本發(fā)明涉及對于胰高血糖素樣肽-l(glp-l)受體和胰高血糖素受體皆具有優(yōu)異效果的新穎的胰高血糖素衍生物，以及用于預防或治療肥胖的含有該胰高血糖素衍生物作為活性成分的組合物。
背景技術：
近來的經濟進展和生活方式改變已伴隨膳食習慣的重大改變。特別地，現(xiàn)今忙碌的人們由于高熱量飲食和不充足的運動而變成超重和肥胖。根據(jù)世界衛(wèi)生組織(who)的報道，全世界超過10億的成人超重，他們當中超過三百萬人經臨床診斷為嚴重肥胖，并且每年歐洲有250,000人、全世界有二百五十萬人因超重或肥胖相關疾病死亡(worldhealthorganization,globalstrategyondiet,physicalactivityandhealth,2004)。
超重和肥胖增加血壓和血膽固醇量，因此成為包括心臟疾病、糖尿病、關節(jié)炎等多種疾病的成因，或使這些疾病惡化。再者，超重和肥胖為兒童和青少年以及成人中增加如動脈粥狀硬化、高血壓、高血脂癥和心臟疾病風險的一些主因。
像這樣，目前肥胖被認為是流行于全世界的嚴重疾病且為多種疾病的成因。然而，由于肥胖被認為能通過自助努力而克服，肥胖患者被評價為低自我調控的人。盡管如此，因為肥胖為與食欲調控和能量代謝作用的機制密切相關的復雜疾病，所以其不容易治療。因此，對于肥胖治療，需要同時進行對于食欲調控的個人努力和能量代謝作用的異常機制的治療。關于此點，有需要開發(fā)能治療異常作用機制的藥物。
以上努力的結果是已開發(fā)如利莫那班
像這樣，已進行活躍的研究以開發(fā)解決傳統(tǒng)抗肥胖藥物中的問題的新醫(yī)藥藥物，且近來敏銳的注意力已關注于胰高血糖素衍生物。當因例如藥物治療、疾病、激素或酶缺乏而血糖水平降低時，由胰臟分泌胰高血糖素。胰高血糖素發(fā)信號至肝臟以將糖原裂解成葡萄糖和提升血液葡萄糖水平回到其正常水平。再者，已報道除了提升血液葡萄糖水平外，胰高血糖素通過壓抑食欲和激活脂肪細胞中的激素敏感脂肪酶從而促進脂肪分解而具有抗肥胖效果。
胰高血糖素樣肽-1(后文中，稱為‘glp-1’)——一種胰高血糖素衍生物——為開發(fā)作為于糖尿病患者中改良高血糖癥藥物的物質。glp-1具有增加胰島素合成和促進其分泌、抑制胰高血糖素分泌、抑制胃排空、增加葡萄糖的使用和抑制食物攝取的功能。同時，艾塞那肽(exendin)-4——由蜥蜴毒液分泌且顯示與glp-1約50％的氨基酸序列同源性——已知通過活化glp-1受體而在糖尿病患者中緩解高血糖癥。然而，已經報道含有glp-1或艾塞那肽-4的抗肥胖藥物具有引起嘔吐和惡心的不良作用。
從這一點上，作為glp-1的替代物，胃泌酸調節(jié)素已突出顯示，其可結合至glp-1和胰高血糖素肽。胃泌酸調節(jié)素為自前胰高血糖素——胰高血糖素前體——所制備的肽，且具有如抑制食物攝取、促進飽足和脂肪分解的與glp-1相同的效果，因而提升其作為抗肥胖劑的潛力。
然而，胃泌酸調節(jié)素或其衍生物具有因其體內短的半衰期和低有效性而每日需以高劑量施用的缺點。
技術實現(xiàn)要素：
技術問題
本發(fā)明者們致力于改良肥胖治療效果同時降低劑量，已開發(fā)在其氨基酸序列具有部分修飾的胰高血糖素衍生物，且確認該胰高血糖素衍生物對于胰高血糖素受體和glp-1受體皆具有優(yōu)異效果，從而完成本發(fā)明。
技術方案
本發(fā)明已將現(xiàn)有技術中所發(fā)生的上述問題了然于心，而且本發(fā)明的目的是提供顯示優(yōu)異肥胖治療效果的新穎肽。
本發(fā)明的另一目的是提供含有該肽的用于預防或治療肥胖的組合物。
發(fā)明的有益效果
相比于天然胰高血糖素，本發(fā)明的新穎肽可顯著地活化glp-受體和胰高血糖素受體兩者，即使以小量施用也顯示優(yōu)異的抗肥胖效果，且因此其可廣泛地用作治療肥胖的安全和有效的藥劑。
具體實施方式
為了實現(xiàn)上述目的，一方面，本發(fā)明提供具有下述式1的氨基酸序列的新穎肽：
x1-x2-qgtftsdyskyl-x15-x16-x17-x18-x19-x20-x21-f-x23-x24-w-l-x27-x28-x29(式1)
其中，x1為組氨酸、去氨基-組氨?；?、n-二甲基-組氨?；?、β-羥基咪唑并丙酰基、4-咪唑并乙?；?、β-羧基咪唑并丙?；蚶野彼?；
x2為α-甲基-谷氨酸、氨基異丁酸(aib)、d-丙氨酸、甘氨酸、sar(n-甲基甘氨酸)、絲氨酸或d-絲氨酸；
x15為半胱氨酸、天冬氨酸或谷氨酸；
x16為谷氨酸、天冬氨酸、絲氨酸、α-甲基-谷氨酸或不存在；
x17為半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、賴氨酸、精氨酸、絲氨酸或不存在；
x18為半胱氨酸、丙氨酸、精氨酸、纈氨酸或不存在；
x19為丙氨酸、精氨酸、絲氨酸、纈氨酸或不存在；
x20為賴氨酸、組氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、α-甲基-谷氨酸或不存在；
x21為天冬氨酸、谷氨酸、亮氨酸或不存在；
x23為異亮氨酸、纈氨酸或不存在；
x24為精氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、賴氨酸、谷氨酰胺、α-甲基-谷氨酸或不存在；
x27為纈氨酸、丙氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、谷氨酰胺、精氨酸或不存在；
x28為谷氨酰胺、賴氨酸、天冬酰胺或不存在；和
x29為賴氨酸、丙氨酸、甘氨酸、蘇氨酸或不存在；
限制條件為排除與seqidno:1相同的氨基酸序列。
本發(fā)明的肽可包括肽、肽衍生物和其肽模擬物，其通過取代而修飾部分氨基酸(一個或多個)來活化glp-1受體和胰高血糖素受體。
如本文所用，術語“天然胰高血糖素”意指具有下列氨基酸序列的天然人胰高血糖素：his-ser-gln-gly-thr-phe-thr-ser-asp-tyr-ser-lys-tyr-leu-asp-ser-arg-arg-ala-gln-asp-phe-val-gln-trp-leu-met-asn-thr(seqidno:1)
本發(fā)明提供上述所定義的肽作為天然胰高血糖素的衍生物，和在定義本發(fā)明所提供的肽中，該肽意圖僅通過改變(一次或多次)序列中的位置(一個或多個)x而不同于天然胰高血糖素。
在根據(jù)本發(fā)明的式1的序列中，氨基酸可被認為是由第1個氨基酸至第29個氨基酸以傳統(tǒng)方向由n-末端至c-末端連續(xù)編號。因此，式1序列中對于“位置”的描述應以與天然人胰高血糖素和其他分子的位置的描述相同的方式解讀。
如本文所用，術語“肽”意指形式為其中二個或更多個氨基酸通過肽鍵(一個或多個)連接的化合物。對于本發(fā)明的目的，肽可意指通過活化glp-1受體和胰高血糖素受體兩者而顯示抗肥胖效果的肽。
遍及本發(fā)明，通常給予不同氨基酸，如α-氨基異丁酸(aib)、sar(n-甲基甘氨酸)和α-甲基-谷氨酸的三字母代碼是與對于天然產生的氨基酸的傳統(tǒng)一字母或三字母代碼一起使用。
此外，本發(fā)明中描述的氨基酸是根據(jù)iupac-iub命名學簡寫為如下所示的。
丙氨酸(a)精氨酸(r)
天冬酰胺(n)天冬氨酸(d)
半胱氨酸(c)谷氨酸(e)
谷氨酰胺(q)甘氨酸(g)
組氨酸(h)異亮氨酸(i)
亮氨酸(l)賴氨酸(k)
甲硫氨酸(m)苯丙氨酸(f)
脯氨酸(p)絲氨酸(s)
蘇氨酸(t)色氨酸(w)
酪氨酸(y)纈氨酸(v)
具有根據(jù)本發(fā)明式1的氨基酸序列的肽，可包括任何肽，其在seqidno:1所述的胰高血糖素的氨基酸序列中通過在翻譯后引入取代、添加、刪除或修飾(例如，甲基化、?；?、泛素化和分子內共價鍵)，可活化胰高血糖素受體和glp-1受體兩者。
為了氨基酸的取代或添加，除了在人蛋白質中傳統(tǒng)觀察到的20個氨基酸之外，可使用非典型或非天然產生的氨基酸。非典型氨基酸的商業(yè)提供者包括sigma-aldrich、chempep、genzymepharmaceuticals等。對于包括這些非典型氨基酸的肽序列和對于典型肽序列可合成或由商業(yè)肽制造公司購得，例如americanpeptidecompany或bachem(usa)或anygen(korea)等。
為了增加本發(fā)明的肽對胰高血糖素受體和glp-1受體的效果，在由seqidno:1所表示的氨基酸序列中，第1個氨基酸——組氨酸——可通過刪除組氨酸的α-碳而以4-咪唑并乙?；〈?，通過刪除n-末端氨基而以去氨基-組氨酰基取代，通過以二個甲基修飾n-末端氨基而以n-二甲基-組氨?；〈ㄟ^以羥基取代n-末端氨基而以β-羥基咪唑并丙?；〈?，通過以羧基取代n-末端氨基而以羧基咪唑丙?；〈蛞岳野彼崛〈?。
此外，結合至glp-1受體的結構域可用可強化疏水鍵和離子鍵的氨基酸取代。再者，胰高血糖素序列的部分序列可以glp-1的氨基酸序列或艾塞那肽-4的氨基酸序列取代以增加glp-1受體的活性。
此外，胰高血糖素序列的部分序列可用可強化α-螺旋的序列取代。優(yōu)選地，在位置10、14、16、20、24和28的式1的氨基酸(一個或多個)可以由tyr(4-me)、phe、phe(4-me)、phe(4-cl)、phe(4-cn)、phe(4-no2)、phe(4-nh2)、phg、pal、nal、ala(2-噻吩基)或ala(苯并噻吩基)所組成的氨基酸(一個或多個)或其衍生物取代，這些氨基酸已知有助于α-螺旋形成。為此目的欲添加的氨基酸或其衍生物的種類和數(shù)目并不限定。
此外，優(yōu)選地，在式1的氨基酸序列的位置10和14、12和16、16和20、20和24以及24和28的至少一個氨基酸對中的至少一個氨基酸可以谷氨酸或賴氨酸取代，造成可形成環(huán)的谷氨酸和賴氨酸對，而且用于插入的環(huán)數(shù)目亦不限定。
在示例性實施方式中，胰高血糖素的氨基酸序列可以具有結合至glp-1受體的能力而使該肽對于glp-1受體和胰高血糖素受體皆可顯現(xiàn)優(yōu)異效果的序列取代。
優(yōu)選地，本發(fā)明的肽可為式1的氨基酸序列中的肽，
其中x1為組氨酸；
x2為α-甲基-谷氨酸；
x15為半胱氨酸或天冬氨酸；
x16為絲氨酸、谷氨酸或天冬氨酸；
x17為精氨酸、賴氨酸、谷氨酸或半胱氨酸；
x18為半胱氨酸、纈氨酸或精氨酸；
x19為丙氨酸或纈氨酸；
x20為谷氨酰胺、賴氨酸或組氨酸；
x21為天冬氨酸、谷氨酸或亮氨酸；
x23為異亮氨酸或纈氨酸；
x24為精氨酸、谷氨酸或谷氨酰胺；
x27為纈氨酸、賴氨酸或甲硫氨酸；
x28為谷氨酰胺、賴氨酸或天冬酰胺；和
x29為賴氨酸、甘氨酸或蘇氨酸；
限制條件為排除與seqidno:1相同的氨基酸序列
更優(yōu)選，本發(fā)明的肽可為包括選自seqidno:2至14的氨基酸序列的氨基酸序列的肽。
本發(fā)明的肽可通過標準合成方法、重組表達系統(tǒng)或本領域中已知的任何方法制備。因此，根據(jù)本發(fā)明的胰高血糖素類似物可通過包括下述的數(shù)種方法合成：
(a)通過固相或液相方法的逐步方法或片段組裝而合成肽，分離最終肽，接著純化；
(b)在宿主細胞中表達編碼該肽的核酸構建體，且由該宿主細胞培養(yǎng)物回收該表達產物；
(c)在無細胞管中進行編碼肽的核酸構建體的表達，且回收該表達產物；或
通過(a)、(b)和(c)的隨機組合而獲得肽片段，連接這些片段，從而回收對應肽的方法。
本發(fā)明者們通過體外試驗確認，本發(fā)明的肽相比于天然胰高血糖素對glp-1受體和胰高血糖素受體具有優(yōu)異效果(參見表2)。此外，通過體外試驗確認，本發(fā)明的肽在肥胖動物模式中具有對抗喂食攝入的優(yōu)異抑制效果，因而證明本發(fā)明的肽即使當小量施用時也可顯現(xiàn)優(yōu)異的抗肥胖效果。
因此，本發(fā)明的肽為能剌激glp-1受體和胰高血糖素受體兩者中camp形成的雙重激動劑，且相比于現(xiàn)存胰高血糖素，本發(fā)明的肽期待為具有更優(yōu)異的治療肥胖的效果。關于此點，本發(fā)明的肽對于治療肥胖和肥胖相關疾病可提供更具吸引力的選擇。
本發(fā)明的肽——為雙重激動劑——可組合glp-1在食物攝入中的效果和胰高血糖素在脂肪代謝中的效果，從而協(xié)同地作用以加速脂質累積物的移除和體重的持續(xù)降低。作為雙重激動劑的該協(xié)同效果可助于降低心血管風險因子，如高膽固醇和ldl，這些因子可與對于體重的效果完全無關。
因此，本發(fā)明的肽可用作醫(yī)藥藥物用于防止重量增加、促進重量降低、減低超重和不但治療包括病態(tài)肥胖的肥胖(例如通過調整食欲、攝食、食物攝人、熱量攝入和/或能量消耗)，而且治療肥胖相關疾病，包括肥胖相關炎癥、肥胖相關膽囊疾病、肥胖誘發(fā)的睡眠呼吸暫停，但不限于此，以及健康狀況。此外，本發(fā)明的肽可用于治療可與肥胖相關的醫(yī)學狀況，如代謝綜合征、高血壓、動脈硬化誘發(fā)的血脂異常、動脈粥狀硬化、動脈硬化、冠狀動脈心臟疾病、中風等。然而，關于這些癥狀，本發(fā)明的肽的效果可完全地或部分地通過體重相關效果而調節(jié)或可與這些無關。
為了提高本發(fā)明的胰高血糖素衍生物的治療效果，該胰高血糖素衍生物可使用本領域的傳統(tǒng)技術修飾，如聚合物如聚乙二醇(peg)、聚糖等的修飾，或與白蛋白、轉鐵蛋白(transferring)、脂肪酸、免疫球蛋白等的融合物。例如，本發(fā)明化合物中至少一個氨基酸側鏈可于體內接合至聚合物以增加溶解性和/或半衰期和/或增加生物利用度。這些修飾已知降低治療蛋白質和肽的清除。
優(yōu)選地，聚合物可為水溶性(兩性的或親水的)、無毒的和藥學上無活性的，和更優(yōu)選可包括peg、peg的均聚物或共聚物、peg的單甲基取代聚合物(mpeg)或聚氨基酸如聚賴氨酸、聚天冬氨酸和聚谷氨酸。
對本領域技術人員顯而易見的是經此修飾的胰高血糖素衍生物較天然胰高血糖素具有更優(yōu)異的治療效果。因此，胰高血糖素衍生物的變異體亦包括在本發(fā)明的范圍中。
另一方面，本發(fā)明提供編碼該肽的多核苷酸。
如本文所用，術語“同源性”，如使用于多核苷酸，意指與野生型氨基酸序列和野s生型核苷酸序列的序列相似度，且包括與編碼該多肽的多核苷酸序列共享至少75％、優(yōu)選至少85％、更優(yōu)選至少90％、和甚至更優(yōu)選至少95％的基因序列。這些同源性比較可以通過肉眼或使用可容易購得的比較程序進行。市場上可取得的計算機程序可計算二個或更多個序列之間的同源性，其表示為百分比(％)。可計算相鄰序列之間的同源性(％)。
肽可通過將編碼肽的多核苷酸插入至載體，接著通過其表達而大量獲得。
此類重組表達中，本發(fā)明的多核苷酸通常被插入至合適載體，且形成擁有該核苷酸的克隆或重組載體，且該載體亦包括在本發(fā)明的范圍中。
如本文所用，術語“重組載體”意指包括編碼目標肽的多核苷酸的核苷酸序列的dna構建體，該多核苷酸可操作地連接至合適的調控序列，使得目標肽能在合適的宿主細胞中表達。該調控序列可包括能起始轉錄的啟動子、用于調控轉錄的操作子序列、編碼合適的mrna核糖體-結合結構域的序列和用于調控轉錄和翻譯終止的序列。重組載體，一旦轉化至適當?shù)乃拗骷毎?，就可無關于宿主基因組而復制或起作用，且可整合至宿主基因組本身。
用于本發(fā)明的重組載體沒有特別限定，只要該載體可在宿主細胞中復制，且其可使用本領域中已知的任何載體構建。將使用的傳統(tǒng)載體的實例可包括野生型或重組質粒、粘粒、病毒、和噬菌體。例如，作為噬菌體載體或粘粒載體，可使用pwe15、m13、mbl3、mbl4、ixii、ashii、apii、t10、t11、charon4a、charon21a等。作為質粒載體，可使用基于pbr、基于puc、基于pbluescriptii、基于pgem、基于ptz、基于pcl、和基于pet的質粒。將用于本發(fā)明的載體沒有特別限定，本領域已知的任何載體皆可使用。
重組載體可用于轉化宿主細胞以產生本發(fā)明的肽。此外，作為本發(fā)明的一部分，經轉化細胞可用于本發(fā)明的核酸片段的擴增或載體的復制，或經培養(yǎng)細胞或細胞系可用于重組制造本發(fā)明的肽。
如本文所用，術語“轉化”意指將包括編碼目標蛋白質的多核苷酸的重組載體導入至宿主細胞，以便能在該宿主細胞中表達該多核苷酸所編碼的目標蛋白質。不論是否插入多核苷酸以位于染色體內或染色體外，只要轉化的多核苷酸可在宿主細胞中表達即可。
此外，多核苷酸包括編碼目標蛋白質的dna和rna。多核苷酸可以任何形式導入，只要其可在被導入至宿主細胞后表達即可。例如，該多核苷酸可以表達盒的形式被導入至宿主細胞，該表達盒為包括自我表達所需要的所有基本特征的基因組結構。表達盒通?？砂刹僮鞯剡B接至該多核苷酸的啟動子、轉錄終止信號、核糖體結合結構域和翻譯終止信號。表達盒可為可自我復制的表達載體。此外，該多核苷酸自身可被導入至宿主細胞且可操作地連接至用于其在宿主細胞中表達必需的序列，但不限定于此。
此外，如本文所用，術語“可操作地連接”意指一種狀態(tài)，其中啟動子序列功能性地連接至該基因序列，該啟動子序列起始和調節(jié)編碼目標蛋白質的多核苷酸的轉錄。
適合于本發(fā)明的宿主細胞沒有特別限定，只要其可表達本發(fā)明的多核苷酸即可?？捎糜诒景l(fā)明的宿主細胞的實例可包括埃希氏菌屬(escherichiasp.)如大腸桿菌(e.coli)；芽孢桿菌(bacillussp.)如枯草桿菌(bacillussubtilis)；假單胞菌屬(pseudomonassp.)如惡臭假單胞菌(pseudomonasputida)；酵母如畢赤酵母(pichiapastoris)、釀酒酵母(saccharomycescerevisiae)和粟酒裂殖酵母(schizosaccharomycespombe)；昆蟲細胞如秋粘蟲(spodopterafrugiperda)(sf9)；和動物細胞如cho、cos、bsc等。
另一方面，本發(fā)明提供用于預防或治療肥胖的含有肽作為活性成分的藥物組合物。
如本文所用，術語“預防”意指通過施用本發(fā)明的肽或藥物組合物而造成抑制或延遲肥胖發(fā)生的任何作用，術語“治療”意指通過施用本發(fā)明的肽或藥物組合物而造成肥胖癥狀改善或有利改變的任何作用。
如本文所用，術語“施用”意指以合適的方式對患者導入特定物質。本發(fā)明的藥物組合物的施用途徑，雖無特別限定，但是可以是任何一般途徑，例如，腹膜內、靜脈內、肌肉內、皮下、皮內、經口、局部、鼻內、肺內、直腸內等，只要藥物組合物可到達體內的目標組織即可。
如本文所用，術語“肥胖”意指體內已累積過多身體脂肪的醫(yī)學狀況，且當身體質量指數(shù)(bmi；通過人的重量(kg)除以身高(m)平方所獲得的測量值)為25或更高時認定為肥胖。一般而言，肥胖由因熱量攝取高于能量消耗的能量不平衡所引起。肥胖為代謝疾病，其可誘發(fā)糖尿病和高脂血癥，增加性功能障礙、關節(jié)炎和心血管疾病的風險，而且在某些情況中，其亦與癌癥的發(fā)生相關。
本發(fā)明的藥物組合物可包括藥學可接受的載體、賦形劑或稀釋劑。
如本文所用，術語“藥血可接受的”意指足量，其可顯現(xiàn)治療效果但不發(fā)生任何不良反應，且其可由本領域技術人員根據(jù)醫(yī)藥領域已知的因素如欲治療的疾病種類、患者的年齡、體重、性別、對藥物的敏感性、施用途徑、施用數(shù)目、欲組合或同時使用的藥物(一種或多種)等來決定。
本發(fā)明藥物組合物可進一步包括藥學可接受的載體。對于經口施用，藥學可接受的載體可包括，但不限于，粘合劑、潤滑劑、崩解劑、賦形劑、增溶劑、分散劑、穩(wěn)定劑、懸浮劑、著色劑和香料。對于可注射施用，可混合使用緩沖劑、防腐劑、鎮(zhèn)痛藥、增溶劑、等張劑和穩(wěn)定劑。對于局部施用，藥學可接受的載體可包括基料、賦形劑、潤滑劑、防腐劑等。
本發(fā)明的藥物組合物可與藥學可接受的載體組合而配制成各種劑型。例如，對于經口施用，醫(yī)藥組合物可配制成片劑、錠劑、膠囊、酏劑、懸浮劑、糖漿、圓片等。對于可注射施用，藥物組合物可配制成呈單一劑量形式的安瓿或多劑量施用。藥物組合物亦可配制成溶液、懸浮劑、片劑、丸劑、膠囊和長效制劑。
另一方面，適用于本發(fā)明的藥物組合物的載體、賦形劑和稀釋劑的實例可包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、赤蘚醇、麥芽糖醇、淀粉、阿拉伯膠、藻酸鹽、明膠、磷酸鈣、硅酸鈣、纖維素、甲基纖維素、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羥基苯甲酸甲酯、羥基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸鎂、礦物油等。此外，本發(fā)明的藥物組合物可進一步包括填料、抗凝結劑、潤滑劑、保濕劑、香料、防腐劑等。
此外，本發(fā)明的藥物組合物可配制成選自以下中的一個：片劑、丸劑、粉末、顆粒、膠囊、懸浮劑、內用的液體藥物、乳劑、糖漿、無菌水溶液、非水溶劑、冷凍干燥的機制和栓劑。
此外，藥物組合物可根據(jù)傳統(tǒng)方法配制成用于單位施用至患者身體的合適制劑，優(yōu)選地配制成用于肽藥物施用的制劑類型，且根據(jù)傳統(tǒng)方法通過皮下、靜脈內、肌肉內、動脈內、髓內、鞘內、心室內、肺內、皮內、皮下、腹膜內、鼻內、胃內、局部、舌下、陰道內或直腸內途徑(但不限于此)經口或胃腸外施用。
此外，肽可通過與多種載體如鹽水溶液或有機溶劑混合使用，其可接受為醫(yī)藥藥物。為了增加穩(wěn)定性或吸收性，可與碳水化合物如葡萄糖、蔗糖或右旋糖、或抗氧化劑如谷胱甘肽、螯合劑、低分子量蛋白質或其他穩(wěn)定劑等一起使用。
本發(fā)明的藥物組合物的施用量和次數(shù)可根據(jù)作為活性成分的藥物類型，以及其他因素如欲治療的疾病、施用途徑、患者的年齡、性別、體重、和病的嚴重性等來決定。
本發(fā)明組合物的總有效劑量可作為單一劑量或可根據(jù)區(qū)段治療方案作為多劑量長時期施用至患者。本發(fā)明的藥物組合物可根據(jù)疾病嚴重性而具有不同含量的活性成分。優(yōu)選地，本發(fā)明的肽的總劑量可為患者體重每1kg約0.0001μg至500mg。然而，關于肽的劑量，有效劑量考慮多種因素如患者的年齡、體重、健康狀況、性別、病嚴重性、膳食和排泄率等來決定，本領域技術人員可根據(jù)本發(fā)明組合物的特別用途而決定合適的有效劑量。
本發(fā)明的藥物組合物的制劑、施用途徑和施用方法可沒有特別限定，只要該藥物組合物可顯示本發(fā)明的效果即可。
由于本發(fā)明的藥物組合物具有優(yōu)異的體內持續(xù)時間與效價，本發(fā)明的藥物組合物的施用次數(shù)和頻率可顯著降低。
藥物組合物可單獨施用或與顯示預防或治療肥胖效果的其他藥物制劑組合施用。顯示預防或治療肥胖效果的藥物制劑可包括，但不具體限于，glp-1受體激動劑、瘦素受體激動劑、dpp-iv抑制劑、y5受體拮抗劑、黑色素濃縮激素(mch)受體拮抗劑、y2/3受體激動劑、mc3/4受體激動劑、胃/胰脂肪酶抑制劑、5ht2c激動劑、3a受體激動劑、糊精受體激動劑、饑餓肽拮抗劑和/或饑餓肽受體拮抗劑等。
另一方面，本發(fā)明提供用于預防或治療肥胖的方法，包括對受試者施用該肽或含有該肽的藥物組合物。
如本文所用，術語“受試者”意指懷疑具有肥胖或處于具有肥胖風險的受試者，且具體地，意指哺乳動物，包括人類、大鼠和牛，但受試者可為可通過本發(fā)明的肽治療的任何受試者，而無限定。含有本發(fā)明的肽的藥物組合物的施用可有效地治療懷疑具有肥胖的受試者，且該肥胖與上面描述的相同。
本發(fā)明的治療方法可包括施用藥學有效量的含有該肽的藥物組合物。組合物的每日總劑量可通過合適的醫(yī)學判斷由醫(yī)師決定，且該組合物可一次或以幾次分份劑量施用。然而，鑒于本發(fā)明的目的，對于任何特定患者的組合物的具體的治療有效劑量可根據(jù)醫(yī)學領域中熟知的各種因素而變化，包括欲達到的響應的種類與程度，根據(jù)其他藥劑是否與其使用的特定組合物，患者的年齡、體重、健康狀況、性別和膳食，施用的時間與途徑，組合物的排出速率，治療的持續(xù)時間，與本發(fā)明組合物組合或同時使用的其他藥物和醫(yī)學領域中已知的其他因素。
又一方面，本發(fā)明提供肽在制備用于預防或治療肥胖的醫(yī)藥藥物中的用途。
發(fā)明方式
后文中，本發(fā)明將參照下述實施例更詳細地進行描述。然而，這些實施例僅作說明的目的，且本發(fā)明不意圖受限于這些實施例。
實施例1：用于體內活化的細胞系的產生
<1-1>顯示響應于glp-1的camp的細胞系的產生
使用人glp-1受體基因的cdna(origenetechnologies,inc.,usa)的開放閱讀框架(orf)作為模板，以及分別包括hindlll和ecori限制酶切位點的seqidnos:15和16表示的正向和反向引物來進行pcr反應。
特別地，進行pcr反應30個循環(huán)(95℃變性60秒，55℃退火60秒，和68℃延伸30秒)。pcr產物在1.0％瓊脂凝膠中進行電泳，通過洗脫由其獲得405bp片段。
正向引物：5'-cccggcccccgcggccgctattcgaaatac-3'
反向引物：5'-gaacggtccggaggacgtcgactcttaagatag-3'
pcr產物克隆至已知的動物細胞表達載體x0gc/dhfr(韓國專利號10-0880509，后文相同)，以構建重組載體x0gc/glp1r。
由此所構建的重組載體x0gc/glp1r使用lipofectamine(invitrogene,usa)轉化至中國倉鼠卵巢細胞系chodg44的細胞中，該細胞培養(yǎng)于含有10％fbs的dmem/f12培養(yǎng)基中，且于含有g418(lmg/ml)和氨甲蝶呤(10nm)的選擇培養(yǎng)基中選擇與培養(yǎng)。自其選擇單克隆細胞系，且于其中，最終選擇顯示以劑量依賴方式響應glp-1的優(yōu)異camp的細胞系。
<1-2>顯示響應于胰高血糖素的camp的細胞系的產生
使用人胰高血糖素受體基因的cdna(origenetechnologies,inc.,usa)的開放閱讀框架(orf)作為模板，以及分別包括ecori和xhoi限制酶切位點的seqidnos:17和18表示的正向引物和反向引物來進行pcr反應。
具體地，進行pcr反應30個循環(huán)(95℃變性60秒，55℃退火60秒，和68℃延伸30秒)。pcr產物在1.0％瓊脂凝膠上進行電泳，通過洗脫由其獲得435bp片段。
正向引物：5'-cagcgacaccgaccgtccccccgtacttaaggcc-3'
反向引物：5'-ctaaccgactctcggggaagactgagctcgcc-3'
pcr產物克隆至已知的動物細胞表達載體x0gc/dhfr，以構建重組載體x0gc/gccr。
由此所構建的重組載體x0gc/gccr使用lipofectamine(invitrogene，usa)轉化至中國倉鼠卵巢細胞系chodg44的細胞中，該細胞培養(yǎng)于含有10％fbs的dmem/f12培養(yǎng)基中，且于含有g418(1mg/ml)和氨甲蝶呤(10nm)的選擇培養(yǎng)基中選擇與培養(yǎng)。自其選擇單克隆細胞系，且于其中，最終選擇顯示以劑量依賴方式響應胰高血糖素的優(yōu)異camp的細胞系。
實施例2：胰高血糖素衍生物的合成
為了開發(fā)對于glp-1受體和胰高血糖素受體兩者具有優(yōu)異效果的胰高血糖素衍生物，seqidno:1表示的天然胰高血糖素的氨基酸序列用具有結合至glp-1受體的能力的氨基酸序列取代，且如下述表1所示合成胰高血糖素衍生物。
表1
上述表1中，seqidno:2至14的序列中表示為“x”的氨基酸代表α-甲基-谷氨酸，其為非天然氨基酸，且這些序列中的賴氨酸殘基可與谷氨酸殘基形成環(huán)。
實施例3：胰高血糖素衍生物的體外活性的測量
為了測量實施例2中所合成的胰高血糖素衍生物的抗肥胖活性，使用實施例1-1和1-2中所制備的轉化細胞系測量胰高血糖素衍生物的體外細胞活性。
制備轉化細胞系使得人glp-1受體基因和人胰高血糖素受體基因可分別表達于cho，和適合用于測量glp-1和胰高血糖素的活性。因此，根據(jù)本發(fā)明所合成的胰高血糖素的活性分別使用轉化細胞系測量。
具體地，轉化細胞系分別每周傳代培養(yǎng)二或三次，以lx105細胞/孔分取至96-孔板，且培養(yǎng)24小時。
培養(yǎng)的細胞用krebs-ringerbicarbonate(krb)緩沖溶液清洗，懸浮于40ml的含有1mm3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(ibmx)的krb緩沖溶液，且于室溫靜置5分鐘。
根據(jù)本發(fā)明的天然胰高血糖素(seqidno:1)或胰高血糖素衍生物(代表性地，seqidno:12至14的肽)進行范圍為1000nm至0.02nm5-倍間隔的連續(xù)稀釋，對其添加40ml的上述細胞，且于co2培養(yǎng)箱中于37℃培養(yǎng)1小時。
然后，20ml的細胞裂解緩沖液添加至各自所得物，且將該細胞裂解物施加至camp分析試劑盒(moleculardevice,usa)以測量camp濃度，且計算與相互比較ec50值。結果顯示于下述表2中。
表2
如上述表2所示，根據(jù)本發(fā)明的胰高血糖素衍生物相比于seqidno:1表示的天然胰高血糖素，對于glp-1受體和胰高血糖素受體兩者顯示優(yōu)異的效果。
胰高血糖素已知通過活化glp-1受體和胰高血糖素受體而具有肥胖治療效果，從而抑制食欲、增進飽足和促進脂肪細胞裂解。由于根據(jù)本發(fā)明的胰高血糖素衍生物，相比于天然胰高血糖素，顯示對于glp-1受體和胰高血糖素受體兩者具有優(yōu)異的體外效果，所以這些胰高血糖素衍生物可用作較現(xiàn)存胰高血糖素對于治療肥胖更有效的藥劑。
雖然用于說明目的已公開本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，但是本領域技術人員將明了可能的各種修飾、添加和取代，而不背離如所附權利要求中公開的本發(fā)明的范圍與精神。
序列表
<110>韓美藥品株式會社
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