[技術(shù)領(lǐng)域]

本發(fā)明涉及用于由多能干細(xì)胞制備視網(wǎng)膜細(xì)胞或視網(wǎng)膜組織的方法。

[

背景技術(shù)：
]

作為由多能干細(xì)胞制備諸如視網(wǎng)膜組織的神經(jīng)組織的方法，已經(jīng)報(bào)道了用于制備神經(jīng)組織的方法，所述方法包括在無血清培養(yǎng)基中形成均勻的多能干細(xì)胞聚集體，懸浮培養(yǎng)所述聚集體，酌情在存在分化誘導(dǎo)因子等的條件下在用于分化誘導(dǎo)的培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)所述聚集體，從而誘導(dǎo)多能干細(xì)胞向目的神經(jīng)細(xì)胞的分化(專利文獻(xiàn)1和非專利文獻(xiàn)1)。例如，已知用于由多能干細(xì)胞得到多層視網(wǎng)膜組織的方法(非專利文獻(xiàn)2和專利文獻(xiàn)2)，和用于獲得多層視網(wǎng)膜組織的方法，所述方法包括在含有wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制物質(zhì)的無血清培養(yǎng)基中形成均勻的多能干細(xì)胞聚集體，然后將其在存在基膜制劑的條件下懸浮培養(yǎng)，然后將其在含血清培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)(非專利文獻(xiàn)3和專利文獻(xiàn)3)。另外，還已經(jīng)報(bào)道了用于誘導(dǎo)多能干細(xì)胞向下丘腦組織分化的方法(專利文獻(xiàn)4和非專利文獻(xiàn)4)和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞向神經(jīng)前體細(xì)胞分化的方法(非專利文獻(xiàn)5和6)。

在存在飼養(yǎng)細(xì)胞的條件下并且加入用于維持未分化狀態(tài)的因子，培養(yǎng)作為這些制備方法的起始材料的多能干細(xì)胞，特別是在靈長(zhǎng)類多能干細(xì)胞的情形中，從而維持未分化狀態(tài)。近年來，在維持未分化狀態(tài)的培養(yǎng)中已經(jīng)取得了一些改進(jìn)，并且已經(jīng)報(bào)道了在不存在飼養(yǎng)細(xì)胞(無飼養(yǎng)細(xì)胞)的條件下加入用于維持未分化狀態(tài)的因子培養(yǎng)靈長(zhǎng)類多能干細(xì)胞的方法(非專利文獻(xiàn)7，非專利文獻(xiàn)8和非專利文獻(xiàn)9)。需要使用通過該方法進(jìn)行無飼養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)的多能干細(xì)胞作為起始材料的制備視網(wǎng)膜細(xì)胞或視網(wǎng)膜組織的穩(wěn)定方法。

[文獻(xiàn)列表]

[專利文獻(xiàn)]

[專利文獻(xiàn)1]wo2009/148170

[專利文獻(xiàn)2]wo2011/055855

[專利文獻(xiàn)3]wo2013/077425

[專利文獻(xiàn)4]wo2013/065763

[非專利文獻(xiàn)]

[非專利文獻(xiàn)1]cellstemcell，3，519-32(2008)

[非專利文獻(xiàn)2]nature，472，51-56(2011)

[非專利文獻(xiàn)3]cellstemcell，10(6)，771-775(2012)

[非專利文獻(xiàn)4]nature，480，57-62(2011)

[非專利文獻(xiàn)5]naturebiotechnology，27(3)，275-80(2009)

[非專利文獻(xiàn)6]procnatlacadsciusa，110(50)，20284-9(2013)

[非專利文獻(xiàn)7]naturemethods，8，424-429(2011)

[非專利文獻(xiàn)8]scientificreports，4，3594(2014)

[非專利文獻(xiàn)9]invitrocelldevbiolanim.，46，247-58(2010)

[發(fā)明概述]

[發(fā)明要解決的問題]

本發(fā)明要解決的問題是提供一種用于由在不存在飼養(yǎng)細(xì)胞的條件下制備或培養(yǎng)的保持未分化狀態(tài)的多能干細(xì)胞制備視網(wǎng)膜細(xì)胞或視網(wǎng)膜組織的方法。

[解決問題的方式]

本發(fā)明人已經(jīng)進(jìn)行了深入的研究，嘗試解決前述問題，并且發(fā)現(xiàn)通過在不存在飼養(yǎng)細(xì)胞的條件下培養(yǎng)多能干細(xì)胞(特別是人ips細(xì)胞)同時(shí)維持未分化狀態(tài)，并且將得到的多能干細(xì)胞在含有sonichedgehog信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活物質(zhì)的培養(yǎng)基中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，從而形成細(xì)胞聚集體，可以高效地形成具有光滑表面和致密內(nèi)部并且維持未分化狀態(tài)的球形細(xì)胞聚集體。另外，本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，通過使用這種高質(zhì)量的細(xì)胞聚集體，可以高效地誘導(dǎo)視網(wǎng)膜細(xì)胞或視網(wǎng)膜組織，這導(dǎo)致了本發(fā)明的完成。

即，本發(fā)明涉及下述各項(xiàng)：

[1]用于制備視網(wǎng)膜細(xì)胞或視網(wǎng)膜組織的方法，所述方法包括下述步驟(1)-(3)：

(1)第一步，在不存在飼養(yǎng)細(xì)胞的條件下在含有用于維持未分化狀態(tài)的因子的培養(yǎng)基中培養(yǎng)人多能干細(xì)胞，

(2)第二步，在存在sonichedgehog信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活物質(zhì)的條件下懸浮培養(yǎng)第一步中得到的多能干細(xì)胞，從而形成細(xì)胞聚集體，和

(3)第三步，在存在bmp信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活物質(zhì)的條件下懸浮培養(yǎng)第二步中得到的聚集體，從而得到包含視網(wǎng)膜細(xì)胞或視網(wǎng)膜組織的聚集體。

[2][1]的制備方法，其中，在第二步中，將在第一步中得到的細(xì)胞分散，并且將分散的細(xì)胞進(jìn)行懸浮培養(yǎng)。

[3][1]或[2]的制備方法，其中所述用于維持未分化狀態(tài)的因子是fgf信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活物質(zhì)。

[4][3]的制備方法，其中所述fgf信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活物質(zhì)是bfgf。

[5][1]-[4]中任一項(xiàng)的制備方法，其中，在第二步中，所述培養(yǎng)基中所述sonichedgehog信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活物質(zhì)的濃度是與10nm至700nm的sag的sonichedgehog信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)活性相對(duì)應(yīng)的濃度。

[6][1]-[5]中任一項(xiàng)的制備方法，其中所述sonichedgehog信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活物質(zhì)是sag、purmorphamine或shh。

[7][1]-[6]中任一項(xiàng)的制備方法，其中所述bmp信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活物質(zhì)是選自由bmp2、bmp4、bmp7和gdf7組成的組的一種或多種蛋白。

[8][6]的制備方法，其中所述bmp信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活物質(zhì)是bmp4。

[9][1]-[8]中任一項(xiàng)的制備方法，其中，在第三步中，在第二步開始后第2天與第9天之間向所述培養(yǎng)基中添加所述bmp信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活物質(zhì)。

[10][1]-[9]中任一項(xiàng)的制備方法，其中，在第三步中，在包含濃度不超過與700nmsag的sonichedgehog信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)活性相對(duì)應(yīng)的濃度的sonichedgehog信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活物質(zhì)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述聚集體。

[11][1]-[10]中任一項(xiàng)的制備方法，其中第一步通過貼壁培養(yǎng)方法進(jìn)行。

[12][1]-[11]中任一項(xiàng)的制備方法，其中所述多能干細(xì)胞是誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞。

[13][1]-[12]中任一項(xiàng)的制備方法，其中在第二步中形成均勻的聚集體。

[14][1]-[13]中任一項(xiàng)的制備方法，其中在第三步中得到的聚集體包含一種或多種選自由下述各項(xiàng)組成的組的細(xì)胞：視網(wǎng)膜祖先細(xì)胞，神經(jīng)視網(wǎng)膜祖先細(xì)胞，感光前體細(xì)胞，感光細(xì)胞，視桿感光細(xì)胞，視錐感光細(xì)胞，水平細(xì)胞，無長(zhǎng)突細(xì)胞，中間神經(jīng)元，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞，和睫狀邊緣區(qū)細(xì)胞。

[15][1]-[14]中任一項(xiàng)的制備方法，其中所述懸浮培養(yǎng)在不存在基膜制劑的條件下進(jìn)行。

[16]用于評(píng)價(jià)測(cè)試物質(zhì)的毒性或功效的試劑，所述試劑包含通過[1]-[15]中任一項(xiàng)的方法制備的視網(wǎng)膜細(xì)胞或視網(wǎng)膜組織。

[17]用于評(píng)價(jià)測(cè)試物質(zhì)的毒性或功效的方法，所述方法包括使所述物質(zhì)與通過[1]-[15]中任一項(xiàng)的方法制備的視網(wǎng)膜細(xì)胞或視網(wǎng)膜組織接觸，并且檢測(cè)所述物質(zhì)對(duì)所述細(xì)胞或組織的影響。

[18]用于治療由于視網(wǎng)膜組織紊亂導(dǎo)致的疾病的藥物，其包含通過[1]-[15]中任一項(xiàng)的方法制備的視網(wǎng)膜細(xì)胞或視網(wǎng)膜組織。

[19][18]的藥物，其中所述視網(wǎng)膜細(xì)胞是視網(wǎng)膜祖先細(xì)胞和/或視網(wǎng)膜層專有的神經(jīng)元。

[20]用于治療由于視網(wǎng)膜組織紊亂導(dǎo)致的疾病的方法，所述方法包括向需要移植的受試者移植有效量的通過[1]-[15]中任一項(xiàng)的方法制備的視網(wǎng)膜細(xì)胞或視網(wǎng)膜組織。

[21]通過[1]-[15]中任一項(xiàng)的方法制備的視網(wǎng)膜細(xì)胞或視網(wǎng)膜組織，其用于治療由于視網(wǎng)膜組織紊亂導(dǎo)致的疾病。

[22]包含通過[1]-[15]中任一項(xiàng)的方法制備的視網(wǎng)膜細(xì)胞或視網(wǎng)膜組織作為活性成分的藥物組合物。

[發(fā)明效果]

按照本發(fā)明，可以由在不存在飼養(yǎng)細(xì)胞的條件下培養(yǎng)的多能干細(xì)胞高效地產(chǎn)生高質(zhì)量的細(xì)胞聚集體，以及視網(wǎng)膜細(xì)胞和視網(wǎng)膜組織。

[附圖簡(jiǎn)述]

圖1顯示比較例1和實(shí)施例1的培養(yǎng)條件以及聚集體的亮視野圖像(a-d)。

圖2顯示實(shí)施例1的培養(yǎng)條件以及聚集體針對(duì)視網(wǎng)膜組織標(biāo)記(chx10，rx)的免疫組織化學(xué)染色圖像(a-d)。

圖3顯示實(shí)施例2的培養(yǎng)條件和聚集體的亮視野圖像(a-d)。

圖4顯示實(shí)施例2的培養(yǎng)條件(無bmp4處理)以及定量聚集體形態(tài)水平的圖表。

圖5顯示實(shí)施例3的培養(yǎng)條件以及聚集體針對(duì)視網(wǎng)膜組織標(biāo)記(chx10，rx)的免疫組織化學(xué)染色圖像(a-d)。

圖6顯示在實(shí)施例4的培養(yǎng)條件下產(chǎn)生的視網(wǎng)膜組織針對(duì)視網(wǎng)膜組織標(biāo)記的免疫染色圖像。

圖7顯示在實(shí)施例5的培養(yǎng)條件下產(chǎn)生的視網(wǎng)膜組織針對(duì)視網(wǎng)膜組織標(biāo)記的免疫染色圖像。

圖8顯示在實(shí)施例6的培養(yǎng)條件下產(chǎn)生的聚集體的亮視野圖像(a-c)以及針對(duì)視網(wǎng)膜組織標(biāo)記(chx10)的免疫染色圖像(d-f)。

圖9顯示在實(shí)施例7的培養(yǎng)條件下產(chǎn)生的聚集體的亮視野圖像(a-d)以及針對(duì)視網(wǎng)膜組織標(biāo)記(chx10)的免疫染色圖像(e)。

圖10顯示在實(shí)施例8的培養(yǎng)條件下產(chǎn)生的聚集體的亮視野圖像(a，b)以及針對(duì)視網(wǎng)膜組織標(biāo)記(chxl0，rx)的免疫染色圖像(c，d)。

[實(shí)施方案描述]

1.定義

在本發(fā)明中，“干細(xì)胞”意指具有分化潛能和保持分化潛能的增殖能力(特別是自我更新的能力)的未分化的細(xì)胞。干細(xì)胞依據(jù)分化潛能包括多種亞群，諸如多能干細(xì)胞(pluripotentstemcell)，專能干細(xì)胞(multipotentstemcell)，單能干細(xì)胞等。多能干細(xì)胞是指能夠在體外培養(yǎng)并且具有分化成屬于三個(gè)胚層(外胚層、中胚層、內(nèi)胚層)和/或來源于胚外組織的組織的任意細(xì)胞譜系的潛能(多能性)的干細(xì)胞。專能干細(xì)胞意指具有分化成多種類型的組織或細(xì)胞但不是所有種類的組織或細(xì)胞的潛能的干細(xì)胞。單能干細(xì)胞意指具有分化成特定的組織或細(xì)胞的潛能的干細(xì)胞。

多能干細(xì)胞可以由受精卵、克隆胚胎、生殖干細(xì)胞、組織中的干細(xì)胞、體細(xì)胞等誘導(dǎo)。多能干細(xì)胞的實(shí)例包括胚胎干細(xì)胞(es細(xì)胞)，eg細(xì)胞(胚胎生殖細(xì)胞)，誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞(ips細(xì)胞)等。由間質(zhì)干細(xì)胞(msc)得到的muse細(xì)胞(多系分化應(yīng)激持久細(xì)胞(multi-lineagedifferentiatingstressenduringcell))和由生殖細(xì)胞(例如，睪丸)產(chǎn)生的gs細(xì)胞也包括在多能干細(xì)胞中。胚胎干細(xì)胞最先在1981年建立，并且自1989年起還已經(jīng)用于產(chǎn)生敲除小鼠。在1998年，建立了人胚胎干細(xì)胞，其也用于再生藥物?？梢酝ㄟ^在飼養(yǎng)細(xì)胞上或在含有l(wèi)if的培養(yǎng)基中培養(yǎng)內(nèi)細(xì)胞團(tuán)而產(chǎn)生es細(xì)胞。es細(xì)胞的制備方法記載在，例如，wo96/22362，wo02/101057，us5,843,780，us6,200,806，us6,280,718等中。胚胎干細(xì)胞可從給定的機(jī)構(gòu)得到，或可以購(gòu)買商購(gòu)產(chǎn)品。例如，人胚胎干細(xì)胞，khes-1，khes-2和khes-3，可從京都大學(xué)前沿醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院(kyotouniversity’sinstituteforfrontiermedicalsciences)得到。作為小鼠胚胎干細(xì)胞的eb5可從incorporatedadministrativeagencyriken得到，并且作為小鼠胚胎干細(xì)胞的d3細(xì)胞系可從atcc得到。

作為es細(xì)胞中的一種的核移植es細(xì)胞(ntes細(xì)胞)可以由通過將體細(xì)胞的細(xì)胞核移植到無核卵中產(chǎn)生的克隆胚胎建立。

eg細(xì)胞可以通過在含有mscf、lif和bfgf的培養(yǎng)基中培養(yǎng)原始生殖細(xì)胞而產(chǎn)生(cell，70：841-847，1992)。

本發(fā)明中的“誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞”是通過已知的方法等使體細(xì)胞重新編程而被誘導(dǎo)具有多能性的細(xì)胞。具體地，可以提及通過表達(dá)多種基因的組合使分化的體細(xì)胞(諸如成纖維細(xì)胞、外周血單核細(xì)胞等)重新編程而被誘導(dǎo)具有多能性的細(xì)胞，所述多種基因選自由包括下述各項(xiàng)的重新編程基因組成的組：oct3/4，sox2，klf4，myc(c-myc，n-myc，l-myc)，glisl，nanog，sall4，lin28，esrrb等。優(yōu)選的重新編程因子的組合的實(shí)例包括：(1)oct3/4，sox2，klf4，和myc(c-myc或l-myc)，和(2)oct3/4，sox2，klf4，lin28和l-myc(stemcells，2013；31：458-466)。

誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞由yamanaka等人在2006年在小鼠細(xì)胞中建立(cell，2006，126(4)，pp.663-676)。在2007年，還由人成纖維細(xì)胞建立了誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞，并且具有與胚胎干細(xì)胞相似的多能性和自我更新能力(cell，2007，131(5)，pp.861-872；science，2007，318(5858)，pp.1917-1920；nat.biotechnol.，2008，26(1)，pp.101-106)。除了基于通過基因表達(dá)的直接重新編程的制備方法之外，還可以通過添加化合物等由體細(xì)胞得到誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞(science，2013，341，pp.651-654)。

還可以獲得建立的誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞，并且，例如，由京都大學(xué)建立的人誘導(dǎo)的多能細(xì)胞系，諸如201b7細(xì)胞，201b7-ff細(xì)胞，253g1細(xì)胞，253g4細(xì)胞，1201c1細(xì)胞，1205d1細(xì)胞，1210b2細(xì)胞或1231a3細(xì)胞等可從京都大學(xué)和ipsacademiajapan，inc.獲得。作為建立的誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞，例如，由京都大學(xué)建立的ff-i01細(xì)胞和ff-i14細(xì)胞可從京都大學(xué)獲得。

盡管用于獲得誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞的體細(xì)胞沒有特別限制，但是可以提及組織來源的成纖維細(xì)胞、血液譜系細(xì)胞(例如，外周血單核細(xì)胞、t細(xì)胞)、肝細(xì)胞、胰腺細(xì)胞、腸上皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞等。

當(dāng)通過表達(dá)一些種類的基因進(jìn)行重新編程產(chǎn)生誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞時(shí)，對(duì)基因表達(dá)的方式?jīng)]有特別限制。前述方式的實(shí)例包括使用病毒載體(例如，反轉(zhuǎn)錄病毒載體，慢病毒載體，仙臺(tái)病毒(sendaivirus)載體，腺病毒載體，腺伴隨病毒載體)的感染法，使用質(zhì)粒載體(例如，質(zhì)粒載體，附加型載體)的基因轉(zhuǎn)移法(例如，磷酸鈣法，脂轉(zhuǎn)染法，retronectin法，電穿孔法)，使用rna載體的基因轉(zhuǎn)移法(例如，磷酸鈣法，脂轉(zhuǎn)染法，電穿孔法)，直接注射蛋白的方法等。

誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞可以在存在飼養(yǎng)細(xì)胞的條件下或在不存在飼養(yǎng)細(xì)胞的條件下(無飼養(yǎng)細(xì)胞)產(chǎn)生。當(dāng)在存在飼養(yǎng)細(xì)胞的條件下產(chǎn)生時(shí)，所述誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞可以在存在用于維持未分化狀態(tài)的因子的條件下通過已知的方法產(chǎn)生。盡管用于在不存在飼養(yǎng)細(xì)胞的條件下產(chǎn)生誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞的培養(yǎng)基沒有特別限制，但是可以使用已知的用于胚胎干細(xì)胞和/或誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞的維持培養(yǎng)基和用于在無飼養(yǎng)細(xì)胞的條件下建立誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞的培養(yǎng)基。用于在無飼養(yǎng)細(xì)胞的條件下建立誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞的培養(yǎng)基的實(shí)例包括無飼養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)基，諸如essential8培養(yǎng)基，tesr培養(yǎng)基，mtesr培養(yǎng)基，mtesr-e8培養(yǎng)基，stemfit培養(yǎng)基等。例如，可以在不存在飼養(yǎng)細(xì)胞的條件下，用仙臺(tái)病毒(sendaivirus)載體向體細(xì)胞中基因轉(zhuǎn)移oct3/4、sox2、klf4和myc4個(gè)因子而產(chǎn)生誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞。

用于本發(fā)明的多能干細(xì)胞優(yōu)選是es細(xì)胞或誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞，更優(yōu)選是誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞。

作為專能干細(xì)胞，可以提及組織干細(xì)胞(還稱為組織中的干細(xì)胞、組織特異性干細(xì)胞或體干細(xì)胞)，諸如造血干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞、視網(wǎng)膜干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞等。

可以例如，通過使用同源重組技術(shù)產(chǎn)生遺傳上修飾的多能干細(xì)胞。染色體上要被修飾的基因的實(shí)例包括細(xì)胞標(biāo)記基因、組織相容性抗原基因、與神經(jīng)細(xì)胞紊亂導(dǎo)致的疾病相關(guān)的基因等。染色體上的靶基因可以使用以下各項(xiàng)中記載的方法進(jìn)行修飾：manipulatingthemouseembryo，alaboratorymanual(操作小鼠胚胎，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè))，第二版，coldspringharborlaboratorypress(1994)；genetargeting，apracticalapproach(基因靶向，實(shí)踐方法)，irlpressatoxforduniversitypress(1993)；biomanualseries8，genetargeting，makingofmutantmouseusingescell(基因靶向，使用es細(xì)胞產(chǎn)生突變體小鼠)，yodoshaco.，ltd.(1995)；等等。

具體而言，例如，分離包含要被修飾的靶基因(例如，細(xì)胞標(biāo)記基因、組織相容性抗原基因、疾病相關(guān)的基因等)的基因組dna，并且使用該分離的基因組dna產(chǎn)生用于該靶基因同源重組的靶向載體。將所產(chǎn)生的靶向載體引入到干細(xì)胞中，并且選擇表現(xiàn)出在所述靶基因與所述靶向載體之間的同源重組的細(xì)胞，由此可以產(chǎn)生在染色體中具有所述修飾的基因的干細(xì)胞。

用于分離包含靶基因的基因組dna的方法的實(shí)例包括以下各項(xiàng)中記載的已知方法：molecularcloning，alaboratorymanual(分子克隆，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè))，第二版，coldspringharborlaboratorypress(1989)，currentprotocolsinmolecularbiology(現(xiàn)代分子生物學(xué)流程)，johnwiley&sons(1987-1997)等。包含靶基因的基因組基因也可以使用基因組dna文庫(kù)篩選系統(tǒng)(由genomesystems制造)、通用基因組步量試劑盒(universalgenomewalkerkits)(由clontech制造)等分離。也可以使用編碼靶蛋白的多核苷酸替代基因組dna。所述多核苷酸可以通過用pcr法擴(kuò)增相對(duì)應(yīng)的多核苷酸而得到。

用于靶基因同源重組的靶向載體的產(chǎn)生和同源重組子的有效選擇可以按照以下各項(xiàng)中記載的方法進(jìn)行：genetargeting，apracticalapproach(基因靶向，實(shí)踐方法)，irlpressatoxforduniversitypress(1993)；biomanualseries8，genetargeting，makingofmutantmouseusingescell(基因靶向，使用es細(xì)胞產(chǎn)生突變體小鼠)，yodoshaco.，ltd.(1995)；等等。作為所述靶向載體，可以使用替換類型或插入類型中的任一種。作為所述選擇方法，可以使用諸如陽(yáng)性選擇、啟動(dòng)子選擇、陰性選擇、聚腺苷酸(polya)選擇等的方法。

用于從所選的細(xì)胞系中選擇需要的同源重組子的方法的實(shí)例包括用于基因組dna的dna雜交法(southernhybridizationmethod)、pcr法等。

本發(fā)明中的“哺乳動(dòng)物”包括嚙齒類、有蹄類、食肉類、靈長(zhǎng)類動(dòng)物等。嚙齒類包括小鼠、大鼠、倉(cāng)鼠、豚鼠等。有蹄類包括豬、牛、山羊、馬、綿羊等、食肉類包括狗、貓等。本發(fā)明中的“靈長(zhǎng)類”是指屬于靈長(zhǎng)類的哺乳動(dòng)物，并且靈長(zhǎng)類包括原猴亞目(prosimian)，如狐猴(lemur)，懶猴(loris)，tupai等，和類人猿亞目(anthropoidea)，如猴，類人猿(ape)，人等。

用于本發(fā)明的多能干細(xì)胞是人多能干細(xì)胞，更優(yōu)選是人誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞(ips細(xì)胞)或人胚胎干細(xì)胞(es細(xì)胞)。

本發(fā)明中的“懸浮培養(yǎng)”或“懸浮培養(yǎng)法”是指在維持細(xì)胞或細(xì)胞聚集體懸浮在培養(yǎng)基中的狀態(tài)的同時(shí)進(jìn)行培養(yǎng)和進(jìn)行所述培養(yǎng)的方法。即，懸浮培養(yǎng)在細(xì)胞或細(xì)胞聚集體不粘附在培養(yǎng)容器等上的條件下進(jìn)行，并且在允許粘附到培養(yǎng)容器等上的條件下進(jìn)行的培養(yǎng)(貼壁培養(yǎng)或貼壁培養(yǎng)法)不包括在懸浮培養(yǎng)的范疇內(nèi)。在這一情形中，細(xì)胞粘附意指在細(xì)胞或細(xì)胞聚集體與培養(yǎng)容器之間形成強(qiáng)的細(xì)胞-基質(zhì)間接合。更具體地，懸浮培養(yǎng)是指在細(xì)胞或細(xì)胞聚集體與培養(yǎng)容器之間不形成強(qiáng)的細(xì)胞-基質(zhì)間接合的條件下的培養(yǎng)，并且貼壁培養(yǎng)是指在細(xì)胞或細(xì)胞聚集體與培養(yǎng)容器等之間形成強(qiáng)的細(xì)胞-基質(zhì)間接合的條件下的培養(yǎng)。

在懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞聚集體中，形成平面的細(xì)胞-細(xì)胞粘附。在懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞聚集體中，幾乎不形成與培養(yǎng)容器等的細(xì)胞-基質(zhì)間接合，并且即使形成與培養(yǎng)容器等的細(xì)胞-基質(zhì)間接合，其貢獻(xiàn)也是小的。在一些實(shí)施方案中，在聚集體內(nèi)部存在內(nèi)源性細(xì)胞-基質(zhì)間接合，但是幾乎不形成與培養(yǎng)容器等的細(xì)胞-基質(zhì)間接合，即使形成與培養(yǎng)容器等的細(xì)胞-基質(zhì)間接合，其貢獻(xiàn)也是小的。

平面細(xì)胞-細(xì)胞粘附(平面附著)意指一個(gè)細(xì)胞經(jīng)由平面與另一個(gè)細(xì)胞連接。更具體地，平面細(xì)胞-細(xì)胞粘附意指，例如，一個(gè)細(xì)胞不少于1％，優(yōu)選不少于3％，更優(yōu)選不少于5％的表面積粘附到另一個(gè)細(xì)胞的表面上。細(xì)胞的表面可以通過用對(duì)膜染色的試劑(例如，dii)染色、細(xì)胞粘附分子(例如，e-鈣粘蛋白和n-鈣粘蛋白)的免疫染色而觀察到。

進(jìn)行懸浮培養(yǎng)時(shí)使用的細(xì)胞培養(yǎng)容器沒有特別限制，只要其能夠使得能夠“懸浮培養(yǎng)”即可，并且本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能夠適當(dāng)?shù)卮_定此類細(xì)胞培養(yǎng)容器。此類細(xì)胞培養(yǎng)容器的實(shí)例包括燒瓶、組織培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)平皿(平皿)、培養(yǎng)皿、組織培養(yǎng)皿、多聯(lián)培養(yǎng)皿、微量平板、微孔平板、微孔、多聯(lián)平板、多孔平板、室載玻片、碗(schale)、管、托盤、培養(yǎng)袋、錐形瓶(erlenmeyerflask)、旋轉(zhuǎn)燒瓶、搖瓶等。為了能夠允許懸浮培養(yǎng)，這些培養(yǎng)容器優(yōu)選是非細(xì)胞粘附性的?？捎玫姆羌?xì)胞粘附性的培養(yǎng)容器包括表面沒有進(jìn)行改善細(xì)胞粘附性的人工處理(例如，使用諸如基膜制劑、層粘連蛋白、觸覺蛋白(entactin)、膠原蛋白、明膠等的細(xì)胞外基質(zhì)等進(jìn)行的表面處理或用諸如聚賴氨酸、聚鳥氨酸等的聚合物進(jìn)行的包被處理或正電荷處理等)以及類似處理的培養(yǎng)皿。作為非細(xì)胞粘附性培養(yǎng)容器，可以使用表面已被人工處理以減小對(duì)細(xì)胞的粘附性(例如，使用mpc聚合物等的超親水處理、蛋白低吸附性處理等)以及類似處理的培養(yǎng)容器?？梢允褂眯D(zhuǎn)燒瓶、搖瓶等進(jìn)行轉(zhuǎn)管(roller)培養(yǎng)。培養(yǎng)容器的培養(yǎng)表面可以是平底的或可以具有凹陷和凸出。

用于貼壁培養(yǎng)的培養(yǎng)容器沒有特別限制，只要可以進(jìn)行“貼壁培養(yǎng)”即可，并且本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能夠依據(jù)培養(yǎng)規(guī)模、培養(yǎng)條件和培養(yǎng)時(shí)間適當(dāng)?shù)剡x擇合適的培養(yǎng)容器。此類培養(yǎng)容器的實(shí)例包括燒瓶、組織培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)平皿(平皿)、組織培養(yǎng)皿、多聯(lián)培養(yǎng)皿、微量平板、微孔平板、多聯(lián)平板、多孔平板、室載玻片、碗(schale)、管、托盤、培養(yǎng)袋、微載體、珠子、疊板、旋轉(zhuǎn)燒瓶和搖瓶。為了能夠允許貼壁培養(yǎng)，這些培養(yǎng)容器優(yōu)選是細(xì)胞粘附性的。細(xì)胞粘附性的培養(yǎng)容器包括對(duì)表面進(jìn)行人工處理以改善細(xì)胞粘附性的培養(yǎng)容器，并且具體是表面處理的培養(yǎng)容器，或可以提及內(nèi)部用涂層劑涂覆的培養(yǎng)容器。涂層劑的實(shí)例包括細(xì)胞外基質(zhì)，如層粘連蛋白[包括層粘連蛋白α5β1γ1(以下為層粘連蛋白511)，層粘連蛋白α1β1γ1(以下為層粘連蛋白111)等和層粘連蛋白片段(層粘連蛋白511e8等)]，觸覺蛋白，膠原蛋白，明膠，玻連蛋白，synthemax(corningincorporated)，基質(zhì)膠(matrigel)等，或聚合物，諸如聚賴氨酸，聚鳥氨酸等。所述表面處理的培養(yǎng)容器的實(shí)例包括通過正電荷處理等進(jìn)行表面處理的培養(yǎng)容器。

在本發(fā)明中用于培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基可以由通常用于培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基而制備。所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基的實(shí)例包括可以用于培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)基，諸如bme培養(yǎng)基，bgjb培養(yǎng)基，cmrl1066培養(yǎng)基，glasgowmem(gmem)培養(yǎng)基，改良的mem鋅選擇培養(yǎng)基，imdm培養(yǎng)基，medium199培養(yǎng)基，eaglemem培養(yǎng)基，αmem培養(yǎng)基，dmem培養(yǎng)基，f-12培養(yǎng)基，dmem/f-12培養(yǎng)基，imdm/f12培養(yǎng)基，ham培養(yǎng)基，rpmi1640培養(yǎng)基，費(fèi)希爾培養(yǎng)基(fischer’smedium)，以及它們的混合培養(yǎng)基等。

本發(fā)明中的“無血清培養(yǎng)基”表示不含未調(diào)節(jié)的或未純化的血清的培養(yǎng)基。在本發(fā)明中，含有純化的血液來源的組分和動(dòng)物組織來源的組分(例如，生長(zhǎng)因子)的培養(yǎng)基也包括在無血清培養(yǎng)基中，除非其中含有未調(diào)節(jié)的或未純化的血清。

無血清培養(yǎng)基可以含有血清代替物。血清代替物的實(shí)例包括適當(dāng)?shù)睾幸韵挛镔|(zhì)的那些：白蛋白，轉(zhuǎn)鐵蛋白，脂肪酸，膠原蛋白前體，痕量元素，2-巰基乙醇或3’硫醇甘油，或它們的等效物等。此種血清代替物可以通過例如wo98/30679中所述的方法制備。此外，血清代替物可以是市售的產(chǎn)品。此種市售血清代替物的實(shí)例包括knockout^tm血清替代品(knockout^tmserumreplacement，lifetechnologies，現(xiàn)為thermofisher：下文中有時(shí)也被稱為ksr)，化學(xué)成分確定的脂質(zhì)濃縮物(由lifetechnologies生產(chǎn))，和glutamax^tm(由lifetechnologies生產(chǎn))，b27(由lifetechnologies生產(chǎn))，n2補(bǔ)充劑(由lifetechnologies生產(chǎn))。

用于懸浮培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)基可以適當(dāng)?shù)睾兄舅峄蛑|(zhì)，氨基酸(例如，非必需氨基酸)，維生素，生長(zhǎng)因子，細(xì)胞因子，抗氧化劑，2-巰基乙醇，丙酮酸，緩沖劑，無機(jī)鹽等。

為避免復(fù)雜的制備，補(bǔ)充有適當(dāng)量(例如，約0.5％-約30％，優(yōu)選約1-約20％)的市售的ksr(由lifetechnologies生產(chǎn))的無血清培養(yǎng)基可以用作所述無血清培養(yǎng)基(例如，補(bǔ)充有10％ksr、1x化學(xué)成分確定的脂質(zhì)濃縮物(cdlc)和450μm1-一硫代甘油的f-12培養(yǎng)基和imdm培養(yǎng)基的1∶1混合物的培養(yǎng)基)。關(guān)于與ksr相當(dāng)?shù)漠a(chǎn)品，可以提及jp-a-2001-508302中公開的培養(yǎng)基。

本發(fā)明中的“含血清培養(yǎng)基”表示含有未調(diào)節(jié)的或未純化的血清的培養(yǎng)基。所述培養(yǎng)基可以含有脂肪酸、脂質(zhì)，氨基酸(例如，非必需氨基酸)，維生素，生長(zhǎng)因子，細(xì)胞因子，抗氧化劑，2-巰基乙醇，1-一硫代甘油，丙酮酸，緩沖劑，無機(jī)鹽等。例如，血清培養(yǎng)基可以用在維持由本發(fā)明產(chǎn)生的神經(jīng)組織(例如，視網(wǎng)膜組織)的步驟中(也被稱為成熟培養(yǎng))。

在本發(fā)明中，培養(yǎng)優(yōu)選地在無外源物質(zhì)(xeno-free)的條件下進(jìn)行?！盁o外源物質(zhì)”意指消除源自與要培養(yǎng)的細(xì)胞不同的物種的成分的條件。

在本發(fā)明中，“含有物質(zhì)x的培養(yǎng)基”和“在存在物質(zhì)x的條件下”表示補(bǔ)充有外源物質(zhì)x的培養(yǎng)基或含有外源物質(zhì)x的培養(yǎng)基，或在存在外源物質(zhì)x的條件下。即，當(dāng)培養(yǎng)基中存在的細(xì)胞或組織內(nèi)源性表達(dá)、分泌或產(chǎn)生物質(zhì)x時(shí)，內(nèi)源性物質(zhì)x與外源性物質(zhì)x區(qū)分，并且，理解無內(nèi)源性物質(zhì)x的培養(yǎng)基落在“含有物質(zhì)x的培養(yǎng)基”的范疇之外(甚至當(dāng)其包含內(nèi)源性物質(zhì)x時(shí))。

例如，“含有sonichedgehog信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活物質(zhì)的培養(yǎng)基”是補(bǔ)充有外源性sonichedgehog信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活物質(zhì)的培養(yǎng)基或包含外源性sonichedgehog信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活物質(zhì)的培養(yǎng)基。

在本發(fā)明中，飼養(yǎng)細(xì)胞是指在培養(yǎng)干細(xì)胞時(shí)共存的除干細(xì)胞之外的細(xì)胞。用于培養(yǎng)多能干細(xì)胞同時(shí)保持未分化狀態(tài)的飼養(yǎng)細(xì)胞的實(shí)例包括小鼠成纖維細(xì)胞(mef等)、人成纖維細(xì)胞、snl細(xì)胞等。關(guān)于飼養(yǎng)細(xì)胞，優(yōu)選經(jīng)歷生長(zhǎng)抑制處理的飼養(yǎng)細(xì)胞。生長(zhǎng)抑制處理的實(shí)例包括用生長(zhǎng)抑制劑(例如，絲裂霉素c)、γ輻射、uv輻照等處理。用于培養(yǎng)多能干細(xì)胞同時(shí)保持未分化狀態(tài)的飼養(yǎng)細(xì)胞通過分泌激素因子(優(yōu)選用于維持未分化狀態(tài)的因子)或產(chǎn)生用于細(xì)胞粘附的構(gòu)架(細(xì)胞外基底)而有助于維持多能干細(xì)胞的未分化。

在本發(fā)明中，不存在飼養(yǎng)細(xì)胞(無飼養(yǎng)細(xì)胞)意指在不存在飼養(yǎng)細(xì)胞的條件下培養(yǎng)。不存在飼養(yǎng)細(xì)胞意指，例如，無飼養(yǎng)細(xì)胞添加的條件，或基本上無飼養(yǎng)細(xì)胞的條件(例如，飼養(yǎng)細(xì)胞數(shù)目相對(duì)于細(xì)胞總數(shù)的比例不大于3％)。

在本發(fā)明中，細(xì)胞的“聚集體”是指由分散在培養(yǎng)基中的細(xì)胞組裝形成的團(tuán)塊，其中細(xì)胞彼此粘附。細(xì)胞團(tuán)塊、胚狀體、球體、球狀體也包含在所述細(xì)胞聚集體中。優(yōu)選地，在細(xì)胞的聚集體中形成平面細(xì)胞-細(xì)胞粘附。在一些實(shí)施方案中，在一些或全部的聚集體中，細(xì)胞有時(shí)形成細(xì)胞-細(xì)胞接合和/或細(xì)胞粘附，例如，粘附接合。本發(fā)明中的“聚集體”特別包括：在上文提及的本發(fā)明[1]的第二步中產(chǎn)生的聚集體，其由在開始懸浮培養(yǎng)時(shí)分散的細(xì)胞形成，和在上文提及的本發(fā)明[1]的第三步中產(chǎn)生的聚集體，其包含由多能干細(xì)胞分化的誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜細(xì)胞，并且所述“聚集體”還包括在上文提及的本發(fā)明[1]的第二步開始時(shí)(即，在懸浮培養(yǎng)開始時(shí))已經(jīng)形成的聚集體。在第二步中形成的細(xì)胞聚集體包含“胚狀體(eb)”。

在本發(fā)明中，“均勻的聚集體”意指在培養(yǎng)多個(gè)聚集體時(shí)，每個(gè)聚集體的尺寸一致，并且在通過最大直徑的長(zhǎng)度評(píng)價(jià)所述聚集體的尺寸時(shí)，最大直徑的長(zhǎng)度變化小。更具體地，這意味著全部聚集體群體中不少于75％的聚集體在所述聚集體群體中最大直徑的平均值±100％、優(yōu)選平均值±50％、更優(yōu)選平均值±20％內(nèi)。

在本發(fā)明中，“形成均勻的細(xì)胞聚集體”意指，當(dāng)匯聚細(xì)胞形成細(xì)胞聚集體并且懸浮培養(yǎng)所述細(xì)胞聚集體時(shí)，“迅速聚集給定數(shù)量的分散的細(xì)胞”從而形成尺寸均勻的細(xì)胞聚集體。

分散是指通過諸如酶處理、物理處理等的分散處理將細(xì)胞或組織分成小細(xì)胞塊(不少于2個(gè)細(xì)胞，并且不多于100個(gè)細(xì)胞，優(yōu)選不多于50個(gè)細(xì)胞)或單個(gè)細(xì)胞。給定數(shù)量的分散的細(xì)胞是特定數(shù)量的細(xì)胞塊或單個(gè)細(xì)胞的集合。

分散多能干細(xì)胞的方法的實(shí)例包括機(jī)械分散處理、細(xì)胞分散液處理和細(xì)胞保護(hù)劑添加處理。這些處理可以聯(lián)合進(jìn)行。優(yōu)選地，進(jìn)行細(xì)胞分散處理，然后進(jìn)行機(jī)械分散處理。

關(guān)于機(jī)械分散處理的方法，可以提及吹吸處理或通過刮刀刮片操作。

關(guān)于用于細(xì)胞分散液處理的細(xì)胞分散液，可以提及包含諸如胰蛋白酶、膠原蛋白酶、透明質(zhì)酸酶、彈性蛋白酶、鏈霉蛋白酶、dna酶、木瓜蛋白酶等中的任一種酶和諸如乙二胺四乙酸等的螯合劑的溶液。還可以使用商購(gòu)的細(xì)胞分散液，諸如trypleselect(由lifetechnologies生產(chǎn))和trypleexpress(由lifetechnologies生產(chǎn))。

當(dāng)分散多能干細(xì)胞時(shí)，可以通過用細(xì)胞保護(hù)劑處理而抑制多能干細(xì)胞的細(xì)胞死亡。關(guān)于用于細(xì)胞保護(hù)劑處理的要使用的細(xì)胞保護(hù)劑，可以提及fgf信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活物質(zhì)、肝素、igf信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活物質(zhì)、血清和血清代替物。為了抑制由分散引起的細(xì)胞死亡(特別是人多能干細(xì)胞的細(xì)胞死亡)，可以在分散時(shí)添加rho相關(guān)卷曲螺旋激酶(rock)抑制物質(zhì)或肌球蛋白抑制物質(zhì)。關(guān)于rock抑制物質(zhì)，可以提及y-27632、法舒地爾(fasudil)(ha1077)、h-1152等。關(guān)于肌球蛋白抑制物質(zhì)。可以提及blebbistatin。關(guān)于優(yōu)選的細(xì)胞保護(hù)劑，可以提及rock抑制物質(zhì)。

例如，用于分散多能干細(xì)胞的方法包括，例如，包括在存在rock抑制物質(zhì)作為細(xì)胞保護(hù)劑的條件下，用細(xì)胞分散液(trypleselect)處理多能干細(xì)胞的集落，并且通過吹吸進(jìn)一步將其分散的方法。

在本發(fā)明的制備方法中，優(yōu)選地通過迅速匯集多能干細(xì)胞而形成多能干細(xì)胞聚集體。當(dāng)以這樣的方式形成多能干細(xì)胞聚集體時(shí)，可以以良好的重現(xiàn)性在由所形成的聚集體誘導(dǎo)和分化的細(xì)胞中形成上皮樣結(jié)構(gòu)。形成聚集體的實(shí)驗(yàn)操作的實(shí)例包括涉及使用具有小孔的平板(例如，當(dāng)以平底方式計(jì)算時(shí)，具有基底面積為約0.1-2.0cm²的孔的平板)、微孔等將細(xì)胞保持在小空間內(nèi)的方法，涉及通過用小離心管短時(shí)間離心而使細(xì)胞聚集的方法。關(guān)于具有小孔的平板，例如，可以提及24孔平板(當(dāng)以平底方式計(jì)算時(shí)，面積約為1.88cm²)、48孔平板(當(dāng)以平底方式計(jì)算時(shí)，面積約為1.0cm²)、96孔平板(當(dāng)以平底方式計(jì)算時(shí)，面積約為0.35cm²，內(nèi)徑約為6-8mm)和384孔平板。優(yōu)選96孔平板。關(guān)于具有小孔的平板的形狀，例如，從上方看孔時(shí)底表面的形狀為多邊形、長(zhǎng)方形、橢圓形、真正的圓形，優(yōu)選是真正的圓形。關(guān)于從側(cè)孔觀察孔時(shí)具有小孔的平板的形狀，底表面的形狀可以是平底結(jié)構(gòu)或具有高外部周長(zhǎng)和低內(nèi)部凹陷的結(jié)構(gòu)。底表面的形狀包括，例如，u型底、v型底、m型底，優(yōu)選u型底或v型底，更優(yōu)選v型底。關(guān)于具有小孔的平板，也可以使用在底表面上具有凹凸或齒狀(dent)的細(xì)胞培養(yǎng)平皿(例如，60mm-150mm的平皿，培養(yǎng)瓶)。具有小孔的平板的底表面優(yōu)選是非細(xì)胞粘附性底表面，優(yōu)選前述非細(xì)胞粘附性涂覆的底表面。

多能干細(xì)胞聚集體或包含多能干細(xì)胞的細(xì)胞群的聚集體的形成以及它們的均勻性可以基于聚集體塊的尺寸和其中的細(xì)胞數(shù)目、宏觀形態(tài)、通過組織染色分析的微觀形態(tài)和它們的同質(zhì)性等來確定。另外，可以基于聚集體的宏觀形態(tài)、通過組織染色分析的微觀形態(tài)及其均勻性、分化和未分化標(biāo)記的表達(dá)及其均勻性、分化標(biāo)記表達(dá)的控制及其同步性、聚集體之間的分化效率的重現(xiàn)性等確定聚集體中上皮樣結(jié)構(gòu)的形成及其均勻性。

在本發(fā)明中，“組織”是指細(xì)胞群結(jié)構(gòu)，其具有這樣的構(gòu)造，其中具有均勻的形態(tài)或性質(zhì)的一種細(xì)胞，或具有不同形態(tài)和性質(zhì)的多種類型的細(xì)胞在空間上以給定模式排列。

在本發(fā)明中，“神經(jīng)組織”是指由神經(jīng)細(xì)胞組成的組織，包括處在發(fā)育階段或成人階段的大腦、中腦、小腦、脊髓、視網(wǎng)膜、周圍神經(jīng)、前腦、后腦、端腦、間腦等。神經(jīng)組織有時(shí)形成具有層結(jié)構(gòu)的上皮結(jié)構(gòu)(神經(jīng)上皮)，并且細(xì)胞聚集體中神經(jīng)上皮的量可以通過使用光學(xué)顯微鏡的亮視野觀察進(jìn)行評(píng)價(jià)。

在本發(fā)明中，“神經(jīng)細(xì)胞”是指來源于外胚層的組織中除表皮譜系細(xì)胞之外的細(xì)胞。即，其包括諸如神經(jīng)前體細(xì)胞、神經(jīng)元(神經(jīng)元細(xì)胞)、神經(jīng)膠質(zhì)、神經(jīng)干細(xì)胞、神經(jīng)元前體細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)前體細(xì)胞等的細(xì)胞。神經(jīng)細(xì)胞還包括組成下文提及的視網(wǎng)膜組織(視網(wǎng)膜細(xì)胞)、視網(wǎng)膜祖先細(xì)胞、視網(wǎng)膜層專有的神經(jīng)元、神經(jīng)視網(wǎng)膜細(xì)胞和視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的細(xì)胞。神經(jīng)細(xì)胞可以通過使用巢蛋白、tuj1、psa-ncam、n-鈣粘蛋白等作為標(biāo)記進(jìn)行鑒定。

神經(jīng)元(或神經(jīng)元細(xì)胞)是形成神經(jīng)回路并且對(duì)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有貢獻(xiàn)的功能細(xì)胞，并且可以通過使用不成熟神經(jīng)元標(biāo)記(諸如tuj1，dcx，huc/d等)和/或成熟神經(jīng)元細(xì)胞標(biāo)記(諸如map2，neun等)的表達(dá)作為指標(biāo)進(jìn)行鑒定。

關(guān)于神經(jīng)膠質(zhì)，可以提及星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞、müller膠質(zhì)等。關(guān)于星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記，可以提及gfap；關(guān)于少突膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記，可以提及o4，并且關(guān)于müller膠質(zhì)標(biāo)記，可以提及cralbp等。

神經(jīng)干細(xì)胞是具有向神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的分化潛能(多能性)和維持多能性的增殖能力(有時(shí)稱為自我更新能力)的細(xì)胞。關(guān)于神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)記，可以提及巢蛋白、sox2、musashi、hes家族、cd133等；然而，這些標(biāo)記通常是關(guān)于祖先細(xì)胞/前體細(xì)胞的標(biāo)記，并且不被認(rèn)為是神經(jīng)干細(xì)胞-特異性的標(biāo)記。神經(jīng)干細(xì)胞的數(shù)量可以通過神經(jīng)球測(cè)定、克隆測(cè)定等評(píng)估。

神經(jīng)元前體細(xì)胞是具有增殖能力的細(xì)胞，其產(chǎn)生神經(jīng)元，并且不產(chǎn)生膠質(zhì)細(xì)胞。關(guān)于神經(jīng)元前體細(xì)胞標(biāo)記，可以提及tbr2、tα1等。備選地，不成熟的神經(jīng)元標(biāo)記(tuj1，dcx，huc/d)-陽(yáng)性的和生長(zhǎng)標(biāo)記(ki67，ph3，mcm)-陽(yáng)性的細(xì)胞也可以被鑒定為神經(jīng)元前體細(xì)胞。

神經(jīng)膠質(zhì)前體細(xì)胞是具有增殖能力的細(xì)胞，其產(chǎn)生神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，并且不產(chǎn)生神經(jīng)元。

神經(jīng)前體細(xì)胞是前體細(xì)胞的集合，包括神經(jīng)干細(xì)胞、神經(jīng)元前體細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)前體細(xì)胞，并且具有增殖能力和神經(jīng)元-與神經(jīng)膠質(zhì)-產(chǎn)生能力。神經(jīng)前體細(xì)胞可以用巢蛋白、glast、sox2、soxl、musashi、pax6等作為標(biāo)記鑒定。備選地，神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)記-陽(yáng)性的和生長(zhǎng)標(biāo)記(ki67，ph3，mcm)-陽(yáng)性的細(xì)胞也可以被鑒定為神經(jīng)前體細(xì)胞。

在本發(fā)明中，“視網(wǎng)膜組織”意指這樣的組織，其中在體內(nèi)組成各個(gè)視網(wǎng)膜層的一種類型的或至少兩種或更多種類型的細(xì)胞在空間上按層排列，所述細(xì)胞諸如感光細(xì)胞、感光前體細(xì)胞、視桿感光細(xì)胞、視錐感光細(xì)胞、中間神經(jīng)元、水平細(xì)胞、雙極細(xì)胞、無長(zhǎng)突細(xì)胞、視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(神經(jīng)節(jié)細(xì)胞)、視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(rpe)、睫狀邊緣區(qū)細(xì)胞、它們的祖先/前體細(xì)胞以及視網(wǎng)膜祖先細(xì)胞等。由每個(gè)細(xì)胞組成的視網(wǎng)膜層可以通過已知的方法，例如，通過細(xì)胞標(biāo)記表達(dá)的存在或不存在或其水平等驗(yàn)證。

本發(fā)明中的“視網(wǎng)膜層”表示構(gòu)成視網(wǎng)膜的每個(gè)層。其具體實(shí)例包括視網(wǎng)膜色素上皮層，光感受器層，外界膜，外核層，外網(wǎng)織層，內(nèi)核層，內(nèi)網(wǎng)織層，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層，神經(jīng)纖維層和內(nèi)界膜。

本發(fā)明中的“視網(wǎng)膜祖先細(xì)胞”是指能夠分化成任何成熟的視網(wǎng)膜細(xì)胞(包括感光細(xì)胞，水平細(xì)胞，雙極細(xì)胞，無長(zhǎng)突細(xì)胞，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞和視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞等)的祖先細(xì)胞。

在本發(fā)明中，“神經(jīng)視網(wǎng)膜祖先細(xì)胞”是指能夠分化成多種成熟的視網(wǎng)膜細(xì)胞(包括感光細(xì)胞，水平細(xì)胞，雙極細(xì)胞，無長(zhǎng)突細(xì)胞，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞等)中的任一種的祖先細(xì)胞。通常，神經(jīng)視網(wǎng)膜祖先細(xì)胞不分化成視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞。

感光前體細(xì)胞、水平細(xì)胞前體細(xì)胞、雙極細(xì)胞前體細(xì)胞、無長(zhǎng)突細(xì)胞前體細(xì)胞、視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞前體細(xì)胞和視網(wǎng)膜色素上皮前體細(xì)胞分別是指確定分化成感光細(xì)胞、水平細(xì)胞、雙極細(xì)胞、無長(zhǎng)突細(xì)胞、視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞和視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的前體細(xì)胞。

在本發(fā)明中，“視網(wǎng)膜層專有的神經(jīng)元”是構(gòu)成視網(wǎng)膜層的細(xì)胞并且為視網(wǎng)膜層所專有的神經(jīng)元細(xì)胞(神經(jīng)元)。視網(wǎng)膜層專有的神經(jīng)元的實(shí)例包括雙極細(xì)胞，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，無長(zhǎng)突細(xì)胞，水平細(xì)胞，感光細(xì)胞，視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞，視桿細(xì)胞和視錐細(xì)胞。

本發(fā)明中的“視網(wǎng)膜細(xì)胞”包括前述視網(wǎng)膜祖先細(xì)胞和視網(wǎng)膜層專有的神經(jīng)元。

視網(wǎng)膜細(xì)胞標(biāo)記的實(shí)例包括在視網(wǎng)膜祖先細(xì)胞中表達(dá)的rx(還稱作rax)、pax6和chx10，在下丘腦神經(jīng)元的前體細(xì)胞中表達(dá)而在視網(wǎng)膜祖先細(xì)胞中不表達(dá)的nkx2.1，在下丘腦神經(jīng)上皮中表達(dá)而在視網(wǎng)膜中不表達(dá)的sox1，在感光細(xì)胞的前體細(xì)胞中表達(dá)的crx、blimp1等，等等。視網(wǎng)膜層專有的神經(jīng)元的標(biāo)記的實(shí)例包括在雙極細(xì)胞中表達(dá)的chx10、pkcα和l7，在視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中表達(dá)的tuji和brn3，在無長(zhǎng)突細(xì)胞表達(dá)中的鈣視網(wǎng)膜蛋白，在水平細(xì)胞表達(dá)中的鈣結(jié)合蛋白，在成熟的感光細(xì)胞中表達(dá)的視紫質(zhì)(rhodopsin)和恢復(fù)蛋白，在視桿細(xì)胞中表達(dá)的nrl和視紫質(zhì)，在視錐細(xì)胞中表達(dá)的rxr-γ和s-視蛋白，在視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞中表達(dá)的rpe65和mitf，在睫狀邊緣區(qū)中表達(dá)的rdh10和ssea1等。

2.制備視網(wǎng)膜細(xì)胞或視網(wǎng)膜組織的方法

本發(fā)明的制備方法是用于制備視網(wǎng)膜細(xì)胞或視網(wǎng)膜組織的方法，所述方法包括下述步驟(1)-(3)：

(1)第一步，在不存在飼養(yǎng)細(xì)胞的條件下在含有用于維持未分化狀態(tài)的因子的培養(yǎng)基中培養(yǎng)人多能干細(xì)胞，

(2)第二步，在存在sonichedgehog信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活物質(zhì)的條件下懸浮培養(yǎng)第一步中得到的多能干細(xì)胞，從而形成細(xì)胞聚集體，和

(3)第三步，在存在或不存在分化誘導(dǎo)因子的條件下懸浮培養(yǎng)第二步中得到的聚集體，從而得到包含視網(wǎng)膜細(xì)胞或視網(wǎng)膜組織的聚集體。

在步驟(1)中，在不存在飼養(yǎng)細(xì)胞的條件下在含有用于維持未分化狀態(tài)的因子的培養(yǎng)基中培養(yǎng)人多能干細(xì)胞。

關(guān)于步驟(1)中的人多能干細(xì)胞，可以提及人誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞或人胚胎干細(xì)胞(es細(xì)胞)。

誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞的制備方法沒有特別限制，并且其可以通過本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的方法產(chǎn)生，如上文提及的。在無飼養(yǎng)細(xì)胞的條件下進(jìn)行制備誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞的步驟(即，使體細(xì)胞重新編程建立多能干細(xì)胞的步驟)也是合乎需要的。

盡管胚胎干細(xì)胞(es細(xì)胞)的制備方法沒有特別限制，并且可以通過本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的方法制備，如上文提及的，在無飼養(yǎng)細(xì)胞的條件下制備胚胎干細(xì)胞(es細(xì)胞)的步驟也是合乎需要的。

用于得到步驟(1)中所用的多能干細(xì)胞的維持培養(yǎng)或擴(kuò)增培養(yǎng)可以通過本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的方法進(jìn)行，如上文提及的。盡管上文提及的多能干細(xì)胞的維持培養(yǎng)和擴(kuò)增培養(yǎng)可以通過貼壁培養(yǎng)或懸浮培養(yǎng)進(jìn)行，但是其優(yōu)選地通過貼壁培養(yǎng)進(jìn)行。盡管上文提及的多能干細(xì)胞的維持培養(yǎng)和擴(kuò)增培養(yǎng)可以在存在飼養(yǎng)細(xì)胞的條件下或在無飼養(yǎng)細(xì)胞的條件下進(jìn)行，但是其優(yōu)選在無飼養(yǎng)細(xì)胞的條件下進(jìn)行。

在步驟(1)中不存在飼養(yǎng)細(xì)胞(無飼養(yǎng)細(xì)胞)意指基本上沒有飼養(yǎng)細(xì)胞的條件(例如，飼養(yǎng)細(xì)胞數(shù)目相對(duì)于細(xì)胞總數(shù)的比例不大于3％)。優(yōu)選地，步驟(1)在無飼養(yǎng)細(xì)胞的條件下進(jìn)行。

用于步驟(1)的培養(yǎng)基沒有特別限制，只要其是能夠允許在無飼養(yǎng)細(xì)胞條件下培養(yǎng)多能干細(xì)胞培養(yǎng)以維持未分化狀態(tài)的培養(yǎng)基(無飼養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)基)即可。優(yōu)選地，為了允許培養(yǎng)以維持未分化狀態(tài)的培養(yǎng)，其包含用于維持未分化狀態(tài)的因子。例如，其是包含用于維持未分化狀態(tài)的因子并且不含tgfβ家族信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制物質(zhì)和sonichedgehog信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活物質(zhì)的培養(yǎng)基。

用于維持未分化狀態(tài)的因子沒有特別限制，只要其是具有抑制多能干細(xì)胞分化的作用的物質(zhì)即可。在致敏的(primed)多能干細(xì)胞(例如，人es細(xì)胞，人ips細(xì)胞)的情形中，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員廣泛應(yīng)用的用于維持未分化狀態(tài)的因子的實(shí)例包括fgf信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活物質(zhì)、tgfβ家族信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活物質(zhì)、胰島素等。關(guān)于fgf信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活物質(zhì)，可以特別提及成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(例如，bfgf，fgf4，fgf8)。關(guān)于tgfβ家族信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活物質(zhì)，可以提及tgfβ信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活物質(zhì)，nodal/激活蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活物質(zhì)。關(guān)于tgfβ信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活物質(zhì)，可以提及tgfβ1、tgfβ2。關(guān)于nodal/激活蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活物質(zhì)，可以提及nodal、激活蛋白a、激活蛋白b。當(dāng)培養(yǎng)人多能干細(xì)胞(人es細(xì)胞，人ips細(xì)胞)時(shí)，步驟(1)的培養(yǎng)基優(yōu)選包含bfgf作為用于維持未分化狀態(tài)的因子。

要用于本發(fā)明的維持未分化狀態(tài)的因子通常是用于維持哺乳動(dòng)物未分化狀態(tài)的因子。所述哺乳動(dòng)物例如是上文提及的那些。由于用于維持未分化狀態(tài)的因子可以在哺乳動(dòng)物物種之間具有交叉反應(yīng)性，因此也可以使用用于維持任何哺乳動(dòng)物未分化狀態(tài)的因子，只要能夠維持要培養(yǎng)的多能干細(xì)胞的未分化狀態(tài)即可。優(yōu)選地，使用用于維持與要培養(yǎng)的細(xì)胞是同一物種的哺乳動(dòng)物的未分化狀態(tài)的因子。例如，對(duì)于人多能干細(xì)胞的培養(yǎng)，使用用于維持未分化狀態(tài)的人因子(例如，bfgf，fgf4，fgf8，egf，nodal，激活蛋白a，激活蛋白b，tgfβ1，tgfβ2等)。此處，“人蛋白x”意指蛋白x具有在人體內(nèi)天然表達(dá)的蛋白x的氨基酸序列。

要用于本發(fā)明的維持未分化狀態(tài)的因子優(yōu)選是分離的?！胺蛛x的”意指已經(jīng)進(jìn)行了去除除想要的成分或細(xì)胞之外的因子的操作，并且所述成分或細(xì)胞不再以天然存在的狀態(tài)存在。因此，“分離的蛋白x”不包括由培養(yǎng)的細(xì)胞或組織產(chǎn)生的和包含在細(xì)胞或組織中或在培養(yǎng)基中的內(nèi)源性蛋白x?！胺蛛x的蛋白x”的純度(蛋白x重量占總蛋白重量的百分?jǐn)?shù))通常不小于70％，優(yōu)選不小于80％，更優(yōu)選不小于90％，還優(yōu)選不小于99％，進(jìn)一步優(yōu)選為100％。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括提供分離的用于維持未分化狀態(tài)的因子的步驟。在一個(gè)實(shí)施方案中，其包括向步驟(1)中使用的培養(yǎng)基中外源添加分離的用于維持未分化狀態(tài)的因子的步驟。備選地，可以在步驟(1)中使用的培養(yǎng)基中預(yù)先添加用于維持未分化狀態(tài)的因子。

在步驟(1)中使用的培養(yǎng)基中用于維持未分化狀態(tài)的因子的濃度是能夠維持要培養(yǎng)的多能干細(xì)胞的未分化狀態(tài)的濃度，并且可以由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員適當(dāng)?shù)卮_定。例如，當(dāng)在不存在飼養(yǎng)細(xì)胞的條件下使用bfgf作為用于維持未分化狀態(tài)的因子時(shí)，其濃度通常為約4ng-500ng/ml，優(yōu)選10ng-200ng/ml，更優(yōu)選約30ng-150ng/ml。

關(guān)于無飼養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基，已經(jīng)開發(fā)了多種合成的培養(yǎng)基，并且是可商購(gòu)獲得的，例如，可以提及essential8培養(yǎng)基。essential8培養(yǎng)基是包含下述各項(xiàng)作為添加劑的dmem/f12培養(yǎng)基：l-抗壞血酸-2-磷酸鎂(64mg/l)，硒酸鈉(sodiumselenium)(14μg/1)，胰島素(19.4mg/1)，nahco3(543mg/l)，轉(zhuǎn)鐵蛋白(10.7mg/l)，bfgf(100ng/ml)，和tgfβ家族信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活物質(zhì)(tgfβ1(2ng/ml)或nodal(100ng/ml))(naturemethods，8，424-429(2011))。可商購(gòu)的無飼養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)基的實(shí)例包括essential8(由lifetechnologies制造)，s-培養(yǎng)基(由dspharmabiomedical制造)，stempro(由lifetechnologies制造)，hesf9(procnatlacadsciusa.2008年9月9日；105(36)：13409-14)，mtesr1(由stemcelltechnologies制造)，mtesr2(由stemcelltechnologies制造)，和tesr-e8（由stemcelltechnologies制造)。除了這些之外，可以提及stemfit(由ajinomotoco.，inc.制造)作為無飼養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基。本發(fā)明可以通過在上文提及的步驟(1)中使用這些而便利地進(jìn)行。

盡管用于貼壁培養(yǎng)的培養(yǎng)容器沒有特別限制，只要能夠進(jìn)行“貼壁培養(yǎng)”即可，但是優(yōu)選細(xì)胞粘附性培養(yǎng)容器。細(xì)胞粘附性培養(yǎng)容器包括表面已經(jīng)經(jīng)過人工處理以提高細(xì)胞粘附性的培養(yǎng)容器，并且具體地，可以提及上文提及的表面處理的培養(yǎng)容器，內(nèi)部用涂層劑涂覆的培養(yǎng)容器。涂層劑的實(shí)例包括細(xì)胞外基質(zhì)，如層粘連蛋白[包括層粘連蛋白α5β1γ1(以下為層粘連蛋白511)，層粘連蛋白α1β1γ1(以下為層粘連蛋白111)等和層粘連蛋白片段(層粘連蛋白511e8等)]，觸覺蛋白，膠原蛋白，明膠，玻連蛋白，synthemax(corningincorporated)，基質(zhì)膠(matrigel)等，或聚合物，諸如聚賴氨酸，聚鳥氨酸等，以及類似的物質(zhì)。還可以使用表面經(jīng)過正電荷處理等處理的培養(yǎng)容器。優(yōu)選的是層粘連蛋白，更優(yōu)選的是層粘連蛋白511e-8。層粘連蛋白511e-8可以是商購(gòu)產(chǎn)品(例如，imatrix-511，nippi)。

盡管用于步驟(1)的培養(yǎng)基可以是含血清培養(yǎng)基或無血清培養(yǎng)基，但是優(yōu)選是無血清培養(yǎng)基，以避免化學(xué)上不確定的成分的污染。

為了避免化學(xué)上不確定的成分的污染，用于步驟(1)的培養(yǎng)基可以是成分為化學(xué)上確定的培養(yǎng)基。

在步驟(1)中，多能干細(xì)胞可以在懸浮培養(yǎng)和貼壁培養(yǎng)的任一條件下培養(yǎng)，優(yōu)選進(jìn)行貼壁培養(yǎng)。

對(duì)于步驟(1)中在無飼養(yǎng)細(xì)胞的條件下培養(yǎng)多能干細(xì)胞，可以使用前文提及的無飼養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)基作為培養(yǎng)基。

對(duì)于步驟(1)中在無飼養(yǎng)細(xì)胞的條件下培養(yǎng)多能干細(xì)胞，可以使用適當(dāng)?shù)幕|(zhì)作為構(gòu)架，用于給多能干細(xì)胞提供替代飼養(yǎng)細(xì)胞的構(gòu)架。多能干細(xì)胞在表面用作為構(gòu)架的基質(zhì)涂覆的細(xì)胞容器中進(jìn)行貼壁培養(yǎng)。

關(guān)于可以用作構(gòu)架的基質(zhì)，可以提及層粘連蛋白(natbiotechnol28，611-615(2010))，層粘連蛋白片段(natcommun3，1236(2012))，基膜制劑(natbiotechnol19，971-974(2001))，明膠，膠原蛋白，硫酸乙酰肝素蛋白聚糖，觸覺蛋白，玻連蛋白等。

“層粘連蛋白”是由α、β、γ鏈組成的異三聚體分子，并且是包含具有不同亞基鏈組成的異構(gòu)體的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白。具體地，基于具有5種α鏈、4種β鏈和3種γ鏈的異三聚體組合，層粘連蛋白具有約15種異構(gòu)體。層粘連蛋白的名稱通過組合α鏈(α1-α5)、β鏈(β1-β4)和γ鏈(γ1-γ4)各自的數(shù)目而確定。例如，具有α5鏈、β1鏈、γ1鏈的組合的層粘連蛋白稱為層粘連蛋白511。在本發(fā)明中，優(yōu)選使用層粘連蛋白511(natbiotechnol28，611-615(2010))。

用于本發(fā)明的層粘連蛋白通常是哺乳動(dòng)物層粘連蛋白。關(guān)于哺乳動(dòng)物，可以提及上文提及的那些。為了獲得無外源物質(zhì)(xeno-free)的條件，優(yōu)選使用與要培養(yǎng)的細(xì)胞是相同物種的哺乳動(dòng)物的層粘連蛋白。例如，使用人層粘連蛋白(優(yōu)選地，人層粘連蛋白511)培養(yǎng)人多能干細(xì)胞。

本發(fā)明中使用的層粘連蛋白片段沒有特別限制，只要其具有與多能干細(xì)胞的粘附性并且允許在無飼養(yǎng)細(xì)胞的條件下維持培養(yǎng)多能干細(xì)胞即可，并且其優(yōu)選是e8片段。在通過用彈性蛋白酶消化層粘連蛋白511得到的多個(gè)片段中，層粘連蛋白e8片段被鑒定為具有強(qiáng)細(xì)胞粘附活性的片段(emboj.，3：1463-1468，1984，j.cellbiol.，105：589-598，1987)。在本發(fā)明中，優(yōu)選使用層粘連蛋白511的e8片段(natcommun3，1236(2012)，scientificreports4，3549(2014))。用于本發(fā)明的層粘連蛋白e8片段不需要是層粘連蛋白的彈性蛋白酶消化產(chǎn)物，并且可以是重組的。為了避免不確定成分的污染，在本發(fā)明中優(yōu)選使用重組的層粘連蛋白片段。層粘連蛋白511的e8片段可商購(gòu)獲得，并且，例如，可以從nippi，inc.等購(gòu)買。

用于本發(fā)明的層粘連蛋白或?qū)诱尺B蛋白片段優(yōu)選是分離的。

本發(fā)明中的“基膜制劑”是指這樣的制劑，即，當(dāng)將能夠形成基膜的目的細(xì)胞涂布在其上并培養(yǎng)時(shí)，包含具有與上皮細(xì)胞的那些功能類似的控制細(xì)胞形態(tài)、分化、生長(zhǎng)、移動(dòng)性、功能表達(dá)等的功能的基膜組成成分的制劑。例如，當(dāng)進(jìn)行進(jìn)一步的貼壁培養(yǎng)時(shí)，通過本發(fā)明制備的神經(jīng)細(xì)胞和神經(jīng)組織可以分散并在存在基膜制劑的條件下培養(yǎng)。此處，“基膜組成成分”是指在動(dòng)物組織中的上皮細(xì)胞層與間質(zhì)細(xì)胞層等之間存在的薄膜形式的胞外基質(zhì)分子。例如，基膜制劑可以通過用能夠溶解細(xì)胞的脂質(zhì)的溶液、堿溶液等從支持物上去除能夠形成基膜的細(xì)胞而產(chǎn)生，所述細(xì)胞通過基膜粘附在所述支持物上?；ぶ苿┑膶?shí)例包括可作為基膜制劑商購(gòu)獲得的產(chǎn)品(例如，matrigel^tm(由corningincorporated制造：以下有時(shí)稱為基質(zhì)膠(matrigel)))，geltrex^tm(由lifetechnologies制造)，和已知為基膜成分的細(xì)胞外基質(zhì)(例如，層粘連蛋白，iv型膠原蛋白，硫酸乙酰肝素蛋白聚糖，觸覺蛋白等)。

matrigel^tm是從engelbrethholmswarn(ehs)小鼠肉瘤提取的基膜制劑。matrigel^tm的主要成分是iv型膠原蛋白、層粘連蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖和觸覺蛋白。除了這些之外，包含tgf-β、fgf、組織纖溶酶原激活物和由ehs腫瘤天然產(chǎn)生的生長(zhǎng)因子。matrigel^tm的“生長(zhǎng)因子減少的產(chǎn)品”具有比常規(guī)matrigel^tm低的生長(zhǎng)因子濃度，并且其標(biāo)準(zhǔn)濃度為：＜0.5ng/ml的egf，＜0.2ng/ml的ngf，＜5pg/ml的pdgf，5ng/ml的igf1，和1.7ng/ml的tgfβ。

為了避免不確定的成分的污染，在本發(fā)明中優(yōu)選使用分離的層粘連蛋白或?qū)诱尺B蛋白片段。

優(yōu)選地，在步驟(1)中在無飼養(yǎng)細(xì)胞的條件下培養(yǎng)多能干細(xì)胞時(shí)，將人多能干細(xì)胞在表面用分離的層粘連蛋白511或?qū)诱尺B蛋白511的e8片段(更優(yōu)選地，層粘連蛋白511的e8片段)涂覆的細(xì)胞容器中以粘附狀態(tài)培養(yǎng)。

盡管步驟(1)中培養(yǎng)多能干細(xì)胞的時(shí)間期沒有特別限制，只要可以實(shí)現(xiàn)提高步驟(2)中形成的聚集體的質(zhì)量的效果即可，其通常為0.5-144小時(shí)，優(yōu)選2-96小時(shí)，更優(yōu)選6-48小時(shí)，進(jìn)一步優(yōu)選12-48小時(shí)，進(jìn)一步更優(yōu)選18-28小時(shí)(例如，24小時(shí))。即，第一步在步驟(2)開始前0.5-144小時(shí)(優(yōu)選18-28小時(shí))開始，并且步驟(2)在步驟(1)結(jié)束時(shí)繼續(xù)進(jìn)行。

在步驟(1)中，可以酌情更換培養(yǎng)基，并且一個(gè)實(shí)施方案具體包括涉及每1-2天更換培養(yǎng)基的方法。此處，例如，培養(yǎng)基可以更換為不含下述細(xì)胞保護(hù)劑或抑制細(xì)胞死亡的試劑(如rock抑制劑等)的培養(yǎng)基。

可以適當(dāng)?shù)卮_定步驟(1)中的培養(yǎng)條件，如培養(yǎng)溫度和co2濃度。例如，盡管培養(yǎng)溫度為約30℃-約40℃，但是優(yōu)選約37℃。例如，co2濃度為約1％-約10％，優(yōu)選約5％。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在不存在飼養(yǎng)細(xì)胞的條件下，和在包含bfgf的無血清培養(yǎng)基中，以粘附狀態(tài)培養(yǎng)人多能干細(xì)胞(例如，人ips細(xì)胞)。優(yōu)選地，在表面用層粘連蛋白511、層粘連蛋白511的e8片段或玻連蛋白涂覆的細(xì)胞容器中進(jìn)行貼壁培養(yǎng)。貼壁培養(yǎng)優(yōu)選地使用essential8、tesr培養(yǎng)基、mtesr培養(yǎng)基、mtesr-e8培養(yǎng)基或stemfit培養(yǎng)基、更優(yōu)選essential8或stemfit培養(yǎng)基作為無飼養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基進(jìn)行。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在不存在飼養(yǎng)細(xì)胞的條件下，和在包含bfgf的無血清培養(yǎng)基中，懸浮培養(yǎng)人多能干細(xì)胞(例如，人ips細(xì)胞)。在懸浮培養(yǎng)中，人多能干細(xì)胞可以形成人多能干細(xì)胞聚集體。

解釋步驟(2)，其中步驟(1)得到的多能干細(xì)胞在存在sonichedgehog信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活物質(zhì)的條件下懸浮培養(yǎng)，從而形成多能干細(xì)胞的細(xì)胞聚集體。

用于步驟(2)的培養(yǎng)基沒有特別限制，只要其在上文提及的定義部分有記載即可。用于步驟(2)的培養(yǎng)基可以是含血清培養(yǎng)基或無血清培養(yǎng)基。為了避免化學(xué)上不確定成分的污染，在本發(fā)明中優(yōu)選使用無血清培養(yǎng)基。例如，可以使用無wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制物質(zhì)的無血清培養(yǎng)基。例如，為了避免復(fù)雜的制備，優(yōu)選使用補(bǔ)充了適量的商購(gòu)血清代替物(如ksr等)的無血清培養(yǎng)基(例如，補(bǔ)充了10％ksr、450μm1-一硫代甘油和1x化學(xué)成分確定的脂質(zhì)濃縮物的imdm與f-12的1∶1混合物的培養(yǎng)基，或補(bǔ)充了5％-20％ksr、neaa、丙酮酸、2巰基乙醇的gmem培養(yǎng)基)。在人es細(xì)胞的情形中，要添加到無血清培養(yǎng)基中的ksr的量通常為約1％至約30％，優(yōu)選約2％至約20％。

關(guān)于聚集體的形成，首先進(jìn)行步驟(1)得到的多能干細(xì)胞的分散操作。通過分散操作得到的“分散的細(xì)胞”是指其中例如不少于70％的細(xì)胞是單細(xì)胞并且不多于30％的細(xì)胞是2-50個(gè)細(xì)胞的團(tuán)塊的狀態(tài)。優(yōu)選地，關(guān)于分散的細(xì)胞，可以提及其中不少于80％的細(xì)胞是單細(xì)胞并且不多于20％的細(xì)胞是2-50個(gè)細(xì)胞的團(tuán)塊的狀態(tài)。分散的細(xì)胞是指幾乎沒有細(xì)胞的相互粘附(例如，平面附著)的狀態(tài)。在該實(shí)施方案的一部分中，分散的細(xì)胞是指幾乎不含細(xì)胞-細(xì)胞接合(例如，粘附連接)的狀態(tài)。

步驟(1)得到的多能干細(xì)胞的分散操作可以包含上文提及的機(jī)械分散處理、細(xì)胞分散液處理和細(xì)胞保護(hù)劑添加處理。這些處理可以聯(lián)合進(jìn)行。優(yōu)選地，細(xì)胞分散液處理與細(xì)胞保護(hù)劑添加處理同時(shí)進(jìn)行，然后進(jìn)行機(jī)械分散處理。

關(guān)于用于細(xì)胞保護(hù)劑添加處理的細(xì)胞保護(hù)劑，可以提及fgf信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活物質(zhì)，肝素，igf信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活物質(zhì)，血清，和血清代替物。此外，為了抑制由分散誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞的細(xì)胞死亡(特別地，人多能干細(xì)胞的細(xì)胞死亡)并且保護(hù)細(xì)胞，可以添加rho相關(guān)卷曲螺旋激酶(rock)抑制劑或肌球蛋白抑制劑。為了抑制由分散誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞(特別是人多能干細(xì)胞)的細(xì)胞死亡，可以在第二步培養(yǎng)開始時(shí)添加rho相關(guān)卷曲螺旋激酶(rock)抑制物質(zhì)或肌球蛋白抑制劑。關(guān)于rock抑制物質(zhì)，可以提及y-27632、fasudil(ha1077)、h-1152等。關(guān)于肌球蛋白抑制劑，可以提及blebbistatin。

關(guān)于用于細(xì)胞分散處理的細(xì)胞分散液，可以提及包含諸如胰蛋白酶、膠原蛋白酶、透明質(zhì)酸酶、彈性蛋白酶、鏈霉蛋白酶、dna酶、木瓜蛋白酶等中的任一種酶和諸如乙二胺四乙酸等的螯合劑的溶液。也可以使用商購(gòu)的細(xì)胞分散液，諸如trypleselect(由lifetechnologies制造)和trypleexpress(由lifetechnologies制造)。

關(guān)于機(jī)械分散處理方法，可以提及吹吸處理或刮刀的刮擦。

將分散的細(xì)胞懸浮在上文提及的培養(yǎng)基中。

然后，將分散的多能干細(xì)胞的混懸液接種在上文提及的培養(yǎng)容器中，將分散的多能干細(xì)胞在不與所述培養(yǎng)容器粘附的條件下培養(yǎng)，由此多個(gè)細(xì)胞聚集在一起形成聚集體。

在這種情形中，可以通過將分散的多能干細(xì)胞接種在比較大的培養(yǎng)容器中，如10cm平皿中，在一個(gè)培養(yǎng)容器中同時(shí)形成多個(gè)細(xì)胞聚集體。然而，在這種情形中，聚集體的尺寸不同。因此，例如，將給定量的分散的多能干細(xì)胞放置在多孔平板(u型底、v型底)(如96孔微量平板)的每個(gè)孔中，并且進(jìn)行靜置培養(yǎng)，由此在每個(gè)孔中細(xì)胞快速凝聚形成一個(gè)聚集體。從多個(gè)孔中回收聚集體，由此可以得到均勻的聚集體群。

步驟(2)中多能干細(xì)胞的濃度可以適當(dāng)?shù)卦O(shè)置，從而更均勻有效地形成細(xì)胞聚集體。例如，當(dāng)使用96孔微孔平板懸浮培養(yǎng)人細(xì)胞(例如，步驟(1)中得到的人ips細(xì)胞)時(shí)，向孔中添加制備得到每孔約1x10³至約1x10⁵個(gè)細(xì)胞、優(yōu)選約3x10³至約5x10⁴個(gè)細(xì)胞、更優(yōu)選約4x10³至約2x10⁴個(gè)細(xì)胞、進(jìn)一步優(yōu)選約4x10³至約1.6x10⁴個(gè)細(xì)胞、進(jìn)一步更優(yōu)選約8x10³至約1.2x10⁴個(gè)細(xì)胞的液體，并且將平板靜置以形成聚集體。

可以適當(dāng)?shù)卮_定步驟(2)的培養(yǎng)條件，諸如培養(yǎng)溫度、co2濃度等。例如，培養(yǎng)溫度為約30℃至約40℃，優(yōu)選約37℃。例如，co2濃度為約1％至約10％，優(yōu)選約5％。

在步驟(2)中，當(dāng)進(jìn)行培養(yǎng)基更換操作時(shí)，例如，可以提及不丟棄已有的培養(yǎng)基添加新鮮培養(yǎng)基的操作(培養(yǎng)基添加操作)，棄掉約一半量的已有的培養(yǎng)基(已有的培養(yǎng)基體積的約30-90％，例如，40-60％)并且添加約一半量的新鮮培養(yǎng)基(已有的培養(yǎng)基體積的約30-90％，例如，約40-60％)的操作(一半培養(yǎng)基更換操作)，和棄掉約全部量的已有的培養(yǎng)基(不少于已有的培養(yǎng)基的量的90％)并且添加約全部量的新鮮培養(yǎng)基(不少于已有的培養(yǎng)基的量的90％)的操作(完全培養(yǎng)基更換操作)。

當(dāng)在特定時(shí)間點(diǎn)添加特定成分(例如，分化誘導(dǎo)因子)時(shí)，例如，可以進(jìn)行這樣的操作：計(jì)算終濃度，棄掉約一半量的已有的培養(yǎng)基，并且添加約一半量的新鮮培養(yǎng)基(一半培養(yǎng)基更換操作)，所述新鮮培養(yǎng)基包含濃度高于所述終濃度(具體地，所述終濃度的1.5倍-3.0倍，例如，約為終濃度的2倍)的特定成分。

當(dāng)在特定時(shí)間點(diǎn)保持已有的培養(yǎng)基中包含的特定成分的濃度時(shí)，例如，可以進(jìn)行這樣的操作：棄掉約一半量的已有的培養(yǎng)基，并且添加約一半量的新鮮培養(yǎng)基，所述新鮮培養(yǎng)基包含濃度與已有的培養(yǎng)基中相同的特定成分。

當(dāng)通過在特定時(shí)間點(diǎn)稀釋而降低已有的培養(yǎng)基中包含的成分的濃度時(shí)，例如，可以每天多次進(jìn)行培養(yǎng)基更換操作，優(yōu)選在1小時(shí)內(nèi)進(jìn)行多次(例如，2-3次)。此外，當(dāng)通過在特定時(shí)間點(diǎn)的稀釋降低已有的培養(yǎng)基中包含的成分的濃度時(shí)，可以將細(xì)胞或聚集體轉(zhuǎn)移到另一個(gè)培養(yǎng)容器中。

盡管用于培養(yǎng)基更換操作的工具沒有特別限制，例如，可以提及移液管、微量移液管(pipetman)、多通道微量移液管(multichannelpipetman)、連續(xù)的分配器等。例如，當(dāng)使用96孔平板作為培養(yǎng)容器時(shí)，可以使用多通道微量移液管(multichannelpipetman)。

形成細(xì)胞聚集體所需要的懸浮培養(yǎng)的時(shí)間期可以依據(jù)要用的多能干細(xì)胞適當(dāng)?shù)卮_定，以使細(xì)胞可以均勻地聚集。為了形成均勻的細(xì)胞聚集體，理想地是其盡可能短。用于分散的細(xì)胞以形成細(xì)胞聚集體的步驟可以分成聚集細(xì)胞的步驟和由所聚集的細(xì)胞形成細(xì)胞聚集體的步驟。在人多能干細(xì)胞(例如，人ips細(xì)胞)的情形中，在接種分散的細(xì)胞(即，在懸浮培養(yǎng)開始時(shí))以使細(xì)胞聚集的步驟中，優(yōu)選地在約24小時(shí)內(nèi)，更優(yōu)選在約12小時(shí)內(nèi)，形成聚集的細(xì)胞。在人多能干細(xì)胞(例如，人ips細(xì)胞)的情形中，從接種分散的細(xì)胞的時(shí)間點(diǎn)(即，在懸浮培養(yǎng)開始的時(shí)間)到形成聚集體的時(shí)間期，例如，優(yōu)選在約72小時(shí)內(nèi)，更優(yōu)選在約48小時(shí)內(nèi)形成聚集體。細(xì)胞聚集體形成的時(shí)間期可以通過控制使細(xì)胞聚集的工具、離心條件等而適當(dāng)?shù)卣{(diào)節(jié)。

可以基于聚集體的尺寸和細(xì)胞數(shù)目、宏觀形態(tài)、組織染色分析的微觀形態(tài)和其均勻性、分化-和未分化-標(biāo)記的表達(dá)及其均勻性、分化標(biāo)記表達(dá)的控制及其同步性、聚集體之間的分化效率的重現(xiàn)性等，確定細(xì)胞聚集體的形成及其均勻性。

在聚集體形成后，聚集體可以按原樣繼續(xù)培養(yǎng)。步驟(2)中懸浮培養(yǎng)的時(shí)間期通常為約12小時(shí)-6天，優(yōu)選約12小時(shí)-48小時(shí)。

用于步驟(2)的培養(yǎng)基包含sonichedgehog信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活物質(zhì)。在步驟(1)中，多能干細(xì)胞在無飼養(yǎng)細(xì)胞的條件下進(jìn)行維持培養(yǎng)；并且在第二步中，將在第一步中得到的多能干細(xì)胞在包含sonichedgehog信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活物質(zhì)的培養(yǎng)基(優(yōu)選是無血清培養(yǎng)基)中懸浮培養(yǎng)，從而提高聚集體的質(zhì)量，并且能夠以高效率形成球形的、表面平滑的、未塌陷的、內(nèi)部致密的維持未分化特性的細(xì)胞聚集體。

sonichedgehog(以下有時(shí)表示為shh)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活物質(zhì)是能夠提高由shh介導(dǎo)的增強(qiáng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的物質(zhì)。shh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活物質(zhì)的實(shí)例包括屬于hedgehog家族的蛋白(例如，shh和ihh)，shh受體，shh受體激動(dòng)劑，purmorphamine(pma；9-環(huán)己基-n-[4-(4-嗎啉基)苯基]-2-(1-萘基氧基)-9h-嘌呤-6-胺)，sag(平滑的激動(dòng)劑；n-甲基-n’-(3-吡啶基芐基)-n’-(3-氯代苯并[b]噻吩-2-羰基)-1，4-二氨基環(huán)己烷)等。關(guān)于shh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活物質(zhì)，例如，優(yōu)選的是sag，purmorphamine(pma)和shh蛋白(genbank登錄號(hào)：nm_000193，np_000184)，并且更優(yōu)選sag。培養(yǎng)基中shh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活物質(zhì)的濃度可以適當(dāng)?shù)卮_定，以落在能夠?qū)崿F(xiàn)前述效果的范圍內(nèi)。sag通常以1-2000nm、優(yōu)選10nm-1000nm、優(yōu)選10nm-700nm、30nm-700nm、50nm-700nm、更優(yōu)選100nm-600nm、進(jìn)一步優(yōu)選100nm-500nm的濃度使用。當(dāng)使用不同于sag的shh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活物質(zhì)時(shí)，其理想地以賦予與上文提及的濃度的sag的活性相當(dāng)?shù)膕hh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)促進(jìn)活性的濃度使用。在pma的情形中，例如，濃度通常對(duì)應(yīng)于0.002-20μm，優(yōu)選0.02-2μm，更優(yōu)選約0.2μm；并且在shh蛋白的情形中，例如，濃度通常對(duì)應(yīng)于約10-1000ng/ml，優(yōu)選約10-300ng/ml。

培養(yǎng)基中sonichedgehog信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活物質(zhì)的濃度在步驟(2)期間可能變化。例如，提供sonichedgehog信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活物質(zhì)以落在上文提及的步驟(2)開始時(shí)的范圍之內(nèi)，并且濃度可以以每2-4天40-60％的比例逐漸或逐步地降低。

向培養(yǎng)基中添加sonichedgehog信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活物質(zhì)的時(shí)間沒有特別限制，只要可以提供上文提及的效果即可，但是越早添加能夠獲得更高的效果。sonichedgehog信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活物質(zhì)通常在自步驟(2)開始時(shí)3天內(nèi)、優(yōu)選在2天內(nèi)、更優(yōu)選在1天內(nèi)、并且進(jìn)一步優(yōu)選地在步驟(2)開始時(shí)添加到培養(yǎng)基中。

在優(yōu)選的實(shí)施方案中，在步驟(2)中，在步驟(1)中得到的人多能干細(xì)胞(例如，人ips細(xì)胞)在包含sonichedgehog信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活物質(zhì)(例如，sag，shh蛋白，pma)的無血清培養(yǎng)基中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，從而形成聚集體。sonichedgehog信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活物質(zhì)優(yōu)選在懸浮培養(yǎng)開始時(shí)就包含在培養(yǎng)基中。還可以向培養(yǎng)基中添加rock抑制物質(zhì)(例如，y-27632)。培養(yǎng)的時(shí)間期是12小時(shí)-6天，優(yōu)選12小時(shí)-48小時(shí)。形成的聚集體優(yōu)選是均勻的聚集體。

例如，將在步驟(1)中得到的人多能干細(xì)胞(例如，人ips細(xì)胞)回收，分散成單細(xì)胞或接近單細(xì)胞的狀態(tài)，懸浮在包含sonichedgehog信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活物質(zhì)(例如，sag，shh蛋白，pma)的無血清培養(yǎng)基中，并且進(jìn)行懸浮培養(yǎng)。所述無血清培養(yǎng)基可以包含rock抑制物質(zhì)(例如，y-27632)。將人多能干細(xì)胞(例如，ips細(xì)胞)的混懸液接種在上文提及的培養(yǎng)容器中，并且在多能干細(xì)胞不與培養(yǎng)容器粘附的條件下培養(yǎng)分散的多能干細(xì)胞，由此組裝多個(gè)多能干細(xì)胞形成聚集體。培養(yǎng)的時(shí)間期是12小時(shí)-6天，優(yōu)選12小時(shí)-48小時(shí)。形成的聚集體優(yōu)選是均勻的聚集體。

通過以這種方式進(jìn)行步驟(2)，形成步驟(1)中得到的多能干細(xì)胞的聚集體或由其衍生的細(xì)胞。本發(fā)明還提供制備所述聚集體的方法。與通過在步驟(2)中不進(jìn)行利用sonichedgehog信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活物質(zhì)的處理形成的聚集體相比，步驟(2)中得到的聚集體具有更高的質(zhì)量。具體而言，可以得到具有高比例的球形細(xì)胞聚集體的聚集體群，所述球形細(xì)胞聚集體具有平滑的表面、致密的內(nèi)部、和未塌陷的形狀。在一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)自第二步開始起第6天隨機(jī)選擇聚集體(例如，不少于100個(gè)聚集體)時(shí)，例如，未塌陷的聚集體和/或非囊性聚集體的比例總數(shù)不小于30％，優(yōu)選不小于50％。

步驟(2)中得到的聚集體具有向多種分化細(xì)胞和分化組織分化的潛能。在一個(gè)實(shí)施方案中，步驟(2)中得到的聚集體具有向神經(jīng)細(xì)胞(例如，視網(wǎng)膜細(xì)胞)或神經(jīng)組織(例如，視網(wǎng)膜組織)分化的潛能。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過使用步驟(1)中得到的并且在步驟(2)中具有向至少神經(jīng)細(xì)胞或神經(jīng)組織(優(yōu)選地，視網(wǎng)膜組織，視網(wǎng)膜祖先細(xì)胞，或視網(wǎng)膜層專有的神經(jīng)元)分化的潛能的干細(xì)胞(優(yōu)選地，具有向至少神經(jīng)細(xì)胞或神經(jīng)組織(優(yōu)選地，視網(wǎng)膜組織，視網(wǎng)膜祖先細(xì)胞，或視網(wǎng)膜層專有的神經(jīng)元)分化的潛能的oct3/4陽(yáng)性的干細(xì)胞)，可以得到包含具有向至少神經(jīng)細(xì)胞或神經(jīng)組織(優(yōu)選地，視網(wǎng)膜組織，視網(wǎng)膜祖先細(xì)胞，或視網(wǎng)膜層專有的神經(jīng)元)分化的潛能的干細(xì)胞(例如，oct3/4陽(yáng)性的干細(xì)胞)的聚集體。通過在適當(dāng)?shù)姆只瘲l件下培養(yǎng)步驟(2)中得到的聚集體，可以高效地誘導(dǎo)多種分化的細(xì)胞和分化的組織(例如，神經(jīng)細(xì)胞，諸如視網(wǎng)膜細(xì)胞等，神經(jīng)組織，諸如視網(wǎng)膜組織等)。

在一個(gè)實(shí)施方案中，在步驟(2)中得到的聚集體包含與在步驟(1)中得到的多能干細(xì)胞與神經(jīng)細(xì)胞或神經(jīng)組織(優(yōu)選地，視網(wǎng)膜細(xì)胞或視網(wǎng)膜組織)之間的中間階段的細(xì)胞相對(duì)應(yīng)的細(xì)胞。這些細(xì)胞表達(dá)多能性狀態(tài)標(biāo)記oct3/4、外胚層標(biāo)記(sox1，sox2，n-鈣粘蛋白，tp63)、神經(jīng)外胚層標(biāo)記(sox1，sox2，巢蛋白，n-鈣粘蛋白，otx2)和前文提及的神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)記中的任一種。即，在一個(gè)實(shí)施方案中，在步驟(2)中得到的聚集體包含表達(dá)多能性狀態(tài)標(biāo)記oct3/4、外胚層標(biāo)記(sox1，sox2，n-鈣粘蛋白，tp63)、神經(jīng)外胚層標(biāo)記(sox1，sox2，巢蛋白，n-鈣粘蛋白，otx2)和前文提及的神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)記中的任一種的細(xì)胞的混合物。即，在步驟(2)中得到的聚集體包含具有向至少神經(jīng)細(xì)胞或神經(jīng)組織(優(yōu)選地，視網(wǎng)膜細(xì)胞或視網(wǎng)膜組織)分化的潛能的干細(xì)胞，和/或神經(jīng)細(xì)胞或神經(jīng)組織(優(yōu)選地，視網(wǎng)膜細(xì)胞或視網(wǎng)膜組織)的祖先/前體細(xì)胞。另外，所述祖先/前體細(xì)胞特征在于，當(dāng)將它們?cè)谝阎倪m當(dāng)培養(yǎng)條件下培養(yǎng)時(shí)，它們表現(xiàn)出表達(dá)前文提及的神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)記(優(yōu)選地，視網(wǎng)膜細(xì)胞標(biāo)記)的能力(competence)。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，在步驟(2)中得到的聚集體包含具有向至少神經(jīng)細(xì)胞或神經(jīng)組織(優(yōu)選地，視網(wǎng)膜細(xì)胞或視網(wǎng)膜組織)分化的潛能的oct3/4陽(yáng)性干細(xì)胞，和/或神經(jīng)細(xì)胞或神經(jīng)組織(優(yōu)選地，視網(wǎng)膜細(xì)胞或視網(wǎng)膜組織)的祖先/前體細(xì)胞。在步驟(2)中得到的聚集體中包含的一部分細(xì)胞可以表達(dá)前文提及的神經(jīng)組織標(biāo)記。在一個(gè)實(shí)施方案中，在步驟(2)中得到的聚集體可以包含不少于總細(xì)胞的50％(例如，不少于70％)的比例的oct3/4陽(yáng)性細(xì)胞。

在步驟(2)中，當(dāng)進(jìn)行培養(yǎng)基更換操作時(shí)，例如，可以提及不丟棄已有的培養(yǎng)基添加新鮮培養(yǎng)基的操作(培養(yǎng)基添加操作)，棄掉約一半量的已有的培養(yǎng)基(已有的培養(yǎng)基體積的約30-90％，例如，約40-60％)并且添加約一半量的新鮮培養(yǎng)基(已有的培養(yǎng)基體積的約30-90％，例如，約40-60％)的操作(一半培養(yǎng)基更換操作)，和棄掉約全部量的已有的培養(yǎng)基(不少于已有的培養(yǎng)基的量的90％)并且添加約全部量的新鮮培養(yǎng)基(不少于已有的培養(yǎng)基的量的90％)的操作(完全培養(yǎng)基更換操作)。

當(dāng)在特定時(shí)間點(diǎn)添加特定成分(例如，分化誘導(dǎo)因子)時(shí)，例如，可以進(jìn)行這樣的操作：計(jì)算終濃度，棄掉約一半量的已有的培養(yǎng)基，并且添加約一半量的新鮮培養(yǎng)基(一半培養(yǎng)基更換操作)，所述新鮮培養(yǎng)基包含濃度高于所述終濃度(具體地，所述終濃度的1.5-3.0倍，例如，約為終濃度的2倍)的特定成分。

當(dāng)在特定時(shí)間點(diǎn)保持已有的培養(yǎng)基中包含的特定成分的濃度時(shí)，例如，可以進(jìn)行這樣的操作：棄掉約一半量的已有的培養(yǎng)基，并且添加約一半量的新鮮培養(yǎng)基，所述新鮮培養(yǎng)基包含濃度與已有的培養(yǎng)基中相同的特定成分。

當(dāng)通過在特定時(shí)間點(diǎn)的稀釋而降低已有的培養(yǎng)基中包含的成分的濃度時(shí)，例如，可以每天多次進(jìn)行培養(yǎng)基更換操作，優(yōu)選在1小時(shí)內(nèi)進(jìn)行多次(例如，2-3次)。此外，當(dāng)通過在特定時(shí)間點(diǎn)的稀釋降低已有的培養(yǎng)基中包含的成分的濃度時(shí)，可以將細(xì)胞或聚集體轉(zhuǎn)移到另一個(gè)培養(yǎng)容器中。

盡管用于培養(yǎng)基更換操作的工具沒有特別限制，例如，可以提及移液管、微量移液管(pipetman)、多通道微量移液管(multichannelpipetman)、連續(xù)的分配器等。例如，當(dāng)使用96孔平板作為培養(yǎng)容器時(shí)，可以使用多通道微量移液管(multichannelpipetman)。

解釋步驟(3)，其中由步驟(2)中得到的聚集體誘導(dǎo)包含視網(wǎng)膜細(xì)胞或視網(wǎng)膜組織的聚集體。

將步驟(2)中得到的聚集體在存在或不存在(優(yōu)選在存在)適當(dāng)?shù)姆只T導(dǎo)因子的條件下懸浮培養(yǎng)，由此可以得到包含視網(wǎng)膜細(xì)胞或視網(wǎng)膜組織的聚集體。

關(guān)于通過懸浮培養(yǎng)誘導(dǎo)細(xì)胞聚集體成為視網(wǎng)膜細(xì)胞或視網(wǎng)膜組織的方法，已經(jīng)報(bào)道了多種方法。例如，已知在nature，472，51-56(2011)，cellstemcell，10(6)，771-775(2012)等中記載的方法，但是所述方法不限于這些。

關(guān)于在不存在分化誘導(dǎo)因子的條件下制備視網(wǎng)膜細(xì)胞或視網(wǎng)膜組織的方法，可以提供及這樣的方法，其包括在含血清的培養(yǎng)基或無血清培養(yǎng)基中誘導(dǎo)步驟(2)中得到的聚集體自發(fā)分化為包括視網(wǎng)膜細(xì)胞的神經(jīng)細(xì)胞。關(guān)于前文提及的含血清培養(yǎng)基或無血清培養(yǎng)基，可以提及不含用于維持未分化狀態(tài)的因子的血清培養(yǎng)基或無血清培養(yǎng)基。在向神經(jīng)細(xì)胞的分化過程中產(chǎn)生的視網(wǎng)膜細(xì)胞可以進(jìn)行選擇和分離。對(duì)于選擇和分離，可以使用facs或macs。另外，也可以使用容易產(chǎn)生視網(wǎng)膜的多能干細(xì)胞作為步驟(1)中的起始材料。

優(yōu)選地，將步驟(2)中得到的聚集體在存在分化誘導(dǎo)因子的條件下進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，從而產(chǎn)生包含視網(wǎng)膜細(xì)胞或視網(wǎng)膜組織的聚集體。

此處所用的分化誘導(dǎo)因子沒有特別限制，只要其是具有誘導(dǎo)向視網(wǎng)膜細(xì)胞或視網(wǎng)膜組織分化的能力的因子即可。其實(shí)例包括bmp信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)激活物質(zhì)，基膜制劑，wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制物質(zhì)，tgfβ家族信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制物質(zhì)等。對(duì)分化誘導(dǎo)因子的反應(yīng)隨細(xì)胞的種類和分化狀態(tài)(能力或潛能)而不同，并且分化誘導(dǎo)因子的作用甚至在分化誘導(dǎo)過程中可能改變，這取決于分化誘導(dǎo)因子的濃度和加入的時(shí)機(jī)。此外，已知分化誘導(dǎo)因子表現(xiàn)出相似效果的最佳濃度隨動(dòng)物物種而不同，并且，例如，已知在小鼠細(xì)胞與人細(xì)胞之間，人細(xì)胞的最佳濃度通常較高(特別是在外胚層、內(nèi)胚層中)。關(guān)于多能干細(xì)胞向特定細(xì)胞或組織的分化誘導(dǎo)的方法存在多個(gè)報(bào)道，并且可以選擇適于目的細(xì)胞或組織的分化誘導(dǎo)因子或分化誘導(dǎo)方法。

優(yōu)選地，使用bmp信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活物質(zhì)作為分化誘導(dǎo)因子。即，將步驟(2)中得到的聚集體在存在bmp信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活物質(zhì)的條件下懸浮培養(yǎng)，以產(chǎn)生包含視網(wǎng)膜細(xì)胞或視網(wǎng)膜組織的聚集體。

bmp信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活物質(zhì)是能夠增強(qiáng)由bmp介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的物質(zhì)。bmp信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活物質(zhì)的實(shí)例包括bmp蛋白如bmp2，bmp4或bmp7等，gdf蛋白如gdf7等，抗-bmp受體抗體，bmp部分肽等。bmp2蛋白，bmp4蛋白和bmp7蛋白可獲自，例如，r&dsystems，而gdf7蛋白可獲自，例如，wakopurechemicalindustries，ltd。所述bmp信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活物質(zhì)優(yōu)選是bmp4。

用于本發(fā)明的分化誘導(dǎo)因子(例如，bmp4)通常是哺乳動(dòng)物分化誘導(dǎo)因子。哺乳動(dòng)物的實(shí)例包括上文提及的那些。由于分化誘導(dǎo)因子可能在哺乳動(dòng)物物種之間具有交叉反應(yīng)性，也可以使用任意哺乳動(dòng)物的分化誘導(dǎo)因子，只要可以實(shí)現(xiàn)培養(yǎng)的多能干細(xì)胞的分化誘導(dǎo)即可。優(yōu)選地，使用與培養(yǎng)的細(xì)胞相同物種的哺乳動(dòng)物分化誘導(dǎo)因子。例如，當(dāng)誘導(dǎo)人多能干細(xì)胞向視網(wǎng)膜組織或視網(wǎng)膜細(xì)胞分化時(shí)，優(yōu)選使用人分化誘導(dǎo)因子(例如，bmp4)。

用于本發(fā)明的分化誘導(dǎo)因子(例如，bmp4)優(yōu)選是分離的。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括提供分離的分化誘導(dǎo)因子(例如，bmp4)的步驟。并且，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括向用于步驟(3)的培養(yǎng)基中外源添加分離的分化誘導(dǎo)因子(例如，bmp4)的步驟。

在一個(gè)實(shí)施方案中，用于步驟(3)的培養(yǎng)基是補(bǔ)充了分化誘導(dǎo)因子(例如，bmp4)的無血清培養(yǎng)基或含血清培養(yǎng)基(優(yōu)選無血清培養(yǎng)基)。所述培養(yǎng)基可以包含或可以不包含基膜制劑。關(guān)于基膜制劑，可以使用上文提及的那些。當(dāng)添加基膜制劑時(shí)，其濃度例如為使用基質(zhì)膠時(shí)的體積濃度的0.1-10％，更優(yōu)選為0.5％-2％。為避免化學(xué)上不確定物質(zhì)的污染，不添加基膜制劑。

用于所述培養(yǎng)基的無血清培養(yǎng)基或含血清培養(yǎng)基沒有特別限制，只要其是上文提及的即可。為了避免復(fù)雜的制備，例如，優(yōu)選使用補(bǔ)充了適量的商購(gòu)血清代替物(如ksr等)的無血清培養(yǎng)基(例如，補(bǔ)充了10％ksr、450μm1-一硫代甘油和1x化學(xué)成分確定的脂質(zhì)濃縮物的imdm與f-12的1∶1混合物的培養(yǎng)基或補(bǔ)充了5％-20％ksr、neaa、丙酮酸、2巰基乙醇的gmem培養(yǎng)基)。在人es細(xì)胞的情形中，要添加到無血清培養(yǎng)基中的ksr的量通常為約1％至約20％，優(yōu)選約2％至約20％。

關(guān)于要用于步驟(3)的培養(yǎng)基(優(yōu)選是無血清培養(yǎng)基)，可以直接使用步驟(2)所用的培養(yǎng)基(優(yōu)選是無血清培養(yǎng)基)或可以用新鮮培養(yǎng)基(優(yōu)選是無血清培養(yǎng)基)替換。當(dāng)步驟(2)中所用的不含分化誘導(dǎo)因子(例如，bmp4)的無血清培養(yǎng)基直接用于步驟(3)時(shí)，可以向所述培養(yǎng)基中添加分化誘導(dǎo)因子(例如，bmp4)。

在一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)添加到步驟(2)的培養(yǎng)基中的shh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活物質(zhì)的濃度比較低(例如，對(duì)于sag，不大于700nm，并且對(duì)于其他shh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活物質(zhì)，以賦予與上文提及的濃度的sag相當(dāng)或比其更低的shh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)促進(jìn)活性的濃度)時(shí)，培養(yǎng)基更換不是必要的，并且可以向步驟(2)中所用的培養(yǎng)基中添加分化誘導(dǎo)因子(例如，bmp4)。另一方面，當(dāng)shh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活物質(zhì)的濃度比較高(例如，對(duì)于sag，超過700nm或不小于1000nm，并且對(duì)于其他shh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活物質(zhì)，以賦予與上文提及的濃度的sag相當(dāng)?shù)膕hh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)促進(jìn)活性的濃度)時(shí)，需要將培養(yǎng)基更換為含有分化誘導(dǎo)因子(例如，bmp4)的新鮮培養(yǎng)基，以抑制在加入分化誘導(dǎo)因子時(shí)殘留的shh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活物質(zhì)的影響。

在優(yōu)選的實(shí)施方案中，當(dāng)相對(duì)于sag的shh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)促進(jìn)活性計(jì)算時(shí)，在用于步驟(3)的培養(yǎng)基中的shh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活物質(zhì)的濃度不大于700nm，優(yōu)選不大于300nm，更優(yōu)選不大于10nm，進(jìn)一步優(yōu)選不大于0.1nm，進(jìn)一步優(yōu)選不含shh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活物質(zhì)。“不含shh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活物質(zhì)”的培養(yǎng)基還包括基本上不含shh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活物質(zhì)的培養(yǎng)基，例如，不含處在對(duì)向視網(wǎng)膜細(xì)胞或視網(wǎng)膜組織的選擇性分化施加不利影響的濃度的shh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活物質(zhì)的培養(yǎng)基?！安缓瑂hh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活物質(zhì)”的培養(yǎng)基還包括基本上沒有補(bǔ)充shh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活物質(zhì)的培養(yǎng)基，例如，沒有補(bǔ)充處在對(duì)向視網(wǎng)膜細(xì)胞或視網(wǎng)膜組織的選擇性分化施加不利影響的濃度的shh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活物質(zhì)的培養(yǎng)基。

培養(yǎng)基中分化誘導(dǎo)因子(例如，bmp信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活物質(zhì))的濃度可以是可以誘導(dǎo)多能干細(xì)胞或由其衍生的細(xì)胞的聚集體向視網(wǎng)膜細(xì)胞分化的濃度。例如，在人bmp4的情形中，將其以約0.01nm至約1μm，優(yōu)選約0.1nm至約100nm，更優(yōu)選約1nm至約10nm，進(jìn)一步優(yōu)選約1.5nm(55ng/ml)的濃度添加到培養(yǎng)基中。當(dāng)使用不同于bmp4的bmp信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活物質(zhì)時(shí)，其理想地以施加與上文提及的濃度的bmp4相當(dāng)?shù)腷mp信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)促進(jìn)活性的濃度使用。

培養(yǎng)基中分化誘導(dǎo)因子(例如，bmp4)的濃度在步驟(3)期間可以變化。例如，在步驟(3)開始時(shí)提供分化誘導(dǎo)因子(例如，bmp4)落在上文提及的范圍內(nèi)，并且濃度以每2-4天40-60％的比例逐漸或逐步地降低。

分化誘導(dǎo)因子(例如，bmp4)可以在自步驟(2)的懸浮培養(yǎng)起始時(shí)約24小時(shí)或以后加入，并且也可以在自懸浮培養(yǎng)起始時(shí)數(shù)天內(nèi)(例如，15天內(nèi))加入到培養(yǎng)基中。優(yōu)選地，分化誘導(dǎo)因子(例如，bmp4)在自懸浮培養(yǎng)起始第1天至第15天內(nèi)、更優(yōu)選第1天至第9天內(nèi)、更優(yōu)選第3天至第8天內(nèi)、仍然更優(yōu)選地第3天至第6天內(nèi)加入到培養(yǎng)基中。

向培養(yǎng)基中加入分化誘導(dǎo)因子(例如，bmp4)并且開始將聚集體向視網(wǎng)膜細(xì)胞的誘導(dǎo)分化后，向所述培養(yǎng)基中加入分化誘導(dǎo)因子(例如，bmp4)不是必需的，并且培養(yǎng)基可以更換為分別不含分化誘導(dǎo)因子(例如，bmp4)的無血清培養(yǎng)基或含血清培養(yǎng)基。在一個(gè)實(shí)施方案中，在開始將聚集體向神經(jīng)細(xì)胞的分化誘導(dǎo)后，通過將培養(yǎng)基更換為分別不含分化誘導(dǎo)因子(例如，bmp4)的無血清培養(yǎng)基或含血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中分化誘導(dǎo)因子(例如，bmp4)的濃度以每2-4天40-60％的比例逐漸或逐步降低。結(jié)果，分化誘導(dǎo)因子(例如，bmp4)的濃度可以逐步被稀釋，并且分化誘導(dǎo)因子作用的效果和持續(xù)時(shí)間可以得到限制。

在具體的實(shí)施方案中，在開始懸浮培養(yǎng)后(即，在前述步驟(2)開始后)第1-9天、優(yōu)選第2-8天、進(jìn)一步優(yōu)選第3天或第4天，培養(yǎng)基可以被部分或完全更換為包含bmp4的培養(yǎng)基，以調(diào)節(jié)bmp4的終濃度至約1-10nm，并且可以將細(xì)胞在存在bmp4的條件下培養(yǎng)約1-12天，優(yōu)選2-9天，更優(yōu)選2-5天。為了將bmp4的濃度保持在相同水平，可以將培養(yǎng)基用包含bmp4的培養(yǎng)基部分或完全更換一次或兩次。備選地，如上文提及的，bmp4的濃度也可以逐步減小。

其中已經(jīng)開始向視網(wǎng)膜細(xì)胞分化的誘導(dǎo)的細(xì)胞可以通過例如檢測(cè)所述細(xì)胞中視網(wǎng)膜祖先細(xì)胞標(biāo)記基因(例如，rx基因(別名rax)，pax6基因，chx10基因)的表達(dá)而證實(shí)。將通過使用在rx基因座中敲入了熒光報(bào)告蛋白基因(如gfp等)的多能干細(xì)胞在步驟(2)中形成的聚集體在存在向視網(wǎng)膜細(xì)胞分化誘導(dǎo)需要的濃度的分化誘導(dǎo)因子(例如，bmp4)的條件下懸浮培養(yǎng)，并且檢測(cè)由所表達(dá)的熒光受體蛋白發(fā)射的熒光，由此可以證實(shí)向視網(wǎng)膜細(xì)胞分化誘導(dǎo)開始的時(shí)間點(diǎn)。作為步驟(3)的一個(gè)實(shí)施方案，在包含向視網(wǎng)膜細(xì)胞分化誘導(dǎo)需要的濃度的分化誘導(dǎo)因子(例如，bmp4)的無血清培養(yǎng)基或含血清培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)步驟(2)中形成的聚集體的步驟，直到開始出現(xiàn)表達(dá)視網(wǎng)膜祖先細(xì)胞標(biāo)記基因(例如，rx基因，pax6基因，chx10基因)的細(xì)胞，由此得到包含視網(wǎng)膜祖先細(xì)胞的細(xì)胞聚集體。

在步驟(3)中，當(dāng)進(jìn)行培養(yǎng)基更換操作時(shí)，例如，可以提及培養(yǎng)基添加操作，一半培養(yǎng)基更換操作和完全培養(yǎng)基更換操作。

當(dāng)在特定時(shí)間點(diǎn)加入特定的成分(例如，分化誘導(dǎo)因子)時(shí)，例如，可以進(jìn)行這樣的操作：計(jì)算終濃度，棄掉約一半量的已有的培養(yǎng)基，并且添加約一半量的新鮮培養(yǎng)基(一半培養(yǎng)基更換操作)，所述新鮮培養(yǎng)基包含濃度高于所述終濃度(具體地，所述終濃度的1.5-3.0倍，例如，約為終濃度的2倍)的特定成分。

當(dāng)在特定時(shí)間點(diǎn)保持已有的培養(yǎng)基中包含的特定成分的濃度時(shí)，例如，可以進(jìn)行這樣的操作：棄掉約一半量的已有的培養(yǎng)基，并且添加約一半量的新鮮培養(yǎng)基，所述新鮮培養(yǎng)基包含濃度與已有的培養(yǎng)基中相同的特定成分。

當(dāng)通過在特定時(shí)間點(diǎn)的稀釋而降低已有的培養(yǎng)基中包含的成分的濃度時(shí)，例如，可以每天多次進(jìn)行培養(yǎng)基更換操作，優(yōu)選在1小時(shí)內(nèi)進(jìn)行多次(例如，2-3次)。此外，當(dāng)通過在特定時(shí)間點(diǎn)的稀釋降低已有的培養(yǎng)基中包含的成分的濃度時(shí)，可以將細(xì)胞或聚集體轉(zhuǎn)移到另一個(gè)培養(yǎng)容器中。

盡管用于培養(yǎng)基更換操作的工具沒有特別限制，例如，可以提及移液管、微量移液管(pipetman)、多通道微量移液管(multichannelpipetman)、連續(xù)的分配器等。例如，當(dāng)使用96孔平板作為培養(yǎng)容器時(shí)，可以使用多通道微量移液管(multichannelpipetman)。

可以適當(dāng)?shù)卮_定步驟(3)中的培養(yǎng)條件，如培養(yǎng)溫度和co2濃度等。例如，培養(yǎng)溫度為約30℃-約40℃，優(yōu)選約37℃。例如，co2濃度為約1％-約10％，優(yōu)選約5％。

通過這樣的培養(yǎng)，誘導(dǎo)形成步驟(2)中得到的聚集體的細(xì)胞向視網(wǎng)膜祖先細(xì)胞分化，由此可以得到包含視網(wǎng)膜祖先細(xì)胞的聚集體。本發(fā)明還提供制備此類包含視網(wǎng)膜祖先細(xì)胞的聚集體的方法。得到包含視網(wǎng)膜祖先細(xì)胞的聚集體的事實(shí)可以通過例如檢測(cè)所述聚集體中表達(dá)rax、pax6或chx10(它們是視網(wǎng)膜祖先細(xì)胞標(biāo)記)的細(xì)胞的存在而證實(shí)。步驟(3)的一個(gè)實(shí)施方案是在包含處于向視網(wǎng)膜細(xì)胞分化誘導(dǎo)所需要的濃度的bmp信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活物質(zhì)(例如，bmp4)的無血清培養(yǎng)基或含血清培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)步驟(2)中形成的聚集體的步驟，直到開始出現(xiàn)表達(dá)rx基因的細(xì)胞，由此得到包含視網(wǎng)膜祖先細(xì)胞的聚集體。在一個(gè)實(shí)施方案中，進(jìn)行步驟(3)的培養(yǎng)直到聚集體中包含的不少于20％(優(yōu)選地，不少于30％，不少于40％，不少于50％，不少于60％)的細(xì)胞表達(dá)rx。

得到的包含視網(wǎng)膜祖先細(xì)胞的聚集體可以按其原樣作為用于評(píng)價(jià)毒性或功效的試劑使用。將包含視網(wǎng)膜祖先細(xì)胞的聚集體進(jìn)行分散處理(例如，胰蛋白酶/edta處理或木瓜蛋白酶處理)，并且使用facs或macs對(duì)得到的細(xì)胞進(jìn)行選擇，由此也可以得到高純度的視網(wǎng)膜祖先細(xì)胞。

此外，可以將包含視網(wǎng)膜組織的聚集體繼續(xù)在無血清培養(yǎng)基或含血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)，以使視網(wǎng)膜組織中包含的視網(wǎng)膜細(xì)胞(例如，視網(wǎng)膜祖先細(xì)胞)進(jìn)一步分化，由此可以產(chǎn)生神經(jīng)上皮結(jié)構(gòu)樣視網(wǎng)膜組織。

用于所述培養(yǎng)基的無血清培養(yǎng)基或含血清培養(yǎng)基沒有特別限制，只要其是上文提及的即可。例如，可以提及作為補(bǔ)充了10％胎牛血清、n2補(bǔ)充物、100μm牛磺酸和500nm視黃酸的dmem-f12培養(yǎng)基的含血清培養(yǎng)基或補(bǔ)充了適量的商購(gòu)得到的血清代替物如ksr等的無血清培養(yǎng)基(例如，補(bǔ)充了10％ksr、450μm1-一硫代甘油和1x化學(xué)上明確的脂質(zhì)濃縮物的imdm和f-12的1∶1混合物的培養(yǎng)基)等。

盡管從視網(wǎng)膜祖先細(xì)胞誘導(dǎo)視網(wǎng)膜組織的培養(yǎng)時(shí)間期隨目的視網(wǎng)膜層專有的神經(jīng)元而不同，但是，例如，該時(shí)間期為約7天至約200天。

視網(wǎng)膜組織覆蓋著聚集體的表面存在。在懸浮培養(yǎng)結(jié)束后，可以將聚集體用固定劑(如多聚甲醛溶液等)固定，并且制備冷凍切片，隨后可以通過免疫染色等證實(shí)具有層結(jié)構(gòu)的視網(wǎng)膜組織的形成。由于視網(wǎng)膜組織的各個(gè)層由不同的細(xì)胞(感光細(xì)胞、水平細(xì)胞、雙極細(xì)胞、無長(zhǎng)突細(xì)胞、視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞)構(gòu)成，層結(jié)構(gòu)的形成可以使用針對(duì)在這些細(xì)胞中表達(dá)的前述標(biāo)記的抗體通過免疫染色證實(shí)。在一個(gè)實(shí)施方案中，視網(wǎng)膜組織是rx-或chx10-陽(yáng)性神經(jīng)上皮結(jié)構(gòu)。

存在于聚集體表面上的視網(wǎng)膜組織可以使用鑷子等從所述聚集體上物理切下。在這一情形中，由于可以在每個(gè)聚集體表面上形成除視網(wǎng)膜組織之外的神經(jīng)組織，從所述聚集體上切下的一部分神經(jīng)組織可以通過下文提及的免疫染色等進(jìn)行驗(yàn)證，由此可以證實(shí)所述組織是視網(wǎng)膜組織。

在一個(gè)實(shí)施方案中，步驟(3)中得到的聚集體包含視網(wǎng)膜組織，并且基本上不含非神經(jīng)頭部外胚層。在包含視網(wǎng)膜組織且基本上不含非神經(jīng)頭部外胚層的聚集體中，例如，在前述聚集體冷凍切片的免疫染色圖像中，在其外側(cè)觀察到rx-陽(yáng)性組織，沒有觀察到rx-陰性組織。

步驟(3)的一個(gè)實(shí)施方案是在包含處于向視網(wǎng)膜細(xì)胞分化誘導(dǎo)需要的濃度的bmp信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活物質(zhì)的無血清培養(yǎng)基或含血清培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)步驟(2)中形成的聚集體的步驟，直到開始出現(xiàn)表達(dá)rx基因的細(xì)胞，從而產(chǎn)生包含視網(wǎng)膜祖先細(xì)胞的聚集體，并且隨后在無血清培養(yǎng)基或含血清培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)包含所述視網(wǎng)膜祖先細(xì)胞的聚集體，直到形成視網(wǎng)膜組織，由此得到包含視網(wǎng)膜組織的聚集體。當(dāng)隨后在無血清培養(yǎng)基或含血清培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)包含所述視網(wǎng)膜祖先細(xì)胞的聚集體直到形成視網(wǎng)膜組織時(shí)，通過將所述培養(yǎng)基更換為分別不含bmp信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活物質(zhì)的無血清培養(yǎng)基或含血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中誘導(dǎo)視網(wǎng)膜祖先細(xì)胞的bmp信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活物質(zhì)的濃度可以以每2-4天40-60％的比例逐漸或逐步降低。在一個(gè)實(shí)施方案中，進(jìn)行包含視網(wǎng)膜祖先細(xì)胞的聚集體的懸浮培養(yǎng)，直到所述聚集體中所包含的不少于20％(優(yōu)選地，不少于30％，不少于40％，不少于50％，不少于60％)的細(xì)胞表達(dá)chx10。

在步驟(3)的一個(gè)實(shí)施方案中，步驟(2)中得到的聚集體或通過上文提及的方法懸浮培養(yǎng)步驟(2)中得到的聚集體而得到的聚集體可以進(jìn)行貼壁培養(yǎng)以形成粘附的聚集體。在包含處于向視網(wǎng)膜細(xì)胞分化誘導(dǎo)所需要的濃度的分化誘導(dǎo)因子(例如，bmp4)的無血清培養(yǎng)基或含血清培養(yǎng)基中以粘附狀態(tài)培養(yǎng)粘附的聚集體，直到開始出現(xiàn)表達(dá)rx基因的細(xì)胞，從而產(chǎn)生包含視網(wǎng)膜祖先細(xì)胞的粘附的聚集體。將包含所述視網(wǎng)膜祖先細(xì)胞的聚集體在無血清培養(yǎng)基或含血清培養(yǎng)基中以粘附狀態(tài)培養(yǎng)，直到形成視網(wǎng)膜組織，由此得到包含視網(wǎng)膜組織的粘附的聚集體。在一個(gè)實(shí)施方案中，進(jìn)行包含視網(wǎng)膜祖先細(xì)胞的粘附的聚集體的貼壁培養(yǎng)，直到不少于10％(優(yōu)選地，不少于20％，不少于30％，不少于40％，不少于50％)的所述細(xì)胞表達(dá)chx10。

通過本發(fā)明的方法，可以高效地從多能干細(xì)胞得到視網(wǎng)膜細(xì)胞和視網(wǎng)膜組織。由于通過本發(fā)明的方法得到的視網(wǎng)膜組織包含每個(gè)視網(wǎng)膜層專有的神經(jīng)元(神經(jīng)元細(xì)胞)，因此也可能得到組成視網(wǎng)膜組織的各個(gè)細(xì)胞，諸如感光細(xì)胞、水平細(xì)胞、雙極細(xì)胞、無長(zhǎng)突細(xì)胞、視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞或它們的祖先/前體細(xì)胞等。由獲得的視網(wǎng)膜組織獲得什么細(xì)胞可以通過本身已知的方法(例如，細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá))來確認(rèn)。

獲得的含有視網(wǎng)膜組織的聚集體也可以直接按原樣地用作用于評(píng)估毒性或功效的試劑。將包含視網(wǎng)膜組織的聚集體進(jìn)行分散處理(例如，胰蛋白酶/edta處理)，并且使用facs或macs，對(duì)得到的細(xì)胞進(jìn)行選擇，由此也可以獲得高純度的視網(wǎng)膜組織-組成細(xì)胞，例如，高純度的感光細(xì)胞。

可以通過下述步驟(a)和步驟(b)由通過本發(fā)明的制備方法得到的包含視網(wǎng)膜組織的細(xì)胞聚集體產(chǎn)生睫狀邊緣區(qū)樣結(jié)構(gòu)。

睫狀邊緣區(qū)樣結(jié)構(gòu)是指與睫狀邊緣區(qū)相似的結(jié)構(gòu)?！敖逘钸吘墔^(qū)(cmz)”的實(shí)例包括在體內(nèi)在視網(wǎng)膜中的視網(wǎng)膜組織(具體地，神經(jīng)視網(wǎng)膜)和視網(wǎng)膜色素上皮的邊緣區(qū)中存在的組織，其是包含視網(wǎng)膜組織干細(xì)胞(視網(wǎng)膜干細(xì)胞)的區(qū)域。睫狀邊緣區(qū)還稱為睫狀邊緣或視網(wǎng)膜邊緣，并且睫狀邊緣區(qū)、睫狀邊緣和視網(wǎng)膜邊緣是同等的組織。已知睫狀邊緣區(qū)在供應(yīng)視網(wǎng)膜祖先細(xì)胞或向視網(wǎng)膜組織的分化細(xì)胞、維持視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)等中起重要作用。睫狀邊緣區(qū)的標(biāo)記基因的實(shí)例包括rdh10基因(陽(yáng)性)、otx1基因(陽(yáng)性)、zicl基因(陽(yáng)性)等。

步驟(a)包括在分別包含wnt信號(hào)途徑激活物質(zhì)和/或fgf信號(hào)途徑抑制物質(zhì)的無血清培養(yǎng)基或含血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)通過本發(fā)明的制備方法2得到的包含視網(wǎng)膜組織的細(xì)胞聚集體持續(xù)僅在表達(dá)rpe65基因的細(xì)胞出現(xiàn)之前的時(shí)間期，在所述細(xì)胞聚集體中chx10陽(yáng)性細(xì)胞以占所述視網(wǎng)膜組織20％以上且100％以下的比例存在。

此處關(guān)于步驟(a)優(yōu)選的培養(yǎng)，可以提及懸浮培養(yǎng)。

關(guān)于用于步驟(a)的無血清培養(yǎng)基，可以提及作為補(bǔ)充了n2或ksr的基礎(chǔ)培養(yǎng)基的無血清培養(yǎng)基。更具體地，可以提及作為補(bǔ)充了n2補(bǔ)充劑(n2，由lifetechnologies制造)的dmem/f-12培養(yǎng)基的無血清培養(yǎng)基。關(guān)于含血清的培養(yǎng)基，可以提及作為補(bǔ)充了胎牛血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基的含血清培養(yǎng)基。

可以適當(dāng)設(shè)置步驟(a)的培養(yǎng)條件，諸如培養(yǎng)溫度、co2濃度。例如，培養(yǎng)溫度在約30℃至約40℃的范圍內(nèi)，優(yōu)選地，例如，大致約37℃。例如，co2濃度在約1％至約10％的范圍內(nèi)，優(yōu)選地，例如，大致約5％。

在步驟(a)中，當(dāng)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)上文提及的“包含視網(wǎng)膜組織的細(xì)胞聚集體”時(shí)，要包含在無血清培養(yǎng)基或含血清培養(yǎng)基中的wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活物質(zhì)沒有特別限制，只要其能夠增強(qiáng)由wnt介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)即可。wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活物質(zhì)的具體實(shí)例包括屬于wnt家族的蛋白(例如，wnt1，wnt3a，wnt7a)，wnt受體，wnt受體激動(dòng)劑，gsk3抑制劑(例如，6-溴靛玉紅-3’-肟(6-bromoindirubin-3’-oxime，bio)，chir99021，kenpaullone)等。

在常見的wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活物質(zhì)諸如chir99021的情形中，例如，步驟(a)中包含在無血清培養(yǎng)基或含血清培養(yǎng)基中的wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活物質(zhì)的濃度在約0.1μm至約100μm的范圍內(nèi)，優(yōu)選地，例如，在約1μm至約30μm的范圍內(nèi)，更優(yōu)選地，例如，為約3μm。

當(dāng)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)上文提及的“包含視網(wǎng)膜組織的細(xì)胞聚集體”時(shí)，步驟(a)中包含在無血清培養(yǎng)基或含血清培養(yǎng)基中的fgf信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制物質(zhì)沒有特別限制，只要其能夠抑制由fgf介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)即可。fgf信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制物質(zhì)的實(shí)例包括fgf受體，fgf受體抑制劑(例如，su-5402，azd4547，bgj398)，map激酶級(jí)聯(lián)抑制物質(zhì)(例如，mek抑制劑，mapk抑制劑，erk抑制劑)，pi3激酶抑制劑，akt抑制劑等。

步驟(a)中包含在無血清培養(yǎng)基或含血清培養(yǎng)基中的fgf信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制物質(zhì)的濃度僅需要是可以誘導(dǎo)聚集體向睫狀邊緣區(qū)樣結(jié)構(gòu)分化的濃度。例如，在su-5402的情形中，將其添加到培養(yǎng)基中至約0.1μm至約100μm、優(yōu)選地約1μm至約30μm、更優(yōu)選地約5μm的濃度。

步驟(a)中“培養(yǎng)持續(xù)僅在表達(dá)rpe65基因的細(xì)胞出現(xiàn)之前的時(shí)間期”意指在表達(dá)rpe65基因的細(xì)胞出現(xiàn)之前的全部時(shí)間期內(nèi)或部分時(shí)間期內(nèi)培養(yǎng)。即，在此時(shí)間期內(nèi)，培養(yǎng)系統(tǒng)中的前述“包含視網(wǎng)膜組織的細(xì)胞聚集體”由基本上不表達(dá)rpe65基因的細(xì)胞組成的時(shí)間期(任意時(shí)間期)的全部或部分內(nèi)的培養(yǎng)。通過使用這樣的培養(yǎng)，可以得到其中沒有出現(xiàn)表達(dá)rpe65基因的細(xì)胞的細(xì)胞聚集體。

為了確定所述特定的時(shí)間期，使用前述“包含視網(wǎng)膜組織的細(xì)胞聚集體”作為樣品，并且可以通過一般的遺傳改造方法或生物化學(xué)方法測(cè)量存在或不存在樣品中包含的rpe65基因的表達(dá)或其水平。具體地，例如，可以通過使用針對(duì)rpe65蛋白的抗體使前述“包含視網(wǎng)膜組織的細(xì)胞聚集體”的冷凍切片進(jìn)行免疫染色法檢驗(yàn)存在或不存在rpe65基因的表達(dá)或其水平。

關(guān)于步驟(a)中“在表達(dá)rpe65基因的細(xì)胞出現(xiàn)之前的時(shí)間期”，例如，可以提及這樣的時(shí)間期，在所述時(shí)間期內(nèi)，與在分別包含wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活物質(zhì)和/或fgf信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制物質(zhì)的無血清培養(yǎng)基或含血清培養(yǎng)基中開始培養(yǎng)前述細(xì)胞聚集體的時(shí)刻相比，在上述視網(wǎng)膜組織中存在的chx10陽(yáng)性細(xì)胞的比例降低，并且落入30％至0％的范圍內(nèi)。關(guān)于“其中沒有出現(xiàn)表達(dá)rpe65基因的細(xì)胞的細(xì)胞聚集體”，可以提及這樣的細(xì)胞聚集體，其中在前述視網(wǎng)膜組織中存在占所述組織的30％至0％比例的chx10陽(yáng)性細(xì)胞。

盡管步驟(a)中“在表達(dá)rpe65基因的細(xì)胞出現(xiàn)之前的時(shí)間期”的天數(shù)隨wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活物質(zhì)和/或fgf信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制物質(zhì)的種類、無血清培養(yǎng)基或含血清培養(yǎng)基的種類、其他培養(yǎng)條件等而變化，但是，例如，其在14天內(nèi)。更具體地，當(dāng)使用無血清培養(yǎng)基(例如，作為補(bǔ)充了n2的基礎(chǔ)培養(yǎng)基的無血清培養(yǎng)基)時(shí)，例如，上述時(shí)間期優(yōu)選地在10天內(nèi)，更優(yōu)選地，例如，3天至6天。當(dāng)使用含血清培養(yǎng)基(例如，作為補(bǔ)充了胎牛血清的含血清培養(yǎng)基)時(shí)，例如，前述時(shí)間期優(yōu)選地在12天內(nèi)，更優(yōu)選地，例如，6天至9天。

然后，關(guān)于步驟(b)，將通過上述培養(yǎng)得到的“其中沒有出現(xiàn)表達(dá)rpe65基因的細(xì)胞的細(xì)胞聚集體”在分別不含wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活物質(zhì)的無血清培養(yǎng)基或含血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

關(guān)于步驟(b)中優(yōu)選的培養(yǎng)，可以提及懸浮培養(yǎng)。

關(guān)于步驟(b)中的無血清培養(yǎng)基，可以提及作為補(bǔ)充了n2或ksr的基礎(chǔ)培養(yǎng)基的培養(yǎng)基。關(guān)于含血清培養(yǎng)基，可以提及作為補(bǔ)充了胎牛血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基的培養(yǎng)基。更具體地，可以提及作為補(bǔ)充了胎牛血清的dmem/f-12培養(yǎng)基的含血清培養(yǎng)基。

步驟(b)中上述無血清培養(yǎng)基或含血清培養(yǎng)基可以包含已知的生長(zhǎng)因子、添加劑和促進(jìn)生長(zhǎng)的化學(xué)物質(zhì)等。已知的生長(zhǎng)因子的實(shí)例包括egf，fgf，igf，胰島素等。促進(jìn)生長(zhǎng)的添加劑的實(shí)例包括n2補(bǔ)充劑(lifetechnologies)，b27補(bǔ)充劑(lifetechnologies)，ksr等。促進(jìn)生長(zhǎng)的化學(xué)物質(zhì)的實(shí)例包括類視黃醇(例如，視黃酸)和?；撬?。

例如，步驟(b)中的培養(yǎng)的優(yōu)選的時(shí)間期是這樣的培養(yǎng)時(shí)間期，在所述時(shí)間期內(nèi)，與在分別不含wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活物質(zhì)的無血清培養(yǎng)基或含血清培養(yǎng)基中開始培養(yǎng)前述細(xì)胞聚集體的時(shí)刻相比，在前述視網(wǎng)膜組織中存在的chx10陽(yáng)性細(xì)胞的比例增加，并且達(dá)到30％以上。

可以適當(dāng)?shù)卦O(shè)定步驟(b)中的培養(yǎng)條件，諸如培養(yǎng)溫度、co2濃度等。例如，培養(yǎng)溫度在約30℃至約40℃的范圍內(nèi)，優(yōu)選地，例如，大致約37℃。例如，co2濃度在約1％至約10％的范圍內(nèi)，優(yōu)選地，例如，大致約5％。

盡管步驟(b)中直到得到“包含睫狀邊緣區(qū)樣結(jié)構(gòu)的細(xì)胞聚集體”的上述培養(yǎng)天數(shù)隨無血清培養(yǎng)基或含血清培養(yǎng)基的種類、其他培養(yǎng)條件等而變化，但是，例如，其在100天之內(nèi)。例如，上述培養(yǎng)天數(shù)優(yōu)選地為20天至70天，更優(yōu)選地，例如，30天至60天。

在通過前述步驟(a)、(b)制備的“包含睫狀邊緣區(qū)樣結(jié)構(gòu)的細(xì)胞聚集體”中，在同一細(xì)胞聚集體中，鄰近所述睫狀邊緣區(qū)樣結(jié)構(gòu)存在視網(wǎng)膜色素上皮和視網(wǎng)膜組織(具體地，神經(jīng)視網(wǎng)膜)。所述結(jié)構(gòu)可以通過顯微鏡觀察等證實(shí)。具體地，例如，可以通過顯微鏡觀察證實(shí)睫狀邊緣區(qū)樣結(jié)構(gòu)的存在，其作為具有厚視網(wǎng)膜側(cè)和薄視網(wǎng)膜色素上皮側(cè)的上皮結(jié)構(gòu)存在，其在具有高透明度的視網(wǎng)膜組織與表現(xiàn)出色素沉著的視網(wǎng)膜色素上皮之間形成。另外，可以通過免疫染色聚集體的冷凍切片鑒定rdh10陽(yáng)性、otxl陽(yáng)性或zicl陽(yáng)性細(xì)胞而證實(shí)睫狀邊緣區(qū)樣結(jié)構(gòu)的存在。

可以通過下述步驟(c)由通過本發(fā)明的制備方法和類似方法得到的包含視網(wǎng)膜組織的細(xì)胞聚集體產(chǎn)生視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞。視網(wǎng)膜色素上皮片層(sheet)可以通過下述步驟(d)由通過下述步驟(c)得到的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞產(chǎn)生。

本發(fā)明中的“視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞”意指在體內(nèi)在視網(wǎng)膜中神經(jīng)視網(wǎng)膜組織外側(cè)存在的上皮細(xì)胞。其是否是視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞可以由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員基于例如細(xì)胞標(biāo)記(rpe65(成熟的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞)，mitf(幼態(tài)的或成熟的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞)等)的表達(dá)、黑素顆粒的存在、多邊形特征性細(xì)胞形態(tài)等而驗(yàn)證。

首先，在步驟(c)中，將通過本發(fā)明的制備方法2得到的包含視網(wǎng)膜組織的細(xì)胞聚集體在不含bmp信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活物質(zhì)但是包含wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活物質(zhì)的無血清培養(yǎng)基或含血清培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)，從而產(chǎn)生包含視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的聚集體。

關(guān)于用于步驟(c)的無血清培養(yǎng)基，可以提及作為補(bǔ)充了n2或ksr的基礎(chǔ)培養(yǎng)基的無血清培養(yǎng)基。更具體地，可以提及作為補(bǔ)充了n2補(bǔ)充劑(lifetechnologies)的dmem/f-12培養(yǎng)基的無血清培養(yǎng)基。關(guān)于含血清培養(yǎng)基，可以提及作為補(bǔ)充了胎牛血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基的含血清培養(yǎng)基。

除了前述wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活物質(zhì)之外，用于步驟(c)的無血清培養(yǎng)基還可以包含前述nodal/激活蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活物質(zhì)和/或前述fgf信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制物質(zhì)。

例如，步驟(c)中優(yōu)選的培養(yǎng)是懸浮培養(yǎng)。

解釋步驟(d)，其中將在步驟(c)中得到的聚集體分散并且將得到的細(xì)胞以粘附狀態(tài)培養(yǎng)。

在步驟(c)開始后60天內(nèi)，優(yōu)選地在30天內(nèi)，更優(yōu)選地3天內(nèi)，進(jìn)行步驟(d)。

關(guān)于步驟(d)中用于貼壁培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)基或含血清培養(yǎng)基，可以提及前述培養(yǎng)基。為了避免復(fù)雜的制備，優(yōu)選使用補(bǔ)充了適量商購(gòu)血清代替物(如ksr等)的無血清培養(yǎng)基(例如，補(bǔ)充了1/2xn2補(bǔ)充劑、1/2xb27補(bǔ)充劑和100μm2-巰基乙醇的dmem/f-12和neurobasal的1∶1混合物的培養(yǎng)基)。在來源于人ips細(xì)胞的細(xì)胞的情形中，例如，要添加到無血清培養(yǎng)基中的ksr的量通常為約1％至約20％，優(yōu)選約2％至約20％。

在步驟(d)中，優(yōu)選地在包含rock抑制物質(zhì)的前述無血清培養(yǎng)基或含血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞。

在步驟(d)中，更優(yōu)選地在進(jìn)一步包含選自由下述組成的組的一種或多種物質(zhì)的無血清培養(yǎng)基或含血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞：wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活物質(zhì)，fgf信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制物質(zhì)，激活蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活物質(zhì)和bmp信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活物質(zhì)。

激活蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活物質(zhì)是能夠增強(qiáng)由激活蛋白介導(dǎo)的信號(hào)的物質(zhì)。激活蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活物質(zhì)的實(shí)例包括屬于激活蛋白家族的蛋白(例如，激活蛋白a，激活蛋白b，激活蛋白c，激活蛋白ab等)，激活蛋白受體，和激活蛋白受體激動(dòng)劑。

用于步驟(d)的激活蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活物質(zhì)的濃度可以是任意濃度，只要可以有效地形成均勻的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞片層即可。例如，加入重組的人/小鼠/大鼠激活蛋白a(r&dsystems，#338-ac)至約1ng/ml至約10μg/ml、優(yōu)選地約10ng/ml至約1μg/ml、更優(yōu)選地約100ng/ml的濃度。

例如，在步驟(d)開始起18天內(nèi)，優(yōu)選地在第6天，添加激活蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活物質(zhì)。

在步驟(d)中，優(yōu)選地在表面用培養(yǎng)基底處理的培養(yǎng)容器上進(jìn)行貼壁培養(yǎng)。關(guān)于步驟(d)中用于處理培養(yǎng)容器的培養(yǎng)基底，可以提及能夠允許聚集體來源的細(xì)胞的貼壁培養(yǎng)和視網(wǎng)膜色素上皮片層形成的細(xì)胞培養(yǎng)基底。

3.用于評(píng)價(jià)毒性和功效的方法

由于通過本發(fā)明的制備方法產(chǎn)生的視網(wǎng)膜組織或視網(wǎng)膜細(xì)胞(例如，感光細(xì)胞，視網(wǎng)膜祖先細(xì)胞，視網(wǎng)膜層專有的神經(jīng)元)可作為用于疾病研究或藥物發(fā)現(xiàn)的材料用于篩選治療由于視網(wǎng)膜組織或視網(wǎng)膜細(xì)胞的紊亂導(dǎo)致的疾病的藥物，或用于毒性評(píng)價(jià)，其可以用作評(píng)價(jià)測(cè)試物質(zhì)的毒性或功效的試劑。例如，由患有由于視網(wǎng)膜組織紊亂導(dǎo)致的疾病、特別是遺傳病的人患者產(chǎn)生ips細(xì)胞，并且使用該ips細(xì)胞，通過本發(fā)明的方法產(chǎn)生視網(wǎng)膜組織或視網(wǎng)膜細(xì)胞(例如，感光細(xì)胞，視網(wǎng)膜祖先細(xì)胞，視網(wǎng)膜層專有的神經(jīng)元)。所述視網(wǎng)膜組織或視網(wǎng)膜細(xì)胞可以在體外重現(xiàn)引起患者的疾病的視網(wǎng)膜組織紊亂。因此，本發(fā)明提供用于評(píng)價(jià)測(cè)試物質(zhì)的毒性或功效的方法，所述方法包括使所述測(cè)試物質(zhì)與通過本發(fā)明的制備方法產(chǎn)生的視網(wǎng)膜組織或視網(wǎng)膜細(xì)胞(例如，感光細(xì)胞，視網(wǎng)膜祖先細(xì)胞，視網(wǎng)膜層專有的神經(jīng)元)接觸，并且檢測(cè)所述物質(zhì)對(duì)所述細(xì)胞或組織的影響。

例如，在存在或不存在(陰性對(duì)照)測(cè)試物質(zhì)的條件下，培養(yǎng)通過本發(fā)明的制備方法產(chǎn)生的具有特定紊亂(例如，遺傳性紊亂)的視網(wǎng)膜組織或視網(wǎng)膜細(xì)胞(例如，感光細(xì)胞，視網(wǎng)膜祖先細(xì)胞，視網(wǎng)膜層專有的神經(jīng)元)。然后，將用測(cè)試物質(zhì)處理的所述視網(wǎng)膜組織或視網(wǎng)膜細(xì)胞的紊亂的嚴(yán)重性與陰性對(duì)照的進(jìn)行比較。結(jié)果，可以選擇減輕紊亂的嚴(yán)重性的測(cè)試物質(zhì)作為用于治療由所述紊亂導(dǎo)致的疾病的藥物的候選物質(zhì)。例如，可以尋找改善通過本發(fā)明的制備方法產(chǎn)生的視網(wǎng)膜細(xì)胞的生理活性(例如，存活促進(jìn)或成熟)的測(cè)試物質(zhì)作為藥物產(chǎn)品的候選物質(zhì)。備選地，按照本發(fā)明的制備方法，通過誘導(dǎo)由體細(xì)胞制備的誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞的分化制備視網(wǎng)膜細(xì)胞，所述體細(xì)胞具有引起特定紊亂諸如伴有視網(wǎng)膜中的紊亂等的疾病的基因突變。

可以基于添加了測(cè)試物質(zhì)的視網(wǎng)膜細(xì)胞是否表現(xiàn)出前述紊亂作為指標(biāo)，尋找有效作為所述紊亂的治療藥或預(yù)防藥的測(cè)試物質(zhì)的候選物。

對(duì)于毒性評(píng)價(jià)，將通過本發(fā)明的制備方法產(chǎn)生的視網(wǎng)膜組織或視網(wǎng)膜細(xì)胞(例如，感光細(xì)胞，視網(wǎng)膜祖先細(xì)胞，視網(wǎng)膜層專有的神經(jīng)元)在存在或不存在(陰性對(duì)照)測(cè)試物質(zhì)的條件下培養(yǎng)。然后，將對(duì)用所述測(cè)試物質(zhì)處理的視網(wǎng)膜組織或視網(wǎng)膜細(xì)胞的毒性嚴(yán)重性與陰性對(duì)照的毒性嚴(yán)重性比較。結(jié)果，與陰性對(duì)照相比，可以判斷表現(xiàn)出毒性的測(cè)試物質(zhì)是對(duì)視網(wǎng)膜組織或視網(wǎng)膜細(xì)胞(例如，感光細(xì)胞，視網(wǎng)膜祖先細(xì)胞，視網(wǎng)膜層專有的神經(jīng)元)具有毒性的物質(zhì)。

即，本發(fā)明包括評(píng)價(jià)毒性的方法，所述方法包括下述步驟：

(步驟1)在測(cè)試物質(zhì)的存在下，在存活培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)通過本發(fā)明的制備方法產(chǎn)生的視網(wǎng)膜組織或視網(wǎng)膜細(xì)胞達(dá)給定的時(shí)間，并且測(cè)量細(xì)胞損傷的嚴(yán)重性的步驟，

(步驟2)在不存在測(cè)試物質(zhì)或存在陽(yáng)性對(duì)照時(shí)，在存活培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)通過本發(fā)明的制備方法產(chǎn)生的視網(wǎng)膜組織或視網(wǎng)膜細(xì)胞達(dá)給定的時(shí)間，并且測(cè)量細(xì)胞損傷的嚴(yán)重性的步驟，

(步驟3)基于(步驟1)和(步驟2)中測(cè)量的結(jié)果的差異，評(píng)價(jià)步驟1中測(cè)試物質(zhì)的毒性的步驟。

用于本文時(shí)，“在不存在測(cè)試物質(zhì)時(shí)”包括僅添加培養(yǎng)基或用于溶解所述測(cè)試物質(zhì)的溶劑，而不添加測(cè)試物質(zhì)。另外，“陽(yáng)性對(duì)照”意指具有毒性的已知化合物。

測(cè)量細(xì)胞損傷嚴(yán)重性的方法的實(shí)例包括測(cè)量存活細(xì)胞數(shù)量的方法，例如，測(cè)量細(xì)胞內(nèi)atp的量的方法，通過細(xì)胞染色(例如，核染色)和形態(tài)觀察測(cè)量存活細(xì)胞數(shù)量的方法等。

在步驟3中，關(guān)于評(píng)價(jià)測(cè)試物質(zhì)的毒性的方法，比較步驟1中的測(cè)量值和步驟2中陰性對(duì)照的測(cè)量值，并且當(dāng)步驟1中細(xì)胞損傷的嚴(yán)重性高時(shí)，可以判斷所述測(cè)試物質(zhì)具有毒性。另外，比較步驟1中的測(cè)量值與步驟2中陽(yáng)性對(duì)照的測(cè)量值，并且當(dāng)步驟1中細(xì)胞損傷的嚴(yán)重性相同或更高時(shí)，可以判斷所述測(cè)試物質(zhì)具有毒性。

4.藥物組合物

本發(fā)明提供包含有效量的通過本發(fā)明的制備方法產(chǎn)生的視網(wǎng)膜組織或視網(wǎng)膜細(xì)胞(例如，感光細(xì)胞，視網(wǎng)膜祖先細(xì)胞，視網(wǎng)膜層專有的神經(jīng)元)的藥物組合物。

所述藥物組合物包含有效量的通過本發(fā)明的制備方法產(chǎn)生的視網(wǎng)膜組織或視網(wǎng)膜細(xì)胞(例如，感光細(xì)胞，視網(wǎng)膜祖先細(xì)胞，視網(wǎng)膜層專有的神經(jīng)元)和藥用載體。

關(guān)于藥用載體，可以使用生理水性溶劑(鹽水，緩沖液，無血清培養(yǎng)基等)。必要時(shí)，在移植治療中，包含要移植的組織或細(xì)胞的藥物可以包含常規(guī)使用的防腐劑、穩(wěn)定劑、還原劑、等滲劑等。

本發(fā)明的藥物組合物可以通過將由本發(fā)明的制備方法1或2產(chǎn)生的視網(wǎng)膜組織或視網(wǎng)膜細(xì)胞懸浮在適當(dāng)?shù)纳硭匀軇┲兄瞥苫鞈覄?。必要時(shí)，所述組合物可以添加冷凍保護(hù)劑，冷凍保藏，使用時(shí)解凍，用緩沖液洗滌，并且用于移植治療。

通過本發(fā)明的制備方法得到的視網(wǎng)膜組織也可以用鑷子等切成適當(dāng)?shù)某叽纾援a(chǎn)生片層制劑。

通過本發(fā)明的制備方法得到的細(xì)胞也可以在步驟(3)中進(jìn)行貼壁培養(yǎng)用于分化誘導(dǎo)，從而形成片層樣細(xì)胞，產(chǎn)生片層制劑。

本發(fā)明的藥物組合物可以用作由于神經(jīng)組織或神經(jīng)細(xì)胞(例如，視網(wǎng)膜組織，視網(wǎng)膜祖先細(xì)胞，視網(wǎng)膜層專有的神經(jīng)元)的紊亂導(dǎo)致的疾病的治療藥。

5.治療藥

通過本發(fā)明的制備方法產(chǎn)生的視網(wǎng)膜組織或視網(wǎng)膜細(xì)胞(例如，感光細(xì)胞，視網(wǎng)膜祖先細(xì)胞，視網(wǎng)膜層專有的神經(jīng)元)可用于由于視網(wǎng)膜組織或視網(wǎng)膜細(xì)胞的紊亂導(dǎo)致的疾病的移植治療。因此，本發(fā)明提供用于治療由于視網(wǎng)膜組織或視網(wǎng)膜細(xì)胞的紊亂導(dǎo)致的疾病的藥物，其包含通過本發(fā)明的制備方法產(chǎn)生的視網(wǎng)膜組織或視網(wǎng)膜細(xì)胞(例如，感光細(xì)胞，視網(wǎng)膜祖先細(xì)胞，視網(wǎng)膜層專有的神經(jīng)元)。通過本發(fā)明的制備方法產(chǎn)生的視網(wǎng)膜組織或視網(wǎng)膜細(xì)胞(包括視網(wǎng)膜祖先細(xì)胞，視網(wǎng)膜層專有的神經(jīng)元)可以用作治療由于視網(wǎng)膜組織或視網(wǎng)膜細(xì)胞的紊亂導(dǎo)致的疾病的藥物或用于補(bǔ)充視網(wǎng)膜組織的損傷狀態(tài)中相對(duì)應(yīng)的損傷位點(diǎn)。由于視網(wǎng)膜組織或視網(wǎng)膜細(xì)胞的紊亂導(dǎo)致的疾病和視網(wǎng)膜組織的損傷狀態(tài)可以通過向具有由于視網(wǎng)膜組織或視網(wǎng)膜細(xì)胞的紊亂導(dǎo)致的疾病或視網(wǎng)膜組織的損傷狀態(tài)的患者(其需要移植)移植通過本發(fā)明的制備方法產(chǎn)生的視網(wǎng)膜組織或視網(wǎng)膜細(xì)胞進(jìn)行治療，從而補(bǔ)充視網(wǎng)膜細(xì)胞或紊亂的視網(wǎng)膜組織本身。由于視網(wǎng)膜組織或視網(wǎng)膜細(xì)胞的紊亂導(dǎo)致的疾病的實(shí)例包括視網(wǎng)膜變性(retinaldenaturation)、視網(wǎng)膜色素性變性(pigmentarydegenerationoftheretina)、年齡相關(guān)黃斑變性(age-relatedmaculardegeneration)、有機(jī)汞中毒(organicmercurypoisoning)、氯喹視網(wǎng)膜病變(chloroquineretinopathy)、青光眼(glaucoma)、糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabeticretinopathy)、新生兒視網(wǎng)膜病變(retinopathyofnewbornbabies)等。

在移植治療中，由于組織相容性抗原的差異導(dǎo)致的排異通常構(gòu)成問題。然而，該問題可以通過使用由移植接受體的體細(xì)胞建立的多能干細(xì)胞(例如，誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞)而解決。即，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，由接受體的體細(xì)胞建立的多能干細(xì)胞(例如，誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞)用作本發(fā)明的方法中的多能干細(xì)胞，并且產(chǎn)生對(duì)于所述接受體在免疫上是自身的神經(jīng)組織或神經(jīng)細(xì)胞并移植到所述接受體中。

另外，可以從由與接受體免疫相容的(例如，在hla型和mhc型方面相容)其他人的體細(xì)胞建立多能干細(xì)胞(例如，誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞)產(chǎn)生同種異體神經(jīng)組織或神經(jīng)細(xì)胞，并且移植到所述接受體中。

[實(shí)施例]

在下文通過參考實(shí)施例和藥理學(xué)實(shí)施例詳細(xì)解釋本發(fā)明，所述實(shí)施例不應(yīng)該解釋為限制性的。

比較例1：在步驟2中不使用shh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活物質(zhì)由人ips細(xì)胞分化的實(shí)施例

按照“scientificreports，4，3594(2014)”中所述的方法，在無飼養(yǎng)細(xì)胞的條件下培養(yǎng)人ips細(xì)胞(1231a3株，獲自京都大學(xué)(kyotouniversity))。關(guān)于無飼養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基，使用stemfit培養(yǎng)基(ak03，由ajinomotoco.，inc.制造)，并且關(guān)于無飼養(yǎng)細(xì)胞的構(gòu)架，使用層粘連蛋白511-e8(由nippi，inc.制造)。

關(guān)于具體的維持培養(yǎng)操作，首先將亞匯合(subconfluent)的人ips細(xì)胞(1231a3株)用pbs洗滌，并且使用trypleselect(由lifetechnologies制造)分散成單個(gè)細(xì)胞。然后，將前述分散成單個(gè)細(xì)胞的人ips細(xì)胞接種在用層粘連蛋白511-e8包被的塑料培養(yǎng)皿中，并且在存在y27632(rock抑制物質(zhì)，10μm)的條件下，在stemfit培養(yǎng)基中進(jìn)行無飼養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)。當(dāng)使用6孔平板(由iwaki制造，對(duì)于細(xì)胞培養(yǎng)，培養(yǎng)面積為9.4em²)作為前述塑料培養(yǎng)皿時(shí)，將關(guān)于前述分散成單個(gè)細(xì)胞的人ips細(xì)胞的鋪板細(xì)胞數(shù)目調(diào)整為6x10³。接種后一天，將全部量的培養(yǎng)基更換為不含y27632的stemfit培養(yǎng)基。然后，1-2天一次，將全部量的培養(yǎng)基更換為不含y27632的stemfit培養(yǎng)基。之后，接種后6天，細(xì)胞培養(yǎng)至亞匯合(60％的培養(yǎng)面積被細(xì)胞覆蓋)。

通過使用trypleselect(lifetechnologies)，將上述亞匯合的人ips細(xì)胞用細(xì)胞分散液處理，并且通過吹吸操作進(jìn)一步分散成單個(gè)細(xì)胞。然后，將上述分散成單個(gè)細(xì)胞的人ips細(xì)胞以1.2×10⁴個(gè)細(xì)胞/孔懸浮在非細(xì)胞粘附性的96孔培養(yǎng)板(primesurface96v型底平板，sumitomobakelite)中的100μl無血清培養(yǎng)基中，并且在37℃，5％co2進(jìn)行懸浮培養(yǎng)。關(guān)于用于此的無血清培養(yǎng)基(gfcdm+ksr)，使用補(bǔ)充了10％ksr、450μm1-一硫代甘油、1x化學(xué)成分確定的脂質(zhì)濃縮物的f-12培養(yǎng)基與imdm培養(yǎng)基的1∶1混合物。在懸浮培養(yǎng)開始時(shí)(在懸浮培養(yǎng)開始后的第0天，步驟2開始)，向上述無血清培養(yǎng)基中加入y27632(終濃度為20μm)。到懸浮培養(yǎng)開始后第2天，形成細(xì)胞聚集體(步驟2結(jié)束，并且步驟3開始)。在懸浮培養(yǎng)開始后第3天，加入不含y27632的無血清培養(yǎng)基(50μl)。

在懸浮培養(yǎng)開始后第6天，將一半量的培養(yǎng)基更換為不含y27632但包含或不包含人重組bmp4(由r&d制備)的培養(yǎng)基，以將外源性人重組bmp4的濃度調(diào)整為1.5nm(55ng/ml，圖1b)或產(chǎn)生不含外源性人重組bmp4的培養(yǎng)基(圖1a)。關(guān)于一半培養(yǎng)基更換操作，棄掉培養(yǎng)容器中一半體積的培養(yǎng)基，即75μl，加入上述新鮮的無血清培養(yǎng)基(75μl)調(diào)整總培養(yǎng)基量至150μl。然后，將一半量的培養(yǎng)基更換為上述不含y27632和人重組bmp4的無血清培養(yǎng)基，每2-4天更換一次。在懸浮培養(yǎng)開始后第19天，將這樣制備的細(xì)胞聚集體在倒置顯微鏡(biorevo，由keyence制造)下進(jìn)行亮視野觀察(圖1a，b)。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)在涉及添加人重組bmp4的條件下(圖1b)和在不涉及添加的條件下(圖1a)，都有不少于90％的細(xì)胞聚集體塌陷，并且神經(jīng)組織形成效率差。

實(shí)施例1：通過在步驟2中使用shh轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活物質(zhì)，由在步驟1中使用stemfit作為無飼養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)的人ips細(xì)胞制備的細(xì)胞聚集體、神經(jīng)組織和視網(wǎng)膜組織的形成的實(shí)施例

按照“scientificreports，4，3594(2014)”中所述的方法，在無飼養(yǎng)細(xì)胞的條件下培養(yǎng)人ips細(xì)胞(1231a3株，獲自京都大學(xué)(kyotouniversity))。關(guān)于無飼養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基，使用stemfit培養(yǎng)基(ak03，由ajinomotoco.，inc.制造)，并且關(guān)于無飼養(yǎng)細(xì)胞的構(gòu)架，使用層粘連蛋白511-e8(由nippi，inc.制造)。維持培養(yǎng)按照比較例1中所述的方法進(jìn)行。

通過使用trypleselect(lifetechnologies)，將這樣制備的亞匯合的人ips細(xì)胞用細(xì)胞分散液處理，并且通過吹吸操作進(jìn)一步分散成單個(gè)細(xì)胞。然后，將上述分散成單個(gè)細(xì)胞的人ips細(xì)胞以1.2×10⁴個(gè)細(xì)胞/孔懸浮在非粘附性96孔培養(yǎng)板(primesurface96v型底平板，sumitomobakelite)中的100μl無血清培養(yǎng)基中，并且在37℃，5％co2進(jìn)行懸浮培養(yǎng)。關(guān)于用于此的無血清培養(yǎng)基(gfcdm+ksr)，使用補(bǔ)充了10％ksr、450μm1-一硫代甘油、1x化學(xué)成分確定的脂質(zhì)濃縮物的f-12培養(yǎng)基與imdm培養(yǎng)基的1∶1混合物。在懸浮培養(yǎng)開始時(shí)(在懸浮培養(yǎng)開始后的第0天，步驟2開始)，向上述無血清培養(yǎng)基中加入y27632(終濃度為20μm)和作為shh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活物質(zhì)的sag(300nm)。到懸浮培養(yǎng)開始后第2天，形成細(xì)胞聚集體(步驟2結(jié)束，步驟3開始)。在懸浮培養(yǎng)開始后第3天，加入不含y27632和sag的無血清培養(yǎng)基(50μl)。在懸浮培養(yǎng)開始后第6天，將一半量的培養(yǎng)基更換為不含y27632但包含或不包含人重組bmp4(由r&d制備)的培養(yǎng)基，以將外源性人重組bmp4的濃度調(diào)整為1.5nm(55ng/ml，圖1d)或產(chǎn)生不含外源性人重組bmp4的培養(yǎng)基(圖1c)。關(guān)于一半培養(yǎng)基更換操作，棄掉培養(yǎng)容器中一半體積的培養(yǎng)基，即75μl，加入上述新鮮的無血清培養(yǎng)基(75μl)調(diào)整總培養(yǎng)基量至150μl。然后，將一半量的培養(yǎng)基更換為上述不含y27632、sag和人重組bmp4的無血清培養(yǎng)基，每2-4天更換一次。在懸浮培養(yǎng)開始后第19天，將這樣制備的細(xì)胞聚集體在倒置顯微鏡(biorevo，由keyence制造)下進(jìn)行亮視野觀察(圖1c，d)。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)在涉及添加人重組bmp4的條件下(圖1d)和在不涉及其添加的條件下(圖1c)，細(xì)胞聚集體都得到維持，并且觀察到神經(jīng)上皮結(jié)構(gòu)。即，發(fā)現(xiàn)加入shh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活物質(zhì)提供良好的聚集體形狀并且提高神經(jīng)組織形成的效率(圖1a-d)。從該結(jié)果，發(fā)現(xiàn)通過在步驟2的懸浮培養(yǎng)開始時(shí)添加shh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活物質(zhì)，可以由進(jìn)行無飼養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)的人ips細(xì)胞有效地產(chǎn)生神經(jīng)組織。

將上述在開始懸浮培養(yǎng)后第19天的細(xì)胞聚集體分別用4％多聚甲醛固定，產(chǎn)生冷凍切片。將這些冷凍切邊針對(duì)chx10(抗-chx10抗體，由exalpha制備，綿羊)(其是一種視網(wǎng)膜組織標(biāo)記)或rx(抗-rx抗體，由takara制備，豚鼠)(其是一種視網(wǎng)膜組織標(biāo)記)免疫染色。在判斷上述標(biāo)記在免疫染色分析中是否是陽(yáng)性時(shí)，將高于背景熒光強(qiáng)度不少于2倍的熒光強(qiáng)度視為是陽(yáng)性的。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)在涉及在懸浮培養(yǎng)的第0天添加shh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活物質(zhì)和在懸浮培養(yǎng)的第6天不添加bmp信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活物質(zhì)的條件下，總細(xì)胞中rx-陽(yáng)性細(xì)胞的比例低于3％，并且chx10-陽(yáng)性細(xì)胞的比例也低于3％(圖2a，c)。另一方面，發(fā)現(xiàn)在涉及在懸浮培養(yǎng)的第0天添加shh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活物質(zhì)并且在懸浮培養(yǎng)的第6天添加bmp信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活物質(zhì)的條件下，總細(xì)胞中rx-陽(yáng)性細(xì)胞的比例不低于60％，并且chx10-陽(yáng)性細(xì)胞的比例也不低于60％(圖2b，d)。此外，從連續(xù)切片分析來看，表明在具有高比例(不低于95％)的chx10-陽(yáng)性細(xì)胞的神經(jīng)組織中，rx也是強(qiáng)陽(yáng)性的(圖2b，d)。從這些結(jié)果，發(fā)現(xiàn)通過在步驟2懸浮培養(yǎng)開始時(shí)添加shh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活物質(zhì)并且在步驟3的懸浮培養(yǎng)期間添加作為分化誘導(dǎo)物質(zhì)的bmp信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活物質(zhì)，能夠由無飼養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)的人ips細(xì)胞(以下有時(shí)稱為無飼養(yǎng)細(xì)胞的人ips細(xì)胞)有效地產(chǎn)生視網(wǎng)膜組織。

實(shí)施例2：在步驟1中使用essential8作為無飼養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)基并且在開始懸浮培養(yǎng)時(shí)使用shh轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活物質(zhì)由人ips細(xì)胞產(chǎn)生神經(jīng)組織的實(shí)施例

按照“scientificreports，4，3594(2014)”中所述的方法，在無飼養(yǎng)細(xì)胞的條件下培養(yǎng)人ips細(xì)胞(1231a3株，獲自京都大學(xué)(kyotouniversity))。關(guān)于無飼養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基，使用essential8培養(yǎng)基(由lifetechnologies制造)，并且關(guān)于無飼養(yǎng)細(xì)胞的構(gòu)架，使用層粘連蛋白511-e8(由nippi，inc.制造)。

關(guān)于具體的維持培養(yǎng)操作，首先將亞匯合的人ips細(xì)胞(1231a3株)用pbs洗滌，并且使用trypleselect(由lifetechnologies制造)分散成單個(gè)細(xì)胞。然后，將前述分散成單個(gè)細(xì)胞的人ips細(xì)胞接種在用層粘連蛋白511-e8包被的塑料培養(yǎng)皿中，并且在存在y27632(rock抑制物質(zhì)，10μm)的條件下，在essential8培養(yǎng)基中進(jìn)行無飼養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)。當(dāng)使用6孔平板(由iwaki制造，對(duì)于細(xì)胞培養(yǎng)，培養(yǎng)面積為9.4cm²)作為上述塑料培養(yǎng)皿時(shí)，將關(guān)于上述分散成單個(gè)細(xì)胞的人ips細(xì)胞的鋪板細(xì)胞數(shù)目調(diào)整為6x10³。接種后一天，將全部量的培養(yǎng)基更換為不含y27632的essential8培養(yǎng)基。然后，1-2天一次，將全部量的培養(yǎng)基更換為不含y27632的essential8培養(yǎng)基。之后，接種后6天，細(xì)胞培養(yǎng)至亞匯合(60％的培養(yǎng)面積被細(xì)胞覆蓋)。

通過使用trypleselect(lifetechnologies)，將這樣制備的亞匯合的人ips細(xì)胞用細(xì)胞分散液處理，并且通過吹吸操作進(jìn)一步分散成單個(gè)細(xì)胞，并且將上述分散成單個(gè)細(xì)胞的人ips細(xì)胞以1.2×10⁴個(gè)細(xì)胞/孔懸浮在非細(xì)胞粘附性的96孔培養(yǎng)板(primesurface96v型底平板，由sumitomobakelite制造)中的100μl無血清培養(yǎng)基中。然后，將細(xì)胞在37℃，5％co2進(jìn)行懸浮培養(yǎng)。關(guān)于用于此的無血清培養(yǎng)基(gfcdm+ksr)，使用作為補(bǔ)充了10％ksr、450μm1-一硫代甘油、1x化學(xué)成分確定的脂質(zhì)濃縮物的f-12培養(yǎng)基與imdm培養(yǎng)基的1∶1混合物的無血清培養(yǎng)基。在懸浮培養(yǎng)開始時(shí)(在懸浮培養(yǎng)開始后的第0天，步驟2開始)，使用補(bǔ)充了y27632(終濃度為20μm)的無血清培養(yǎng)基(圖3a-d)。這些中，在特定條件下，使用補(bǔ)充了y27632(終濃度為20μm)和作為shh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活物質(zhì)的sag(300nm)的無血清培養(yǎng)基(圖3c，d)。到懸浮培養(yǎng)開始后第2天，在具有和不具有sag添加的兩種條件下都形成細(xì)胞聚集體(步驟2結(jié)束，并且步驟3開始)。在懸浮培養(yǎng)開始后第3天，添加不含y27632和sag的無血清培養(yǎng)基(50μl)。在懸浮培養(yǎng)開始后第6天，將一半量的培養(yǎng)基更換為不含y27632和sag但包含或不包含人重組bmp4(由r&d制備)的培養(yǎng)基，以將外源性人重組bmp4的終濃度設(shè)定為1.5nm(圖3b，d)或產(chǎn)生不含外源性人重組bmp4的培養(yǎng)基(圖3a，c)。然后，將一半量的培養(yǎng)基更換為上述不含y27632、sag和人重組bmp4的無血清培養(yǎng)基，每2-4天更換一次。將在懸浮培養(yǎng)開始后第18天的這樣制備的細(xì)胞聚集體在倒置顯微鏡(biorevo，由keyence制造)下進(jìn)行亮視野觀察(圖3a-d)。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)在懸浮培養(yǎng)開始時(shí)不添加sag并且在懸浮培養(yǎng)過程中不添加bmp4的條件(條件1，圖3a)和在懸浮培養(yǎng)開始時(shí)不添加sag并且在懸浮培養(yǎng)過程中添加bmp4的條件(條件2，圖3b)下，都有不少于80％的細(xì)胞聚集體塌陷，并且神經(jīng)組織形成效率差。另一方面，發(fā)現(xiàn)在懸浮培養(yǎng)開始時(shí)添加sag并且在懸浮培養(yǎng)過程中不添加bmp4的條件下(條件3，圖3c)，和在懸浮培養(yǎng)開始時(shí)添加sag并且在懸浮培養(yǎng)過程中添加bmp4的條件下(條件4，圖3d)，細(xì)胞聚集體得以維持，并且有效地形成神經(jīng)上皮結(jié)構(gòu)。

此外，在懸浮培養(yǎng)開始后第18天，觀察到多種聚集體的形狀，并且分類為良好的形狀(圖4，黑色條，良好的聚集體，包含多個(gè)神經(jīng)上皮)、中等水平的形狀(圖4，灰色條，良好的聚集體但是神經(jīng)上皮比例低)和差的形狀(圖4，白色條，聚集體塌陷，不含神經(jīng)上皮)并定量。結(jié)果，在條件1(圖3a)，良好的形狀的比例低于3％，并且差的形狀的比例為71％(圖4，對(duì)照)。相反，在條件3(圖3c)，良好的形狀的比例為93％，并且差的形狀的比例為6％(圖4，sag)。

從這些結(jié)果，發(fā)現(xiàn)關(guān)于在essential8培養(yǎng)基中培養(yǎng)的無飼養(yǎng)細(xì)胞的人ips細(xì)胞，通過在懸浮培養(yǎng)開始時(shí)添加shh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活物質(zhì)提高神經(jīng)組織形成的效率。

實(shí)施例3：通過在步驟1中使用essential8作為無飼養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)基并且在開始懸浮培養(yǎng)時(shí)使用shh轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活物質(zhì)由人ips細(xì)胞產(chǎn)生視網(wǎng)膜組織的實(shí)施例

按照“scientificreports，4，3594(2014)”中所述的方法，在無飼養(yǎng)細(xì)胞的條件下培養(yǎng)人ips細(xì)胞(201b7株，獲自京都大學(xué)(kyotouniversity))。關(guān)于無飼養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基，使用essential8培養(yǎng)基(由lifetechnologies制造)，并且關(guān)于無飼養(yǎng)細(xì)胞的構(gòu)架，使用層粘連蛋白511-e8(由nippi，inc.制造)。

關(guān)于具體的維持培養(yǎng)操作，首先將亞匯合的人ips細(xì)胞(201b7株)用pbs洗滌，并且使用trypleselect(由lifetechnologies制造)分散成單個(gè)細(xì)胞。然后，將上述分散成單個(gè)細(xì)胞的人ips細(xì)胞接種在用層粘連蛋白511-e8包被的塑料培養(yǎng)皿中，并且在存在y27632(rock抑制物質(zhì)，10μm)的條件下，在essential8培養(yǎng)基中進(jìn)行無飼養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)。當(dāng)使用6孔平板(由iwaki制造，用于細(xì)胞培養(yǎng)，培養(yǎng)面積為9.4cm²)作為上述塑料培養(yǎng)皿時(shí)，將關(guān)于上述分散成單個(gè)細(xì)胞的人ips細(xì)胞的鋪板細(xì)胞數(shù)目調(diào)整為6x10³。接種后一天，將全部量的培養(yǎng)基更換為不含y27632的essential8培養(yǎng)基。然后，1-2天一次，將全部量的培養(yǎng)基更換為不含y27632的essential8培養(yǎng)基。之后，接種后6天，細(xì)胞培養(yǎng)至亞匯合(60％的培養(yǎng)面積被細(xì)胞覆蓋)。

通過使用trypleselect(由lifetechnologies制造)，將這樣制備的亞匯合的人ips細(xì)胞用細(xì)胞分散液處理，并且通過吹吸操作進(jìn)一步分散成單個(gè)細(xì)胞，并且將上述分散成單個(gè)細(xì)胞的人ips細(xì)胞以1.2×10⁴個(gè)細(xì)胞/孔懸浮在非細(xì)胞粘附性的96孔培養(yǎng)板(primesurface96v型底平板，sumitomobakelite)中的100μl無血清培養(yǎng)基中。然后，將細(xì)胞在37℃，5％co2進(jìn)行懸浮培養(yǎng)。關(guān)于用于此的無血清培養(yǎng)基(gfcdm+ksr)，使用作為補(bǔ)充了10％ksr、450μm1-一硫代甘油、1x化學(xué)成分確定的脂質(zhì)濃縮物的f-12培養(yǎng)基與imdm培養(yǎng)基的1∶1混合物的無血清培養(yǎng)基。在懸浮培養(yǎng)開始時(shí)(在懸浮培養(yǎng)開始后的第0天，步驟2開始)，使用補(bǔ)充了sag(終濃度為300μm)(作為shh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活物質(zhì))和y27632(20μm)的無血清培養(yǎng)基(圖5a-d)。到懸浮培養(yǎng)開始后第2天，形成細(xì)胞聚集體。在懸浮培養(yǎng)開始后第3天，加入不含y27632和sag的無血清培養(yǎng)基(50μl)。在懸浮培養(yǎng)開始后第6天，將一半量的培養(yǎng)基更換為不含y27632和sag但包含或不包含人重組bmp4(由r&d制備)的培養(yǎng)基，以將外源性人重組bmp4的濃度調(diào)整為1.5nm(55ng/ml)。然后，將一半量的培養(yǎng)基更換為上述不含y27632、sag和人重組bmp4的無血清培養(yǎng)基，每2-4天更換一次。在懸浮培養(yǎng)開始后第18天，將這樣制備的細(xì)胞聚集體在倒置顯微鏡(biorevo，由keyence制造)下進(jìn)行亮視野觀察。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)形成了神經(jīng)上皮。

將在開始懸浮培養(yǎng)后第18天的細(xì)胞聚集體用4％多聚甲醛固定，產(chǎn)生冷凍切片。將這些冷凍切邊針對(duì)chx10(抗-chx10抗體，exalpha，綿羊)(其是一種視網(wǎng)膜組織標(biāo)記)或rx(抗-rx抗體，由takara制備，豚鼠)(其是一種視網(wǎng)膜組織標(biāo)記)免疫染色。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)在涉及在懸浮培養(yǎng)的第0天添加shh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活物質(zhì)并且在懸浮培養(yǎng)的第6天不添加bmp信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活物質(zhì)的條件下，總細(xì)胞中rx-陽(yáng)性細(xì)胞的比例不大于3％，并且chx10-陽(yáng)性細(xì)胞的比例也不大于3％(圖5a，c)。另一方面，發(fā)現(xiàn)在涉及在懸浮培養(yǎng)的第0天添加shh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活物質(zhì)并且在懸浮培養(yǎng)的第6天添加bmp信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活物質(zhì)的條件下，總細(xì)胞中rx-陽(yáng)性細(xì)胞的比例不低于40％，并且chx10-陽(yáng)性細(xì)胞的比例也不低于40％(圖5b，d)。此外，連續(xù)切片分析表明，在具有高比例(不低于95％)的chx10-陽(yáng)性細(xì)胞的神經(jīng)組織中，rx也是強(qiáng)陽(yáng)性的(圖5b，d)。從這些結(jié)果，發(fā)現(xiàn)通過在步驟2懸浮培養(yǎng)開始時(shí)添加shh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活物質(zhì)并且在步驟3的懸浮培養(yǎng)期間添加作為分化誘導(dǎo)物質(zhì)的bmp信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活物質(zhì)，能夠由無飼養(yǎng)細(xì)胞的人ips細(xì)胞有效地產(chǎn)生視網(wǎng)膜組織。

實(shí)施例4：通過在步驟2中使用shh轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活物質(zhì)并且在步驟3中使用bmp4由人ips細(xì)胞產(chǎn)生視網(wǎng)膜組織的實(shí)施例

按照“scientificreports，4，3594(2014)”中所述的方法，將人ips細(xì)胞(1231a3株，獲自京都大學(xué)(kyotouniversity))進(jìn)行無飼養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)。關(guān)于無飼養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基，使用stemfit培養(yǎng)基(ak03，由ajinomotoco.，inc.制造)，并且關(guān)于無飼養(yǎng)細(xì)胞的構(gòu)架，使用層粘連蛋白511-e8(由nippi，inc.制造)。

關(guān)于具體的維持培養(yǎng)操作，首先將亞匯合的人ips細(xì)胞(1231a3株)用pbs洗滌，并且使用trypleselect(由lifetechnologies制造)分散成單個(gè)細(xì)胞。然后，將上述分散成單個(gè)細(xì)胞的人ips細(xì)胞接種在用層粘連蛋白511-e8包被的塑料培養(yǎng)皿中，并且在存在y27632(rock途徑抑制物質(zhì)，10μm)的條件下，在stemfit培養(yǎng)基中進(jìn)行無飼養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)。當(dāng)使用6孔平板(由iwaki制造，用于細(xì)胞培養(yǎng)，培養(yǎng)面積為9.4cm²)作為上述塑料培養(yǎng)皿時(shí)，將關(guān)于上述分散成單個(gè)細(xì)胞的人ips細(xì)胞的鋪板細(xì)胞數(shù)目調(diào)整為6x10³。接種后一天，將培養(yǎng)基更換為不含y27632的stemfit培養(yǎng)基。然后，1-2天一次，將培養(yǎng)基更換為不含y27632的stemfit培養(yǎng)基。之后，接種后6天，細(xì)胞培養(yǎng)至亞匯合(60％的培養(yǎng)面積被細(xì)胞覆蓋)。

通過使用trypleselect(lifetechnologies)，將上述亞匯合的人ips細(xì)胞分散成單個(gè)細(xì)胞，并且將上述分散成單個(gè)細(xì)胞的人ips細(xì)胞以1.2×10⁴個(gè)細(xì)胞/孔懸浮在非細(xì)胞粘附性的96孔培養(yǎng)板(primesurface96v型底平板，sumitomobakelite)中的100μl無血清培養(yǎng)基中，并且在37℃，5％co2進(jìn)行懸浮培養(yǎng)。關(guān)于用于此的無血清培養(yǎng)基(gfcdm+ksr)，使用作為補(bǔ)充了10％ksr、450μm1-一硫代甘油、1x化學(xué)成分確定的脂質(zhì)濃縮物的f-12培養(yǎng)基與imdm培養(yǎng)基的1∶1混合物的無血清培養(yǎng)基。在懸浮培養(yǎng)開始時(shí)(在懸浮培養(yǎng)開始后的第0天，步驟2開始)，向上述無血清培養(yǎng)基中加入y27632(終濃度為20μm)和sag(終濃度為300nm)。到懸浮培養(yǎng)開始后第2天，形成細(xì)胞聚集體(步驟2結(jié)束，步驟3開始)。

此處，關(guān)于步驟3，培養(yǎng)在下述條件1和條件2下進(jìn)行。

在條件1下(+bmp，d3)，在開始懸浮培養(yǎng)后第3天添加不含y27632和sag但是包含人重組bmp4(由r&d制備)的培養(yǎng)基(50μl)，以使外源性人重組bmp4的終濃度調(diào)整為1.5nm(總培養(yǎng)基量為150μl)。在懸浮培養(yǎng)開始后第6天，將一半量的培養(yǎng)基更換為上述不含y27632、sag和人重組bmp4的無血清培養(yǎng)基。

在條件2下(+bmp，d6)，在開始懸浮培養(yǎng)后第3天添加不含y27632、sag和人重組bmp4的無血清培養(yǎng)基(50μl)。在懸浮培養(yǎng)開始后第6天，將一半量的培養(yǎng)基更換為上述不含y27632和sag但是包含人重組bmp4(由r&d制備)的培養(yǎng)基，以使外源性人重組bmp4的終濃度調(diào)整為1.5nm。

在條件1和條件2下開始細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)后第6天或以后，將一半量的培養(yǎng)基更換為上述不含y27632、sag和人重組bmp4的無血清培養(yǎng)基，每2-4天更換一次。在懸浮培養(yǎng)開始后第18天，在倒置顯微鏡下觀察形狀。發(fā)現(xiàn)在條件1和條件2下，細(xì)胞聚集體得以維持，并且形成神經(jīng)組織。

將在懸浮培養(yǎng)開始后第18天的這樣制備的細(xì)胞聚集體(其通過由無飼養(yǎng)細(xì)胞的ips細(xì)胞作為起始材料在步驟2中添加sag產(chǎn)生)用4％多聚甲醛固定，產(chǎn)生冷凍切片。將這些冷凍切邊針對(duì)chx10(抗-chx10抗體，exalpha，綿羊)(其是一種視網(wǎng)膜組織標(biāo)記)或rx(抗-rx抗體，由takara制備，豚鼠)(其是一種視網(wǎng)膜組織標(biāo)記)免疫染色。在倒置熒光顯微鏡下觀察這些免疫染色的切片。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)對(duì)于在條件1和條件2下的細(xì)胞二者，總細(xì)胞中rx-陽(yáng)性細(xì)胞的比例為約40％，chx10-陽(yáng)性細(xì)胞的比例也為約40％(圖6)。此外，從連續(xù)切片分析來看，發(fā)現(xiàn)在具有高比例的chx10-陽(yáng)性細(xì)胞(約95％)的神經(jīng)組織中，rx也是強(qiáng)陽(yáng)性的。從這些結(jié)果，發(fā)現(xiàn)通過在步驟2添加sag并且在步驟3開始懸浮培養(yǎng)后第3天或第6天的懸浮培養(yǎng)過程中添加作為分化誘導(dǎo)物質(zhì)的bmp信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活物質(zhì)，能夠由無飼養(yǎng)細(xì)胞的人ips細(xì)胞有效地產(chǎn)生視網(wǎng)膜組織。

實(shí)施例5：通過在步驟2中使用600nmshh轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活物質(zhì)并且在步驟3中使用bmp4由人ips細(xì)胞產(chǎn)生視網(wǎng)膜組織的實(shí)施例

使用trypleselect(lifetechnologies)將按照實(shí)施例4中所述的方法制備的無飼養(yǎng)細(xì)胞的人ips細(xì)胞(1231a3株)分散成單個(gè)細(xì)胞，并且將上述分散成單個(gè)細(xì)胞的人ips細(xì)胞以1.2×10⁴個(gè)細(xì)胞/孔懸浮在非細(xì)胞粘附性的96孔培養(yǎng)板(primesurface96v型底平板，sumitomobakelite)中的100μl無血清培養(yǎng)基中，并且在37℃，5％co2進(jìn)行懸浮培養(yǎng)。關(guān)于用于此的無血清培養(yǎng)基(gfcdm+ksr)，使用作為補(bǔ)充了10％ksr、450μm1-一硫代甘油、1x化學(xué)成分確定的脂質(zhì)濃縮物的f-12培養(yǎng)基與imdm培養(yǎng)基的1∶1混合物的無血清培養(yǎng)基。在懸浮培養(yǎng)開始時(shí)(在懸浮培養(yǎng)開始后的第0天，步驟2開始)，向上述無血清培養(yǎng)基中添加y27632(終濃度為20μm)和sag(終濃度為600nm)。到懸浮培養(yǎng)開始后第2天，形成細(xì)胞聚集體(步驟2結(jié)束，步驟3開始)。

此處，關(guān)于步驟3，培養(yǎng)在下述條件1和條件2下進(jìn)行。

在條件1下(+bmp，d3)，在開始懸浮培養(yǎng)后第3天添加不含y27632和sag但是包含人重組bmp4(由r&d制備)的培養(yǎng)基(50μl)，以使外源性人重組bmp4的終濃度調(diào)整為1.5nm(總培養(yǎng)基量為150μl)。在懸浮培養(yǎng)開始后第6天，將一半量的培養(yǎng)基更換為上述不含y27632、sag和人重組bmp4的無血清培養(yǎng)基。

在條件2下(+bmp，d6)，在開始懸浮培養(yǎng)后第3天添加不含y27632、sag和人重組bmp4的無血清培養(yǎng)基(50μl)。在懸浮培養(yǎng)開始后第6天，將一半量的培養(yǎng)基更換為不含y27632但是包含人重組bmp4(由r&d制備)的培養(yǎng)基，以使外源性人重組bmp4的終濃度調(diào)整為1.5nm。

在條件1和條件2下開始細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)后第6天或以后，將一半量的培養(yǎng)基更換為上述不含y27632、sag和人重組bmp4的無血清培養(yǎng)基，每2-4天更換一次。在懸浮培養(yǎng)開始后第18天，在倒置顯微鏡下觀察形狀。發(fā)現(xiàn)在條件1和條件2下，細(xì)胞聚集體得以維持，并且形成神經(jīng)組織。

將在懸浮培養(yǎng)開始后第18天的這樣制備的細(xì)胞聚集體(其通過由無飼養(yǎng)細(xì)胞的ips細(xì)胞作為起始材料在步驟2中添加sag產(chǎn)生)用4％多聚甲醛固定，產(chǎn)生冷凍切片。將這些冷凍切邊針對(duì)chx10(抗-chx10抗體，exalpha，綿羊)(其是一種視網(wǎng)膜組織標(biāo)記)或rx(抗-rx抗體，由takara制備，豚鼠)(其是一種視網(wǎng)膜組織標(biāo)記)免疫染色。在倒置熒光顯微鏡下觀察這些免疫染色的切片。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)對(duì)于在條件1和條件2下的細(xì)胞二者，總細(xì)胞中rx-陽(yáng)性細(xì)胞的比例為約40％，并且chx10-陽(yáng)性細(xì)胞的比例也為約40％(圖7)。此外，從連續(xù)切片分析來看，提示在具有高比例的chx10-陽(yáng)性細(xì)胞(約95％)的神經(jīng)組織中，rx也是強(qiáng)陽(yáng)性的。從這些結(jié)果，發(fā)現(xiàn)通過在步驟2添加600nmsag并且在步驟3開始懸浮培養(yǎng)后第3天或第6天添加作為分化誘導(dǎo)物質(zhì)的bmp信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活物質(zhì)，能夠由無飼養(yǎng)細(xì)胞的人ips細(xì)胞有效地產(chǎn)生視網(wǎng)膜組織。

實(shí)施例6：通過在步驟2中使用sag、purmorphamine或重組shh蛋白作為sonichedgehog信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活物質(zhì)由人ips細(xì)胞產(chǎn)生視網(wǎng)膜組織的實(shí)施例

按照“scientificreports，4，3594(2014)”中所述的方法，在無飼養(yǎng)細(xì)胞的條件下培養(yǎng)人ips細(xì)胞(201b7株，獲自京都大學(xué)(kyotouniversity))。關(guān)于無飼養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基，使用stemfit培養(yǎng)基(ak03；由ajinomotoco.，inc.制造)，并且關(guān)于無飼養(yǎng)細(xì)胞的構(gòu)架，使用層粘連蛋白511-e8(由nippi，inc.制造)。

關(guān)于具體的維持培養(yǎng)操作，首先將亞匯合的人ips細(xì)胞(201b7株)用pbs洗滌，并且使用trypleselect(由lifetechnologies制造)分散成單個(gè)細(xì)胞。然后，將上述分散成單個(gè)細(xì)胞的人ips細(xì)胞接種在用層粘連蛋白511-e8包被的塑料培養(yǎng)皿中，并且在存在y27632(rock途徑抑制物質(zhì)，10μm)的條件下，在stemfit培養(yǎng)基中進(jìn)行無飼養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)。當(dāng)使用6孔平板(由iwaki制造，用于細(xì)胞培養(yǎng)，培養(yǎng)面積為9.4cm²)作為上述塑料培養(yǎng)皿時(shí)，將關(guān)于上述分散成單個(gè)細(xì)胞的人ips細(xì)胞的鋪板細(xì)胞數(shù)目調(diào)整為1.3x10⁴。接種后一天，將全部量的培養(yǎng)基更換為不含y27632的stemfit培養(yǎng)基。然后，1-2天一次，將全部量的培養(yǎng)基更換為不含y27632的stemfit培養(yǎng)基。之后，接種后6天，細(xì)胞培養(yǎng)至亞匯合(60％的培養(yǎng)面積被細(xì)胞覆蓋)。

通過使用trypleselect(由lifetechnologies制造)，將這樣制備的亞匯合的人ips細(xì)胞用細(xì)胞分散液處理，通過吹吸操作進(jìn)一步分散成單個(gè)細(xì)胞，并且將上述分散成單個(gè)細(xì)胞的人ips細(xì)胞以1.0×10⁴個(gè)細(xì)胞/孔懸浮在非細(xì)胞粘附性的96孔培養(yǎng)板(sumilonspheroidv型底平板primesurface96v型底平板，sumitomobakelite)中的100μl無血清培養(yǎng)基中。然后，將細(xì)胞在37℃，5％co2進(jìn)行懸浮培養(yǎng)。關(guān)于用于此的無血清培養(yǎng)基(gfcdm+ksr)，使用作為補(bǔ)充了10％ksr、450μm1-一硫代甘油、1x化學(xué)成分確定的脂質(zhì)濃縮物的f-12培養(yǎng)基與imdm培養(yǎng)基的1∶1混合物的無血清培養(yǎng)基。在懸浮培養(yǎng)開始時(shí)(在懸浮培養(yǎng)開始后的第0天，步驟2開始)，使用補(bǔ)充了y27632(終濃度為20μm)并進(jìn)一步補(bǔ)充了sag(終濃度為30nm)、purmorphamine(由wako制造，終濃度為0.2μm)或人重組shh(由r&d制造，重組n-端，終濃度為50ng/ml)(作為shh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活物質(zhì))的上述無血清培養(yǎng)基(圖8)。在懸浮培養(yǎng)開始后第2天，形成細(xì)胞聚集體。在懸浮培養(yǎng)開始后第3天，加入不含y27632、sag，purmorphamine和重組shh但是包含人重組bmp4的培養(yǎng)基(50μl)，以將外源性人重組bmp4的終濃度調(diào)整為1.5nm(55ng/ml)。在懸浮培養(yǎng)開始后第6天，將一半量的培養(yǎng)基更換為不含y27632、sag、purmorphamine、重組shh和人重組bmp4的無血清培養(yǎng)基。然后，將一半量的培養(yǎng)基更換為上述不含y27632、sag和人重組bmp4的無血清培養(yǎng)基，每2-4天更換一次。將在懸浮培養(yǎng)開始后第18天的這樣制備的細(xì)胞聚集體在倒置顯微鏡(biorevo，由keyence制造)下進(jìn)行亮視野觀察。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)形成了神經(jīng)上皮。

將在開始懸浮培養(yǎng)后第18天的細(xì)胞聚集體用4％多聚甲醛固定，產(chǎn)生冷凍切片。將這些冷凍切邊針對(duì)chx10(抗-chx10抗體，exalpha，綿羊)(其是一種視網(wǎng)膜組織標(biāo)記)免疫染色。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)在涉及在懸浮培養(yǎng)的第0天添加sag、pma或shh作為shh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活物質(zhì)和在懸浮培養(yǎng)的第3天添加bmp4的條件下，總細(xì)胞中chx10-陽(yáng)性細(xì)胞的比例不大于30％(圖8，d-f)。從這些結(jié)果，發(fā)現(xiàn)通過在步驟2開始懸浮培養(yǎng)時(shí)添加sag、purmorphamine和重組shh中的任一種作為shh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活物質(zhì)，并且在步驟3的懸浮培養(yǎng)過程中添加bmp信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活物質(zhì)作為分化誘導(dǎo)物質(zhì)，能夠由無飼養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)的人ips細(xì)胞有效地產(chǎn)生視網(wǎng)膜組織。

實(shí)施例7：通過在步驟2中使用sag、purmorphamine或重組shh蛋白作為sonichedgehog信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活物質(zhì)并且在步驟3中使用bmp4由人ips細(xì)胞產(chǎn)生視網(wǎng)膜組織的實(shí)施例

按照“scientificreports，4，3594(2014)”中所述的方法，在無飼養(yǎng)細(xì)胞的條件下培養(yǎng)人ips細(xì)胞(1231a3株，獲自京都大學(xué)(kyotouniversity))。關(guān)于無飼養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基，使用stemfit培養(yǎng)基(ak03；由ajinomotoco.，inc.制造)，并且關(guān)于無飼養(yǎng)細(xì)胞的構(gòu)架，使用層粘連蛋白511-e8(由nippi，inc.制造)。

通過使用trypleselect(由lifetechnologies制造)，將按照實(shí)施例6所述的方法制備的亞匯合的人ips細(xì)胞用細(xì)胞分散液處理，通過吹吸操作進(jìn)一步分散成單個(gè)細(xì)胞，并且將上述分散成單個(gè)細(xì)胞的人ips細(xì)胞以1.0x10⁴個(gè)細(xì)胞/孔懸浮在非粘附性96孔培養(yǎng)板(sumilonspheroidv型底平板primesurface96v型底平板，sumitomobakelite)中的100μl無血清培養(yǎng)基中。然后，將細(xì)胞在37℃，5％co2進(jìn)行懸浮培養(yǎng)。關(guān)于用于此的無血清培養(yǎng)基(gfcdm+ksr)，使用作為補(bǔ)充了10％ksr、450μm1-一硫代甘油、1x化學(xué)成分確定的脂質(zhì)濃縮物的f-12培養(yǎng)基與imdm培養(yǎng)基的1∶1混合物的無血清培養(yǎng)基。在懸浮培養(yǎng)開始時(shí)(在懸浮培養(yǎng)開始后的第0天，步驟2開始)，使用補(bǔ)充了y27632(終濃度為20μm)并進(jìn)一步補(bǔ)充了sag(終濃度為30nm)、purmorphamine(pma，由wako制造，終濃度為0.2μm)或人重組shh(由r&d制造，重組n-端，終濃度為300ng/ml)(作為shh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活物質(zhì))的上述無血清培養(yǎng)基或不含shh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活物質(zhì)的無血清培養(yǎng)基(圖9)。在懸浮培養(yǎng)開始后第2天，細(xì)胞聚集體形成。在懸浮培養(yǎng)開始后第3天，加入不含y27632、sag、purmorphamine和shh蛋白但是包含人重組bmp4(r&d)的培養(yǎng)基(50μl)，以將外源性人重組bmp4的終濃度調(diào)整為1.5nm(55ng/ml)。在開始懸浮培養(yǎng)后第6天，將一半量的培養(yǎng)基更換為不含y27632、sag、purmorphamine、shh蛋白和人重組bmp4的無血清培養(yǎng)基。然后，將一半量的培養(yǎng)基更換為上述不含y27632、sag、purmorphamine、重組shh和人重組bmp4的無血清培養(yǎng)基，每2-4天更換一次。在懸浮培養(yǎng)開始后第18天，將這樣制備的細(xì)胞聚集體在倒置顯微鏡(biorevo，由keyence制造)下進(jìn)行亮視野觀察。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)在步驟2不添加外源性shh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活物質(zhì)的條件下，細(xì)胞聚集體不生長(zhǎng)并且沒有形成神經(jīng)上皮(圖9：對(duì)照)，而在步驟2添加sag、pma或重組shh蛋白的條件下，細(xì)胞聚集體生長(zhǎng)并且形成了神經(jīng)上皮(圖9：sag，pma，shh)。

將在開始懸浮培養(yǎng)后第18天的細(xì)胞聚集體用4％多聚甲醛固定，產(chǎn)生冷凍切片。將這些冷凍切邊針對(duì)chx10(抗-chx10抗體，exalpha，綿羊)(其是一種視網(wǎng)膜組織標(biāo)記)免疫染色。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)在涉及在懸浮培養(yǎng)的第0天添加pma，和在懸浮培養(yǎng)的第3天添加bmp4的條件下，總細(xì)胞中chx10-陽(yáng)性細(xì)胞的比例不大于60％(圖9，下部的圖pma)。另外，發(fā)現(xiàn)甚至在懸浮培養(yǎng)的第0天添加sag或shh的條件下，細(xì)胞聚集體包含chx10-陽(yáng)性細(xì)胞。從這些結(jié)果，發(fā)現(xiàn)通過在步驟2懸浮培養(yǎng)開始時(shí)添加sag、purmorphamine和重組shh中的任一種作為shh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活物質(zhì)并且在步驟3的懸浮培養(yǎng)過程中添加bmp信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活物質(zhì)作為分化誘導(dǎo)物質(zhì)，可以由無飼養(yǎng)細(xì)胞的人ips細(xì)胞產(chǎn)生視網(wǎng)膜組織。

實(shí)施例8：通過在懸浮培養(yǎng)開始時(shí)使用shh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活物質(zhì)并且在步驟3中使用bmp4使由仙臺(tái)病毒建立的人ips細(xì)胞進(jìn)行無飼養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)產(chǎn)生視網(wǎng)膜組織的實(shí)施例

使用商購(gòu)的仙臺(tái)病毒載體(4種因子：oct3/4，sox2，klf4，c-myc，由dnavec(現(xiàn)在的idpharma)制造的cytotune試劑盒)、stemfit培養(yǎng)基(ak03；由ajinomotoco.，inc.制造)和層粘連蛋白511-e8(由nippi，inc.制造)，并且基于lifetechnologies的公布流程(ips2.0仙臺(tái)重新編程試劑盒(sendaireprogrammingkit)，publicationnumberman0009378，revision1.0)和京都大學(xué)(kyotouniversity)的公布的流程(在無飼養(yǎng)細(xì)胞的條件下建立·維持培養(yǎng)人ips細(xì)胞，cira_ff-ipsc_orotocol_jp_v140310，http：//www.cira.kyoto-u.ac.jp/j/research/protocol.html)中所述的方法，建立人ips細(xì)胞(dspc-3株，由sumitomodainipponpharmaco.，ltd.建立)。

按照scientificreports，4，3594(2014)中所述的方法，將人ips細(xì)胞(dspc-3株)進(jìn)行無飼養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)。作為無飼養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基，使用stemfit培養(yǎng)基(由ajinomotoco.，inc.制造)，并且作為無飼養(yǎng)細(xì)胞的構(gòu)架，使用層粘連蛋白511-e8(由nippi，inc.制造)。

關(guān)于具體的維持培養(yǎng)操作，首先將亞匯合的人ips細(xì)胞用pbs洗滌，并且通過使用trypleselect(由lifetechnologies制造)分散成單個(gè)細(xì)胞。然后，將上述分散成單個(gè)細(xì)胞的人ips細(xì)胞接種在用層粘連蛋白511-e8包被的塑料培養(yǎng)皿中，并且在存在y27632(rock途徑抑制物質(zhì)，10μm)的條件下，在stemfit培養(yǎng)基中進(jìn)行無飼養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)。當(dāng)使用6孔平板(由iwaki制造，對(duì)于細(xì)胞培養(yǎng)，培養(yǎng)面積為9.4cm²)作為上述塑料培養(yǎng)皿時(shí)，將關(guān)于上述分散成單個(gè)細(xì)胞的人ips細(xì)胞的鋪板細(xì)胞數(shù)目調(diào)整為1.3x10⁴。接種后一天，將全部量的培養(yǎng)基更換為不含y27632的stemfit培養(yǎng)基。然后，1-2天一次，將全部量的培養(yǎng)基更換為不含y27632的stemfit培養(yǎng)基。之后，接種后6天，細(xì)胞培養(yǎng)至亞匯合(60％的培養(yǎng)面積被細(xì)胞覆蓋)。

通過使用trypleselect(由lifetechnologies制造)，將這樣制備的亞匯合的人ips細(xì)胞用細(xì)胞分散液處理，通過吹吸操作進(jìn)一步分散成單個(gè)細(xì)胞，并且將上述分散成單個(gè)細(xì)胞的人ips細(xì)胞以1.2x10⁴個(gè)細(xì)胞/孔懸浮在非細(xì)胞粘附性的96孔培養(yǎng)板(sumilonspheroidv型底平板primesurface96v型底平板，sumitomobakelite)中的100μl無血清培養(yǎng)基中。然后，將細(xì)胞在37℃，5％co2進(jìn)行懸浮培養(yǎng)。關(guān)于用于此的無血清培養(yǎng)基(gfcdm+ksr)，使用作為補(bǔ)充了10％ksr、450μm1-一硫代甘油、1x化學(xué)成分確定的脂質(zhì)濃縮物的f-12培養(yǎng)基與imdm培養(yǎng)基的1∶1混合物的無血清培養(yǎng)基。在懸浮培養(yǎng)開始時(shí)(在懸浮培養(yǎng)開始后的第0天，步驟2開始)，使用補(bǔ)充了y27632(終濃度為20μm)并進(jìn)一步補(bǔ)充了作為外源性shh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活物質(zhì)的sag(終濃度為300nm)或沒有補(bǔ)充sag(終濃度為0nm)的上述無血清培養(yǎng)基(圖10)。在懸浮培養(yǎng)開始后第2天，形成細(xì)胞聚集體。在懸浮培養(yǎng)開始后第3天，加入不含y27632和sag但是包含或不包含人重組bmp4的培養(yǎng)基(50μl)，以將外源性人重組bmp4的終濃度調(diào)整為1.5nm(55ng/ml)或0nm。在懸浮培養(yǎng)開始后第6天，將一半量的培養(yǎng)基更換為不含y27632、sag和bmp4的無血清培養(yǎng)基。然后，將一半量的培養(yǎng)基更換為上述不含y27632、sag和bmp4的無血清培養(yǎng)基，每2-4天更換一次。在懸浮培養(yǎng)開始后第22天，將這樣制備的細(xì)胞聚集體在倒置顯微鏡(biorevo，由keyence制造)下進(jìn)行亮視野觀察。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)在不添加shh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活物質(zhì)的條件下，細(xì)胞聚集體的形成效率低(圖10，對(duì)照)。另一方面，發(fā)現(xiàn)在懸浮培養(yǎng)開始時(shí)添加sag的條件下，細(xì)胞聚集體得以維持，并且形成神經(jīng)上皮(圖10，sag300nm)。

將在開始懸浮培養(yǎng)后第22天的細(xì)胞聚集體用4％多聚甲醛固定，產(chǎn)生冷凍切片。將這些冷凍切邊針對(duì)chx10(抗-chx10抗體，exalpha，綿羊)(其是一種視網(wǎng)膜組織標(biāo)記)或rx(抗-rx抗體，由takara制造，豚鼠)(其是一種視網(wǎng)膜組織標(biāo)記)免疫染色。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)在涉及在懸浮培養(yǎng)的第0天添加sag并且在懸浮培養(yǎng)的第3天添加bmp4的條件下，總細(xì)胞中rx-陽(yáng)性細(xì)胞的比例為約10％，并且總細(xì)胞中chx10-陽(yáng)性細(xì)胞的比例也為約10％(圖10)。此外，從連續(xù)切片分析來看，發(fā)現(xiàn)在chx10-陽(yáng)性細(xì)胞的神經(jīng)組織中，rx也是強(qiáng)陽(yáng)性的(圖10)。從這些結(jié)果，可以證實(shí)通過在步驟2中的懸浮培養(yǎng)開始時(shí)添加shh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活物質(zhì)和在步驟3中的懸浮培養(yǎng)過程中添加bmp信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活物質(zhì)作為分化誘導(dǎo)物質(zhì)，也可以由使用仙臺(tái)病毒建立的不含飼養(yǎng)細(xì)胞的人ips細(xì)胞產(chǎn)生視網(wǎng)膜組織。

[工業(yè)實(shí)用性]

根據(jù)本發(fā)明的制備方法，可以在不存在飼養(yǎng)細(xì)胞的條件下誘導(dǎo)多能干細(xì)胞向視網(wǎng)膜細(xì)胞分化，從而產(chǎn)生視網(wǎng)膜組織。本發(fā)明的制備方法是有用的，原因在于其能夠產(chǎn)生用作藥物產(chǎn)品候選化合物和其他化學(xué)物質(zhì)的毒性和功效評(píng)價(jià)的材料、用于視網(wǎng)膜移植治療的移植材料的應(yīng)用測(cè)試或治療的視網(wǎng)膜組織。

本文引用的任何公布中公開的內(nèi)容，包括專利、專利申請(qǐng)的說明書和科學(xué)文獻(xiàn)，通過引用以它們?cè)诒疚闹泄_的程度完全結(jié)合在本文中。

本申請(qǐng)是基于在日本提交的專利申請(qǐng)?zhí)?014-217868(申請(qǐng)日期：2014年10月24日)，其內(nèi)容完全結(jié)合在本文中。