相關申請的交叉引用

本申請要求在35u.s.c.§119下于2014年12月19日提交的美國臨時專利申請?zhí)?2/094,751的優(yōu)先權，其整體通過引用并入本文。

發(fā)明領域

本發(fā)明總體上涉及具有導致感興趣的蛋白質的表達增加的遺傳改變的細菌細胞，以及制造和使用此類細胞的方法。本發(fā)明的方面包括具有遺傳改變的革蘭氏陽性微生物，如芽孢桿菌屬的成員，該遺傳改變延遲、降低、或阻斷用于孢子形成的基因的表達或激活，從而導致感興趣的蛋白質的表達增強。遺傳改變的實例包括降低kina、phra、和/或phre的表達或活性的那些。

序列表的引用

命名為nb40522-wo-pct_sequencelisting.txt的文本文件序列表的電子提交的內容創(chuàng)建于2015年11月30日，并且大小為18kb，通過引用并入本文。

本發(fā)明的背景

遺傳工程已經(jīng)允許改進在食品發(fā)酵中用作工業(yè)生物反應器和細胞工廠的微生物。包括多個芽孢桿菌物種的革蘭氏陽性生物體被用于產生大量有用的蛋白質和代謝產物(參見，例如，zukowski,“productionofcommerciallyvaluableproducts,”in:doiandmcglouglin(eds.)biologyofbacilli:applicationstoindustry,butterworth-heinemann,stoneham.masspages311-337,1992[zukowski，“有商業(yè)價值的產品的生產”，在：doi和mcglouglin(編輯)桿菌生物學：工業(yè)應用，巴特沃思-海涅曼出版公司(butterworth-heinemann)，斯通哈姆，馬薩諸塞州，第311-337頁，1992中])。工業(yè)中使用的常見芽孢桿菌屬物種包括地衣芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌。由于其gras(通常被認為是安全的)狀態(tài)，這些芽孢桿菌屬物種的菌株是用于生產用于食品和制藥工業(yè)的蛋白質的天然候選物。在革蘭氏陽性生物體中產生的蛋白質的實例包括酶，例如α-淀粉酶、中性蛋白酶、和堿性(或絲氨酸)蛋白酶。

盡管對細菌宿主細胞中蛋白質的生產的理解有所進展，但是仍然需要開發(fā)新的表達增加水平的感興趣的蛋白質的重組菌株。

發(fā)明概述

本發(fā)明提供表達增加水平的感興趣的蛋白質的重組革蘭氏陽性細胞及其制備和使用方法。特別地，本發(fā)明涉及具有遺傳改變的細菌細胞，與不具有遺傳改變的細菌細胞相比，所述遺傳改變導致感興趣的蛋白質的表達增加。因此，本發(fā)明的方面包括革蘭氏陽性微生物，如芽孢桿菌屬的成員，這些革蘭氏陽性微生物包含降低用于激活磷酸化途徑的基因的表達的遺傳改變(例如，參見圖5中磷酸化途徑原理圖)并且從而導致感興趣的蛋白質(下文稱為“poi”)的表達增強。還提供了制備和使用這些重組細菌細胞的方法。

本發(fā)明的方面包括用于從革蘭氏陽性細菌細胞增加poi的表達的方法，這些方法包括：(a)獲得產生poi的經(jīng)改變的革蘭氏陽性細菌細胞，其中該經(jīng)改變的革蘭氏陽性細菌細胞包含降低激活磷酸化途徑的一種或多種蛋白質的表達或活性的至少一個遺傳改變，并且(b)在表達poi的條件下培養(yǎng)所述經(jīng)改變的革蘭氏陽性細菌細胞，其中在基本上相同的培養(yǎng)條件下，該poi的增加的表達是相對于未經(jīng)改變的(親本)革蘭氏陽性細菌細胞中相同poi的表達而言的。在某些實施例中，降低激活磷酸化途徑的一種或多種蛋白質的表達或活性的遺傳改變是kina基因、phra基因和/或phre基因的遺傳改變。

在某些其他實施例中，該經(jīng)改變的革蘭氏陽性細胞源自具有一個或多個有缺陷或無活性的孢子形成基因(例如，其表達受spo0a控制或在spo0a下游的基因)的親本細胞，并且因此已防止形成孢子。例如，申請人已經(jīng)觀察到，即使在這種非孢子形成的遺傳背景下，降低激活磷酸化途徑(即，控制孢子形成起始基因表達的基因)的一種或多種蛋白質的表達或活性的另外的遺傳改變增加了poi從細胞中的表達。因此，本披露的遺傳改變的(子代)細胞中蛋白質表達/產生的改進不僅僅是因為防止革蘭氏陽性細胞的孢子形成。例如，本披露的經(jīng)改變的革蘭氏陽性(子代)細胞源自于其的親本革蘭氏陽性細胞可以具有非功能性孢子形成基因、突變孢子形成基因、缺失孢子形成基因等(例如，參見實例部分，其中使用孢子形成缺陷型芽孢桿菌屬細胞)。

在某些實施例中，該經(jīng)改變的革蘭氏陽性細菌細胞是芽孢桿菌屬的成員(例如，芽孢桿菌屬細胞選自下組，該組由以下各項組成：枯草芽孢桿菌(b.subtilis)、地衣芽孢桿菌(b.licheniformis)、遲緩芽孢桿菌(b.lentus)、短芽孢桿菌(b.brevis)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(b.stearothermophilus)、嗜堿芽孢桿菌(b.alkalophilus)、解淀粉芽孢桿菌(b.amyloliquefaciens)、克勞氏芽孢桿菌(b.clausii)、索諾拉沙漠芽孢桿菌(b.sonorensis)、耐鹽芽孢桿菌(b.halodurans)、短小芽孢桿菌(b.pumilus)、燦爛芽孢桿菌(b.lautus)、飼料芽孢桿菌(b.pabuli)、蠟樣芽孢桿菌(b.cereus)、黏瓊脂芽孢桿菌(b.agaradhaerens)、秋葉氏芽孢桿菌(bakibai)、庫拉奇芽孢桿菌(b.clarkii)、假堅強芽孢桿菌(b.pseudofirmus)、列城芽孢桿菌(b.lehensis)、巨大芽孢桿菌(b.megaterium)、凝結芽孢桿菌(b.coagulans)、環(huán)狀芽孢桿菌(b.circulans)、吉氏芽孢桿菌(b.gibsonii)、和蘇云金芽孢桿菌(b.thuringiensis))。在某些實施例中，該芽孢桿菌屬細胞是枯草芽孢桿菌細胞。在某些實施例中，該經(jīng)改變的革蘭氏陽性細菌細胞進一步包含選自下組基因中的突變，該組由以下各項組成：degu、degq、degs、scoc4等。在某些實施例中，突變?yōu)閐egu(hy)32。

在某些實施例中，與在基本上相同的培養(yǎng)條件下生長的對應的未經(jīng)改變的革蘭氏陽性(親本)細菌細胞相比，遺傳改變導致在經(jīng)改變的革蘭氏陽性(子代)細菌細胞中kina、phra、和phre基因中一個或多個的表達水平的降低。因此，該遺傳改變可導致kina、phra、和phre基因中任一個；kina、phra、和phre基因中任兩個；或kina、phra、和phre基因中所有三個的表達水平的降低。在其他實施例中，與在基本上相同的培養(yǎng)條件下生長的對應的未經(jīng)改變的革蘭氏陽性細菌細胞相比，遺傳改變導致在經(jīng)改變的革蘭氏陽性細菌細胞中kina、phra、和phre蛋白中一種或多種的活性的降低。因此，該遺傳改變可導致kina、phra、和phre蛋白中任一種；kina、phra、和phre蛋白中任兩種；或kina、phra、和phre蛋白中所有三種的活性的降低。

在某些實施例中，野生型kina基因的序列與seqidno:1具有至少60％同一性，野生型phra基因的序列與seqidno:6具有至少60％同一性，并且野生型phre基因的序列與seqidno:8具有至少60％同一性。在某些實施例中，野生型kina蛋白的序列與seqidno:2具有至少80％同一性，野生型phra蛋白的序列與seqidno:7具有至少80％同一性，并且野生型phre蛋白的序列與seqidno:9具有至少80％同一性。在某些實施例中，該遺傳改變是kina、phra、和phre基因中的一個或多個的全部或部分的缺失。

在某些實施例中，該poi是同源蛋白質。在某些實施例中，該poi是異源蛋白質。在某些實施例中，該poi是酶。在某些實施例中，該酶選自下組，該組由以下各項組成：蛋白酶、纖維素酶、支鏈淀粉酶、淀粉酶、糖酶、脂肪酶、異構酶、轉移酶、激酶、和磷酸酶。在某些其他實施例中，該酶選自下組，該組由以下各項組成：乙酰酯酶、氨肽酶、淀粉酶、阿拉伯糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維素酶、幾丁質酶、凝乳酶、角質酶、脫氧核糖核酸酶、差向異構酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、α-葡聚糖酶、葡聚糖裂解酶、內切-β-葡聚糖酶、葡糖淀粉酶、葡萄糖氧化酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、葡萄糖醛酸酶、半纖維素酶、己糖氧化酶、水解酶、轉化酶、異構酶、漆酶、脂肪酶、裂解酶、甘露糖苷酶、氧化酶、氧化還原酶、果膠酸裂解酶、果膠乙酰酯酶、果膠解聚酶、果膠甲酯酶、果膠分解酶、過水解酶、多元醇氧化酶、過氧化物酶、酚氧化酶、植酸酶、聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶、鼠李糖-半乳糖醛酸酶、核糖核酸酶、轉移酶、轉運蛋白、轉谷氨酰胺酶、木聚糖酶、己糖氧化酶、及其組合。

在某些其他實施例中，該poi是蛋白酶。在某些實施例中，該蛋白酶是枯草桿菌蛋白酶。在某些其他實施例中，枯草桿菌蛋白酶選自下組，該組由以下各項組成：枯草桿菌蛋白酶168、枯草桿菌蛋白酶bpn'、枯草桿菌蛋白酶carlsberg、枯草桿菌蛋白酶dy、枯草桿菌蛋白酶147，枯草桿菌蛋白酶309、及其變體。

在某些實施例中，該方法進一步包括分離并回收該poi。在又其他實施例中，將該分離并回收的poi進一步純化。

本發(fā)明的方面包括經(jīng)改變的革蘭氏陽性細菌細胞，其中與在基本上相同的培養(yǎng)條件下生長的對應的未經(jīng)改變的革蘭氏陽性細菌細胞相比，所述經(jīng)改變的革蘭氏陽性細菌細胞包含降低激活磷酸化途徑的一種或多種蛋白質的表達或活性的至少一個遺傳改變，該磷酸化途徑誘導孢子形成起始基因的表達。在某些實施例中，該經(jīng)改變的革蘭氏陽性細菌細胞是芽孢桿菌屬的成員。在某些實施例中，該芽孢桿菌屬細胞選自下組，該組由以下各項組成：枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、短芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌、索諾拉沙漠芽孢桿菌、耐鹽芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、飼料芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、黏瓊脂芽孢桿菌、秋葉氏芽孢桿菌、庫拉奇芽孢桿菌、假堅強芽孢桿菌、列城芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、凝結芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、吉氏芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌。在某些其他實施例中，該芽孢桿菌屬細胞是枯草芽孢桿菌細胞。在某些實施例中，該經(jīng)改變的革蘭氏陽性細菌細胞進一步包含選自下組基因中的突變，該組由以下各項組成：degu、degq、degs、scoc4等。在某些實施例中，突變?yōu)閐egu(hy)32。

在某些實施例中，與在基本上相同的培養(yǎng)條件下生長的對應的未經(jīng)改變的革蘭氏陽性細菌細胞相比，遺傳改變導致在經(jīng)改變的革蘭氏陽性細菌細胞中kina、phra、和phre基因中一個或多個的表達水平的降低。因此，該遺傳改變可導致kina、phra、和phre基因中任一個；kina、phra、和phre基因中任兩個；或kina、phra、和phre基因中所有三個的表達水平的降低。在其他實施例中，與在基本上相同的培養(yǎng)條件下生長的對應的未經(jīng)改變的革蘭氏陽性細菌細胞相比，遺傳改變導致在經(jīng)改變的革蘭氏陽性細菌細胞中kina、phra、和phre蛋白中一種或多種的活性的降低。因此，該遺傳改變可導致kina、phra、和phre蛋白中任一種；kina、phra、和phre蛋白中任兩種；或kina、phra、和phre蛋白中所有三種的活性的降低。

在某些實施例中，野生型kina基因的序列與seqidno:1具有至少60％同一性，野生型phra基因的序列與seqidno:6具有至少60％同一性，并且野生型phre基因的序列與seqidno:8具有至少60％同一性。在某些實施例中，野生型kina蛋白的序列與seqidno:2具有至少80％同一性，野生型phra蛋白的序列與seqidno:7具有至少80％同一性，并且野生型phre蛋白的序列與seqidno:9具有至少80％同一性。在某些實施例中，該遺傳改變是kina、phra、和phre基因中的一個或多個的全部或部分的缺失。

在某些實施例中，該經(jīng)改變的細胞表達poi。在某些實施例中，該poi是同源蛋白質。在某些實施例中，該poi是異源蛋白質。在某些實施例中，該poi是酶。

在某些實施例中，該酶選自下組，該組由以下各項組成：蛋白酶、纖維素酶、支鏈淀粉酶、淀粉酶、糖酶、脂肪酶、異構酶、轉移酶、激酶、和磷酸酶。在某些其他實施例中，該酶選自下組，該組由以下各項組成：乙酰酯酶、氨肽酶、淀粉酶、阿拉伯糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維素酶、幾丁質酶、凝乳酶、角質酶、脫氧核糖核酸酶、差向異構酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、α-葡聚糖酶、葡聚糖裂解酶、內切-β-葡聚糖酶、葡糖淀粉酶、葡萄糖氧化酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、葡萄糖醛酸酶、半纖維素酶、己糖氧化酶、水解酶、轉化酶、異構酶、漆酶、脂肪酶、裂解酶、甘露糖苷酶、氧化酶、氧化還原酶、果膠酸裂解酶、果膠乙酰酯酶、果膠解聚酶、果膠甲酯酶、果膠分解酶、過水解酶、多元醇氧化酶、過氧化物酶、酚氧化酶、植酸酶、聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶、鼠李糖-半乳糖醛酸酶、核糖核酸酶、轉移酶、轉運蛋白、轉谷氨酰胺酶、木聚糖酶、己糖氧化酶、及其組合。在其他實施例中，該poi是蛋白酶。在某些實施例中，該蛋白酶是枯草桿菌蛋白酶。在某些實施例中，該枯草桿菌蛋白酶選自下組，該組由以下各項組成：枯草桿菌蛋白酶168、枯草桿菌蛋白酶bpn'、枯草桿菌蛋白酶carlsberg、枯草桿菌蛋白酶dy、枯草桿菌蛋白酶147、枯草桿菌蛋白酶309、及其變體。

在某些實施例中，與在基本上相同的培養(yǎng)條件下生長的對應的未經(jīng)改變的革蘭氏陽性細菌細胞相比，遺傳改變導致在經(jīng)改變的革蘭氏陽性細菌細胞中kina、phra、和phre基因中一個或多個的表達水平的降低。因此，該遺傳改變可導致kina、phra、和phre基因中任一個；kina、phra、和phre基因中任兩個；或kina、phra、和phre基因中所有三個的表達水平的降低。在其他實施例中，與在基本上相同的培養(yǎng)條件下生長的對應的未經(jīng)改變的革蘭氏陽性細菌細胞相比，遺傳改變導致在經(jīng)改變的革蘭氏陽性細菌細胞中kina、phra、和phre蛋白中一種或多種的活性的降低。因此，該遺傳改變可導致kina、phra、和phre蛋白中任一種；kina、phra、和phre蛋白中任兩種；或kina、phra、和phre蛋白中所有三種的活性的降低。

在某些實施例中，野生型kina基因的序列與seqidno:1具有至少60％同一性，野生型phra基因的序列與seqidno:6具有至少60％同一性，并且野生型phre基因的序列與seqidno:8具有至少60％同一性。在某些實施例中，野生型kina蛋白的序列與seqidno:2具有至少80％同一性，野生型phra蛋白的序列與seqidno:7具有至少80％同一性，并且野生型phre蛋白的序列與seqidno:9具有至少80％同一性。在某些實施例中，該遺傳改變是kina、phra、和phre基因中的一個或多個的全部或部分的缺失。

在某些實施例中，所述經(jīng)改變的革蘭氏陽性細菌細胞表達感興趣的蛋白質。在某些實施例中，該方法進一步包括將編碼所述感興趣的蛋白質的表達盒引入所述親本革蘭氏陽性細菌細胞中。在某些實施例中，該方法進一步包括將編碼所述感興趣的蛋白質的表達盒引入所述經(jīng)改變的革蘭氏陽性細菌細胞中。在某些實施例中，該感興趣的蛋白質是同源蛋白質。在某些實施例中，該感興趣的蛋白質是異源蛋白質。在某些實施例中，該感興趣的蛋白質是酶。在某些實施例中，該酶選自下組，該組由以下各項組成：蛋白酶、纖維素酶、支鏈淀粉酶、淀粉酶、糖酶、脂肪酶、異構酶、轉移酶、激酶、和磷酸酶。在某些實施例中，該感興趣的蛋白質是蛋白酶。在某些實施例中，該蛋白酶是枯草桿菌蛋白酶。在某些實施例中，該枯草桿菌蛋白酶選自下組，該組由以下各項組成：枯草桿菌蛋白酶168、枯草桿菌蛋白酶bpn'、枯草桿菌蛋白酶carlsberg、枯草桿菌蛋白酶dy、枯草桿菌蛋白酶147、枯草桿菌蛋白酶309、及其變體。

在某些實施例中，該方法進一步包括在由所述經(jīng)改變的革蘭氏陽性細菌細胞表達所述感興趣的蛋白質的條件下培養(yǎng)所述經(jīng)改變的革蘭氏陽性細菌細胞。在某些實施例中，該方法進一步包括回收所述感興趣的蛋白質。

本發(fā)明的方面包括通過上述方法生產的經(jīng)改變的革蘭氏陽性細菌細胞。

附圖簡要說明

圖1顯示了kina(δkina)缺失的遺傳圖譜。

圖2a顯示了表達amye的未經(jīng)改變的(親本)枯草芽孢桿菌細胞和經(jīng)改變的(δkina)枯草芽孢桿菌細胞的細胞密度的圖。

圖2b顯示了來自未經(jīng)改變的(親本)枯草芽孢桿菌細胞和經(jīng)改變的(δkina)枯草芽孢桿菌細胞的amye表達的圖。

圖3a顯示了表達fna的未經(jīng)改變的(親本)枯草芽孢桿菌細胞和經(jīng)改變的(δkina)枯草芽孢桿菌細胞的細胞密度的圖。

圖3b顯示了來自未經(jīng)改變的(親本)枯草芽孢桿菌細胞和經(jīng)改變的(δkina)枯草芽孢桿菌細胞的fna表達的圖。

圖4a顯示了表達綠色熒光蛋白(gfp)的未經(jīng)改變的(親本)枯草芽孢桿菌細胞和經(jīng)改變的(δkina)枯草芽孢桿菌細胞的細胞密度的圖。

圖4b顯示了來自未經(jīng)改變的(親本)枯草芽孢桿菌細胞和經(jīng)改變的(δkina)枯草芽孢桿菌細胞的gfp表達的圖。

圖5顯示了調節(jié)芽孢桿菌屬細胞中孢子形成起始的磷酸化途徑的圖示。一種或多種激酶的自身磷酸化被特異性饑餓信號觸發(fā)，隨后是spo0f、spo0b和spo0a蛋白質的順序磷酸化。spo0a-p控制孢子形成級聯(lián)的激活。激酶(例如，kina、kinb、kinc、kind、kine)和磷酸酶(例如，rapa、rapb、rape)由基因名稱指示。箭頭表示陽性效應，如磷酸化或對靶基因表達的控制，而端部截斷的線(blunt-facelin)表示負效應，如去磷酸化或抑制基因表達。例如，激酶kina磷酸化spo0f磷酸酶，其將磷?；鶊F轉移到spo0b，并且然后轉移到spo0a，而轉錄調節(jié)劑abrb抑制spo0h(sigh)表達并因此抑制spo0a表達。

圖6顯示了phra缺失的遺傳構建體。

圖7顯示了phre缺失的遺傳構建體。

圖8a顯示了表達gfp的未經(jīng)改變的(親本)枯草芽孢桿菌細胞和經(jīng)改變的枯草芽孢桿菌細胞(即，包含phra和phre基因的缺失(本文為δphra/δphre)的經(jīng)改變的枯草芽孢桿菌細胞)的細胞密度的圖。

圖8b顯示了來自未經(jīng)改變的(親本)枯草芽孢桿菌細胞和經(jīng)改變的(δphra/δphre)枯草芽孢桿菌細胞的gfp表達的圖。

圖9a顯示了表達fna的未經(jīng)改變的(親本)枯草芽孢桿菌細胞和經(jīng)改變的(δphra/δphre)枯草芽孢桿菌細胞的細胞密度的圖。

圖9b顯示了來自未經(jīng)改變的(親本)枯草芽孢桿菌細胞和經(jīng)改變的(δphra/δphre)枯草芽孢桿菌細胞的fna表達的圖。

圖10a顯示了表達amye的未經(jīng)改變的(親本)枯草芽孢桿菌細胞和經(jīng)改變的(δphra/δphre)枯草芽孢桿菌細胞的細胞密度的圖。

圖10b顯示了來自未經(jīng)改變的(親本)枯草芽孢桿菌細胞和經(jīng)改變的(δphra/δphre)枯草芽孢桿菌細胞的amye表達的圖。

發(fā)明詳細說明

本發(fā)明總體上涉及具有遺傳改變的細菌細胞，以及制造和使用此類細胞的方法，所述遺傳改變導致感興趣的蛋白質(下文稱為“poi”)的增加的表達/生產。本發(fā)明的某些方面包括革蘭氏陽性微生物，如芽孢桿菌屬的成員，這些革蘭氏陽性微生物包含降低激活磷酸化途徑的一種或多種蛋白質的表達和/或活性的遺傳改變，該遺傳改變導致poi的表達增加。

在更詳細地描述本發(fā)明組合物和方法之前，應當理解，本發(fā)明組合物和方法不限于所描述的具體實施例，因此當然可以變化。還應當理解，在此使用的術語僅是出于描述具體實施例的目的，并且不旨在進行限制，因為本發(fā)明組合物和方法的范圍將僅由所附權利要求書限制。

在提供了一系列值的情況下，應理解每個中間值為到下限的十分之一單位(除非上下文清晰地另外指示)，該范圍的上限與下限之間以及在該陳述范圍內的任何其他陳述的或中間值均被涵蓋在本發(fā)明的組合物和方法之內。這些較小范圍的上限和下限可以被獨立地包括在所述較小的范圍內，并且也被涵蓋在本發(fā)明的組合物和方法之內，服從所陳述范圍中任何特別排除的限值。在所陳述的范圍包括一個或者全部兩個限值的情況下，排除那些包括的限值的任一個或者全部兩個的范圍也包括在本發(fā)明的組合物和方法中。

本文提供了某些范圍，其中數(shù)值前面是術語“約”。術語“約”在本文中用于為其后面的確切數(shù)字以及與該術語后面的數(shù)字接近或近似的數(shù)字提供文字支持。在確定數(shù)字是否接近或近似于具體敘述的數(shù)字時，接近或近似的未列舉的數(shù)字可以是在呈現(xiàn)其的上下文中提供具體敘述的數(shù)字的實質性等值的數(shù)字。例如，關于數(shù)值，術語“約”是指數(shù)值的-10％至+10％的范圍，除非術語在上下文中另有具體定義。在另一個實例中，短語“約6的ph值”是指ph值為從5.4至6.6，除非ph值另有具體定義。

本文提供的標題并非對本發(fā)明的組合物和方法的各個方面或實施例進行限制，這些方面或實施例可通過將說明書作為一個整體來參考而得到。因此，將說明書作為一個整體參考時，下面即將定義的術語被定義得更全面。

將本文件分為若干部分以便于閱讀；然而，讀者將領會的是，在一個部分中進行的陳述可能適用于其他部分。以這種方式，用于本披露的不同部分的標題不應被解釋為限制。

除非另有定義，本文使用的所有技術和科學術語具有與本發(fā)明組合物和方法所屬領域的普通技術人員通常理解的相同含義。雖然類似于或等同于本文描述的那些的任何方法和材料也可以用于本發(fā)明組合物和方法的實踐或測試中，但現(xiàn)在將對代表性示例方法和材料進行描述。

在本說明書中引用的所有公開物以及專利都通過引用并入本文。任何公開物的引用內容是針對其在申請日之前的披露，并且不能理解為承認因為先前發(fā)明而本發(fā)明組合物和方法不能獲得比這些公開物更早的申請日。

根據(jù)此詳細描述，適用下列簡稱和定義。應當注意單數(shù)形式“一個/一種(a/an)”和“該(the)”包括復數(shù)個指示物，除非上下文中清楚地另外指出。因此，例如提及“酶”包括多個這樣的酶，并且提及“劑量”包括提及一個或多個劑量以及本領域技術人員已知的其等效物，等等。

進一步注意的是，權利要求書可以撰寫以排除任何可選擇的要素(例如像附帶條件)。因此，該陳述旨在作為使用與權利要求要素的敘述有關的排他性術語如“單獨”、“僅”、“排除”等或利用“否定型”限定的前提基礎。

進一步注意到，如本文使用的術語“基本上由……組成”是指一種組合物，其中該術語之后的一種或多種組分在存在其他已知的一種或多種組分的情況下為總體組合物的以重量計小于30％的總量，并且不會有助于或干擾一種或多種組分的作用或活性。

進一步注意到，如本文所使用的術語“包含”意指包含但不限于在術語“包含”之后的一種或多種組分。在術語“包含”之后的組分是必需的或強制性的，但是包含一種或多種組分的組合物可以進一步包括其他非強制性或可選擇的一種或多種組分。

還要注意的是，如本文所使用的術語“由……組成”意指包括且限于術語“由……組成”之后的一種或多種組分。因此，術語“由……組成”之后的一種或多種組分是必需的或強制性的，且組合物中不存在一種或多種其他組分。

如將對于本領域技術人員顯而易見的是，在閱讀本披露時，本文描述和展示的單獨實施例中的每一個具有離散的組分和特征，這些組分和特征可以在不偏離本文所述的本發(fā)明組合物和方法的范圍或精神的情況下容易地與任何其他幾個實施例的任何一個的特征分離或組合。可以按照所敘述的事件的順序或按照邏輯上可行的任何其他順序來進行任何敘述的方法。

定義

本發(fā)明總體上涉及革蘭氏陽性細菌細胞(及其制備和使用方法)，其被改變或修飾以具有增加一種或多種poi的表達和/或產生的能力。

因此，某些實施例涉及經(jīng)改變的革蘭氏陽性細菌細胞，所述革蘭氏陽性細菌細胞包含降低種用于激活磷酸化途徑(例如，編碼kina、phra、phre的基因)的一個或多個基因的表達的至少一個遺傳改變。例如，枯草芽孢桿菌中的磷酸化途徑(即，信號轉導系統(tǒng))通常被認為圍繞轉錄因子spo0a循環(huán)(參見，“bacillussubtilisandothergram-positivebacteria:biochemistry,physiologyandmoleculargenetics”；eds.a.l.sonenshein,j.a.hoch,r.losick,am.societyofmicorbiology,1993[“枯草芽孢桿菌和其他革蘭氏陽性細菌：生物化學、生理學和分子遺傳學”；編輯，a.l.sonenshein、j.a.hoch、r.losick，美國微生物學會，1993])。

更具體地說，據(jù)信磷酸化信號轉導系統(tǒng)的作用是最終將(無活性)spo0a轉錄因子磷酸化成spo0a～p，其中該活性spo0a～p轉錄因子負責參與孢子形成初始階段的基因的轉錄。不希望受到本發(fā)明的任何特定理論或操作模式的約束，圖5總體上顯示了調節(jié)芽孢桿菌屬細胞中孢子形成起始的磷酸化途徑的圖示。例如，某些激酶(例如，kina、kinb等)被認為參與解釋環(huán)境信號并將該信息轉導到自身磷酸化的激酶蛋白質中(例如，kina至kina～p)。磷酸化激酶然后將磷酸鹽轉移到spo0f蛋白質以產生spo0f～p，該spo0f～p被認為在磷酸化中用作次級信使，其中spo0f～p將其磷酸轉移到spo0b以產生spo0b～p，然后該spo0b～p轉移該磷酸基團spo0a以產生spo0a～p。

不希望受到任何特定理論約束或束縛，以下闡述的實例部分證明阻斷或降低kina活性(其阻斷或降低spo0a轉錄因子的磷酸化和激活)，導致芽孢桿菌屬細胞中一種或多種poi的表達增加。此外，不希望受到任何特定理論約束或束縛，五肽phra和五肽phre(參見，圖5)分別用來阻斷rapa和rape磷酸酶的功能，其脫抑制由kina激活的磷酸化途徑。如實例部分所證實的，阻斷phra和/或phre對rap磷酸酶的抑制活性導致在芽孢桿菌屬細胞中poi的表達增加。

如本文所定義的，“經(jīng)改變的細胞”、“修飾的細胞”、“經(jīng)改變的細菌細胞”、“修飾的細菌細胞”、“經(jīng)改變的宿主細胞”或“修飾的宿主細胞”可互換使用并且是指重組革蘭氏陽性細菌細胞，這些重組革蘭氏陽性細菌細胞包含降低用于激活磷酸化途徑的一個或多個基因的表達的至少一個遺傳改變。例如，本披露的“經(jīng)改變的”革蘭氏陽性細菌細胞可以被進一步定義為源自親本細菌細胞的“經(jīng)改變的細胞”，其中該經(jīng)改變的(子代)細胞包含降低用于激活磷酸化途徑的一個或多個基因的表達的至少一個遺傳改變。

如本文所定義的，“未經(jīng)改變的細胞”、“未修飾的細胞”、“未經(jīng)改變的細菌細胞”、“未修飾的細菌細胞”、“未經(jīng)改變的宿主細胞”或“未修飾的宿主細胞”可互換使用并且是指“未經(jīng)改變的”‘親本’革蘭氏陽性細菌細胞，這些革蘭氏陽性細菌細胞不包含降低用于激活磷酸化途徑的一個或多個基因的表達的至少一個遺傳改變。在某些實施例中，未經(jīng)改變的(親本)革蘭氏陽性細菌細胞稱為“對照細胞”或未經(jīng)改變的(親本)革蘭氏陽性細菌“對照”細胞。

例如，本披露的某些實施例涉及表達增加量的poi的“經(jīng)改變的”革蘭氏陽性細菌(子代)細胞，其中該poi的增加的量是相對于在“未經(jīng)改變的”革蘭氏陽性細菌(親本)細胞(即，未經(jīng)改變的革蘭氏陽性細菌“對照”細胞)中相同poi的表達而言的。因此，如本文定義的，當術語或短語“一個或多個未經(jīng)改變的細菌細胞”、“一個或多個未經(jīng)改變的革蘭氏陽性細菌細胞”、“一個或多個未經(jīng)改變的革蘭氏陽性細菌‘對照’細胞”等用于與本披露的一個或多個“經(jīng)改變的細菌細胞”進行比較的上下文中時，應理解經(jīng)改變的(子代)細胞和未經(jīng)改變的親本(對照)細胞均在基本上相同的條件和培養(yǎng)基下生長/培養(yǎng)。

如本文所使用的，“宿主”細胞是指具有作為新引入的dna序列的宿主或表達載體的能力的“革蘭氏陽性細菌細胞”。

在本發(fā)明的某些實施例中，宿主細胞是芽孢桿菌屬的成員胞。.

如本文所使用的，“芽孢桿菌屬”或“芽孢桿菌屬物種”包括本領域技術人員已知的“芽孢桿菌屬”內的所有物種，這些所有物種包括但不限于：枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、短芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌、索諾拉沙漠芽孢桿菌、耐鹽芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、飼料芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、黏瓊脂芽孢桿菌、秋葉氏芽孢桿菌、庫拉奇芽孢桿菌、假堅強芽孢桿菌、列城芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、凝結芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、吉氏芽孢桿菌、和蘇云金芽孢桿菌。

我們意識到芽孢桿菌屬在不斷進行分類學重組。因此，該屬旨在包括已重新分類的物種，這些物種包括但不限于：如嗜熱脂肪芽孢桿菌(b.stearothermophilus)(現(xiàn)在稱為“嗜熱脂肪土芽孢桿菌(geobacillusstearothermophilus)”)的此類生物體。在氧氣存在下的抗性內生孢子的產生被認為是芽孢桿菌屬的定義性特性，盡管這個特征也適用于最近命名的脂環(huán)酸芽孢桿菌屬、雙芽孢桿菌屬(amphibacillus)、硫胺素芽孢桿菌屬(aneurinibacillus)、厭氧芽孢桿菌屬(anoxybacillus)、短芽孢桿菌屬、線性桿菌屬(filobacillus)、薄壁芽孢桿菌屬(gracilibacillus)、喜鹽芽孢桿菌屬(halobacillus)、類芽孢桿菌屬、需鹽芽孢桿菌屬(salibacillus)、耐熱芽孢桿菌屬(thermobacillus)、脲芽孢桿菌屬(ureibacillus)和枝芽孢桿菌屬(virgibacillus)。

如本文所使用的，“核酸”是指核苷酸或多核苷酸序列、及其片段或部分，以及可能是雙鏈或單鏈的基因組或合成來源的dna、cdna、和rna，無論其代表正義或反義鏈。應當理解，由于遺傳密碼的簡并性，許多核苷酸序列可以編碼給定的蛋白質。

如本文所使用的，術語“載體”是指可以在細胞中復制并且可以攜帶新基因或dna(多核苷酸)片段到細胞中的任何核酸。因此，該術語是指設計用于在不同宿主細胞之間轉移的核酸構建體?！氨磉_載體”是指具有在外來細胞中表達異源dna片段的能力的載體。許多原核和真核表達載體是可商購的?！鞍邢蜉d體”是包含與其轉化的宿主細胞的染色體中的區(qū)域同源的多核苷酸序列并且可以驅動該區(qū)域的同源重組的載體。靶向載體可用于通過同源重組將突變引入細胞染色體中。在一些實施例中，靶向載體包括其他非同源序列，例如添加到末端的非同源序列(即，填充序列或側翼序列)。末端可以閉合，這樣使得靶向載體形成閉環(huán)，例如像，插入載體中。合適的一種或多種載體的選擇和/或構建在本領域技術人員的知識范圍內。

如本文所使用的，術語“質?！笔侵赣米骺寺≥d體的環(huán)狀雙鏈(ds)dna構建體，并且其在許多細菌和一些真核生物中形成額外的染色體自復制遺傳元件。在一些實施例中，質粒被合并入宿主細胞的基因組中。

“純化的”或“分離的”或“富集的”意指生物分子(例如，多肽或多核苷酸)通過將其與它在自然界中相關聯(lián)的天然存在的成分中的一些或所有分離而被從其天然狀態(tài)改變。這種分離或純化可以通過本領域公認的分離技術如離子交換層析、親和層析、疏水分離、透析、蛋白酶處理、硫酸銨沉淀或其他蛋白質鹽沉淀、離心、尺寸排阻層析、過濾、微量過濾、凝膠電泳或梯度分離進行，以去除最終組合物中所不希望的全細胞、細胞碎片、雜質、外來蛋白質或酶。隨后可以進一步向純化或分離的生物分子組合物中添加成分，該成分提供了額外的益處，例如是活化劑、抗抑制劑、期望的離子、控制ph的化合物或其他酶或化學品。

如本文所使用的，當提及感興趣的生物分子(例如，感興趣的蛋白質)的表達時，術語“增加”、“增強”和“改進”在本文中可互換使用，以指示生物分子的表達(即，在經(jīng)改變的細胞中)高于在基本上相同的生長條件下生長的對應的未改變(親本)細胞中的表達水平。

如本文定義的，關于基因序列、orf序列或多核苷酸序列的術語“表達”或“表達的”是指基因、orf或多核苷酸的轉錄，并且在適當情況下將所得mrna轉錄物翻譯成蛋白質。因此，如將從上下文清楚看出的，蛋白質的表達是由開放閱讀框序列的轉錄和翻譯產生的。所希望產物在宿主微生物中的表達水平可以基于存在于宿主中的相應mrna的量或所選序列編碼的所需產物的量來確定。例如，可以通過pcr或通過rna雜交來定量從所選序列轉錄的mrna(參見sambrooketal.,molecularcloning:alaboratorymanual,coldspringharborlaboratorypress,1989[sambrook等人，分子克?。簩嶒炇沂謨?，冷泉港實驗室出版社，1989])。由所選序列編碼的蛋白質可以通過各種方法進行定量(例如，通過elisa，通過測定蛋白質的生物學活性，或通過采用使用識別并結合蛋白質的抗體的、獨立于此類活性的測定，如蛋白質印跡或放射免疫測定)?；?或其多核苷酸)的上下文中的術語“表達”是基于該基因(或其多核苷酸)的核酸序列產生蛋白質的方法，并且因此包括轉錄和翻譯兩者。

如本文定義的，術語“引入”，如短語中所使用的，如“向細菌細胞中引入”至少一種多核苷酸開放閱讀框(orf)、或其基因、或其載體，包括本領域已知用于將多核苷酸引入細胞的方法，這些方法包括但不限于原生質體融合、轉化(例如，氯化鈣、電穿孔)、轉導、轉染、綴合等(參見，例如，ferrarietal.,“genetics,”inhardwoodetal,(eds.),bacillus,plenumpublishingcorp.,pages57-72,1989[ferrari等人，在hardwood等人(編輯)的“遺傳學”中，芽孢桿菌屬，普萊南出版公司，第57-72頁，1989])。

如本文所使用的，術語“轉化的”和“穩(wěn)定轉化的”是指通過人為干預被引入多核苷酸序列的細胞。多核苷酸可以整合到細胞的基因組中，或作為保持至少兩代的附加型質粒存在。

如本文所使用的，術語“可選擇的標志物”或“選擇性標志物”是指能夠在宿主細胞中表達的核酸(例如，基因)，其允許容易地選擇包含該核酸的那些宿主。這些可選擇的標志物的實例包括但不限于抗微生物劑。因此，術語“可選擇的標志物”是指提供宿主細胞已經(jīng)攝取了感興趣的輸入dna，或者已經(jīng)發(fā)生了一些其他反應的指示。通常，可選擇的標志物是賦予宿主細胞抗微生物抗性或代謝優(yōu)勢的基因，以允許在轉化期間將包含外源dna的細胞與未接受任何外源序列的細胞區(qū)分開來。根據(jù)本發(fā)明有用的其他標志物包括但不限于營養(yǎng)缺陷型標志物，如色氨酸；和檢測標志物，如β-半乳糖苷酶。

如本文所使用的，術語“啟動子”是指用于引導下游基因轉錄的核酸序列。在實施例中，啟動子適用于正在表達靶基因的宿主細胞。啟動子與其他轉錄和翻譯調控核酸序列(也稱為“控制序列”)一起是表達給定的基因所必須的。通常，轉錄和翻譯調控序列包括但不限于啟動子序列、核糖體結合位點、轉錄起始和終止序列、翻譯起始和終止序列、以及增強子或激活子序列。

如本文所使用的，“功能附接”或“可操作地連接”意指具有已知或所期望活性的調節(jié)區(qū)域或功能結構域(如啟動子、終止子、信號序列或增強子區(qū)域)按這樣一種方式附接于或連接于靶標(例如，基因或多肽)，以允許調節(jié)區(qū)域或功能結構域根據(jù)其已知或期望的活性來控制該靶標的表達、分泌或功能。

當用于描述重組細胞(例如，“經(jīng)改變的”革蘭氏陽性細菌細胞)時，術語“遺傳改變”意指與親本細胞相比，該細胞具有至少一個遺傳差異。一個或多個遺傳改變可以是染色體突變(例如，插入、缺失、取代、倒位、用一個染色體區(qū)域替代另一個染色體區(qū)域(例如用異源啟動子替代染色體啟動子)等)和/或引入染色體外多核苷酸(例如，質粒)。在一些實施例中，可以將染色體外多核苷酸整合到宿主細胞染色體中，以產生穩(wěn)定轉染子/轉化子。本披露的實施例包括降低kina、phra、和/或phre蛋白的表達或活性的遺傳改變(經(jīng)轉錄、翻譯或通過降低蛋白質本身的活性，例如通過氨基酸序列的突變)。如本文詳細描述的，這種改變改進感興趣的蛋白質的表達。

基因的“失活”意味著基因的表達或其編碼的蛋白質的活性被阻斷，或不能發(fā)揮其已知的功能。基因的失活可以通過任何合適的手段進行，例如通過如上所述的遺傳改變。在某些實施例中，滅活基因的表達產物是具有蛋白質生物活性相應變化的截短蛋白質。在一些實施例中，經(jīng)改變的革蘭氏陽性細菌細胞包含導致穩(wěn)定和不可恢復性失活的一個或多個基因的失活。

在一些實施例中，通過缺失實現(xiàn)基因失活。在一些實施例中，通過同源重組缺失靶向缺失的區(qū)域(例如，基因)。例如，使用包括具有選擇性標志物的輸入序列的dna構建體，該選擇性標志物在每側側翼有與靶向缺失的區(qū)域同源的序列(其中該序列在本文中稱為“同源盒”)。dna構建體與宿主染色體的同源序列對齊，并且在雙重交叉事件中，將靶向缺失的區(qū)域從宿主細胞染色體上切除。

“插入”或“添加”是與天然存在的或親本的序列相比分別導致添加一個或多個核苷酸或氨基酸殘基的核苷酸或氨基酸序列的改變。

如本文所使用的，“取代”由一或多個多核苷酸或氨基酸分別被不同的多核苷酸或氨基酸替代產生。

使基因突變的方法是本領域熟知的，并且包括但不限于位點定向突變、隨機突變的產生、和缺口雙鏈體方法(參見，例如，美國專利4,760,025；moringetal.,biotech.2:646[1984][moring等人，生物技術2:646[1984]]；和krameretal.,nucleicacidsres.,12:9441[1984][kramer等人，核酸研究，12:9441])。

如本文所使用的，“同源基因”是指來自不同的、但通常相關的物種的基因對，這些基因彼此對應并且彼此相同或非常相似。該術語涵蓋通過物種形成(即，新物種的發(fā)育)(例如，直系同源基因)分離的基因、以及通過遺傳重復分離的基因(例如，旁系同源基因)。

如本文所使用的，“直向同源物”和“直向同源基因”是指通過物種形成從共同祖先基因(即，同源基因)演化的不同物種中的基因。通常，直系同源物在進化過程中保持相同的功能。直系同源物的鑒定可用于新測序基因組中基因功能的可靠預測。

如本文所使用的，“旁系同源物”和“旁系同源基因”是指與基因組內重復相關的基因。雖然直系同源物在進化過程中保持相同的功能，但旁系同源物發(fā)展新功能，即使一些功能通常與原始功能相關。旁系同源基因的實例包括但不限于編碼胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、彈性蛋白酶、和凝血酶的基因，上述酶都是絲氨酸蛋白酶并且在同一物種內一起發(fā)生。

如本文所使用的，“同源性”是指序列相似性或同一性，同一性優(yōu)先。該同源性是使用本領域已知的標準技術來確定的(參見，例如，smithandwaterman,adv.appl.math.,2:482[1981]；needlemanandwunsch,j.mol.biol.,48:443[1970]；pearsonandlipman,proc.natl.acad.sci.usa85:2444[1988]；programssuchasgap,bestfit,fasta,andtfastainthewisconsingeneticssoftwarepackage(geneticscomputergroup,madison,wi)；anddevereuxetal.,nucl.acidres.,12:387-395[1984][smith和waterman，應用數(shù)學進展，2:482[1981]；needleman和wunsch，分子生物學雜志，48:443[1970]；pearson和lipman，美國科學院院刊85:2444[1988]；程序，如威斯康星遺傳軟件包中的gap、bestfit、fasta、和tfasta(遺傳學計算機組，麥迪遜，威斯康星州)；和devereux等人，核酸研究，12:387-395[1984]])。

如本文所使用的，“類似的序列”是其中基因的功能基本上與指定來自枯草芽孢桿菌菌株168的基因相同的序列。另外，類似的基因與枯草芽孢桿菌菌株168基因的序列包括至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％序列同一性?？商娲?，類似的序列具有在枯草芽孢桿菌168區(qū)域中發(fā)現(xiàn)的在70％至100％之間的基因的對齊和/或在與枯草芽孢桿菌168染色體中的基因對齊的區(qū)域中發(fā)現(xiàn)的至少在5-10個之間的基因。在另外的實施例中，多于一個上述性質適用于該序列。類似的序列由已知的序列比對方法確定。通常使用的比對方法是blast，盡管如上下文所示，存在也可用于比對序列的其他方法。

有用的算法的一個實例是pileup。pileup使用漸進的、兩兩比對創(chuàng)建了來自一組相關序列的多個序列比對。它還可以標繪顯示用于創(chuàng)建該比對的聚類關系的一個樹。pileup使用feng和doolittle的漸進比對方法的簡化(fenganddoolittle,j.mol.evol.,35:351-360[1987][feng和doolittle，分子進化雜志，35:351-360[1987]])。該方法類似于higgins和sharp所述的方法(higgins和sharp，cabios5:151-153[1989])。有用的pileup參數(shù)包括為3.00的默認空位權重，為0.10的默認空位長度權重，以及加權的末端空位。

有用的算法的另一個實例是由altschul等人描述的blast算法(altschuletal.,j.mol.biol.,215:403-410,[1990]；andkarlinetal.,proc.natl.acad.sci.usa90:5873-5787[1993][altschul等人，分子生物學雜志，215:403-410，[1990]；和karlin等人，美國科學院院刊90:5873-5787[1993]])。一個特別有用的blast程序是wu-blast-2程序(參見，altschuletal.,meth.enzymol.,266:460-480[1996][altschul等人，酶學方法，266:460-480[1996]])。

如本文所使用的，相對于本文鑒定的氨基酸或核苷酸序列，“序列同一性百分比(％)”被定義為在比對序列并引入空位(必要的話)以實現(xiàn)最大百分比序列同一性之后，并且不考慮作為序列同一性的一部分的任何保守取代，候選序列中與感興趣的序列中的氨基酸殘基或核苷酸相同的氨基酸殘基或核苷酸的百分比。

“同系物”(或“同源物”)是指與主題氨基酸序列和主題核苷酸序列具有特定程度的同一性的實體。使用常規(guī)序列比對工具(例如，clustal、blast等等)，同源序列可以包括與主題序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或甚至99％同一性的氨基酸序列。通常，除非另有說明，同系物將包括與主題氨基酸序列相同的活性位點殘基。

進行序列比對并且確定序列同一性的方法是本領域技術人員已知的，可以在不進行過多實驗的情況下實施，并且可以明確地獲得同一性值的計算。參見，例如，ausubeletal.,eds.(1995)currentprotocolsinmolecularbiology,chapter19(greenepublishingandwiley-interscience,newyork)；andthealignprogram(dayhoff(1978)inatlasofproteinsequenceandstructure5:suppl.3(nationalbiomedicalresearchfoundation,washington,d.c.)[ausubel等人編輯(1995)分子生物學現(xiàn)代方法，第19章(格林出版與威利交叉科學出版社，紐約)；和align程序(dayhoff(1978)，在蛋白質序列和結構圖集5：增刊3中(國家生物醫(yī)學研究基金會，華盛頓)]。許多算法可用于比對序列并確定序列同一性，并且包括，例如，needlemanetal.(1970)j.mol.biol.48:443[needleman等人(1970)分子生物學雜志48:443]的同源性比對算法；smithetal.(1981)adv.appl.math.2:482[smith等人(1981)應用數(shù)學進展2:482]的局部同源性算法；pearsonetal.(1988)proc.natl.acad.sci.85:2444[pearson等人(1988)美國科學院院刊85:2444]的相似性捜索方法；smith-waterman算法(meth.mol.biol.70:173-187(1997)[分子生物學方法70:173-187(1997)])；和blastp、blastn、和blastx算法(參見altschuletal.(1990)j.mol.biol.215:403-410[altschul等人(1990)分子生物學雜志215:403-410])。

使用這些算法的計算機化程序也是可用的，并且包括但不限于：align或megalign(dnastar)軟件，或wu-blast-2(altschuletal.,meth.enzym.,266:460-480(1996)[altschul等人，酶學方法，266:460-480(1996)])；或可在遺傳學計算機組(gcg)包，版本8，麥迪遜，威斯康星州，美國中獲得的gap、bestfit、blast、fasta、和tfasta；以及智能遺傳學(intelligenetics)，山景城，加利福尼亞州的pc/基因程序中的clustal。本領域的技術人員可以確定用于測量比對的適當參數(shù)，包括在進行比較的序列的整個長度上實現(xiàn)最大比對所需的算法。

如本文所使用的，術語“雜交”是指通過堿基配對將核酸鏈與互補鏈連接的過程，如本領域已知的。

如果兩個序列在中至高嚴格雜交和洗滌條件下彼此特異性雜交，則認為核酸序列可與參考核酸序列“選擇性雜交”。雜交條件是基于結合復合物或探針的核酸的解鏈溫度(tm)。例如，“最大嚴格”通常發(fā)生在約tm-5℃(低于探針的tm5°)；“高嚴格”發(fā)生在低于tm約5℃-10℃；“中等嚴格”發(fā)生在低于探針的tm約10℃-20℃；并且“高嚴格”發(fā)生在低于tm約20℃-25℃。在功能上，最大嚴格條件可以用于鑒定與雜交探針具有嚴格同一性或近乎嚴格同一性的序列；而中等或低嚴格雜交可用于鑒定或檢測多核苷酸序列同系物。

中和高嚴格雜交條件是本領域熟知的。高嚴格條件的實例包括在約42℃下在50％甲酰胺，5xssc，5x登哈特溶液，0.5％sds和100μg/ml變性載體dna中進行的雜交，隨后在室溫下在2xssc和0.5％sds中洗滌兩次，并在42℃下在0.1xssc和0.5％sds中再洗滌兩次。中嚴格雜交條件的實例包括在37℃下在包括20％甲酰胺，5×ssc(150mmnacl，15mm檸檬酸三鈉)，50mm磷酸鈉(ph7.6)，5×登哈特溶液，10％葡聚糖硫酸鹽和20mg/ml變性剪切的鮭魚精子dna的溶液中過夜孵育，然后在約37℃-50℃下以1xssc洗滌濾器來進行。如果需要，本領域技術人員知道如何調節(jié)溫度、離子強度等以適應因素如探針長度等等。

當用于提及生物組分或組合物(例如，細胞、核酸、多肽/酶、載體等)時，術語“重組體”表示該生物組分或組成物處于自然界中未發(fā)現(xiàn)的狀態(tài)。換句話說，生物組分或組合物已經(jīng)通過人類干預從其天然狀態(tài)進行了修飾。例如，重組細胞涵蓋表達在其天然親本(即，非重組)細胞中未發(fā)現(xiàn)的一個或多個基因的細胞，表達與其天然親本細胞不同的量的一個或多個天然基因的細胞，和/或在不同于其天然親本細胞的條件下表達一個或多個天然基因的細胞。重組核酸可以與天然序列相差一個或多個核苷酸，可操作地連接到異源序列(例如，異源啟動子，編碼非天然或變體信號序列的序列等)，沒有內含子序列，和/或處于分離形式。重組多肽/酶可以與天然序列相差一個或多個氨基酸，可以與異源序列融合，可能被截短或具有氨基酸的內部缺失，能以在天然細胞中未發(fā)現(xiàn)的方式表達(例如，來自由于細胞中存在編碼多肽的表達載體而過表達該多肽的重組細胞)，和/或處于分離形式。需要強調的是，在一些實施例中，重組多核苷酸或多肽/酶具有與其野生型對應物相同但處于非天然形式(例如，分離或富集形式)的序列。

如本文所使用的，術語“靶序列”是指宿主細胞中編碼如下序列的dna序列：其中希望將輸入序列插入宿主細胞基因組中。在一些實施例中，靶序列編碼功能性野生型基因或操縱子，而在其他實施例中，靶序列編碼功能性突變基因或操縱子、或非功能基因或操縱子。

如本文所使用的，“側翼序列”是指正在討論的序列的上游或下游的任何序列(例如，針對基因a-b-c，基因b以a和c基因序列為側翼)。在一個實施例中，輸入序列每側側翼有同源盒。在另一個實施例中，輸入序列和同源盒包括在每側側翼有填充序列的單元。在一些實施例中，側翼序列僅存在于單側(3’或5’)，但在實施例中，序列的每側均有側翼序列。每個同源盒的序列與芽孢桿菌屬染色體中的序列同源。這些序列指導在芽孢桿菌屬染色體中，新構建體被整合，并且部分芽孢桿菌屬染色體將被輸入序列替代。在一個實施例中，選擇性標志物的5’和3’端側翼有包含失活染色體區(qū)段的部分的多核苷酸序列。在一些實施例中，側翼序列僅存在于單側(3’或5’)，而在實施例中，其存在于所側翼序列的每側。

如本文所使用的，術語“可擴增標志物”、“可擴增基因”、和“擴增載體”是指基因或編碼基因的載體，其允許在適當生長條件下擴增該基因。

在大多數(shù)擴增技術中通過酶的選擇實現(xiàn)“模板特異性”。擴增酶是在使用它們的條件下僅在核酸的不均勻混合物中處理核酸的特定序列的酶。例如，在qβ復制酶的情況下，mdv-1rna是復制酶的特異性模板(參見，例如，kacianetal.,proc.natl.acad.sci.usa69:3038[1972][kacian等人，美國科學院院刊69:3038[1972]])。其他核酸不被該擴增酶復制。類似地，在t7rna聚合酶的情況下，該擴增酶對其本身的啟動子具有嚴格的特異性(參見，chamberlinetal.,nature228:227[1970][chamberlin等人，自然，228:227[1970]])。在t4dna連接酶的情況下，該酶將不連接兩個寡核苷酸或多核苷酸，其中寡核苷酸或多核苷酸底物與連接接合處的模板之間存在錯配(參見，wuandwallace,genomics4:560[1989][wu和wallace，基因組學，4:560[1989]])。最后，發(fā)現(xiàn)taq和pfu聚合酶由于其在高溫下起作用的能力而對引物限制并由此限定的序列顯示出高特異性；高溫導致有利于與靶序列引物雜交而不與非靶序列雜交的熱力學條件。

如本文所使用的，術語“可擴增核酸”是指可以通過任何擴增方法擴增的核酸。預期“可擴增核酸”通常將包含“樣本模板”。

如本文所使用的，術語“樣品模板”是指源自樣品的核酸，將該樣品對“靶標”的存在進行分析(下文所定義)。相比之下，“背景模板”用于提及除樣品模板之外的核酸，其可以存在或不存在于樣品中。背景模板通常是無意的。它可能是遺留(carryover)的結果，或者它可能是因為試圖從樣品中純化掉的核酸污染物的存在導致的。例如，來自生物體的而非待檢測那些的核酸可作為背景存在于測試樣品中。

如本文所使用的，術語“引物”是指當置于以下條件下能作為合成起始點的寡核苷酸，無論是純化的限制性消化物中天然存在的還是經(jīng)合成而產生的：其中誘導與核酸鏈互補的引物延伸產物的合成(即，在核苷酸和誘導劑例如dna聚合酶存在下并在合適的溫度和ph下)。引物優(yōu)選是單鏈，用于最大效率的擴增，但是可替代地可以是雙鏈。如果是雙鏈，引物首先經(jīng)過處理以分離其雙鏈，然后再用于制備延伸產物。優(yōu)選地，引物是寡脫氧核糖核苷酸。引物必須足夠長，以在誘導劑存在下引發(fā)延伸產物的合成。引物的準確長度將取決于多個因素，包括溫度、引物來源和方法的使用。

如本文所使用的，術語“探針”是指能與另一感興趣的寡核苷酸雜交的寡核苷酸(即核苷酸序列)，無論是在純化的限制性消化中天然存在還是以合成，重組或通過pcr擴增產生的。探針可以是單鏈或雙鏈的。探針可用于檢測、鑒定和分離特定基因序列。預期的是，本發(fā)明所用的任何探針都將用任何“報道分子”標記，這樣使得在任何檢測系統(tǒng)中都可檢測，所述檢測系統(tǒng)包括但不限于酶(例如elisa、以及基于酶的組織化學測定)系統(tǒng)、熒光系統(tǒng)、放射性系統(tǒng)、和發(fā)光系統(tǒng)。本發(fā)明并不旨在限于任何具體的檢測系統(tǒng)或標記。

如本文所使用的，術語“靶”當用于提及聚合酶鏈式反應時，是指由用于聚合酶鏈式反應的引物所界定的核酸區(qū)域。因此，試圖從其他核酸序列分選“靶標”?！皡^(qū)段”被定義為靶序列內的核酸區(qū)域。

如本文所使用的，術語“聚合酶鏈式反應”(“pcr”)是指通過引用并入本文的美國專利號4,683,195、4,683,202和4,965,188的方法，其包括用于在不進行克隆或純化的情況下增加基因組dna混合物中靶序列的區(qū)段濃度的方法。

如本文所使用的，術語“擴增試劑”是指除引物、核酸模板和擴增酶之外的擴增所需的那些試劑(脫氧核糖核苷酸三磷酸、緩沖液等)。通常，將擴增試劑以及其他反應組分放置并包含在反應容器中(試管，微孔等)中。

使用pcr，可以將基因組dna中特異性靶序列的單拷貝擴增至通過若干種不同方法可檢測的水平(例如，與標記的探針雜交；摻入生物素化引物，再經(jīng)抗生物素蛋白-酶綴合物檢測；將³²p標記的脫氧核苷酸三磷酸(如dctp或datp)摻入擴增區(qū)段)。除基因組dna外，任何寡核苷酸或多核苷酸序列可以用適當?shù)囊锓肿咏M來擴增。具體地講，經(jīng)pcr方法本身所產生的擴增區(qū)段自身就是用于隨后的pcr擴增的有效模板。

如本文所使用的，術語“pcr產物”、“pcr片段”、及“擴增產物”是指在變性、退火及延伸的pcr步驟的兩個或更多個循環(huán)完成之后所得到的化合物的混合物。這些術語涵蓋一個或多個靶序列的一個或多個區(qū)段已經(jīng)擴增的情況。

如本文所使用的，術語“rt-pcr”是指rna序列的復制和擴增。在該方法中，將逆轉錄與pcr偶聯(lián)，最常使用其中采用熱穩(wěn)定聚合酶的一種酶程序，如美國專利5,322,770中所述，其通過引用并入本文。在rt-pcr中，由于聚合酶的逆轉錄酶活性，將rna模板轉化為cdna，并且然后使用聚合酶的聚合活性擴增(即，如在其他pcr方法中)。

如本文所使用的，術語“染色體整合”是指將輸入序列引入宿主細胞(例如，芽孢桿菌屬)的染色體的過程。轉化dna的同源區(qū)域與染色體的同源區(qū)域對齊。隨后，在雙交換(即同源重組)中，同源盒之間的序列被輸入序列替代。在本發(fā)明的一些實施例中，dna構建體的滅活染色體區(qū)段的同源段與芽孢桿菌屬染色體的固有染色體區(qū)域的側翼同源區(qū)域對齊。隨后，在雙交換(即同源重組)中，通過dna構建體缺失固有染色體區(qū)域。

“同源重組”意指在相同或幾乎相同核苷酸序列位點處的兩個dna分子或配對染色體之間的dna片段的交換。在一個實施例中，染色體整合是同源重組。

如本文所使用的“同源序列”意指，當最佳比對用于比較時，與另一個核酸或多肽序列具有100％、99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、88％、85％、80％、75％、或70％序列同一性的核酸或多肽序列。在一些實施例中，同源序列具有85％至100％之間的序列同一性，而在其他實施例中，存在在90％至100％之間的序列同一性，并且在更多實施例中，存在95％和100％的序列同一性。

如本文所使用的，“氨基酸”是指肽或蛋白質序列或其部分。術語“蛋白質”、“肽”和“多肽”可互換使用。

如本文所使用的，“感興趣的蛋白質”(poi)是指所期望的和/或進行評估的蛋白質/多肽。在一些實施例中，感興趣的蛋白質是細胞內的，而在其他實施例中，其是分泌的多肽。多肽包括酶，這些酶包括但不限于選自以下各項的那些：淀粉分解酶、蛋白水解酶、纖維素分解酶、氧化還原酶和植物細胞壁降解酶。更具體地說，這些酶包括但不限于淀粉酶、蛋白酶、木聚糖酶、脂肪酶、漆酶、酚氧化酶、氧化酶、角質酶、纖維素酶、半纖維素酶、酯酶、過氧化物酶、過氧化氫酶、葡萄糖氧化酶、植酸酶、果膠酶、過水解酶，多元醇氧化酶、果膠酸裂解酶、葡糖苷酶、異構酶、轉移酶、半乳糖苷酶和幾丁質酶。在本發(fā)明的具體實施例中，感興趣的多肽是蛋白酶。在一些實施例中，感興趣的蛋白質是與信號肽融合的分泌多肽(即，待分泌的蛋白質上的氨基末端延伸)。幾乎所有分泌的蛋白質都使用氨基末端蛋白質延伸，其在前體蛋白質穿過膜的靶向和易位中起關鍵作用。在膜轉移期間或之后立即通過信號肽酶水解去除該延伸。

在本發(fā)明的一些實施例中，感興趣的多肽選自激素、抗體、生長因子、受體等。涵蓋本發(fā)明的激素包括但不限于：卵泡刺激素、黃體生成激素、促皮質素釋放因子、生長激素抑制素、促性腺激素、加壓素、催產素、促紅細胞生成素、胰島素等。生長因子包括但不限于：血小板衍生生長因子、胰島素樣生長因子、表皮生長因子、神經(jīng)生長因子、成纖維細胞生長因子、轉化生長因子、細胞因子如白介素(例如，il-1至il-13)、干擾素、集落刺激因子等?？贵w包括但不限于：直接從需要產生抗體的任何物種獲得的免疫球蛋白。此外，本發(fā)明涵蓋修飾的抗體。多克隆和單克隆抗體也由本發(fā)明所涵蓋。在具體實施例中，抗體是人抗體。

如本文所使用的，多肽的“衍生物”或“變體”意指一種多肽，該多肽通過以下方式來自前體多肽(例如，天然多肽)：向c-和n-末端之一或二者添加一個或多個氨基酸，在氨基酸序列的不同位點的一個或多個處取代一個或多個氨基酸，在多肽的一端或兩端處或在氨基酸序列的一個或多個位點處缺失一個或多個氨基酸，在氨基酸序列的一個或多個位點處插入一個或多個氨基酸，以及其任何組合。多肽的衍生物或變體的制備能以任何方便的方式實現(xiàn)，例如通過修飾編碼天然多肽的dna序列，將該dna序列轉化到合適的宿主中，以及修飾的dna序列的表達以形成衍生物/變體多肽。衍生物或變體進一步包括經(jīng)化學修飾的多肽。

如本文所使用的，術語“異源蛋白質”是指在天然存在于宿主細胞中的蛋白質或多肽。異源蛋白質的實例包括酶如水解酶，包括蛋白酶、纖維素酶、淀粉酶、糖酶、和脂肪酶；異構酶如消旋酶、差向異構酶、互變異構酶、或變位酶；轉移酶、激酶和磷酸酶。在一些實施例中，蛋白質是治療上重要的蛋白質或肽，包括但不限于：生長因子、細胞因子、配體、受體和抑制劑，連同疫苗和抗體。在另外的實施例中，蛋白質是商業(yè)上重要的工業(yè)蛋白質/肽(例如，蛋白酶、糖酶如淀粉酶和葡糖淀粉酶、纖維素酶、氧化酶和脂肪酶)。在一些實施例中，編碼蛋白質的基因是天然存在的基因，而在其他實施例中，使用突變的和/或合成的基因。

如本文所使用的，“同源蛋白質”是指天然的或天然存在于細胞中的蛋白質或多肽。在某些實施例中，細胞是革蘭氏陽性細胞，而在某些其他實施例中，革蘭氏陽性細胞是芽孢桿菌屬細胞。在替代性實施例中，同源蛋白質是由其他生物體產生的天然蛋白質，包括但不限于大腸桿菌。本發(fā)明涵蓋通過重組dna技術產生同源蛋白質的宿主細胞。

如本文所使用的，“操縱子”包含可以從共同啟動子轉錄成單個轉錄單元的一組連續(xù)基因，并且從而進行共調節(jié)。在一些實施例中，操縱子可以包括驅動多個不同mrna的轉錄的多個啟動子。

如上所述，本披露的某些實施例涉及經(jīng)改變的細菌細胞，以及制備和使用這些細胞的方法，這些經(jīng)改變的細菌細胞包含導致poi表達增加的遺傳改變。因此，本發(fā)明的某些方面包括經(jīng)改變的革蘭氏陽性細胞，如芽孢桿菌屬成員的細胞，其中該經(jīng)改變的革蘭氏陽性細菌(子代)細胞包含導致選自kina基因、phra基因和/或phre基因的至少一個基因的表達水平降低的遺傳改變。如本文所述，并且在實例部分中進一步描述的，本發(fā)明的經(jīng)改變的革蘭氏陽性細菌細胞(即，包含導致選自kina基因、phra基因和/或phre基因的至少一個基因的表達水平降低的遺傳改變)當與在基本上相同的培養(yǎng)條件下生長的對應未經(jīng)改變的革蘭氏陽性細菌(親本)細胞相比時，證明一種或多種poi的表達增加。因此，本披露的遺傳改變是降低kina、phra、和phre基因中任一個；kina、phra、和phre基因中任兩個；或kina、phra、和phre基因中所有三個的表達水平的任何改變。在其他實施例中，與在基本上相同的培養(yǎng)條件下生長的對應的未經(jīng)改變的革蘭氏陽性細菌(親本)細胞相比，遺傳改變導致在經(jīng)改變的革蘭氏陽性細菌(子代)細胞中kina、phra、和phre蛋白中一種或多種的活性的降低。因此，在某些實施例中，遺傳改變是降低kina、phra、和phre蛋白中任一種；kina、phra、和phre蛋白中任兩種；或kina、phra、和phre蛋白中所有三種的活性的任何改變。

如上所述，本發(fā)明的方面包括用于從革蘭氏陽性細菌細胞增加poi的表達的方法，并且是基于以下觀察：在已被遺傳改變以具有降低的激活磷酸化途徑的一個或多個基因的表達的革蘭氏陽性(子代)細胞中poi的產生增加，這是相對于對應的未經(jīng)改變的革蘭氏陽性(親本)細胞中相同poi的產生而言的。如上所述，遺傳改變被定義為宿主細胞中改變宿主細胞的遺傳構成的任何改變，例如通過附加體添加和/或染色體插入、缺失、倒位、堿基變換等。在這方面不意圖進行限制。

在某些實施例中，親本革蘭氏陽性細胞具有一個或多個有缺陷或無活性的孢子形成起始基因(即，其表達受spo0a或spo0a下游控制的基因)，并且從而防止親本細胞形成孢子。令人驚奇的是，本發(fā)明的申請人發(fā)現(xiàn)即使在這種遺傳背景(即，包括一個或多個有缺陷或無活性的孢子形成起始基因的親本革蘭氏陽性細胞)中，另外的遺傳改變(例如，導致選自kina基因、phra基因和/或phre基因的至少一個基因的表達水平降低的遺傳改變)增加了此類經(jīng)改變的革蘭氏陽性細菌(子代)細胞中poi的表達。因此，本披露的遺傳改變的(子代)細胞中蛋白質表達/產生的改進不僅僅是因為防止革蘭氏陽性細胞的孢子形成。例如，本披露的經(jīng)改變的革蘭氏陽性細胞源自于其的親本革蘭氏陽性細胞可以具有通過spo0a或通過σ因子sigf、sigg、sige和sigk調節(jié)的非功能性/突變的/缺失的孢子形成基因(例如，參見實例部分，其中使用孢子形成缺陷型芽孢桿菌屬細胞)。

在某些實施例中，本發(fā)明涉及用于產生或獲得經(jīng)改變的革蘭氏陽性細菌(子代)細胞的方法(及其組合物)，該細胞包含降低激活磷酸化途徑的一個或多個基因表達的至少一個遺傳改變。在其他實施例中，當在由經(jīng)改變的革蘭氏陽性(子代)細菌細胞表達感興趣的蛋白質的條件下培養(yǎng)時，該經(jīng)改變的革蘭氏陽性細菌(子代)細胞(其包含降低激活磷酸化途徑的一個或多個基因的表達的至少一個遺傳改變)表達和/或產生增加的量的一種或多種poi。因此，當與在基本上相同培養(yǎng)條件下生長的對應的未經(jīng)改變的革蘭氏陽性細菌(親本)細胞中poi的表達和/或產生相比(即，相對于其)時，經(jīng)改變的革蘭氏陽性細菌(子代)細胞中相同的poi的表達和/或產生增加。

根據(jù)某些實施例，遺傳改變的革蘭氏陽性細菌細胞(或產生遺傳改變的革蘭氏陽性細菌細胞的親本細胞)是芽孢桿菌屬成員的細胞。在一些實施例中，芽孢桿菌屬細胞是嗜堿芽孢桿菌屬細胞。許多嗜堿芽孢桿菌屬細胞是本領域已知的(參見例如，美國專利5,217,878；和aunstrupetal.,procivifs:ferment.technol.today,299-305[1972][aunstrup等人，procivifs：當今發(fā)酵技術，299-305[1972]])。在一些實施例中，該芽孢桿菌屬細胞是工業(yè)相關的芽孢桿菌屬細胞。工業(yè)芽孢桿菌屬細胞的實例包括但不限于地衣芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、和解淀粉芽孢桿菌。在另外的實施例中，芽孢桿菌屬細胞選自下組，該組由以下各項組成：地衣芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、嗜堿芽孢桿菌、凝結芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、或蘇云金芽孢桿菌、以及芽孢桿菌屬內的其他生物體，如以上所討論的。在具體實施例中，使用枯草芽孢桿菌細胞。例如，美國專利5,264,366和4,760,025(re34,606)描述了可用于本發(fā)明的各種芽孢桿菌屬宿主細胞，盡管其他合適的細胞也被考慮用于本發(fā)明。

如本文所述的遺傳改變的革蘭氏陽性細胞的親代細胞(例如，親本芽孢桿菌屬細胞)是重組革蘭氏陽性細胞，其中編碼poi的異源多核苷酸已被引入細胞。雖然引入編碼poi的多核苷酸可以在親本細胞中進行，但是該步驟也可以在已經(jīng)被遺傳改變的細胞中進行以增加多肽產生，如本文所詳述的。在一些實施例中，宿主細胞是枯草芽孢桿菌宿主菌株，例如重組枯草芽孢桿菌宿主菌株。

已知許多枯草芽孢桿菌菌株可用于本發(fā)明的方面，包括但不限于例如1a6(atcc39085)、168(1a01)、sb19、w23、ts85、b637、pb1753至pb1758、pb3360、jh642、1a243(atcc39,087)、atcc21332、atcc6051、mi113、de100(atcc39,094)、gx4931、pbt110、和pep211菌株(參見例如，hochetal.,genetics,73:215-228[1973][hoch等人，遺傳學，73:215-228[1973]]；美國專利號4,450,235；美國專利號4,302,544；和ep0134048)。palva等人以及其他人進一步描述了使用枯草芽孢桿菌作為表達宿主(參見，palvaetal.,gene19:81-87[1982][palva等人，基因，19:81-87[1982]]；還參見fahnestockandfischer,j.bacteriol.,165:796-804[1986][fahnestock和fischer，細菌學雜志，165:796-804[1986]]；以及wangetal.,gene69:39-47[1988][wang等人，基因，69:39-47[1988]])。

在某些實施例中，產生工業(yè)蛋白酶的芽孢桿菌屬菌株可用作親本表達宿主。在一些實施例中，本發(fā)明中這些菌株的使用進一步提高了效率和蛋白酶生產。兩種一般類型的蛋白酶通常由芽孢桿菌屬物種分泌，即中性(或“金屬蛋白酶”)和堿性(或“絲氨酸”)蛋白酶。絲氨酸蛋白酶是催化肽鍵的水解的酶，其中在活性位點存在必需的絲氨酸殘基。絲氨酸蛋白酶具有在25,000至30,000范圍內的分子量(參見，priest,bacteriol.rev.,41:711-753[1977][priest，細菌學評論，41:711-753[1977]])?？莶輻U菌蛋白酶是用于本發(fā)明的絲氨酸蛋白酶。已經(jīng)鑒定并測序了多種枯草芽孢桿菌蛋白酶，例如枯草桿菌蛋白酶168，枯草桿菌蛋白酶bpn’，枯草桿菌蛋白酶carlsberg，枯草桿菌蛋白酶dy，枯草桿菌蛋白酶147和枯草桿菌蛋白酶309(參見，例如，ep414279b；wo89/06279；和stahletal.,j.bacteriol.,159:811-818[1984][stahl等人，細菌學雜志，159:811-818[1984]])。在本發(fā)明的一些實施例中，芽孢桿菌宿主菌株產生突變體(例如，變體)蛋白酶。許多參考文獻提供了變體蛋白酶的實例(參見例如，wo99/20770；wo99/20726；wo99/20769；wo89/06279；re34,606；美國專利號4,914,031；美國專利號4,980,288；美國專利號5,208,158；美國專利號5,310,675；美國專利號5,336,611；美國專利號5,399,283；美國專利號5,441,882；美國專利號5,482,849；美國專利號5,631,217；美國專利號5,665,587；美國專利號5,700,676；美國專利號5,741,694；美國專利號5,858,757；美國專利號5,880,080；美國專利號6,197,567；和美國專利號6,218,165)。

這里注意到，本發(fā)明不限于作為感興趣的蛋白質的蛋白酶。實際上，本披露涵蓋了多種感興趣的蛋白質，針對它們而言在革蘭氏陽性細胞中的增加的表達是所希望的(詳述如下)。

在其他實施例中，用于本發(fā)明方面的革蘭氏陽性細菌細胞可能在提供有益表型的其他基因中具有額外的遺傳改變。例如，可以使用包括以下基因中的至少一個的突變或缺失的芽孢桿菌屬細胞：degu、degs、degr和degq。在一些實施例中，突變?yōu)閐egu基因，例如degu(hy)32突變。(參見，msadeketal.,j.bacteriol.,172:824-834[1990][msadek等人，細菌學雜志，172:824-834[1990]]；和olmosetal.,mol.gen.genet.,253:562-567[1997][olmos等人，分子遺傳和基因組學，253:562-567[1997]])。因此，可用于本發(fā)明的方面的親本/遺傳改變的革蘭氏陽性細胞的一個實例是攜帶degu32(hy)突變的枯草芽孢桿菌細胞。在另一個實施例中，芽孢桿菌屬宿主可以包括在以下各項中的突變或缺失：scoc4(參見，caldwelletal.,j.bacteriol.,183:7329-7340[2001][caldwell等人，細菌學雜志，183:7329-7340[2001]])；spoiie(參見，arigonietal.,mol.microbiol.,31:1407-1415[1999][arigoni等人，分子微生物學，31:1407-1415[1999]])；oppa或opp操縱子的其他基因(參見，peregoetal.,mol.microbiol.,5:173-185[1991][perego等人，分子微生物學，5:173-185[1991]])。實際上，預期引起與oppa基因突變相同的表型的opp操縱子中的任何突變將可用于本發(fā)明的經(jīng)改變的芽孢桿菌屬細胞的一些實施例中。在一些實施例中，這些突變單獨發(fā)生，而在其他實施例中，存在突變的組合。在一些實施例中，本發(fā)明的改變的芽孢桿菌獲得自已經(jīng)包括對一種或多種上述基因的突變的親本芽孢桿菌宿主菌株。在替代實施例中，將本發(fā)明的前述經(jīng)遺傳改變的芽孢桿菌進一步工程化以包括上述基因中的一個或多個的突變。

如上所述，與親本細胞(在基本相同的條件下生長的)相比，在遺傳改變的革蘭氏陽性細胞中降低了激活磷酸化途徑的至少一個基因的表達。表達的這種降低能以任何方便的方式實現(xiàn)，并且可以是在轉錄、mrna穩(wěn)定性、翻譯的水平上，或者可能是由于從此類基因產生的一種或多種多肽中存在降低其活性的變異導致的(即，它是基于多肽的活性的、表達的“功能性”降低)。因此，不意圖限制遺傳改變的類型或誘導孢子形成起始基因表達的至少一個基因表達的方式。例如，在一些實施例中，革蘭氏陽性細胞中的遺傳改變是改變感興趣的基因的一個或多個啟動子的遺傳改變，這導致轉錄活性降低。

在某些實施例中，與對應的未經(jīng)改變的革蘭氏陽性細菌細胞相比，遺傳改變導致在經(jīng)改變的革蘭氏陽性細菌細胞中kina、phra、和phre基因中一個或多個的表達水平的降低。因此，該遺傳改變可導致kina、phra、和phre基因中任一個；kina、phra、和phre基因中任兩個；或kina、phra、和phre基因中所有三個的表達水平的降低。在其他實施例中，與對應的未經(jīng)改變的革蘭氏陽性細菌細胞相比，遺傳改變導致在經(jīng)改變的革蘭氏陽性細菌細胞中kina、phra、和phre蛋白中一種或多種的活性的降低。因此，該遺傳改變可導致kina、phra、和phre蛋白中任一種；kina、phra、和phre蛋白中任兩種；或kina、phra、和phre蛋白中所有三種的活性的降低。

在某些實施例中，在磷酸化途徑中用于激活孢子形成起始基因表達的基因的表達在遺傳改變的革蘭氏陽性細胞中降低至在基本相同培養(yǎng)條件下培養(yǎng)的野生型和/或親本細胞中表達水平的約3％，包括約4％、約5％、約6％、約7％、約8％、約9％、約10％、約11％、約12％、約13％、約14％、約15％、約16％、約17％、約18％、約19％、約20％、約21％、約22％、約23％、約24％、約25％、約26％、約27％、約28％、約29％、約30％、約35％、約40％、約45％、約50％、約55％、約60％、約65％、約70％、約75％、或約80％。因此，誘導孢子形成起始基因表達的一個或多個基因表達的降低范圍可以從約3％至約80％、從約4％至約75％、從約5％至約70％、從約6％至約65％、從約7％至約60％、從約8％至約50％、從約9％至約45％、從約10％至約40％、從約11％至約35％、從約12％至約30％、從約13％至約25％、從約14％至約20％等。預期了在上述范圍內的表達的任何子范圍。

在某些實施例中，與在基本上相同的培養(yǎng)條件下生長的對應的未經(jīng)改變的革蘭氏陽性細菌細胞中這些基因的表達相比，該經(jīng)改變的革蘭氏陽性細菌細胞降低了kina、phra和phre基因中任何一個、兩個或三個的表達。

在某些實施例中，遺傳改變(或突變)是降低kina基因表達的遺傳改變。親本革蘭氏陽性細胞中的kina基因(即，在如本文所述進行遺傳改變之前)是與seqidno:1具有至少60％同一性的基因，包括與seqidno:1具有至少約65％、至少約70％、至少約75％、至少約80％、至少約85％、至少約90％、至少約91％、至少約92％、至少約93％、至少約94％、至少約95％、至少約96％、至少約97％、至少約98％、至少約99％、或100％同一性。在某些實施例中，遺傳改變是kina基因全部或部分的缺失。

在某些實施例中，遺傳改變(或突變)是降低phra基因表達的遺傳改變(或突變)。親本革蘭氏陽性細胞中的phra基因(即，在如本文所述進行遺傳改變之前)是與seqidno:6具有至少60％同一性的基因，包括與seqidno:6具有至少約65％、至少約70％、至少約75％、至少約80％、至少約85％、至少約90％、至少約91％、至少約92％、至少約93％、至少約94％、至少約95％、至少約96％、至少約97％、至少約98％、至少約99％、或100％同一性。在某些實施例中，遺傳改變是phra基因全部或部分的缺失。

在某些實施例中，遺傳改變(或突變)是降低phre基因表達的遺傳改變(或突變)。親本革蘭氏陽性細胞中的phre基因(即，在如本文所述進行遺傳改變之前)是與seqidno:8具有至少60％同一性的基因，包括與seqidno:8具有至少約65％、至少約70％、至少約75％、至少約80％、至少約85％、至少約90％、至少約91％、至少約92％、至少約93％、至少約94％、至少約95％、至少約96％、至少約97％、至少約98％、至少約99％、或100％同一性。在某些實施例中，遺傳改變是phre基因全部或部分的缺失。

在某些實施例中，與在基本上相同的培養(yǎng)條件下生長的對應的未經(jīng)改變的革蘭氏陽性細菌細胞中這些基因的表達相比，該經(jīng)改變的革蘭氏陽性細菌細胞降低了kina、phra和phre基因中任何一個、兩個或三個的表達。

在某些實施例中，遺傳改變(或突變)是降低kina蛋白的活性的遺傳改變(或突變)，例如，變體kina蛋白(例如，與野生型序列相比，具有一個或多個氨基酸的缺失、插入或取代)。變體kina蛋白可以包含與seqidno:2具有至少約80％、至少約85％、至少約90％、至少約91％、至少約92％、至少約93％、至少約94％、至少約95％、至少約96％、至少約97％、至少約98％、或至少約99％同一性的氨基酸序列。

在某些實施例中，遺傳改變(或突變)是降低phra蛋白的活性的遺傳改變(或突變)，例如，變體phra蛋白(例如，與野生型序列相比，具有一個或多個氨基酸的缺失、插入或取代)。變體phra蛋白可以包含與seqidno:7具有至少約80％、至少約85％、至少約90％、至少約91％、至少約92％、至少約93％、至少約94％、至少約95％、至少約96％、至少約97％、至少約98％、或至少約99％同一性的氨基酸序列。

在某些實施例中，遺傳改變(或突變)是降低phre蛋白的活性的遺傳改變(或突變)，例如，變體phre蛋白(例如，與野生型序列相比，具有一個或多個氨基酸的缺失、插入或取代)。變體phre蛋白可以包含與seqidno:9具有至少約80％、至少約85％、至少約90％、至少約91％、至少約92％、至少約93％、至少約94％、至少約95％、至少約96％、至少約97％、至少約98％、或至少約99％同一性的氨基酸序列。

如上所述，許多不同的蛋白質可用作革蘭氏陽性細胞中的poi(即，其表達在遺傳改變的細胞中增加的蛋白質)。poi可以是同源蛋白質或異源蛋白質，并且可以是野生型蛋白質、天然變體或重組變體。在某些實施例中，該poi是酶，其中在某些實施例中，該酶選自乙酰酯酶、氨肽酶、淀粉酶、阿拉伯糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維素酶、幾丁質酶、凝乳酶、角質酶、脫氧核糖核酸酶、差向異構酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、α-葡聚糖酶、葡聚糖裂解酶、內切-β-葡聚糖酶、葡糖淀粉酶、葡萄糖氧化酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、葡萄糖醛酸酶、半纖維素酶、己糖氧化酶、水解酶、轉化酶、異構酶、漆酶、脂肪酶、裂解酶、甘露糖苷酶、氧化酶、氧化還原酶、果膠酸裂解酶、果膠乙酰酯酶、果膠解聚酶、果膠甲酯酶、果膠分解酶、過水解酶、多元醇氧化酶、過氧化物酶、酚氧化酶、植酸酶、聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶、鼠李糖-半乳糖醛酸酶、核糖核酸酶、轉移酶、轉運蛋白、轉谷氨酰胺酶、木聚糖酶、己糖氧化酶、及其組合。

在某些其他實施例中，該poi是蛋白酶，其中該蛋白酶可以是枯草桿菌蛋白酶，例如選自以下各項的枯草桿菌蛋白酶：枯草桿菌蛋白酶168、枯草桿菌蛋白酶bpn’、枯草桿菌蛋白酶carlsberg、枯草桿菌蛋白酶dy、枯草桿菌蛋白酶147、枯草桿菌蛋白酶309、及其變體。在某些實施例中，該poi是熒光蛋白，例如，綠色熒光蛋白(gfp)。

在某些實施例中，其方法和組合物進一步包括回收感興趣的蛋白質。因為在遺傳改變的革蘭氏陽性(子代)細胞中，感興趣的蛋白質的表達/產生水平增加(與未經(jīng)改變的親本細胞相比)，當在基本相同的培養(yǎng)條件(和相同的規(guī)模)下培養(yǎng)時，回收的poi量相對于對應的革蘭氏陽性(親代)細胞是增加的。本領域普通技術人員已知有用于檢測和測量細胞內和細胞外所表達的多肽的表達水平/產生的各種測定。這些測定由本發(fā)明的用戶確定，并且可以取決于poi的同一性和/或活性(例如酶活性)而變化。例如，為了測定蛋白酶，存在基于從酪蛋白或血紅蛋白的酸溶性肽的釋放的測定，該釋放以280nm的吸光度或使用folin方法經(jīng)比色法進行測量(參見例如，bergmeyeretal.,“methodsofenzymaticanalysis”vol.5,peptidases,proteinasesandtheirinhibitors,verlagchemie,weinheim[1984][bergmeyer等人，“酶分析方法”，第5卷，肽酶，蛋白酶及其抑制劑，化學出版社，魏因海姆[1984]])。其他測定涉及顯色底物的溶解(參見例如，ward,“proteinases,”infogarty(ed.).,microbialenzymesandbiotechnology,appliedscience,london,[1983],pp251-317[ward，“蛋白酶”，在：福格蒂(編輯)，微生物酶與生物技術，應用科學出版社，倫敦[1983]，第251-317頁])。測定的其他實例包括但不限于琥珀酰-ala-ala-pro-phe-對硝基苯胺測定(saapfpna)和2,4,6-三硝基苯磺酸鈉鹽測定(tnbs測定)。許多本領域技術人員已知的附加參考文獻提供了合適的方法(參見，例如，wellsetal.,nucleicacidsres.11:7911-7925[1983]；christiansonetal.,anal.biochem.,223:119-129[1994]；andhsiaetal.,analbiochem.,242:221-227[1999][wells等人，核酸研究，11:7911-7925[1983]；christianson等人，分析生物化學，223:119-129[1994]；以及hsia等人，分析生物化學，242:221-227[1999]])。

同樣如上所述，用于確定poi在宿主細胞中的分泌水平并檢測所表達的蛋白質的手段包括對感興趣的蛋白質具有特異性的多克隆或單克隆抗體的免疫測定的使用。實例包括酶聯(lián)免疫吸附測定(elisa)、放射免疫測定(ria)、熒光免疫測定(fia)以及熒光激活細胞分選術(facs)。然而，其他方法是本領域技術人員已知的，并且可用于評估感興趣的蛋白質(參見例如，hamptonetal.,serologicalmethods,alaboratorymanual,apspress,st.paul,mn[1990]；andmaddoxetal.,j.exp.med.,158:1211[1983][hampton等人，血清學方法，實驗室手冊，aps出版社，圣保羅，明尼蘇達州[1990]；和maddox等人，實驗醫(yī)學雜志，158:1211[1983]])。如本領域已知的，將使用本發(fā)明產生的經(jīng)改變的芽孢桿菌屬細胞在適于從細胞培養(yǎng)物中表達和回收poi的條件下維持和生長(參見例如，hardwoodandcutting(eds.)molecularbiologicalmethodsforbacillus,johnwiley&sons[1990][hardwood和cutting(編輯)芽孢桿菌屬的分子生物學方法，約翰威利父子公司[1990]])。進一步注意到，如本文所述的遺傳改變的細胞可以表達多于一種poi，包括兩種或更多種、三種或更多種、四種或更多種、五種或更多種、六種或更多種、七種或更多種、八種或更多種、九種或更多種、十種或更多種等。在一些實施例中，需要在細菌分泌物中增加蛋白質的表達，其包括從細胞分泌的許多不同的蛋白質。

本發(fā)明的方面包括用于獲得具有改進的蛋白質生產能力的經(jīng)改變的革蘭氏陽性細菌細胞的方法。通常，這些方法包括遺傳改變親本革蘭氏陽性細胞以產生遺傳改變的子代革蘭氏陽性細胞，其中激活磷酸化系統(tǒng)的一個或多個基因的表達(如上所述)。

在某些實施例中，該方法包括將多核苷酸序列引入親本革蘭氏陽性細菌細胞中，當整合到染色體中或作為附加體遺傳元件維持時，該方法產生遺傳改變的革蘭氏陽性細胞，在該細胞中激活磷酸化系統(tǒng)的一個或多個基因的表達水平降低。

已知使用本領域技術人員熟知的多核苷酸載體(例如，質粒構建體)來轉化芽孢桿菌屬物種，以改變染色體或維持芽孢桿菌屬細胞中的附加型遺傳元件的各種方法。用于將多核苷酸序列引入芽孢桿菌屬細胞的合適方法見于例如ferrarietal.,“genetics,”inharwoodetal.(ed.),bacillus,plenumpublishingcorp.[1989],pages57-72[ferrari等人，“遺傳學,”在：harwood等人(編輯)，芽孢桿菌屬，plenum出版公司，[1989]，第57-72頁]中；還參見，saundersetal.,j.bacteriol.,157:718-726[1984]；hochetal.,j.bacteriol.,93:1925-1937[1967]；mannetal.,currentmicrobiol.,13:131-135[1986]；andholubova,foliamicrobiol.,30:97[1985][saunders等人，細菌學雜志，157:718-726[1984]；hoch等人，細菌學雜志，93:1925-1937[1967]；mann等人，當代微生物學，13:131-135[1986]；和holubova，微生物學大觀，30:97[1985]]；針對解淀粉芽孢桿菌，changetal.,mol.gen.genet.,168:11-115[1979][chang等人，分子遺傳學與基因組學，168:11-115[1979]]；針對巨大芽孢桿菌，vorobjevaetal.,femsmicrobiol.lett.,7:261-263[1980][vorobjeva等人，fems微生物學快報，7:261-263[1980]]；針對解淀粉芽孢桿菌，smithetal.,appl.env.microbiol.,51:634(1986)[smith等人，應用與環(huán)境微生物學，51:634(1986)]；針對蘇云金芽孢桿菌，fisheretal.,arch.microbiol.,139:213-217[1981][fisher等人，微生物學文獻集，139:213-217[1981]]；以及針對球形芽孢桿菌，mcdonald,j.gen.microbiol.,130:203[1984][mcdonald，普通微生物學雜志，130:203[1984]]。實際上，包括原生質體轉化和中板集合、轉導、和原生質體融合在內的轉化方法是已知的并且適合用于本發(fā)明。轉化方法具體是將本發(fā)明提供的dna構建體引入宿主細胞。

此外，將dna構建體引入宿主細胞包含本領域已知的將dna插入宿主細胞而不將靶向dna構建體插入質?；蜉d體中的物理和化學方法。此類方法包括但不限于氯化鈣沉淀、電穿孔、裸dna、脂質體等。在另外的實施例中，dna構建體可以與質粒一起共轉化而不插入該質粒中。

在可選擇的標志物基因用于選擇穩(wěn)定轉化體的實施例中，可能需要使用任何方便的方法從遺傳改變的革蘭氏陽性菌株中刪除可選擇的標志物，其中許多方法是本領域已知的(參見，stahletal.,j.bacteriol.,158:411-418[1984]；andpalmerosetal.,gene247:255-264[2000][stahl等人，細菌學期刊，158:411-418[1984]；和palmeros等人，基因，247:255-264[2000]])。

在一些實施例中，將兩個或更多個dna構建體(即，各自被設計用于遺傳改變宿主細胞的dna構建體)引入親本革蘭氏陽性細胞中，導致在細胞中引入兩個或更多個遺傳改變，例如，在兩個或更多個染色體區(qū)域的改變。在一些實施例中，這些區(qū)域是連續(xù)的(例如，在單個操縱子內的兩個區(qū)域)，而在其他實施例中，這些區(qū)域是分開的。在一些實施例中，一種或多種遺傳改變是通過添加附加型遺傳元件實現(xiàn)的。

在一些實施例中，用根據(jù)本發(fā)明的一種或多種dna構建體轉化宿主細胞以產生改變的芽孢桿菌菌株，其中兩個或更多個基因已經(jīng)在宿主細胞中失活。在一些實施例中，從宿主細胞染色體中缺失兩個或更多個基因。在替代實施例中，通過插入dna構建體使兩個或更多個基因失活。在一些實施例中，滅活的基因是連續(xù)的(無論通過缺失和/或插入失活)，而在其他實施例中，它們不是連續(xù)的基因。

一旦產生遺傳改變的宿主細胞，就可以將其在表達感興趣的蛋白質的條件下培養(yǎng)，其中在某些實施例中回收該poi。

在一些實施例中，本發(fā)明包括dna構建體，該dna構建體包含進入序列，當穩(wěn)定并入宿主細胞時，該進入序列遺傳改變該細胞，這樣使得降低了激活誘導孢子形成起始基因表達的磷酸化系統(tǒng)的一個或多個基因的表達降低(如上文詳細描述的)。在一些實施例中，將dna構建體在體外組裝，然后將構建體直接克隆到感受態(tài)革蘭氏陽性(例如芽孢桿菌屬)宿主中，這樣使得dna構建體整合入宿主細胞染色體中。例如，可以采用pcr融合和/或連接以在體外組裝dna構建體。在一些實施例中，dna構建體是非質粒構建體，而在其他實施例中，其被并入載體(例如，質粒)中。在一些實施例中，使用環(huán)狀質粒。在實施例中，環(huán)狀質粒被設計為使用適當?shù)南拗泼?即，不破壞dna構建體的限制酶)。因此，線性質?？捎糜诒景l(fā)明。然而，如本領域技術人員已知的，其他方法適用于本發(fā)明(參見，例如，perego,“integrationalvectorsforgeneticmanipulationinbacillussubtilis,”in(sonensheinetal.(eds.),bacillussubtilisandothergram-positivebacteria,americansocietyformicrobiology,washington,dc[1993][perego，“枯草芽孢桿菌遺傳操作的整合載體”，在：(sonenshein等人(編輯)，枯草芽孢桿菌和其他革蘭氏陽性菌，美國微生物學會，華盛頓，哥倫比亞特區(qū)[1993]中])。

在某些實施例中，設計dna靶向載體以使全部或部分kina基因、phra基因、或phre基因缺失(或允許其缺失)。在某些實施例中，同時或依次使用多個dna構建體來使kina基因、phra基因、和phre基因中的任何兩個或三個缺失。在某些實施例中，dna靶向載體包括選擇性標志物。在一些實施例中，選擇性標志物位于兩個loxp位點之間(參見，kuhnandtorres,meth.mol.biol.,180:175-204[2002][kuhn和torres，分子生物學方法，180:175-204[2002]])，并且然后通過cre蛋白的作用來使抗微生物基因缺失。

本發(fā)明的方面包括用于增強poi在革蘭氏陽性細菌細胞中的表達的方法，該方法包括用上述dna構建體或載體(即，包括進入序列的dna構建體或載體，當穩(wěn)定并入宿主細胞時，遺傳上改變該細胞，這樣使得磷酸化途徑的一個或多個基因的表達降低)，允許載體和親本革蘭氏陽性細菌細胞的感興趣基因中的相應區(qū)域的同源重組以產生經(jīng)改變的革蘭氏陽性細菌細胞；并在適于表達poi的條件下生長經(jīng)改變的革蘭氏陽性細菌細胞，其中與革蘭氏陽性細菌(親本)細胞相比，經(jīng)改變的革蘭氏陽性細菌(子代)細胞中poi的產生增加。上文詳細描述了可用于本發(fā)明的這個方面的革蘭氏陽性細胞、突變和其他特征的實例。

無論dna構建體是否并入到載體中或者在質粒dna的不存在下使用，將其用于轉化微生物。預期，任何合適的轉化方法將用于本發(fā)明。在某些實施例中，將dna構建體的至少一個拷貝整合到宿主芽孢桿菌染色體中。在一些實施例中，使用本發(fā)明的一種或多種dna構建體轉化宿主細胞。

通過參考以下實例，本領域技術人員可以更充分地理解實施本發(fā)明的方式和方法，這些實例不旨在以任何方式限制本發(fā)明或涉及其的權利要求的范圍。

實例

提供以下實例以便證實和進一步說明本發(fā)明的某些實施例和方面，而不應被解釋為限制其范圍。

在下面的實驗披露中，應用以下縮寫中的某些：℃(攝氏度)；rpm(每分鐘轉數(shù))；μg(微克)；mg(毫克)；μl(微升)；ml(毫升)；mm(毫摩爾)；μm(微摩爾)；sec(秒)；min(s)(分鐘)；hr(s)(小時)；od280(在280nm下的光密度)；od600(在600nm下的光密度)；pcr(聚合酶鏈式反應)；rt-pcr(逆轉錄pcr)；sds(十二烷基硫酸鈉)。

實例1

在kina基因中通過缺失增加芽孢桿菌屬中的蛋白質表達

a.在枯草芽孢桿菌中kina基因座的缺失

通過使用kina缺失盒的同源重組將kina中的缺失引入親本枯草芽孢桿菌細胞中(圖1)。通過pcr和kina基因座的測序證實缺失。所得到的子代細胞由δkina和未經(jīng)改變的枯草芽孢桿菌細胞(本文稱為親本細胞)表示。seqidno:1顯示了kina基因的野生型序列，并且seqidno:2顯示了kina蛋白序列。

b.kina缺失菌株中的淀粉酶表達

將淀粉酶表達構建體引入δkina(子代細胞)和未經(jīng)改變的親本細胞的apre基因座，該淀粉酶表達構建體驅動來自apre啟動子的amye的表達，并且包括氯霉素乙酰轉移酶抗性(catr)標記基因(本文中為“papre-amyecatr”)。成熟的amye蛋白序列如seqidno:3所示。

在包含25μg/ml氯霉素的luria瓊脂平板上擴增細胞。將δkina(子代)細胞和親本細胞在5ml的luria肉湯培養(yǎng)基中生長過夜。使用一(1)ml預培養(yǎng)物接種在37℃，250rpm下的搖瓶中的25mlluria肉湯培養(yǎng)基以測試amye淀粉酶蛋白的表達。使用spectramax分光光度計在600nm下以每小時間隔測量細胞密度(分子器件公司，唐寧鎮(zhèn)，賓夕法尼亞州，美國)。將600nm下的吸光度作為時間的函數(shù)作圖，并且將結果示于圖2a中。例如，圖2a顯示親本細胞和δkina(子代)細胞的細胞生長是等效的，表明(子代)細胞中kina基因的缺失不影響細胞生長。

使用ceralpha試劑(梅格澤姆公司(megazyme)，威克洛，愛爾蘭)測量全發(fā)酵液的amye淀粉酶活性。首先將來自ceralphahr試劑盒的ceralpha試劑混合物溶解在10ml的milliq水中，隨后添加30ml的50mm蘋果酸鹽緩沖液(ph5.6)。將培養(yǎng)物上清液在milliq水中稀釋40倍，并將5μl的稀釋的樣品添加到55μl稀釋的工作底物溶液中。在震蕩后，將mtp板于室溫下孵育4分鐘。通過添加70μl的200mm硼酸鹽緩沖液(ph10.2)(終止溶液)來淬滅反應。使用spectramax分光光度計(分子器件公司，唐寧鎮(zhèn)，賓夕法尼亞州，美國)在400nm下測量溶液的吸光度。將400nm下的吸光度作為時間的函數(shù)作圖，并且將結果示于圖2b中。圖2b中的圖顯示出在經(jīng)改變的(δkina；子代)細胞中在生長6小時處開始的增加的amye生產。鑒于經(jīng)改變的(δkina；子代)細胞中細胞生長不受影響(如圖2a所示)，相對于未經(jīng)改變的(親本)芽孢桿菌細屬胞(在相同的培養(yǎng)條件下生長的)，經(jīng)改變的(δkina；子代)芽孢桿菌屬細胞中amye產生的增加不是由于培養(yǎng)物中細胞數(shù)量的增加，而是由于細胞本身的表達水平增加導致的(即，在逐個細胞的基礎上)。

c.kina缺失菌株中的蛋白酶(fna)表達

在包含fna表達盒(本文中稱為“papre-fna-catr”)的枯草芽孢桿菌細胞中測試kina缺失(δkina)對fna蛋白酶(包含y217l取代的枯草桿菌蛋白酶bpn’；seqidno:4)表達的影響。通過用圖1所示的構建體轉化菌株來使經(jīng)改變的枯草芽孢桿菌(子代)細胞中的kina基因缺失。在包含25μg/ml氯霉素的la平板上擴增攜帶缺失kina的壯觀霉素霉素抗性菌落。將親本枯草芽孢桿菌細胞和δkina敲除子代細胞在5ml的luria肉湯培養(yǎng)基中生長過夜。使用一(1)ml預培養(yǎng)物接種在250rpm下的thompson燒瓶中的25ml2xnb(描述于pct國際公開號wo2010/14483中的2x營養(yǎng)肉湯，1xsnb鹽)以測試蛋白酶表達。將全發(fā)酵液的細胞密度稀釋20倍，并使用spectramax分光光度計(分子器件公司，唐寧頓，賓夕法尼亞州，美國)在600nm下以每小時間隔進行測量。將600nm下的吸光度作為時間的函數(shù)作圖，并且將結果示于圖3a中，該圖3a顯示了表達fna的枯草芽孢桿菌親本細胞和表達fna的枯草芽孢桿菌子代細胞(即，δkina)的細胞生長是相等的，表明子代細胞中的kina缺失不影響細胞生長。

使用如pct國際公開號wo2010/144283中所述的n-suc-aapf-pna底物(來自西格瑪化學公司(sigmachemicalco.))監(jiān)測fna蛋白酶表達。簡言之，在測定緩沖液(100mmtris，0.005％tween80，ph8.6)中將全發(fā)酵液稀釋40倍，并且將10μl稀釋的樣品排列在微量滴定板中。將aapf原液在測定緩沖液(100mg/mlaapf儲備液，在dmso中，稀釋100倍)中稀釋，并將190μl該溶液添加到微量滴定板中，并使用spectramax分光光度計(分子器件公司，唐寧頓，賓夕法尼亞州，美國)在405nm下測量溶液的吸光度。將405nm下的吸光度作為時間的函數(shù)作圖，并且將結果示于圖3b中，該圖3b顯示了與在相同培養(yǎng)條件下生長的親本芽孢桿菌屬細胞的培養(yǎng)物相比，包含δkina缺失的子代芽孢桿菌屬細胞培養(yǎng)物中的fna產量增加。鑒于經(jīng)改變的(δkina)芽孢桿菌屬子代細胞中細胞生長不受影響(如圖3a所示)，相對于未經(jīng)改變的親本芽孢桿菌屬細胞(在相同的培養(yǎng)條件下生長的)，芽孢桿菌屬(δkina)子代細胞中fna產生的增加不是由于培養(yǎng)物中細胞數(shù)量的增加，而是由于經(jīng)改變的細胞本身的表達水平的增加(即，在逐個細胞的基礎上)。

d.在kina缺失菌株中的綠色熒光蛋白(gfp)表達

為了測試kina缺失對其他蛋白質表達的影響，將在apre啟動子控制下的并且進一步包含氯霉素乙酰轉移酶抗性標志物(seqidno:5顯示了gfp的氨基酸序列)的gfp表達盒(本文中稱為“papre-gfpcatr”)引入未經(jīng)改變的枯草芽孢桿菌親本細胞和經(jīng)改變的(δkina)枯草芽孢桿菌子代細胞的apre基因座。在包含5μg/ml氯霉素的luria瓊脂平板上選擇轉化體。表達gfp的經(jīng)改變的枯草芽孢桿菌(δkina)子代細胞和表達gfp的未經(jīng)改變的枯草芽孢桿菌親本細胞在5ml的luria肉湯中生長過夜。使用一(1)ml預培養(yǎng)物接種在37℃，250rpm下的搖瓶中的25ml的2xnb培養(yǎng)基(2x營養(yǎng)肉湯，1xsnb鹽)中以測試綠色熒光蛋白(gfp)的表達。使用spectramax分光光度計在600nm下以每小時間隔測量稀釋20倍的全肉湯的細胞密度(分子器件公司(moleculardevices)，唐寧鎮(zhèn)，賓夕法尼亞州，美國)。將600nm下的吸光度作為時間的函數(shù)作圖，并且將結果示于圖4a中，該圖4a顯示了與表達gfp的枯草芽孢桿菌(δkina)子代細胞相比，表達gfp的枯草芽孢桿菌親本細胞的細胞生長降低了，表明這些表達gfp的細胞中的kina缺失對細胞生長有積極的影響。

為了測量gfp表達，將100μl培養(yǎng)物轉移到96孔微量滴定板中，并在熒光板讀數(shù)器中使用485nm的激發(fā)波長，508nm的發(fā)射波長用495nm發(fā)射截止濾光片測量gfp表達。將485/508nm下的相對熒光單位(rfu)作為時間的函數(shù)作圖，并且將結果示于圖4b中。該圖顯示由于kina缺失導致的6小時生長的gfp生成的增加。與未經(jīng)改變的枯草芽孢桿菌親本細胞相比，經(jīng)改變的枯草芽孢桿菌(δkina)子代細胞中增加的gfp表達水平超過了僅從圖4a中所見的細胞活力的改進的預期。

實例2

通過phra和phre基因的缺失增加芽孢桿菌屬中的蛋白質表達

a.在枯草芽孢桿菌中phra基因座的缺失

將phra基因中的缺失通過圖6中示意性示出的缺失盒的同源重組引入親本枯草芽孢桿菌細胞中。通過pcr和phra基因座測序證實phra缺失(δphra)。使用編碼cre重組酶的質粒除去壯觀霉素標志物(specr)。

b.在經(jīng)改變的(δphra)芽孢桿菌屬細胞中phre基因座的缺失

在實例2中，還缺失了phre基因。通過圖7中示意性示出的缺失盒的同源重組所描述的經(jīng)改變的(δphra)枯草芽孢桿菌子代細胞。通過pcr和phre基因座測序證實phre缺失。

c.經(jīng)改變的(δphra/δphre)芽孢桿菌屬細胞中的蛋白質表達

將前文在實施例1中描述的表達盒(即，“papre-fnacatr”盒、“papre-gfpcatr”盒或“papre-amyecatr”盒)引入到未經(jīng)改變的(親代)枯草芽孢桿菌細胞和經(jīng)改變的(δphra/δphre)枯草芽孢桿菌細胞的染色體中。如實例1所述進行菌株選擇、細胞生長、和酶測定。在氯霉素25ppm平板上選擇包含“paper-fancar”盒的枯草芽孢桿菌細胞。在氯霉素5ppm平板上選擇包含“paper-gfpcar”盒或“paper-amyecar”盒的枯草芽孢桿菌細胞。如實例1所述測量細胞密度和蛋白質表達。

圖8a顯示了表達gfp的親本枯草芽孢桿菌細胞和表達gfp的子代(δphra/δphre)枯草芽孢桿菌細胞的細胞生長是相等的，表明枯草芽孢桿菌(子代)細胞中的phra-phre缺失不影響細胞生長。圖8b顯示了由于phra-phre缺失導致的4小時生長的gfp產生的增加。

圖9a顯示了表達fna的親本枯草芽孢桿菌細胞和表達fna的子代(δphra/δphre)枯草芽孢桿菌細胞的細胞生長是相等的，表明枯草芽孢桿菌(子代)細胞中的phra-phre缺失不影響細胞生長。圖9b顯示了由于phra-phre缺失導致的4小時生長的fna產生的增加。

圖10a顯示了表達amye的親本枯草芽孢桿菌細胞和表達amye的子代(δphra/δphre)枯草芽孢桿菌細胞的細胞生長是相等的，表明枯草芽孢桿菌(子代)細胞中的phra-phre缺失不影響細胞生長。圖10b顯示了由于phra-phre缺失導致的amye產生的增加。

雖然前述組合物和方法已經(jīng)通過說明和實例的方式出于清楚理解的目的在一些細節(jié)方面進行了描述，但是對于本領域的普通技術人員而言根據(jù)本文的傳授內容顯而易見的是可以對其進行某些改變和修改而不偏離所附權利要求的精神或范圍。

因此，前面僅僅舉例說明了本發(fā)明組合物和方法的原理。將了解的是本領域技術人員將能夠設計不同的安排，這些不同的安排雖然沒有在此明確地描述或顯示，但體現(xiàn)本發(fā)明組合物和方法的原理并且被包括在其精神和范圍之內。此外，本文敘述的所有實例和條件性語言主要旨在幫助讀者理解諸位發(fā)明人所貢獻的本發(fā)明的組合物和方法的原理和概念以推動本領域發(fā)展，并且將被視為而不限于這些具體敘述的實例和條件。此外，本文中敘述本發(fā)明組合物和方法的原理、方面、以及實施例的所有陳述連同其具體實例旨在涵蓋其結構和功能等效物兩者。另外，預期此類等效物包括當前已知的等效物以及將來開發(fā)的等效物兩者，即不論結構如何而執(zhí)行相同功能的任何開發(fā)的要素。因此，本發(fā)明的組合物和方法的范圍不是旨在受限于本文顯示和描述的示例性實施例。

序列

seqidno:1-kina野生型編碼序列

gtggaacaggatacgcagcatgttaaaccacttcaaacaaaaaccgatattcatgcagtcttggcctctaatggacgcatcatttatatatctgccaactccaaactgcatttgggctatctccaaggagagatgatcggatcattcctcaaaacgtttctgcatgaggaagaccaatttttggttgaaagctatttttataatgaacatcatctgatgccgtgcacctttcgttttattaaaaaagatcatacgattgtgtgggtggaggctgcggtagaaattgttacgacaagagctgagcggacagaacgggaaatcattttgaaaatgaaggttcttgaagaagaaacaggccatcaatccctaaactgcgaaaaacatgaaatcgaacctgcaagcccggaatcgactacatatataacggatgattatgaacggttggttgaaaatctcccgagtccgctatgcatcagtgtcaaaggcaagatcgtctatgtaaacagcgcgatgctttcaatgctgggagccaaaagcaaggatgctattattggtaaatcgtcctatgaatttattgaagaagaatatcatgatatcgtgaaaaacaggattatacgaatgcaaaaaggaatggaagtcggaatgattgaacagacgtggaaaaggcttgatggcacacctgttcatttagaagtgaaagcatccccgaccgtctacaaaaaccagcaggctgagctgctgctgctgatcgatatctcttcaaggaaaaaattccaaaccatcctgcaaaaaagccgtgaacgatatcagctgctgattcaaaattccattgataccattgcggtgattcacaatggaaaatgggtatttatgaatgaatcgggaatttccctgtttgaagcggctacatatgaggatttaattggcaaaaacatatacgatcagctgcatccttgcgatcacgaggatgtaaaagagagaatccaaaacattgccgagcaaaaaacagaatctgaaattgtcaagcaatcctggttcacctttcagaacagggtcatctatacggagatggtctgcattccgacgaccttttttggtgaagcggccgtccaggtcattcttcgggacatctcagagagaaaacaaacagaagaattgatgctgaaatcggaaaaattatcaatcgcagggcagctcgcggcgggaatcgcccatgagatccgcaaccctcttacagcgatcaaaggatttttacagctgatgaaaccgacaatggaaggcaacgaacattactttgatattgtgttttctgaactcagccgtatcgaattaatactcagtgaactgctcatgctggcgaaacctcagcaaaatgctgtcaaagaatatttgaacttgaaaaaattaattggtgaggtttcagccctgttagaaacgcaggcgaatttaaatggcatttttatcagaacaagttatgaaaaagacagcatttatataaacggggatcaaaaccaattaaagcaggtattcattaatttaatcaaaaatgcagttgaatcaatgcctgatgggggaacagtagacattatcataaccgaagatgagcattctgttcatgttactgtcaaagacgaaggggaaggtatacctgaaaaggtactaaaccggattggagagccatttttaacaacaaaagaaaaaggtacggggcttggattaatggtgacatttaatatcattgaaaaccatcagggagttatacatgtggacagccatcctgaaaaaggcacagcgtttaaaatttcatttccaaaaaaataa

seqidno:2-kina蛋白序列

meqdtqhvkplqtktdihavlasngriiyisansklhlgylqgemigsflktflheedqflvesyfynehhlmpctfrfikkdhtivwveaaveivttraertereiilkmkvleeetghqslncekheiepaspesttyitddyerlvenlpsplcisvkgkivyvnsamlsmlgakskdaiigkssyefieeeyhdivknriirmqkgmevgmieqtwkrldgtpvhlevkasptvyknqqaellllidissrkkfqtilqksreryqlliqnsidtiavihngkwvfmnesgislfeaatyedligkniydqlhpcdhedvkeriqniaeqkteseivkqswftfqnrviytemvcipttffgeaavqvilrdiserkqteelmlkseklsiagqlaagiaheirnpltaikgflqlmkptmegnehyfdivfselsrielilsellmlakpqqnavkeylnlkkligevsalletqanlngifirtsyekdsiyingdqnqlkqvfinliknavesmpdggtvdiiitedehsvhvtvkdegegipekvlnrigepflttkekgtglglmvtfniienhqgvihvdshpekgtafkisfpkk

seqidno:3-amye蛋白序列

ltapsiksgtilhawnwsfntlkhnmkdihdagytaiqtspinqvkegnqgdksmsnwywlyqptsyqignrylgteqefkemcaaaeeygikvivdavinhttsdyaaisnevksipnwthgntqiknwsdrwdvtqnsllglydwntqntqvqsylkrfldralndgadgfrfdaakhielpddgsygsqfwpnitntsaefqygeilqdsasrdaayanymdvtasnyghsirsalknrnlgvsnishyasdvsadklvtwveshdtyanddeestwmsdddirlgwaviasrsgstplffsrpegggngvrfpgksqigdrgsalfedqaitavnrfhnvmagqpeelsnpngnnqifmnqrgshgvvlanagsssvsintatklpdgrydnkagagsfqvndgkltgtinarsvavlypd

seqidno:4-fna蛋白序列

agksngekkyivgfkqtmstmsaakkkdvisekggkvqkqfkyvdaasatlnekavkelkkdpsvayveedhvahayaqsvpygvsqikapalhsqgytgsnvkvavidsgidsshpdlkvaggasmvpsetnpfqdnnshgthvagtvaalnnsigvlgvapsaslyavkvlgadgsgqyswiingiewaiannmdvinmslggpsgsaalkaavdkavasgvvvvaaagnegtsgssstvgypgkypsviavgavdssnqrasfssvgpeldvmapgvsiqstlpgnkygalngtsmasphvagaaalilskhpnwtntqvrsslentttklgdsfyygkglinvqaaaq

seqidno:5-gfp蛋白序列

vnrnvlkntglkeimsakasvegivnnhvfsmegfgkgnvlfgnqlmqirvtkggplpfafdivsiafqygnrtftkypddiadyfvqsfpagffyernlrfedgaivdirsdisleddkfhykveyrgngfpsngpvmqkailgmepsfevvymnsgvlvgevdlvyklesgnyyschmktfyrskggvkefpeyhfihhrlektyveegsfveqhetaiaqlttigkplgslhewv

seqidno:6-phra野生型編碼序列

atgaaatctaaatggatgtcaggtttgttgctcgttgcggtcgggttcagctttactcaggtgatggttcatgcaggtgaaacagcaaacacagaagggaaaacatttcatattgcggcacgcaatcaaacatga

seqidno:7-phra蛋白序列

mkskwmsglllvavgfsftqvmvhagetantegktfhiaarnqt

seqidno:8-phre野生型編碼序列

atgaaatctaaattgtttatcagtttatccgccgttttaattggacttgcctttttcggatctatgtataatggcgaaatgaaggaagcatcccggaatgtaactctcgcacctactcatgaattccttgtttaa

seqidno:9-phre蛋白序列

mksklfislsavliglaffgsmyngemkeasrnvtlaptheflv