本發(fā)明涉及用于制造在宿主細(xì)胞中表達(dá)的蛋白質(zhì)的方法；以更具體的方式，本發(fā)明涉及導(dǎo)致具有減少水平的產(chǎn)物相關(guān)雜質(zhì)的蛋白質(zhì)的制造蛋白質(zhì)的方法。
背景技術(shù)：
：在治療學(xué)領(lǐng)域中，蛋白質(zhì)和抗體及抗體衍生的分子的使用在不斷地發(fā)生并且顯示其重要性，并因此并行發(fā)展了對受控制造工藝的需求。治療性蛋白質(zhì)的商業(yè)化需要其的大量生產(chǎn)。為此，蛋白質(zhì)經(jīng)常在宿主細(xì)胞中表達(dá)，隨后在其制備成可施用的形式之前進(jìn)行回收和純化。取決于要表達(dá)的蛋白質(zhì)，宿主細(xì)胞的選擇可以是哺乳動物宿主細(xì)胞(通常是cho(中國倉鼠卵巢)細(xì)胞)或細(xì)菌宿主細(xì)胞。在第一種情況下，蛋白質(zhì)通常被分泌到回收的培養(yǎng)物上清液中，然后處理該溶液以進(jìn)行蛋白質(zhì)純化。當(dāng)宿主細(xì)胞是革蘭氏陰性原核細(xì)胞時，常常優(yōu)選的表達(dá)系統(tǒng)涉及新合成的蛋白質(zhì)，其積聚在周質(zhì)空間內(nèi)并從周質(zhì)空間分離出來。在這種情況下，一旦達(dá)到所需的蛋白質(zhì)表達(dá)水平，就將該細(xì)胞收獲和加工。然后通過使收獲的細(xì)胞進(jìn)行蛋白質(zhì)提取方法來回收蛋白質(zhì)，這涉及將蛋白質(zhì)從周質(zhì)釋放到溶液中，隨后除去細(xì)胞碎片和其它雜質(zhì)。細(xì)胞收獲到蛋白質(zhì)釋放的這些步驟通常包括在所謂的初級回收中。然后將所得的含蛋白質(zhì)的溶液加工以進(jìn)行蛋白質(zhì)純化。用于周質(zhì)表達(dá)的優(yōu)選革蘭氏陰性原核細(xì)胞通常是大腸桿菌(escherichiacoli)菌株或熒光假單胞菌(pseudomonasfluorescens)細(xì)胞。在從周質(zhì)空間初次提取過程中在原核宿主細(xì)胞中表達(dá)的異源蛋白的回收通常是一個挑戰(zhàn)。在這方面，現(xiàn)有技術(shù)中已經(jīng)描述了不同的方法。例如，us5,655,866描述了使用熱處理來促進(jìn)抗體的功能性fab'片段的隨后分離。wo2006/054063描述了在初級提取階段結(jié)合熱處理處理的非裂解處理。wo2005/019466描述了在發(fā)酵之后但是在提取之前包括中斷步驟。us2013/0060009描述了在提取步驟中進(jìn)行熱處理之前樣品的ph調(diào)節(jié)。然而，另一個重要的挑戰(zhàn)是在初次提取之后存在的高水平的雜質(zhì)，其增加了隨后的純化步驟和整個純化過程的總體效率的負(fù)擔(dān)。這些雜質(zhì)可以是細(xì)胞碎片，宿主細(xì)胞蛋白(hcp)，dna或產(chǎn)物相關(guān)雜質(zhì)(如表達(dá)產(chǎn)物的截短形式，聚集體或其它修飾形式如脫酰胺，異構(gòu)化，氧化或其它綴合形式)的形式。其中，重組蛋白降解產(chǎn)物(也稱為產(chǎn)物相關(guān)雜質(zhì))通常在熱提取過程和初級回收過程中是最難以除去的，因為它們具有與靶蛋白非常相似的物理化學(xué)性質(zhì)，如熔融溫度(tm)。盡管提取后獲得的蛋白質(zhì)溶液然后將被處理用于蛋白質(zhì)純化，但該溶液的純度水平影響與純化步驟相關(guān)的總體效率和成本，因此影響總治療蛋白質(zhì)生產(chǎn)的總體效率和成本。當(dāng)考慮大規(guī)模蛋白質(zhì)制造時，這種影響變得更加明顯。特別地，產(chǎn)物相關(guān)雜質(zhì)對最終產(chǎn)物的品質(zhì)狀況有影響，其控制對于不同批次間的一致性尤為重要。因此，本領(lǐng)域仍然需要用于在從細(xì)胞培養(yǎng)物提取蛋白質(zhì)的過程中改善雜質(zhì)去除的方法。附圖說明圖1.提取物的氧化還原電位和溫度曲線。如可以觀察到的那樣，在熱處理步驟期間保持氮?dú)飧采w始終維持持低氧化還原電位測量，在59℃的溫度保持期間最小為約-435mv，并且通常為-375mv。當(dāng)?shù)獨(dú)鈬娚鋾r，觀察到類似的低氧化還原電位。當(dāng)含有宿主細(xì)胞的緩沖液用空氣代替氮?dú)飧采w時，可以看出，在加熱步驟提取期間氧化還原電位值顯著更高，在59℃的溫度保持期間變?yōu)殛栃?通常約+45mv)。當(dāng)噴射空氣時，觀察到類似的高氧化還原電位。由于觀察到高發(fā)泡水平，氣體噴射被切換至部分覆蓋通過提取物。圖2.提取后樣品的sds-page凝膠。泳道m(xù)描繪分子量標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)記(mark12，invitrogen)。泳道1是抗tnfαfab'參照標(biāo)準(zhǔn)品。泳道2是dsbc標(biāo)準(zhǔn)品(二硫鍵異構(gòu)酶蛋白)。泳道3是在提取期間施加氮?dú)飧采w的樣品后提取物。泳道4是提取期間施加空氣覆蓋物的樣品后提取物。泳道5是在提取期間氮?dú)鈬娚渫ㄟ^樣品時的樣品后提取物。泳道6是在提取期間空氣噴射通樣品時的樣品后提取物。該圖顯示，在存在氮?dú)獾那闆r下，與在空氣存在下進(jìn)行的提取相比，熱提取期間的還原條件足以顯著降低產(chǎn)物相關(guān)雜質(zhì)的水平。圖3.蛋白l純化后通過cexhplc測量的所有產(chǎn)物相關(guān)物質(zhì)的百分比表示的總fab'片段?？梢杂^察到氮?dú)飧采w對產(chǎn)物相關(guān)雜質(zhì)的清除具有的明顯效果。沒有施加氮?dú)飧采w的提取物#8具有顯著更高水平的產(chǎn)物相關(guān)雜質(zhì)。另一方面，通過比較提取物1和2以及7和8，該圖還表明，氮?dú)飧采w的速率可能對這種雜質(zhì)的清除有影響。圖4.蛋白l純化后通過cexhplc測量的所有產(chǎn)物相關(guān)物質(zhì)的百分比表示的總fab'片段。結(jié)果再次顯示氮?dú)獾拇嬖诘囊嫣?，?dǎo)致在熱提取后殘留的產(chǎn)物相關(guān)雜質(zhì)的水平顯著降低。進(jìn)一步的有益效果來自在熱提取之前進(jìn)行的ph調(diào)節(jié)，因為由于與以前的實例相比，產(chǎn)物相關(guān)雜質(zhì)的水平似乎進(jìn)一步降低。圖5.端點(diǎn)氧化還原電位測量相對搖瓶填充體積。這些結(jié)果表明，在氮?dú)飧采w存在下制備的搖瓶比在空氣存在下制備的燒瓶保持提取物中更加還原的環(huán)境。該圖還顯示，具有較大填充體積的燒瓶比具有較小填充體積的燒瓶更具還原性，這可能是由于較小的表面積與體積比而導(dǎo)致的提取物的氧化速度較慢。在空氣中制備的燒瓶都具有正的終點(diǎn)氧化還原電位值，與填充體積無相關(guān)性。圖6.蛋白l純化后通過cexhplc測量的所有產(chǎn)物相關(guān)物質(zhì)的百分比表示的總fab'片段。這些結(jié)果表明，在氮?dú)庀轮苽涞膿u瓶在提取后具有顯著較低水平的產(chǎn)物相關(guān)雜質(zhì)。所有氮?dú)庵苽涞臒?終點(diǎn)氧化還原電位范圍為-10mv至-116mv)顯示與空氣中制備的所有燒瓶(終點(diǎn)氧化還原電位范圍+79mv至+97mv)相比顯著降低的產(chǎn)物相關(guān)雜質(zhì)水平。圖7.ph和還原環(huán)境對純化的fab'片段的tm的影響。該圖顯示了兩種主要產(chǎn)物相關(guān)雜質(zhì)的熱穩(wěn)定性測定結(jié)果。氧化還原電位和熱穩(wěn)定性(熔融溫度)顯示相關(guān)性；氧化還原電位越低，蛋白質(zhì)的熔融溫度越低。當(dāng)ph變得更加中性時，可以描述類似的效果。這兩個變量都會使產(chǎn)物相關(guān)雜質(zhì)更易于降解，從而便于其清除。發(fā)明詳述本發(fā)明通過提供蛋白質(zhì)制造的新方法來解決上述需要，其中蛋白質(zhì)在宿主細(xì)胞中表達(dá)。特別地，本發(fā)明提供了適用于工業(yè)制造的方法。在第一個實施方案中，本發(fā)明提供了制備目標(biāo)蛋白質(zhì)的方法，其中所述蛋白質(zhì)在宿主細(xì)胞中表達(dá)，所述方法包括-在宿主細(xì)胞表達(dá)所述蛋白質(zhì)的條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞，-從細(xì)胞培養(yǎng)液中收集宿主細(xì)胞，-向宿主細(xì)胞添加緩沖液，-使緩沖液中的宿主細(xì)胞經(jīng)受熱處理，其中在所述熱處理期間緩沖液的氧化還原電位保持在0mv以下。在具體實施方案中，宿主細(xì)胞是原核細(xì)胞，例如革蘭氏陰性細(xì)菌。在另一個實施方案中，宿主細(xì)胞是大腸桿菌細(xì)胞。用于蛋白質(zhì)表達(dá)的原核宿主細(xì)胞在本領(lǐng)域中是公知的(terpe,k.(2006).overviewofbacterialexpressionsystemsforheterologousproteinproduction:frommolecularandbiochemicalfundamentalstocommercialsystems.applmicrobiolbiotechnol72,211-222.)。根據(jù)本發(fā)明的宿主細(xì)胞包括經(jīng)遺傳工程改造以產(chǎn)生目標(biāo)蛋白質(zhì)如抗體片段的重組細(xì)胞。重組大腸桿菌宿主細(xì)胞可以衍生自任何合適的大腸桿菌菌株，包括mc4100，tg1，tg2，dhb4，dh5α，dh1，bl21，k12，xl1blue和jm109。一個例子是用于重組蛋白質(zhì)發(fā)酵的常用宿主菌株，大腸桿菌菌株w3110(atcc27,325)。還可以通過培養(yǎng)修飾的大腸桿菌菌株，例如代謝突變體或蛋白酶缺陷型大腸桿菌菌株來產(chǎn)生抗體片段，如wo2011/086138，wo2011/086139，wo2011/086136和wo2013/007388中公開的方法，其整體并入本文?？梢愿鶕?jù)本發(fā)明的方法純化的目標(biāo)蛋白質(zhì)通常從大腸桿菌宿主細(xì)胞的周質(zhì)中分離。將蛋白質(zhì)靶向至該區(qū)室的方法是本領(lǐng)域公知的(makrides,s.c.(1996).strategiesforachievinghigh-levelexpressionofgenesinescherichiacoli.microbiolrev60,512-538)。將蛋白質(zhì)引導(dǎo)到大腸桿菌周質(zhì)的適當(dāng)信號序列的實例包括大腸桿菌phoa，ompa，ompt，lamb和ompf信號序列。重組蛋白在大腸桿菌宿主細(xì)胞中的表達(dá)還可以在可誘導(dǎo)系統(tǒng)的控制之下，由此重組抗體在大腸桿菌中的表達(dá)受誘導(dǎo)型啟動子的控制。適用于大腸桿菌的許多誘導(dǎo)型啟動子是本領(lǐng)域熟知的，并且取決于啟動子，重組蛋白的表達(dá)可以通過變化的因素例如溫度或生長培養(yǎng)基中特定物質(zhì)的濃度來誘導(dǎo)。誘導(dǎo)型啟動子的實例包括可用乳糖或非水解性乳糖類似物異丙基-b-d-1-硫代吡喃半乳糖苷(iptg)誘導(dǎo)的大腸桿菌lac、tac和trc啟動子，和分別由磷酸鹽、色氨酸和l-阿拉伯糖誘導(dǎo)的phoa、trp和arabad啟動子?？梢酝ㄟ^例如誘導(dǎo)劑的添加或當(dāng)誘導(dǎo)為溫度依賴性時溫度的變化來誘導(dǎo)表達(dá)。當(dāng)通過向培養(yǎng)物中加入誘導(dǎo)劑來實現(xiàn)重組蛋白表達(dá)的誘導(dǎo)時，取決于發(fā)酵系統(tǒng)和誘導(dǎo)劑可以通過任何合適的方法加入誘導(dǎo)劑，例如通過單次或多次快速加入或通過進(jìn)料逐漸加入誘導(dǎo)劑。應(yīng)當(dāng)理解，在誘導(dǎo)劑的添加和蛋白質(zhì)表達(dá)的實際誘導(dǎo)之間可能存在延遲，例如在誘導(dǎo)劑是乳糖的情況下，在誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達(dá)出現(xiàn)之前可能存在延遲，雖然在乳糖之前使用了任何預(yù)先存在的碳源?；蛘?，可根據(jù)本發(fā)明的方法純化的目標(biāo)蛋白質(zhì)是從熒光假單胞菌的周質(zhì)中分離的。將蛋白質(zhì)引導(dǎo)到熒光假單胞菌的周質(zhì)區(qū)室中的合適的序列包括本領(lǐng)域已經(jīng)描述的sec型分泌前導(dǎo)序列(d.m.retallack,etal.transportofheterologousproteinstotheperiplasmicspaceofpseudomonasfluorescensusingavarietyofnativesignalsequencesbiotechnol.lett.,29(2007),pp.1483–1491)。目標(biāo)蛋白質(zhì)的表達(dá)可以在可誘導(dǎo)系統(tǒng)的控制之下，由此表達(dá)受前述段落中所述的誘導(dǎo)型啟動子的控制。在本文中可以使用眾所周知的誘導(dǎo)劑例如iptg，或者誘導(dǎo)劑如誘導(dǎo)pben509和pben278啟動子的鄰氨基苯甲酸酯的苯甲酸酯分別在熒光假單胞菌表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行了描述。可以在將支持宿主細(xì)胞生長和重組蛋白表達(dá)的任何培養(yǎng)基中培養(yǎng)原核宿主細(xì)胞培養(yǎng)物(發(fā)酵)。培養(yǎng)基可以是任何化學(xué)確定的培養(yǎng)基，例如duranyo,etal.(2004).studiesontheexpressionofrecombinantfuculose-1-phosphatealdolaseinescherichiacoli.processbiochem39,1677-1684描述的用于大腸桿菌的培養(yǎng)基。原核宿主細(xì)胞的發(fā)酵可以在任何合適的系統(tǒng)例如連續(xù)、分批或補(bǔ)料分批模式中進(jìn)行，這取決于蛋白質(zhì)和所需的產(chǎn)率。分批模式可以在需要時快速加入營養(yǎng)素或誘導(dǎo)劑?；蛘?，可以使用補(bǔ)料分批培養(yǎng)，并且培養(yǎng)物在誘導(dǎo)前以分批模式在最大比生長速率下生長，該最大比生長速率可以使用最初存在于發(fā)酵罐中的營養(yǎng)物和用于控制生長速率的一種或多種營養(yǎng)補(bǔ)料方案來維持直到發(fā)酵完成。補(bǔ)料分批模式也可以在誘導(dǎo)前使用以控制原核宿主細(xì)胞的代謝并允許達(dá)到較高的細(xì)胞密度。宿主細(xì)胞隨后從發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行收集，例如，通過離心、過濾或濃縮從樣品中收集宿主細(xì)胞。在根據(jù)本發(fā)明的方法的一個實施方案中，細(xì)胞收集步驟包括離心和細(xì)胞回收的步驟。在本發(fā)明的特別優(yōu)選的實施方案中，所述離心步驟是連續(xù)離心，從其回收細(xì)胞漿液。對于原核(例如大腸桿菌)宿主細(xì)胞培養(yǎng)方法，其中目標(biāo)蛋白質(zhì)(例如抗體片段)存在于宿主細(xì)胞的周質(zhì)空間中，需要從宿主細(xì)胞中釋放蛋白質(zhì)。釋放可以通過任何合適的方法或方法的組合來實現(xiàn)，例如通過機(jī)械或壓力處理的細(xì)胞裂解，凍融處理，滲透沖擊，提取劑和/或熱處理。蛋白質(zhì)釋放的這種提取方法是本領(lǐng)域公知的。在本發(fā)明的方法中，蛋白質(zhì)提取是通過熱處理步驟實現(xiàn)的，即在規(guī)定的時間內(nèi)將樣品保持在升高的溫度。根據(jù)本發(fā)明的方法，在熱處理步驟之前，將緩沖液加入到從細(xì)胞培養(yǎng)液中收集的細(xì)胞中。在本發(fā)明方法的一個具體實施方案中，所述緩沖液是ph7.4的100mmtris和10mmedta，在另一個實施方案中，所述提取緩沖液是ph7.4的75mmtris和7.5mmedta，ph7.4的200mmtris和20mmedta，或ph7.4的300mmtris和30mmedta。在本發(fā)明的一個實施方案中，緩沖液具有的ph確保在熱處理步驟之前樣品的ph為ph6至9，例如ph6至8，如wo2002/013930(其在此整體并入本文)中描述的。優(yōu)選地，所述ph為6.5至8，ph6.8至7.8，或ph7至7.6。本領(lǐng)域技術(shù)人員將知道本領(lǐng)域中描述用于蛋白質(zhì)提取的更多合適的緩沖液。在另一個替代實施方案中，所述緩沖液的氧化還原電位保持在-100mv以下，-200mv以下，-300mv以下或-400mv以下。環(huán)境的氧化還原電位對存在于蛋白質(zhì)分子中的半胱氨酸殘基上硫醇基團(tuán)之間的二硫鍵的動力學(xué)特別重要。當(dāng)還原時，所述二硫鍵被破壞從而釋放相應(yīng)的硫醇基團(tuán)(-sh)?？贵w分子具有若干二硫鍵，其對于維持其結(jié)構(gòu)及其生物學(xué)活性至關(guān)重要。這些二硫鍵中的一些由于它們在分子內(nèi)的位置而比其他二硫鍵更容易接觸到存在于環(huán)境中的還原和/或氧化物質(zhì)，因此更易于被破壞。在本發(fā)明的上下文中，產(chǎn)物相關(guān)雜質(zhì)實際上是目標(biāo)蛋白質(zhì)的片段，因此結(jié)構(gòu)更小和更簡單。不希望受理論束縛，所述產(chǎn)物相關(guān)雜質(zhì)中的半胱氨酸鍵是更可及的，因此由于環(huán)境的氧化還原電位而更容易受到破壞。在本發(fā)明方法的第二個實施方案中，所述熱處理在容器中進(jìn)行，并且通過減少熱處理期間容器中氣相中存在的氧氣(o2)的量來維持所述氧化還原電位。通常在容器中在由緩沖液和宿主細(xì)胞組成的樣品上方的存在一定體積的空氣(這里稱為氣相)。在本發(fā)明的意義上，減少氣相中的氧氣的量意味著以使得氣相含有比空氣更少的氧氣的方式改變所述氣相的組成。如本領(lǐng)域已知的，空氣通常含有約21％的氧氣(體積)。為了根據(jù)本發(fā)明的方法將氧化還原電位保持在0mv以下，本領(lǐng)域技術(shù)人員將意識到可用于防止提取樣品氧化的不同手段。這可以通過除去存在于容器中的氣相中的氧氣和其它氧化氣體，通常通過用另一種惰性氣體替代來實現(xiàn)。所述替代可以通過氮?dú)?n2)覆蓋實現(xiàn)，即將容器中的樣品保持與含n2氣相接觸，或通過將惰性氣體噴射即鼓泡或移動通過樣品而進(jìn)入容器?？捎糜诟鶕?jù)本發(fā)明的方法保持氧化還原電位的其它惰性氣體包括氬和氦?；蛘?，選擇本領(lǐng)域可獲得的具有不同程度的強(qiáng)度的還原劑。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員將根據(jù)所需的氧化還原電位和應(yīng)保持的時間來選擇最合適的還原劑。本領(lǐng)域已知的還原劑包括但不限于谷胱甘肽，巰基乙醇，二硫蘇糖醇或三(2-羧乙基)膦。根據(jù)所需的生產(chǎn)規(guī)模，原核宿主細(xì)胞的培養(yǎng)可以在任何合適的容器如搖瓶或發(fā)酵罐中進(jìn)行?？色@得各種大型發(fā)酵罐，容量為大于1,000升至約100,000升。優(yōu)選使用1,000至50,000升的發(fā)酵罐，更優(yōu)選為1,000至25,000或1,000至20,000，1,000至15,000，1,000至10,000，1,000至5,000，20,000，15,000，12,000，10,000，5000或2000升的發(fā)酵罐。也可以使用小型發(fā)酵罐，容量為0.5至1,000升。在優(yōu)選的實施方案中，所述氣相在熱處理步驟期間含有小于20％，15％，12％，10％，8％，5％，2％或1％的氧氣(體積)。在優(yōu)選的實施方案中，在熱處理步驟期間從氣相中基本上除去所述氧氣。在本發(fā)明方法的第三個實施方案中，將氮?dú)?n2)加入到容器的氣相中。在本發(fā)明方法的第四個實施方案中，所述氣相含有至少80％的n2，至少85％，至少90％的n2，至少95％的n2或至少97％或99％的n2。在另一替代實施方案中，所述氣相基本上為n2。通常，將所述n2作為覆蓋層加入到容器的氣相中，并通過以0.1％至1vvm(每分鐘每液體體積的氣體體積)將100％n2氣加入到頂部空間中來將所述n2維持在含有緩沖液和宿主細(xì)胞的容器的頂部空間中。在具體實施方案中，本發(fā)明涉及用于制備目標(biāo)蛋白質(zhì)的方法，其中所述蛋白質(zhì)在宿主細(xì)胞中表達(dá)，所述方法包括-在宿主細(xì)胞表達(dá)所述蛋白質(zhì)的條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞，-從細(xì)胞培養(yǎng)液中收集宿主細(xì)胞，-向宿主細(xì)胞添加緩沖液，和-使緩沖液中的宿主細(xì)胞在容器中經(jīng)受熱處理，其中容器的氣相基本上為n2。取決于容器的結(jié)構(gòu)，所述n2可以被添加到容器的氣相中，其中容器隨后被密封，即將容器的內(nèi)部與外部隔開，從而在熱處理期間使n2保持在氣相中?；蛘撸跓崽幚聿襟E期間，施加恒定的n2流通過容器的氣相，例如，對于不允許將內(nèi)部從外部環(huán)境密封的容器。在一個實施方案中，在熱處理步驟之前將n2加入或引入氣相，以確保在熱處理步驟期間氧化還原電位維持在期望值以下。在特定實施方案中，本發(fā)明的方法包括：-在宿主細(xì)胞表達(dá)目標(biāo)蛋白質(zhì)的條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞，-從細(xì)胞培養(yǎng)液中收集宿主細(xì)胞，-向容器中的宿主細(xì)胞添加緩沖液，-向容器的氣相中加入n2，-密封所述容器；和-將緩沖液中的宿主細(xì)胞在容器中經(jīng)受熱處理，其中在所述熱處理期間所述緩沖液的氧化還原電位保持在0mv以下。因此，在本發(fā)明方法的另一個實施方案中，使用至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少97％，至少99％，至少99％或100％n2引入所述n2作為覆蓋層。在本發(fā)明的替代實施方案中，所述n2通過在熱處理期間噴射n2通過緩沖液，優(yōu)選通過噴射基本上純的n2來引入。在本發(fā)明的第五個實施方案中，所述n2作為容器的氣相中的覆蓋層加入到容器中，或者通過將n2噴射通過緩沖液而加入到容器中。根據(jù)本發(fā)明的方法包括熱處理步驟，其通過促進(jìn)除去其它蛋白質(zhì)相關(guān)材料而使得可以獲得可溶性、正確折疊和組裝的蛋白質(zhì)如抗體片段的樣品。通過在非還原性sds-page上對應(yīng)于組裝的蛋白質(zhì)鏈的預(yù)期分子量的單個帶的存在來顯示“正確折疊和組裝”的蛋白質(zhì)。其他蛋白質(zhì)相關(guān)材料通常將是正確折疊和組裝的蛋白質(zhì)的部分降解的片段。本發(fā)明方法中的熱處理步驟是在加熱階段達(dá)到所需的升高溫度后將樣品的溫度保持在該所需的升高溫度的步驟。熱處理步驟通過使樣品經(jīng)受所需的高溫來進(jìn)行。最優(yōu)選地，熱處理步驟在30℃至70℃的范圍內(nèi)進(jìn)行?？梢愿鶕?jù)需要選擇溫度，并且可以取決于用于純化的蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性來選擇溫度。在另一個實施方案中，溫度在40℃至65℃的范圍內(nèi)，或優(yōu)選在40℃至60℃的范圍內(nèi)，更優(yōu)選在45℃至60℃的范圍內(nèi)，甚至更優(yōu)選在該范圍內(nèi)50℃至60℃的范圍內(nèi)，最優(yōu)選為55℃至60℃，58℃至60℃或59℃。因此，最低溫度為30℃、35℃或40℃，最高溫度為60℃、65℃或70℃。在本發(fā)明方法的第六個實施方案中，所述熱處理步驟在30℃至70℃下進(jìn)行。在本發(fā)明方法的第七個實施方案中，所述熱處理步驟在55℃至65℃下進(jìn)行。熱處理步驟優(yōu)選進(jìn)行較長時間。熱處理的時間長度優(yōu)選為1至24小時或1至18小時，更優(yōu)選為4至18小時，進(jìn)一步優(yōu)選為6至16小時，最優(yōu)選為8至14小時，或8至12小時，例如10小時。因此，熱處理的最短時間為1、2或3小時，最長時間為20、22或24小時。在本發(fā)明方法的第八實施方案中，第六或第七實施方案的熱處理步驟保持1小時至18小時。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，反應(yīng)時間和溫度之間通常存在反比關(guān)系，因此進(jìn)行反應(yīng)的溫度越高，反應(yīng)發(fā)生所需的時間越短。在具體實施方案中，熱處理在50℃至60℃下進(jìn)行10至16小時，更優(yōu)選在59℃下進(jìn)行10至12小時。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，可以選擇溫度和時間來適應(yīng)所涉及的樣品和目標(biāo)蛋白質(zhì)(例如抗體或抗體片段)的特征。在本發(fā)明方法的另一個替代實施方案中，所述蛋白質(zhì)提取在58℃至60℃的溫度下進(jìn)行8至12小時。熱處理步驟優(yōu)選在樣品攪拌下進(jìn)行，例如在搖動器或攪拌器中，以在合適的攪拌速度(例如200轉(zhuǎn)/分鐘)下進(jìn)行操作。然而，合適的攪拌速度將根據(jù)方法的規(guī)模而變化。在本發(fā)明方法的第九個實施方案中，在熱處理步驟之前，樣品的ph調(diào)節(jié)至6至9。在本發(fā)明方法的另一個具體實施方案中，在熱處理步驟之前，所述樣品的ph為6.5至8，6.5至7.5或6.8至7.2。在特定的實施方案中，在熱處理步驟之前測量或調(diào)整樣品的ph，以確保在熱處理步驟期間樣品的ph為5至9，優(yōu)選在熱處理步驟期間樣品的ph為6至7。在另一個實施方案中，用堿例如無機(jī)堿例如氫氧化鈉或有機(jī)堿例如三乙胺或三甲胺或tris堿來調(diào)節(jié)ph?？梢允褂萌魏魏线m的試劑來調(diào)節(jié)樣品的ph。試劑可以是緩沖液，或可以在緩沖液之前和/或之后添加?？捎糜谡{(diào)節(jié)ph的典型試劑包括以下的一種或多種或由其組成：naoh，nh4oh,，硫酸，edta，tris緩沖液。在另一個具體實施方案中，在熱處理步驟之前和在將惰性氣體例如氮?dú)饧尤氲饺萜鞯臍庀嘁詫⒀趸€原電位保持在0mv以下之前測量或調(diào)整樣品的ph?；蛘?，在本發(fā)明的另一個實施方案中，在熱處理步驟之前測量和/或調(diào)整樣品的ph，并且在熱處理步驟期間使惰性氣體例如氮?dú)馔ㄟ^樣品。本文所述的ph測量通常歸一化至20℃。在本發(fā)明的上下文中，“在熱處理步驟之前”是指在樣品達(dá)到期望的升高的溫度并且開始熱處理步驟(保持在升高的溫度)的時間點(diǎn)之前并包括此時間點(diǎn)。為了達(dá)到熱處理步驟的所需的升高的溫度，樣品經(jīng)受“加熱階段”，在此期間樣品的溫度升高到所需溫度。在一個實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的方法包括使樣品經(jīng)受加熱階段和熱處理步驟。在其中方法包括使樣品經(jīng)受加熱階段和熱處理步驟的實施方案中，樣品可以在加熱階段開始之前處于所需的ph水平和/或在加熱階段期間處于所需ph水平。在特定實施方案中，在加熱階段開始之前，將n2加入到容器的氣相中。優(yōu)選地，在所述加熱階段之前，樣品處于所需的ph水平。在本發(fā)明方法的第十個實施方案中，目標(biāo)蛋白質(zhì)是在表達(dá)載體中編碼的重組蛋白質(zhì)。在第十一實施方案中，根據(jù)本發(fā)明第八實施方案的方法，蛋白質(zhì)是重組抗體。在第十二實施方案中，所述重組抗體是重組抗體片段。本領(lǐng)域已知有許多重組抗體片段，包括fab，fab'，f(ab')2和fv和scfv片段?；蛘?，重組抗體選自雙抗體，三抗體，四抗體，微抗體，結(jié)構(gòu)域抗體，單鏈抗體，由抗體片段或抗體形成的雙特異性、三特異性、四特異性或多特異性抗體，包括但不限于fab-fv構(gòu)建體。在本發(fā)明方法的第十三個實施方案中，所述重組抗體或重組抗體片段特異性結(jié)合tnf-α或cd154。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了制備重組抗體的方法，其中所述重組抗體在宿主細(xì)胞中表達(dá)，所述方法包括在宿主細(xì)胞表達(dá)所述蛋白質(zhì)的條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞，從細(xì)胞培養(yǎng)液收集宿主細(xì)胞，向宿主細(xì)胞中加入緩沖液，并對宿主細(xì)胞進(jìn)行熱處理，以從容器中的所述宿主細(xì)胞中提取重組抗體，其中所述緩沖液的氧化還原電位在所述提取期間維持在0mv以下，-100mv以下，-200mv以下，-300mv以下或-400mv以下。在另一個具體實施方案中，本發(fā)明提供了制備重組抗體的方法，其中所述重組抗體在宿主細(xì)胞中表達(dá)，所述方法包括在宿主細(xì)胞表達(dá)所述蛋白質(zhì)的條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞，從細(xì)胞培養(yǎng)液收集宿主細(xì)胞，向容器中的宿主細(xì)胞中加入緩沖液，向容器的氣相中加入n2，對宿主細(xì)胞進(jìn)行熱處理，并回收所述蛋白質(zhì)。在另一個具體實施方案中，本發(fā)明的方法提供了制備重組抗體的方法，其中所述重組抗體在宿主細(xì)胞中表達(dá)，所述方法包括在宿主細(xì)胞表達(dá)所述蛋白質(zhì)的條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞，從細(xì)胞培養(yǎng)液收集宿主細(xì)胞，向容器中的宿主細(xì)胞加入緩沖液，向容器的氣相中加入n2，對宿主細(xì)胞進(jìn)行熱處理，并回收所述蛋白質(zhì)；其中所述回收的蛋白質(zhì)與從包括在容器的氣相中不存在n2的情況下進(jìn)行的熱處理的制備方法回收的蛋白質(zhì)相比具有較低水平的產(chǎn)物相關(guān)雜質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明的方法可以包括一個或多個其它步驟，例如純化程序，例如過濾和/或離心。還包括流化床色譜。優(yōu)選的進(jìn)一步的純化方法包括離子交換色譜，微濾，超濾，滲濾和固定床捕獲和膨脹床捕獲以及任何這些的組合。本文所用的術(shù)語“抗體”是指單克隆或多克隆抗體。本文所用的術(shù)語“抗體”包括但不限于由本領(lǐng)域已知的重組技術(shù)產(chǎn)生的重組抗體?！翱贵w”包括任何物種特別是哺乳動物物種的抗體；例如任何同種型的人抗體，包括iga1,iga2,igd,igg1,igg2a,igg2b,igg3,igg4,ige和igm及其修飾的變體，非人靈長類動物抗體，例如來自黑猩猩、狒狒、恒河猴或食蟹猴；嚙齒動物抗體，例如來自小鼠，大鼠或兔子；山羊或馬抗體；和駱駝科動物抗體(例如來自駱駝或美洲駝，如nanobodiestm)及其衍生物；或鳥類物種的抗體，如雞抗體或魚類物種的抗體如鯊魚抗體。術(shù)語“抗體”也指“嵌合”抗體，其中至少一個重鏈和/或輕鏈抗體序列的第一部分來自第一物種，重鏈和/或輕鏈抗體序列的第二部分來自第二物種。本文的目標(biāo)嵌合抗體包括衍生自非人靈長類動物(例如舊大陸猴，例如狒狒，恒河猴和食蟹猴)的可變結(jié)構(gòu)域抗原結(jié)合序列和人恒定區(qū)序列的“靈長類化”抗體。“人源化”抗體是含有源自非人抗體的序列的嵌合抗體。在大多數(shù)情況下，人源化抗體是人抗體(受體抗體)，其中受體高變區(qū)的殘基被來自非人物種(例如小鼠，大鼠，兔，雞或非人靈長類動物)(供體抗體)的具有所需的特異性、親和力和活性的高變區(qū)(或互補(bǔ)決定區(qū)(cdr))的殘基替代。在大多數(shù)情況下，在cdr外的人(受體)抗體的殘基(即在框架區(qū)(fr)中)另外被相應(yīng)的非人殘基替代。此外，人源化抗體可以包含在受體抗體或供體抗體中未發(fā)現(xiàn)的殘基。進(jìn)行這些修飾以進(jìn)一步改善抗體性能。人源化降低了非人抗體在人中的免疫原性，從而有助于將抗體用于治療人類疾病。人源化抗體和產(chǎn)生它們的幾種不同的技術(shù)是本領(lǐng)域公知的。術(shù)語“抗體”還指人抗體，其可以作為人源化的替代產(chǎn)生。例如，可以產(chǎn)生在免疫時能夠在不產(chǎn)生內(nèi)源性鼠抗體的情況下產(chǎn)生人抗體的完整庫的轉(zhuǎn)基因動物(例如小鼠)。例如，已經(jīng)描述嵌合和種系突變小鼠中抗體重鏈連接區(qū)(jh)基因的純合缺失導(dǎo)致內(nèi)源抗體產(chǎn)生的完全抑制。將人種系免疫球蛋白基因陣列轉(zhuǎn)移到這種種系突變小鼠中將導(dǎo)致在用特定抗原免疫攜帶人種系免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因動物后產(chǎn)生特異性抗所述抗原的人抗體。用于生產(chǎn)這種轉(zhuǎn)基因動物的技術(shù)和用于從這些轉(zhuǎn)基因動物分離和產(chǎn)生人抗體的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的?；蛘撸谵D(zhuǎn)基因動物例如小鼠中，只有編碼小鼠抗體可變區(qū)的免疫球蛋白基因被相應(yīng)的人可變免疫球蛋白基因序列替代。編碼抗體恒定區(qū)的小鼠種系免疫球蛋白基因保持不變。以這種方式，抗體效應(yīng)子在轉(zhuǎn)基因小鼠的免疫系統(tǒng)中起作用，因此b細(xì)胞發(fā)育基本上不變，這可能導(dǎo)致體內(nèi)抗原性攻擊后改善的抗體反應(yīng)。在已經(jīng)從這樣的轉(zhuǎn)基因動物中分離出編碼特定目標(biāo)抗體的基因后，可以用人恒定區(qū)基因替代編碼恒定區(qū)的基因，以獲得完全人抗體。用于在體外獲得人抗體/抗體片段的其它方法基于展示技術(shù)，例如噬菌體展示或核糖體展示技術(shù)，其中使用至少部分人造產(chǎn)生或來自供體的免疫球蛋白可變(v)結(jié)構(gòu)域基因庫的重組dna文庫。用于產(chǎn)生人抗體的噬菌體和核糖體展示技術(shù)是本領(lǐng)域公知的。人抗體也可以從分離的人b細(xì)胞中產(chǎn)生，所述人b細(xì)胞用目標(biāo)抗原離體免疫，隨后融合以產(chǎn)生雜交瘤，其然后可以就最佳的人抗體進(jìn)行篩選。本文所用的術(shù)語“抗體”也指糖基化抗體。在本發(fā)明的某些實施方案中，抗體是通過共價連接功能部分如水溶性聚合物如聚(乙二醇)、聚(乙二醇)和聚(丙二醇)的共聚物、羧甲基纖維素、葡聚糖、聚(乙烯醇)、聚(乙烯基吡咯烷酮)或聚(脯氨酸)進(jìn)行修飾的(所有這些已知在靜脈內(nèi)注射后在血液中的半衰期比相應(yīng)的未修飾的蛋白質(zhì)顯示更長的半衰期)。在一些實施方案中，本發(fā)明的抗體是與功能部分如聚(乙二醇)(peg)部分連接的抗體。在一個具體實施方案中，抗體是抗體片段，并且peg分子可以通過位于抗體片段中的任何可用的氨基酸側(cè)鏈或末端氨基酸官能團(tuán)(例如任何游離的氨基，亞氨基，硫醇，羥基或羧基)連接。這樣的氨基酸可以天然存在于抗體片段中，或者可以使用重組dna方法工程化成片段(參見例如us5,219,996；us5,667,425；wo98/25971)。本文所用的術(shù)語“抗體”不僅指任何物種包括人(例如igg)和其他哺乳動物物種的未經(jīng)截斷的抗體，而且還指抗體片段。抗體的片段包含本領(lǐng)域已知的至少一種重鏈或輕鏈免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域并結(jié)合一種或多種抗原。根據(jù)本發(fā)明的抗體片段的實例包括fab,fab',f(ab')2和fv和scfv片段；以及雙抗體；三抗體；四抗體；微抗體；結(jié)構(gòu)域抗體；(dab)，例如sdab，vhh和vnar片段，單鏈抗體；由抗體片段或抗體形成的雙特異性、三特異性、四特異性或多特異性抗體，包括但不限于fab-fv或fab-fv-fv構(gòu)建體。如上所定義的抗體片段是本領(lǐng)域已知的。本文所用的術(shù)語“氧化還原電位”是指化學(xué)物質(zhì)獲得電子并由此被還原的傾向的度量。氧化還原電位以伏(v)或毫伏(mv)測量。每種物質(zhì)都有自己的內(nèi)在還原電位；電位越大，物質(zhì)對電子的親和力和被還原的傾向越大。本文所用的術(shù)語“提取”或“蛋白質(zhì)提取”是指從宿主細(xì)胞中移出在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的蛋白質(zhì)。提取可能涉及宿主細(xì)胞的破壞和細(xì)胞內(nèi)流體與細(xì)胞碎片的分離，或者宿主的操作使革蘭氏陰性細(xì)菌或具有外細(xì)胞膜的其它細(xì)胞的外細(xì)胞膜泄漏以釋放來自這樣的細(xì)胞的周質(zhì)空間的流體。實施例方法發(fā)酵過程a將用載體轉(zhuǎn)染以表達(dá)與人tnf-α特異性結(jié)合的fab'的大腸桿菌w3110用作宿主細(xì)胞。將含有這些細(xì)胞的冷凍細(xì)胞庫小瓶用于接種含有6x蛋白胨酵母提取物(6×p-y)培養(yǎng)基加四環(huán)素的搖瓶(700ml總體積)。將該搖瓶在30℃和230rpm下孵育。在所需的od范圍(od600＝2-3)下，將搖瓶用于接種含有sm6化學(xué)確定培養(yǎng)基(popplewelletal.expressionofantibodyfragmentsbyperiplasmicsecretioninescherichiacoli；methodsinmolecularbiology,vol.308:therapeuticproteins:methodsandprotocols；2005)加四環(huán)素的種子發(fā)酵罐(10l總體積)，甘油作為碳源。種子發(fā)酵罐內(nèi)的細(xì)胞培養(yǎng)物保持在30℃，溶解氧氣濃度(po2)維持在30％，ph值控制在7.0。在所需的od范圍(od600＝30-37)下，使用種子培養(yǎng)物接種以甘油作為碳源的含有化學(xué)確定的培養(yǎng)基的生產(chǎn)發(fā)酵罐(600l總體積)。生產(chǎn)發(fā)酵罐最初保持在30℃，30％po2，ph控制在7.0，并將細(xì)胞在分批階段中生長直到進(jìn)行誘導(dǎo)。在分批階段期間，將溫度降至25℃，加入mgso4以避免該代謝物的耗盡。在特定的od范圍(od600＝43-47)下，其中發(fā)生甘油消耗，向培養(yǎng)物中加入乳糖溶液。然后，乳糖將被細(xì)胞用作主要碳源，并且還將作為fab'表達(dá)的誘導(dǎo)劑。通過連續(xù)進(jìn)料在誘導(dǎo)期維持乳糖的濃度，并在誘導(dǎo)后30小時收獲細(xì)胞。發(fā)酵過程b將含有表達(dá)與人tnf-α特異性結(jié)合的fab'的大腸桿菌mxe012宿主細(xì)胞fab'的冷凍細(xì)胞庫小瓶用于接種含有6x蛋白胨酵母提取物(6×p-y)培養(yǎng)基加四環(huán)素的搖瓶(700ml總體積)。將該搖瓶在30℃和230rpm下孵育。在所需的od范圍(od600＝2-3)下，搖瓶用于接種含有md化學(xué)確定的培養(yǎng)基(duranyetal.2004.studiesontheexpressionofrecombinantfuculose-1-phosphatealdolaseinescherichiacoli.processbiochem39:1677–1684)加四環(huán)素的種子發(fā)酵罐(10l總體積)，甘油作為碳源。種子發(fā)酵罐內(nèi)的細(xì)胞培養(yǎng)物保持在30℃，溶解氧氣濃度(po2)維持在30％，ph值控制在6.9。在所需的od范圍(od600＝30-37)，使用種子培養(yǎng)物接種以甘油作為碳源的含有化學(xué)確定的培養(yǎng)基的生產(chǎn)發(fā)酵罐(600l總體積)。生產(chǎn)發(fā)酵罐最初保持在30℃，30％po2，ph控制在ph6.9，并并將細(xì)胞在分批階段中生長直到甘油耗盡。在此期間，加入mgso4以避免該代謝物的耗盡。在分批階段結(jié)束時，開始指數(shù)甘油進(jìn)料，并對培養(yǎng)物進(jìn)料特定量的甘油以達(dá)到約70單位的od600。此時，將甘油進(jìn)料從指數(shù)進(jìn)料切換至線性進(jìn)料，并通過加入iptg(38.79g/kg培養(yǎng)物)誘導(dǎo)fab'表達(dá)。誘導(dǎo)后40小時收獲細(xì)胞。大腸桿菌菌株mxe012是如wo2011/086136(其整體并入本文)中所述的包含spr基因的突變sprh145a的代謝大腸桿菌突變體。回收和提取方法通過使用westfaliapsc5盤式離心機(jī)的連續(xù)離心來收獲細(xì)胞。通過加入水和ph7.4的提取緩沖液至10mmedta、100mmtris的最終提取緩沖液濃度將濃縮的細(xì)胞漿液重新懸浮在2l或5l玻璃容器中的原始細(xì)胞收獲濃度中。如果需要，在通過加熱步驟進(jìn)行蛋白質(zhì)提取之前通過向提取緩沖液中加入2.5mtris堿將再懸浮的細(xì)胞調(diào)節(jié)至ph7.2。對于熱提取，將細(xì)胞加熱至59℃進(jìn)行10小時。使用biostatbplus控制單元(sartorius)和多發(fā)酵器控制系統(tǒng)軟件維持溫度和混合。樣品純化從提取樣品中純化fab'相關(guān)物質(zhì)，以使得能夠評估產(chǎn)物相關(guān)雜質(zhì)。首先通過離心澄清提取樣品，收集澄清的上清液并通過0.2μm過濾器過濾。然后將澄清的上清液加載到1ml蛋白l柱(pierce#89928)上，用ph7.4的低濃度磷酸鹽緩沖液洗滌，并用ph為2.8的甘氨酸緩沖液洗脫。顯示蛋白l樹脂可以捕獲fab'片段，并且回收是線性的且在實驗范圍內(nèi)可重復(fù)。樣品分析通過陽離子交換色譜法分析和定量純化的樣品。將樣品加載到dionexpropacscx-10(thermoscientific)分析柱上，并使用鹽梯度洗脫。在280nm監(jiān)測洗脫的蛋白質(zhì)，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)程序定量和解釋色譜峰。實施例1根據(jù)方法b進(jìn)行發(fā)酵，并如上所述提取蛋白質(zhì)。使用orp(氧化還原電位)探針(broadleyjamescorporation，irvineca)測量在提取過程中容器中的氧化還原電位，并使用軟件(sartorius，bethlehempa)進(jìn)行監(jiān)測。為了評估維持氧化還原降低的環(huán)境的效果，在提取過程中一些提取容器暴露于氮?dú)?，而其他提取容器暴露于空氣，還將氣體噴射通過樣品到容器中或作為覆蓋流維持在容器的頂部空間。下表1顯示了容器氣流條件的總結(jié)。使用100％氮?dú)饣驂嚎s空氣供應(yīng)，所有氣體以1vvm的流速(每分鐘每流體體積的氣體體積，即1l提取物的1l/min)保持。表1圖1和圖2顯示提取物的相應(yīng)氧化還原和溫度曲線(圖1)和提取后樣品的sdspage凝膠(圖2)。從這些圖可以得出，在熱處理步驟期間保持氮?dú)飧采w層始終保持低的氧化還原電位測量，在59℃的溫度保持期間最小為約-435mv，通常為-375mv。當(dāng)?shù)獨(dú)鈬娚鋾r，觀察到類似的低氧化還原電位。當(dāng)含有宿主細(xì)胞的緩沖液用空氣代替氮?dú)飧采w時，可以看出，在加熱步驟提取期間氧化還原電位值顯著更高，在59℃的溫度保持期間變?yōu)殛栃?通常約+45mv)。當(dāng)噴射空氣時，觀察到類似的高氧化還原電位。由于觀察到高發(fā)泡水平，氣體噴射被切換至部分覆蓋通過提取物。圖2顯示了通過sdspage測量的產(chǎn)物相關(guān)雜質(zhì)水平的顯著差異。該圖顯示，在存在氮?dú)獾那闆r下，與在空氣存在下進(jìn)行的提取相比，熱提取期間的還原條件足以顯著降低產(chǎn)物相關(guān)雜質(zhì)的水平。實施例2根據(jù)方法a的發(fā)酵和隨后的提取如上所述進(jìn)行。，頂部空間的氮?dú)饬魉購?.1vvm變化到1vvm，結(jié)合根據(jù)表2的改變的攪拌和填充體積。表2提取物編號氮?dú)飧采w(vvm)rpm填充體積10.11501.5211501.530.1450341450350.553002.2560.553002.2570.553002.25803002.25從圖3可以看出，可以觀察到氮?dú)飧采w對產(chǎn)物相關(guān)雜質(zhì)的清除具有的明顯效果。沒有施加氮?dú)飧采w的提取物#8具有顯著更高水平的產(chǎn)物相關(guān)雜質(zhì)。另一方面，通過比較提取物1和2以及7和8，該圖還表明，氮?dú)飧采w的速率可能對這種雜質(zhì)的清除有影響。實施例3根據(jù)方法a的發(fā)酵和細(xì)胞收獲如上所述進(jìn)行。通過在熱提取之前立即向提取緩沖液中加入2.5mtris堿將重懸浮的宿主細(xì)胞調(diào)節(jié)至ph7.2。該熱提取在有或沒有氮?dú)飧采w的情況下進(jìn)行。當(dāng)適用時，通過使用100％的氮?dú)庖?vvm氣化容器的頂部空間來維持氮?dú)飧采w。在圖4中，在氮?dú)飧采w層的存在下進(jìn)行提取1至3，而提取4至6用空氣覆蓋。結(jié)果再次顯示氮?dú)獾拇嬖诘囊嫣?，?dǎo)致在熱提取后殘留的產(chǎn)物相關(guān)雜質(zhì)的水平顯著降低。進(jìn)一步的有益效果來自在熱提取之前進(jìn)行的ph調(diào)節(jié)，因為由于與以前的實施例相比，產(chǎn)物相關(guān)雜質(zhì)的水平似乎進(jìn)一步降低。實施例4在還原條件下提取的效果還以較小規(guī)模分析，即使用搖瓶。收集25-100ml蛋白質(zhì)誘導(dǎo)的細(xì)胞培養(yǎng)物，并通過加入水和3x提取緩沖液(ph7.4)至最終的1x提取緩沖液濃度(10mmedta，100mmtris)將細(xì)胞培養(yǎng)物重新懸浮于250mlerlenmeyer瓶中。燒瓶具有塞子密封并由聚碳酸酯制成以使氧氣進(jìn)入燒瓶的滲透性最小化。使用具有穿過手套袋的連續(xù)氮?dú)饬鞯囊淮涡允痔状?aldrichatmosbag，cat#z530220)將氮?dú)飧采w層加入到燒瓶的氣相中。將瓶子從手套袋中取出和進(jìn)行熱提取之前其被密封。還在試驗臺上制備樣品(將空氣作為燒瓶氣相中的覆蓋層)以用于比較。在搖瓶培養(yǎng)箱(newbrunswickinnova42)中，在60℃下進(jìn)行熱提取10小時。使用broadleyjamesorp探針測量提取后每個燒瓶中的氧化還原電位。熱處理步驟還在不同的燒瓶填充體積下進(jìn)行，以評估不同表面積與體積比對蛋白質(zhì)提取的影響。表3總結(jié)了所測試的實驗條件。表3提取物#制備填充體積(ml)1氮?dú)?52氮?dú)?03氮?dú)?004空氣255空氣506空氣100圖5顯示在氮?dú)飧采w存在下制備的搖瓶比在空氣存在下制備的燒瓶保持提取物中更加還原的環(huán)境。該圖還顯示，具有較大填充體積的燒瓶比具有較小填充體積的燒瓶更具還原性，這可能是由于較小的表面積與體積比而導(dǎo)致的提取物的氧化速度較慢。在空氣中制備的燒瓶都具有正的終點(diǎn)氧化還原電位值，與填充體積無相關(guān)性。圖6顯示在氮?dú)庀轮苽涞膿u瓶在提取后具有顯著較低水平的產(chǎn)物相關(guān)雜質(zhì)。所有氮?dú)庵苽涞臒?終點(diǎn)氧化還原電位范圍為-10mv至-116mv)顯示與空氣中制備的所有燒瓶(終點(diǎn)氧化還原電位范圍+79mv至+97mv)相比顯著降低的產(chǎn)物相關(guān)雜質(zhì)水平。實施例5與人tnf-α特異性結(jié)合的fab’具有比hcp(宿主細(xì)胞蛋白)更高的熔融溫度(tm)，這是在熱處理步驟期間被利用的特征。加熱使顯著量的hcp和產(chǎn)物相關(guān)雜質(zhì)變性，導(dǎo)致它們聚集并在提取步驟期間被清除。然而，如前述實施例所述，當(dāng)施加氮?dú)飧采w時，由于降低的氧化還原電位，這些雜質(zhì)的清除率大大提高。認(rèn)為由于在加熱期間在這些物質(zhì)中鏈內(nèi)鍵的減少(這將導(dǎo)致雜質(zhì)中的熔融溫度降低)，還原環(huán)境有助于清除雜質(zhì)。為了確認(rèn)上述，在非還原和還原條件下測量兩種主要產(chǎn)物相關(guān)雜質(zhì)的熔融溫度。這些還原條件通過使用tcep-hcl(三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽)來實現(xiàn)，以模擬在提取期間進(jìn)行的氮?dú)飧采w產(chǎn)生的環(huán)境。使用thermofluor測定進(jìn)行測量，其基于結(jié)合蛋白質(zhì)的疏水性熒光團(tuán)的使用，前提是蛋白質(zhì)的一些或全部疏水區(qū)域被暴露。在這種特殊情況下，熒光團(tuán)是sypro橙(dmso中的5000x濃度；lifetechnologiess-6650)。這允許使用實時pcr系統(tǒng)(7900ht快速實時pcr系統(tǒng)，來自lifetechnologies)通過在變性條件(例如增加溫度)下測量染料與蛋白質(zhì)結(jié)合時發(fā)出的熒光來監(jiān)測解折疊過程。樣品在不斷升高的溫度(從25℃到99℃，保持30秒，增量為0.5℃)下孵育，并記錄熒光發(fā)射。繪制數(shù)據(jù)圖并通過找到斜率的拐點(diǎn)來確定蛋白質(zhì)的熔融點(diǎn)。在這種情況下，在ph5.0和7.0的檸檬酸鹽-磷酸鹽緩沖液以及ph7.4的磷酸鹽緩沖鹽水中測量兩種純化的產(chǎn)物相關(guān)雜質(zhì)。使用兩種不同濃度的tcep-hcl來實現(xiàn)2：1和10：1的還原劑：蛋白摩爾比，將沒有tcep-hcl的樣品用作對照。圖7顯示了兩種主要產(chǎn)物相關(guān)雜質(zhì)的熱穩(wěn)定性測定結(jié)果。氧化還原電位和熱穩(wěn)定性(熔融溫度)顯示相關(guān)性；氧化還原電位越低，蛋白質(zhì)的熔融溫度越低。當(dāng)ph變得更加中性時，可以描述類似的效果。這兩個變量都會使產(chǎn)物相關(guān)雜質(zhì)更易于降解，從而便于其清除。結(jié)論總體而言，數(shù)據(jù)表明在加熱步驟期間維持還原環(huán)境(低氧化還原電位)以使得能夠在蛋白質(zhì)提取期間顯著減少產(chǎn)物相關(guān)雜質(zhì)水平的重要性。此外，數(shù)據(jù)表明，通過應(yīng)用氮?dú)飧采w可以實現(xiàn)這種還原環(huán)境，并且當(dāng)沒有氮?dú)飧采w時，環(huán)境的氧化還原電位是顯著更不具還原性的，這導(dǎo)致更高水平的產(chǎn)物相關(guān)雜質(zhì)。當(dāng)前第1頁12