相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用

無(wú)。

背景技術(shù)：

親水相互作用色譜(“hilic”)分離與uplc平臺(tái)的熒光檢測(cè)聯(lián)用，可用于拆分復(fù)雜的n-連接聚糖群，這是因?yàn)槠淠軌蛟趩未紊V運(yùn)行中分離中性聚糖和帶電荷聚糖二者。由于聚糖的異質(zhì)性、異構(gòu)化和端基異構(gòu)性，要闡明復(fù)雜的n-聯(lián)聚糖結(jié)構(gòu)可能是一個(gè)重大的分析挑戰(zhàn)。葡聚糖梯(dextranladder)可用于校準(zhǔn)對(duì)聚糖的親水相互作用色譜(“hilic”)分離，并將峰保留時(shí)間轉(zhuǎn)化成葡萄糖單元(“gu”)值。每個(gè)單獨(dú)的聚糖結(jié)構(gòu)具有與其鍵和其組成單糖直接相關(guān)的gu值。由于對(duì)于給定的聚糖，每個(gè)聚糖結(jié)構(gòu)組分均以特定的方式貢獻(xiàn)gu值，所以gu值可用于預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)。

因此，通過(guò)參考分離校準(zhǔn)物，例如基于葡聚糖梯的校準(zhǔn)物，聚糖的洗脫時(shí)間可用葡萄糖單元表示。葡聚糖梯可用于校準(zhǔn)液相色譜(“l(fā)c”)的運(yùn)行，防止其因不同時(shí)日或不同系統(tǒng)而變化。gu值可通過(guò)將五階多項(xiàng)式分布曲線或三次樣條擬合曲線擬合到葡聚糖梯的保留時(shí)間來(lái)計(jì)算。然后，使用該曲線，可根據(jù)在測(cè)試樣品中觀察到的保留時(shí)間來(lái)分配gu值。只要柱間的標(biāo)準(zhǔn)偏差小于0.3，n-聚糖的gu值便為可重現(xiàn)的。這就允許與在一段時(shí)間內(nèi)從一系列儀器中收集到的數(shù)據(jù)庫(kù)值進(jìn)行直接比較。有了gu值，就能夠查詢以gu值儲(chǔ)存的聚糖的數(shù)據(jù)庫(kù)，從而有助于闡明聚糖群中存在的潛在聚糖結(jié)構(gòu)。

此外，甚至在比較不同的加標(biāo)簽方法時(shí)，可以看出hilic分離將標(biāo)記的n-聚糖拆分成非常相似的特征譜。要產(chǎn)生適用于用快速加標(biāo)簽試劑快速標(biāo)記的聚糖的葡聚糖梯并不是一項(xiàng)簡(jiǎn)單的任務(wù)。與通過(guò)n-糖基化蛋白的酶促去糖基化釋放的n-糖基胺不同，葡聚糖是一種含還原醛末端的糖。因此，與n-糖基胺不同，葡聚糖不能用靶向胺親核試劑的快速加標(biāo)簽試劑來(lái)修飾。因?yàn)槠暇厶遣话线m的親核物質(zhì)，因此不能被快速標(biāo)記。因此，需要使用與快速標(biāo)記的n-聚糖具有相同的光學(xué)和/或其他物理化學(xué)性質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)物來(lái)校準(zhǔn)液相色譜過(guò)程的方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本文提供了制備快速標(biāo)記的葡聚糖梯和其他可用于液相色譜的校準(zhǔn)物的方法。該方法包括以下步驟：提供具有醛基的還原性聚糖，并將該還原性聚糖與具有伯胺的化合物反應(yīng)以產(chǎn)生中間化合物。用快速加標(biāo)簽試劑快速標(biāo)記該中間化合物以產(chǎn)生快速標(biāo)記的葡聚糖梯，該葡聚糖梯與用快速加標(biāo)簽試劑對(duì)n-聚糖快速加標(biāo)簽所產(chǎn)生的快速標(biāo)記的n-聚糖具有基本上相同的光學(xué)性質(zhì)。本文還提供了具有以下結(jié)構(gòu)式的校準(zhǔn)物：

其中r為葡萄糖單元或單糖單元。本文提供的方法適用于對(duì)含醛基的化合物快速加標(biāo)簽或加雙標(biāo)簽。

附圖說(shuō)明

圖1示出了用于制備快速標(biāo)記的n-聚糖的工作流程的實(shí)施方案。

圖2示出了用快速加標(biāo)簽試劑標(biāo)記的快速標(biāo)記的n-聚糖的熒光發(fā)射光譜，其具有的優(yōu)化激發(fā)波長(zhǎng)為265nm，優(yōu)化發(fā)射波長(zhǎng)為425nm。

圖3示出了用快速加標(biāo)簽試劑的類似物僅通過(guò)還原胺化標(biāo)記的葡聚糖梯的熒光發(fā)射光譜，其熒光特性發(fā)生了偏移，具有的優(yōu)化激發(fā)波長(zhǎng)為370nm，優(yōu)化發(fā)射波長(zhǎng)為480nm。

圖4a和圖4b示出了用本文提供的方法產(chǎn)生的快速標(biāo)記的葡聚糖梯的熒光特性。

圖5a、圖5b和圖5c示出了通過(guò)本文提供的方法產(chǎn)生的快速標(biāo)記的乙醇胺葡聚糖梯的代表性hilic熒光色譜圖。

圖6a、圖6b和圖6c示出了實(shí)施例3的每批次快速標(biāo)記的葡聚糖梯的對(duì)應(yīng)基峰離子(“bpi”)色譜圖。

圖7a和圖7b示出了采用glycanbehamide2.1×50mm色譜柱，將快速標(biāo)記的丙基氨基葡聚糖與快速標(biāo)記的乙醇胺葡聚糖對(duì)此獲得的熒光色譜圖。

具體實(shí)施方式

在制備生物藥物時(shí)，生物樣品的糖基化特征譜通常通過(guò)分析釋放的聚糖來(lái)進(jìn)行評(píng)估。然而，這些樣品的制備技術(shù)常常都是耗時(shí)的，或可導(dǎo)致樣品對(duì)質(zhì)譜(“ms”)分析不敏感。n-聚糖的酶促釋放和快速標(biāo)記可解決許多不足之處、提供更高的n-聚糖樣品制備通量，并且能夠提高聚糖檢測(cè)的敏感度。例如，如本文所述，通過(guò)n-聚糖的酶促釋放和快速標(biāo)記，糖蛋白如今可在低至10分鐘的時(shí)間內(nèi)去糖基化產(chǎn)生n-聚糖，產(chǎn)生的n-聚糖隨后與快速加標(biāo)簽試劑快速反應(yīng)。然后，為了方便樣品分析，通過(guò)spe法從標(biāo)記的反應(yīng)副產(chǎn)物中提取所得的標(biāo)記聚糖。

生物藥物的n-聚糖特征譜是一個(gè)關(guān)鍵的質(zhì)量屬性，因?yàn)樗蔀楣π?、安全性和制備條件的量度。因此，用于臨床和商業(yè)生物治療制劑的聚糖分析方法需要具備高敏感度。另外，當(dāng)進(jìn)行分析時(shí)，快速的周轉(zhuǎn)時(shí)間和高通過(guò)能力可促進(jìn)產(chǎn)品開發(fā)。

大多數(shù)評(píng)估來(lái)自糖蛋白的n-聚糖的分析策略都涉及經(jīng)由pngasef的去糖基化以及標(biāo)記所得的n-聚糖使其具有賦予其可檢測(cè)屬性的化學(xué)部分。在本文所述的一個(gè)方法中，標(biāo)記的聚糖通過(guò)親水相互作用色譜(“hilic”)進(jìn)行分離，通過(guò)熒光(“flr”)和質(zhì)譜(“ms”)進(jìn)行檢測(cè)。

此外，我們此前開發(fā)了一種樣品制備解決方案，該方案使flr和ms能夠?qū)厶菣z測(cè)敏感，同時(shí)提高了n-聚糖樣品制備的通量。我們已開發(fā)了快速加標(biāo)簽試劑，該試劑可合成產(chǎn)生，當(dāng)n-聚糖從糖蛋白釋放時(shí)能夠快速與其反應(yīng)。(brousmiche等人，2014年8月13日提交的美國(guó)公布的專利申請(qǐng)2014/0350263，[0008]-[0022]、[0047]-[0050]、[0053]-[0182]、[0191]、[0228]和[0230]-[0316]，以引用方式并入本文)。通過(guò)利用該快速加標(biāo)簽試劑，在5分鐘的反應(yīng)時(shí)間內(nèi)，n-聚糖就能夠被標(biāo)記。本文利用的快速加標(biāo)簽試劑包含n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)氨基甲酸酯快速標(biāo)記基團(tuán)、高效喹啉熒光團(tuán)和用于增強(qiáng)電離的強(qiáng)堿性叔胺，并且例示于下表1中。

表1

示例性快速加標(biāo)簽試劑

在本發(fā)明的方法中，還原性糖通過(guò)還原胺化被標(biāo)記(加標(biāo)簽)，并且將所得的含仲胺的糖用快速加標(biāo)簽試劑快速加標(biāo)簽。本文提供的方法可用于對(duì)任何含醛的化合物加標(biāo)簽或加雙標(biāo)簽。

為進(jìn)一步促進(jìn)n-聚糖的制備，快速加標(biāo)簽試劑的使用可直接與pngasef的去糖基化工序結(jié)合，該工序還涉及表面活性劑和hilicμ洗脫固相萃取(“spe”)清理工序以提供對(duì)所釋放和標(biāo)記的聚糖的定量回收，可省去對(duì)樣品進(jìn)行液相色譜(“l(fā)c”)分析前的溶劑干燥步驟，從而具有附加的益處。

實(shí)施例1

使用快速加標(biāo)簽試劑快速制備釋放的n-聚糖用于hilic分析

在這個(gè)實(shí)施例中，我們描述了制備加標(biāo)簽(本文也稱為“標(biāo)記”)的n-聚糖的方法，從糖蛋白到分析就緒樣品，在30分鐘內(nèi)完全去糖基化。我們的方法是一種改進(jìn)的方案，可通過(guò)稱為glycoworks^tmrapifluor-ms^tmn-聚糖試劑盒的試劑盒來(lái)促進(jìn)實(shí)施。相比于此前的熒光和ms檢測(cè)，對(duì)標(biāo)記的n-聚糖的敏感度可增加至少2倍至100倍，并且可基于用于中和四唾液酸化n-聚糖的穩(wěn)固的固相萃取(“spe”)提供準(zhǔn)確的特征譜分析。lauber，m.etal.，rapidpreparationofreleasedn-glyansforhilicanalysisusingalabelingreagentthatfacilitatessensitivefluorescenceandesi-msdetection，anal.chem.2015，97，5401-5409(lauber，m.等人，“使用促進(jìn)敏感熒光和esi-ms檢測(cè)的標(biāo)記試劑快速制備釋放的n-聚糖以供hilic分析”，《分析化學(xué)》，2015年，第97卷，第5401-5409頁(yè))，以引用方式并入本文。

基于對(duì)提供快速標(biāo)記動(dòng)力學(xué)、高熒光量子產(chǎn)率和顯著提高的ms可檢測(cè)性的合理設(shè)計(jì)考慮，來(lái)合成促進(jìn)我們的n-聚糖分析的快速加標(biāo)簽試劑。n-聚糖樣品制備可取決于醛封端糖的還原胺化。在這個(gè)過(guò)程中，聚糖在無(wú)水條件下被還原胺化以最小化去唾液酸作用。樣品制備從水性條件轉(zhuǎn)變?yōu)闊o(wú)水條件。另一方面，通過(guò)利用快速加標(biāo)簽試劑，還原胺化可通過(guò)水性快速加標(biāo)簽反應(yīng)被消除。

如果聚糖通過(guò)快速加標(biāo)簽反應(yīng)沒(méi)有被標(biāo)記，則可使用還原胺化使聚糖在其還原端被標(biāo)記。在這個(gè)反應(yīng)中，含伯胺的加標(biāo)簽試劑與聚糖的醛基發(fā)生縮合反應(yīng)，得到亞胺或席夫堿，其被還原劑還原產(chǎn)生仲胺。該反應(yīng)通常在含乙酸的二甲基亞砜中進(jìn)行，但是已經(jīng)描述了使用四氫呋喃和甲醇的替代方法。胺(本文也稱為伯胺或具有伯胺的化合物)的示例包括乙醇胺、丙胺、氨基苯甲酰胺、具有游離氨基末端的肽(如本文實(shí)施例5所示)、n，n-二甲基乙二胺、氨基蒽和氨基生物素。這種標(biāo)記方法的優(yōu)點(diǎn)在于每個(gè)聚糖都化學(xué)計(jì)量連接一個(gè)標(biāo)記，允許基于熒光或uv吸光強(qiáng)度直接進(jìn)行定量。

作為另外一種選擇，使用本文描述的glycoworks^tmrapifluor-ms^tmn-聚糖試劑盒，能夠在實(shí)驗(yàn)室中容易地采用聚糖的快速加標(biāo)簽，該試劑盒的設(shè)計(jì)目的就是消除n-聚糖樣品制備各個(gè)方面的瓶頸。如下圖1中所示，優(yōu)化的n-聚糖樣品制備工作流程需要三個(gè)步驟：(1)去糖基化，從糖蛋白釋放聚糖；(2)標(biāo)記，賦予聚糖可檢測(cè)的化學(xué)實(shí)體；以及(3)清理步驟，消除樣品中潛在的干擾。然后將這些聚糖與一種或多種快速加標(biāo)簽試劑快速反應(yīng)，用由高效熒光團(tuán)和強(qiáng)堿性叔胺組成的標(biāo)簽對(duì)其進(jìn)行標(biāo)記，從而對(duì)熒光和ms檢測(cè)產(chǎn)生增強(qiáng)的敏感度。下文緊接著示出了快速標(biāo)記的聚糖的結(jié)構(gòu)描述。值得注意的是，快速標(biāo)記的聚糖具有一個(gè)非常獨(dú)特的鍵部分，其不同于來(lái)自還原胺化反應(yīng)的仲胺鍵?？焖贅?biāo)記的n-聚糖將包含中性(非酸性)的脲鍵。這種結(jié)構(gòu)可影響快速標(biāo)記的聚糖的物理化學(xué)特性和/或性質(zhì)，包括它們的色譜保留及其熒光性質(zhì)和其他物理化學(xué)性質(zhì)諸如等電點(diǎn)(“pi”)、酸性、堿性、疏水性、親水性、螯合金屬的能力、uv吸光度、熒光度、在可見(jiàn)光譜中的吸光度、比色變化、分子大小、與結(jié)合伴侶相互作用的親和力(即生物素酰化殘基與親和素或鏈霉親和素之間，表位與對(duì)位之間)、還原/氧化電位、交聯(lián)傾向、可裂解性(化學(xué)和熱)，以及不同長(zhǎng)度的聚合取代基(即4個(gè)重復(fù)的聚乙二醇(peg)，40個(gè)重復(fù)的peg)。

如本文所用，商標(biāo)glycoworks^tm和rapifluor-ms^tm為其申請(qǐng)者沃特世科技公司(waterstechnologiescorporation)所有。商標(biāo)glycoworks^tm與用于實(shí)驗(yàn)室用途的樣品制備試劑盒結(jié)合使用，所述樣品制備試劑盒包括生物標(biāo)準(zhǔn)品、樣品制備裝置和一次性刀片架以及用于制備色譜和質(zhì)譜樣品的化學(xué)試劑。相似地，商標(biāo)rapifluor-ms^tm與用于制備色譜和質(zhì)譜樣品的化學(xué)試劑結(jié)合使用，也與用于實(shí)驗(yàn)室用途的樣品制備試劑盒結(jié)合使用，所述樣品制備試劑盒包括生物標(biāo)準(zhǔn)品、樣品制備裝置和一次性刀片架。

因此glycoworks^tmrapifluor-ms^tmn-聚糖試劑盒可用于n-聚糖的快速酶促釋放和快速標(biāo)記。這種方案已經(jīng)用單克隆抗體進(jìn)行了驗(yàn)證，并且也已經(jīng)進(jìn)行了大范圍的其他n-連接糖蛋白的測(cè)試。這種樣品制備試劑盒使用優(yōu)化的去糖基化條件和試劑來(lái)進(jìn)行快速釋放。該試劑盒可包括在2014年8月13日提交的美國(guó)公布的專利申請(qǐng)2014/0350263，[0008]-[0022]、[0047]-[0050]、[0053]-[0182]、[0191]、[0228]和[0230]-[0316]中描述的快速標(biāo)記試劑，該專利申請(qǐng)以引用的方式并入本文，并且該試劑盒被設(shè)計(jì)成提供敏感熒光檢測(cè)的同時(shí)對(duì)質(zhì)量檢測(cè)也具有適當(dāng)?shù)男盘?hào)強(qiáng)度的雙重益處。

如本文所述，蛋白質(zhì)的n-糖基化的表征和監(jiān)測(cè)對(duì)于疾病狀態(tài)的檢測(cè)和生物藥物的制備意義重大。糖基化特征譜通常主要通過(guò)分析釋放的聚糖來(lái)評(píng)估，其中常用于制備樣品的技術(shù)眾所周知的非常耗時(shí)，或?qū)е聵悠穼?duì)ms分析不敏感。隨著本文所述的glycoworksrapifluor-msn-聚糖試劑盒的開發(fā)，實(shí)現(xiàn)了聚糖檢測(cè)的前所未有的敏感度，同時(shí)還提高了n-聚糖樣品制備的通量，這些不足之處就都得到了解決。

與通過(guò)這種新的樣品制備方法提供的效率和敏感度增益以及相關(guān)方法同等重要的是，其穩(wěn)健性以及其產(chǎn)生與歷史n-聚糖特征譜分析一致的結(jié)果的能力。此外，生成的聚糖數(shù)據(jù)可用于查詢聚糖數(shù)據(jù)庫(kù)，但首先需要轉(zhuǎn)化成被稱為葡萄糖單元(“gu”)值的標(biāo)準(zhǔn)化值。從而，實(shí)施校準(zhǔn)基準(zhǔn)的另一個(gè)益處就是能夠?qū)F(xiàn)有聚糖數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化成搜索可能的聚糖數(shù)據(jù)庫(kù)的格式。轉(zhuǎn)換的數(shù)據(jù)可用于正在研究未知聚糖組成的樣品的發(fā)現(xiàn)過(guò)程。一旦聚糖被轉(zhuǎn)換成gu值，用戶就能夠查詢?cè)诰€數(shù)據(jù)庫(kù)以深入了解樣品中可能存在的潛在聚糖結(jié)構(gòu)，潛在地減少了進(jìn)行典型表征所需的時(shí)間。在液相色譜中，校準(zhǔn)進(jìn)行的非常頻繁，有時(shí)頻繁到在聚糖混合物每次分離之后都要進(jìn)行一次。

為了檢測(cè)熒光(“flr”)標(biāo)記的聚糖，可將親水相互作用液相色譜(“hilic”)與熒光檢測(cè)聯(lián)用。對(duì)于分離處理和與某些常規(guī)的高效液相色譜(“hplc”)方法相比，在hilic模式下操作的乙烯橋連聚糖色譜柱(后文稱為“beh聚糖色譜柱”或”beh色譜柱”)通過(guò)其分離中性和酸性聚糖兩者的能力可提高峰值分辨率。beh聚糖色譜柱實(shí)現(xiàn)并產(chǎn)生可重現(xiàn)的聚糖分離數(shù)據(jù)，并在更少的時(shí)間內(nèi)優(yōu)化方法。

beh色譜柱利用混合二氧化硅beh、橋連技術(shù)顆粒，所述顆粒用穩(wěn)定的含酰胺的物質(zhì)官能化。beh技術(shù)產(chǎn)生了直徑范圍為1.7至5μm的多種粒度的固定相，為hplc和超高效液相色譜(“uplc”)技術(shù)平臺(tái)搭建了橋梁。beh顆粒提供堿性分析物的峰形和效率、合理的一系列色譜選擇性，以及在流動(dòng)相極限下(特別是在升高的ph下)化學(xué)穩(wěn)定性的改善。這些色譜柱的拆分能力部分是由于具有用于相關(guān)應(yīng)用的最佳酰胺配體濃度的多孔顆粒。該色譜柱可經(jīng)優(yōu)化用于具有熒光(“flr”)檢測(cè)的uplc或hplc系統(tǒng)，用于從各種生物治療劑分離釋放的和標(biāo)記的n-連接聚糖，并實(shí)現(xiàn)中性和帶電荷的標(biāo)記聚糖物質(zhì)二者的基于hilic的分離。

為了充分利用beh聚糖色譜柱，或簡(jiǎn)單地使用聚糖的任何基于hilic的特征譜分析，可使用葡聚糖校準(zhǔn)梯(在下文中有時(shí)稱為“葡聚糖梯”或“葡聚糖梯標(biāo)準(zhǔn)物”)。從hilic/flr系統(tǒng)獲得的聚糖特征譜可針對(duì)葡聚糖梯進(jìn)行校準(zhǔn)，并分配葡萄糖單元(gu)值。例如，一個(gè)已知的此類梯，即2ab標(biāo)記的葡聚糖校準(zhǔn)梯，不同于其他市售產(chǎn)品。該葡萄糖均聚物的平均分子量較高(約4，500道爾頓)，因此“可用”的gu值范圍是其他葡聚糖梯標(biāo)準(zhǔn)物的兩倍，觀察到的gu為2到30。因此，大分子量聚糖的保留時(shí)間分配得到提高。葡聚糖梯的純度和結(jié)構(gòu)完整性可通過(guò)hilic和質(zhì)譜(“ms”)進(jìn)行評(píng)估。

聚糖的洗脫時(shí)間可以參照葡聚糖梯，用葡萄糖單元(“gu”)表示。每個(gè)單獨(dú)的聚糖結(jié)構(gòu)具有與其鍵和組成單糖直接相關(guān)的gu值。由于對(duì)于給定的聚糖，特定鍵中的每個(gè)單糖均以特定的方式貢獻(xiàn)gu值，所以gu值可用于預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)。因此，本文提供的葡聚糖梯可用于校準(zhǔn)lc的運(yùn)行，防止其因不同時(shí)日或不同系統(tǒng)而變化。gu值可通過(guò)將五階多項(xiàng)式分布曲線或三次樣條擬合曲線擬合到葡聚糖梯來(lái)計(jì)算，然后用該曲線根據(jù)保留時(shí)間來(lái)分配gu值。只要柱間的標(biāo)準(zhǔn)偏差小于0.3，n-聚糖的gu值便可具有很高的可重現(xiàn)性。這就允許與在一段時(shí)間內(nèi)從一系列儀器中收集到的數(shù)據(jù)庫(kù)值進(jìn)行直接比較。

有了gu值，就能夠查詢以gu值儲(chǔ)存的聚糖的數(shù)據(jù)庫(kù)，從而有助于闡明聚糖群中存在的潛在聚糖結(jié)構(gòu)。葡聚糖梯也提供經(jīng)質(zhì)量控制的標(biāo)準(zhǔn)物，其可用于校準(zhǔn)在不同實(shí)驗(yàn)室用不同儀器獲得的色譜圖。用hilic-flr儀采集的聚糖保留時(shí)間將因儀器和實(shí)驗(yàn)室而異。通過(guò)將保留時(shí)間轉(zhuǎn)化為gu值，所得的數(shù)據(jù)可用于現(xiàn)場(chǎng)和非現(xiàn)場(chǎng)比較不同地方之間的信息。雖然gu值的使用在此只是作為一個(gè)示例，但其他色譜方法可以從使用通過(guò)本發(fā)明方法制備的葡聚糖校準(zhǔn)物中獲益，所述方法包括但不限于反相色譜法以及反相與hilic的復(fù)合型迭代。

n-聚糖的快速標(biāo)記簡(jiǎn)化了分析用聚糖樣品的制備。但是，要產(chǎn)生適用于用快速加標(biāo)簽試劑快速標(biāo)記的聚糖的葡聚糖梯并不是一項(xiàng)簡(jiǎn)單的任務(wù)。本文提供了用于標(biāo)記還原性聚糖的兩步法，其允許調(diào)節(jié)色譜響應(yīng)和化學(xué)性質(zhì)諸如熒光和ms活性，以及調(diào)節(jié)具有不同檢測(cè)性質(zhì)的多個(gè)標(biāo)簽。每個(gè)步驟在與還原性聚糖連接的性質(zhì)上有所不同。術(shù)語(yǔ)“還原性聚糖”是指還原糖、還原性糖、還原性多糖(雜多糖不同的糖單元，或不同的單糖，或均多糖)，并且包括任何醛封端的糖如殼三糖、殼二糖、半乳糖-β-(1-3)-galnac-聚糖、甘露糖-二-(n-乙?；?d-葡糖胺)和麥芽糖。還原性聚糖或還原糖是能夠充當(dāng)還原劑的任何糖，因?yàn)槠渚哂杏坞x的醛基。因此本文提供的方法可用于任何含醛(有時(shí)也稱為醛基)的化合物(包括o-聚糖)加標(biāo)簽或加雙標(biāo)簽。

如下文緊接著所示，第一步利用還原胺化方法，所述還原胺化方法包括將還原性聚糖(醛封端的糖)與具有伯胺的化合物反應(yīng)，產(chǎn)生諸如乙醇氨基葡聚糖梯、丙基氨基葡聚糖梯的中間化合物，或具有已經(jīng)被轉(zhuǎn)化為仲胺的醛的其他化合物，或被轉(zhuǎn)化成用仲胺封端的還原性聚糖(還原性糖)的步驟。為了產(chǎn)生中間化合物或其醛被轉(zhuǎn)化成仲胺的化合物，可顯示所需特性的伯胺(本文也稱為“具有伯胺的化合物”或胺)包括乙醇胺、丙胺、氨基苯甲酰胺、具有游離氨基末端的肽(如本文實(shí)施例5所示)、n，n-二甲基乙二胺/氨基蒽和氨基生物素。第二步是與可賦予不同性質(zhì)的快速加標(biāo)簽試劑反應(yīng)。換句話講，中間化合物的特性與快速加標(biāo)簽化合物(即快速加標(biāo)簽聚糖)的特性不同。

其中r-nh2為乙醇胺或具有伯胺的類似類型的化合物。

這種方法最初是出于如下需要：用快速加標(biāo)簽試劑(圖2)加標(biāo)簽的n-連接聚糖之間的光學(xué)性質(zhì)與用如下文緊接著所示的前體僅通過(guò)還原胺化加標(biāo)簽的葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)物(本文也稱為還原糖)(圖3)的性質(zhì)相匹配。

據(jù)發(fā)現(xiàn)，這兩類物質(zhì)的熒光性質(zhì)(即激發(fā)峰和發(fā)射峰)是不利地不同的。因此，這種葡聚糖梯不適合作為用于分析液相色譜中快速標(biāo)記的聚糖的校準(zhǔn)物。

本文提供的方法利用快速加標(biāo)簽/胺反應(yīng)性標(biāo)記對(duì)還原性聚糖(或任何醛封端的聚糖)加標(biāo)簽的反應(yīng)途徑，提供通過(guò)n-聚糖的熒光和/或ms活性性質(zhì)對(duì)n-聚糖的檢測(cè)。傳統(tǒng)的對(duì)還原性聚糖加標(biāo)簽涉及使用特定加標(biāo)簽試劑的還原胺化(漫長(zhǎng)的過(guò)程，即反應(yīng)1至4小時(shí)并且可能長(zhǎng)達(dá)8小時(shí)以獲得高產(chǎn)率)。然而，本發(fā)明的方法則利用還原胺化，一旦產(chǎn)生胺中間體，就馬上進(jìn)行第二步驟(快速，約5分鐘)以引入具有熒光/ms活性性質(zhì)的標(biāo)簽(或標(biāo)記)并提供具有如下結(jié)構(gòu)式i的糖分子。如本實(shí)施方案中所提供的，末端單糖殘基顯示為通過(guò)其4-oh位置連接到剩下的糖結(jié)構(gòu)的n-乙酰化葡糖胺(glcnac)。然而末端單糖殘基不一定非得是glcnac；葡聚糖梯可用通過(guò)其6-oh位置與結(jié)構(gòu)連接的葡萄糖單糖封端。另外，末端單糖殘基可通過(guò)4-oh位置連接。葡聚糖梯可用通過(guò)其6-oh位置連接到剩下的糖結(jié)構(gòu)的如下式ii例示的任何葡萄糖單糖進(jìn)行封端。

其中r可為單糖單元或葡萄糖殘基，r1為-ch2ch2oh，r2為在結(jié)構(gòu)中加入flr-ms官能團(tuán)的快速加標(biāo)簽試劑的部分并通過(guò)以下結(jié)構(gòu)例示：

本文提供的方法允許用與其他已經(jīng)用快速加標(biāo)簽試劑標(biāo)記的分子具有相同光學(xué)性質(zhì)和ms性質(zhì)的快速加標(biāo)簽試劑來(lái)對(duì)還原性聚糖加標(biāo)簽。換句話講，用快速加標(biāo)簽試劑的伯胺進(jìn)行還原胺化可產(chǎn)生與用快速加標(biāo)簽試劑(n-連接分子)標(biāo)記的對(duì)此分子具有不同吸光性質(zhì)和發(fā)射性質(zhì)的分子。連接基可不同(胺與尿素)，導(dǎo)致發(fā)色團(tuán)性質(zhì)改變。通過(guò)用具有伯胺的化合物進(jìn)行還原胺化，然后用快速加標(biāo)簽試劑對(duì)所述胺加標(biāo)簽來(lái)保持光學(xué)性質(zhì)。

圖4a示出了用本文所述方法產(chǎn)生的快速標(biāo)記的葡聚糖梯的光學(xué)性質(zhì)，其中所述快速加標(biāo)簽試劑為：

圖4b顯示，葡聚糖梯與用相同快速加標(biāo)簽試劑產(chǎn)生的快速標(biāo)記的聚糖具有基本上相同的熒光性質(zhì)，所述快速標(biāo)記的聚糖例示如下：

本發(fā)明的方法允許通過(guò)改變整體極性來(lái)調(diào)整葡萄糖均聚物(本文稱為“葡聚糖梯”)的相對(duì)保留。例如，通過(guò)用a)乙醇胺或b)丙胺進(jìn)行還原胺化，然后與快速加標(biāo)簽試劑反應(yīng)來(lái)對(duì)葡聚糖梯加標(biāo)簽，會(huì)產(chǎn)生不同的保留特性。因此，可調(diào)整葡聚糖梯的除其他特性以外的色譜保留特性作為校準(zhǔn)基準(zhǔn)。

因此，本發(fā)明的方法可產(chǎn)生與用快速加標(biāo)簽標(biāo)記試劑標(biāo)記的n-聚糖具有高度類似的化學(xué)性質(zhì)的葡聚糖梯。

如實(shí)施例3中列出的所推薦工序中提供的那樣，此類葡萄糖均聚物的一個(gè)實(shí)施方案包括用乙醇胺還原胺化，然后用快速加標(biāo)簽試劑標(biāo)記以產(chǎn)生如下文緊接著所示的快速標(biāo)記的乙醇胺葡聚糖梯(快速標(biāo)記的葡聚糖梯的實(shí)施方案)：

在另一個(gè)實(shí)施方案中，實(shí)施例3所列工序中的乙醇胺可以用丙胺代替。與圖7b所示的相比，當(dāng)用圖7a所示的behamide固定相分離時(shí)，所得的快速標(biāo)記的丙基氨基葡聚糖(如下所示)顯示具有改變的色譜保留。

快速標(biāo)記的丙基氨基葡聚糖，一種快速標(biāo)記的葡聚糖梯

實(shí)施例2

制備快速標(biāo)記的葡聚糖梯

葡聚糖的還原胺化，偶聯(lián)工序

準(zhǔn)確稱量100mg的葡聚糖5000(dextran5000)并置于8ml的小瓶中。然后用吸管向該8ml小瓶中滴入2800μl的dmso，并攪拌直到葡聚糖溶解。然后記錄實(shí)際重量。

向該8ml小瓶中依次加入1200μl的冰乙酸、90.0mg(91.0ml)的重蒸餾乙醇胺(mw＝61.08，d＝1.012)以及128mg的氰基硼氫化鈉。輕輕混合漿液，并在磁力攪拌下在70℃的加熱塊中溫育3小時(shí)。溫育3小時(shí)后，將所得反應(yīng)液從加熱塊中取出，并冷卻至40℃以下。將反應(yīng)內(nèi)容物從8ml小瓶轉(zhuǎn)移至配衡的50ml離心機(jī)中，并添加40ml的acn溶液。測(cè)量并記錄皮重，并將小瓶置于冰箱中30分鐘。然后，在4000prm下離心混合物5分鐘，并潷析上層清液。將所得顆粒重懸在40mlacn溶液中并劇烈渦旋。重復(fù)離心、潷析、重懸步驟，總共清洗三次。不需要靜置30分鐘。將顆粒在氮?dú)饬飨赂稍?0分鐘，然后在室溫下于真空中過(guò)夜。稱量顆粒重量以測(cè)定最終回收量。記錄最終重量、皮重和回收重量。

產(chǎn)生乙醇胺標(biāo)記的葡聚糖梯的快速標(biāo)記工序

該工序旨在以超過(guò)快速加標(biāo)簽試劑100-200倍的摩爾量進(jìn)行快速加標(biāo)簽反應(yīng)。將4.0±0.3mg乙醇胺葡聚糖溶解于500μl的50mmhepes溶液中，ph7.9(用氫氧化鈉滴定游離酸而得)。加入300μl無(wú)水dmf。用此葡聚糖溶液溶解100±0.5mg快速加標(biāo)簽試劑。使反應(yīng)在室溫下進(jìn)行10分鐘。周期性地(每20至30秒一次)攪拌/搖動(dòng)反應(yīng)混合物。在室溫下完成溫育后，用7.6mlacn稀釋反應(yīng)物。最佳做法是剛好在加載到spe柱之前稀釋反應(yīng)液。

hilicspe清理

用6ml水進(jìn)行清洗并用6ml85％的acn溶液進(jìn)行平衡。將acn稀釋的反應(yīng)混合物分成兩(2)份4.5ml體積(近似體積)并加載到柱上。用6ml體積的1∶9∶90甲酸/水/acn清洗三次。用三(3)份4ml體積的未調(diào)節(jié)ph的200mm乙酸銨和5％的acn進(jìn)行洗脫。分配600μl體積并通過(guò)離心式真空蒸發(fā)進(jìn)行干燥。

上述工序可使由乙醇胺葡聚糖中間體制備的標(biāo)記的葡聚糖梯的每批次產(chǎn)量高達(dá)約80個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品。

實(shí)施例3

快速標(biāo)記的乙醇胺葡聚糖(快速標(biāo)記的葡聚糖)的實(shí)驗(yàn)條件和代表性數(shù)據(jù)

1至3批次的快速標(biāo)記的乙醇胺葡聚糖的實(shí)驗(yàn)條件，使用快速標(biāo)記的葡聚糖液相色譜分析如實(shí)施例2中所制備的標(biāo)記的葡聚糖梯的熒光和ms性質(zhì)。用70％hplc級(jí)乙腈(acn)/30％hplc級(jí)水(v/v)沖洗色譜柱。然后用流動(dòng)相條件平衡柱，之后進(jìn)行第一次進(jìn)樣。下表2和表3提供了分析中使用的hilicuplc/flr/ms條件。

表2

表3

質(zhì)譜分析

圖5a、圖5b和圖5c示出了制備的三批次標(biāo)記的(乙醇胺)葡聚糖梯中每批次的熒光色譜圖。圖6a、圖6b和圖6c示出了每批次快速標(biāo)記的葡聚糖梯的對(duì)應(yīng)基峰離子(“bpi”)色譜圖。標(biāo)記的葡萄糖單元(gu)物質(zhì)的質(zhì)量示于表4中。

表4

實(shí)施例4

通過(guò)還原胺化用具有伯胺的化合物調(diào)節(jié)色譜保留

通過(guò)用丙胺替換實(shí)施例2中所列的乙醇胺制備第二快速標(biāo)記的葡聚糖。根據(jù)如下概述的實(shí)驗(yàn)條件，將所得的快速標(biāo)記的丙基氨基葡聚糖的色譜保留與前述快速標(biāo)記的乙醇胺葡聚糖的色譜保留進(jìn)行比較：

用70％hplc級(jí)乙腈(acn)/30％hplc級(jí)水(v/v)沖洗色譜柱。然后用流動(dòng)相條件平衡柱，之后進(jìn)行第一次進(jìn)樣。表5提供了分析中使用的hilicuplc/flr條件。

表5

圖7a和圖7b示出了當(dāng)使用behamide2.1×50mm色譜柱時(shí)，將快速標(biāo)記的丙基氨基葡聚糖與快速標(biāo)記的乙醇胺葡聚糖對(duì)此獲得的熒光色譜圖。

預(yù)示實(shí)施例5

將多種功能引入還原性糖

更廣泛地講，所提出的方法可通過(guò)引入單獨(dú)的標(biāo)記部分(或者在本文中也稱為“標(biāo)簽”或“標(biāo)記”)賦予還原性聚糖和還原糖某些化學(xué)性質(zhì)，一種通過(guò)還原胺化，另一種通過(guò)快速加標(biāo)簽處理。

在本發(fā)明方法的一個(gè)實(shí)施方案中，可通過(guò)鏈霉親和素下拉(pull-down)從樣品基質(zhì)純化被兩次標(biāo)記的n-聚糖，隨后經(jīng)由快速加標(biāo)簽試劑檢測(cè)以賦予熒光和/或增強(qiáng)的電離效率。下文所示的這種“兩次標(biāo)記”的糖可同時(shí)具有生物素標(biāo)記和高度熒光、ms活性標(biāo)記。在如下所示的一個(gè)實(shí)施方案中，可使用氨基生物素分子進(jìn)行還原胺化，被還原胺化的糖可通過(guò)快速加標(biāo)簽反應(yīng)被標(biāo)記。

在一個(gè)實(shí)施方案中，如果將本方法應(yīng)用于用氨基苯甲酰胺還原胺化聚糖并且隨后用快速加標(biāo)簽試劑進(jìn)行標(biāo)記，將可能可使用不止一種熒光團(tuán)/發(fā)色團(tuán)來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)單一糖類物質(zhì)的多波長(zhǎng)檢測(cè)。

本發(fā)明的方法也可允許使用表位標(biāo)簽標(biāo)記糖/聚糖，從而實(shí)現(xiàn)免疫親和富集或基于免疫的檢測(cè)。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，可用血凝素(ha)表位標(biāo)簽(一種序列為ypydvpdya的肽)還原胺化糖，然后用快速加標(biāo)簽試劑標(biāo)記。