本發(fā)明涉及使用由靶分子控制的核酸聚合酶活性檢測和量化生物分子的方法，且更具體地涉及用于檢測或量化生物分子的方法，其可以高靈敏性檢測和量化核酸、蛋白、小分子物質、生理活性物質(酶活性)等，所述檢測或量化以由特異性核酸的特異性結合引起的dna聚合酶活性的變化為基礎，所述特異性核酸與所制備的dna適體(aptamer)形成復合物適體以包含特異性識別所述特異性核酸的單鏈dna。
背景技術：
：基于核酸的檢測技術在疾病診斷、藥物檢測、環(huán)境監(jiān)測和刑事調查中起重要的作用，且對于具有出色靈敏性和特異性并便于使用的新型檢測技術存在持續(xù)的需求。已在現(xiàn)有技術中常規(guī)使用的基于核酸的檢測技術基于為u形dna探針的分子信標(molecularbeacon)，所述u形dna探針用熒光團和淬滅劑標記。該技術包括確認熒光信號是否由分子信標的構象變化產(chǎn)生，所述分子信標的構象變化由靶核酸的存在導致(tyagietal.,naturebiotechnology,14:303-308,1996；masukoetal.,nucleicacidsresearch,26:5409-5416,1998)。由于該技術可迅速分析靶核酸而無需分離核酸，其被廣泛使用，且已開發(fā)了多種類型的基于分子信標的核酸分析技術(songetal.,angewandtechemie-internationaledition,48:8670-8674,2009；wuetal.,biosensors&bioelectronics,26:3870-3875,2011；yehetal.,nanoletters,10:3870-3875,2011)。然而，上述基于分子信標的分析技術具有的不足在于，由于靶核酸和分子信標以1:1的比率反應以生成熒光信號，難以實現(xiàn)較高的靈敏性。近年來，出于克服該問題并開發(fā)具有出色靈敏性的檢測傳感器的目的，已對使用酶作為工具用于信號放大做出了嘗試。典型的實例包括其中酶以檢測探針標記用于檢測靶核酸的系統(tǒng)，且其中引入了抑制劑(gianneschietal.,angewandtechemie-internationaledition,46:3955-3958,2007；saghatelianetal.,journaloftheamericanchemicalsociety,125:344-345,2003；pavlovetal.,journaloftheamericanchemicalsociety,127:6522-6523,2005；niemeyeretal.,angewandtechemie-internationaledition,49:1200-1216,2010)。在該系統(tǒng)中，通過與檢測探針的雜交，靶核酸的存在阻斷抑制劑的抑制功能，且恢復的酶活性生成高熒光信號。然而，該技術具有的不足在于，其需要使用抑制劑標記酶的步驟，耗時長且需要很多技巧。此外，其不足還在于標記操作本身可能引起酶構象的變化從而降低酶的活性。此外，該技術具有的局限在于，其難以用作用于檢測多種靶核酸的通用技術，這是由于其需要為每種靶核酸制備酶-抑制劑復合物。因此，需要開發(fā)無標記的基于酶的技術用于檢測多種靶核酸。因此，本發(fā)明的發(fā)明人付出大量的努力以克服現(xiàn)有技術中存在的上述問題并建立了高度靈敏的基于酶的檢測和量化系統(tǒng)，其無需使用抑制劑標記且其可普遍用于檢測和量化多種靶核酸。結果是，本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了使用包含特異性識別靶核酸的單鏈dna的dna適體以選擇性和精確的方式實現(xiàn)了下述：(1)以關閉(switch-off)模式檢測和量化靶核酸；(2)以開啟(switch-on)模式檢測和量化靶核酸；(3)以開啟模式檢測和量化靶分子；(4)以開啟模式檢測和量化靶ber酶的活性；和(5)以開啟模式檢測和量化靶核酸酶，由此完成本發(fā)明。技術實現(xiàn)要素：技術問題本發(fā)明的主要目的是提供使用dna適體檢測和量化靶核酸的方法，所述dna適體包含特異性識別靶核酸的單鏈dna。本發(fā)明的另一目的是提供使用適體檢測和量化靶核酸的方法，所述適體包含與阻斷劑核酸(blockernucleicacid)互補的單鏈dna，所述阻斷劑核酸具有與靶核酸互補的序列。本發(fā)明的另一目的是提供使用適體檢測和量化靶分子的方法，所述適體包含與阻斷劑dna(blockerdna)互補的單鏈dna，所述阻斷劑dna特異性地識別靶分子且具有與靶分子結合的序列。本發(fā)明的另一目的是提供使用適體檢測和量化靶ber(堿基切除修復(baseexcisionrepair))酶活性的方法，所述適體包含與阻斷劑核酸互補的單鏈dna，所述阻斷劑核酸具有特異性針對靶ber(堿基切除修復)酶的核苷酸序列。本發(fā)明的另一目的是提供使用適體檢測和量化靶核酸酶活性的方法，所述適體包含與阻斷劑核酸互補的單鏈dna，所述阻斷劑核酸具有特異性針對靶核酸酶的核苷酸序列。技術方案為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供使用由靶核酸控制的核酸聚合酶活性以關閉模式檢測或量化所述靶核酸的方法，其包括：(a)添加核酸聚合酶至包含適體和檢測樣品的混合物，并使所述核酸聚合酶與所述混合物反應以由此使核酸聚合酶與適體-靶核酸復合物結合，所述適體含有特異性識別所述靶核酸的單鏈核酸，且所述檢測樣品推測可能(suppose)包含所述靶核酸，(b)將包含引物和信號生成物質的混合物與步驟(a)的反應產(chǎn)物混合，隨后進行引物延伸(primerextension)反應；和(c)分析步驟(b)的引物延伸反應以由此檢測或量化所述靶核酸。本發(fā)明還提供使用由靶核酸控制的核酸聚合酶活性以開啟模式檢測或量化所述靶核酸的方法，其包括：(a)添加核酸聚合酶和推測可能(presume)包含所述靶核酸的檢測樣品至包含阻斷劑核酸和適體的混合物，并使所述核酸聚合酶和所述檢測樣品與所述混合物反應以由此使所述核酸聚合酶與適體-阻斷劑核酸復合物結合，所述阻斷劑核酸具有與所述靶核酸互補的核苷酸序列，所述適體包含與所述阻斷劑核酸互補的單鏈核酸；(b)將包含引物和信號生成物質的混合物與步驟(a)的反應產(chǎn)物混合，隨后進行引物延伸反應；和(c)分析步驟(b)的引物延伸反應以由此檢測或量化所述靶核酸。本發(fā)明還提供使用由靶核酸控制的核酸聚合酶活性以開啟模式檢測或量化所述靶分子的方法，其包括：(a)添加核酸聚合酶和推測可能包含所述靶分子的檢測樣品至包含阻斷劑核酸和適體的混合物，并使所述核酸聚合酶和所述檢測樣品與所述混合物反應以由此使所述核酸聚合酶與適體-阻斷劑核酸復合物結合，所述阻斷劑核酸具有特異性識別并與結合所述靶分子的核苷酸序列，所述適體包含與所述阻斷劑核酸互補的單鏈核酸；(b)將包含引物和信號生成物質的混合物與步驟(a)的反應產(chǎn)物混合，隨后進行引物延伸反應；和(c)分析步驟(b)的引物延伸反應以由此檢測或量化所述靶分子。本發(fā)明還提供使用由ber(堿基切除修復)酶控制的核酸聚合酶活性以開啟模式檢測或量化靶ber(堿基切除修復)酶活性的方法，其包括：(a)添加核酸聚合酶和推測可能包含所述靶ber酶的檢測樣品至包含阻斷劑核酸和適體的混合物，并使所述核酸聚合酶和所述檢測樣品與所述混合物反應以由此使所述核酸聚合酶與適體-阻斷劑核酸復合物結合，所述阻斷劑核酸具有特異性針對靶ber酶的核苷酸序列，所述適體包含與所述阻斷劑核酸互補的單鏈核酸；(b)將包含引物和信號生成物質的混合物與步驟(a)的反應產(chǎn)物混合，隨后進行引物延伸反應；和c)分析步驟(b)的引物延伸反應以由此檢測或量化所述靶ber(堿基切除修復)酶的活性。本發(fā)明還提供使用由靶核酸酶控制的核酸聚合酶活性以開啟模式檢測或量化靶核酸酶活性的方法，其包括：(a)添加核酸聚合酶和推測可能包含所述靶核酸酶的檢測樣品至包含阻斷劑核酸和適體的混合物，并使所述核酸聚合酶和所述檢測樣品與所述混合物反應以由此使所述核酸聚合酶與適體-阻斷劑核酸復合物結合，所述阻斷劑核酸具有特異性針對所述靶核酸酶的核苷酸序列，所述適體包含與所述阻斷劑核酸互補的單鏈核酸；(b)將包含引物和信號生成物質的混合物與步驟(a)的反應產(chǎn)物混合，隨后進行引物延伸反應；和(c)分析步驟(b)的引物延伸反應以由此檢測或量化所述靶核酸酶活性。附圖簡述圖1是顯示靶dna誘導的dna聚合酶活性開關和使用taqman探針分析所述開關的原理的示意圖。具體地，圖1是顯示基于dna適體檢測和量化靶核酸的原理的示意圖，所述dna適體特異性地與taqdna聚合酶結合以抑制酶的活性。圖2顯示了測試靶dna誘導的dna聚合酶活性開關可行性的結果。具體地，圖2顯示了表明經(jīng)設計以包含多種單鏈核苷酸序列的dna適配體通過與互補的靶核酸結合抑制聚合酶活性的實驗結果。(a)在引物延伸反應過程中taqman探針熒光強度的變化。(b)引物延伸反應200分鐘后熒光信號的變化。此處，f200和f0分別代表引物延伸反應200分鐘和0分鐘后taqman探針的熒光強度。nc：無聚合酶的樣品，pc：包含聚合酶的樣品，(1)：通過將作為陽性對照的原始dna適體添加至pc獲得的樣品，(#,a)：通過僅將適體添加至pc而無靶核酸獲得的樣品，和(#,p)：通過將靶核酸和適體添加至pc獲得的樣品。在該實驗中使用的聚合酶、dna適體和靶核酸的終濃度分別為5.5nm、100nm和100nm。圖3顯示通過應用由靶核酸(示于圖2中)對聚合酶活性的控制用于檢測和量化脲(解脲脲原體(ureaplasmaurealyticum)，一種引起性傳播疾病的病原體)獲得的實驗結果。(a)引物延伸反應過程中taqman探針熒光強度的變化。(b)引物延伸反應50分鐘后熒光信號的變化。此處，f50和f0分別代表引物延伸反應50分鐘和0分鐘后taqman探針的熒光強度。(c)page(聚丙烯酰胺凝膠電泳)圖像，nc：無聚合酶的樣品，pc：包含聚合酶的樣品，(1)：通過僅將脲特異性適體添加至pc而無互補的脲靶核酸獲得的樣品，(2)：通過將互補的脲靶核酸和脲特異性適體添加至pc獲得的樣品，和(3)：通過將非互補的衣原體靶核酸和脲特異性適體添加至pc獲得的樣品。該實驗中使用的聚合酶、dna適體和靶核酸的終濃度分別為5.5nm、200nm和100nm。圖4顯示測量本發(fā)明用于檢測和量化脲靶dna的系統(tǒng)的靈敏性的結果。具體地，圖4顯示測量基于通過實驗確定的最佳條件添加不同濃度的脲dna時發(fā)生的熒光信號的結果。(a)引物延伸反應過程中taqman探針熒光強度的變化。不同濃度的脲靶dna存在下將脲特異性適體添加至包含聚合酶的樣品。(b)不同濃度的脲靶dna存在下引物延伸反應50分鐘后熒光信號的變化。f50和f0分別代表引物延伸反應50分鐘和0分鐘后taqman探針的熒光強度。(b)中的插圖：顯示在脲靶dna的濃度(0-10nm)引物延伸反應50分鐘后熒光強度的變化的線形圖。該實驗中使用的聚合酶和dna適體的終濃度分別為5.5nm和200nm。圖5顯示測量本發(fā)明用于檢測和量化衣原體靶dna的系統(tǒng)的靈敏性的結果。具體地，圖5顯示表明用于檢測和量化靶dna的新開發(fā)的系統(tǒng)可普遍用于檢測和量化多種靶dna的結果。(a)引物延伸反應過程中taqman探針熒光強度的變化。不同濃度的衣原體靶dna存在下，將衣原體特異性適體添加至包含聚合酶的樣品。(b)不同濃度的衣原體靶dna存在下引物延伸反應50分鐘后熒光信號的變化。此處，f50和f0分別代表引物延伸反應50分鐘和0分鐘后taqman探針的熒光強度。(b)中的插圖：顯示在衣原體靶dna的濃度(0-10nm)引物延伸反應50分鐘后熒光強度的變化的線形圖。該實驗中使用的聚合酶和dna適體的終濃度分別為5.5nm和200nm。圖6是顯示靶dna誘導的聚合酶活性開關和使用taqman探針分析所述開關的原理的示意圖。具體地，圖6是顯示通過引入阻斷劑dna檢測和量化靶dna的原理的示意圖，從而除了如上文所述實施的關閉模式(信號關閉模式)之外，實施了以開啟模式(信號開啟模式)操作的本發(fā)明。圖7顯示了使用開啟系統(tǒng)檢測和量化脲靶dna的結果。具體地，圖7顯示了在經(jīng)設計以開啟模式(信號開啟模式)操作的靶dna檢測和量化系統(tǒng)中由靶dna控制聚合酶活性的實驗結果。(a)將不同濃度的脲特異性阻斷劑dna添加至包含聚合酶和dna適體的樣品。(b)將下述添加至包含dna聚合酶的樣品：游離的dna適體(1)、或脲特異性阻斷劑dna存在下的dna適體(2)、或具有互補的脲靶dna的脲特異性阻斷劑dna存在下的dna適體(3)、或具有非互補的衣原體靶dna的脲特異性阻斷劑dna存在下的dna適體(4)。(c)引物延伸反應過程中taqman探針熒光強度的變化。將不同濃度的脲靶dna添加至包含dna聚合酶和dna適體的樣品，所述dna適體與脲特異性阻斷劑dna結合。(d)不同濃度的脲靶dna存在下引物延伸反應50分鐘后熒光信號的變化。(d)中的插圖：顯示在脲靶dna的濃度(0-20nm)引物延伸反應50分鐘后熒光強度的變化的線形圖。該實驗中使用的聚合酶、dna適體和脲特異性阻斷劑dna的終濃度分別為5.5nm、200nm和20nm。圖8是顯示靶分子誘導的dna聚合酶活性開關和使用taqman探針分析所述開關的原理的示意圖。圖9是顯示udg靶標酶誘導的dna聚合酶活性開關和使用taqman探針分析所述開關的原理的示意圖。圖10顯示了測試udg靶標酶誘導的dna聚合酶活性開關可行性的結果。具體地，圖10顯示了使用經(jīng)設計以特異性響應udg的dna適體測試udg對dna聚合酶活性的影響的結果適體。(a)引物延伸反應過程中taqman探針熒光強度的變化。(b)引物延伸反應50分鐘后熒光信號的變化。此處，f50和f0分別代表引物延伸反應50分鐘和0分鐘后taqman探針的熒光強度。將dna聚合酶添加至包含下述的樣品：udg適體(1)，或udg阻斷劑存在下的udg適體(2)，或具有udg的udg阻斷劑存在下的udg適體(3)，或對照udg阻斷劑存在下的udg適體(4)，或具有udg的對照udg阻斷劑存在下的udg適體(5)。在該實驗中使用的聚合酶、udg適體、udg阻斷劑和udg的終濃度分別為5.5nm、200nm、10nm和0.5u/ml。圖11顯示了測量本發(fā)明用于檢測和量化udg靶標酶的系統(tǒng)的靈敏性的結果。具體地，圖10顯示了測量基于通過上述實驗確定的最佳條件添加不同濃度的udg時發(fā)生的熒光信號的結果。(a)引物延伸反應過程中taqman探針熒光強度的變化。將不同濃度的udg添加至包含udg適體和udg阻斷劑的udg檢測探針樣品。(b)不同濃度的udg存在下引物延伸反應50分鐘后熒光信號的變化。此處，f50和f0分別代表引物延伸反應50分鐘和0分鐘后taqman探針的熒光強度。(b)中的插圖：顯示在udg的濃度(0-0.3u/ml)引物延伸反應50分鐘后熒光強度的變化的線形圖。該實驗中使用的聚合酶、udg適體和udg阻斷劑的終濃度分別為5.5nm、200nm、10nm和10nm。圖12顯示了測試本發(fā)明用于檢測和量化udg靶標酶的系統(tǒng)的特異性的結果。(b)引物延伸反應50分鐘后熒光信號的變化。此處，f50和f0分別代表引物延伸反應50分鐘和0分鐘后taqman探針的熒光強度。將dna聚合酶添加至包含下述的樣品：空白(1)、udg(2)、haag(3)、hogg1(4)、fpg(5)、bamhi(6)、exoi(7)和λ核酸外切酶(8)。該實驗中使用的聚合酶、udg適體、udg阻斷劑、udg和另一種酶的終濃度分別為5.5nm、200nm、10nm、0.5u/ml和5u/ml。用于實施本發(fā)明的最佳模式在本發(fā)明中，建立了高度靈敏的基于酶的檢測和量化系統(tǒng)，其無需使用抑制劑標記且可普遍用于檢測和量化多種靶dna。在本發(fā)明中，引入了實施dna延伸反應的taqdna聚合酶和與taqdna聚合酶特異性結合以抑制dna聚合酶活性的dna適體(dangetal.,journalofmolecularbiology,264:268-278,1996；linetal.,journalofmolecularbiology,271:100-111,1997；yakimovichetal.,biochemistry-moscow,68:228-235,2003)。具體地，設計了用于檢測和量化靶核酸的dna適體以包含特異性識別靶核酸的單鏈dna，且可以看到的是，僅當所述單鏈dna通過與靶核酸結合穩(wěn)定化時，其可與taqdna聚合酶結合以抑制dna聚合酶活性。此外，還開發(fā)了通過與阻斷劑dna結合抑制聚合酶活性的dna適體系統(tǒng)。由于設計了阻斷劑dna以具有與靶核酸互補的序列，靶核酸的存在從dna適體分離阻斷劑dna。結果是，dna適體不再抑制聚合酶活性，且因此聚合酶的特征性活性恢復。通過核酸酶和dna適體之間的相互作用的這種聚合酶活性的變化可通過實時測量在基于taqman探針的引物延伸反應過程中發(fā)生的熒光信號進行分析。本發(fā)明具有超越常規(guī)基于核酸的檢測技術(hutteretal.,trendsinpharmacologicalsciences,34:497-507,2013)的優(yōu)勢在于，由于識別靶核酸的部分和信號檢測部分彼此分離，可基于dna適體的單鏈核苷酸序列的變化分析多種靶核酸，所述dna適體是識別靶核酸的部分，同時保持信號檢測部分而無變化。此外，本發(fā)明還具有通過使用適體序列以高靈敏性檢測和量化除靶核酸之外的多種生物分子和化學物質的能力，所述適體序列作為阻斷劑dna特異性識別細胞、蛋白、小分子物質等。在本發(fā)明中使用的基于taqman探針的信號生成技術可容易地用顯色和電化學技術等替換。在本發(fā)明中，已發(fā)現(xiàn)僅當dna適體(其特異性識別taqdna聚合酶以抑制聚合酶活性)被修飾從而其將通過與靶核酸結合形成穩(wěn)定的結構時，其可抑制聚合酶活性?；谠摪l(fā)現(xiàn)，開發(fā)了可普遍用于檢測和量化多種靶核酸的新方法。目前尚未報道通過靶核酸誘導嘗試的聚合酶活性控制和基于其開發(fā)的檢測和量化系統(tǒng)，且本發(fā)明的系統(tǒng)具有的超越常規(guī)基于核酸的檢測技術的優(yōu)勢在于，其可僅基于在dna適體的單鏈核苷酸序列的變化檢測和量化多種靶核酸，且在于可以簡單的方式實施檢測和量化而無需使用抑制劑標記酶。此外，本發(fā)明不僅可基于靶標控制的聚合酶活性用于檢測和量化靶核酸，還可檢測和量化其他生物分子和化學物質。如本文使用的術語"核酸"意為單鏈或雙鏈dna、rna和及其任何化學修飾物，且這樣的修飾包括但不限于：骨架(backbone)修飾、甲基化、異常的堿基配對組合、5-溴-尿嘧啶的取代等，條件僅是所述修飾不干擾所選核酸的擴增。如本文使用的術語"適體"指可以高親和力特異性識別其靶分子的小的單鏈寡核苷酸。本發(fā)明中的適體一般可具有約15至約200個核苷酸的長度，但不限于此。例如，適體的長度可低于約100個核苷酸，且優(yōu)選低于約80個核苷酸?？稍诒景l(fā)明中使用的適體的長度不受具體限制，但可以是約96個核苷酸，且可通過后selex過程(post-selexprocess)修飾以具有20-30個核苷酸的長度。如果核苷酸總數(shù)小，則化學合成和大量生產(chǎn)得以改進，且成本效益提高。此外，提供了對于在活體上應用的較高穩(wěn)定性和較低毒性。本發(fā)明的適體可通過說明書的公開內容和本領域本身已知的方法化學合成。適體通?？墒褂胹elex方法或其改進的版本制備[例如ellingtonetal.,nature,346:818-822,1990；tuerketal.,science,249:505-510,1990]。selex方法指鑒別特異性針對每種分子的dna序列的方法，其通過選擇和擴增對于來自隨機合成的dna或rna的集合的特定分子具有高特異性的dna或rna實現(xiàn)(j.w.parketal.,chemicalcommunications,48(15):2071-2073,2012)。在selex方法中，濃縮對于靶分子具有較強結合親和力的適體并通過增加輪數(shù)或使用競爭物質選擇。因此，通過調整selex的輪數(shù)和/或改變競爭性條件，在一些情況中可獲得具有不同結合親和力的適體、具體不同結合模式的適體，或具有相同結合親和力或結合模式但具有不同核苷酸序列的適體。包含在本發(fā)明適體中的每種相同或不同的核苷酸可以是在核糖(即嘧啶核苷酸的核糖)的2′位置包含羥基基團的核苷酸(即未經(jīng)取代的核苷酸)或具有在核糖2’位置由任何原子或基團取代的羥基基團的核苷酸。由任何原子或基團取代的這種核苷酸的實例包括由氫原子、氟原子或-o-烷基(例如-o-me基團)、-o-?；?例如-o-cho基團)或氨基(例如-nh2基團)取代的核苷酸。本發(fā)明的適體還可以是其中在核糖的2'位置至少一個(例如1、2、3或4個)核苷酸包含羥基或任何上述原子或基團的核苷酸，例如包含至少兩個(例如2、3或4個)選自下組的基團：氫原子、氟原子、羥基和甲氧基。本發(fā)明的適體還可以是其中全部核苷酸在核糖的2’位置相同地包含羥基或任何上述原子或基團，例如，選自下組的相同的基團：氫原子、氟原子、羥基和-o-me基。本發(fā)明的適體可以是其中每個核苷酸的糖殘基(例如核糖或脫氧核糖)已經(jīng)修飾以增加適體對于靶分子或靶核酸的親和力、適體的穩(wěn)定性等的一種。作為在糖殘基中可修飾的位點的實例，可提到在2′-位置、3′-位置和/或4′-位置具有的氧原子由另一原子等替換的一些糖殘基。作為修飾的實例，可提到氟化作用、o-烷基化(例如o-甲基化、o-乙基化)、o-芳基化、s-烷基化(例如s-甲基化、s-乙基化)、s-芳基化和氨基化(例如-nh2)。糖殘基中這樣的改變可通過本身已知的方法實施(參加例如sproatetal.,nucle.acid.res.19:733-738,1991；cottonetal.,nucl.acid.res.19:2629-2635,1991；hobbsetal.,biochemistry,12:5138-5145,1973)。本發(fā)明的適體還可具有改變(例如化學取代)的核酸堿基(例如嘌呤或嘧啶)以增加其對于靶分子或靶核酸的親和力。這種改變的實例包括在5-位置的嘧啶改變、在6-和/或8-位置的嘌呤改變、具有外環(huán)胺的改變、用4-硫代尿苷取代和用5-溴或5-碘-尿嘧啶取代。此外，包含在本發(fā)明適體內的磷酸基團可經(jīng)改變以賦予對核酸酶和水解的抗性。例如，p(o)o基團可用p(o)s(硫酯)、p(s)s(二硫代酯)、p(o)nr2(酰胺酯(amidate))、p(o)r、r(o)or’、co或ch2(甲縮醛)或3’-胺(-nh-ch2-ch2-)替換，其中r或r’的每個單元獨立地為h或取代或未取代的烷基(例如甲基、乙基)。連接基團為例如-o-、-n-或-s-，且核苷酸可與相鄰的核苷酸經(jīng)由連接基團結合。本發(fā)明中的改變還可包括如在3'和5'帽化(capping)的改變。改變可進一步通過對末端添加聚乙二醇、氨基酸、肽、反向dt、核酸、核苷、肉豆蔻?；⑹懰嵊突⒍榛?、月桂?；?、硬脂?；?、棕櫚?；?、油?；?、亞油酰基、其他脂質、類固醇、膽固醇、咖啡因、維生素、色素、熒光物質、抗癌劑、毒素、酶、放射性物質、生物素等(參見美國專利第5,660,985和5,756,703號)。適體與靶分子以廣泛的多種結合模式結合，諸如基于磷酸基團負電荷的離子鍵、基于核糖的疏水鍵和氫鍵及基于核酸堿基的氫鍵和堆疊相互作用。具體地，以與組成性核苷酸的數(shù)目相同數(shù)目存在的基于磷酸基團的負電荷的離子鍵強，且與存在于蛋白正電荷表面上的賴氨酸和精氨酸結合。由于該原因，未參與與靶分子的直接結合的核酸堿基可被取代。具體而言，由于莖(stem)結構區(qū)已形成堿基對并面向雙螺旋結構的內側，核酸堿基不大可能直接與靶分子結合。因此，即使當堿基對用另一堿基對替換時，適體的活性通常并不降低。在其中未形成堿基對的結構中，諸如環(huán)(loop)結構，條件是核酸堿基未參與與靶分子的直接結合，則堿基取代是可能的。對于核糖2′-位置的修飾，在核糖2′-位置的官能團很少直接與分子相互作用，但在多種情況中，這并無相關性，且可由另一經(jīng)修飾的分子取代。因此，適體經(jīng)常保持其活性，除非參與與靶分子直接結合的官能團被取代或缺失。在本發(fā)明的實例中，作為以關閉模式用于檢測和量化靶dna的方法，實施了實驗以確認經(jīng)設計以便包含多種單鏈核苷酸序列的dna適體與互補的靶核酸結合以抑制聚合酶活性。如圖2(a)和2(b)中所示，可以看到僅當與dna適體的單鏈核苷酸序列互補的靶核酸存在下，dna適體抑制聚合酶的活性，且因此出現(xiàn)低熒光信號。此外，可以看到靶核酸存在下dna適體抑制聚合酶活性的程度與原始78聚體dna適體抑制聚合酶的程度相似。在本發(fā)明的另一實例中，在實施的實驗中，將靶核酸誘導的聚合酶活性用于檢測和量化脲(解脲脲原體(ureaplasmaurealyticum)，一種引起性傳播疾病的病原體)。如圖3(a)、3(b)和3(c)中所示，可以看到僅在作為靶核酸的脲dna存在下，經(jīng)設計以與脲dna特異性結合的dna適體抑制聚合酶的活性。然而，當添加不與dna適體相互作用的陰性對照衣原體(沙眼衣原體(chlamydiatrachomatis))dna時，可以看到dna聚合酶活性未受抑制并出現(xiàn)固有的高聚合酶活性。在本發(fā)明的另一實例中，實施了實驗以測量基于優(yōu)化的條件在不同濃度添加脲dna時存在的熒光信號。結果是，可以看到，隨脲dna的濃度增加，聚合酶活性受到抑制，且因此發(fā)生熒光信號的減少。此外，可以看到的是，在0-10nm的脲dna濃度范圍熒光信號線性減少且檢測極限為0.91nm。在本發(fā)明的另一實例中，實施的實驗中將以關閉模式用于檢測和量化靶dna的方法普遍用于檢測和量化多種靶核酸。因此，在該實驗中，設計了包含與衣原體dna特異性結合的單鏈dna的dna適體并與不同濃度的衣原體dna溫育。如圖5中所見，隨衣原體dna的濃度增加，聚合酶活性受到抑制，且結果是，發(fā)生熒光信號的減少。可以看到的是，在0-10nm的衣原體dna濃度范圍熒光信號線性減少且檢測極限為1.47nm。在本發(fā)明中使用的適體如下(下劃線：保守區(qū)(seqidno:21))：原始的dna適體:5'-ttctcggttggtctctggcggagcaagaccagacaatgtacagtattggcctgatcttgtgtatgattcgcttttccc-3'(seqidno:1)t20-適體:5'-ttttttttttttttttttttcaatgtacagtattg-3'(seqidno:2)隨機1-適體:5'-agtcagtcagtcagtcagtccaatgtacagtattg-3'(seqidno:4)隨機2-適體:5'-actgactgactgactgactgcaatgtacagtattg-3'(seqidno:6)t20-適體(反向):5'-caatgtacagtattgtttttttttttttttttttt-3'(seqidno:8)脲特異性適體1:5'-taggacggtcaccagtatttttaatcaatgtacagtattg-3'(seqidno:9)衣原體特異性適體:5'-tacaagctgcaatcccttttaagatcaatgtacagtattg-3'(seqidno:12)脲特異性適體2:5'-aaatactggtgaccgtcctacaatgtacagtattg-3'(seqidno:14)udg適體:5'-ttttaattttaattttcaatgtacagtattg-3'(seqidno:18)因此，第一方面，本發(fā)明涉及使用由靶核酸控制的核酸聚合酶活性以關閉模式檢測或量化所述靶核酸的方法，其包括：(a)添加核酸聚合酶至包含適體和檢測樣品的混合物，并使所述核酸聚合酶與所述混合物反應以由此使核酸聚合酶與適體-靶核酸復合物結合，所述適體含有特異性識別所述靶核酸的單鏈核酸，且所述檢測樣品推測可能包含所述靶核酸，(b)將包含引物和信號生成物質的混合物與步驟(a)的反應產(chǎn)物混合，隨后進行引物延伸反應；和(c)分析步驟(b)的引物延伸反應以由此檢測或量化所述靶核酸。在本發(fā)明中，所述適體的單鏈具有與所述靶核酸互補的核苷酸序列。此外，當其與所述靶核酸結合時所述適體形成穩(wěn)定的結構，且隨后與所述核酸聚合酶結合以降低所述聚合酶的活性。此外，所述適體在其5’末端或3’末端具有seqidno:21所示的保守區(qū)。此外，所述適體具有選自下組的核苷酸序列：seqidno:1、seqidno:2、seqidno:4、seqidno:6、seqidno:8、seqidno:9和seqidno:12。在本發(fā)明中，所述靶核酸可選自下組：a20-靶標、隨機1-靶標、隨機2-靶標、互補的脲-靶標1、非互補的衣原體-靶標1和互補的衣原體-靶標2，且所述核酸聚合酶可以是taqdna聚合酶。在本發(fā)明中，將步驟(a)的混合物在約90℃加熱約5分鐘，且隨后緩慢冷卻至約25℃，隨后向其添加所述核酸聚合酶并進行反應。更具體地，將步驟(a)的混合物在90℃加熱5分鐘，且隨后以0.1℃/秒的速率緩慢冷卻至25℃，并在25℃溫育30分鐘，隨后向其添加核酸聚合酶并反應20分鐘以由此使核酸聚合酶與適體-靶核酸復合物結合。在本發(fā)明中，包含所述信號生成物質的混合物可進一步包含模板核酸和taqman探針。在本發(fā)明中，將步驟(b)中使用的包含所述信號生成物質的混合物在約90°加熱約5分鐘，且隨后緩慢冷卻至約25℃，隨后使其進行反應，所述反應使所述引物和taqman探針與模板核酸結合，且隨后與步驟(a)的反應產(chǎn)物混合。更具體地，將步驟(b)中使用的包含所述信號生成物質的混合物在90°加熱5分鐘，且隨后以0.1℃/秒的速率緩慢冷卻至25℃，隨后使其進行反應，所述反應使所述引物和taqman探針與模板核酸結合，且隨后進行使所述引物和taqman探針與模板核酸結合的反應達60分鐘，且隨后與步驟(a)的反應產(chǎn)物混合。在本發(fā)明中，步驟(c)可包括檢測或量化源自步驟(b)的引物延伸反應的信號以由此確定所述靶核酸的存在或不存在。此外，所述引物延伸反應在20-30℃的溫度實施，且所述信號生成物質用選自下組的物質標記：放射性同位素、熒光物質、染料、納米顆粒、酶、酶底物、發(fā)光物質和包含電化學官能團的物質。如圖1所示，根據(jù)本發(fā)明使用靶核酸控制的核酸聚合酶活性以關閉模式檢測或量化靶核酸的方法是使用如下特性檢測和量化靶核酸的方法：當其與靶核酸結合時包含單鏈核酸的適體形成穩(wěn)定的結構，且隨后與核酸聚合酶結合以降低聚合酶的活性。如本文使用的術語"樣品"指包含或推測可能包含靶核酸或靶分子的且將對其進行分析的組合物。樣品可以是收集自下述一種或多種的樣品：包括但不限于液體、土壤、空氣、食品、廢物、動物腸道和動物組織。此處，液體的實例可以是血清、血液、尿液、水、淚液、汗液、唾液、血液、血清、血漿、痰液、淋巴液和腦脊液。水的實例包括河水、海水、湖水和雨水。廢物的實例包括污水、廢水等。動物包括人體。此外，動物和植物組織的實例包括粘膜、皮膚、皮質、毛發(fā)、鱗屑、眼睛、舌頭、臉頰、蹄、喙、鼻、腳、手、嘴、乳頭、耳朵、鼻等。在本發(fā)明的另一實例中，在靶核酸檢測和量化系統(tǒng)(其經(jīng)設計以便操作以開啟模式檢測和量化靶dna的方法)中，實施了用于靶核酸控制的聚合酶活性的實驗(圖7)。具體地，設計了特異性識別脲dna的阻斷劑dna，并構建了適于所述阻斷劑dna的dna適體以實施實驗?？梢钥吹降氖?，隨阻斷劑dna的濃度增加，聚合酶活性受到抑制。使用實驗中確定為最佳的20nm的阻斷劑dna濃度()，實施了脲dna的檢測和量化。如圖7(b)中所示，可以看到的是，僅當靶核酸脲dna存在時(3)，聚合酶被活化，并出現(xiàn)高熒光信號。然而，當陰性對照衣原體dna存在時(4)，聚合酶活性持續(xù)受到抑制，并出現(xiàn)低熒光信號。測量了在通過實驗所選的條件下添加不同濃度的脲dna時出現(xiàn)的熒光信號。如圖7(c)和7(d)中所見，隨脲dna的濃度增加，聚合酶活性增加，且因此出現(xiàn)高熒光信號。此外，可以看到的是，在0-20nm的脲dna濃度范圍中熒光信號線性增加且檢測極限為2.67nm。因此，第二方面，本發(fā)明涉及使用由靶核酸控制的核酸聚合酶活性以開啟模式檢測或量化所述靶核酸的方法，其包括：(a)添加核酸聚合酶和推測可能包含所述靶核酸的檢測樣品至包含阻斷劑核酸和適體的混合物，并使所述核酸聚合酶和所述檢測樣品與所述混合物反應以由此使所述核酸聚合酶與適體-阻斷劑核酸復合物結合，所述阻斷劑核酸具有與所述靶核酸互補的核苷酸序列，所述適體包含與所述阻斷劑核酸互補的單鏈核酸；(b)將包含引物和信號生成物質的混合物與步驟(a)的反應產(chǎn)物混合，隨后進行引物延伸反應；和(c)分析步驟(b)的引物延伸反應以由此檢測或量化所述靶核酸。在本發(fā)明中，所述適體的單鏈具有與所述阻斷劑核酸互補的核苷酸序列，且當其與所述阻斷劑核酸結合時所述適體形成穩(wěn)定的結構，且隨后與所述核酸聚合酶結合以降低所述聚合酶的活性。此外，所述適體在其5’末端或3’末端具有seqidno:21所示的保守區(qū)，且所述適體具有seqidno:14所示的核苷酸序列。在本發(fā)明中，所述靶核酸可以是互補的脲-靶標2或非互補的衣原體-靶標2，且所述核酸聚合酶可以是taqdna聚合酶。所述引物延伸反應可在20-30℃的溫度實施。在本發(fā)明中，步驟(a)的混合物在約90℃加熱約5分鐘，且隨后緩慢冷卻至約25℃，隨后向其添加所述核酸聚合酶并進行反應。更具體地，步驟(a)的混合物在90℃加熱5分鐘，且隨后以0.1℃/秒的速率緩慢冷卻至25℃，并在25℃溫育30分鐘，隨后向其添加核酸聚合酶并反應20分鐘以由此使核酸聚合酶與適體-靶核酸復合物結合。在本發(fā)明中，包含所述信號生成物質的混合物可進一步包含模板核酸和taqman探針。在本發(fā)明中，將步驟(b)中使用的包含所述信號生成物質的混合物在約90°加熱約5分鐘，且隨后緩慢冷卻至約25℃，隨后使其進行反應，所述反應使所述引物和taqman探針與模板核酸結合，且隨后與步驟(a)的反應產(chǎn)物混合。更具體地，將步驟(b)中使用的包含所述信號生成物質的混合物在90°加熱5分鐘，且隨后以0.1℃/秒的速率緩慢冷卻至25℃，隨后使其進行反應，所述反應使所述引物和taqman探針與模板核酸結合，且隨后進行使所述引物和taqman探針與模板核酸結合的反應達60分鐘，且隨后與步驟(a)的反應產(chǎn)物混合。在本發(fā)明中，所述信號生成物質可用選自下組的物質標記：放射性同位素、熒光物質、染料、納米顆粒、酶、酶底物、發(fā)光物質和包含電化學官能團的物質，且步驟(c)可包括檢測或量化源自步驟(b)的引物延伸反應的信號以由此確定所述靶核酸的存在或不存在。在本發(fā)明中，所述阻斷劑核酸可以是阻斷劑dna或阻斷劑rna，且所述阻斷劑核酸是具有seqidno:15所示的核苷酸序列的脲特異性阻斷劑。如圖6中所示，根據(jù)本發(fā)明使用靶核酸控制的核酸聚合酶活性以開啟模式檢測或量化靶核酸的方法是使用如下特性檢測和量化靶核酸的方法：當其與阻斷劑核酸結合時包含單鏈核酸的適體形成穩(wěn)定的結構，且隨后與核酸聚合酶結合以降低聚合酶的活性。在本發(fā)明的另一實例中，在以開啟模式檢測和量化udg的方法中，如可在圖10(a)和10(b)中所見，使用經(jīng)設計以對udg特異性響應的dna適體檢測udg對聚合酶活性的影響的結果是，僅當udg靶標酶存在時，聚合酶活性增加，且因此出現(xiàn)高熒光信號(3)。然而，當實施其中將包含代替尿嘧啶核堿基的胸腺嘧啶的dna引入與dna適體的單鏈區(qū)互補的阻斷劑dna的實驗時，可以看到的是，聚合酶活性由dna適體抑制，而不論ugd存在或不存在(4和5)。這表明通過udg切割尿嘧啶核堿基在聚合酶活性的恢復中起重要的作用且udg酶活性可基于通過udg對尿嘧啶核堿基的切割檢測和量化。在本發(fā)明的另一實例中，實施了測量當基于通過實驗確定的最佳條件以不同濃度添加udg時出現(xiàn)的熒光信號的實驗(圖11)。結果是，可以看到，隨udg的濃度增加，聚合酶活性增加，且因此出現(xiàn)高熒光信號。此外，可以看到的是，在0-0.3u/ml的udg濃度范圍內熒光信號線性增加且檢測極限為0.024u/ml。在本發(fā)明的另一實例中，實施了測量新開發(fā)的系統(tǒng)對于分析本發(fā)明中的靶標酶的特異性的實驗(圖12)。從圖12中的結果可以看到的是，當haag(人烷基腺嘌呤dna糖基化酶)(3)、hogg1(人8-氧基鳥嘌呤dna糖基化酶1)(4)、fpg(甲酰氨基嘧啶-dna糖基化酶)(5)、bamhi(6)、exoi(7)或λ核酸外切酶(8)存在時，受到dna適體抑制的聚合酶活性未恢復，且出現(xiàn)了低熒光信號。然而，當存在靶酶udg時，dna適體轉化為包含通過尿嘧啶核堿基切割的單鏈的dna適體結構，且因此聚合酶被活化并出現(xiàn)高熒光信號。在本發(fā)明中使用的"靶材料"可以是選自下組的任一種：核酸、糖、脂質、蛋白、肽、適體、抗原、抗體、半抗原、低分子量材料、大分子復合物、細胞、藥劑、有機化合物和無機化合物，但不限于此。此處，術語“低分子量材料”意為包括非極性低分子量化合物諸如雙酚a。因此，第三方面，本發(fā)明涉及使用由靶核酸控制的核酸聚合酶活性以開啟模式檢測或量化靶分子的方法，其包括：(a)添加核酸聚合酶和推測可能包含所述靶分子的檢測樣品至包含阻斷劑核酸和適體的混合物，并使所述核酸聚合酶和所述檢測樣品與所述混合物反應以由此使所述核酸聚合酶與適體-阻斷劑核酸復合物結合，所述阻斷劑核酸具有特異性識別并結合靶分子的核苷酸序列，所述適體包含與所述阻斷劑核酸互補的單鏈核酸；(b)將包含引物和信號生成物質的混合物與步驟(a)的反應產(chǎn)物混合，隨后進行引物延伸反應；和(c)分析步驟(b)的引物延伸反應以由此檢測或量化所述靶分子。在本發(fā)明中，所述適體的單鏈可具有與所述阻斷劑核酸互補的核苷酸序列，且當與所述阻斷劑核酸結合時所述適體形成穩(wěn)定的結構，且隨后與所述核酸聚合酶結合以降低所述聚合酶的活性。此外，所述適體在其5’末端或3’末端具有seqidno:21所示的保守區(qū)。在本發(fā)明中，所述阻斷劑核酸可以是特異性識別并結合靶分子的dna或rna。所述靶分子可以是選自下組的任一種：核酸、糖、脂質、蛋白、肽、適體、抗原、抗體、半抗原、低分子量材料、大分子復合物、細胞、藥劑、有機化合物和無機化合物。在本發(fā)明中，所述核酸聚合酶可以是taqdna聚合酶，且所述引物延伸反應在20-30℃的溫度實施。所述信號生成物質用選自下組的物質標記：放射性同位素、熒光物質、染料、納米顆粒、酶、酶底物、發(fā)光物質和包含電化學官能團的物質，且步驟(c)可包括檢測或量化源自步驟(b)的引物延伸反應的信號以由此確定所述靶核酸的存在或不存在。包含所述信號生成物質的混合物進一步包含模板核酸和taqman探針。如圖8所示，根據(jù)本發(fā)明使用靶分子控制的核酸聚合酶活性以開啟模式檢測或量化靶分子的方法是使用如下特性檢測和量化靶核酸的方法：當其與阻斷劑核酸結合時包含單鏈核酸的適體形成穩(wěn)定的結構，且隨后與核酸聚合酶結合以降低聚合酶的活性。第四方面，本發(fā)明針對使用由ber(堿基切除修復)酶控制的核酸聚合酶活性以開啟模式檢測或量化靶ber(堿基切除修復)酶活性的方法，其包括：(a)添加核酸聚合酶和推測可能包含所述靶ber酶的檢測樣品至包含阻斷劑核酸和適體的混合物，并使所述核酸聚合酶和所述檢測樣品與所述混合物反應以由此使所述核酸聚合酶與適體-阻斷劑核酸復合物結合，所述阻斷劑核酸具有特異性針對靶ber酶的核苷酸序列，所述適體包含與所述阻斷劑核酸互補的單鏈核酸；(b)將包含引物和信號生成物質的混合物與步驟(a)的反應產(chǎn)物混合，隨后進行引物延伸反應；和(c)分析步驟(b)的引物延伸反應以由此檢測或量化所述靶ber(堿基切除修復)酶的活性。在本發(fā)明中，所述適體的單鏈具有與所述阻斷劑核酸互補的核苷酸序列，且當其與所述阻斷劑核酸結合時所述適體形成穩(wěn)定的結構，且隨后與所述核酸聚合酶結合以降低所述聚合酶的活性。此外，所述適體在其5’末端或3’末端可具有seqidno:21所示的保守區(qū)。所述適體可具有seqidno:18所示的核苷酸序列。在本發(fā)明中，所述阻斷劑核酸可以是用作靶ber酶的底物的dna。所述阻斷劑核酸可以是具有seqidno:19所示的核苷酸序列的udg(尿嘧啶dna糖基化酶)阻斷劑，將其用作靶ber酶的底物，且所述靶ber酶可以是udg(尿嘧啶dna糖基化酶)。在本發(fā)明中，所述核酸聚合酶可以是taqdna聚合酶，且所述引物延伸反應可在20-30℃的溫度實施。在本發(fā)明中，步驟(a)的混合物在約90℃加熱約5分鐘，且隨后緩慢冷卻至約37℃，隨后向其添加推測可能包含所述靶ber(堿基切除修復)酶的檢測樣品，并將獲得的混合物緩慢冷卻至約25℃，隨后向其添加靶核酸聚合酶并進行反應。更具體地，將步驟(a)的混合物在90℃加熱5分鐘，且隨后以0.1℃/秒的速率緩慢冷卻至37℃，并在37℃溫育20分鐘，隨后向其添加推測可能包含所述靶ber(堿基切除修復)酶的檢測樣品且隨后將獲得的混合物以0.1℃/秒的速率緩慢冷卻至25℃，并在25℃溫育5分鐘，隨后向其添加核酸聚合酶并在25℃反應20分鐘以由此使核酸聚合酶與適體-阻斷劑核酸復合物結合。在本發(fā)明中，包含所述信號生成物質的混合物可進一步包含模板核酸和taqman探針。在本發(fā)明中，將步驟(b)的包含所述信號生成物質的混合物在約90°加熱約5分鐘，且隨后緩慢冷卻至約25℃，隨后使其進行反應，所述反應使所述引物和taqman探針與模板核酸結合，且隨后與步驟(a)的反應產(chǎn)物混合。更具體地，可將包含步驟(b)的信號生成物質的混合物在90℃加熱5分鐘，且隨后以0.1℃/秒的速率緩慢冷卻至25℃，隨后在25℃進行使引物和taqman探針與模板結合的反應達60分鐘且隨后與步驟(a)的反應產(chǎn)物混合。在本發(fā)明中，所述信號生成物質可用選自下組的物質標記：放射性同位素、熒光物質、染料、納米顆粒、酶、酶底物、發(fā)光物質和包含電化學官能團的物質，且步驟(c)可包括檢測或量化源自步驟(b)的引物延伸反應的信號以由此分析所述靶ber(堿基切除修復)酶的活性。如圖9中所示，根據(jù)本發(fā)明使用靶ber(堿基切除修復)酶控制的核酸聚合酶活性以開啟模式檢測或量化靶ber(堿基切除修復)酶的方法是使用如下特性檢測和量化靶核酸的方法：當其與阻斷劑核酸結合時含有單鏈核酸的適體形成穩(wěn)定的結構，且隨后與核酸聚合酶結合以降低靶ber(堿基切除修復)酶的活性。第五方面，本發(fā)明涉及使用由靶核酸酶控制的核酸聚合酶活性以開啟模式檢測或量化靶核酸酶活性的方法，其包括：(a)添加核酸聚合酶和推測可能包含所述靶核酸酶的檢測樣品至包含阻斷劑核酸和適體的混合物，并使所述核酸聚合酶和所述檢測樣品與所述混合物反應以由此使所述核酸聚合酶與適體-阻斷劑核酸復合物結合，所述阻斷劑核酸具有特異性針對所述靶核酸酶的核苷酸序列，所述適體包含與所述阻斷劑核酸互補的單鏈核酸；(b)將包含引物和信號生成物質的混合物與步驟(a)的反應產(chǎn)物混合，隨后進行引物延伸反應；和(c)分析步驟(b)的引物延伸反應以由此檢測或量化所述靶核酸酶的活性。在本發(fā)明中，所述適體的單鏈可具有與所述阻斷劑核酸互補的核苷酸序列，且當其與所述阻斷劑核酸結合時所述適體形成穩(wěn)定的結構，且隨后與所述核酸聚合酶結合以降低所述聚合酶的活性。此外，所述適體在其5’末端或3’末端具有seqidno:21所示的保守區(qū)。在本發(fā)明中，所述阻斷劑核酸是用作靶核酸酶底物的dna或rna。在本發(fā)明中，所述核酸聚合酶可以是taqdna聚合酶，且所述引物延伸反應在20-30℃的溫度實施。在本發(fā)明中，所述信號生成物質用選自下組的物質標記：放射性同位素、熒光物質、染料、納米顆粒、酶、酶底物、發(fā)光物質和包含電化學官能團的物質，且步驟(c)可包括檢測或量化源自步驟(b)的引物延伸反應的信號以由此分析所述靶核酸酶的活性。包含所述信號生成物質的混合物可進一步包含模板核酸和taqman探針。如圖9中所示，根據(jù)本發(fā)明使用靶核酸酶控制的核酸聚合酶活性以開啟模式檢測或量化靶核酸酶的方法是使用如下特性檢測和量化靶核酸的方法：當其與阻斷劑核酸結合時包含單鏈核酸的適體形成穩(wěn)定的結構，且隨后與核酸聚合酶結合以降低靶核酸酶的活性。圖1是顯示靶核酸誘導的核酸聚合酶活性開關和使用taqman探針分析所述聚合酶活性的原理的示意圖。具體地，圖1是顯示基于dna適體檢測和量化靶核酸的原理的示意圖，所述dna適體特異性地與taqdna聚合酶結合以抑制酶的活性。如果待檢測和量化的靶核酸不存在，則經(jīng)設計以包含單鏈dna區(qū)的dna適體將不會識別聚合酶，且因此所述聚合酶將具有固有的高活性。然而，如果靶核酸存在，則其將與dna適體的單鏈dna區(qū)特異性結合，且由所述結合穩(wěn)定化的dna適體將與聚合酶結合以抑制所述聚合酶的活性(1，靶標識別)。如上文所述的由靶核酸控制的聚合酶活性可通過基于taqman探針的引物延伸反應進行分析。如果靶核酸不存在，則taqman探針的切割將通過聚合酶的高活性誘導，且因此將出現(xiàn)高熒光信號。然而，如果靶核酸存在，則聚合酶的活性將由dna適體抑制，且因此從taqman探針產(chǎn)生的熒光信號將減少。如上文所述，靶核酸可以容易地通過觀察dna適體的結構穩(wěn)定化(由靶核酸的結合引起)和聚合酶活性的抑制和生成的熒光信號的變化(由結構穩(wěn)定化引起)檢測和量化。此外，本發(fā)明具有的優(yōu)勢在于其可以成本有效和容易的方式分析多種靶核酸，上述方式通過僅改變dna適體的單鏈核苷酸序列(其為識別靶核苷酸的部分)同時保持信號檢測部分不變來實現(xiàn)，這是由于識別靶核酸的部分和信號檢測部分彼此分離。圖6是顯示通過引入阻斷劑dna檢測和量化靶核酸的原理的示意圖，從而除了如上文所述實施的關閉模式(信號關閉模式)之外，實施了以開啟模式(信號開啟模式)操作的本發(fā)明。如圖6所示，如果待檢測和量化的靶核酸不存在，則由阻斷劑dna穩(wěn)定化的dna適體將抑制聚合酶活性，且因此將出現(xiàn)低熒光信號。然而，如果靶核酸不存在，則阻斷劑dna將從dna適體分離從而dna適體將不再抑制聚合酶活性。結果是，聚合酶活性將增加，且將出現(xiàn)高熒光信號。圖8是顯示根據(jù)本發(fā)明檢測和量化靶分子的原理的示意圖。如果使用可特異性識別細胞、蛋白、小分子物質等的適體核苷酸序列設計本發(fā)明中的阻斷劑dna，則靶分子的存在將從dna適體分離阻斷劑dna，且聚合酶可通過其酶活性產(chǎn)生高熒光信號。結果是，不僅靶核酸，靶細胞、靶蛋白、靶小分子物質等也可通過控制本發(fā)明系統(tǒng)中阻斷劑dna的核苷酸序列進行分析。圖9是顯示本發(fā)明可用于分析靶標酶活性的示意圖。多種靶標酶中，將udg(尿嘧啶dna糖基化酶)選作實例，設計與包含在dna適體中的單鏈dna結合的互補阻斷劑dna以包含尿嘧啶核堿基。因此，僅當待檢測和量化的靶標酶(udg)存在時，將出現(xiàn)尿嘧啶核堿基的切割，且包含(缺乏)尿嘧啶核堿基的阻斷劑dna將從dna適體的單鏈區(qū)分離。獲得的不穩(wěn)定的dna適體將不再抑制聚合酶，且因此聚合酶活性將增加。通過基于taqman探針的引物延伸反應觀察增加的聚合酶活性。如上文所述嘗試的靶標酶誘導的聚合酶活性控制和在其基礎上的檢測和量化系統(tǒng)，通過僅變化dna適體的單鏈區(qū)同時保持讀取基于taqman探針的信號而無變化的過程，可有利地應用至用于分析多種靶標酶的系統(tǒng)。實施例在下文中，將參照實施例對本發(fā)明進行進一步詳述。對本領域的技術人員顯而易見的是，這些實施例僅出于闡述目的而不應理解為限制本發(fā)明的范圍。實施例1:以關閉模式檢測和量化靶dna的方法反應混合物作為部分a和部分b分別制備。部分a(總體積20μl)，其由下述組成：1xtaq反應緩沖液(10mmtris-hcl,ph8.3,50mmkcl,4mmmgcl2)、500μmdntp、400nmdna適體和不同濃度的互補的靶dna，將部分a在90℃加熱5分鐘，緩慢冷卻至25℃(0.1℃/秒)并在25℃溫育30分鐘。隨后將taqdna聚合酶(11nm)添加至各溶液并溫育20分鐘。部分b(總體積20μl)，其由下述組成：1xtaq反應緩沖液、600nm模板、600nm引物和500nmtaqman探針，將部分b在90℃加熱5分鐘，緩慢冷卻至25℃(0.1℃/秒)并在25℃溫育60分鐘。將部分a和部分b彼此混合，并在c1000tm熱循環(huán)儀(bio-rad,ca,usa)上測量熒光信號。以2分鐘的時間間隔在25℃監(jiān)測引物延伸反應過程中從taqman探針產(chǎn)生的熒光信號。根據(jù)實施例1的方法實施了下述實驗實施例1-4。實驗實施例1圖2顯示的實驗結果表明經(jīng)設計以包含多種單鏈核苷酸序列的dna適體通過與互補的靶核酸結合抑制酶活性。下表1顯示了在實驗中使用的dna核苷酸序列(下劃線：保守區(qū))。在圖2(a)和2(b)中可以看到，僅當與dna適體的單鏈核苷酸序列互補的靶核酸存在時，dna適體抑制聚合酶活性，且因此出現(xiàn)低熒光信號(2-5)。此外，可以看到的是，靶核酸存在下dna適體抑制聚合酶活性的程度與原始的78聚體dna適體抑制聚合酶活性的程度相似。表1實驗實施例2圖3顯示通過應用圖2中所示的靶核酸對聚合酶活性的控制用于檢測和量化脲(解脲脲原體，一種引起性傳播疾病的病原體)獲得的實驗結果。下表2顯示了在實驗中使用的dna核苷酸序列(下劃線：保守區(qū))。如圖3(a)、3(b)和3(c)中所見，僅當作為靶核酸的脲dna存在時，經(jīng)設計以與脲dna特異性結合的dna適體抑制了聚合酶活性(2)。然而，可以看到的是，當添加不與dna適體相互作用的陰性對照衣原體(沙眼衣原體)時，dna聚合酶活性未受到抑制，且出現(xiàn)了固有的高活性(3)。表2實驗實施例3圖4顯示了測量基于由實驗確定的最佳條件添加不同濃度的脲dna時出現(xiàn)的熒光信號的結果。可以看到的是，隨脲dna濃度增加，聚合酶活性受到抑制，且因此發(fā)生熒光信號的減少。此外，可以看到的是，在0-10nm的脲dna濃度范圍熒光信號線性減少且檢測極限為0.91nm。上表2顯示了在實驗中使用的dna序列。實驗實施例4圖5顯示的結果表明以關閉模式檢測和量化靶dna的方法可普遍用于檢測和量化多種靶核酸。在該實驗中，設計了包含與衣原體dna特異性結合的單鏈dna的dna適體并允許其與不同濃度的衣原體dna反應。下表3顯示在該實驗中使用的dna序列(下劃線：保守區(qū))。如圖5中所見，隨衣原體dna的濃度增加，聚合酶活性受到抑制，且因此發(fā)生熒光信號的減少。此外，可以看到的是，在0-10nm的衣原體dna濃度范圍中熒光信號線性減少且檢測極限為1.47nm。表3實施例2:以開啟模式檢測和量化靶dna的方法反應混合物分別作為部分a和部分b制備。部分a(總體積20μl)，其由下述組成：1xtaq反應緩沖液(10mmtris-hcl,ph8.3,50mmkcl,4mmmgcl2)、500μmdntp、400nmdna適體、40nm阻斷劑dna和不同濃度的互補的靶dna，將部分a在90℃加熱5分鐘，緩慢冷卻至25℃(0.1℃/秒)并在25℃溫育30分鐘。隨后將taqdna聚合酶(11nm)添加至各溶液并溫育20分鐘。部分b(總體積20μl)，其由下述組成：1xtaq反應緩沖液、600nm模板、600nm引物和500nmtaqman探針，將部分b在90℃加熱5分鐘，緩慢冷卻至25℃(0.1℃/秒)并在25℃溫育60分鐘。將部分a和部分b彼此混合，并在c1000tm熱循環(huán)儀(bio-rad,ca,usa)上測量熒光信號。以2分鐘的時間間隔在20-30℃(優(yōu)選25℃)的聚合反應溫度監(jiān)測引物延伸反應過程中從taqman探針產(chǎn)生的熒光信號。根據(jù)實施例2的方法實施了下述實驗實施例5。實驗實施例5圖7顯示了使用開啟系統(tǒng)檢測和量化脲靶dna的結果。具體地，圖7顯示了在經(jīng)設計以便以開啟模式(信號開啟模式)操作的靶dna檢測和量化系統(tǒng)中通過靶dna控制聚合酶活性的實驗結果。在該實驗中，設計了特異性識別脲dna的阻斷劑dna，并構建了適于阻斷劑dna的dna適體以實施實驗。下表4顯示了在該實驗中使用的dna序列(下劃線：保守區(qū))。圖7(a)顯示了優(yōu)化引入的阻斷劑dna的濃度的結果?？梢钥吹降氖?，隨阻斷劑dna的濃度增加，聚合酶活性降低。使用實驗中確定為最佳的20nm的阻斷劑dna濃度，實施了脲dna的檢測和量化。如在圖7(b)中所見，僅當作為靶核酸的脲dna存在時(3)，可以看到的是，聚合酶被活化，且出現(xiàn)高熒光信號。然而，當作為陰性對照的衣原體dna存在時(4)，可以看到的是，聚合酶活性持續(xù)受到抑制，且出現(xiàn)低熒光信號。測量了在通過實驗所選的條件下當添加不同濃度的脲dna時出現(xiàn)的熒光信號。如圖7(c)和7(d)中所見，隨脲dna的濃度增加，聚合酶活性增加，且因此出現(xiàn)高熒光信號。此外，可以看到的是，在0-20nm的脲dna濃度范圍中熒光信號線性增加且檢測極限為2.67nm。表4實施例3:以開啟模式檢測和量化udg的方法反應混合物分別作為部分a和部分b制備。部分a(總體積20μl)，其由下述組成：1xtaq反應緩沖液(10mmtris-hcl,ph8.3,50mmkcl,4mmmgcl2)、500μmdntp、400nmudg適體和40nmudg阻斷劑，將部分a在90℃加熱5分鐘，緩慢冷卻至37℃(0.1℃/秒)并在37℃溫育20分鐘。隨后，將不同濃度的udg或其他酶(包括haag、hogg1、fpg、bamhi、exoi和λ核酸外切酶)添加至各溶液并在37℃溫育30分鐘。將如上文所述溫育的溶液緩慢冷卻至25℃(0.1℃/秒)并在25℃溫育5分鐘。隨后將taqdna聚合酶(11nm)添加至各溶液并溫育20分鐘。部分b(總體積20μl)，其由下述組成：1xtaq反應緩沖液、600nm模板、600nm引物和500nmtaqman探針，將部分b在90℃加熱5分鐘，緩慢冷卻至25℃(0.1℃/秒)并在25℃溫育60分鐘。將部分a和部分b彼此混合，并在c1000tm熱循環(huán)儀上測量熒光信號。以2分鐘的時間間隔在20-30℃(優(yōu)選25℃)的聚合反應溫度監(jiān)測引物延伸反應過程中從taqman探針產(chǎn)生的熒光信號。根據(jù)實施例3的方法實施了下述實驗實施例6-8。實驗實施例6圖10顯示了使用經(jīng)設計以對udg特異性響應的dna適體測試udg對聚合酶活性的影響的結果。下表5顯示了在該實驗中使用的dna序列。如圖10(a)和10(b)中所見，僅當udg靶標酶存在時，聚合酶活性增加，且因此出現(xiàn)高熒光信號(3)。然而，當實施其中將包含代替尿嘧啶核堿基的胸腺嘧啶的dna引入與dna適體的單鏈區(qū)互補的阻斷劑dna的實驗時，可以看到的是，聚合酶活性由dna適體抑制，而不論udg的存在或不存在(4和5)。這表明通過udg切割尿嘧啶核堿基在聚合酶活性的恢復中起重要的作用且udg酶活性可基于通過udg對尿嘧啶核堿基的切割檢測和量化。表5鏈名稱dna序列(5′→3′)seqidnoudg適體ttttaattttaattttcaatgtacagtattgseqidno：18udg阻斷劑aaaauuaaaauuaaaaseqidno：19對照udg阻斷劑aaaattaaaattaaaaseqidno：2o實驗實施例7圖11顯示測量基于通過如圖10中所示的實驗確定的最佳條件添加不同濃度的udg時出現(xiàn)的熒光信號的結果。上表5顯示了在該實驗中使用的dna序列(下劃線：保守區(qū))?？梢钥吹降氖牵Sudg的濃度增加，聚合酶活性增加，且因此出現(xiàn)高熒光信號。此外，可以看到的是，在0-0.3u/ml的udg濃度范圍中熒光信號線性增加且檢測極限為0.024u/ml。實驗實施例8圖12顯示了測試用于分析靶標酶的新開發(fā)的系統(tǒng)的特異性的結果。上表5顯示了在該實驗中使用的dna序列(下劃線：保守區(qū))。如圖12中的結果所見，當haag(人烷基腺嘌呤dna糖基化酶)(3),hogg1(人8-氧代鳥嘌呤dna糖基化酶1)(4)、fpg(甲酰氨基嘧啶-dna糖基化酶)(5)、bamhi(6)、exoi(7)或λ核酸外切酶(8)存在時，由dna適體抑制的聚合酶活性未恢復，且出現(xiàn)低熒光信號。然而，當靶標酶udg存在時，dna適體轉化為包含由尿嘧啶核堿基切割的單鏈的dna適體結構，且因此聚合酶被活化且出現(xiàn)高熒光信號。工業(yè)實用性如上所述，本發(fā)明可提供用于診斷生物分子的方法，其可以無標記和靈敏的方式檢測和量化靶核酸、靶蛋白、靶小分子物質、靶酶活性等，所述檢測和量化由通過靶分子誘導的dna適體的構象變化來控制聚合酶的活性實現(xiàn)。盡管已參照具體特征對本發(fā)明進行了詳細說明，但對本領域技術人員顯而易見的是，本說明書僅針對優(yōu)選的實施方案且并不限制本發(fā)明的范圍。因此，本發(fā)明的實質范圍將通過所附權利要求及其等同內容限定。序列表<110>韓國科學技術院<120>通過使用由靶材料調節(jié)的核酸聚合酶的活性用于檢測和量化生物材料的方法<130>pf-b1867-cn<140>pct/kr2015/011817<141>2015-11-04<150>10-2014-0152468<151>2014-11-04<160>21<170>patentinversion3.5<210>1<211>78<212>dna<213>人工序列<220><223>原始的dna適體<400>1ttctcggttggtctctggcggagcaagaccagacaatgtacagtattggcctgatcttgt60gtatgattcgcttttccc78<210>2<211>35<212>dna<213>人工序列<220><223>t20-適體<400>2ttttttttttttttttttttcaatgtacagtattg35<210>3<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>a20-靶標<400>3aaaaaaaaaaaaaaaaaaaa20<210>4<211>35<212>dna<213>人工序列<220><223>隨機1-適體<400>4agtcagtcagtcagtcagtccaatgtacagtattg35<210>5<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>隨機1-靶標<400>5gactgactgactgactgact20<210>6<211>35<212>dna<213>人工序列<220><223>隨機2-適體<400>6actgactgactgactgactgcaatgtacagtattg35<210>7<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>隨機2-靶標<400>7cagtcagtcagtcagtcagt20<210>8<211>35<212>dna<213>人工序列<220><223>t20-適體(反向)<400>8caatgtacagtattgtttttttttttttttttttt35<210>9<211>40<212>dna<213>人工序列<220><223>脲特異性適體1<400>9taggacggtcaccagtatttttaatcaatgtacagtattg40<210>10<211>25<212>dna<213>人工序列<220><223>互補的脲-靶標1<400>10attaaaaatactggtgaccgtccta25<210>11<211>25<212>dna<213>人工序列<220><223>非互補的衣原體-靶標1<400>11atcttaaaagggattgcagcttgta25<210>12<211>40<212>dna<213>人工序列<220><223>衣原體特異性適體<400>12tacaagctgcaatcccttttaagatcaatgtacagtattg40<210>13<211>25<212>dna<213>人工序列<220><223>互補的衣原體-靶標<400>13atcttaaaagggattgcagcttgta25<210>14<211>35<212>dna<213>人工序列<220><223>脲特異性適體2<400>14aaatactggtgaccgtcctacaatgtacagtattg35<210>15<211>40<212>dna<213>人工序列<220><223>脲特異性阻斷劑<400>15taggacggtcaccagtatttttaatgctgattacttttgc40<210>16<211>40<212>dna<213>人工序列<220><223>互補的脲-靶標<400>16gcaaaagtaatcagcattaaaaatactggtgaccgtccta40<210>17<211>40<212>dna<213>人工序列<220><223>非互補的衣原體-靶標<400>17aaaagggattgcagcttgtagtcctgcttgagagaacgtg40<210>18<211>31<212>dna<213>人工序列<220><223>udg適體<400>18ttttaattttaattttcaatgtacagtattg31<210>19<211>16<212>dna<213>人工序列<220><223>udg阻斷劑<400>19aaaauuaaaauuaaaa16<210>20<211>16<212>dna<213>人工序列<220><223>對照udg阻斷劑<400>20aaaattaaaattaaaa16<210>21<211>15<212>dna<213>人工序列<220><223>適體的保守區(qū)<400>21caatgtacagtattg15當前第1頁12