本申請根據(jù)35u.s.c.§119，要求2014年12月9日提交的序列號為62/089333的美國臨時申請的優(yōu)先權的權益，本文以該申請為基礎并將其全文通過引用結合于此。

本公開一般涉及用于核酸純化的方法和試劑盒，更具體地，涉及用于純化轉染級別質粒dna的基于磁性顆粒的試劑盒和方法。

背景技術：

核酸純化(如dna或rna的分離)可以是多種生物化學和診斷過程中的重要步驟。質粒dna(pdna)可用于許多應用中，從制備載體用于克隆到產生模板用于轉錄或偶聯(lián)轉錄/翻譯反應。在能夠進行其他加工步驟(如克隆、轉染、測序、擴增、雜交和/或合成等)之前，需要從其中常發(fā)現(xiàn)核酸的復雜混合物(例如組織、細胞、流體等)中分離出核酸。污染物質(例如蛋白質、脂質和/或碳水化合物)的存在可能阻礙或阻止這些過程中的許多過程。例如，在分離期間攜帶的雜質可降低產量和/或防止酶系統(tǒng)合成感興趣的產物。另外，dna還可能污染rna應用，反之亦然。因此，從各種不同的起始物質中有效地分離出核酸以確保所需的最終用途功能可以是重要的。

在一些情況下，所選用于純化核酸的方法影響分離的產物的多種特性，包括核酸樣品的產量、質量和/或純度。雖然已開發(fā)了許多用于核酸純化的方法，但這些方法可能具有一種或多種缺點，包括例如成本高、復雜程度高、速度低、產量低、純度低、污染、毒性和/或低效。先前已經用磁性顆粒在各種純化方法中結合和分離核酸。這些方法可以具有一些優(yōu)勢，如消除了離心和/或真空處理步驟，得到了較高純度的產物和/或提高了操作者的安全性。然而，使用磁性顆粒的方法仍然可能具有各種缺點，例如速度慢、復雜程度高和/或總產量低。

因此，將會有利的是提供可以更快、復雜程度更低、更便宜和/或使產品純度和/或產量提高的，用于核酸純化的基于磁性顆粒的方法和試劑盒。所形成的經純化的核酸可用于各種各樣的生物化學和診斷應用，例如聚合酶鏈反應(pcr)、克隆、轉染、限制性消化和臨床診斷。

技術實現(xiàn)要素：

在各個實施方式中，本公開涉及用于純化核酸的方法，所述方法包括(a)將包含至少一種核酸的樣品與懸浮緩沖液結合以形成懸浮液，(b)將所述懸浮液與裂解緩沖液結合以形成裂解液，(c)將所述裂解液與結合緩沖液結合以形成溶液；(d)將所述溶液與至少一種磁性顆粒結合以形成合并溶液，所述合并溶液包含與至少一種核酸可逆結合的至少一種修飾的磁性顆粒，(e)從所述合并溶液中分離所述至少一種修飾的磁性顆粒，(f)用第一洗滌緩沖液和第二洗滌緩沖液洗滌所述至少一種修飾的磁性顆粒，以及(g)將修飾的磁性顆粒與洗脫緩沖液結合。

根據(jù)各個實施方式，懸浮緩沖液可包含至少一種離子螯合劑，其存在的濃度范圍為約1mm至約10mm；和至少一種緩沖化合物，其存在的濃度范圍為約10mm至約100mm。裂解緩沖液可包含至少一種去垢離液劑，其存在的濃度范圍為，以重量計，約1％至約10％；和至少一種緩沖化合物，其存在的濃度為大于或等于約0.2m。在非限定性的實施方式中，結合緩沖液可包含至少一種離液劑，其存在的濃度范圍為約4m至約6m；任選地，至少一種鹽，其存在的濃度范圍為約0.1m至約2m；至少一種醇，以體積計，其存在的濃度范圍為約1％至約5％和至少一種緩沖化合物，其存在的濃度范圍為，以重量計，約0.25％至約3％。根據(jù)其他實施方式，第一洗滌緩沖液可包含至少一種離液劑，其存在的濃度范圍為約4m至約6m；至少一種離子螯合劑，其存在的濃度范圍為約1mm至約10mm；至少一種緩沖化合物，其存在的濃度范圍為約10mm至約100mm和至少一種醇，其存在的濃度范圍為，以體積計，約30％至約50％。在另外的實施方式中，第二洗滌緩沖液可以包含至少一種醇和任選的至少一種鹽。磁性顆粒可選自，例如，羧基包被的磁性顆粒、基于二氧化硅的磁性顆粒及其組合。本文還公開了一種核酸純化試劑盒，其包含這些緩沖液和磁性顆粒。

在以下的詳述中給出了本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點，對本領域的技術人員而言，其中的部分特征和優(yōu)點根據(jù)所作描述就可以容易地看出，或者通過實施包括以下詳述、權利要求書和附圖在內的本文所述的本發(fā)明而被認識。

應理解，前面的一般性描述和以下的發(fā)明詳述都顯示了本公開的多種實施方式，并旨在提供用于理解權利要求的性質和特性的總體評述或框架。包括的附圖提供了對本公開的進一步的理解，附圖結合于本說明書中并構成說明書的一部分。附圖例示了本公開的各種實施方式，并與說明書一起用來解釋本發(fā)明的原理和操作。

附圖簡要說明

結合以下附圖閱讀，便可以最好地理解下文中的詳述，圖中相同的結構用相同的附圖標記表示，其中：

圖1為示出了根據(jù)本公開的一個實施方式的核酸純化方法的流程圖；

圖2為與現(xiàn)有技術方法相比，示出了根據(jù)本公開的多個實施方式的方法的pdna產量圖；

圖3為與現(xiàn)有技術方法相比，示出了根據(jù)本公開的多個實施方式的方法的轉染效率圖；

圖4示出了使用根據(jù)本公開的多個實施方式的方法和使用現(xiàn)有技術方法純化的pdna(使用或未使用ecori切割)的瓊脂糖凝膠電泳分析；

圖5為與現(xiàn)有技術方法相比，示出了根據(jù)本公開的多個實施方式的方法的pdna產量圖；和

圖6為與現(xiàn)有技術方法相比，示出了根據(jù)本公開的多個實施方式的方法的轉染效率圖。

詳述

方法

本文公開了用于核酸純化的方法，所述方法包括(a)將包含至少一種核酸的樣品與懸浮緩沖液結合以形成懸浮液，(b)將所述懸浮液與裂解緩沖液結合以形成裂解液，(c)將所述裂解液與結合緩沖液結合以形成溶液，(d)將所述溶液與至少一種磁性顆粒結合以形成合并溶液，所述合并溶液包含與至少一種核酸可逆結合的至少一種修飾的磁性顆粒，(e)從所述合并溶液中分離所述至少一種修飾的磁性顆粒，(f)用第一洗滌緩沖液和第二洗滌緩沖液洗滌所述至少一種修飾的磁性顆粒，以及(g)將所述至少一種修飾的磁性顆粒與洗脫緩沖液結合。

參考圖1將對本公開的實施方式進行討論，圖1示出了根據(jù)本公開的非限定性實施方式的核酸純化方法的流程圖。以下總體說明旨在提供權利要求所主張方法的概述，并將參考非限定性實施方式在整個公開中對多個方面進行更具體地討論，這些實施方式在下文所討論的通用方法的上下文中可彼此互換。

如在圖1中所示，在步驟s中，包含至少一種核酸的樣品(例如細菌)105可懸浮在懸浮緩沖液中。然后，在步驟l中可以裂解樣品以生成裂解液，該裂解液包含pdna120和各種污染物110，該污染物110包括不期望的核酸115(例如rna和基因組dna)。裂解液還可與結合/中和緩沖液結合和孵育，并且在步驟c中通過離心分離出附聚物或大分子125進行處理。接著可將磁性顆粒130加入到剩余溶液中。在步驟b中，從樣品(細菌)105中釋放出來的pdna120可以可逆地結合至磁性顆粒130的表面。磁體135可用于吸引磁性顆粒130并且將它們從剩余溶液中分離出來。在步驟w中，通過使用一種或多種洗滌緩沖液洗滌磁性顆粒130，可除去未結合的污染物110。接著，在步驟e中，使用洗脫緩沖液可從磁性顆粒中洗脫并分開pdna120。在步驟p中，例如使用磁體，可從溶液中除去磁性顆粒130以生成經純化的pdna產物，其接著可用于各種應用。

本文所用術語“包含至少一種核酸的樣品”及其變化形式旨在表示從生物或環(huán)境樣品中獲得的任何材料(如試樣或培養(yǎng)物)，其可以含有至少一種核酸，例如dna分子、rna分子或dna/rna雜交分子。所述至少一種核酸可包括，例如，基因組dna、染色體dna(cdna)、質粒dna(pdna)、總rna、信使rna(mrna)、核糖體rna(rrna)、轉運rna(trna)和/或rna/dna雜交體。生物樣品可包括人和動物樣品，例如細胞、組織和體液，所述體液如尿、全血和源自血液的流體(如血清和血漿)。舉例來說，環(huán)境樣品可包括植物組織(例如瓊脂糖)和細菌樣品。在各個實施方式中，樣品可包括細菌培養(yǎng)物。例如，細菌培養(yǎng)物可在o.d.600濃度大致等于1(8x10⁸細胞/ml)下過夜制備。根據(jù)另外的實施方式，待純化的所述至少一種核酸可為dna，例如，pdna。

包含所述至少一種核酸的樣品可結合于(例如懸浮于)懸浮緩沖液(s1)中(參見圖1中的步驟s)。在各個實施方式中，懸浮緩沖液s1可包含至少一種離子螯合劑(ic1)和至少一種緩沖化合物(b1)。懸浮緩沖液s1還可包含rna酶，其濃度在約10μg/ml至約1,000μg/ml的范圍內，如約50μg/ml至約500μg/ml，或約100μg/ml至約250μg/ml，包括其間所有范圍和子范圍。在某些實施方式中，可將rna酶先加入到懸浮緩沖液s1中再與樣品結合。

所述至少一種離子螯合劑ic1可以一定的濃度范圍存在于懸浮緩沖液s1中，例如約1mm至約10mm，如約2mm至約9mm、約3mm至約8mm、約4mm至約7mm或約5mm至約6mm，包括其間所有范圍和子范圍。例如，ic1濃度可為約1mm、1.5mm、2mm、2.5mm、3mm、3.5mm、4mm、4.5mm、5mm、5.5mm、6mm、6.5mm、7mm、7.5mm、8mm、8.5mm、9mm、9.5mm或10mm，包括其間所有范圍和子范圍。根據(jù)各個實施方式，所述至少一種離子螯合劑ic1可選自：乙二胺四乙酸(edta)及其異構體，例如乙二胺-n,n’-二琥珀酸(edds)；環(huán)己烷-1,2-二胺四乙酸(cdta)；亞氨基二琥珀酸(ids)；聚天冬氨酸(pasa)；甲基甘氨酸二乙酸(mgda)；l-谷氨酸n,n-二乙酸,四鈉鹽(glda)及其組合。在某些非限定性的實施方式中，所述至少一種離子螯合劑ic1可選自edta及其異構體。在各個實施方式中，所述至少一種離子螯合劑ic1還可用作蛋白酶抑制劑。

所述至少一種緩沖化合物b1可以一定的濃度存在于懸浮緩沖液s1中，所述濃度例如在約10mm至約100mm的范圍內，如約20mm至約90mm、約30mm至約80mm、約40mm至約70mm或約50mm至約60mm，包括其間所有范圍和子范圍。例如，b1濃度可為約10mm、15mm、20mm、25mm、30mm、35mm、40mm、45mm、50mm、55mm、60mm、65mm、70mm、75mm、80mm、85mm、90mm、95mm或100mm，包括其間所有范圍和子范圍。根據(jù)各個實施方式，所述至少一種緩沖化合物b1可選自tris、tris-hcl、3-(n-嗎啉代)丙磺酸(mops)、4-(2-羥基乙基)-1-哌嗪乙磺酸(hepes)、2-(n-嗎啉代)乙磺酸(mes)，及其組合。在某些非限定性的實施方式中，所述至少一種緩沖化合物b1可選自tris(三羥甲基氨基甲烷)和tris-hcl。

在各個實施方式中，所述至少一種緩沖化合物b1在約25℃下的pka可以在約7至約9的范圍內，例如約7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9或9，包括其間所有范圍和子范圍。所述至少一種緩沖化合物b1可包括在懸浮緩沖液s1中，其量足以將ph調節(jié)到約7至約10范圍內的值，如約7.5至約9.5、約8.5至約9、約8至約8.3，包括其間所有范圍和子范圍。例如，s1的ph可以等于約7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10，包括其間所有范圍和子范圍。

懸浮后，可加入裂解緩沖液s2以形成來自懸浮樣品的裂解液(參見例如圖1中的步驟l)。在各個實施方式中，裂解緩沖液s2可包含至少一種去垢離液劑(dc)和至少一種緩沖化合物(b2)。懸浮液和裂解緩沖液s2可以本領域已知的任何方式結合，例如，可將裂解緩沖液s2加入到懸浮液中并且例如通過顛倒進行混合。在某些實施方式中，可以將混合物顛倒多次，如至少五次、至少十次或者更多次。通過顛倒結合可確保最佳的細胞裂解效率和/或最終的核酸產量。另外，懸浮液可任選地在裂解緩沖液s2中孵育足以裂解樣品的一段時間。該時間段可在例如約30秒至約10分鐘的范圍內，例如約1分鐘至約8分鐘、約2分鐘至約5分鐘、或約3分鐘至約4分鐘，包括其間所有范圍和子范圍。

所述至少一種去垢離液劑dc可以一定濃度存在于裂解緩沖液s2中，所述濃度例如以重量計在約1％至約10％的范圍內，如約2％至約9％、約3％至約8％、約4％至約7％或約5％至約6％，包括其間所有范圍和子范圍。例如，dc濃度以重量計可為約1％、1.25％、1.5％、1.75％、2％、2.25％、2.5％、2.75％、3％、3.25％、3.5％、3.75％、4％、4.25％、4.5％、4.75％、5％、5.25％、5.5％、5.75％、6％、6.25％、6.5％、6.75％、7％、7.25％、7.5％、7.75％、8％、8.25％、8.5％、8.75％、9％、9.25％、9.5％、9.75％或10％，包括其間所有范圍和子范圍。根據(jù)各個實施方式，所述至少一種去垢離液劑dc可選自陽離子、陰離子、非離子和兩性離子去垢劑或表面活性劑，如十二烷基硫酸鈉(sds)、十二烷基苯磺酸鈉(sdbs)、月桂基硫酸銨(als)、十二烷基硫酸鉀(pds)、肉豆蔻醇聚醚硫酸鈉、辛基酚乙氧基化物(例如triton^tmx-100或x-114)、聚氧乙烯山梨聚糖單月桂酸酯(例如20、40或80)及其組合。在某些非限定性的實施方式中，所述至少一種去垢離液劑dc可選自sds和sdbs。在各個實施方式中，所述至少一種去垢離液劑dc可用于破壞細胞膜和/或使樣品中的脂質和/或蛋白質變性。

所述至少一種緩沖化合物b2可以大于或等于0.2m的濃度存在于裂解緩沖液s2中，所述濃度例如大于或等于約0.25m、0.3m、0.35m、0.4m、0.45m、0.5m、0.55m、0.6m、0.65m、0.7m、0.75m、0.8m、0.85m、0.9m、0.95m、1m或更高，包括其間所有范圍和子范圍。根據(jù)各個實施方式，所述至少一種緩沖化合物b2可選自氫氧化物，例如氫氧化鈉(naoh)、氫氧化鋰(lioh)、氫氧化鉀(koh)、氫氧化銣(rboh)、氫氧化銫(csoh)及其組合。在某些非限定性的實施方式中，所述至少一種緩沖化合物b2可為naoh。

在各個實施方式中，所述至少一種緩沖化合物b2在約25℃下的pkb可以在約0.1至約2的范圍內，例如約0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9或2，包括其間所有范圍和子范圍。所述至少一種緩沖化合物b2可包括在懸浮緩沖液s2中，其量足以將ph調節(jié)到約10至約13范圍內的值，如約10.5至約12.5或約11至約12，包括其間所有范圍和子范圍。例如，s2的ph可等于約10、10.1、10.2、10.3、10.4、10.5、10.6、10.7、10.8、10.9、11、11.1、11.2、11.3、11.4、11.5、11.6、11.7、11.8、11.9、12、12.1、12.2、12.3、12.4、12.5、12.6、12.7、12.8、12.9或13，包括其間所有范圍和子范圍。

裂解后，可向裂解液中加入結合(或中和)緩沖液(s3)以形成溶液。結合緩沖液s3可包含至少一種離液劑(c1)、至少一種醇(a1)、任選至少一種鹽(z1)和至少一種緩沖化合物(b3)。裂解液和結合緩沖液s3可以本領域已知的任何方式結合，例如，可將裂解緩沖液s3加入到裂解液中并例如通過顛倒進行混合。在某些實施方式中，可以將混合物顛倒多次，如至少五次、至少十次或者更多次。任選地，裂解液可在結合緩沖液s3中孵育一段時間，所述一段時間足以中和樣品和/或促進不需要的污染物的聚集形成(其可表現(xiàn)為云狀顆粒)。該時間段可在例如約1分鐘至約30分鐘的范圍內，如約2分鐘至約25分鐘、約3分鐘至約20分鐘、約4分鐘至約15分鐘或約5分鐘至約10分鐘，包括其間所有范圍和子范圍。

所述至少一種離液劑c1可以一定的濃度存在于結合緩沖液s3中，所述濃度例如在約4m至約6m的范圍內，如約4.2m至約5.8m、約4.4m至約5.6m、約4.6m至約5.4m或約4.8m至約5.2m，包括其間所有范圍和子范圍。例如，c1濃度可為約4m、4.1m、4.2m、4.3m、4.4m、4.5m、4.6m、4.7m、4.8m、4.9m、5m、5.1m、5.2m、5.3m、5.4m、5.5m、5.6m、5.7m、5.8m、5.9m或6m，包括其間所有范圍和子范圍。根據(jù)各個實施方式，所述至少一種離液劑c1可選自鹽酸胍(guhcl)、硫氰酸胍(guscn)、脲及其組合。在某些非限定性的實施方式中，所述至少一種離液劑c1可選自guhcl和guscn。在各個實施方式中，所述至少一種離液劑d1可用于破壞細胞膜和/或使樣品中的脂質和/或蛋白質變性。

所述至少一種醇a1可以一定濃度存在于結合緩沖液s3中，所述濃度以體積計，在例如約1％至約5％的范圍內，如以體積計約2％至約4％或約2.5％至約3％，包括其間所有范圍和子范圍。例如，a1濃度以體積計可為約1％、1.5％、2％、3％、3.5％、4％、4.5％或5％，包括其間所有范圍和子范圍。根據(jù)各個實施方式，所述至少一種醇a1可選自異丙醇、乙醇、甲醇、丁醇及其組合。在某些非限定性的實施方式中，所述至少一種醇a1可為異丙醇。在各個實施方式中，所述至少一種醇a1可以是離液的，并且可以用于破壞細胞膜和/或使樣品中的蛋白質變性。

如果存在所述至少一種鹽z1，則其可以一定的濃度存在于結合緩沖液s3中，所述濃度例如在約0.2m至約2m的范圍內，如約0.4m至約1.8m、約0.6m至約1.6m、約0.8m至約1.4m或約1m至約1.2m，包括其間所有范圍和子范圍。例如，z1濃度可為約0.2m、0.3m、0.4m、0.5m、0.6m、0.7m、0.8m、0.9m、1m、1.1m、1.2m、1.3m、1.4m、1.5m、1.6m、1.7m、1.8m、1.9m或2m，包括其間所有范圍和子范圍。根據(jù)各個實施方式，所述至少一種鹽z1可選自硫酸銨((nh4)2so4)、乙酸銨(nh4ac)、乙酸鋰(liac)、乙酸鉀(kac)、乙酸鈉(naac)、氯化鈉(nacl)及其組合。在某些非限定性的實施方式中，所述至少一種鹽z1可為硫酸銨。在各個實施方式中，可包括所述至少一種鹽z1以改進核酸純化，或者，在其它實施方式中，可排除所述至少一種鹽z1，但這樣會產生較低的產量。結合緩沖液s3中的鹽濃度的升高能夠例如促進核酸與磁性顆粒的結合和/或不需要的污染物聚集體的沉淀。

所述至少一種緩沖化合物b3可以一定濃度存在于結合緩沖液s3中，所述濃度以重量計在約0.25％至約3％的范圍內，如約0.5％至約2.5％或如約1％至約1.5％，包括其間所有范圍和子范圍。例如，b3濃度以重量計可為約0.25％、0.5％、0.75％、1％、1.25％、1.5％、1.75％、2％、2.25％、2.5％、2.75％或3％，包括其間所有范圍和子范圍。根據(jù)各個實施方式，所述至少一種緩沖化合物b3可選自冰乙酸、鹽酸及其組合。

在各個實施方式中，所述至少一種緩沖化合物b3在約25℃下的pka可在約4至約7的范圍內，例如約4、4.25、4.5、4.75、5、5.25、5.5、5.75、6、6.25、6.5、6.75或7，包括其間所有范圍和子范圍。所述至少一種緩沖化合物b3可包括在懸浮緩沖液s3中，其量足以將ph調節(jié)到約4至約9范圍內的值，如約5至約8或約6至約7，包括其間所有范圍和子范圍。例如，s3的ph可等于約4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9或9，包括其間所有范圍和子范圍。

根據(jù)各個實施方式，通過例如加入裂解緩沖液s2所產生的堿性條件(例如ph>10)可用于使樣品中存在的pdna和基因組dna變性。隨后的用結合緩沖液s3中和可有助于所公開的方法的總效率，尤其是對于以各種方式純化pdna來說。例如，中和可造成基因組dna以鏈內的方式形成堿基對，從而形成可從溶液中沉淀出來的不溶性聚集體。通過對比，認為圓形pdna的共價閉合性質可促進鏈間重雜化，因而使pdna保持在溶液中。另外，當結合緩沖液s3包含至少一種鹽z1(例如鉀鹽、鈉鹽或鋰鹽)時，這些鹽可與溶液中的一種或多種組分反應形成另外的沉淀物。例如，sds的鉀鹽是不溶性的。因此，蛋白質和去垢劑的沉淀和聚集均可有助于截留高分子量基因組dna。然后，通過例如離心或其它已知方法(例如過濾)可將這些聚集體和任意大分子從溶液中除去(參見，例如圖1中的步驟c)，這在下文中會進行更詳細的討論。

加入結合緩沖液后，可將溶液與至少一種磁性顆粒結合以生成合并溶液(參見例如圖1中的步驟b)。如在本文中所使用的，術語“磁性顆?！奔捌渥兓问街荚诒硎揪哂写判?例如順磁性或超順磁性)核，且該磁性核被至少一種材料包被的顆粒，所述顆粒具有可與核酸可逆性結合的表面。合適的磁性顆?？砂?，例如，羧基包被的順磁性顆粒、基于二氧化硅的順磁性顆粒等。在一些實施方式中，基于二氧化硅的磁性顆?？砂ㄓ霉栀|氧化物包被的順磁性核，從而提供了可與核酸結合的含水硅質氧化物吸附性表面(例如，包含硅烷醇基團的表面)。在另外的實施方式中，可對磁性顆粒進行表面修飾以生成官能化的表面，舉例來說，例如帶弱或強正電荷的表面、帶弱或強負電荷的表面或疏水表面。

可商購的磁性顆粒的非限定性實例包括磁量生技有限公司(magquco.ltd)的q珠(qbeads)、格雷斯公司(w.r.grace&co.)的格雷斯珠(gracebeads)等。磁性顆?？删哂羞m于結合核酸的任何尺寸，包括可商購的尺寸，如直徑在約0.3μm至約10μm范圍內，例如直徑為約0.3、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10μm，包括其間所有范圍和子范圍。例如，q珠的平均直徑可在約4μm至約5μm的范圍內，格雷斯珠的平均直徑可在約5μm至約10μm的范圍內。

在一些實施方式中，可將磁性顆粒加入溶液中作為至少一種介質中的懸浮液。所述介質可選自例如水和/或離液劑。在某些實施方式中，磁性顆?？蔀閼腋≡谒械膓珠或者懸浮在離液劑(例如guscn)中的格雷斯珠。懸浮液中珠的濃度可根據(jù)需要變化并且可在例如約10μg/ml至約100μg/ml的范圍內，如約20μg/ml至約90μg/ml、約30μg/ml至約80μg/ml、約40μg/ml至約70μg/ml或約50μg/ml至約60μg/ml，包括其間所有范圍和子范圍。如果使用離液劑，則懸浮液中離液劑的濃度也可根據(jù)需要變化并且可以在例如約1m至約8m的范圍內，如約2m至約6m或約4m至約5m，包括其間所有范圍和子范圍。包含磁性珠的溶液的ph可在例如約4至約9的范圍內，如約5至約8或者約6至約7，包括其間所有范圍和子范圍。

不希望囿于理論，認為由結合緩沖液s3導入的相對高濃度的離液劑和/或鹽可增強核酸(如pdna)可逆(例如非共價)結合至磁性顆粒表面(如二氧化硅表面)的能力。然后，可將由此而修飾的磁性顆粒，例如包含可逆結合的核酸的磁性顆粒與未結合的污染物相分離。例如，可將磁體放置于接近修飾的磁性顆粒的位置并用于使顆粒聚攏，例如形成聚集體或丸。在某些實施方式中，可將含有包含修飾的磁性顆粒的合并溶液的容器(如管)置于磁力架上，所述磁力架能夠收集并稍微固定顆粒，同時移除剩余溶液。

在核酸與磁性顆粒結合后，以及在使用例如磁體分離經修飾的磁性顆粒后，接著可用一種或多種洗滌緩沖液結合、清洗或洗滌顆粒(參見例如圖1中的步驟w)。第一洗滌緩沖液(w1)可包含例如至少一種離液劑(c2)、至少一種離子螯合劑(ic2)、至少一種醇(a2)和至少一種緩沖化合物(b4)。

所述至少一種離液劑c2可以一定的濃度存在于第一洗滌緩沖液w1中，所述濃度例如在約4m至約6m的范圍內，如約4.2m至約5.8m、約4.4m至約5.6m、約4.6m至約5.4m或約4.8m至約5m，包括其間所有范圍和子范圍。例如，c2濃度可為約4m、4.1m、4.2m、4.3m、4.4m、4.5m、4.6m、4.7m、4.8m、4.9m、5m、5.1m、5.2m、5.3m、5.4m、5.5m、5.6m、5.7m、5.8m、5.9m或6m，包括其間所有范圍和子范圍。根據(jù)各個實施方式，所述至少一種離液劑c2可選自鹽酸胍(guhcl)、硫氰酸胍(guscn)、脲及其組合。在某些非限定性的實施方式中，所述至少一種離液劑c2可選自guhcl和guscn。在各個實施方式中，所述至少一種離液劑c2可用于促進核酸結合至磁性顆粒表面。

所述至少一種離子螯合劑ic2可以一定的濃度存在于第一洗滌緩沖液w1中，所述濃度例如在約1mm至約10mm的范圍內，如約2mm至約9mm、約3mm至約8mm、約4mm至約7mm或約5mm至約6mm，包括其間所用范圍和子范圍。例如，ic2濃度可為約1mm、1.5mm、2mm、2.5mm、3mm、3.5mm、4mm、4.5mm、5mm、5.5mm、6mm、6.5mm、7mm、7.5mm、8mm、8.5mm、9mm、9.5mm或10mm，包括其間所有范圍和子范圍。根據(jù)各個實施方式，所述至少一種離子螯合劑ic2可選自：乙二胺四乙酸(edta)及其異構體，例如乙二胺-n,n’-二琥珀酸(edds)；環(huán)己烷-1,2-二胺四乙酸(cdta)；亞氨基二琥珀酸(ids)；聚天冬氨酸(pasa)；甲基甘氨酸二乙酸(mgda)；l-谷氨酸n,n-二乙酸,四鈉鹽(glda)及其組合。在某些非限定性的實施方式中，所述至少一種離子螯合劑ic2可選自edta及其異構體。在各個實施方式中，所述至少一種離子螯合劑ic2可以用于減少氧化損傷和/或污染核酸酶活性和/或螯合金屬離子(如鎂)。

所述至少一種醇a2可以一定濃度存在于第一洗滌緩沖液w1中，所述濃度例如以體積計在約30％至約50％的范圍內，如以體積計約35％至約45％，包括其間所有范圍和子范圍。例如，a2濃度可為約30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％或50％，包括其間所有范圍和子范圍。根據(jù)各個實施方式，所述至少一種醇a2可選自異丙醇、乙醇、甲醇、丁醇及其組合。在某些非限定性的實施方式中，所述至少一種醇a2可為異丙醇。

所述至少一種緩沖化合物b4可以一定的濃度存在于第一洗滌緩沖液w1中，所述濃度例如在約10mm至約100mm的范圍內，如約20mm至約90mm、約30mm至約80mm、約40mm至約70mm或約50mm至約60mm，包括其間所有范圍和子范圍。例如，b4濃度可為約10mm、15mm、20mm、25mm、30mm、35mm、40mm、45mm、50mm、55mm、60mm、65mm、70mm、75mm、80mm、85mm、90mm、95mm或100mm，包括其間所有范圍和子范圍。根據(jù)各個實施方式，所述至少一種緩沖化合物b4可選自tris、tris-hcl、3-(n-嗎啉代)丙磺酸(mops)、4-(2-羥基乙基)-1-哌嗪乙磺酸(hepes)、2-(n-嗎啉代)乙磺酸(mes)，及其組合。在某些非限定性的實施方式中，所述至少一種緩沖化合物b4可選自tris和tris-hcl。

在各個實施方式中，所述至少一種緩沖化合物b4在約25℃下的pka可以在約7至約9的范圍內，例如約7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9或9，包括其間所有范圍和子范圍。所述至少一種緩沖化合物b4可包括在第一洗滌緩沖液w1中，其量足以將ph調節(jié)到約6至約8范圍內的值，如約6.5至約7.5或約6.8至約7.2，包括其間所有范圍和子范圍。例如，w1的ph可等于約6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或8，包括其間所有范圍和子范圍。

還可用第二洗滌緩沖液(w2)結合、清洗或洗滌經修飾的磁性顆粒，所述第二洗滌緩沖液(w2)可以包含至少一種醇(a3)和任選的至少一種鹽(z2)。所述至少一種醇a3可以一定濃度存在于第二洗滌緩沖液w2中，所述濃度以體積計，在例如約70％至約100％的范圍內，如以體積計約75％至約95％或約80％至約90％，包括其間所有范圍和子范圍。例如，a3濃度可為約70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％，包括其間所有范圍和子范圍。根據(jù)各個實施方式，所述至少一種醇a3可選自異丙醇、乙醇、甲醇、丁醇及其組合。在某些非限定性的實施方式中，所述至少一種醇a3可為乙醇。

如果存在所述至少一種鹽z2，則其可以一定的濃度存在于第二洗滌緩沖液w2中，所述濃度例如在約10mm至約100mm的范圍內，如約20mm至約90mm、約30mm至約80mm、約40mm至約70mm或約50mm至約60mm，包括其間所有范圍和子范圍。例如，z2濃度可為約10mm、15mm、20mm、25mm、30mm、35mm、40mm、45mm、50mm、55mm、60mm、65mm、70mm、75mm、80mm、85mm、90mm、95mm或100mm，包括其間所有范圍和子范圍。根據(jù)各個實施方式，所述至少一種鹽z2可選自硫酸銨((nh4)2so4)、乙酸銨(nh4ac)、乙酸鋰(liac)、乙酸鉀(kac)、乙酸鈉(naac)、氯化鈉(nacl)及其組合。在某些非限定性的實施方式中，所述至少一種鹽z2可選自naac和nh4ac。

根據(jù)各個實施方式，第二洗滌緩沖液w2的ph可在例如約6至約8的范圍內，如約6.2至約7.5、約6.5至約7或約6.4至約6.8，包括其間所有范圍和子范圍。第二洗滌緩沖液w2的ph可通過改變醇和/或鹽的量調節(jié)，或者可使用如本文公開的一種或多種緩沖化合物(如冰乙酸或naoh)調節(jié)。

加入和移除洗滌緩沖液w1和w2后，可提供表面上可逆結合有核酸的修飾的磁性顆粒，其可不含或基本不含污染物(如細胞碎片、脂質、蛋白質和/或不需要的核酸)。根據(jù)各個實施方式，接著可將由此形成的經修飾的磁性顆粒與洗脫緩沖液(e1)結合以釋放結合的核酸并且將結合的核酸與磁性顆粒分離(參見例如圖1中的步驟e)。經修飾的磁性顆?？稍谙疵摼彌_液e1中孵育足以釋放核酸的一段時間，如約30秒至約10分鐘，例如，約45秒至約9分鐘、約1分鐘至約8分鐘、約2分鐘至約7分鐘、約3分鐘至約6分鐘或約4分鐘至約5分鐘，包括其間所有范圍和子范圍。

洗脫緩沖液e1可包含例如水或相對低的鹽溶液，所述相對低的鹽溶液包含例如至少一種緩沖化合物(如tris等)、至少一種鹽和/或至少一種離子螯合劑(如edta等)。在某些實施方式中，洗脫緩沖液e1可包含約10mm至約100mm的至少一種緩沖化合物和約0.1mm至約10mm的至少一種離子螯合劑。根據(jù)一個非限定性的實施方式，洗脫緩沖液e1可包含10mmtris和1mmedta。

隨后，可從溶液中除去(不再與核酸結合的)磁性顆粒，例如使用磁體分離，從而生成作為終產物的溶液中的純化的核酸(參見例如圖1中的步驟p)。例如，本文公開的方法和試劑盒可用于提供純化的pdna產物。根據(jù)各個實施方式，本文公開的方法和試劑盒可用于在短時間內有效地生產轉染級別的pdna。例如，在非限定性的實施方式中，本文公開的方法可在小于約30分鐘的時間段內進行，如在小于約20分鐘的時間段內進行。在某些實施方式中，本文公開的方法可在約20分鐘內從1ml過夜細菌培養(yǎng)物(o.d.600≈1)中產生平均10μg的pdna。

應理解，在一些實施方式中，各種緩沖溶液的組分可互換使用，例如可以是彼此相同的或不同的。例如，離液劑c1和c2可以是相同的或不同的。類似地，離子螯合劑ic1和ic2；鹽z1和z2；醇a1、a2和a3；以及緩沖液b1、b2、b3和b4；分別可以是相同的或不同的。類似地，這些組分的濃度可以變化，且在一些情況下，取決于所需應用，這些組分的濃度可以是相同的或相似的。

還應理解，本文公開的方法還可包括本領域已知的額外步驟，如離心、過濾等。作為非限定性的實例，在加入結合緩沖液s3后，可對形成的溶液進行離心或過濾以除去不需要的聚集體或大分子。根據(jù)各個實施方式，還可任選地對樣品和/或磁性顆粒進行離心。在這樣的情況下，離心可在以下范圍內的加速度下進行：約10,000g至約18,000g，如約12,000g至約16,000g或約14,000g至約5,000g，包括其間所有范圍和子范圍。在各個實施方式中，離心可進行的時間段在約30秒至約15分鐘的范圍內，例如，約1分鐘至約14分鐘、約2分鐘至約13分鐘、約3分鐘至約12分鐘、約4分鐘至約11分鐘、約5分鐘至約10分鐘、約6分鐘至約9分鐘或約7分鐘至約8分鐘，包括其間所有范圍和子范圍。

在其他非限定性的實施方式中，本文公開的方法不包括任何離心步驟，這可以增強使過程自動化的能力。其它任選的步驟可包括空氣干燥，例如，在用洗滌緩沖液w1和w2清洗經修飾的磁性顆粒后，可以將顆粒干燥一段時間，所述一段時間在約1分鐘至約10分鐘的范圍內，如約2分鐘至約9分鐘、約3分鐘至約8分鐘、約4分鐘至約7分鐘或約5分鐘至約6分鐘，包括其間所有范圍和子范圍。按照所需或所必要的，在本文公開的方法期間還可將各種樣品、溶液或者樣品或溶液的部分移除到和/或轉移到新的容器(如管)中。

試劑盒

本公開還涉及用于核酸純化的試劑盒，所述試劑盒包括懸浮緩沖液、裂解緩沖液、結合/中和緩沖液、至少一種磁性顆粒、第一洗滌緩沖液、第二洗滌緩沖液和任選的洗脫緩沖液。在各個實施方式中，參照純化方法，緩沖液可對應于上文公開的緩沖液s1、s2、s3、b1、w1、w2和e1。應理解，上文討論的關于每種緩沖液的各個實施方式可以任何方法結合并且不限于形成本文公開的試劑盒。

根據(jù)各個實施方式，在試劑盒中可以用于即用的各組分的預定濃度提供各緩沖液?；蛘?，可提供一種或多種濃縮溶液，其由終端用戶用合適類型及合適量的溶劑稀釋成即用的緩沖液。例如，在某些實施方式中，可提供濃縮的洗滌緩沖液w2，其可由用戶用醇(如乙醇)稀釋至70％或更高的終濃度，以乙醇的體積計。

在一些實施方式中，試劑盒還可包括針對終端用戶的關于純化實驗方案和/或任何稀釋說明的說明書。根據(jù)其它實施方式，試劑盒還可包含各種另外的組分或設備，如磁力架、管、離心機、用于細菌培養(yǎng)的培養(yǎng)基和/或抗生素、溶劑和/或rna酶。

應理解，各個公開的實施方式可以涉及與特定實施方式一起描述的特定特征、元素或步驟。還應理解，雖然以涉及某一特定實施方式的形式描述，但特定特征、元素或步驟可以多種未說明的組合或排列方式與替代性的實施方式互換或組合。

還應理解的是，本文所用術語“該”、“一個”或“一種”表示“至少一個(一種)”，并且不應局限為“僅一個(一種)”，除非明確有相反的說明。因此，例如，提到的“一種緩沖液”包括具有兩種或更多種這類“緩沖液”的實例，除非文中另行明確指明。

本文中，范圍可以表示為從“約”一個具體值開始和/或至“約”另一個具體值終止。當表述這種范圍時，實例包括自某一具體值始和/或至另一具體值止。類似地，當使用先行詞“約”表示數(shù)值為近似值時，應理解，具體數(shù)值構成了另一個方面。還應理解的是，每個范圍的端點值在與另一個端點值相結合以及獨立于另一個端點值的情況下都是有意義的。

與實施例中不同，無論是否說明，本文所用的所有數(shù)值應解釋為包括“約”，除非另有明確指明。然而，還應當理解的是，所述的每個數(shù)值也可以考慮其精確值，無論其是否在該數(shù)值前存在“約”。因此，高于“大于2m的濃度”和“大于約2m的濃度”都包括“大于約2m的濃度”以及“大于2m的濃度”的實施方式。

除非另有表述，否則都不旨在將本文所述的任意方法理解為需要使其步驟以具體順序進行。因此，當方法權利要求實際上沒有陳述為其步驟遵循一定的順序或者其沒有在權利要求書或說明書中以任意其他方式具體表示步驟限于具體的順序，都不旨在暗示該任意特定順序。

雖然會用過渡語“包含”來公開特定實施方式的各種特征、元素或步驟，但是應理解的是，這暗示了包括可采用過渡語“由……構成”或“基本上由……構成”描述在內的替代實施方式。因此，例如，包含a+b+c的緩沖液的暗示替代實施方式包括其中緩沖液由a+b+c組成的實施方式以及其中緩沖液基本上由a+b+c組成的實施方式。

對本領域的技術人員而言，顯而易見的是，可以在不偏離本公開的范圍和精神的情況下對本公開進行各種修改和變動。因為本領域的技術人員可以想到融合了本公開的精神和實質的所公開的實施方式的各種改良組合、子項組合和變化，因此，應認為本公開包括所附權利要求書范圍內的全部內容及其等同內容。

以下的實施例旨在僅為非限制性的和說明性的，本發(fā)明的范圍通過權利要求來限定。

實施例

示例性的純化方案

僅用于討論目的，下文提供了一種用于從細菌培養(yǎng)物中純化pdna的示例性方案。當然，該方案不旨在限制，并且不應被理解為是對所附權利要求的限制。

a)制備細菌培養(yǎng)物樣品：使用合適的培養(yǎng)基和抗生素制備5ml的過夜細菌培養(yǎng)物，o.d.600≈1；

b)制備懸浮緩沖液：向懸浮緩沖液s1中加入rna酶直至終濃度為100μg/ml；

c)懸浮樣品：將1ml的過夜細菌培養(yǎng)物轉移至1.5微量離心管中并通過12,000g離心1分鐘收獲細胞，隨后除去培養(yǎng)介質并使用250μl制備好的s1緩沖液重懸；

d)裂解樣品：向懸浮液中加入250μl的裂解緩沖液s2并通過顛倒最少10次進行混合；

e)準備結合：向細胞裂解液中加入350μl的結合緩沖液s3并通過顛倒最少10次進行混合，或直至可見到云狀顆粒；

f)澄清細胞裂解液：將溶液在12,000g下離心10分鐘并將澄清的裂解液轉移至新的微量離心管中；

g)制備磁性顆粒：使用前在水或離液劑中渦旋磁性顆粒的懸浮液至少1分鐘；

h)結合pdna：向澄清的裂解液中加入50μl磁性顆粒溶液并通過顛倒混合，隨后在室溫下孵育5分鐘；

i)分離結合了pdna的磁性顆粒：使用磁力架，將磁性顆粒與可逆結合的pdna磁性分離1分鐘并除去剩余的裂解液；

j)洗滌結合了pdna的磁性顆粒：對包含可逆結合的pdna的磁性顆粒，使用500μl的洗滌緩沖液w1洗滌一次并使用700μl的洗滌緩沖液w2洗滌一次；

k)除去洗滌緩沖液：除去洗滌緩沖液w1和w2并將具有可逆結合的pdna的磁性顆粒在磁力架上倒置，空氣干燥5分鐘；

l)洗脫pdna：從磁力架上取下管并加入100μl水(或50μl以生成更加濃縮的樣品)并在室溫下孵育1分鐘；

m)純化pdna：將管置于磁力架上1分鐘以除去磁性顆粒并將洗脫的pdna轉移至新的微量離心管中。

對比實施例1

使用上述實驗方案用1000μgq珠或5000μg格雷斯珠從細菌培養(yǎng)物中純化pdna。還使用普洛麥格公司(promega)的wizardmagnesiltfx^tm系統(tǒng)純化相同的細菌培養(yǎng)物。對每種方法的平均總pdna產量進行定量并示于圖2。使用q珠的本發(fā)明方法從1ml細菌培養(yǎng)物樣品(o.d.600≈1)中得到的平均總pdna產量為10.0μg。使用格雷斯珠的本發(fā)明方法的平均pdna產量為9.2μg，而對比的普洛麥格方法產生10.7μgpdna。

然后通過將編碼egfp的質粒pegfp-c1轉染至hela細胞中來確定每種pdna樣品的轉染效率。用4％多聚甲醛對轉染的細胞固定15分鐘，并且用dapi染色以使細胞核可視化。使用合適濾光器獲取gfp和細胞核的熒光圖像，隨后通過首先轉換二色圖像(黑和白)和用于對gfp陽性細胞和總細胞(細胞核)進行計數(shù)的計數(shù)標準，使用imagej進行圖像分析。通過用視野中gfp陽性細胞除以總細胞數(shù)確定轉染效率。每種方法的轉染效率示于圖3，其中誤差條代表至少8張圖像的標準偏差。對于使用q珠、格雷斯珠和普洛麥格試劑盒的方法來說，轉染效率分別為39.0％、39.6％和40.4％。

因此，圖2-3證明了與基準對比性普洛麥格試劑盒相比，在約20分鐘內進行的本發(fā)明方法提供了相當?shù)膒dna產量和質量。

對比實施例2

使用上述實驗方案用含sds或sdbs的裂解緩沖液s2從細菌培養(yǎng)物中純化pdna。還使用普洛麥格公司的wizardmagnesiltfx^tm系統(tǒng)純化相同的細菌培養(yǎng)物。對每種方法的平均總pdna產量進行定量并示于圖4。使用sds在其中的裂解緩沖液s2的本發(fā)明方法從1ml細菌培養(yǎng)物樣品(o.d.600≈1)中得到的平均總pdna產量為7.3μg。使用sdbs在其中的裂解緩沖液s2的本發(fā)明方法的平均pdna產量為9.8μg，而對比的普洛麥格方法產生6.4μgpdna。

進行下游應用(如限制性消化和轉染)以確定每種方法所產生的純化的pdna的質量。對于限制性消化，使用限制性酶ecori對pdna進行線性化。圖5示出了對于三種不同方法，pdna樣品(未切割的a或者用ecori切割的b)的瓊脂糖凝膠電泳分析。如圖5所示，可通過限制性酶ecori消化每種方法所產生的pdna。

然后通過將編碼egfp的質粒pegfp-c1轉染至hela細胞中來確定每種pdna樣品的轉染效率。用4％多聚甲醛對轉染的細胞固定15分鐘，并且用dapi染色以使細胞核可視化。使用合適濾光器獲取gfp和細胞核的熒光圖像，隨后通過首先轉換二色圖像(黑和白)和用于對gfp陽性細胞和總細胞(細胞核)進行計數(shù)的計數(shù)標準，使用imagej進行圖像分析。通過用視野中gfp陽性細胞除以總細胞數(shù)確定轉染效率。每種方法的轉染效率示于圖6，其中誤差條代表至少8張圖像的標準偏差。對于使用sds裂解緩沖液、sdbs裂解緩沖液和普洛麥格試劑盒的方法來說，轉染效率分別為38.0％、45.4％和52.9％。

因此，圖4-6證明了與基準對比性普洛麥格試劑盒相比，在約20分鐘內進行的本發(fā)明方法提供了改善的或相當?shù)膒dna產量和/或質量。