vigs)證實的酶促步驟。當psmt1、cyp719a21、cyp82x2、pscxe1、pssdr1和psmt2在罌粟中失活時，(s)-坎那丁、(s)-n-甲基坎那丁、那可托林、罌粟奧辛、那可汀半縮醛和罌粟殼堿因此得以積累。
圖2a圖解說明根據(jù)本發(fā)明的實施方案基于釀酒酵母的生物化學表征將坎那丁轉化為諾斯卡品的生物合成方案。
圖2a和2b繪示從坎那丁合成諾斯卡品的更新的生物合成路徑。圖2a繪示用于生物合成諾斯卡品的主要路徑并且圖2b圖解說明主要路徑以及用于產生副產物的路徑。如在圖2a中并且根據(jù)酵母中的生物化學表征可看出，cyp82x2催化在合成1-羥基-n-甲基坎那丁之后的酶促步驟。隨后，psat1添加乙酰基以產生1-羥基-13-o-乙酰基-n-甲基坎那丁，隨后cyp82x1催化c-n鍵裂解并合成4’-o-去甲基-3-o-乙?；浰趭W辛。pscxe1和pssdr1如先前所表明發(fā)揮作用并從4’-o-去甲基-3-o-乙?；浰趭W辛合成罌粟殼堿。cyp82y1可以作用于(s)-坎那丁以產生1-羥基坎那丁。n-甲基左旋蛇果黃堇堿可以根據(jù)cyp82x2的活性從n-甲基坎那丁合成。那可托林是在tnmt、cyp82y1和cyp82x1存在下從坎那丁合成。當將cyp82x1引入產生1,13-二羥基-n-甲基坎那丁的菌株中時，產生那可托林吉地。
圖2b圖解說明根據(jù)本發(fā)明的實施方案基于釀酒酵母的生物化學表征將坎那丁轉化為諾斯卡品并產生副產物的另一生物合成方案。
圖3圖解說明根據(jù)本發(fā)明的實施方案由工程化的酵母菌株分泌到培養(yǎng)基中的化合物的液相色譜-質譜法(lc-ms)分析的eic跡線。具體來說，圖3圖解說明諾斯卡品、中間體和衍生物產生的lc-ms跡線。圖3繪示由工程化的酵母菌株分泌到培養(yǎng)基中的化合物的液相色譜串聯(lián)質譜法(lc-ms)分析。所有測定都在250μm坎那丁(s,r外消旋混合物)存在下生長72h的酵母體內實施。通過離心將培養(yǎng)基與細胞沉淀分離并且通過lc-ms進行分析。利用耦合到配備有agilentzorbaxsb-aq管柱(3.0×50mm1.8微米)和agilentzorbaxsb-aqguard管柱(2.1×12.5mm5微米)的agilent1200serieshplc的agilent6320iontrap(電噴霧毛細管電壓-3.5kv；加熱毛細管溫度350℃；保護氣體：氮)獲得陽離子電噴霧電離(esi)質譜。lc分離方法為在7min內h2o:ch3從80:20到40:60的梯度洗脫、在1min內100％ch3oh的梯度洗脫和最后4min的等度洗脫，并且流速為0.5mlmin-1。兩種溶劑都為0.1％乙酸。
圖4圖解說明根據(jù)本發(fā)明的實施方案在圖3中描述的化合物的陽離子電噴霧電離(esi)質譜ms/ms片段化。如針對圖3所描述獲得陽離子電噴霧電離(esi)質譜。并且以1.00v的片段化振幅保持40ms并且利用氦作為背景氣體獲得給定前體離子的ms/ms質譜。
圖5圖解說明根據(jù)本發(fā)明的實施方案在表達來自罌粟或花菱草的tnmt并且在坎那丁存在下生長的酵母體內n-甲基坎那丁體的合成。在表達來自罌粟或花菱草的tnmt并且在30℃下在250μm坎那丁(s,r外消旋混合物)存在下生長72h的酵母體內實施測定。如針對圖3所描述獲得陽離子電噴霧電離(esi)質譜。繪制分子離子的產物萃取離子色譜圖的萃取離子色譜圖并且手動進行整合。誤差棒是三個生物重復的s.d.。
圖6圖解說明根據(jù)本發(fā)明的實施方案在具有或不具有pstnmt下在坎那丁存在下生長且在各種啟動子的下游表達不同形式的cyp82y1的酵母的體內測定結果。在250μm坎那丁(s,r外消旋混合物)存在下生長72h的酵母體內實施測定。酵母在具有或不具有pstnmt下在各種啟動子的下游表達不同形式的cyp82y1。如針對圖3所描述獲得陽離子電噴霧電離(esi)質譜。繪制分子離子的產物萃取離子色譜圖的萃取離子色譜圖并手動進行整合。誤差棒是三個生物重復的s.d.。a繪示在不同溫度(25℃和30℃)下在通過染色體整合pstnmt的酵母菌株中在各種啟動子(gal1、gpd、tpi1、tef1、pgk1、pyk1、cyc1、adh1、hxt7啟動子)的下游通過不同形式的cyp82y1(1.將cyp82y1標簽的n-端與其他er-結合蛋白的n-端交換；2.將其他er-結合蛋白的n-端標簽直接貼到cyp82y1上)的1-羥基-n-甲基坎那丁的產生。b繪示在25℃下在hxt7啟動子或tpi11啟動子的下游表達cyp82y1或cyp82y1a(n-端標簽與msh的n-端標簽交換的cyp82y1)且整合pstnmt的釀酒酵母中1-羥基-n-甲基坎那丁或1-羥基坎那丁的產生。
圖7圖解說明根據(jù)本發(fā)明的實施方案在pstnmt和cyp82y1a存在下在坎那丁存在下生長且在各種啟動子(gal1、gpd、pgk1、hxt7)的下游表達cyp82x2的酵母的體內測定結果。在250μm坎那丁(s,r外消旋混合物)存在下生長72h的酵母體內實施測定。酵母在pstnmt和cyp82y1a存在下在各種啟動子(gal1、gpd、pgk1、hxt7啟動子)的下游表達cyp82x2。如針對圖3所描述獲得陽離子電噴霧電離(esi)質譜。繪制分子離子的產物萃取離子色譜圖的萃取離子色譜圖并手動進行整合。誤差棒是三個生物重復的s.d.。
圖8圖解說明根據(jù)本發(fā)明的實施方案在pstnmt和cyp82y1a存在下、在具有和不具有cyp82x2和psat1下在坎那丁存在下生長且在各種啟動子(gal1、gpd、pgk1、cyc1、adh1、hxt7)的下游表達野生型(wt)的酵母的體內測定結果。在250μm坎那丁(s,r外消旋混合物)存在下生長72h的酵母體內實施測定。在pstnmt和cyp82y1a存在下在具有或沒有cyp82x2和psat1的情況下，酵母在gal1、hxt7、adh1、cyc1、gpd、tef1和pgk1啟動子的下游表達野生型cyp82x1。如針對圖3所描述獲得陽離子電噴霧電離(esi)質譜。繪制分子離子的產物萃取離子色譜圖的萃取離子色譜圖并手動進行整合。誤差棒是三個生物重復的s.d.。
圖9圖解說明根據(jù)本發(fā)明的實施方案將全去甲勞丹堿轉化為諾斯卡品的生物合成方案。
圖10圖解說明3-o-乙?；?罌粟奧辛、那可汀半縮醛和諾斯卡品的lc-ms跡線。具體來說，圖10繪示使用如本文所描述的方法通過工程化的酵母菌株分泌到培養(yǎng)基中的化合物的eic-lcms分析。
圖11圖解說明根據(jù)本發(fā)明的實施方案諾斯卡品從全去甲勞丹堿的生物合成。a繪示諾斯卡品標準品(黑色)和產生諾斯卡品的菌株csyn16的培養(yǎng)基(紅色)的ms/ms光譜。b繪示從具有不同組表達盒的工程化菌株分析的諾斯卡品滴度。csyn16：從染色體表達atatr1、ps6omt、ps4'omt、pscnmt、psbbe、pss9omt、cjcas、cyp82y1、cyp82x2、psat1、pssdr1、pstnmt、psmt2、cyp82x1、pscxe1和psmt3。csyn17_1：從染色體表達atatr1、ps6omt、ps4'omt、pscnmt、psbbe、tfs9omt、cjcas、cyp82y1、cyp82x2、psat1、pssdr1、psmt2、pstnmt、cyp82x1、pscxe1和psmt3；從低拷貝質粒表達cyp82x2。csyn17_2：從染色體表達atatr1、ps6omt、ps4'omt、pscnmt、psbbe、tfs9omt、cjcas、cyp82y1、cyp82x2、psat1、pssdr1、psmt2、pstnmt、cyp82x1、pscxe1和psmt3；從低拷貝質粒表達pss9omt。csyn18：從染色體表達atatr1、ps6omt、ps4'omt、pscnmt、psbbe、tfs9omt、cjcas、cyp82y1、cyp82x2、psat1、pssdr1、psmt2、pstnmt、cyp82x1、pscxe1和psmt3；從低拷貝質粒表達cyp82x2、pss9om。c繪示產生諾斯卡品的酵母菌株csyn18的m/z+＝288(黑色)和414(紅色)的eic。誤差棒代表五個生物重復的平均值±1s.d.并且誤差棒代表所述重復的標準偏差。
圖12圖解說明根據(jù)本發(fā)明的實施方案從酪氨酸生物合成諾斯卡品的路徑。
圖13圖解說明根據(jù)本發(fā)明的實施方案在酵母中諾斯卡品的重新產生的證實。
圖14圖解說明根據(jù)本發(fā)明的實施方案在酵母中類諾斯卡品的重新產生的例示性生物合成示意圖。n4’omt代表mt2、mt3異二聚體。
圖15圖解說明根據(jù)本發(fā)明的實施方案在酵母中的類諾斯卡品的重新產生的另一例示性生物合成示意圖。n4’omt代表mt2、mt3異二聚體。
圖16圖解說明根據(jù)本發(fā)明的實施方案將葡萄糖轉化為4-hpa、多巴胺和3,4-dhpa的生物合成方案。
圖17圖解說明根據(jù)本發(fā)明的實施方案通過去甲烏藥堿將l-酪氨酸轉化為牛心果堿的生物合成方案。
圖18圖解說明根據(jù)本發(fā)明的實施方案通過全去甲勞丹堿將l-酪氨酸轉化為牛心果堿的生物合成方案。
圖19圖解說明根據(jù)本發(fā)明的實施方案的四氫生物喋呤的合成、循環(huán)和再利用路徑的實例。
圖20圖解說明根據(jù)本發(fā)明的實施方案將l-酪氨酸轉化為原小檗堿、苯酞異喹啉和小檗堿生物堿產物的生物合成方案。
圖21圖解說明根據(jù)本發(fā)明的實施方案將l-酪氨酸轉化為諾斯卡品、類諾斯卡品和苯酞異喹啉生物堿產物的生物合成方案。
圖22圖解說明根據(jù)本發(fā)明的實施方案將l-酪氨酸轉化為血根堿和苯啡啶生物堿的生物合成方案。
酶列表的論述
宿主細胞可以工程化以包括一種或多種修飾(例如兩種或更多種、三種或更多種、四種或更多種、五種或更多種或甚至更多種修飾)從而產生所關注bia和/或所關注酶。表1提供可以被一種或多種修飾作用從而在工程化的宿主細胞中產生所關注bia和/或所關注酶的例示性基因的列表。
如表1中所提供的基因修飾可用于從用含有生長所需要的基本營養(yǎng)素的培養(yǎng)基提供的工程化的宿主細胞產生所關注bia。此基礎培養(yǎng)基可以含有碳源、氮源、氨基酸、維生素和鹽。例如，如表1中所提供的基因修飾可用于從進給糖的工程化的宿主細胞產生所關注bia。另外，如表1中所提供的一種或多種基因的修飾可用于擴大可以工程化用于藥物產生的宿主細胞的生物合成過程。
另外，僅從鑒定可由基因產生的酶不易明了使用這些修飾在工程化的宿主細胞中產生所關注bia和/或所關注酶。具體來說，如本文所描述已在宿主細胞(例如酵母細胞)中重構的合成路徑包含在單一生物體內本質上不共同起作用的各種酶。另外，一些本文所論述的酶在其天然環(huán)境中并不對bi生物合成起作用。另外，一些本文所描述的酶未進化成在具體宿主細胞(例如酵母細胞)中起作用且未進化成共同起作用。在這些情形下，可能無法顯而易見酶可以在宿主細胞(例如酵母)中在合成bia路徑的情況中展現(xiàn)充足的活性，以使充足的通量通過所述路徑以產生下游bia終產物。
例如，植物酶通常難以在異源微生物宿主(例如酵母)中功能性地表達。在許多情形下，酶可能錯誤折疊、在宿主細胞內不正確定位和/或不正確地加工。在酵母與植物之間的蛋白質翻譯和加工的差異可導致這些酶在酵母宿主中展現(xiàn)實質上降低到檢測不到的活性。定位在內膜的酶(例如細胞色素p450)通常出現(xiàn)這些變化，這在bia路徑中有很強的代表性。甚至降低的酶活性也可能對工程化酵母產生復雜的bia構成重大挑戰(zhàn)，這需要在每一步驟中都具有充足的活性以確保高水平積累所需要的bia產物。
另外，在一些宿主細胞(例如酵母)中存在可能作用于bia路徑中的許多早期前體(也就是從酪氨酸到去甲烏藥堿的中間體)的內源性酶/路徑，且因此可能鑒于這些競爭性的內源性路徑而不會明了可有充足的通量通過異源路徑以達成大量bia產生。例如，酵母中的erlich路徑(hazelwood等人2008.appl.environ.microbiol.74:2259-66；larroy等人2003.chem.biol.interact.143-144:229-38；larroy等人2002.eur.j.biochem.269:5738-45)是主要的內源性路徑，其可能起作用以將早期bia路徑中的許多中間體轉化為不需要的產物并從合成路徑轉移通量。
此外，如本文所論述和如表1中所提供的許多酶都可以在天然植物宿主中在非常特定的調節(jié)策略(包括空間調節(jié))下起作用，所述酶在轉移到異源酵母宿主之后可能喪失。另外，植物呈現(xiàn)與酵母細胞非常不同的生物化學環(huán)境，酶在所述生物化學環(huán)境下進化成起作用，所述生物化學環(huán)境包括ph、氧化還原狀態(tài)和底物、輔底物、輔酶和輔因子可用性。鑒于在天然宿主與異源酵母宿主之間的生物化學環(huán)境和調節(jié)策略的差異，酶在酵母環(huán)境中時不明顯展現(xiàn)大量活性且另外所述酶不明顯可共同起作用以將諸如糖等簡單前體轉化成復雜的bia化合物。因為許多路徑都具有許多反應步驟(>10個)，所以在酵母宿主中維持酶的活性特別重要，因此如果這些步驟不是有效的，那么可以預計所需下游產物不會積累。
另外，在天然植物宿主中，這些路徑中的相關代謝物可以定位在不同的細胞和組織類型內。在幾個實例中，存在可以專門用于生物合成的細胞類型和可經合成用于代謝物積累的細胞類型。在異源酵母宿主內在路徑中表達時，此類型的細胞專門化可能喪失并且可能在控制這些代謝物對細胞的毒性方面起重要作用。因此，不會顯而易見酵母可以成功地工程化以生物合成和積累這些代謝物而不會受這些化合物的毒性傷害。
作為一個實例，在天然植物宿主中，報道酶bbe具有動態(tài)的亞細胞定位。具體來說，酶bbe最初在er中開始且然后被分到液泡(bird和facchini.2001.planta.213:888-97)。已表明植物中bbe的er-締合(alcantara等人2005.plantphysiol.138:173-83)為bbe活性提供最優(yōu)的堿性ph(ph為約8.8)(ziegler和facchini.2008.annu.rev.plantbiol.59:735-69)。作為另一實例，有證據(jù)表明血根堿生物合成是在植物細胞內的專門泡囊中發(fā)生(amann等人1986.planta.167:310-20)，但只有一部分中間體積累在泡囊中。這可能發(fā)生以便將它們與其他酶活性和/或毒性效應隔離。
作為另一實例，嗎啡喃(morphinan)路徑分支中的生物合成酶都定位到作為植物維管組織的一部分的韌皮部。在韌皮部中，可以在兩種細胞類型之間進一步劃分路徑酶：所有植物共有的篩管分子，和為僅存在于某些制備專門次級代謝物的植物中的專門細胞類型的乳汁管。篩管分子中主要為上游酶(也就是從ncs到salat)且乳汁管中大多為下游酶(也就是t6odm、cor、codm)(onoyovwe等人2013plantcell.25:4110-22)。另外，已發(fā)現(xiàn)諾斯卡品生物合成路徑中的最后步驟是在乳汁管中進行的(chen和facchini.2014.plantj.77:173-84)。認為此區(qū)室化對于調節(jié)生物合成非常重要，所述調節(jié)通過是離析或運輸中間體、提供最優(yōu)ph、增強輔因子的供應來實現(xiàn)，但是罌粟乳汁管微環(huán)境的性質仍在研究(ziegler和facchini.2008.annu.rev.plantbiol.59:735-69)。另外，預測幾種酶可以作為植物次級代謝共有的多酶復合體或代謝通道使用(kempe等人2009.phytochemistry.70:579-89；allen等人2004.nat.biotechnol.22:1559-66)。當來自不同宿主的生物合成酶被組合和/或在異源酵母細胞中重組表達時，不清楚這些復合體或通道將如同其在天然宿主中一樣形成。在另一實例中，在日本黃連中，在根部組織中生物合成小檗堿且所述小檗堿然后通過專門atp-結合盒運輸?shù)鞍椎淖饔梅e累于根莖內(shitan等人2013.phytochemistry.91:109-16)。在鴉片罌粟中，嗎啡喃生物堿積累于乳膠(乳汁管細胞的細胞質)內(martin等人1967.biochemistry.6:2355-63)。
另外，即使存在這些研究，但情形還是用于本文所描述路徑中的幾個步驟的植物酶尚未被表征。例如，酪氨酸到早期芐基異喹啉生物堿支架去甲烏藥堿的轉化就尚未被表征。另外，罌粟殼堿到諾斯卡品的轉化只是最近才如本文所描述被表征的。因此，對于本文所描述路徑中的幾個步驟，通過將通常不會共同天然存在的酶活性結合在一起用于bia的生物合成或根據(jù)基因組序列信息鑒定新的酶活性，產生替代生物合成方案以用于重構路徑中。
例如，可以通過將不會共同天然存在且不會進化成在此路徑的情況中或與植物酶一起發(fā)揮作用的至少5種哺乳動物酶和1種細菌酶組合來實現(xiàn)酪氨酸到多巴胺的兩步驟轉化。在這些情況中，這些酶用于化合物的生物合成可能不是很明顯，所述酶在自然界中不進化且其可在異源微生物宿主和此路徑的情況中有效發(fā)揮作用。作為另一實例，負責將罌粟殼堿轉化為諾斯卡品的酶是未知的。盡管原位轉化研究指示psmt2參與此轉化，但psmt2本身無法甲基化罌粟殼堿以得到諾斯卡品。如本文所論述的新穎酶復合體在酵母中和在合成bia路徑的情況中實施此o-甲基化反應。由于ps6omt與psmt3之間的序列相似度較高，在植物中可能難以發(fā)現(xiàn)功能psmt2/psmt3酶復合體。酵母中的純凈酶背景使得作為罌粟殼堿4’-o-甲基轉移酶的psmt2/psmt3異二聚體的發(fā)現(xiàn)可能如本文所陳述。
下文論述作為目標進行修飾以產生所關注bia和/或所關注酶的基因的實例。另外，在一系列圖解說明用于生成所關注bia和/或所關注酶中的路徑的圖的情況中論述基因。
[tlk1]在一些實例中，工程化的宿主細胞可以改良酶轉酮醇酶的表達。轉酮醇酶是由tkl1基因編碼。在實例中，轉酮醇酶催化果糖-6-磷酸+甘油醛-3-磷酸
[zwf1]在一些實例中，工程化的宿主細胞可以改良酶葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的表達。葡萄糖-6-磷酸脫氫酶是由zwf1基因編碼。在實例中，葡萄糖-6-磷酸脫氫酶催化葡萄糖-6-磷酸→6-磷酸葡糖酸內酯的反應，如在圖16中所提及。工程化的宿主細胞可以被修飾以在工程化的宿主細胞中刪除zwf1基因的編碼區(qū)?；蛘?，工程化的宿主細胞可以通過(例如)引入失活突變被修飾以使zwf1基因的功能性喪失。
[aro4]在一些實例中，工程化的宿主細胞可以改良酶3-去氧-d-阿拉伯糖基-庚糖酮酸-7-磷酸(dahp)合成酶的表達。dahp合成酶是由aro4基因編碼。在實例中，dahp合成酶催化赤藻糖-4-磷酸+磷酸烯醇丙酮酸→dahp的反應，如在圖16中所提及。工程化的宿主細胞可以修飾aro4基因以并入一種或多種反饋抑制緩解突變。具體來說，反饋抑制緩解突變(例如aro4fbr)可以如下并入：作為天然aro4基因的定向突變在原始基因座并入；作為以遺傳整合引入的另一拷貝在單獨基因座并入；或作為附加型載體(例如2-μm或著絲粒質粒)上的另一拷貝。突變aro4fbr中的標識符“fbr”指的是反饋抗性突變體和突變。例如當工程化的宿主細胞是酵母細胞時，dahp合成酶的反饋抑制拷貝可處于天然酵母轉錄調節(jié)之下?；蛘?，dahp合成酶的反饋抑制拷貝可以通過將其置于合成啟動子的控制下被引入到具有工程化的蛋白質表達組成型或動態(tài)調節(jié)的工程化宿主細胞中。在一些情形下，aro4基因可以衍生自釀酒酵母。在一些情形下，aro4基因與天然存在基因可以為100％類似。aro4基因的修飾的實例包括反饋抑制抗性突變、k229l或q166k。
[aro7]在一些實例中，工程化的宿主細胞可以改良酶分支酸變位酶的表達。分支酸變位酶是由aro7基因編碼。在實例中，分支酸變位酶催化分支酸→預苯酸的反應，如在圖16中所提及。工程化的宿主細胞可以修飾aro7基因以并入一種或多種反饋抑制緩解突變。具體來說，反饋抑制緩解突變(例如aro7fbr)可以如下并入：作為針對天然aro7基因的定向突變在原始基因座引入；作為以遺傳整合引入的另一拷貝在單獨基因座引入；或作為附加型載體(例如2-μm或著絲粒質粒)上的另一拷貝。突變aro7fbr中的標識符“fbr”是指反饋抗性突變體和突變。例如當工程化的宿主細胞是酵母細胞時，分支酸變位酶的反饋抑制拷貝可以處于天然酵母轉錄調節(jié)下?；蛘?，分支酸變位酶的反饋抑制拷貝可以通過將其置于合成啟動子的控制下引入具有工程化的蛋白質表達組成型或動態(tài)調節(jié)的工程化宿主細胞中。在一些情形下，aro7基因可以源自釀酒酵母。在一些情形下，aro7基因與天然存在基因可以為100％類似。aro7基因的修飾的實例包括反饋抑制抗性突變或t226i。
[aro10]在一些實例中，工程化的宿主細胞可以改良酶苯丙酮酸脫羧酶的表達。苯丙酮酸脫羧酶是由aro10基因編碼。在實例中，苯丙酮酸脫羧酶催化羥基苯丙酮酸→4-羥基苯乙酸(4hpa)的反應，如在圖16中所提及。工程化的宿主細胞可以被修飾以在工程化的宿主細胞中包括aro10基因的組成型過表達。另外或或者，工程化的宿主細胞可以被修飾以在工程化的宿主細胞中以合成方式調節(jié)aro10基因的表達。在實例中，工程化的宿主細胞可以被修飾以并入aro10基因的一或多個拷貝或額外拷貝。另外或或者，工程化的宿主細胞可以被修飾以在工程化的宿主細胞內引入用于過表達aro10基因的強啟動子元件。aro10基因可以源自釀酒酵母或另一物種。在一些實例中，aro10基因與天然存在基因可以為100％類似。
[aro9]在一些實例中，工程化的宿主細胞可以改良酶芳香族胺基轉移酶的表達。芳香族胺基轉移酶是由aro9基因編碼。在實例中，芳香族胺基轉移酶催化羥基苯丙酮酸+谷氨酸鹽→酪氨酸+α-酮戊二酸的反應，如在圖16中所提及。工程化的宿主細胞可以被修飾以在工程化的宿主細胞中包括aro9基因的組成型過表達。另外或或者，工程化的宿主細胞可以被修飾以在工程化的宿主細胞中以合成方式調節(jié)aro9基因的表達。在實例中，工程化的宿主細胞可以被修飾以并入aro9基因的一個或多個拷貝或額外拷貝。另外或或者，工程化的宿主細胞可以被修飾以在工程化的宿主細胞內中引入用于過表達aro9基因的強啟動子元件。aro9基因可以源自釀酒酵母或另一物種。在一些實例中，aro9基因與天然存在基因可以為100％類似。
[tyrh]在一些實例中，工程化的宿主細胞可以改良酶酪氨酸羥化酶的表達。酪氨酸羥化酶是由tyrh基因編碼。在實例中，酪氨酸羥化酶催化酪氨酸→l-dopa的反應，如在圖16和17中所提及。工程化的宿主細胞可以被修飾以在工程化的宿主細胞中包括tyrh基因的組成型表達。另外或或者，工程化的宿主細胞可以被修飾以在工程化的宿主細胞中以合成方式調節(jié)tyrh基因的表達。在實例中，工程化的宿主細胞可以被修飾以并入tyrh基因的一個或多個拷貝或額外拷貝。另外或或者，工程化的宿主細胞可以被修飾以在工程化的宿主細胞內中引入用于過表達tyrh基因的強啟動子元件。tyrh基因可以源自智人、褐鼠、小家鼠或另一物種。在一些實例中，tyrh基因與天然存在基因可以為100％類似。
[dodc]在一些實例中，工程化的宿主細胞可以改良酶l-dopa脫羧酶的表達。l-dopa脫羧酶是由dodc基因編碼。在實例中，l-dopa脫羧酶催化l-dopa→多巴胺的反應，如在圖16和17中所提及。工程化的宿主細胞可以被修飾以在工程化的宿主細胞中包括dodc基因的組成型表達。另外或或者，工程化的宿主細胞可以被修飾以在工程化的宿主細胞中以合成方式調節(jié)dodc基因的表達。在實例中，工程化的宿主細胞可以被修飾以并入dodc基因的一個或多個拷貝或額外拷貝。另外或或者，工程化的宿主細胞可以被修飾以在工程化的宿主細胞內中引入用于過表達dodc基因的強啟動子元件。dodc基因可以源自惡臭假單胞菌、褐鼠或另一物種。在一些實例中，dodc基因與天然存在基因可以為100％類似。
[ncs]在一些實例中，工程化的宿主細胞可以改良酶去甲烏藥堿合成酶的表達。去甲烏藥堿合成酶是由ncs基因編碼。在實例中，去甲烏藥堿合成酶催化4hpa+多巴胺→(s)-去甲烏藥堿的反應，如在圖17中所提及。具體來說，圖17圖解說明根據(jù)本發(fā)明的實施方案通過去甲烏藥堿將l-酪氨酸轉化為牛心果堿的生物合成方案。圖17提供以下酶的使用：如本文所論述的tyrh，酪氨酸羥化酶；dodc，dopa脫羧酶；ncs，去甲烏藥堿合成酶；6omt，6-o-甲基轉移酶；cnmt，烏藥堿n-甲基轉移酶；cyp80b1，細胞色素p45080b1；cpr，細胞色素p450nadph還原酶；4’omt，3’羥基-n-甲基烏藥堿4’-o-甲基轉移酶。l-dopa，l-3,4-二羥基苯丙氨酸；和4-hpa，4-羥基苯基乙醛。在圖17中圖解說明的酶中，4-hpa和l-酪氨酸是在酵母中天然合成的。所顯示的所有其他代謝物都不是在酵母中天然產生的。另外，盡管tyrh被繪示為催化l-酪氨酸到l-dopa的轉化，但如說明書中所描述還可以使用其他酶實施此步驟。例如，還可以使用酪氨酸酶實施l-酪氨酸到l-dopa的轉化。另外，還可以使用諸如細胞色素p450氧化酶等其他酶實施l-酪氨酸到l-dopa的轉化。此類酶對相關的bia前體化合物(包括l-dopa和l-酪氨酸)可以展現(xiàn)氧化酶活性。
另外，去甲烏藥堿合成酶催化3,4-dhpa+多巴胺→(s)-全去甲勞丹堿的反應，如在圖18中所提及。具體來說，圖18圖解說明根據(jù)本發(fā)明的實施方案通過全去甲勞丹堿將l-酪氨酸轉化為牛心果堿的生物合成方案。圖18提供以下酶的使用：tyrh，酪氨酸羥化酶；dodc，dopa脫羧酶；maoa，單胺氧化酶；ncs，去甲烏藥堿合成酶；6omt，6-o-甲基轉移酶；cnmt，烏藥堿n-甲基轉移酶；4’omt，3’羥基-n-甲基烏藥堿4’-o-甲基轉移酶。l-dopa，l-3,4-二羥基苯丙氨酸；和3,4-dhpa，3,4-二羥基苯基乙醛。在圖18中圖解說明的酶中，l-酪氨酸是在酵母中天然合成的。在圖18中所顯示的其他代謝物不是在酵母中天然產生的。
工程化的宿主細胞可以被修飾以在工程化的宿主細胞中包括ncs基因的組成型表達。另外或或者，工程化的宿主細胞可以被修飾以在工程化的宿主細胞中以合成方式調節(jié)ncs基因的表達。在實例中，工程化的宿主細胞可以被修飾以并入ncs基因的一個或多個拷貝或額外拷貝。另外或或者，工程化的宿主細胞可以被修飾以在工程化的宿主細胞內中引入用于過表達ncs基因的強啟動子元件。另外，去甲烏藥堿合成酶可以具有n-端截短。在一些情形下，ncs基因可以進行密碼子優(yōu)化用于在釀酒酵母中表達。ncs基因可以源自日本黃連、罌粟、大紅罌粟、黃花唐松草、巖黃連或另一物種。在一些實例中，ncs基因與天然存在基因可以為80％類似。
[6omt]在一些實例中，工程化的宿主細胞可以改良酶去甲烏藥堿6-o-甲基轉移酶的表達。去甲烏藥堿6-o-甲基轉移酶是由6omt基因編碼。在一些實例中，去甲烏藥堿6-o-甲基轉移酶催化去甲烏藥堿→烏藥堿的反應，如在圖17中所提及。在其他實例中，去甲烏藥堿6-o-甲基轉移酶催化全去甲勞丹堿→3’羥基烏藥堿的反應，以及本文詳述的其他反應，例如在圖18中所提供的那些反應。另外，工程化的宿主細胞可以被修飾以在工程化的宿主細胞中包括6omt基因的組成型表達。另外或或者，工程化的宿主細胞可以被修飾以在工程化的宿主細胞中以合成方式調節(jié)6omt基因的表達。在實例中，工程化的宿主細胞可以被修飾以并入6omt基因的一個或多個拷貝或額外拷貝。另外或或者，工程化的宿主細胞可以被修飾以在工程化的宿主細胞內中引入用于過表達6omt基因的強啟動子元件。6omt基因可以源自罌粟、黃花唐松草、日本黃連或另一物種。在一些實例中，6omt基因與天然存在基因可以為100％類似。
[cnmt]在一些實例中，工程化的宿主細胞可以改良酶烏藥堿-n-甲基轉移酶的表達。烏藥堿-n-甲基轉移酶是由cnmt基因編碼。在一些實例中，烏藥堿-n-甲基轉移酶催化烏藥堿→n-甲基烏藥堿的反應，如在圖17中所提及。在其他實例中，烏藥堿-n-甲基轉移酶可以催化3’羥基烏藥堿→3’羥基-n-甲基烏藥堿的反應。在其他實例中，烏藥堿-n-甲基轉移酶可以催化本文詳述的其他反應，例如在圖18中所提供的那些反應。另外，工程化的宿主細胞可以被修飾以在工程化的宿主細胞中包括cnmt基因的組成型表達。另外或或者，工程化的宿主細胞可以被修飾以在工程化的宿主細胞中以合成方式調節(jié)cnmt基因的表達。在實例中，工程化的宿主細胞可以被修飾以并入cnmt基因的一個或多個拷貝或額外拷貝。另外或或者，工程化的宿主細胞可以被修飾以在工程化的宿主細胞內中引入用于過表達cnmt基因的強啟動子元件。cnmt基因可以源自罌粟、黃花唐松草、日本黃連或另一物種。在一些實例中，cnmt基因與天然存在基因可以為100％類似。
[4’omt]在一些實例中，工程化的宿主細胞可以改良酶4’-o-甲基轉移酶的表達。4’-o-甲基轉移酶是由4’omt基因編碼。在一些實例中，4’-o-甲基轉移酶催化3’-羥基-n-甲基烏藥堿→牛心果堿的反應，如在圖17中所提及。在其他實例中，4’-o-甲基轉移酶催化本文詳述的其他反應，例如在圖18中所提供的那些反應。另外，工程化的宿主細胞可以被修飾以在工程化的宿主細胞中包括4’omt基因的組成型表達。另外或或者，工程化的宿主細胞可以被修飾以在工程化的宿主細胞中以合成方式調節(jié)4’omt基因的表達。在實例中，工程化的宿主細胞可以被修飾以并入4’omt基因的一個或多個拷貝或額外拷貝。另外或或者，工程化的宿主細胞可以被修飾以在工程化的宿主細胞內中引入用于過表達4’omt基因的強啟動子元件。4’omt基因可以源自罌粟、黃花唐松草、日本黃連或另一物種。在一些實例中，4’omt基因與天然存在基因可以為100％類似。
[cyp80b1]在一些實例中，工程化的宿主細胞可以改良酶細胞色素p45080b1的表達。細胞色素p45080b1是由cyp80b1基因編碼。在實例中，細胞色素p45080b1催化n-甲基烏藥堿→3’-羥基-n-甲基烏藥堿的反應，如在圖17中所提及。工程化的宿主細胞可以被修飾以在工程化的宿主細胞中包括細胞色素p45080b1基因的組成型表達。另外或或者，工程化的宿主細胞可以被修飾以在工程化的宿主細胞中以合成方式調節(jié)細胞色素p45080b1基因的表達。在實例中，工程化的宿主細胞可以被修飾以并入細胞色素p45080b1基因的一個或多個拷貝或額外拷貝。另外或或者，工程化的宿主細胞可以被修飾以在工程化的宿主細胞內中引入用于過表達細胞色素p45080b1基因的強啟動子元件。在一些情形下，cyp80b1基因可以進行密碼子優(yōu)化以在釀酒酵母中表達。細胞色素p45080b1基因可以源自罌粟、花菱草、黃花唐松草或另一物種。在一些實例中，p45080b1基因與天然存在基因可以為77％類似。
[ptps]在一些實例中，工程化的宿主細胞可以改良酶6-丙酮酰基四氫生物喋呤(ptp)合成酶的表達。丙酮?；臍渖镟┻屎铣擅甘怯蓀tps基因編碼。在一些實例中，6-丙酮?；臍渖镟┻屎铣擅复呋湫锣┻嗜姿帷鷓tp的反應，如在圖19中所提及。工程化的宿主細胞可以被修飾以在工程化的宿主細胞中包括ptps基因的組成型表達。另外或或者，工程化的宿主細胞可以被修飾以在工程化的宿主細胞中以合成方式調節(jié)ptps基因的表達。在實例中，工程化的宿主細胞可以被修飾以并入ptps基因的一個或多個拷貝或額外拷貝。另外或或者，工程化的宿主細胞可以被修飾以在工程化的宿主細胞內中引入用于過表達ptps基因的強啟動子元件。在一些情形下，ptps基因可以進行密碼子優(yōu)化以在釀酒酵母中表達。ptps基因可以源自褐鼠、智人、小家鼠或另一物種。在一些實例中，ptps基因與天然存在基因可以為80％類似。
[sepr]在一些實例中，工程化的宿主細胞可以改良酶墨蝶蛉還原酶的表達。墨蝶蛉還原酶是由sepr基因編碼。在一些實例中，墨蝶蛉還原酶催化ptp→bh4的反應，如在圖19中所提及。工程化的宿主細胞可以被修飾以在工程化的宿主細胞中包括sepr基因的組成型表達。另外或或者，工程化的宿主細胞可以被修飾以在工程化的宿主細胞中以合成方式調節(jié)sepr基因的表達。在實例中，工程化的宿主細胞可以被修飾以并入sepr基因的一個或多個拷貝或額外拷貝。另外或或者，工程化的宿主細胞可以被修飾以在工程化的宿主細胞內中引入用于過表達sepr基因的強啟動子元件。在一些情形下，sepr基因可以進行密碼子優(yōu)化以在釀酒酵母中表達。sepr基因可以源自褐鼠、智人、小家鼠或另一物種。在一些實例中，sepr基因與天然存在基因可以為72％類似。
[pcd]在一些實例中，工程化的宿主細胞可以改良酶4a-羥基四氫生物喋呤(喋呤-4α-甲醇胺)脫水酶的表達。4a-羥基四氫生物喋呤脫水酶是由pcd基因編碼。在一些實例中，4a-羥基四氫生物喋呤脫水酶催化4a-羥基四氫生物喋呤→h2o+醌類二氫喋啶的反應，如在圖19中所提及。工程化的宿主細胞可以被修飾以在工程化的宿主細胞中包括pcd基因的組成型表達。另外或或者，工程化的宿主細胞可以被修飾以在工程化的宿主細胞中以合成方式調節(jié)pcd基因的表達。在實例中，工程化的宿主細胞可以被修飾以并入pcd基因的一個或多個拷貝或額外拷貝。另外或或者，工程化的宿主細胞可以被修飾以在工程化的宿主細胞內中引入用于過表達pcd基因的強啟動子元件。在一些情形下，pcd基因可以進行密碼子優(yōu)化以在釀酒酵母中表達。pcd基因可以源自褐鼠、智人、小家鼠或另一物種。在一些實例中，pcd基因與天然存在基因可以為79％類似。
[qdhpr]在一些實例中，工程化的宿主細胞可以改良酶醌類二氫喋啶還原酶的表達。醌類二氫喋啶還原酶是由qdhpr基因編碼。在一些實例中，醌類二氫喋啶還原酶催化醌類二氫喋啶→bh4的反應，如在圖19中所提及。工程化的宿主細胞可以被修飾以在工程化的宿主細胞中包括qdhpr基因的組成型表達。另外或或者，工程化的宿主細胞可以被修飾以在工程化的宿主細胞中以合成方式調節(jié)qdhpr基因的表達。在實例中，工程化的宿主細胞可以被修飾以并入qdhpr基因的一個或多個拷貝或額外拷貝。另外或或者，工程化的宿主細胞可以被修飾以在工程化的宿主細胞內中引入用于過表達qdhpr基因的強啟動子元件。在一些情形下，qdhpr基因可以進行密碼子優(yōu)化以在釀酒酵母中表達。qdhpr基因可以源自褐鼠、智人、小家鼠或另一物種。在一些實例中，qdhpr基因與天然存在基因可以為75％類似。
[dhfr]在一些實例中，工程化的宿主細胞可以改良酶二氫葉酸還原酶的表達。二氫葉酸還原酶是由dhfr基因編碼。在一些實例中，二氫葉酸還原酶催化7,8-二氫生物喋呤(bh2)→5,6,7,8-四氫生物喋呤(bh4)的反應，如在圖19中所提及。此反應可用于回收bh4作為共底物以將酪氨酸轉化為l-dopa，如圖17中所圖解說明。工程化的宿主細胞可以被修飾以在工程化的宿主細胞中包括dhfr基因的組成型表達。另外或或者，工程化的宿主細胞可以被修飾以在工程化的宿主細胞中以合成方式調節(jié)dhfr基因的表達。在實例中，工程化的宿主細胞可以被修飾以并入dhfr基因的一個或多個拷貝或額外拷貝。另外或或者，工程化的宿主細胞可以被修飾以在工程化的宿主細胞內中引入用于過表達dhfr基因的強啟動子元件。在一些情形下，dhfr基因可以進行密碼子優(yōu)化以在釀酒酵母中表達。dhfr基因可以源自褐鼠、智人或另一物種。在一些實例中，dhfr基因與天然存在基因可以為77％類似。
[cpr]在一些實例中，工程化的宿主細胞可以改良酶細胞色素p450還原酶的表達。細胞色素p450還原酶催化的其他反應，例如在圖在整個申請中所描述的那些反應。工程化的宿主細胞可以被修飾以在工程化的宿主細胞中包括cpr基因的組成型表達。另外或或者，工程化的宿主細胞可以被修飾以在工程化的宿主細胞中以合成方式調節(jié)cpr基因的表達。在實例中，工程化的宿主細胞可以被修飾以并入cpr基因的一個或多個拷貝或額外拷貝。另外或或者，工程化的宿主細胞可以被修飾以在工程化的宿主細胞內中引入用于過表達cpr基因的強啟動子元件。cpr基因可以源自花菱草、罌粟、智人、釀酒酵母、擬南芥或另一物種。在一些實例中，cpr基因與天然存在基因可以為100％類似。
[bbe]在一些實例中，工程化的宿主細胞可以改良酶小檗堿橋酶的表達。小檗堿橋酶是由bbe基因編碼。在一些實例中，小檗堿橋酶催化(s)-牛心果堿→(s)-金黃紫堇堿的反應，如在圖20中所提及。圖20圖解說明根據(jù)本發(fā)明的實施方案將l-酪氨酸轉化為原小檗堿生物堿的生物合成方案。具體來說，圖20提供以下酶的使用：bbe，小檗堿橋酶；s9omt，金黃紫堇堿9-o-甲基轉移酶；cas，坎那丁合成酶；cpr，細胞色素p450還原酶；和stox，四氫原小檗堿氧化酶。工程化的宿主細胞可以被修飾以在工程化的宿主細胞中包括bbe基因的組成型表達。另外或或者，工程化的宿主細胞可以被修飾以在工程化的宿主細胞中以合成方式調節(jié)bbe基因的表達。在實例中，工程化的宿主細胞可以被修飾以并入bbe基因的一個或多個拷貝或額外拷貝。另外或或者，工程化的宿主細胞可以被修飾以在工程化的宿主細胞內中引入用于過表達bbe基因的強啟動子元件。bbe基因可以源自罌粟、薊罌粟、花菱草、刺小檗、粉綠色黃花唐松草亞種、日本黃連、罌粟屬或另一物種。在一些實例中，bbe基因與天然存在基因可以為99％類似。
[s9omt]在一些實例中，工程化的宿主細胞可以改良酶s-腺苷-l-甲硫氨酸:(s)-金黃紫堇堿9-o-甲基轉移酶的表達。s-腺苷-l-甲硫氨酸:(s)-金黃紫堇堿9-o-甲基轉移酶是由s9omt基因編碼。在一些實例中，s-腺苷-l-甲硫氨酸:(s)-金黃紫堇堿9-o-甲基轉移酶催化s-腺苷-l-甲硫氨酸+(s)-金黃紫堇堿→s-腺苷-l-高半胱氨酸+(s)-四氫非洲防己堿的反應，如在圖20中所提及。工程化的宿主細胞可以被修飾以在工程化的宿主細胞中包括s9omt基因的組成型表達。另外或或者，工程化的宿主細胞可以被修飾以在工程化的宿主細胞中以合成方式調節(jié)s9omt基因的表達。在實例中，工程化的宿主細胞可以被修飾以并入s9omt基因的一個或多個拷貝或額外拷貝。另外或或者，工程化的宿主細胞可以被修飾以在工程化的宿主細胞內中引入用于過表達s9omt基因的強啟動子元件。在一些情形下，s9omt基因可以進行密碼子優(yōu)化以在釀酒酵母中表達。s9omt基因可以源自粉綠色黃花唐松草亞種、日本黃連、黃連、罌粟、唐松草屬、黃連屬、罌粟屬或另一物種。在一些實例中，s9omt基因與天然存在基因可以為100％類似。在實例中，s9omt基因與天然存在基因可以為80％類似。
[cas]在一些實例中，工程化的宿主細胞可以改良酶(s)-坎那丁合成酶的表達。(s)-坎那丁合成酶是由cas基因編碼。在一些實例中，(s)-坎那丁合成酶催化(s)-四氫非洲防己堿→(s)-坎那丁的反應，如在圖20中所提及。工程化的宿主細胞可以被修飾以在工程化的宿主細胞中表達cas基因。工程化的宿主細胞可以被修飾以在工程化的宿主細胞中包括cas基因的組成型表達。另外或或者，工程化的宿主細胞可以被修飾以在工程化的宿主細胞中以合成方式調節(jié)cas基因的表達。在實例中，工程化的宿主細胞可以被修飾以并入cas基因的一個或多個拷貝或額外拷貝。另外或或者，工程化的宿主細胞可以被修飾以在工程化的宿主細胞內中引入用于過表達cas基因的強啟動子元件。cas基因可以源自粉綠色黃花唐松草亞種、日本黃連、唐松草屬、黃連屬或另一物種。在一些實例中，cas基因與天然存在基因可以為100％類似。
[tnmt]在一些實例中，工程化的宿主細胞可以改良酶四氫原小檗堿-n-甲基轉移酶的表達。四氫原小檗堿-n-甲基轉移酶是由tnmt基因編碼。在一些實例中，四氫原小檗堿-n-甲基轉移酶催化坎那丁→n-甲基坎那丁的反應，如在圖21中所提及。圖21圖解說明根據(jù)本發(fā)明的實施方案將l-酪氨酸轉化為諾斯卡品、類諾斯卡品和苯酞異喹啉的生物合成方案。具體來說，圖21提供以下酶的使用：bbe，小檗堿橋酶；s9omt，金黃紫堇堿9-o-甲基轉移酶；cas，坎那丁合成酶；cpr，細胞色素p450還原酶；tnmt，四氫原小檗堿順式-n-甲基轉移酶；cyp82y1，n-甲基坎那丁1-羥化酶；cyp82x2，1-羥基-n-甲基坎那丁13-羥化酶；at1，1,13-二羥基-n-甲基坎那丁13-o-乙酰基轉移酶；cyp82x1，4'-o-去甲基-3-o-乙?；浰趭W辛合成酶；cxe1，那可汀半縮醛合成酶；nos(或sdr1)，諾斯卡品合成酶；mt2，罌粟殼堿-4'-o-甲基轉移酶1；mt3，罌粟殼堿-4'-o-甲基轉移酶2；和6omt，6-o-甲基轉移酶。
在其他實例中，四氫原小檗堿-n-甲基轉移酶催化刺罌粟堿→順式-n-甲基刺罌粟堿的反應，如在圖22中所提及。圖22圖解說明根據(jù)本發(fā)明的實施方案將l-酪氨酸轉化為血根堿和苯啡啶生物堿的生物合成方案。具體來說，圖22提供以下酶的使用：bbe，小檗堿橋酶；cfs，碎葉紫堇堿合成酶；sts，刺罌粟堿合成酶；tnmt，四氫小檗堿n-甲基轉移酶；msh，順式-n-甲基刺罌粟堿14-羥化酶；p6h，原鴉片堿6-羥化酶；和dbox，二氫苯并菲啶氧化酶。工程化的宿主細胞可以被修飾以在工程化的宿主細胞中包括tnmt基因的組成型表達。另外或或者，工程化的宿主細胞可以被修飾以在工程化的宿主細胞中以合成方式調節(jié)tnmt基因的表達。在實例中，工程化的宿主細胞可以被修飾以并入tnmt基因的一個或多個拷貝或額外拷貝。另外或或者，工程化的宿主細胞可以被修飾以在工程化的宿主細胞內中引入用于過表達tnmt基因的強啟動子元件。在一些情形下，tnmt基因可以進行密碼子優(yōu)化以在釀酒酵母中表達。tnmt基因可以源自罌粟、花菱草、大紅罌粟、薊罌粟或另一物種。在一些實例中，tnmt基因與天然存在基因可以為100％類似。在實例中，tnmt基因與天然存在基因可以為81％類似。
[cyp82y1]在一些實例中，工程化的宿主細胞可以改良酶n-甲基坎那丁1-羥化酶的表達。n-甲基坎那丁1-羥化酶是由cyp82y1基因編碼。在一些實例中，n-甲基坎那丁1-羥化酶催化n-甲基坎那丁→1-羥基-n-甲基坎那丁的反應，如在圖21中所提及。工程化的宿主細胞可以被修飾以在工程化的宿主細胞中包括cyp82y1基因的組成型表達。另外或或者，工程化的宿主細胞可以被修飾以在工程化的宿主細胞中以合成方式調節(jié)cyp82y1基因的表達。在實例中，工程化的宿主細胞可以被修飾以并入cyp82y1基因的一個或多個拷貝或額外拷貝。另外或或者，工程化的宿主細胞可以被修飾以在工程化的宿主細胞內中引入用于過表達cyp82y1基因的強啟動子元件。在一些情形下，cyp82y1基因可以進行密碼子優(yōu)化以在釀酒酵母中表達。在一些實例中，cyp82y1可以在n-端被修飾。cyp82y1基因可以源自罌粟、罌粟屬、沙生車前、異葉蛇根草、北美荷包藤、白毛茛、異葉風罌粟、角茴香屬(hypecoum)或另一物種。在一些實例中，cyp82y1基因與天然存在基因可以為70-78％類似。
[cyp82x2]在一些實例中，工程化的宿主細胞可以改良酶1-羥基-n-甲基坎那丁13-羥化酶的表達。1-羥基-n-甲基坎那丁13-羥化酶是由cyp82x2基因編碼。在一些實例中，1-羥基-n-甲基坎那丁13-羥化酶催化1-羥基-n-甲基坎那丁→1-羥基-n-甲基左旋蛇果黃堇堿(也就是1,13-二羥基-n-甲基坎那丁)的反應，如在圖21中所提及。工程化的宿主細胞可以被修飾以在工程化的宿主細胞中包括cyp82x2基因的組成型表達。另外或或者，工程化的宿主細胞可以被修飾以在工程化的宿主細胞中以合成方式調節(jié)cyp82x2基因的表達。在實例中，工程化的宿主細胞可以被修飾以并入cyp82x2基因的一個或多個拷貝或額外拷貝。另外或或者，工程化的宿主細胞可以被修飾以在工程化的宿主細胞內中引入用于過表達cyp82x2基因的強啟動子元件。在一些情形下，cyp82x2基因可以進行密碼子優(yōu)化以在釀酒酵母中表達。在一些實例中，cyp82x2可以在n-端被修飾。cyp82x2基因可以源自罌粟、罌粟屬、沙生車前、異葉蛇根草、北美荷包藤、白毛茛、異葉風罌粟、扭果紫金龍、黃海罌粟、月桂小檗、甜菜、紫堇屬、球果紫堇屬、紫金龍屬或另一物種。在一些實例中，cyp82x2基因與天然存在基因可以為70-77％類似。在其他實例中，cyp82x2基因可以經歷n-端工程化。在實例中，n-端工程化可以包括n-端截短。
[cyp82x1]在一些實例中，工程化的宿主細胞可以改良酶4’-o-去甲基-3-o-乙酰基罌粟奧辛合成酶的表達。4’-o-去甲基-3-o-乙?；浰趭W辛合成酶是由cyp82x1基因編碼。在一些實例中，4’-o-去甲基-3-o-乙?；浰趭W辛合成酶催化1-羥基-13-o-乙酰基-n-甲基坎那丁→4’-o-去甲基-3-o-乙?；浰趭W辛的反應，如在圖21中所提及。另外，cyp82x1催化1-羥基-n-甲基坎那丁→4’-o-去甲基馬克蘭特醛的反應。工程化的宿主細胞可以被修飾以在工程化的宿主細胞中包括cyp82x1基因的組成型表達。另外或或者，工程化的宿主細胞可以被修飾以在工程化的宿主細胞中以合成方式調節(jié)cyp82x1基因的表達。在實例中，工程化的宿主細胞可以被修飾以并入cyp82x1基因的一個或多個拷貝或額外拷貝。另外或或者，工程化的宿主細胞可以被修飾以在工程化的宿主細胞內中引入用于過表達cyp82x1基因的強啟動子元件。在一些情形下，cyp82x1基因可以進行密碼子優(yōu)化以在釀酒酵母中表達。在一些實例中，cyp82x1可以在n-端被修飾。cyp82x1基因可以源自罌粟、罌粟屬、沙生車前、異葉蛇根草、北美荷包藤、白毛茛、異葉風罌粟、角茴香屬或另一物種。在一些實例中，cyp82x1基因與天然存在基因可以為71-77％類似。在其他實例中，cyp82x1基因可以經歷n-端工程化。在實例中，n-端工程化可以包括n-端截短。
[mt2和mt3]在一些實例中，工程化的宿主細胞可以改良酶罌粟殼堿4’-o-甲基化酶的表達。罌粟殼堿4’-o-甲基化酶是通過由mt2和mt3基因編碼的o-甲基轉移酶單體形成的的異二聚體。在一些實例中，罌粟殼堿4’-o-甲基化酶催化罌粟殼堿→諾斯卡品的反應，如在圖2中所提及。另外，罌粟殼堿4’-o-甲基化酶催化罌粟殼堿半縮醛→那可汀半縮醛和4’-o-去甲基-3-o-乙?；浰趭W辛→3-o-乙酰基罌粟奧辛的反應。工程化的宿主細胞可以被修飾以在工程化的宿主細胞中包括mt2和mt3基因的組成型表達。另外或或者，工程化的宿主細胞可以被修飾以在工程化的宿主細胞中以合成方式調節(jié)mt2和mt3基因的表達。在實例中，工程化的宿主細胞可以被修飾以并入mt2和mt3基因的一個或多個拷貝或額外拷貝。另外或或者，工程化的宿主細胞可以被修飾以在工程化的宿主細胞內中引入用于過表達mt2和mt3基因的強啟動子元件。在一些情形下，mt2和mt3基因可以進行密碼子優(yōu)化以在釀酒酵母中表達。mt2和mt3基因可以源自罌粟、罌粟屬、小花球果紫堇、沙生車前、異葉蛇根草或另一物種。在一些實例中，mt2和mt3基因與天然存在基因分別可以為80％和79％類似。在一些實例中，可以用ps6omt取代mt3。
[at1]在一些實例中，工程化的宿主細胞可以改良酶1,13-二羥基-n-甲基坎那丁13-o乙?；D移酶的表達。1,13-二羥基-n-甲基坎那丁13-o乙?；D移酶是由at1基因編碼。在一些實例中，1,13-二羥基-n-甲基坎那丁13-o乙酰基轉移酶催化1,13-二羥基-n-甲基坎那丁→1-羥基-13-o-乙?；?n-甲基坎那丁的反應，如在圖2中所提及。圖2圖解說明根據(jù)本發(fā)明的實施方案將坎那丁轉化為諾斯卡品的生物合成方案。工程化的宿主細胞可以被修飾以在工程化的宿主細胞中包括at1基因的組成型表達。另外或或者，工程化的宿主細胞可以被修飾以在工程化的宿主細胞中以合成方式調節(jié)at1基因的表達。在實例中，工程化的宿主細胞可以被修飾以并入at1基因的一個或多個拷貝或額外拷貝。另外或或者，工程化的宿主細胞可以被修飾以在工程化的宿主細胞內中引入用于過表達at1基因的強啟動子元件。在一些情形下，at1基因可以進行密碼子優(yōu)化以在釀酒酵母中表達。at1基因可以源自罌粟、罌粟屬、沙生車前、異葉蛇根草、北美荷包藤、白毛茛、異葉風罌粟、細果角茴香、扭果紫金龍、黃海罌粟、月桂小檗、甜菜、紫堇屬、球果紫堇屬、紫金龍屬或另一物種。在一些實例中，at1基因與天然存在基因可以為81％類似。
[cxe1或cxe2]在一些實例中，工程化的宿主細胞可以改良酶那可汀半縮醛合成酶的表達。那可汀半縮醛合成酶是由cxe1基因編碼。由cxe2基因編碼的酶還可以用作那可汀半縮醛合成酶。在一些實例中，那可汀半縮醛合成酶催化4’-o-去甲基-3-o-乙?；浰趭W辛→罌粟殼堿半縮醛和3-o-乙?；浰趭W辛→那可汀半縮醛的反應，如在圖2中所提及。工程化的宿主細胞可以被修飾以在工程化的宿主細胞中包括cxe1或cxe2基因的組成型表達。另外或或者，工程化的宿主細胞可以被修飾以在工程化的宿主細胞中以合成方式調節(jié)cxe1或cxe2基因的表達。在實例中，工程化的宿主細胞可以被修飾以并入cxe1或cxe2基因的一個或多個拷貝或額外拷貝。另外或或者，工程化的宿主細胞可以被修飾以在工程化的宿主細胞內中引入用于過表達cxe1或cxe2基因的強啟動子元件。在一些情形下，cxe1或cxe2基因可以進行密碼子優(yōu)化以在釀酒酵母中表達。cxe1或cxe2基因可以源自罌粟、罌粟屬、沙生車前、異葉蛇根草、北美荷包藤、白毛茛、異葉風罌粟、細果角茴香、扭果紫金龍、黃海罌粟、月桂小檗、甜菜、紫堇屬、球果紫堇屬、紫金龍屬或另一物種。在一些實例中，cxe1基因或cxe2基因與天然存在基因可以為78％類似。
[sdr1]在一些實例中，工程化的宿主細胞可以改良酶諾斯卡品合成酶的表達。諾斯卡品合成酶是由sdr1基因編碼。在一些實例中，諾斯卡品合成酶催化罌粟殼堿半縮醛→罌粟殼堿的反應，如在圖2中所提及。另外，諾斯卡品合成酶催化那可汀半縮醛→諾斯卡品的反應。工程化的宿主細胞可以被修飾以在工程化的宿主細胞包括sdr1基因的組成型表達中。另外或或者，工程化的宿主細胞可以被修飾以在工程化的宿主細胞中以合成方式調節(jié)sdr1基因的表達。在實例中，工程化的宿主細胞可以被修飾以并入sdr1基因的一個或多個拷貝或額外拷貝。另外或或者，工程化的宿主細胞可以被修飾以在工程化的宿主細胞內中引入用于過表達sdr1基因的強啟動子元件。在一些情形下，sdr1基因可以進行密碼子優(yōu)化以在釀酒酵母中表達。sdr1基因可以源自罌粟、罌粟屬、沙生車前、異葉蛇根草、北美荷包藤、白毛茛、異葉風罌粟、細果角茴香、扭果紫金龍、黃海罌粟、月桂小檗、甜菜、紫堇屬、球果紫堇屬、紫金龍屬或另一物種。在一些實例中，sdr1基因與天然存在基因可以為79％類似。
上述基因的實例可在宿主細胞中從多個不同平臺表達，包括質粒(2μ，ars/cen)、yac或基因組。另外，上述基因序列的實例可以是天然的或密碼子被優(yōu)化的用于在所需異源宿主(例如釀酒酵母)中表達。
在實例中，工程化的非植物宿主細胞從坎那丁產生類諾斯卡品或其前體。在一些實例中，類諾斯卡品或其前體選自由以下組成的組：1-羥基-n-甲基坎那丁、n-甲基坎那丁、諾斯卡品、罌粟殼堿、那可汀半縮醛、4’-o-去甲基-3-o-乙酰基罌粟奧辛、罌粟殼堿半縮醛、n-甲基左旋蛇果黃堇堿、1,13-二羥基-n-甲基坎那丁、1-羥基-13-o-乙?；?n-甲基坎那丁、那可托林吉地、那可托林和1-羥基坎那丁。在其他實例中，細胞可以產生諾斯卡品。在一些實例中，細胞可以通過包含一種或多種選自由以下組成的組的諾斯卡品前體的合成路徑從坎那丁產生類諾斯卡品或其前體：(s)-n-甲基坎那丁、1-羥基-n-甲基坎那丁、1,13-二羥基-n-甲基坎那丁、1-羥基-13-o-乙?；?n-甲基坎那丁、4’-o-去甲基-3-o-乙酰基罌粟奧辛、罌粟殼堿半縮醛和罌粟殼堿。
在一些其他實例中，細胞可以包含一個或多個編碼一種或多種酶的異源編碼序列。在一些實施方案中，所述一個或多個異源編碼序列可以編碼四氫原小檗堿n-甲基轉移酶(tnmt)。在其他實例中，所述一個或多個異源編碼序列編碼n-甲基坎那丁1-羥化酶(cyp82y1)。在其他實例中，所述一個或多個異源編碼序列編碼1-羥基-n-甲基坎那丁13-羥化酶(cyp82x2)。另外，所述一個或多個異源編碼序列可以編碼1,13-二羥基-n-甲基坎那丁13-o乙酰基轉移酶(psat1)。在一些實例中，所述一個或多個異源編碼序列編碼4’-o-去甲基-3-乙?；浰趭W辛合成酶(cyp82x1)。另外，在一些實例中，所述一個或多個異源編碼序列可以編碼那可汀半縮醛合成酶(pscxe1)。
另外，所述一個或多個異源編碼序列可以編碼諾斯卡品合成酶(pssdr1)。在其他實例中，所述一個或多個異源編碼序列可以編碼一種或多種選自psmt3和ps6omt的酶。另外，所述一個或多個異源編碼序列可以編碼酶cyp82y1、cyp82x1和cyp82x2。在一些實施方案中，細胞可以包含用于cpr酶的異源編碼序列。在一些實例中，cpr酶是atr1。在其他實例中，所述一個或多個異源編碼序列是從低拷貝構建體表達。在其他實例中，細胞可能缺乏一種或多種選自psmt3、ps6omt、psmt2和cyp82y1的酶。
在一些情形下，細胞可以產生類諾斯卡品且可以包含一個或多個用于一種或多種選自以下的酶的異源編碼序列：p450、鹵化酶、糖基化酶、甲基轉移酶、乙酰基轉移酶、短鏈脫氫酶、羧基酯酶和異戊二烯基轉移酶。在一些實例中，所述一個或多個異源編碼序列可以源自選自罌粟和花菱草的來源生物體。在一些實例中，細胞是真核細胞。在一些情形下，真核細胞是酵母細胞。在其他實例中，酵母細胞是釀酒酵母細胞。另外，在一些情形下，細胞包含一種或多種源自兩種或更多種與所述細胞不同的來源生物體的酶。在其他情形下，細胞包含多個各自編碼酶且各自源自與所述細胞不同的來源生物體的異源編碼序列。另外，細胞可以包含兩個或更多個各自編碼tnmt酶的異源編碼序列。另外，所述兩個或更多個各自編碼tnmt的異源編碼序列可以源自不同的來源生物體。在一些實施方案中，來源生物體可以選自罌粟和花菱草。
在一些其他實例中，所述一個或多個異源編碼序列可以編碼一種或多種突變酶。另外，一種或多種突變酶可以是cyp82y1n-端突變體。在其他實例中，細胞可以包含一種或多種用于所述一個或多個異源編碼序列的啟動子。另外，在一些情形下，所述一種或多種啟動子包含強啟動子。在實例中，啟動子可以選自由以下組成的組：hxt7、adh1、pgk1、tpi1、pyk1、tef1、gal1、cyc1、gpd。另外，在一些實例中，所述一個或多個異源編碼序列編碼cyp82y1或cyp82y1突變并且所述一種或多種啟動子包含hxt7。在一些情形下，細胞可以產生1-羥基-n-甲基坎那丁或1-羥基坎那丁。另外，在一些實例中，所述一個或多個異源編碼序列編碼cyp82x2或cyp82x2突變體并且所述一種或多種啟動子包含hxt7。
在一些其他情形下，細胞可以產生1,13-二羥基-n-甲基坎那丁。另外，所述一個或多個異源編碼序列可以編碼cyp82x2或cyp82x2突變體并且所述一種或多種啟動子包含pgk1和gpd。另外，細胞可以產生n-甲基-左旋蛇果黃堇堿。所述一個或多個異源編碼序列可以編碼cyp82x1或cyp82x1突變體并且所述一種或多種啟動子包含hxt7。另外，細胞可以產生4’-o-去甲基-2-o-乙?；浰趭W辛，或細胞可以產生那可托林和那可托林吉地。在其他實例中，細胞可以包含一種或多種選自以下的植物蛋白伴侶：結合性免疫球蛋白(bip)、dnaj蛋白、葡萄糖調節(jié)蛋白(grp)94、結合蛋白(bip)、蛋白二硫化物異構酶(pdi)、親環(huán)素和鈣聯(lián)蛋白。
在實例中，細胞包含所述一個或多個異源編碼序列的多個拷貝。在一些實例中，所述一個或多個異源編碼序列編碼一種或多種選自以下的酶：cyp82y1、cyp82x2、cyp82x1、pscxe1、pssdr1和psmt3。另外，在一些實例中，所述一個或多個異源編碼序列的多個拷貝源自兩種或更多種與細胞不同的來源生物體。在其他實例中，所述酶中的一種或多種是在空間上定位到酵母細胞中的區(qū)室，其中所述區(qū)室是選自線粒體、內質網(er)、高爾基體、液泡、細胞核、質膜、過氧化物酶體和周質。另外，在實例中，所述一種或多種酶是在空間上定位到酵母細胞中的區(qū)室的外部。另外，在實例中，所述一種或多種酶是在空間上定位到酵母細胞中的區(qū)室的內部。
在其他實例中，細胞可以從全去甲勞丹堿產生諾斯卡品生物堿。另外，細胞可以包含一個或多個編碼一種或多種選自以下的酶的異源編碼序列：tnmt、psat1、cyp82x1、pscxe1、pssdr1、psmt3、cyp82y1、cyp82x1、s9omt、psmt2、ps6omt、ps4’omt、pscnmt、psbbe、cpr1和cyp719a。另外，細胞可以從yac表達tnmt、psat1、cyp82x1、pscxe1、pssdr1、psmt2。另外，細胞可以從低拷貝質粒表達cyp82y1和cyp82x1。在其他實例中，細胞可以從高拷貝質粒表達s9omt。在一些情形下，ps6omt、ps4’omt、pscnmt、psbbe、cpr1和cyp719a是通過染色體整合于細胞中。
在一些實例中，提供制備類諾斯卡品或其前體的方法，其包含在適于蛋白產生的條件下培養(yǎng)如權利要求1到56中任一項的宿主細胞以產生類諾斯卡品或其前體。在一些情形下，所述方法可以進一步包含從細胞培養(yǎng)物中回收類諾斯卡品或其前體。在其他實例中，所述方法可以進一步包含在足以從類諾斯卡品產生bia的條件下培養(yǎng)細胞；和從細胞培養(yǎng)物中回收bia。在其他實例中，所述方法可以進一步包含向細胞培養(yǎng)物中添加起始化合物。在一些情形下，起始化合物是坎那丁。在一些情形下，起始化合物是全去甲勞丹堿。另外，在一些情形下，起始化合物是酪氨酸或酪氨酸類似物。在其他實例中，所述方法可以進一步包含向細胞培養(yǎng)物中添加生長原料。
盡管已出于理解清楚的目的借助圖解說明和實例相當詳細地描述了上述發(fā)明，但本領域技術人員鑒于本發(fā)明的教示易于明了可以對其作出某些改變和修飾，這并不背離隨附權利要求書的精神或范圍。
因此，前述內容僅闡釋本發(fā)明的原理。應了解本領域技術人員將能設想出各種盡管未明確描述或顯示于本文中但體現(xiàn)本發(fā)明的原理且包括在本發(fā)明的精神和范圍內的布置。此外，本文所敘述的所有實例和條件性語言都旨在協(xié)助讀者理解本發(fā)明的原理和由發(fā)明人貢獻的概念以促進所述領域，且應視為對此類明確敘述的實例和條件無限制。此外，本文中敘述本發(fā)明的原理、方面和實施方案以及其特定實例的所有陳述都旨在涵蓋其結構和功能等效形式。另外，此類等效形式包括目前已知的等效形式和未來將發(fā)展的等效形式(也就是無論結構如何都實施相同功能的所發(fā)展的任何要素)。因此，本發(fā)明的范圍不打算限于本文所顯示和描述的例示性實施方案。而是，通過隨附權利要求書體現(xiàn)本發(fā)明的范圍和精神。
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