本發(fā)明涉及與神經(jīng)氈蛋白1(neuropilin1,nrp1)結(jié)合的抗體或其抗原結(jié)合片段、編碼它們的核酸、包含所述核酸的載體、用所述載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞、用于制備所述抗體或其抗原結(jié)合片段的方法、包含所述抗體或其抗原結(jié)合片段的抗體-藥物綴合物和其用于預(yù)防或治療癌癥的組合物。

背景技術(shù)：

神經(jīng)氈蛋白(nrp)包括nrp1和nrp2，其最初發(fā)現(xiàn)于神經(jīng)細(xì)胞中。已知nrp1由約923個(gè)氨基酸組成且nrp2由約926個(gè)氨基酸組成。此外，其具有共同的相似結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)且因此具有總計(jì)44％的氨基酸同源性。

已知nrp1為與信號(hào)素3a配體結(jié)合的受體，其作為叢蛋白輔助受體發(fā)揮作用以調(diào)整軸突誘導(dǎo)。已發(fā)現(xiàn)nrp1與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vegf)配體家族成員結(jié)合且因此介導(dǎo)血管生成。

多種生理過(guò)程和病理過(guò)程都通過(guò)血管系統(tǒng)的發(fā)展而發(fā)生。血液必須充足補(bǔ)給至活躍生長(zhǎng)的組織諸如腫瘤。這些組織通常產(chǎn)生促進(jìn)新血管生成和維持的促血管生成因子進(jìn)而通過(guò)血管生成補(bǔ)給血液。血管生成并非簡(jiǎn)單的過(guò)程，其通過(guò)下述步驟實(shí)現(xiàn)：a)從現(xiàn)有內(nèi)皮細(xì)胞(ec)增殖或分化內(nèi)皮細(xì)胞；b)內(nèi)皮細(xì)胞遷移并合生(coalesce)以形成索(cord)樣結(jié)構(gòu)；c)血管索進(jìn)行小管形成并形成在中心形成具有腔的血管；d)現(xiàn)有的索或血管芽開(kāi)始形成二級(jí)血管；e)原始叢繼續(xù)進(jìn)一步的再次生長(zhǎng)和再次生成；和f)內(nèi)皮細(xì)胞置于內(nèi)皮管從而為血管提供維持和調(diào)整功能(這些細(xì)胞包括小毛細(xì)血管情況中的周皮細(xì)胞、大血管情況中的平滑肌細(xì)胞和心臟中的心肌細(xì)胞)。

已知nrp1在多種人腫瘤細(xì)胞系和人腫瘤(諸如成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、星形細(xì)胞瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、睪丸癌、結(jié)腸直腸癌、黑素瘤、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、食管癌和前列腺癌)中表達(dá)。還已知nrp1參與vegf和信號(hào)素對(duì)癌細(xì)胞增殖、存活和轉(zhuǎn)移的效應(yīng)。此外，已知根據(jù)nrp1表達(dá)的程度，癌癥進(jìn)展的程度增加或癌癥患者的預(yù)后差。

當(dāng)腫瘤生長(zhǎng)時(shí)，血管生成在增生(hyperplasia)轉(zhuǎn)化為瘤形成(neoplasia)過(guò)程中至關(guān)重要且在向腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移提供營(yíng)養(yǎng)的過(guò)程中起關(guān)鍵作用。新生血管允許腫瘤細(xì)胞相比于正常細(xì)胞獲得生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)和增殖自主性。由于距可用的毛細(xì)血管層的距離，腫瘤通常始于僅可以數(shù)立方毫米增殖的單異常細(xì)胞且可長(zhǎng)時(shí)間停滯在“潛伏(latent)”狀態(tài)而無(wú)進(jìn)一步生長(zhǎng)或傳播。隨后，一些腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化成為血管生成表型，活化內(nèi)皮細(xì)胞并增殖且成熟為新的毛細(xì)血管。這些新形成的血管不僅允許原發(fā)性腫瘤連續(xù)生長(zhǎng)，還傳播并重新定植轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞。

在這方面，需要能夠以高特異性與nrp1結(jié)合并抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抗nrp1抗體進(jìn)而治療其中nrp1過(guò)表達(dá)的癌癥。

治療性抗體的市場(chǎng)預(yù)期以11.8％的年平均速率生長(zhǎng)，在2017年將達(dá)到899億美元，其中癌癥治療為最大貢獻(xiàn)者。目前，260家生物技術(shù)公司正在開(kāi)發(fā)約700種治療性抗體，其中220種抗體在臨床試驗(yàn)中(gabilondoandlarrick,2000)。在過(guò)去的15年間，已開(kāi)發(fā)了多種抗體，其特異性靶向癌細(xì)胞中高表達(dá)或突變的抗原，且已施用至具有血液或?qū)嶓w腫瘤的患者。

在這些技術(shù)背景下，本申請(qǐng)的發(fā)明人尋求開(kāi)發(fā)用于化療的抗體，其與已知在多種癌癥中表達(dá)的nrp1結(jié)合并內(nèi)化入細(xì)胞。結(jié)果是，本發(fā)明的發(fā)明人使用噬菌體展示技術(shù)開(kāi)發(fā)了以高特異性與nrp1結(jié)合并內(nèi)化入細(xì)胞的抗nrp1抗體，并確認(rèn)了這樣的抗nrp1抗體可顯著抑制癌細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)，由此完成本發(fā)明。

背景部分的上述信息目的僅在于加強(qiáng)對(duì)本發(fā)明背景的理解，且因此本發(fā)明可排除本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的現(xiàn)有技術(shù)中的信息。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供與nrp1結(jié)合的新穎抗體或其抗原結(jié)合片段。

本發(fā)明的另一目的是提供編碼所述抗體或其抗原結(jié)合片段的核酸。

本發(fā)明另一目的是提供包含所述核酸的載體、用所述載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞和用于制備它們的方法。

本發(fā)明的另一目的是提供包含所述抗體或其抗原結(jié)合片段的抗體-藥物綴合物。

本發(fā)明的另一目的是提供用于預(yù)防或治療癌癥的組合物，所述組合物包含所述抗體或其抗原結(jié)合片段或抗體-藥物綴合物。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供nrp1(神經(jīng)氈蛋白1)的抗體或其抗原結(jié)合片段，其與表達(dá)在細(xì)胞表面上的nrp1結(jié)合并內(nèi)化入細(xì)胞。

本發(fā)明進(jìn)一步提供編碼所述抗體或其抗原結(jié)合片段的重鏈可變區(qū)的核酸。

本發(fā)明進(jìn)一步提供包含所述核酸的載體。

本發(fā)明進(jìn)一步提供用所述載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。

本發(fā)明進(jìn)一步提供生產(chǎn)所述抗體或其抗原結(jié)合片段的方法，其包括步驟：(a)培養(yǎng)所述細(xì)胞；和(b)從所述培養(yǎng)的細(xì)胞回收所述抗體或其抗原結(jié)合片段。

本發(fā)明進(jìn)一步提供包含所述抗體或其抗原結(jié)合片段的抗體-藥物綴合物。

本發(fā)明進(jìn)一步提供用于預(yù)防或治療癌癥的包含所述抗體或其抗原結(jié)合片段的組合物。

附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示了過(guò)表達(dá)nrp1的患者衍生細(xì)胞的facs分析結(jié)果。

圖2顯示了用于鑒定抗nrp1scfv抗體片段的噬菌體展示篩選的結(jié)果。

圖3顯示了41種與人nrp1結(jié)合的scfv抗體片段的結(jié)合親和力。

圖4是用于生成scfv抗體片段的噬菌粒載體的示意圖。

圖5顯示了每種純化的scfv抗體片段的考馬斯染色結(jié)果。

圖6顯示了闡明三種抗nrp1scfv抗體對(duì)nrp1的結(jié)合親和力的elisa結(jié)果。

圖7顯示了闡明依據(jù)三種抗nrp1抗體片段的濃度對(duì)nrp1的結(jié)合親和力的elisa結(jié)果。

圖8顯示了闡明通過(guò)spr分析三種抗nrp1scfv抗體的kd值的結(jié)果。

圖9顯示了闡明抗nrp1scfv抗體片段對(duì)nrp1過(guò)表達(dá)的患者衍生細(xì)胞的結(jié)合親和力的facs分析結(jié)果。

圖10a-10c是通過(guò)共聚焦激光掃描顯微鏡獲得的圖像，其顯示三種抗nrp1scfv抗體的內(nèi)化功能。

圖11顯示了使用u87mg細(xì)胞系的抗nrp1scfv抗體片段抑制細(xì)胞遷移的結(jié)果。

圖12顯示了三種抗nrp1igg抗體的生成純度。

圖13顯示了三種抗nrp1igg抗體的內(nèi)毒素測(cè)試結(jié)果。

圖14顯示了使用elisa測(cè)量抗nrp1igg的kd值的結(jié)果。

圖15顯示了測(cè)量三種抗nrp1igg對(duì)人nrp1的特異性結(jié)合親和力的結(jié)果。

圖16顯示了使用活細(xì)胞成像的癌細(xì)胞特異性內(nèi)化的結(jié)果。

圖17顯示了使用細(xì)胞成像的正常細(xì)胞內(nèi)化的結(jié)果。

圖18顯示了使用facs的癌細(xì)胞特異性內(nèi)化的結(jié)果。

圖19顯示了成膠質(zhì)細(xì)胞瘤皮下模型中ircr-101內(nèi)化的結(jié)果。

圖20顯示了ircr-101的癌細(xì)胞特異性結(jié)合能力。

圖21顯示了ircr-101對(duì)成膠質(zhì)細(xì)胞瘤異種移植模型中的癌癥特異性nrp1的結(jié)合能力。

圖22顯示了ircr-101對(duì)成膠質(zhì)細(xì)胞瘤患者樣品中的癌癥特異性nrp1的結(jié)合能力。

圖23顯示了使用成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞系u87mg和患者衍生細(xì)胞的細(xì)胞遷移抑制能力的結(jié)果。

圖24顯示了ircr-101對(duì)成膠質(zhì)細(xì)胞瘤皮下模型中新生血管的抑制性效應(yīng)的結(jié)果。

圖25顯示了ircr-101治療涉及的下游信號(hào)傳導(dǎo)變化的結(jié)果。

圖26顯示了成膠質(zhì)細(xì)胞瘤原位模型中ircr-101的分布。

圖27顯示了雄性和雌性猴tma的分析結(jié)果。

具體實(shí)施方式

除非另外定義，本文使用的全部的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員所通常理解的相同含義。一般而言，本文使用的命名法是本領(lǐng)域公知和常用的。

一方面，本發(fā)明涉及針對(duì)nrp1(神經(jīng)氈蛋白1)的抗體或其抗原結(jié)合片段，且所述抗體或其抗原結(jié)合片段與表達(dá)在細(xì)胞表面上的nrp1結(jié)合并內(nèi)化入細(xì)胞。

本發(fā)明的發(fā)明人尋求開(kāi)發(fā)用于化療的抗體，其通過(guò)與已知在多種癌癥中表達(dá)的nrp1結(jié)合內(nèi)化入細(xì)胞。結(jié)果是，本發(fā)明的發(fā)明人使用噬菌體展示技術(shù)生成了以高親和力與nrp1結(jié)合并內(nèi)化入細(xì)胞的抗nrp1抗體，并確認(rèn)了這樣的抗nrp1抗體可顯著抑制癌細(xì)胞的遷移。

根據(jù)本發(fā)明示例性實(shí)施方案，已確認(rèn)本發(fā)明的抗nrp1抗體與在癌細(xì)胞表面上表達(dá)的nrp1結(jié)合且隨后內(nèi)化入細(xì)胞(參見(jiàn)圖10a-10c)。與細(xì)胞表面上的nrp1結(jié)合并在該位點(diǎn)阻斷子信號(hào)傳輸?shù)目贵w不同的是，本發(fā)明的抗體與細(xì)胞表面的nrp1結(jié)合且隨后進(jìn)入細(xì)胞，進(jìn)而阻斷與nrp1相關(guān)的全部信號(hào)傳輸，由此預(yù)期將產(chǎn)生巨大的治療效果。

如本文使用的“神經(jīng)氈蛋白”或nrp共包括神經(jīng)氈蛋白-1(nrp1)、神經(jīng)氈蛋白-2(nrp2)及其同種型和變體。神經(jīng)氈蛋白是120-130kda的非酪氨酸激酶受體。存在多種nrp-1和nrp-2的剪接變體和可溶性同種型。神經(jīng)氈蛋白的基本結(jié)構(gòu)包括五個(gè)結(jié)構(gòu)域：三個(gè)胞外結(jié)構(gòu)域(a1a2、b1b2和c)、一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域和一個(gè)細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。a1a2結(jié)構(gòu)域與clr和cls(cub)的補(bǔ)體組分同源，其一般包含形成兩個(gè)二硫橋的四個(gè)半胱氨酸殘基。b1b2結(jié)構(gòu)域與凝血因子v和viii同源。c結(jié)構(gòu)域的中心部分由于其與安眠蛋白(meprin)、a5和受體酪氨酸磷酸酶μ蛋白的同源性被稱為mam。a1a2和b1b2結(jié)構(gòu)域?qū)τ谂潴w結(jié)合是關(guān)鍵的，而c結(jié)構(gòu)域?qū)τ谕刍虍惗刍顷P(guān)鍵的。

“神經(jīng)氈蛋白-1介導(dǎo)的生物活性”指其中神經(jīng)氈蛋白-1起實(shí)質(zhì)性作用的生理或病理狀況，例如但不限于胚胎神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育或神經(jīng)細(xì)胞再生、血管生成(包括再次血管生成)、腫瘤發(fā)生和腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程中的外顯子引導(dǎo)。

如本文使用的術(shù)語(yǔ)“抗體”意為與nrp1特異性結(jié)合的抗nrp1抗體。本發(fā)明的范圍不僅包括與nrp1特異性結(jié)合的完整抗體形式，還包括這種抗體分子的抗原結(jié)合片段。

完整的抗體是具有兩條全長(zhǎng)輕鏈和兩條全長(zhǎng)重鏈的結(jié)構(gòu)，且每條輕鏈通過(guò)二硫鍵與重鏈連接。重鏈的恒定區(qū)具有伽瑪(γ)、繆(μ)、阿爾法(α)、德?tīng)査?δ)和伊普西龍(ε)類型。亞型具有伽瑪1(γ1)、伽瑪2(γ2)、伽瑪3(γ3)、伽瑪4(γ4)、阿爾法1(α1)和阿爾法2(α2)類型。輕鏈的恒定區(qū)具有卡帕(κ)和蘭布達(dá)(λ)類型。

抗體的抗原結(jié)合片段或抗體片段指具有抗原結(jié)合功能的片段且包括fab、f(ab')、f(ab')2、fv等?？贵w片段的fab具有包括下述的結(jié)構(gòu)：輕鏈和重鏈的可變區(qū)、輕鏈的恒定區(qū)和具有一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的重鏈的第一恒定區(qū)(ch1)。fab'與fab的區(qū)別在于其具有在重鏈ch1結(jié)構(gòu)域的c末端處的包含一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸殘基的鉸鏈區(qū)。當(dāng)fab'鉸鏈區(qū)的半胱氨酸殘基形成二硫鍵時(shí)生成f(ab')2抗體。用于生成具有最小抗體片段(僅具有重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū))的fv片段的重組技術(shù)描述于pct國(guó)際公開(kāi)第wo88/10649、wo88/106630、wo88/07085、wo88/07086和wo88/09344號(hào)中。兩條鏈的fv在重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)間具有非共價(jià)鍵合。單鏈fv(scfv)經(jīng)由肽接頭通過(guò)共價(jià)鍵或直接在c末端與重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)連接。因此，單鏈fv(scfv)具有諸如二聚體的結(jié)構(gòu)，其與兩條鏈fv相似。這樣的抗體片段可使用蛋白水解酶獲得(例如，當(dāng)使用木瓜蛋白酶切割完整抗體時(shí)，可獲得fab，且當(dāng)使用胃蛋白酶切割完整蛋白時(shí)，可獲得f(ab')2片段)，且其還可通過(guò)基因重組技術(shù)生成。

根據(jù)本發(fā)明的示例性實(shí)施方案，抗體為fv(例如scfv)形式或完整抗體形式。此外，重鏈恒定區(qū)可選自下述任一種同種型：伽瑪(γ)、繆(μ)、阿爾法(α)、德?tīng)査?δ)和伊普西龍(ε)。例如，恒定區(qū)為γ1(igg1)、γ3(igg3)或γ4(igg4)。輕鏈恒定區(qū)可以是κ或λ類型。

如本文使用的術(shù)語(yǔ)“重鏈”指包含可變區(qū)結(jié)構(gòu)域vh和三個(gè)恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域ch1、ch2和ch3的全長(zhǎng)重鏈及其片段，所述可變區(qū)結(jié)構(gòu)域vh包含具有足以賦予對(duì)抗原的特異性的可變區(qū)序列的氨基酸序列。如本文使用的術(shù)語(yǔ)“輕鏈”指包含可變區(qū)結(jié)構(gòu)域vl和恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域cl的全長(zhǎng)重鏈及其片段，所述可變區(qū)結(jié)構(gòu)域vl包含具有足以賦予對(duì)抗原的特異性的可變區(qū)序列的氨基酸序列。

本發(fā)明的抗體包括但不限于單克隆抗體、多重特異性抗體、人抗體、人源化抗體、嵌合抗體、單鏈fv(scfv)、單鏈抗體、fab片段、f(ab)'片段、二硫鍵fv(sdfv)和抗獨(dú)特型(抗id)抗體或這些抗體的表位結(jié)合片段等。

單克隆抗體指從基本上同源的抗體群體獲得的抗體，即除可能以占據(jù)群體的個(gè)體抗體的痕量存在的天然發(fā)生的突變外，它們是相同的。單克隆抗體是高度特異性的且針對(duì)單抗原性位點(diǎn)衍生。

“人源化”形式的非人(例如鼠類)抗體是嵌合抗體，其包含源自非人免疫球蛋白的最小序列。在大多情況中，人源化抗體是人免疫球蛋白(受體抗體)，其已由來(lái)自非人物種(諸如小鼠、大鼠、兔和非人靈長(zhǎng)類)的高變區(qū)(供體抗體)的殘基替換，其具有特異性、親和力和保持來(lái)自受體高變區(qū)殘基的能力。

“人抗體”是源自人免疫球蛋白的分子且意為構(gòu)成抗體的全部氨基酸序列(包括互補(bǔ)決定區(qū)和結(jié)構(gòu)區(qū))由人免疫球蛋白組成。

重鏈和/或輕鏈與源自特定物種或?qū)儆谔囟贵w種類或亞類的抗體對(duì)應(yīng)的序列部分相同或同源，而剩余的鏈與源自另一物種或?qū)儆诹硪豢贵w類型或亞類的抗體對(duì)應(yīng)的序列相同或同源。“嵌合”抗體(免疫球蛋白)以及這種抗體的片段呈現(xiàn)期望的生物活性。

如本文使用的“抗體可變域”指抗體分子的輕和重鏈區(qū)，其包含互補(bǔ)決定區(qū)(cdr；即cdr1、cdr2和cdr3)和框架區(qū)(fr)的氨基酸序列。vh指重鏈的可變域。vl指輕鏈的可變域。

“互補(bǔ)決定區(qū)”(cdr；即cdr1、cdr2和cdr3)指抗體可變域的氨基酸殘基，其對(duì)于抗原結(jié)合是必需的。每個(gè)可變域通常具有三個(gè)cdr區(qū)，稱為cdr1、cdr2和cdr3。

“框架區(qū)”(fr)是可變域殘基而非cdr殘基。每個(gè)可變域通常具有四個(gè)fr，稱為fr1、fr2、fr3和fr4。

根據(jù)本發(fā)明的示例性實(shí)施方案，抗體或其抗原結(jié)合片段包括如下的重鏈cdr(互補(bǔ)決定區(qū))和輕鏈cdr：重鏈可變區(qū)，其包含含有序列seqidno:1或7的序列的互補(bǔ)決定區(qū)(cdr)h1、含有序列seqidno:2或8的序列的cdrh2和含有選自序列seqidno:3、9和13的任一種序列的cdrh3；和輕鏈可變區(qū)，其包含含有序列seqidno:4或10的cdrl1、含有選自序列seqidno:5、11和14的任一種序列的cdrl2和含有選自序列seqidno:6、12和15的任一種序列的cdrl3。

根據(jù)本發(fā)明的示例性實(shí)施方案，抗體或其抗原結(jié)合片段包含具有如下cdr的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)：

(i)重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)包含分別含有序列seqidno:1-3的cdrh1、cdrh2和cdrh3，所述輕鏈可變區(qū)包含分別含有序列seqidno:4-6的cdrl1、cdrl2和cdrl3；

(ii)重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)包含分別含有序列seqidno:7-9的cdrh1、cdrh2和cdrh3，所述輕鏈可變區(qū)包含分別含有序列seqidno:10-12的cdrl1、cdrl2和cdrl3；或

(iii)重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)包含分別含有序列seqidno:7、8和13的cdrh1、cdrh2和cdrh3，所述輕鏈可變區(qū)包含分別含有序列seqidno:10、14和15的cdrl1、cdrl2和cdrl3。

根據(jù)本發(fā)明的示例性實(shí)施方案，抗體或其抗原結(jié)合片段可包含含有重鏈框架區(qū)(fr)的重鏈可變區(qū)，所述重鏈框架區(qū)(fr)包含選自序列seqidno:28-33的一種序列。

此處，抗體或其抗原結(jié)合片段可包含含有序列編號(hào)28的序列的重鏈fr1、含有序列seqidno:29或30的重鏈fr2、含有序列seqidno:31或32的重鏈fr3或含有序列seqidno:33的重鏈fr4。

此外，本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合片段可包含含有輕鏈框架區(qū)(fr)的輕鏈可變區(qū)，所述輕鏈框架區(qū)(fr)包含選自序列seqidno:34-42的一種序列。

此處，抗體或其抗原結(jié)合片段可包含含有seqidno:34-36的任一序列的輕鏈fr1、含有seqidno:37-39的任一序列的輕鏈fr2、含有seqidno:40或41的序列的輕鏈fr3或含有seqidno:42的序列的輕鏈fr4。

根據(jù)本發(fā)明的示例性實(shí)施方案，抗體或其抗原結(jié)合片段可包含如下的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)：

(i)含有seqidno:16的序列的重鏈可變區(qū)和含有seqidno:17的輕鏈可變區(qū)；(ii)含有seqidno:18的序列的重鏈可變區(qū)和含有seqidno:19的輕鏈可變區(qū)；或(iii)含有seqidno:20的序列的重鏈可變區(qū)和含有seqidno:21的輕鏈可變區(qū)。

更具體地，本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合片段包含如下的輕鏈可變區(qū)或重鏈可變區(qū)：

(i)含有seqidno:16的序列的重鏈可變區(qū)和含有seqidno:17的輕鏈可變區(qū)(4f12抗體)；

(ii)含有seqidno:18的序列的重鏈可變區(qū)和含有seqidno:19的輕鏈可變區(qū)(1a03抗體)；或

(iii)含有seqidno:20的序列的重鏈可變區(qū)和含有seqidno:21的輕鏈可變區(qū)(3h10抗體)。

fv片段是包含完整的抗體識(shí)別和結(jié)合位點(diǎn)的抗體片段。這樣的區(qū)包括重鏈可變域和輕鏈可變域，例如，與scfv基本上緊密共價(jià)連接的二聚體。

“fab”片段包含輕鏈的可變域和恒定域和重鏈的可變域和第一恒定域(chl)。f(ab')2抗體片段一般包括一對(duì)fab片段，所述fab片段通過(guò)其靠近其羧基末端的鉸鏈半胱氨酸共價(jià)連接。

“單鏈fv”或“scfv”抗體片段包括抗體的vh和vl結(jié)構(gòu)域。這樣的結(jié)構(gòu)域在單多肽鏈內(nèi)。fv多肽可進(jìn)一步包含在vh結(jié)構(gòu)域和vl結(jié)構(gòu)域間的多肽接頭進(jìn)而scfv可形成抗原結(jié)合的期望結(jié)構(gòu)。

“噬菌體展示”是用于展示融合蛋白的技術(shù)，其通過(guò)將突變的多肽和噬菌體(諸如纖維狀噬菌體顆粒)表面上的至少一部分衣殼蛋白融合實(shí)現(xiàn)。噬菌體展示可用于靶向大的隨機(jī)化蛋白變體文庫(kù)以迅速并有效地將以高親和力與靶抗原結(jié)合的序列分類。在噬菌體上展示肽和蛋白文庫(kù)已用于篩選上百萬(wàn)的多肽以鑒別具有特異性結(jié)合性質(zhì)的多肽。

噬菌體展示技術(shù)已為生成并篩選與特異性配體(例如抗原)結(jié)合的新穎蛋白提供了有力工具。使用噬菌體展示技術(shù)，可生成大的蛋白變體文庫(kù)并對(duì)以高親和力與靶抗原結(jié)合的序列迅速分類。編碼突變體多肽的核酸與編碼病毒衣殼蛋白(例如基因iii蛋白或基因viii蛋白)的核酸序列融合。已經(jīng)開(kāi)發(fā)了單價(jià)噬菌體展示系統(tǒng)，其中編碼蛋白或多肽的核酸序列與編碼部分基因iii蛋白的核酸序列融合。在單價(jià)噬菌體展示系統(tǒng)中，基因融合以低水平表達(dá)，且還表達(dá)野生型基因iii蛋白，由此維持顆粒的感染性。

證明肽在纖維狀噬菌體表面上的表達(dá)和功能性抗體片段在大腸桿菌的外周細(xì)胞質(zhì)中的表達(dá)對(duì)于發(fā)展抗體噬菌體展示文庫(kù)是重要的。已以多種方式制備抗體或抗原結(jié)合多肽的文庫(kù)，例如通過(guò)插入隨機(jī)dna序列改變單基因或通過(guò)克隆相關(guān)的基因系。可使用文庫(kù)篩選具有期望性質(zhì)的抗體或抗原結(jié)合蛋白的表達(dá)。

噬菌體展示技術(shù)對(duì)于生成具有期望性質(zhì)的抗體具有超越常規(guī)雜交瘤和重組方法的數(shù)種優(yōu)勢(shì)。該技術(shù)允許在短時(shí)間內(nèi)生成具有多種序列的大的抗體文庫(kù)而無(wú)需使用動(dòng)物。雜交瘤或人源化抗體的生成可花費(fèi)數(shù)月生產(chǎn)。此外，由于無(wú)需免疫，噬菌體抗體文庫(kù)可針對(duì)有毒或具有低抗原性的抗原生成抗體。噬菌體抗體文庫(kù)還可用于生成或鑒別新穎的治療性抗體。

人抗體可從原始b細(xì)胞ig所有組成成分(repertoire)或未經(jīng)免疫或經(jīng)免疫的人種系序列使用噬菌體展示文庫(kù)生成。多種淋巴組織可用于制備原始或非免疫抗原結(jié)合文庫(kù)。

用于從噬菌體展示文庫(kù)鑒別和分離高親和力抗體的技術(shù)對(duì)于分離新型治療性抗體是重要的。從文庫(kù)分離高親和力抗體可依賴于文庫(kù)大小、細(xì)菌細(xì)胞中的生產(chǎn)效率和文庫(kù)多樣性。文庫(kù)的大小由于抗體或抗原結(jié)合蛋白的不當(dāng)折疊和終止密碼子的存在通過(guò)不足生產(chǎn)而減少。當(dāng)抗體或抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域不當(dāng)折疊時(shí)，細(xì)菌細(xì)胞中的表達(dá)可受到抑制。表達(dá)可通過(guò)交替突變?cè)诳勺?恒定界面表面上的殘基或經(jīng)選擇的cdr殘基而增加?？蚣軈^(qū)的序列是當(dāng)抗體噬菌體文庫(kù)在細(xì)菌細(xì)胞中生成時(shí)提供適當(dāng)折疊的一種元件(element)。

重要的是在高親和力抗體分離中生成抗體或抗原結(jié)合蛋白的多種文庫(kù)。已發(fā)現(xiàn)cdr3區(qū)經(jīng)常參與抗原結(jié)合。重鏈上的cdr3區(qū)就大小、序列和結(jié)構(gòu)空間構(gòu)象而言變化很大，進(jìn)而可使用cdr3區(qū)制備多種文庫(kù)。

此外，可在每個(gè)位置使用全部20種氨基酸通過(guò)隨機(jī)化可變重鏈和輕鏈的cdr區(qū)產(chǎn)成多樣性。使用全部20種氨基酸導(dǎo)致變體抗體序列的變性的增加和鑒別新型抗體機(jī)會(huì)的增加

在特異性識(shí)別nrp1的范圍內(nèi)，本發(fā)明的抗體或抗體片段可包括本發(fā)明所述的抗nrp1抗體的序列及其生物學(xué)等價(jià)物。可僅額外修飾抗體的氨基酸序列以進(jìn)一步改善抗體的結(jié)合親和力和/或其他生物學(xué)性質(zhì)。這樣的修飾包括抗體氨基酸序列殘基的例如缺失、插入和/或取代。這樣的氨基酸變化基于氨基酸側(cè)鏈取代基的相對(duì)相似性諸如疏水性、親水性、電荷和大小產(chǎn)生。通過(guò)分析氨基酸側(cè)鏈取代基的大小、形狀和類型，認(rèn)可的是精氨酸、賴氨酸和組氨酸的每一種是帶正電荷的殘基；丙氨酸、甘氨酸和絲氨酸具有相似的大小；且苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸具有相似的形狀?；谶@些考量，因此發(fā)現(xiàn)了精氨酸、賴氨酸和組氨酸；丙氨酸、甘氨酸和絲氨酸；及苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸分別為生物學(xué)上的功能等價(jià)物。

在引入突變時(shí)，可以考慮氨基酸的親水性指數(shù)(hydropathicindex)。根據(jù)其疏水性和電荷，為每種氨基酸分配了疏水性指數(shù)：異亮氨酸(+4.5)；纈氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；蘇氨酸(-0.7)；絲氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；組氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；賴氨酸(-3.9)；和精氨酸(-4.5)。

疏水性氨基酸指數(shù)對(duì)于賦予蛋白的交互生物功能非常重要。已知使用具有相似疏水性指數(shù)的氨基酸取代可保持相似的生物學(xué)活性。當(dāng)參照疏水性指數(shù)引入突變時(shí)，在顯示疏水指數(shù)差異的氨基酸之間生成取代，所述疏水指數(shù)差異優(yōu)選在±2內(nèi)，更優(yōu)選在±1內(nèi)，甚至更優(yōu)選在±0.5內(nèi)。

同時(shí)，還已知具有相似親水性值的氨基酸之間的取代導(dǎo)致具有等價(jià)生物學(xué)活性的蛋白。如美國(guó)專利第4,554,101號(hào)所公開(kāi)，將下述親水性值分配給每個(gè)氨基酸殘基：精氨酸(+3.0)；賴氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；絲氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；蘇氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸(-0.5)；組氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；纈氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；異亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；和色氨酸(-3.4)。

蛋白中不完全改變分子活性的氨基酸取代為本領(lǐng)域已知(h.neurath,r.l.hill,theproteins,academicpress,newyork,1979)。取代最常發(fā)生在氨基酸殘基例如ala/ser、val/ile、asp/glu、thr/ser、ala/gly、ala/thr、ser/asn、ala/val、ser/gly、thr/phe、ala/pro、lys/arg、asp/asn、leu/ile、leu/val、ala/glu和asp/gly之間。

考慮具有上述生物學(xué)等價(jià)活性的突變，本發(fā)明的抗體或編碼所述抗體的核酸分子應(yīng)理解為包括與序列表中所述序列展示基本同一性(substantialidentity)的序列?；就恍砸鉃橥ㄟ^(guò)將本發(fā)明的序列與任何其他序列盡可能多地進(jìn)行比對(duì)并使用本領(lǐng)域通常使用的算法分析經(jīng)比對(duì)的序列，序列展示至少61％同源性的序列，更優(yōu)選70％同源性，甚至更優(yōu)選80％同源性，且最優(yōu)選90％同源性。序列比較的比對(duì)方法為本領(lǐng)域公知。ncbi基本局部比對(duì)搜索工具(ncbibasiclocalalignmentsearchtool，blast)可從例如nbci獲得且可與互聯(lián)網(wǎng)上的序列分析程序諸如blastp、blasm、blastx、tblastn和tblastx聯(lián)合使用。blsat可在www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/獲得。使用該程序比較序列同源性可在www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast_help.html獲得。

另一方面，本發(fā)明涉及編碼所述抗體或其抗原結(jié)合片段的核酸。

本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合片段可通過(guò)分離編碼本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合片段的核酸重組生成。分離核酸并將其插入可克隆載體以實(shí)現(xiàn)進(jìn)一步的克隆(dna的擴(kuò)增)或進(jìn)一步的表達(dá)。以此為基礎(chǔ)，本發(fā)明涉及包含根據(jù)本發(fā)明的另一方面的核酸的載體。

“核酸”具有包含dna(gdna和cdna)和rna分子的廣泛含義。核酸的基本元件核苷酸包括天然核苷酸以及其中糖或堿基位點(diǎn)經(jīng)修飾的類似物。編碼本發(fā)明的重鏈和輕鏈可變區(qū)的核酸的序列可以是經(jīng)修飾的。這樣的修飾包括核苷酸的添加、缺失或非保守取代或保守取代。

根據(jù)本發(fā)明的示例性實(shí)施方案，編碼抗體或其抗原結(jié)合部分的重鏈可變區(qū)的核酸可包含seqidno:22、24或26的序列，且編碼輕鏈可變區(qū)的核酸可包含seqidno:23、25或27的序列。

本發(fā)明的核酸可理解為包含與所述核苷酸序列呈現(xiàn)基本同一性的核苷酸序列?；就恍砸鉃橥ㄟ^(guò)將本發(fā)明的核苷酸序列與任何其他序列盡可能多地進(jìn)行比對(duì)并使用本領(lǐng)域常用的算法分析經(jīng)比對(duì)的序列，核苷酸序列顯示至少80％同源性，更優(yōu)選至少90％同源性，且最優(yōu)選至少95％同源性。

編碼所述抗體的dna可使用常規(guī)操作容易地分離或合成(例如，使用能夠特異性地與編碼抗體的重鏈和輕鏈的dna特異性結(jié)合的寡核苷酸探針)?？墒褂枚喾N載體。載體組分一般包括但不限于下述一種或多種：信號(hào)序列、復(fù)制起點(diǎn)、一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記物基因、增強(qiáng)子元件、啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄終止序列。

如本文使用的術(shù)語(yǔ)“載體”包括質(zhì)粒載體；黏粒載體；噬菌體載體和病毒載體(例如腺病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體和腺相關(guān)病毒載體)作為用于在宿主細(xì)胞中表達(dá)靶基因的方式。在載體中編碼所述抗體的核酸與啟動(dòng)子可操作連接。

“可操作連接”意為核酸表達(dá)控制序列(例如啟動(dòng)子陣列、信號(hào)序列或轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子結(jié)合位點(diǎn))和另一核酸序列之間的功能性連接，由此控制另一核酸序列的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯。

當(dāng)將原核細(xì)胞用作宿主時(shí)，一般包括能夠促進(jìn)轉(zhuǎn)錄的強(qiáng)啟動(dòng)子(諸如tac啟動(dòng)子、lac啟動(dòng)子、lacuv5啟動(dòng)子、lpp啟動(dòng)子、plλ啟動(dòng)子、prλ啟動(dòng)子、rac5啟動(dòng)子、amp啟動(dòng)子、reca啟動(dòng)子、sp6啟動(dòng)子、trp啟動(dòng)子和t7啟動(dòng)子)、用于初始翻譯的核糖體結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄/翻譯終止序列。此外，例如當(dāng)將真核細(xì)胞用作宿主時(shí)，可使用源自哺乳動(dòng)物細(xì)胞的基因組的啟動(dòng)子(例如金屬硫蛋白啟動(dòng)子、β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子、人血紅蛋白啟動(dòng)子和人肌肉肌酸啟動(dòng)子)或源自哺乳動(dòng)物病毒的啟動(dòng)子(例如腺病毒晚期啟動(dòng)子、牛痘病毒7.5k啟動(dòng)子、sv40啟動(dòng)子、巨細(xì)胞病毒(cmv)啟動(dòng)子、hsvtk啟動(dòng)子、小鼠乳腺腫瘤病毒(mmtv)啟動(dòng)子、hivltr啟動(dòng)子、eb病毒(ebv)啟動(dòng)子、莫洛尼病毒(moloneyvirus)啟動(dòng)子和勞斯肉瘤病毒(rsv)啟動(dòng)子)，且一般具有作為轉(zhuǎn)錄終止序列的多聚腺苷酸化序列。

任選地，載體可與另一序列融合進(jìn)而促進(jìn)由其表達(dá)的抗體的純化。融合的序列包括例如谷胱甘肽s-轉(zhuǎn)移酶(pharmacia,usa)、麥芽糖結(jié)合蛋白(neb,usa)、flag(ibi,usa)和6xhis(hexahistidine；quiagen,usa)。

載體包括本領(lǐng)域通常使用的抗生素抗性基因作為可選擇的標(biāo)記物，且所述抗性基因包括例如針對(duì)氨芐青霉素、慶大霉素、羧芐青霉素、氯霉素、鏈霉素、卡那霉素、遺傳霉素、新霉素和四環(huán)素的基因。

根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了以上述載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。用于生成本發(fā)明抗體的細(xì)胞可以是但不限于原核細(xì)胞、酵母或更高等的真核細(xì)胞。

可使用原核宿主細(xì)胞，例如屬于芽孢桿菌屬諸如大腸桿菌、枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)和蘇蕓金芽胞桿菌(bacillusthuringiensis)、鏈霉菌屬(streptomyces)、假單胞菌屬(pseudomonas)(例如惡臭假單胞菌(pseudomonasputida))、奇異變形菌(proteusmirabilis)和葡萄球菌屬(staphylococcus)(例如肉葡萄球菌(staphylococcuscarnosus))。

同時(shí)，對(duì)動(dòng)物細(xì)胞的興趣最大，且有用的宿主細(xì)胞系的實(shí)例可以是但不限于此：cos-7、bhk、cho、chok1、dxb-11、dg-44、cho/-dhfr、cv1、cos-7、hek293、bhk、tm4、vero、hela、mdck、brl3a、w138、hepg2、sk-hep、mmt、tri、mrc5、fs4、3t3、rin、a549、pc12、k562、per.c6、sp2/0、ns-0、u20s或ht1080。

根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了生成抗體或其抗原結(jié)合片段的方法，其包括：(a)培養(yǎng)所述細(xì)胞；和(b)從所述培養(yǎng)的細(xì)胞回收所述抗體或其抗原結(jié)合片段。

可在多種介質(zhì)中培養(yǎng)細(xì)胞?？蓪⑹惺劢橘|(zhì)用作培養(yǎng)基而不受限制。本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的全部其他必須補(bǔ)加物(supplement)可以適當(dāng)濃度包含在內(nèi)。培養(yǎng)條件例如溫度和ph已與用于表達(dá)的經(jīng)選擇的宿主細(xì)胞一起使用，其對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員將是顯而易見(jiàn)的。

當(dāng)回收抗體或其抗原結(jié)合片段時(shí)，可去除雜質(zhì)，例如通過(guò)離心或超濾，且可純化所得產(chǎn)物，例如通過(guò)親和色譜。可使用其他純化技術(shù)，諸如陰離子或陽(yáng)離子交換色譜、疏水相互作用色譜和羥基磷灰石色譜。

根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了包含所述抗體或其抗原結(jié)合片段和藥物的抗體-藥物綴合物。由于nrp1是在癌細(xì)胞表面上過(guò)表達(dá)的分子，當(dāng)使用其中藥物額外與本發(fā)明的抗體結(jié)合的抗體-藥物綴合物時(shí)，可能選擇性地僅靶向癌細(xì)胞同時(shí)最小程度地影響正常細(xì)胞。

這樣的藥物包括化學(xué)物質(zhì)、放射性核素、免疫治療劑、細(xì)胞因子、趨化因子、毒素、生物制劑和酶抑制劑。例如，本發(fā)明的抗體或其片段可直接或間接與抗癌劑結(jié)合，所述抗癌劑為例如阿西維辛(acivicin)、阿柔比星(aclarubicin)、阿考達(dá)唑(acodazole)、山油柑堿(acronycine)、阿多來(lái)新(adozelesin)、阿拉諾新(alanosine)、阿地白介素(aldesleukin)、別嘌醇鈉(allopurinolsodium)、六甲蜜胺(altretamine)、氨魯米特(aminoglutethimide)、氨萘非特(amonafide)、聚肌胞(ampligen)、安吖啶(amsacrine)、雄激素(androgen)、蛇形菌素(anguidine)、氨基乙酸阿非迪霉素(aphidicolinglycinate)、亮氨酸溶肉瘤素(asaley)、天冬酰胺酶(asparaginase)、5-阿扎胞苷(5-azacitidine)、硫唑嘌呤(azathioprine)、卡介苗(bacilluscalmette-guerin，bcg)、三嗪苯酰胺(baker'santifol)、β-2-脫氧硫代鳥(niǎo)苷(beta-2-deoxythioguanosine)、鹽酸比生群(bisantrenehcl)、硫酸博來(lái)霉素(bleomycinsulfate)、白消安(busulfan)、丁硫氨酸亞砜(buthioninesulfoximine)、bwa773u82、bw502u83/hcl、bw7u85甲磺酸鹽、ceracemide、卡貝替姆(carbetimer)、卡鉑(carboplatin)、卡莫司汀(carmustine)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、氯喹喔啉-磺酰胺(chloroquinoxaline-sulfonamide)、氯脲菌素(chlorozotocin)、色霉素a3(chromomycina3)、順鉑(cisplatin)、克拉屈濱(cladribine)、皮質(zhì)類固醇(corticosteroid)、短小棒狀桿菌(corynebacteriumparvum)、cpt-11、克立那托(crisnatol)、安西他濱(cyclocytidine)、環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide)、阿糖胞苷(cytarabine)、溴茴丙烯酸鈉(cytembena)、dabismaleate、達(dá)卡巴嗪(dacarbazine)、放線菌素d(dactinomycin)、鹽酸柔紅霉素(daunorubicinhcl)、deazauridine、右雷佐生(dexrazoxane)、二脫水衛(wèi)矛醇(dianhydrogalactitol)、地吖醌(diaziquone)、二溴衛(wèi)矛醇(dibromodulcitol)、didemninb、乙基二硫代氨甲酸鹽/酯(ethyldithiocarbamate)、二甘醇醛(diglycoaldehyde)、二氫-5-氮胞苷(dihydro-5-azacytine)、多柔比星(doxorubicin)、棘霉素(echinomycin)、依達(dá)曲沙(dedatrexate)、依地福新(edelfosine)、依氟鳥(niǎo)氨酸(eplolnitin)、elliott溶液(elliott'ssolution)、依沙蘆星(elsamitrucin)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、磷酸雌莫司汀(estramustinephosphate)、雌激素(estrogen)、依他硝唑(etanidazole)、氨磷汀(ethiofos)、依托泊苷(etoposide)、法倔唑(fadrazole)、法扎拉濱(fazarabine)、芬維a胺(fenretinide)、非格司亭(filgrastim)、非那雄胺(finasteride)、黃酮乙酸(flavoneaceticacid)、氟尿苷(floxuridine)、磷酸氟達(dá)拉濱(fludarabinephosphate)、5'-氟尿嘧啶(5’-fluorouracil)、fluosol^tm、氟他胺(flutamide)、硝酸鎵(galliumnitrate)、吉西他濱(gemcitabine)、醋酸戈舍瑞林(goserelinacetate)、hepsulfam、六亞甲基雙乙酰胺(hexamethylenebisacetamide)、高三尖杉酯堿(homoharringtonine)、硫酸肼(hydrazinesulfate)、4-羥基雄烯二酮(4-hydroxyandrostenedione)、羥基脲(hydrozyurea)、鹽酸伊達(dá)比星(idarubicinhcl)、異環(huán)磷酰胺(ifosfamide)、4-依波米醇(4-ipomeanole)、異丙鉑(iproplatin)、異維a酸(isotretinoin)、亞葉酸鈣(leucovorincalcium)、醋酸亮丙立德(leuprolideacetate)、左旋咪唑(levamisole)、柔紅霉素脂質(zhì)體(liposomedaunorubicin)、脂質(zhì)體包囊的多柔比星(liposomeencapsulateddoxorubicin)、洛莫司汀(lomustine)、氯尼達(dá)明(lonidamine)、美登素(maytansine)、鹽酸氮芥(mechlorethaminehydrochloride)、美法侖(melphalan)、美諾立爾(menogaril)、merbarone、6-巰嘌呤(6-mercaptopurine)、巰乙磺酸鈉(mesna)、卡介苗的甲醇提取物(methanolextractofbacilluscalmette-guerin)、甲氨蝶呤(methotrexate)、n-甲基甲酰胺(n-methylformamide)、米非司酮(mifepristone)、米托胍腙(mitoguazone)、絲裂霉素-c(mitomycin-c)、米托坦(mitotane)、鹽酸米托蒽醌(mitoxantronehydrochloride)、單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞集落刺激因子(monocyte/macrophagecolony-stimulatingfactor)、大麻隆(nabilone)、萘福昔定(nafoxidine)、新制癌菌素(neocarzinostatin)、醋酸奧曲肽(octreotideacetate)、奧馬鉑(ormaplatin)、奧沙利鉑(oxaliplatin)、紫杉醇(paclitaxel)、pala、噴司他丁(pentostatin)、哌嗪二酮(piperazinedione)、哌泊溴烷(pipobroman)、吡柔比星(pirarubicin)、吡曲克辛(piritrexim)、鹽酸吡羅蒽醌(piroxantronehydrochloride)、pixy-321、普卡霉素(plicamycin)、卟吩姆鈉(porfimersodium)、潑尼莫司汀(prednimustine)、丙卡巴肼(procarbazine)、孕酮(progestin)、吡唑呋林(pyrazofurin)、雷佐生(razoxane)、沙格司亭(sargramostim)、司莫司汀(semustine)、螺鍺(spirogermanium)、螺莫司汀(spiromustine)、鏈黑霉素(streptonigrin)、鏈佐星(streptozocin)、磺氯苯脲(sulofenur)、舒拉明鈉(suraminsodium)、他莫昔芬(tamoxifen)、泰索帝(taxotere)、替加氟(tegafur)、替尼泊苷(teniposide)、對(duì)苯二甲脒(terephthalamidine)、替羅昔隆(teroxirone)、硫鳥(niǎo)嘌呤(thioguanine)、塞替派(thiotepa)、胸苷注射劑(thymidineinjection)、噻唑呋林(tiazofurin)、托泊替康(topotecan)、托瑞米芬(toremifene)、維a酸(tretinoin)、鹽酸三氟拉嗪(trifluoperazinehydrochloride)、曲氟尿苷(trifluridine)、三甲曲沙(trimetrexate)、腫瘤壞死因子(tnf)、烏拉莫司汀(uracilmustard)、硫酸長(zhǎng)春堿(vinblastinesulfate)、硫酸長(zhǎng)春新堿(vincristinesulfate)、長(zhǎng)春地辛(vindesine)、長(zhǎng)春瑞濱(vinorelbine)、長(zhǎng)春利定(vinzolidine)、yoshi864、佐柔比星(zorubicin)、阿糖胞苷(cytosinearabinoside)、依托泊苷(etoposide)、美法侖(melphalan)、紫杉特爾(taxotele)和泰素(taxol)。

根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供用于預(yù)防或治療癌癥的組合物，其包含所述抗體或其抗原結(jié)合片段或所述抗體-藥物綴合物作為活性成分。

本發(fā)明可以是例如用于預(yù)防或治療癌癥的藥物組合物，其包含(a)藥學(xué)上有效量的本發(fā)明的與nrp1結(jié)合的抗體或其抗原結(jié)合片段或抗體-藥物綴合物和(b)藥學(xué)上可接受的載劑。本發(fā)明還涉及用于預(yù)防或治療癌癥的方法，其包括將有效量的本發(fā)明的與nrp1結(jié)合的抗體或其抗原結(jié)合片段或抗體-藥物綴合物施用至患者。

由于將本發(fā)明的抗nrp1抗體或其抗原結(jié)合片段用作活性成分，排除對(duì)二者常見(jiàn)的說(shuō)明從而避免由反復(fù)說(shuō)明引起的本說(shuō)明書(shū)過(guò)度的復(fù)雜性。

如下文所述的實(shí)施例中所證明，本發(fā)明的抗nrp1抗體可抑制表達(dá)nrp1的癌細(xì)胞的遷移(參見(jiàn)圖11)。因此，本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合片段以高親和力與nrp1結(jié)合并因此抑制過(guò)表達(dá)nrp1的癌細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)，從而其可以單獨(dú)的抗體形式或抗體-藥物綴合物的形式用于癌癥的預(yù)防和治療。

“預(yù)防”意為通過(guò)施用本發(fā)明的組合物抑制或延遲癌癥進(jìn)展的任何行動(dòng)，且“治療”意為抑制癌癥的發(fā)展、緩解和消除癌癥。

所述組合物可應(yīng)用至作為過(guò)表達(dá)nrp1的癌癥的疾病，例如成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、星形細(xì)胞瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、睪丸癌、結(jié)腸癌、黑素瘤、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、食管癌和前列腺癌。

“過(guò)表達(dá)nrp1的癌癥”指相比于相同組織類型的非癌細(xì)胞，在癌細(xì)胞表面以顯著較高的水平具有nrp1的癌癥。

根據(jù)本發(fā)明的示例性實(shí)施方案，組合物用于抑制癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移或侵襲。本發(fā)明還涉及通過(guò)處理本發(fā)明的與nrp1結(jié)合的抗體或其抗原結(jié)合片段或抗體-藥物綴合物用于抑制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移或侵襲的方法?？砂诒景l(fā)明的組合物中的藥學(xué)上可接受的載劑是制劑中常用的且包括但不限于乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯膠(acaciarubber)、磷酸鈣、海藻酸鹽(alginate)、明膠、硅酸鈣、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、水、糖漿、甲基纖維素、羥基苯甲酸甲酯、羥基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸鎂、礦物油等。除所述組分外，本發(fā)明的組合物還可進(jìn)一步包括例如潤(rùn)滑劑、潤(rùn)濕劑、增甜劑、調(diào)味劑、乳化劑、懸浮劑和防腐劑。

本發(fā)明的藥物組合物可口服或腸胃外施用。腸胃外施用通過(guò)靜脈內(nèi)注射、皮下注射、肌內(nèi)注射、腹膜內(nèi)注射、內(nèi)皮施用、局部施用、鼻內(nèi)施用、肺內(nèi)施用、直腸施用等實(shí)施。

由于口服施用時(shí)蛋白或肽被消化，口服的組合物應(yīng)經(jīng)配制或活性藥物作用劑應(yīng)經(jīng)包衣從而防止其在胃中的分解。此外，藥物組合物可通過(guò)能夠?qū)⒒钚晕镔|(zhì)轉(zhuǎn)移至靶細(xì)胞的任何裝置施用。

本發(fā)明的組合物的適當(dāng)劑量可取決于下述因素而變化：諸如配制方法、施用方法、患者年齡、體重、性別、病理狀況、飲食、施用時(shí)間、施用途徑、排泄率和響應(yīng)。因此，熟練的醫(yī)師可以容易地確定對(duì)于期望治療或預(yù)防有效的劑量并給出處方。例如，本發(fā)明的藥物組合物的每日劑量為0.0001mg/kg至100mg/kg。如本文使用的術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)上有效量”指足以預(yù)防或治療癌癥的量。

本發(fā)明的藥物組合物可根據(jù)能夠由本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員容易實(shí)施的方法使用藥學(xué)上可接受的載劑和/或賦形劑配制從而以單位劑型生產(chǎn)或在多劑量容器中生產(chǎn)。此處，制劑可以是油或水性介質(zhì)中的溶液、懸浮液或乳液的形式，或提取物、谷物、栓劑、粉劑、顆粒、片劑或膠囊的形式，且可額外包括分散劑或穩(wěn)定劑。

本發(fā)明的組合物可作為單獨(dú)的治療劑施用或與另一治療劑組合施用，且可與常規(guī)治療劑依序或同時(shí)施用。

實(shí)施例

在下文中，將參照實(shí)施例更詳細(xì)地描述本發(fā)明。實(shí)施例僅出于闡述目的，且本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解的是，本發(fā)明的范圍不應(yīng)理解為受到實(shí)施例的限制。

實(shí)施例1

使用患者衍生的細(xì)胞鑒別抗體內(nèi)化

為篩選細(xì)胞淘選(cellpanning)所需的細(xì)胞用于鑒別抗nrp1抗體片段，在由項(xiàng)目小組(難治性癌癥研究所(instituteforrefractorycancerresearch)，三星醫(yī)療中心(samsungmedicalcenter))處理的患者衍生的細(xì)胞中，使用熒光活化細(xì)胞分選(facs)方法選擇具有高nrp1表達(dá)水平的細(xì)胞。其中，將從三星醫(yī)療中心的難治性癌癥研究所獲得的患者衍生的細(xì)胞(其中nrp1在其表面上以最高表達(dá)水平表達(dá))用于細(xì)胞淘選?；颊哐苌募?xì)胞的facs分析結(jié)果示于圖1中。

與人nrp1結(jié)合的scfv抗體片段通過(guò)噬菌體展示篩選使用先前制備的合成scfv抗體片段噬菌體文庫(kù)(yangetal.,mol.cells.27:225-235,2009)鑒別。將四種亞文庫(kù)樣品各培養(yǎng)在400ml培養(yǎng)基(sb/氨芐青霉素/2％葡萄糖)中2小時(shí)以回收作為噬菌體形式導(dǎo)入大腸桿菌宿主細(xì)胞er2537的噬菌粒載體。當(dāng)在光密度(od)600的吸收為約0.5至約0.7時(shí)，通過(guò)在5000g離心20分鐘去除上清，且隨后懸浮于400ml的二級(jí)培養(yǎng)基(sb/氨芐青霉素)中。隨后，添加10¹²pfu(噬斑形成單位)的輔助噬菌體(vcsm13)并培養(yǎng)1小時(shí)。接下來(lái)，添加70μg/ml的卡那霉素抗生素(引入輔助噬菌體中的抗生素基因)并在30℃培養(yǎng)過(guò)夜以允許消除宿主細(xì)胞外的噬菌體文庫(kù)。隨后，通過(guò)離心獲得的培養(yǎng)物使用聚乙二醇(peg)溶液僅以噬菌體的形式沉淀以獲得噬菌體文庫(kù)。

將獲得的噬菌體文庫(kù)與患者衍生的細(xì)胞(4×10⁶)(其為具有高nrp1表達(dá)的患者衍生的細(xì)胞)混合以置于共5ml的nba(神經(jīng)基底介質(zhì))中，在4℃于旋轉(zhuǎn)器中固定，且隨后360度旋轉(zhuǎn)1小時(shí)至2小時(shí)。隨后，在300g離心細(xì)胞5分鐘以去除未與患者衍生的細(xì)胞結(jié)合的噬菌體顆粒，且隨后再次通過(guò)添加5ml的nba洗滌細(xì)胞。重復(fù)該步驟4次。在最終步驟中，使用置于具有37℃的溫育器的5ml的nba將患者衍生的細(xì)胞和噬菌體置于t燒瓶中并在37℃溫育30分鐘以允許附著至細(xì)胞表面的噬菌體顆粒穿過(guò)細(xì)胞。

隨后，將細(xì)胞置于15-ml錐形管中，在300g離心5分鐘以分離細(xì)胞，且隨后使用5ml的冷pbs(磷酸緩沖鹽水)洗滌。重復(fù)洗滌步驟6次。該步驟的頻率隨細(xì)胞淘選數(shù)目增加而增加。隨后，添加5ml的0.1m甘氨酸(ph2.2)，并將混合物保持在室溫5分鐘以從細(xì)胞表面分離附著在細(xì)胞表面的噬菌體顆粒。隨后，在300g離心細(xì)胞5分鐘以僅分離細(xì)胞，并添加0.5ml的100mmtea。將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至e-管并留在室溫15分鐘。接下來(lái)，通過(guò)在12,000rpm離心5分鐘分離細(xì)胞碎片，并通過(guò)與1ml的2mtris(ph8)混合中和包含細(xì)胞中的噬菌體顆粒的上清。其后，將細(xì)胞置于8.5ml包含預(yù)溫育的er2537的培養(yǎng)基(sb)中，并在37℃于120rpm培養(yǎng)以感染大腸桿菌宿主細(xì)胞er2537。其后，將通過(guò)在3,000rpm離心15分鐘湮沒(méi)的er2537與500μg的培養(yǎng)基(sb)混合，隨后鋪展在15cm培養(yǎng)基上。培養(yǎng)后，添加5ml的sb培養(yǎng)基(50％甘油)以回收并儲(chǔ)存菌落(-80℃)。為進(jìn)行反復(fù)的細(xì)胞淘選，選擇1ml先前儲(chǔ)存的噬菌體溶液并進(jìn)行噬菌體顆粒擴(kuò)增。在宿主細(xì)胞er2537中溫育后，添加輔助噬菌體以通過(guò)peg沉淀分離回收的噬菌體顆粒。以相同的方案將上述用于下一輪的淘選。實(shí)施第三輪淘選，且細(xì)胞淘選步驟示于圖2。確認(rèn)了淘選后相比于淘選前噬菌體顆粒的比例隨重復(fù)次數(shù)增加而增加。這意味著內(nèi)化的噬菌體顆粒通過(guò)細(xì)胞淘選擴(kuò)增，且結(jié)果示于表1中。

[表1]使用患者衍生的細(xì)胞的細(xì)胞淘選

實(shí)施例2

用于選擇抗nrp1scfv候選物的elisa和測(cè)序分析

通過(guò)宿主細(xì)胞(er2537)感染將從第3輪細(xì)胞淘選回收的噬菌體顆粒確認(rèn)為培養(yǎng)基中的菌落。選擇這些菌落以在包含200μl的sb/氨芐青霉素培養(yǎng)基的96孔板中接種且隨后在37℃溫育2小時(shí)至3小時(shí)。

隨后，使用1mm終濃度的iptg(異丙基β-d-1-硫代半乳吡喃糖苷)處理每孔用于誘導(dǎo)scfv-piii蛋白表達(dá)并在30℃培養(yǎng)過(guò)夜。在3,000rpm離心培養(yǎng)板15分鐘以去除上清。其后，為回收經(jīng)培養(yǎng)的細(xì)胞的周質(zhì)(periplasm)中的噬菌體顆粒，將40μl的tes溶液(20％w/v蔗糖、50mmtris、1mmedta，ph8.0)置于每孔并留在4℃30分鐘從而溶解所述細(xì)胞。隨后，使用60μl的0.2xtes溶液處理細(xì)胞并在4℃溫育30分鐘以憑借滲透壓分解細(xì)胞。隨后在3,000rpm離心平板15分鐘以獲得上清scfv-piii蛋白。

將25μl獲得的上清添加于每個(gè)提前準(zhǔn)備的以人nrp1蛋白包覆的96孔板中，隨后在室溫結(jié)合1小時(shí)，且隨后使用tbst和蒸餾水洗滌6次。隨后，獲得的產(chǎn)物與hrp-綴合的抗ha抗體(其能夠與scfv-piii的ha標(biāo)簽結(jié)合)在室溫結(jié)合1小時(shí)且隨后使用tbst(0.1％吐溫20)和蒸餾水洗滌6次。將tmb溶液用于誘導(dǎo)生色反應(yīng)。使用h2so4溶液終止生色反應(yīng)，并在450nm的od測(cè)量其值。

分析的克隆總數(shù)為384，其中41個(gè)克隆(結(jié)合效力>2)顯示了與人nrp1的高結(jié)合能力(參見(jiàn)圖3)。作為對(duì)照，使用了bsa溶液。在這41個(gè)克隆中通過(guò)elisa選擇了10個(gè)具有高結(jié)合能力的克隆。隨后，從10個(gè)克隆回收噬菌粒，并實(shí)施dna測(cè)序，且選擇了具有共6個(gè)不同序列的克隆。選擇具有不同序列的克隆，除3h10，其與1c08序列相同，且最終將3h10、1a03和4f12克隆選作抗nrp1scfv候選物。3h10、1a03和4f12克隆的氨基酸序列示于表2中。

[表2]

抗nrp1scfv的重鏈fr/cdr的序列

抗nrp1scfv的輕鏈fr/cdr的序列

實(shí)施例3

抗nrp1scfv的生成和nrp1結(jié)合能力的確認(rèn)

噬菌粒的基本結(jié)構(gòu)示于圖4中。在上述實(shí)施例中使用的宿主細(xì)胞er2537的情況中，scfv不能單獨(dú)表達(dá)，這是由于其抑制位于噬菌體piii前的轉(zhuǎn)錄抑制密碼子(琥珀密碼子(uag))。因此，使用作為非抑制株的表達(dá)株(top10f')將噬菌粒轉(zhuǎn)染入表達(dá)株。其后，dna序列分析揭示了每種噬菌粒都表達(dá)而未表達(dá)突變體。將表達(dá)株視為菌落，接種入3ml的lb/氨芐青霉素培養(yǎng)基中，并在37℃培養(yǎng)過(guò)夜。其后，將3ml的過(guò)夜培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至400ml培養(yǎng)基(sb/氨芐青霉素)并在od600培養(yǎng)直至濃度達(dá)到0.5至0.7。添加1mm終濃度的iptg并在30℃培養(yǎng)過(guò)夜。將培養(yǎng)物離心后，使用40ml的tes溶液溶解表達(dá)宿主，且隨后添加60ml的0.2xtes以回收周質(zhì)中的噬菌體顆粒。通過(guò)0.45μm過(guò)濾器過(guò)濾回收的上清。對(duì)于his標(biāo)簽純化，將存在于經(jīng)過(guò)濾的溶液中的scfv蛋白添加至1ml的ni-nta珠粒(qiagen)并在室溫結(jié)合1小時(shí)。其后，產(chǎn)物被包裝在重力柱(bio-rad)中并經(jīng)由200mm咪唑溶液回收。表達(dá)和純化每種克隆后，通過(guò)sds-page和考馬斯藍(lán)染色確認(rèn)了scfv的大小為約28kda(參見(jiàn)圖5)。

使用經(jīng)純化的scfv實(shí)施elisa以確認(rèn)存在與靶nrp1結(jié)合的能力。在用200ng的nrp1蛋白包覆的96孔板中和作為對(duì)照組的用200ng的bsa包覆的96孔板中，在室溫通過(guò)elisa(3次重復(fù))在1小時(shí)其各以每克隆5μg/ml的濃度結(jié)合。其后，使用0.1％tbst洗滌產(chǎn)物三次，使用hrp-綴合的ha抗體處理1小時(shí)，再次洗滌，且隨后與tmb溶液共同放置5分鐘。使用2m硫酸溶液終止顯色反應(yīng)后，測(cè)量了od值。

結(jié)果是，相比于未與nrp1結(jié)合的12bscfv，1a03、3h10和4f12scfv顯示了與nrp1特異性結(jié)合的能力(參見(jiàn)圖6)。

接下來(lái)，為根據(jù)每種抗體片段的濃度測(cè)量與人nrp1的結(jié)合能力，將每種scfv以2,000ng/ml、1,000ng/ml、500ng/ml、250ng/ml、125ng/ml、62.5ng/ml、31.25ng/ml或15.62ng/ml的濃度接種至96孔板，所述96孔板中已包覆200ng的nrp1或bsa。隨后分析了od值的變化。對(duì)于與nrp1的結(jié)合能力，12bscfv的od值未根據(jù)濃度變化而變化。另一方面，在1a03、3h10和4f12scfvs的情況中，通過(guò)od值的變化，確認(rèn)了相比于bsa與nrp1結(jié)合的scfv隨濃度的增加而增加(參見(jiàn)圖7)。

為精確測(cè)量三種scfv抗體片段與nrp1蛋白的結(jié)合能力的程度，使用biacoret100(表面等離子體共振(spr)儀器)通過(guò)ka和kd值獲得了最終的kd值。kd值是通過(guò)將kd值除以ka值獲得的值。kd值越低，與相應(yīng)物質(zhì)的結(jié)合能力越大。分析結(jié)果是，4f12scfv的kd(m)值最低，為73.60×10^-9。1a03scfv的kd(m)值為89.40×10^-9，且3h10scfv的kd(m)值為295.4×10^-9(參見(jiàn)圖8)。

實(shí)施例4

使用nrp1過(guò)表達(dá)細(xì)胞系確認(rèn)抗nrp1scfv的結(jié)合能力

通過(guò)elisa確認(rèn)了與人nrp1蛋白的結(jié)合能力后，使用具有nrp1高表達(dá)的患者衍生的細(xì)胞實(shí)施了facs分析從而確認(rèn)了其是否與存在于真實(shí)細(xì)胞膜中的nrp1結(jié)合。

每種scfv在4℃與5×10⁵個(gè)患者衍生的細(xì)胞結(jié)合約1小時(shí)且隨后使用1ml的facs溶液洗滌3次。隨后，使用1μg與紅色熒光(pe；藻紅蛋白)綴合的ha抗體處理產(chǎn)物，且將其在4℃結(jié)合30分鐘。使用1ml的facs溶液洗滌產(chǎn)物三次并使用facscalibur^tm系統(tǒng)分析。

分析結(jié)果是，相比于pe綴合的ha抗體和12b處理的細(xì)胞，三種scfv抗體片段諸如1a03、3h10和4f12與nrp1過(guò)表達(dá)的細(xì)胞系特異性結(jié)合(參見(jiàn)圖9)。

實(shí)施例5

抗nrp1scfv進(jìn)入nrp1過(guò)表達(dá)的癌細(xì)胞中的通透性的確認(rèn)

對(duì)于三種抗nrp1抗體片段，通過(guò)細(xì)胞免疫熒光染色方法確認(rèn)了細(xì)胞內(nèi)通透性。將pd-賴氨酸溶液添加至腔室載玻片并在室溫包覆1小時(shí)至2小時(shí)。隨后除去溶液后干燥載玻片。其后，用200μl包含5×10⁴個(gè)患者衍生的細(xì)胞的nba溶液處理載玻片且隨后在37℃溫育4小時(shí)至5小時(shí)以將其固定至載玻片。接下來(lái)，去除nba溶液，并添加4％的多聚甲醛以將其在4℃固定10分鐘。使用pbs洗滌三次后，用0.1％的tritonx-100處理以增加細(xì)胞通透性。為了染色nrp1蛋白，同時(shí)用抗人nrp1抗體(r&d)和抗nrp1抗體片段處理以在分為15/30/60分鐘的時(shí)間段內(nèi)在37℃結(jié)合。使用pbs洗滌三次后，使用1％的bsa溶液在室溫阻斷非特異性結(jié)合1小時(shí)。作為二抗，以使用綠色熒光(alexa-fluor488)標(biāo)記的山羊抗小鼠抗體(invitrogen)處理以檢查nrp1蛋白，并用抗ha抗體(santacruzbiotechnology)處理以檢查抗npr1抗體片段以便在室溫結(jié)合1小時(shí)。最終，實(shí)施dapi染色用于核染色。最終洗滌后，在載玻片上固定蓋玻片。使用共聚焦掃描顯微鏡觀察結(jié)果。

結(jié)果是，在全部的三種抗nrp1抗體片段中，與其表面附著的抗nrp1抗體片段和插入細(xì)胞的抗nrp1抗體片段在15分鐘和30分鐘混合。然而，約60分鐘過(guò)去后，確認(rèn)了大多數(shù)抗nrp1抗體片段穿透進(jìn)入所插入的細(xì)胞(參見(jiàn)圖10a至10c)。具體而言，4f12抗體片段而非1a03和3h10抗體根據(jù)時(shí)間變化呈現(xiàn)了相對(duì)高的細(xì)胞通透性(參見(jiàn)圖10a)。這些結(jié)果顯示了本發(fā)明的抗體可出于將抑制特定蛋白表達(dá)的物質(zhì)或治療性/診斷性化學(xué)藥物遞送入細(xì)胞的目的使用。

實(shí)施例6

scfv抗體片段對(duì)于nrp1過(guò)表達(dá)的癌細(xì)胞系抑制癌細(xì)胞遷移的能力的確認(rèn)

實(shí)施了細(xì)胞遷移分析以測(cè)試經(jīng)鑒別的1a03、3h10和4f12scfv抗體片段抑制癌細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的抗癌能力。在實(shí)驗(yàn)中，使用了已知高表達(dá)nrp1的u87mg細(xì)胞系(成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞系)。將plo(聚-l-鳥(niǎo)氨酸)置于transwell(corning)，并在室溫包覆混合物30分鐘且隨后自然干燥。隨后，將5×10⁴個(gè)u87mg細(xì)胞和三種抗nrp1scfv抗體片段(50μg/ml)置于dmem培養(yǎng)基(不含將放置在transwell中的100μl的生長(zhǎng)因子)，將600μl具有10％fbs(胎牛血清)的dmem培養(yǎng)基置于較低的孔。隨后在37℃培養(yǎng)細(xì)胞過(guò)夜。隨后，對(duì)于12個(gè)孔，在每transwell中制備甲醇、蘇木精和曙紅(600μl)的一種，且隨后將transwell置于甲醇中1分鐘，隨后置于蘇木精中5分鐘以對(duì)核染色。隨后，使用水洗滌后，去除水，且隨后將transwell置于曙紅中30秒以對(duì)細(xì)胞質(zhì)染色，隨后再次用水洗滌，并使用棉簽將transwell的內(nèi)部擦干凈。

圖11顯示了使用蘇木精將核染成了深藍(lán)色且細(xì)胞質(zhì)由曙紅染紅。如圖11所示，當(dāng)其中抗nrp1scfv抗體片段未處理的對(duì)照組視為100％細(xì)胞轉(zhuǎn)移時(shí)，顯示包含1a03抗體片段具有41％的細(xì)胞遷移，包含3h10抗體片段的細(xì)胞具有46％的細(xì)胞遷移，且包含4f12抗體片段的細(xì)胞具有29％的細(xì)胞遷移。這些結(jié)果證明三種抗nrp1抗體片段可用作針對(duì)具有nrp1高表達(dá)的成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、肺癌、胰腺癌等的抗癌劑。

實(shí)施例7

抗nrp1scfv向抗nrp1igg的轉(zhuǎn)化

為將抗nrp1抗體片段轉(zhuǎn)化為igg形式，使用expi293f表達(dá)系統(tǒng)(lifetechnologies)轉(zhuǎn)染nrp1scfv的重鏈和輕鏈序列的基因。為在培養(yǎng)基中獲得nrp1igg，使用蛋白純化系統(tǒng)和amicon離心過(guò)濾器實(shí)施純化。ircr-101(3h10)的產(chǎn)量為120mg/l，1a03為66mg/l且4f12為15mg/l。為確認(rèn)經(jīng)純化的抗nrp1抗體的純度，引入高效液相色譜。因?yàn)閕gg的大小為150kd，16.388min在標(biāo)記物峰出現(xiàn)的物質(zhì)為igg。在該峰檢測(cè)三種nrp1抗體(ircr-101、1a03和4f12)，且每種的純度為99.5％、99.4％和99.5％(參見(jiàn)圖12)。將鱟變形細(xì)胞溶解物(limulusamebocytelysate)(lal)qcl-1000^tm試劑盒用于確定產(chǎn)生的三種nrp1抗體的內(nèi)毒素水平。結(jié)果是，三種抗體具有對(duì)應(yīng)于治療性蛋白質(zhì)的內(nèi)毒素正常水平的約0.5-3.1eu/mg(參見(jiàn)圖13)。

通過(guò)elisa和spr分析使用三種nrp1抗體針對(duì)人nrp1的結(jié)合親和力分析揭示了結(jié)合親和力強(qiáng)的順序?yàn)椋?a03、ircr-101和4f12。具體而言，4f12具有0.6nm的kd值，其為目前治療性抗體的結(jié)合親和力水平(參見(jiàn)圖14)。通過(guò)相比于其他具有與人nrp1相似的結(jié)構(gòu)的蛋白，分析對(duì)人nrp1的特異性結(jié)合親和力的結(jié)果是，確認(rèn)了全部三種nrp1抗體僅與人nrp1結(jié)合(參見(jiàn)圖15)。

實(shí)施例8

使用癌細(xì)胞和正常細(xì)胞確認(rèn)癌癥特異性內(nèi)化和結(jié)合親和力

使用redmicroscalelabeling試劑盒(thermo#p35363)比較了三種抗nrp1igg在癌細(xì)胞和正常細(xì)胞中的內(nèi)化。試劑盒的原理是將顯色樣品與抗體綴合。當(dāng)抗體在細(xì)胞外時(shí)，其不顯色。另一方面，當(dāng)抗體引入細(xì)胞內(nèi)以酸化周圍環(huán)境時(shí)，其顯色。因此，可使用該顯色原理確認(rèn)抗體的內(nèi)化。將分別與三種nrp1igg綴合的患者衍生的癌細(xì)胞和作為正常細(xì)胞的huvec細(xì)胞用于在彼此間比較內(nèi)化。結(jié)果是，自20分鐘在患者衍生的癌細(xì)胞上觀察到內(nèi)化的抗體(參見(jiàn)圖16)。另一方面，在作為正常細(xì)胞的huvec細(xì)胞中，經(jīng)過(guò)2小時(shí)后4f12顯示了抗體的內(nèi)化，且ircr-101和1a03抗體未顯示任何內(nèi)化的抗體。因此，確認(rèn)了ircr-101和1a03呈現(xiàn)了癌細(xì)胞特異性內(nèi)化(參見(jiàn)圖17)。

在4℃和37℃(內(nèi)化溫度)比較了彼此間對(duì)于正常和癌細(xì)胞的結(jié)合并通過(guò)facs進(jìn)行了分析。由于在4℃正常細(xì)胞和癌細(xì)胞中不存在內(nèi)化，ircr-101和1a03抗體在細(xì)胞表面的抗體的量上隨時(shí)間未顯示任何增加或減少。另一方面，確認(rèn)了細(xì)胞表面上抗體的量隨時(shí)間減少，這是由于其僅在37℃在癌細(xì)胞中內(nèi)化。另一方面，4f12抗體在37℃內(nèi)化入正常細(xì)胞和癌細(xì)胞，且細(xì)胞表面上抗體的量隨時(shí)間減少(參見(jiàn)圖18)。因此，通過(guò)活細(xì)胞成像和facs分析確認(rèn)了ircr-101和1a03抗體各具有癌癥特異性內(nèi)化功能。

通過(guò)靜脈內(nèi)注射將對(duì)照igg、ircr-101和1a03成膠質(zhì)細(xì)胞瘤注射入皮下模型中。20小時(shí)后，將其處死以通過(guò)細(xì)胞解離分離成為單細(xì)胞。隨后使用facs在彼此間比較了其對(duì)癌細(xì)胞的內(nèi)在性(immanence)。在通過(guò)透化(permeabilization)僅篩選內(nèi)化入癌細(xì)胞的抗體的結(jié)果中，ircr-101和1a03比對(duì)照igg顯示了5倍至6倍更高的平均熒光強(qiáng)度(mfi)。還確認(rèn)了體內(nèi)模型具有與如上文所述的體外模型相同的癌細(xì)胞特異內(nèi)在性(參見(jiàn)圖19)。

在4℃使用ircr-101和nrp1抗體以比較正常細(xì)胞和癌細(xì)胞之間結(jié)合力的差異。在相同的濃度，相比于癌細(xì)胞，常規(guī)nrp1抗體顯示了對(duì)正常細(xì)胞更大的結(jié)合親和力，而ircr-101顯示了癌細(xì)胞特異性結(jié)合親和力(參見(jiàn)圖20)。

為確認(rèn)體內(nèi)模型是否可重復(fù)，使用從成膠質(zhì)細(xì)胞瘤異種移植物獲得的癌組織分析了ihc(免疫組化)和if(免疫熒光)。常規(guī)nrp1抗體顯示了與由正常內(nèi)皮細(xì)胞組成的血管的結(jié)合力，而ircr-101未與正常內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合(參見(jiàn)圖21)。還在成膠質(zhì)細(xì)胞瘤患者組織中觀察到了該結(jié)果(參見(jiàn)圖22)。

實(shí)施例9

癌細(xì)胞遷移和新生血管生長(zhǎng)抑制的確認(rèn)

使用成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞系u87mg和患者衍生的細(xì)胞確認(rèn)了三種nrp1抗體抑制癌細(xì)胞遷移。每種抗體處理后，在37℃溫育細(xì)胞24小時(shí)。確認(rèn)了在患者衍生的細(xì)胞中ircr-101和1a03各抑制大于50％的腫瘤細(xì)胞遷移且4f12抑制40％的腫瘤細(xì)胞遷移(參見(jiàn)圖23)。

在成膠質(zhì)細(xì)胞瘤的皮下模型中，將ircr-101靜脈內(nèi)注射2周，且隨后對(duì)cd31變化是否與新生血管相關(guān)進(jìn)行了檢查。相比于對(duì)照組，cd31顯著減少，且血管的數(shù)量和厚度均減少。因此，除在成膠質(zhì)細(xì)胞瘤的細(xì)胞遷移能力外，確認(rèn)了在體內(nèi)模型中ircr-101抑制新生血管(參見(jiàn)圖24)。

在ircr-101處理中，于15、30和120min實(shí)施了nrp1、akt和erk的免疫印跡從而檢查相關(guān)信號(hào)傳輸材料的變化。確認(rèn)了30分鐘后nrp1完全降解至消除且由于經(jīng)磷酸化的akt和erk減少，因此akt和erk抑制了相關(guān)信號(hào)機(jī)制(參見(jiàn)圖25)。

實(shí)施例10

體內(nèi)模型中ircr-101分布的確認(rèn)和猴tma的分析

在成膠質(zhì)細(xì)胞瘤的原位模型中，用ircr-101標(biāo)記熒光物質(zhì)并靜脈內(nèi)注射細(xì)胞以觀察熒光強(qiáng)度隨時(shí)間的變化。在15分鐘、1小時(shí)、1天和2天進(jìn)行觀察。結(jié)果是，確認(rèn)了在1天時(shí)在對(duì)應(yīng)于腫瘤位點(diǎn)的位點(diǎn)顯現(xiàn)強(qiáng)的熒光，且直至第3天仍在相同位置顯現(xiàn)熒光(參見(jiàn)圖26)。

實(shí)施了雄性和雌性猴以及常規(guī)的nrp1抗體的tma(組織微陣列)從而研究了ircr-101的副作用。分析顯示了相比于常規(guī)的nrp1抗體，大多正常器官組織顯示較少的ircr-101抗體結(jié)合或無(wú)結(jié)合。因此，預(yù)測(cè)ircr-101在臨床試驗(yàn)中的副作用低，這是由于其顯示對(duì)正常組織低的結(jié)合親和力或無(wú)結(jié)合親和力(參見(jiàn)圖27)。

工業(yè)實(shí)用性

本發(fā)明的特征和優(yōu)勢(shì)總結(jié)如下：

(i)本發(fā)明提供抗nrp1抗體及其醫(yī)療用途，所述抗nrp1抗體與表達(dá)在癌細(xì)胞表面上的nrp1結(jié)合且隨后內(nèi)化入所述細(xì)胞。

(ii)本發(fā)明的抗體抑制表達(dá)nrp1的癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。

(iii)本發(fā)明的抗體可單獨(dú)或以抗體-藥物綴合物的形式用于治療癌癥。由于nrp1是在癌細(xì)胞表面上過(guò)表達(dá)的分子，本發(fā)明的抗體-藥物綴合物用于選擇性地僅靶向癌細(xì)胞同時(shí)最小程度地影響正常細(xì)胞。

對(duì)本發(fā)明的特定部分如上文詳述進(jìn)行了描述。對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的是，這些具體的說(shuō)明僅為優(yōu)選的實(shí)施方案且本發(fā)明的范圍并不限于此。因此，本發(fā)明實(shí)際的范圍將通過(guò)所附權(quán)利要求及其等同內(nèi)容進(jìn)行限定。

序列表

<110>社會(huì)福祉法人三星生命公益財(cái)團(tuán)

<120>針對(duì)神經(jīng)氈蛋白的抗體及其用途

<130>pf-b1893-cn

<140>pct/kr2015/013102

<141>2015-12-03

<150>10-2014-0171949

<151>2014-12-03

<160>42

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>4f12的cdrh1

<400>1

glyphethrpheserglytyrala

15

<210>2

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>4f12的cdrh2

<400>2

ileserproglyserglyserthr

15

<210>3

<211>9

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>4f12的cdrh3

<400>3

alalysarglysthrargpheasptyr

15

<210>4

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>4f12的cdrl1

<400>4

serserasnileglyasnasnser

15

<210>5

<211>3

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>4f12的cdrl2

<400>5

alaasnasn

1

<210>6

<211>11

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>4f12的cdrl3

<400>6

alaalatrpaspserserleuasnglytyrval

1510

<210>7

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>1a03或3h10的cdrh1

<400>7

glyphethrphesersertyrtyr

15

<210>8

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>1a03或3h10的cdrh2

<400>8

ileserproglyserserasnlys

15

<210>9

<211>9

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>1a03的cdrh3

<400>9

alaargarglyslysserpheasptyr

15

<210>10

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>1a03或3h10的cdrl1

<400>10

serserasnileglyasnasnasp

15

<210>11

<211>3

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>1a03的cdrl2

<400>11

seraspasn

1

<210>12

<211>11

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>1a03的cdrl3

<400>12

glyalatrpvalalaserleuseralatyrval

1510

<210>13

<211>9

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>3h10的cdrh3

<400>13

alaargarglystyrmetpheasptyr

15

<210>14

<211>3

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>3h10的cdrl2

<400>14

seraspser

1

<210>15

<211>11

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>3h10的cdrl3

<400>15

alasertrpaspserserleuserglytyrval

1510

<210>16

<211>116

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>4f12的vh

<400>16

gluvalglnleuleugluserglyglyglyleuvalglnproglygly

151015

serleuargleusercysalaalaserglyphethrpheserglytyr

202530

alametsertrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpval

354045

serglyileserproglyserglyserthrtyrtyralaaspserval

505560

lysglyargphethrileserargaspasnserlysasnthrleutyr

65707580

leuglnmetasnserleuargalagluaspthralavaltyrtyrcys

859095

alalysarglysthrargpheasptyrtrpglyglnglythrleuval

100105110

thrvalserser

115

<210>17

<211>110

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>4f12的vl

<400>17

glnservalleuthrglnproproseralaserglythrproglyarg

151015

argvalthrilesercysserglyserserserasnileglyasnasn

202530

servaltyrtrptyrglnglnleuproglythralaprolysleuleu

354045

iletyralaasnasnlysargproserglyvalproaspargpheser

505560

glyserlysserglythrseralaserleualaileserglyleuarg

65707580

sergluaspglualaasptyrtyrcysalaalatrpaspserserleu

859095

asnglytyrvalpheglyglyglythrlysleuthrvalleu

100105110

<210>18

<211>116

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>1a03的vh

<400>18

gluvalglnleuleugluserglyglyglyleuvalglnproglygly

151015

serleuargleusercysalaalaserglyphethrphesersertyr

202530

tyrmetsertrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpval

354045

seralaileserproglyserserasnlystyrtyralaaspserval

505560

glnglyargphethrileserargaspasnserlysasnthrleutyr

65707580

leuglnmetasnserleuargalagluaspthralavaltyrtyrcys

859095

alaargarglyslysserpheasptyrtrpglyglnglythrleuval

100105110

thrvalserser

115

<210>19

<211>110

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>1a03的vl

<400>19

glnservalleuthrglnproproseralaserglythrproglygln

151015

argvalthrilesercysserglyproserserasnileglyasnasn

202530

aspvalsertrptyrglnglnleuproglythralaprolysleuleu

354045

iletyrseraspasnasnargproserglyvalproaspargpheser

505560

glyserlysserglythrseralaserleualaileserglyleuarg

65707580

sergluaspglualaasptyrtyrcysglyalatrpvalalaserleu

859095

seralatyrvalpheglyglyglythrlysleuthrvalleu

100105110

<210>20

<211>116

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>3h10的vh

<400>20

gluvalglnleuleugluserglyglyglyleuvalglnproglygly

151015

serleuargleusercysalaalaserglyphethrphesersertyr

202530

tyrmetsertrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpval

354045

seralaileserproglyserserasnlystyrtyralaaspserval

505560

lysglyargphethrileserargaspasnserlysasnthrleutyr

65707580

leuglnmetasnserleuargalagluaspthralavaltyrtyrcys

859095

alaargarglystyrmetpheasptyrtrpglyglnglythrleuval

100105110

thrvalserser

115

<210>21

<211>110

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>3h10的vl

<400>21

glnservalleuthrglnproproseralaserglythrproglygln

151015

argvalthrilesercysthrglyserserserasnileglyasnasn

202530

aspvaltyrtrptyrglnglnleuproglythralaprolysleuleu

354045

iletyrseraspserasnargproserglyvalproaspargpheser

505560

glyserlysserglythrseralaserleualaileserglyleuarg

65707580

sergluaspglualaasptyrtyrcysalasertrpaspserserleu

859095

serglytyrvalpheglyglyglythrlysleuthrvalleu

100105110

<210>22

<211>348

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>4f12的vh

<400>22

gaggtgcagctgttggagtctgggggaggcttggtacagcctggggggtccctgagactc60

tcctgtgcagcctctggattcacctttagcggttatgctatgagctgggtccgccaggct120

ccagggaaggggctggagtgggtctcagggatctctcctggtagtggtagtacatattac180

gctgattctgtaaaaggtcggttcaccatctccagagacaattccaagaacacgctgtat240

ctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggccgtgtattactgtgcgaaacgtaag300

actaggttcgactactggggccagggtacactggtcaccgtgagctca348

<210>23

<211>330

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>4f12的vl

<400>23

cagtctgtgctgactcagccaccctcagcgtctgggacccccgggcggagggtcaccatc60

tcttgtagtggctcttcatctaatattggcaataattctgtctactggtaccagcagctc120

ccaggaacggcccccaaactcctcatctatgctaataataagcggccaagcggggtccct180

gaccgattctctggctccaagtctggcacctcagcctccctggccatcagtgggctccgg240

tccgaggatgaggctgattattactgtgctgcttgggattctagcctgaatggttatgtc300

ttcggcggaggcaccaagctgacggtccta330

<210>24

<211>348

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>1a03的vh

<400>24

gaggtgcagctgttggagtctgggggaggcttggtacagcctggggggtccctgagactc60

tcctgtgcagcctctggattcacctttagcagttattatatgagctgggtccgccaggct120

ccagggaaggggctggagtgggtctcagcgatctctcctggtagtagtaataaatattac180

gctgattctgtacaaggtcggttcaccatctccagagacaattccaagaacacgctgtat240

ctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggccgtgtattactgtgcgagaaggaag300

aagtcgttcgactactggggccagggtacactggtcaccgtgagctca348

<210>25

<211>330

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>1a03的vl

<400>25

cagtctgtgctgactcagccaccctcagcgtctgggacccccgggcagagggtcaccatc60

tcttgtagtggcccttcatctaatattggcaataatgatgtctcctggtaccagcagctc120

ccaggaacggctcccaaactcctcatctattctgataataatcggccaagcggggtccct180

gaccgattctctggctccaagtctggcacctcagcctccctggccatcagtgggctccgg240

tccgaggatgaggctgattattactgtggtgcttgggttgctagcctgagtgcttatgtc300

ttcggcggaggcaccaagctgacggtccta330

<210>26

<211>348

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>3h10的vh

<400>26

gaggtgcagctgttggagtctgggggaggcttggtacagcctggggggtccctgagactc60

tcctgtgcagcctctggattcacctttagcagttattatatgagctgggtccgccaggct120

ccagggaaggggctggagtgggtctcagcgatctctcctggtagtagtaataaatattac180

gctgattctgtaaaaggtcggttcaccatctccagagacaattccaagaacacgctgtat240

ctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggccgtgtattactgtgcgagaaggaag300

tatatgttcgactactggggccagggtacactggtcaccgtgagctca348

<210>27

<211>330

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>3h10的vl

<400>27

cagtctgtgctgactcagccaccctcagcgtctgggacccccgggcagagggtcaccatc60

tcttgtactggctcttcatctaatattggcaataatgatgtctactggtaccagcagctc120

ccaggaacggcacccaaactcctcatctattctgatagtaatcggccaagcggggtccct180

gaccgattctctggctccaagtctggcacctcagcctccctggccatcagtgggctccgg240

tccgaggatgaggctgattattactgtgcttcttgggattctagcctgagtggttatgtc300

ttcggcggaggcaccaagctgacggtccta330

<210>28

<211>25

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>1a03,3h10&4f12hvfr1

<400>28

gluvalglnleuleugluserglyglyglyleuvalglnproglygly

151015

serleuargleusercysalaalaser

2025

<210>29

<211>17

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>1a03&3h10hvfr2

<400>29

metsertrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpvalser

151015

ala

<210>30

<211>17

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>4f12hvfr2

<400>30

metsertrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpvalser

151015

gly

<210>31

<211>38

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>1a03hvfr3

<400>31

tyrtyralaaspservalglnglyargphethrileserargaspasn

151015

serlysasnthrleutyrleuglnmetasnserleuargalagluasp

202530

thralavaltyrtyrcys

35

<210>32

<211>38

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>3h10&4f12hvfr3

<400>32

tyrtyralaaspservallysglyargphethrileserargaspasn

151015

serlysasnthrleutyrleuglnmetasnserleuargalagluasp

202530

thralavaltyrtyrcys

35

<210>33

<211>11

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>1a03,3h10&4f12hvfr4

<400>33

trpglyglnglythrleuvalthrvalserser

1510

<210>34

<211>25

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>1a03lvfr1

<400>34

glnservalleuthrglnproproseralaserglythrproglygln

151015

argvalthrilesercysserglypro

2025

<210>35

<211>25

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>3h10lvfr1

<400>35

glnservalleuthrglnproproseralaserglythrproglygln

151015

argvalthrilesercysthrglyser

2025

<210>36

<211>25

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>4f12lvfr1

<400>36

glnservalleuthrglnproproseralaserglythrproglyarg

151015

argvalthrilesercysserglyser

2025

<210>37

<211>17

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>1a03lvfr2

<400>37

valsertrptyrglnglnleuproglythralaprolysleuleuile

151015

tyr

<210>38

<211>17

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>3h10lvfr2

<400>38

valtyrtrptyrglnglnleuproglythralaprolysleuleuile

151015

tyr

<210>39

<211>17

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>4f12lvfr2

<400>39

valtyrtrptyrglnglnleuproglythralaprolysleuleuile

151015

tyr

<210>40

<211>36

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>1a03&3h10lvfr3

<400>40

asnargproserglyvalproaspargpheserglyserlyssergly

151015

thrseralaserleualaileserglyleuargsergluaspgluala

202530

asptyrtyrcys

35

<210>41

<211>36

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>4f12lvfr3

<400>41

lysargproserglyvalproaspargpheserglyserlyssergly

151015

thrseralaserleualaileserglyleuargsergluaspgluala

202530

asptyrtyrcys

35

<210>42

<211>10

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>1a03,3h10&4f12lvfr4

<400>42

pheglyglyglythrlysleuthrvalleu

1510