本發(fā)明涉及獸醫(yī)疫苗、即基于重組火雞皰疹病毒(hvt)作為病毒載體的針對nd和ibd的家禽疫苗的領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及重組dna表達(dá)盒，包含重組dna表達(dá)盒的重組hvt，基于重組hvt或包含重組hvt的宿主細(xì)胞的家禽疫苗。此外，本發(fā)明涉及表達(dá)盒、重組hvt和宿主細(xì)胞用于疫苗的制備和使用的方法和用途。

馬立克氏病(md)是世界范圍內(nèi)發(fā)生的高度傳染性的家禽疾病，并且其特征在于在幾種器官和神經(jīng)中存在t細(xì)胞淋巴瘤。這導(dǎo)致各種癥狀，尤其是麻痹和死亡。新生雛雞可以被來自免疫母體的母體來源的抗體(mda)保護(hù)。md由馬立克氏病病毒(mdv)引起，所述馬立克氏病病毒(mdv)屬于α皰疹病毒亞科和馬立克病毒屬。病毒粒子是有包膜的，并且大小約160nm。在衣殼內(nèi)包含大小為100和200kbp之間的線性雙鏈dna的大基因組。

存在不同血清型的mdv，其各自具有不同的特征。盡管mdv血清型1(mdv1)和mdv2對家禽致病，但mdv3沒有。mdv3更通常被稱為：meleagrid皰疹病毒1，火雞皰疹病毒，但通常為：火雞皰疹病毒(hvt)。hvt在1970年被描述為對雞不致病(apathogenic)的火雞皰疹病毒(witter等人,1970,am.j.vet.res.,vol.31,p.525)。自那時(shí)起hvt毒株例如pb1或fc-126已通常用于針對由mdv1或mdv2引起的md接種雞。并且在需要針對毒力更強(qiáng)的mdv1變體的保護(hù)的情況下，hvt與mdv2疫苗毒株例如sb1組合使用，如在nobilis?marexineca126+sb1(msdanimalhealth)中，或與減毒mdv1疫苗毒株例如rispens組合，例如在nobilis?rismavac+ca126(msdanimalhealth)中。

hvt在鳥類的外周血淋巴細(xì)胞(pbl)中復(fù)制，并且因此是誘導(dǎo)主要針對細(xì)胞免疫系統(tǒng)的長持續(xù)時(shí)間的免疫反應(yīng)的全身性病毒。

hvt疫苗作為冷凍的hvt感染的細(xì)胞市售，并且可以在早期應(yīng)用于雞，因?yàn)樗鼈儗τ卺槍vt的抗體相對不敏感(例如mda中)。因?yàn)樾鲁錾碾r雞從其第一天起面臨mdv的感染壓力，因此hvt疫苗盡可能早地(例如在其從蛋中孵化的當(dāng)天(第一天)，或甚至在孵化前仍在蛋中時(shí))接種到雛雞內(nèi)。該后一種方法，所謂的‘卵內(nèi)接種(inovovaccination)’，是胚胎接種的形式，其通常在胚胎發(fā)育(ed)的第18天(在孵化前約3天)應(yīng)用。

除了用作疫苗本身之外，hvt還被用作用于將各種免疫原性蛋白表達(dá)和遞送給家禽的病毒載體疫苗，參見例如，wo87/04463。通常，表達(dá)的基因編碼對需要針對其接種的家禽致病的微生物的保護(hù)性抗原(的一部分)。多年來，許多異源基因已經(jīng)在hvt載體中表達(dá)，例如來自：新城疫病毒(ndv)(sondermeijer等人,1993,vaccine,vol.11,p.349-358)、傳染性法氏囊病病毒(ibdv)(darteil等人,1995,virology,vol.211,p.481-490)和寄生蟲抗原(cronenberg等人,1999,actavirol.,vol.43,p.192-197)。

hvt載體疫苗向家禽的施用因此生成針對所表達(dá)的異源基因、以及針對hvt(其針對md進(jìn)行保護(hù))的免疫反應(yīng)。這應(yīng)用于多種商業(yè)hvt載體疫苗產(chǎn)品中，例如：ndvf蛋白基因：innovax?-nd(msdanimalhealth)，和vectormune?hvt-ndv(ceva)；或ibdvvp2基因：vaxxitek?hvt+ibd(merial；先前命名為：gallivac?hvt-ibd)、和vectormune?hvt-ibd(ceva)。

或者，hvt載體可用于表達(dá)和遞送治療性蛋白，例如細(xì)胞因子，以操縱雞的免疫反應(yīng)(wo2009/156.367;tarpey等人,2007,vaccine,vol.25,p.8529-8535)。

hvt的基因組核苷酸序列例如可作為：af291866(毒株fc-126)得自genbank?。已描述了用于將異源基因插入hvt內(nèi)的幾種方法，例如通過使用同源重組(sondermeijer等人，同上)、粘粒再生(us5,961,982)或桿粒(細(xì)菌人工染色體)(baigent等人，2006，j.ofgen.virol.，vol.87，p.769-776)。

用于將異源基因構(gòu)建體插入hvt基因組內(nèi)的許多遺傳位置已進(jìn)行研究，并且?guī)讉€(gè)合適的非必需基因座已得到描述，例如在hvt基因組的獨(dú)特短(us)區(qū)(uniqueshortregion)中(ep431.668)；或在hvt獨(dú)特長(ul)區(qū)(uniquelongregion)中(ep794.257)。

不同啟動(dòng)子已用于驅(qū)動(dòng)異源基因在hvt的表達(dá)盒中的表達(dá)，例如：prvgpx啟動(dòng)子(wo87/04.463)，勞斯肉瘤病毒ltr啟動(dòng)子、sv40早期基因啟動(dòng)子，雞β-肌動(dòng)蛋白基因啟動(dòng)子(ep1.298.139)或來自人(hcmvie1)或鼠(mcmvie1)巨細(xì)胞病毒的立即早期1基因啟動(dòng)子，參見：ep728.842。近來，描述了hvt載體疫苗，其表達(dá)來自單一構(gòu)建體的ndv和ibdv的抗原：wo2013/057.235。

對于重組載體的構(gòu)建，待插入載體的基因組內(nèi)的異源核酸通常包含至少一個(gè)異源基因或編碼區(qū)，其編碼抗原(的至少免疫原性部分)。而且，構(gòu)建體可以包含啟動(dòng)子序列以驅(qū)動(dòng)異源基因的表達(dá)和調(diào)節(jié)信號例如增強(qiáng)子或轉(zhuǎn)錄終止子。此組合的插入片段通常稱為‘表達(dá)盒’。

表達(dá)盒插入載體的基因組內(nèi)的作用不同，這取決于其插入的位置和方式：載體基因組的大小可以變得更大、相同或更小，這取決于對基因組的凈結(jié)果是否分別是遺傳材料的添加、替換或缺失。插入位置也可以具有作用：置于基因組的編碼區(qū)、非編碼區(qū)或調(diào)節(jié)區(qū)內(nèi)。其中，這些選擇影響了所得載體疫苗在其復(fù)制和表達(dá)能力及其遺傳穩(wěn)定性方面的特征。

無論構(gòu)建體多么精確，插入的表達(dá)盒必須允許活的重組病毒載體克服對其穩(wěn)定性和功效的許多生物應(yīng)激：首先，在已接受異源插入片段后復(fù)制和生成后代的能力。這指示盡管插入其基因組內(nèi)，但重組載體病毒本身仍是活的。接下來，在體外在宿主細(xì)胞系中復(fù)制多個(gè)循環(huán)，同時(shí)正確地和完全地保持異源插入片段的復(fù)制和表達(dá)的能力。這指示重組體未由于插入而在其復(fù)制方面減弱，并且插入的表達(dá)盒是穩(wěn)定維持且表達(dá)的。第三，體內(nèi)復(fù)制和表達(dá)。這指示重組病毒可以克服活動(dòng)物中例如由其免疫系統(tǒng)造成的強(qiáng)選擇壓力。在這個(gè)環(huán)境中，載體對異源基因的表達(dá)喪失會有利于在動(dòng)物中的更快速復(fù)制；此類‘逃避突變體(escapemutants)’可以具有在外源基因或在其調(diào)節(jié)序列中的獲得性突變或主要缺失，并且該突變體可以使完整病毒載體過度生長。最后且最重要的是，在目標(biāo)中的載體的復(fù)制和異源基因的表達(dá)需要能夠生成有效的針對微生物的免疫反應(yīng)，所述微生物是載體表達(dá)的異源插入片段的供體。

因而，重組載體疫苗必須提供載體及其插入片段在體外和體內(nèi)的良好復(fù)制，和一種或多種異源基因在體內(nèi)的有效表達(dá)，其優(yōu)選為高水平并隨著時(shí)間保持一致，以誘導(dǎo)且維持目標(biāo)中的保護(hù)性免疫反應(yīng)。

這個(gè)特征組合將允許在體外的大量輪次的復(fù)制(這是大規(guī)模生產(chǎn)必需的)以及當(dāng)載體疫苗在接種的目標(biāo)動(dòng)物中復(fù)制時(shí)插入的外源基因的持續(xù)表達(dá)和呈遞給宿主的免疫系統(tǒng)。此外，這在復(fù)制和表達(dá)方面的穩(wěn)定性是載體疫苗符合非常高的安全性和生物穩(wěn)定性標(biāo)準(zhǔn)所需的，在獲得來自政府或監(jiān)管當(dāng)局的上市許可后，待作為商業(yè)產(chǎn)品引入領(lǐng)域內(nèi)的重組病毒必須滿足所述標(biāo)準(zhǔn)。

新城疫(nd)和傳染性法氏囊病(ibd)是重要的家禽疾病，其在全世界發(fā)生且可以引起養(yǎng)禽業(yè)中關(guān)于動(dòng)物福利和經(jīng)濟(jì)運(yùn)行的嚴(yán)重負(fù)面效應(yīng)。這被描述例如于手冊中，如：‘themerckveterinarymanual(2010,第10版,2010,c.m.kahn編,isbn:091191093x)和：‘diseaseofpoultry’(2008,第12版,y.saif編,iowastateuniv.press,isbn-10:0813807182)。

nd由新城疫病毒(ndv)引起，所述新城疫病毒(ndv)屬于單股反鏈病毒目(mononegavirales)，具體為副粘液病毒科(paramyxoviridae)，并且可以根據(jù)其毒力分組成不同致病型：非致病性弱毒型(lentogenic)ndv在家禽中幾乎不引起癥狀。相比之下，中毒型(mesogenic)(中等致病性)和高毒型(velogenic)(高致病性)ndv毒株引起廣泛疾病和死亡率，并且因此是許多國家中的法定傳染病。疾病癥狀包括呼吸和神經(jīng)異常，并且喘息(gasping)和‘斜頸’是最值得注意的體征。

在商業(yè)家禽操作中，針對由致病性ndv毒株引起的感染和/或疾病的保護(hù)通過家禽的常規(guī)接種來實(shí)現(xiàn)，通常在孵化當(dāng)天，使用活的弱毒型ndv毒株，例如nobilis?ndclone30(msdanimalhealth)。

ndv具有非節(jié)段、負(fù)義、單鏈rna基因組，其大小為約15kb，并且含有六種基因，在其中有融合(f)糖蛋白的基因。f蛋白參與ndv附著宿主細(xì)胞和進(jìn)入宿主細(xì)胞內(nèi)，并且作為免疫優(yōu)勢蛋白，其可以是針對ndv的有效免疫反應(yīng)的基礎(chǔ)。ndvf蛋白作為天然f0蛋白表達(dá)，所述f0蛋白在通過細(xì)胞外肽酶切割后被活化。

ibd由傳染性法氏囊病病毒(ibdv)(也被稱作‘禽腎病病毒’，雙核糖核酸病毒科的成員)引起。這些病毒具有由雙鏈rna的兩個(gè)節(jié)段(a和b)組成的基因組。較大節(jié)段a編碼110kda的多蛋白，其隨后通過自體蛋白水解切割，以形成成熟病毒蛋白vp2、vp3和vp4。在這些中，vp2和vp3是病毒粒子的結(jié)構(gòu)衣殼蛋白，并且vp2是主要宿主保護(hù)性免疫原。

在ibdv的情況下，存在兩種血清型，血清型1和2。兩種血清型可以通過病毒中和(vn)測試加以區(qū)分。血清型1病毒已顯示對雞是致病性的，而血清型2ibdv僅在火雞中引起亞急性疾病。

歷史上，ibdv血清型1病毒僅由稱為“經(jīng)典”ibd病毒的一種類型組成。更近來，出現(xiàn)所謂的“變體”ibdv毒株，其可以通過使用單克隆抗體實(shí)驗(yàn)對象組的病毒中和測試或通過rt-pcr來鑒定并區(qū)分；這由wu等人(2007，aviandiseases，vol.51，p.515-526)綜述。眾所周知的經(jīng)典ibdv毒株是：d78、faragher52/70和stc。

ibdv引起鳥類的淋巴組織的急性、高度接觸傳染性病毒感染，具有鳥類的基本免疫器官：法氏囊作為它的主要目標(biāo)。易感群體中的死亡率高，伴隨快速體重減輕和中至高的死亡率。由于法氏囊(部分)的破壞，從該疾病恢復(fù)的鳥類可能具有免疫缺陷。這使得它們易受繼發(fā)感染影響。

針對ibd的常規(guī)接種使用減毒ibdv毒株在家禽壽命中盡可能早地進(jìn)行，但這些僅在針對ibdv的mda水平已足夠降低時(shí)(其通常在孵化后15-20天之間的某處)才可以適用。許多‘活的’或滅活的ibdv疫苗是市售的，例如‘活’疫苗例如nobilis?gumborod78(msdanimalhealth)。

為了實(shí)現(xiàn)成本效益，常見方法是設(shè)計(jì)包含抗原組合的獸醫(yī)疫苗。以這種方式，單個(gè)接種輪次可以使動(dòng)物針對許多疾病一次性免疫。這不僅節(jié)省時(shí)間和勞力成本，它還減少對接種動(dòng)物的不適和應(yīng)激，所述不適和應(yīng)激否則將由于必須接受反復(fù)接種而發(fā)生。這甚至更適用于需要通過單次注射來施用的疫苗，例如基于重組hvt作為病毒載體的疫苗，因此在這種情況下的組合疫苗也是非常需要的，并且一次性地防止幾種不同的疾病的能力-除了來自hvv載體本身的mdv保護(hù)外-將有很大的益處。然而，在過去，僅僅兩種單獨(dú)的hvt載體與單個(gè)異源基因插入片段的組合證明是不成功的：復(fù)制載體之間的干擾引起一個(gè)或另一個(gè)在接種的目標(biāo)中變得被抑制。因此，研究已集中于來自單一重組hvt載體的多于一種異源抗原的組合表達(dá)和遞送。

幾篇出版物描述了包含多基因插入片段的hvt載體構(gòu)建體，例如于：wo93/025.665和wo96/005.291，其描述二價(jià)和三價(jià)‘疫苗’。類似地：ep719.864和ep1.026.246。然而，僅提出了所描述的多基因構(gòu)建體的大部分，并且僅實(shí)際上構(gòu)建和分離了具有多個(gè)插入片段的一些重組載體。非常少曾經(jīng)在雞中測試過。總體上沒有給出關(guān)于它們在復(fù)制后的穩(wěn)定性或外來基因的表達(dá)水平的結(jié)果，更不用說關(guān)于在目標(biāo)動(dòng)物中誘導(dǎo)有效免疫保護(hù)的任何數(shù)據(jù)。

事實(shí)上，從關(guān)于多基因hvt作為載體的疫苗的許多現(xiàn)有技術(shù)出版物中，已經(jīng)被徹底測試并被證明是針對多于兩種禽類病原體的有效載體疫苗的唯一構(gòu)建體是如wo2013/057.235中所述的包含ndvf基因和ibdvvp2基因的hvt構(gòu)建體以及如wo2013/057.236中所述的hvt作為載體的ilt-nd疫苗。

遺憾的是，在產(chǎn)品開發(fā)期間的長時(shí)間測試后，如wo2013/057.235中所述的命名為hvp309的主要構(gòu)建體之一沒有展現(xiàn)異源插入片段的足夠遺傳穩(wěn)定性和持續(xù)表達(dá)。該hvp309重組hvt載體包含表達(dá)盒，其具有由人巨細(xì)胞病毒立即早期1基因核心啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的ndvf基因，隨后下游為由雞β-肌動(dòng)蛋白基因核心啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的ibdvvp2基因。

hvp309載體構(gòu)建體的不穩(wěn)定性在其體外和體內(nèi)復(fù)制后變得明顯，因?yàn)?％至3％的hvp309病毒展現(xiàn)它們不再表達(dá)異源基因的一者或兩者。這從疫苗效力觀點(diǎn)來看是不合需要的，并且它是獲得政府當(dāng)局的營銷授權(quán)的障礙。因此，目前仍然沒有具有一致和可靠的遺傳穩(wěn)定性的針對nd和ibd兩者的安全且有效的hvt載體疫苗。

本發(fā)明的一個(gè)目的在于適應(yīng)領(lǐng)域中的該需要，并且首次提供重組hvt載體疫苗，其允許針對nd和ibd的家禽的有效免疫，并且具有一致和可靠的遺傳穩(wěn)定性。

最初，本發(fā)明人失望地得知，hvp309構(gòu)建體具有這種固有的遺傳不穩(wěn)定性，導(dǎo)致其異源基因插入片段的表達(dá)的喪失。沒有現(xiàn)有技術(shù)關(guān)于克服這種不穩(wěn)定性(同時(shí)保持疫苗效力和病毒復(fù)制水平)的方式的指導(dǎo)，他們必須完全重新設(shè)計(jì)載體疫苗。

這根本不是直截了當(dāng)?shù)?，并且需要做出不明顯的選項(xiàng)和選擇。這從制備和測試的許多重組hvt構(gòu)建體顯而易見，但沒有顯示期望的有利特征的組合。盡管偶爾，但新構(gòu)建體之一在特定方面例如病毒血癥或插入基因之一的表達(dá)水平方面更好；然而，這然后被發(fā)現(xiàn)缺乏其他性質(zhì)，或者沒有足夠的遺傳穩(wěn)定性。下面描述實(shí)例。

因此，發(fā)明人令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，一種特異性重組hvt疫苗表現(xiàn)出良好的病毒載體復(fù)制、持續(xù)的ndvf-和ibdvvp2基因表達(dá)以及針對nd和ibd的有效免疫保護(hù)，并且與現(xiàn)有技術(shù)構(gòu)建體相比，也具有改善的遺傳穩(wěn)定性。事實(shí)上，穩(wěn)定性現(xiàn)在使得不會再發(fā)現(xiàn)不表達(dá)的病毒蝕斑，甚至在細(xì)胞培養(yǎng)中15次連續(xù)傳代之后和在鳥類中一次傳代之后。此外，相對于先前的載體構(gòu)建體，針對nd和ibdv的疫苗效力水平略微(nd)或甚至顯著(ibdv)改善。

鑒于此載體疫苗可用于家禽生產(chǎn)行業(yè)中的潛在大規(guī)模，這些影響和改善是重要的，并且代表具有很大的商業(yè)意義的令人驚訝的技術(shù)效果。因此，以這種方式，可以滿足本發(fā)明的目的，因此可以克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)。

目前不知道為什么新的重組hvt作為載體的nd-ibd疫苗具有改善的效力和改善的穩(wěn)定性特征。

盡管本發(fā)明人不想受可能解釋這些觀察的任何理論或模型的束縛，但他們推測，所用元件的選擇和它們在該hvt病毒中包含的表達(dá)盒中的特定布局以一種方式或其他方式允許新的重組hvt載體更好地容納異源基因的表達(dá)，同時(shí)在體外或體內(nèi)復(fù)制。這可以使得新載體在遺傳上穩(wěn)定和免疫上有效。

因此，在第一方面，本發(fā)明涉及重組dna表達(dá)盒，其以5'至3'方向且按該順序包含：

a.鼠巨細(xì)胞病毒立即早期1基因(mcmv-ie1)啟動(dòng)子，

b.傳染性法氏囊病病毒(ibdv)病毒蛋白2(vp2)基因，

c.轉(zhuǎn)錄終止子，

d.人巨細(xì)胞病毒立即早期1基因(hcmv-ie1)啟動(dòng)子，

e.新城疫病毒(ndv)融合(f)蛋白基因。

根據(jù)本發(fā)明的重組dna表達(dá)盒可用于生成重組hvt載體病毒疫苗，其當(dāng)在體外和體內(nèi)傳代時(shí)有效地預(yù)防或減少ibdv和ndv的感染或相關(guān)疾病體征，并且具有一致和可靠的遺傳穩(wěn)定性。

“重組體”是其遺傳材料已相對于其起始或天然條件進(jìn)行修飾以導(dǎo)致它最初不具有的遺傳構(gòu)成的核酸分子或微生物。

用于本發(fā)明的“表達(dá)盒”包含如本文所述和定義的基因和調(diào)控元件。任選地，表達(dá)盒還可以含有可以幫助其生成和操作的其他dna元件，例如用于限制性酶識別或pcr引物的位點(diǎn)，以實(shí)現(xiàn)分子克隆。盡管表達(dá)盒可以以dna或rna形式存在，但由于其在hvt載體中的預(yù)期用途，因此表達(dá)盒用作dna。

如技術(shù)人員顯而易見，表達(dá)盒是自我包含的表達(dá)模塊，因此其在載體病毒基因組中的取向通常不是關(guān)鍵的。這意味著該盒作為整體可以例如以兩個(gè)取向中任一者整合在hvt基因組的us區(qū)域中：朝向tr讀取或朝向irs讀取。圖1在這方面僅展現(xiàn)這兩種可能取向之一。然而，如果期望特定取向，表達(dá)盒可以與來自載體基因組的側(cè)接區(qū)段(其可以引導(dǎo)其以期望取向整合在載體基因組的特定位點(diǎn))一起使用。

根據(jù)本發(fā)明的重組dna表達(dá)盒和本文所述的其他遺傳元件的生成、構(gòu)建和組裝可以通過眾所周知的分子生物學(xué)技術(shù)(涉及克隆、轉(zhuǎn)染、重組、選擇和擴(kuò)增)進(jìn)行。這些和其他技術(shù)非常詳細(xì)地解釋于標(biāo)準(zhǔn)教科書，如sambrook&russell:“molecularcloning:alaboratorymanual”(2001,coldspringharbourlaboratorypress;isbn:0879695773);ausubel等人,:currentprotocolsinmolecularbiology(j.wileyandsonsinc,ny,2003,isbn:047150338x);c.dieffenbach&g.dveksler:“pcrprimers:alaboratorymanual”(cshlpress,isbn0879696540);和j.bartlett和d.stirling的“pcrprotocols”(humanapress,isbn:0896036421)。

如本文使用的術(shù)語“包含(comprising)”(以及變化諸如“包含(comprise)”、“包含(comprises)”、和“包含(comprised)”)意在指由在其中使用該術(shù)語的正文部分、段落、權(quán)利要求等覆蓋或包括于其中的，對于本發(fā)明可設(shè)想的所有要素和以任何可能組合的所有要素，即使此類要素或組合并未明確敘述；并且不指排除任何的此類一種或多種要素或組合。

因此，任何此類正文部分、段落、權(quán)利要求等因此還可以涉及其中術(shù)語“包含(comprising)”(或其變體)替換為術(shù)語例如“由……組成(consistof)”、“由……組成(consistingof)”、或“基本上由……組成(consistessentiallyof)”的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案。

術(shù)語“以5'至3'方向上，也被稱為：“以下游方向”，是本領(lǐng)域眾所周知的。

其連同術(shù)語“按該順序”一起用于指示其后概括的元件需要關(guān)于彼此以便宿主細(xì)胞的基因表達(dá)機(jī)制有功能而具有的相對方向，包含根據(jù)本發(fā)明的表達(dá)盒的重組hvt將在所述宿主細(xì)胞中復(fù)制且表達(dá)。如技術(shù)人員將認(rèn)識到，該方向涉及來自hvt的雙鏈dna基因組的為‘編碼鏈’的dna鏈，并且其涉及在‘+’或‘有義’方向上編碼的mrna分子。

雖然如此，并且對上文部分無偏差：在hvtdsdna基因組的互補(bǔ)鏈(‘模板’鏈)上，所列元件的相對順序是相同的，但在該dna鏈上，這些元件的方向是3'至5'。

術(shù)語“基因”用于指示能夠編碼蛋白的dna區(qū)段。用于本發(fā)明的基因優(yōu)選編碼完整的蛋白。然而，基因還可以編碼蛋白的區(qū)段，例如僅編碼成熟形式的蛋白，即不含‘前導(dǎo)區(qū)’、‘錨’或‘信號序列’。在該方面，如本文所用的基因?qū)?yīng)于開放閱讀框或orf?；蛏踔量梢跃幋a蛋白的特定區(qū)段，例如包含免疫保護(hù)性表位的區(qū)段。

在該方面，本發(fā)明的“蛋白”是氨基酸的分子鏈。蛋白可以是天然或成熟蛋白、前蛋白(preprotein)或蛋白原(proprotein)、或蛋白的功能片段。尤其地：肽、寡肽和多肽包括在蛋白的定義內(nèi)。

本發(fā)明的“啟動(dòng)子”眾所周知是在生物的基因組上的功能區(qū)，其指導(dǎo)下游編碼區(qū)的轉(zhuǎn)錄。啟動(dòng)子因此位于基因的上游。

啟動(dòng)子引導(dǎo)的mrna合成從‘轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)’(tss)開始。產(chǎn)生的mrna依次從基因的起始密碼子開始翻譯成蛋白，所述起始密碼子是開放閱讀框中的第一個(gè)atg序列(mrna中的第一個(gè)aug)。通常，tss位于起始密碼子上游30-40個(gè)核苷酸處。tss可以通過例如經(jīng)由race技術(shù)測序基因mrna的5'端進(jìn)行測定。

一般而言，啟動(dòng)子包含在起始密碼子的a位置上游約1000個(gè)核苷酸內(nèi)，所述a位置一般指示為a+1，并且大多數(shù)啟動(dòng)子位于核苷酸-500和a+1之間。

啟動(dòng)子的命名法通?；谒刂破浔磉_(dá)的基因。例如，術(shù)語‘mcmv-ie1基因啟動(dòng)子’指在自然界中驅(qū)動(dòng)來自mcmv的ie1基因表達(dá)，并且因此位于該基因緊密上游的啟動(dòng)子。因?yàn)閕e1-基因是如此充分記錄且可明確識別的基因，并且因?yàn)閹追Nmcmv的基因組已(整體或部分)進(jìn)行測序，所以此類啟動(dòng)子可以容易地通過常規(guī)技術(shù)進(jìn)行鑒定。例如，在基本方案中，啟動(dòng)子可以簡單地通過大致亞克隆在兩個(gè)連續(xù)基因之間的區(qū)域獲得，所述區(qū)域例如從上游基因的polya信號到下游基因的tss。啟動(dòng)子隨后可以通過標(biāo)準(zhǔn)測試進(jìn)行鑒定，例如通過懷疑的啟動(dòng)子的進(jìn)行性更小區(qū)段表達(dá)標(biāo)記基因。

通常，啟動(dòng)子含有一些可識別的調(diào)節(jié)區(qū)，例如增強(qiáng)子區(qū)，其參與結(jié)合影響轉(zhuǎn)錄的時(shí)間、持續(xù)時(shí)間、條件和水平的調(diào)節(jié)因子。盡管增強(qiáng)子區(qū)通常位于上游，但啟動(dòng)子還含有更下游的區(qū)域，其參與結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子并引導(dǎo)rna聚合酶本身。該下游區(qū)通常含有許多保守的啟動(dòng)子序列元件，例如tata盒、caat盒和gc盒。

包含增強(qiáng)子區(qū)域和下游區(qū)域的啟動(dòng)子被稱為“完全”啟動(dòng)子；僅包含下游區(qū)域的啟動(dòng)子被稱為“核心”啟動(dòng)子。

用于在(病毒)載體中表達(dá)(異源)基因的啟動(dòng)子需要能夠有效地驅(qū)動(dòng)該下游編碼區(qū)的轉(zhuǎn)錄。這通常被稱為啟動(dòng)子與基因“可操作地連接”，使得該基因在啟動(dòng)子的“控制”下，或“由啟動(dòng)子”驅(qū)動(dòng)。這通常意味著在表達(dá)盒中，啟動(dòng)子和基因有效鄰近地連接在相同dna上，并且在它們之間沒有會干擾有效轉(zhuǎn)錄的信號或序列。

因此，在根據(jù)本發(fā)明的重組dna表達(dá)盒中，本發(fā)明的mcmv-ie1基因啟動(dòng)子和hcmv-ie1基因啟動(dòng)子與其下游基因(分別為ibdvvp2基因和ndvf基因)“可操作連接”。

“轉(zhuǎn)錄終止子”是參與將編碼區(qū)轉(zhuǎn)錄為rna的終止的調(diào)節(jié)性dna元件。通常此元件編碼具有可以引起rna聚合酶復(fù)合物終止轉(zhuǎn)錄的二級結(jié)構(gòu)(例如發(fā)夾)的區(qū)段。因此，轉(zhuǎn)錄終止子總是位于來自待翻譯的區(qū)域的終止密碼子的下游，3'非翻譯區(qū)。終止子還可以包含聚腺苷酸化信號或polya信號。這誘導(dǎo)對于大多數(shù)真核細(xì)胞mrna發(fā)生且與mrna分子的轉(zhuǎn)運(yùn)和穩(wěn)定有關(guān)的聚腺苷酸化。

對于本發(fā)明，在兩個(gè)異源基因之間使用轉(zhuǎn)錄終止子提供它們的表達(dá)的有效分離，防止rna轉(zhuǎn)錄的可能的通讀(read-through)。

對于本發(fā)明，如果基因不存在于用于生成重組hvt載體的親本hvt中，則基因與攜帶其的重組hvt載體“異源”。

mcmv-ie1-或hcmv-ie1基因啟動(dòng)子是本領(lǐng)域眾所周知的，并且可以容易地獲得自多種商業(yè)來源，例如得自用于克隆和表達(dá)的商業(yè)質(zhì)粒的供應(yīng)商。ie1基因也被稱作‘主要ie基因’。

mcmv-ie1蛋白也稱為pp89。在1985年描述了mcmvie1基因啟動(dòng)子(k.d?rsch-h?sler,等人,1985,pnas,vol.82,p.8325)。該啟動(dòng)子在異源表達(dá)中的用途描述于wo87/03.905和ep728.842中。完整mcmvie基因座的核苷酸序列可以acc.nr.l06816.1得自genbank(2004年3月起)。mcmv本身可最初以acc.nr.vr-194得自atcc，并且更近來，這已經(jīng)以acc.nr.vr-1399繼續(xù)。

hcmv-ie1基因啟動(dòng)子在其完整版本大小約1.5kb，并且由增強(qiáng)子、核心啟動(dòng)子和內(nèi)含子組成，由此啟動(dòng)子活性進(jìn)行到內(nèi)含子區(qū)內(nèi)，參見koedood等人(1995,j.ofvirol.,vol.69,p.2194-2207)。

通過使用常規(guī)分子生物學(xué)工具和方法亞克隆ie1基因之前的基因組區(qū)域，可以從hcmv病毒的基因組(可廣泛獲得)獲得hcmv-ie1基因啟動(dòng)子。或者，啟動(dòng)子可以源自例如表達(dá)型質(zhì)粒，例如由cox等人(2002,scand.j.immunol.,vol.55,p.14-23)描述的pi17，或哺乳動(dòng)物表達(dá)載體例如pcmv(clontech)或pcmv-mcs系列(stratagene;genbank?acc.nr.af369966)。

從hcmv-ie1基因啟動(dòng)子，許多高度相似的版本，是已知的，例如，來自genbank。此類同系物和變體在本發(fā)明的范圍內(nèi)。

本發(fā)明的“ndvf蛋白基因”是眾所周知的，并且序列信息在現(xiàn)有技術(shù)中廣泛可用。f蛋白基因可以獲得自各種常用的質(zhì)粒構(gòu)建體?；蛘?，其可以使用用于操縱rna病毒的常規(guī)技術(shù)從分離自自然界的ndv獲得?？梢允褂醚鍖W(xué)或分子生物學(xué)容易地鑒定ndv。

對于本發(fā)明，ndvf蛋白基因的同系物以及變體例如來自弱毒型、中毒型或強(qiáng)毒型ndv的變體同樣適用，因?yàn)閒蛋白基因序列本身在這些不同的ndv病原體中是高度保守的。

在根據(jù)本發(fā)明的表達(dá)盒的一個(gè)實(shí)施方案中，mcmv-ie1基因啟動(dòng)子是mcmv-ie1基因的完整啟動(dòng)子，其包含核心啟動(dòng)子區(qū)以及增強(qiáng)子區(qū)。完整的mcmv-ie1基因啟動(dòng)子大小為約1.4kb。

如技術(shù)人員清楚地知道的，可以出現(xiàn)mcmv-ie1基因啟動(dòng)子以及其他元件的長度中的一些變化，所述其他元件構(gòu)成根據(jù)本發(fā)明的重組dna表達(dá)盒。這可以由用于克隆和構(gòu)建的確切條件中的差異所產(chǎn)生；例如由使用不同限制性酶位點(diǎn)、pcr克隆引物、或用于適應(yīng)使用的克隆分子端的不同條件所產(chǎn)生。因此，可發(fā)生組成元件的長度的一些變化(更小或更大)，而不影響整個(gè)表達(dá)盒的穩(wěn)定性和效力。在該情況下，這些長度差異是不重要的，并且在本發(fā)明的范圍內(nèi)。

因此，關(guān)于本發(fā)明的mcmv-ie1基因啟動(dòng)子，“約1.4kb”是：1.4kb±約25％，優(yōu)選±約20、15、12、10、8、6、5、4、3、2或甚至±約1％，按該優(yōu)先順序。

類似地，可以使用同樣有效和穩(wěn)定的啟動(dòng)子元件的同系物或變體。

因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的mcmv-ie1基因啟動(dòng)子是約1.4kb的dna分子，其包含與seqidno:1的核苷酸630-2020的區(qū)域的全長具有至少95％核苷酸序列同一性的核苷酸序列。更優(yōu)選的是至少96、97、98或甚至99％的核苷酸序列同一性，按該優(yōu)先順序。

在一個(gè)實(shí)施方案中，mcmv-ie1基因啟動(dòng)子是seqidno:1的核苷酸630-2020的區(qū)域。

在根據(jù)本發(fā)明的表達(dá)盒的一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的ibdvvp2基因編碼來自為經(jīng)典型的ibdv的vp2蛋白。此類基因是眾所周知的，并且它們的序列信息是現(xiàn)有技術(shù)中可容易獲得的，參見例如genbankacc.nr：d00869(f52/70)、d00499(stc)或af499929(d78)?；蛘?，這種基因可以使用用于操作雙rna病毒的常規(guī)技術(shù)得自從自然界中分離的經(jīng)典ibdv的基因組。經(jīng)典型ibdv可以使用血清學(xué)或分子生物學(xué)容易地鑒定。

因?yàn)閕bdvvp2基因的同系物或變體可以具有相等的效力和穩(wěn)定性，因此在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的ibdvvp2蛋白基因與seqidno:1的核苷酸2052-3410的區(qū)域的全長具有至少90％核苷酸序列同一性。優(yōu)選地，至少92、94、95、96、97、98或甚至99％的核苷酸序列同一性，按該優(yōu)先順序。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的ibdvvp2蛋白基因源自經(jīng)典ibdv毒株faragher52/70。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的ibdvvp2蛋白基因是seqidno:1的核苷酸2052-3410的區(qū)域。

對于根據(jù)本發(fā)明的表達(dá)盒，特定類型的轉(zhuǎn)錄終止子的選擇不是關(guān)鍵的，只要提供rna轉(zhuǎn)錄的有效終止。

在根據(jù)本發(fā)明的表達(dá)盒的實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)錄終止子包含終止區(qū)和polya區(qū)。

在一個(gè)實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)錄終止子源自猿猴病毒40(sv40)，優(yōu)選源自sv40晚期基因。該終止子及其在異源表達(dá)中的用途已多年應(yīng)用于分子病毒學(xué)，并由clontech以他們的‘pcmv?’克隆質(zhì)粒商業(yè)化，其自1980年代末以來可商購。

在一個(gè)實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)錄終止子源自sv40晚期基因，且大小為約0.2kb。

因?yàn)榇_切大小不是關(guān)鍵的，因此，關(guān)于本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄終止子，“約0.2kb”是：0.2kb±約25％，優(yōu)選±約20、15、12、10、8、6、5、4、3、2或甚至±約1％，按該優(yōu)先順序。

在一個(gè)實(shí)施方案中，源自sv40晚期基因且大小為約0.2kb的轉(zhuǎn)錄終止子包含與seqidno:1的核苷酸3441-3650的區(qū)域的全長具有至少95％核苷酸序列同一性的核苷酸序列。更優(yōu)選的是至少96、97、98或甚至99％的核苷酸序列同一性，按該優(yōu)先順序。

在一個(gè)實(shí)施方案中，來自sv40晚期基因的轉(zhuǎn)錄終止子是seqidno:1的核苷酸3441-3650的區(qū)域。

在根據(jù)本發(fā)明的表達(dá)盒的一個(gè)實(shí)施方案中，hcmv-ie1基因啟動(dòng)子是核心啟動(dòng)子。此核心啟動(dòng)子通常將大小小于1kb；優(yōu)選大小約0.4kb。

如所述，確切大小不是關(guān)鍵的，因此，關(guān)于本發(fā)明的hcmv-ie1基因核心啟動(dòng)子，“約0.4kb”是：0.4kb±約25％，優(yōu)選±約20、15、12、10、8、6、5、4、3、2或甚至±約1％，按該優(yōu)先順序。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的hcmv-ie1基因啟動(dòng)子是約0.4kb的dna分子，其包含與seqidno:1的核苷酸3789-4149的區(qū)域的全長具有至少95％核苷酸序列同一性的核苷酸序列。更優(yōu)選的是至少96、97、98或甚至99％的核苷酸序列同一性，按該優(yōu)先順序。

在一個(gè)實(shí)施方案中，hcmv-ie1基因核心啟動(dòng)子是seqidno:1的核苷酸3789-4149的區(qū)域。

在根據(jù)本發(fā)明的表達(dá)盒的一個(gè)實(shí)施方案中，ndvf蛋白基因來自弱毒型的ndv。

優(yōu)選地，來自弱毒ndv毒株的ndvf蛋白基因來自ndv毒株克隆30。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的ndvf蛋白基因與seqidno:1的核苷酸4174-5835的區(qū)域的全長具有至少90％核苷酸序列同一性。優(yōu)選地，至少92、94、95、96、97、98或甚至99％的核苷酸序列同一性，按該優(yōu)先順序。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的ndvf蛋白啟動(dòng)子是seqidno:1的核苷酸4174-5835的區(qū)域。

在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的表達(dá)盒包含位于ndvf蛋白基因下游的額外轉(zhuǎn)錄終止子。

位于ndvf蛋白基因下游的額外轉(zhuǎn)錄終止子可以在ibdvvp2蛋白基因和hcmv-ie1啟動(dòng)子之間與根據(jù)本發(fā)明的表達(dá)盒中的轉(zhuǎn)錄終止子相比相同或不同，只要提供適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄終止，并且穩(wěn)定性和表達(dá)不受影響。

在一個(gè)實(shí)施方案中，額外轉(zhuǎn)錄終止子源自hcmv-ie1基因。優(yōu)選地，額外轉(zhuǎn)錄終止子大小為約0.3kb。

因?yàn)榇_切大小不是關(guān)鍵的，因此，關(guān)于源自hcmv-ie1基因的額外轉(zhuǎn)錄終止子，“約0.3kb”是：0.3kb±約25％，優(yōu)選±約20、15、12、10、8、6、5、4、3、2或甚至±約1％，按該優(yōu)先順序。

在一個(gè)實(shí)施方案中，源自hcmv-ie1基因且大小為約0.3kb的額外轉(zhuǎn)錄終止子包含與seqidno:1的核苷酸5847-6127的區(qū)域的全長具有至少95％核苷酸序列同一性的核苷酸序列。更優(yōu)選的是至少96、97、98或甚至99％的核苷酸序列同一性，按該優(yōu)先順序。

在一個(gè)實(shí)施方案中，源自hcmv-ie1基因的額外轉(zhuǎn)錄終止子是seqidno:1的核苷酸5847-6127的區(qū)域。

在根據(jù)本發(fā)明的重組dna表達(dá)盒的一個(gè)實(shí)施方案中，選自以下的條件中的一種或多種或全部適用：

-mcmv-ie1基因啟動(dòng)子是完整的啟動(dòng)子，

-ibdvvp2基因編碼來自經(jīng)典型ibdv的vp2蛋白，

-轉(zhuǎn)錄終止子包含終止區(qū)和polya區(qū)兩者，

-轉(zhuǎn)錄終止子源自猿猴病毒40(sv40)，

-hcmv-ie1基因啟動(dòng)子是核心啟動(dòng)子，

-ndvf基因來自弱毒ndv毒株，

-表達(dá)盒包含位于ndvf基因下游的額外轉(zhuǎn)錄終止子，且

-額外轉(zhuǎn)錄終止子源自hcmv-ie1基因。

在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的重組dna表達(dá)盒包含來自hvt的基因的5'和/或3'側(cè)接區(qū)。這些側(cè)接區(qū)允許同源重組以引導(dǎo)插入至載體的基因組上的靶基因插入基因座，且呈期望的取向。

在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的重組dna表達(dá)盒在兩側(cè)側(cè)接hvtus2基因的區(qū)段。

一個(gè)實(shí)例是如seqidno:1所示的dna序列。

表1：seqidno:1的元件：

在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的重組dna表達(dá)盒大小為約5.5kb。因?yàn)?如所述-確切大小不是關(guān)鍵的，因此，關(guān)于根據(jù)本發(fā)明的重組dna表達(dá)盒，其大小為約5.5kb，意指5.5kb±約25％，優(yōu)選±約20、15、12、10、8、6、5、4、3、2或甚至±約1％，按該優(yōu)先順序。

如所述，根據(jù)本發(fā)明的重組dna表達(dá)盒的元件的同系物或變體可以同樣安全、穩(wěn)定和有效。

因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的重組dna表達(dá)盒是約5.5kb的dna分子，其包含與seqidno:1的核苷酸630-6127的區(qū)域的全長具有至少95％核苷酸序列同一性的核苷酸序列。更優(yōu)選的是至少96、97、98或甚至99％的核苷酸序列同一性，按該優(yōu)先順序。

在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的重組dna表達(dá)盒是seqidno:1的核苷酸630-6127的區(qū)域。

為了便于方便構(gòu)建、操作和使用根據(jù)本發(fā)明的重組dna表達(dá)盒，其本身可以包含在dna分子中。

因此，在一個(gè)進(jìn)一步方面，本發(fā)明涉及包含根據(jù)本發(fā)明的重組dna表達(dá)盒的重組dna分子。

在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的重組dna分子由包含根據(jù)本發(fā)明的重組dna表達(dá)盒的克隆質(zhì)粒組成。普通克隆質(zhì)粒的實(shí)例是例如來自pbr322或puc系列的質(zhì)粒。這些是廣泛商業(yè)可得的。

在作為根據(jù)本發(fā)明的重組dna分子的質(zhì)粒的一個(gè)實(shí)施方案中，該質(zhì)粒可以含有允許大插入片段的穩(wěn)定維持，并且在細(xì)菌中擴(kuò)增至少量后控制質(zhì)粒的拷貝數(shù)的調(diào)控序列。此類用于大插入片段的克隆質(zhì)粒通常被稱為：粘粒或桿粒。

當(dāng)根據(jù)本發(fā)明的重組dna分子用于轉(zhuǎn)染方案時(shí)，其通常被稱為“轉(zhuǎn)移載體”、“穿梭載體”或“供體質(zhì)?！薄Ｔ谠撉闆r下，根據(jù)本發(fā)明的重組dna分子包含根據(jù)本發(fā)明的重組dna表達(dá)盒，并且該盒可以在兩側(cè)側(cè)接源自載體的基因組的序列以引導(dǎo)插入。

通常，用于轉(zhuǎn)染的轉(zhuǎn)移載體本身并不整合至載體的基因組中，其僅促進(jìn)其攜帶的表達(dá)盒的整合。

在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的重組dna分子包含seqidno:1的核苷酸630-6127的區(qū)域。

在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的重組dna分子包含如seqidno:1所示的dna分子。

根據(jù)本發(fā)明的重組dna表達(dá)盒優(yōu)選用于生成重組hvt載體病毒疫苗。

因此，在一個(gè)進(jìn)一步方面，本發(fā)明涉及包含根據(jù)本發(fā)明的重組dna表達(dá)盒的重組火雞皰疹病毒(hvt)，由此將表達(dá)盒插入重組hvt的基因組的us區(qū)域。

術(shù)語“火雞皰疹病毒”(hvt)是指病毒微生物，其展現(xiàn)其分類組-成員的表征特征例如形態(tài)學(xué)、基因組學(xué)和生物化學(xué)特征以及該組的生物學(xué)特征例如其生理、免疫學(xué)或病理行為。這還包括以任何方式細(xì)分，例如細(xì)分為亞種、毒株、分離株、基因型、變體、亞型、病理型或亞類等的hvt。

技術(shù)人員顯而易見的是，本文描述的微生物(例如本發(fā)明的hvt、mdv、ndv或ibdv)的當(dāng)前分類學(xué)分類法可隨時(shí)間而改變，因?yàn)樾碌囊娊鈱?dǎo)致重新分類為新的或不同的分類組。然而，由于這不改變微生物本身或其生物學(xué)行為，但僅其科學(xué)名稱或分類，此類重新分類的微生物仍然在本發(fā)明的范圍內(nèi)。

對于本發(fā)明，“包含重組dna表達(dá)盒”涉及將根據(jù)本發(fā)明的重組dna表達(dá)盒插入hvt的基因組中。這種插入原則上可以通過任何可用技術(shù)進(jìn)行，并且相對于hvt載體的基因組可以導(dǎo)致插入、取代或缺失，只要所得重組hvt能夠展現(xiàn)其安全、穩(wěn)定和有效多價(jià)抗原表達(dá)的有利效果。在本文下面描述細(xì)節(jié)和實(shí)例。

根據(jù)本發(fā)明的重組hvt在單個(gè)遺傳基因座中且在其基因組的區(qū)域(被稱為獨(dú)特短(uniqueshort)區(qū)域，或us)中包含根據(jù)本發(fā)明的重組dna表達(dá)盒。hvt的us區(qū)域是眾所周知的且易于識別；其位于hvt基因組中的兩個(gè)眾所周知的重復(fù)元件(irs和trs)之間。

hvtus區(qū)域的幾個(gè)插入基因座是已知的，并且原則上這些都適用于本發(fā)明，條件是插入的表達(dá)盒和所得重組hvt能夠展現(xiàn)其穩(wěn)定和有效的特性。

在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的重組hvt包含插入重組hvt的基因組的us2或us10基因中的根據(jù)本發(fā)明的重組dna表達(dá)盒。

可以通過采用hvt基因組的us2基因作為本發(fā)明的單個(gè)遺傳插入基因座來制備用于本發(fā)明的特別穩(wěn)定和有效的重組hvt載體。

因此，在根據(jù)本發(fā)明的重組hvt的一個(gè)實(shí)施方案中，將根據(jù)本發(fā)明的重組dna表達(dá)盒插入重組hvt的基因組的us2基因中。

對于本發(fā)明，術(shù)語“在us2基因中”或“在us10基因中”意在指示在分別包含us2或us10基因的hvt基因組的區(qū)域中已進(jìn)行插入；這可以指基因的啟動(dòng)子或其編碼區(qū)。此外，相對于hvt基因組的插入的凈效應(yīng)(nettoeffect)可以是如所述的插入、取代或缺失。此插入的預(yù)期后果是us2或us10基因的正常編碼功能被干擾，或者在所得重組hvt中甚至完全消除。

在一個(gè)實(shí)施方案中，重組dna表達(dá)盒在hvtus區(qū)域中的插入是插入；即除了作為克隆過程的結(jié)果可能缺失或被替換的幾個(gè)核苷酸之外，不存在us基因組區(qū)域中的實(shí)質(zhì)缺失。因此，隨著大小的凈增加，以該方式，所得重組hvt具有大于其親本的基因組的基因組大小。

在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的重組hvt包含約5.5kb的dna分子，其包含與seqidno:1的核苷酸630-6127的區(qū)域的全長具有至少95％核苷酸序列同一性的核苷酸序列。更優(yōu)選的是至少96、97、98或甚至99％的核苷酸序列同一性，按該優(yōu)先順序。

在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的重組hvt包含seqidno:1的核苷酸630-6127的區(qū)域。

在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的重組hvt包含如seqidno:1所示的核苷酸序列。

為了使根據(jù)本發(fā)明的重組hvt安全用于疫苗使用，重組hvt可以基于這樣的親本hvt，其為復(fù)制良好的已建立的hvt疫苗毒株，并且已知適合于接種幼鳥或胚胎，例如hvt疫苗毒株pb1或fc-126。這些通?？捎茫簛碜詀tcc：vr#584-c的fc-126，并且pb1是市售的，例如來自msdanimalhealth。根據(jù)本發(fā)明的重組dna表達(dá)盒的并入不增加親本hvt的毒力或致病性(相反地)，并且預(yù)期不會回復(fù)至毒力，因?yàn)閔vt是天然無致病性的。

因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，用于生成根據(jù)本發(fā)明的重組hvt的親本hvt是hvt疫苗毒株；優(yōu)選地pb1或fc-126毒株的hvt疫苗毒株。

根據(jù)本發(fā)明的重組hvt是活重組載體微生物或“載體”病毒，其可有利地用于家禽的接種。其組合作為針對nd和ibd的安全且有效的疫苗的特征，此外還是遺傳穩(wěn)定的。

對于本發(fā)明是“遺傳穩(wěn)定的”意味著根據(jù)本發(fā)明的重組hvt的遺傳構(gòu)成在隨后的病毒復(fù)制輪次中不改變，或者至少不會在可檢測的程度上改變。在替代方案中，不穩(wěn)定的構(gòu)建體可導(dǎo)致插入的異源基因中的一者或兩者的表達(dá)的喪失。這種穩(wěn)定性可以用常規(guī)技術(shù)方便地監(jiān)測，例如通過使根據(jù)本發(fā)明的重組hvt在細(xì)胞培養(yǎng)物中隨后傳代，隨后在動(dòng)物中傳代。在這些步驟期間重新分離的病毒可以鋪板在細(xì)胞培養(yǎng)皿中，用瓊脂覆蓋，并且孵育，直到hvt特異性蝕斑變得可見；都使用常規(guī)技術(shù)。接下來，可以在免疫熒光測定(ifa)方案中使用合適的抗體制備物以及足夠的陽性和陰性對照來針對f或vp2蛋白的表達(dá)染色蝕斑。可以記錄不顯示熒光的蝕斑的數(shù)量，由此應(yīng)當(dāng)監(jiān)測特定樣品的至少100個(gè)個(gè)體蝕斑。

根據(jù)本發(fā)明的重組hvt的遺傳穩(wěn)定性的嚴(yán)格測試是應(yīng)用15個(gè)連續(xù)的組織培養(yǎng)傳代，隨后接種至目標(biāo)動(dòng)物中，重新分離和攻擊-感染。下面描述詳情。

令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，如上所述的嚴(yán)格穩(wěn)定性測試中的根據(jù)本發(fā)明的重組hvt在所有測試的蝕斑中保持ndvf和ibdvvp2蛋白基因兩者的存在和表達(dá)，并且持續(xù)15次細(xì)胞-培養(yǎng)傳代，以及持續(xù)一次動(dòng)物傳代。在實(shí)施例中描述詳情。

與用現(xiàn)有技術(shù)hvt重組體發(fā)現(xiàn)的結(jié)果相比以及與在本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)過程中制備和測試的其他重組體相比，這是強(qiáng)大且高度顯著的改進(jìn)。

根據(jù)本發(fā)明的重組hvt可以通過常見技術(shù)擴(kuò)增，主要通過在原代雞細(xì)胞、通常雞胚成纖維細(xì)胞(cef)的體外培養(yǎng)中擴(kuò)增。這些可以通過雞胚的胰蛋白酶消化進(jìn)行制備，其都是本領(lǐng)域眾所周知的。將cef鋪為單層并且用hvt感染。該方法可以將規(guī)模擴(kuò)大到工業(yè)規(guī)模的生產(chǎn)。

通常，通過收獲含有其細(xì)胞相關(guān)形式的重組hvt的感染的宿主細(xì)胞來收集重組hvt。將這些細(xì)胞吸收于適當(dāng)?shù)妮d體組合物中以在冷凍和儲存期間提供穩(wěn)定作用。接下來，受感染細(xì)胞通常被裝填到玻璃安瓿內(nèi)，將所述玻璃安瓿密封、冷凍且儲存于液氮中。

盡管優(yōu)選hvt的細(xì)胞相關(guān)的冷凍儲存，但在液氮的使用不可行的情況下，替代方案是使用冷凍干燥：這采用hvt的有利特征，其可以通過細(xì)胞-破碎(例如通過弗氏壓碎器或超聲波儀)使用整個(gè)培養(yǎng)物從其宿主分離。這可以通過離心來澄清，然后將其吸收至穩(wěn)定劑中，并冷凍干燥用于延長儲存。

因此，在一個(gè)進(jìn)一步方面，本發(fā)明涉及包含根據(jù)本發(fā)明的重組hvt的宿主細(xì)胞。

用于本發(fā)明的“宿主細(xì)胞”是易被hvt感染和復(fù)制的細(xì)胞。此類細(xì)胞的實(shí)例是禽類細(xì)胞，特別是淋巴細(xì)胞或成纖維細(xì)胞。

在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的宿主細(xì)胞是原代禽類細(xì)胞；即直接源自動(dòng)物或動(dòng)物器官、而非源自細(xì)胞系的細(xì)胞。通常，原代細(xì)胞只能進(jìn)行小量且有限數(shù)量的細(xì)胞分裂，而來自細(xì)胞系的細(xì)胞是有效地永生的，并且-在正確的條件下-可以繼續(xù)分裂。

在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的原代禽類宿主細(xì)胞是原代雞胚成纖維細(xì)胞(cef)。

在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的宿主細(xì)胞是永生化的禽類細(xì)胞。已經(jīng)描述了幾種永生化的禽類細(xì)胞，例如在wo97/044.443和wo98/006.824中。

在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的永生化禽類宿主細(xì)胞是永生化cef；優(yōu)選如ep14196345中所述的永生化cef。

通過克隆和轉(zhuǎn)染的不同方法，可以使用根據(jù)本發(fā)明的重組dna表達(dá)盒來獲得根據(jù)本發(fā)明的重組hvt，其包含穩(wěn)定整合在重組hvt的基因組的us區(qū)中的表達(dá)盒。

因此，本發(fā)明的一個(gè)進(jìn)一步方面涉及用于構(gòu)建根據(jù)本發(fā)明的重組hvt的方法，所述方法包括將根據(jù)本發(fā)明的重組dna表達(dá)盒插入重組hvt的基因組的us區(qū)域。

根據(jù)本發(fā)明的重組dna表達(dá)盒插入hvt基因組以生成根據(jù)本發(fā)明的重組hvt，可以以本領(lǐng)域都已知的不同方式進(jìn)行。一種方便的方式是使用轉(zhuǎn)移載體；在一個(gè)實(shí)施方案中，這可以是根據(jù)本發(fā)明的重組dna分子。

根據(jù)本發(fā)明的重組dna表達(dá)盒直接插入hvt基因組內(nèi)是生成根據(jù)本發(fā)明的重組hvt的優(yōu)選方法。然而，存在其中可以生成此類重組hvt的其他眾所周知的方法。例如通過間接插入，由此表達(dá)盒的一部分在單次或多次轉(zhuǎn)染中插入hvt中。這些部分可以以這樣的方式設(shè)計(jì)，使得在所有部分都整合后，全部插入片段形成完整表達(dá)盒，例如通過采用重疊區(qū)以控制部分的順序和取向。一種替代方案是使用桿粒，如ep996.738中所述。

用于生成根據(jù)本發(fā)明的重組hvt的優(yōu)選插入技術(shù)是通過使用粘粒再生，例如，如wo93/25.665中所述。該技術(shù)基本上采用hvt基因組的一組大的重疊亞基因組片段，以通過共轉(zhuǎn)染至宿主細(xì)胞中來重構(gòu)完整的hvt基因組。由于制備一種粘粒以包含根據(jù)本發(fā)明的重組dna表達(dá)盒，這變得穩(wěn)定地整合至重組hvt的基因組中。

如所述，根據(jù)本發(fā)明的重組hvt的優(yōu)選用途是在用于家禽疫苗中。

因此，在進(jìn)一步方面，本發(fā)明涉及用于家禽疫苗，其包含根據(jù)本發(fā)明的重組hvt和/或根據(jù)本發(fā)明的宿主細(xì)胞、和藥學(xué)上可接受的載體。

“疫苗”眾所周知是在藥學(xué)上可接受的載體中包含免疫活性化合物的組合物?！懊庖呋钚曰衔铩被颉翱乖笔怯山臃N目標(biāo)的免疫系統(tǒng)識別且誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的分子。反應(yīng)可以源于先天性或獲得性免疫系統(tǒng)，并且可以是細(xì)胞和/或體液類型。

根據(jù)本發(fā)明的疫苗提供針對nd和ibd的雞的安全和早期保護(hù)。這種效果通過預(yù)防或減少在其各自目標(biāo)器官中通過ndv或ibdv的野外感染的生產(chǎn)性感染的建立或增殖而獲得。這例如通過降低病毒載量或縮短病毒復(fù)制的持續(xù)時(shí)間來實(shí)現(xiàn)。進(jìn)而，這導(dǎo)致目標(biāo)動(dòng)物中由病毒感染引起的疾病的數(shù)量、強(qiáng)度或病變和相關(guān)臨床體征的嚴(yán)重程度的減少。此疫苗被通俗地稱為‘針對’ndv或ibdv的疫苗。

除了針對nd和ibd的疫苗效力之外，因?yàn)閔vt本身的接種能力，根據(jù)本發(fā)明的疫苗對于md也是有效的。這通過將根據(jù)本發(fā)明的重組dna表達(dá)盒插入us區(qū)中而減少。然而，根據(jù)mdv野外病毒在特定區(qū)域中的毒力，可能必需添加如所述的其他md疫苗組分，以便作為針對mdv的疫苗是完全有效的。

根據(jù)本發(fā)明的疫苗的有效性的確定完全在常規(guī)操作者的技術(shù)之內(nèi)，并且可以如下進(jìn)行：例如通過監(jiān)測接種后的免疫反應(yīng)或通過測試攻擊感染后的臨床癥狀的出現(xiàn)或死亡率，例如通過監(jiān)測目標(biāo)的疾病的體征、臨床評分、血清學(xué)參數(shù)，或通過攻擊病原體的重新分離，且將這些結(jié)果與模擬接種的動(dòng)物中看到的接種-攻擊反應(yīng)進(jìn)行比較。為了評估針對nd的疫苗效力，攻擊存活是一種方便的測量；對于ibd，可以方便地使用粘液囊中的疾病的臨床體征。

下面將概述根據(jù)本發(fā)明的疫苗的各個(gè)實(shí)施方案、優(yōu)選項(xiàng)和實(shí)例。

用于本發(fā)明的術(shù)語“家禽”涉及與獸醫(yī)實(shí)踐相關(guān)且對用hvt接種敏感的鳥類物種；優(yōu)選的家禽物種是：雞、火雞和鵪鶉。雞是最優(yōu)選物種。

對于本發(fā)明，家禽可以是任何類型、品種或種類，例如：下蛋雞、育種雞、肉雞、組合品種或任何此類品種的親本品系。優(yōu)選的類型是：肉雞、育種雞和下蛋雞。最優(yōu)選的是肉雞，對于這種類型的鳥類，針對nd和ibd的早期保護(hù)導(dǎo)致存活率、生長速率和飼料轉(zhuǎn)化率的改善。

“藥學(xué)上可接受的載體”意在幫助疫苗的穩(wěn)定和施用，同時(shí)無害且被目標(biāo)良好耐受。此類載體可以例如是無菌水或無菌生理鹽溶液。在更復(fù)雜的形式中，載體可以例如是緩沖液，其可以包含進(jìn)一步的添加劑，例如穩(wěn)定劑或防腐劑。細(xì)節(jié)和實(shí)例例如在眾所周知的手冊中描述，例如：“remington：thescienceandpracticeofpharmacy”(2000，lippincott，usa，isbn：683306472)，和：“veterinaryvaccinology”(p.pastoret等人編輯，1997，elsevier，amsterdam，isbn0444819681)。

對于本發(fā)明，當(dāng)疫苗是細(xì)胞相關(guān)的hvt時(shí)，則藥學(xué)上可接受的載體優(yōu)選是培養(yǎng)基與約10%血清和約6%dmso的混合物。血清可以是常規(guī)用于細(xì)胞培養(yǎng)的任何血清，例如胎牛血清或新生小牛血清。

根據(jù)本發(fā)明的疫苗通過如本文描述的方法從根據(jù)本發(fā)明的重組hvt制備，所述方法可容易地由本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)用。例如，根據(jù)本發(fā)明的重組hvt通過經(jīng)由轉(zhuǎn)染和重組而插入根據(jù)本發(fā)明的重組表達(dá)盒進(jìn)行構(gòu)建。接下來，選擇期望的重組hvt，并且在工業(yè)上以更小或更大的體積進(jìn)行擴(kuò)增，優(yōu)選在體外細(xì)胞培養(yǎng)物中，例如在cef中擴(kuò)增。從此類培養(yǎng)物收獲包含病毒的懸浮液，作為完全感染的細(xì)胞或作為通過細(xì)胞-破碎獲得的無細(xì)胞制備物。將這種懸浮液配制成疫苗且將最終產(chǎn)品包裝。然后將細(xì)胞相關(guān)的疫苗儲存在液氮中，并且將冷凍干燥的疫苗儲存在-20℃或+4℃。在對質(zhì)量、數(shù)量和無菌度的廣泛測試后，將疫苗產(chǎn)品投放出售。

適用于疫苗制備的一般技術(shù)和考慮是本領(lǐng)域眾所周知的，并且例如在政府法規(guī)(藥典)和手冊例如“veterinaryvaccinology”和“remington”(兩者同上)中描述。

在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的疫苗是細(xì)胞相關(guān)的疫苗。

“細(xì)胞相關(guān)的”意味著包含根據(jù)本發(fā)明的宿主細(xì)胞，其被根據(jù)本發(fā)明的重組hvt感染。因此，這種類型的疫苗包含均根據(jù)本發(fā)明的宿主細(xì)胞以及重組hvt。

在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的疫苗是無細(xì)胞的病毒疫苗。

“無細(xì)胞的”意味著包含根據(jù)本發(fā)明的重組hvt，并且基本上不含根據(jù)本發(fā)明的宿主細(xì)胞。然而，無細(xì)胞的疫苗可以含有(非常)少量的宿主細(xì)胞-碎片，其從細(xì)胞-破碎過程中殘留。無細(xì)胞的疫苗優(yōu)選為冷凍干燥的形式。用于冷凍干燥的程序是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，且用于以不同規(guī)模冷凍干燥的設(shè)備是可商購的。

因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的無細(xì)胞的病毒疫苗是冷凍干燥形式。

為了重構(gòu)冷凍干燥的疫苗，將其懸浮于生理上可接受的稀釋劑中。這通常在臨施用前進(jìn)行，以驗(yàn)證疫苗的最佳質(zhì)量。稀釋劑可以例如是無菌水或生理鹽溶液。待用于重構(gòu)疫苗的稀釋劑本身可以含有額外化合物，例如佐劑。

在冷凍干燥的根據(jù)本發(fā)明的無細(xì)胞的疫苗的一個(gè)進(jìn)一步實(shí)施方案中，用于疫苗的稀釋劑與包含活性疫苗組合物的冷凍干燥餅分開供應(yīng)。在該情況下，冷凍干燥的疫苗和稀釋劑組合物形成一起實(shí)施根據(jù)本發(fā)明的疫苗的部件試劑盒。

因此，在冷凍干燥的根據(jù)本發(fā)明的無細(xì)胞的疫苗的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，疫苗是具有至少兩種類型的容器的部件試劑盒，一種容器包含冷凍干燥的疫苗，一種容器包含水性稀釋劑。

根據(jù)本發(fā)明的疫苗的目標(biāo)動(dòng)物原則上可以是健康的或患病的，并且對于存在ndv或ibdv的存在或針對ndv或ibdv的抗體可以是陽性或陰性的。此外，目標(biāo)可以具有其易于接種的任何體重、性別或年齡。然而，接種健康、未被感染的目標(biāo)且盡可能早地接種以防止任何野外感染及其后果顯然是有利的。

因此，根據(jù)本發(fā)明的疫苗可以用作預(yù)防性或治療性治療或兩者，因?yàn)槠渚蓴_ndv或ibdv的感染的建立和進(jìn)展。

在該方面，通過根據(jù)本發(fā)明的疫苗降低病毒載量的進(jìn)一步有利的效果是預(yù)防或減少脫落，從而預(yù)防或減少病毒垂直地?cái)U(kuò)散至后代，并且水平地在群或群體內(nèi)和在地理區(qū)域內(nèi)擴(kuò)散。因此，使用根據(jù)本發(fā)明的疫苗導(dǎo)致ndv或ibdv的流行率降低。

因此，本發(fā)明的另外的方面是：

-根據(jù)本發(fā)明的疫苗用于減少群體或地理區(qū)域內(nèi)ndv或ibdv的流行率的用途，和

-根據(jù)本發(fā)明的疫苗，其用于減少群體或地理區(qū)域內(nèi)ndv或ibdv的流行率。

根據(jù)本發(fā)明的疫苗原則上可以通過不同應(yīng)用途徑和在其壽命的不同點(diǎn)時(shí)給予目標(biāo)家禽，只要接種的重組hvt可以建立保護(hù)性感染。

然而，因?yàn)橛蒼dv或ibdv的感染可以已在超幼齡時(shí)建立，所以盡可能早地應(yīng)用根據(jù)本發(fā)明的疫苗是有利的。因此，根據(jù)本發(fā)明的疫苗可以在孵化當(dāng)天時(shí)(“第1天”)或在卵內(nèi)例如在ed18天時(shí)應(yīng)用。

因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，卵內(nèi)施用根據(jù)本發(fā)明的疫苗。

在工業(yè)規(guī)模上用于將疫苗自動(dòng)注射到蛋內(nèi)的設(shè)備是商購可得的。這提供了最早的可能保護(hù)，同時(shí)使勞力成本降到最低。不同的卵內(nèi)接種途徑是已知的，例如向卵黃囊中、向胚胎中或向尿囊液腔中；這些可以根據(jù)需要進(jìn)行優(yōu)化。優(yōu)選地，進(jìn)行卵內(nèi)接種，使得針實(shí)際上接觸胚胎。

在一個(gè)實(shí)施方案中，通過胃腸外途徑施用根據(jù)本發(fā)明的疫苗。優(yōu)選地通過肌肉內(nèi)或皮下途徑。

根據(jù)本發(fā)明的疫苗可以適于施用于家禽目標(biāo)且與期望的應(yīng)用途徑和期望效果匹配的形式制備。

優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的疫苗被配制為適合于注射(卵內(nèi)或腸胃外注射)的可注射液體；例如作為：懸浮液、溶液、分散體或乳液。通常此類疫苗被制備為無菌。

依賴根據(jù)本發(fā)明的疫苗的應(yīng)用途徑，可能需要改變疫苗組合物。這完全在技術(shù)人員的能力內(nèi)，并且一般涉及疫苗功效或安全性的細(xì)調(diào)。這可以通過下述來完成：改變疫苗劑量、數(shù)量、頻率、途徑，通過使用以另一種形式或制劑的疫苗，或通過改變疫苗的其他組成成分(例如穩(wěn)定劑或佐劑)。

例如，為了適合于在卵內(nèi)應(yīng)用，疫苗組合物需要是非常安全的，以便不降低蛋的孵化率。然而，即使這樣，仍可以出現(xiàn)孵化率中的一些降低，例如由通過接種自身或感染等對胚胎的機(jī)械損害導(dǎo)致。

根據(jù)本發(fā)明的疫苗的每動(dòng)物劑量的根據(jù)本發(fā)明的重組hvt的確切量不是像它對于滅活型疫苗那樣關(guān)鍵的；這因?yàn)橹亟Mhvt可以復(fù)制，并且從而在目標(biāo)動(dòng)物中繁殖直到生物學(xué)上可以忍受的病毒血癥水平。原則上，疫苗劑量僅需要足以起始此類產(chǎn)毒性感染。更高的接種物劑量并不縮短其在宿主中達(dá)到最佳病毒血癥感染花費(fèi)的時(shí)間。因此，非常高的劑量是無效的，并且另外由于經(jīng)濟(jì)原因也不具有吸引力。

優(yōu)選的接種物劑量因此是每動(dòng)物劑量1x10^1至1x10^5蝕斑形成單位(pfu)的根據(jù)本發(fā)明的重組hvt，更優(yōu)選1x10^2至1x10^4pfu/劑量，甚至更優(yōu)選500至5000pfu/劑量；最優(yōu)選約1000至約3000pfu/劑量。

當(dāng)根據(jù)本發(fā)明的疫苗是細(xì)胞相關(guān)的時(shí)，這些量的重組hvt包含在受感染的宿主細(xì)胞中。

計(jì)數(shù)根據(jù)本發(fā)明的重組hvt的病毒顆粒的方法是眾所周知的。

根據(jù)本發(fā)明的重組hvt的每個(gè)動(dòng)物劑量的體積可以根據(jù)預(yù)期的施用途徑進(jìn)行優(yōu)化：卵內(nèi)接種通常以約0.01至約0.5ml/卵的劑量施用，并且腸胃外注射通常以約0.1至約1ml/鳥的劑量進(jìn)行。

何者為根據(jù)本發(fā)明的疫苗的免疫有效量的確定或每劑量的疫苗的體積的優(yōu)化兩者完全在技術(shù)人員的能力之內(nèi)。

用于將根據(jù)本發(fā)明的疫苗應(yīng)用于目標(biāo)生物的給藥方案可以在單個(gè)或多個(gè)劑量中，以與疫苗制劑相容的方式，以及以此類將是免疫學(xué)有效的量。

優(yōu)選地，將施用根據(jù)本發(fā)明的疫苗的方案整合至目標(biāo)家禽可需要的其他疫苗的現(xiàn)有接種時(shí)間表中，以減少對動(dòng)物的應(yīng)激并降低勞動(dòng)力成本。這些其他疫苗可以以與其注冊用途相容的方式以同時(shí)、并發(fā)或依次方式施用。

不言而喻的是將其他化合物例如穩(wěn)定劑、載體、佐劑、稀釋劑、乳化劑等與根據(jù)本發(fā)明的疫苗混合也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。此類添加劑描述于眾所周知的手冊例如：“remington”和“veterinaryvaccinology”(兩者同上)。

通過這種方式，可以進(jìn)一步優(yōu)化根據(jù)本發(fā)明的疫苗以超幼齡的單次接種來針對nd、ibd和md保護(hù)家禽的效力。

根據(jù)本發(fā)明的疫苗有效地是對于ndv和ibdv的‘標(biāo)記疫苗’，因?yàn)樗傻拿庖邇H針對來自這些病毒的一種蛋白。這允許“區(qū)分受感染和接種的動(dòng)物”，所謂的diva法。這可以方便地通過血清學(xué)測定例如elisa或免疫熒光測定進(jìn)行檢測。

根據(jù)本發(fā)明的疫苗已經(jīng)提供了多種免疫：通過異源插入片段的表達(dá)來針對ndv和ibdv提供免疫，并且另外通過hvt載體本身也針對mdv提供免疫。盡管如此，通過額外的免疫活性組分來進(jìn)行進(jìn)一步組合可能是有利的。這可以用于增強(qiáng)已經(jīng)提供的免疫保護(hù)，或擴(kuò)展至其他病原體。

因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的疫苗包含至少一種額外的免疫活性組分。

此類“額外的免疫活性組分”可以是抗原、免疫增強(qiáng)物質(zhì)、細(xì)胞因子、疫苗或其任何組合。這提供了在成本、效率和動(dòng)物福利方面的優(yōu)點(diǎn)。或者，根據(jù)本發(fā)明的疫苗自身可以加入疫苗中。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述至少一種額外的免疫活性組分是免疫刺激化合物；優(yōu)選細(xì)胞因子或免疫刺激性寡脫氧核苷酸。

免疫刺激性寡脫氧核苷酸優(yōu)選為免疫刺激性的含非甲基化cpg的寡脫氧核苷酸(ino)。優(yōu)選的ino是禽類toll樣受體(tlr)21激動(dòng)劑，例如wo2012/089.800(x4家族)、wo2012/160.183(x43家族)或wo2012/160.184(x23家族)中所述。

在一個(gè)實(shí)施方案中，至少一種額外的免疫活性組分是來源于對家禽致病性的微生物的抗原。這可以以任何合適的方式，例如作為“活”減毒、滅活或亞單位抗原‘衍生’自對家禽致病的該微生物。

源自對家禽致病的微生物的額外抗原優(yōu)選源自一種或多種選自以下組的微生物：

-病毒：傳染性支氣管炎病毒、ndv、腺病毒、減蛋綜合征病毒、ibdv、雞貧血病毒、禽腦脊髓炎病毒、禽痘病毒、火雞鼻氣管炎病毒、鴨瘟病毒(鴨病毒性腸炎)、鴿痘病毒、mdv、禽白血病病毒、iltv、禽肺病毒和呼腸孤病毒；

-細(xì)菌；大腸桿菌、沙門氏菌屬(salmonella)、鼻氣管鳥桿菌(ornitobacteriumrhinotracheale)、副雞嗜血桿菌(haemophilusparagallinarum)、多殺巴斯德桿菌(pasteurellamultocida)、紅斑丹毒絲菌(erysipelothrixrhusiopathiae)、丹毒種(erysipelas)、支原體屬(mycoplasma)和梭菌屬(clostridium)；

-寄生蟲：艾美蟲屬(eimeria)；和

-真菌：曲霉屬(aspergillus)。

額外抗原可以是其他hvt-載體疫苗。

所有這些組合都是可能的，條件是根據(jù)本發(fā)明的疫苗的效力、安全性和穩(wěn)定性不受負(fù)面影響。

在根據(jù)本發(fā)明的疫苗的一個(gè)實(shí)施方案中，源自對家禽致病的微生物的額外抗原是‘活’減毒mdv、ndv或ibdv疫苗毒株。這用于改進(jìn)且擴(kuò)展根據(jù)本發(fā)明的疫苗的免疫原性，并且這在其中mdv、ndv或ibdv的超強(qiáng)毒野生株流行的那些情況下或地理區(qū)域中是有利的。

在這點(diǎn)上，hvt與mdv1、mdv2或hvt的組合是已知的；對于本發(fā)明，mdv毒株rispens(mdv1)、毒株sb1(mdv2)或毒株fc-126或pb1(hvt)優(yōu)選作為額外的免疫活性組分。

為了改進(jìn)針對ndv的反應(yīng)，根據(jù)本發(fā)明的重組hvt可以與ndv疫苗毒株例如溫和的活ndv疫苗毒株c2組合。

類似地，為了改進(jìn)針對ibdv的反應(yīng)，根據(jù)本發(fā)明的重組hvt可以與溫和的活ibdv疫苗毒株例如d78、pbg98、cu-1、st-12或89-03組合。

如技術(shù)人員將理解的，這些‘組合’還包括其中根據(jù)本發(fā)明的重組hvt和額外的免疫活性組分不同時(shí)、但并發(fā)或依次應(yīng)用的接種時(shí)間表；例如重組hvt可以在卵內(nèi)應(yīng)用，ndvc2可以在第一天應(yīng)用，且ibdv89-03毒株可以在第17天應(yīng)用。

因此，在根據(jù)本發(fā)明包含至少一種額外的免疫活性組分的疫苗的一個(gè)實(shí)施方案中，所述至少一種額外的免疫活性組分是選自下述疫苗毒株的微生物：mdv、ndv和ibdv，或其任何組合。

更優(yōu)選地，額外的免疫活性組分選自：mdvrispens、mdvsb1、ndvc2、ibdvd78和ibdv89-03。

此類組合疫苗可以以多種方式進(jìn)行制備：通過組合病毒或宿主細(xì)胞的制備物，或這些的混合物；全部都在本發(fā)明的范圍內(nèi)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，此類組合疫苗的組分方便地分開產(chǎn)生，并且隨后通過裝填到相同的疫苗容器內(nèi)而組合。

通過上文描述和下文例示的方法，可以制備根據(jù)本發(fā)明的疫苗。

因此，本發(fā)明的進(jìn)一步方面涉及用于制備根據(jù)本發(fā)明的疫苗的方法，所述方法包括下述步驟：

-用根據(jù)本發(fā)明的重組hvt感染宿主細(xì)胞，

-收獲受感染的宿主細(xì)胞，和

-將收獲的受感染的宿主細(xì)胞與藥學(xué)上可接受的載體混合。

用于本發(fā)明的合適宿主細(xì)胞和藥學(xué)上可接受的載體已在上文得到描述。另外，用于感染、培養(yǎng)和收獲的合適方法是本領(lǐng)域眾所周知的，并且在本文中描述且例示。

如上文詳細(xì)概述，根據(jù)本發(fā)明的重組hvt可以有利地應(yīng)用于家禽疫苗中，提供針對md、nd和ibd或相關(guān)疾病體征的安全、穩(wěn)定和有效的接種，并且可以在超幼齡時(shí)施用于家禽。

因此，本發(fā)明的進(jìn)一步方面涉及用于家禽疫苗中的根據(jù)本發(fā)明的重組hvt。

根據(jù)本發(fā)明的重組hvt的‘用于疫苗中’的不同方面和實(shí)施方案已在上文進(jìn)行概述，并且包含作為無細(xì)胞病毒或作為細(xì)胞相關(guān)的病毒用于用以接種家禽的不同疫苗組合物中。

因而，本發(fā)明的不同方面和實(shí)施方案可以有利地用于產(chǎn)生安全、穩(wěn)定和有效的家禽疫苗。

因此，在進(jìn)一步方面，本發(fā)明涉及所有根據(jù)本發(fā)明的表達(dá)盒、重組dna分子、重組hvt或宿主細(xì)胞或其任何組合用于制造家禽疫苗的用途。

如上所述，且如下文所例舉，根據(jù)本發(fā)明的疫苗可以有利地用于通過在超幼齡的單次接種來預(yù)防或減少ibdv和/或ndv的感染或相關(guān)的疾病體征。

因此，本發(fā)明的另外的方面是：

-根據(jù)本發(fā)明的疫苗用于預(yù)防或減少ibdv和/或ndv的感染或相關(guān)疾病體征的用途。

-用于預(yù)防或減少ibdv和/或ndv的感染或相關(guān)疾病體征的方法，所述方法包括向家禽施用根據(jù)本發(fā)明的疫苗。

-接種家禽的方法，其包括用根據(jù)本發(fā)明的疫苗接種所述家禽的步驟。

關(guān)于根據(jù)本發(fā)明的疫苗通過接種家禽的用途的細(xì)節(jié)已在上文描述；具體地，通過一日齡雛雞的肌肉內(nèi)接種或皮下接種，以及18日齡胚胎的卵內(nèi)接種。

本發(fā)明現(xiàn)在將參考下述非限制性實(shí)施例進(jìn)行進(jìn)一步描述。

實(shí)施例

1.測試的不同的表達(dá)盒插入

為了尋找表達(dá)ndvf和ibdvvp2兩者的穩(wěn)定且有效的重組hvt，本發(fā)明人使用不同的元件和取向構(gòu)建了一系列具有插入us2的不同表達(dá)盒的重組hvt構(gòu)建體。在圖2中，給出(未按比例繪制)測試的代表性數(shù)量的類似構(gòu)建體的相關(guān)元件的圖形表示。為了比較，還表示現(xiàn)有技術(shù)構(gòu)建體hvp309。

測試的變異為蛋白基因的順序、所用的不同啟動(dòng)子和所用的插入基因的類型。

更詳細(xì)地：將ibdvvp2基因連接至以下啟動(dòng)子：

-mcmvie1基因啟動(dòng)子(包括增強(qiáng)子區(qū)和核心區(qū))，

-來自勞斯肉瘤病毒(schmidt-ruppind毒株)的3'端末端的長末端重復(fù)(ltr)啟動(dòng)子，和

-來自疫苗毒株bartha(genbankacc.nr:bk001744)的偽狂犬病病毒的gb基因啟動(dòng)子

此外，使用hvt密碼子表以天然和密碼子優(yōu)化的版本測試vp2基因。

此外，在許多構(gòu)建體中，異源基因彼此順序相反。

構(gòu)建、轉(zhuǎn)染和擴(kuò)增所有這些不同的重組hvt。接下來，通過測試在cef細(xì)胞上體外表達(dá)和通過接種至實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中來測試體內(nèi)表達(dá)和病毒血癥來選擇它們。

2.不同的重組hvt構(gòu)建體的病毒血癥和血清學(xué)

在動(dòng)物試驗(yàn)中，測試了由各種重組體hvt構(gòu)建體誘導(dǎo)的病毒血癥和血清學(xué)反應(yīng)?；旧先鐆o2013/057.235中所述進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。簡而言之:將一日齡spf層雞肌肉內(nèi)接種，并在負(fù)壓下保持在隔離器中。在接種后10、24和38天，從脾臟(10和38天)或血液樣品(24天；外周血淋巴細(xì)胞：pbl)中重新分離hvt病毒，以測試病毒血癥。在接種后37天采集的血液樣品中測定血清反應(yīng)。結(jié)果呈現(xiàn)于表2和圖3和4中。

表2：在1日齡肌肉內(nèi)接種的spf層中測試的不同重組hvt構(gòu)建體的病毒血癥和血清學(xué)反應(yīng)。

vp2*=ibdvvp2基因-針對hvt優(yōu)化的密碼子

(1)病毒血癥以pfu/5x10^6個(gè)脾細(xì)胞表示。

所有hvt重組體都在接種的雞中復(fù)制。與其他重組體相比，hvp364及其反映的構(gòu)建體hvp367的病毒血癥水平更低。在10天和24天，來自病毒血癥的兩種病毒的蝕斑的一部分在if-測定中未顯示vp2和/或f的表達(dá)。因此，在38天未測定病毒血癥水平，并且從進(jìn)一步研究排除hvp364和hvp367。

所有其他重組體在測試的所有時(shí)間點(diǎn)都顯示所有蝕斑中vp2和f的表達(dá)。

測定在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中接種后誘導(dǎo)的血清學(xué)反應(yīng)：對于ndvf，elisa值不具有區(qū)分性，因此使用針對ndv(克隆30)的血凝反應(yīng)(hi)作為選擇工具；對于ibdv，使用針對d78的中和(vn)；圖4。

盡管hvp364和hvp367顯示非表達(dá)性蝕斑，但測量抗體誘導(dǎo)。重組hvthvp362給出優(yōu)異的病毒血癥，但針對ibdvvp2沒有血清反應(yīng)。類似地，hvp361和hvp366確實(shí)給出針對ndv的血清轉(zhuǎn)化，但針對ibdv非常小或完全沒有。因此，也從進(jìn)一步研究排除這三種重組體。

令人驚訝地，只有hvp360構(gòu)建體給出良好的病毒血癥和血清學(xué)水平，并且因此選擇該重組hvt用于進(jìn)一步研究。

3.重組hvt：hvp360的表征

3.1.引言

hvp360是根據(jù)本發(fā)明的重組hvt，并且表達(dá)ibdvvp2基因和ndvf基因兩者。使用基于hvtfc-126的粘粒組將其表達(dá)盒插入hvt基因組上的us2基因座。

在hvp360中，ibdv的vp2基因分離自經(jīng)典型f52/70毒株，并且由來自mcmv毒株atccvr-194的ie1基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)。f基因源自ndv疫苗毒株克隆30，并且由來自hcmv毒株ad169的ie1基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)。hvp360還含有如本文所定義的sv40終止信號和hcmvie1基因終止子。圖1顯示hvp360中表達(dá)盒(其中所有元件均按比例繪制)和hvtus2基因的側(cè)接序列的示意圖。在該實(shí)施例中，描述了hvp360的構(gòu)建和表征。

3.2材料和方法

3.2.1.hvp重組體的構(gòu)建：

對于hvp360的構(gòu)建，重組dna表達(dá)盒至hvtus2基因座中的插入用來自hvt疫苗毒株fc-126的一組重疊的粘粒衍生的dna片段進(jìn)行，所述dna片段在轉(zhuǎn)染至cef中后，再生感染性病毒，如wo2013/057.235中所述。此外，使用基于pbr322的質(zhì)粒作為轉(zhuǎn)移載體。在可能的情況下使用獨(dú)特的限制性酶消化位點(diǎn)；當(dāng)不可用時(shí)，這些通過包含此獨(dú)特位點(diǎn)的合成接頭序列的pcr引導(dǎo)的插入來引入。

通過用適當(dāng)?shù)南拗菩悦赶瘉韽恼沉］d體和轉(zhuǎn)移質(zhì)粒切下病毒dna片段。然后借助磷酸鈣沉淀將線性dna片段轉(zhuǎn)染入cef細(xì)胞中。在dna已進(jìn)入細(xì)胞后，通過dna片段的重疊序列之間的同源重組來再生感染性hvt病毒，從而生成包含us2中的表達(dá)盒的完整hvtfc-126基因組。該病毒構(gòu)建體被稱為hvp360。

將轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)物的后代在新鮮cef上擴(kuò)增一次，并通過使用針對抗原vp2和f的單克隆抗血清的免疫熒光測定(ifa)檢查表達(dá)vp2和f的hvt的存在。通過單蝕斑純化分離重組病毒：當(dāng)hvtcpe清晰可見時(shí)，在培養(yǎng)基中用瓊脂糖覆蓋受感染cef的單層。隨機(jī)挑選幾個(gè)蝕斑，并且在cef上傳代兩次，然后作為細(xì)胞相關(guān)病毒制備物進(jìn)行收獲和儲存。

將兩個(gè)hvp360平行蝕斑分離株(a1和b1)在連續(xù)的cef細(xì)胞培養(yǎng)物中各自傳代15次，并通過ifa在不同傳代水平篩選vp2和f的表達(dá)。

3.2.2.dna分析

對于hvp360構(gòu)建體的詳細(xì)表征，對轉(zhuǎn)移載體的質(zhì)粒dna和用來自兩個(gè)平行分離株的fc-126或hvp360第5代感染的cef培養(yǎng)物的總dna進(jìn)行幾種dna分析。進(jìn)行插入盒的編碼核苷酸序列和hvtus2側(cè)接區(qū)的序列分析和southern印跡分析，以證實(shí)正確整合至us2中，以及傳代后的遺傳穩(wěn)定性。還對hvp360的全基因組進(jìn)行southern印跡分析，以證實(shí)來自用于重構(gòu)病毒的粘粒組的hvtdna片段的重疊區(qū)域處的正確重組。

hvtdna分離自用hvp360或?qū)φ沼H本hvpfc-126感染的cef細(xì)胞培養(yǎng)物，其也已從如用于hvp360、但無us2表達(dá)盒的一組粘粒組裝；這在隨后實(shí)驗(yàn)中被用作對照病毒，并且被稱為hvtfc-126/435。將病毒儲備物在cef上傳代一次，并且使用easy-dna?試劑盒(invitrogen)分離總dna。從用轉(zhuǎn)移載體轉(zhuǎn)化的大腸桿菌培養(yǎng)物分離轉(zhuǎn)移載體的質(zhì)粒dna，并且使用quantumprep?質(zhì)粒midiprep試劑盒(bio-rad)分離dna。

3.2.3.通過southern印跡的表征

進(jìn)行southern印跡用于深入分析hvp360的基因組結(jié)構(gòu)，以驗(yàn)證病毒組裝完全如預(yù)期，并且在病毒再生期間沒有發(fā)生無意識的插入或缺失。

用限制性酶pvui和aatii；或用bamhi、kpni、bglii和ecori消化hvt病毒dna。轉(zhuǎn)移質(zhì)粒dna用限制性酶pvui和aatii消化。

消化后，將dna片段上樣在0.7％瓊脂糖/tae凝膠上的多個(gè)平行泳道中，電泳，并轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。將印跡切成相同片段，并與³²p標(biāo)記的hvt探針和探測dna大小標(biāo)記物的探針(smartladder?,eurogentec)之一單獨(dú)雜交。孵育16小時(shí)后，在兩個(gè)洗滌步驟中除去過量探針，并將印跡暴露于x-射線膠片。顯現(xiàn)放射自顯影后，與探針特異性雜交的dna限制性片段是可見的。

為了檢測克隆質(zhì)粒的任何部分是否已并入重組hvt中，通過用haeiii將質(zhì)粒pbr322消化成更小片段來制備探針。這些片段用³²p標(biāo)記。hvt重構(gòu)中使用的所有克隆載體都是pbr322的衍生物，并且如果存在載體序列，則將通過該探針檢測。此外，hvp360轉(zhuǎn)移質(zhì)粒用于southern印跡的一個(gè)泳道中作為用于檢測質(zhì)粒序列的陽性對照。

為了檢查在粘粒插入片段的重疊區(qū)域和hvt基因組的重復(fù)區(qū)域處的正確組裝，設(shè)計(jì)引物對以在這些相關(guān)區(qū)域中雜交，并且通過對從感染的cef細(xì)胞培養(yǎng)物制備的hvtfc-126病毒dna的pcr來獲得探針。用sau3ai將擴(kuò)增子消化成較小片段，用³²p標(biāo)記，并在southern印跡雜交中用作探針。

接下來，將各種探針與已經(jīng)用bamhi、kpni、bglii或ecori消化的hvp360dna雜交。

將southern印跡中檢測到的限制性片段長度與基于hvt毒株fc-126的公開序列(genbankacc.nr.af291866)預(yù)期的那些進(jìn)行比較。

3.2.4.通過序列分析的表征

為了證實(shí)編碼序列的正確插入和穩(wěn)定性，對表達(dá)盒和hvtus2側(cè)接區(qū)進(jìn)行完整dna序列分析。

為了允許dna測序，通過使用特異性引物的pcr擴(kuò)增hvt的特異性dna片段。使用qiaquick?試劑盒(qiagen)純化擴(kuò)增子。接下來，根據(jù)制造商的說明書，使用bigdyeterminator?v.3.1循環(huán)測序試劑盒(appliedbiosystems)對這些擴(kuò)增子進(jìn)行pcr測序。使用3500系列g(shù)eneticanalyzer?(appliedbiosystems)進(jìn)行測序。使用sequencher?v.5.0軟件(genecodescorporation)分析序列讀數(shù)。

從重疊序列讀數(shù)組裝連續(xù)序列。通過重復(fù)測序反應(yīng)和編譯多個(gè)序列讀數(shù)來解決任何歧義。

3.2.5.通過ifa表征表達(dá)

轉(zhuǎn)染、蝕斑純化和連續(xù)傳代后，通過ifa監(jiān)測來自傳代水平5、10和15的hvp360的兩種平行分離株的分離株的插入基因的維持表達(dá)。將cef單層用重組分離株感染，孵育2-3天，直到cpe清晰可見，然后用80％乙醇固定。ibdvvp2或ndvf的表達(dá)用單克隆抗體作為第一試劑和異硫氰酸熒光素(fitc)標(biāo)記的綴合物作為二抗進(jìn)行檢測，并通過uv顯微鏡讀取。

3.3.結(jié)果

3.3.1.southern印跡雜交的結(jié)果

通過使用特異性探針的southern印跡分析來證實(shí)遺傳同質(zhì)性和穩(wěn)定性。在含有來自毒株hvp360和fc126的限制性dna的泳道上與質(zhì)粒pbr322探針雜交的印跡沒有給出質(zhì)粒探針的信號。然而，質(zhì)粒探針的確與來自轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的含有限制性dna的泳道陽性反應(yīng)，顯示如預(yù)期的對于質(zhì)粒骨架特異性的片段。此外，質(zhì)粒探針對于dna大小標(biāo)記物的大多數(shù)條帶是陽性的。

然后將相同印跡與對于us2插入基因座特異性的探針雜交，再次顯示如預(yù)測的限制性片段。

如預(yù)期，對于已插入表達(dá)盒的基因組區(qū)域，觀察到不同的預(yù)期條帶模式。

雜交顯示，hvp360的病毒基因組被正確組裝，并且與對于親本hvt粘粒-重構(gòu)毒株fc-126/435觀察到的模式相匹配。

在與檢測重疊序列和重復(fù)區(qū)域的探針的雜交中，發(fā)現(xiàn)hvp360和fc-126的模式在很大程度上是相同的，盡管在一些區(qū)域中發(fā)現(xiàn)的模式與基于hvtfc-126的公開的dna序列預(yù)測的獨(dú)特長和末端重復(fù)區(qū)域之間的連接的southern印跡雜交模式略有不同。然而，這些區(qū)域中的模式對于重組和親本病毒毒株兩者是相同的。

因此，這些差異由親本毒株hvtfc-126的病毒基因組序列和公開的序列的差異引起，而不是由通過粘粒重構(gòu)技術(shù)在病毒基因組的組裝期間的重排引起。

3.3.2.通過序列分析表征結(jié)果

通過pcr-測序確定所用轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的插入盒和側(cè)接區(qū)的整個(gè)dna序列。對于分離株a1和b1兩者比對hvp360的病毒基因組中插入片段的共有序列，并且與轉(zhuǎn)移質(zhì)粒中的序列以及親本毒株fc-126的插入?yún)^(qū)序列進(jìn)行比較。比對的結(jié)果證實(shí)，插入hvp360的序列對于分離株a1和b1是相同的。

此外，顯示該序列與轉(zhuǎn)移質(zhì)粒中的原始表達(dá)盒相同。此外，hvp360a1和b1以及fc-126的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的us2插入基因座的側(cè)接區(qū)域都顯示在dna序列中是相同的。

3.3.3.通過ifa表征表達(dá)的結(jié)果

通過ifa篩選用于兩種平行分離株以及來自所有3個(gè)傳代水平5、10和15的hvp360的蝕斑純化病毒的vp2和f的表達(dá)。測試的所有蝕斑都顯示f和vp2基因的完全表達(dá)。這證實(shí)最多達(dá)(至少)細(xì)胞傳代水平15的vp2和f的功能和穩(wěn)定表達(dá)。

3.4.結(jié)論

hvp360是表達(dá)ibdvvp2和ndvf兩者的重組hvt。通過ifa的詳細(xì)表征、對病毒dna的southern印跡分析和插入片段和側(cè)接區(qū)的dna測序證實(shí)，兩種獨(dú)立的hvp360分離株a1和b1都在hvtfc-126的us2區(qū)域中正確地整合了表達(dá)盒，并且在噬斑純化后在cef細(xì)胞中15次隨后傳代期間，在cef的感染培養(yǎng)物中功能性表達(dá)ibdvvp2和ndvf基因。

hvp360分離株a1和b1的表達(dá)盒和總基因組是正確的，因?yàn)樵谟靡幌盗衕vt特異性基因組探針的southern印跡雜交后獲得的限制性消化模式中沒有檢測到缺失、重排或額外外來序列。在us2區(qū)域中僅整合一個(gè)拷貝的插入片段。

在us2插入基因座的表達(dá)盒和側(cè)接區(qū)的詳細(xì)序列分析后，得出結(jié)論：hvp360a1和b1與彼此、與轉(zhuǎn)移載體中的序列且與親本病毒fc-126是相同的。

4.接種-用hvp360的攻擊試驗(yàn)

用重組hvthvp360進(jìn)行接種-攻擊實(shí)驗(yàn)。簡而言之:一日齡spf層用平行分離株hvp360a1或b1中任一種肌肉內(nèi)接種。在接種后3或4周時(shí)，針對用ibdv或ndv的嚴(yán)重攻擊感染測量誘導(dǎo)的保護(hù)：對于ibdv，以3000cid50/0.1ml，通過至每只眼睛的眼途徑，接種攻擊毒株cs89；對于ndv，以6log10eld50/0.2ml/動(dòng)物，通過肌肉內(nèi)途徑，給予毒株herts33/56。通過來自接種的動(dòng)物的脾臟的病毒重新分離來確定疫苗和對照病毒的病毒血癥水平。結(jié)果呈現(xiàn)于表3中。

攻擊保護(hù)的水平如下確定：

對于ndv攻擊，在接種后3或4周攻擊后2周確定活比死亡動(dòng)物的比率。例如：組中的20只動(dòng)物中的18只存活者給出90％的ndv保護(hù)評分。

對于ibdv攻擊，攻擊后10天尸檢時(shí)粘液囊(bursa)的臨床癥狀評分在0和5之間，代表無一達(dá)到嚴(yán)重的淋巴細(xì)胞耗竭。具有0–2的評分的動(dòng)物被認(rèn)為是受保護(hù)的，而3-5的評分不受保護(hù)。ibd保護(hù)是從組中的動(dòng)物數(shù)量受保護(hù)(粘液囊(bursa)臨床評分0-2)的動(dòng)物的百分比。

結(jié)果顯示，在該實(shí)驗(yàn)中，在接種后3周，用hvp360肌肉內(nèi)接種以59％至73%針對nd保護(hù)一日齡的雞。在4周時(shí)，nd保護(hù)率為79％至93％。在接種后3至4周時(shí)針對ibd的保護(hù)率為93%至100％。

表3：用hvp360在1日齡肌肉內(nèi)接種的spf層中針對ibdv和ndv的病毒血癥、血清學(xué)和攻擊保護(hù)。

(1)病毒血癥以pfu/5x10^6個(gè)脾細(xì)胞表示。

5.針對nd和ibd的免疫的開始和持續(xù)時(shí)間

在隨后的接種-攻擊實(shí)驗(yàn)中，使用hvp360作為疫苗和用ndv或ibdv進(jìn)行攻擊，確定免疫的開始和免疫的持續(xù)時(shí)間。hvp360疫苗病毒在傳代水平13；動(dòng)物是spf層，1日齡；接種途徑為：皮下；接種劑量為0.2ml的1500至2500pfu/動(dòng)物劑量。攻擊病毒是ibdvcs89或ndvherts33/56。對照動(dòng)物用hvtfc-126/435皮下接種。

表4：通過用約1500-2500pfu/動(dòng)物的劑量皮下接種的1日齡雛雞中hvp360針對ndv或ibdv的攻擊感染的保護(hù)。

結(jié)果顯示，用hvp360接種后，通過皮下途徑在1日齡接種后4周，針對ndv攻擊獲得超過90％保護(hù)率。這符合針對活nd疫苗的pheur0450專著要求。

甚至更好的是針對ibdv攻擊實(shí)現(xiàn)的保護(hù)：在用hvp360接種后2周，針對攻擊獲得超過90％保護(hù)率。這符合針對ibd疫苗的pheur0587專著要求。

此外，這些結(jié)果表明，免疫-保護(hù)的持續(xù)時(shí)間進(jìn)行，直到接種后(至少)8周，針對nd和針對ibd的保護(hù)水平為100％。

6.針對nd的劑量-反應(yīng)以及不同的施用途徑的測試

在動(dòng)物試驗(yàn)中，應(yīng)用用不同劑量的hvp360接種，并測試不同的途徑：卵內(nèi)(io)和皮下(sc)，以測試來自這些劑量和這些途徑針對ndv的攻擊感染的反應(yīng)。此外，測定在各種處理組中從接種動(dòng)物重新分離后的hvp360疫苗和fc-126對照病毒的病毒血癥水平。

在通過皮下途徑接種18日齡的spf層(io)的含胚卵或一日齡spf層后，用ndvherts33/56在3或4周齡時(shí)攻擊動(dòng)物。在4、11或17天從脾臟或血液樣品中重新分離疫苗/對照病毒，以確定達(dá)到的病毒血癥水平。結(jié)果呈現(xiàn)于表5中。病毒血癥以兩種方式呈現(xiàn)：一次作為該組中鳥類的總數(shù)中對于疫苗/對照病毒重新分離陽性的鳥類數(shù)目，且一次作為每2x10^6個(gè)脾細(xì)胞的平均病毒pfu。

在“劑量”列中，呈現(xiàn)實(shí)際接種劑量，其通過接種后接種物的其余部分的反滴定進(jìn)行測定。

表5：用不同劑量的hvp360在卵內(nèi)或皮下接種的spf層中的病毒血癥和針對ndv的攻擊保護(hù)。

皮下接種似乎幾乎不依賴于使用的劑量；500至2500pfu/動(dòng)物之間的劑量都達(dá)到令人滿意的免疫保護(hù)水平。

最終，兩種途徑(io和sc)可以在3周和4周時(shí)分別產(chǎn)生65-70％和84-90％的相同保護(hù)。

序列表

<110>intervetinternationalbv

<120>改進(jìn)的hvt作為載體的nd-ibd疫苗

<130>23888

<160>1

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>6674

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>具有側(cè)接區(qū)的hvp360表達(dá)盒

<220>

<221>基因

<222>(1)..(399)

<223>hvtus2基因的上游部分;af291866,nt140143-140541

<220>

<221>啟動(dòng)子

<222>(630)..(2020)

<223>鼠巨細(xì)胞病毒立即早期1基因啟動(dòng)子-增強(qiáng)子

<220>

<221>基因

<222>(2052)..(3410)

<223>ibdv毒株52/70,vp2基因

<220>

<221>polya_信號

<222>(3441)..(3650)

<223>sv40polya信號+終止子

<220>

<221>啟動(dòng)子

<222>(3805)..(4149)

<223>人巨細(xì)胞病毒立即早期1基因核心啟動(dòng)子

<220>

<221>基因

<222>(4174)..(5835)

<223>ndv克隆30f-基因

<220>

<221>終止子

<222>(5815)..(6127)

<223>hcmvie基因終止子

<220>

<221>基因

<222>(6156)..(6674)

<223>hvtus2基因的下游部分;af291866,nt140541-141059

<400>1

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