相關(guān)申請的交叉參考

本申請依據(jù)35usc§119(e)要求2014年10月24日提交的美國臨時專利申請62/068,322和2015年1月8日提交的美國臨時專利申請62/101,164的優(yōu)先權(quán)，其中的每一個的全部都以引入的方式并入本文中。

關(guān)于聯(lián)邦贊助的研究的聲明

本發(fā)明是在美國國家衛(wèi)生研究院(nationalinstitutesofhealth)授予biotherapeuticsinc.的sbir撥款號1r43dk097940-01a1和sttr撥款號1r41dk099027-01a1下部分地由美國政府支持進(jìn)行的。美國政府具有本發(fā)明中的某些權(quán)利。

本發(fā)明涉及對疾病和病癥進(jìn)行醫(yī)學(xué)治療的領(lǐng)域。更具體來說，本發(fā)明涉及治療和預(yù)防尤其以下疾病的生物活性化合物類別：發(fā)炎性和免疫介導(dǎo)疾病，如發(fā)炎性腸病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、牛皮癬、多發(fā)性硬化癥和1型糖尿病，以及慢性發(fā)炎性疾病和病癥，如胰島素抵抗、葡萄糖耐量異常、前驅(qū)糖尿病、2型糖尿病和肥胖相關(guān)炎癥。

背景技術(shù)：

羊毛硫氨酸c樣蛋白質(zhì)2(lancl2)(也稱為“羊毛硫氨酸合成酶c樣蛋白質(zhì)2”或“羊毛硫氨酸合成酶組分c樣蛋白質(zhì)2”是所表達(dá)免疫細(xì)胞、胃腸道、神經(jīng)元、睪丸和胰臟的信號傳導(dǎo)路徑蛋白質(zhì)[1]。使lancl2路徑活化增加胰島素敏感性并且減少與各種自身免疫、發(fā)炎性和代謝病狀相關(guān)聯(lián)的炎癥。小鼠中體內(nèi)和體外測試的結(jié)果展示，與對照組相比，使用靶向此路徑的化合物在葡萄糖耐量測試中降低葡萄糖水平2倍并且提供與處方(英格蘭布倫特福德的葛蘭素史克公司(glaxosmithklineplc,brentford,england))，是有效治療但具有顯著副作用。靶向lancl2路徑還使腸道炎癥減少90％，并且使病變數(shù)量相應(yīng)減少4倍。所述路徑的此測試和其它驗證的結(jié)果出版于12篇同行審查的在職文章中[2-13]。

在自身免疫相關(guān)炎癥的類別內(nèi)，目前存在自身免疫性病癥全球大流行，如發(fā)炎性腸病(ibd)、全身性狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、1型糖尿病、牛皮癬、多發(fā)性硬化癥。還存在慢性代謝發(fā)炎性疾病大流行，包括代謝綜合征、肥胖、前驅(qū)糖尿病、心血管疾病和2型糖尿病。目前的治療是適度有效的，但昂貴并且具有嚴(yán)重副作用。對自身免疫性疾病最有效的治療(如抗tnf抗體)的投藥途徑是經(jīng)由iv或皮下注射，因而要求訪問診所/手術(shù)和頻繁監(jiān)測。lancl2的獨特作用模式提供與抗tnf抗體同樣有效但不具有副作用和高成本的口服投與的治療劑。鑒于發(fā)炎性和自身免疫性疾病整體的流行性，lancl2路徑具有顯著影響數(shù)百萬患者的潛能。

脫落酸(“aba”)是在原始篩選過程中發(fā)現(xiàn)的結(jié)合于lancl2的一種天然化合物。

在合成有機(jī)化學(xué)領(lǐng)域中描述大量化合物。各種化合物由以下參考文獻(xiàn)提供：diana等人的wo1997/036866、sun等人的wo2006/053109、kim等人的wo2006/080821、nunes等人的wo2007/019417、singh等人的wo2009/067600和wo2009/067621、adams等人的wo2008/079277、urasoe等人的jp2008/056615、stoessel等人的wo2011/066898、bassaganya-riera等人的us2013/0142825以及bassaganya-riera等人的美國專利7,741,367。已知描述于這些參考文獻(xiàn)中的化合物中的一些使lancl2路徑活化，而另一些不使之活化。

需要研發(fā)lancl2路徑的新穎配位體以允許治療針對個別疾病進(jìn)行特異性定制并潛在地使其功效達(dá)到最大。

本申請因此描述一系列化合物類別，其已經(jīng)通過新穎醫(yī)藥化學(xué)方法研發(fā)，并使用計算機(jī)模擬、體外和體內(nèi)技術(shù)篩選以使其結(jié)合于lancl2蛋白質(zhì)的能力達(dá)到最大并且因此在各種疾病病狀中實現(xiàn)有益反應(yīng)，所述疾病病狀包括(但不限于)自身免疫、慢性發(fā)炎性、代謝和傳染性疾病。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供包含式z-y-q-y'-z'的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽或酯，

其中：

z是：

y是：

q是哌嗪-1,4-二基；2,5-二氮雜雙環(huán)[2.2.1]庚烷-2,5-二基；2,5-二氮雜雙環(huán)[2.2.2]辛烷-2,5-二基；1,4-二氮雜環(huán)庚烷-1,4-二基；苯-1,4-二胺-n¹,n⁴-二基；乙烷-1,2-二胺-n¹,n²-二基；n¹,n²-二烷基乙烷-1,2-二胺-n¹,n²-二基；丙烷-1,3-二胺-n¹,n³-二基；n¹,n³-二烷基丙烷-1,3-二胺-n¹,n³-二基；1,4-二氨基蒽-9,10-二酮-1,4-二基；c6芳烴-1,4-二胺-n¹,n⁴-二基，其中所述芳烴在2、3、5或6位被一個到四個取代基取代，并且其中所述取代基獨立地選自由以下組成的群組：-c(o)o(c1到c6)烷基、oh、o(c1到c6)烷基、(c1到c6)烷基、cf3、f、cl和br；或被取代的哌嗪-1,4-二基，其中所述哌嗪在2、3、5或6位被一個到八個取代基取代，并且其中所述取代基獨立地選自由以下組成的群組：(c1到c6)烷基、芳基、芳基(c1到c6)烷基、c(o)oh和c(o)o(c1到c6)烷基；

y'是：

或單鍵；并且

z'是：

或r⁵；

其中：

僅在z'是r⁵時，y'是單鍵；

a1和a1'各自獨立地是n、n(c1到c6)烷基、o、s或cr⁶；

a2和a2'各自獨立地是n或cr⁷；

a3和a3'各自獨立地是nr⁸、o或s；

a4和a4'各自獨立地是n或cr⁹；

a5和a5'各自獨立地是n或cr¹⁰；

a6和a6'各自獨立地是n或cr¹¹；

r¹、r^1'、r²、r^2'、r³、r^3'、r⁴、r^4'、r⁵、r⁶、r⁷、r⁸、r⁹、r¹⁰和r¹¹各自獨立地選自由以下組成的群組：氫；烷基；鹵基；三氟甲基；二烷基氨基，其中每一烷基獨立地加以選擇；-nh2；烷基氨基；芳基烷基；雜芳基烷基；雜環(huán)烷基；被取代的雜環(huán)烷基，其被1到2個獨立地選自由以下組成的群組的取代基取代：-c(o)oh、-c(o)o(c1到c6)烷基、(c1到c6)烷基、-cf3、f、cl和br；以及被取代的雜芳基烷基；

其中所述被取代的雜芳基烷基被1到3個獨立地選自由以下組成的群組的取代基取代：-nh2；-nh(c1到c6)烷基；-n((c1到c6)烷基)2，其中每一烷基獨立地加以選擇；烷基；鹵基；芳基；被取代的芳基，其被1到3個獨立地選自由以下組成的群組的取代基取代：-so2r¹²、-or¹³、-鹵基、-cn、-cf3、氨基烷基-、-s(o)r¹⁴和烷基；雜環(huán)烷基；雜芳基；被取代的芳基，其被1到3個獨立地選自由以下組成的群組的取代基取代：烷基、-cf3、f、cl和br；烷基氨基-；雜環(huán)烷基-烷基-氨基-；烷基氨基烷基氨基-；-nhc(o)or¹⁵；-nhc(o)nr¹⁶r¹⁷；-c(o)nr¹⁶r¹⁷；以及被取代的雜芳基，其被1到3個選自由以下組成的群組的取代基取代：烷基、鹵基、cn、nh2、-nh(c1-c6烷基)、-n(c1-c6烷基)2(其中每一烷基獨立地加以選擇)、-cf3和被取代的芳基(被1到3個獨立地選自由-s(o)2r¹⁵和-cn組成的群組的取代基取代)；

其中r¹²、r¹³、r¹⁴、r¹⁵、r¹⁶和r¹⁷各自獨立地選自由以下組成的群組：c1-c6烷基、包含獨立選擇發(fā)c1-c6烷基的二烷基氨基、-nh2、烷基氨基、雜環(huán)烷基和被取代的雜環(huán)烷基(被一個到兩個獨立地選自由-c(o)o(c1-c6烷基)和c1-c6烷基組成的群組的取代基取代)。

在一些化合物中，a3和a3'中的至少一個是o或s。在一些化合物中，a1和a1'中的一個或兩個是n。在一些化合物中，a2和a2'中的一個或兩個是ch，a3是nh，a4是n，a5是ch，并且a6是ch。在一些化合物中，a2和a2'中的一個或兩個是ch，a3和a3'中的一個或兩個是nh，a4和a4'中的一個或兩個是n，a5和a5'中的一個或兩個是ch，并且a6和a6'中的一個或兩個是ch。在一些化合物中，q是哌嗪-1,4-二基；2,5-二氮雜雙環(huán)[2.2.1]庚烷-2,5-二基；2,5-二氮雜雙環(huán)[2.2.2]辛烷-2,5-二基；1,4-二氮雜環(huán)庚烷-1,4-二基；n¹,n²-二烷基乙烷-1,2-二胺-n¹,n²-二基；n¹,n³-二烷基丙烷-1,3-二胺-n¹,n³-二基；1,4-二氨基蒽-9,10-二酮-1,4-二基；c6芳烴-1,4-二胺-n¹,n⁴-二基，其中所述芳烴在2、3、5或6位被一個到四個取代基取代，并且每一取代基獨立地選自由以下組成的群組：-c(o)o(c1到c6)烷基、oh、o(c1到c6)烷基、(c1到c6)烷基、cf3、f、cl和br；或被取代的哌嗪-1,4-二基，其中所述哌嗪在2、3、5或6位被一個到八個取代基取代，并且每一取代基獨立地選自由以下組成的群組：(c1到c6)烷基、芳基、芳基(c1到c6)烷基、c(o)oh和c(o)o(c1到c6)烷基。

在一些化合物中，式z-y-q-y'-z'是：

或

其鹽。在一些化合物中，選自由以下組成的群組的一對或多對的成員相同：a1和a1'、a2和a2'、a3和a3'、a4和a4'、a5和a5'、a6和a6'、r1和r1'、r2和r2'、r3和r3'以及r4和r4'。在一些化合物中，選自由以下組成的群組的一對或多對的成員不同：a1和a1'、a2和a2'、a3和a3'、a4和a4'、a5和a5'、a6和a6'、r1和r1'、r2和r2'、r3和r3'以及r4和r4'。在一些化合物中，選自由以下組成的群組的每一對的成員相同：a1和a1'、a2和a2'、a3和a3'、a4和a4'、a5和a5'、a6和a6'、r1和r1'、r2和r2'、r3和r3'以及r4和r4'。在一些化合物中，選自由以下組成的群組的每一對的成員不同：a1和a1'、a2和a2'、a3和a3'、a4和a4'、a5和a5'、a6和a6'、r1和r1'、r2和r2'、r3和r3'以及r4和r4'。

在一些化合物中，式z-y-q-y'-z'是：

或

其鹽。

本發(fā)明的一些化合物具有以下結(jié)構(gòu)：

或

其鹽。

本發(fā)明還提供包含式a-b-c的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽或酯，

其中：

a是：

b是：

并且

c是：

其中：

a7、a8、a9、a10、a11、a12、a13和a14各自獨立地選自ch、cr¹⁸和n；

a15、a16、a17、a18、a19和a20各自獨立地選自ch、cr¹⁹、n、nr²⁰、o和s，其限制條件為a15、a16和a17中的僅一個可以是n、nr²⁰、o或s，并且a18、a19和a20中的僅一個可以是n、nr²⁰、o或s；

r¹⁸和r¹⁹各自獨立地選自c1-c6烷基；c1-c6二烷基氨基，其中每一c1-c6烷基獨立地加以選擇；-nh2；烷基氨基；雜環(huán)烷基；以及被取代的雜環(huán)烷基，其中所述被取代的雜環(huán)烷基被一個到兩個獨立地選自由-c(o)o(c1-c6烷基)和c1-c6烷基組成的群組的取代基取代；其中在具有超過一個cr¹⁸的化合物中，每一r¹⁸獨立地加以選擇，并且在具有超過一個cr¹⁹的化合物中，每一r¹⁹獨立地加以選擇；并且

r²⁰是c1-c6烷基。

在一些化合物中，b是：

一些化合物具有以下結(jié)構(gòu)：

或其鹽。

本發(fā)明還提供用本文所描述化合物中的任何一種或多種治療動物中的病狀的方法。所述方法包含向動物投與有效量的本文所描述化合物中的一種或多種。所述病狀可以選自由以下組成的群組：傳染性疾病、自身免疫性疾病、糖尿病以及慢性發(fā)炎性疾病。在一些方法中，傳染性疾病包含病毒性疾病，如流感感染。在一些方法中，自身免疫性疾病包含自身免疫性發(fā)炎性疾病，如發(fā)炎性腸病，包括潰瘍性結(jié)腸炎和/或克羅恩氏病(crohn'sdisease)。在一些方法中，糖尿病選自由1型糖尿病和2型糖尿病組成的群組。在一些方法中，慢性發(fā)炎性疾病包含代謝綜合征。在一些方法中，所述方法包含投與一定量的有效增加lancl2活性、減少炎癥和/或增加抗炎作用的化合物。

本發(fā)明還提供用于用本文所描述化合物中的任何一種或多種治療動物中的病狀的化合物。用于此類用途的化合物包括本文所描述的任何化合物。使用可以包含向動物投與有效量的本文所描述化合物中的一種或多種，其中病狀選自由以下組成的群組：傳染性疾病、自身免疫性疾病、糖尿病以及慢性發(fā)炎性疾病。在一些型式中，傳染性疾病包含病毒性疾病，如流感感染。在一些型式中，自身免疫性疾病包含自身免疫性發(fā)炎性疾病，如發(fā)炎性腸病，包括潰瘍性結(jié)腸炎和/或克羅恩氏病。在一些型式中，糖尿病選自由1型糖尿病和2型糖尿病組成的群組。在一些型式中，慢性發(fā)炎性疾病包含代謝綜合征。在一些型式中，化合物有效增加lancl2活性、減少炎癥和/或增加抗炎作用。

本發(fā)明的目標(biāo)和優(yōu)點將由以下結(jié)合附圖進(jìn)行的本發(fā)明優(yōu)選實施例詳細(xì)描述而表現(xiàn)得更完全。

附圖說明

圖1a和1b化合物與lancl2的結(jié)合的計算性預(yù)測和使用spr的生化實驗驗證。

圖2nsc6160前五個集群的群集直方圖(clusteringhistogram)。使用autodocktools用與lancl2對接的nsc6160執(zhí)行一百次對接操作。rmsd集群容限是結(jié)合能以kj/mol為單位列出。

圖3aba前五個集群的群集直方圖。使用autodocktools用與lancl2對接的aba執(zhí)行一百次對接操作。rmsd集群容限是結(jié)合能以kj/mol為單位列出。

圖4bt-11前五個集群的群集直方圖處理。使用autodocktools用與lancl2對接的bt-11執(zhí)行一百次對接操作。rmsd集群容限是結(jié)合能以kj/mol為單位列出。

圖5bt-6前五個集群的群集直方圖。使用autodocktools用與lancl2對接的bt-6執(zhí)行一百次對接操作。rmsd集群容限是結(jié)合能以kj/mol為單位列出。

圖6bt-15前五個集群的群集直方圖。使用autodocktools用與lancl2對接的bt-15執(zhí)行一百次對接操作。rmsd集群容限是結(jié)合能以kj/mol為單位列出。

圖7bt-aba-5a前五個集群的群集直方圖。使用autodocktools用與lancl2對接的bt-aba-5a執(zhí)行一百次對接操作。rmsd集群容限是結(jié)合能以kj/mol為單位列出。

圖8羊毛硫氨酸合成酶c樣蛋白質(zhì)2(lancl2)與bt-11和bt-15的結(jié)合動力學(xué)。圖a和c展示對變化濃度的bt-11(a)和bt-15(c)與固定化lancl2的結(jié)合的表面等離子共振(spr)傳感圖。圖b和d展示最大共振單位(ru)對比bt-11(b)和bt-15(d)濃度的曲線圖。指示利用1:1結(jié)合模型的穩(wěn)態(tài)解離常數(shù)(kd)。

圖9a和9b羊毛硫氨酸合成酶c樣蛋白質(zhì)2(lancl2)與bt-6(圖9a)和bt-aba-5a(圖9b)的結(jié)合動力學(xué)。展示對變化濃度的bt-6和bt-aba-5a與固定化lancl2的結(jié)合的表面等離子共振(spr)傳感圖。

圖10口服投藥對患有葡聚糖硫酸鈉(dss)結(jié)腸炎的小鼠的疾病活動性和總病理學(xué)的作用。圖a展示在僅用bt-11或媒劑處理的小鼠中的疾病活動性指數(shù)評分。圖b-c展示來自在用媒劑或bt-11處理的小鼠中(b)脾臟、(c)腸系膜淋巴結(jié)(mln)和(d)結(jié)腸的總病理學(xué)評分。用星號指示統(tǒng)計學(xué)上顯著的差異(p<0.05)(n＝10)。

圖11口服bt-11投藥對患有dss結(jié)腸炎的小鼠中的結(jié)腸發(fā)炎性病變的作用。展示(a，d)對照組(b，e)dss和(c，f)經(jīng)過bt-11處理的dss小鼠的代表性顯微圖?；?g)白細(xì)胞浸潤、(h)上皮細(xì)胞侵蝕和(i)粘膜增厚來評估組織病理學(xué)病變。用星號指示統(tǒng)計學(xué)上顯著的差異(p<0.05)(n＝10)。

圖12口服bt-11投藥對患有dss結(jié)腸炎的小鼠中的結(jié)腸發(fā)炎性病變的劑量反應(yīng)作用?；?a)白細(xì)胞浸潤、(b)粘膜增厚和(c)上皮細(xì)胞侵蝕來評估組織病理學(xué)病變。用星號指示統(tǒng)計學(xué)上顯著的差異(p<0.05)(n＝10)。

圖13tnfα、白介素10(il-10)和lancl2的結(jié)腸基因表達(dá)分析。展示結(jié)腸基因表達(dá)以評定(a)促炎性tnfα、(b)il-10和(c)lancl2的水平。用星號指示統(tǒng)計學(xué)上顯著的差異(p<0.05)(n＝10)。

圖14經(jīng)口投與bt-11對患有dss結(jié)腸炎的小鼠中的結(jié)腸促炎性和抗炎性免疫細(xì)胞子組的劑量反應(yīng)作用。流式細(xì)胞測量術(shù)分析用于測量結(jié)腸粘膜中的(a)tnfa+細(xì)胞、(b)il-10+cd4+t細(xì)胞和(c)foxp3+cd4+t細(xì)胞。

圖15口服bt-11投藥對患有dss結(jié)腸炎的野生型和lancl2-/-小鼠中的組織總病理學(xué)病變的作用。圖a展示僅用bt-11或媒劑處理的野生型對比lancl2-/-小鼠中的疾病活動性指數(shù)評分。圖b-d展示來自在用媒劑或bt-11處理的野生型和lancl2-/-小鼠中的(b)結(jié)腸、(c)腸系膜淋巴結(jié)(mln)和(d)脾臟的總病理學(xué)評分。用星號指示統(tǒng)計學(xué)上顯著的差異(p<0.05)(n＝10)。

圖16口服bt-11投藥對患有dss結(jié)腸炎的野生型和lancl2-/-小鼠中的結(jié)腸發(fā)炎性病變的作用?；?a)白細(xì)胞浸潤、(b)粘膜增厚和(c)上皮細(xì)胞侵蝕來評估組織病理學(xué)病變。用星號指示群組之間的統(tǒng)計學(xué)上顯著的差異(p<0.05)。

圖17口服bt-11投藥對浸潤患有慢性結(jié)腸炎的野生型和lancl2-/-小鼠中結(jié)腸固有層、脾臟和腸系膜淋巴結(jié)(mln)的免疫細(xì)胞子組的作用。流式細(xì)胞測量術(shù)用于分析在用bt-11處理之后的(a)結(jié)腸mcp1+cd45+細(xì)胞、(b)mln中mcp1+cd45+細(xì)胞、(c)結(jié)腸tnfa+cd45+細(xì)胞、(d)結(jié)腸mhc-ii+cd11c+粒細(xì)胞、(e)結(jié)腸il-10+cd45+細(xì)胞和(f)il-10+cd45+脾細(xì)胞的水平。用星號指示群組之間的統(tǒng)計學(xué)上顯著的差異(p<0.05)。

圖18口服bt-11投藥對患有慢性結(jié)腸炎的il-10-/-小鼠中疾病活動性指數(shù)(dai)評分的作用。對發(fā)展出自發(fā)性結(jié)腸炎并且每日單獨用媒劑或用每千克體重20、40和80mgbt-11處理的il-10剔除式小鼠的dai評分(n＝10)。用星號指示群組之間的統(tǒng)計學(xué)上顯著的差異(p<0.05)。

圖19口服bt-11投藥對在用bt-11處理之后的結(jié)腸炎慢性模型中宏觀組織評分的作用。在用媒劑或用三種不同濃度(20、40和80mg/kg)的bt-11處理的小鼠的(a)脾臟、(b)腸系膜淋巴結(jié)(mln)和(c)結(jié)腸中的宏觀評分。用星號指示群組之間的統(tǒng)計學(xué)上顯著的差異(p<0.05)。

圖20口服bt-11投藥對在ibd慢性il-10-/-模型中結(jié)腸組織病理學(xué)病變的作用?；?a)白細(xì)胞浸潤、(b)上皮細(xì)胞侵蝕和(c)粘膜增厚來評估組織病理學(xué)病變。用星號指示群組之間的統(tǒng)計學(xué)上顯著的差異(p<0.05)。

圖21口服bt-11投藥對浸潤患有慢性結(jié)腸炎的il-10-/-中結(jié)腸固有層的免疫細(xì)胞子組的作用。流式細(xì)胞測量術(shù)用于分析在用bt-11處理之后的結(jié)腸lp中(a)f4/80+巨噬細(xì)胞、(b)mhc-ii+cd11c+樹突狀細(xì)胞(dc)、(c)cd4+foxp3+調(diào)節(jié)性t細(xì)胞和(d)t輔助1(th1)細(xì)胞的水平。用星號指示群組之間的統(tǒng)計學(xué)上顯著的差異(p<0.05)。

圖22口服bt-11投藥對浸潤患有慢性結(jié)腸炎的il-10-/-中脾臟和腸系膜淋巴結(jié)的免疫細(xì)胞子組的作用。流式細(xì)胞測量術(shù)用于分析在用bt-11處理之后的(a)cd4+rorgt+t細(xì)胞、(b)cd4+foxp3+t細(xì)胞、(c)cd4+cd45+foxp3+調(diào)節(jié)性t細(xì)胞和(d)t輔助1(th1)細(xì)胞的水平。用星號指示群組之間的統(tǒng)計學(xué)上顯著的差異(p<0.05)。

圖23用bt-11口服治療對lancl2和tnfα結(jié)腸表達(dá)的作用。結(jié)腸基因表達(dá)用于評定(a)lancl2和(b)tnfα的水平。用星號指示群組之間的統(tǒng)計學(xué)上顯著的差異(p<0.05)。

圖24口服bt-11投藥對慢性結(jié)腸炎過繼轉(zhuǎn)移模型中媒劑對比經(jīng)過處理的小鼠中疾病活動性指數(shù)評分的作用。在腹膜內(nèi)轉(zhuǎn)移400,000個未經(jīng)處理的cd4+t細(xì)胞后，用媒劑或bt-11處理rag2-/-小鼠。用星號指示群組之間的統(tǒng)計學(xué)上顯著的差異(p<0.05)。

圖25口服bt-11投藥對慢性結(jié)腸炎過繼轉(zhuǎn)移模型中媒劑對比經(jīng)過處理的野生型對比lancl2-/-轉(zhuǎn)移小鼠中疾病活動性指數(shù)評分的作用。在由野生型或lancl2-/-供體腹膜內(nèi)轉(zhuǎn)移400,000個未經(jīng)處理的cd4+t細(xì)胞后，用媒劑或bt-11處理rag2-/-小鼠。用星號指示群組之間的統(tǒng)計學(xué)上顯著的差異(p<0.05)。

圖26口服bt-11投藥對cd4+誘導(dǎo)結(jié)腸炎的慢性ibd模型中重量損失的作用。對小鼠進(jìn)行稱重并計算重量損失百分比。用星號指示群組之間的統(tǒng)計學(xué)上顯著的差異(p<0.05)。

圖27口服bt-11投藥對在用bt-11處理之后的cd4+t細(xì)胞誘導(dǎo)結(jié)腸炎慢性模型中宏觀組織評分的作用。展示在用媒劑或80mg/kgbt-11處理的小鼠的(a)脾臟、(b)mln、(c)結(jié)腸和(d)回腸中的宏觀評分。用星號指示群組之間的統(tǒng)計學(xué)上顯著的差異(p<0.05)。

圖28口服bt-11投藥對在用bt-11處理之后的使用野生型和lancl2-/-小鼠的cd4+t細(xì)胞誘導(dǎo)結(jié)腸炎慢性模型中宏觀組織評分的作用。展示在用媒劑或80mg/kgbt-11處理的野生型和lancl2-/-小鼠的(a)脾臟、(b)mln和(c)結(jié)腸中的宏觀評分。用星號指示群組之間的統(tǒng)計學(xué)上顯著的差異(p<0.05)。

圖29口服bt-11投藥對慢性結(jié)腸炎過繼轉(zhuǎn)移模型中媒劑對比經(jīng)過處理的小鼠中結(jié)腸和回腸組織病理學(xué)的作用?；?a，b)白細(xì)胞浸潤、(c，d)上皮細(xì)胞侵蝕和(e，f)粘膜增厚來評估結(jié)腸(a，c，e)和回腸(b，d，f)中的組織病理學(xué)病變。用星號指示群組之間的統(tǒng)計學(xué)上顯著的差異(p<0.05)。

圖30口服bt-11投藥對慢性結(jié)腸炎過繼轉(zhuǎn)移模型中媒劑對比經(jīng)過處理的用野生型或lancl2-/-cd4+t細(xì)胞轉(zhuǎn)移的小鼠中結(jié)腸組織病理學(xué)的作用?；?a)白細(xì)胞浸潤、(b)粘膜增厚和(c)上皮細(xì)胞侵蝕來評估組織病理學(xué)病變。用星號指示群組之間的統(tǒng)計學(xué)上顯著的差異(p<0.05)。

圖31口服bt-11投藥對慢性結(jié)腸炎過繼轉(zhuǎn)移模型中媒劑對比經(jīng)過處理的小鼠中疾病活動性指數(shù)評分的作用。流式細(xì)胞測量術(shù)用于分析在用bt-11處理之后的(a)f4/80+cd11b+巨噬細(xì)胞、(b)cd45+ifng+細(xì)胞、(c)cd4+foxp3+調(diào)節(jié)性t細(xì)胞和(d)cd4+il-10+抗炎性細(xì)胞的水平。用星號指示群組之間的統(tǒng)計學(xué)上顯著的差異(p<0.05)。

圖32口服bt-11投藥對慢性結(jié)腸炎過繼轉(zhuǎn)移模型中媒劑對比經(jīng)過處理的小鼠中疾病活動性指數(shù)評分的作用。流式細(xì)胞測量術(shù)用于分析在用bt-11處理之后的mln中(a)cd4+foxp3+t細(xì)胞、(b)cd4+il-10+t細(xì)胞、(c)cd45+ifng+細(xì)胞和脾臟中(d)cd4+foxp3+t細(xì)胞、(e)cd4+il-10+t細(xì)胞、(f)cd45+ifng+細(xì)胞的水平。用星號指示群組之間的統(tǒng)計學(xué)上顯著的差異(p<0.05)。

圖33口服bt-11投藥對慢性結(jié)腸炎過繼轉(zhuǎn)移模型中媒劑對比經(jīng)過處理的野生型對比pparγ-/-轉(zhuǎn)移小鼠中疾病活動性指數(shù)評分的作用。在由野生型或pparγ-/-供體腹膜內(nèi)轉(zhuǎn)移400,000個未經(jīng)處理的cd4+t細(xì)胞后，用媒劑或bt-11處理rag2-/-小鼠。(a)展示疾病活動性指數(shù)評分對比轉(zhuǎn)移后時間?；?b)白細(xì)胞浸潤、(c)粘膜增厚和(d)上皮細(xì)胞侵蝕來評估結(jié)腸中的組織病理學(xué)病變。用星號指示群組之間的統(tǒng)計學(xué)上顯著的差異(p<0.05)。

圖34口服bt-11投藥對患有糖尿病的nod小鼠中空腹血液葡萄糖和胰島素水平的作用。(a)在用媒劑或bt-11(80mg/kg/d)處理第0、1、3、4、5、10和11周時評定空腹葡萄糖水平。(b)在用媒劑或bt-11(80mg/kg/d)處理第5周時評定空腹血清胰島素水平。用星號指示統(tǒng)計學(xué)上顯著的差異(p<0.05)(n＝10)。

圖35口服bt-11投藥在1型糖尿病小鼠胰臟中病變形成中的作用?；诎准?xì)胞浸潤、病變形成和組織侵蝕來評估組織病理學(xué)病變。用星號指示群組之間的統(tǒng)計學(xué)上顯著的差異(p<0.05)。

圖36口服bt-11投藥對(a)空腹血液葡萄糖水平和(b)葡萄糖耐量測試的作用。(a)在實驗設(shè)置之后第2和12周，使小鼠禁食12h并且評定血液葡萄糖水平。(b)還用ip葡萄糖注射(2g/kg)攻擊小鼠，并且測量葡萄糖。用星號指示統(tǒng)計學(xué)上顯著的差異(p<0.05)。

圖37口服bt-11投藥對促炎性群體向白色脂肪組織(wat)中的浸潤的作用。切除wat并加以消化，并且通過流式細(xì)胞測量術(shù)來評定免疫表型結(jié)果。展示(a)浸潤性巨噬細(xì)胞和(b)ly6c^高gr1+浸潤性細(xì)胞的水平。用星號指示統(tǒng)計學(xué)上顯著的差異(p<0.05)。

圖38口服bt-11投藥對糖尿病db/db模型中葡萄糖穩(wěn)態(tài)的作用。(a)展示在實驗設(shè)置之后第1和3周時，來自用bt-11或媒劑處理的瘦素受體缺陷型(db/db)小鼠的空腹血液葡萄糖(fbg)濃度。(b)展示在腹膜內(nèi)葡萄糖攻擊(每千克體重1g)之后的血漿葡萄糖水平。在葡萄糖負(fù)荷之前(0)，接著在葡萄糖負(fù)荷之后15、30、60、90、120、180、220和265分鐘時收集血液。用星號指示群組之間的統(tǒng)計學(xué)上顯著的差異(p<0.05)。

圖39口服bt-11投藥對來自患有膳食誘導(dǎo)肥胖的小鼠的白色脂肪組織(wat)中l(wèi)ancl2、tnfα和mcp-1表達(dá)的作用。與未處理的小鼠相比，評估lancl2、tnfα和mcp-1的基因表達(dá)分析。零處線表示僅接受媒劑的小鼠的基線。

圖40口服bt-11投藥對感染有流感病毒的小鼠的臨床評分和發(fā)病率的作用。小鼠感染有流感病毒，并且在整個實驗中進(jìn)行臨床評分。對(a)活動性和(b)身體外觀標(biāo)注臨床評分。(c)繪制損失超過15％體重的小鼠的百分比以展示發(fā)病率變化。用星號指示群組之間的統(tǒng)計學(xué)上顯著的差異(p<0.05)。

具體實施方式

一般定義

除非另外陳述，否則在本申請通篇中使用以下定義：

方差分析(anova)：用于將資料集整體變化基于變化來源而分割成特定分量的算術(shù)方法。其已經(jīng)用于確定處理組之間的數(shù)值差異是否是統(tǒng)計學(xué)上顯著的。

脂肪生成：產(chǎn)生新脂肪細(xì)胞或脂肪存儲細(xì)胞的過程。

等位基因：相同基因中多個可行dna編碼中的一個。

共軛二烯：含有由一個單鍵分隔的兩個雙鍵的分子。

db/db小鼠：用于定義小鼠類型的術(shù)語，所述小鼠缺乏瘦素受體長同功異型物的全部兩個等位基因。此不足引起發(fā)展出2型糖尿病的高傾向性。對db/db小鼠的進(jìn)一步討論參見下文實例。

對映異構(gòu)體：光學(xué)異構(gòu)體；分子基于其順時針(+)或逆時針(-)旋轉(zhuǎn)偏光平面的能力的化學(xué)分類。

血糖：血液中葡萄糖的濃度。

高血糖癥：血液中葡萄糖的濃度增加超出正常范圍。

高胰島素血癥：血液中胰島素的濃度增加超出正常范圍。

血胰島素：血液中胰島素的濃度。

胰島素抵抗：組織不能對胰島素有反應(yīng)和吸收來自血液的葡萄糖。

基本上純：純度為至少90重量％，優(yōu)選地至少95重量％，如至少98重量％、99重量％或約100重量％。

2型糖尿病或非胰島素依賴型糖尿?。褐复捎诩?xì)胞對胰島素作用無反應(yīng)而造成的常見糖尿病類型的術(shù)語。如果細(xì)胞對胰島素?zé)o反應(yīng)，則其不能吸收來自血液的葡萄糖，其引起血糖毒性(glucotoxicity)。另外，細(xì)胞缺乏來源于葡萄糖氧化的能量。

ibd：發(fā)炎性腸病(ibd)涉及你消化道的全部或部分中的慢性炎癥。ibd主要包括潰瘍性結(jié)腸炎和克羅恩氏病。兩者通常都涉及嚴(yán)重腹瀉、疼痛、疲乏和重量損失。ibd可能引起衰弱，并且有時導(dǎo)致危及生命的并發(fā)癥。

潰瘍性結(jié)腸炎(uc)：uc是在你大腸(結(jié)腸)和直腸中的最內(nèi)襯層中引起持久炎癥和瘡(潰瘍)的ibd。

克羅恩氏?。嚎肆_恩氏病是引起你消化道襯層的炎癥的ibd。在克羅恩氏病中，炎癥常常擴(kuò)散到受影響組織中的深處。炎癥可能涉及消化道的不同區(qū)域，大腸、小腸或兩者。

il-10：白介素-10(il-10)(也稱為人類細(xì)胞因子合成抑制因子(csif))其是抗炎性細(xì)胞因子。在人類中，il-10由il10基因編碼。

foxp3：foxp3(叉頭框p3)(也稱為scurfin)是參與免疫系統(tǒng)反應(yīng)的蛋白質(zhì)。fox蛋白質(zhì)家族的成員，foxp3似乎在調(diào)節(jié)性t細(xì)胞的發(fā)育和功能中充當(dāng)母調(diào)節(jié)子(轉(zhuǎn)錄因子)。

tnf-α：腫瘤壞死因子(tnf，惡病質(zhì)(cachexin)或惡病質(zhì)素(cachectin)，并且以前稱為腫瘤壞死因子α或tnfα)是參與全身性炎癥的細(xì)胞因子，并且是刺激急性期反應(yīng)得細(xì)胞因子群組的成員。

mcp1：單核細(xì)胞趨化蛋白-1。cc細(xì)胞因子的早期術(shù)語，其對動脈粥樣硬化病變發(fā)展是關(guān)鍵的，見于進(jìn)行冠狀動脈旁路程序的患者的內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞中。官方優(yōu)選的術(shù)語現(xiàn)在是趨化因子(chemokine)(c-c基元)配位體2。

干擾素γ：干擾素γ是促炎性二聚可溶性細(xì)胞因子，其是ii型類別干擾素僅有的成員。

1型糖尿?。?型糖尿病(曾稱為幼年期糖尿病或胰島素依賴性糖尿病)是其中胰臟產(chǎn)生極少或不產(chǎn)生胰島素的慢性病狀，所述胰島素是允許糖(葡萄糖)進(jìn)入細(xì)胞以產(chǎn)生能量所需的激素。

白細(xì)胞浸潤：白細(xì)胞浸潤是指使白細(xì)胞移動或浸潤到受傷組織中以開始修復(fù)過程的過程。

化學(xué)定義

除非另外陳述，否則術(shù)語“烷基”單獨或作為另一取代基的一部分意味著具有所指定碳原子數(shù)目的完全飽和的直鏈、分支鏈或環(huán)狀烴基或其組合(例如，c1-c10意味著一個到十個碳原子，包括端點)，并且可以包括二價和多價基團(tuán)。烷基的實例包括(但不限于)甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、叔丁基、異丁基、仲丁基、環(huán)己基、(環(huán)己基)乙基、環(huán)丙基甲基以及其同系物和異構(gòu)體，例如正戊基、正己基、正庚基、正辛基等。除非另外指出，否則術(shù)語“烷基”還包括下文更詳細(xì)定義為“雜烷基”和“環(huán)烷基”的那些烷基衍生物。

術(shù)語“烯基”意味著除了其含有一個或多個雙鍵之外如上文所定義的烷基。烯基的實例包括乙烯基、2-丙烯基、巴豆基、2-異戊烯基、2-(丁二烯基)、2,4-戊二烯基、3-(1,4-戊二烯基)等，以及高碳數(shù)同系物和異構(gòu)體。

術(shù)語“炔基”意味著除了其含有一個或多個三鍵之外如上文所定義的烷基或烯基。炔基的實例包括乙炔基、1-丙炔基和3-丙炔基、3-丁炔基等，包括高碳數(shù)同系物和異構(gòu)體。

術(shù)語“亞烷基”、“亞烯基”和“亞炔基”單獨或作為另一取代基的一部分意味著分別衍生自烷基、烯基或炔基的二價基團(tuán)，如由-ch2ch2ch2ch2-所例示。

通常，烷基、烯基、炔基、亞烷基、亞烯基和亞炔基將具有1到24個碳原子。具有10個或更少碳原子的那些基團(tuán)在本發(fā)明中是優(yōu)選的。術(shù)語“低碳數(shù)”當(dāng)應(yīng)用于這些基團(tuán)中的任一個時，如在“低碳數(shù)烷基”或“低碳數(shù)亞烷基”中，標(biāo)示具有10個或更少碳原子的基團(tuán)。

“被取代”是指如本文所描述的化學(xué)基團(tuán)進(jìn)一步包括一個或多個取代基，如低碳數(shù)烷基、芳基、?；?、鹵素(例如，烷基鹵基，如cf3)、羥基、氨基、烷氧基、烷基氨基、酰胺基、硫基酰胺基、酰氧基、芳氧基、芳氧基烷基、巰基、硫雜、氮雜、氧代、飽和和不飽和環(huán)狀烴、雜環(huán)等。這些基團(tuán)可以附接到烷基、烯基、炔基、亞烷基、亞烯基和亞炔基部分的任何碳或取代基上。另外，這些基團(tuán)可以側(cè)接自或整合到碳鏈自身。

術(shù)語“芳基”在本文中用于指芳香族取代基，其可以是單個芳香族環(huán)或稠合在一起、共價連接或連接于共同基團(tuán)(如重氮基、亞甲基或亞乙基部分)的多個芳香族環(huán)。共同連接基團(tuán)還可以是羰基，如在二苯甲酮中。芳香族環(huán)可以尤其包括例如苯基、萘基、聯(lián)二苯、二苯甲基和二苯甲酮。術(shù)語“芳基”涵蓋“芳基烷基”和“被取代的芳基”。對于苯基，芳基環(huán)可以是單、二、三、四或五取代的。更大環(huán)可以是未被取代的或帶有一個或多個取代基。

“被取代的芳基”是指包括一個或多個官能團(tuán)的如剛才所描述的芳基，所述官能團(tuán)如低碳數(shù)烷基、?；?、鹵素、烷基鹵基(例如cf3)、羥基、氨基、烷氧基、烷基氨基、酰胺基、酰氧基、苯氧基、巰基以及稠合于芳香族環(huán)、共價連接或連接于共同基團(tuán)(如重氮基、亞甲基或亞乙基部分)的飽和和不飽和環(huán)狀烴。連接基團(tuán)還可以是羰基，如在環(huán)己基苯基酮中。術(shù)語“被取代的芳基”涵蓋“被取代的芳基烷基”。

術(shù)語“鹵素”或“鹵基”在本文中用于指氟、溴、氯和碘原子。

術(shù)語“羥基”在本文中用于指基團(tuán)-oh。

術(shù)語“氨基”用于指代nrr'，其中r和r'獨立地是h、烷基、烯基、炔基、芳基或其被取代的類似物?！鞍被焙w標(biāo)示仲胺和叔胺的“烷基氨基”以及描述基團(tuán)rc(o)nr'的“酰胺基”。

投藥

在本發(fā)明方法的歷程中，可以多種方式向動物(包括哺乳動物和人類)投與治療有效量的本發(fā)明化合物。雖然在優(yōu)選實施例中，經(jīng)口或非經(jīng)腸投與本發(fā)明化合物，但也涵蓋其它投藥形式，如經(jīng)由醫(yī)學(xué)化合物或氣霧劑。

對于口服投藥，可以例如固體、半固體、液體或氣體狀態(tài)投與有效量的化合物。具體實例包括片劑、膠囊、粉末、顆粒、溶液、懸浮液、糖漿和酏劑藥劑。然而，化合物不限于這些形式。

為了將本發(fā)明化合物調(diào)配成片劑、膠囊、粉末、顆粒、溶液或懸浮液，優(yōu)選地將所述化合物與粘合劑、崩解劑和/或潤滑劑混合。視需要，可以使用已知方法將所得組合物與稀釋劑、緩沖劑、浸潤劑、防腐劑和/或調(diào)味劑混合。粘合劑的實例包括結(jié)晶纖維素、纖維素衍生物、玉米淀粉、環(huán)糊精和明膠。崩解劑的實例包括玉米淀粉、馬鈴薯淀粉和羧甲基纖維素鈉。潤滑劑的實例包括滑石和硬脂酸鎂。此外，也可以使用已經(jīng)常規(guī)使用的添加劑，如乳糖和甘露糖醇。

對于非經(jīng)腸投藥，可以經(jīng)直腸或通過注射投與本發(fā)明化合物。對于經(jīng)直腸投藥，可以使用栓劑。栓劑可以通過將本發(fā)明化合物與藥學(xué)上合適的賦形劑混合來制備，所述賦形劑在體溫下熔融但在室溫下保持固體。實例包括(但不限于)可可油、碳蠟和聚乙二醇?？梢允褂妙I(lǐng)域中已知的方法將所得組合物模制成任何所需形式。

對于通過注射投藥，可以皮下、皮內(nèi)、靜脈內(nèi)或肌肉內(nèi)注射本發(fā)明化合物。用于此類注射的醫(yī)用藥物可以通過用已知方法使本發(fā)明化合物溶解、懸浮或乳化于水性或非水性溶劑(如植物油、合成樹脂酸甘油酯、高級脂肪酸酯或丙二醇)中來制備。必要時，還可以添加已經(jīng)常規(guī)使用的添加劑，如增溶劑、滲透壓調(diào)節(jié)劑、乳化劑、穩(wěn)定劑或防腐劑。雖然不要求，但優(yōu)選的是組合物為無菌的或經(jīng)過滅菌。

為了將本發(fā)明化合物調(diào)配成懸浮液、糖漿或酏劑，可以使用藥學(xué)上合適的溶劑。在這些溶劑當(dāng)中包括非限制性實例水。

本發(fā)明化合物還可以與具有其它藥學(xué)上合適活性的其它化合物一起用以制備醫(yī)用藥物。含有本發(fā)明化合物作為單獨化合物或作為組合物一部分的藥物可以用于治療有需要的個體。

本發(fā)明化合物還可以氣霧劑或吸入劑形式投與，所述氣霧劑或吸入劑通過將呈液體或精細(xì)粉末形式的化合物與氣態(tài)或液體噴霧劑和(視需要)已知助劑(如膨脹劑)一起裝入非加壓容器(如氣霧劑容器或霧化器)中來制備。例如二氯氟甲烷、丙烷或氮氣的加壓氣體可以用作噴霧劑。

本發(fā)明化合物可以藥學(xué)組合物(如片劑、膠囊、溶液或乳液)形式向有需要的動物(包括哺乳動物和人類)投與。本發(fā)明還涵蓋以單劑量或多劑量投與本發(fā)明中所描述化合物的其它形式，包括(但不限于)其酯、其藥學(xué)上合適的鹽、其代謝物、其結(jié)構(gòu)上相關(guān)化合物、其類似物以及其組合。

本發(fā)明化合物還可以營養(yǎng)添加劑(食品或營養(yǎng)藥劑補充劑)的形式向有需要的動物投與。

本文所用的術(shù)語“預(yù)防”、“治療”或“改善”和類似術(shù)語包括預(yù)防和完全或部分治療。所述術(shù)語還可以包括減少癥狀、改善癥狀、降低癥狀嚴(yán)重性、減少疾病發(fā)生率或改善治療結(jié)果的任何其它患者病狀變化。

本發(fā)明中所描述的化合物優(yōu)選地以組合物形式加以使用和/或投與。合適的組合物優(yōu)選地是藥學(xué)組合物、食物或食品補充劑。這些組合物提供遞送化合物的便利形式。本發(fā)明的組合物可以有效增加化合物關(guān)于氧化的穩(wěn)定性或可溶性的量包含抗氧化劑。

在本發(fā)明方法中投與或用于在本發(fā)明使用中投與的化合物的量是任何合適的量。其優(yōu)選地是每天約0.0001g到約20g(更優(yōu)選地0.01g到1g，如0.05g到0.5g)化合物。可以相應(yīng)地調(diào)配合適的組合物。生物活性藥劑給藥領(lǐng)域的技術(shù)人員將能夠基于已知和充分理解的參數(shù)研發(fā)出用于各種個體的特定給藥方案。

根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選組合物是藥學(xué)組合物，如呈片劑、丸劑、膠囊、囊片、多顆粒物(包括顆粒、珠粒、球粒和微囊封粒子)、粉末、酏劑、糖漿、懸浮液和溶液形式。藥學(xué)組合物將通常包含藥學(xué)上可接受的稀釋劑或載劑。藥學(xué)組合物優(yōu)選地適宜于非經(jīng)腸或經(jīng)口投與?？煽诜慕M合物可以呈固體或液體形式，并且可以尤其采取片劑、粉末、懸浮液和糖漿的形式。任選地，組合物包含一種或多種調(diào)味劑和/或著色劑。一般來說，治療和營養(yǎng)組合物可以包含不顯著干擾化合物對個體作用的任何物質(zhì)。

適合用于此類組合物中的藥學(xué)上可接受的載劑是藥學(xué)領(lǐng)域中眾所周知的。本發(fā)明的組合物可以含有0.01-99重量％的本發(fā)明化合物。本發(fā)明的組合物一般以單位劑型制備。優(yōu)選地，本發(fā)明中所描述化合物的單位劑量是1mg到1000mg(更優(yōu)選地50mg到500mg)。在制備這些組合物中所用的賦形劑是本領(lǐng)域中已知的賦形劑。

用于組合物的產(chǎn)物形式的其它實例是食品補充品，如呈包含囊封材料的軟凝膠或硬膠囊形式，所述囊封材料選自由以下組成的群組：明膠、淀粉、改性淀粉、淀粉衍生物，如葡萄糖、蔗糖、乳糖和果糖。囊封材料可以任選地含有交聯(lián)劑或聚合劑、穩(wěn)定劑、抗氧化劑、用于保護(hù)光敏填充物的光吸收劑、防腐劑等。優(yōu)選地，食品補充品中化合物的單位劑量是1mg到1000mg(更優(yōu)選地50mg到500mg)。

一般來說，術(shù)語載劑可以在本申請通篇中用于表示可以與所描述的化合物混合的組合物，不論其是藥物載劑、食物、營養(yǎng)補充劑或膳食輔劑。出于本發(fā)明的目的，上文所描述的材料可以視為載劑。在本發(fā)明的某些實施例中，載劑對本發(fā)明化合物具有極少到不具有生物活性。

劑量：本發(fā)明的方法可以包含向有需要的動物投與治療有效量的化合物?；衔锏挠行Я咳Q于所投與化合物的形式、投藥時長、投藥途徑(例如經(jīng)口或非經(jīng)腸)、動物年齡以及動物條件，所述動物包括哺乳動物和人類。

舉例來說，在動物中有效治療或預(yù)防2型糖尿病、前驅(qū)糖尿病、1型糖尿病、葡萄糖耐量異常、胰島素抵抗、潰瘍性結(jié)腸炎或克羅恩氏病或本文所描述的任何其它病狀的化合物量可以在每天0.1-10,000mg/kg范圍內(nèi)變化?；衔锏膬?yōu)選有效量是每天1到5,000mg/kg，并且更優(yōu)選的劑量為每天2到100mg/kg。由于如我們的毒理學(xué)數(shù)據(jù)所展現(xiàn)，化合物相對無毒性，故待投與的有效量的上限并非關(guān)鍵的。當(dāng)向動物投與持續(xù)介于約7到100天范圍內(nèi)的時段(并且優(yōu)選的時段為15到50天，并且最優(yōu)選的時段為30到42天)時，有效量的化合物在治療或預(yù)防動物潰瘍性結(jié)腸炎、克羅恩氏病、2型糖尿病、1型糖尿病、前驅(qū)糖尿病、代謝綜合征、葡萄糖耐量異常和胰島素抵抗中最有效。

在預(yù)防免疫系統(tǒng)過度活化中最有效的化合物量可以在每天0.1到500mg/kg范圍內(nèi)變化，并且優(yōu)選的劑量為每天1到150mg/kg。

當(dāng)以營養(yǎng)、治療、醫(yī)學(xué)或獸醫(yī)學(xué)組合物形式投與有效量的本發(fā)明化合物時，優(yōu)選的劑量在相對于食品或營養(yǎng)藥劑產(chǎn)品約0.01％到2.0％wt/wt范圍內(nèi)變化。

在某些其它實施例中，本發(fā)明提供lancl2結(jié)合性化合物以及結(jié)構(gòu)上相關(guān)化合物的用途，所述結(jié)構(gòu)上相關(guān)化合物如選自其酯、其藥學(xué)上合適的鹽、其代謝物、其結(jié)構(gòu)上相關(guān)化合物或其組合組成的群組的化合物，所述化合物用于治療和預(yù)防ibd和胃腸道炎癥。

另外，一般來說，本發(fā)明涉及抑制胃腸道中的炎癥，其中相關(guān)組件包括胃、小腸、大腸和直腸。由使化合物暴露于身體中誘導(dǎo)生物學(xué)效應(yīng)的各種細(xì)胞類型來產(chǎn)生作用。細(xì)胞可以包括來自胃腸道組織的那些細(xì)胞、免疫細(xì)胞(即巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞)或上皮細(xì)胞。在某些實施例中，本發(fā)明提供用本發(fā)明化合物(例如以膳食補充劑形式)治療個體以減少或預(yù)防與發(fā)炎性腸病(克羅恩氏病或潰瘍性結(jié)腸炎)相關(guān)的炎癥。本發(fā)明還涵蓋向胃腸道投與本發(fā)明化合物以便抑制腸道中細(xì)胞粘附分子的表達(dá)。

當(dāng)實踐時，本發(fā)明的方法可以借助于如上文所描述經(jīng)由任何可接受投藥途徑使用任何可接受形式向個體投與化合物，并且允許個體身體經(jīng)由自然過程將所述化合物分配到目標(biāo)細(xì)胞。如上文所描述，投與可以同樣通過直接注射到含有目標(biāo)細(xì)胞(即，待治療的細(xì)胞)的位點(例如器官、組織)來進(jìn)行。

此外，投與可以遵循任何數(shù)目的方案。因此，其可以包含單劑量或單次給藥實驗化合物，或歷經(jīng)一定時間段多劑量或多次給藥。因此，治療可以包含重復(fù)投與步驟一次或多次，直到實現(xiàn)所結(jié)果為止。在某些實施例中，治療可以持續(xù)很長一段時間，如數(shù)周、數(shù)月或數(shù)年。本領(lǐng)域的技術(shù)人員完全能夠容易地基于本領(lǐng)域中已知的參數(shù)研發(fā)出用于個體的合適給藥方案。本發(fā)明化合物的劑量可以用于本發(fā)明這些實施例的方法中。對于治療ibd、胃腸道炎癥或遏制腸道中細(xì)胞粘附分子的表達(dá)，優(yōu)選的是化合物以約1毫克/天到9,000毫克/天的量投與。

待投與的量將取決于個體、疾病或病癥分期、個體年齡、個體一般健康狀況以及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員已知并常規(guī)考慮的各種其它參數(shù)而變化。作為一般情況，將投與足夠量的化合物以便產(chǎn)生胃腸道炎癥量的可檢測變化，所述炎癥量在ibd的情況下常常與個體所經(jīng)歷的疼痛量相關(guān)。在患者目前未經(jīng)歷ibd癥狀得情況下，可以尋找的變化可以涉及免疫細(xì)胞參數(shù)，如免疫細(xì)胞上的tnfα表達(dá)或血液中調(diào)節(jié)性t細(xì)胞的百分比。本文公開合適的量，并且其它合適的量可以由本領(lǐng)域的技術(shù)人員基于本文所公開的量在無不當(dāng)或過量實驗的情況下鑒別。

在一個方面中，本發(fā)明提供一種治療或預(yù)防罹患ibd的個體或在其它方面健康但可能具有克羅恩氏病或潰瘍性結(jié)腸炎遺傳傾向性的個體發(fā)展出ibd的方法。所述方法還可以涉及治療患有緩解形式ibd的那些個體。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“罹患ibd的個體”用于意味著患有展示一種或多種ibd典型臨床征象的疾病或病癥的個體(例如動物、人類)。一般來說，根據(jù)本發(fā)明此方面治療或預(yù)防的方法包含向個體投與有效治療或預(yù)防一種或多種ibd癥狀或臨床表現(xiàn)或有效預(yù)防此類癥狀或表現(xiàn)發(fā)展的量的化合物療法。

因此，根據(jù)本發(fā)明的方法，本發(fā)明可以提供治療ibd、與腸感染相關(guān)聯(lián)的炎癥和與自身免疫性疾病相關(guān)聯(lián)的炎癥的方法。治療方法可以預(yù)防方法。在某些實施例中，所述方法是治療ibd、與腸感染相關(guān)聯(lián)的炎癥和與自身免疫性疾病相關(guān)聯(lián)的炎癥的方法。在其它實施例中，所述方法是預(yù)防ibd的方法。在實施例中，所述方法是預(yù)防緩解形式的ibd變得活化的方法。在再其它實施例中，所述方法是改善罹患ibd、與腸感染相關(guān)聯(lián)的炎癥和與自身免疫性疾病相關(guān)聯(lián)的炎癥的個體健康狀況的方法。造成胃腸感染的生物體包括(但不限于)：大腸桿菌(escherichiacoli)、志賀桿菌屬(shigella)、沙門氏菌屬(salmonella)、病原性弧菌屬(vibrios)、空腸彎曲桿菌(campylobacterjejuni)、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌(enterocoliticayersina)、剛地弓形蟲(toxoplasmagondii)、溶組織內(nèi)阿米巴(entamoebahistolytica)和藍(lán)氏賈第鞭毛蟲(giardialamblia)。因此，在某些實施例中，本發(fā)明提供一種保護(hù)罹患ibd、與腸感染相關(guān)聯(lián)的炎癥和與自身免疫性疾病相關(guān)聯(lián)的炎癥或具有發(fā)展出ibd、與腸感染相關(guān)聯(lián)的炎癥和與自身免疫性疾病相關(guān)聯(lián)的炎癥的個體的健康狀況、器官和/或組織的方法。

在本發(fā)明的一個實施例中，治療ibd的方法包含在不造成可辨別副作用的情況下治療ibd，所述副作用如目前可獲得的ibd治療(即皮質(zhì)類固醇、腫瘤壞死因子α抑制劑)常見的顯著重量增加、全身性免疫抑制、類庫欣氏癥(cushingoid)外觀、骨質(zhì)減少/骨質(zhì)疏松或胰臟炎。也就是說，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)與不接受所述治療的其它類似個體相比，根據(jù)本發(fā)明治療的方法(其至少部分地通過影響lancl2在一些細(xì)胞中的表達(dá)和/或活化來提供治療作用)提供有益作用而不在所治療的個體中造成顯著重量增加(例如通過液體潴留)。

因而，本發(fā)明的方法可以提供減少炎癥的方法。所述方法可以全身性地(即，在整個個體身體中)或局部地(例如，在投藥位點或發(fā)炎性細(xì)胞位點處，包括(但不限于)t細(xì)胞和巨噬細(xì)胞處)減少炎癥。在根據(jù)本發(fā)明的方法治療或預(yù)防炎癥中，可以發(fā)現(xiàn)的一種作用是浸潤腸的血液單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的數(shù)目減少。另一種作用可以是調(diào)節(jié)性免疫細(xì)胞群體(如cd4⁺cd25⁺foxp3⁺調(diào)節(jié)性t細(xì)胞)增加，或淋巴細(xì)胞或巨噬細(xì)胞的調(diào)節(jié)特性增加(例如增加的白介素4(il-4)或il-10或減少的tnf-α和il-6)。另一種作用可以是減少發(fā)炎性基因和/或粘附分子的存在。因此，所述方法還可以被視為影響或改變化合物療法所投與個體的免疫反應(yīng)的方法。個體可能患有發(fā)炎性腸病或其中t細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)或細(xì)胞粘附分子的下調(diào)為所需結(jié)果的另一種病狀。

本發(fā)明還提供用本文所描述的化合物治療傳染性疾病的方法。此類傳染性疾病的非限制性實例包括病毒感染、細(xì)菌感染和真菌感染。

病毒感染的非限制性實例包括由尤其以下病毒感染：腺病毒科(adenoviridae)病毒，如腺病毒；皰疹病毒科(herpesviridae)病毒，如1型單純性皰疹、2型單純性皰疹、水痘-帶狀皰疹病毒、艾伯斯坦-巴爾病毒(epstein-barrvirus)、人類巨細(xì)胞病毒、人類皰疹病毒和8型；乳頭狀瘤病毒科(papillomaviridae)病毒，如人類乳突狀瘤病毒；多瘤病毒科(polyomaviridae)病毒，如bk病毒和jc病毒；痘病毒科(poxviridae)病毒，如天花；嗜肝dna病毒科(hepadnaviridae)病毒，如b型肝炎病毒；細(xì)小病毒科(parvoviridae)病毒，如人類博卡病毒和細(xì)小病毒b19；星狀病毒科(astroviridae)病毒，如人類星狀病毒；杯狀病毒科(caliciviridae)病毒，如諾沃克病毒(norwalkvirus)；小rna病毒科(picornaviridae)病毒，如柯薩奇病毒(coxsackievirus)、a型肝炎病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒和鼻病毒；冠狀病毒科(coronaviridae)病毒，如急性呼吸道綜合征病毒；黃病毒科(flaviviridae)病毒，如c型肝炎病毒、黃熱病病毒、登革熱病毒和西尼羅病毒；披膜病毒科(togaviridae)病毒，如風(fēng)疹病毒；肝炎病毒科(hepeviridae)病毒，如肝炎e病毒；逆轉(zhuǎn)錄病毒科(retroviridae)病毒，如人類免疫缺陷病毒(hiv)；正粘病毒科(orthomyxoviridae)病毒，如流感病毒；沙粒病毒科(arenaviridae)病毒，如瓜納里托病毒(guanaritovirus)、胡寧病毒(juninvirus)、拉沙熱病毒(lassavirus)、馬丘波病毒(machupovirus)和薩比亞病毒(sabiávirus)；布尼亞病毒科(bunyaviridae)病毒，如克里米亞-剛果出血熱病毒(crimean-congohemorrhagicfevervirus)；絲狀病毒科(filoviridae)病毒，如埃博拉病毒(ebolavirus)和馬堡病毒(marburgvirus)；副粘病毒科(paramyxoviridae)病毒，如麻疹病毒、腮腺炎病毒、副流感病毒、呼吸道合胞體病毒、人類間質(zhì)性肺炎病毒、亨德拉病毒(hendravirus)和尼帕病毒(nipahvirus)；彈狀病毒科(rhabdoviridae)病毒，如狂犬病病毒；未分配的病毒，如d型肝炎病毒；以及呼腸孤病毒科(reoviridae)病毒，如輪狀病毒、環(huán)狀病毒、科羅拉多蜱傳熱癥病毒(coltivirus)和版納病毒(bannavirus)。

細(xì)菌感染的非限制性實例包括由除以下細(xì)菌以外還由上文所描述的細(xì)菌感染：炭疽芽孢桿菌(bacillusanthracis)、蠟樣芽孢桿菌(bacilluscereus)、百日咳博德特菌(bordetellapertussis)、伯氏疏螺旋體(borreliaburgdorferi)、牛布魯氏菌(brucellaabortus)、犬布魯氏菌(brucellacanis)、羊布魯氏菌(brucellamelitensis)、豬布魯氏菌(brucellasuis)、空腸彎曲桿菌(campylobacterjejuni)、肺炎衣原體(chlamydiapneumoniae)、沙眼衣原體(chlamydiatrachomatis)、鸚鵡熱嗜衣體(chlamydophilapsittaci)、肉毒芽孢梭菌(clostridiumbotulinum)、艱難芽孢梭菌(clostridiumdifficile)、產(chǎn)氣莢膜芽胞梭菌(clostridiumperfringens)、破傷風(fēng)芽孢梭菌(clostridiumtetani)、白喉桿菌(corynebacteriumdiphtheriae)、糞腸球菌(enterococcusfaecalis)、屎腸球菌(enterococcusfaecium)、大腸桿菌、土拉弗朗西斯菌(francisellatularensis)、流感嗜血桿菌(haemophilusinfluenzae)、幽門螺旋桿菌(helicobacterpylori)、嗜肺性軍團(tuán)桿菌(legionellapneumophila)、鉤端螺旋體(leptospirainterrogans)、單核球增多性李斯特菌(listeriamonocytogenes)、麻風(fēng)分枝桿菌(mycobacteriumleprae)、結(jié)核分枝桿菌(mycobacteriumtuberculosis)、潰瘍分枝桿菌(mycobacteriumulcerans)、肺炎支原體(mycoplasmapneumoniae)、淋病奈瑟氏菌(neisseriagonorrhoeae)、腦膜炎奈瑟氏菌(neisseriameningitidis)、綠膿假單胞菌(pseudomonasaeruginosa)、立氏立克次體(rickettsiarickettsii)、傷寒沙門氏菌(salmonellatyphi)、傷寒沙門氏菌(salmonellatyphi)、鼠傷寒沙門氏菌(salmonellatyphimurium)、索氏志賀桿菌(sonneishigella)、金黃色葡萄球菌(staphylococcusaureus)、表皮葡萄球菌(staphylococcusepidermidis)、腐生葡萄球菌(staphylococcussaprophyticus)、無乳鏈球菌(streptococcusagalactiae)、肺炎鏈球菌(streptococcuspneumoniae)、釀膿鏈球菌(streptococcuspyogenes)、梅毒螺旋體(treponemapallidum)、霍亂弧菌(vibriocholerae)、鼠疫耶爾森菌(yersiniapestis)、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌(yersiniaenterocolitica)、假結(jié)核病耶爾森氏菌(yersiniapseudotuberculosis)以及來自上文所提及生物體的屬的其它物種。

真菌感染的非限制性實例包括用以下真菌感染：曲霉屬(aspergillus)真菌，如煙曲菌(aspergillusfumigatus)，其引起曲霉??；芽生菌屬(blastomyces)真菌，如皮炎芽生菌(blastomycesdermatitidis)，其引起芽生菌??；念珠菌屬(candida)真菌，如白色念珠菌(candidaalbicans)，其引起念珠菌??；球霉菌屬(coccidioides)真菌，其引起球霉菌病(河谷熱)；隱球菌屬(cryptococcus)真菌，如新型隱球菌(cryptococcusneoformans)和加特隱球菌(cryptococcusgattii)，其引起隱球菌?。黄つw癬菌(dermatophytes)真菌，其引起癬；引起真菌性角膜炎的真菌，如鐮孢菌(fusariumspecies)、曲霉(aspergillusspecies)和念珠菌(candidaspecies)；組織漿菌屬(histoplasma)真菌，如莢膜組織漿菌(histoplasmacapsulatum)，其引起組織漿菌??；毛霉目(mucorales)真菌，其引起毛霉??；酵母菌屬(saccharomyces)真菌，如釀酒酵母(saccharomycescerevisiae)；肺囊蟲屬(pneumocystis)真菌，如耶氏肺囊蟲(pneumocystisjirovecii)，其引起肺囊蟲肺炎；以及孢子絲菌屬(sporothrix)真菌，如申克孢子絲菌(sporothrixschenckii)，其引起孢子絲菌病。

本發(fā)明還提供用本文所描述的化合物治療自身免疫性發(fā)炎性疾病的方法。自身免疫性發(fā)炎性疾病的非限制性實例尤其包括發(fā)炎性腸病(ibd)、全身性狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、1型糖尿病、牛皮癬和多發(fā)性硬化癥。

本發(fā)明還提供用本文所描述的化合物治療慢性發(fā)炎性疾病的方法。慢性發(fā)炎性疾病的非限制性實例尤其包括代謝綜合征、肥胖、前驅(qū)糖尿病、心血管疾病和2型糖尿病。

本發(fā)明還提供用本文所描述的化合物治療糖尿病的方法，所述糖尿病包括1型糖尿病、2型糖尿病和其它類型的糖尿病。術(shù)語“糖尿病(diabetes/diabetesmellitus)”用于涵蓋個體具有高血糖(即，高血糖癥)的代謝病癥。高血糖病狀具有各種致病源，如胰臟不產(chǎn)生足夠胰島素，或細(xì)胞對所產(chǎn)生的胰島素?zé)o反應(yīng)。存在若干種公認(rèn)的糖尿病亞型。1型糖尿病的特征在于身體完全不能產(chǎn)生胰島素或身體不能產(chǎn)生足夠胰島素。2型糖尿病一般由胰島素抵抗產(chǎn)生，其為細(xì)胞不能正確使用胰島素的病狀。2型糖尿病有時與胰島素不足共呈現(xiàn)。當(dāng)先前未診斷有糖尿病的孕婦發(fā)展出高血糖癥時，出現(xiàn)妊娠期糖尿病。更不常見的糖尿病形式包括先天性糖尿病(歸因于與胰島素分泌相關(guān)的遺傳缺陷)、囊腫性纖維化相關(guān)糖尿病、由高劑量糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的類固醇糖尿病以及若干單基因性糖尿病形式(包括幼體的成熟期發(fā)作糖尿病)。單基因性糖尿病涵蓋由單一常染色體顯性基因中的突變造成的若干遺傳性糖尿病形式(與導(dǎo)致高血糖癥的更復(fù)雜的多基因性致病源對照)。

鑒于上文方法，應(yīng)顯而易見的是，本發(fā)明提供lancl2結(jié)合性化合物療法以用于接觸細(xì)胞，如處理個體細(xì)胞。上文的討論集中于本發(fā)明化合物的用途，其作為組合物的一部分用于一般可被視為藥學(xué)或醫(yī)學(xué)環(huán)境的情況。

如上文更詳細(xì)描述的，本發(fā)明中所描述的用于治療ibd、胃腸道炎癥和所描述其它病狀的化合物可以調(diào)配為藥學(xué)、營養(yǎng)組合物、功能性食品組合物或膳食輔劑。

不論是否明確描述，本文所描述的要素和方法步驟可以任何組合使用。

除非由進(jìn)行所提及組合的上下文另外指定或明確暗示相反，否則如本文所用的所有方法步驟組合可以以任何次序執(zhí)行。

如本文所用，除非內(nèi)容另外明確指示，否則單數(shù)形式“一(a/an)”和“所述(the)”包括多個參考物。

不論是否具體公開，如本文所用的數(shù)值范圍打算包括含于該范圍內(nèi)的每一數(shù)目和數(shù)目子集。此外，這些數(shù)值范圍應(yīng)解釋成為對該范圍中任何數(shù)目或數(shù)目子集的權(quán)利要求提供支持。舉例來說，1到10的公開內(nèi)容應(yīng)解釋為支持2到8、3到7、5到6、1到9、3.6到4.6、3.5到9.9等等的范圍。

本文所引用的所有專利、專利公開和同行審查的公開(即，“參考文獻(xiàn)”)通過引用明確地并入，其程度如同每一個別參考文獻(xiàn)具體并個別地指示為通過引用并入一樣。在本發(fā)明與所并入?yún)⒖嘉墨I(xiàn)沖突情況下，以本發(fā)明為準(zhǔn)。

應(yīng)理解，本發(fā)明不限制于本文所展示和描述的各部分的特定構(gòu)造和排列，但涵蓋其落入權(quán)利要求范圍內(nèi)的此類修改形式。

分子模型化實例

實例1：lancl2配位體結(jié)合的分子模型化

介紹

確立的lancl2促效劑，如脫落酸(aba)和nsc61610在介于從ibd到糖尿病和流感范圍內(nèi)的廣泛范圍疾病模型中發(fā)揮抗炎活性。lancl2作為新穎治療標(biāo)靶的價值值得努力發(fā)現(xiàn)和研發(fā)用于治療慢性代謝、免疫介導(dǎo)和傳染性疾病的新類別口服活性藥物。如在本實例中所討論，經(jīng)由反復(fù)地組合計算模型化與實驗驗證的合理藥物設(shè)計來研發(fā)其它lancl2促效劑。本實例展示增加合理藥物設(shè)計和醫(yī)藥化學(xué)工作以增加可溶性、增加與lancl2的結(jié)合、降低成本并理解lancl2蛋白質(zhì)自身的方法。

方法

lancl2結(jié)構(gòu)。lancl2的晶體結(jié)構(gòu)不存在。因此，為了理解lancl2的結(jié)構(gòu)和功能，使用lancl1晶體結(jié)構(gòu)作為模板執(zhí)行對人類lancl2的同源性模型化。評定模型品質(zhì)，并且經(jīng)由能量最小化程序來進(jìn)行改進(jìn)。同源性模型化經(jīng)由相對于蛋白質(zhì)家族中已經(jīng)以實驗方式解決結(jié)構(gòu)的其它成員鑒別其同源蛋白質(zhì)來預(yù)測蛋白質(zhì)的3d結(jié)構(gòu)[52]。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)具有大于35％序列一致性時，其很可能是同源的。lancl1與lancl2共用54％序列一致性[15]。

化合物產(chǎn)生和配位體結(jié)構(gòu)。產(chǎn)生lancl2促效劑結(jié)構(gòu)(圖1a和1b)。使用nih線上smiles變換器和轉(zhuǎn)換器(nih'sonlinesmilestranslatorandconverter)產(chǎn)生這些促效劑的smiles[53]。同時，產(chǎn)生并下載個別結(jié)構(gòu)的.pdb文件。使用autodocktools將pdb文件轉(zhuǎn)換成虛擬篩選必要的.pdbqt。

虛擬篩選。用autodocktools執(zhí)行所產(chǎn)生衍生物文件的對接。界定搜索空間，包括柵格方塊中心以及x、y和z維度。對接應(yīng)用于全蛋白標(biāo)靶，并且柵格覆蓋全部蛋白質(zhì)表面。柵格是普通立方體其中柵格點分隔開此柵格中心位于蛋白質(zhì)中間。這些維度和間距允許柵格覆蓋整個lancl2表面。遺傳算法用于隨機(jī)全局優(yōu)化。對每一化合物，由autodocktools產(chǎn)生一百個結(jié)合構(gòu)象。用的rmsd集群容限對每一衍生物的100個所得位姿進(jìn)行群集。

分析虛擬篩選結(jié)果。尋找使用autodockvina將每一化合物組裝到lancl2中的最佳方式得到對接記錄文件，其含有對接記錄，包括所有化合物的每一預(yù)測結(jié)合模式的結(jié)合能。結(jié)合能表示總分子間能量、總內(nèi)部能量和扭轉(zhuǎn)自由能的總和減去未結(jié)合系統(tǒng)的能量。通過能量最大負(fù)值對化合物進(jìn)行定級。第一集群中的最低結(jié)合能位姿被視為最有利對接位姿。較低結(jié)合自由能指示較穩(wěn)定的蛋白質(zhì)-配位體系統(tǒng)和在蛋白質(zhì)與配位體之間的較高親和力。通過使用人類疾病的小鼠模型進(jìn)行體外測試和臨床前研究來進(jìn)一步驗證示例性化合物。

結(jié)果

nsc61610對接概述。在圖2中給出nsc61610中具有最低能量位置能量的前五個集群的直方圖。nsc61610對‘中央裂隙(centralcleft)’具有極高親和力。代表總操作7％的前兩個集群各自針對此位點。歸因于兩埃(angstrom)容限，其它集群很可能針對此位點。接下來兩個集群針對接近藍(lán)色無規(guī)卷曲的‘變構(gòu)位點(allostericsite)’。

aba對接概述。在圖3中給出aba中具有最低能量位置能量的前五個集群的直方圖。aba對淡綠色螺旋和淡綠色無規(guī)卷曲之間的‘變構(gòu)’位點具有中度親和力但極高特異性。29％的操作針對此最前集群。第二集群也針對此位點。歸因于兩埃容限，其它集群很可能針對此位點。第四集群似乎處于‘中央裂隙’中。這使aba真正治療位點的問題仍需解答。

bt-11對接概述。在圖4中給出bt-11中具有最低能量位置能量的前五個集群的直方圖。bt-11的前兩個集群針對‘中央裂隙’，但僅代表2％的操作。然而，歸因于兩埃容限，其它集群很可能針對此位點。bt-11對此位點的親和力比nsc61610略小但大于aba。bt-11已經(jīng)展現(xiàn)治療效果(參見下文實例)。

bt-6對接概述。在圖5中給出bt-6中具有最低能量位置能量的前五個集群的直方圖。bt-6在所對接任何化合物中具有最高親和力。前兩個，可能前三個集群針對‘中央裂隙’。歸因于兩埃容限，其它集群很可能針對此位點。集群4針對沿著藍(lán)色無規(guī)卷曲的‘變構(gòu)’位點。

bt-15對接概述。在圖6中給出bt-15中具有最低能量位置能量的前五個集群的直方圖。bt-15不具有nsc61610或bt-11的結(jié)合親和力。雖然其的確似乎針對‘中央裂隙’，但此作用似乎不如nsc61610或bt-11明顯。

bt-aba-5a對接概述。在圖7中給出bt-aba-5a中具有最低能量位置能量的前五個集群的直方圖。bt-aba-5a的最高親和力處于未見于任何先前檢查的對接中的點處。然而，集群2和3代表絕大部分操作，為32％。集群2針對右后方的變構(gòu)位點。集群3針對aba的‘變構(gòu)’位點。集群4也針對此位點。歸因于兩埃容限，其它集群很可能針對此位點。

討論

aba和nsc61610發(fā)揮lancl2依賴性免疫調(diào)節(jié)、抗炎和抗糖尿病作用，然而，計算預(yù)測表明其在lancl2不同位點處結(jié)合。正如預(yù)期的，合理設(shè)計的配位體主要針對aba和nsc61610的初級結(jié)合位點。bt-aba化合物尺寸較小并且具有-cooh官能團(tuán)；這直觀表明其將針對親水性表面袋。bt化合物的疏水性大得多；因此，這直觀表明其將針對α-螺旋圍繞的更具疏水性的中央裂隙。

結(jié)合親和力與spr數(shù)據(jù)具有中度相關(guān)性(圖1a和1b；參見下文實例)。spr數(shù)據(jù)(與kd值)表明結(jié)合強度次序為nsc61610(2.3&6.3)、bt-11(6.3&7.7)、bt-15(11.4&21.4)、bt-6(18.2)。模型化數(shù)據(jù)(與最低be)表明結(jié)合強度次序為bt-6(-10.47)、nsc61610(-10.27)、bt-11(-9.39)、bt-15(-8.87)。除bt-6從最差翻轉(zhuǎn)為第一之外，spr數(shù)據(jù)和模型化數(shù)據(jù)表明相同的結(jié)合強度次序。分子模型化數(shù)據(jù)與合理藥物設(shè)計組合很可能得到對lancl2蛋白質(zhì)的更好理解，其將允許進(jìn)一步研發(fā)靶向lancl2路徑并使之活化以利用其強效抗糖尿病和抗炎特性的類似物。

醫(yī)藥化學(xué)實例

實例2：bt-11和鹽

如流程2-1中所示，使6-(1h-苯并咪唑-2-基)吡啶-2-甲酸(12g)于dmf(100ml)中的溶液冷卻到0℃，并且接著依序添加edc·hcl(1.5當(dāng)量)、hobt(1.5當(dāng)量)和dipea(1.2eq，以具有推測密度的體積取用)。在0℃下攪拌混合物10分鐘。添加哌嗪(0.5當(dāng)量)，并且使反應(yīng)混合物逐漸升溫到室溫并攪拌16小時。在反應(yīng)完成(通過tlc監(jiān)測，洗脫劑：含10％meoh的dcm)之后，將反應(yīng)混合物傾入冰冷水(約300ml)中，過濾所沉淀的固體，用冰冷水洗滌，并且干燥，得到呈淺棕色固體狀的bt-11(10g，75％)。¹hnmr(400mhz,dmso-d6),δ13.0(s,1h),12.8(s,1h),8.38(dd,2h),8.13(dt,2h),7.73(dd,2h),7.67(d,2h),7.57(dd,2h),7.25(m,4h),3.90(bs,2h),3.80(bdd,2h),3.65(bdd,2h),3.56(bs,2h)。lcms-es529.44[m+h]⁺,265.46[(m+2h)/2]⁺⁺。

流程2-1

如流程2-2中所示，使bt-11(1.0當(dāng)量)于最少量meoh(5ml)中的懸浮液冷卻到0℃，歷經(jīng)15-20分鐘的時段逐滴添加4m甲醇鹽酸(methanolichcl)(過量，15ml/1g)。使混合物逐漸升溫到室溫，持續(xù)3小時。在反應(yīng)完成(通過tlc監(jiān)測，洗脫劑：含10％meoh的ch2cl2)之后，在減壓下蒸發(fā)揮發(fā)物。用含10％meoh的ch2cl2洗滌粗物質(zhì)，并且凍干，得到灰白色固體(850mg，75％)。¹hnmr(400mhz,dmso-d6),δ8.58(dd,2h),8.29(dt,2h),7.83(m,6h),7.44(bd,4h),3.91(bs,2h),3.81(bm,2h),3.64(bm,2h),3.55(bs,2h)。lcms-es529.56[m+h]⁺。

流程2-2

實例3：bt-12

如流程3-1中所示，在0℃下用edc·hcl(1.5當(dāng)量)、hobt(1.5當(dāng)量)和dipea(1.2當(dāng)量，以具有推測密度的體積取用)和0.5當(dāng)量哌嗪處理6-(苯并噁唑-2-基)吡啶-2-甲酸(4.05g)于含10％dmf的ch2cl2中的溶液。使混合物升溫到室溫，持續(xù)16小時。形成淡棕色固體，并且在燒結(jié)玻璃漏斗中過濾，用水洗滌，并且凍干，得到淡棕色固體(3.2g)。¹hnmr(300mhz,cdcl3),δ8.45(dd,2h),8.05(m,2h),7.9(d,2h),7.8(dd,2h),7.6(dd,2h),7.4(m,2h),7.35(m,2h),4.0(bm,8h)。

流程3-1

實例4：bt-14和鹽

如流程4-1中所示，在0℃下用edc·hcl(1.5當(dāng)量)、hobt(1.5當(dāng)量)、dipea(3當(dāng)量)和哌嗪-1-甲酸叔丁酯(1.1當(dāng)量)處理6-(苯并噁唑-2-基)吡啶-2-甲酸(500mg)于dmf(10ml)中的溶液。使混合物升溫到室溫，持續(xù)16小時。在蒸發(fā)溶劑之后，將殘余物萃取到etoac中，并且用水洗滌。在真空下蒸發(fā)有機(jī)層，用戊烷洗滌的粗殘余物得到淡棕色固體(120mg，48％)。¹hnmr(400mhz,dmso-d6),δ8.4(d,1h),8.2(t,1h),7.9(t,2h),7.8(d,1h),7.5(dt,2h),3.7(bm,2h),3.5(bm,4h),3.4(bm,2h),1.4(s,9h)。lcms-es409.49[m+h]⁺,431.37[m+na]⁺,447.36[m+k]⁺。

流程4-1

如流程4-2中所示，在0℃下用甲醇鹽酸(6ml)處理來自流程4-1的所得化合物(200mg)。使混合物升溫到室溫，持續(xù)3小時。蒸發(fā)溶劑并用戊烷和乙醚洗滌，得到淡棕色固體(160mg，定量的)。¹hnmr(300mhz,dmso-d6),δ9.30(bs,2h),8.45(d,1h),8.25(t,1h),7.9(m,3h),7.5(五重峰,2h),3.7(bm,2h),3.5(bm,2h),3.3(bm,4h),1.4(s,9h)。lcms-es309.26[m+h]⁺。

流程4-2

如流程4-3中所示，用飽和nahco3水溶液中和來自流程4-2的所得鹽(25mg)，后接在凍干器中干燥，手頭得到20mg/96％bt-14。產(chǎn)率是90％。¹hnmr(300mhz,dmso-d6),δ8.4(d,1h),8.2(t,1h),7.90(t,2h),7.75(d,1h),7.5(五重峰,2h),3.95(bm,2h),3.8(bm,2h),3.3(bm,2h),3.2(bm,2h)；309.37lcms-es[m+h]⁺。

流程4-3

實例5：bt-15

如流程5-1中所示，在0℃下用edc·hcl(1.5當(dāng)量)、hobt(1.5當(dāng)量)、dipea(3當(dāng)量)和0.9當(dāng)量bt-14鹽酸鹽處理含6-(1h-苯并咪唑-2-基)吡啶-2-甲酸(50mg)的dmf(5ml)。使混合物升溫到室溫，持續(xù)16小時。經(jīng)燒結(jié)漏斗過濾，后接水洗滌，并且凍干以去除水分，得到20mgbt-15。¹h-nmr(400mhz,dmso-d⁶),δ12.93(d,1h),8.44(dd,1h),8.36(t,1h)8.25(t,1h),8.17(m,2h),7.87(m,3h),7.72(m,2h),7.54(m,2h),7.31(m,3h),3.90(s,2h),3.82(bm,2h),3.67(bm,2h),3.58(bm,2h)。lcms-es530.48[m+h]⁺,265.94[(m+2h)/2]⁺⁺。

流程5-1

bt-15已經(jīng)展示lancl2結(jié)合(圖1a)。其與lancl2的結(jié)合親和力預(yù)測值是-9.9，并且由spr確認(rèn)的親和力的kd值為21.4。

實例6：bt-13鹽

如流程6-1中所示，在0℃下用edc·hcl(1.5當(dāng)量)、hobt(1.5當(dāng)量)、dipea(3當(dāng)量)和哌嗪-1-甲酸叔丁酯(1.1當(dāng)量)處理含6-(1h-苯并咪唑-2-基)吡啶-2-甲酸(500mg)的dmf(10ml)。使混合物升溫到室溫，持續(xù)16小時。在將反應(yīng)混合物傾入冰冷水中之后，過濾沉淀，并且干燥，得到淺棕色固體(600mg，70％)。tlc(100％乙酸乙酯)。hnmr&lcmscomplies.(yield:70％).¹hnmr(300mhz,dmso-d6),δ12.90(s,1h),8.4(d,1h),8.15(t,1h),7.65(td,3h),7.25(五重峰,2h),3.7(bm,2h),3.5(bm,2h),3.3(bm,4h),1.4(s,9h)。lcms-es408.35[m+h]⁺。

流程6-1

如流程6-2中所示，在0℃下用甲醇鹽酸(6ml)處理來自流程6-1的所得化合物(600mg)持續(xù)3小時。使混合物逐漸升溫到室溫，持續(xù)3小時。蒸發(fā)過量甲醇鹽酸得到呈淡棕色固體狀的bt-13鹽酸鹽(500mg)。

流程6-2

實例7：bt-4和鹽

如流程7-1中所示，在0℃下用edc·hcl(1.5當(dāng)量)、hobt(1.5當(dāng)量)、dipea(1當(dāng)量)和0.5當(dāng)量哌嗪處理含3-(1h-苯并咪唑-2-基)苯甲酸(100mg)的dmf(6ml)。使混合物升溫到室溫，持續(xù)16小時。tlc(10％甲醇:dcm)展示形成非極性樣點并且不存在起始材料。在處理和用乙醚洗滌之后，分離出30mg/95％bt-4。¹hnmr(400mhz,dmso-d6),δ13.0(s,2h),8.3(bm,4h),7.75(bm,4h),7.60(bm,4h),7.2(bm,4h),3.65(bm,8h)。lcms-es527.36[m+h]⁺,264.50[(m+2h)/2]⁺⁺。

流程7-1

如流程7-2中所示，用含4mhcl的二噁烷處理30mg/95％bt-4，持續(xù)3小時。蒸發(fā)溶劑并且用乙醚洗滌，得到10mg/97％bt-4鹽酸鹽。¹hnmr(400mhz,dmso-d6),δ8.45(bm,4h),7.80(bm,8h),7.50(bm,4h),3.65(bm,8h)。lcms-es527.44[m+h]⁺,264.50[(m+2h)/2]⁺⁺。

流程7-2

實例8：bt-6和鹽

如流程8-1中所示，在0℃下用edc·hcl(1.5當(dāng)量)、hobt(1.5當(dāng)量)、dipea(1當(dāng)量)和苯-1,4-二胺(0.5當(dāng)量)處理含3-(1h-苯并咪唑-2-基)苯甲酸(100mg)的dmf(6ml)。使混合物升溫到室溫，持續(xù)16小時。tlc(10％甲醇:dcm)展示形成非極性樣點并且不存在起始材料。在處理和用乙醚洗滌之后，分離出淡棕色固體(60mg)。¹hnmr(300mhz,dmso-d6),δ13.1(s,2h),10.45(s,2h),8.75(s,2h),8.40(d,2h),8.05(d,2h),7.85(s,4h),7.70(t,4h),7.55(d,2h)7.25(五重峰,4h)。lcms-es549.0[m+h]⁺275.1[(m+2h)/2]⁺⁺。

流程8-1

如流程8-2中所示，用含4mhcl的二噁烷處理60mg/98％bt-6，持續(xù)3小時。在蒸發(fā)溶劑和用乙醚洗滌之后，得到50mg/96％bt-6鹽酸鹽。¹hnmr(300mhz,dmso-d6),δ10.60(s,2h),9.00(s,2h),8.55(d,2h),8.30(d,2h),7.90(s,4h),7.85m,6h),7.50(m,4h)。lcms-es549.3[m+h]⁺275.3[(m+2h)/2]⁺⁺。

流程8-2

實例9：bt-16和鹽

如流程9-1中所示，在0℃下用edc·hcl(1.5當(dāng)量)、hobt(1.5當(dāng)量)、dipea(3當(dāng)量)和苯-1,4-二胺(0.5當(dāng)量)處理含6-(1h-苯并咪唑-2-基)吡啶-2-甲酸(100mg)的dmf(10ml)。使混合物升溫到室溫，持續(xù)16小時。在將反應(yīng)混合物傾入冰冷水中之后，過濾沉淀，并且干燥，得到淺棕色固體(60mg)。

流程9-1

如流程9-2中所示，在0℃下用含hcl的二噁烷(3ml)處理化合物bt-16(50mg)。使混合物升溫到室溫，持續(xù)4小時。蒸發(fā)過量二噁烷鹽酸得到30mg棕色固體(30mg)。¹hnmr(300mhz,dmso-d6),δ11.00(s,2h),8.6(bm,2h),8.35(bm,4h),8.05(s,4h),7.85(bm,4h),7.40(bm,4h)。lcms-es551.84[m+h]⁺。

流程9-2

實例10：bt-3和鹽

如流程10-1中所示，在0℃下用edc·hcl(1.25當(dāng)量)、hobt(1.25當(dāng)量)、dipea(1當(dāng)量)和哌嗪(1當(dāng)量)處理含3-(2-苯并噁唑基)苯甲酸(50mg)的dmf(10ml)。使混合物升溫到室溫，持續(xù)16小時。在用冰冷水稀釋反應(yīng)混合物之后，扔掉所得固體，過濾，后接干燥，得到30mgbt-3。¹hnmr(300mhz,dmso-d6),δ8.2(bm,4h),7.8(bm,4h),7.7(bm,4h),7.45(bm,4h),3.6(bm,8h)。lcms-es529.32[m+h]⁺。

流程9-1

如流程10-2中所示，在0℃下在甲醇鹽酸(5ml)中處理bt-3(30mg)。使混合物升溫到室溫，持續(xù)4小時。在于真空下蒸發(fā)過量甲醇鹽酸之后，形成棕色固體(15mg)。

流程10-2

實例11：bt-5和鹽

如流程11-1中所示，在0℃下用edc·hcl(1.25當(dāng)量)、hobt(1.25當(dāng)量)、dipea(1當(dāng)量)和苯-1,4-二胺(0.5當(dāng)量)處理含3-(2-苯并噁唑基)苯甲酸(50mg)的dmf(10ml)。使混合物升溫到室溫，持續(xù)16小時。用冰冷水稀釋反應(yīng)混合物，扔掉固體，過濾，后接干燥，得到淡棕色固體(30mg)。¹hnmr(300mhz,tfa),δ9.2(bs,2h),8.8(bm,2h),8.6(bm,2h),7.9(bm,14h)。

流程11-1

如流程11-2中所示，在0℃下在鹽酸二噁烷(hcldioxane)(5ml)中處理35mgbt-5。使混合物升溫到室溫，持續(xù)4小時。在于真空下蒸發(fā)過量二噁烷之后，形成淡棕色固體(15mg)。¹hnmr(300mhz,tfa),δ9.3(bs,2h),8.8(bm,2h),8.6(bm,2h),7.9(bm,14h)。

流程11-2

實例12：bt-17和鹽

如流程12-1中所示，在0℃下用edc·hcl(1.5當(dāng)量)、hobt(1.5當(dāng)量)、dipea(1.2當(dāng)量)和苯-1,4-二胺(0.5當(dāng)量)處理含6-(苯并噁唑-2-基)吡啶-2-甲酸(100mg)發(fā)dmf(10ml)。使混合物升溫到室溫，持續(xù)16小時。用冰冷水稀釋反應(yīng)混合物，扔掉固體，過濾，后接干燥，得到淡棕色固體(70mg)。¹hnmr(400mhz,tfa),δ8.85(dd,4h),8.55(t,2h),8.1(bm,4h),7.95(m,4h),7.85(s,4h).lcms-es553.28[m+h]⁺。

流程12-1

如流程12-2中所示，在0℃到室溫下在二噁烷鹽酸(10ml)中處理bt-17(60mg)持續(xù)4小時。在通過使用凍干器蒸發(fā)溶劑之后，形成淡棕色固體(45mg)。¹hnmr(400mhz,tfa),δ8.90(bm,4h),8.6(bm,2h),8.0(bm,10h)。

流程12-2

實例13：bt-aba-25

在流程13-1中展示bt-aba-25的結(jié)構(gòu)。bt-aba-25是lancl2的配位體(圖1b)。其與lancl2的結(jié)合親和力預(yù)測值是-7.5，并且由spr確認(rèn)的親和力的kd值為1.77e-04。

流程13-1

實例14：bt-aba-5a

如流程14-1中所示，用氬氣使8-乙烯基-1,4-二氧雜螺[4.5]癸-8-醇(200mg，1當(dāng)量)和5-溴呋喃-2-甲酸甲酯(1.5當(dāng)量)于et3n(2ml)中的溶液脫氣10分鐘。接著，添加pd(oac)2(0.025當(dāng)量)、dppf(0.05當(dāng)量)，并且再次脫氣10分鐘。在100℃下加熱所得反應(yīng)混合物16小時。通過柱色譜法(etoax/己烷3:7)分離出淡棕色固體(130mg)。¹hnmr(400mhz,dmso-d6),δ7.30(d1h),6.60(d1h),6.45(dd,2h),4.75(s,1h),3.85(s,4h),3.80(s,3h),1.85(m,2h),1.65(m,2h),1.50(m,4h),lcms-es291.34[m+h]⁺。

流程14-1

如流程14-2中所示，向100mg流程14-1中所得化合物(化合物4)于thf:h2o:meoh(2:1:0.5ml)中的溶液中添加lioh(3當(dāng)量)，并且在室溫下攪拌混合物16小時。接著在減壓下濃縮混合物，并且使粗物質(zhì)溶解于最小量的水中，并且用2nhcl酸化直到ph4。用etoac萃取化合物，并且濃縮，得到淡棕色固體(54mg)，其不經(jīng)進(jìn)一步純化即用于接下來的反應(yīng)(流程14-3)。¹hnmr(400mhz,dmso-d6),δ7.50(d1h),6.60(d1h),6.45(dd,2h),4.75(s,1h),3.85(s,4h),3.80(s,3h),1.85(m,2h),1.65(m,2h),1.50(m,4h)。lcms-es277.26[m+h]⁺。

流程14-2

如流程14-3中所示，在0℃下在攪拌下向含化合物5(50mg)的thf中添加3nhcl(0.1ml)。使混合物升溫到室溫，持續(xù)6小時。tlc展示不存在sm和非極性樣點。在減壓下濃縮混合物，用水稀釋，用etoac萃取，并且再濃縮，得到棕色固體(20mg)。¹hnmr(400mhz,dmso-d6),δ13.00(bs1h),7.20(d1h),6.95(d1h),6.60(d1h),6.45(d,1h),6.10(t,1h),3.05(m,2h),2.65(t,2h),2.5,(2h)。lcms-es233.21[m+h]⁺lcms-es231.27[m-h]^-463.15[2m-h]^-。

流程14-3

實例15：bt-aba-6

如流程15-1中所示，用氬氣使8-乙烯基-1,4-二氧雜螺[4.5]癸-8-醇(500mg，1當(dāng)量)、3-碘苯甲酸乙酯(0.8當(dāng)量)和pph3(0.02當(dāng)量)于et3n(8ml)中的溶液脫氣10分鐘。接著，添加pd(oac)2(0.02當(dāng)量)，并且再次脫氣10分鐘。在95℃下加熱所得反應(yīng)混合物16小時。在處理之后，通過柱色譜法(etoac/己烷3:7)分離出淺棕色固體(500mg)。¹hnmr(400mhz,dmso-d6),δ7.95(s1h),7.80(d1h),7.71(d1h),7.47(t1h),6.65(d1h),6.49(d,1h),4.65(bs1h),4.32(q,2h),3.68(s,4h),1.99-1.68(m,4h),1.55-1.50(m,4h),1.33(t3h)。lcms-es315.38[m-17]⁺。

流程15-1

如流程15-2中所示，使化合物4(500mg)于thf/h2o/etoh(4:2:1，17.5ml)中的溶液冷卻到0℃；添加lioh(2.5當(dāng)量)，并且在歷經(jīng)16小時上升到室溫的同時攪拌混合物。在減壓下濃縮混合物，并且使粗物質(zhì)溶解于最小量的水中，并且用1nhcl酸化直到ph3-4。通過柱色譜法(etoac/己烷1:1)純化得到淺黃色固體(220mg)。¹hnmr(400mhz,dmso-d6),δ13.00(bs1h),7.95(s1h),7.78(d1h),7.67(d1h),7.44(t1h),6.64(d1h),6.48(d,1h),4.65(s1h),3.86(s,4h),1.87-1.61(m,4h),1.55-1.50(m,4h)。lcms-es287.34[m-17]⁺。

流程15-2

如流程15-3中所示，在0℃下在攪拌下向100mg化合物5(100mg)與thf中的混合物中添加2nhcl(1.5ml)。使混合物升溫到室溫，持續(xù)6小時。接著在減壓下濃縮溶液，用水稀釋，用etoac萃取，并且再濃縮，得到淺黃色固體(20mg)。¹hnmr(400mhz,dmso-d6),δ13.00(bs1h),8.00(s,1h),7.80(d1h),7.65(d1h),7.45(t1h),6.75(d1h),6.45(d,1h),6.10(t,1h),5.15(s1h),2.65(m,2h),2.15(m,2h),1.90(m,4h),lcms-es259.37[m-h]^-519.48[2m-h]^-。

流程15-3

實例16：bt-aba-13

如流程16-1中所示，在0℃下在攪拌下向化合物2(2.5g，1當(dāng)量)于ch2cl2(50ml)中的溶液中添加二氫哌喃(1.3當(dāng)量)和tsoh(0.1當(dāng)量)。使所得溶液逐漸升溫到室溫，持續(xù)14小時。通過柱色譜法(etoac/己烷1:9)分離出淺黃色液體。所述化合物不經(jīng)進(jìn)一步純化即用于下一步驟中。

流程16-1

如流程16-2中所示，向et3n中添加化合物3(2.5g，1.0當(dāng)量)、4,4,5,5-四甲基-[1,3,2]二氧雜硼戊烷(1.2當(dāng)量)和雙(環(huán)戊二烯基)氫氯化鋯(0.15當(dāng)量)在60℃-70℃下加熱所得反應(yīng)混合物16小時。用己烷稀釋反應(yīng)混合物。通過經(jīng)短硅膠墊過濾和用己烷洗滌來去除沉淀。在濃縮己烷溶液后，獲得無色油狀液體(1.3g)。¹hnmr(400mhz,cdcl3),δ6.60(d1h),5.60(d1h),6.35(d,1h),4.75(s,1h),3.85(s,3h),2.80(m,2h),2.35(m,2h),2.05(m,4h)。

流程16-2

如流程16-3中所示，用氬氣使化合物4(550mg，1.1當(dāng)量)、6-溴吡啶甲酸甲酯(1.0當(dāng)量)、k2co3(2.0當(dāng)量)于dme/h2o9:1混合物(8ml)中的溶液脫氣10分鐘。接著，添加pd[(p(ph)3]4(0.04當(dāng)量)。在100℃下加熱所得反應(yīng)混合物16小時。濃縮反應(yīng)溶液，后接柱色譜法(etoac/己烷1:3)，得到淺黃色固體(230mg)。lcms-es404.39[m+h]⁺,302.26[m-101]⁺。

流程16-4

如流程16-5中所示，向化合物5(230mg，1.0當(dāng)量)于丙酮/h2o1:1(6ml)中的溶液中添加tsoh(0.1當(dāng)量)。在室溫下攪拌所得反應(yīng)混合物16小時。濃縮反應(yīng)混合物，后接柱色譜法(etoac/己烷7:3)，得到淺黃色液體(110mg)。¹hnmr(400mhz,cdcl3),δ8.00(d1h),7.80(t,1h),7.50(d,1h),6.90(m2h),4.00(s,3h),2.80(m,2h),2.35(m,2h),2.10(m,4h),lcms-es276.38[m+h]⁺。

流程16-5

如流程16-6中所示，在攪拌下向化合物6(75mg)于0℃thf/h2o3:1(3ml)中的溶液中添加lioh(2.5當(dāng)量)。使混合物升溫到室溫，持續(xù)6小時。用檸檬酸使反應(yīng)混合物酸化，并且用thf和etoac的混合物萃取。濃縮有機(jī)溶液得到灰白色固體(10mg)。¹hnmr(300mhz,dmso-d6),δ13.05(bs,1h),7.90(m,2h),7.65(d,1h),7.05(d,1h),6.80(d,1h),5.20(s,1h),2.65(m,2h),2.20(bd2h),2.10-1.90(m,4h),lcms-es262.27[m+h]⁺。

流程16-6

實例17：bt-aba-16

如流程17-1中所示，用氬氣使化合物4(437mg，1.2當(dāng)量)、2-溴異煙堿酸甲酯(1.0當(dāng)量)、k2co3(2.0當(dāng)量)于dme/h2o9:1混合物(8ml)中的溶液脫氣10分鐘。接著，添加pd[(p(ph)3]4(0.04當(dāng)量)。在90℃下加熱所得反應(yīng)混合物12小時。濃縮反應(yīng)溶液，后接柱色譜法(etoac/己烷1:3)，得到淺黃色液體(300mg)。¹hnmr(300mhz,cdcl3),δ8.70(d,1h),7.85(s,1h),7.65(d,1h),6.85(d,1h),6.65(d,1h),4.70(m,1h),3.95(m,4h),2.20-1.40(m,16h),lcms-es404.54[m+h]⁺,302.53[m-101]⁺。

流程17-1

如流程17-2中所示，向5(300mg，1.0當(dāng)量)于丙酮/h2o1:1(6ml)中的溶液中添加tsoh(0.1當(dāng)量)。在室溫下攪拌所得反應(yīng)混合物48小時。濃縮反應(yīng)混合物，后接柱色譜法(etoac/己烷7:3)，得到灰白色固體(160mg)。¹hnmr(300mhz,dmso-d6),δ8.70(d,1h),7.85(s,1h),7.65(d,1h),7.05(d,1h),6.85(d,1h),5.20(s,1h),3.90(s,3h),2.65(td,2h),2.15(bd,2h),2.00(m,2h),1.85(m,2h),lcms-es276.22[m+h]⁺。

流程17-2

如流程17-3中所示，在0℃下在攪拌下向化合物6(100mg)于thf/h2o3:1(3ml)中的溶液中添加lioh(2.5當(dāng)量)。使混合物升溫到室溫，持續(xù)16小時。用檸檬酸使反應(yīng)混合物酸化，并且用thf和etoac的混合物萃取。在減壓下濃縮得到灰白色固體(20mg)。¹hnmr(300mhz,dmso-d6),δ13.60(bs,1h),8.70(d,1h),7.85(s,1h),7.60(d,1h),7.00(d,1h),6.85(d,1h),5.20(s,1h),2.65(m,2h),2.20-1.80(m,6h),lcms-es262.28[m+h]⁺。

流程17-3

實例18：bt-aba-14

如流程18-1中所示，用氬氣使化合物4(300mg，1.2當(dāng)量)、4-溴吡啶甲酸甲酯(1.0當(dāng)量)、k2co3(2.0當(dāng)量)于dme/h2o9:1混合物(8ml)中的溶液脫氣10分鐘。接著，添加pd[(p(ph)3]4(0.04當(dāng)量)。在90℃下加熱所得反應(yīng)混合物12小時。濃縮反應(yīng)溶液，后接柱色譜法(etoac/己烷1:3)，得到淺黃色液體(200mg)。¹hnmr(300mhz,cdcl3),δ8.50(d,1h),8.20(bs,1h),7.45(d,1h),6.70(d,1h),6.50(d,1h),4.60(m,1h),3.95(m,4h),2.20-1.40(m,16h),lcms-es390.35[m+h]⁺。

流程18-1

如流程18-2中所示，向5(200mg，1.0當(dāng)量)于丙酮/h2o1:1(6ml)中的溶液中添加tsoh(0.1當(dāng)量)。在室溫下攪拌所得反應(yīng)混合物48小時。用檸檬酸使反應(yīng)混合物酸化，并且用thf和etoac的混合物萃取。濃縮溶液，得到灰白色固體(18mg)。¹hnmr(300mhz,dmso-d6),δ8.60(d,1h),8.05(s,1h),7.60(d,1h),6.90(d,1h),6.70(d,1h),5.20(bs,1h),2.65(m,2h),2.15(bd,2h),2.05-1.80(m,4h),lcms-es262.27[m+h]⁺。

受體結(jié)合實例

實例19：lancl2結(jié)合實例

組合計算模型化研究和生化驗證以引導(dǎo)對結(jié)合于lancl2的化合物的選擇。表面等離子共振(spr)技術(shù)的最新迭代提供實時測定在無標(biāo)記蛋白質(zhì)與小分子(>25da)之間分子相互作用的體外、高處理量定量手段。biacore^tmt200(新澤西州皮斯卡塔韋的通用電氣醫(yī)療集團(tuán)(gehealthcare,piscataway,nj))技術(shù)進(jìn)一步提供gmp/glp順應(yīng)性以及在小于24小時時段中篩選或詳細(xì)滴定的自發(fā)大規(guī)模數(shù)據(jù)采集的附加益處。所關(guān)注分子相互作用通過biacore^tmt200spr技術(shù)常規(guī)地驗證。

方法

經(jīng)由lancl2-化合物相互作用分子模型化的高處理量篩選。auto-docvina[14]是能夠進(jìn)行高處理量并行計算以確定lancl2-植物化合物結(jié)合的目前先進(jìn)技術(shù)軟件套件。軟件套件首先計算(i)與結(jié)合復(fù)合物相關(guān)聯(lián)的自由能的力，并且隨后計算(ii)可供用于在標(biāo)靶與配位體之間復(fù)合物形成的構(gòu)象空間。這些方法本質(zhì)上是隨機(jī)，因此需要重復(fù)獨立篩選以詳盡地搜索所有參數(shù)空間并提供預(yù)測可信度。目前，lancl2模型可經(jīng)由lancl1的同源性模型化獲得[15]。autodock和autogrid的圖形前端autodocktools用于界定搜索空間，包括柵格方塊中心以及x、y、z維度[16]。autodockvina對每一化合物產(chǎn)生五種結(jié)合構(gòu)象。對接應(yīng)用于全蛋白標(biāo)靶，其中柵格覆蓋全部蛋白質(zhì)表面。產(chǎn)生對接記錄文件，其由對所有化合物對所有表面的每一預(yù)測結(jié)合模式的結(jié)合能組成。

lancl2-小分子相互作用的動力學(xué)測定。biacore^tmt200用于測定小分子bt-11、bt-aba-5a、bt-6和bt-15(被分析物)與lancl2(配位體)結(jié)合發(fā)動力學(xué)參數(shù)。以劑量依賴性(5-8個滴定點)方式一式三份地產(chǎn)生數(shù)據(jù)，并且加以分析以確定結(jié)合模型(朗格繆爾(langmuir)、構(gòu)象偏移等)、實時締合與解離常數(shù)以及平衡解離常數(shù)。spr技術(shù)允許驗證特異性lancl2-植物化學(xué)成分相互作用以及增加對結(jié)合機(jī)制和速率的金標(biāo)準(zhǔn)深刻理解。實驗通過由胺偶合共價附接lancl2在羧基甲基聚葡萄糖(cm5)傳感器芯片上執(zhí)行。以10μl/min用0.1mn-羥基琥珀酰亞胺(nhs)和0.5m1-乙基-3-(-3-二甲氨基丙基)-碳化二亞胺鹽酸鹽(edc)的1:1混合物使傳感器晶片的流動池1和2活化持續(xù)720秒。將儲備液lancl2(0.41mg/ml)在10mm乙酸鈉(ph5.0)中稀釋到8.2μg/ml(1:50稀釋度)，并且以10μl/min流動速率注射到活化流動池2表面上持續(xù)1000秒。在于流動池2上捕獲lancl2(11000ru)之后，通過以10μl/min注射1m乙醇胺持續(xù)720秒來使流動池1和2的表面失活。操作緩沖液是含有0.05％t-20和0.15mnacl的25mmmops，ph6.5。動力學(xué)研究通過一式三份注射不同濃度的bt-11(25μm、12.5μm、6.25μm、3.13μm、1.56μm和0.76μm)、bt-aba-5a(40μm、20μm、10μm、5μm、2.5μm和1.25μm)以及bt-15/bt-6(20μm、10μm、5μm、2.5μm、1.25μm、0.625μm和0.313μm)來執(zhí)行。每一樣品注射60秒(接觸時間)，后接流動速率為100μl/min的60秒解離時間。在下一次注射之前使用180秒穩(wěn)定化時間。用biacore^tmt200評估軟件(版本1)分析數(shù)據(jù)以使用1:1結(jié)合模型確定親和力結(jié)合常數(shù)(kd)。

結(jié)果

bt-11和bt-15兩者強結(jié)合于lancl2。為了確認(rèn)bt-11和bt-15與lancl2蛋白質(zhì)的結(jié)合，我們在biacore^tmt-200儀器中執(zhí)行spr分析。用于檢測分子相互作用的光學(xué)技術(shù)spr用于測量lancl2與其配位體(即，bt-11和bt-15)之間的結(jié)合親和力。我們將經(jīng)過純化的重組lancl2蛋白質(zhì)固定在biacore^tm傳感器芯片上，并且使用儀器微流體系統(tǒng)將小分子注射到蛋白質(zhì)表面上。測量芯片表面上的總質(zhì)量的變化，其對應(yīng)于與蛋白質(zhì)的小結(jié)合。通過注射一系列小分子濃度，我們能夠計算bt-11結(jié)合于lancl2和bt-15結(jié)合于lancl2的穩(wěn)態(tài)結(jié)合親和力。結(jié)合傳感圖展示典型小分子蛋白質(zhì)相互作用，其具有極快締合速率和極快解離速率(圖8，圖a和c)。這些快速相互作用超出儀器的技術(shù)能力。因此，未確定可靠締合速率常數(shù)(ka)和解離速率常數(shù)(kd)。平衡解離常數(shù)(kd)常用以描述配位體與蛋白質(zhì)之間的親和力，如配位體結(jié)合于特定蛋白質(zhì)的緊密程度。配位體-蛋白質(zhì)親和力受兩個分子之間的非共價分子間相互作用影響，所述相互作用如氫鍵結(jié)、靜電相互作用、疏水力和范德華力。通過針對化合物濃度繪制平衡結(jié)合水平，我們能夠測量每一相互作用的穩(wěn)態(tài)親和力(kd)(圖8，圖b和d)。兩個小分子都展示對lancl2的類似結(jié)合親和力(bt-11：7.7um，bt-1511.4um)。

bt-aba-5a和bt-6強結(jié)合于lancl2。與上文所描述的結(jié)果類似并且為了確認(rèn)bt-6和bt-aba-5a與lancl2的結(jié)合，我們在biacore^tmt-200儀器中執(zhí)行spr分析。在此情況下，我們也將經(jīng)過純化的重組lancl2蛋白質(zhì)固定在biacore^tm傳感器芯片上，并且使用儀器微流體系統(tǒng)將小分子注射到蛋白質(zhì)表面上。測量芯片表面上的總質(zhì)量的變化，其對應(yīng)于與蛋白質(zhì)的小結(jié)合。更仔細(xì)查看結(jié)合傳感圖(圖9a和9b)，與極快締合并極快解離的bt-11/bt-15相比，我們的結(jié)果展示bt-6和bt-aba-5a如何極快結(jié)合但不以同樣速率解離。值得注意的是，bt-aba-5a的占有時間展示最慢的解離速率，意味著bt-aba-5a在lancl2結(jié)合袋中保持時間最長。此更長結(jié)合可以通過觸發(fā)更有效的抗炎和抗糖尿病和其它治療反應(yīng)來潛在地影響lancl2路徑的活化。

已經(jīng)由spr測試其它化合物，并且結(jié)果可理解地展示于圖1a和1b中。

實驗研究實例

實例20：bt-11對ibd急性模型的用途

介紹

發(fā)炎性腸病(ibd)是胃腸道的慢性復(fù)發(fā)疾病，其在美國困擾超過一百四十萬人。ibd包含兩種不同表現(xiàn)：潰瘍性結(jié)腸炎和克羅恩氏病。目前針對ibd的療法是適度成功的，并且對于長期控制所述疾病具有明顯不利的副作用[17]?？肆_恩氏病代表疾病的慢性期，而急性潰瘍性結(jié)腸炎(uc)表現(xiàn)為影響結(jié)腸組織的早期病理學(xué)。uc是胃腸道的慢性特發(fā)性發(fā)炎性病癥，其特征在于以連續(xù)方式近端延伸穿過結(jié)腸達(dá)到不同程度的直腸中的粘膜炎癥。病癥的特征在于不同嚴(yán)重性的復(fù)發(fā)和緩解歷程。大多數(shù)患者呈現(xiàn)輕度到中度嚴(yán)重性的左側(cè)或遠(yuǎn)端疾病。大部分在維持性藥物治療的情況下保持緩解持續(xù)長時段。然而，自然史研究表明，介于10％與40％之間的患者將在其疾病歷程期間的某一點時經(jīng)歷結(jié)腸切除術(shù)。

類固醇難治性嚴(yán)重uc的藥物治療近年來已在某種程度上擴(kuò)張，其中可獲得環(huán)孢菌素(ciclosporin)和英利昔單抗(infliximab)作為急救劑；然而手術(shù)仍保持為僅有的“治愈性”選項。本發(fā)明提供一種用于治療uc的新穎藥品，所述治療通過靶向稱為lancl2的新穎受體來進(jìn)行。我們的最優(yōu)化合物bt-11經(jīng)口投與并全身性分布，并且在uc中通過靶向腸道免疫細(xì)胞中的lancl2來發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。我們在小鼠中急性uc中的臨床前功效研究展示用bt-11投藥如何降低疾病活動性指數(shù)并且改善腸道炎癥，所述降低和改善通過顯著地減少腸道粘膜中的白細(xì)胞浸潤以及減少粘膜增厚和上皮細(xì)胞侵蝕來進(jìn)行?；虮磉_(dá)分析確認(rèn)，在小鼠中的急性dss誘導(dǎo)潰瘍性結(jié)腸炎模型中，經(jīng)口投與bt-11上調(diào)il-10和lancl2表達(dá)，并且下調(diào)tnfαmrna表達(dá)。

方法

小鼠。c57bl/6購自jacksonlaboratory，并且在特定無病原體條件下收容于通風(fēng)架中。lancl2-/-小鼠購自加利福尼亞大學(xué)戴維斯分校(universityofcaliforniadavis)的komp儲存庫。所有小鼠維持在動物設(shè)施中。所有實驗方案都由機(jī)構(gòu)動物照護(hù)與使用委員會(institutionalanimalcareandusecommittee)批準(zhǔn)，并且符合或超出美國國家衛(wèi)生研究院(nationalinstitutesofhealth)實驗室動物福利和公共衛(wèi)生服務(wù)辦公室(officeoflaboratoryanimalwelfareandpublichealthservicepolicy)政策的指導(dǎo)原則。

dss誘導(dǎo)結(jié)腸炎。在c57bl/6j小鼠中通過投與向飲用水中添加的5％(w/v)葡聚糖硫酸鈉(dss；分子量42kda；俄亥俄州奧羅拉(aurora,oh)的icnbiochemicals)來誘導(dǎo)結(jié)腸炎。在dss處理之后7天時評定結(jié)腸炎癥。dss項目中的群組由以下組成：i.非dss并且媒劑處理的小鼠，ⅱ.非dss并且bt-11(80mg/kg)處理的小鼠，ⅲ.dss處理并且媒劑處理的小鼠，和iv.dss處理并且bt-11(80mg/kg)處理的小鼠。在每一群組中包括十二只小鼠。

組織病理學(xué)。將來自小鼠中ibd研究的結(jié)腸切片固定在10％緩沖中性福爾馬林中，稍后嵌入于石蠟中，并且接著切片(5μm)并用h&e染色劑染色以用于組織學(xué)檢查。用混合組織學(xué)評分對結(jié)腸進(jìn)行分級，包括(1)白細(xì)胞浸潤、(2)粘膜增厚和(3)上皮細(xì)胞侵蝕的程度。對先前類別中的每一個，用0-4的評分對切片進(jìn)行分級，并且分析數(shù)據(jù)作為歸一化的混合評分。

定量實時pcr。根據(jù)制造商說明書使用rneasyplus迷你試劑盒(加利福尼亞州巴倫西亞(valencia,ca)的qiagen)從小鼠結(jié)腸分離出總rna。總rna(1μg)用于使用iscript^tmcdna合成試劑盒(加利福尼亞州埃庫萊斯(hercules)的bio-rad)來產(chǎn)生cdna模板?？偡磻?yīng)體積是20μl，其中在mjmini^tm熱循環(huán)儀(bio-rad)中如下培育反應(yīng)物：在25℃下5分鐘，在52℃下30分鐘，在85℃下5分鐘，并且保持在4℃下。使用taqdna聚合酶(加利福尼亞州卡爾斯巴德(carlsbad)的lifetechnologies)對cdna執(zhí)行pcr。用minelutepcr純化試劑盒(qiagen)來純化每一基因擴(kuò)增子，并且在瓊脂糖凝膠上通過使用dna質(zhì)量序列梯(威斯康星州麥迪遜的普洛麥格公司(promega,madison,wi))和使用納米滴(nanodrop)來量化。這些經(jīng)過純化的擴(kuò)增子用于在實時pcr分析中對實時pcr條件進(jìn)行優(yōu)化和產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線。使用oligo6軟件設(shè)計引物。對于每一引物集合，使用系統(tǒng)梯度方案對引物濃度和粘接溫度進(jìn)行優(yōu)化以用于icycleriq^tm系統(tǒng)(bio-rad)在優(yōu)化期間并且還在樣品dna實時pcr期間，對每一引物集合維持pcr效率介于92％與105％之間并且相關(guān)系數(shù)>0.98。通過實時qpcr使用icycleriq^tm系統(tǒng)和iq^tm綠色超級混合物(greensupermix)(bio-rad)來檢查所關(guān)注基因的cdna濃度。使用經(jīng)過純化的擴(kuò)增子以5pgcdna起始的10倍稀釋液產(chǎn)生每一基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并且稍后用以計算未知樣品中標(biāo)靶cdna的起始量。綠色i是一般雙鏈dna插入染料，并且因此除所關(guān)注擴(kuò)增子以外還可以檢測非特異性產(chǎn)物和引物/二聚體。為了確定在實時pcr期間合成的產(chǎn)物數(shù)目，對每一產(chǎn)物執(zhí)行熔融曲線分析。實時pcr用于在同一96孔板上測量每一未知cdna樣品中核酸的起始量。

統(tǒng)計分析。使用anova后接雪費多重比較法(scheffe'smultiplecomparisonmethod)來分析參數(shù)數(shù)據(jù)。通過使用曼-惠特尼u測試(mann-whitney'sutest)后接鄧恩多重比較測試(dunn'smultiplecomparisonstest)來分析非參數(shù)數(shù)據(jù)。通過使用sas版本6.0.3(sasinstitute)的一般線性模型程序來執(zhí)行anova。以p≤0.05評定統(tǒng)計顯著性。

結(jié)果

bt-11改善結(jié)腸炎dss模型中的疾病和組織病理學(xué)。本研究的目標(biāo)是調(diào)查投與bt-11是否在ibd的情形下使lancl2活化并發(fā)揮抗炎特性。為了評定我們的示例性化合物bt-11在ibd急性模型中的功效，我們在7天攻擊中用5％dss處理c57bl/6j小鼠。在整個攻擊時段中，用bt-11處理顯著地改善疾病活動性評分(圖10，圖a)。此外，在通過在攻擊后第7天使用bt-11使lancl2路徑活化后，脾臟(圖10，圖b)、mln(圖10，圖c)和結(jié)腸(圖10，圖d)中的宏觀病變也顯著地減少。

bt-11在患有急性發(fā)炎性結(jié)腸炎的小鼠中以劑量反應(yīng)方式改善結(jié)腸組織病理學(xué)。我們接下來檢查bt-11對組織病理學(xué)結(jié)腸發(fā)炎性病變的作用。與我們對疾病活動性和總病變的觀察一致的是，基于對白細(xì)胞浸潤(圖11，圖g)、上皮細(xì)胞侵蝕(圖11，圖h)，粘膜增厚(圖11，圖i)的評定，組織病理學(xué)分析確認(rèn)用bt-11處理使腸道粘膜中的炎癥顯著地減少5倍。代表性結(jié)腸顯微圖展示在小鼠中dss誘導(dǎo)結(jié)腸炎期間用bt-11處理如何顯著地改善腸道粘膜狀態(tài)以及若干免疫子組的浸潤，所述改善通過改善上皮細(xì)胞完整性和減少腸道架構(gòu)的破壞來進(jìn)行(圖11，圖a-f)。我們用bt-11執(zhí)行劑量反應(yīng)研究，并且我們有趣地觀察到隨著bt-11的劑量從10增加到80mg/kg，結(jié)腸炎癥的三個標(biāo)志(白細(xì)胞浸潤、粘膜增厚和上皮細(xì)胞侵蝕)如何在患有結(jié)腸炎的小鼠中減少(圖12，圖a-c)。

用bt-11口服處理減少tnfα表達(dá)并上調(diào)lancl2和il-10。為了更仔細(xì)調(diào)查bt-11對免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)的作用，我們評定il-10、lancl2和tnfα的遺傳表達(dá)。結(jié)果展示用bt-11處理如何下調(diào)腫瘤壞死因子α(tnfα)的表達(dá)(圖13，圖a)以及上調(diào)白介素10(il-10)(圖13，圖b)和lancl2受體(圖13，圖c)的水平，因此產(chǎn)生促進(jìn)抗炎性作用并且下調(diào)由tnfα驅(qū)動的發(fā)炎性反應(yīng)的正反饋回路(positivefeedbackloop)通過執(zhí)行劑量反應(yīng)研究，我們可以假設(shè)，當(dāng)通過流式細(xì)胞測量術(shù)評定的結(jié)腸il-10表達(dá)在用bt-11的劑量反應(yīng)動力學(xué)之后進(jìn)行時，我們的配位體bt-11和lancl2路徑的后續(xù)活化直接增加結(jié)腸il-10的產(chǎn)生(圖14，圖b)。我們觀察到，結(jié)腸tnfα表達(dá)性細(xì)胞的減少在40與80mg/kgbt-11兩種情況下明顯不同，但在較低劑量(如10或20mg/kg)情況下并非如此(圖14，圖a)我們還觀察到mln中的foxp3表達(dá)如何具有劑量依賴性(圖14，圖c)。

bt-11在急性結(jié)腸炎期間的作用依賴于lancl2。為了展現(xiàn)在小鼠中急性結(jié)腸炎期間如何發(fā)揮用bt-11投藥的有益作用，我們執(zhí)行比較野生型和lancl2基因剔除(lancl2-/-)小鼠中此類作用的研究。我們的結(jié)果展現(xiàn)，由于lancl2損失阻止小鼠從急性dss誘導(dǎo)結(jié)腸炎恢復(fù)，故lancl2對于bt-11發(fā)揮其抗炎益處是必要的(圖15，圖a)。同樣，當(dāng)比較野生型和lancl2-/-同窩幼畜時，lancl2的損失消除結(jié)腸(圖15，圖b)、mln(圖15，圖c)和脾臟(圖15，圖d)中的宏觀評分降低。此外，由于我們評定用媒劑或bt-11處理的lancl2-/-小鼠中的組織病理學(xué)分析，并且我們觀察到lancl2損失如何完全消除bt-11作用，故bt-11在結(jié)腸粘膜中病變形成中的作用也具有l(wèi)ancl2依賴性(圖16)。

為了進(jìn)一步表征在用bt-11處理后的細(xì)胞反應(yīng)，我們執(zhí)行進(jìn)一步lancl2基因剔除研究以確定促炎性蛋白質(zhì)的減少和抗炎性因子的增加是否得到削弱。我們的流式細(xì)胞測量術(shù)結(jié)果展現(xiàn)，促炎性因子mcp1的減少在結(jié)腸(圖17，圖a)和mln(圖17，圖b)中具有l(wèi)ancl2依賴性，這是因為lancl2基因的損失消除bt-11作用。我們還發(fā)現(xiàn)結(jié)腸中的tnfα分泌具有l(wèi)ancl2依賴性(圖17，圖c)，以及mhc-ii+cd11c+粒細(xì)胞群體的上調(diào)具有l(wèi)ancl2依賴性(圖17，圖d)。與這些結(jié)果一致的是，我們發(fā)現(xiàn)il-10分泌在bt-11處理之后的上調(diào)在lancl2基因剔除小鼠中結(jié)腸(圖17，圖e)和脾臟(圖17，圖f)中完全消除，再次展示我們的最優(yōu)化合物與我們所關(guān)注的標(biāo)靶的依賴性。

討論

lancl2已經(jīng)作為用于發(fā)炎和免疫介導(dǎo)疾病的新穎治療標(biāo)靶出現(xiàn)[18]。我們的體內(nèi)結(jié)果首次展現(xiàn)，用lancl2配位體bt-11口服治療通過遏制炎癥改善ibd小鼠模型中的腸道免疫病理學(xué)。lancl2作為潛在治療標(biāo)靶最近已收到一些關(guān)注，這歸因于其與aba結(jié)合和信號傳導(dǎo)相關(guān)的功能[19]和最近發(fā)現(xiàn)的基于替代性膜的pparγ活化機(jī)制[8]。此外，我們測定一系列小鼠組織中的lancl2表達(dá)，其展示除大腦和睪丸之外，lancl2也在其它組織中表達(dá)，如胸腺、脾臟、結(jié)腸和派伊爾集合淋巴結(jié)(peyer'spatches)，其指示lancl2與免疫反應(yīng)之間的可能關(guān)聯(lián)并且表明lancl2作為治療標(biāo)靶的更廣潛能。

先前，我們已經(jīng)報告aba在體外使pparγ轉(zhuǎn)活化(transactivate)，并且與其它pparγ促效劑類似遏制全身性炎癥。因為aba和nsc61610都靶向lancl2，所以nsc61610也可以經(jīng)由pparγ活化起作用。實驗結(jié)果展示，nsc61610處理使原始巨噬細(xì)胞中的pparγ活化，由此提供lancl2與pparγ之間潛在信號傳導(dǎo)關(guān)聯(lián)的證據(jù)并且指示nsc61610可能體外靶向lancl2-pparγ軸。為了調(diào)查lancl2在nsc61610介導(dǎo)的pparγ活化中的重要性，我們測定通過使用sirna剔除原始巨噬細(xì)胞中的lancl2是否削弱或消除nsc61610對pparγ報告子活性的作用。我們的發(fā)現(xiàn)指示剔除lancl2顯著地減弱nsc61610對pparγ活性的作用[12]。在此實例中，我們展現(xiàn)投與bt-11如何發(fā)揮抗炎特性，所述發(fā)揮通過不僅降低疾病活動性指數(shù)評分以及脾臟、mln和結(jié)腸中的宏觀評分(圖10)而且還顯著地減少組織病理學(xué)病變(圖11)來進(jìn)行。我們展現(xiàn)此兩種具體作用如何依賴于lancl2(圖15和圖16)。我們還展現(xiàn)bt-11降低tnfa水平并且上調(diào)lancl2和il-10(圖13)。我們還展現(xiàn)，由于我們未在lancl2-/-小鼠中觀察到這些趨勢，故此處效果具有l(wèi)ancl2依賴性(圖17)。這些結(jié)果確認(rèn)，lancl2是用于發(fā)炎性疾病的新穎治療標(biāo)靶，并且bt-11是靶向其的化合物。

實例21：bt-11對克羅恩氏病慢性模型的用途

介紹

如上文所陳述，發(fā)炎性腸病(ibd)與其兩種臨床表現(xiàn)潰瘍性結(jié)腸炎和克羅恩氏病是免疫介導(dǎo)的疾病，其特征在于胃腸道的廣泛炎癥和免疫細(xì)胞浸潤。ibd病源學(xué)是多因素的，并且引起遺傳傾向性、環(huán)境因素和腸道微生物叢當(dāng)中的相互作用。

本實例將集中于慢性ibd表現(xiàn)：克羅恩氏病。潰瘍性結(jié)腸炎中炎癥的特征在于涉及表層粘膜和粘膜下層但限于結(jié)腸的連續(xù)模式，而在克羅恩氏病中，此炎癥是具有透壁性并且不連續(xù)的，并且超出最受影響的回腸，腸道的任何區(qū)都可能受影響?？肆_恩氏病致病機(jī)制是復(fù)雜的，并且受到遺傳和環(huán)境因素以及由粘膜免疫系統(tǒng)長期活化引起的對腸道粘膜的免疫介導(dǎo)損傷影響。

目標(biāo)為下調(diào)免疫和發(fā)炎性反應(yīng)的治療，如皮質(zhì)類固醇潑尼松(prednisone)或抗腫瘤壞死因子-α抗體(賓夕法尼亞州霍舍姆(horsham,pa)的janssenbiotech,inc.)(英利昔單抗)已經(jīng)展示降低疾病嚴(yán)重性和減少其復(fù)發(fā)的前景。然而，這些治療也與各種不利副作用相關(guān)聯(lián)，如類庫欣氏癥外觀、重量增加和全身性免疫抑制，因此迫切需要研發(fā)用于長期控制ibd的安全替代方案[20]。

本發(fā)明提供一種用于治療克羅恩氏病的新穎藥品，所述治療通過靶向稱為lancl2的新穎受體來進(jìn)行。示例性化合物bt-11經(jīng)口投與并全身性分布，并且不僅在uc中而且還在克羅恩氏病中通過靶向腸道免疫細(xì)胞中的lancl2來發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。我們在小鼠中克羅恩氏病慢性模型中的臨床前功效研究展示用bt-11投藥如何降低疾病活動性指數(shù)并且改善腸道炎癥，所述降低和改善通過顯著地減少腸道粘膜中的白細(xì)胞浸潤以及減少粘膜增厚和上皮細(xì)胞侵蝕來進(jìn)行?；虮磉_(dá)分析確認(rèn)，在小鼠中的ibd慢性模型中，經(jīng)口投與bt-11上調(diào)lancl2表達(dá)，并且下調(diào)tnfαmrna表達(dá)。此外，投與bt-11減少進(jìn)入結(jié)腸固有層中的促炎性巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞浸潤，以及在結(jié)腸中上調(diào)foxp3-表達(dá)性cd4+t細(xì)胞并下調(diào)效應(yīng)th1細(xì)胞的數(shù)目。我們還執(zhí)行基因剔除研究以確認(rèn)這些效果具有l(wèi)ancl2依賴性。最后，在誘導(dǎo)位點中，bt-11能夠下調(diào)th17細(xì)胞的產(chǎn)生以及經(jīng)由上調(diào)foxp3表達(dá)來上調(diào)調(diào)節(jié)性cd4+t細(xì)胞隔室。

方法

小鼠。c57bl/6和il-10基因剔除小鼠購自jacksonlaboratory，并且在特定無病原體條件下收容于通風(fēng)架中。lancl2-/-小鼠購自加利福尼亞大學(xué)戴維斯分校的komp儲存庫。所有小鼠維持在動物設(shè)施中。所有實驗方案都由機(jī)構(gòu)動物照護(hù)與使用委員會批準(zhǔn)，并且符合或超出美國國家衛(wèi)生研究院實驗室動物福利和公共衛(wèi)生服務(wù)辦公室政策的指導(dǎo)原則。

cd4+t細(xì)胞富集和分選。使用i-mag細(xì)胞分離系統(tǒng)(bdpharmingen)通過磁性負(fù)分選使獲自c57bl/6j(野生型)小鼠的脾細(xì)胞富含cd4+t細(xì)胞。將細(xì)胞與生物素標(biāo)記的ab混合物一起培育，后接與抗生蛋白鏈菌素粒子一起二次培育，并且暴露于磁鐵以去除不合需要的細(xì)胞。富含cd4+的細(xì)胞懸浮液的純度在93％與96％之間。富含cd4+的細(xì)胞用于過繼轉(zhuǎn)移，或通過facs進(jìn)一步純化。對于facs分選，用cd45rb、cd4和cd25標(biāo)記細(xì)胞，并且在facsaria^tm細(xì)胞分選儀(加利福尼亞州圣何塞(sanjose)的bdbiosciences)中將其分離成cd4+cd45rbhighcd25-細(xì)胞(即，效應(yīng)t細(xì)胞)。facs分選的cd4+子組的純度≥98％。

過繼轉(zhuǎn)移。向六周齡scid和rag2-/-小鼠腹膜內(nèi)(i.p.)投與4×10⁵個來自c57bl/6j(野生型)或lancl2-/-小鼠的cd4+cd45rbhighcd25-。每周對小鼠進(jìn)行稱重，并且每日記錄疾病臨床征象，持續(xù)14周。殺死發(fā)展出嚴(yán)重消耗病跡象的小鼠。否則，在轉(zhuǎn)移之后90天時殺死小鼠。用于過繼轉(zhuǎn)移研究的群組如下：i.非轉(zhuǎn)移并且媒劑處理，ⅱ.非轉(zhuǎn)移并且bt-11(80mg/kg)處理，ⅲ.轉(zhuǎn)移并且媒劑處理，iv.轉(zhuǎn)移并且bt-11(80mg/kg)處理。在每一群組中使用12只小鼠。

組織病理學(xué)。將來自小鼠中ibd研究的結(jié)腸切片固定在10％緩沖中性福爾馬林中，稍后嵌入于石蠟中，并且接著切片(5μm)并用h&e染色劑染色以用于組織學(xué)檢查。用混合組織學(xué)評分對結(jié)腸進(jìn)行分級，包括(1)白細(xì)胞浸潤、(2)粘膜增厚和(3)上皮細(xì)胞侵蝕的程度。對先前類別中的每一個，用0-4的評分對切片進(jìn)行分級，并且分析數(shù)據(jù)作為歸一化的混合評分。

細(xì)胞分離。切除脾臟和腸系膜淋巴結(jié)(mln)，并且使用兩個無菌顯微鏡載玻片的磨砂末端在1×pbs/5％fbs中壓碎。使單一細(xì)胞懸浮液以300×g離心10分鐘，并且用1×pbs洗滌一次。在洗滌步驟之前通過滲透溶解來去除紅細(xì)胞。將所有細(xì)胞小球再懸浮于facs緩沖液(補充有5％fbs和0.09％疊氮化鈉的1×pbs)中，并且對其進(jìn)行流式細(xì)胞測量分析。并行地，切除結(jié)腸，并且分離固有層白細(xì)胞(lpl)。在cmf(1×hbss/10％fbs/25mmhepes)中洗滌組織片，并且在37℃下在攪拌的同時用cmf/5mmedta培育組織兩次，每次15分鐘。在用1×pbs洗滌之后，在37℃下在攪拌的同時在補充有300u/mlviii型膠原蛋白酶和50u/mldna酶i(兩者都是西格瑪-奧德里奇公司(sigma-aldrich))的cmf中使組織進(jìn)一步消化1.5小時。在過濾上清液之后，在1×pbs中洗滌細(xì)胞一次，使小球再懸浮于facs緩沖液中，并且對其進(jìn)行流式細(xì)胞測量分析。

通過流式細(xì)胞測量術(shù)進(jìn)行的免疫表型和細(xì)胞因子分析。對于免疫細(xì)胞子組的熒光染色，將4-6×10⁵個細(xì)胞與以下熒光染料結(jié)合原代小鼠特異性抗體一起培育20分鐘：抗cd3pe-cy5克隆株145-2c11(加利福尼亞州圣地亞哥(sandiego)的ebioscience)、抗cd4pe-cy7克隆株gk1.5(ebioscience)、抗cd4apc克隆株rm4-5和抗cd25生物素克隆株7d4(bdbiosciences)。用facs緩沖液(補充有5％fbs和0.09％疊氮化鈉的1×pbs)洗滌細(xì)胞。對于轉(zhuǎn)錄因子和細(xì)胞因子的細(xì)胞內(nèi)染色，使用商業(yè)試劑盒根據(jù)制造商說明書(ebioscience)固定細(xì)胞并對其進(jìn)行滲透。簡言之，固定細(xì)胞對其進(jìn)行滲透20分鐘，用小鼠抗cd16/cd32fcblock(bdbiosciences)阻斷fc受體，并且用針對以下的熒光染料結(jié)合抗體對細(xì)胞進(jìn)行染色：抗小鼠foxp3fitc克隆株fjk-16s、抗小鼠rorγ(t)pe、克隆株b2b和抗小鼠il17-aapc克隆株ebio17b7(ebioscience)。將所有樣品在暗處固定儲存在4℃下，直到在facsaria流式細(xì)胞儀(bdbiosciences)上采集為止。將活細(xì)胞門控(fsc-a、ssc-a)應(yīng)用于所有樣品，后接單一細(xì)胞門控(fsc-h、fsc-w)，隨后用于細(xì)胞的特定標(biāo)記物表達(dá)。用facsdiva^tm(bdbiosciences)和flowjo(treestarinc)執(zhí)行數(shù)據(jù)分析。

定量實時pcr。根據(jù)制造商說明書使用rneasyplus迷你試劑盒(qiagen)從小鼠結(jié)腸分離出總rna。總rna(1μg)用于使用iscript^tmcdna合成試劑盒(bio-rad)來產(chǎn)生cdna模板?？偡磻?yīng)體積是20μl，其中在mjmini^tm熱循環(huán)儀(bio-rad)中如下培育反應(yīng)物：在25℃下5分鐘，在52℃下30分鐘，在85℃下5分鐘，并且保持在4℃下。使用taqdna聚合酶(invitrogen)對cdna執(zhí)行pcr。用minelutepcr純化試劑盒(qiagen)來純化每一基因擴(kuò)增子，并且在瓊脂糖凝膠上通過使用dna質(zhì)量序列梯(普洛麥格公司)和使用納米滴來量化。這些經(jīng)過純化的擴(kuò)增子用于在實時pcr分析中對實時pcr條件進(jìn)行優(yōu)化和產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線。使用oligo6軟件設(shè)計引物。對于每一引物集合，使用系統(tǒng)梯度方案對引物濃度和粘接溫度進(jìn)行優(yōu)化以用于icycleriq^tm系統(tǒng)(bio-rad)在優(yōu)化期間并且還在樣品dna實時pcr期間，對每一引物集合維持pcr效率介于92％與105％之間并且相關(guān)系數(shù)>0.98。通過實時qpcr使用icycleriq^tm系統(tǒng)和iq^tm綠色超級混合物(bio-rad)來檢查所關(guān)注基因的cdna濃度。使用經(jīng)過純化的擴(kuò)增子以5pgcdna起始的10倍稀釋液產(chǎn)生每一基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并且稍后用以計算未知樣品中標(biāo)靶cdna的起始量。綠色i是一般雙鏈dna插入染料，并且因此除所關(guān)注擴(kuò)增子以外還可以檢測非特異性產(chǎn)物和引物/二聚體。為了確定在實時pcr期間合成的產(chǎn)物數(shù)目，對每一產(chǎn)物執(zhí)行熔融曲線分析。實時pcr用于在同一96孔板上測量每一未知cdna樣品中核酸的起始量。

統(tǒng)計分析。使用anova后接雪費多重比較法來分析參數(shù)數(shù)據(jù)。通過使用曼-惠特尼u測試后接鄧恩多重比較測試來分析非參數(shù)數(shù)據(jù)。通過使用sas版本6.0.3(sasinstitute)的一般線性模型程序來執(zhí)行anova。以p≤0.05評定統(tǒng)計顯著性。

結(jié)果

bt-11改善ibd慢性il-10-/-模型中的疾病活動性。鑒于已知il-10遏制許多促炎性細(xì)胞因子的分泌[21]，研究克羅恩氏病慢性的多種動物研究已經(jīng)采用白介素-10缺陷型小鼠(il-10-/-)小鼠模型。為了不僅在結(jié)腸炎急性模型中而且還在慢性模型中評定bt-11的功效，我們設(shè)置結(jié)腸炎il-10剔除式小鼠模型研究并且用增加劑量的bt-11(20、40和80mg/kg)處理所述小鼠。在經(jīng)過處理的小鼠中，與其媒劑處理的同窩幼畜相比，用bt-11處理顯著地降低疾病活動性指數(shù)評分(圖18)。此外，與在第13周開始并且直到實驗結(jié)束為止用20或40mg/kgbt-11化合物處理的那些小鼠相比，用最高劑量bt-11(80mg/kg)處理的小鼠顯著地降低評分。

bt-11在ibd的il10-/-慢性模型中減少脾臟、mln和結(jié)腸中的宏觀病變。為了最初測定臨床功效，我們在用bt-11處理和后續(xù)lancl2路徑活化之后評定宏觀組織病變。在研究開始之后19周時，我們在安樂死和組織收集之后立刻對脾臟(圖19，圖a)、mln(圖19，圖b)和結(jié)腸(圖19，圖c)進(jìn)行宏觀評分。用低到20mg/kg濃度的bt-11處理極大并顯著地降低三種組織中的宏觀評分，展現(xiàn)其強效功效。

bt-11改善ibd的il-10-/-慢性模型中的組織病理學(xué)病變和炎癥。為了評定腸道粘膜中的組織病理學(xué)病變和一般病理學(xué)，用h&e對結(jié)腸切片進(jìn)行染色，并且在顯微鏡下觀察。我們的結(jié)果基于白細(xì)胞浸潤(圖20，圖a)、上皮細(xì)胞侵蝕(圖20，圖b)和粘膜增厚(圖20，圖c)的減少展示用bt-11處理如何顯著地減少炎癥。我們還觀察到與粘膜增厚相關(guān)的腸道粘膜中浸潤量的劑量依賴性機(jī)制。

用bt-11處理在結(jié)腸固有層、脾臟和mln中誘導(dǎo)強效抗炎性反應(yīng)并減少促炎性子組。為了測定bt-11對免疫細(xì)胞子組的作用，我們表型地表征從結(jié)腸、脾臟和mln分離的細(xì)胞。我們的分析指示bt-11顯著地降低結(jié)腸固有層中促炎性f4/80+巨噬細(xì)胞(圖21，圖a)、mhc-ii+cd11c+樹突狀細(xì)胞(圖21，圖b)和效應(yīng)th1細(xì)胞(圖21，圖d)的百分比。此外，bt-11經(jīng)由上調(diào)結(jié)腸lp中的foxp3表達(dá)性cd4+t細(xì)胞來發(fā)揮抗炎特性(圖21，圖c)。

也在mln(圖22，圖b)和脾臟(圖22，圖c)中注意到foxp3表達(dá)性cd4+t細(xì)胞的上調(diào)，也展示和展現(xiàn)bt-11如何具有全身性作用。也在脾臟中以劑量反應(yīng)方式觀察到促炎性th1細(xì)胞的下調(diào)(圖22，圖d)。最后，由其rorγt表達(dá)表征的效應(yīng)th17細(xì)胞在mln中下調(diào)(圖22，圖a)。

此外，基因表達(dá)分析確認(rèn)用bt-11處理上調(diào)結(jié)腸lancl2表達(dá)(圖23，圖a)并且下調(diào)tnfα表達(dá)(圖23，圖b)。這些表達(dá)作用對所投與bt-11的量具有劑量依賴性。

bt-11展現(xiàn)ibd結(jié)腸炎模型的cd4+t細(xì)胞誘導(dǎo)中的疾病活動性的改善。為了進(jìn)一步驗證bt-11在另一種ibd慢性模型中的功效，我們將來自野生型和lancl2-/-小鼠的未經(jīng)處理的cd4+t細(xì)胞過繼轉(zhuǎn)移到rag2-/-接受體中?；趯嶒炘O(shè)計用媒劑或bt-11處理rag2-/-小鼠。在經(jīng)過處理的小鼠中，當(dāng)與其野生型同窩幼畜相比時，用我們的最優(yōu)化合物bt-11處理顯著地降低疾病活動性指數(shù)評分(圖24)。我們發(fā)現(xiàn)由于bt-11的作用在lancl2損失的情況下完全消除，故這些結(jié)果具有l(wèi)ancl2依賴性(圖25)。

有趣地，當(dāng)與在7周開始直到實驗結(jié)束為止用媒劑處理的小鼠相比時，bt-11處理的小鼠中的重量損失得到明顯改善(圖26)。

bt-11在ibd過繼轉(zhuǎn)移慢性模型中減少脾臟、mln和結(jié)腸中的宏觀病變。為了在慢性結(jié)腸炎第二模型中確認(rèn)臨床功效，我們在用bt-11處理和后續(xù)lancl2路徑活化之后在用野生型或lancl2-/-細(xì)胞過繼轉(zhuǎn)移并用媒劑或bt-11處理的小鼠中評定宏觀組織病變。在研究開始之后11周時，我們在安樂死和組織收集之后立刻對脾臟(圖27，圖a)、mln(圖27，圖b)和結(jié)腸(圖27，圖c)和回腸(圖27，圖d)進(jìn)行宏觀評分。用80mg/kg濃度的bt-11處理極大并顯著地降低四種組織中的宏觀評分，展現(xiàn)其強效功效。我們發(fā)現(xiàn)這些觀察結(jié)果具有l(wèi)ancl2依賴性，以及l(fā)ancl2損失完全消除bt-11的作用(圖28)。

bt-11還在慢性結(jié)腸炎過繼轉(zhuǎn)移模型中改善組織病理學(xué)病變和炎癥。與il-10-/-誘導(dǎo)的結(jié)腸炎實驗類似并且為了用ibd第二小鼠模型確認(rèn)腸道粘膜中的組織病理學(xué)病變和一般病理學(xué)，用h&e對結(jié)腸切片進(jìn)行染色，并且在顯微鏡下觀察。我們的結(jié)果基于結(jié)腸和回腸中的白細(xì)胞浸潤(圖29，圖a和b)和粘膜增厚(圖29，圖e和f)的減少確認(rèn)用bt-11處理如何顯著地減少炎癥。值得注意的是，回腸的上皮細(xì)胞侵蝕受影響較小(圖29，圖d)，但發(fā)現(xiàn)結(jié)腸中的侵蝕在用我們的最優(yōu)化合物bt-11處理的小鼠中明顯較低(圖29，圖c)。為了確認(rèn)bt-11對lancl2的依賴性，我們執(zhí)行過繼轉(zhuǎn)移研究，并且轉(zhuǎn)移來自lancl2-/-供體的cd4+t細(xì)胞。我們的結(jié)果展示白細(xì)胞浸潤、上皮細(xì)胞侵蝕和粘膜增厚的減少在lancl2-/-轉(zhuǎn)移的接受體中如何得到極大消除(圖30)。

bt-11在小鼠中不斷地誘導(dǎo)極大的抗炎性反應(yīng)并且下調(diào)促炎性介體。為了表征用bt-11對比媒劑處理的小鼠中的免疫細(xì)胞概況，我們在從結(jié)腸、脾臟和腸系膜淋巴結(jié)分離的細(xì)胞中執(zhí)行流式細(xì)胞測量術(shù)分析。我們確認(rèn)在ibd第二慢性小鼠模型中，用bt-11處理持續(xù)11周時段的接受體小鼠在結(jié)腸中具有明顯較低的浸潤性f4/80+cd11b+促炎性巨噬細(xì)胞水平(圖31，圖a)，以及基于對總cd45+白細(xì)胞所進(jìn)行分析的ifnγ水平降低(圖31，圖b)。此外，用bt-11處理不斷地通過促進(jìn)局部炎癥位點(在此情況下，結(jié)腸粘膜)處foxp3(圖31，圖c)和強效抗炎性細(xì)胞因子il-10(圖31，圖d)的表達(dá)來上調(diào)調(diào)節(jié)性cd4+t細(xì)胞。

與在結(jié)腸固有層細(xì)胞中所觀察到的概況類似，我們表征誘導(dǎo)位點(如脾臟和mln)中的這些群體。免疫表型結(jié)果展示用bt-11處理也如何增加誘導(dǎo)位點(如脾臟和mln)中foxp3和il-10水平(圖32，圖a、b、d和e)。值得注意的是，bt-11處理在mln和脾臟兩者中降低cd45+群體中ifnγ的表達(dá)(圖32，圖c和f)。

靶向lancl2的bt-11的作用不依賴于pparγ?；谖覀兊膶嶒灲Y(jié)果，lancl2的活化使過多的最終調(diào)節(jié)基于il-10的抗炎性反應(yīng)的路徑活化，所述抗炎性反應(yīng)在系統(tǒng)水平中調(diào)節(jié)炎癥。一種活化的lancl2下游路徑是pparγ路徑。為了幫助克服此核因子和轉(zhuǎn)錄因子二級活化的潛在毒理學(xué)問題，我們也用來自pparγ-/-供體的cd4+t細(xì)胞轉(zhuǎn)移rag2-/-小鼠。我們接著用媒劑或80mg/kg的bt-11處理這些小鼠。我們的結(jié)果明確展現(xiàn)，bt-11經(jīng)由lancl2活化對疾病活動性和組織病理學(xué)的有益作用以pparγ非依賴性方式進(jìn)行(圖33，圖a-d)。這些結(jié)果展現(xiàn)，lancl2的活化也對調(diào)節(jié)lancl2活化抗炎作用的其它路徑進(jìn)行調(diào)節(jié)。

討論

目前針對發(fā)炎性腸病(ibd)的療法是適度成功的，并且對于長期控制所述疾病具有明顯不利的副作用[17]。植物化合物脫落酸(aba)在結(jié)腸炎小鼠模型中發(fā)揮強效抗炎作用[22，23]。羊毛硫氨酸合成酶組分c樣蛋白質(zhì)2(lancl2)是用于aba結(jié)合和信號傳導(dǎo)的標(biāo)靶[15，19，24]。因此，lancl2已經(jīng)作為針對炎癥的有前景的新穎治療標(biāo)靶出現(xiàn)[18]?；衔?1610(雙(苯并咪唑基)對苯二甲酰苯胺，btt)鑒別為在具有數(shù)百萬化學(xué)品的文庫中以最高親和力結(jié)合于lancl2。另外，61610在腸道炎癥小鼠模型中發(fā)揮強效抗炎作用[25]。產(chǎn)生20個61610源性btt的專題文庫，并且bt-11鑒別為最優(yōu)示例性化合物。bt-11結(jié)合于lancl2，具有口服活性，已經(jīng)在3種結(jié)腸炎小鼠模型中展現(xiàn)抗炎性功效和突出的安全概況。

根據(jù)美國克羅恩氏病和結(jié)腸炎基金會，ibd在北美困擾超過1百萬人并且在世界范圍困擾4百萬人。此分布廣泛并引起衰弱的病導(dǎo)致生活品質(zhì)降低和大量衛(wèi)生保健相關(guān)成本[26]。在美國，用于治療ibd單次發(fā)作的平均醫(yī)學(xué)費用超過每患者$55,000[27]，并且總費用超出每年$150億。另外，間接費用包括治療反復(fù)性胰臟炎[28]或其它ibd并發(fā)癥的成本，所述并發(fā)癥如膿腫、腸梗阻、貧血、血栓癥、肛周病變、關(guān)節(jié)炎、葡萄膜炎、虹膜炎或皮膚病變[29]。ibd為患者帶來大量負(fù)擔(dān)，常常使其與社會隔絕，影響家庭關(guān)系并且限制其專業(yè)機(jī)會[17]。在此方面，ibd患者不參與勞動力的比率較高；此高比率隨時間持續(xù)[30]。另外，腸炎癥(潰瘍性結(jié)腸炎(uc)和克羅恩氏病(cd))尤其在早齡期(年齡<30歲)增加發(fā)展出結(jié)腸癌的風(fēng)險[31]。根據(jù)全球行業(yè)分析公司的新報告，預(yù)期全球ibd治療劑市場到2015為止達(dá)到$43億。

盡管目前用于ibd的治療已經(jīng)改進(jìn)[17，32]，但其對于慢性控制疾病僅是適度成功的并且導(dǎo)致明顯副作用，包括免疫系統(tǒng)進(jìn)行針對病原體或惡性病的保護(hù)性免疫反應(yīng)的能力減弱。用于患者的治療選項包括解決炎癥癥狀。當(dāng)今市場上所用的大多數(shù)藥理學(xué)治療包括氨基水楊酸鹽、皮質(zhì)類固醇、免疫調(diào)節(jié)劑、抗生素、生物制劑(抗腫瘤壞死因子-α抗體)。氨基水楊酸鹽極其有效并且一般耐受良好。然而，具有復(fù)發(fā)或更中度疾病的患者可能需要更積極的治療，其包括短期劑量的皮質(zhì)類固醇持續(xù)較短時段以控制癥狀。此類型的快速起作用的療法無法得到長時段耐受。為了維持病狀，免疫調(diào)節(jié)劑也常用于cd和uc中，但其具有較慢起始作用時間(對于完全作用，3到6個月)。這些藥劑具有潛在地明顯不利副作用，介于從胰臟炎到糖尿病到有疤痕肝臟和發(fā)炎肺范圍內(nèi)。對于未能用其它療法的控制的中度到重度疾病病例，將對患者使用抗tnf-α，其以受控設(shè)定每6-8周靜脈內(nèi)給予。此極其昂貴療法盡管有效，但由于投藥需要熟練技術(shù)人員和臨床環(huán)境而難以使用。此外，存在明顯副作用，如庫欣氏綜合征、躁癥、失眠、高血壓、高血糖、骨質(zhì)疏松、惡性病、感染以及長骨無血管壞死。

示例性化合物bt-11已經(jīng)展示極其安全的毒理學(xué)概況。我們在ibd慢性模型中的功效數(shù)據(jù)展示bt-11處理如何在兩個慢性ibd模型中改善疾病活動性評分(圖18和24)以及體重?fù)p失(圖26)。我們的數(shù)據(jù)展現(xiàn)這些效果如何具有l(wèi)ancl2依賴性(圖25)我們的功效數(shù)據(jù)也展現(xiàn)通過bt-11的lancl2路徑活化促進(jìn)主要由以下表征的抗炎性反應(yīng)：il-10產(chǎn)生性和foxp3表達(dá)性cd4+t細(xì)胞(圖21、22、31和32)以及發(fā)炎性巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和促炎性因子(如ifnγ)的顯著減少(圖22、23、31和32)。此外，基因表達(dá)分析通過展示用bt-11處理如何降低結(jié)腸中的tnfα水平(圖23)來確認(rèn)這些基于細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)。所有這些發(fā)現(xiàn)在一起在兩個慢性ibd模型中在白細(xì)胞浸潤、上皮細(xì)胞侵蝕和粘膜增厚方面造成結(jié)腸粘膜中劇烈的lancl2依賴性改善(圖20、29和30)。我們也已經(jīng)展現(xiàn)，bt-11在結(jié)合于lancl2后的作用是pparγ非依賴性的(圖33)。這些結(jié)果確認(rèn)lancl2的活化使過多的下游活化子活化，所述活化子經(jīng)由pparγ非依賴性機(jī)制調(diào)節(jié)炎癥。在一起，這些結(jié)果強有力地支持以下事實：lancl2是用于發(fā)炎性疾病的新穎治療標(biāo)靶，并且bt-11適用作新藥物。

實例22：bt-11治療1型糖尿病(t1d)的用途

介紹

糖尿病(diabetesmellitus，dm)(也簡單稱為糖尿病(diabetes))是在長期時間段存在高血糖水平的一組代謝疾病。兩種類型的糖尿病被稱作1型和2型。這些病狀以前的名稱是胰島素依賴性和非胰島素依賴性糖尿病，或幼年期發(fā)作和成年期發(fā)作糖尿病。在t1d中，身體不產(chǎn)生胰島素。關(guān)于t2d，t1d完全不如t2d常見。實際上，大致10％的所有糖尿病病例是1型。t1d困擾3百萬美國人。每年，在美國有超過15,000名兒童和15,000名成人診斷為患有t1d。估計世界范圍內(nèi)14歲以下兒童當(dāng)中的t1d發(fā)生率每年增加3％。t1d患者需要胰島素注射以保持存活，但其不治愈疾病或預(yù)防其嚴(yán)重副作用。

目前的抗糖尿病藥劑有效改善胰島素敏感性，但其慢性投藥具有明顯副作用，如心血管并發(fā)癥、肝毒性、重量增加、液體潴留和膀胱腫瘤。羊毛硫氨酸合成酶組分c樣2(lancl2)路徑發(fā)揮抗糖尿病作用而不具有副作用[18]。bt-11結(jié)合于lancl2，具有口服活性，已經(jīng)展現(xiàn)小鼠中的抗糖尿病功效和突出的安全概況。

方法

小鼠。nod小鼠購自jacksonlaboratory，并且在特定無病原體條件下收容于通風(fēng)架中。小鼠維持在動物設(shè)施中。所有實驗方案都由機(jī)構(gòu)動物照護(hù)與使用委員會批準(zhǔn)，并且符合或超出美國國家衛(wèi)生研究院實驗室動物福利和公共衛(wèi)生服務(wù)辦公室政策的指導(dǎo)原則。

體重和葡萄糖耐量的評定。在研究開始之前，確定所有小鼠為血糖量正常的(空腹血液葡萄糖水平低于250mg/dl)，并且具有類似重量(20±1.5g)。每周對小鼠進(jìn)行稱重，并且由不知情的觀察者檢查疾病臨床征象。在標(biāo)準(zhǔn)12小時禁食之后，使用血糖儀(印第安納州印第安納波利斯(indianapolis,in))來測量葡萄糖。經(jīng)由側(cè)尾靜脈收集血液，并且放到毛細(xì)血管血液收集試管上。

組織病理學(xué)。將來自小鼠中nod研究的胰臟切片固定在10％緩沖中性福爾馬林中，稍后嵌入于石蠟中，并且接著切片(5μm)并用h&e染色劑染色以用于組織學(xué)檢查。取決于淋巴細(xì)胞浸潤、細(xì)胞損傷和組織侵蝕，用0-4的評分對切片進(jìn)行分級，并且分析數(shù)據(jù)作為歸一化的混合評分。

統(tǒng)計分析。使用anova后接雪費多重比較法來分析參數(shù)數(shù)據(jù)。通過使用曼-惠特尼u測試后接鄧恩多重比較測試來分析非參數(shù)數(shù)據(jù)。通過使用sas版本6.0.3(sasinstitute)的一般線性模型程序來執(zhí)行anova。以p≤0.05評定統(tǒng)計顯著性。

結(jié)果

bt-11在1型糖尿病小鼠模型中降低空腹血液葡萄糖水平并且增加胰島素。

為了測定bt-11在t1d小鼠模型中調(diào)節(jié)血糖水平的作用，我們在研究開始之后第0、1、3、4、5、10和11周執(zhí)行空腹血液葡萄糖測試。我們的結(jié)果展示用我們的化合物bt-11處理的小鼠在禁食12小時時段之后如何具有明顯較低的血液中葡萄糖水平(圖34，圖a)。并行地，我們在第5周評定胰島素水平，并且我們的結(jié)果展示用bt-11處理的小鼠如何具有明顯升高的血漿胰島素水平(圖34，圖b)。

bt-11改善小鼠nod模型中的臨床組織病理學(xué)胰臟病變和炎癥。為了評定t1d小鼠模型中的組織病理學(xué)病變，收集胰臟并且用10％福爾馬林固定。接著用h&e對胰臟切片進(jìn)行染色，并且在顯微鏡下觀察。我們的結(jié)果展示，當(dāng)與媒劑處理的小鼠相比時，用bt-11處理如何顯著地減少胰臟中的臨床組織病理學(xué)病變(圖35)。

討論

需要用于1型糖尿病(t1d)的有效并安全的口服藥劑，所述t1d是困擾超過3百萬美國人的疾病。aba處理發(fā)揮抗糖尿病作用[2]。羊毛硫氨酸合成酶組分c樣蛋白質(zhì)2(lancl2)是用于aba結(jié)合和信號傳導(dǎo)的標(biāo)靶[15，19，24]。因此，lancl2已經(jīng)作為針對炎癥的有前景的新穎治療標(biāo)靶出現(xiàn)[18]。aba有效改善糖尿病[2，33]和免疫介導(dǎo)疾病，如發(fā)炎性腸病(ibd)[22，23]?；衔?1610(雙(苯并咪唑基)對苯二甲酰苯胺，btt)在具有數(shù)百萬化學(xué)品的文庫中以最高親和力結(jié)合于lancl2。另外，61610在腸道炎癥小鼠模型中發(fā)揮強效免疫調(diào)節(jié)作用[25]。bt-11在nod小鼠中發(fā)揮抗糖尿病作用(圖34和35)。此外，aba增加人類胰臟β-細(xì)胞中的胰島素分泌[34]，表明aba作為1型糖尿病(t1d)治療的潛在應(yīng)用。

在免疫細(xì)胞中，aba由lancl2識別，所述lancl2是在豆蔻?；笈c細(xì)胞膜締合的g蛋白偶合受體[19，35]。結(jié)合于lancl2的aba增加camp并且引發(fā)經(jīng)由pka的信號傳導(dǎo)，并且調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞和t細(xì)胞中的免疫反應(yīng)[8]。我們通過使用lancl1晶體結(jié)構(gòu)作為模板來執(zhí)行同源性模型化以構(gòu)筑lancl2的三維結(jié)構(gòu)。使用分子對接，第一計算機(jī)模擬并且接著體外展現(xiàn)aba結(jié)合于lancl2。由spr結(jié)果和與人類lancl2的結(jié)合分析驗證此計算預(yù)測[35]。我們使用經(jīng)由同源性模型化而獲得的lancl2結(jié)構(gòu)執(zhí)行基于lancl2的虛擬篩選以發(fā)現(xiàn)新lancl2配位體。用autodock將來自ncidiversitysetii、chembridge和zinc天然產(chǎn)物數(shù)據(jù)庫的化合物對接到lancl2模型中，并且通過親和力計算值來定級。雖然aba對lancl2具有高親和力，但也預(yù)測其它含二烯天然化合物(如61610)結(jié)合在相同區(qū)中并且也可以成為lancl2結(jié)合性藥物[12]。bt-11還展現(xiàn)強結(jié)合于lancl2和在t1d的nod小鼠模型中的治療功效(圖34)。此數(shù)據(jù)提供lancl2路徑和其它本發(fā)明化合物適用作用于t1d的免疫調(diào)節(jié)藥物的一定驗證。支持lancl2路徑作為調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)并改善自身免疫性疾病手段的作用的進(jìn)一步證據(jù)包括aba[22，23]、61610[12，18]和bt-11在發(fā)炎性腸病(ibd)小鼠模型中的lancl2結(jié)合和保護(hù)性作用。

t1d的發(fā)生率在世界范圍內(nèi)以每年3％的估計速率增加[36-38]。雖然成功移植胰臟胰島可以治療t1d，但缺乏足夠胰島、進(jìn)行中的免疫介導(dǎo)的移植胰島破壞和免疫抑制藥物的副作用極大地限制此方法的廣泛使用[39]。因而，安全地組合促進(jìn)胰臟β-細(xì)胞功能與免疫調(diào)節(jié)的能力的療法是治療t1d的基本策略。我們的數(shù)據(jù)展現(xiàn)，由bt-11使lancl2活化不僅改善血液中的葡萄糖水平，而且還改善其在葡萄糖攻擊之后的正?；?圖34)。此外，在t1d發(fā)作期間用bt-11處理改善胰臟中的組織病理學(xué)(圖35)。實際上，aba預(yù)防性地并且治療性地遏制炎癥并改善葡萄糖耐量[2，3]。因此，lancl2的天然活化引起如由其在ibd中的治療作用所說明的免疫調(diào)節(jié)[12，18，22，23]和葡萄糖穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)，其歸因于炎癥遏制和胰島素敏感性增強[2，3]。基于此背景以及在圖34和35中所呈現(xiàn)的數(shù)據(jù)，對lancl2作為t1d治療標(biāo)靶的作用的研究是至關(guān)重要的。

實例23：bt-11治療2型糖尿病(t2d)的用途

介紹

糖尿病(dm)是當(dāng)身體無法產(chǎn)生足夠胰島素或無法有效使用胰島素時發(fā)生的慢性病狀，并且由遺傳傾向性與環(huán)境因素偶合誘導(dǎo)。不同于患有1型糖尿病的人，2型糖尿病能夠產(chǎn)生胰島素。然而，此類患者的胰臟不制造足夠的胰島素，或身體無法足夠充分地使用胰島素。此現(xiàn)象稱作胰島素抵抗。當(dāng)不存在足夠胰島素或胰島素不以其應(yīng)使用的方式使用時，葡萄糖無法得到加工和使用。因此，當(dāng)葡萄糖在血流中積聚而非進(jìn)入細(xì)胞中并得到代謝時，系統(tǒng)中的其它細(xì)胞無法正確起作用。實際上，高血糖癥和糖尿病是發(fā)病和死亡的重要原因，這歸因于心血管疾病(cvd)、腎病變、神經(jīng)病變、足部潰瘍和視網(wǎng)膜病變。

約2830萬美國人患有2型糖尿病(t2d)，并且超過40.1％的中年人患有前驅(qū)糖尿病，所述前驅(qū)糖尿病是特征在于葡萄糖耐量異常、全身性炎癥和胰島素抵抗的病狀。世界衛(wèi)生組織估計到2030年為止患有t2d的人數(shù)到將增加到3億6600萬。

如上文所陳述，目前的抗糖尿病藥劑有效改善胰島素敏感性，但其慢性投藥具有明顯副作用，如心血管并發(fā)癥、肝毒性、重量增加、液體潴留和膀胱腫瘤。羊毛硫氨酸合成酶組分c樣2(lancl2)路徑發(fā)揮抗糖尿病作用而不具有副作用[18]。bt-11結(jié)合于lancl2，具有口服活性，已經(jīng)展現(xiàn)小鼠中的抗糖尿病功效和突出的安全概況。

方法

小鼠和膳食治療。c57bl/6和db/db小鼠購自jacksonlaboratory，并且在特定無病原體條件下收容于通風(fēng)架中。向膳食誘導(dǎo)肥胖糖尿病模型(dio)中的小鼠喂食高脂肪膳食(40kcal％脂肪)。小鼠維持在動物設(shè)施中。所有實驗方案都由機(jī)構(gòu)動物照護(hù)與使用委員會批準(zhǔn)，并且符合或超出美國國家衛(wèi)生研究院實驗室動物福利和公共衛(wèi)生服務(wù)辦公室政策的指導(dǎo)原則。

體重和葡萄糖耐量的評定。在研究開始之前，確定所有小鼠為血糖量正常的(空腹血液葡萄糖水平低于250mg/dl)，并且具有類似重量(重量±1.5g)。每周對小鼠進(jìn)行稱重，并且由不知情的觀察者檢查疾病臨床征象。在標(biāo)準(zhǔn)12小時禁食之后，在不同天測定葡萄糖。簡言之，經(jīng)由側(cè)尾靜脈收集血液，并且放到毛細(xì)血管血液收集試管上。接著通過腹膜內(nèi)注射d-葡萄糖(每千克體重2g)向小鼠投與葡萄糖耐量測試，并且在注射之前(時間0)(對應(yīng)于在上午6點開始12小時禁食后的基線fbg水平)和在葡萄糖注射后15、60和90分鐘時(db/db模型)或15、30、60、90、120、180、220和265分鐘時(dio模型)收集血液樣品。接著切除腹部(附睪)白色脂肪組織(wat)、皮下wat和肝臟，并且進(jìn)行稱重。隨后對腹部(附睪)wat進(jìn)行消化和分級分離。

白色脂肪組織的消化。切除腹部wat，稱重，剁碎成<10mg的小片，并且放到消化培養(yǎng)基(補充有2.5％hepes(弗吉尼亞州赫恩登(herndon,va)的mediatech)和10％胎牛血清的含有ii型膠原蛋白酶(0.2％，西格瑪-奧德里奇公司)的1×hbss(mediatech))中。將樣品在37℃培育箱中培育30分鐘，經(jīng)由100μm尼龍細(xì)胞過濾器過濾以去除未消化的粒子，并且在4℃下以1000×g離心10分鐘。用1×hbss洗滌由基質(zhì)血管細(xì)胞(svc)組成的小球，并且在4℃下以1000×g離心10分鐘。棄去上清液，并且通過在2ml紅細(xì)胞溶解緩沖液中培育svc持續(xù)2分鐘來溶解紅細(xì)胞，隨后用9ml1×pbs停止反應(yīng)。接著將細(xì)胞在4℃下以1000×g再次離心10分鐘，懸浮于1ml1×pbs中，并且用庫爾特計數(shù)器(加利福尼亞州富勒頓的貝克曼庫爾特公司(beckmancoulter,fullerton,ca))來計數(shù)。

對基質(zhì)血管細(xì)胞進(jìn)行免疫表型。對于免疫表型，以2×105個細(xì)胞/孔將svc接種到96孔板(costar)中。在用fcblock(20μg/ml；bdbiosciences-pharmingen)培育初始20分鐘以抑制非特異性結(jié)合之后，在含有5％血清和0.09％疊氮化鈉的pbs(facs緩沖液)中洗滌細(xì)胞，并且用特異性原代抗小鼠抗體染色。用facsaria流式細(xì)胞儀計算流動結(jié)果，并且用facsdiva^tm(bdbiosciences)和flowjo(treestar)執(zhí)行數(shù)據(jù)分析。。

實時定量pcr。根據(jù)制造商說明書使用rneasy脂質(zhì)迷你試劑盒(qiagen)從脂肪組織和使用rneasy迷你試劑盒(qiagen)從細(xì)胞分離出總rna?？俽na用于使用qscript^tmcdna合成試劑盒(馬里蘭州蓋瑟斯堡(gaithersburg,md)的quantabiosciences)來產(chǎn)生互補dna(cdna)模板?？偡磻?yīng)體積是20μl，其中在mjmini^tm熱循環(huán)儀(bio-rad)中如下培育反應(yīng)物：在25℃下5分鐘，在52℃下30分鐘，在85℃下5分鐘，保持在4℃下。用minelutepcr純化試劑盒(qiagen)來純化每一基因擴(kuò)增子，并且在瓊脂糖凝膠上通過使用dna質(zhì)量序列梯(普洛麥格公司)來定量。這些經(jīng)過純化的擴(kuò)增子用于在實時pcr分析中對實時pcr條件進(jìn)行優(yōu)化。對于每一引物集合，使用系統(tǒng)梯度方案對引物濃度和粘接溫度進(jìn)行優(yōu)化以用于cfx系統(tǒng)(bio-rad)在優(yōu)化期間并且還在樣品dna實時pcr期間，對每一引物集合維持pcr效率介于92％與105％之間并且相關(guān)系數(shù)高于0.98。使用δδct量化方法展示數(shù)據(jù)。

結(jié)果

bt-11在t2d小鼠dio模型中降低空腹血液葡萄糖水平。為了評定示例性化合物bt-11在t2d模型中的功效，我們向c57bl/6小鼠喂食高脂肪膳食(dio模型)。在高脂肪喂食第12周時，在經(jīng)過bt-11處理的小鼠中，當(dāng)與其媒劑處理的同窩幼畜相比時，口服bt-11投藥顯著地降低血液葡萄糖水平(圖36，圖a)。此外，在12小時禁食和經(jīng)由ip以每千克體重2g進(jìn)行葡萄糖攻擊之后，用bt-11處理的小鼠能夠比未經(jīng)處理的小鼠快得多地使血液葡萄糖水平正?；?圖36，圖b)。

bt-11處理減少白色脂肪組織中的促炎性巨噬細(xì)胞浸潤以及促炎性粒細(xì)胞。為了表征浸潤白色脂肪組織的細(xì)胞，如方法部分中所指定，收集腹部wat并進(jìn)行消化。執(zhí)行流式細(xì)胞測量術(shù)分析以評估wat中的不同促炎性群體。我們的結(jié)果展示用bt-11處理如何顯著地降低f4/80+cd11b+促炎性巨噬細(xì)胞的水平(圖37，圖a)以及具有高水平ly6c的促炎性粒細(xì)胞(gr1+ly6c高)的數(shù)目(圖37，圖b)。

bt-11在t2d小鼠db/db模型中降低空腹血液葡萄糖水平。為了評估口服bt-11處理在兩個糖尿病小鼠模型中的治療功效，我們還使用db/db小鼠，其由于瘦素受體中的突變而發(fā)展出自發(fā)性t2d。通過經(jīng)口管飼向db/db小鼠投與80mg/kg日劑量的bt-11。我們通過測量空腹血液葡萄糖濃度來測定bt-11對葡萄糖穩(wěn)態(tài)的作用。與其媒劑處理的同窩幼畜相比，用bt-11處理早在一周內(nèi)就顯著地降低血液葡萄糖水平，在第3周使隨時間的差異更突出(圖38，圖a)。為了確定口服bt-11處理是否調(diào)節(jié)動物如何引發(fā)葡萄糖穩(wěn)態(tài)，我們向?qū)嶒瀯游锝o予腹膜內(nèi)葡萄糖攻擊，并且評估葡萄糖注射后0到265分鐘時的血漿葡萄糖動力學(xué)。在注射之前(時間0)(對應(yīng)于12小時禁食后的基線fbg水平)收集血液樣品。我們的結(jié)果展示在ip葡萄糖攻擊之前(時間0，圖38，圖b)用bt-11口服處理如何顯著地降低葡萄糖水平。在于db/db模型中進(jìn)行葡萄糖攻擊后，我們的結(jié)果展示用我們的最優(yōu)化合物bt-11處理的小鼠中的葡萄糖水平如何比媒劑處理的小鼠更快速地落到正常水平(圖38，圖b)。

bt-11降低tnfα和mcp-1的mrna水平并且上調(diào)lancl2。為了進(jìn)一步確認(rèn)bt-11的抗炎性效力，如方法部分中所指示，我們評定wat上的基因表達(dá)。我們的結(jié)果展示當(dāng)與未經(jīng)處理的小鼠相比較時，用bt-11處理的小鼠如何具有更高的lancl2表達(dá)水平并顯著地降低促炎性因子tnfα和mcp-1的mrna水平(圖39)。

討論

隨著肥胖和2型糖尿病(t2d)在美國的比率持續(xù)上升，越來越多的人變得依賴于口服抗糖尿病藥物。約2830萬(群體的8.3％)美國人患有t2d，并且超過40.1％的中年人患有前驅(qū)糖尿病，所述前驅(qū)糖尿病是特征在于葡萄糖耐量異常和胰島素抵抗的病狀[40]。在美國，可歸因于t2d的總直接和間接成本超過$1320億[40]。盡管具有此增長中的問題，但藥物制造商尚不能研發(fā)出安全并且有效的藥劑。最受歡迎和有效的口服抗糖尿病藥劑中的一種是噻唑烷二酮(tzd)類別的胰島素敏化藥。盡管tzd增強胰島素敏感性，但其具有限制其可用性的明顯不利副作用，包括重量增加、充血性心力衰竭、膀胱癌、肝毒性和液體潴留[41，42]。舉例來說，大致10％-15％的使用tzd的患者由于水腫而強制停止治療，并且來自過量液體潴留的細(xì)胞外體積增加也成為患有先前存在的充血性心力衰竭的個體中的主要問題。在2000年，在曲格列酮開始3年之后，由于嚴(yán)重肝損傷和死亡報告而將其從市場去除[43]。關(guān)于其它tzd的安全性關(guān)注產(chǎn)生必選黑匣子標(biāo)記和后續(xù)使用限制。

lancl2是待鑒別的lanc樣蛋白質(zhì)家族的第二成員。第一成員lancl1是從人類紅細(xì)胞膜中分離的[44]。隨后鑒別lancl2并且在整個身體[1，18]中表達(dá)，包括免疫細(xì)胞、胰臟、肺和腸[1，44]。羊毛硫氨酸合成酶c樣2(lancl2)路徑作為用于t2d的新穎治療標(biāo)靶出現(xiàn)[18]。大量的臨床前測試提供lancl2配位體(如脫落酸(aba))在糖尿病和慢性發(fā)炎性疾病中治療潛能的充分證據(jù)[2，3，22，23，45]?；衔?1610(雙(苯并咪唑基)對苯二甲酰苯胺，btt)在具有數(shù)百萬化學(xué)品的文庫中以最高親和力結(jié)合于lancl2。

鑒于目前用于t2d的藥物未能在無副作用的情況下滿足患者第一需要(即葡萄糖控制)的事實，bt-11代表極有吸引力的潛在取代。我們的結(jié)果展示在不同的t2d小鼠模型中投與bt-11如何在禁食時段之后顯著地降低血液中的葡萄糖水平(圖36和38)。此外，投與此化合物也有助于在葡萄糖攻擊之后使葡萄糖水平正常化(圖36和38)。bt-11的抗炎特性也反映在我們的免疫表型結(jié)果中。實際上，投與bt-11引起腹部wat中促炎性巨噬細(xì)胞和促炎性粒細(xì)胞的更少浸潤(圖37)。這些結(jié)果由兩種極重要促炎性因子tnfα和mcp-1的基因表達(dá)數(shù)據(jù)支持，發(fā)現(xiàn)所述促炎性因子在用bt-11處理的小鼠中顯著地減少(圖39)。

實例24：bt-11在流感感染期間的用途

介紹

造成肺炎的呼吸道病原體是工業(yè)化國家中傳染性疾病相關(guān)死亡的首要原因。有效疫苗和抗病毒劑的不存在與增長中的對抗病毒抗性出現(xiàn)的關(guān)注偶合，強調(diào)需要研發(fā)靶向宿主的免疫治療方法。與呼吸道感染相關(guān)聯(lián)的肺部致病機(jī)制和臨床疾病常常由病毒的致細(xì)胞病變作用與宿主免疫反應(yīng)的組合產(chǎn)生。在此方面，考慮將針對調(diào)節(jié)先天性免疫反應(yīng)的療法用于治療流感[46]。

流感仍是世界范圍內(nèi)主要的公共健康問題。季節(jié)性流感與常常失能的上呼吸道過程相關(guān)聯(lián)，并且需要數(shù)天受約束的活動。據(jù)估計單獨在美國，每年流感流行導(dǎo)致3000萬人門診訪問和300,000人住院。某些群體(例如，幼兒、老年人和具有易感染醫(yī)學(xué)病狀的人)具有更高的發(fā)展出病毒性肺炎的風(fēng)險。專家已經(jīng)估計，在美國中每年25,000到35,000人因季節(jié)性流感而死亡，并且全球財政負(fù)擔(dān)已計算為數(shù)千億美元[47]。流感大流行周期每30-50年發(fā)生一次，其中由于其不可預(yù)測表現(xiàn)和缺乏預(yù)先存在的免疫性而增加復(fù)雜性，并且與高死亡率相關(guān)聯(lián)[48]。流感與較高發(fā)病率和死亡率相關(guān)聯(lián)，但缺乏有效和安全的藥物治療。

數(shù)據(jù)表明羊毛硫氨酸合成酶組分c樣蛋白質(zhì)2(lancl2)是用于aba結(jié)合和信號傳導(dǎo)的標(biāo)靶[15，19，24]。因此，lancl2已經(jīng)作為有前景的用于免疫調(diào)節(jié)的新穎治療標(biāo)靶出現(xiàn)。使用分子模型化和表面等離子共振(spr)，bti鑒別化合物bt-11(雙(苯并咪唑基)對苯二甲酰苯胺，btt)，其以高親和力結(jié)合于lancl2。另外，bt-11在肺中發(fā)揮強效促消腫(pro-resolutive)作用，并且在流感小鼠模型中降低死亡率和發(fā)病率。

方法

小鼠。c57bl/6小鼠購自jacksonlaboratory，并且在特定無病原體條件下收容于通風(fēng)架中。所有實驗方案都由機(jī)構(gòu)動物照護(hù)與使用委員會批準(zhǔn)，并且符合或超出美國國家衛(wèi)生研究院實驗室動物福利和公共衛(wèi)生服務(wù)辦公室政策的指導(dǎo)原則。

用流感病毒對小鼠進(jìn)行鼻內(nèi)感染。使用氣化器臺用2％-5％異氟醚對小鼠進(jìn)行麻醉，經(jīng)由鼻孔投與50μl10³tcid50的病毒稀釋液(每個25μl)。接著將小鼠放在其籠中，并且監(jiān)視麻醉恢復(fù)。

通過口胃管飼經(jīng)口投與bt-11。使用可商購的安全球鑲尖的管飼針(18-24規(guī)格，取決于動物重量)通過口胃管飼向小鼠投與bt-11。此程序不造成疼痛或痛苦。以80mg/kg劑量用bt-11處理小鼠，每24小時一次持續(xù)實驗時長。

監(jiān)測小鼠和疾病活動性以及稱重。在感染之后每日一次監(jiān)測小鼠(或如果其發(fā)展出等效于疾病評分2的嚴(yán)重疾病臨床征象，則每4小時監(jiān)測一次)，并且如果其發(fā)展出明顯病征，則在規(guī)劃終點之前進(jìn)行安樂死，所述病征如通過重量損失(即，逐漸損失25％初始體重)、脫水、運動性損失、疼痛區(qū)域的防護(hù)/保護(hù)、亂毛(豎毛)所測量。一天一次對小鼠進(jìn)行稱重持續(xù)實驗時長。

結(jié)果

經(jīng)口投與bt-11在具有流感病毒的小鼠中降低臨床評分和發(fā)病率。

為了評估bt-11的治療功效，我們在小鼠中使用流感感染小鼠模型。簡言之，在用5％異氟醚麻醉之后，對小鼠進(jìn)行鼻內(nèi)感染。每日以80或40mg/kg用bt-11口服懸浮液處理小鼠。對小鼠進(jìn)行稱重和評分持續(xù)實驗時長(16天)。結(jié)果展示投與bt-11如何在第3天開始并在整個實驗中顯著地降低活動性(圖40，圖a)。此外，在接受40和80mg/kgbt-11處理的小鼠中，物理外觀的臨床評分顯著地降低(圖40，圖b)。

為了評估處理在疾病發(fā)病率中的作用，我們計算重量損失百分比，并且進(jìn)一步評估每一實驗組內(nèi)損失超過15％的小鼠數(shù)目。在感染后第6天開始，當(dāng)與媒劑組相比時，用80mg/kgbt-11處理引起更小發(fā)病率。差異在第10天開始突出，并且持續(xù)到第12天(圖40，圖c)。

討論

控制流感擴(kuò)散和疾病的傳統(tǒng)方法以經(jīng)由疫苗接種和抗病毒治療的病毒側(cè)面為中心。疫苗必須每年基于前一季的流行菌株來調(diào)配。然而，不論新型疫苗是用于季節(jié)性流感還是大流行性流感，生產(chǎn)、得到許可和測試其功效需要約4到6個月[49]。抗病毒劑的主要缺點是抗性菌株的極頻繁出現(xiàn)和選擇。除以病毒為中心的治療以外，基于控制加重的宿主反應(yīng)的療法發(fā)展有極高可能性用于補充抗微生物和預(yù)防策略。靶向宿主的治療劑具有在不同雜交情況下提供交叉保護(hù)的優(yōu)點，并且因此每季有效，其可以生產(chǎn)并儲備，并且可以用于在病毒暴露之后治療疾病[46，50，51]。

將lancl2鑒別為用于流感的新穎治療標(biāo)靶為靶向宿主的治療劑開辟了一條新途徑。我們展現(xiàn)通過bt-11對lancl2進(jìn)行活化不僅改善活動性和臨床評分，而且還降低由流感病毒造成的發(fā)病率，并且促進(jìn)從流感感染恢復(fù)(圖33)。這些結(jié)果強有力地支持lancl2是用于流感的新穎治療標(biāo)靶并且bt-11是靶向宿主的潛在新藥物。

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