本發(fā)明涉及光敏藥物與光動力療法領(lǐng)域，具體的說涉及一類雙羧甲基四苯基二氫卟吩化合物及其制備方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
光動力療法(pdt)是一種治療腫瘤、視網(wǎng)膜黃斑變性、光化性角化病、鮮紅斑痣、尖銳濕疣等疾病的新方法。自20世紀(jì)70年代進(jìn)入臨床研究以來，pdt在臨床治療中已取得了令人矚目的成就，因其具有選擇性好、毒副作用小、可重復(fù)性好、安全、微創(chuàng)性、可協(xié)同性和相對低成本等優(yōu)點(diǎn)脫穎而出，顯示出巨大的潛力和強(qiáng)大的生命力。
光動力療法的原理是光敏劑進(jìn)入機(jī)體后，隨血液循環(huán)選擇性地聚集于靶組織中，然后利用一定波長的激光直接照射到腫瘤組織上，光敏劑吸收光子能量后由基態(tài)變成不穩(wěn)定的激發(fā)態(tài)，處于激發(fā)態(tài)的光敏劑與周圍分子發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生高氧化活性的自由基(如單線態(tài)氧)，作用于靶細(xì)胞，引起細(xì)胞代謝紊亂，殺傷靶細(xì)胞。
在光動力治療中，光敏藥物(也稱光敏劑或光動力藥物)作為能量的載體、反應(yīng)的橋梁而起著決定性的作用。第一代光敏劑是以1993年在荷蘭上市的第一個光敏劑photofrinii為代表，它是組成復(fù)雜的血卟啉衍生物的混合物，在紅光區(qū)的相對吸收較弱；第二代光敏劑以卟啉類衍生物為主，該類化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)明確、組成成分單一、紅光區(qū)的吸收較強(qiáng)、體內(nèi)停留時間短，因此具有開發(fā)成pdt藥物的巨大潛力。目前已經(jīng)上市的光動力藥物如替莫泊芬(temoporfin)，被廣泛的應(yīng)用于各種腫瘤疾病的治療中，取得了顯著的社會效益與經(jīng)濟(jì)效益，應(yīng)用前景十分可觀。但這些藥物尚存在某些缺點(diǎn)，如temoporfin易被氧化、穩(wěn)定性差、在水中溶解度差(chem.soc.rev.，1995，24(1)：19-33)，因此亟待研制結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、水溶性良好、療效好的新型光敏劑。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
有鑒于此，為了克服temoporfin等四苯基二氫卟吩類光敏劑穩(wěn)定性差、在水中溶解度差的缺陷，本發(fā)明對四苯基二氫卟吩類化合物結(jié)構(gòu)進(jìn)行了修飾改造，在付出大量創(chuàng)造性勞動后合成了新的雙羧甲基四苯基二氫卟吩化合物，完成了本發(fā)明。
本發(fā)明涉及一類雙羧甲基四苯基二氫卟吩化合物及其制備方法與應(yīng)用。
本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下：
雙羧甲基四苯基二氫卟吩化合物具有下述結(jié)構(gòu)(i)：
其中r1、r2處于苯環(huán)的鄰位(o-)或間位(m-)或?qū)ξ?p-)。
r1＝-h，-oh，-me，-ome，-nme2，-cooh，-f，-cl或-br。
r2＝-h，-oh，-me，-ome，-nme2，-cooh，-f，-cl或-br。
雙羧甲基四苯基二氫卟吩化合物的制備方法，包括如下步驟：
將卟啉化合物(ii)(其合成方法參照文獻(xiàn)eur.j.inorg.chem.2005，3857-3874)和氰基乙酸甲酯溶于有機(jī)溶劑，在堿性條件下加熱回流，將反應(yīng)液冷卻倒入水中，二氯甲烷萃取。有機(jī)相用無水硫酸鈉干燥，柱層析分離得到四苯基二氫卟吩類化合物(iii)。
上述制得的四苯基二氫卟吩類衍生物(iii)溶于有機(jī)溶劑中，在酸性條件下加熱回流，將反應(yīng)液倒入到冰水中，二氯甲烷萃取。有機(jī)相用無水硫酸鈉干燥，柱層析分離即得雙羧甲基四苯基二氫卟吩化合物(i)。
其中r1、r2處于苯環(huán)的鄰位(o-)或間位(m-)或?qū)ξ?p-)。
r1＝-h，-oh，-me，-ome，-nme2，-cooh，-f，-cl或-br。
r2＝-h，-oh，-me，-ome，-nme2，-cooh，-f，-cl或-br。
所述步驟中，式(ii)制備式(iii)時所用的有機(jī)溶劑是n，n-二甲基甲酰胺、1，4-二氧六環(huán)、二甲基亞砜、乙腈、丙酮、四氫呋喃、乙醚、甲基叔丁基醚、乙二醇二甲醚、乙二醇二乙醚、乙二醇二正丁醚等中的任意一種或任意多種的混合物。
所述步驟中，式(ii)制備式(iii)時所用的堿是二異丙基乙基胺、三乙胺、吡啶、鈉氫、碳酸鉀、碳酸鈉、碳酸氫鉀、碳酸氫鈉、磷酸氫鉀、磷酸氫鈉、氫氧化鉀、氫氧化鈉、氫氧化鋰、甲酸鈉、乙酸鈉、甲醇鈉、乙醇鈉、乙醇鉀、正丙醇鈉、正丙醇鉀、異丙醇鈉、異丙醇鉀、叔丁醇鉀、叔丁醇鈉等中的任意一種或任意多種的混合物；反應(yīng)時間為8～18h。
所述步驟中，式(ii)制備式(iii)時柱層析分離所用的填充劑為硅膠，洗脫液為二氯甲烷∶石油醚的混合溶液(1∶10～10∶1)。
所述步驟中，式(iii)制備式(i)時所用的有機(jī)溶劑是甲醇、乙醇、乙二醇、乙酸乙酯、丙酮、二氯甲烷、乙腈、四氫呋喃、乙醚、甲基叔丁基醚、乙二醇二甲醚、乙二醇二乙醚、乙二醇二正丁醚等中的任意一種或任意多種的混合物。
所述步驟中，式(iii)制備式(i)時所用的酸是鹽酸、硫酸、磷酸、甲酸、乙酸、丙酸、正丁酸、三氟乙酸等中的任意一種或任意多種的混合物。
所述步驟中，式(iii)制備式(i)時柱層析分離所用的填充劑為硅膠，洗脫液為二氯甲烷∶甲醇的混合溶液(100∶1～5∶1)。
本發(fā)明所述的雙羧甲基四苯基二氫卟吩化合物作為光動力藥物在腫瘤、視網(wǎng)膜黃斑變性、光化性角化病、鮮紅斑痣、尖銳濕疣等疾病中的用途。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
[實(shí)施例1]
1、2，3-二氫-2，3-二羧甲基-5，10，15，20-四苯基二氫卟吩的制備方法
在250ml的三口燒瓶中，加入碳酸鉀(3.4g，24.4mmol)和氰基乙酸甲酯(2.16ml，0.4mmol)以及100ml1，4-二氧六環(huán)，氮?dú)鈿夥障掠?0℃攪拌1h；然后加入2-硝基-5，10，15，20-四苯基卟吩(2g，3.04mmol)，加熱回流反應(yīng)約8h，薄層層析(tlc)監(jiān)測至反應(yīng)完全。待反應(yīng)液冷卻至室溫，加入1l水，用二氯甲烷(300ml×4)萃取水相，合并有機(jī)相，用飽和食鹽水(200ml×3)洗滌有機(jī)相三次，無水硫酸鈉干燥，過濾。將濾液減壓濃縮，對所得殘留物進(jìn)行柱層析(洗脫液為二氯甲烷∶石油醚＝1∶10)，得到紫紅色固體粉末2，3-二氫-2，3-二氰基甲基-5，10，15，20-四苯基二氫卟吩，產(chǎn)率約為30.3％。
在25ml的三口燒瓶中，加入2，3-二氫-2，3-二氰基甲基-5，10，15，20-四苯基卟吩(130mg，0.19mmol)，四氫呋喃4ml和鹽酸8ml，加熱回流攪拌約20h，薄層層析監(jiān)測至反應(yīng)完全。待反應(yīng)液冷卻至室溫，加入40ml二氯甲烷萃取。有機(jī)相用水(20ml×3)洗滌，飽和食鹽水(20ml×3)洗滌，無水硫酸鈉干燥，過濾。將濾液減壓濃縮，對所得殘留物進(jìn)行柱層析(洗脫液為甲醇∶二氯甲烷＝1∶10)，得到紫紅色固體粉末2，3-二氫-2，3-二羧甲基-5，10，15，20-四苯基二氫卟吩43.8mg，產(chǎn)率約為32％。
1hnmr(400mhz，dmso-d6)：612.25(s，2h)，8.59(d，j＝4.8hz，2h)，8.34(s，2h)，8.25(d，j＝7.2hz，4h)，8.15(d，j＝4.9hz，2h)，7.95(d，j＝7.2hz，2h)，7.90-7.67(m，14h)，4.90-4.80(m，2h)，2.60(d，j＝12.5hz，2h)，2.38(dd，j＝15.3，9.9hz，2h)，-1.71(s，2h).ms(esi)m/z：733.3[m+h]+。uv/visλmax(ch2cl2)nm：410，549，653。
2、對人食管癌細(xì)胞(eca-109)的光動力抗增殖實(shí)驗(yàn)
受試細(xì)胞：人食管癌細(xì)胞(eca-109)
受試藥物：2，3-二氫-2，3-二羧甲基-5，10，15，20-四苯基二氫卟吩(以下簡稱光敏劑1)，在無菌條件下將該藥物溶于最小量吐溫-80，用生理鹽水稀釋至0.2mg/ml溶液備用；替莫泊芬(上海先輝醫(yī)藥科技有限公司)，配制方法同光敏劑1。
光源：xd-650ab型激光器。
激光功率儀：sd2490型激光功率測量儀。
光動力抗腫瘤細(xì)胞增殖作用實(shí)驗(yàn)：
將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞用胰酶消化后，完全培養(yǎng)基重懸成細(xì)胞懸液，隨之將其接種于96孔板，每孔100μl，置于37℃5％co2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，24h后加入濃度不同的光敏劑；12h換成新鮮培養(yǎng)基，然后進(jìn)行光照(功率25mw/cm2、波長650nm、光劑量18j/cm2)；24h后進(jìn)行mtt檢測。培養(yǎng)終止前4h加入10μl5mg/ml的mtt，吸棄培養(yǎng)液后加100μldmso終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀570nm檢測od值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1，結(jié)果表明光敏劑1對人食管癌細(xì)胞(eca-109)有顯著的光動力抗增殖作用。
表1光敏劑1對人食管癌細(xì)胞(eca-109)增殖抑制作用
3、對裸鼠體內(nèi)人食管癌細(xì)胞(eca-109)移植瘤的光動力治療實(shí)驗(yàn)
受試動物：babl/c裸小鼠，平均體重15～20g(上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司)
受試藥物：2，3-二氫-2，3-二羧甲基-5，10，15，20-四苯基二氫卟吩(以下簡稱光敏劑1)，在無菌條件下將該藥物溶于最小量吐溫-80，用生理鹽水稀釋至0.2mg/ml溶液備用；替莫泊芬(上海先輝醫(yī)藥科技有限公司)，配制方法同光敏劑1。
光源：xd-650ab型激光器。
激光功率儀：sd2490型激光功率測量儀。
人食管癌細(xì)胞(eca-109)移植瘤光動力損傷實(shí)驗(yàn)：
無菌條件下于小鼠前胸部皮下接種eca-109細(xì)胞，待腫瘤長至直徑5～7mm時，選取生長良好、無潰瘍、具半球狀單一腫瘤的裸鼠，按同窩同性別隨機(jī)分組，每組8只，尾靜脈注射給藥，并以藥物溶劑作為空白對照，將替莫泊芬配成相同濃度溶液作為陽性對照，給藥后3h用功率密度為180mw/cm2的激光(波長650mm、光劑量100j/cm2)輻射腫瘤；光照后5天，處死小鼠，剝離腫瘤，稱瘤重，計算抑制率。
腫瘤抑制率％＝(c-t)/c×100％
式中，t：給藥組平均瘤重；c：對照組平均瘤重。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2，光敏劑1對腫瘤具有顯著的光動力抑制作用。
表2光敏劑1對腫瘤的抑制效果
*p＜0.05與空白對照
[實(shí)施例2]
1、2，3-二氫-2，3-二羧甲基-5，10，15，20-四(4-甲氧基苯基)二氫卟吩的制備方法
在250ml的三口燒瓶中，加入碳酸鉀(3.4g，24.4mmol)和氰基乙酸甲酯(2.16ml，0.4mmol)以及100ml1，4-二氧六環(huán)，氮?dú)鈿夥障掠?0℃攪拌約1h；然后加入2-硝基-5，10，15，20-四(4-甲氧基苯基)卟吩(2.37g，3.04mmol)，加熱回流反應(yīng)約8h，薄層層析監(jiān)測至反應(yīng)完全。待反應(yīng)液冷卻至室溫，加入1l水，用二氯甲烷(300ml×4)萃取水相，合并有機(jī)相。有機(jī)相用飽和食鹽水(200ml×3)洗滌，無水硫酸鈉干燥，過濾。將濾液減壓濃縮，對所得殘留物進(jìn)行柱層析(洗脫液為二氯甲烷∶石油醚＝1∶10)，得到紫紅色固體粉末2，3-二氫-2，3-二氰基甲基-5，10，15，20-四(4-甲氧基苯基)二氫卟吩，產(chǎn)率約為34.3％。
在25ml的三口燒瓶中，加入2，3-二氫-2，3-二氰基甲基-5，10，15，20-四(4-甲氧基苯基)二氫卟吩(155mg，0.19mmol)，四氫呋喃4ml和鹽酸8ml，加熱回流攪拌約20h，薄層層析監(jiān)測至反應(yīng)完全。待反應(yīng)液冷卻至室溫，加入40ml二氯甲烷萃取，有機(jī)相依次用水(20ml×3)洗滌，飽和食鹽水(20ml×3)洗滌，無水硫酸鈉干燥，過濾。將濾液減壓濃縮，對所得殘留物進(jìn)行柱層析(洗脫液為甲醇∶二氯甲烷＝1∶10)，得到紫紅色固體粉末2，3-二氫-2，3-二羧甲基-5，10，15，20-四(4-甲氧基苯基)二氫卟吩58.3mg，產(chǎn)率約為36％。
1hnmr(400mhz，dmso-d6)：612.23(s，2h)，8.57(d，j＝4.8hz，2h)，8.32(s，2h)，8.23(d，j＝7.2hz，4h)，8.11(d，j＝4.9hz，2h)，7.92(d，j＝7.2hz，2h)，7.89-7.64(m，14h)，4.88-4.76(m，2h)，4.53(s，12h)，2.58(d，j＝12.5hz，2h)，2.34(dd，j＝15.3，9.9hz，2h)，-1.69(s，2h)。ms(esi)m/z：853.3[m+h]+。uv/visλmax(ch2cl2)nm：411，552，656。
2、對人食管癌細(xì)胞(eca-109)的光動力抗增殖實(shí)驗(yàn)
受試細(xì)胞：人食管癌細(xì)胞(eca-109)
受試藥物：2，3-二氫-2，3-二羧甲基-5，10，15，20-四(4-甲氧基苯基)二氫卟吩(以下簡稱光敏劑2)，在無菌條件下將該藥物溶于最小量吐溫-80，用生理鹽水稀釋至0.2mg/ml溶液備用；替莫泊芬(上海先輝醫(yī)藥科技有限公司)，配制方法同光敏劑2。
光源：xd-650ab型激光器。
激光功率儀：sd2490型激光功率測量儀。
光動力抗腫瘤細(xì)胞增殖作用實(shí)驗(yàn)：
將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞用胰酶消化后，完全培養(yǎng)基重懸成細(xì)胞懸液，隨之將其接種于96孔板，每孔100μl，置于37℃5％co2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，24h后加入濃度不同的光敏劑；12h換成新鮮培養(yǎng)基，然后進(jìn)行光照(功率25mw/cm2、波長650nm、光劑量18j/cm2)；24h后進(jìn)行mtt檢測。培養(yǎng)終止前4h加入10μl5mg/ml的mtt，吸棄培養(yǎng)液后加100μldmso終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀570nm檢測od值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3，結(jié)果發(fā)現(xiàn)光敏劑2對人食管癌細(xì)胞(eca-109)有顯著的光動力抗增殖作用。
表3光敏劑2對人食管癌細(xì)胞(eca-109)增殖抑制作用
3、對裸鼠體內(nèi)人食管癌細(xì)胞(eca-109)移植瘤的光動力治療實(shí)驗(yàn)
受試動物：babl/c裸小鼠，平均體重15～20g(上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司)
受試藥物：2，3-二氫-2，3-二羧甲基-5，10，15，20-四(4-甲氧基苯基)二氫卟吩(以下簡稱光敏劑2)，在無菌條件下將該藥物溶于最小量吐溫-80，用生理鹽水稀釋至0.2mg/ml溶液備用；替莫泊芬(上海先輝醫(yī)藥科技有限公司)，配制方法同光敏劑2。
光源：xd-650ab型激光器。
激光功率儀：sd2490型激光功率測量儀。
人食管癌細(xì)胞(eca-109)移植瘤光動力損傷實(shí)驗(yàn)：
無菌條件下于小鼠前胸部皮下接種eca-109細(xì)胞，待腫瘤長至直徑5～7mm時，選取生長良好、無潰瘍、具半球狀單一腫瘤的裸鼠，按同窩同性別隨機(jī)分組，每組8只，尾靜脈注射給藥，并以藥物溶劑作為空白對照，將替莫泊芬配成相同濃度溶液作為陽性對照，給藥后3h用功率密度為180mw/cm2的激光(波長650mm、光劑量100j/cm2)輻射腫瘤；光照后5天，處死小鼠，剝離腫瘤，稱瘤重，計算抑制率。
腫瘤抑制率％＝(c-t)/c×100％
式中，t：給藥組平均瘤重；c：對照組平均瘤重。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4，表明光敏劑2對腫瘤具有顯著的光動力抑制作用。
表4光敏劑2對腫瘤的抑制效果
*p＜0.05與空白對照。